特許 5753775 化学合成した核酸の純度を測定する方法と組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5753775

(24)【登録日】2015年5月29日

(45)【発行日】2015年7月22日

(54)【発明の名称】化学合成した核酸の純度を測定する方法と組成物

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/02 20060101AFI20150702BHJP

   C07H 21/04 20060101ALI20150702BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20150702BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150702BHJP

【ＦＩ】

   C07H21/02

   C07H21/04 A

   C07K16/00

   !C12N15/00 A

【請求項の数】19

【外国語出願】

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2011-286484(P2011-286484)

(22)【出願日】2011年12月27日

(62)【分割の表示】特願2001-550285(P2001-550285)の分割

【原出願日】2000年12月29日

(65)【公開番号】特開2012-107019(P2012-107019A)

(43)【公開日】2012年6月7日

【審査請求日】2012年1月26日

(31)【優先権主張番号】09/476,975

(32)【優先日】1999年12月31日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】598139601

【氏名又は名称】ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(73)【特許権者】

【識別番号】512182186

【氏名又は名称】プロテオーム・サイエンシズ・ピーエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100114591

【弁理士】

【氏名又は名称】河村 英文

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100154298

【弁理士】

【氏名又は名称】角田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】アグリス，ポール・エフ

(72)【発明者】

【氏名】ミッチェル，ロイド・ジー

(72)【発明者】

【氏名】ピアース，クリストファー・ディー・ジェイ

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０５２２１７３６（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０８０１８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biological Chemistry Hoppe-Seyler，１９９１年，Vol.372，p.845-848

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ ２１／００−２１／０４

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）の塩基のアミノ基が完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチドから保護されている合成オリゴヌクレオチド（部分的に保護されている合成オリゴヌクレオチドおよび完全に保護されている合成オリゴヌクレオチドを含む）を分離する方法であって、
前記保護されている合成オリゴヌクレオチドと完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチドの混合物を、前記保護されている合成オリゴヌクレオチドに選択的に結合する抗体に接触させるステップと、
前記抗体が結合した保護されたオリゴヌクレオチドから前記完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチドを精製するステップと
を含み、
前記保護されている合成オリゴヌクレオチドが、式（Ｉ）、

【化1】

（式中、Ｒは隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ_１は隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ_２はＨまたは−ＯＨであり、
塩基はプリンまたはピリミジン塩基であり、
Ｒ_４は、前記塩基のアミノ基に結合した保護基である）の保護されているヌクレオチドを含み、
前記抗体が、前記保護基が共有結合したヌクレオチドに特異的に結合する抗体であって、前記保護基が共有結合していないヌクレオチドには結合しない抗体である、方法。

【請求項2】

下記式（Ｉ）の塩基のアミノ基に保護基が共有結合したヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチド（部分的に保護されている合成オリゴヌクレオチドおよび完全に保護されている合成オリゴヌクレオチドを含む）に特異的に結合する抗体であって、前記保護基が共有結合していないヌクレオチドに結合しない抗体に合成オリゴヌクレオチドを接触させるステップを含み、
前記抗体が選択的に結合する前記オリゴヌクレオチドが、式（Ｉ）、

【化2】

（式中、Ｒは隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ_１は隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ_２はＨまたは−ＯＨであり、
塩基はプリンまたはピリミジン塩基であり、
Ｒ_４は、前記塩基のアミノ基に結合した保護基である）の保護されているヌクレオチドを含む、イムノアッセイによって合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を検出する方法。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチドが３〜２０のヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの１つが感光性保護基で保護されている請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記抗体が固体担体に固定されている請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記イムノアッセイが、ヘテロジニアスイムノアッセイである請求項２〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記イムノアッセイがホモジニアスイムノアッセイである請求項２〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記イムノアッセイがサンドイッチアッセイである請求項２〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記保護されている合成オリゴヌクレオチドが、部分的に保護されている合成オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記接触させるステップおよび精製するステップがアフィニティークロマトグラフィーによって実施される請求項９に記載の方法。

【請求項11】

オリゴヌクレオチドの不十分な脱保護についてオリゴヌクレオチドアレイをスクリーニングする請求項２に記載の方法であって、
（ａ）複数の異なるオリゴヌクレオチドが固定された基板を含むオリゴヌクレオチドアレイを提供するステップであって、前記異なるオリゴヌクレオチドは、前記基板の異なる離れた別個の位置に固定されているステップと、
（ｂ）保護基が共有結合した合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合する抗体であって、前記保護基が共有結合していない場合には、前記合成オリゴヌクレオチドに結合しない抗体を提供するステップと、
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドアレイに前記抗体を接触させ、それによって前記アレイ上の離れた別個の位置への前記抗体の結合の有無を検出するステップであって、前記アレイの離れた別個の位置への結合の存在がオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護を示すステップと
を含む方法。

【請求項12】

前記基板がケイ素を含有する請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

アレイを提供する前記ステップが、前記基板上で前記オリゴヌクレオチドをｉｎ ｓｉｔｕで合成することによって実施される請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

アレイのオリゴヌクレオチドにおける複数の異なる保護基を検出できるように、各反復時に異なる抗体を用いてステップ（ｂ）〜ステップ（ｃ）を少なくとも１回反復するステップをさらに含む請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記アレイの少なくとも１つの離れた別個の位置のオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護または不十分な伸長の存在を記録する証拠を作成するステップをさらに含む請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

前記証拠が定性的な証拠である請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記証拠が定量的な証拠である請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

下記式（Ｉ）の塩基のアミノ基が保護されたオリゴヌクレオチドから完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを同定及び／又は分離するための、前記保護されたオリゴヌクレオチドに選択的に結合する抗体の使用であって、
前記保護されたオリゴヌクレオチドが、式（Ｉ）

【化3】

（式中、Ｒは隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ_１は隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ_２はＨまたは−ＯＨであり、
塩基はプリンまたはピリミジン塩基であり、
Ｒ_４は、前記塩基のアミノ基に結合した保護基である）の保護されているヌクレオチドを含み（部分的に保護されている合成オリゴヌクレオチドおよび完全に保護されている合成オリゴヌクレオチドを含む）、前記抗体が、前記保護基が共有結合したヌクレオチドに特異的に結合する抗体であって、前記保護基が共有結合していないヌクレオチドに結合しない抗体である、使用。

【請求項19】

式（Ｉ）

【化4】

（式中、Ｒは隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ_１は隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ_２はＨまたは−ＯＨであり、
塩基はプリンまたはピリミジン塩基であり、
Ｒ_４は、前記塩基のアミノ基に結合した保護基である）の保護されているヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド（部分的に保護されているオリゴヌクレオチドおよび完全に保護されているオリゴヌクレオチドを含む）に選択的に結合し、前記保護基で保護されていないヌクレオチドには結合しない抗体を含む請求項１〜１７のいずれかに記載の方法で使用するための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願］
本願は、その開示内容が全体として本明細書に参照として組み入れられている、１９９９年１２月３１日に提出された同じ出願人による同時係属出願第０９／４７６，９７５号の一部継続出願である。

【0002】

本発明は、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドの化学合成後に残存する保護基の検出と、同定と、定量とに関する。

【背景技術】

【0003】

この１０年に、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸の固体担体での自動化学合成が開発された。これらの化学的方法には、ヌクレオチド塩基アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンの環外アミンを保護し、ＲＮＡリボースの２’ＯＨをブロックすることによって合成させる薬品の使用が含まれる。合成の核酸生成物内の塩基は、固体担体から核酸を切断すると脱保護される。しかし、塩基の脱保護程度は容易に測定されない。

【0004】

例えば、合成ＲＮＡの塩基脱保護後にも、生成物は、リボース部分の２’ＯＨの保護として２’−ジメチルシリルｔｅｒｔ−ブチル基を含有する。この保護基は、ＲＮＡの化学および構造に影響しないように、化学的手段によって慎重に除去される。しかし、２’ＯＨの脱保護の程度は容易に測定されない。核酸は高速液体クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によって精製される。しかし、合成の望ましくない生成物の一部は、１つ以上の保護基および特に５０ヌクレオチドより長いオリゴマーでは、全長の配列からの分離が困難な全長より短い（中断された）配列を含有する完全な核酸配列である。現在、各保護基が、存在する場合には、どの程度生成物に残存するか、生成物のどのくらいの割合が全長であるかを測定する容易な方法はない。一般に、Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｇｅｈｒｋｅ，
Ｃ．Ｗ．，Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．，ａｎｄ Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．（１９７９）Ｍａｊｏｒ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｔＲＮＡ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１７３：２８１−２９８；Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．，Ｔｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．，Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．，ａｎｄ Ｒｉｃｅ，Ｒ．Ｈ．（１９８０）Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ Ｂａｓｅｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９４：２０５−２１２；Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．，Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．，ＭｃＣｕｎｅ，Ｒ．Ａ．，Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｋ．Ｏ．，ａｎｄ Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．（１９８１）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｅｎｃｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔＲＮＡｓ：ＲＰ−ＨＰＬＣ ｏｆ ｔＲＮＡ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２３０：２９７−３０８；Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｖｏｌｕｍｅｓ Ａ，Ｂ ａｎｄ Ｃ（Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．Ｔ．，ｅｄｓ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９０；Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ． ａｎｄ Ｓｉｅｒｚｐｕｔｏｗｓｋａ−Ｇｒａｃｚ，Ｈ．（１９９０）Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔＲＮＡ’ｓ ｂｙ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ．Ｉｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ（Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．Ｔ．，ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ｐｐ．２２５−２５３；Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．，Ｈａｙｄｅｎ，Ｊ．，Ｓｉｅｒｚｐｕｔｏｗｓｋａ−Ｇｒａｃｚ，Ｈ．，Ｄｉｔｓｏｎ，Ｓ．，Ｄｅｇｒｅｓ，Ｊ．Ａ．，Ｔｅｍｐｅｓｔａ，Ｍ．，Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ． ａｎｄ Ｇｅｈｒｋｅ ａｎｄ Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．（１９９０）Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｉｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．参照。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

保護基の除去が不完全であることおよび簡単なアッセイがないことは、２つの業界にとって、また全世界の数多くの研究者にとって問題である。（ｉ）現在翌日渡しにより核酸配列合成を提供している多数の会社は、生成物が脱保護された程度を顧客に伝えることが難しい、（ｉｉ）製薬会社は、導入または販売しようとしている治療用または診断用オリゴヌクレオチド生成物の純度および／または鎖長を規制機関に対して容易には証明できない。従って、全長のオリゴヌクレオチド生成物の純度および割合を測定する簡単で信頼できる方法の必要性がある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一態様は、有機保護基が共有結合している合成オリゴマー（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド）に特異的に結合し、有機保護基が共有結合していない場合にはその合成オリゴマーに結合しない抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）である。

【0007】

本発明の第２の態様は、上記の抗体を発現する、細胞培養物および単離細胞を含む細胞を含む。このような細胞は、抗体を発現する異種核酸を含有し、発現するハイブリドーマ細胞および組み換え細胞を含む。

【0008】

本発明の第３の態様は、（ａ）上記の抗体に合成オリゴヌクレオチドを接触させるステップと、（ｂ）前記抗体と前記オリゴマーとの結合の有無を検出するステップであって、結合の存在が前記合成オリゴマーの不完全な脱保護を示すステップとを含む、イムノアッセイによって合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を検出する方法である。不均一な(heterogeneous)イムノアッセイおよび均一な(homogeneous)イムノアッセイを含む、任意の好適なアッセイ方式を使用することができる。例えば、イムノアッセイはイムノブロット−ドットアッセイであっても、サンドイッチアッセイであってもよい。

【0009】

本発明の第４の態様は、完全に脱保護された合成オリゴマーから（部分的および完全に保護されている合成オリゴマーを含む）保護されている合成オリゴマーを分離する方法である。本発明の方法は、（ａ）保護されている合成オリゴマーと完全に脱保護された合成オリゴマーの混合物を上記の抗体に接触させるステップであって、保護されている合成オリゴマーは有機保護基が共有結合されており、その結果、保護されている合成オリゴマーが抗体に結合するステップと、完全に脱保護されたオリゴマーから抗体を分離するステップとを含む。抗体は、分離を容易にするために、固体担体に固定されてもよい。保護されている合成オリゴマーは、部分的に保護されている合成オリゴマー（用途の１つは、全長および中断された(aborted)配列オリゴマーの同定および／または精製である）または脱
保護を受けていない完全に保護されている合成オリゴマーであってもよい。アフィニティークロマトグラフィーを含むが、これに限定されない任意の分離方式を使用することができる。

【0010】

本発明の第５の態様は、イムノアッセイにおいて合成オリゴマーの不完全な脱保護を測定するのに有用な物品であって、（ａ）少なくとも２つの離れた別個の領域が形成された表面部分を有する固体担体（例えば、ニトロセルロースストリップ）と、（ｂ）前記離れた別個の領域の１つに結合し、保護基が結合されている第１のオリゴマーと、（ｃ）前記離れた別個の領域の別の１つに結合し、前記保護基が結合されていない第２のオリゴマーとを含み、前記第１および第２のオリゴマーのヌクレオチド配列が同じである物品である。好ましい実施態様において、物品は、（ｄ）前記離れた別個の領域の別の１つに結合し、前記第１のオリゴマーに結合している前記保護基が結合している第３のオリゴマーをさらに含み、前記第３のオリゴマーが部分的に脱保護されており、前記第１、第２および第３のオリゴマーのヌクレオチド配列が同じである。

【0011】

本発明の第６の態様は、有機保護基が共有結合した合成オリゴマーに特異的に結合し、前記有機保護基が共有結合していない場合には前記合成オリゴマーに結合しない抗体を作製する方法であって、（ａ）前記有機保護基が共有結合した（好ましくは、スクシニルリンカーで共有結合した）前記合成オリゴマーを固体粒状担体で合成するステップ（または、前記保護基が共有結合した１ヌクレオチドのモノマーを固体担体で合成するステップ）と、前記オリゴマーを前記固体担体からはずすことなく、（ｂ）前記抗体を形成するのに十分な量の、前記固体担体に結合した前記合成オリゴマー（または、前記固体担体に結合したモノマー）で動物を免疫するステップを含む方法である。必要に応じて、固体担体は、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）などの担体グループと交換してもよい。

【0012】

要約すると、本発明の抗体および方法は、有機合成方法に使用される保護基の定性および定量的検出などのイムノアッセイに有用であり、研究、治療、診断および生物医科学にオリゴヌクレオチドまたはペプチドの特定の用途がある。本発明の抗体は、副産物夾雑物からの最終生成物の分離などの精製技法に使用することができる。本発明は、遺伝子治療の薬剤、アンチセンス、ａｎｔｉｇｅｎｅの品質管理および遺伝子発現のコントロール、保護基を含有してもよい生物医学ポリマーの品質管理、並びに合成オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチドの精製および特徴づけなどの、オリゴヌクレオチドおよびペプチド合成の品質管理過程に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】オリゴＩｂｕ−ｄＧ２０ｍｅｒｓに選択的に結合する、モノクローナル抗体１Ｈ１１のドット−ブロットイムノアッセイである。

【図2】オリゴＢｚ−ｄＣ２０ｍｅｒｓに選択的に結合する、モノクローナル抗体７Ｈ３のドット−ブロットイムノアッセイである。

【図3】核酸の化学合成に通常使用される保護基、ベンゾイル（Ｂｚ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性および検出感度を証明するＥＬＩＳＡ（Ａ）およびドット−ブロット（Ｂ）を示す。部分的に脱保護されたオリゴマーオリゴＢｚ−ｄＣ（中央のカラム）を再処理して、残存する保護基を除去し、ｍＡｂで再試験することができる（Ｃ）。保護基Ｂｚ、ｉｂｕおよびｉｐｒ−Ｐａｃを有するＲＮＡ標品を合成し、Ｂｚに対するｍＡｂによる保護基の同定をアッセイした（Ｄ）。

【図4】核酸の化学合成に通常使用される保護基、イソブトリル（ｉｂｕ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性および感度並びにその検出を証明するＥＬＩＳＡ（Ａ）およびドット−ブロット（Ｂ）結果を示す。大量のＤＮＡを用いたドット−ブロットアッセイは、ｉｂｕ保護基は、どの核酸塩基が保護されているかにかかわらず、ｍＡｂによって認識されたことを証明している（Ｃ）。部分的に脱保護されたオリゴマーオリゴＢｚ−ｄＣ（中央のカラム）を再処理して、残存する保護基を除去し、ｍＡｂで再試験することができる（Ｄ）。保護基Ｂｚ、ｉｂｕおよびｉｐｒ−Ｐａｃを有するＲＮＡ標品を合成し、ｉｂｕに対するｍＡｂによる保護基の同定をアッセイした（Ｅ）。

【図5】核酸の化学合成に通常使用される保護基、イソプロピルフェノキシアセチル（ｉｐｒ−Ｐａｃ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性および感度並びにその検出を証明するＥＬＩＳＡ（Ａ）およびドット−ブロット（Ｂ）結果を示す。部分的に脱保護されたオリゴマーオリゴｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧおよびオリゴｉｂｕ−ｄＧ（それぞれ、左から２番目および４番目のカラム）を再処理して、残存する保護基を除去し、ｍＡｂで再試験することができる（Ｃ）。保護基Ｂｚ、ｉｂｕおよびｉｐｒ−Ｐａｃを有するＲＮＡ標品を合成し、ｉｐｒ−Ｐａｃに対するｍＡｂによる保護基の同定をアッセイした（Ｄ）。

【図6】ＨＰＬＣに関連する技術の感度および定量応答を証明する、保護基のｍＡｂドット−ブロットアッセイを示す。標準の２０ｍｅｒオリゴｄＣ分子に残存するＢｚ基のドット−ブロット検出を実施し（Ａ）、ｍＡｂ応答の定量（Ｂ）を行った。ｍＡｂ応答は、ドット−ブロット膜のＤＮＡ量を増加させて分析した（Ｃ）。左のカラムは保護されているＢｚ−ｄＣ２０ｍｅｒである。右のカラムは、保護されているＢｚ−ｄＣと２５００倍過剰量の完全に脱保護されたオリゴｄＣ（Ｂｚ）である。

【図7】それぞれ、ｐｍｏｌｅ（Ａ）およびｎｍｏｌ範囲（Ｂ）のＢｚのｍＡｂおよびＨＰＬＣ検出の直接比較を示す。

【図8】市販の試料中に残存する保護基の検出を証明する盲検試験を示す。ｄＡ−ｄＣオリゴは抗ＢｚｍＡｂ（Ａ）で分析し、ｄＧ−ｄＴオリゴは抗ｉｐｒ−ＰａｃｍＡｂ（Ｂ）で分析した。＃２社および＃６社製のオリゴｄＡ−ｄＣ試料は、Ｂｚ保護基の存在を確認するために大量で試験した（Ｃ）。また、標準的なプロトコールを使用して残存する保護基を除去するために試料を処理した。オリゴｄＧ−ｄＴ試料はｉｐｒ−Ｐａｃ保護基についてアッセイした（Ｄ）。試料を再処理して、残存する保護基を除去し、（Ｃ）のように再分析した。

【図9】５’末端保護基、ジメトリチル（ＤＭＴ）に対するポリクローナル抗体の作製および分析を示す。

【図10】配列は同じで類似したオリゴヌクレオチドを、保護または脱保護の程度の差についてスクリーニングする試験標準として使用することができる、配列が同じで、脱保護の程度が異なる種々のオリゴヌクレオチドを含有する基板を示す。

【図11】本発明の抗体を用いて、保護基の存在または不十分な伸長をスクリーニングすることができるオリゴヌクレオチドアレイを例示する。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、本明細書の図面および以下に記載する明細書により詳細に説明されている。

【0015】

１．一般的な定義
本明細書において使用される「抗体」は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方をいい、（ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を含むが、これらに限定されない）任意の免疫グロブリン型の抗体をいい、高頻度可変領域または結合領域を保持する抗体断片を含む。抗体はいかなる起源のものであってもよいが、典型的には、哺乳類である（例えば、ウマ、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ）。抗体は、既知の技法により、ニトロセルロース、アガロース、ガラス、有機ポリマー（「プラスチック」）等に結合または固定されてもよく、既知の技法により、他の検出可能な基で標識されても、または検出可能な基に接続されてもよい。

【0016】

抗体のオリゴマーへの選択的な結合に関して本明細書において使用される「結合」は当技術上通常の意味を有する。一般に、イムノアッセイまたは親和性精製技法において識別するために、抗体は、少なくとも約Ｋ_d＝１０^-6、１０^-7または１０^-8Ｍの親和性で保護されているオリゴマーに結合するべきであり、約Ｋ_d＝１０^-2、１０^-3または１０^-4Ｍを超えない親和性で保護されていないオリゴマーと結合するべきである。

【0017】

本明細書において使用される「オリゴマー」は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの天然型の形態の合成オリゴマー、並びに以下に考察する修飾された骨格の化合物を含む、合成オリゴヌクレオチドおよび合成オリゴペプチドをいう。オリゴヌクレオチドは本発明を実施する際に現在好ましく、本発明は、本明細書のオリゴヌクレオチドに言及して主に説明されている。しかし、本明細書に記載されている方法および技法はまたオリゴペプチド、オリゴサッカライド等（すなわち、合成に保護基を必要とする、合成によって生成される任意のポリマー）に適用することもできる。

【0018】

本明細書において使用される「ヌクレオチド」は、ペントース、含窒素複素環塩基（典型的には、ペントースの１位に結合している）およびリン酸塩またはリン酸基（典型的には、ペントースの５’位に結合している）を含むオリゴヌクレオチドのサブユニットをいうが、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの３’位が欠損しているかまたは３’位に結合していると考えられる。これらの構造は周知である。例えば、Ａ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０９−３２０を参照）。「ヌクレオシド」は、典型的には、リン酸またはリン酸塩を欠損しているヌクレオチドをいう。

【0019】

本明細書において使用される「保護基」は当技術上従来の意味を持ち、（典型的には、有機合成において）その分子が関係する化学反応の前に、分子中の原子に結合、典型的には、共有結合し、その結果、保護基が結合している原子に化学反応が起きない化学的部分、基または置換基をいう。典型的には、最終生成物が生成されるために、保護基は中間体分子から化学的に除去されるが、除去技法により最終生成物の部分的な脱保護（すなわち、その分子に残存する少なくとも１つの保護基が存在する）だけが生じるわけではないことがある。保護基は、上記の抗体を作製または試験する目的のために分子に意図的に残されることがある。

【0020】

本明細書において使用される「脱保護」または「脱保護された」は、分子からの化学的なオリゴヌクレオチド合成に使用される保護基がないことをいう。このような保護基は以下に記載されている。保護基が鎖の末端である場合には、このような保護基の存在はオリゴヌクレオチドの不十分な伸長を示すことができる。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、理想的には、完全に脱保護されているが、本発明は、このようなオリゴヌクレオチドの部分的または不完全な脱保護（すなわち、オリゴヌクレオチドに以下に記載する少なくとも１つの保護基が存在する）を検出するために使用される。

【0021】

オリゴヌクレオチドに関して本明細書において使用される「塩基」は、プリン（例えば、アデニン、グアニン）またはピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、シトシン）の誘導体であるまたは含窒素複素環塩基をいう。ピリミジン塩基は、１環窒素によってペントースに結合し、プリン塩基は９環窒素によってペントースに結合する。好ましい塩基は、グアニン、アデニンおよびシトシンなどの遊離アミノ基を含有するものである（次いで、遊離アミノ基の水素の１つまたは２つの置換によって、保護基が遊離アミノ酸基に共有結合される）。しかし、保護するための遊離アミノ基または合成中に保護を必要とする他の基をオリゴヌクレオチド中に含有する、標準的または修飾／稀（ｒａｒｅ）な任意のプリンまたはピリミジン塩基に使用することができる。標準的および修飾／稀な塩基の例は以下の表１に記載されているヌクレオシドに見られるものである。

【0022】

【表1-1】

【表1-2】

【0023】

出願人らは、本明細書に引用されている全ての米国特許参照文献の開示内容が
全体として本明細書に参照として組み入れられていることを意図している。

【0024】

２．保護基
特定の保護基は、合成されるオリゴマーおよびそのオリゴマーが合成される方法に依存する。

【0025】

オリゴヌクレオチドの合成に好適な保護基には、Ｎ、ＯまたはＳなどの１つ以上のヘテロ原子を含有してもよく、置換または未置換であってもよい（例えば、カルボニル基）アルキル、アリール(aryl)、アルキルアリール、アリールアルキル基が含まれる。保護基の例には、以下を含むが、これらに限定されない：アセチル、イソブチリル、２−（ｔ−ブチルジフェニル−シリルオキシメチル）ベンゾイル、ナフタロイル、イソ−ブチリルオキシカルボニル、レブリニル（ｌｅｖｕｌｉｎｙｌ）、フルオレニルメトキシカルボニル、２−ニトロチオフェニル、２，２，２−トリクロロ−ｔ−ブトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロフェニル−エチルオキシカルボニル、Ｎ’Ｎ−ジメチルホルムアミジン、ホルミル、ベンゾイル、トルイル、２，４−６−トリメチルベンゾイル、アニソイル、２，４−ジメチルフェニル、２，４，６−トリメチルフェニル、トリフェニルチオメチル、ピボロイルオキシメチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ｐ−ニトロフェニルエチル、メトキシエトキシメチル、ブチルチオカルボニル、２−メチル−ピリジン−５−イル、２−ニトロチオフェニル、２，４−ジニトロチオフェニル、２−ニトロ−４−メチルチオフェニル、ｐ−ニトロフェニルスルホニルエチル、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、チオフェニル、β−シアノエチル、フェニルエチル、ｐ−ニトロフェニルエチル、ピリジルエチル、２−Ｎ−メチルイミダゾリルフェニル、メチル、アリル(allyl)、トリクロロエチル、ジベンゾイル、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル、ベンゾイルおよびその置換誘導体、２（アセトキシメチル）ベンゾイル、４，４’、４’’−トリス（ベンジルオキシ）トリチル、５−メチルピリジノ（ｐｙｒ
ｉｄｙｎｏ）−２−イル、フェニルチオエチル、ジフェニルカルバモイル、３，４−ジメトキシベンジル、３−クロロフェニル、２−ニトロフェニル、９−フェニルキサンテン−９−イル、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル、９−（ｐ−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル、「架橋」ビス−ジメトキシトリチル基、フタノイル、スクシニル、ベンゼンスルホニルエトキシカルボニル、４，４’、４’’−トリス（ベブリニルオキシ（ｂｅｖｕｌｉｎｙｌｏｘｙ））トリストリチル、ｐ−フェニルアゾフェニルオキシカルボニル、ｏ−置換ベンゾイル、４，４’、４’’−トリス（４，５−ジクロロファルイミジン（ｐｈａｌｉｍｉｄｉｎ）トリチル、レベリニル（ｌｅｖｅｌｉｎｙｌ）、アルキルオキシおよびアリールオキシアセチル、１，３−ベンゾジチオール
−２−イル、テトラヒドロフラニル、［２−（メチルチオ）フェニル］チオメチル、１−（２−クロロエチ（ｅｔｈｙ）オキシ）エチル、１−［（２−フルオロ−フェニル］４−メトキシピペリジン−４−イル、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル、（１−メチル−１−メトキシ）エチル、テトラヒドロピラニル、３−メトキシ−１，５−ジカルボメトキシペンタム（ｐｅｎｔａｍ）−３−イル、２−ニトロベンジル、ベンジル、４−ニトロフェニルエチル−スルホニル、ｔ−ブチルジメチルシリル、４−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、９−ｐ−メトキシフェニルチオキサンテン−９−イル、式Ｒ₁Ｒ₂Ｒ₃Ｃ−（ここで、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は、各々独立に、フェニル、ｐ−モノメトキシフェニル、ｏ−モノメトキシフェニル、ビフェニル、ｐ−フルオロフェニル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メチルフェニル、ｐ−ニトロフェニル等からなる群から選択される）の化合物。

【0026】

３．オリゴヌクレオチド
保護基を含有し、本発明を実施するために使用することができる合成オリゴヌクレオチドには、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの天然型、並びにホスホネート、ホスホールアミド、ホスホンアミド、ホスファイト、ホスフィンアミド等、などのポリ（ホスフェート誘導体）スルホン、スルホネート、スルファイト、スルホンアミド、スルフェンアミド（ｓｕｌｆｅｎａｍｉｄｅｓ）のようなポリ（硫黄誘導体）等などの修飾された骨格の化合物が含まれる。本発明の抗体は特定の「試薬」または「ベンチマーク」オリゴヌクレオチドとの選択的な結合によって特徴づけることができるが、同じ抗体は、同じ保護基を含有する種々の他のオリゴヌクレオチド（例えば、より長いヌクレオチド）または他の化合物にも結合することができるということが注目される。

【0027】

例えば、抗体が選択的に結合するオリゴヌクレオチドは、３〜２０のヌクレオチドからなってもよく、前記ヌクレオチドの１つは以下の式（Ｉ）、

【化6】

（式中、ＲはＨまたはジメトキシトリチルなどの保護基であるが、ただし、前記保護されている塩基が前記オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドでない場合には、Ｒは隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ₁はＨまたはβ−シアノエチルなどの保護基であるが、ただし、前記保護されている塩基が前記オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドでない場合には、Ｒ₁は隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ₂はＨまたは−ＯＲ₃であり、
Ｒ₃はＨまたはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどの保護基であり、
塩基はプリンまたはピリミジン塩基であり、
Ｒ₄は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ジメチルホルムアミジン（ｄｍｆ）、イソブチル（ｉｓｏｂｕｔｙｒｌ）（Ｉｂｕ）、フェノキシアセチル（Ｐａｃ）およびイソプロピル−フェノキシアセチル（ｉｐｒ−Ｐａｃ）からなる群から選択される保護基などの前記塩基のアミノ基に結合した保護基であるが、ただし、Ｒ、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₄の１つが保護基である場合には、Ｒ、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₄の残りは保護基でない）の保護されたヌクレオチドである。

【0028】

上記の１つの特定の実施態様において、抗体は、３〜２０ヌクレオチドからなり、式（Ｉ）、

【化7】

（式中、Ｒはジメトキシトリチルなどの保護基であり、
Ｒ₁は隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ₂は−Ｈまたは−ＯＨであり、
塩基はプリンまたはピリミジン塩基である）の保護されたヌクレオチドである５’ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに選択的に結合するものであってもよい。

【0029】

上記の別の特定の実施態様において、抗体は、３〜２０ヌクレオチドからなり、式（Ｉ）、

【化8】

（式中、Ｒは隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ₁はβ−シアノエチルなどの保護基であり、
Ｒ₂は−Ｈまたは−ＯＨであり、
塩基はプリンまたはピリミジン塩基である）の保護されたヌクレオチドである３’ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに選択的に結合するものであってもよい。

【0030】

上記の別の特定の実施態様において、抗体は、３〜２０ヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの１つは、式（Ｉ）、

【化9】

（式中、Ｒは隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ₁は隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ₂は−ＯＲ₃であり、
Ｒ₃はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどの保護基であり、
塩基はプリンまたはピリジン塩基である）の保護されたヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドに選択的に結合するものであってもよい。

【0031】

上記のさらに別の特定の実施態様において、抗体は、３〜２０ヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの１つは、式（Ｉ）、

【化10】

（式中、Ｒは隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ₁は隣接ヌクレオチドとの共有結合であり、
Ｒ₂は−Ｈまたは−ＯＨであり、
塩基はプリンまたはピリジン塩基であり、
Ｒ₄は、アセチル、ベンゾイル、ジメチルホルムアミジン、イソブチリル、フェノキシアセチルおよびイソプロピル−フェノキシアセチルなどの、前記塩基のアミノ基に結合した保護基である）の保護されたヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドに選択的に結合するものであってもよい。

【0032】

従って、上記に示す構造に使用することができる保護された塩基の例には、以下の、

【化11】

（式中、Ｒ₁およびＲ₂は保護されていない塩基ではＨであり、保護されている塩基では、Ｒ₁またはＲ₂は、上記の保護基（例えば、Ｐａｃ、Ｉｐｒ−Ｐａｃ、Ｉｂｕ、Ｂｚ、Ａｃ、ｄｍｆ）である）のようなアデニン、グアニンおよびシトシンが含まれるが、これらに限定されない。同様に、修飾されているヌクレオチドは、化学的に反応性である修飾基に保護基を有する。

【0033】

本発明の一実施態様において、オリゴヌクレオチドはペプチド核酸であり、保護基は、米国特許第６，１３３，４４４号に記載されているものを含むが、これらに限定されないペプチド核酸の合成に使用されるような保護基である。

【0034】

上記のさらに別の特定の実施態様において、抗体は３〜２０ヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの１つは、米国特許第５，７４４，１０１号および同第５，４８９，６７８号（Ａｆｆｙｍａｘに付与されている）に記載されているものを含むが、これらに限定されない感光性保護基で保護されているオリゴヌクレオチドに選択的に結合するものであってもよい。

【0035】

４．抗体
上記のように、本発明は、有機保護基が共有結合した合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、前記有機保護基が共有結合していない場合には前記合成オリゴヌクレオチドに結合しない抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を提供する。

【0036】

抗体は、既知の技法により固体担体に固定（または結合）された状態で提供されても、遊離の結合していない形態（例えば、凍結乾燥、凍結、水性担体中等）で提供されてもよい。抗体が固定されるかどうかは、抗体を使用する特定のイムノアッセイまたは親和性精製技法に依存し、このような技法の既知のパラメーターによって決定される。同様に、典型的には、抗体を使用するイムノアッセイ方式に応じて、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ビオチンまたはアビジンなどの数多くの結合対、放射性基または緑色蛍光タンパク質などの蛍光基などの好適な検出可能な基を既知の技法により抗体に結合または接合することができる。

【0037】

５．イムノアッセイ方法
本発明は、イムノアッセイによって（保護基を含有する中断された（ａｂｏｒｔｅｄ）配列を含む）合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を検出する方法を提供する。一般に、このようなイムノアッセイは、（ａ）上記の抗体に合成オリゴヌクレオチドを接触させるステップと、（ｂ）前記抗体と前記オリゴヌクレオチドとの結合の有無を検出するステップであって、結合の存在が前記合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を示すステップとを含む。不均一なイムノアッセイおよび均一なイムノアッセイを含む、任意の好適なアッセイ方式を使用することができる。例えば、イムノアッセイはイムノドット−ブロットアッセイであっても、またはサンドイッチアッセイであってもよい。脱保護について試験されるオリゴヌクレオチドは、溶液または固体担体に固定された形態などの任意の好適な形態であってもよい。

【0038】

好ましい実施態様において、検出方法は、抗体と試験オリゴヌクレオチドとの結合を、抗体と既知のオリゴヌクレオチドセットとの結合と比較し、全てが共通の固体担体に固定されている「ディップスティック」等を使用する。イムノアッセイにおいて合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を測定するのに有用な、図１０に例示するような物品は、（ａ）少なくとも２つの離れた別個の領域２６および２７が形成されている表面部分を有する固体担体（例えば、ニトロセルロースストリップ）２５と、（ｂ）前記離れた別個の領域の１つに結合し、保護基が（例えば、少なくとも１つの保護基）結合している第１のオリゴヌクレオチドと、（ｃ）前記離れた別個の領域の別の１つに結合し、前記保護基が結合していない第２のオリゴヌクレオチドとを含み、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が同じである。好ましい実施態様において、本発明の物品は、（ｄ）前記離れた別個の領域２８の別の１つに結合し、前記第１のオリゴヌクレオチドに結合している前記保護基が結合している第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが部分的に脱保護されており（すなわち、共有結合されている保護基の数が、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドに結合しているものの中間であり、例えば、保護基が第１のオリゴヌクレオチドより少なくとも１、２、３または４つ以上多く、第１のオリゴヌクレオチドより少なくとも１０、２０以上多い）、前記第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が同じである。当然のことであるが、望ましい場合には、別の離れた別個の位置の基板に、異なる数の保護基を有するさらに多くのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。別のオリゴヌクレオチドが結合する別個の領域は、ドットなどの任意の形態であってもよい。

【0039】

６．親和性精製方法
イムノアッセイ以外に、本発明はまた、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチド（完全に保護されているオリゴヌクレオチドを含む）（例えば、保護基を除去するために脱保護過程を実施したオリゴヌクレオチドと脱保護過程を実施していないオリゴヌクレオチドの両方）から分離する親和性精製技法を提供する。このような手法は、典型的には、（ａ）保護されている合成オリゴヌクレオチドと完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチドの混合物を上記の抗体に接触させるステップであって、保護されている合成オリゴヌクレオチドは、抗体が選択できる有機保護基が共有結合されており、その結果、保護されている合成オリゴヌクレオチドが抗体に結合するステップと、次いで前記抗体を前記完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドから分離する
ステップとを含む。保護されている合成オリゴヌクレオチドは部分的に保護されている合成オリゴヌクレオチドであっても、脱保護を受けていない完全に保護されている合成オリゴヌクレオチドであってもよい。アフィニティークロマトグラフィーを含むが、これに限定されない任意の分離方式を使用することができる。

【0040】

７．抗体の作製
有機保護基が共有結合している合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、前記有機保護基が共有結合していない場合には、前記合成オリゴヌクレオチドに結合しない抗体を作製する方法は、（ａ）有機保護基が共有結合した合成オリゴヌクレオチドを（好ましくは、例えば、スクシニルリンカーで共有結合している）固体粒状担体で合成するステップと、前記固体担体からオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドをはずすことなく、（ｂ）抗体を形成するのに十分な量の、固体担体に結合した合成オリゴヌクレオチドで動物を免疫するステップとを含む。また、有機保護基が結合している１つのヌクレオチドを固体粒状担体に結合してもよく、本明細書に上記するように使用することができる。

【0041】

合成ステップは、既知の技法により固体担体上で実施することができる。固体担体は合成前は粒状形態であってもよく、合成後は粒子に断片化されてもよい。一般に、固体担体は、全体が完全に固体であっても、多孔性であっても、変形可能であっても、または硬くてもよいビーズである。ビーズは、一般に、直径が少なくとも１０、２０または５０〜２５０、５００または２０００μｍであり、最も典型的には、直径５０〜２５０μｍである。セルロース、多孔性ガラス、シリカゲル、ジビニルベンゼンを架橋したポリスチレンビーズなどのポリスチレンビーズ、ポリエチレングリコール／ポリスチレンなどのグラフトコポリマービーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、ジメチルアクリルアミドビーズ、直鎖状ポリスチレンを接続した架橋ポリスチレンまたはフッ素化エチレンポリマーなどの疎水性ポリマーをコーティングしたガラスビーズなどの複合体等を含む、任意の便利な組成物を固体担体に使用することができる。粒子またはビーズなどの離れた別個の個体担体を使用する場合には、それらは、一般に、総反応混合物の約１〜９９重量パーセントを含む。

【0042】

好ましい実施態様において、合成ステップの次で、免疫ステップの前に、固体担体を（例えば、粉砕によって）断片化するステップを実施する。ポリクローナル抗体を既知の技法により動物の血清から回収するか、または脾臓細胞を動物から回収してもよく、複数のハイブリドーマ細胞系統を脾臓細胞から作製し、次いで抗体を作製する特定のハイブリドーマ細胞系統を複数のハイブリドーマ細胞系統から単離することができる。

【0043】

核酸および他の合成に使用される保護基に対する抗血清／ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する特定のプロトコールは、典型的には、以下のステップを含む。（ａ）保護基を含有する、または含有しないオリゴヌクレオチドおよび他を作製するステップ、（ｂ）そのような調製物で動物を免疫するステップ、（ｃ）保護基に対する抗体を示すものを同定するために動物をスクリーニングするステップ、（ｄ）典型的な融合方法によってモノクローナル抗体を作製するステップと、（ｅ）必要に応じて、抗体操作によってｓｃＦａｂ、Ｆａｂ断片および抗体分子全体を作製するステップ、および（ｆ）保護基に対するモノクローナル抗体を評価し、特徴づけるステップ。これらのステップの各々は以下にさらに詳細に考察されている。

【0044】

保護基を含有する合成オリゴヌクレオチドは、当業者に既知の種々の方法で合成することができる。例えば、細孔性ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ））ビーズに接続している個々のヌクレオチドに保護基を結合することができる。例として以下が挙げられる：
ＣＰＧビーズ−ｄＴ（ＤＭＴ基のみ）。

【0045】

別の方法として、ＣＰＧビーズに接続しているオリゴヌクレオチド鎖に保護基を結合することができる。例として以下が挙げられる：
Ｂｚ−ｄＣおよびＩｂｕ−ｄＧによるＰａｃ−ｄＡ−Ｐａｃ−ｄＡ−ＣＰＧ
ビーズ、
Ｂｚ−ｄＣおよびＩｂｕ−ｄＧによるＩｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−Ｉｐｒ−Ｐａ
ｃ−ｄＧ−ＣＰＧビーズ、
Ｂｚ−ｄＣおよびＩｂｕ−ｄＧによるＡｃ−ｄＣ−Ａｃ−ｄＣ−ＣＰＧビー
ズ、
Ｂｚ−ｄＣおよびＩｂｕ−ｄＧによるｄｍｆ−Ｇ−ｄｍｆ−Ｇ−ＣＰＧビー
ズ、および
上記の４つのオリゴヌクレオチドの混合物。

【0046】

さらに別の方法では、部分的に脱保護されているオリゴヌクレオチド鎖に保護基を結合してもよい（脱保護手法は以下に詳細に記載されている）。例として以下が挙げられる：
ポリｄＴ２０ｍｅｒｓ（ＤＭＴ基のみ）、
ポリｄＴ２０ｍｅｒｓ（シアノエチル基のみ）、
ポリＩｂｕ−ｄＧ２０ｍｅｒｓ（部分的に脱保護されている）、
ポリＩｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ２０ｍｅｒｓ（部分的に脱保護されている）、
ポリＢｚ−ｄＣ２０ｍｅｒｓ（部分的に脱保護されている）、
ポリＰａｃ−ｄＡ２０ｍｅｒｓ（部分的に脱保護されている）、および
ポリＡｃ−ｄＣ２０ｍｅｒｓ（部分的に脱保護されている）。

【0047】

本明細書に記載されているように生成される合成オリゴヌクレオチドは以下のように部分的に脱保護することができる：（ａ）合成ポリヌクレオチドに３０％水酸化アンモニウム溶液を添加し、次いで室温において異なる時間インキュベーションし（５、１０および３０分）、（ｂ）処理したオリゴマーのアンモニウム溶液を取り、アンモニウム対酢酸１：４比により１：１希釈し、４℃に事前に冷却した酢酸に添加し、（ｃ）氷浴で３０分試料を維持し、（ｄ）スピード−Ｖａｃで試料を乾燥し、（ｅ）乾燥したペレットを水に溶解し、（ｆ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムで試料を脱塩し、（ｇ）スピード−Ｖａｃで試料を乾燥し、（ｈ）脱塩した試料を水に溶解する。

【0048】

本明細書に記載されているように生成される合成オリゴヌクレオチドは任意の好適な技法によって完全に脱保護することができる。１つの特定の技法は以下のようである：（ａ）合成オリゴヌクレオチドに３０％水酸化アンモニウム溶液を添加し、次いで６５℃において６時間インキュベーションし、（ｂ）スピード−Ｖａｃで試料を乾燥し、（ｃ）乾燥したペレットを水に溶解し、（ｄ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムで試料を脱塩し、（ｅ）スピード−Ｖａｃで試料を乾燥し、（ｆ）脱塩した試料を水に溶解する。

【0049】

部分的および完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドは、さらに使用するために、または手法を証明するために、ゲル電気泳動、尿素−アクリルアミドゲル電気泳動、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる５’末端標識、ＨＰＬＣ分析、質量分析法等を含むが、これらに限定されない任意の好適な手段によって、特徴づけることができる。

【0050】

滅菌生理食塩溶液などの好適な担体にオリゴヌクレオチドを加えたものの非経口注射によって上記のオリゴヌクレオチドで好適な動物を免疫することができる。注射は、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内等を含むが、これらに限定されない任意の好適な経路によってもよい。好適な動物は、典型的には、マウス、ウサギ、ラット等を含む哺乳類である。

【0051】

特定の実施態様において、モノクローナル抗体を作製するためには、若い雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用し、抗原物質注射の時間経過は以下のようにする：
初日 最初の注射
１４日め 最初の追加免疫投与
２８日め ２回めの追加免疫投与
融合４日前 最後の追加免疫投与
望ましい場合には、追加の注射を使用してもよい。抗原量は、１回あたり各マウスについて、５０μｇまたは１００μｇの未保護（対照抗体用）または保護オリゴヌクレオチドであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチド合成の担体として使用されるビーズまたは他の個体担体が動物に注射される場合には、ビーズまたは粒子は水に懸濁され、次いでマウスに注射される。ヌクレオチド溶液を使用する場合には、溶液をフロイントの完全または不完全アジュバントと混合し、マウスに注射する。

【0052】

ポリクローナル抗体は、既知の技法により上記のように免疫または接種した動物から回収することができ、または既知の技法により、脾臓細胞を動物から回収し、ハイブリドーマ細胞系統を脾臓細胞から作製し、ハイブリドーマ細胞系統を望ましい抗体の作製についてスクリーニングすることができる。

【0053】

３’または５’末端にビオチン分子を含有するまたは含有しないオリゴヌクレオチド（以下に記載するＥＬＩＳＡアッセイ用）は標準的な技法により合成することができる。例として以下が挙げられる：
ポリＩｂｕ−ｄＧ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）
ポリＩｂｕ−ｄＡ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）
ポリＩｂｕ−ｄＣ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）
ポリＩｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）
ポリＢｚ−ｄＣ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）
ポリＢｚ−ｄＡ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）
ポリｄＴ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）
ポリＰａｃ−ｄＡ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）
ポリＡｃ−ｄＣ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）、および
ポリｄｍｆ−Ｇ２０ｍｅｒｓ（ビオチン有または無）。

【0054】

上記のように作製される抗体は、その結合特性を測定するために、ウェスタンブロットおよびイムノドット−ブロットを含むが、これらに限定されない任意の好適な技法によって特徴づけることができる。

【0055】

ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を使用する以外に、本発明は、組み換えＤＮＡによる抗体の作製、すなわち「抗体操作」技法を含む。例えば、ハイブリドーマ細胞から単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用することができ、抗体全体または抗体断片（例えば、ｓｃＦａｂまたはＦａｂ断片）をコードする配列を単離し、好適な発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを、抗体をコードする単離したｃＤＮＡを発現する宿主細胞に挿入することができる。

【0056】

モノクローナルＦａｂ断片を、当業者に既知の組み換え技法によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で作製することができる。例えば、Ｗ．Ｈｕｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６，１２７５−８１（１９８９）参照。

【0057】

８．抗体のスクリーニング
保護基特異的抗体についての血清およびハイブリドーマ細胞培養培地のスクリーニングは以下のように実施することができる。

【0058】

Ａ．血清
１．固体担体に（直接またはオリゴマーを介して）接続した保護基を接種する予定のマウスから免疫前（免疫する前）血清を標準的な手段によって採取する。
２．接種後血清も採取する。
３．特異的な保護基が、マイクロタイタープレートに結合されたビオチン化オリゴヌクレオチドに残存するＥＬＩＳＡアッセイを実施する。他のマイクロタイタープレートウェルは、保護基のない対照オリゴマーまたは他の保護基のオリゴヌクレオチドを含有する。二次抗体は、抗体を可視化するためにホスファターゼがコンジュゲートされているヤギ抗マウスＩｇＧである。
４．特異的な保護基に対して陽性の活性を有するマウスに追加抗原投与し、ハイブリドーマを作製するために犠牲にした。

【0059】

Ｂ．ハイブリドーマ細胞培養培地
１．約１００の培養物を各脾臓ハイブリッド細胞生成物から作製した。
２．培養物をマイクロタイタープレートウェル、９６ウェルプレートで増殖する。
３．培養培地を各ウェルから除去し、上記のように、〜１０００マイクロタイタープレートウェルの各々がプレートに結合された保護されたオリゴヌクレオチドを含有するＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
４．陽性の活性を有する抗体を産生する培養物をより大型の培養ウェル、２４ウェルマイクロタイタープレートに移した。
５．大型の培養物の培養培地を、保護基に対する活性について再度試験し、特異性についてもアッセイする；すなわち、保護基がないものおよび他の保護基の対照。
６．陽性である培養物を分離（希釈）し、再度試験し、各最終培養が１細胞の結果となる点；すなわち、モノカルチャーまで再度分離した。これらの最終培養物の培地を特異性および親和性について十分に評価する。特異性および親和性はドット−ブロットアッセイを使用して評価する。

【0060】

Ｃ．ＥＬＩＳＡアッセイの代わりのドット−ブロットアッセイ
１．一部の保護基に対する抗体は、マイクロタイタープレートウェル環境において試験するのに扱い難く、ドット−ブロットアッセイを使用して試験する必要がある。一例は、５’−末端保護基、ジメチル−トリチル（ＤＭＴ）である。
２．ニトロセルロース膜でのドット−ブロットアッセイは、ほとんどの目的のための用途において別の文献に記載されているように実施される。しかし、利用できる培地が少量しかない〜１０００マイクロタイターウェル培養物により抗体産生を評価する際にはこれは不可能である。従って、新規改良法が開発された。
ａ）保護されているオリゴヌクレオチドを、ＵＶ−架橋を使用してニトロセルロースにドット状に結合する。ＤＭＴの場合には、膜上の５’−ＤＭＴの存在は弱酸でドットを処理することによって確認され、反転は黄色−橙色に変わる。３’−ビオチンの存在は市販のアビジン染色で確認することができる。
ｂ）膜をブロックする（ドット−ブロットアッセイ参照）。
ｃ）乾燥した膜のドットを慎重に印をつけ（鉛筆）、膜から「くりぬく」。
ｃ）個々のドットを、個々のマイクロタイタープレートウェルの細胞培養培地
に加えてインキュベーションする。
ｄ）個々のドットを取り、洗浄し、二次抗体、ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈ
ｏｔａｓｅ）反応を実施し、適当な試薬を用いたマイクロタイタープレートウェ
ルを使用して呈色させる。
ｅ）陽性のドットを、少量の培養培地を得た元のマイクロタイタープレートウ
ェル培養物に戻って関連させる。
ｆ）さらに培養および分離をＢに記載するように実施する。

【0061】

９．マイクロアレイの試験
本発明は、マイクロアレイなどの固体支持体に固定したオリゴヌクレオチドを、固体担体で合成したオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護または伸長について試験またはスクリーニングするために使用することができる。

【0062】

本発明を実施するために使用される固体担体は、典型的には、別個の固体担体である。別個の固体担体は物理的に互いに離れていても、または単一構造基板の表面部分の別個の領域であってもよい。このような「チップ型」または「ピン型」固体担体は既知である。例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇに付与された米国特許第５，１４３，８５４号、Ｅｌｌｍａｎに付与された米国特許第５，２８８，５１４号（ピン型担体）、Ｆｏｄｏｒらに付与された米国特許第５，５１０，２７０号（チップ型担体）を参照。本発明を実施するために使用することができるオリゴヌクレオチドアレイの別の限定するものではない例およびこれらを製造する方法は、米国特許第５，６３１，７３４号、同第５，５９９，６９５号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５１０，２７０号、同第５
，５７１，６３９号、同第６，０５６，９２６号、同第５，４４５，９３４号および同第５，７０３，２２３号に記載されているものを含むが、これらに限定されない。このような装置は、本発明を実施するためにそこに記載されているように使用することができる。

【0063】

アレイを形成する固体担体または基板は、ケイ素を含む任意の好適な物質を含んでもよい。オリゴヌクレオチドはマイクロアレイ上のin situでモノマー（または個々のヌクレオチド）からin situ重合または成長（ｇｒｏｗｎ）させてもよく（この場合には、固体担体を分析装置に通過させることができないので、保護基を検出するのに現在利用可能な技法のどれも、アレイ上のオリゴヌクレオチドの不完全な脱保護または伸長を検出するのに有用ではない）、またはオリゴヌクレオチドを別に重合し、次いで固体担体の適当な領域に接続してもよい。アレイは、異なる離れた別個の領域に任意の数の異なるオリゴヌクレオチドを含んでもよく、例として、異なる離れた別個の領域に少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも１０，０００または少なくとも２０，０００の異なる
オリゴヌクレオチドのアレイを含む。

【0064】

一般に、オリゴヌクレオチドの不十分な脱保護または不十分な伸長についてオリゴヌクレオチドアレイをスクリーニングする方法は以下のステップを含む。
（ａ）上記のオリゴヌクレオチドアレイを提供するステップ、
（ｂ）上記の抗体（すなわち、有機保護基が共有結合した合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、前記有機保護基が共有結合していない場合には、前記合成オリゴヌクレオチドに結合しない抗体）を提供するステップであって、好ましくは、抗体は、そのアレイが保有するオリゴヌクレオチドの有機合成過程中に保護基が使用される場合に、有機保護基を有するオリゴヌクレオチドに特異的に結合するステップ、次いで
（ｃ）前記抗体に前記オリゴヌクレオチドアレイを接触させ、それによってオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護または不十分な伸長の存在を検出するステップであって、定性的であっても、定量的であってもよいこのような検出は上記の任意の好適なイムノアッセイ技法によって実施することができるステップ。

【0065】

本発明の方法において、ステップ（ｂ）〜（ｃ）を、各反復時に異なる抗体を用いて少なくとも１回反復してもよく、その結果、アレイ中のオリゴヌクレオチドに存在することがある複数の異なる保護基を検出することができる。

【0066】

好ましくは、離れた別個の領域の１つ以上（例えば、複数）のオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護（保護基が存在する）が一旦検出されたら、本発明の方法は、アレイの少なくとも１つの離れた別個の位置（または複数の離れた別個の位置）のオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護または不十分な伸長の存在を記録する記録または証拠を作成するステップをさらに含む。証拠は、（不十分な伸長を含む）不十分な脱保護の定性的または定量的証拠であってもよい。

【0067】

上記の方法は、図１１に例示する補正可能なオリゴヌクレオチドアレイを提供する。アレイは、
（ａ）複数の異なるオリゴヌクレオチドが固定された基板３０であって、前記異なるオリゴヌクレオチドが前記基板の異なる離れた別個の位置３１に固定されている基板３０と、
（ｂ）前記アレイに関連する複数の証拠であって、これらの証拠は複数の異なるオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護または不十分な伸長の存在を記録し、前記異なるオリゴヌクレオチドは前記アレイの離れた別個の位置に位置づけられている証拠とを組み合わせて含む。これらの証拠は、マイクロリソグラフィーなどの技法によってアレイ３２の領域に印刷されてもよく、紙などの従来の媒体に印刷されて、アレイとともに出荷されてもよく、アレイチップ（位置３２に組み込まれてもよい）に接続されたまたはアレイチップに形成されたメモリーまたは記憶装置に収納されてもよく、フロッピー（登録商標）ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなどのコンピュータ読み取り可能な媒体に提供することができる別のデータまたはコンピュータファイルの形態で提供されてもよく、アレイのエンドユーザーによるダウンロードのためにワールドワイドウェブのウェブサイトに格納されてもよい。証拠が別のデータファイルの形態で提供される場合には、アレイは、好ましくは、アレイに形成される、またはアレイに接続されるまたはアレイに関連するコード番号などの識別子(identifier)をさらに含む（例えば、アレイを含む包装に印刷される、またはアレイと共に包装されるインフォメーションシートに印刷される、および／またはアレイに直接印刷される）。不十分な脱保護および／または伸長の記録を含む正しい証拠が、アレイの最終的なエンドユーザーによってアレイに最終的に関連づけられることを保証するために、識別子を別の証拠に関連づけることができる（例えば、データシートに印刷する、コンピュータファイルのパスワード、ファイル識別子および/またはアクセスコード等として使用する）。

【0068】

米国特許第５，９２５，５６２号、同第６，０１７，４９６号、同第５，７５１，６２９号および同第５，７４１，４６２号に記載されているように、アレイに接続したデータ装置または記憶装置を既知の技法により実施することができ、本発明を実施するためにこのような装置をそこに記載されているように使用することができる。

【0069】

アレイのエンドユーザーは、
（ａ）上記の基板を提供するステップ、
（ｂ）上記の前記アレイに関連する少なくとも１つまたは複数の証拠を提供するステップ、
（ｃ）試験化合物を提供するステップであって、試験化合物は、試験化合物ライブラリーのメンバーであっても、タンパク質、ペプチドまたはオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡ）などの任意の好適な化合物であってもよいステップ、
（ｄ）（例えば、アレイに試験化合物を接触させることによって）前記複数の異なるオリゴヌクレオチドの少なくとも１つへの前記試験化合物の結合を検出するステップ、次いで、
（ｄ）（ｉ）前記検出された結合、および（ｉｉ）不十分な脱保護または不十分な伸長の存在を記録する前記証拠から、アレイの１つ以上のオリゴヌクレオチドへの試験化合物の結合の程度（単に、結合の有無を含む）を検出し、測定するステップを含む方法において、前記アレイのオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護または不十分な伸長を補正するために上記の証拠を使用することができる。従って、アレイの１つ以上の位置のオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護または不十分な伸長は、測定ステップ中に補正することができる。このような補正は、アレイの特定の離れた別個の領域を無視することを含む（例えば、同じオリゴヌクレオチドを含有するアレイの他の離れた別個の領域を支持する）、任意の手段によって実施することができる。別の例では、１つ以上の位置が不十分な脱保護または伸長を含有し、それによってそのような位置への結合が減少する場合には、記録されている証拠によって対照を可能にしない場合に示されるものより大きい結合を示すために、そのアレイを用いた実験から誘導される結合データをそれらの位置について上向きに調整することができる。検出または測定ステップは、結合の程度の呈色表示を形成する、結合の程度の数値表示を形成する、結合の程度のグラフまたは他の記号表示を形成する等などの任意の好適な手段によって実施することができる。結合の程度は、結合親和性、結合量、または結合親和性と結合量の両方であるが、典型的には、アレイの特定の離れた別個の領域に結合する試験化合物の量の表示である結合の表示であってもよい。

【0070】

本発明は、限定することを意図するものではない、以下の実施例においてさらに詳細に説明されている。

【0071】

［実施例１］
オリゴヌクレオチドの合成
合成は、製造業者のプロトコールに従い、ＡＢＩ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、モデル３９４（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）で実施した。合成中、わずかに改良した１マイクロモルスケールサイクルを使用した（製造業者の取り扱い説明書参照）。主な出発物質（および供給業者／製造業者は括弧内に記載されている）は以下のようであった。
アクティベーター（０．４５Ｍ テトラゾールのアセトニトリル溶液）、ＣＡＰ Ａ（無水酢酸／テトラヒドロフラン／２，６ルチジン），ＣＡＰ Ｂ（Ｎ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン）および酸化剤（０．０２Ｍヨウ素／ピリジン／ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ）（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ） Ｐａｃ−ｄＡ（５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホールアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ（５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ｐ−イソプロピル−フェノキシアセチル−２’−グアノシン、３’ −［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホールアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
Ａｃ−ｄＣ（５’−ジメトキシトリチル−アセチル−２’−デオキシシチジン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホールアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
ｄｍｆ−Ｇ（５’−ジメトキシトリチル−ジメチルホルムアミジン−グアノシン、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホールアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
Ｂｚ−ｄＣ−ＣＰＧビーズ（５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホールアミダイト−スクシニルリンカー−ビーズ（３０００Ａｎｇ）（ＣＰＧ Ｉｎｃ．）
Ｉｂｕ−ｄＧ−ＣＰＧビーズ（５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−イソブチル−２’−デオキシシチジン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホールアミダイト−スクシニルリンカー−ビーズ（３０００Ａｎｇ）（ＣＰＧ Ｉｎｃ．）

【0072】

以下の化合物を合成した。化合物は以下に示すビーズに結合した：
Ｐａｃ−ｄＡ−Ｐａｃ−ｄＡ−Ｂｚ−ｄＣ−スクシニルリンカー−ビーズ
Ｐａｃ−ｄＡ−Ｐａｃ−ｄＡ−Ｉｂｕ−ｄＧ−スクシニルリンカー−ビーズ
Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−Ｂｚ−ｄＣ−スクシニルリンカー−ビーズ
Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−Ｉｂｕ−ｄＧ−スクシニルリンカー−ビーズ
Ａｃ−ｄＣ−Ａｃ−ｄＣ−Ｂｚ−ｄＣ−スクシニルリンカー−ビーズ
Ａｃ−ｄＣ−Ａｃ−ｄＣ−Ｉｂｕ−ｄＧ−スクシニルリンカー−ビーズ
ｄｍｆ−Ｇ−ｄｍｆ−Ｇ−Ｂｚ−ｄＣ−スクシニルリンカー−ビーズ
ｄｍｆ−Ｇ−ｄｍｆ−Ｇ−Ｉｂｕ−ｄＧ−スクシニルリンカー−ビーズ。

【0073】

上記の化合物は、以下の実施例２にさらに記載されているように、抗体を作製するために、オリゴヌクレオチドを固体担体から分離することなく、免疫原として動物に直接投与した。

【0074】

［実施例２］
動物の接種
８〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡから購入した。マウスは、フィルターキャップ付きのケージで飼育した。

【0075】

オリゴヌクレオチド鎖の合成を実施例１に記載されているように実施したら、ガラス板の間にビーズを置いて、ガラス板を手で押してヌクレオチド付きビーズをやさしく粉砕した。

【0076】

上記の８つのオリゴヌクレオチドの各々５μＭを４ｍｌのＰＢＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを１００ｍＭリン酸緩衝液に加えたもの、ｐＨ７．２）に混合した。

【0077】

混合物を十分に撹拌して、粉砕したビーズを懸濁させた。撹拌した混合物１５０μＬを取り、注射筒のＰＢＳ３００μＬに添加した。注射直前に、破壊したビーズを懸濁させるために、注射筒を振とうすることによって、ビーズを含有する溶液を再度混合した。次いで、十分に混合した溶液の１５０μＬまたは３００μＬをマウスの腹腔内に注射した。この手法を最初の注射と以下の追加抗原投与に使用した。
注射時間スケジュール
注射 日数（日）
１回め ０
２回め １４日め
３回め ２８日め
４回め ４２日め
５回め ５６日め
６回め ７０日め
７回め ８４日め
８回め ９８日め
９回め １１２日め
１０回め １３８日め
１１回め（最後、融合の４日前） １４２日め

【0078】

最後の注射の４日後、脾臓細胞を動物から採取し、ハイブリドーマ細胞系統を作製するために既知の技法により骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ．６３．Ａｇ８．６５３）と融合し、次いで特定の細胞系統を単離し、本発明の望ましい抗体を作製するために、以下に記載する特徴であるかどうかを判定するためにスクリーニングした。

【0079】

［実施例３］
抗体の特徴づけのためのイムノドット−ブロットアッセイ
イムノドット−ブロットアッセイは膜の紙へのオリゴヌクレオチドのＵＶ架橋に関係し、生成物オリゴマーの保護基を検出、同定および定量するための試験キットに直接適用することができる。この手法は以下のように実施することができる：（ａ）ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．２；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で膜の紙を濡らす、（ｂ）減圧下で膜の紙に試験対象のオリゴヌクレオチドをドットする、（ｃ）膜の紙にヌクレオチドをＵＶ架橋する、（ｄ）室温において２時間または４℃において終夜１％カゼイン−ＴＢＳＴ（ＴＢＳプラスＴｗｅｅｎ２０，０．１容量％）で膜の紙をブロックする、（ｅ）ＴＢＳＴで各々１５分ずつ３回膜を洗浄する、（ｆ）室温においてプレートを試験対象の試料（１％カゼイン−ＴＢＳＴで希釈）と共に１時間インキュベーションすることによって抗原−抗体複合体を形成する、（ｇ）上記のように洗浄する、（ｈ）室温において１時間第２抗体接合体（１％カゼイン−ＴＢＳＴで希釈）と反応させる、（ｉ）上記のように洗浄する、（ｊ）膜を基板溶液と共にインキュベーションすることによって呈色反応を形成する。

【0080】

［実施例４］
モノクローナル抗体１Ｈ１１のドット−ブロットアッセイ
上記の実施例２に記載するように作製したモノクローナル抗体１Ｈ１１をドット−ブロットアッセイによって特徴づけた。結果は、図１の棒グラフとして示す。図１において、レーン（またはカラム）１および２は、それぞれ、６５℃において６時間および４℃において１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＰａｃ−ｄＡ２０ｍｅｒｓを示す。カラム３および４は、それぞれ、６５℃において６時間および１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＢｚ−ｄＣ２０ｍｅｒｓを示す。カラム５および６は、それぞれ、６５℃において６時間および１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＡｃ−ｄＣ２０ｍｅｒｓを示す。カラム７および８は、それぞれ、６５℃において６時間および１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＩｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ２０ｍｅｒｓを示す。カラム９および１０は、それぞれ、６５℃において６時間および１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＩｂｕ−ｄＧ２０ｍｅ
ｒｓを示す。カラム１１、１２および１３は、それぞれ、ＤＭＴ基だけおよびシアノエチル基だけを有する完全に脱保護されているオリゴｄＴ２０ｍｅｒｓを示す。抗体活性はＥＬＩＳＡの光学密度（４７９ｎｍ）として示し（以下の実施例７）、ドット−ブロットアッセイの陽性または陰性の結果は、棒グラフの各カラムの上方の白丸または黒丸で示してある。モノクローナル抗体１Ｈ１１の活性はカラム１０ではオリゴＩｂｕ−ｄＧ２０ｍｅｒに選択的に結合していることに注目すべきである。

【0081】

［実施例５］
モノクローナル抗体７Ｈ３のドット−ブロットアッセイ
上記の実施例２に記載するように作製したモノクローナル抗体７Ｈ３を、上記の実施例３に記載するドット−ブロットアッセイによって特徴づけた。結果は、図１の棒グラフとして示す。図１において、レーン（またはカラム）１および２は、それぞれ、６５℃において６時間および４℃において１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＰａｃ−ｄＡ２０ｍｅｒｓを示す。カラム３および４は、それぞれ、６５℃において６時間および１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＢｚ−ｄＣ２０ｍｅｒｓを示す。カラム５および６は、それぞれ、６５℃において６時間および１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＡｃ−ｄＣ２０ｍｅｒｓを示す。カラム７および８は、それぞれ、６５℃において６時間および１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＩｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ２０ｍｅｒｓを示す。カラム９および１
０は、それぞれ、６５℃において６時間および１５分間ＮＨ₄ＯＨで処理したオリゴＩｂｕ−ｄＧ２０ｍｅｒｓを示す。カラム１１、１２および１３は、それぞれ、ＤＭＴ基だけおよびシアノエチル基だけを有する完全に脱保護されているオリゴｄＴ２０ｍｅｒｓを示す。抗体活性は上記の光学密度として示し、ドット−ブロットアッセイの陽性または陰性の結果は、棒グラフの各カラムの上方の白丸または黒丸で示してある。モノクローナル抗体１Ｈ１１の活性はカラム４ではオリゴＢｚ−ｄＣ２０ｍｅｒに選択的に結合していることに注目すべきである。

【0082】

［実施例６］
抗体を特徴づけるためのウェスタンブロットアッセイ
ウェスタンブロットアッセイは、オリゴヌクレオチドのゲルから膜の紙への低電圧移動およびオリゴヌクレオチドの膜へのＵＶ架橋に関係する。このアッセイは以下のように実施することができる：（ａ）１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含有する１５％未変性ゲルを注ぐ、（ｂ）ゲルのウェルにオリゴヌクレオチド（オリゴマー）をロードする、（ｃ）氷浴中で２００ボルトでゲルを泳動する、（ｄ）氷浴中で２５ボルトで２５分間ゲルから膜の紙にオリゴヌクレオチドを移動させる、（ｅ）膜にヌクレオチドをＵＶ架橋する、（ｆ）室温において２時間または４℃において終夜１％カゼイン−ＴＢＳＴで膜の紙をブロックする、（ｇ）ＴＢＳＴで各々１５分ずつ３回膜を洗浄する、（ｈ）室温において試験対象の試料（１％カゼイン−ＴＢＳＴで希釈）を１時間インキュベーションする、（ｉ）上記のように洗浄する、（ｊ）室温において１時間膜を第２抗体接合体（１％カゼイン−ＴＢＳＴで希釈）と共にインキュベーションする、（ｋ）上記のように洗浄する、（ｌ）膜を基板溶液と共にインキュベーションすることによって呈色を形成する。

【0083】

［実施例７］
抗原としてビオチン化ポリヌクレオチドを使用した抗体の検出およびストレプトアビジン−ビオチン系に関係するＥＬＩＳＡ
抗体を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は以下のように実施する：（ａ）ストレプトアビジンを事前にコーティングしたマイクロタイタープレートを事前スクリーニングする、（ｂ）試験対象のビオチン化オリゴヌクレオチドまたは他の物質（濃度５μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液）（ＰＢＳ：１５ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）の調製物でプレートをコーティングし、次いで室温において２時間インキュベーションする、（ｃ）０．１％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）で各々１５分ずつ３回を洗浄する、（ｄ）室温において時間または４℃において終夜１％カゼインのＰＢＳＴ溶液でブロックする、（ｅ）上記のように洗浄する、（ｆ）プレートを抗体と共に室温において１時間インキュベーションすることによって抗原−抗体複合体を形成する
、（ｇ）上記のように洗浄する、（ｆ）室温において１時間第２抗体−ペルオキシダーゼ接合体（１％カゼイン−ＰＢＳＴ溶液）と反応させる、（ｉ）上記のように洗浄する、（ｊ）テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（ＴＭＢ溶液：４２ｍＭ ＴＭＢ、０．００４％Ｈ₂Ｏ₂、０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．６）を添加し、室温において１５分間インキュベーションし、次いで２ＭＨ₂ＳＯ₄で反応を停止することによって呈色反応を形成する、（ｋ）４６９ｎｍの吸光度値を読む。

【0084】

［実施例８］
ベンゾイル、イソブチリルおよびイソプロピルフェノキシアセチルに対するモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡおよびドット−ブロットアッセイ
上記の実施例２に記載するように作製した、保護基ベンゾイル（Ｂｚ）、イソブチリル（ｉｂｕ）およびイソプロピルフェノキシアセチル（ｉｐｒ−Ｐａｃ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、上記の実施例３に記載する、標準的なＥＬＩＳＡアッセイおよびドット−ブロットアッセイによって特徴づけた。９６−ウェルマイクロタイタープレートに各々結合した２０残基のビオチン化核酸で展開したＥＬＩＳＡアッセイは、それぞれの抗原に対する抗体の特異性を証明した。図３Ａ、図４Ａおよび図５Ａは、それぞれ、Ｂｚ、ｉｂｕおよびｉｐｒ−Ｐａｃに対するモノクローナル抗体の結果を示す。図は、オリゴｄＣ（Ｂｚ）と名づけられる、すなわち、最初はＢｚで保護されていた、完全に脱保護されている（＜１％Ｂｚ残存）ｄＣ残基のホモポリマー（レーン１、白ぬきの棒）、保護されている（＞９７％Ｂｚ残存）オリゴＢｚ−ｄＣ（レーン２、影つきの棒）、完全に（＜１％ｉｐｒ−Ｐａｃ残存）脱保護されているオリゴｄＧ（ｉｐｒ−Ｐ
ａｃ）（レーン３）、保護されている（＞７６％ｉｐｒ−Ｐａｃ）オリゴｉｐｒ−ＰａｃｄＧ（レーン４）、完全に（＜１％ｉｂｕ残存）脱保護されているオリゴｄＧ（ｉｂｕ）（レーン５）、保護されている（＞９１％ｉｂｕ残存）オリゴｉｂｕ−ｄＧ（レーン６）および完全に脱保護されているオリゴｄＴ（レーン７）を示す。ｄＴポリマーは、１つの保護基以外に、弱酸で５’−末端残基の５’ＯＨから除去されるジメチルトリチル（ＤＭＴ）を有した。最後にレーン８は、ＤＭＴが残存するオリゴｄＴを示す。

【0085】

２０ｍｅｒのＤＮＡｓをニトロセルロース膜にＵＶで結合した、抗ＢｚｍＡｂ、抗ｉｂｕｍＡｂおよび抗ｉｐｒ−ＰａｃｍＡｂのドット−ブロットアッセイを実施した。膜に適用した２０ｍｅｒＤＮＡの量を図３Ｂ、図４Ｂおよび図５Ｂの右に示し、アッセイ感度のレベルを証明する。抗ＢｚｍＡｂを試験するために使用したＤＮＡｓは、ＥＬＩＳＡについて記載したものプラス脱保護されているオリゴｄＡ（Ｂｚ）、保護されているオリゴＢｚ−ｄＡ、オリゴｄＣ（ｉｂｕ）、オリゴｉｂｕ−ｄＣ、オリゴｄＡ（ｉｂｕ）およびオリゴｉｂｕ−ｄＡであった。図３Ｂは、抗ＢｚｍＡｂはｄＡおよびｄＣの保護基を認識したことを示している。抗ｉｂｕｍＡｂを試験するために使用したＤＮＡｓは、ＥＬＩＳＡについて記載したものプラス保護されているオリゴｉｂｕ−ｄＡ、脱保護されているオリ
ゴｄＡ（ｉｂｕ）、オリゴｉｂｕ−ｄＣ、オリゴｄＣ（ｉｂｕ）であり、全てドット−ブロットの上部に記載されている。図４Ｂは、抗ｉｂｕｍＡｂは、保護基のうち最も一般的な用途の、ｄＧのｉｂｕを認識したが、ｄＡでも認識したことを示している。抗ｉｐｒ−ＰａｃｍＡｂを試験するために使用したＤＮＡｓは、ＥＬＩＳＡについて記載したものプラス保護されているオリゴｉｂｕ−ｄＡ、脱保護されているオリゴｄＡ（ｉｂｕ）、オリゴｉｂｕ−ｄＣ（ｉｂｕ）、オリゴＢｚ ｄＡ（Ｂｚ）であり、全てドット−ブロットの上部に記載されている。図５Ｂは、抗ｉｐｒ−ＰａｃｍＡｂは、保護基のうち最も一般的な用途の、ｄＧのｉｐｒ−Ｐａｃを認識したが、ｄＡおよびｄＣでも認識したことを示している。ｍＡｂはまたｉｂｕ保護基を認識した（ｉｂｕ−ｄＧ、ｉｂｕ−ｄＡおよびｉｂ
ｕ−ｄＣ）。この交差反応は、抗体は、ｉｐｒ−Ｐａｃおよびｉｂｕに共通の化学、おそらくＣＨ（ＣＨ₃）₂の識別に選択性が高いことを示している。従って、抗ｉｂｕおよび抗ｉｐｒ−ＰａｃｍＡｂｓは、オリゴに残存する保護基を同定するために組み合わせて使用することができると思われる。

【0086】

抗ｉｂｕｍＡｂのドット−ブロットアッセイには大量のＤＮＡを試験した（図４Ｃ）。この実験の結果は、ｉｂｕ保護基は、どの核塩基が保護されているかにかかわらず、ｍＡｂによって認識されることを証明した。

【0087】

図３Ｃ、図４Ｃおよび図５Ｃは、部分的に脱保護されたオリゴマーを再処理して、残存する保護基を除去し、ｍＡｂで再試験することができることを証明している。図３Ｃは、抗ＢｚｍＡｂは再度脱保護されたオリゴマーオリゴＢｚ−ｄＣを認識したことを示している（中央のカラム）。同様に、図４Ｄは、抗ｉｂｕｍＡｂは再度脱保護されたオリゴマーオリゴｉｂｕ−ｄＧ（中央のカラム）を認識することを示し、図５Ｃは、抗ｉｐｒ−ＰａｃｍＡｂは再度脱保護されたオリゴマーオリゴｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧおよびオリゴｉｂｕ−ｄＧ（それぞれ、左から２番めおよび４番めのカラム）を認識することを示している。従って、この方法は、高価な核酸試料を破棄する必要なく、品質管理に適用可能である。

【0088】

保護基Ｂｚ、ｉｂｕおよびｉｐｒ−Ｐａｃを有するＲＮＡ標品を合成し、Ｂｚ（図３Ｄ）、ｉｂｕ（図４Ｅ）およびｉｐｒ−Ｐａｃ（図５Ｄ）に対するｍＡｂを用いた保護基の同定についてアッセイした。ドット−ブロットアッセイは、モノクローナル抗体はＲＮＡとＤＮＡを識別しないことを明らかに示している。ＲＮＡにはＤＮＡより高いバックグラウンドシグナルが存在したが、特に少量のＲＮＡでは保護基のあるＲＮＡと保護基のないＲＮＡには有意な差があった。膜のＲＮＡの量は試料の吸光度から推定した。

【0089】

［実施例９］
保護基のｍＡｂドット−ブロットアッセイとＨＰＬＣ
標準化した２０ｍｅｒのオリゴｄＣ分子に残存するＢｚ基のドット−ブロット検出を実施例３に記載するように実施した。完全に脱保護されたｄＣ２０ｍｅｒと未処理のｄＣ２０ｍｅｒを、全く独立した異なる定量方法を使用して分析した。２つのオリゴマーを構成ヌクレオシドに加水分解し、濃縮した試料を用いた認識されている高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して同定し、定量した。感度が悪いので、ＨＰＬＣ検出は、ｍＡｂアッセイに使用されるＢｚ−ｄＣの量の５０〜１００倍が必要であった（図７参照）。図６Ａは、保護されているオリゴＢｚ−ｄＣのｎｍｏｌｅ量のＢｚ基に対して試験した抗ＢｚｍＡｂの結果（右のカラム）およびＢｚ−ｄＣの同じｎｍｏｌｅ量のＢｚ−の結果（左のカラム）示す。各量のＢｚ−ｄＣオリゴを同じ鎖長（２０ｍｅｒ）の完全に脱保護されているｄＣオリゴで希釈して、２５００倍のｄＣが存在する場合でも（すなわち、０．０４％）ｍＡｂの検出感度があることを証明した。ｍＡｂアッセイは、ｍＡｂは、２５００倍過剰量のｄＣがＤＮＡ中に存在する場合でも、ＤＮＡのＢｚ基を検出することができることを証明した。

【0090】

ｍＡｂ応答を定量するために、図６Ａに示すドット−ブロットに濃度測定を実施した。バックグラウンドを引いた後、ＨＰＬＣで測定したオリゴＢｚ−ｄＣのＢｚ基の関数として残存する密度をプロットした（図６Ｂ）。データは、抗ＢｚｍＡｂ検出の高感度は０．１〜１．０ｎｍｏｌの範囲において直線状であることを示した。

【0091】

次に、ｍＡｂ応答が、ドット−ブロット膜のＤＮＡ量の増加に伴って増加するかどうかを測定した。Ｂｚの量は標準的なＨＰＬＣ方法で測定した。保護されている試料と脱保護されている試料の１／２５００の比の混合物中のＢｚ保護基の検出は、膜のＤＮＡの量を増加することによって増加するが、比は維持されることをこの実験は示した（図６Ｃ）。

【0092】

最後に、ＢｚのｍＡｂ検出とＨＰＬＣ検出の直接比較を示すために、実験を実施した。オリゴＢｚ−ｄＣ（２０ｍｅｒ）のｄＣのＢｚを検出するために抗ＢｚｍＡｂをドット−ブロットアッセイに使用した。ｍＡｂアッセイにより検出され、濃度測定によって定量されたＢｚ基の密度応答を、各ドットのＤＮＡのＢｚの量に対してプロットした（図７Ａ）。ＤＮＡ中のＢｚの量は、大量のＤＮＡの消化並びにＢｚ−ｄＣモノヌクレオシドのＨＰＬＣ同定および定量による分析によって較正した。ＨＰＬＣ実験では、３つのＢｚ−ｄＣオリゴ試料を加水分解し、ＨＰＬＣによって組成を分析した。ＵＶ−ダイオードアレイディテクターの応答を試料中のＢｚの量に対してプロットした（図７Ｂ）。試料の量は、既知量のＢｚ−ｄＣで「ピークを生じた（ｓｐｉｋｅｄ）」試料と比較することによって求めた。スパイク（ｓｐｉｋｅ）として試料に添加したＢｚ−ｄＣの量は、秤量し
たＢｚ−ｄＣストックによるものであった。従って、ＨＰＬＣ応答は、既知量のＢｚ−ｄＣを用いて較正した。これらの実験の結果は、抗ＢｚｍＡｂによるＢｚの検出はｐｍｏｌｅ範囲内であるが、ＢｚのＨＰＬＣ検出はｎｍｏｌｅ範囲に制限されることを示している。

【0093】

［実施例１０］
市販の試料中の残存保護基の検出
市販の試料中の残存保護基のｍＡｂによる検出を証明するために盲検検討を実施した。この実験の目的は、オリゴ合成業界において通常実施されているように処理されたおそらく完全に脱保護されている試料においてｍＡｂ技術で保護基を検出および同定できるかどうかを判定することであった。選択した８社によって使用されている保護基の性質は未知であったので、実験は盲検試験であった。８社の各々製の２つの２０ｍｅｒオリゴ（オリゴｄＡ−ｄＣおよびオリゴｄＧ−ｄＴ）を合成して、脱保護するように注文し、できるだけ理想的な条件下で塩を除去した。オリゴは通常どおり速達で出荷され、ドット−ブロットによるｍＡｂ分析を実施した。１社（＃６）とおそらくもう１社（＃２）製のｄＡ−ｄＣオリゴは、抗ＢｚｍＡｂ試験によって測定したとき、Ｂｚ保護基が残存していた（図８
Ａ）。２社（＃２および＃６）製のｄＧ−ｄＴオリゴは、抗ｉｐｒ−ＰａｃｍＡｂで測定したとき、ｉｐｒ−Ｐａｃ保護基が残存していた（図８Ｂ）。市販の試料中の残存保護基は、試料の量を増加し、さらに脱保護して再分析することによって確認した。＃２社および＃６社製のオリゴｄＡ−ｄＣ試料は、Ｂｚ保護基の存在を確認するためにより大量で試験した。また、標準的なプロトコールを使用して、残存する保護基を除去するために試料を処理した。さらに脱保護した後の再分析は、基は今度は除去されたことを示した（図８Ｃ）。これは、高価な核酸試料を再処理して保護基を除去すると、それらを破棄する必要がないことを証明している。オリゴｄＧ−ｄＴ試料を再処理して、残存する保護基を除去し、抗ｉｐｒ−ＰａｃｍＡｂで再分析すると、ｉｐｒ−Ｐａｃ基はＤＮＡを犠牲にするこ
となく除去されうるという結果が得られた（図８Ｄ）。

【0094】

ジメトリチルに対するポリクローナル抗体
５’末端保護基、ジメトリチル（ＤＭＴ）に対するポリクローナル抗体の作製および分析は実施例２に記載されているとおりであった。４匹のマウスにＤＭＴを接種し、数週間抗原で追加免疫投与してから、血清をマウスから採取した。ＤＭＴ［ＤＭＴ−ＯＨ］、デオキシヌクレオチドトリマーｄ（Ｔ）₃［（ＤＭＴ）₃−ｄ（Ｔ）₃］の５’−末端の３つのＤＭＴ、３’−ビオチンを有するデオキシヌクレオチド２０ｍｅｒ［（ＤＭＴ）₃−ｄ（Ｔ）₂₀−ビオチン］の５’−末端の３つのＤＭＴ、３’−ビオチンを有するデオキシヌクレオチド２０ｍｅｒ［ＤＭＴ−ｄ（Ｔ）₂₀−ビオチン］の５’−末端の１つのＤＭＴ、３’−ビオチンを有するｄＴ２０ｍｅｒ［ｄ（Ｔ）₂₀−ビオチン］，ビオチンを有するＤＭＴ［ＤＭＴ−ビオチン］の１つのＤＭＴおよびトリス−ボレート生理食塩液対照をニト
ロセルロース膜に適用し、次いで抗ＤＭＴ抗体を評価するためのマウス血清（接種マウス＃１〜４および対照血清、正常）、ＤＭＴの存在をあきらかにするための弱酸（ＴＢＳ）およびビオチンの存在を明らかにするためのアビジンを用いてアッセイした（図９）。マウス＃２および＃４の血清はＤＭＴ［（ＤＭＴ）₃−ｄ（Ｔ）₃として］を認識したが、＃１、＃３および正常なマウスは認識しなかった。弱酸は黄色としてＤＭＴの存在を明らかにし（図には示していない）、アビジンはビオチンの存在を明らかにした。

【0095】

上記は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の請求の範囲およびそこに含まれる請求の範囲の等価物によって規定される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】