特許 5754013 ヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5754013

(24)【登録日】2015年6月5日

(45)【発行日】2015年7月22日

(54)【発明の名称】ヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20150702BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 HZNA

【請求項の数】1

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2010-28012(P2010-28012)

(22)【出願日】2010年2月10日

(65)【公開番号】特開2011-160738(P2011-160738A)

(43)【公開日】2011年8月25日

【審査請求日】2013年1月28日

(73)【特許権者】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(74)【代理人】

【識別番号】100114074

【弁理士】

【氏名又は名称】大谷 嘉一

(72)【発明者】

【氏名】仁宮 一章

(72)【発明者】

【氏名】清水 宣明

【審査官】 水野 浩之

(56)【参考文献】

【文献】 Analytical Chemistry，２００８年 ２月 １日，Vol.80, No.3，721-728，[online]，ＵＲＬ，http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ac701962v

【文献】 Virologica Sinica，２０１０年 ２月１２日，Vol 25, Issue 1，27-35，[online]，ＵＲＬ，http://rd.springer.com/article/10.1007/s12250-010-3091-7

【文献】 PLoS One，２００９年１２月 ３日，Vol 4, Issue 12，e8142，[online]，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2780912/

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＢＩＯＴＥＣＨＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に対して特異的な結合性を有する、配列番号１〜１２のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡアプタマー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーに関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ターゲット（化学物質、タンパク質や細胞など）に結合する核酸リガンド（アプタマー）の選別と、ＰＣＲによる指数関数的な増幅をシステマテックに複数回繰り返すことにより，ターゲットに親和性をもつ核酸分子（一本鎖ＤＮＡ；single strand DNA、以下、ｓｓＤＮＡと称する）を得るＳＥＬＥＸ (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 法が開発され、これまでに白血球がん細胞や肺がん細胞に対するＤＮＡアプタマーが非特許文献１〜３に示されているもののヒト肝臓がん細胞に適用できるものではなく、その塩基配列も大きく相違すると推定された。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Sefah, K.; Tang, Z.; Shangguan, D.; Chen, H.; Lopez-Colon, D.; Li, Y.; Parekh, P.; Martin, J.; Meng, L.; Phillips, J. A.; Kim, Y. M.; Tan, W. Molecular Recognition of Acute Myeloid Leukemia Using Aptamers. Leukemia 2009, 23,235-244.

【非特許文献2】Chen, H.; Medley, C.; Sefah, K.; Shangguan, D.; Tang, Z.; Meng, L.; Smith, J.; Tan, W. Molecular Recognition of Small-Cell Lung Cancer Cells Using Aptamers. ChemMedChem. 2008, 3, 991-1001.

【非特許文献3】Tang, Z.; Shangguan, D.; Wang, K.; Shi, H.; Sefah, K.; Mallikratchy, P.; Chen, H.; Li, Y.; Tan, W. Selection of Aptamers for Molecular Recognition and Characterization of Cancer Cells. Anal. Chem. 2007, 79, 4900-4907.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、ヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に特異的な結合性を示すＤＮＡアプタマーの提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明に係るヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に対して、特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーは、下記配列番号１〜１２のいずれかで表される塩基配列を有することを特徴とする。
なお、塩基配列は、５’末端から３’末端方向に左から右へ記載する。
＜配列番号１＞：アプタマーＡ―１
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｔａａｃｔｃａａｔａａｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔａｃｃｃｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号２＞：アプタマーＡ―２
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｔａａｃｔｃａａｔａａｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔｇｃｃｃｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号３＞：アプタマーＡ―３
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｃａａｃｔｃａａｔａａｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔａｃｃｃｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号４＞：アプタマーＡ―４
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｃａａｃｔｃａａｔａａｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔｇｃｃｃｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号５＞：アプタマーＢ―１
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｔａａｃｔｃａａｔａａｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔａｔｃｃｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号６＞：アプタマーＢ―２
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｔａａｃｔｃａａｔａａｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔａｃｔｃｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号７＞：アプタマーＢ―３
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｃａａｃｔｃａａｔａａｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔａｃｔｃｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号８＞：アプタマーＢ―４
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｔａａｃｔｃａｇｔａａｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔａｔｃｃｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号９＞：アプタマーＣ―１
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｔａａｃｔｃａａｔａｇｇｃｔａｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔａｃｃａｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号１０＞：アプタマーＤ―１
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｃｇａｔｇｇｃｇｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａａａｔｔｔｇｇｇｇｇｇｃｇｔｔｇｇｇｔｇｔｔｔｇｔｇｇｔｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号１１＞：アプタマーＥ―１
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｇｇｔｇｇｔｇｇｇｇａｇｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｃｇａｃｔａｇｇａａａｃｔｃａｔｇｃｇｇｔａａｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ
＜配列番号１２＞：アプタマーＦ―１
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇｔｔｃｃｇｃａａｔｇｇｃｃｃｔｃｇａｔｔａｃｔｇｔｃｃｃｔａｃｃａｃａｔｇａｇｔｔｔｃｃｃａｃａｔｃｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ

【0006】

これらの塩基配列を有するＤＮＡアプタマーのうち、図６に示すように、最も出現頻度が高いものはアプタマーＡ―１であり、これに対して１つ又は２つの塩基が置換されてもヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に特異的な結合性を示すもの（グループ１：配列番号１〜９）の他に部分的に他の塩基配列に置換されても同様にヒト肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２に特異的な結合性を示すもの（グループ２：配列番号１０〜１２）が有していることが分かる。
（図６の表にて、グループ１中、□で囲んだ塩基がアプタマーＡ―１と異なる塩基を示す。）

【0007】

そこで詳細は後述するが、ソフトウエアｍｆｏｌｄにより二次元構造を推定した結果、下記の６つのグループに分かれることが明らかになった。
＜構造Ａを示すグループ（配列番号１〜４）＞
＜構造Ａ＞

＜構造Ｂを示すグループ（配列番号５〜８）＞
＜構造Ｂ＞

＜構造Ｃを示すグループ（配列番号９）＞
＜構造Ｃ＞

＜構造Ｄを示すグループ（配列番号１０）＞
＜構造Ｄ＞

＜構造Ｅを示すグループ（配列番号１１）＞
＜構造Ｅ＞

＜構造Ｆを示すグループ（配列番号１２）＞
＜構造Ｆ＞

【0008】

よって、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、構造Ａ〜Ｆのいずれかに属する範囲において塩基配列の一部が他の塩基に置換されてもよい。
また、本発明には、これらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するＤＮＡアプタマーも含まれる。

【0009】

本発明に係るヒト肝臓がん細胞に対して特異的な結合性を有するＤＮＡアプタマーは、下記に示した配列番号１３の塩基配列を含む第１プライマー領域と配列番号１４の塩基配列を含む第２プライマー領域の間に４つの塩基のランダム配列領域Ｎを有するｓｓＤＮＡライブラリーに対して、ヒト肝臓由来がん細胞ＨｅｐＧ２を用いたＣｅｌｌ ＳＥＬＥＸ法にて得ることができる。
＜配列番号１３＞：第１プライマー
ｃａｇｃｔｃａｇａａｇｃｔｔｇａｔｃｃｔｇｔｇ
＜配列番号１４＞：第２プライマー
ｔｇｃａｇａｔｇｃａｃｇａｃｔｔｃｇａｇｔｃ

【発明の効果】

【0010】

本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ヒト肝臓がん細胞に特異的に結合することから、蛍光標識等を施すことによりがんマーカーとして用いたり、ドラッグデリバリーシステムに適用できる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】第１段階（１〜７round）のＤＮＡアプタマーの選抜の流れを示す。

【図2】第２段階（８〜１１round）のＤＮＡアプタマーの選抜の流れを示す。

【図3】増幅したｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡを回収する流れを示す。

【図4】初期ｓｓＤＮＡ（０Ｒ）と１１ＲｏｕｎｄのＣｅｌｌ ＳＥＬＥＸ終了後（１１Ｒ）の蛍光顕微鏡観察比較した例を示す。

【図5】３〜１１Ｒｏｕｎｄ後の各ｓｓＤＮＡにＨｅｐＧ２を添加して、回収した細胞の蛍光強度測定結果を示す。

【図6】本発明に係る配列番号１〜１２のグループ分け表を示す。

【図7】本発明に係るＤＮＡアプタマーの６つの構造を示す。

【図8】ヒト肝臓由来の正常細胞に対するＤＮＡアプタマーの結合試験結果を示す。

【図9】ヒト肝臓由来のがん細胞ＨｅｐＧ２に対するＤＮＡアプタマーの結合試験結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明に係るＤＮＡアプタマーを選抜するための母集団となるｓｓＤＮＡライブラリーとして、両端に２３ｂｐ，２２ｂｐの第１プライマー領域と第２プライマー領域をもち、このプライマー領域の間に５０ｂｐのランダム領域をもつ９５ｂｐのオリゴＤＮＡ（N50-ssDNA;5'-cagctcagaagcttgatcctgtg-N50-tgcagatgcacgacttcgagtc-3'、* N50は４種類(A・T・C・G)の混合塩基による５０ｍｅｒのランダムな塩基配列）を用いた。
ターゲットとなるがん細胞としては、ヒト肝臓由来がん細胞ＨｅｐＧ２(RIKEN Cell Bank・RCB1648)を用い、カウンタースクリーニングには、ヒト肝臓由来正常細胞（大日本住友製薬・CS-ABI-3716）を用いた。

【0013】

目的とするｓｓＤＮＡの選抜の流れを図１に示す第１段階（１〜７round）と図２に示す第２段階（８〜１１round）に分けて実施した。
その操作ステップについて以下説明する。
１）ｓｓＤＮＡの増幅
１−１）；ＰＣＲによるｄｓＤＮＡとしての増幅
下記４）のステップで回収されたｓｓＤＮＡを鋳型にして、以下のプライマーとｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO・TAP-201）を用いてＰＣＲ（TAKARA・PCR Thermal Cycler DiceR Gradient）によりｄｓＤＮＡを複製した。
Forward primer:5'-FITC-cagctcagaagcttgatcctgtg-3'
Reverse primer:5'-Biotin-tgcagatgcacgacttcgagtc-3'
１−２）；増幅したｄｓＤＮＡからのｓｓＤＮＡの回収
上記のステップで得られたｄｓＤＮＡを、図３に示すように、アビジン修飾セファロースビーズ充填カラム（Streptavidin HP SpinTrap 16カラム,GE healthcare・28-9031-30）にアプライし、ビーズ表面にｄｓＤＮＡを固定化しその後、ＮａＯＨ水溶液を加えｄｓＤＮＡ間の水素結合を切断しビオチン修飾されていない側のｓｓＤＮＡを分離溶出、回収した。
２）がん細胞へのｓｓＤＮＡの添加・結合
上記、１）で得られたｓｓＤＮＡ溶液（４００ｎＭ、５００μｌ）を、コラーゲンタイプ１コートｄｉｓｈ ３５ｍｍ（IWAKI・4020-010）に培養したＨｅｐＧ２細胞に対して添加し３７℃で４５ｍｉｎ反応させた。
３）がん細胞に未結合のｓｓＤＮＡの洗浄・除去
上記、２）の反応後、培地を除去し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でコラーゲンコートｄｉｓｈに培養したＨｅｐＧ２細胞を洗浄した。
４）がん細胞に結合したｓｓＤＮＡの分離・回収
上記、３）の洗浄後、細胞剥離剤ＮＯ−ＺＹＭＥ （SAFC biosciences）を用いて細胞を回収した。ここで結合したｓｓＤＮＡを細胞から遊離させるため、９５℃で１０ｍｉｎ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋを行なった。
０．４５ ｍｍフィルターおよび０．２５ｍｍフィルターで細胞と遊離したｓｓＤＮＡを分離し、ｓｓＤＮＡを回収した。
以上の１）〜４）の手順を１Ｒｏｕｎｄとして、１１Ｒｏｕｎｄ繰り返したが、８〜１１ｒｏｕｎｄについては、上記１）と２）の操作の間に、図２に示すように、下記の操作ａ）およびｂ）を追加した作業を行なった。
ａ） 正常細胞へのｓｓＤＮＡの添加・結合
１）で得られたｓｓＤＮＡ溶液（４００ｎＭ、５００μｌ）を、コラーゲンコートｄｉｓｈに培養した正常細胞に対して添加し３７℃で４５ｍｉｎ 反応させる。
ｂ） 正常細胞に未結合のｓｓＤＮＡの回収
ａ）の反応後、培地を除去し、ＢＳＡとＦＢＳを含むＰＢＳでコラーゲンコートｄｉｓｈに培養したＨｅｐＧ２細胞を洗浄する。
洗浄液中のｓｓＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。
５）がん細胞に結合したｓｓＤＮＡの単離・解析
１１Ｒｏｕｎｄ終了後、得られたｓｓＤＮＡをMighty TA-cloning Kit(TAKARA・6028)を用いてＴＡクローニングし、シーケンシングを行った。

【0014】

＜実験結果＞
初期ｓｓＤＮＡライブラリーと、１１ＲｏｕｎｄのＣｅｌｌ ＳＥＬＥＸ終了後に得られたｓｓＤＮＡとを、それぞれＨｅｐＧ２細胞に添加し、洗浄後、蛍光顕微鏡観察を行なった。
図４に示すように、１１ＲｏｕｎｄのＣｅｌｌ ＳＥＬＥＸ終了後に得られたｓｓＤＮＡは、ＨｅｐＧ２細胞への顕著な結合が観察された。
初期ｓｓＤＮＡライブラリーと、３〜１１ＲｏｕｎｄのＣｅｌｌ ＳＥＬＥＸ終了後に得られたｓｓＤＮＡとを、それぞれＨｅｐＧ２細胞に添加し、洗浄後、細胞を回収しサイトメーターで計測を行なった。
図５に示すように、ｒｏｕｎｄ数の上昇とともにヒストグラムは蛍光強度の高い方へ移動し、１１Ｒｏｕｎｄで飽和していることが確認できた。
１１ＲｏｕｎｄのＣｅｌｌ ＳＥＬＥＸ終了後、得られたｓｓＤＮＡをＴＡクローニングにより単離し、４５コロニーについてシーケンシングを行なった。
その結果、図６のように、得られたＤＮＡアプタマーの塩基配列は１２種類であることが分かった。
１２種類のうち９種類までは、最も出現頻度の高かった配列（図６Ａ−１）に対して、１もしくは２塩基の違いしかない相同性の高いものであった。
また、これらの１２種類を、ＤＮＡアプタマーとしてとりうる構造でカテゴリー分けることとした。
この際、ｍｆｏｌｄ(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-form1.cgi)というＷｅｂ上のソフトウエアにより、二次元構造を推定した。
二次元構造の推定の際には、以下１７個のパラメータを入力した。
１．DNA sequence：図６の塩基配列
２．The DNA sequence is linear or circular:linearを選んだ
３．Folding temperature：37℃と入力した
４．Ionic conditions: Na+137mM,Mg+0.5mMと入力した
５．Enter the percent suboptimality number.:5と入力した
６．Enter an upper bound on the number of computed foldings.:50と入力した
７．Enter the window parameter if you wish.:defaultを選んだ
８．Enter the maximum distance between paired bases if you wish.: no limitを選んだ
９．Choose image width for png & jpg files:Largeを選んだ
１０．Choose structure format:automaticを選んだ
１１．Grid lines in energy dot plot: onを選んだ
１２．Choose structure draw mode: Natural anglesを選んだ
１３．Choose base numbering frequency:defaultと入力した
１４．Choose sequence numbering offset:0と入力した
１５．Choose regularization angle(in degrees):0と入力した
１６．Choose structure rotation angle(in degrees):autoと入力した
１７．Choose structure annotation:p-numを選んだ
これにより、図６の塩基配列は、図７に示すＡ−Ｆまでの６種類の二次元構造にカテゴリー分けされることが判った。

【0015】

次に、２次元構造Ａ〜Ｅにおいて、各カテゴリーから１種類のＤＮＡアプタマーを選び、正常細胞及びＨｅｐＧ２細胞に対する結合試験を実施した。
ヒト肝臓由来の正常細胞に対するＤＮＡアプタマーの結合試験結果を図８に示し、
ヒト肝臓由来のがん細胞ＨｅｐＧ２に対するＤＮＡアプタマーの結合試験結果を図９に示す。
これらの蛍光強度分布を比較すると、いずれのＤＮＡアプタマーも、正常細胞に対しては、０Ｒｏｕｎｄの初期ｓｓＤＮＡライブラリーと同程度の低い結合性であった。
それに比較し、ＨｅｐＧ２細胞に対しては、１１ＲｏｕｎｄのＣｅｌｌ ＳＥＬＥＸ終了後に得られたｓｓＤＮＡと同程度の高い結合性を示すことが確認できた。

【図6】

【図7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]