特許 5753783 神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）およびその他の癌の治療に用いる腫瘍関連ペプチド組成物と関連抗癌ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5753783

(24)【登録日】2015年5月29日

(45)【発行日】2015年7月22日

(54)【発明の名称】神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）およびその他の癌の治療に用いる腫瘍関連ペプチド組成物と関連抗癌ワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/00 20060101AFI20150702BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20150702BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20150702BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150702BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20150702BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20150702BHJP

   C07K 14/435 20060101ALN20150702BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150702BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALN20150702BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/02

   A61K39/00 H

   A61K39/39

   A61P35/00

   !C07K7/06ZNA

   !C07K7/08

   !C07K14/435

   !C12N15/00 A

   !C12N5/00 202M

【請求項の数】10

【全頁数】84

(21)【出願番号】特願2011-529471(P2011-529471)

(86)(22)【出願日】2009年9月28日

(65)【公表番号】特表2012-504563(P2012-504563A)

(43)【公表日】2012年2月23日

(86)【国際出願番号】EP2009006979

(87)【国際公開番号】WO2010037513

(87)【国際公開日】20100408

【審査請求日】2012年3月26日

(31)【優先権主張番号】08017305.7

(32)【優先日】2008年10月1日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/105,970

(32)【優先日】2008年10月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506258073

【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100152319

【弁理士】

【氏名又は名称】曽我 亜紀

(72)【発明者】

【氏名】ショール，オリヴァー

(72)【発明者】

【氏名】ヒルフ，ノルベルト

(72)【発明者】

【氏名】ヴァインシェンク，トーニ

(72)【発明者】

【氏名】トラウトヴァイン，クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】ヴァルター，シュテッフェン

(72)【発明者】

【氏名】ジング，ハルプレート

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５０００３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１０９７５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 欧州特許出願公開第０１７６００８９（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０３５３５０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０２８５７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０６７０２３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ４１／００−４５／０８

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）ペプチドの全長が9〜30アミノ酸長である、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチドおよび配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むペプチドの少なくとも２つのペプチド、および／または
ｂ）ａ）に記載のペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容される担体
を含む、神経膠腫の予防または治療のための医薬組成物。

【請求項2】

配列番号３〜２０からなる群から１つ選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの付加的なペプチド、または配列番号３〜２０からなる群から１つ選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

ペプチドの全長は、9〜17アミノ酸長である、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

少なくとも１つのペプチドは非ペプチド結合を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも２つのペプチドを含む、または前記少なくとも２つのペプチドと共に配列番号３〜２０からなる群から１つ選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つの付加的なペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

神経膠腫の患者に有効なペプチドが選択され、および／または有効なペプチドの数量が含まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

1018 ISS、アルミニウム塩、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド、ImuFactIMP321、IS Patch、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、モノホスホリルリピドA、モンタニドIMS 1312、モンタニドISA206、モンタニドISA 50V、モンタニドISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTelベクター系、PLG微粒子、レシキモド、SRL172、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、YF-17DBCG、Aquila'sQS21 stimulon、Ribi's Detox. Quil、Superfos、フロイントアジュバント、GM-CSF、コレラ毒素、免疫学的アジュバント、MF59、およびサイトカインからなる群から選択される、少なくとも１つの適切なアジュバントをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

さらに少なくとも１つの抗原提示細胞または樹状細胞を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

少なくとも１つの抗原提示細胞または樹状細胞が、
a）ペプチドでパルスされているか、もしくは前記ペプチドを提示している、または
b）ペプチドをコードする発現構成物を含む、
請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

医薬組成物がワクチンとして、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、腫瘍内投与、経口投与、経皮投与、経鼻投与、頬側投与、直腸投与、経膣投与、吸入、または局所投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫療法で用いられるペプチドと、免疫療法、特に癌の免疫療法におけるその使用法に関する。本発明では、単独で、または他の腫瘍関連ペプチドと共に、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分として働く、腫瘍関連ヘルパーＴ細胞ペプチドのエピトープについて開示する。特に、本発明のペプチド組成物は、神経膠腫に対して抗腫瘍免疫応答を誘導するワクチン組成物に利用することができる。

【0002】

本発明の目的のため、本明細書で引用されている全ての参考文献が、その全体の参照として組み込まれている。

【背景技術】

【0003】

神経膠腫は神経系の膠細胞由来の脳腫瘍である。膠細胞は、一般に神経膠細胞、または単にグリアと呼ばれる非神経細胞であり、神経系において、神経細胞の維持と栄養補給、ホメオスタシスの維持、髄鞘（ミエリン）の構成を司り、神経伝達に関与している。神経膠腫の最も重要な2つのサブグループは、星状膠細胞腫と稀突起膠細胞腫であり、それらが由来する正常な膠細胞種である星状膠細胞、または稀突起膠細胞よりそれぞれ名前がつけられた。星状膠細胞腫のサブグループに属する多形性神経膠芽細胞腫（以下、神経膠芽細胞腫という）は、成人に最も多い悪性脳腫瘍であり、全悪性脳腫瘍の約40％、また、神経膠腫の約50％を占めている。神経膠芽細胞腫は中枢神経系（CNS）への浸潤が非常に強く、全神経膠腫中で最も高い悪性度（grade IV）に入る。神経膠腫の治療方法は、神経画像処理や顕微手術の改良、また、テモゾロミドや放射線など多岐にわたる治療が選択できるようになったことで着実に進歩してきているが、神経膠芽細胞腫は未だに不治の病である。この脳腫瘍の致死率は非常に高く、最初に診断されてからの平均余命は9〜12ヶ月である。1986年から1990年の観察期間中の5年生存率は8.0％であった。今日まで、腫瘍全摘出などの積極的治療法施行後の5年生存率は未だに10％未満である。そのため、これに代わりうる効果的な治療方法を求める医療ニーズは高い。

【0004】

神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞は、脳腫瘍の中で最も未分化であり、そのため遊走能および増殖能が高く、また浸潤性が高く、予後が極めて悪くなる。神経膠芽細胞腫は、脳内で急速に、侵攻的に、さらに浸潤的に発育するため、死につながっている。神経膠芽細胞腫は浸潤性発育型のため、本来摘出不能である。また、神経膠芽細胞腫は、比較的、放射線や化学療法に耐性を持つため、治療後の再発率が高い。さらに、これらの腫瘍細胞に対する免疫応答性には、摘出し放射線照射後、全腫瘍細胞を完全に根絶できるほどの効果はむしろない。

【0005】

神経膠芽細胞腫は、未分化星状膠細胞または神経膠前駆細胞の悪性転換過程での遺伝子メカニズムの違いによって、原発性神経膠芽細胞腫（de novo）と続発性神経膠芽細胞腫に分けられる。続発性神経膠芽細胞腫は、45歳までの若年層に発症する。続発性神経膠芽細胞腫は、平均して4年から5年の間に低悪性度の星状細胞腫から未分化星状細胞腫に進展する。対照的に、原発性神経膠芽細胞腫は老年層に圧倒的に多く発症し、平均年齢は55歳である。一般に、原発性神経膠芽細胞腫は劇症型神経膠芽細胞腫として発症し、臨床的または病理学的に異常のない状態から3ヶ月以内に腫瘍へと進行することで特徴付けられる。

【0006】

神経膠芽細胞腫は有髄神経に沿って移動し、中枢神経系内に広範囲に広がる。殆どの症例で、外科的治療でも治療効果の持続が限られている。

【0007】

悪性神経膠腫細胞は、T細胞の増殖と免疫を刺激するサイトカインIL-2産生を減弱させる免疫抑制物質を生成することにより、宿主の免疫系からの探知を逃れる。

【0008】

頭蓋内腫瘍は、脳、髄膜、脳下垂体、頭蓋骨、さらに胚組織の残りなど、CNSに存在するあらゆる構造や細胞型から発生しうる。米国における原発性脳腫瘍の年間総罹患件数は人口10万人に対して14例である。最も好発する原発性脳腫瘍は髄膜腫および神経膠芽細胞腫であり、髄膜腫は全原発性脳腫瘍の27％、神経膠芽細胞腫は23％を占める（ただし、成人の悪性脳腫瘍では、神経膠芽細胞腫が40％を占める）。これらの腫瘍の多くは侵攻性で、悪性度が高い。原発性脳腫瘍は小児に最も好発する固形腫瘍であり、小児癌の中では白血病に次いで2番目に多い死因となっている。

【0009】

神経膠芽細胞腫患者に対する効果的な治療方法の探究は今日もなお続けられている。これらの腫瘍細胞と戦うため、免疫療法すなわち免疫系の補充による治療法が研究されてきている。最初の有望な研究成果は、ヒト神経膠芽細胞腫の治療に対する免疫学的療法の試験で「DCVaxBrain」を用い、Northwest Therapeuticsによって得られたが、その研究では、抗原特異的CTL応答を誘導することができ、毒性が最小限の標準療法を適用した場合と比べ、生存期間中央値が延長された（Heimberger et al., 2006）。

【0010】

大腸癌
米国癌協会（ACS）によると、大腸癌（CRC）は米国で3番目に多い癌であり、175,000例を超える患者が毎年新たに罹患している。米国、日本、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、英国では480,000例を超える患者が罹患している。先進国での癌による死亡の最も一般的な原因の1つである。大腸癌の発症は遺伝的要因と環境的要因の相互作用の結果であることを調査が示唆している。殆どの場合、腺腫性ポリープが大腸癌の前駆状態として現れるが、癌への移行には多年を要することもある。大腸癌の主なリスク要因は年齢であり、大腸癌と診断される症例の90％が50歳を超えている。米国癌協会によると大腸癌の他のリスク要因には、アルコール消費量、脂肪および／または赤身肉の多い食事、および果物野菜の不十分な摂取などが含まれる。大腸癌の発症増加は、特に日本などの地域で続いており、脂肪や肉の過剰摂取と、食物線維摂取の低下につながる西洋化された食事を取り入れたことが原因と思われる。しかしながら、スクリーニングの増加やポリープの除去が、ポリープの癌への進行を防いでいると考えられ、発症率の増加は以前ほど速くはない。

【0011】

殆どの固形腫瘍でファーストライン治療は手術であるが、その利点は早期の患者に限られ、大半の患者は進行期で診断されている。進行大腸癌には、フルオロウラシル系の化学療法レジメンが標準治療となっている。これらのレジメンの大半は、FOLFOX（5-FU点滴／ロイコボリン＋オキサリプラチン）とFOLFIRI（イリノテカン、ロイコボリン、5-FUのボーラス投与と持続点滴）と呼ばれるプロトコールである。

【0012】

イリノテカンやオキサリプラチンのような第3世代の細胞傷害性抗癌剤の導入により有意に有効性が向上するという期待が高まっているが、その予後はまだ比較的悪く、生存率は転移癌では約20ヶ月に留まっており、そのため、大腸癌の薬剤開発のニーズはなおも高くなっている。

【0013】

最近、アバスチン（ベバシズマブ（bevacizumab））やエルビタックス（セツキシマブ（Cetuximab））のような、分子標的薬といわれる新世代の抗癌剤が利用できるようになり、大腸癌の異なる病期を対象とし、現在約40種の化合物が臨床開発の最終試験に入っている。これらの化合物数種を併用すると、将来期待される治療選択肢の数が増える。大部分の物質が第2相試験に入っており、これらの物質では、大腸癌の開発において他のどの薬物よりもEGFRが頻繁に着目されており、それは、約80％の大腸癌患者でEGFRの発現がアップレギュレートされているためである。

【0014】

病期II期の患者を対象とし、最近承認されたモノクローナル抗体（mAbs）（セツキシマブ＋イリノテカンまたはFOLFOX4、ベバシズマブ単剤またはFOLFOX4との併用）の化学療法に関する臨床試験が現在実施されている。これらの臨床試験で統計的に有意な結果を出すためには、3〜4年の観察期間が求められる。

【0015】

一般に腫瘍学で現在使われているモノクローナル抗体（mAbs）は、実施中の免疫療法を妨害しないという点で他を上回る可能性を有している。事実、（ベバシズマブによる）VEGFの枯渇は、DCによるT細胞活性化促進に貢献していることを示唆する前臨床結果がある。

【0016】

前立腺癌およびその他の腫瘍
前立腺癌による死亡は2007年に27,050例と推定され、男性の癌において主要な死因となっている。白人とアフリカ系米国人男性では1990年初頭より、その死亡率は減少しているが、アフリカ系米国人男性の死亡率はなおも白人男性の2倍を超えている。前立腺癌は男性で最も頻繁に診断される癌である。理由は未だ不明であるが、アフリカ系米国人男性の発症率は白人男性よりも有意に高い。前立腺癌の発症率はここ20年でかなり変化している。つまり、1988〜1992年では急増し、1992〜1995年では急減し、1995年以降は徐々に増えている。この傾向は、前立腺特異抗原（PSA）血液検査による前立腺癌スクリーニングの増加によるところが大きい。過去10年間で発症率が徐々に上昇していることの大部分は、65歳未満の男性の間でPSAスクリーニングが広まったことに帰する可能性が最も高い。男性前立腺癌の発症率は65歳以上では横ばいとなる。白人男性での発症率のピークは1992年（10万人中237.6例）に、アフリカ系米国人男性では1993年（10万人中342.8例）にある。

【0017】

前立腺癌の治療として、待機療法、手術、放射線療法、高密度焦点式超音波療法（HIFU）、化学療法、凍結手術、内分泌療法、またはそれらの併用療法が考えられる。どの治療法が最適かは、病期、Gleasonスコア、PSAレベルによって決まる。他の重要な要因は、男性の年齢、全体的な健康状態、可能な治療法に対する患者の感情、および副作用の可能性などである。治療法は全て、勃起不全や尿失禁など重大な副作用をもたらす可能性があるため、治療法を検討する際は、しばしば、治療目標と生活習慣の変化によるリスクとのバランスに焦点が当てられる。

【0018】

癌が前立腺以外に転移すると、治療選択肢はかなり変化するため、前立腺癌を治療する殆どの医師は、様々なノモグラフを利用して転移の可能性を予測する。待機療法、HIFU、放射線療法、凍結手術、手術などによる治療法は、一般的に癌が前立腺内に留まっている男性に実施される。内分泌療法と化学療法は、たびたび前立腺以外に転移した場合のためにとっておかれる。しかし、一部の進行性腫瘍に放射線療法を、一部の早期腫瘍に内分泌療法を使用するという例外もある。初期療法が成功せず、癌が進行する場合、凍結療法、内分泌療法、および化学療法が適用されることもある。

【0019】

癌が臓器内の発育に限定されることが臨床的に推測されたため、前立腺全摘術を施行した前立腺癌患者のかなりの人数に、手術準備用の最も確実な組織化学的検査で、臓器の境界を越えて局部的に転移した腫瘍がみられる。これらの患者は早期に局部再発するリスクが高く、通常、生化学的再発という点でPSAレベルの上昇として検出されうる。この状況での治療選択肢は、外部放射線療法とホルモン除去療法があるが、これらの治療アプローチの価値は、特に患者の長期生存率を延長するという点において、証明されたとみなすわけにはいかない。さらに、尿道狭窄の発生（放射線療法）、性欲の喪失やインポテンス、骨粗鬆症に関与する骨カルシウム塩の減少リスク、病理的骨折リスクの顕著な増加（ホルモン除去療法）など、治療に関連する合併症の可能性を考慮しなければならない。

【0020】

前立腺癌患者全員の90％以上が局部的な段階および限局期で発見される。腫瘍と診断された患者の5年相対生存率は、これらの病期では100％に近い。過去25年間で、全病期を合わせた5年生存率は69％から90％近くに上昇した。つい最近のデータによれば、10年相対生存率は93％であり、15年生存率は77％である。生存率の劇的な改善、特に5年生存率の改善は、一部早期診断と治療法の改善に帰する。しかしながら、他の組織や臓器に転移後の生存率は大幅に低下する。

【0021】

肺癌
2007年、米国では、癌診断症例の約15％にあたる、推定210,000例が新たに肺癌になることが予想されている。男性の発症率は、1984年の10,000人当たり102例から2003年の78.5例に有意に減少している。女性では、発症率は長期間にわたり上昇が続いた後、ほぼ横ばい状態となっている。肺癌は治療目的から、臨床的に小細胞癌（13％）または非小細胞癌（87％）に分類される。

【0022】

肺癌は男女とも癌において最も多い死因となっている。2007年には、推定死亡例は160,390例となることが予想され、これは癌の全死亡例の約29％を占める。1987年以降、毎年乳癌よりも肺癌により死亡する女性が多くなっている。男性の死亡率は1991年から2003年の間、毎年約1.9％ずつ有意に低下し続けた。女性の肺癌死亡率は数十年間連続して上昇した後、ほぼ横ばい状態となっている。肺癌死亡率のこれらの傾向は、過去30年間の喫煙率の低下を反映している。

【0023】

治療選択肢は癌のタイプ（小細胞癌か非小細胞癌か）と病期によって決定され、手術、放射線療法、化学療法、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））およびエルロチニブ（タルセバ（登録商標））などの分子標的療法がある。限局性の癌には通常手術が選択される。最近の試験では、早期非小細胞肺癌の生存率は術後の化学療法により改善されることが示されている。肺癌は発見時には通常転移しているため、放射線療法と化学療法が頻繁に使われ、手術と併用されることもある。化学療法のみまたは放射線との併用が小細胞肺癌に通常選択される治療法である。このレジメンでは、高い割合の患者が、症例によっては長く続く寛解を経験している。

【0024】

肺癌の1年相対生存率は、1975〜1979年の37％から2002年には42％にわずかながら増加したが、これは大部分が手術テクニックと併用療法の改善によるものである。しかし、5年生存率は全ての病期を合わせてもわずか16％である。癌がまだ限局しているうちに発見されると生存率は49％であるが、早期に診断される肺癌は16％にすぎない。

【0025】

表１：2007年米国で推定された性別新規癌症例数と死亡数（米国癌協会、2007年版、癌の正確な情報（Cancer Facts & Figures 2007）、アトランタ、米国癌協会、2007年）

【表1】

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0026】

【非特許文献1】Heimberger et al.,2006

【非特許文献2】米国癌協会、2007年版、癌の正確な情報（Cancer Facts & Figures 2007）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0027】

それ故、神経膠芽細胞腫、前立腺腫瘍、乳癌、食道癌、大腸癌、腎明細胞癌、肺癌、CNS、卵巣癌、メラノーマ、膵臓癌、扁平上皮癌、白血病、髄芽腫、およびサービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の過剰発現を示す他の腫瘍に対し、重度の副作用に至る可能性がある化学療法剤や他の薬剤を使用せずに患者の幸福を促進させる、有効で安全な新規療法の選択肢の必要性は未だにある。

【課題を解決するための手段】

【0028】

本発明で使用される全ての用語は、特に記載されない限り、以下に定義する通りである。「ペプチド」という用語は、本明細書では、隣接したアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基間のペプチド結合によって、通常互いに結合された一連のアミノ酸残基を表すために使用される。前記ペプチドは、好ましくは9アミノ酸長であるが、最短で8アミノ酸長、最長で10、11、12、13、14、15、16、17、または18アミノ酸長である。

【0029】

「オリゴペプチド」という用語は、本明細書では、隣接したアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基間のペプチド結合によって、通常互いに結合された一連のアミノ酸残基を表すために使用される。正しいエピトープの1つあるいは複数がそこに保持される限り、オリゴペプチドの長さは本発明に決定的なものではない。オリゴペプチドの長さは通常、約30アミノ酸残基長未満で、約14アミノ酸長を超える

【0030】

「ポリペプチド」という用語は、隣接したアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基間のペプチド結合によって、通常互いに結合された一連のアミノ酸残基を表す。正しいエピトープの1つあるいは複数がそこに維持される限り、ポリペプチドの長さは本発明に決定的なものではない。ペプチドやオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約30アミノ酸残基を超える分子を示す。

【0031】

かかる分子をコードするペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できる場合、「免疫原性」（従って、本発明内では「免疫原」）である。本発明の場合は、免疫原性はT細胞応答を誘導する能力としてより明確に定義される。従って、「免疫原」は、免疫応答の誘導が可能な分子で、本発明の場合は、T細胞応答を誘導できる分子と考えられる。

【0032】

T細胞の「エピトープ」は、クラスIあるいはIIのMHC受容体に結合し、三元複合体（MHCクラスIα鎖、β−2−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成する短鎖ペプチドを必要とし、この三元複合体は、適度な親和性でMHC／ペプチド複合体と結合する対応T細胞受容体を有するT細胞によって認識されうる。MHCクラスI分子と結合するペプチドは通常、8〜14アミノ酸長で、最も典型的には9アミノ酸長である。クラスIIMHC分子と結合するT細胞エピトープは通常、12〜30アミノ酸長である。MHCクラスII分子と結合するペプチドの場合には、同じペプチドと対応するT細胞エピトープが共通のコア断片を共有することがあるが、コア配列のアミノ酸末端の上流とそのカルボキシ末端の下流で隣接配列の長さが異なるため、全体の長さが異なることがある。MHCクラスII受容体はより開いた立体構造になり、それに応じて、MHCクラスII受容体に結合しているペプチドは、MHCクラスI分子のペプチド結合溝に入るように、MHCクラスII分子のペプチド結合溝の構造に完全には入らなくなる。ペプチド長の変化がわずかでも活性は非常に低下するため（以下参照）、意外にも、これは配列番号：１のペプチドには当てはまらない。

【0033】

ヒトでは、MHCクラスI分子をコードする3種類の遺伝子座（ヒトMHC分子はまたヒト白血球抗原（HLA）と呼ばれる）、つまりHLA-A、HLA-B、およびHLA-Cがある。HLA-A*01、HLA-A*02およびHLA-A*11は、これらの遺伝子座から発現されうる異なるMHCクラスI対立遺伝子の例である。

【0034】

MHCクラスII遺伝子のヒトゲノムには、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DPの3種類の遺伝子座がある。MHCクラスII受容体は、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーであり、両鎖とも膜貫通領域により細胞膜に固定される。HLA-DRB1*04とHLA-ERB1*07は、これらの遺伝子座でコードされることが既知である、異なるMHCクラスIIβ対立遺伝子の2つの例である。クラスII対立遺伝子は非常に多様な形を持ち、例えば、数百種類のHLA-DRB1対立遺伝子が報告されている。HLA-A*02および最も発現頻度の高いHLA-DR血清型について、集団による発現頻度を表２に示す。

【0035】

表２：HLA-A*02および最も発現頻度の高いHLA-DR血清型の発現頻度F。ハーディー・ワインベルク式F=1-(1-G_f)²を利用し、Moriらの文献(Mori et al., 1997)から採用した米国人集団のハプロタイプ頻度G_fから頻度を推測した。A*02と特定のHLA-DR対立遺伝子が組み合わさると、連鎖不平衡により、それぞれ単一の頻度から予想されるよりも頻度が上下するかもしれない。詳細については、Chanockらの文献(Chanock et al., 2004)を参照。

【表2】

【0036】

それ故、治療と診断の目的には、数種類のHLAクラスII受容体に適度な親和性で結合するペプチドが大変望ましい。数種類のHLAクラスII分子に結合するペプチドは無差別な結合因子と呼ばれている。

【0037】

本発明で用いる通り、DNA配列に言及した場合、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの両方が含まれる。そのため、特に記載のない限り、特異的配列とは、かかる配列の一本鎖DNA、かかる配列の相補鎖との二本鎖（二本鎖DNA）、およびかかる配列の相補鎖を示す。「コード領域」という用語は、天然ゲノム環境、すなわち、in vivoにおける遺伝子の天然発現産物のコード領域において、自然にまたは正常状態で該遺伝子の発現産物をコードする、遺伝子のその部分を示す。

【0038】

コード領域は、正常の、変異した、または変化した遺伝子からなる可能性があり、また、DNA合成の当業者に周知の方法で研究室において完全に合成されたDNA配列または遺伝子のものである可能性もある。

【0039】

「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ多量体を示す。

【0040】

特定のペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、自然に発生することも、合成されることもある。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をコードするDNAセグメントは、cDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから作製され、微生物またはウイルスオペロン由来の調節エレメントからなる遺伝子組換え転写単位内で発現されうる合成遺伝子を与える。

【0041】

「発現産物」という用語は、遺伝子コード縮重の結果、同等遺伝子をコードするため、同一アミノ酸をコードしている、遺伝子およびあらゆる核酸配列から自然翻訳された、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

【0042】

「フラグメント」という用語は、コード配列に関する場合は、完全なコード領域より短いDNAの一部を意味し、その発現産物は、完全なコード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保持する。

【0043】

「DNAセグメント」という用語は、分離フラグメントあるいはより大きいDNA構成物の一組成の形であるDNAポリマーを示し、このポリマーは十分に純粋な形、すなわち、内因性物質の混在がない形で、しかも、標準的な生化学的方法たとえばクローニングベクターによりセグメントやその構成ヌクレオチド配列の同定、操作、回収が可能な量と濃度で、少なくとも1回単離されたDNAから誘導されている。そのようなセグメントは、真核生物の遺伝子中で通常提示される内部非翻訳配列、すなわちイントロンによって中断されないオープンリーンディングフレームの形で与えられる。非翻訳DNA配列は、オープンリーンディングフレームの下流に存在することがあるが、コード領域の調節や発現を邪魔することはない。

【0044】

「プライマー」という用語は一本鎖DNAと対になることができ、DNAポリメラーゼがデオキシリボ核酸鎖の合成を開始する遊離3'OH末端となる短い核酸配列を意味する。

【0045】

「プロモーター」という用語は、転写を開始するRNAポリメラーゼの結合に関わるDNAの一領域を意味する。

【0046】

「オープンリーディングフレーム（ORF）」という用語は、終止コドンが全くない、一連のアミノ酸トリプレットコードのことであり、タンパク質に翻訳される（可能性のある）配列である。

【0047】

「単離される」という用語は、物質がその本来の環境（例えば、それが自然に発生するのであれば、自然環境）から取り除かれることを意味する。例えば、生存する動物の自然発生したポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されているとは言えないが、自然界の一部または全ての共存物質から分けられた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていると言える。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部である可能性があり、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部となる可能性があり、そのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないため、単離されていると言える。

【0048】

本発明によって開示されているポリヌクレオチドおよび、遺伝子組換えポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドも、「精製されている」状態である。「精製される」という用語は、完全に精製される必要はなく、むしろ、相対的な定義を意味し、高純度に精製された調製物または、部分的にのみ精製された調製物も含むが、これらの用語は関連分野の当業者には理解されている。例えば、cDNAライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動で均一になるように従来法で精製されている。出発物質または天然物質の精製では、最低でも有効数字1桁、好ましくは2桁または3桁、より好ましくは4桁または5桁で明確に意図される。さらに、請求項におけるポリペプチドの純度は、重量で、好ましくは99.999％、または少なくとも99.99％または99.9％、さらに望ましくは99％以上で明確に意図される。

【0049】

本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、およびそのような核酸および／またはポリペプチドを含む発現ベクターは「濃縮型」である。本明細書で使用される通り、「濃縮型」と言う用語は、物質の濃度が（例えば）、それ自身の自然に存在する濃度の少なくとも約2、5、10、100、または1000倍であり、また、重量で0.01％であれば有利であり、好ましくは少なくとも約0.1％であることを意味する。また、濃縮型調製物で期待されるのは、重量で約0.5％、1％、5％、10％、および20％である。本発明における配列、構成物、ベクター、クローンおよび他の物質は、濃縮型または単離型であることが有利である。

【0050】

「活性フラグメント」という用語は、選択的に適切なアジュバントと共に、または単独で、動物例えばウサギまたはマウス、およびヒトも含む哺乳動物に投与した際、免疫応答を起こす（すなわち免疫原性活性を有する）フラグメントを意味し、このような免疫応答は、ヒトなどの受容動物内でT細胞応答を刺激する。また、この「活性フラグメント」は、in vitroでT細胞応答の誘導に使用されることもある。

【0051】

本明細書では、「一部分」、「セグメント」、「フラグメント」という用語は、ポリペプチドに関して使用される時、アミノ酸残基のような残基の連続的な配列を指し、その配列はより大きな配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドがトリプシンまたはキモトリプシンのような一般的なエンドペプチダーゼの処理を受けた場合、そのような処理により得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの一部分、セグメントあるいはフラグメントに相当すると思われる。これは、そのようなフラグメントが必然的にアミノ酸配列の一部としてセグメント、フラグメント、あるいは一部分を含んでおり、それらが、配列番号：１〜２０の配列を持つ自然発生タンパク質、あるいは「親」タンパク質に相当する、配列番号：１〜２０の配列に、全く同一ではないにせよ実質的に同一であることを意味する。ポリヌクレオチドに関連して使用する時、そのような用語は任意の共通のエンドヌクレアーゼをもつ前記ポリヌクレオチドの処理によって生成された生成物を指す。

【0052】

本発明に従って、配列に言及する場合、「同一性パーセント」または「同一パーセント」という用語は、比較する配列（「比較配列」）を報告済みまたは請求項の配列（「参照配列」）とアラインメントした後に、ある配列を、報告済みまたは請求項の配列と比較することを意味する。続いて、同一性パーセントは次式により決定される:

同一性パーセント＝100［I−（C/R）］

Cは、参照配列と比較配列間でアラインメントした長さにおいて、参照配列と比較配列間とで異なる残基数を示し、ここで、
（i）比較配列上で相当するアラインメントした塩基やアミノ酸を持たない参照配列の各塩基またはアミノ酸、および
（ii）参照配列の各欠落部、および
（iii）比較配列のアラインメントした塩基あるいはアミノ酸とは異なる、参照配列のアラインメントした各塩基あるいはアミノ酸が差の構成要素となっており、
Rは、塩基またはアミノ酸としても数えられ、参照配列に作られた任意の欠落部を伴い、比較配列とアラインメントした長さにおいて、参照配列の塩基またはアミノ酸の数である。

【0053】

もし、比較配列と参照配列の間に一致があり、上記のように計算した同一性パーセントが、指定の最小同一性パーセント以上である場合、たとえ、本明細書で上述の計算した同一性パーセントが指定の同一パーセントより小さい一致がある可能性があったとしても、比較配列は参照配列に対し指定の最小同一性パーセントを有する。

【0054】

本明細書で開示されている本来のペプチドは、特に記載されない限り、ペプチド鎖内で異なる、おそらく選択される部位において、一つまたは複数残基の置換によって修飾できる。そのような置換は保存的であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸に置き換わるように、1個のアミノ酸が類似構造および特性を持つアミノ酸に置換される。さらに保存的な置換の例として、ロイシンがイソロイシンに置換されるように、サイズおよび化学的性質が同一あるいは類似のアミノ酸に交換されることが考えられる。自然発生的な相同タンパク質ファミリーにおける配列多様性の研究において、ある種のアミノ酸置換は他のアミノ酸置換より認容性が高いことが多く、これらは元のアミノ酸とその置換物との間で、大きさ、電荷、極性、疎水性が類似の相関関係を示すことが多く、これが、「保存的置換」の定義の基礎である。

【0055】

保存的置換は、本明細書では次の5グループの1つに交換されることと定義される：グループ1−分子量が小さい脂肪族の、非極性またはやや極性残基（Ala、Ser、Thr、Pro、Gly）；グループ2−極性、負電荷残基およびそれらのアミド類（Asp、Asn、Glu、Gln）；グループ3−極性、正電荷残基（His、Arg、Lys）；グループ4−分子量が大きい脂肪族の、非極性残基（Met、Leu、Ile、Val、Cys）；そしてグループ5−分子量が大きい、芳香族残基（Phe、Tyr、Trp）である。

【0056】

より保存性の少ない保存的置換には、イソロイシン残基によるアラニンの置換のように、類似の特性を有するがサイズが多少異なる別の分子によるアミノ酸1置換を含む可能性も多少ある。非常に非保存的な置換には、酸性アミノ酸と極性アミノ酸、あるいは塩基性アミノ酸との置換を含む可能性も多少ある。しかしながら、化学的効果が完全には予想できないこと、また、過激な置換は他に単純な化学的原理から予想できない限り、思いがけない効果を生じる可能性が多少あるため、そのような「過激な」置換は、効果がないと考えられるとは片付けることができない。

【0057】

もちろん、そのような置換は、共通のL−アミノ酸以外の構造を含むこともある。そのため、D−アミノ酸は、本発明の抗原ペプチドで一般に見つかるＬ−アミノ酸の代わりに用いられ、依然として開示により本明細書に包含されている。さらに、非標準R基（すなわち、自然タンパク質の一般的な20種類のアミノ酸に見られる以外のR基）を有するアミノ酸も、本発明によって免疫原および免疫原性ポリペプチドを生産する置換目的に使用されうる。

【0058】

2つ以上の位置での置換が、以下に定義するように、実質的に同等かまたはより大きな抗原活性を有するペプチドに帰着することが分かっている場合、組み合わせた置換がペプチド抗原性への相加効果あるいは相乗効果に帰着するかを判断するために、これらの置換の組み合わせが検討される。ペプチド内で同時に置換されるのは多くても4箇所までであろう。

【0059】

「T細胞応答」という用語は、in vitroまたはin vivoにおいて、ペプチドによって引き起こされるエフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。MHCクラスI拘束性CTLにおいて、エフェクター機能とはパルスしたペプチド、パルスしたペプチド前駆体、または自然状態でペプチドを提示した標的細胞の溶解、ペプチドによって誘導されるサイトカイン、好ましくはインターフェロンγ、TNFα、またはIL−2の分泌、エフェクター分子、好ましくはグランザイム、またはペプチドによって誘導されるパーフォリンの分泌、または脱顆粒のこともある。MHCクラスIIにより制御されるヘルパーT細胞において、エフェクター機能とはサイトカイン、好ましくはIFN−γ、TNF−α、IL−4、IL−5、IL−10またはIL−2のペプチド誘導性分泌、またはペプチド誘導性脱顆粒のこともある。CTLとヘルパーT細胞に対する考えられるエフェクター機能は、このリストだけに限定されない。

【0060】

治療の免疫療法アプローチ
免疫応答の刺激は、宿主の免疫系により異物であると認識された抗原が存在するかに依存する。腫瘍関連坑原が存在することが発見され、現在、腫瘍の発育に介入するため、宿主の免疫系を利用する可能性が浮上している。体液性免疫系と細胞性免疫系の両方を結びつける様々なメカニズムが、現在、癌の免疫療法において研究されつつある。

【0061】

細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識し破壊することができる。細胞傷害性T細胞（CTL）が腫瘍浸潤細胞群や末梢血から単離されることから、このような細胞が癌に対する自然免疫防御において重要な役割を果たしていることが示唆される。特に、CD8陽性T細胞は、タンパク質または不完全なリボゾーム産物（DRIPS）に由来する、通常8〜10残基の主要組織適合複合体（MHC）を有するペプチドである、クラスI分子を認識し（SchubertU, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, BenninkJR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000;404(6779):770-774）、これは細胞質に存在するが、この反応に重要な役割を果たしている。ヒトのMHC分子はヒト白血球型抗原（HLA）とも呼ばれる。

【0062】

MHC分子には2つのクラスがあり、MHCクラスI分子は、核を有する殆どの細胞にみられ、主に内因性、細胞質性または核タンパク質、DRIPS、より大きなペプチドのタンパク質分解的切断によって生じたペプチドを提示する。しかし、エンドソーム区画または外因性供給源に由来するペプチドも、MHCクラスI分子に認められることが多い。この非古典的なクラスIの提示方法は、文献ではクロスプレゼンテーションと呼ばれている。MHCクラスII分子は、主にプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）に認められ、エンドサイトーシスの過程でAPCにより取り込まれた後処理される、外因性タンパク質のペプチドを主に与える。クラスIについては、別の抗原プロセシング方法が報告されており、内因性ペプチドをMHCクラスII分子に提示させることも可能である（例えば、自家食作用）。ペプチドとMHCクラスI分子の複合体は、適切なTCRを持つCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球により認識され、ペプチドとMHCクラスII分子の複合体は、適切なTCRを持つCD4陽性ヘルパーT細胞により認識される。

【0063】

CD4陽性ヘルパーT細胞は抗腫瘍T細胞応答のエフェクター機能の調整に重要な役割を果たしており、このため、腫瘍関連抗原（TAA）由来CD4陽性T細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を誘導する医薬品の開発において非常に重要と考えられる（Gnjatic,S., D. Atanackovic, E. Jaeger, M.Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G.Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibodyresponses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7）。CD4+ T細胞は、局所的にIFN-γレベルを上昇させることができる。

【0064】

マウスなどの哺乳類動物モデルでは、CTLエフェクター細胞（すなわち、CD8陽性Tリンパ球）がない場合も、CD4陽性T細胞があれば、インターフェロン−γ（IFNγ）の分泌により血管形成を抑制することで、腫瘍の兆候を阻止するため十分であることが示された（Qin,Z. and T. Blankenstein. CD4+ T-cell--mediated tumor rejection involvesinhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expressionby nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686）。さらに、HLAクラスII分子が提示する腫瘍関連抗原のCD4陽性T細胞認識ペプチドは、抗体（Ab）反応を誘導することで、腫瘍の進行を相殺できることが示された（Kennedy,R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. CD4+ T lymphocytes play acritical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40large tumor antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045）。HLAクラスI分子に結合する腫瘍関連ペプチドと比較して、これまでに報告されたTAAクラスIIリガンドはわずかである（www.cancerimmunity.org,www.syfpeithi.de）。

【0065】

HLAクラスII分子の構成的発現は、通常免疫系の細胞に限られているため、原発性腫瘍から直接クラスIIペプチドを単離することはできないと考えられていた。しかし、発明者は最近、腫瘍から直接多数のMCHクラスIIエピトープを同定することに成功した（EP1642905, EP 1760088; Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G,Schoor O, Altenberend F, Mueller M, Kraemer B, Missiou A, Sauter M,Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin CancerRes. 2006; 12:4163-4170）。

【0066】

MHCクラスII分子の発現は、炎症がない場合、主に免疫系細胞、特にAPC、例えば、単核球、単核球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞に限られる。腫瘍患者では、驚くべきことに、腫瘍細胞がMHCクラスII分子を発現していることが分かった（DengjelJ, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Mueller M, Kraemer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J,Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance ofHLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin CancerRes. 2006; 12:4163-4170）。

【0067】

ペプチドが細胞性免疫応答を始動する（引き起こす）には、MHC分子へ結合が必要である。この過程はMHC分子の対立遺伝子とペプチドアミノ酸配列の固有の多型性によって決定される。MHCクラスI結合ペプチドは通常8から10アミノ酸残基長であり、MHC分子の対応する結合溝と相互作用するペプチドの配列内に、通常2つの保存された残基（「アンカー」）を持つ。このように、それぞれのMHC対立遺伝子には、どのペプチドが結合溝と特異的に結合するかを決定する「結合モチーフ」がある（RammenseeHG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs, LandesBioscience, USA, 1997）。

【0068】

MHC依存性免疫応答において、ペプチドは、腫瘍細胞によって発現されるある種のMHC分子と結合できる必要があるだけでなく、特定のT細胞受容体（TCR）を持つT細胞によって認識されることも必要である。

【0069】

腫瘍特異的Tリンパ球、つまりそのエピトープによって認識された抗原は、酵素、受容体、転写因子など、あらゆるタンパク質クラスに由来する分子である可能性がある。さらに、例えば、腫瘍関連抗原は、例えば突然変異遺伝子の産物として、腫瘍細胞のみに提示される可能性もある。もう1つ重要なクラスの腫瘍関連抗原は、様々な種類の腫瘍および健常な精巣組織に発現されるCT（「cancer testis（癌・精巣）」）抗原など、組織特異的抗原である。

【0070】

様々な腫瘍関連抗原が同定されてきた。さらに、追加の腫瘍関連抗原を特定するため、多くの研究努力が費やされている。一部の腫瘍関連抗原グループは、当該技術において腫瘍特異抗原とも呼ばれ、組織特異的である。例えば、これに限定されないが、メラノーマのチロシナーゼ、前立腺癌のPSAおよびPSMA、リンパ腫のbcr/ablなどの染色体交差（転座）などである。しかし、同定された多くの腫瘍関連抗原は多数の腫瘍タイプで発生し、発癌タンパク質および／または癌抑制遺伝子など（癌抑制遺伝子は、例えば、Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170 (6Pt1):2163-72で腎臓癌について検討されている）、実際に形質転換イベントを引き起こす抗原の一部は、ほぼ全ての腫瘍タイプに発生する。例えば、p53（癌抑制遺伝子の一例）、ras、c-met、myc、pRB、VHL、HER-2/neuなど、細胞の増殖および分化を制御する通常の細胞タンパク質は、突然変異を蓄積し、これらの遺伝子産物の発現をアップレギュレートさせることで、発癌性を生じさせる可能性がある（McCarteyet al. Cancer Research, 1998, 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp.1994, 187:198-211）。これらの変異タンパク質も、複数の癌タイプで腫瘍特異的免疫応答の標的となる可能性がある。

【0071】

癌患者の免疫療法は、腫瘍細胞に対抗し、免疫系の細胞、特にいわゆる細胞傷害性T細胞（CTL、「キラー細胞」、CD8陽性T細胞としても知られる）を特異的に活性化することを目的としているが、正常組織は標的としない。腫瘍細胞は腫瘍関連タンパク質が発現しているという点で、正常細胞とは異なる。細胞表面のHLA分子は外側に向かって細胞内容物を提示するため、細胞傷害性T細胞は正常細胞と腫瘍細胞を区別することができる。この事実は、細胞内の全てのタンパク質を短いペプチドに分解したことで理解され、この短いペプチドは、その後HLA分子に接着し、細胞表面に提示される(Rammensee et al., 1993)。腫瘍細胞に提示されるが、正常な体細胞には提示されないか、提示されたとしてもはるかに少ないペプチドは、腫瘍関連ペプチド（TUMAP）と呼ばれる。

【0072】

タンパク質が腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原として細胞傷害性Tリンパ球に認識され、さらに、治療に使用されるには、特定の条件を満たしていなければならない。この抗原は主に腫瘍細胞に発現されるものであり、正常な健康組織には発現されないか、比較的少量で発現される。個々の抗原はあるタイプの腫瘍に存在するだけでなく、濃度（つまり、1細胞あたりの各々のペプチドのコピー数）が高いことがさらに好ましい。腫瘍特異抗原および腫瘍関連抗原は、例えば細胞周期の制御やアポトーシスのような機能により、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関わるタンパク質から生ずる。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流ターゲットはアップレギュレートされるため、腫瘍に間接的に関連している可能性がある。このような間接的腫瘍関連抗原は、ワクチン療法のターゲットにもなることがある。いずれの場合も、エピトープが抗原のアミノ酸配列に存在することが不可欠であり、これは、このような腫瘍関連抗原由来のペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、in vitroまたはin vivoでT細胞応答を引き起こすためである。

【0073】

基本的に、MHC分子に結合できるいずれのペプチドも、T細胞エピトープとして機能しうる。in vitroまたはin vivoにおいてT細胞応答を誘導するには、対応するTCRを有するT細胞の存在と、さらにこの固有エピトープに対する免疫学的耐性がないことが必須条件である。ヘルパーT細胞は、抗腫瘍免疫において、CTLのエフェクター機能を統合する際に重要な役割を果たす。T_H1タイプのヘルパーT細胞応答を始動させるヘルパーT細胞エピトープは、腫瘍関連ペプチド／MHC複合体を細胞表面に提示している腫瘍細胞に対する傷害機能など、CD8陽性キラーT細胞のエフェクター機能をサポートしている。このようにして、腫瘍関連ヘルパーT細胞ペプチドのエピトープは、単独で、または他の主要関連ペプチドと共に、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分とすることができる。

【0074】

CD8およびCD4依存型の2つの免疫応答タイプは共に、連携し、相乗的に抗腫瘍効果に寄与しているため、CD8+CTL（MHCクラスI分子）またはCD4陽性CTL（MHCクラスII分子）のいずれかにより認識される腫瘍関連抗原の同定と特徴決定は腫瘍ワクチンの開発において重要である。そのため、いずれかのクラスのMHC複合体に結合するペプチドを含むペプチド組成物を提供することが、本発明の目的である。

【0075】

腫瘍関連ペプチドを用いた最初の臨床試験は、主にメラノーマを適応症とし、1990年代中頃、Boonらによって開始された。臨床的奏功は、最高の試験で10％〜30％の範囲であった。ペプチドを基本としたワクチンの単独療法を利用した臨床試験において、重度の副作用または重度の自己免疫は報告されていない。メラノーマ関連ペプチドを投与した一部の患者に、軽度の白斑が報告された。

【0076】

しかし、1種類のCTLをプライミングしても、通常は全ての腫瘍細胞を除去するには不十分である。腫瘍は非常に変異原性が高いため、タンパク質パターンを変化させ、CTLによる認識を逃れることで、CTLの攻撃に急速に反応することができる。腫瘍の回避メカニズムに抵抗するため、様々な特異的ペプチドがワクチンに使用されている。このようにして、いくつかのCTLクローンを同時に用い、腫瘍に対して広範囲に同時攻撃を開始することができる。これにより、腫瘍が免疫応答を逃れる可能性を低下させる。この仮説は、最近、末期メラノーマ患者を治療した臨床試験で確認された。わずかに例外はあるものの、少なくとも3回明確なT細胞応答が示された患者は、客観的な臨床的奏功または病態安定を示し(Banchereau et al., 2001)、生存年数が長くなるが（J. Banchereauとの私信）、T細胞応答が3回未満の患者は、大部分が進行性疾患と診断された。

【0077】

出願者の研究では、腎細胞癌患者に13種類のペプチドからなるワクチンを投与し、同様の効果が示された（H.Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler,A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cellresponse, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cellcarcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine、2007年ASCO学会、ポスター番号3017;M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A.Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study toevaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccineIMA901、2007年ASCO学会、ポスター番号3017）。

【0078】

従って、腫瘍ワクチンの開発における重要な課題は、新規腫瘍関連抗原およびそれに由来する免疫原性ヘルパーTエピトープの同定と特徴決定のみならず、異なるエピトープを併用することで、各患者で1つ以上のエピトープに反応する可能性を高めることである。従って、ヒト主要組織適合複合体（MHC）クラス−I（HLAクラスI）またはII（HLAクラスII）分子に結合することのできる、そのようなペプチドのアミノ酸配列の組み合わせを提供することは、本発明の目的である。さらに、1種類のペプチドの組み合わせに基づく、効果的な抗癌ワクチンを提供することも、本発明の目的である。

【0079】

本発明では、発明者は、直接哺乳類の腫瘍、つまり主に神経膠芽細胞腫患者の一次サンプルから、HLAクラスIまたはII分子に結合するペプチドを単離し、特徴を決定したが、大腸癌、腎細胞癌、肺癌、膵臓癌、悪性メラノーマ、胃癌の一次組織サンプルからもペプチドを単離し、特徴を決定した。

【0080】

本発明では、腫瘍形成に関連し、MHC（HLA）クラスII分子に十分結合し、ヒト白血球、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD4陽性Tリンパ球、特にT_H1タイプの免疫応答に介在するCD4陽性Tリンパ球の免疫応答を誘導することのできる抗原由来のペプチドを提供する。

【0081】

また本発明では、腫瘍形成に関連し、MHC（HLA）クラスI分子に十分結合し、ヒト白血球、特にリンパ球、特にTリンパ球、特にCD8陽性細胞傷害性Tリンパ球、および、癌に罹患した患者のワクチン接種に特に有用なこのうち2つの組み合わせの免疫応答を誘導することのできる抗原由来のペプチドを提供する。

【0082】

本発明によれば、その目的は、配列番号：１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列、および／または配列番号：１〜８と少なくとも80％相同性のある変異アミノ酸配列を含む少なくとも2つのペプチド、および／または配列番号：１〜８もしくは該変異アミノ酸配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供することで解決される。本発明の医薬組成物は、さらに、配列番号：９〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：９〜２０と少なくとも80％同一の変異アミノ酸配列を含む少なくとも1つの追加ペプチド、または配列番号：９〜２０もしくは該変異アミノ酸配列をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。前記ペプチド全体は、8〜100アミノ酸長、好ましくは8〜30アミノ酸長、最も好ましくは8〜17アミノ酸長である。前記ペプチドは非ペプチド結合を有することもある。

【0083】

本明細書で以下に説明する通り、本発明の基礎となるMET-005を除くペプチドは、全てMHCクラスIまたはIIを有する細胞によって提示されることが同定された。従って、これらの特定ペプチドと前記配列（つまり、誘導ペプチド）を含む他のペプチドは、全て特異的T細胞応答を誘導するが、そのような反応が誘導される程度は個々のペプチドによって、また個々の患者によって異なるかもしれない。その違いは、例えば、ペプチドの変異による可能性がある。当業者は、特に、本明細書の例と個別の文献を参照し、反応がどの程度個々のペプチドによって誘導されるかの判定に応用することのできる方法を十分把握している。

【0084】

好ましくは、本発明の変異体は本発明の各ペプチドと交差反応するT細胞を誘導する。

【0085】

前記ペプチドは、腫瘍関連抗原、特に、例えば、タンパク質分解、血管形成、細胞増殖、細胞周期の制御、細胞分裂、転写の制御、翻訳の制御、組織浸潤などの機能を持つ腫瘍関連抗原に由来する。表３は、ペプチドと、ペプチドが由来するタンパク質の機能を示している。

【0086】

表３：本発明のペプチドと親タンパク質の機能

【表3】

【0087】

コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）
CSPG4（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）は、内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを意味する。これは、腫瘍細胞の増殖、遊走、浸潤の刺激に関係する、初期の細胞表面メラノーマ進行マーカーとしても知られている。CSPG4は、ヒトメラノーマ病変の90％超で強く発現される。CSPG4は厳密には腫瘍に特異的なものではないが、メラノーマ患者および健常者の腫瘍反応性CD4+T細胞応答は、自己免疫を伴わずに、HLA-DR11発現メラノーマ細胞のCSPG4_693-709を認識する (Erfurt et al.,2007)。

【0088】

CSPG4の発現は、インテグリンが介在する細胞拡散、FAK（焦点接着キナーゼ）のリン酸化、ERK1/2（細胞外シグナル調節キナーゼ）の活性化を促進する(Yang et al., 2004)。さらにCSPG4が腫瘍の血管形成に重要な役割を果たしているという、in vitroデータの蓄積した根拠がある。そのため、CSPG4陽性腫瘍は血管新生の速度と血管容量が有意に上昇していることが分かり、CSPG4はアンギオスタチンを隔離することが示されたが、アンギオスタチンは通常、内皮細胞の増殖と血管形成を抑制する。未熟な血管にはCSPG4陽性周皮細胞も含まれることから、この細胞群には血管発生時にアンギオテンシンの抑制効果を遮断することで、内皮細胞増殖を調節する役割があることが示唆される(Chekenya et al., 2002b)。

【0089】

CSPG4の発現は、内皮細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、上皮内にある特定の基底ケラチン生成細胞、および毛包内の細胞など、活性化された周皮細胞に加え、一部の正常組織でも報告された(Campoli et al., 2004)。

【0090】

血管形成中、およびCNSの病状に反応し、高度な運動性を持つCSPG4細胞が急速な形態変化を受け、血管の増殖と修復が発生している箇所に補充される。CSPG4は、悪性脳腫瘍の血管に存在する腫瘍細胞と周皮細胞の両方で過剰発現される(Chekenya and Pilkington, 2002)。CSPG4陽性ヒト神経膠腫細胞株の細胞を免疫不全ヌードラットの脳に移植することで、これらの腫瘍は微小血管密度が対照と比較して高いことが示され、CSPG4の発現が宿主由来の腫瘍血管系の機能と構造をいずれも制御していることを意味している(Brekke et al., 2006)。GBM生検材料の異種移植片をヌードラットに移植する実験では、CSPG4が周皮細胞および腫瘍血管系の基底膜成分両方の血管と主に関連していることが同定され、その発現は細胞増殖が高い部位とも関連していた(Chekenya et al., 2002a)。さらに、CSPG4の発現は、神経膠腫移植モデルの腫瘍進行に対応していた (Wiranowska et al., 2006)。悪性の進行は、腫瘍とその間質とのクロストークによって維持され、活性化された間質は血管新生、細胞外基質成分、刺激性増殖因子を提供することで、増殖性、浸潤性の腫瘍細胞を育む。この状況において、CSPG4は細胞接着、遊走、増殖、血管の形態形成の変化により、腫瘍間質の活性化に重要な役割を果たしている(Chekenya and Immervoll, 2007)。

【0091】

CSPG4は低悪性度の神経膠腫と比較し、高い発現率でヒト神経膠腫に特異的に発現される(Chekenya et al., 1999)。CSPG4の発現率が高いことは、α3β1インテグリン／PI3Kシグナル伝達およびその下流の標的の活性化亢進が介在する多剤耐性と関連があり、細胞生存を促す(Chekenya et al., 2008)。

【0092】

脳型脂肪酸結合タンパク質7（IMA-FABP7-001）
脂肪酸結合タンパク質（FABP）は14〜15kDaの細胞質タンパク質であり、脂肪酸（FA）の取り込み、輸送、標的化に関与していると想定されている。FABPは、膜分画間でFAを輸送する際にFAの溶解性を上昇させると考えられ、FAを核内の標的に輸送する(Glatz et al., 2002)。FABPはFA濃度を調節すると考えられ、このようにして、酵素活性、遺伝子発現、細胞の増殖と分化など、様々な細胞機能に影響する(Glatz and Storch, 2001)。

【0093】

神経組織には、時空間的分布が異なる既知のFABPタイプ9種類のうち4種類が含まれる(Veerkamp and Zimmerman, 2001)。FABP7は中枢神経系の発達中、放射状膠細胞に多く発現され、成人では徐々に減少する (Fengand Heintz, 1995; Shimizu et al., 1997)。FABP7は、神経細胞により誘導される膠細胞の分化と、その後の膠細胞突起に沿った神経細胞の遊走に必要であるが、細胞の増殖と接着には影響しない(Feng et al., 1994; Kurtz et al., 1994)。シュワン細胞では、FABP7の発現がRas非依存性EGFRシグナル伝達経路の下流にあり、正常な末梢神経および末梢神経腫瘍において、シュワン細胞と軸索との相互作用を制御する(Miller et al., 2003)。

【0094】

FABP7 mRNAは、神経上皮由来組織および悪性神経膠腫（WHOのgradeIIIおよびIV）で発現される。この遺伝子は染色体バンド6q22-23にマッピングされ、この領域にはプロトオンコジーンc-mycも含まれ、悪性神経膠腫ではヘテロ接合性が消失していることが多い。悪性神経膠腫細胞株の分析では、FABP7がしばしば神経膠細線維性酸性タンパク質（GFAP）と同時に発現されることが示され、悪性神経膠腫由来の細胞は、正常に、または腫瘍形成の結果としてタンパク質を発現する可能性がある、星状細胞の前駆細胞と考えられることが指摘されている(Godbout et al., 1998)。FABP7タンパク質は、GBMの核および細胞質で中等度から強度に発現されることが示されている。FABP7形質転換神経膠腫細胞は、対照細胞よりも5倍遊走能が高いことが示されている。従って、特にGBMでFABP7の過剰発現により全体的な生存年数が短くなるのは、周囲の脳実質への腫瘍細胞の遊走および浸潤が亢進したためと考えられる(Liang et al., 2005)。星状細胞腫におけるFABP7の分布をさらに分析すると、腫瘍の浸潤領域でFABP7レベルが上昇していることが示され、隣接した脳組織へ悪性細胞を浸潤させる際に、FABP7が重要な役割を果たしていることを提案している(Mita et al., 2007)。神経膠組織および全ての悪性度の星状細胞腫において、FABP7は発現レベルが様々であり、細胞内に位置することを示している。それでも尚、EGFRの活性化後にFABP7の核への移行が検出され、EGFR陽性GBMでは予後が悪いことと関連しているため、特にFABP7の核への局在は、神経膠腫細胞のおよびEGFR経路浸潤性の表現型と関連していると考えられる。さらに、gradeIの星状細胞腫では、核にFABP7免疫応答を観察することができない (Liang et al., 2006; Kaloshi et al., 2007)。

【0095】

X染色体ニューログリン4（IMA-NLGN4X-001）
X染色体ニューログリン4は、神経細胞シナプスの成熟と機能に関与していると考えられる、細胞接着タンパク質ファミリーの一員である。ニューログリンファミリーには関連する構造的構成があり、N末端シグナルペプチド、2箇所の選択的スプライシングがあるエステラーゼ様ドメイン、膜貫通ドメイン前の配列同一性の低い小さなリンカー領域、C末端が非常に保存された短い細胞質部分がある。相対的にニューログリン4 mRNAレベルが最も高いのは心臓であることが分かった。肝臓、骨格筋、および膵臓で検出された発現は少なく、脳、胎盤、肺、腎臓ではニューログリン4 mRNAは殆ど検出できなかった(Bolliger et al., 2001)。

【0096】

X染色体NLGN4遺伝子の変異は自閉症スペクトル障害の原因である可能性があり、自閉症、アスペルガー症候群、精神遅滞患者数例で変異が報告された(Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson-Yuen et al., 2008)。

【0097】

NLGN4Xと癌との関連性は殆ど報告されておらず、胃腸間質性腫瘍では、高齢成人の症例と対比し、小児および若年成人ではNLGN4Xの過剰発現が認められている(Prakash et al., 2005)。

【0098】

テネイシンC（ヘキサブラチオン）（IMA-TNC-001）
腫瘍細胞を囲む細胞外基質は、正常組織の細胞外基質とは異なる。テネイシン−C（TNC）は、胚発生(Bartsch et al., 1992)、創傷治癒 (Mackie et al., 1988)、腫瘍過程 (Chiquet-Ehrismann,1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003)など、遊走能の上昇と密接な関連性があるプロセスで非常にアップレギュレートされる、細胞外基質タンパク質である。さらに、TNCは増殖指数が高い腫瘍血管で過剰発現されるが、増殖指数はTNCが腫瘍の血管形成に関係していることを示している(Kim et al., 2000)。正常なヒト脳では、TNCの発現が検出されることはまれにしかないが、悪性神経膠腫では高レベルで発現される (Bourdonet al., 1983)。TNCの発現は、低酸素症 (Lal et al., 2001)、高悪性度神経膠腫の正常な実質への浸潤メカニズムを形成するTGF-β1(Hau et al., 2006)、またはヒトGBM細胞遊走の調節に重要な意味を持つガストリン (Kucharczak et al., 2001)によって誘導されうる。TNCはトロポミオシン−1をダウンレギュレートするため、アクチンストレス線維を不安定化する。さらに、TNCはWnt阻害因子Dickkopf1をダウンレギュレートさせる。トロポミオシン−1の発現低下とWntシグナル伝達の亢進は形質転換および腫瘍形成と密接な関連性があるため、TNCはこれらのシグナル伝達経路を特異的に調節し、神経膠腫細胞の増殖を増進する(Ruiz et al., 2004)。

【0099】

腫瘍に供給する血管周囲のTNCによる血管周囲染色はGBM組織で観察されるが、WHOのgradeIIおよびIII神経膠腫で観察されることは少ないことから、TNC染色の強度は腫瘍の悪性度と関連性があり、最も強く染色された場合は予後が悪いことを示している(Herold-Mende et al., 2002)。TNCは脳室下帯（SVZ）の幹細胞ニッチの生成にも寄与し、成長因子のシグナル伝達を統合し、神経幹細胞の発達を促進させるように作用する。SVZにおける細胞に対するTNCの主な作用は、発達過程の制御である(Garcion et al., 2004)。TNCは、定方向へのヒト神経幹細胞（NSC）遊走の強力な誘導因子である。そのため、腫瘍によって誘導されるECMは、播種性腫瘍細胞へのNSCの向性を許容する環境を作る(Ziu et al., 2006)。

【0100】

神経細胞接着分子（IMA-NRCAM-001）
NRCAM（神経細胞接着分子）は、免疫グロブリン様のC2型ドメインおよびフィブロネクチンIII型ドメインを複数持つ、神経細胞の膜貫通細胞接着分子である。NRCAMは、他のIgCAMと同種親和性、および異好性の相互作用を形成することにより(Volkmer et al., 1996; Sakurai et al., 1997; Zacharias et al., 1999)、神経細胞の誘導、成長、線維束性収縮に関与する(Grumet et al., 1991; Morales et al., 1993; Stoeckli and Landmesser, 1995;Perrin et al., 2001; Sakurai et al., 2001)。アンキリン結合NRCAM (Davis and Bennett,1994)は管形成を行う内皮細胞でアップレギュレートされているため、管形成および血管形成に関与している可能性が示唆される (Aitkenhead etal., 2002)。

【0101】

NRCAMは、腫瘍形成に寄与するβ−カテニンおよびプラコグロビン−LEF/TCF複合体の標的遺伝子である(Conacci-Sorrell et al., 2002)。NRCAMの細胞外ドメインは、メタロプロテアーゼ様活性により、細胞表面から外れる可能性がある。このようにして外れたドメインは、マウスにおいて、様々なシグナル伝達経路を活性化し、細胞の運動性を高め、腫瘍を形成させることができる(Conacci-Sorrell et al., 2005)。

【0102】

NRCAMは、正常な脳と比較し、未分化星状細胞腫およびGBMの腫瘍組織においてアップレギュレートされ、NRCAMレベルの上昇は浸潤行動と関連している (Sehgal et al., 1998)。NRCAMに対するアンチセンスRNAは、ヒトGBM細胞の腫瘍形成能を低下させる(Sehgal et al., 1999)。

【0103】

インスリン様成長因子2 mRNA結合タンパク質3（IMA-IGF2BP3-001）
IGF2BP3はインスリン様成長因子II mRNA結合タンパク質ファミリーの一員であり、mRNAの局在化、代謝回転、翻訳調節に関係があるとされている。このタンパク質にはいくつかのKH（K−相同性）ドメインが含まれ、RNA結合において重要であり、RNAの合成および代謝に関与していることが知られている。発現は主に胚発生時に起こり、いくつかの腫瘍で報告されてきた。そのため、IGF2BP3は癌胎児性タンパク質であると考えられている(Liao et al., 2005)。対照組織と比較し、多数の癌組織でIGF2BP3の転写レベルが高くなっていることは、IGF2BP3タンパク質が形質転換細胞の増殖に機能的役割を果たしていることを示している。この仮説はIGF2BP3転写産物を発現した、唯一の非悪性ヒト組織はヒト胎盤であり、この組織は細胞成長と増殖を特徴としているという所見によって裏付けられる(Mueller-Pillasch et al., 1997)。

【0104】

科学文献では、GBMにおけるIGF2BP3発現に関する具体的な情報はないが、このタンパク質はいくつか他の悪性腫瘍でも過剰発現されることが報告された。

【0105】

例えば、IGF2BP3は明細胞のRCC検体で発現され、その発現は原発腫瘍の進行期および悪性度と関連している。例えば、IGF2BP3発現が陽性の場合、遠隔転移のリスクが5〜10倍高くなることと関連しており、RCCによる死亡リスクが42％〜50％高くなることと関連している(Hoffmann et al., 2008; Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008)。またIGF2BP3の発現は、異形成の特徴がある場合でも、発現が明らかではない良性の母斑と比較し、悪性メラノーマで検出された(Pryor et al., 2008)。食道扁平上皮癌に罹患した患者では、IGF2BP3のHLA-A*2402拘束性エピトープペプチドに特異的なT細胞は、全症例の40％で腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、局所リンパ節のリンパ球、末梢血リンパ球に観察することができた(Mizukami et al., 2008)。

【0106】

IGF2BP3は膵臓癌でも多く発現される。2研究では、膵臓組織サンプルの90％超で免疫染色後にIGF2BP3発現が示されたが、非腫瘍性膵臓組織はIGF2BP3が陰性であった。さらに、IGF2BP3発現は腫瘍の病期と共に進行性に増加した(Yantiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008)。
IGF2BP3発現は高悪性度の尿路上皮腫瘍で有意に増加することも分かったが、良性の尿路上皮または低悪性度の尿路上皮腫瘍では一般に発現されない。さらに、IGF2BP3陽性腫瘍の患者はIGF2BP3陰性腫瘍の患者よりも、無進行生存率および無病生存率がはるかに低い(Li et al., 2008; Sitnikova et al., 2008; Zheng et al., 2008)。

【0107】

BCAN−ブレビカン（IMA-BCA-002）
ブレビカン（BCAN）は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのレクチンファミリーの脳特異的な構成要素である。2種類のBCANアイソフォームが報告されており、細胞外基質に分泌される全長のアイソフォームと、グリコフォスファチジル（GPI）アンカーを予測する配列を持つ、短いアイソフォームである。分泌されたアイソフォームは出生時から8歳までは高く発現され、20歳までに低レベルにダウンレギュレートされ、正常成人の大脳皮質ではこのレベルが維持される。GPIアイソフォームは、発達中、一様に低レベルで発現される(Gary et al., 2000)。BCANは通常、成人の神経系で細胞および神経突起の運動を妨げるバリア分子として説明される、プロテオグリカンファミリーに属する(Viapiano and Matthews, 2006)。in vivoでは、BCANは吻側細胞移動経路の境界あたりで発現され(Jaworski and Fager, 2000)、神経損傷後のグリア性瘢痕で主にアップレギュレートされる成分である (Jaworski et al.,1999)。

【0108】

BCANは神経膠腫で劇的にアップレギュレーションを示し、通常レベルよりも約7倍発現が増加していることが検出される可能性がある(Gary et al., 2000; Gary et al., 1998)。発現は実験的に誘導した腫瘍の浸潤境界で検出可能であり (Glass etal., 2005)、浸潤性の高い腫瘍で増加する (Phillips et al., 2006)。臨床的には、BCANのアップレギュレーションは、高悪性度神経膠腫患者の生存率が悪いことと関連している(Liang et al., 2005)。神経膠腫におけるBCANのアップレギュレーションに加え、全長タンパク質のタンパク質プロセシングも浸潤に寄与している可能性がある(Gary et al., 1998; Nutt et al., 2001)。ADAMTSファミリーのメタロプロテアーゼによるBCANの開裂は、神経膠腫の浸潤促進作用に介在する上で必要な段階である。ADMATSによる開裂に抵抗性の部位特異的突然変異型を作製したことで、この「開裂できない」BCANは、in vitroでは神経膠腫細胞の浸潤を亢進することができず、in vivoでは腫瘍の進行を促すことができないことが示された (Zhang et al.,1998; Viapiano et al., 2008)。分子レベルでは、BCANはEGFRの活性化を促進し、細胞接着分子の発現を亢進し、フィブロネクチンの分泌を促す(Hu et al., 2008)。

【0109】

BCANのmRNAは、神経学的合併症を呈さずに死亡した成人ヒト患者の皮質サンプルには検出されなかった。際立って対照的に、BCANのmRNAはヒト神経膠腫の手術時サンプル27例全てに検出されたため、BCANは神経膠腫の独特で選択的なマーカーと考えられることを提示している(Jaworski et al., 1996)。

【0110】

神経膠腫におけるBCANのアップレギュレーションは、全体的に発現を亢進させるだけでなく、特異的に糖化されたアイソフォームを神経膠腫特異的に発現させる。従って、B/b_Δgはコアタンパク質の糖化が不完全であるか、抑制されて発生したBCAN mRNAの全長生成物である。B/b_Δgは出生前後半および生後数日の発達中は非常に低レベルで発現され、生後1年までに消失し、正常な成人の脳にはないが、高悪性度神経膠腫のサンプルには認められる。一研究では、grade3および4の高悪性度神経膠腫サンプルの全てにB/b_Δgが認められ、管理水準以上に過剰発現した、開裂していないBCAN全体の半数を占めることを示すことができた。B/b_Δg陰性のサンプルは、低悪性度腫瘍と診断された患者に対応していた(Viapiano et al., 2005)。従って、この高悪性度神経膠腫に特異的な発現は、神経膠腫進行に関係があるとされる、初期発達段階のプログラムが再活性化されたものである可能性がある(Seyfried, 2001)。IMA-BCA-002は、その配列内に潜在的なグリコシル化部位を含む。IMA-BCA-002は、グリコシル化部位のないBCAN（IMA-BCA-001）由来の別のペプチドと比較し、免疫原性が非常に高いことが示された。さらに、BCANは、in vivoで多能性および腫瘍原性が最も高いことが示されているGBM癌幹細胞の一種に、選択的に過剰発現されることが報告された (Gunther et al.,2008)。

【0111】

Metプロトオンコジーン（肝細胞成長因子受容体）（IMA-MET-005）
METプロトオンコジーンのc-Metは、細胞の増殖、分化、運動性、接着、浸潤の調節能を有する膜貫通チロシンキナーゼ受容体をコードする。c-Metは肝細胞成長因子（HGF）によって活性化される(Giordano et al., 1989; Trusolino and Comoglio, 2002)。

【0112】

c-Metのシグナル伝達は、臓器再生（肝臓および腎臓で証明された）、胚形成、造血、筋発生、また、正常に活性化されたB細胞と単球の遊走および接着の制御に関与している(Naldini et al., 1991; Mizuno et al., 1993; Bladt et al., 1995; Schmidt et al.,1995; Zarnegar and Michalopoulos, 1995; van der Voort et al., 1997; Beilmann etal., 2000)。

【0113】

様々な腫瘍タイプに関する研究では、HGF/c-Metオートクラインループなどc-Metの活性化、点突然変異の活性化、TPR-Met融合タンパク質、c-METをα鎖およびβ鎖に開裂することができないなど、いくつかのメカニズムが証明された(Park et al., 1986; Mondino et al., 1991; Ebert et al., 1994; Schmidt et al.,1997; Olivero et al., 1999; Park et al., 1999; Di Renzo et al., 2000)。リン酸化による構成的c-Met活性化は、ヒト明細胞RCCの腫瘍形成の重要なメカニズムとして同定された(Nakaigawa et al., 2006)。

【0114】

さらに、多数の研究から、悪性細胞の悪性形質転換および侵襲性にc-Metの過剰発現が関与していることが示唆された。c-Metは、HGFの多機能性および潜在的発癌活性に介在する(Bottaro et al., 1991; Rubin et al., 1993; Zarnegar and Michalopoulos, 1995)。HGFは受容体に結合することで、c-Metの自己リン酸化を誘導し、ras、ホスファチジルイノシトール3’−キナーゼ、ホスホリパーゼC、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ関連経路など、下流のシグナル伝達イベントを活性化する(Naldini et al., 1991; Ponzetto et al., 1993; Montesano et al., 1998; Furge etal., 2000; Dong et al., 2001; Furge et al., 2001)。c-Met遺伝子は主に上皮細胞で発現され、いくつかの悪性組織および細胞株で過剰発現されている(Di Renzo et al., 1995; Ferracini et al., 1995; Tuck et al., 1996; Koochekpour et al., 1997; Fischer et al., 1998; Ramirez et al., 2000; Li et al., 2001;Maulik et al., 2002; Qian et al., 2002)。

【0115】

c-Metの過剰発現は腫瘍の低酸素状態により誘導されることが多く、受容体の構成的活性化につながり、予後が悪いことと関連している。内因性c-MET遺伝子のサイレンシングによりin vitroで浸潤性増殖プログラムを完全に実行できなくなり、腫瘍が発育しなくなり、in vivoでは実験的転移の生成が低下する (Corso et al.,2008)。

【0116】

c-METの過剰発現はGBMで報告された (Tso et al.,2006)。c-Metは腫瘍の組織学的悪性度と関連していることから、HGF/c-METオートクラインループの形成は星状細胞脳腫瘍の進行と平行して発生することが示唆される。そのため、HGFは、c-Met受容体を有するGBM細胞に対して強力な遊走／浸潤誘導活性を示すと考えられる(Moriyama et al., 1999)。c-Metプロモーターには低酸素誘導因子−1結合部位が含まれるため、低酸素状態によりc-Metプロモーターが活性化され、その発現がアップレギュレートされることが示された。ヒトGBM全体のおよそ半数が、HGFの腫瘍細胞遊走に対する刺激効果を高める可能性のあるc-Metの誘導により、低酸素状態に反応すると考えられ(Eckerich et al., 2007)、神経幹細胞を腫瘍に引き寄せる可能性がある (Kendall et al., 2008)。c-MetとEGFRは悪性星状細胞腫で共発現されることが多い(Reznik et al., 2008)。c-Met受容体のリン酸化部位の活性化は、EGFRvIIIレベルに非常に反応しやすいことが示されたため、神経膠芽細胞腫においてEGFRvIIIとc-Met受容体との間にクロストークがあることが提案されている(Huang et al., 2007a; Huang et al., 2007b)。METは、GBMにおける癌幹細胞のマーカーであることが示唆された(Nam et al., 2008)。別の研究では、METがGBM由来癌幹細胞の異なるサブタイプで選択的に過剰発現されることが示された (Gunther et al., 2008)。

【0117】

HGFに対するヒト中和抗体のAMG102を用いた再発性GBM患者に関する第II相試験の中間結果から、治療を行った患者18例中1例は部分的奏功を示し、1例はわずかな奏功を示し、2例は病態が安定していたため、一部の患者では、疾患がc-MET：HGFシグナル伝達経路に依存している可能性があることが示唆される(Reardon et al., 2008)。

【0118】

興味深いことに、METシグナル伝達が、大腸癌でアップレギュレートされることが多いWnt/beta−カテニン経路と相互作用するという根拠が一部示されている。METはプロスタグランジンE2（PGE2）により活性化される可能性があり、PGE2により活性化されたc-Metはβ−カテニンと関連し、チロシンリン酸化を亢進することで、大腸癌細胞の浸潤性を誘導する(Pai et al., 2003)。最近、METとβ−カテニンが相互に活性化していることが報告され、これにより大腸の腫瘍形成において、これら2つの主要因子の間に正のフィードバック・ループあることになる(Rasola et al., 2007)。

【0119】

原発性CRC腫瘍（n＝36）におけるc-Met mRNAの発現レベルは早期浸潤と局所的腫瘍転移の重要な予測マーカーであるため、大腸癌の病期と直接関連性がある(Takeuchi et al., 2003)。CRCサンプル130例のc-Met発現を検討した別の分析では、69％の原発性CRCでc-Metが過剰発現し（T/N＞2.0）、血管への浸潤（P＝0.04）を伴うCRCおよび進行期（P＝0.04）で有意にc-Metレベルが高いことが示され、ヒトCRCの進行と転移にc-Metが関与していることを支持している(Zeng et al., 2004)。別の研究では、結腸腺癌60例の69％でc-Met mRNAが隣接する正常粘膜の2倍、48％で10倍高くなっていることが示された(Kammula et al., 2007)。従って、早期CRCではc-Metのシグナル伝達が亢進していることが多いが、進行期の疾患と転移性疾患ではさらに発現が高くなっている。

【0120】

表４：本発明の組成物に有用な追加免疫原性ペプチド

【表4】

【0121】

配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６はWO2007/028574で開示され、CDC42（細胞分裂周期42）は細胞周期の制御に関与するタンパク質である。このタンパク質はRhoサブファミリーの低分子GTPアーゼであり、細胞の形態、遊走、移動、エンドサイトーシス、細胞周期の進行など、様々な細胞機能を管理するシグナル伝達経路を制御している。CDC42は神経膠芽細胞腫で大きく過剰発現されることが分かった。

【0122】

WO2004/067023では、腫瘍関連抗原サービビンに由来するMHCクラスI拘束性ペプチドについて報告しており、このペプチドは高い親和性でクラスIのHLA分子に結合できる。

【0123】

骨シアロタンパク質I（BSP-1）、早期Tリンパ球活性化タンパク質（ETA-1）、また最も一般的にはオステオポンチン（OPN）としても知られる分泌性リンタンパク質1（SPP1）はヒト遺伝子産物であり、他の種でも保存されている。オステオポンチンは骨再形成の重要な因子として関係があるとされてきた。特に、研究では、破骨細胞を骨の無機物基質に固定する役割を果たしていることが指摘されている。骨の有機物部分は乾燥重量の約20％であり、オステオポンチン以外の部分として、I型コラーゲン、オステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質、アルカリホスファターゼが含まれる。I型コラーゲンがタンパク質質量の90％に相当する。

【0124】

OPNは、白血球で発現されるα4β1、α9β1、α9β4など、数種類のインテグリン受容体に結合する。これらの受容体は、白血球細胞の接着、遊走、生存に働くことが十分確立されている。そのため、最近の研究努力は、このような反応に介在する上でのOPNの役割に焦点が当てられている。

【0125】

オステオポンチンは、マクロファージ、好中球、樹状細胞、TおよびB細胞など、一連の免疫細胞において、様々な動態で発現される。OPNは様々な方法で免疫調節因子として作用することが報告されている。まず、OPNには化学走性があり、細胞の炎症部位への補充を促す。接着タンパク質としても機能し、細胞接着および創傷治癒に関与する。さらに、OPNは細胞の活性化とサイトカイン産生に介在し、アポトーシスを制御することで細胞の生存を促す。

【0126】

活性化されたT細胞はIL-12の働きを受けてTh1タイプに分化し、IL-12およびIFNγなどのサイトカインを産生する。OPNはTh2サイトカインIL-10の産生を抑制し、Th1応答を亢進する。OPNは細胞性免疫に影響し、Th1サイトカインの機能を有する。また、B細胞の免疫グロブリン産生と増殖を増進する。2008年に実施された最近の研究では、OPNが肥満細胞の脱顆粒を誘導することが示唆されている。［NagasakaA, Matsue H, Matsushima H, et al. (February 2008). "Osteopontin isproduced by mast cells and affects IgE-mediated degranulation and migration ofmast cells". Eur. J. Immunol. 38 (2): 489-99］この研究者らは、IgEが介在するアナフィラキシーは、野生型マウスと比較し、OPNノックアウトマウスで有意に減少することを観察した。マクロファージの活性化におけるOPNの役割は癌研究でも意味づけられ、この研究では、OPNを産生する腫瘍がOPNを産生しない腫瘍と比較し、マクロファージの活性化を誘導できることを発見した［21］。

【0127】

OPNは多くの状況で重要な抗アポトーシス因子である。OPNは、マクロファージおよびT細胞、また有害刺激に曝露した線維芽細胞や内皮細胞の活性化誘導細胞死を阻害する。OPNは炎症性大腸炎の非プログラム細胞死も予防する。

【0128】

OPNが遍在的に発現された複数の細胞表面受容体と相互作用するという事実は、創傷治癒、骨代謝回転、腫瘍形成、炎症、虚血、免疫応答など、多くの生理的、病的プロセスにOPNが積極的に関与していることを示している。従って、血漿OPNレベルを操作することは、自己免疫疾患、癌転移、骨粗鬆症、一部のストレスの治療に有用と考えられる。

【0129】

OPNはIL-17産生を促進することが示されたが、OPNは肺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌、メラノーマ、中皮腫など、様々な癌で過剰発現されており、OPNは糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎のいずれにも関与し、OPNは動脈内の粥状斑に認められる。従って、血漿OPNレベルを操作することは、自己免疫疾患、癌転移、骨粗鬆症、一部のストレスの治療に有用と考えられる。

【0130】

受容体型タンパク質チロシンホスファターゼξ１（PTPRZ1、PTP-ξ）
PTPRZ1は、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの一員であり、細胞質側に2つのチロシンタンパク質ホスファターゼドメイン、α−炭酸脱水酵素ドメイン、フィブロネクチンIII型ドメインを持つ、1回膜貫通型I型膜タンパク質をコードしている。この遺伝子の発現は、胃癌細胞(Wu et al., 2006)、乳癌 (Perez-Pinera et al., 2007)、複数の硬化病変の稀突起膠細胞による再ミエリン化(Harroch et al., 2002)、低酸素条件下でのヒト胎児腎臓細胞 (Wang et al., 2005)で誘導される。
タンパク質と転写産物は共に神経膠芽細胞腫の細胞で過剰発現され、走触性の遊走(Lu et al., 2005)、および神経膠芽細胞腫でのゲノムDNAの増幅 (Mulholland et al., 2006)を促す。

【0131】

キチナーゼ3様2（CHI3L2）
CHI3L2は最初に軟骨細胞から同定され、変形性関節症などでアップレギュレートされる(Steck et al., 2002)。このタンパク質はまだ十分に特徴が決定されていないが、細胞外間隙に分泌される可能性が最も高い。しばしば、関節リウマチの標的抗原として説明されてきた。ヒト神経膠腫細胞株のsiRNA形質移入により、実験的に抗血管形成作用を誘導すると（VEGF-A）、CHI3L2がアップレギュレートされた。

【0132】

サービビン（BIRC5）
アポトーシス阻害タンパク質（IAP）ファミリーの一員であるBIRC5（サービビン）の発現は、胎生組織および様々なヒト癌で上昇している。サービビンは、細胞増殖とアポトーシス細胞死の両方の調節が可能であると思われる。特に神経膠芽細胞腫では、非常に高レベルのサービビンの発現が検知できる(Angileri et al., 2008)。脳神経膠腫中のサービビン過剰発現が悪性増殖、抗アポトーシスおよび血管形成に重要な役割を果たしている可能性があることが指摘されている(Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006)。特に神経膠芽細胞腫では、ただし他の腫瘍にも当てはまるが、サービビン陰性腫瘍患者と比較し、サービビンの発現が悪性度（神経膠芽細胞腫においてサービビンの発現が最も高い）および全体的な生存期間が短いことと有意に関連していた(Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002;Chakravarti et al., 2002)。

【0133】

B型肝炎コア抗原
B型肝炎ウイルス（HBV）コアタンパク質HBcでは、免疫原性ペプチドがよく知られている(Bertoletti et al., 1993; Livingston et al., 1997)。HBcの10アミノ酸ペプチドは、本発明に基づき、患者の免疫能および癌ワクチンへの免疫付与成功の陽性コントロールに含めることができる。

【0134】

本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は配列番号：１および、配列番号：１２または配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを含む。

【0135】

本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は配列番号：１のアミノ酸配列と配列番号：２および／または配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを含む。

【0136】

本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は配列番号 配列番号：３のアミノ酸配列と配列番号：２および／または配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを含む。

【0137】

本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は配列番号配列番号：１のアミノ酸配列と配列番号：７および任意で配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを含む。

【0138】

本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は配列番号：２のアミノ酸配列と配列番号：７および任意で配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを含む。

【0139】

本発明の好ましい実施形態において、前記医薬組成物は配列番号 配列番号：３のアミノ酸配列と配列番号：７および任意で配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、少なくとも2つのペプチドを含む。

【0140】

さらに好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、配列番号：２〜１１および配列番号：１４〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列、および／または配列番号：２〜１１または配列番号：１４〜２０の配列と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む少なくとも一つのペプチド、および／または配列番号：２〜１１または配列番号：１４〜２０をコードする核酸を含むポリヌクレオチド、またはその変異型アミノ酸配列、および薬学的に許容される担体を含む。

【0141】

本発明のさらに好ましい実施形態は、配列番号：１〜１２および配列番号：１４〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列および／または配列番号：１〜１２の配列と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18個のペプチド、および／または配列番号：１〜１２および配列番号：１４〜２０をコードする核酸を含むポリヌクレオチド、またはその変異型アミノ酸配列、および薬学的に許容される担体を含む。

【0142】

以下にさらに説明される通り、前記医薬組成物は、より効果的にするため、さらに追加ペプチドおよび／または添加物を含むことができる。

【0143】

特定のアミノ酸配列の「異型アミノ酸配列」により、発明者は、例えば、1もしくは2アミノ酸残基の側鎖を（例えば、これを別の自然に発生したアミノ酸残基の側鎖または一部の他の側鎖と置換することにより）変更していることを意味し、特定のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、ペプチドがなおもHLA分子に結合することができるようにする。例えば、HLA-Aまたは-DRなどの適切なMHC分子と相互作用し、結合する能力を改善しない場合も、少なくとも維持できるように、また、本発明の観点において定義したアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現した細胞を認識し、死滅させることができる、活性化CTLを発生させる能力を改善しない場合も、少なくとも維持できるように、ペプチドを修飾してもよい。データベースから導出できる通り、HLA-A結合ペプチドの特定の位置は典型的にはアンカー残基であり、HLA結合溝の結合モチーフに合うコア配列を形成している。

【0144】

T細胞受容体と相互作用することが不可欠ではないこれらのアミノ酸残基は、実質上T細胞の反応性に影響せず、また関連するMHCとの結合を阻害しない、他のアミノ酸との置換によって修飾できる。そのため、本発明のペプチドは、所定の条件とは別に、アミノ酸配列または、その一部分または変異体を含んだいずれかのペプチド（この用語により、発明者はオリゴペプチドまたはポリペプチドを含む）である。

【0145】

さらに、MHCクラスII提示ペプチドは、特定のHLA特異的アミノ酸モチーフを持つ「コア配列」と、任意選択として、コア配列の機能を阻害しないN末端および／またはC末端伸長アミノ酸配列（すなわちこのペプチドとT細胞との相互作用とは無関係とみなされる）からなることが知られている。N末端および／またはC末端の伸長は、それぞれ例えば、1から10アミノ酸長である。これらのペプチドはMHCクラスII分子に直接載せるために使用するか、または以下に示す方法で、この配列をベクターに入れてクローン化できる。これらのペプチドは、細胞内で、より大きなペプチドがプロセシングされた最終産物であるため、より長いペプチドも、同様に利用できる。本発明のペプチドは、いずれのサイズでもよいが、一般的には分子量は100,000未満、好ましくは50,000未満、より好ましくは10,000未満、より好ましくは5,000未満、より好ましくは2,500未満であり、また通常は約1000〜2000である。アミノ酸残基数に関して、本発明のペプチドは1000残基未満、好ましくは500残基未満、より好ましくは100残基未満である。さらに、本発明ではペプチド組成物およびその変異体も提供するが、前記ペプチドまたは変異体は、全体が8から100アミノ酸長、好ましくは8から30アミノ酸長であり、最も好ましくは8から17アミノ酸長、すなわち8、9、10、11、12、13、14、15または16アミノ酸長である。好ましくは、配列番号：８、配列番号：１２および配列番号：１４〜２０からなる群から選択したコア配列を持ち、C末端および／またはN末端が1〜10アミノ酸伸長したコア配列を持つペプチドであり、より好ましくは、これらの隣接アミノ酸の総数が1〜12残基、より好ましくは1〜8残基、より好ましくは1〜6残基であり、配列番号：８、配列番号：１２、および配列番号：１４〜２０いずれかの前記ペプチドと同様に、前記ペプチドがHLA分子に結合できるならば、前記隣接アミノ酸は前記C末端および前記N末端にどのような比率でも分配することができる（例えば、全ての隣接アミノ酸を片方の末端に加えるか、前記アミノ酸を両方の末端に等しく、又は他のいかなる比率でも加えることができる）。

【0146】

従って、本発明のペプチドとのT細胞交差反応を誘導する変異体は、しばしは長さが異なる変異体である。

【0147】

約12アミノ酸残基より長いペプチドがMHCクラスII分子との結合に直接使用われる場合、コアHLA結合部位に隣接するアミノ酸残基は、MHCクラスII分子の結合溝に特異的に結合する、あるいは、CTLにペプチドを提示する、ペプチドの能力に実質上影響しない残基であることが好ましい。しかし、すでに上述した通り、より大きなペプチドは適当な抗体提示細胞によって断片化されるため、特に、ポリペプチドによってコードされる場合は、このようなより大きなペプチドが利用可能であることは理解される。さらに、前記隣接アミノ酸はin vivoにおいてペプチド分解速度を減速させることができ、CTLが利用できる実際のペプチド量が、隣接アミノ酸がないペプチドと比較して多くなるようにする。

【0148】

また、通常8から10アミノ酸長のMHCクラスIエピトープは、実際のエピトープを含んだより長いペプチド、またはタンパク質からプロセシングされたペプチドから作製することも可能である。MHCクラスIIエピトープと同様、実際のエピトープのNおよびC末端上流および／または下流の伸長した前駆ペプチドの隣接する残基は、実質的にCTLへのペプチド提示に影響せず、また前記伸長したペプチドのプロセシングにより、実際のエピトープが生成するために必要なタンパク質分解的切断部位を隠さないことが好ましい。

【0149】

好ましくは、配列番号：１〜７および配列番号：９〜１１からなるコア配列を持ち、C末端および／またはN末端が1〜10アミノ酸伸長したペプチドであり、より好ましくは、これらの隣接アミノ酸の全数が1〜12残基、より好ましくは1〜10残基、より好ましくは1〜8残基、より好ましくは1〜6残基であり、前記ペプチドが配列番号：１〜７、および配列番号：９〜１１いずれかの前記ペプチドと同様に、なおもHLA分子に結合できるならば、前記隣接アミノ酸はC末端およびN末端にどのような比率でも分配することができる（例えば、全ての隣接アミノ酸を片方の末端に加えるか、前記アミノ酸を両方の末端に等しく、又は他のいかなる比率でも加えることができる）。

【0150】

さらに本発明では、MHCクラスIエピトープのペプチドおよび変異体も提供し、このペプチドまたは変異体の全体は、8〜100アミノ酸長であり、好ましくは8〜30アミノ酸長であり、最も好ましくは8〜18アミノ酸長、すなわち8、9、10、11、12、13、14、15、16または17アミノ酸長である。

【0151】

当然のことながら、本発明のペプチドまたは変異体は、ヒトMHCクラスIあるいはII分子に結合する能力を持つ。MHC複合体へのペプチドまたは変異体の結合は、例えば、本発明の以下の例で説明される方法、または異なるMHCクラスII対立遺伝子に関する文献で報告された方法など、該分野で既知の方法により検討することができる（例として、VogtAB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R;Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated fromself-peptides; J Immunol. 1994; 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V,Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specificcontact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149;Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G,Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibilityleukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F,Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide bindingspecificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritisassociation; .J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC,Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen toclass II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993;163(2): 209-216; Boyton RJ,Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG,Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responsesassociated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis indisease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenicmice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776）。

【0152】

さらに、Nおよび／またはC末端に位置する付加的なアミノ酸ストレッチは、必ずしも、MHC分子の実際のエピトープとして機能するペプチドの一部を形成しているわけではないが、それでも、本発明のペプチドを細胞に効率的に導入するために重要と考えられる（上記参照）。本発明の1つの実施形態において、本発明のペプチドが、例えば、NCBIのGenBank受入番号X00497由来のHLA-DR抗原関連不変鎖の80残基のN末端アミノ酸（p33、以下「Ii」）を有する融合タンパク質である（Strubin,M., Mach, B. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for theHLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)）。

【0153】

好ましくは医薬組成物において、前記ペプチドの全体は8〜100アミノ酸長、好ましくは8〜30アミノ酸長、最も好ましくは8〜17アミノ酸長、または9、10、11、12、13、14、15、または16アミノ酸長である。

【0154】

さらに、前記ペプチドまたは変異体は、より強い免疫応答を引き起こすため、MHC分子に対する安定性および／または結合性を向上できるようにさらに修飾される。そのようなペプチド配列の最適化の方法は、該分野では良く知られており、逆方向ペプチド結合または非ペプチド結合の導入などがある。

【0155】

従って、本発明の別の観点では、少なくとも1つのペプチドまたは変異体が非ペプチド結合を含む医薬組成物を提供する。

【0156】

逆方向ペプチド結合において、アミノ酸残基はペプチド（-CO-NH-）結合ではなく、逆向きに結合している。このようなレトロインバーソ型ペプチド模倣物は、例えば、参照文献として引用されるMeziereet al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載のように、該分野で知られている方法で作製される。この方法では、骨格の変化はあるが側鎖方向は変化させずに擬ペプチドを作製する。Meziereら（1997）は、これらの擬ペプチドが、MHCとヘルパーT細胞応答に有用であることを示している。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含むレトロインバーソ型ペプチドは、タンパク質分解にはるかに耐性がある。

【0157】

非ペプチド結合とは、例えば、-CH₂-NH、-CH₂S-、-CH₂CH₂-、-CH=CH-、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-、およびCH₂SO-などのことである。米国特許4,897,445では、標準的方法で合成したポリペプチドを含むポリペプチド鎖内の非ペプチド結合（-CH₂-NH）と、NaCNBH₃存在下アミノアルデヒドとアミノ酸を反応させ合成した非ペプチド結合の固相合成法が提供されている。

【0158】

上述の本発明の配列を持つペプチドは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端にある別の化学基を用いて合成され、例えば、ペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、および／または親和性を向上させることもできる。例えば、カルボベンゾキシル基、ダンシル基、またはt−ブチルオキシカルボニル基などの疎水基は、ペプチドのアミノ末端に付加できる。同様に、アセチル基または9−フルオレニルメトキシ−カルボニル基をペプチドのアミノ末端に付加することもできる。さらに、疎水基、t−ブチルオキシカルボニル基、またはアミノ基を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することもできる。

【0159】

さらに、本発明の全てのペプチドは、その立体配置が変化するように合成することもできる。例えば、通常のL異性体の代わりに、前記ペプチドの1個またはそれ以上のアミノ酸残基のD異性体を使用する。さらに、本発明のペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基を、既知の合成アミノ酸残基の1つに置換してもよい。このような変化は、本発明のペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、および／または結合作用を向上させることもある。

【0160】

同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前後において、特定のアミノ酸と反応して化学的に修飾することもできる。このような修飾の例は、当該分野では良く知られており、本明細書で参考文献として引用した、R.Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005などに要約されている。アミノ酸の化学的修飾としては、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元的アルキル化、2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、カルボキシル基のアミド修飾、およびシステインからシステイン酸への過蟻酸酸化によるスルフィドリル修飾、水銀誘導体の形成、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドとのカルボキシメチル化、およびアルカリ性pH下でのシアン酸塩とのカルバモイル化が挙げられるが、これだけに限定されない。これに関して、当業者は、より広義なタンパク質の化学修飾に関する方法論について、Eds.ColiganらのCurrent Protocols In Protein Science（John Wiley & Sons NY1995-2000）の15章を参照されたい。

【0161】

治療用のタンパク質およびペプチドをPEGによりうまく修飾できると、しばしば循環血液中の半減期の延長につながり、一方、グルタルアルデヒト、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドによるタンパク質の架橋は、ヒドロゲルの調製用として使われる。免疫療法のためのアレルゲンの化学的修飾は、しばしばシアン酸カリウムとのカルバミル化によって達成される。

【0162】

一般的に、（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を持つ）ペプチドおよび変異体は、Luet al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433および参考文献で開示されているように、固相ペプチド合成のFmocポリアミド法によって合成される。

【0163】

精製は、再結晶、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常）アセトニトリル／水の勾配分離などによる逆相高速液体クロマトグラフィーの1つあるいはその組み合わせにより達成される。

【0164】

ペプチド解析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動、特にキャピラリー電気泳動、固相抽出（CSPE）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析および、高速原子衝撃（FAB）質量分析法、そしてMALDIおよびESI-Q-TOF質量分析法にて行われる。

【0165】

本発明のさらなる観点では、本発明のペプチドもしくは変異体をコードする核酸（例、ポリヌクレオチド）を提供する。前記ポリヌクレオチドはDNA、cDNA、PNA、CAN、RNAなどであり、一本鎖および／または二本鎖、天然型または例えばホスホロチオエート結合骨格を有するポリヌクレオチドなどの安定型ヌクレオチド、またはその組み合わせであってもよく、また、ペプチドをコードしている限り、イントロン含有または不含どちらの場合であってもよい。当然のことながら、前記ペプチドは、ポリヌクレオチドでコード可能な天然発生のペプチド結合によって連結される天然発生のアミノ酸残基を含むペプチドのみである。さらに、本発明のさらなる観点では、本発明に記載のポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。異なる細胞タイプの発現ベクターは該分野で周知であり、必要以上に実験を重ねなくても選択可能である。

【0166】

一般的に、DNAは、発現の適切な配向と正しいリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要に応じて、DNAは、目的とする宿主に認識される適切な転写および翻訳の調節制御ヌクレオチド配列に連結されるが、そのような制御は一般に発現ベクターで行われる。続いてベクターは、標準的な技術で宿主に導入される。指針は、Sambrooket al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NYなどに見ることができる。

【0167】

ただし、本発明の特に好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、配列番号：１〜１２に示されたアミノ酸配列からなる、少なくとも2つのペプチドを含む。

【0168】

ワクチンおよび最適な投与法に含めるべき各ペプチドの最適量は、必要以上に実験を重ねなくても当業者が決定することができる。例えば、ペプチドまたはその変異体を、静脈内注射（i.v.）、皮下注射（s.c.）、皮内注射（i.d.）、腹腔内注射（i.p.）または筋肉内注射（i.m.）として調製してもよい。ペプチドの好ましい注射経路は、s.c.、i.d.、i.p.、i.m.、i.v.である。DNAの好ましい注射経路は、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.、i.v.である。ペプチドまたはDNAの投与量は、例えば、1〜500mg、50μg〜1.5mgであり、好ましくは125μg〜500μgであり、投与量は各ペプチドやDNAにより異なる。この範囲の投与量は、これまでの試験で成功裏に使用された（Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G,Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Møller M, Eriksen JA, Gaudernack G; .Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-smallcell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M.Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer,S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluatethe safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCOmeeting 2007; Abstract No 3017）。

【0169】

本発明の医薬組成物は、前記組成に存在するペプチドの選択、数、および／または量が組織、癌、および／または患者特異的となるように作ることができる。例えば、ペプチドは、特定組織の親タンパク質の発現パターンによって正確に選択し、副作用を避けることができる。この選択は、治療を行う患者が罹患している具体的な癌のタイプ、および癌の状態、早期治療法、患者の免疫状態、また当然ながら、患者のHLAハプロタイプに左右される。さらに、本発明のワクチンには、特定の患者の個人的必要性によって、個別の成分を含めることができる。例えば、特定患者の関連するTAAの発現によってペプチドの量が異なる、個人的なアレルギーまたは他の治療のため望ましくない副作用が生じる、初回の治療または治療計画後の二次的な治療を調節するなどである。

【0170】

例えば、GBMのワクチンとして使用される組成物については、親タンパク質が正常組織で大量に発現されるペプチドは、本発明の組成物中には避けるか、少量とする。他方、患者の腫瘍が特定のタンパク質を大量に発現していることが分かっている場合、この癌の治療に用いる個別の医薬組成物は大量としてもよく、および／またはこの特定タンパク質またはこのタンパク質の経路に特異的なペプチドを2種類以上含めてもよい。当業者は、例えば、in vitroにおけるT細胞の作製、およびその効率と全体的な存在、特定ペプチドに対する特定T細胞の増殖、親和性、増大、またT細胞の機能性を、例えばIFN-γ産生を分析することにより検討することで、免疫原性ペプチドの好ましい組み合わせを選択することができる（以下の例も参照）。続いて、通常、最も効率的なペプチドは、上述の目的においてワクチンとして混合される。

【0171】

適切なワクチンは、好ましくは1〜20個のペプチド、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20種類の異なるペプチド、さらに好ましくは6、7、8、9、10、11、12、13、または14種類の異なるペプチド、最も好ましくは10、11、12、13、または14種類のペプチドを含む。癌ワクチンに使用するペプチドの長さについては、いかなる適切なペプチドとしてもよい。特に、適切な9 merのペプチド、または適切な8 merまたは9 merまたは10 merまたは11 merのペプチド、または12 mer、13 mer、14 mer、または15 merとしてもよい。より長いペプチドも適当であり、添付の表１および２に説明されている9 merまたは10 merのペプチドがMHCクラスIペプチドに適しているが、12〜15 merがMHCクラスIIペプチドには適している。

【0172】

前記ペプチドは腫瘍または癌ワクチンの構成要素となる。本ワクチンは患者、患部の器官、または全身に直接投与するか、または、その後患者に投与される、患者またはヒト細胞株に由来の細胞にex vivoで適用するか、あるいはin vivoで使用して、その後患者に再投与される、患者由来の免疫細胞の亜集団を選択する。

【0173】

前記ペプチドは実質的に純粋であるか、免疫刺激アジュバントと併用されるか（以下参照）、または免疫刺激性サイトカインと併用される、あるいはリポソームなど適当な送達システムを用いて投与される。前記ペプチドは、また、キーホールリンペットヘモシアニン（HLH）またはマンナンなど、適切な担体に接合させることもできる（WO95/18145およびLongenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291参照）。前記ペプチドは、標識化するか、融合タンパク質とするか、ハイブリッド分子とすることもある。配列が本発明で与えられるペプチドは、CD4T細胞またはCD8 CTLを刺激することが期待される。ただし、逆のCDに陽性のT細胞による助けがあると、刺激はより効率的となる。従って、CD4 T細胞を刺激するMHCクラスIIエピトープに対し、融合パートナーまたはハイブリッド分子の一部は、CD8陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。他方、CD8CTLを刺激するMHCクラスIエピトープに対し、融合パートナーまたはハイブリッド分子の一部は、CD4陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。CD4およびCD8を刺激するエピトープは、該分野で良く知られており、本発明により同定されたエピトープを含む。

【0174】

薬学的に許容される担体はよく知られており、通常は液体で、この担体中に有効な治療薬が調剤される。前記担体は製剤に薬理活性を与えないが、化学的および／または生物学的安定性、放出特性などを与えることができる。典型的製剤は、例えばAlfonsoR. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition.Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000などに見ることができ、生理食塩水、水、緩衝用水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸、デキストロースなどを含むが、これに限定されない。最近、長年、ヒト患者の静脈栄養に利用されてきた若干の脂肪乳剤が、ペプチドの溶媒としての役割を果たすことができることが分かった。そのような乳剤の2つの例は、イントラリピッド、リポフンディンとして知られる市販の脂肪乳剤である。「イントラリピッド」は米国特許3,169,094に報告された、静脈栄養用脂肪乳剤に付けられた、スウェーデンKabiPharmacia社の登録商標である。「リポフンディン」は、ドイツB. Braun Melsungen社の登録商標である。いずれも脂肪として大豆油を含む（1,000mlの蒸留水中、100gまたは200g：それぞれ10%または20%）。イントラリピッドでは卵黄リン脂質が乳化剤として使用され（12g/l蒸留水）、リポフンディンでは卵黄レシチンが使用されている（12g/l蒸留水）。イントラリピッドおよびリポフンディンのいずれにおいても、グリセロール（25g/l）が添加され、等張性が保たれている。

【0175】

免疫応答を誘導するため、通常、前記組成物により高い免疫原性を与えるアジュバントを含めることが必要である。そのため、本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物がさらに少なくとも1つの適切なアジュバントを含む。

【0176】

アジュバントは、免疫応答（例えば、抗原に対するCTLおよびヘルパーT（T_H）細胞介在による免疫応答）を非特異的に増強または促進する物質であり、そのために本発明の薬剤に役立つと考えられる。適切なアジュバントには、1018ISS、アルミニウム塩、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、Mologen社のdSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド、ImuFactIMP321、インターフェロン−αまたはβ、IS Patch、ISS、ISCOM、JuvImmune、LipoVac、MF59、モノホスホリルリピドA、および他の非毒性LPS誘導体、モンタニドIMS1312、モンタニドISA 206、モンタニドISA 50V、モンタニドISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel（登録商標）ベクター系、PLG微粒子、レシキモド、SRL172、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、YF-17D、VEGFtrap、R848、β−グルカン、Pam3Cys、サポニン、マイコバクテリア抽出物、合成細菌細胞壁模倣体由来のAquila's QS21 stimulon（AquilaBiotech、米国マサチューセッツ州ウースター）、およびRibi's Detox. QuilまたはSuperfosなど、他の所有権のあるアジュバントが含まれるが、これに限定されない。イミキモド、レシミキモド、不完全フロイント、インターフェロン−α、もしくはGM-CSFなどのアジュバントなども好ましい。樹状細胞およびその調製物に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（MF59など）については、これまでに報告がある（DupuisM, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendriticcells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol.1998; 186(1):18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants;Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11）。またサイトカインを使用してもよい。いくつかのサイトカインは、リンパ系組織への樹状細胞の遊走に対する影響（例えば、TNF-α）、Tリンパ球に効率的に抗原を提示する抗原提示細胞への樹状細胞の成熟加速（例えば、GM-CSF、IL-1、IL-4）（米国特許5,849,589、その全体を本明細書の参考文献として明確に引用している）、さらに免疫アジュバントとしての作用（例えば、IL-12）などに、直接関連性があった（GabrilovichDI, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendriticcells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis TumorImmunol. 1996 (6):414-418）。

【0177】

CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドも、ワクチン環境におけるアジュバントの作用を増強することが報告されている。理論に拘束されずに、CpGオリゴヌクレオチドは、Toll様受容体（TLR）、主としてTLR9によって生来の（獲得）免疫系を活性化することで作用する。CpGによって誘導されたTLR9活性化は、ペプチドもしくはタンパク抗原、生ウイルスもしくは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自家細胞ワクチン、および予防／治療用ワクチン両方の多糖類接合体を含む、種々様々の抗原に対する抗原特異的体液性および細胞性免疫応答を増強する。さらに重要なことには、この活性化は、CD4T細胞の助けがない状態でさえ、樹状細胞の成熟および分化を増強し、T_H1細胞の活性化の増強、および強力な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の生成をもたらす。TLR9刺激により誘導されたT_H1バイアスは、通常、T_H2バイアスを促進するミョウバンもしくは不完全フロイントアジュバント（IFA）のようなワクチンアジュバントが存在する状態でさえ維持される。CpGオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントと処方された場合もしくは併用して投与された場合、または微粒子、ナノ粒子、脂肪乳剤などの製剤もしくは同様の製剤の場合、さらに大きなアジュバント活性を呈するが、それは抗原が比較的弱い場合に、強い応答を誘導するために特に必要である。CpGオリゴヌクレオチドは免疫応答も加速し、抗原投与量を約2桁減少させることができ、一部の実験では、CpGを用いない全量ワクチンに対する抗体応答と同等である（ArthurM. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, NatureReviews, Drug Discovery, 2006, 5, 471-484）。米国特許6,406,705 B1は、抗原特異的免疫応答を誘導するためにCpGオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバントおよび抗原を組み合わせた使用について記述している。市販のCpGTLR9拮抗薬は、本発明の医薬組成物の好ましい成分であるMologen社（ドイツ、ベルリン）によるdSLIM（ダブルステムループ免疫賦活剤）である。RNA結合TLR7、TLR8および／またはTLR9など、他のTLR結合分子も使用される。

【0178】

他の有用なアジュバントの例には、化学的に修正されたCpGs（例えば、CpR、Idera）、Poly(I:C)、（例えば、polyI:C12U）、非CpG細菌DNAもしくはRNAの他にも、イミダゾキノリン、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、ZD2171、AZD2171、イピリムマブ、トレメリムマブおよびSC58175などの免疫活性小分子および抗体が上げられ、これらは治療用としておよび／またはアジュバントとして作用しうるが、それらだけに限定されるものではない。本発明の状況において有用なアジュバントおよび添加物の量および濃度は、必要以上に実験を重ねなくても熟練した当業者により容易に決定されうる。

【0179】

好ましいアジュバントはdSLIM、BCG、OK432、イミキモド、レシミキモド、GM-CSF、インターフェロン−α、PeviTer、およびJuvImmuneまたはその併用である。

【0180】

本発明の医薬組成物の好ましい実施形態において、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF、サルグラモスチム）、イミキモド、レシミキモド、インターフェロン−αなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。

【0181】

本発明の医薬組成物の好ましい実施形態において、アジュバントはイミキモドまたはレシミキモドである。本発明の医薬組成物の好ましい実施形態において、アジュバントはGM-CSFおよびレシミキモドの併用である。

【0182】

この医薬組成物は、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内などの非経口投与、または経口投与に用いられる。このため、ペプチドおよび任意選択の他の分子は、薬学的に許容される、好ましくは水性担体に溶解または懸濁される。さらに、前記組成物は緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含むこともできる。前記ペプチドは、サイトカインなどの免疫刺激物質と併用投与することもできる。そのような組成物に使用できる賦形剤の広範なリストは、例えばA.Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd Ed. 2000, AmericanPharmaceutical Association and pharmaceutical pressなどから引用することができる。前記組成物は、腺腫または癌性疾患、好ましくはCRCの阻止、予防および／または治療に利用することができる。

【0183】

細胞傷害性T細胞（CTL）は、完全な外来抗原自体ではなく、MHC分子に結合したペプチドの形で抗原を認識する。MHC分子自体は抗原提示細胞の細胞表面にある。そのため、ペプチド抗原、MHC分子、APCの三量体複合体が存在する場合しか、CTLの活性化を行うことができない。対応して、ペプチドがCTLの活性化に利用されるだけでなく、さらにAPCと各MHC分子が追加される場合、免疫応答を増進させることができる。

【0184】

従って、好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物がさらに少なくとも1つの抗原提示細胞を含む。

【0185】

抗原提示細胞（または刺激細胞）は通常は表面にMHCクラスIまたはII分子を有し、一実施形態では、抗原提示細胞自体が実質的に選択される抗原をMHCクラスIまたはII分子に載せることができない。以下に詳細に説明する通り、前記MHCクラスIまたはII分子は、invitroにおいて選択される抗原を容易に載せることができる。

【0186】

好ましくは、哺乳動物細胞に、TAPペプチドトランスポーターがないか、そのレベルが低下しているか、機能が低下している。TAPペプチドトランスポーターがない適切な細胞は、AmericanType Culture Collection（12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA）からカタログ番号CRL1992として販売されている、ヒトペプチドを載せた欠損細胞株T2などである。T2などのTAP欠損細胞株はAPCとして利用でき、TAPがないため、MHCクラスIによって提示されるほぼ全てのペプチドが、これら細胞株の空のMHCクラスI分子を細胞外に載せるために使用される監視下のペプチドとなる。したがって全ての効果は使用したペプチドに明確に帰着することになる。

【0187】

好ましくは、前記抗原提示細胞が樹状細胞である。当然のことながら、前記樹状細胞は自己樹状細胞であり、抗原ペプチドでパルスされている。前記抗原ペプチドは、適切なT細胞応答を引き起こす、いかなる適切な抗原ペプチドであってもよい。腫瘍関連抗原のペプチドをパルスした自己樹状細胞を用いるT細胞療法については、Murphy et al (1996) The Prostate 29, 371-380, and Tjua et al (1997) The Prostate 32,272-278で開示されている。

【0188】

そのため、本発明の好ましい実施形態において、少なくとも1つの抗原提示細胞を含む医薬組成物は、例えば実施例４の方法によりペプチドがパルスされているか、ペプチドが載せられている。

【0189】

別の可能性として、前記抗原提示細胞はペプチドをコードする発現構成物を含む。ポリヌクレオチドはいかなる適切なポリヌクレオチドであってもよく、樹状細胞を形質導入でき、結果としてペプチドを提示し、免疫を誘導できることが好ましい。

【0190】

便宜上、本発明の核酸はウイルスのポリヌクレオチドまたはウイルスに含まれていてもよい。例えば、アデノウイルスを形質導入した樹状細胞は、MUC1と関連し、抗原特異的抗腫瘍免疫を誘導することが示された（Gonget al (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028を参照）。同様に、アデノウイルスを基本とした系を利用することができ（例えば、Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363を参照）、レトロウイルス系を利用することができる（Specht et al(1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221およびSzabolcs et al (1997)）。樹状細胞への血液粒子が介在した移動も利用することができ（Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707）、RNAも利用することができる（Ashley et al (1997)J. Exp. Med. 186, 1177 1182）。

【0191】

一般に、本発明の核酸を含む本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドを含む医薬組成物と同様、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、腫瘍内、経口、経皮、経鼻、頬側、直腸、経膣、吸入、または局所投与により、投与することができる。

【0192】

腫瘍は、回避メカニズムにより、投与している薬物に耐性を生じることが多い。薬物耐性は投与中に発生し、転移および腫瘍の再発として現れる。そのような薬物耐性を回避するため、腫瘍は薬物を併用して治療されることが多く、無病期間後の転移と腫瘍の再発には、しばしば異なる併用が必要となる。そのため、本発明の一観点では、前記医薬組成物を第2の抗癌剤と併用投与する。第2の薬剤は、本発明の医薬組成物の前後またはこれと同時に投与する。同時投与は、化学的性質から混合可能であれば、例えば、本発明の医薬組成物を第2の抗癌剤と混合することにより達成可能である。同時投与の別の方法は、本発明の医薬組成物を例えば注射し、第2の抗癌剤を例えば経口投与するなどの投与経路から、前記組成物と抗癌剤を同じ日に別々に投与するものである。前記医薬組成物と第2の抗癌剤は同じ投与経路で投与することもできるが、異なる日および／または別の投与経路で投与することもできる。

【0193】

本発明の別の観点では、本発明の医薬組成物のいずれか1つを治療有効量で患者に投与することを含め、患者の癌を治療または予防する方法を提供する。

【0194】

治療有効量は、特にCTL亜集団の活性化など、免疫応答を誘導するために十分な量である。当業者は、本明細書の例で提供される方法などの標準的免疫学的方法を利用することで、ある量が有効か否かを容易に決定することができる。医薬組成物のある量の効果をモニターする別の方法は、治療している腫瘍の発育および／またはその再発を観察することである。

【0195】

本発明の特に好ましい実施形態においては、前記医薬組成物を抗癌ワクチンとして使用する。

【0196】

ペプチドまたはペプチドをコードする核酸を含む組成物が腫瘍または癌ワクチンを構成することも可能である。本ワクチンは患者、患部の器官、または全身に直接投与するか、または、その後患者に投与される、患者またはヒト細胞株由来の細胞にex vivoで適用するか、あるいはin vivoで使用して、その後患者に再投与される、患者由来の免疫細胞の亜集団を選択する。

【0197】

本発明の組成物は、癌の治療法に利用するか、癌ワクチンとして利用することができる。前記癌は、口腔および咽頭の癌、消化管の癌、結腸、直腸、肛門の癌、気道の癌、乳癌、子宮頸部、膣、外陰部の癌、子宮体部および卵巣の癌、男性生殖器の癌、尿路の癌、骨および軟組織の癌、カポジ肉腫、皮膚のメラノーマ、眼球メラノーマ、メラノーマ以外の眼球癌、脳および中枢神経系の癌、甲状腺および他の内分泌腺の癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および骨髄腫であってもよく、好ましくは、腎臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、脳腫瘍、GISTまたは神経膠芽細胞腫、好ましくは脳腫瘍、さらに好ましくは神経膠芽細胞腫であってもよい。

【0198】

本発明の治療法またはワクチンの最も好ましい実施形態において、前記ワクチンはGBM治療用の複数ペプチドを含む腫瘍ワクチンである。好ましくは、前記ワクチンが配列番号：１〜１２から選択される一連の腫瘍関連ペプチドを有し、このペプチドは原発性膠芽腫細胞に認められ、この細胞で同定されている。この一連のペプチドには、HLAクラスIおよびクラスIIペプチドが含まれる。前記一連のペプチドは、HBVコア抗原のペプチドなど、少なくとも1つのペプチドを含み、皮内投与の効率を検証する免疫マーカーとして機能する、陽性コントロールペプチドとして用いられる。特定の一実施形態では、前記ワクチンが（配列番号：１〜１２の）個別のペプチド14個から成り、各ペプチドは約1500μg〜約75μg、好ましくは約1000μg〜約175μg、より好ましくは約500μg〜約600μg、最も好ましくは約578μgであり、全てHPLCおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製され、白色から黄色がかった白色の粉末に見える。凍結乾燥品は好ましくは炭酸水素ナトリウムに溶解し、室温で再溶解後30分以内に皮内注射に用いる。本発明によれば、好ましいペプチドの量は、溶液500μlあたり約0.1〜100mg、好ましくは約0.1〜1mg、最も好ましくは約300μg〜800μgで変化する可能性がある。本明細書において、「約」という用語は、別に記載のない限り、特定の値の平均+/-10％を意味する。当業者は、実際に使用するペプチドの量を、例えば個別患者の免疫状態、および／または特定の癌タイプに存在するTUMAPの量など、いくつかの要因に基づき、調節することができる。本発明のペプチドは、凍結乾燥品の代わりに他の適切な形態（滅菌溶液など）で提供されることもある。

【0199】

前記医薬組成物は、遊離型のペプチドあるいは薬学的に許容される塩型のペプチドのいずれかを含む。

【0200】

ここに使用されるような「薬学的に許容される塩」は、開示されたペプチドの誘導体を言い、前記ペプチドは、作用薬の酸性または塩基性塩を調製することにより修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応に関与する遊離塩基（通常、中性型の薬物は中性NH₂基を持つ）から調製される。酸性塩の調製に適当な酸は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）だけでなく、有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）も含む。反対に、ペプチドに存在する酸部分の塩基性塩の調製は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンのような薬学的に許容される塩基を使用して調製される。

【0201】

特に好ましい実施形態において、前記医薬組成物は酢酸（酢酸塩）、アンモニウム、あるいは塩酸（塩化物）の塩としてペプチドを含む。

【0202】

別の実施形態において、本発明の医薬組成物が、骨格形成物質として糖類、糖アルコール、グリシン、アルギニン、グルタミン酸などのアミノ酸などを含む。前記糖類は一、二、三糖であってもよい。これらの糖類は単独で用いるか、糖アルコールと併用して使用されることもある。糖類の例は、単糖としてグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、またはソルボース、二糖としてサッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、三糖としてラフィノースなどである。糖アルコールは、例えば、マンニトースとしてもよい。好ましい成分は、サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マンニットおよび／またはソルビット、より好ましくはマンニトールである。

【0203】

さらに、本発明の医薬組成物は、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化物質、フェノール、m−クレゾール、メチル−またはプロピルパラベン、クロロブタノール、チオマーサル、またはベンズアルコニウムクロライドなどの保存料、安定剤、サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マンニトース、マンニットおよび／またはソルビット、マンニットおよび／またはラクトースなどの骨格形成物質、およびポリエチレングリコール（PEG）、つまりPEG3000、3350、4000、または6000、またはシクロデキストリン、つまりヒドロキシプロピレン−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−β−シクロデキストリンまたはγシクロデキストリン、またはデキストランまたはポロキサマー、つまりポロキサマー407、ポロキサマー188、またはTween 20、Tween 80などの可溶化剤など、生理学的に忍容性に優れた賦形剤（Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5^thed., edited by Raymond Rowe, Paul Sheskey and Sian Owen, Pharmaceutical Press(2006)を参照）を含む。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物が抗酸化物質、骨格形成物質、安定剤からなる群から選択される、1つ以上の忍容性に優れた賦形剤を含む。

【0204】

許容可能なpH範囲は、静脈内および筋肉内投与でpH2〜12であるが、in vivoでは希釈率が減少し、注射部位で放散する可能性が高くなるため、皮下ではこの範囲は2.7〜9.0に減少する。Strickley Robert G., Pharm. Res., 21, NO:2, 201 - 230 (2004)。

【0205】

本発明のペプチドおよび／または核酸を含む本発明の医薬組成物は、それぞれのペプチドまたは抗原が関連した腺腫様または癌性疾患に罹患した患者に投与される。これにより、T細胞性免疫応答が誘導される可能性がある。

【0206】

本発明の医薬組成物が好ましいのは、前記組成物に存在する（特に腫瘍関連）ペプチド、本発明の核酸、または本発明の発現ベクターの量が組織、癌、および／または患者特異的である場合である。

【0207】

本発明の別の実施形態において、前記ワクチンは核酸ワクチンである。ポリペプチドをコードしたDNAワクチンなどの核酸ワクチンを接種すると、T細胞応答が誘導されることが知られている。本ワクチンは患者、患部の器官、または全身に直接投与するか、または、その後患者に投与される患者またはヒト細胞株に由来の細胞にex vivoで適用するか、あるいはin vivoで使用して、その後患者に再投与される患者由来の免疫細胞の亜集団を選択する。細胞にin vitroで核酸を投与する場合は、インターロイキン−2またはGM-CSFなどの免疫刺激サイトカインを同時発現できるように細胞に核酸を形質移入することが有用である。前記核酸は実質的に純粋であるか、免疫刺激アジュバントと併用されるか、または免疫刺激性サイトカインと併用される、あるいはリポソームなど適当な送達システムを用いて投与される。前記核酸ワクチンは、ペプチドワクチンについて上述したように、アジュバントと併用投与されることもある。前記核酸ワクチンがアジュバントなしで投与される場合も好ましい。

【0208】

ポリヌクレオチドは実質的に純粋であり、適切なベクターまたは送達系に含まれる。適切なベクターと送達系は、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスや、複数のウイルスの要素を含むハイブリッドウイルスを基にした系などの、ウイルス系である。ウイルスを用いない送達系は、陽イオン性脂質や陽イオン性ポリマーなどで、DNA送達に関する技術分野で周知である。「遺伝子銃」などの、物理的な送達法を使用してもよい。ペプチドまたは核酸でコードされたペプチドは、例えば、CD4陽性T細胞を刺激する破傷風トキソイドのエピトープとの融合タンパク質である。

【0209】

当然のことながら、患者に投与される核酸は滅菌されており、発熱性物質を含まないものとする。裸DNAは、筋肉内または経皮または皮下投与することができる。便宜上、前記核酸ワクチンはいかなる適切な核酸送達手段を有してもよい。前記核酸、好ましくはDNAは、リポソームまたはウイルスベクター送達系の一部として送達されてもよい。DNAワクチンなどの核酸ワクチンは筋肉に投与される場合に好ましいが、ペプチドワクチンは好ましくはs.c.またはi.d.投与される。前記ワクチンが皮膚に投与されることも好ましい。

【0210】

樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞による核酸の取り込みとコードされたポリペプチドの発現は、免疫応答のプライミングのメカニズムであると考えられるが、樹状細胞は組織中の形質移入された細胞から、発現されたペプチドを受け取ることができるため、樹状細胞は形質移入されないと考えられるが、まだ重要である（「クロスプライミング」、例えば、ThomasAM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA,Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin-specific CD8(+) T cell responsesprovide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells invaccinated pancreatic cancer patients. J Exp Med. 2004 Aug 2; 200(3):297-306）。

【0211】

ポリヌクレオチドによる癌の免疫療法については、Conryet al (1996) Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al (1996) NatureMedicine 2, 1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al(1996) J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65, 664-670;およびBurchellet al (1996) 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics,Calvo et al (Eds), John Libbey Eurotextに報告されており、全ての参考文献が、その全体の参照として本明細書に組み込まれている。

【0212】

注射部位で、標的化ベクターおよび送達系を利用することにより、または患者のそのような細胞集団の選択的精製およびペプチドまたは核酸のex vivo投与により、前記ワクチンの標的を特定の細胞集団、例えば、抗原提示細胞とすることも有用である（例えば、樹状細胞は、Zhou et al (1995)Blood 86, 3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651に報告される通り分類することができる）。例えば、標的化ベクターには、適切な場所で抗原を発現させる、組織または腫瘍特異的プロモーターが含まれる。

【0213】

最後に、本発明のワクチンは、治療を行う患者が罹患している具体的な癌のタイプ、および癌の状態、早期治療法、患者の免疫状態、また当然ながら、患者のHLAハプロタイプに左右される可能性がある。さらに、本発明のワクチンには、特定患者の個人的必要性によって、個別の成分を含めることができる。例えば、特定患者の関連するTAAの発現によってペプチドの量が異なる、個人的なアレルギーまたは他の治療のため望ましくない副作用が生じる、初回の治療または治療計画後の二次的な治療を調節するなどである。

【0214】

本発明のペプチドは、癌の治療に有効であるのに加えて、診断にも有効である。前記ペプチドは神経膠芽細胞腫から作製し、しかも正常組織には存在しないことが判明しているため、癌の有無を診断するために使用できる。

【0215】

本発明のペプチドが組織生検に存在することを、病理学者の癌診断に役立てることができる。病理学者は、抗体、マススペクトロメトリー、または該分野で既知の他の方法を用いて本発明の特定のペプチドを検出し、その組織が悪性または炎症性、あるいは病変組織であるかを判断できる。本発明のペプチドのグループが存在すれば、病変組織の分類または下位分類が可能である。

【0216】

特に、Tリンパ球が既知である、またはTリンパ球が作用機序に関わっていると予想される場合は、病変組織標本で本発明のペプチドを検出することにより、免疫学的療法の有効性を決定できる。MHCの発現欠失は、感染した悪性腫瘍細胞が免疫学的監視から逃れる、十分報告されたメカニズムである。従って、本発明のペプチドの存在は、このメカニズムが分析した細胞により利用されていないことを示している。

【0217】

本発明のペプチドは、T細胞応答など、本発明のペプチドに対するリンパ球応答、または本発明のペプチドまたはMHC分子と複合体を形成した本発明のペプチドに対する抗体応答を分析するために使用されることもある。これらのリンパ球応答は、それ以上の治療段階を決定する際、予後マーカーとして使用できる。これらの応答は、タンパク質ワクチン、核酸、自己物質、リンパ球養子免疫療法など異なる方法を使った、リンパ球応答の誘導を目的とした免疫療法的アプローチにおいて、代理マーカーとしても利用できる。遺伝子療法において、副作用を評価する際、本発明のペプチドに対するリンパ球応答を考慮できる。また、リンパ球応答を監視することで、移植片対宿主病および宿主対移植片病を検出するなど、移植治療の追跡検査に有効であるかもしれない。

【0218】

これに関するまた別の観点では、本発明が（a）上述の医薬組成物（溶液または凍結乾燥物）を含む容器、（b）任意で、希釈剤もしくは、該凍結乾燥製剤用の再溶解用溶液を含む第二の容器、および（c）任意で、（i）溶液の使用あるいは（ii）再溶解および／または該凍結乾燥製剤の使用に関する説明書を含むキットに関する。前記キットはさらに、（i）緩衝剤、（ii）希釈剤、（iii）フィルタ、（iv）針もしくは（v）注射器を1つまたは複数を含むことがある。前記容器は、好ましくはボトル、バイアル、注射器もしくは試験管であり、容器は再利用してもよい。前記医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。

【0219】

本発明のキットには、好ましくは適切な容器中に本発明の凍結乾燥製剤および再溶解および／または使用に関する説明書が含まれる。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル（例えば、ダブルチャンバーバイアル）、注射器（ダブルチャンバー注射器など）および試験管を含む。前記容器はガラスもしくはプラスチックのような様々な材料から形成される。好ましくは、前記キットおよび／または容器は、再溶解および／または使用の方法を示す、容器あるいはその容器に関連する説明書を含む。例えば、ラベルに、前記凍結乾燥製剤が上述のペプチド濃縮物に再溶解されることを表示してもよい。ラベルはさらに、製剤が皮下投与に有用であるか、あるいは皮下投与を意図するものであることを表示してもよい。

【0220】

製剤を入れる容器は再利用可能なバイアルとしてもよく、再溶解した製剤の反復投与（例えば2〜6回）が許される。キットはさらに、適切な希釈剤（例えば重炭酸ナトリウム溶液）を含む、第2容器を含んでもよい。

【0221】

希釈剤および凍結乾燥製剤の混合に際して、再溶解した製剤の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも0.15mg/mL/ペプチド（＝75μg）であり、好ましくは最高3mg/mL/ペプチド（＝1500μg）までである。前記キットはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器および添付文書と使用説明書を含む、商業上および使用者の観点から見て望ましい他の資材を含む。

【0222】

本発明のキットは、他の成分（例えば、他の化合物あるいはこれら他の化合物の医薬組成物）の有無に関わらず、本発明による医薬組成物の製剤を含む単一容器を有してもよく、あるいは各成分を入れる別個の容器を含んでもよい。

【0223】

好ましくは、本発明のキットは、第2化合物（アジュバント（例えば、GM-CSF）、化学療法剤、天然産物、ホルモンもしくは拮抗薬、抗血管形成薬もしくは阻害剤、アポトーシス誘導剤もしくはキレート剤など）、またはその医薬組成物の併用投与を組み合わせる使用目的で包装された本発明の製剤を含む。前記キットの成分は、あらかじめ複合体を形成するか、または各成分が患者に投与する前に個別の容器に入っていてもよい。前記キットの成分は、1つまたはそれ以上の溶液中、好ましくは水溶液、さらに好ましくは無菌水溶液中に提供される。前記キットの成分はまた、固体として提供され、好ましくは他の別個の容器で提供される、適切な溶媒を添加することで液体に変換されてもよい。

【0224】

治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器もしくは固体または液体を入れるその他の手段であってもよい。通常、2つ以上の成分がある時、前記キットは第2のバイアルあるいは他の容器を含み、それにより別々の投与が可能となる。前記キットはまた、薬学的に許容される液体用の別の容器を含んでもよい。好ましくは、治療用キットは器具（例えば、1つまたはそれ以上の針、注射器、点眼容器、ピペットなど）を含み、現在のキットの成分である、本発明の薬剤の投与を可能にする。

【0225】

本発明の製剤は、経口（腸内）、経鼻、点眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、もしくは経皮など、任意の許容可能な経路によるペプチドの投与に適するものである。好ましくは、投与はs.c.で、最も好ましくはi.d.である。投与は輸液ポンプにより行ってもよい。

【0226】

本明細書で開示および報告された本発明の特徴は、明示された各々の組み合わせで使用されるだけでなく、本発明で意図する範囲から逸脱せずに、単一の方法で使用することもできる。本発明の目的のため、本明細書で引用されている全ての参考文献が、その全体の参照として組み込まれている。

【0227】

本発明は、以下の図、配列表、例を参照することで、これからより詳細に説明される。以下の例は説明の目的のみで提供され、本発明を限定する意図はない。

【図面の簡単な説明】

【0228】

【図1】健常ドナーの末梢血から採取したCSP-001およびNLGN4X-001特異的CD8+リンパ球のミクロスフェアによる増殖のテトラマー分析。抗CD28抗体＋高密度腫瘍抗原A*0201/CSP-001（左図）または抗CD28抗体＋高密度腫瘍抗原A*0201/NLGN4X-001（右図）を結合したミクロスフェアを用い、1ウェルあたり1×10⁶個のCD8+強化PBMCを1週間ごとに刺激した。in vitroで3回刺激後、全ての細胞を抗体CD8 FITC、および蛍光標識した四量体A*0201/ CSP-001およびA*0201/ NLGN4X-001により染色した。細胞はCD8+リンパ球のゲートを通過させ、数値はCD8+リンパ球について、図の四分区に入った細胞の割合を示す。

【図2】HLA-A*0201対立遺伝子でコードされるMHC分子に対する、本発明のHLAクラスIペプチドの親和性。IMA950HLAクラスI TUMAP、コントロールペプチドIMA-MUC-001（中等度の結合因子）、およびウイルスマーカーのペプチドHBV-001（強力な結合因子）の解離定数（K_D）は、ELISAに基づくMHCリフォールディング法により測定した。この方法は3回繰り返し、同様の結果を得た。

【図3】IMA-BIR-002およびIMA-MET-005由来の15 merが最も頻度の高いHLA-DR対立遺伝子に結合する際のin vitroにおける相対的結合性。ProImmune REVEAL（商標）技術ではin vitro HLA-DRアセンブリ法を採用し、個別ペプチドの結合定数の主な決定因子の1つとして、MHC：ペプチド複合体のオンレートを決定する。この方法はProImmune（英国オックスフォード）により行う。一定の時点でそのままのMHC：ペプチド複合体の量を測定し、合否判定用のコントロール（相対的に弱い結合因子）の量と比較した。陽性コントロールとして、強力で無差別なHLA-DR結合因子が含まれる。値は合否判定用のコントロールと比較した個別ペプチドおよびHLA-DR分子の結合量を示している。REVEAL（商標）技術は15 merに限定されるため、全長MET-005の代わりに2つの重なった15 mer（位置2-16、6-20）を検討した。

【図4a】図4aと4bは、IFNγ-EliSpotにより決定された、ワクチン接種患者の異なる時点における末梢血単核細胞（PBMC）中のPSMAとサービビン特異的IFNγ分泌CD4⁺T細胞の存在を示すものである。時点は、ワクチン接種前（a）と、ワクチン接種3（b）、6（c）、7（d）、8（e）、9（f）、10（g）、11（h）回後とした。

【図4b】図4aと4bは、IFNγ-EliSpotにより決定された、ワクチン接種患者の異なる時点における末梢血単核細胞（PBMC）中のPSMAとサービビン特異的IFNγ分泌CD4⁺T細胞の存在を示すものである。時点は、ワクチン接種前（a）と、ワクチン接種3（b）、6（c）、7（d）、8（e）、9（f）、10（g）、11（h）回後とした。

【図5】図5は、細胞内染色法（ICS）により決定された、ワクチン接種患者の異なる3時点におけるPBMC中のサービビン特異的IFNγ-、IL-5、IL-10、TNFα分泌CD4⁺T細胞の存在を示すものである。時点は、ワクチン接種1（a）、3（b）、7（c）回後とした。

【発明を実施するための形態】

【0229】

1.合成
ペプチドはFmoc法を利用し、標準的で十分確立された固相合成により合成した。分取用HPLCによる精製後、イオン交換法を行い、生理的に適合可能な対イオン（例えば、酢酸、アンモニウム、または塩化物イオン）を組み込んだ。最終的に、凍結乾燥後、白色から黄色がかった白色の固体が得られた。全てのTUMAPは好ましくは酢酸塩として投与され、他の塩の形態も可能である。

【0230】

重要なことに、ペプチドの同一性と純度は、質量分析、アミノ酸分析、分析用HPLCを用い、容易に、高い精度で決定することができる。分析結果によれば、IMA950ワクチンに用いた全てのペプチドは95％以上の純度で正しい構造を示した。

【0231】

ペプチドFTELTLGEF（HLA-A1、PolyPeptideLaboratories、ドイツ、ウォルフェンビュッテル）、LMLGEFLKL（HLA-A2、Clinalfa、スイス、ジサッハ）、およびEPDLAQCFY（HLA-B35、Poly Peptide Laboratories）は製剤品質のものを入手した。

【0232】

表５：IMA950の物理化学的特徴

【表5】

【0233】

2. 典型的な薬剤組成IMA950の成分
IMA950は、大部分が原発性大腸癌細胞で同定された合成腫瘍関連ペプチド（TUMAP）の混合物からなる。TUMAPには、細胞傷害性T細胞（CD8+T細胞）活性化能を持つ10個のHLAクラスI結合ペプチド、ヘルパーT細胞（CD4+ T細胞）活性化能を持つ1個のHLAクラスII結合ペプチド、および両方の活性化能を持つ1個の伸長HLAクラスI結合ペプチドが含まれる。ヘルパーT細胞は、CD8+T細胞の殺傷機能を高めるサイトカインを放出することで、細胞傷害性T細胞の機能を助ける重要な役割を果たし、腫瘍細胞に直接作用することもある (Knutsonand Disis, 2005)。上記12個のTUMAPに加え、IMA950はウイルスのコントロールペプチドも1つ含む。

【0234】

GBM患者の外科的に切除した悪性組織および正常組織のサンプルおよび健常ドナーの血液は、段階的アプローチで分析した。

【0235】

まず、マイクロアレイによるゲノム規模のmRNA発現分析を利用し、一連の正常な臓器および組織と比較し、悪性組織で過剰発現した遺伝子を同定した。第2段階では、悪性材料のHLAリガンドを質量分析により同定した。その後、同定したHLAリガンドを遺伝子発現データと比較した。第1段階で検出された、選択的に発現または過剰発現された遺伝子によりコードされるペプチドは、マルチペプチドワクチンを開発するために適切な候補TUMAPとみなした。

【0236】

最後に、健常人の末梢CD8+ T細胞は、数種類の免疫測定法（in vitro T細胞測定法）により、腫瘍関連HLAリガンドに対する反応性を検討した。

【0237】

表６：IMA950 TUMAPの組成
典型的IMA950は、10個のHLA-A*02結合ペプチド（クラスI）、1個のHLA-DR結合ペプチド（クラスII）、および1個の伸長HLA-A*02ペプチドを含む。さらに、ウイルスマーカーペプチドHBV-001が含まれるが、ここに記載されていない。

【0238】

表６：TUMAPが由来するタンパク質の機能

【表6】

【0239】

3. 腫瘍サンプルのIMA950に含まれる腫瘍関連ペプチド（TUMAP）の提示
組織サンプル
患者の腫瘍組織は、HopitalCantonal Universitaire de Geneve（腫瘍免疫学癌治療研究室）とNeurochirurgische Universitaets-Klinik Heidelberg（分子生物学研究室）から提供された。手術前に全ての患者から書面でインフォームドコンセントを得た。組織は、術後直ちに液体窒素で衝撃冷凍し、TUMAPを単離するまで−80℃で保存した。

【0240】

組織サンプルからのHLAペプチドの単離
衝撃冷凍した組織サンプルのHLAペプチドプールは、わずかに変更したプロトコール（Falk,K. et al 1991;Seeger, F.H. et al.T 1999）に従い、HLA-A*02特異的抗体BB7.2またはHLA-A、-B、-C特異的抗体W6/32、CNBr活性化セファロース、酸処理、および限外ろ過により、固形組織から免疫沈降によって得た。

【0241】

ESI液体クロマトグラフィー質量分析法（ESI-LCMS）によるTUMAPの検出
方法1：
得られたHLAペプチドプールをその疎水性に従い逆相クロマトグラフィー（CapLC、Waters）により分離し、溶出したペプチドは、ESI源付きハイブリッド四重極直交加速飛行時間型タンデム質量分析計（Q-TOFUltima、Waters）を用いて分析した。ペプチドプールは、濃縮と脱塩のためC18プレカラムに装填された。装填後、5μmの逆相C18充填剤（Dionex）が詰まった溶融石英マイクロキャピラリーカラム（75μmi.d. x 250mm）により分離するため、プレカラムをラインにセットした。溶媒Aは、4mM酢酸アンモニウム水溶液とした。溶媒Bは、2mM酢酸アンモニウムの80％アセトニトリル水溶液とした。両溶媒とも蟻酸でpH3.0に調整した。スプリットシステムで流速を5μl/分から約200nl/分まで減少させながら、90分以内に15％から60％のバイナリー勾配をかけた。金被覆ガラスキャピラリー（PicoTip、NewObjective）をマイクロESI源への導入に使った。TOF分析計の積分時間は内部スキャン遅延時間0.1秒で1.9秒であった。その後、ペプチド配列を衝突誘起解離（CID）質量分析計（ESI-LCMS/MS）で明らかにした。同定したTUMAP配列は、作製された天然TUMAPの断片化パターンを、合成配列の同一参照ペプチドの断片化パターンと比較して確認した。

【0242】

方法2：
得られたHLAペプチドプールをその疎水性に従い逆相クロマトグラフィー（AcquityUPLC system、Waters）により分離し、溶出したペプチドは、ESI源付きLTQオービトラップ型ハイブリッド質量分析計（ThermoElectron）で分析した。ペプチドプールを1.7μmの逆相C18充填剤（Waters）が詰まった分析用溶融石英マイクロキャピラリーカラム（75μm i.d. x 250 mm）に、流速400nL/分とし、直接装填した。その後前記ペプチドは、流速300nL/分で10％から33％に、2段階の180分バイナリー勾配をかけて分離した。勾配は、溶媒A（0.1％蟻酸水溶液）と溶媒B（0.1％蟻酸アセトニトリル溶液）からなる。金被覆ガラスキャピラリー（PicoTip、NewObjective）をマイクロESI源への導入に使った。LTQオービトラップ型質量分析計をTOP5戦略により、データ依存モードで操作した。手短に言えば、オービトラップで（R＝30.000）、高い質量精度の全スキャンからスキャンサイクルを開始し、続いて、以前に選択したイオンを動的排除した5つの最も多量に存在する前駆イオンについて、オービトラップ内で（R＝7.500）MS/MSスキャンを実施した。タンデム質量スペクトルは、SEQUESTおよび別の手動コントロールにより解釈した。同定したTUMAP配列は、作製された天然TUMAPの断片化パターンを、合成配列の同一参照ペプチドの断片化パターンと比較して確認した。図1aおよびbは、腫瘍組織から得たMHCクラスI関連TUMAPの典型的スペクトルを示している。

【0243】

表７は、神経膠芽細胞腫サンプルの分析結果を示しており、殆どは原発性GBM腫瘍のものである。全てのHLA-A*02TUMAPは分析された18サンプルの3個以上で認められ、TUMAPの5個は分析されたGBMサンプルの50％以上で検出された。

【0244】

表７：GBMサンプル中のクラスI TUMAPSの検出
クラスIリガンドについて分析した腫瘍サンプルのみを含めた（「-」＝IMA950クラスI TUMAP非検出、「+」＝IMA950クラスITUMAP検出）

【表7】

【0245】

4. IMA950 MHCクラスI 提示ペプチドのin vitro免疫原性
IMA950に含まれるペプチドの免疫原性について情報を得るため、すでに（Walter,S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cellsexpanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J.Immunol., 171,4974-4978）により報告され、十分確立されたin vitro刺激プラットフォームを用いて検討を行った。このように、IMA950に含まれ、検討されたHLA-A*0201拘束性ペプチド10個中10個について、陽性の免疫原性データを示すことができ、これらのペプチドはT細胞エピトープであり、ヒトではこれに対するCD8+前駆T細胞が存在することを証明している。MET-005は伸長型ではHLA-A*02に結合しなかったため、MET-005の免疫原性はこの方法では検討できなかった。従って、in vitroにおける刺激に不可欠なMET-005との四量体は形成することができなかった。しかし、含まれるHLA-A*02エピトープMET-001（YVDPVITSI、EP1507795B1参照）については、in vitroで免疫原性が示された。APCによる適切で自然に発生するプロセシングの後、MET-005はMET-001特異的CTLを刺激すると考えられている。MET-001の免疫原性は健常ドナーにMET-001特異的CTLが存在することを示しており、癌ワクチンの一部としてのMET-005の有効性には必要不可欠な条件でもある。そのため、MET-001の免疫原性はMET-005の免疫原性の強力な指標である。

【0246】

CD8+ T細胞のin vitroプライミング
ペプチド−MHC複合体（pMHC）と抗CD28抗体を載せた人工抗原提示細胞（aAPC）によるin vitro刺激を実行するために、発明者はまず、標準的な密度勾配分離用溶媒（PAA、Coelbe、ドイツ）を使って、新しいHLA-A*02＋バフィーコートからPBMC（末梢血単核細胞）を単離した。バフィーコートは血液バンクのTuebingenまたはKatharinenhospitalStuttgartから入手した。単離されたPBMCは、10％熱不活性化ヒトAB血清（PAA、Coelbe、ドイツ）が補充されたRPMI−グルタマックス（Invitrogen、Karlsruhe、ドイツ）、100U/mlペニシリン／100μg/mlストレプトマイシン（Cambrex、Verviers、ベルギー）、1mMピルビン酸ナトリウム（CCPro、Neustadt、ドイツ）、および20μgml／ゲンタマイシン（Cambrex）で構成される、ヒトin vitroプライミング用T細胞培地（TCM）で一晩インキュベートした。CD8+リンパ球は、製造業者の指示に従い、CD8+MACS陽性分離キット（Miltenyi、Bergisch Gladbach、ドイツ）を用いて単離した。得られたCD8+細胞は、2.5ng/ml IL-7（PromoCell、Heidelberg、ドイツ）および10U/mlIL-2（Chiron、Munich、ドイツ）が補充されたTCM中で使用するまで、インキュベートした。pMHC／抗CD28被覆ビーズの作製、T細胞刺激および読み出しなどは、わずかな変更を行い、すでに報告の通り（Walteret al., 2003）に実施した。簡単に言うと、膜貫通型ドメインを欠き重鎖のカルボキ末端でビオチン化された、ビオチン化組み換えHLA-A*0201分子は、（Altmanet al., 1996）が報告した方法に従い生成した。精製した共刺激マウスIgG2a抗ヒトCD28 Ab 9.3（Jung et al., 1987）は、製造業者が推奨するように、スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミドビオチンで化学的にビオチン化した。使用したビーズは、5.60μmの大きいサイズのストレプタビジン被覆ポリスチレン粒子（BangsLaboratories、米国イリノイ州）である。陽性および陰性コントロールとして使用したpMHCは、それぞれ、A*0201/MLA-001（修飾Melan-A/MART-1から得たペプチドELAGIGILTV）とA*0201/DDX5-001（DDX5から得たYLLPAIVHI）である。

【0247】

ビーズ800,000個／200μlを、600ngのビオチン抗CD28＋200ngの関連ビオチン−pMHC（高密度ビーズ）あるいは、2ngの関連MHC＋200ngの非関連（pMHCライブラリ）MHC（低密度ビーズ）の存在下、96ウェルプレート中で被覆した。5ng/mlIL-12（PromoCell）が補充された200μl TCM中で2×10⁵個の洗浄済み被覆ビーズおよび1×10⁶個のCD8+T細胞を37℃で3〜4日間共インキュベートし、96ウェルプレート中刺激を開始した。続いて、培地の半分を80U/ml IL-2が補充された新しいTCMと交換し、インキュベーションは37°Cで3〜4日間続けた。この刺激サイクルを合計3回実施した。最後に、四量体分析は、蛍光MHC四量体（(Altman et al., 1996)に報告されている通り作製）＋ 抗体CD8-FITCクローンSK1（BD、Heidelberg、ドイツ）を用い、4色FACS Calibur（BD）にて実施した。ペプチド特異的細胞をCD8+T細胞の合計パーセンテージとして計算した。四量体分析の評価は、ソフトウェアFCS Express（De Novo Software）を用いて行った。特定の四量体＋CD8+リンパ球のin vitroプライミングは、適切なゲート開閉と陰性コントロール刺激との比較によって、検出した。一例の健常ドナーについてin vitroで刺激された評価可能な少なくとも1つのウェルに、in vitro刺激後、特異的なCD8+ T細胞株が含まれることが発見された場合（すなわち、このウェルがCD8+ T細胞中に少なくとも1％の特異的四量体+を含んでおり、特異的四量体＋細胞のパーセンテージが陰性コントロール刺激の中央値の少なくとも10倍であった場合）、特定抗原の免疫原性が検出された。

【0248】

IMA950ペプチドのIn vitro免疫原性
検討したHLAクラスIペプチドについて、in vitro免疫原性はペプチド特異的T細胞株を生成させることにより証明できた。特異的T細胞株が生成したことを示す代表的な染色を図1に示す。結果は表８にまとめる。

【0249】

表８：IMA950に含まれるHLAクラスIペプチドの免疫原性

【表8】

【0250】

Immaticsが実施した、IMA950に含ませる全てのHLAクラスIペプチドに関するin vitro免疫原性実験の結果をここにまとめる。この結果は高密度ビーズでCD8+細胞を刺激することにより得られたものである。ヒト血清ロットが異なると免疫原性の結果に大きな影響を与える可能性があるため、1つあるいは同一血清ロットが使用されたアッセイのみ一緒に評価した。

【0251】

健常血液ドナーから得られたこれらの結果に加え、少数の神経膠芽細胞腫患者では、ペプチドBCA-002、CHI-001、およびNLGN4X-001も検討した。全てのペプチドは健常ドナーと比較し、同程度の免疫原性であることが証明され、このワクチンの関連標的集団には前駆T細胞が存在することを示している。

【0252】

5. IMA950クラスII TUMAP BIR-002の免疫原性
配列番号：１２ペプチドの免疫原性を確認するために、臨床試験を実施した。

【0253】

試験の主な目的は、顕性転移病変が検出されず、根治的前立腺切除術の施行後、生化学的に再発した患者を対象とし、前立腺特異的ペプチドパネルの皮下注投与（ワクチン接種療法）に対するPSA（前立腺特異抗原）に基づく奏効（PSA-R）を検討することであった。

【0254】

試験の第2の目的は、T細胞応答の点から免疫現象を特別に検討した前立腺癌患者について、ワクチン接種療法施行の忍容性と実現性を検討することであった。

【0255】

試験は、「顕性転移病変が検出されず、根治的前立腺切除術を施行後、生化学的に再発した」徴候を検討する、プロスペクティブランダム化第I／II相試験としてデザインされた。

【0256】

試験集団
この第I／II相試験の一部として、根治的前立腺切除術後に生化学的に再発したHLA-A*02⁺患者において、前立腺特異的ペプチドパネルのワクチン接種による腫瘍発育停止の指標として、PSAレベルを軽減させる試みが行われた。前立腺特異的ペプチドの組み合わせが皮下投与され、抗原構造の様々な投与形態に照らし、各免疫応答の程度が評価された。

【0257】

以前のワクチン接種試験とは対照的に、この計画された試験では、画像診断ではまだ検出不可能な、少量の腫瘍組織量を持つ患者の治療を目標とした。患者は全員、既知の前立腺特異的抗原構造を使った同一の方法でワクチン接種を受け、悪性形質転換した細胞への免疫応答を強化した。19例の患者が治療を受けた。

【0258】

表９：試験集団の背景

【表9】

【0259】

治療計画
事前の根治的前立腺切除術後にPSA再発が検出された（14日以上の間隔で2回測定し、PSAが50％上昇した）患者に、CTと骨シンチグラフィーにより顕性転移病変を除外した後、前立腺特異的ペプチドワクチンを異なる投与形態で皮下投与した。ワクチンは0、7、14、28、42、56日目に8倍投与した（1ペプチド、注射1回につき約100mg）。各ワクチン接種後と70日目に再度、PSAを測定し、治療の奏効を評価した。

【0260】

腫瘍の応答（完全寛解［PSA-CR］、部分寛解［PSA-PR］、または安定な臨床経過［変化なし、［PSA-NC］））が検出される場合、患者は、選択した投与形態で維持療法として毎月1回ワクチンを接種した。ワクチン接種療法に対する患者の奏効は以下のように詳細に評価した。

【0261】

完全寛解（PSA-CR）：初期に上昇したPSAレベルが正常化し、これが少なくとも4週間後の測定で確認される。正常化はPSA最低値が＜0.2ng/mlと定義され、全腫瘍または全前立腺の根治的切除術後に期待される。

【0262】

部分寛解：a）PSA-PR≦80％（初期に上昇したPSAレベルの80％減少が、少なくとも4週間後の測定で確認される）、b）PSA-PR≦50％（初期に上昇したPSAレベルの50％減少が、少なくとも4週間後の測定で確認される）。

【0263】

病態安定（PSA-SD）：4週間以上にわたり有意な変化がない。これには、安定化および50％未満の減少および10％未満の上昇が、少なくとも4週間後の測定で確認されることが含まれる。

【0264】

病態進行（PSA-PD）：PSAレベルが10％を超えて上昇する。PSA進行の場合は、試験を中止する。

【0265】

患者の本試験への登録後、エピトープ特異的ワクチンを使用し、前立腺上皮細胞（例えば、PSMA／PSCA）に特異的に発現するタンパク質を検討した。PSAのモニタリングにより評価される残存腫瘍画分の増殖モニリングに関連した、投与ワクチンの全体的有効性を検討することに加え、本試験では免疫系の効果的な調節に関連した、様々なワクチン接種法の効果も検討した。ペプチドのみの単純な皮下投与に加え、様々なアジュバントの併用も利用した。特に、最近非常に好意的に報告された、モンタニド（ヒトでの使用に適した従来からの不完全フロイントアジュバント製剤）ペプチドワクチンのデポーおよびアジュバント活性を利用した。この目的では、ペプチド溶液500μlをモンタニド500μlと混合して投与した。これにより、油中水滴型エマルジョンが形成され、水層に含まれる抗原が数週間かけてゆっくり放出される。このエマルジョンの物理的安定性は非常に高く、4℃で、明らかな相分離を起こさずに3ヶ月を超えて保存できる。モンタニドのデポー製剤としての機能は、数件のワクチン接種試験で開発され、良好な結果を得ている（Oka et al., 2004）。

【0266】

1試験群では、増殖因子GM-CSF製剤である注射用Leukine（登録商標）溶液により、免疫系の同時刺激中にワクチン接種の効能を検討した。GM-CSFはペプチドワクチン接種試験で非常に一般的に使用されるアジュバントであり、この試験のうち数件で臨床的なT細胞応答が強化されることが報告されている。最初に、GM-CSFはワクチン注入部位で樹状細胞数を増加させると考えられる、樹状細胞の補充／分化因子である。GM-CSF自体は、樹状細胞およびマクロファージとしての抗原提示細胞を活性化しないが、in vivoでの間接的活性化が報告されている（Molenkamp et al., 2005）。

【0267】

別の試験群では、イミキモドの経皮投与による樹状細胞の同時活性化中のワクチン接種の有効性を検討した。イミキモドは5％軟膏（Aldara）として投与した。イミキモドはTLR7陽性細胞（例、形質細胞様DC、ランゲルハンス細胞、皮膚DC）への作用を通じて強い免疫刺激作用を有し、MyD88依存性経路を活性化する。活性化APCはT細胞刺激サイトカインと炎症性サイトカインを遊離し、共刺激をアップレギュレートし、流入領域リンパ節まで遊走する。抗原を軟膏中に混合するか、抗原のs.c.またはi.d.注射部位にAldaraを塗布することによりペプチド誘導CTL応答が高まるという、イニキモドの可能性が動物モデルで証明された。

【0268】

別の試験群では、樹状細胞をムチン−1をコードするプロタミン安定化mRNAと混合してTLR7/8を活性化することにより、樹状細胞を同時に活性化している間のワクチン接種の有効性を検討した。mRNAは、マウスおよびヒトの免疫細胞集団を広範囲に活性化することが示された。製剤中に多塩基タンパク質プロタミンが存在すると、mRNAの半減期が増大し、デポーを形成する可能性のある粒子の形成を誘導する。そのため、このアジュバントはデポー形成とAPC活性化の性質を兼ね備えている可能性がある。
要約すると、ワクチンの投与形態には以下の方法が含まれる。
- モンタニド中で乳化されたペプチドワクチンの皮下投与
- 増殖因子の同時投与によりより強力な免疫応答を得る目的で、GM-CSF225μlの局所投与を併用した、モンタニド500μl中に乳化したペプチドワクチンの皮下投与
- 熱で誘導されるより強力な免疫応答を得る目的で行われる局所温熱療法と併用した、モンタニド500μl中に乳化したペプチドワクチンの皮下投与
- TLR 7を介して樹状細胞を活性化するためにイミキモド経皮投与を併用した、モンタニド500μl中に乳化したペプチドワクチンの皮下投与
- TLR7/8によって樹状細胞を活性化するため、ムチン−1のmRNA／プロタミン55μlと共に、モンタニド500μl中に乳化したペプチドワクチンの皮下投与

【0269】

スケジュール：全試験期間は3年であった。
前立腺特異的ペプチドワクチンは0、7、14、28、42、56日目に患者に投与した。病態安定または目的とする腫瘍応答（PSA-CRまたはPSA-PR）が見られる患者では、検出可能な進行が起こるまで毎月1回i.d.でワクチン接種を行った。これまで得られた経験に基づき、ペプチド注射は忍容性があり、重大な有害反応はない。ワクチン接種療法への奏効は、PSA測定に基づき血清学的にのみに評価されたため、検査は試験の開始時に実施し、in vitroのPSA測定を投与ワクチンが妨害するか否かを決定したが、これにより臨床奏効をシミュレートできる。0、7、14、28、42、56、70日目に、臨床検査、PSAレベル、白血球百分率数、FACS分析およびサイトカイン測定用に血液サンプルを採取した。70日目を過ぎて治療が継続される場合、時宜、治療失敗を検出するために、6週間のPSAのモニタリングが実施された。

【0270】

PSA上昇の持続という点からみて疾病の進行が確認されれば、治療は終了とした。

【0271】

免疫療法は84日目に開始し、病態進行が確認されるまで、または最長420日目まで（15ヶ月間）、4週間隔で継続した。本試験終了後に（成功例について）治療を継続するかの決定は、臨機応変に行った。予想外の有害反応は本試験では発生しなかった。

【0272】

臨床検査では、血液凝固、電解質、LDH、β2-M、CK、肝酵素、ビリルビン、クレアチニン、尿酸、総タンパク質、血液凝固、CRP、塗抹による白血球百分率数、PSAレベル、サイトカイン、FACS、Elispotを測定した。

【0273】

確認された細菌および真菌抗原に対する皮膚反応の分析（投与48〜72時間後、T細胞による遅延型過敏症（DTH））は、試験開始前の患者の細胞性免疫系の分析として役立つ。

【0274】

試験に必要なペプチド（ノナペプチド）は、Prof.H.-G. Rammenseeの学部のPD Dr. Stefan Stevanovic研究室で製造された。これらのペプチドはHPLCで精製し、質量分析計で分析された。ペプチドの純度は、HPLC、質量分析計、Edman配列決定により確認することもできる。これらの方法により、最大98％までの純度が確認できる（現状の方法では、どうしても最高とみなされる値である）。合成ペプチドはDMSO（CryoSure、WAKChemie Medical GmbH、10mg/ml）に溶解し、Ampuwa（Fresenius Kabi）で1:10に希釈し、滅菌条件下で分取した。

【0275】

臨床的奏効
患者2例に継続的なデジタル直腸検査によって局所腫瘍が検出された後、PET-CTスキャンで局所再発を発見できた。残る17例の患者では、疾患活動部位を試験終了時に確認できなかった。

【0276】

白血球百分率数または広範な生化学試験の臨床評価を繰り返しても、試験期間中にいかなる異常あるいは変化も発見されなかった。

【0277】

19例の患者のうち16例が配列番号：１２のサービビンIIペプチド（IFN-gELISPOT、+/- ICS）に反応した。このうち12例ではワクチン接種で抗サービビンT細胞応答が誘導され、2例では事前に抗サービビンT細胞が存在し、2例では事前に抗サービビンT細胞が十分存在したどうかは確認されなかった。

【0278】

生化学的奏効
完全奏功とは、PSA値の初期上昇後、共同研究している検査室の検出可能最小値に従い、PSA値が検出不能の場合とみなした。測定は4週間以上の間隔後に確認する必要があった。従って、80％超および50％超のPRは、4週間後に再評価する必要があった。少なくとも4週間後にPSAが50％未満の低下または10％未満の上昇の範囲内と確認されれば、病態安定を示した。病態進行は、治療開始時にPSAの上昇が10％を超えた場合と考えた。

【0279】

試験を中止した患者の生化学的奏効は、患者が局所放射線照射または抗内分泌療法の追加療法を受けるまで追跡した。

【0280】

19例が試験の参加に同意し、最長約3．75年継続した追跡調査によりデータを解析した。

【0281】

PSAの安定とDTの増加
患者2例（10.2％）のPSA値は上述した生化学的奏効基準に従う病態安定を示し、これは、治療開始時に10％を超えていたPSA値は、試験終了時に上昇していなかったことを示している（図6、表１０、11、12）。最後のワクチンを投与後、これらの2症例の追跡調査は14ヶ月間および16ヶ月間実施された。病態安定の平均期間は、データのカットオフ時点で24ヶ月（28ヶ月および31ヶ月）であり、平均ワクチン接種回数は18回（14回および20回）であった。

【0282】

これら2例の患者のうち1例は、9ヶ月間で50％を超える部分的奏功を示し、その後ゆっくりとしたPSAの上昇期間が続き、倍加時間（DT）はワクチン接種前の9.8ヶ月に比べ20.5ヶ月となった。最初のPSA再発は、pT2pN0 Gleasonスコア5の腫瘍の手術後18ヶ月で始まった。

【0283】

データ解析では、患者8は28ヶ月前のワクチン接種プログラム開始時から病態安定を示していた。この患者は10ヶ月後の14回目のワクチン接種後、アレルギー反応のため投与を中止した。この患者はpT3b Gleasonスコア3+4という好ましくない状況であり、根治的前立腺切除術後もPSA最低値が0.6ng/ml未満とならず、PSA進行であり、この進行は術後最初に鈍化した後、適時遅くなることはなかった。倍加時間は6.6ヶ月から148ヶ月まで延びた。

【0284】

これら2例の患者では、ペプチドワクチン接種時に毎回、接種部位にイミキモドも経皮投与した。

【0285】

PSAの安定が認められないPSADTの延長
患者11のPSADTは6ヶ月の試験期間中に1.5ヶ月から10.1ヶ月に延びた。この患者は、PSAが最初に10.8ng/mlであり、17.8ng/mlまで進行したため試験を中止し、PET-CTでは視覚的に悪性病変はなく、抗アンドロゲン単剤療法を受けた。アジュバントとしてAldaraが投与された。

【0286】

患者16は、倍加時間が6.1ヶ月であり、ワクチン投与とムチン−1−mRNA／プロタミンの併用で開始した。PSAの速度は5ヶ月間で半減期2.7ヶ月まで低下し、続いてPSADT上昇の統計的計算値は14.4ヶ月となり、これは治療開始後16ヶ月間続いている。この患者の初期PSA値は0.29ng/mlであり、試験治療を行った最初の5ヶ月間で0.19ng/mlに低下し、次の8ヶ月で0.4ng/mlまで上昇し、治療開始19ヶ月後0.41ng/mlであったため、プロトコールにつき試験を中止した。

【0287】

PSA進行
患者5は、ワクチン接種前の推定PSA倍加時間から判断して試験中に進行した。しかし、この患者はPSA低下を経験し、治療終了後半減期が20.2ヶ月であり、データカットオフ時点で10ヶ月間継続していた。この患者はワクチン接種終了後2回目の治療を受けなかった。この患者には、唯一のアジュバントとしてモンタニドをワクチン接種した。

【0288】

表１０：PSA倍加時間（月）

【表10】

【0289】

7. 本発明のHLAクラスI拘束性ペプチドのHLA-A*0201への結合
目的および概要
本分析の目的は、IMA950の作用機序の重要なパラメータであるため、HLA-A*0201対立遺伝子によってコードされるMHC分子へのHLAクラスIペプチドの親和性を評価することであった。HLA-A*0201への親和性は、IMA950およびMET-001では、10個のHLAクラスI拘束性ペプチド全てにおいて中等度から高度であり、解離定数（KD）は0.14（MET-001）から2.05nM（CSP-001）であった。全ての値が、強力な結合因子HBV-001の0.1から中等度の結合因子MUC-001の4.4までの範囲内にあった。これらの結果から、ワクチン候補のIMA950およびMET-005由来MET-001からHLA-A*02のHLAクラスIペプチド全てにおいて強い結合親和性が確認された。

【0290】

試験の原理
安定なHLA／ペプチド複合体は、HLA重鎖、β2ミクログロブリン（b2m）、およびペプチド性リガンドの3つの分子からなる。変性組み換えHLA-A*0201重鎖分子単独の活性は、その重鎖分子に「空のHLA-A*0201分子」と同等な機能を与えながら保存することができる。これらの分子は、b2mと適切なペプチドを含む水性緩衝剤に希釈すると、完全にペプチド依存的に迅速に効率よく折り畳まれる。これらの分子の有用性は、ペプチドとHLAクラスI分子間の相互作用の親和性を測定する、ELISAに基づくアッセイで利用されている（Sylvester-Hvidet al., 2002）。

【0291】

精製された組み換えHLA-A*0201分子は、b2mと共にインキュベートされ、関心のあるペプチドの用量を評価した。HLAクラスI結合能を持たない全長MET-005に代わり、証明されたA*0結合生成物のMET-001を分析に含めたが、これは自然発生する抗原プロセシングによりMET-005からin vivoで作製した。新規折り畳みHLA／ペプチド複合体の量は、定量的ELISA法で測定した。解離定数（KD値）は、較正物質であるHLA／ペプチド複合体を希釈して記録した標準曲線を用いて計算した。

【0292】

結果
結果は、図２に示している。KD値が低いほどHLA-A*0201への親和性は高い。殆どのIMA950ペプチドは、0.1nM（HBV-001、強力な結合因子）から44.4nM（MUC-001、中等度の結合因子）の範囲でHLA-A*0201に対して同様の強い親和性を示した。従って、全てのIMA950クラスITUMAPはMHC分子A*02に対して中等度から強度の結合親和性を持つ。

【0293】

8. 本発明のHLAクラスII拘束性ペプチドのHLA-DRへの結合
目的および概要
クラスII TUMAPは、クラスI拘束性TUMAPにより誘導されるCTLの機能を補助する上で重要な役割を果たすヘルパーT細胞を活性化する。IMA950クラスIIペプチドが数種類の異なるHLAクラスII分子に結合することは（無差別な結合）、ワクチン候補IMA950を投与した患者の大部分が補助的なヘルパーT細胞応答の利益を得ることができる、ということを確認するために重要である。例えば、最も優位に発現されるヒトHLAクラスII分子のHLA-DRは、非常に多様な形を持ち、数百種類の対立遺伝子が知られている。HLA-DRB1ハプロタイプの既知の対立遺伝子頻度および十分確立された結合アルゴリズムに基づき、IMA950のいずれのHLAクラスIIリガンド、IMA-BIR-002およびIMA-MET-005とも、無差別なHLA-DR結合ペプチドであると予測できる。詳細には、HLA-A*02陽性白人が少なくとも1つ適切なHLA-DR対立遺伝子を発現している可能性は、いずれのIMA950クラスIITUMAPとも90％を超える。頻度データあるいは結合予測アルゴリズムがないという理由から、残りのヒトクラスII対立遺伝子HLA-DQおよび-DPはこの計算から除外したため、実際の無差別性はさらに高くなる可能性が最も高い。2つのIMA950クラスIITUMAPについて計算された無差別性は、既知のpan-DRエピトープ（PADRE、遺伝子型頻度Fprojected＝93.1％）と同じ範囲である。さらに、これらのペプチドの無差別な結合は、invitro結合アッセイにより実験的に確認された。また、IMA-BIR-002では、高いin vivo免疫原性を証明することができた（上記参照）。要約すると、これらの結果から、MET-005およびBIR-002は無差別なHLA-DR結合ペプチドがあることが確認される。

【0294】

結合予測の原理
University of Tuebingenで開発されたSYFPEITHIアルゴリズムにより(Rammensee et al., 1997; Rammensee et al., 1999)、IMA950クラスII TUMAPのいくつかの共通HLA-DR対立遺伝子への結合をランク付けした。このアルゴリズムは、例えばヒト腫瘍関連抗原TRP2（クラスI）(Sun et al., 2000)およびSSX2（クラスII） (Neumann et al., 2004)など、広範な抗原からクラスIおよびクラスIIエピトープを同定するため、すでに使用され、成功している。結合閾値は、開示された既知の無差別HLA-DRリガンドの結合スコア分析に基づき、スコア18に定義した。

【0295】

HLA-A*02陽性白人集団について開示されたHLA-DRハプロタイプの頻度(Mori et al., 1997)および高分解能ハプロタイプ頻度 (Chanock et al., 2004)を利用した（表２参照）。ハプロタイプ頻度とは、個々の染色体上で異なる対立遺伝子が発生する頻度である。哺乳類細胞では染色体が2倍体であるため、この対立遺伝子の遺伝子型が発生する頻度は高く、ハーディー・ワインベルクの法則を用いて計算することができる（ハプロタイプ頻度G_fから遺伝子型発生頻度Fが得られる（F＝2G_f−G_f²））。

【0296】

既知のSYFPEITHIマトリックスを用いたDRB1ハプロタイプ頻度とA*02+白人集団における既知の個別頻度の合計は、47.8％である。従って、クラスIITUMAPのこれらの対立遺伝子に対する予測結合分布は、DRB1対立遺伝子で残りの52.2％になると予想されたが、このデータは利用できない。

【0297】

最後に、無差別な結合は1つのペプチドが数種類のHLA-DR対立遺伝子に結合することと定義され、この対立遺伝子のうち1つが白人集団で発現される確率は50％以上である。

【0298】

in vitro結合アッセイの原理（ProImmune REVEAL（商標））
IMA-BIR-002およびIMA-MET-005を広範なHLA-DR抗原（HLA-DR1からDR7、分割された抗原HLA-DR11から-DR15も含む(Mori et al., 1997)）と会合させ、REVEAL（商標） MHC：ペプチド結合アッセイ（ProImmune、英国オックスフォード）により分析し、MHC分子に組み込まれたレベルを決定した。このアッセイでは、結合を合否判定用のコントロール結合因子、および各HLA-DR抗原の陽性コントロールペプチドと比較した。

【0299】

結果
SYFPEITHIアルゴリズムの予測に基づき、IMA-BIR-002およびIMA-MET-005は、それぞれ既知の結合モチーフを持つHLA-DR対立遺伝子7/8個および8/8個と結合する可能性がある（表１１）。HLA-A*02陽性白人がIMA-BIR-002またはIMA-MET-005に対して少なくとも1つ適切なHLA-DRB1対立遺伝子を発現する確率は、それぞれ92.6％および100％近くである。従って、いずれのIMA950クラスIIペプチドも無差別なHLA-DR結合因子と予想される。

【0300】

結合HLA-DRB1対立遺伝子のハプロタイプ頻度がファクター2のため、このアプローチにより過大評価された場合でも、この遺伝子型の発生率は、IMA950における全てのクラスIITUMAPでまだ50％を超える。さらに、in vitroの結合データから、IMA-BIR-002のHLA-DR1、3、4、11への無差別な結合が実験的に確認された（図3）。IMA-MET-005について、完全配列をカバーする2つの重なり合う15merのinvitro結合データは、HLA-DR11に結合することを示唆しているが、ProImmune REVEAL（商標）は、考えられるHLAクラスIIエピトープを同定するための大まかなスクリーニングツールとして意図されている。オンレートが遅い良好なHLA-DR結合因子は、このアッセイでは非結合因子として偽陰性である可能性が報告されている。このため、invivoにおけるIMA-MET-005のHLA-DR結合の非無差別性は、陰性のin vitro ProImmune REVEAL（商標）データから推測することはできない。そのため、IMA950に基づくワクチン接種では、IMA-MET-005のHLA-DR結合が無差別である可能性は十分ある。残りのクラスII遺伝子座HLA-DQおよび-DPについては、結合特性および頻度に関する十分なデータがないため、これらの分子は計算から除外した。それでも、これらの分子は、さらにIMA950クラスIITUMAPに結合する可能性がある。

【0301】

異なるHLA-DR対立遺伝子を持つ前立腺癌患者を対象とした臨床試験において、IMA-BIR-002は広範な免疫原性が証明されたため、このクラスIIペプチドの無差別性はin vivoで明らかに証明された。

【0302】

結論として、IMA950に含まれる2つのクラスIIペプチドのHLA-DR結合特性に関するコンピュータによる解析、および、さらにBIR-002に関するin vitroアッセイおよび臨床試験の実験的根拠は、これらのTUMAPがヒトクラスII HLA分子の無差別な結合因子であることを強く示唆している。

【0303】

表１１：既知の結合モチーフを持つHLA-DR対立遺伝子に対する、IMA950クラスIITUMAPの結合スコア白人集団で最も多いHLA-DRB1対立遺伝子について、SYFPEITHI結合スコアが示されている。pは、HLA-A*02陽性白人のハプロタイプ頻度を示している。スコアが18以上の場合、そのペプチドはHLA分子に結合するとみなした。DRB1対立遺伝子の結合についてp値を蓄積すると、最小ハプロタイプ頻度p_minが得られる。これらの頻度を結合予測マトリックスまたは頻度データが不完全なものを含む全てのDRB1対立遺伝子に外挿すると、遺伝子型発生頻度F_projectedに対応する予測ハプロタイプ頻度p_projectedが得られる。n.d.＝データなし

【表11】

【0304】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]