特許 5755839 Ｔ細胞応答の増強方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5755839

(24)【登録日】2015年6月5日

(45)【発行日】2015年7月29日

(54)【発明の名称】Ｔ細胞応答の増強方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20150709BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20150709BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20150709BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150709BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150709BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/00 Z

   A61K39/00 H

   A61K39/00 K

   A61K39/02

   A61K39/12

   A61K39/39

   A61P31/00

   A61P35/00

   C12N15/00 A

【請求項の数】32

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2009-549627(P2009-549627)

(86)(22)【出願日】2008年2月15日

(65)【公表番号】特表2010-519205(P2010-519205A)

(43)【公表日】2010年6月3日

(86)【国際出願番号】US2008002044

(87)【国際公開番号】WO2008100598

(87)【国際公開日】20080821

【審査請求日】2011年2月8日

【審判番号】不服2013-22970(P2013-22970/J1)

【審判請求日】2013年11月25日

(31)【優先権主張番号】60/901,980

(32)【優先日】2007年2月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503208552

【氏名又は名称】マンカインド コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】クンディグ，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ボット，アドリアン

(72)【発明者】

【氏名】スミス，ケント アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】キュウ，ジヨン

【合議体】

【審判長】 大宅 郁治

【審判官】 田村 明照

【審判官】 齋藤 恵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／１２０４７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０３／１０３６３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５０６６４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／００２６２１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３９／００−３９／４４

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

感染性又は新生物性疾患の治療又は予防におけるクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激
するための免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物はクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞エ
ピトープを含むかまたはこれをコードする免疫原を含み、該免疫原性組成物は複数回の順次用量として哺乳動物に投与され、初回用量後の各用量が直前用量より多く、前記順次用量が前記初回用量の指数関数として増大する、免疫原性組成物。

【請求項2】

前記免疫原性組成物が免疫原＋免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む、請求項１記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

前記免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤がサイトカイン、ケモカイン、ＰＡＭＰ、ＴＬＲ−リガンド、免疫刺激配列、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、エンドサイトーシスパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、ＬＰＳ、キラヤ・サポニン及びツカレゾルから成る群から選択される、請求項２記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記指数関数が指数因子≧２^n-1により定義される、請求項１〜３のいずれか１項記載の
免疫原性組成物。

【請求項5】

前記指数因子が５^n-1である、請求項４記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記複数回の用量が２〜６回用量を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

前記複数回の用量が２回より多くの用量を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

前記複数回の用量が６回より多くの用量を含む、請求項７記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

最終回用量が前記初回用量の６日以内に投与される、請求項１〜８のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

順次増大用量を伴わない同一累積用量を利用する免疫感作と比較して増強された応答が得られる、請求項１〜９のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

前記増強応答が応答Ｔ細胞の数増大、サイトカインの産生増大、または細胞溶解活性における増大を包含する、請求項１０記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

前記サイトカインがＩＬ−２又はＩＦＮ−γである、請求項１１記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

前記増強応答が免疫抑制性サイトカインのピーク産生における遅延を包含する、請求項１０記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

前記免疫抑制性サイトカインがＩＬ−１０である、請求項１３記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記免疫原性組成物を哺乳類に投与することがリンパ系への直接送達を包含する、請求項１〜１４のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記リンパ系への前記直接送達が節内送達を包含する、請求項１５記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

前記免疫原性組成物を哺乳類に投与することが皮下、筋肉内、皮内、経皮、経粘膜、鼻、気管支、経口又は直腸投与を包含する、請求項１〜１６のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

前記免疫原性組成物がタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、裸ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン、合成エピトープ又はミモトープとして提供される免疫原を含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項19】

前記免疫原がウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、分化抗原、腫瘍抗原、胎児性抗原、癌遺伝子及び突然変異化腫瘍抑制遺伝子の抗原、染色体転座に起因する独自腫瘍抗原、並びにその誘導体から成る群から選択される抗原に対する応答を刺激する、請求項２〜１８のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項20】

前記抗原が自己抗原である、請求項１９記載の免疫原性組成物。

【請求項21】

前記免疫賦活剤がＴＬＲ−リガンドである、請求項２〜２０のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項22】

前記ＴＬＲ−リガンドがＣｐＧ−含有ＤＮＡである、請求項２１記載の免疫原性組成物。

【請求項23】

前記免疫原性組成物が細胞を含む、請求項１〜２２のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項24】

前記細胞が腫瘍細胞または抗原提示細胞である、請求項２３記載の免疫原性組成物。

【請求項25】

前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２４記載の免疫原性組成物。

【請求項26】

前記より多い用量の免疫原性組成物がより多数の細胞を含む、請求項１〜２５のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項27】

前記より多い用量の免疫原性組成物が前記細胞の表面のより多数のエピトープ−ＭＨＣ複
合体を含む、請求項２６記載の免疫原性組成物。

【請求項28】

免疫原＋免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含むクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺
激するための一組の免疫原性組成物であって、該免疫原はクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞エ
ピトープを含むかまたはこれをコードし、前記一組の免疫原性組成物の個々の成員の量が順次用量であり、初回用量後の各用量が直前用量より多く、前記順次用量が前記初回用量の指数関数として増大する、一組の免疫原性組成物。

【請求項29】

請求項２８記載の一組の免疫原性組成物及びそれを必要とする被療体に前記組成物を投与するための使用説明書を含むキット。

【請求項30】

クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激するための順次増大用量の免疫原性組成物を含む
一組の注射器であって、初回用量後の各用量が該一組の注射器の各注射器中の直前用量より多く、前記順次増大用量が前記初回用量の指数関数として増大し、そして被検体におけるＴ細胞応答を増強するために前記免疫原性組成物が免疫原及び免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含み、該免疫原はクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープを含むかまたはこ
れをコードする、一組の注射器。

【請求項31】

クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激するための順次増大用量の免疫原性組成物を含む
一組のバイアルであって、初回用量後の各用量が該一組のバイアルの各バイアル中の直前用量より多く、前記順次増大用量が前記初回用量の指数関数として増大し、そして被検体におけるＴ細胞応答を増強するために前記免疫原性組成物が免疫原及び免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含み、該免疫原はクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープを含むかま
たはこれをコードする、一組のバイアル。

【請求項32】

免疫原及び免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む免疫原性組成物の複数回の順次用量を処方することを含み、該免疫原はクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープを含むかまた
はこれをコードし、初回用量後の各用量が直前用量より多く、前記順次用量が前記初回用量の指数関数として増大する、クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激して新生物性疾患
又は感染性疾患を治療又は予防するための薬剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の実施形態は、免疫学及びワクチン開発の分野に関する。本明細書中に開示される発明の実施形態は、免疫感作及びワクチン接種を増強するための方法及び組成物に関する。より詳細には、本発明の実施形態は、Ｔ細胞応答の刺激を改善する方法に関する。本発明のいくつかの実施形態は、感染性疾患又は癌のような疾患を治療する場合のワクチン接種戦略としてさらなる有用性を有する。

【0002】

［関連出願の相互参照］
本願は、米国仮出願第６０／９０１，９８０号（２００７年２月１５日出願）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）からの優先権を主張する。

【背景技術】

【0003】

生弱毒化ワクチンは通常は、１回注射後の強力な且つ長時間持続する免疫応答を誘導し、そしてこの型の多数のウイルスワクチンは９０％より高い効率を有する（非特許文献１）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。それに対して、死微生物、毒素、ペプチドワクチンを含めたサブユニットワクチン、又は裸ＤＮＡワクチンから成るワクチンは効能がかなり低く、そして追加免疫が不可欠である。生ワクチンは強力な免疫応答を要する漸増抗原用量を生じるが、一方、非複製ワクチンは、本明細書中の実施例で実証されるように、Ｔ細胞に対してむしろ弱い刺激である漸減抗原プロファイルを生じる。

【0004】

感染性疾患又は癌（これらに限定されない）のような疾患に対するＴ細胞応答を増強する免疫感作モデルを開発することの、継続的必要性が存在する。したがって本明細書中に開示される本発明の実施形態は、免疫原性を増強するために、累積的総抗原用量とは無関係に、免疫感作の経過全体にわたって抗原刺激を増大することを包含する免疫療法アプローチに関する。したがって本明細書中に開示される本発明の実施形態は、最新免疫感作モデルの改訂を、そしてワクチン及び免疫療法の設計及び使用のための方法及び組成物を提供する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Nossal, G. Vaccines in Fundamental Immunology (ed., Paul, W.E.)1387-1425; Lippincot-Raven Publishers, Philadelphia, 1999

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本明細書中に開示される本発明の実施形態は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を最適化するための方法及び組成物に関する。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、哺乳類におけるクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、複数回の順次用量の免疫原性組成物を哺乳類に投与することを包含する方法であり、初回用量後の各用量が直前用量より多い方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

いくつかの実施形態では、順次用量が初回用量の線形関数として増大する。さらに別の実施形態では、順次用量が初回用量の指数関数として増大する。指数関数が指数因子≧２^n-1により定義される。さらなる実施形態では、指数因子が５^n-1である。

【0008】

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物が免疫原＋免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む。免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤がサイトカイン、ケモカイン、ＰＡＭＰ、ＴＬＲ−リガンド、免疫刺激配列、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、エンドサイトーシスパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、ＬＰＳ、キラヤ・サポニン及びツカレゾル等であり得るが、これらに限定されない。

【0009】

複数回の用量は、２回以上の用量であり得る。いくつかの実施形態では、複数回の用量は、２〜６回用量を含む。他の実施形態では、複数回の用量は、６回より多くの用量を含む。本発明のいくつかの実施形態では、複数回の用量は、免疫原の半減期（ｔ_1/2）により影響を及ぼされ得る。例えば相対的に短い半減期を有する免疫原は、同様の結果を達成するために、相対的に長い半減期を有する免疫原より高頻度の投与を、したがってより多数回の用量を必要とし得る。

【0010】

いくつかの実施形態では、最終回用量が初回用量の６日以内に投与され得る。いくつかの実施形態では、最終回用量が初回用量の７、８、９、１０日以内又はそれ以上の以内に投与される。

【0011】

本発明の実施形態は、長時間にわたる投与量の線形又は指数的増大を伴わずに同一累積用量を利用する免疫感作と比較した場合に、増強された応答が得られる方法に関する。増強応答は応答Ｔ細胞の数増大を包含し得る。いくつかの実施形態では、増強応答が免疫刺激性サイトカインの産生増大を包含し得る。該サイトカインは例えばＩＬ−２又はＩＦＮ−γであり得る。いくつかの実施形態では、増強応答が細胞溶解活性における増大を包含し得る。いくつかの実施形態では、増強応答が免疫抑制性サイトカインのピーク産生における遅延を包含し得る。免疫抑制性サイトカインは例えばＩＬ−１０であり得る。

【0012】

本発明の実施形態は、リンパ系への直接送達により哺乳類に免疫原性組成物を投与する方法に関する。例えば哺乳類に免疫原性組成物を投与する方法は、節内送達により得る。

【0013】

本発明のいくつかの実施形態では、免疫原性組成物は皮下、筋肉内、皮内、経皮、経粘膜、鼻、気管支、経口又は直腸投与等で哺乳類に投与され得る。

【0014】

いくつかの実施形態では、免疫原がタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、裸ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン、合成エピトープ、ミモトープ等として提供され得るが、好ましくはこれらに限定されない。

【0015】

免疫原は、治療又は防御されるべき疾患に関連した抗原に対する応答を刺激する。抗原は、例えばウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、分化抗原、腫瘍抗原、胎児性抗原、癌遺伝子及び突然変異化腫瘍抑制遺伝子の抗原、染色体転座に起因する独自腫瘍抗原等、及び／又はその誘導体であり得るが、これらに限定されない。抗原は自己抗原であり得る。

【0016】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤はＴＬＲ−リガンドであり得る。ＴＬＲ−リガンドは、ＣｐＧ含有ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は二本鎖ＲＮＡ、例えばポリＩＣであり得る。

【0017】

本明細書に開示される本発明のいくつかの実施形態は、免疫原＋免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む一組の免疫原性組成物であって、該一組の個々の成員の投与量が指数級数として関連づけられる組に関する。いくつかの実施形態では、投与量の指数級数が指数因子≧２^n-1により定義される。いくつかの実施形態では、投与量の指数級数が５^n-1の指数因子により定義される。

【0018】

本発明の他の実施形態は、抗原及び免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む免疫原性組成物の組、並びにそれを必要とする被検体に組成物を投与するための使用説明書を含むキットに関する。

【0019】

免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤は、例えばサイトカイン、ケモカイン、ＰＡＭＰ、ＴＬＲ−リガンド、免疫刺激配列、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、エンドサイトーシスパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、ＬＰＳ、キラヤ・サポニン、ツカレゾル等であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫原並びに免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤が各々別個の容器又は同一容器中に含入され得る。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態では、キットは２回以上の用量の免疫原性組成物を各々別個の適切な容器中に含み得る。適切な容器は例えば注射器、アンプル、バイアル等、又はそれらの組合せであり得る。

【0021】

順次増大用量の免疫原性組成物を含む注射器の一組であって、初回用量後の各用量が注射器の一組の各注射器中の直前用量より多く、そして被検体におけるＴ細胞応答を増強するために免疫原性組成物が免疫原並びに免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む一組に関する。

【0022】

他の実施形態では、免疫原性組成物は、細胞を含む。細胞は、腫瘍細胞又は抗原提示細胞であり得るが、このようなものに限定されない。他の実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞であり得る。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物は細胞を含む。

【0023】

他の実施形態では、より多い用量がより多数の細胞を含む。さらに別の実施形態では、より多い用量が細胞表面のより多数のエピトープ−ＭＨＣ複合体を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、順次増大用量の免疫原性組成物を含むバイアルの一組であって、初回用量後の各用量がバイアルの一組の各バイアル中の直前用量より多く、そして被検体におけるＴ細胞応答を増強するために免疫原性組成物が免疫原並びに免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む一組に関する。

【0025】

いくつかの実施形態では、クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激するための免疫原性組成物の複数回の順次用量の使用であって、初回用量後の各用量が直前用量より多い使用に関する。いくつかの実施形態では、クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激することは、新生物性疾患の治療のため、又は感染性疾患の治療のため、又はその両方のためである。いくつかの実施形態では、クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激することは、新生物性疾患の予防のため、又は感染性疾患の予防のため、又はその両方のための刺激である。

【0026】

いくつかの実施形態では、薬剤の製造における免疫原並びに免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む免疫原性組成物の複数回の順次用量の使用であって、初回用量後の各用量が直前用量より多い使用に関する。いくつかの実施形態では、薬剤の製造における、免疫原＋免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤を含む免疫原性組成物の一組の使用であって、組の個々の成員の投与量が指数級数として関連づけられる使用に関する。好ましくは薬剤は、哺乳類におけるクラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激する。したがって薬剤は、新生物性疾患の治療のため、又は感染性疾患の治療のため、又はその両方のためであり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、新生物性疾患の予防のため、又は感染性疾患の予防のため、又はその両方のための薬剤である。

【0027】

他の目的及び特徴は、本明細書の以下で一部は明らかになり、一部は指し示される。

【0028】

以下の図面は、本明細書の一部を構成し、そして本明細書中に開示される本発明の実施形態の或る態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組合せてこれらの図面のうちの１つ又は複数を参照することにより、より良好に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ｇｐ３３及びＣｐＧの両方の指数的漸増用量がＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を増強することを示すデータを例示する図である。

【図2】ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の増強がＴ細胞ヘルプと無関係であることを示す棒グラフである。

【図3】４日の抗原刺激がＣＤ８⁺Ｔ細胞誘導のために最適であることを示すデータを示す図である。

【図4】ｇｐ３３及びＣｐＧの両方の指数的漸増用量が抗ウイルス性ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を増強することを示すデータを例示する図である。

【図5】抗原動態がＤＣ活性化に影響を及ぼさないことを示すデータを示す図である。

【図6A】指数的免疫感作が持続性Ｔ細胞増殖に好都合であることを示すフローサイトメトリーデータを例示する図である。

【図6B】指数的免疫感作が持続性Ｔ細胞増殖に好都合であることを示すフローサイトメトリーデータを例示する図である。

【図7】ペプチド負荷樹状細胞による指数的免疫感作が強力なＴ細胞及び抗腫瘍応答を誘導することを示すデータを示す図である。

【図8】ＣＤ８⁺Ｔ細胞の指数的ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激がＩＬ−２産生及び細胞傷害性を増強することを示すデータを例示する図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

［発明の詳細な説明］
免疫系は、病原体に最適に応答するよう進化してきた（Janeway, C.A., Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54 Pt 1, 1-13, 1989；Zinkernagel, R.M., Science 271, 173-8, 1996；Germain, R.N., Nat Med 10, 1307-20, 2004）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。病原体の特質を採択することにより、免疫感作は最適化され得るし、ワクチンの効能は増強され得る。例えば貪食作用及び抗原提示を増強するために、乳濁液、微小粒子、免疫刺激複合体、リポソーム、ビロソーム及びウイルス様粒子のような病原体に匹敵する寸法を有する微粒子形態でワクチンが送達されて、貪食作用及び抗原提示を増強し得る（O'Hagan, D.T. & Valiante, N.M. Nat Rev Drug Discov 2, 727-35, 2003）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。さらに、パターン認識受容体（ＰＲＰ）、例えばトール様受容体（ＴＬＲ）により免疫系を刺激する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）は、抗原提示細胞を活性化するための、そしてワクチンに対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして用いられ得る（Johansen, P., et al., Clin Exp Allergy 35, 1591-1598, 2005b；O'Hagan, D.T. & Valiante,
N.M. Nat Rev Drug Discov 2, 727-35, 2003；Krieg, A.M., Annu Rev Immunol 20, 709-60, 2002）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。病原体の重要な一特徴は、複製である。病原体複製は、免疫系を長時間にわたって漸増量の抗原及び免疫刺激性ＰＡＭＰに曝露する。

【0031】

免疫学における一般的パラダイムは、Ｔ細胞応答の強度及び質は、抗原の用量及び局在化により、並びに同時刺激シグナルにより支配され得る、というものである。ワクチン接種の効率を改善するための戦略は、抗原提示の持続時間を増大することに向けられ得る（Lofthouse, S. Adv Drug Deliv Rev 54, 863-70, 2002；Ehrenhofer, C. & Opdebeeck, J
.P., Vet Parasitol 59, 263-73, 1995；Guery, J.C., et al. J Exp Med 183, 485-97, 1996；Zhu, G., et al., Nat Biotechnol 18, 52-7, 2000；Borbulevych, O.Y., et al.,
J Immunol 174, 4812-20, 2005；Levitsky, V., et al., J Exp Med 183, 915-26, 1996；van der Burg, S.H., et al., J Immuno 156, 3308-14, 1996；Chen, J.L., et al., J
Exp Med 201, 1243-55, 2005；Rivoltini, L. et al., Cancer Res 59, 301-6, 1999；Blanchet, J.S. et al., J Immunol 167, 5852-61, 2001；Brinckerhoff, L.H. et al., Int J Cancer 83, 326-34, 1999；Ayyoub, M. et al., J Biol Chem 274, 10227-34, 1999；Stemmer, C. et al., J Biol Chem 274, 5550-6, 1999；O'Hagan, D.T. & Valiante, N.M. Nat Rev Drug Discov 2, 727-35, 2003）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。

【0032】

Ｔ細胞誘導を最適化する方法は、当該技術分野においては依然として難題である。免疫感作の「デポー」理論（“depot”theory）は、当該技術分野でよく知られているように、長時間にわたって組織中に徐々に漏れ出す抗原はワクチンの免疫原性効力と相関する、と仮定する。一般に、この抗原デポー・パラダイムは、大半のアジュバント開発計画に対するバックボーンとして役立つ。しかしながら本発明の開示は、デポー剤処方物で又は１回のボーラスとしてよりむしろ、連続した数日又は密な間隔日にわたって、用量増大様式で、ワクチンを投与することがはるかに有益である、ということを実証する。１回ボーラス又は多数回非変更用量投与と比較した場合、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を増強するために、指数的漸増用量での毎日抗原刺激が本明細書中で示される。本明細書中で用いる場合、クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激することは、応答を誘導すること、初回刺激すること（priming）、開始すること、延長すること、保持すること、増幅すること、増大すること、又は高めることを包含するが、これらに限定されない。

【0033】

生弱毒化ワクチンは通常は１回注射後に強力な且つ長時間持続する応答を誘導すること、そしてこの型の多数のウイルスワクチンが９０％より高い効率を有するということが当該技術分野ではよく知られている（Nossal, G. Vaccines in Fundamental Immunology (ed., Paul, W.E.)1387-1425; Lippincot-Raven Publishers, Philadelphia, 1999）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。それに対して、死微生物、毒素、ペプチドワクチンを含めたサブユニットワクチン、又は裸ＤＮＡワクチンから成るワクチンは効能がかなり低く、そして追加免疫が不可欠である。生ワクチンは強力な免疫応答を要する漸増抗原用量を生じるが、一方、非複製ワクチンは、本明細書中の実施例で実証されるように、Ｔ細胞に対してむしろ弱い刺激である漸減抗原プロファイルを生じる。

【0034】

複製能力のないワクチンは生ワクチンより安全であるということは、良く知られている。本発明の実施形態は、抗原性刺激の用量−動態を考慮せずに複製不可能なワクチンを用いるワクチン開発における傾向に挑戦するのに役立つ。さらに、本発明の実施形態は、感染性疾患又は癌（これらに限定されない）のような疾患に対するＴ細胞応答を増強するための免疫療法アプローチを提供する。

【0035】

本明細書中に開示される本発明の実施形態は、免疫原性の重要な一パラメーターとして抗原性刺激の動態を操作することにより、ワクチン設計の業界における、そして免疫療法の実施における欠陥を取り扱うことに向けられる。本明細書中で開示されるように、線形又は指数的に増大される免疫原性刺激は、一定レベルで提供される刺激に比して有意により強いＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導した。１回注射として又は多数回漸減用量として投与される免疫原は、最も弱い免疫応答を誘導した。本明細書中に開示された知見に関する進化的説明は、複製し、したがって漸増量の抗原を産生する病原体が最強ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を要する、というものであり得る。これに対して、均一な又は漸減量の抗原は、生得的な又はすでに進行中の後天性の免疫により良好に制御される非病原性刺激又は感染を示す。

【0036】

この理論に拘束されることを望まないが、危険に対する感受性増大を媒介するための有望な候補は、抗原提示細胞、特に、ＣＤ８⁺Ｔ細胞誘導のための、樹状細胞（ＤＣ）である。これは、異なるワクチン接種プロトコールは絶対ＤＣ数又はリンパ節におけるＤＣ活性化のレベルは異ならなかったが、一方それらはＤＣ活性化及び数のピークに達するのに要する時間が異なる、という点で以下の実施例で支持される。指数的漸増ワクチン接種モデルでは、ＤＣ活性化のピークは、ボーラスワクチン接種と比較して３日遅延された。両ワクチン接種レジメンに関して、ＤＣ活性化のピークは、最大ワクチン用量が投与された１日後に出現した。この観察は、ペプチドが最大活性化ＤＣ上に提示されるよう、最適ワクチン接種日程が１日のうちにペプチドの１回の注射に先立って１回のＣｐＧ注射を用いることを意味し得る。しかしながら提示されたデータは、このような免疫感作プロトコール、並びに指数的漸増用量のＣｐＧとその後の１回用量のペプチドが、同時の指数的増大用量のＣｐＧ及びペプチドより有意に低免疫原性であった、ということを実証している。

【0037】

抗原の用量−動態が、治療の過程が終わるまでの全用量（累積用量）と関係なく、免疫原性の別個のパラメーターであるか否かを調べるために、固定累積用量の抗原性ペプチド、例えばｇｐ３３、並びに免疫賦活剤又は生物学的応答修飾剤（ＢＲＭ）、例えばシトシン−グアニン・オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）でマウスを免疫感作した。異なる動態、即ち、指数的漸増又は漸減用量での免疫感作、一定一日用量又は１回ボーラス免疫感作が実行された。その短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期が鋭敏な抗原動態の生成を可能にするため、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドが抗原として選択された（Falo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8347-8350, 1992；Widmann et al., J Immunol. 147, 3745-3751, 1991）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。マウスは同一総用量のワクチンで免疫感作されたため、特異的Ｔ細胞誘導はペプチド及びＢＲＭ（ＣｐＧ）投与の動態の相関としてモニタリングされ得る。

【0038】

本明細書中の実施例及び他の箇所に開示されるように、ペプチド及びＢＲＭ（ＣｐＧ）の両方を含む固定累積ワクチン用量は、抗原性刺激の別個の用量−動態を生じるように異なる日程により投与された。指数的漸増抗原刺激は、均一若しくは一定の毎日抗原刺激或いは１回ボーラスとしてのワクチンの投与と比較して、ＣＤ８⁺Ｔ細胞に関する有意により強力な刺激を高め、そしてウイルス感染及び腫瘍に対する長期免疫を増強した。同一現象は、Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激された場合に観察された。

【0039】

したがっていくつかの実施形態は、当該技術分野で説明されたものを上回るクラスＩ ＭＨＣ ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の線形又は指数的漸増抗原刺激のための方法及び組成物に関する。データは、抗原用量と無関係の漸増抗原刺激が免疫原性を増強したことを示す。したがって本発明は、免疫原性を増強し、それによりワクチン開発を改善するための新規の方法を提供する。

【0040】

本発明の実施形態は、免疫原＋免疫賦活剤又はＢＲＭを含む免疫原性組成物の組を提供する。いくつかの実施形態は、指数的漸増方式で抗原及び免疫賦活剤の両方を提供することにより増強免疫（ＣＴＬ）応答を得るための抗原と免疫賦活剤との同時投与を包含する。

【0041】

抗原の免疫原性は、多数のパラメーター、例えば抗原用量（Mitchison, N.A., Proc R Soc Lond Biol Sci 161, 275-92, 1964；Weigle, W.O., Adv Immunol 16, 61-122, 1973；Nossal, G.J., Annu Rev Immunol 1, 33-62, 1983）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）；抗原の局在化（Zinkernagel, R.M., Semin
Immunol 12, 163-71; discussion 257-344, 2000；Zinkernagel, R.M. & Hengartner, H., Science 293, 251-3, 2001）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明
細書中で援用される）；抗原の粒子性又は可溶性（O'Hagan, D.T. & Valiante, N.M. Nat
Rev Drug Discov 2, 727-35, 2003；Bachmann, M.F., et al., Science 262, 1448-51, 1993）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）；並びに抗原が同時刺激シグナルと一緒に提示されるか否か（Janeway, C.A., Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54 Pt 1, 1-13, 1989；Germain, R.N., Nat Med 10, 1307-20, 2004；Matzinger, P., Annu Rev Immunol 12, 991-1045, 1994；Schwartz, R.H., Cell 71, 1065-8, 1992）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）により確定され得る。

【0042】

さらに、免疫原及び免疫感作プロトコールが毒性病原体による感染と類似するほど、より免疫原性になる、と考えられる。高抗原用量及びリンパ性器官における抗原の存在（共に毒性病原体の広範な複製に対応する）は、強力な免疫応答を誘導する。ウイルス又は細菌の構造に類似する粒状抗原は、可溶性抗原より強力な免疫応答を誘導する。付加的には、抗原の提示は、病原体構成成分、例えば細菌ＤＮＡ、リポ多糖又はウイルスＲＮＡと共に、免疫応答を強力に増強する。本明細書中で教示されるように、指数的漸増性抗原刺激は、病原体と関連する一パターンとして免疫系により認識されて、強力な免疫応答を駆動し得る。

【0043】

したがって上記にかんがみて、本発明の実施形態における使用を意図される抗原は、その成長を抑制するか又はそれを排除するために腫瘍又は病原体を攻撃するために悪性腫瘍又は感染性疾患を有する被検体の免疫系を刺激し、それにより疾患を処置するか又は治癒するものである。抗原は、いくつかの場合には、ＣＴＬ応答（細胞媒介性免疫応答とも呼ばれる）、即ち、標的細胞（例えば悪性腫瘍細胞又は病原体感染細胞）の溶解を生じる免疫系による細胞傷害性反応を誘導するために、治療されている動物に見出される特定疾患に適合し得る。当業者に理解されるように、細胞溶解活性増大は、免疫原性組成物の非存在下の場合に比して、免疫原性組成物の存在下で殺傷されるか又は溶解される標的細胞の数の測定値であり得る。殺害されるか又は溶解される標的細胞の数を確定するか又は測定するための方法は、当業者に既知の任意の方法、例えばクロム放出検定、四量体検定等（これらに限定されない）であり得る。

【0044】

本明細書中で用いる場合、クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を刺激することは、応答を誘導すること、初回刺激すること、開始すること、延長すること、保持すること、増幅すること、増大すること、又は高めることを包含するが、これらに限定されない。

【0045】

本明細書中に開示される方法に有用であるとして意図される抗原としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド及びその誘導体、並びに非ペプチド高分子が挙げられるが、これらに限定されない。このような誘導体は、当業者に既知の任意の方法により調製され得るし、当業者に既知の任意の手段により検定され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明で用いるための抗原としては、腫瘍抗原、例えば分化抗原、胎児性抗原、癌−精巣抗原、癌遺伝子及び突然変異化腫瘍抑制遺伝子の抗原、染色体転座に起因する独自腫瘍抗原、ウイルス抗原、並びに、現在又は将来、当業者に明らかになり得る他の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。開示された方法及び組成物に有用である抗原としては、感染性疾患生物体に見出されるもの、例えば構造及び非構造ウイルスタンパク質も挙げられる。開示された組成物及び方法に用いるよう意図される潜在的標的微生物としては、肝炎ウイルス（例えばＢ、Ｃ及びデルタ）、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ等が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答により認識されるか又は標的化されるはずであるこれらの抗原に関する一般用語は、標的関連抗原（ＴＡＡ）である。

【0046】

開示された方法及び組成物に用いられ得るタンパク質抗原としては、以下の：分化抗原、例えばＭＡＲＴ−１／メランＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、及び腫瘍特異的多系統抗原、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５；過剰発現胎児性抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子及び突然変異化腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する独自腫瘍抗原、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；並びにウイルス抗原、例えばエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられるが、これらに限定されない。他のタンパク質抗原としては、例えば以下の：ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ １９−９、ＣＡ ７２−４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトタンパク質、β-ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５−３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＰＬＡ２、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ及びＴＰＳが挙げられ得る。これらのタンパク質ベースの抗原は、文献で又は商業的に、当業者に知られており、利用可能である。

【0047】

本発明の他の例では、８〜１５アミノ酸長のペプチド抗原が意図される。このようなペプチドは、より大きな抗原のエピトープであり得る、即ち、それはＭＨＣ／ＨＬＡ分子により提示されるより大きな分子上の部位に対応するアミノ酸配列を有するペプチドであり、そして、例えば抗原受容体又はＴ細胞受容体により認識され得る。これらのより小さなペプチドは当業者に利用可能であり、そして例えば米国特許第５，７４７，２６９号及び同第５，６９８，３９６号、並びにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２５９３号（国際公開第９６／０１４２９号として公開）（１９９５年７月４日出願、表題「抗原ペプチドの同定及び産生方法並びにワクチンとしてのその使用（METHOD OF IDENTIFYING AND PRODUCING ANTIGEN PEPTIDES AND USE THEREOF AS VACCINES）」）及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＤＥ９６／００３５１号（国際公開第９６／２７００８号として公開）（１９９６年２月２６日出願、表題「腫瘍及びその他の過形成を治療するための作用物質（AGENT FOR TREATING
TUMOURS AND OTHER HYPERPLASIA）」）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）の教示に従って得られる。エピトープ発見への付加的アプローチは、米国特許第６，０３７，１３５号及び同第６，８６１，２３４号（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）に記載されている。

【0048】

概してＴ細胞による抗原特異的認識を最終的に確定する分子はペプチドであるが、抗原の形態が実際には免疫原性調製物で投与され、免疫原はそれ自体ペプチドである必要はない、ということが注目される。投与される場合、全長タンパク質抗原として、それが断片であれ、操作配列であれ、エピトープペプチド（複数可）はより長いポリペプチド内に存在し得る。このような操作配列に含まれるのは、抗体又はウイルスキャプシドタンパク質のようなキャリア配列中に組入れられるポリペプチド及びエピトープである。このようなより長いポリペプチドは、例えば米国特許出願第０９／５６１，５７１号（２０００年４月２８日出願、表題「エピトープクラスター（EPITOPE CLUSTERS）」）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）に記載されているようなエピトープクラスターを包含し得る。エピトープペプチド、又はそれが含有されるより長いポリペプチドは、微生物（例えばウイルス、細菌、原生動物等）、又は哺乳類細胞（例えば腫瘍細胞又は抗原提示細胞）、又は上記いずれかの溶解物（全部又は一部精製）の一構成成分であり
得る。それらは、他のタンパク質、例えば熱ショックタンパク質との複合体として用いられ得る。エピトープペプチドは、例えば脂質化により共有結合的に修飾されるか、又は例えばデンドリマー、多重抗原ペプチド系（ＭＡＰＳ）及びポリオキシムのような合成化合物の一構成成分と成り得るし、又はリポソーム若しくは微小球等に組入れられ得る。本開示中で用いられる場合、「ポリペプチド抗原」という用語は、全てのこのような可能性及び組合せを包含する。本発明は、抗原が微生物又は哺乳類細胞の一ネイティブ構成成分であり得る、と理解する。抗原はさらにまた、組換えＤＮＡ技術を介して、又は特に抗原提示細胞の場合は、投与前にポリペプチド抗原又はエピトープペプチドで細胞をパルス標識することにより、微生物又は哺乳類細胞により発現され得る。付加的には、核酸によりコードされた抗原が投与され得るが、これはその後、ＡＰＣにより発現される。最後に、古典的クラスＩ ＭＨＣ分子がペプチド抗原を提示する一方で、非ペプチド高分子、特に微生物細胞壁の構成成分、例えば脂質及び糖脂質（これらに限定されない）を提示するように適合される付加的クラスＩ分子が存在する。本開示中で用いる場合、抗原、免疫原及びエピトープという用語は、同様にこのような高分子を包含し得る。さらに、核酸ベースのワクチンは、このような高分子の合成に必要な酵素をコードし、それによりＡＰＣ上の抗原発現を付与し得る。

【0049】

現在又は将来に当業者に明らかになり得る、米国特許出願第０９／５６０，４６５号（２０００年４月２８日出願、表題「抗原提示細胞におけるエピトープ同期化（EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS）」）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）に開示された方法により同定される新規のペプチドは、本明細書中に開示される本発明の実施形態において有用である、ということも意図される。

【0050】

本明細書中に開示される本発明の実施形態に用いられ得る付加的ペプチド及びペプチド類似体は、例えば米国仮特許出願第６０／５８１，００１号（２００４年６月１７日出願）及び米国特許出願第１１／１５６，２５３号（２００５年６月１７日出願）（共に表題「ＳＳＸ−２ペプチド類似体（SSX-2 PEPTIDE ANALOGS）」）；並びに米国仮出願第６０／５８０，９６２号（２００４年６月１７日出願）及び米国特許出願第１１／１５５，９２９号（２００５年６月１７日出願）（共に表題「ＮＹ−ＥＳＯペプチド類似体（NY-ESO
PEPTIDE ANALOGS）」）；米国特許出願第０９／９９９，１８６号（２００１年１１月７日出願、表題「抗原の商品化方法（METHODS OF COMMERCIALIZING AN ANTIGEN）」）；米国特許出願第１１／３２３，５７２号（米国特許出願公開第２００６／０１６５７１１号として公開）（２００５年１２月２９日出願、表題「予防的又は治療的目的のためにＭＨＣクラスＩ制限エピトープに対する免疫応答を引き出し、増強し、持続するための方法（METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS 1-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES）」）；並びに米国特許出願第１１／３２３，５２０号（２００５年１２月２９日出願、表題「免疫応答の誘導におけるＣＤ４⁺細胞のバイパス方法（METHODS TO BYPASS CD4⁺ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE）」）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）に開示されている。免疫療法に関する有益なエピトープ選択原理は、例えば米国特許出願第０９／５６０，４６５号（２０００年４月２８日出願）、米国特許出願第１０／０２６，０６６号（米国特許出願公開第２００３／０２１５４２５号として公開）（２００１年１２月７日出願）及び米国特許出願第１０／００５，９０５号（２００１年１１月７日出願）（全て、表題「抗原提示細胞におけるエピトープ同期化（EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS）」）；米国特許出願第０９／５６１，５７１号（２０００年４月２８日出願、表題「エピトープ・クラスター（EPITOPE CLUSTERS）」）;米国特許出願第１０／０９４，６９９号（現在は米国特許第７，２５２，８２４号）（２００２年３月７日出願、表題「癌のための新脈管構造調製物（NEOVASCULATURE
PREPARATIONS FOR CANCER）」）；米国特許出願第１０／１１７，９３７号（米国特許出願公開第２００３／０２２０２３９号として公開）（２００２年４月４日出願）、米国特
許出願第１０／６５７，０２２号（米国特許出願公開第２００４／０１８０３５４号として公開）（２００３年９月５日出願）及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６号（国際公開第０４／０２２７０９号として公開）（２００３年９月５日出願、すべて表題「エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES）」）；並びに米国特許第６，８６１，２３４号（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）に開示されている。

【0051】

本発明のいくつかの態様では、ワクチンプラスミドが用いられ得る。ワクチンプラスミドの全体的設計は、例えば米国特許出願第０９／５６１，５７２号（２０００年４月２８日出願、表題「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS）」）;米国特許出願第１０／２９２，４１３号（米国特許出願公開第２００３／０２２８６３４号として公開）（２００２年１１月７日出願、表題「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計のための方法（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN）」）；米国特許出願第１０／２２５，５６８号（米国特許出願公開第２００３／０１３８８０８号として公開）（２００２年８月２０日出願）及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６２３１号（国際公開第２００４／０１８６６６として公開）（２００３年８月１９日出願、共に表題「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS）」）；並びに米国特許第６，７０９，８４４号（表題「プラスミド増殖における望ましくない複製中間体の回避（AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION
INTERMEDIATES IN PLASMIND PROPAGATION）」）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）に開示されている。

【0052】

本発明の実施形態においてさらに意図されるのは、例えば米国仮出願第６０／４７９，５５４号（２００３年６月１７日出願）及び米国特許出願第１０／８７１，７０８号（米国特許出願公開第２００５／０１１８１８６号として公開）（２００４年６月１７日出願）、米国特許出願第１１／３２３，０４９号（米国特許出願公開第２００６／０１５９６９４号として公開）（２００５年１２月２９日出願）、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９５７１号（２００４年６月１７日出願）（全て、表題「種々の型の癌のためのワクチンにおける腫瘍関連抗原の組合せ（COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN VACCINES FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS）」）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）に開示されているように、特定の癌に対する免疫応答を指図するのに特別な利益を有する特定の抗原組合せである。

【0053】

本明細書中で示されるような、そして当業者に良く知られているようなエピトープは、免疫系の抗原受容体と相互作用する抗原の一部；本発明の場合は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識のためにＭＨＣ分子により提示される抗原の部分、と定義される。免疫原は、免疫応答を刺激し得る分子である。本明細書中で開示される本発明において意図されるような免疫原としては、ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸が挙げられるがこれらに限定されず、この場合、ポリペプチドは、免疫応答を刺激し得る。免疫原は、対応するＴＡＡ又はその断片と同一であり得るが、しかし必ずそうではない。免疫原としては細胞の表面に提示されるエピトープペプチド、並びにそれらがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用し得るよう、クラスＩ ＭＨＣの結合溝と非共有結合的に結合される（複合体形成される）ペプチドが挙げられるが、これらに必ずしも限定されない。付加的には、免疫原は、エピトープ−ＭＨＣ複合体又はそれらの表面にこのような複合体を発現する細胞を包含し得る。

【0054】

本明細書中で示されるような、そして当業者に良く知られているようなミモトープは、エピトープの構造を模倣し、そして同一の又は交差反応性の免疫応答を引き起こす化合物
と定義される。本明細書中で言及されるような、そして当業者によく知られているような合成エピトープは、化学的に合成された非天然エピトープ分子である。タンパク質、ペプチド等を合成するための方法は、当該技術分野でよく知られている。

【0055】

免疫賦活剤及び生物学的応答修飾剤（ＢＲＭ）
本明細書中に開示される本発明の実施形態は、免疫原＋免疫賦活剤又は他の生物学的応答修飾剤（ＢＲＭ）を含む免疫原性組成物の投与によりＴ細胞免疫応答を増強する方法を包含する。ＢＲＭは、例えばエフェクター応答を促進するか又はＴ調節応答を抑制することにより、免疫抑制又は免疫刺激的やり方で作用して、免疫応答を調整し得る。本明細書中で用いられるような免疫賦活剤又はＢＲＭは、抗原受容体以外との相互作用により、免疫系又はその細胞の活性を調整する任意の分子を指し得る。本明細書中で用いられるようなＢＲＭはさらに、生得免疫の経路を刺激することにより免疫調整作用を発揮する天然又は合成の低有機分子を包含し得る。

【0056】

本発明の実施形態で利用され得る好ましい免疫賦活性ＢＲＭは、サイトカイン又はケモカイン産生の引き金となる分子、例えばそれぞれＴＬＲ９及びＴＬＲ３等と結合するＡＰＣ及び生得免疫細胞上の、トール様受容体（ＴＬＲ）に関するリガンド、ペプチドグリカン、ＬＰＳ又は類似体、イミキモド、非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、ｄｓＲＮＡ、例えば細菌ｄｓＤＮＡ（ＣｐＧモチーフを含有する）及び合成ｄｓＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）（これらに限定されない）である。これらのＢＲＭは、全身送達される場合、安全性問題に関連した強力な免疫モジュレーターである、ということが注目される。ＣｐＧは特に（ＴＬＲ−９リガンド）、抗原提示細胞の効率的成熟とその後の抗原特異的リンパ球の活性化を可能にすることにより、アジュバントとしての広範な実験的用途及び臨床的可能性を示している（Krieg, A.M., Annu Rev Immunol 20: 709-760, 2002；Weigel, B.J. et al., Clin. Cancer Res. 9: 3105-3114, 2003；Verthelyi, D. et al.,Aids 18: 1003-1008, 2004；Storni, T. et al., J Immunol 172: 1777-1785, 2004）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。これらの安全性問題の回避への一アプローチは、例えば米国特許出願第１１／３２１，９６７号（米国特許出願公開第２００６／０１５３８４４号として公開）（２００５年１２月２９日出願、表題「リンパ性器官への生物学的応答修飾剤の標的化投与により免疫応答を誘発し、保持し、操作するための方法（METHODS TO TRIGGER, MAINTAIN, AND MANIPULATE
IMMUNE RESPONSES BY TARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS INTO LYMPHOID ORGANS）」）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）に開示されているようなリンパ内投与の使用である。

【0057】

本明細書中で用いる場合、ＢＲＭという用語は、抗原受容体以外との相互作用による免疫系又はその細胞の活性を調整する任意の分子を指し得る。ＢＲＭは、一般に、混合物の活性構成成分（複数可）が規定されていたか否かに関係なく、活性実体（単数又は複数）を含む複合生物学的調製物にも適用される。ＢＲＭとして用いられる複合生物学的調製物の例としては、ＯＫ４３２、ＰＳＫ、ＡＩＬ、レンチナン等が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、このような混合物の活性構成成分（複数可）が規定される。本発明の他の実施形態では、複合生物学的調製物から供給されるＢＲＭは、例えばＯＫ−ＰＳＡ（Okamoto et al., Journal of the National Cancer Institute, 95: 316-326, 2003）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）又はＡＩＬｂ−Ａ（Okamoto et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 11: 483-495, 2004）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）のように、少なくとも部分的に精製されているか又は実質的に精製されている。好ましい実施形態では、ＢＲＭは規定された分子組成を有するものである。ＢＲＭとしては、ｐＡＰＣ又はＴ細胞を活性化する免疫賦活性アジュバント、例えば：ＴＬＲリガンド、エンドサイトーシスパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、キラヤ・サポニン、ツカレゾル、サイトカイン等が挙げ
られる。いくつかの好ましいアジュバントは、例えばMarciani, D.J. Drug Discovery Today 8: 934-943, 2003（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）に開示されている。

【0058】

免疫原としての細胞の投与を包含するいくつかの実施形態では、ＢＲＭは細胞により発現される分子であり得る。一態様では、ＢＲＭ分子は、構成的に、又はいくつかの生物学的刺激に応答して、細胞により自然に発現され得る。別の態様では、発現は、組換えＤＮＡ又はその他の遺伝子操作技術によって変わる。

【0059】

ＢＲＭの一クラスとしては、主に、生得免疫の経路を刺激することにより免疫調整作用を発揮する低有機天然又は合成分子が挙げられる。マクロファージ、樹状細胞及び他の細胞は、微生物上の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するいわゆるトール様受容体（ＴＬＲ）を保有する、ということも示されている（Thoma-Uszynski, S. et al., Science 291: 1544-1547, 2001；Akira, S., Curr. Opin. Immunol., 15: 5-11, 2003）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。さらに意図されるのは、ＴＬＲと結合する低分子、例えばＴＬＲ７及び８を結合することにより免疫の細胞経路を刺激することが示されている新世代の純合成抗ウイルス性イミダゾキノリン、例えばイミキモド及びレシキモドである（Hemmi, H. et al., Nat Immunol 3: 196-200, 2002；Dummer, R. et al., Dermatology 207: 116-118, 2003）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。

【0060】

微生物構成成分を検出する受容体と直接的に相互作用するＢＲＭが、好ましい実施形態で用いられる。しかしながら、シグナル伝達経路の下流で作用する分子も用いられ得る。したがって共刺激性分子（例えば抗ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、抗ＯＸ４０等）と結合する抗体が、本発明の実施形態においてＢＲＭとして用いられ得る。同様に、さらなる実施形態では、本発明の実施形態で用いられるＢＲＭとしては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ等；或いはそれらの産生の引き金となる分子が挙げられ得る。さらに、本発明により本明細書中で意図されるような他のＢＲＭとしては、サイトカイン、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、ｆｌｔ３リガンド（ｆｌｔ３Ｌ）、インターフェロン、ＴＮＦ−α等；或いはケモカイン、例えばＩＬ−８、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ等が挙げられ得る。

【0061】

アジュバントは、抗原の免疫原性を改善する分子及び調製物である。それらは上記のように免疫賦活活性を有し得るが、しかし、このような活性の代わりに、又はそのほかに、免疫原の物理的状態を変更するための特性も有し得る。アジュバントの作用は、抗原特異的でない。しかしながらそれらが精製抗原と一緒に投与される場合、それらは抗原に対する応答を選択的に促進するために用いられ得る。例えば免疫応答は、タンパク質抗原が明礬により沈殿されると、増大する。抗原の乳化も、抗原提示の持続時間を延長する。適切なアジュバントとしては、全ての許容可能な免疫刺激性化合物、例えばサイトカイン、毒素又は合成組成物が挙げられる。例示的な、しばしば好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死結核菌を含有する免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロイントアジュバント、及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。

【0062】

ペプチドをより免疫原性にさせるための一般的一手法は、樹状細胞（ＤＣ）のようなプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）の状況でそれらを注射することである（Steinmann, R.M., Ann Rev Immunol 9, 271-96, 1991）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。ＤＣは、免疫系の強力なＡＰＣである。同様に用いられ得る他のアジュバントとしては、ＭＤＰ化合物、例えばｔｈｕｒ−ＭＤＰ及びｎｏｒ−ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、脂質Ａ及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）が挙げられる。
細菌から抽出される３つの構成成分、すなわちＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液中に含有するＲＩＢＩも意図される。両親媒性及び界面活性剤、例えばサポニン及び誘導体、例えばＱＳ２１（Cambridge Biotech）は、本発明の実施形態に用いるために意図されるアジュバントのさらに別の群を構成する。非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤（Rabinovich et al., 1994）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）も用いられ得る。

【0063】

本発明の免疫原性組成物の投与
本明細書中に開示される本発明の実施形態は、免疫原＋免疫賦活剤又はＢＲＭを含む免疫原性組成物を被検体に投与し、それにより抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するか又は増強する方法に関する。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、指数的漸増方式で被検体に提供される。さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、線形漸増方式で被検体に提供される。

【0064】

本明細書中に開示される方法によれば、免疫原性組成物は、組成物を送達するための当業者に既知の任意の方法により被検体に送達され得る。したがって被検体への本発明の免疫原性組成物の投与は、皮内的、腹腔内的、筋肉内的、粘膜的、並びにリンパ性器官（例えばリンパ節）へ節内的になされ得るが、これらに限定されない。例えばいくつかの実施形態では、免疫原性組成物の投与は、経皮的、経粘膜的、鼻的、気管支的、経口的、直腸的及び／又は皮下的手段によるものであり得る。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物の投与は、リンパ系への直接送達を包含し得る。他の実施形態では、免疫原性組成物の投与は、リンパ系への直接送達から成り得る。ヒトリンパ系は、当業者によく知られているように、リンパ、リンパ球、リンパ管、リンパ節、扁桃、脾臓、胸腺及び骨髄を包含する。

【0065】

いくつかの実施形態では、免疫原＋免疫賦活剤又はＢＲＭを含む有効量の免疫原性組成物は被検体に節内的に投与されるか又は送達され、それにより増強されたＴ細胞応答を引き出す、というのが望ましい。いくつかの実施形態では、増強応答としては、Ｔ細胞応答の線形増大刺激が挙げられる。いくつかの実施形態では、増強応答としては、Ｔ細胞応答の指数的増大刺激が挙げられる。節内投与は、例えば米国特許第６，９９４，８５１号及び同第６，９７７，０７４号；ＰＣＴ特許公開第９９０２１８３号パンフレット；並びに米国特許出願公開第２００５００７９１５２号（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）に開示されている。免疫感作の方法との免疫応答性を査定し、モニタリングするための診断技法の統合は、例えば米国特許出願第１１／１５５，９２８号（２００５年６月１７日出願、表題「診断方法を治療方法と統合することによる能動免疫療法の効能改善（IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS）」）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）により詳細に考察されている。

【0066】

投与のための用具
本明細書中に開示される免疫原性組成物は、以下の実施例におけるような皮下注射器を用いて、又はワクチン接種のための当該技術分野で既知の他の同様の機能性の用具を用いて、ボーラス注射により送達され得る。送達／投与の他の方法としては、例えばポンプのような免疫原送達手段によるリンパ系への皮下的又は直接的な注入を包含し得る。好ましい実施形態では、送達手段は、動物にとって外部であるが、しかし身体中への、好ましくはリンパ系器官又は高リンパ流の領域へ抗原を送達するための手段（例えば針又はカテーテル）を含有する。免疫原送達手段の一利点は、それが多数回実施される注射を不要にする点である。

【0067】

患者の身体の外側に位置する送達用具／手段（外部用具）は、免疫原性組成物を保持するためのレザバー、レザバーから組成物を圧送するためのプログラム可能なポンプ、組成物を送達するための送達チャンネル又はライン、並びに患者の身体中に組成物を導入し、最終的にリンパ系に到達させるための手段で構成される。好ましい一実施形態では、所望の漸増免疫原濃度を提供するために、ポンプは注入される容積を増大するようプログラムされ得る。代替的実施形態では、ポンプのレザバーは、連続増大濃度の免疫原を含む組成物で充填される。好ましくは、免疫原性組成物のためのレザバーは、長時間にわたる所望量の免疫原の送達のために十分に大きく、そしてリンパ系に免疫原性組成物を導入するための手段を使用者が再挿入する必要なく容易に補充可能であるか又は取替え可能である。免疫感作のための外部ポンプ、例えば例示的ポンプの使用は、例えば米国特許第６，９９７，０７４号（表題「ＣＴＬ応答の誘導方法（Method of Inducing a CTL Response）」）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）でさらに考察されている。

【0068】

治療及び投与量レジメン
概して、本発明の実施形態は、被検体の免疫系が疾患を攻撃するために疾患関連抗原に対する細胞媒介性応答を備える疾患を有する被検体を治療するために有用である。疾患の種類は、例えば悪性腫瘍、又は細胞内に進入し、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球により攻撃される細菌、ウイルス、原生動物、蠕虫、もしくは任意の微生物病原体により引き起こされる感染性疾患であり得る。一治療様式において、本発明の方法は持続性又は慢性症状に良好に適しているが、しかし必ずしもこのようなものに限定されない。さらに、本発明は、感染性疾患又は腫瘍を発症する危険に曝されている被検体を免疫感作するために有用である。

【0069】

本発明により意図される疾患及び／又は症状を治療するに際しては、免疫原＋免疫賦活剤又はＢＲＭを含む免疫原性組成物の投与量レジメン及び投与日程が用いられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される免疫原性組成物は複数回の順次用量として投与され得るが、この場合、初回用量後の各用量は増大用量である。このような順次漸増用量は、線形又は指数的漸増用量として提供され得る。本明細書中で用いる場合、線形漸増用量は、ｎｄ_i（ここで、ｄ_iは初期用量であり、そしてｎは一連の指数であって、したがって用量シリーズはｄ_i、２ｄ_i、３ｄ_i、．．．ｎｄ_iである）である一連の用量を指す。指数的漸増用量とは、ｘ^n-1ｄ_i（ここで、ｘ＞１であり、したがって用量シリーズはｄ_i、ｘｄ_i、ｘ²ｄ_i、ｘ³ｄ_i、．．．ｘ^n-1ｄ_iである）である一連の用量を意味する。したがって、ｘ＝２である場合、各用量はシリーズにおける直前用量の２倍である；ｘ＝５である場合、各用量はシリーズにおける直前用量の５倍である。したがって、好ましい一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、各用量が初回用量のｘ^n-1倍である指数因子で提供される複数回の順次用量として投与され得る。このような複数回の用量は、必要に応じて、２、３、４、５、６又はそれより多くの用量であり得る。投与される初回用量（複数可）が免疫応答を生じるためには低過ぎる用量である場合、より多数回の用量（すなわち７、８、９、１０、１２、１５又はそれより多くの回の用量）が被検体に投与されて、より免疫学的に有効な用量応答を達成し得る。

【0070】

本発明のいくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、抗原又はその免疫原性部分を含む細胞を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、細胞は抗原提示細胞として役立ち、抗原を発現し、プロセシングするか、或いは抗原又はエピトープペプチド或いは抗原の他の免疫原性部分でパルス標識される。細胞は抗原（又は免疫原）を自然に発現し得る、例えば癌細胞はＴｕＡＡを発現し、或いはそうするよう操作することができ、例えば、樹状細胞は、免疫原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされる。例えば細胞は、癌又は腫瘍細胞、或いは抗原提示細胞であり得るが、しかしこれらに限定されない。腫瘍細胞は、膀胱細胞、乳房細胞、肺細胞、結腸細胞、前立腺細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、胃細
胞、精巣細胞、脳細胞、卵巣細胞、リンパ球、皮膚細胞、脳細胞、骨細胞、柔組織細胞等であり得る。抗原提示細胞は、例えば樹状細胞であり得る。これらの実施形態における投与量は、直前用量のものに比して投与される細胞の数を順次増大することにより、或いは直前用量のものに比して細胞の表面上のエピトープ−ＭＨＣ複合体の数を順次増大する（この場合、エピトープは標的抗原からのものである）ことにより、或いはその両方により、増大され得る。細胞表面上のエピトープ−ＭＨＣ複合体の数は、異なる濃度のエピトープでパルス標識することにより、最も容易に操作され得る。

【0071】

したがって投与は、投薬処方と適合した任意のやり方で、そして治療的又は予防的に有効であるような量でなされる。本発明の免疫原性組成物の有効量又は用量は、治療されるべき被検体における所望の応答、例えば疾患又は症状、その進行或いはその症候の予防、縮小、逆転、安定化又はその他の改善（これらに限定されない）を提供するために必要とされる量である。免疫原性組成物の投与量及び投与日程は、例えば被検体の体重及び年齢、治療されている疾患及び／又は症状の種類、疾患又は症状の重症度、以前の又は同時進行の治療的介入、応答する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、投与方式等（これらは全て、開業医により容易に確定され得る）のような要因を考慮に入れることにより、被検体毎に変わり得る。

【0072】

本明細書中で用いられる組成物は、種々の「単位用量」を含み得る。単位用量は、その投与、即ち適切な経路及び治療レジメンと関連して所望の応答を生じるよう算定された治療用組成物の予定量を含有する、と定義される。投与されるべき量、並びに特定経路及び処方は、臨床分野の当業者の技量内である。治療されるべき被検体、特に被検体の状態及び所望される防御も重要である。単位用量は、１回注射として投与される必要はなく、規定時間にわたる連続注入を包含し得る。

【0073】

本発明のさらなる実施形態では、複数回の用量の免疫原性組成物は、互いの約２４時間〜４８時間以内に、互いの約１２時間〜２４時間以内に、最も好ましくは互いの約６時間〜１２時間以内に投与され、用量間が約２４時間の間隔であるのが最も好ましい、ということが意図される。いくつかの実施形態では、数日間隔で（この場合、その後の投与までに数日（例えば１、２、３、４、５、６又は７日）が経過する）、複数回の用量の本発明の免疫原性組成物を投与する、というのが望ましい。例えば初回用量は低投与量で投与され、その後、第２回の低用量又は高用量が投与され、そしてこのような第２回用量は初回用量後、１、２、３日目又はそれより後に投与され得る；次に第３回用量が第２回用量の１、２、３日後又はそれ以降に投与され、次に第４回用量が第３回用量の１、２、３日後又はそれ以降に投与され、その後も同様に投与され得る。いくつかの実施形態では、抗原の半減期に影響を及ぼされる間隔で、順次用量が提供され得る。抗原の半減期は、抗原の５０％が被検体から正常な生物学的プロセスにより代謝されるか又は排除されるのに要する時間である。このように熟練開業医又は臨床医は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞免疫応答を最適化するために、複数回の用量の免疫原性組成物を投与するための時間、並びにその後の投与までの時間経過を確定する。

【0074】

本発明の免疫原性組成物の投与間隔（複数可）は、投与量レジメン及び投与される用量の有効性によって、数分から数日の範囲であり得る。しかしながら、長時間にわたる用量の線形又は指数的増大に対応する応答Ｔ細胞の数を増強するために初回用量の或る日数以内に最終用量は投与されることが意図される。種々の実施形態では、初回用量と最終用量との間の時間間隔は７日未満であり、好ましくはそれは４又は５日であり、さらに好ましくは最終用量は初回用量の６日以内に投与され得る。このように投与されるべき最終用量は、投与される日及び初回用量の有効性によって変わるだけでなく、免疫応答を生じるためのＴ細胞の数の増強によっても確定される。時が経つに連れて、引き出される免疫応答は衰え、免疫を延長するか又は再確立するために当該手法が反復され得る。

【0075】

本発明の免疫原性組成物が一療法として投与され得る被検体としては、全ての年齢のヒト及び動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、並びに家庭ペット、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の免疫原性組成物は、主に、癌又は感染性疾患のような疾患又は症状の治療において誘導され、持続され、又は指数的に刺激される特定の免疫学的応答を有する必要があるヒトを治療するのに利用され得る。

【0076】

キット
本明細書中に記載される組成物の何れもが、キット中に一緒に集められ得る。非限定な一例では、免疫原性組成物を送達するための１つ又は複数の作用物質又は試薬は、感染性疾患又は癌による疾患又は症状を治療するために、キット中に単独で、又は付加的作用物質と組合せて提供され得る。しかしながらこれらの構成成分は、限定的であるよう意図されない。キットは、作用物質又は試薬を保存及び分散するための適切な容器手段を提供する。

【0077】

キットは一般的に、適切な容器手段中に、被検体に投与するための免疫原＋免疫賦活剤又はＢＲＭの薬学的に許容可能な処方物を含む免疫原性組成物、並びに投与するための使用説明書を含有する。キットは単一容器手段を有してもよく、及び／又は感染性疾患又は癌による疾患又は症状を治療するための治療薬（複数可）の免疫学的／治療的に有効な処方物のような付加的化合物のための別個の容器手段を有し得る。キットはさらに、適切な容器手段中に、いくつかの用量の免疫原性組成物を各々別個の容器手段中に含有し得る。免疫原性組成物のいくつかの用量は、免疫原性組成物の２つ以上の順次漸増用量であり得るが、この場合、各々のその後の用量はその直前用量より大きい。いくつかの実施形態では、キットは、２つ以上の用量の免疫原性組成物を含有し、各用量は適切な別個の容器手段内にある。例えばキットは、２、３、４、５、６、７又はそれより多くの用量の免疫原性組成物を含有することができ、各用量は適切な別個の容器手段内にある。他の実施形態では、キットは、各々が別個の容器手段内にあるいくつかの用量の免疫原、或いは免疫賦活剤又はＢＲＭを含み得る。

【0078】

キットの構成成分が１つ及び／又は複数の液体溶液中で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。組成物は注射用組成物にも処方され得るが、この場合、容器手段それ自体が、注射器、ピペット、及び／又は他のこのような同様の装置であり、これらから処方物が被検体に送達又は注射され得るか、及び／又はキットの他の構成成分に適用又は混合されることさえある。いくつかの実施形態では、キットの構成成分は乾燥粉末（複数可）として提供され得る。構成成分（例えば試薬）が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒の付加により再構成され得る。溶媒はさらにまた、別の容器手段に入れて提供され得ることが考えられる。

【0079】

本発明に従って用いられる漸増投与量は、同一濃度のより大きい容積を、より高濃度の同一容積を、又はそれらのいくつかの組合せを投与することにより、提供され得る。したがって、種々の実施形態では、キットは、以下の：個別に包装された用量；或いは、漸増容積を分配し、投与するための１つ又は複数の多用量容器；或いは、或る容積を分配し、順次低減希釈を施され、そして定容積を投与するための１つ又は複数の多用量容器；或いは、当業者が思いつくのと同様の組合せ及び利用を含み得る。

【0080】

容器手段は、一般的に、免疫原及び／又は免疫賦活剤又はＢＲＭを含有する少なくとも１つのバイアル、アンプル、試験管、フラスコ、瓶、注射器及び／又はその他の容器手段を包含する。キットは、滅菌性の、薬学的に許容可能な緩衝剤及び／又はその他の希釈剤を含入するための第２の容器手段も包含し得る。本発明のキットは、典型的には、本発明
の方法を実行するための材料を含入するための手段、並びに市販の密閉状態の任意の他の試薬容器も包含し得る。このような容器は、所望のバイアルが保持される射出又は吹込み成形プラスチック容器を包含し得る。容器の数又は型とは関係なく、本発明のキット（複数可）は、被検体の身体内への免疫原＋免疫賦活剤又はＢＲＭを含む免疫原性組成物の注射／投与を手助けするための器具も含み得るか、或いはそれと共に包装され得る。このような器具は、注射器、ポンプ及び／又は任意のこのような医学的に認可された送達手段であり得る。

【0081】

いくつかの実施形態では、漸増用量の免疫原性組成物を含有する一組の注射器が提供されるが、この場合、初回用量の後の各用量は直前用量より多い。いくつかの実施形態では、漸増用量の免疫原性組成物を含有する一組のバイアルが提供されるが、この場合、初回用量の後の各用量は直前用量より多い。漸増用量は、線形的手段により、又は指数的手段により、順次増大され得る。

【0082】

本発明を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲で定義された本発明の範囲を逸脱しない限り、修正、変更及び等価の実施形態がなされ得る、ということは明らかである。さらに、本発明の開示における実施例は全て、非限定例として提供される、と理解されるべきである。

【実施例】

【0083】

本発明をさらに例証するために、以下の非限定例を提示する。実施例に開示された技法は、本発明の実行において良好に機能することを本発明者らが見出した代表的アプローチに従い、したがってその実行のための方式の例を構成すると考えられ得る、と当業者に理解されるべきである。しかしながら、本発明の開示を鑑みて、本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、開示されている特定の実施形態において多数の変更を行うことができ、同様の又は類似の結果を依然として得ることができる、と当業者は理解すべきである。

【0084】

実施例１
材料及び方法
マウス ６〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Harlan（Horst, The Netherlands）から購入した。糖タンパク質中に位置するＨ−２^bマウスにおけるリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の免疫優性エピトープを表すペプチドｇｐ３３（ａａ３３〜４１）に特異的なＴ細胞受容体を発現するＴＣＲ３１８トランスジェニックマウスは、Cytos Biotechnology AG（Schlieren, Switzerland）から入手した（Pircher, H., et al. 1989. Nature 342: 559-561；Pircher, H. et al., Nature 346, 629-633, 1990）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。ＨＬＡ Ａ２．１を発現するＨＨＤトランスジェニックマウスは、MannKind Corporation（Valencia, CA; Pascolo, S. et al., J Exp Med 185, 2043-2051, 1997）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）から最初に得られた。スイスの獣医学機関のガイドラインに従って、チューリッヒ大学病院の特定の無病原体施設で、マウスを繁殖させ、保持した。

【0085】

ウイルス、ペプチド及びオリゴデオキシヌクレオチド ＬＣＭＶ単離物であるＷＥを、チューリッヒ大学病院・実験免疫学研究所（スイス）（Institute of Experimental Immunology, University Hospital, Zurich, Switzerland）から入手した。ＭＣ５７繊維芽細胞に関するフォーカス形成検定を用いて、ＬＣＭＶ力価を確定した（Battegay, M. et al., J Virol Methods 33, 191-198; 1991）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。ＬＣＭＶ糖タンパク質（ｖａｃｃ−ｇｐ）を発現する組換えワクシニアウイルス（Bachmann, M.F. et al., Eur J Immunol 24, 2228-2236, 1994）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）を増殖させて、そしてＢＳＣ４０細胞上にプラーク形成させた（Kundig, T.M. et al., J Virol 67, 3680-3683; 1993
）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。ＬＣＭＶ糖タンパク質ペプチドｇｐ３３（ａａ３３〜４１；ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ、配列番号３）及びｇｐ６１（ａａ６１〜８０；ＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＥＦＤ、配列番号４）、並びにＶＳＶペプチドｎｐ５２（ＳＤＬＲＧＹＶＹＱＧＬＫＳＧ、配列番号５）は、EMC Microcollections（Tubingen, Germany）から購入した。インフルエンザ・マトリックスペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ、配列番号６）は、Neosystems（Strasbourg, France）から入手した。用いられたＨＰＶ１６ Ｅ７（ａａ４９〜５７；ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号７）ペプチドは、MannKind Corporation（Valencia, CA）で９９％超の純度に合成された。ホスホロチオエート修飾高ＣＧオリゴデオキシヌクレオチド１６６８（５’−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＡＴ ＡＡＴ−３’、配列番号８）は、Microsynth（Balgach, Switzerland）により合成された。

【0086】

免疫感作日程 固定累積用量の１２５μｇのｇｐ３３（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ、配列番号３）ペプチド又はインフルエンザ・マトリックスペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ、配列番号６；Falk, K. et al., Immunology 82, 337-342, 1994）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）、及び１２．５ｎｍｏｌのＣｐＧ１６６８を、１〜４日の時間枠の間送達するよう、異なる免疫感作日程（ｓ１〜ｓ６）を計画した（表１）。日程３（ｓ３）及び４（ｓ４）は、それぞれ５倍希釈工程で指数的漸減又は漸増パターンに従う、ということに留意されたい。インフルエンザ・マトリックスペプチドによる免疫感作を１２５μｇの同一累積用量で実行した後、同一日程を続けた。

【0087】

養子免疫伝達実験 １×１０⁶ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、２５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、前駆体Ｔ細胞頻度を増大し、免疫応答の査定を促すために、性別一致Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。１日後、表１に示したようにシトシン−グアニンオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）と混合した種々の用量のｇｐ３３ペプチドを用いて、レシピエントの首領域に皮下ワクチン接種した。代替的には、ＬＣＭＶ−ＷＥ系統（２５０ｐｆｕ）でマウスを静脈内感染させた。同一日程に従って、１２５μｇの同一累積用量を用いて、インフルエンザ・マトリックスペプチドによる免疫感作を実行した。

【0088】

ＦＡＣＳ分析 表面抗原のＦＡＣＳ分析のために、血液、脾臓又はリンパ節のＲＢＣ無含有単一細胞懸濁液を調製した。Ｆｃ−受容体遮断のために抗ＣＤ１６／ＣＤ３２と共に５分間、氷上で細胞をインキュベートし、３７℃で１５分間、ＰＥ標識ｇｐ３３ ＭＨＣクラスＩ四量体（ｇｐ３３／Ｈ−２Ｄｂ）で染色した後、氷上で２０分間、他の表面抗原に関して染色した。染色は全て、ＰＢＳ／ＦＣＳ２％（０．０１％アジ化ナトリウム含有）中で実行した。ＩＦＮ−γの細胞内染色のために、完全培地中の２×１０^-6Ｍのｇｐ３３ペプチド及び１０μｇ／ｍｌブレフェルジンＡ（Sigma, Buchs, Switzerland）を用いて、４時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで単一細胞懸濁液を培養した。次にリンパ球を上記のように表面染色し、タンパク質無含有ＰＢＳ／ＰＦＡ１％中で１０分間固定し、氷上で３分間、ＰＢＳ／ＮＰ４０ ０．１％中に浸透させて、最後に氷上で３５分間、ＰＢＳ／ＦＣＳ ２％中の抗ＩＦＮ−γ抗体と共にインキュベートした。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで獲得して、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（BD Biosciences, San Jose, CA）又はＦｌｏｗＪｏソフトウエア（TreeStar Inc., Ashland, OR）を用いて分析した。他の抗体はすべて、BD Pharmingen(San Diego, CA)から購入した。

【0089】

ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ウイルス免疫の査定 ワクチン接種した雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１．５×１０⁶ｐｆｕ ｖａｃｃ−ｇｐに腹腔内感染させた。５日後に、卵巣を単離し、Kundig, T.M. et al., J Virol 67, 3680-3; 1993（上記）に記載されたようにＢＳＣ ４０細胞に関してワクシニア力価を確定した。代替的には、マウスを２５０ｐｆｕ
ＬＣＭＶ−ＷＥに感染させて、脾臓中のウイルス力価をＭＣ５７細胞に関して確定した
（Battegay et al., 1991、上記）。

【0090】

細胞傷害性検定及びサイトカイン分泌検定 １×１０⁵トランスジェニックｇｐ３３特異的Ｔ細胞を、同系照射支持細胞（２×１０⁶細胞／ウエル；２０００ｒａｄｓ）と一緒に２４ウエルプレート中で６日間培養し、指示量のｇｐ３３ペプチドでパルス標識した。次にエフェクター細胞を３００μｌの新鮮な培地中に再懸濁して、３倍希釈液を作った。ＥＬ−４細胞を１０^-6Ｍのｇｐ３３ペプチドでパルス標識し、５時間⁵¹Ｃｒ放出検定における標的細胞として用いた（Bachmann, M.F. et al., Eur J Immunol 24, 2228-36, 1994、上記）。細胞培養上清中の放射能を、Ｃｏｂｒａ ＩＩ計数器（Canberra Packard, Downers Growe, IL）で測定した。非放射性培養上清を、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１０濃度に関して毎日査定した。サイトカイン分析を、ビーズ・多重検定及びフローサイトメトリーを用いて実施した。

【0091】

ワクチン接種のための骨髄由来樹状細胞の調製 骨髄細胞を若いＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨から単離し、そして５０ｎｇ／ｍｌのｒｍＧＭ−ＣＳＦ及び２５ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−４（R&D Systems, Minneapolis, MN）を有する１００ｍｍ皿中の１０ｍｌの補足培地中に２×１０⁶細胞で植え付けた。７日目に、細胞を収穫し、そして抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を用いた陽性選択によりＤＣを精製した。精製細胞を６ウエルプレート中でプレート化し、２μＭのＣｐＧ ＯＤＮ １６６８で一晩刺激した。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｃ及びマウス系統抗体カクテル（ＣＤ３ｅ、Ｃｄ１１ｂ、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、Ｌｙ−７６、Ｌｙ−６Ｇ、Ｌｙ−６Ｃ）に対する標識化ｍＡｂのパネルを用いて、フローサイトメトリーにより、ＤＣ表現型を査定した。抗体は全て、BD Pharmingenから入手した。その後、ＤＣを、３７℃で２時間、１０μｇ／ｍｌでＨＰＶ Ｅ７（ａａ４９〜５７）ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号７）でパルス標識した。ＤＣをＰＢＳで３回洗浄した後、２５μＬのＤＣを麻酔したＣ５７／Ｂ６マウスの鼠径リンパ節の両側に投与した（Johansen et al. 2005a. Eur J Immunol 35: 568-574）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。マウス１０匹の群に、１日目にＤＣ（１．１１×１０⁵）の１回ボーラス注射（ｓ１）を、或いは１、３及び６日目に指数的漸増数のＤＣ（１０³、１０⁴及び１０⁵）の注射（ｓ４）を施した。

【0092】

Ｅ７四量体分析 ＰＢＭＣを１７日目にマウス（ｎ＝１０）から単離し、密度遠心分離（Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs）後に単核細胞をＲＢＣから分離した。Ｈ−２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号７）−ＰＥ ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter）及びＦＩＴＣ接合抗ＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）（BD Pharmingen）ｍＡｂで、４０℃で１時間、細胞を染色することにより、Ｅ７₄₉〜₅₇特異的ＣＴＬ応答を定量した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いてデータを収集し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。

【0093】

ＥＬＩＳＰＯＴ分析 ＩＦＮ−γ産生細胞の定量のために、脾臓を２１日目に単離し、単一細胞懸濁液を調製した（ｎ＝７）。単核細胞を密度遠心分離により単離し、そして非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、β−メルカプトエタノール及びＨＥＰＥＳを含有する無血清ＨＬ−１完全培地中に再懸濁した。三重の２．５×１０⁵個の脾臓細胞を、９６ウエル・フィルター膜プレート（Multi-screen IP
membrane 96-well plate, Millipore）中で３７℃で７２時間、１０μｇ／ウエルのＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドと共にインキュベートした。コーティング及び検出ＩＦＮ−γ抗体（U-Cytech biosciences, Utrecht, The Netherlands）を用いて２４時間展開後、ＥＬＩＳｐｏｔ読取器及びソフトウエア（AID, Strassberg, Germany）を用いてＥＬＩＳＰＯＴを定量した。

【0094】

腫瘍防御試験 ２１日目（ＤＣの最終注射の１５日後）に、各ワクチン接種群からのマウス３匹並びにナイーブＣ５７／Ｂ６マウス７匹を、ＨＰＶ形質転換腫瘍細胞株Ｃ３．４３の１０⁵細胞で攻撃誘発し（Feltkamp et al. 1993. Eur J Immunol 23: 2242-2249；Feltkamp et al. 1995. Eur J Immunol 25: 2638-2642）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び５０μＭの２−メルカプトエタノール中で培養した。細胞を、左脇腹に皮下投与した。腫瘍進行を内径測定（ｍｍ）によりモニタリングし、腫瘍容積を算定した。

【0095】

統計学的分析 等分散性を想定するスチューデントｔ検定を実施し、データを、０．０５より低い対応なし両端ｐ値で有意とみなした。マン・ホイットニーＵ検定を用いて、又はクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡにより、非パラメーター的又は非正規分布データを分析した。対数順位検定を用いて、カプラン・マイヤー生存曲線の比較を実施した。

【0096】

実施例２
指数漸増的抗原刺激はＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を増強する
Ｔ細胞応答が漸増抗原刺激により増強され得るか否かを調べた。第一の実験では、１×１０⁶個のトランスジェニックｇｐ３３特異的Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６野生型レシピエントマウス中に移して、前駆体Ｔ細胞頻度を増大し、免疫応答の査定を促した。

【0097】

図１Ｄ及び表１に開示したような異なるワクチン接種プロトコールを用いて、ＣｐＧ ＯＤＮと混合した同一累積用量のｇｐ３３ペプチド（全体で、１２５μｇのｇｐ３３及び１２．５ｎｍｏｌのＣｐＧ）で、全マウスを免疫感作した：ｓ１）０日目にボーラス注射で１回用量；ｓ２）４日間にわたって４等用量；ｓ３）４日間にわたって漸減用量；そしてｓ４）４日間にわたって漸増用量。付加的に、マウスの群を１回用量のＣｐＧで免疫感作し、その後、指数的漸増用量のｇｐ３３ペプチドで免疫感作する（ｓ５）、又は１回用量のｇｐ３３で免疫感作し、その後、指数的漸増用量のＣｐＧで免疫感作する（ｓ６）。０日目に２５０ｐｆｕのＬＣＭＶウイルスに静脈内感染させたマウスを、陽性対照として役立てた。６日目（図１Ａ）、１２日目（図１Ｂ）及び８日目（図１Ｃ）に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｇｐ３３ペプチドで再刺激した血中リンパ球の細胞内ＩＦＮ−γ染色により、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を定量した。図１Ｂは、１２日目の分析の代表的ＦＡＣＳ例を表す。

【0098】

ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を強力に増強するため、ＣｐＧ ＯＤＮをアジュバントとして選択した（Krieg, A.M., Annu Rev Immunol 20, 709-60, 2002；Schwarz, K. et al., Eur J Immunol 33, 1465-70, 2003）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。ホスホロチオエート安定化ＯＤＮは、３０分〜６０分の半減期で血漿から除去された（Farman, C.A. & Kornbrust, D.J., Toxicol Pathol 31 Suppl, 119-22, 2003）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。しかしながら、組織中では、ＣｐＧ ＯＤＮは相対的に安定しており、半減期は４８時間であった（Mutwiri, G.K., et al., J Control Release 97, 1-17, 2004）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。さらに、６０分以内に、血清プロテアーゼは検出レベルより低い値に遊離ペプチドを分解させる、ということが文献中で注目される（Falo, L.D., Jr., et al., Proc Natl Acad Sci USA 89, 8347-50, 1992；Widmann, C., et al., J Immunol 147, 3745-51, 1991、上記）。

【0099】

ＬＣＭＶ野生型による感染に匹敵する規模のＣＤ８⁺Ｔ細胞応答をもたらす免疫感作は、ｇｐ３３及びＣｐＧが共に指数的漸増様式で投与されることを必要とした、ということをデータは示す。均一１日用量のｇｐ３３及びＣｐＧを用いた免疫感作は、二次最強ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導したが、しかしながらこれは用量段階的増大刺激より有意に弱かった（６日目にｐ＝０．０００１）。ワクチン構成成分のいずれか１つが１回用量として送達された場合、免疫感作の効力は有意に低減されるが、しかしナイーブ対照と比較して有
意であった（２．２３±０．８４％対０．１９±０．１２％、６日目にｐ＝０．０２）。

【0100】

同じような観察は、ＴＣＲトランスジェニック細胞を施されなかったナイーブ野生型マウスにおいてなされた（図１Ｃ）。指数的漸増ワクチン（ｇｐ３３及びＣｐＧ）用量で免疫感作されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、かろうじて検出可能な頻度の特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を誘導した他のワクチン接種プロトコールと比較して、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の有意に増強された誘導（２．１±０．４％）を示した（ｐ＜０．００８）。４日目に測定可能な免疫応答を示した試験群はなかった（データは示されていない）。これらの結果は、全体的用量とは関係なく、ワクチン接種の動態は免疫原性の重要な一パラメーターである、ということを実証する。

【0101】

試験群の何れもが、４日目に測定可能な免疫応答を示さなかった（データは示されていない）。全体的に、これらの結果は、全体的用量とは関係なく、抗原及びアジュバントの動態が免疫原性の重要なパラメーターである、ということを示した。

【0102】

図中の説明：ｓ１：１回用量のｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧ；ｓ２：等用量のｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧ；ｓ３：指数的漸減用量のｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧ；ｓ４：指数的漸増用量のｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧ；ｓ５：指数的漸増用量のｇｐ３３ペプチド及び最初の１回用量のＣｐＧ；ｓ６：最初の１回用量のｇｐ３３ペプチド及び指数的漸増用量のＣｐＧ；ナイーブ：未処置マウス；ＬＣＭＶ：０日目に２５０ｐｆｕのＬＣＭＶで静脈内免疫感作したマウス。値は、群当たり４匹のマウスの平均及びＳＥＭを表わす。３つの類似の実験のうちの１つの代表的実験が示される。

【0103】

図１Ｂは、１２日目の分析のＦＡＣＳの代表的な例である。上方パネル：ｇｐ３３ペプチドによる再刺激、下方パネル：ｇｐ３３再刺激を伴わない対照染色（下方パネル）。

【0104】

【表1】

【0105】

実施例３
ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の増強はＴ細胞ヘルプとは無関係である
ＣＤ８⁺Ｔ細胞初回刺激に関するＴ−ヘルプの役割は、当該技術分野でよく知られている。Ｔｈ−エピトープは、機能性ＣＤ８⁺Ｔ細胞免疫にきわめて重要であり得る（Johansen et al., Eur J Immunol., 34, 91-97, 2004；Shedlock and Shen, Science, 300, 337-339, 2003；Sun and Bevan, Science, 300, 339-342, 2003）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。他方で、前駆体頻度が高い状況では、特に強力な免疫原、例えばＬＣＭＶ ｇｐ３３を用いる場合、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は低Ｔｈ依存性である（Mintern et al., J Immunol., 168, 977-980, 2002）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。さらに、投与経路もＴ−ヘルプの要求に影響を与え得る（Bour et al., J Immunol., 160, 5522-5529, 1998）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。したがって、ＣＴＬのＴｈ依存性は、実験設定によって大きく変わる。この仮説に基づいて、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の増強が指数的漸増ワクチン用量でのワクチン接種によるＴ細胞ヘルプと無関係であるか否かを、本発明者らは調べた。

【0106】

クラスＩ ＬＣＭＶ ｇｐ３３（ａａ３３〜４１）ペプチド及びＬＣＭＶのクラスＩＩ
ＬＣＭＶ ｇｐ６１（ａａ６１〜８０）Ｔｈ−エピトープの混合物を用いて、上記プロトコールの場合（表１参照）と同様に、指数的漸増ワクチン用量でマウスを免疫感作した。ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答に及ぼす用量動態の同一作用が上記プロトコールで免疫感作されたマウスにおいて得られた（データは示されていない）ため、指数的漸増ワクチン用量での
ワクチン接種によるＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の増強は、Ｔ細胞ヘルプと無関係であることが観察された。

【0107】

上記で観察された指数的免疫感作が他のペプチドで達成され得るか否かを調べるために、ヒトＨＬＡ Ａ２．１クラスＩ分子と結合するインフルエンザ・マトリックスタンパク質由来の別のペプチドに分析を拡大した（Falk, K. et al., Immunology: 82, 337-42, 1994、上記）。ＨＬＡ Ａ２．１を発現するトランスジェニックマウス（ＨＨＤ；Pascolo, S. et al., J. Exp. Med. 185, 2043-51, 1997、上記）を、インフルエンザ・マトリックスペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ、配列番号１）及びＣｐＧ ＯＤＮで皮下免疫感作した。免疫感作日程は、表１（上記）に記載したとおりであった。ワクチンを、１回ボーラス（１２５μｇペプチド及び１２．５ｎｍｏｌ ＣｐＧ、ｓ１）として与えるか、又は同一総用量を、用量段階的増大方式で４日にわたって（ｓ４）投与した。抗原を徐々に放出する鉱油である不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を、陽性対照として用いた（Miconnet, I. et al., J Immunol., 168, 1212-8, 2002；Speiser, D.E. et al., J Clin. Invest. 115, 739-46, 2005；Aichele, P., et al., J Exp. Med. 182, 261-6; 1995）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。８日後、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を、ペプチドによる血中リンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激後のＩＦＮ−γ産生に関して分析した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３〜４）。指数的漸増ワクチン用量は、１回用量のペプチド及びＣｐＧ（０．６％±０．２）又はＩＦＡ中で乳化されたペプチド及びＣｐＧの処理（２．５％±１．９）より高頻度のＩＦＮ−γ産生細胞（６．２％±１．５）を生じる、ということが観察された（図２）。

【0108】

実施例４
４日以上の抗原投与は、最大ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導する
上記実施例で示したように、４日間の期間にわたって指数的に増大した抗原は、ボーラス注射又は均一ワクチン用量の毎日注射より有意に強力なＴ細胞応答を誘導した。したがって、抗原提示のさらなる延長が応答をさらに増強するか否かを調べるために、実験を実行した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群を、同一総用量のｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧ（１２５μｇのｐ３３及び１２．５ｎｍｏｌのＣｐＧ）で、しかし異なる指数的動態に従って、ボーラスとしての用量を注射することにより、或いは４、６又は８日間にわたって（図３Ａ）皮下免疫感作した（ピークは０日目（ボーラス）、３日目、５日目又は７日目）。

【0109】

最終注射後の異なる時点で、フローサイトメトリーによるＣＤ４４発現及び細胞内ＩＦＮ−γの確定のために、血中リンパ球を単離し、ｇｐ３３ペプチドでｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。図３Ｂに示したように、１回ボーラス注射との比較において、４、６又は８日にわたる注射は、免疫応答の高さでの特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の比較可能な有意に増強された頻度を生じたが、これは最終注射の４〜７日後であった。ＦＡＣＳ密度ブロットは、免疫応答のピークでＦＡＣＳにより測定した場合のＣＤ４４ｈｉ及びＩＦＮ−γ産生ＣＤ８陽性リンパ球の頻度を表し、そして数字はＩＦＮ−γ産生ＣＤ４４ｈｉ ＣＤ８⁺Ｔ細胞の平均パーセンテージを示す。２つの同様の実験のうちの１つを示す（ｎ＝３〜４）。

【0110】

ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４４ｈｉ ＣＤ８⁺Ｔ細胞の平均パーセンテージは、時間の関数としても表わされる（図３Ｃ）。２つの同様の実験のうちの１つを示す（ｎ＝３〜４）。４日目にピークに達する抗原動態は、有意に弱い応答を誘導するより短い又はより長い抗原プロファイルと比較して、有意に強力なＣＴＬ応答を誘導した。さらに、最終注射の４週間後に測定した場合の休止した記憶細胞の数に統計学的差は認められなかった。これらの観察に関する生物学的理由は、エフェクター細胞へのＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖及び分化は数日を要し、そして免疫系が１日又は２日以内に宿主に圧倒的に感染する病原体と競合することさえ難しい、というものであり得る。他方、長期間複製する病原体は、それらがＣＴＬにより絶えず争われる場合、より多くの損害を引き起こす。

【0111】

実施例５
指数的漸増抗原刺激は防御的抗ウイルス応答を増強する
上記観察の機能的関連性をさらに解明するために、異なるレジメン（表１に示したようなｓ１〜ｓ４）に従って固定累積用量のｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧで雌野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫感作し、次に、Ｔ細胞応答がすでに収縮又は記憶期にある時点でＬＣＭＶ又はＬＣＭＶ糖タンパク質（ｖａｃｃ−ｇｐ）を発現する組換えワクシニアウイルスで攻撃誘発した（Kaech, S.M., et al., Nat Rev Immunol 2, 251-62, 2002）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。両ウイルスに対する防御は、専らＣＤ８⁺Ｔ細胞によって変わる（Binder, D. and Kundig, T.M., J Immunol 146, 4301-7, 1991；Kundig, T.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA: 93, 9716-23, 1996）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。

【0112】

上記のように、指数的漸増量（ｓ４）で、又はｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧのボーラス注射（ｓ１）で、マウス（ｎ＝４）を免疫感作した（表１）。陰性対照マウスは未処置（ナイーブ）のままにし、そして陽性対照マウスはＬＣＭＶ（２５０ｐｆｕ）に感染させた。ｇｐ３３−ＭＨＣ四量体並びにフローサイトメトリーを用いたｇｐ３３特異的エフェクター又は記憶ＣＴＬの分析のために、１０日目及び３０日目に（図４Ａ）、或いはｇｐ３３でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの再刺激後のＩＦＮ−γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞の分析のために３０日目に（図４Ｂ）、マウスを採血した。図４Ａは、１０日目及び３０日目の、そして左から右に、ナイーブ、ｓ１、ｓ４及びＬＣＭＶの、ｇｐ３３−四量体陽性ＣＤ４４ｈｉ発現を表す。上記結果と一致して、指数的漸増用量のペプチド（ｇｐ３３）及びＣｐＧは、１回注射ワクチン接種の場合より有意に高い頻度のＩＦＮ−γ産生エフェクター及び記憶細胞（図４Ｂ）並びにｇｐ３３−四量体陽性記憶（ＣＤ４４^hi）細胞（図４Ａ）を誘導した。３０日目に、２５０ｐｆｕのＬＣＭＶでの腹腔内注射により全マウスを攻撃誘発した。４日後に、脾臓でウイルス力価を測定した。３０日目に、２５０ｐｆｕのＬＣＭＶでマウスを腹腔内攻撃誘発した。４又は５日後に、脾臓又は卵巣をＬＣＭＶの確定のために採取した。ボーラス（ｓ１）ワクチン接種マウスはウイルス複製に対して有意に防御されなかった（図４Ｃ）が、一方、指数的漸増ワクチン接種は、ナイーブ又はボーラスワクチン接種マウスと比較して、約１０〜２０倍の有意の防御抑制ＬＣＭＶ力価を誘導した（ｐ＜０．０１）。

【0113】

別の組の実験では、異なるレジメンを用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫感作し、次に１．５×１０⁶ｐｆｕの組換えワクシニアウイルス（ｖａｃｃ−ｇｐ）で、８日目（図４Ｄ）又は２４日目（図４Ｅ）に静脈内攻撃誘発した。その５日後に、ｖａｃｃ−ｇｐ複製を卵巣で確定した（図４Ｄ及び図４Ｅ）。さらにまた、用量段階的増大様式で免疫感作したマウスのみが、有意の防御的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を備えて、他のペプチド免疫感作プロトコールよりも平均で２〜３オーダーの大きさでウイルス複製を抑制することができた。

【0114】

したがって、これらの結果は、免疫感作中の抗原提示の動態の生物学的関連性を証明した。

【0115】

実施例６
活性化ＡＰＣの数は刺激動態の型に依存しない
免疫感作動態が活性化状態及び活性化ＡＰＣの数に影響を及ぼすか否かを試験するために、図１〜図３に、並びに表１に記載したような免疫感作プロトコールｓ１（ボーラス注射）及びｓ４（指数的漸増用量）に従って、ｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧでＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫感作した。ワクチンを鼠径部に皮下投与した。１、４、６及び８日後、鼠径リンパ節を除去し、そしてその単一細胞懸濁液を、ＤＣマーカーＣＤ１１ｃ、並びにＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩマーカーＩ−Ａｂの発現に関してフローサイトメトリーによ
り分析した（図５Ａ）。結果は、ナイーブ対照（０日目）に比して平均蛍光として表現される。結果は、異なる動態が流入領域リンパ節中のＤＣの数にも、ＭＨＣ−クラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）及びＣＤ８６発現によりモニタリングされるようなそれらの活性化状態にもきわめて重要な影響を及ぼさない、ということを示唆した（図５Ａ）。しかしながら、ＤＣ数及び活性化のピークは比較可能であるが、しかしそれらは２〜３日隔てられた。ＤＣ活性化は、免疫感作動態の型とは関係なく、最大ＣｐＧ用量の１日後にその最大に達した。

【0116】

したがって、単にＤＣが最も活性化される時点で抗原性ペプチドが送達されるため、指数的漸増ワクチン接種がＣＤ８⁺Ｔ細胞誘導に最適である可能性を試験した。これが真実である場合、ＣｐＧのボーラス注射の１日後の、又は４日間にわたって指数的漸増パターンで投与されるＣｐＧの最終用量の１日後の、ボーラスとしての高用量のペプチドの投与は、用量段階的増大様式でペプチド及びＣｐＧの両方を投与した場合に匹敵するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を生じるはずである。別個の実験では、示したような改変プロトコールに従って、ｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧでマウスを免疫感作した（図５Ｂ）。一群には、３日目にＣｐＧボーラスを、そして４日目にｇｐ３３ペプチドボーラスを施した。一群には、０〜３日目に指数的漸増ＣｐＧ用量を、その後、４日目にｇｐ３３ペプチドボーラスを施した。最後の群には、上記のように１〜４日目に指数的漸増用量のｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧを施した（ｓ４）。ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度を、１０日目に末梢血中で測定した。結果は、２つの比較可能な実験（ｎ＝３）からの１つの平均及びＳＥＭを示す。図５Ｂから明らかなように、ＣｐＧによるＡＰＣの前刺激は、ｇｐ３３及びＣｐＧを一緒に指数的漸増パターンで投与することにより生じる応答より有意に低いｇｐ３３特異的免疫応答を生じた（ｐ＝０．０１６）。

【0117】

実施例７
指数的漸増抗原刺激はＴ細胞刺激延長に好都合である
免疫感作の動態がＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖にどのように影響を及ぼしたかを試験するために、上記のように、そして表１に記載されたように、ｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧの１回用量（ｓ１）で、均一１日用量（ｓ２）で、又は指数的漸増用量（ｓ４）をマウスに注射した。マウスの一群は、陰性対照として未処置のままであった。増殖をモニタリングするために、全てのマウスに、初回免疫感作の１日前に、トランスジェニックＴＣＲ３１８マウスからの１０⁷又は１．５×１０⁶個のＣＦＳＥ標識脾臓細胞を静脈内投与した。異なる時点で、尾からの採血によりリンパ球を単離し、そしてフローサイトメトリーによりＣＤ８発現及びＣＦＳＥ染色に関して分析した。ｐ値は、分裂に入ったＣＦＳＥ標識ＣＤ８⁺Ｔ細胞のパーセンテージに関して、ｓ１日程とｓ４日程との統計学的差を示す。結果は、２つの比較可能な実験のうちの１つを示す。ｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧのボーラス注射は、免疫感作の３日後に分裂するようＣＦＳＥ標識ＣＤ８⁺Ｔ細胞を誘発した（図６Ａ及び図６Ｂ）。増殖は、２日後にすでに検出することができた（図６Ｂ）。５日目に、前駆体細胞は未だ分裂に入ったが、しかし３日目より低度であり、そして７日目までには、ＣＦＳＥ標識細胞は新規の分裂に入るのを止めていた。これに対して、指数的漸増刺激は、Ｔ細胞増殖を顕著に延長した。分裂に入っている細胞は、全免疫感作レジメンを未だ受けていないにも拘わらず、初回免疫の３日後という早くに確定され、分裂は５日目及び７日目に延長した（図６Ｂ）。９日目でさえ、増殖は依然として観察された（示されていない）。さらに、分裂指数、即ち受けた分裂の平均数は、ｓ２よりｓ４に関して有意に高かった（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーによる）。

【0118】

実施例８
指数的漸増数のペプチドパルス標識ＤＣはＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を増強する
異なる数のＡＰＣの寄与を調べるために、同一総数のペプチドパルス標識ＤＣで、しかし異なる動態を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫感作した。骨髄由来ＤＣにＨＰＶ Ｅ７（ａａ４９〜５７、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号２）ペプチドを負荷し、総量１．
１１×１０⁵細胞を、１日目にボーラスとして鼠径リンパ節中に注射し（ｓ１）、或いは同一総量の細胞を、１日目（１０³細胞）、３日目（１０⁴細胞）及び６日目（１０⁵細胞）に漸増（ｓ４）パターンで投与した。さらに、Ｔ細胞初回免疫に利用可能なＤＣの一定総数を保証するために、ワクチンをリンパ内投与した。ナイーブマウスを、陰性対照として用いた。１７日目及び２２日目に、末梢血中のＥ７四量体陽性ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度（図７Ａ（黒四角））をフローサイトメトリーにより分析した。値は、平均及びＳＥＭを表わす（ｎ＝１０）。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ（図７Ａ（白四角））を、脾臓から分析した（ｎ＝７）。値は、平均及びＳＥＭを表わす（ｎ＝７）。２１日目に、３匹のワクチン接種マウス及び１０匹のナイーブマウスを、ＨＰＶ形質転換腫瘍細胞株Ｃ３．４３で攻撃誘発した（図７Ｂ）。腫瘍進行を内径測定（ｍｍ）によりモニタリングし、これから、腫瘍容積を算定した。ＶＳＶ ｎｐ５２ペプチドを負荷したＤＣの皮下注射により免疫感作したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）において、攻撃誘発後の生存を試験した（図７Ｃ）。カプラン・マイヤー曲線の対数順位検定：ｓ４≠ｓ２：ｐ＝０．００８４；ｓ２≠ｓ１：ｐ＝０．００８２；ｓ１≠ナイーブ：ｐ＝０．４０１。

【0119】

指数的漸増用量（ｓ４）はさらにまた、ワクチンのボーラス注射（ｓ１）より多数の抗原特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を誘導した。これは、それぞれ１７日目及び２２日目に測定されたＭＨＣ−Ｅ７四量体陽性（図７Ａ（黒四角））及びＩＦＮ−γ産生（図７Ａ（白四角））ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度の両方に関して明らかであった。測定されたＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の強度と相関して、用量段階的増大プロトコールでワクチン接種されたマウスは、ＨＰＶ形質転換腫瘍細胞株Ｃ３．４３による攻撃誘発を拒絶した（図７Ｂ）。これに対して、１回ボーラスで単にワクチン接種されたマウスは、防御されなかった。

【0120】

同様に、ＶＳＶ ｎｐ５２ペプチドを負荷したＤＣの（ｓ４）プロトコールで免疫感作したマウスは、ＶＳＶ核タンパク質を発現するようトランスフェクトされたマウスリンパ腫細胞ＥＬ−４による攻撃誘発後の生存改善を示した（図７Ｃ）。ＶＳＶ ｎｐ５２ペプチドを負荷したＤＣの皮下注射により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫感作した（ｎ＝４）。１．１１×１０⁵のＤＣを、１日目にボーラスとして（ｓ１）、或いは１、３及び６日目に等用量として（ｓ２）、又は用量段階的増大（ｓ４）用量として、投与した。ナイーブマウスを、対照として用いた。１４日目に、全マウスを用量１０⁶のＥＬ−４ Ｎ．１細胞で腹腔内攻撃誘発した（Kundig, et al., J Immunol. 150, 4450-4456, 1993、上記）。（ｓ４）免疫感作マウスの生存は、３日目に一定数で投与されたＤＣを用いて（ｓ２）プロトコールに従って免疫感作されたマウスより有意に良好であった（ｐ＝０．０８４）、ということをデータは示している。

【0121】

したがって、指数的漸増ワクチン接種は、ボーラスワクチン接種よりも免疫原性であることを立証した。これらの実験は免疫感作全体を通してＤＣ活性化を同一レベルに保持し、そしてＤＣの総数は同一であるので、これは、活性化ペプチド提示ＤＣの出現の動態がＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の強度を確定する、ということを確証する。したがって本発明者らは、ＤＣ数と特異的Ｔ細胞の頻度との同時性がＴ細胞応答の最終バーストサイズを増強する、と結論づけた。早期応答中の特異的Ｔ細胞の低頻度は少数の抗原パルス標識化ＤＣで効率的に刺激され得るが、一方、後期主要応答中の高頻度の特異的Ｔ細胞を多数のＤＣで再刺激することは重要であると思われる。

【0122】

実施例９
指数的漸増抗原性刺激はＴ細胞におけるＩＬ−２産生を増強する：Ｔ細胞クローンのレベルでの抗原動態の影響
本発明者らは次に、上記実施例における観察がＴ細胞クローンのレベルで説明され得るか、或いはそれらが示差的親和性、結合力及び機能性を有するＴ細胞クローン型を包含するｉｎ ｖｉｖｏＴ細胞選択過程の結果であるか否かを調べた。

【0123】

１×１０⁵のＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、支持細胞として役立つ２×１０⁶の照射同系脾臓細胞と共に共培養した。Ｄ^bの文脈でｇｐ３３を認識するトランスジェニックＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を、同一総用量の、しかし種々のプロファイルに対応する抗原で、即ち、０日目に１０^-9Ｍのｇｐ３３のボーラスで（黒四角）；４日間にわたってそれぞれ０、１、２及び３日目に１０^-12、１０^-11、１０^-10及び１０^-9Ｍの指数的漸増ｇｐ３３用量で（黒ひし形）；４日間毎日０．２５×１０^-9Ｍの同一ｇｐ３３用量で（黒三角）；又はそれぞれ０、１、２及び３日目に１０^-9、１０^-10、１０^-11及び１０^-12Ｍの指数的漸減ｇｐ３３用量で（黒丸）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。ｇｐ３３刺激を伴わない対照細胞は、（＊）として示される。ＩＬ−２、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを上清中で毎日確定し（図８Ｂ）、そして６日後、ＣＴＬ活性を５時間⁵¹Ｃｒ放出検定で確定した（図８Ａ）。値は、二重反復実験（図８Ａ）及び三重反復実験（図８Ｂ）培養の平均を表す。

【0124】

ｉｎ ｖｉｖｏ知見と同様に、指数的漸増免疫原用量は、その後の同一ｇｐ３３用量を毎日投与すると、最強のＣＴＬ応答を誘導するが、一方、ボーラスとしての又は漸減用量プロファイルでの免疫原の投与は、より弱いＣＴＬ応答を生じた。差異は、細胞が１０分の１のペプチド用量で刺激された場合、より大きかった。ＣＴＬ活性は、ＩＬ−２の産生と相関した（図８Ｂ、上部パネル）。指数的漸増免疫原用量は最高量のＩＬ−２を誘導したが、一方、一定の毎日免疫原用量ははるかに少ないＩＬ−２を誘導した。一定抗原刺激は、指数的漸増抗原刺激と比較した場合、より早期の開始を伴う多量のＩＬ−１０を誘導した（図８Ｂ、中パネル）。ＩＦＮ−γは、免疫原ボーラス又は指数的漸減量の免疫原で刺激された細胞において早期段階で一過性に産生された（図８Ｂ、底部パネル）。これに対して、一定又は指数的漸増用量による毎日刺激は、特異的Ｔ細胞によるより多量のＩＦＮ−γの分泌を誘導した。

【0125】

したがって、観察されたように、継続的及び十分な抗原刺激は、ＩＦＮ−γ産生を維持するために必要であった。指数的漸増抗原刺激が一定の毎日用量より少ないＩＦＮ−γを産生するようであるという事実は、ＩＦＮ−γの高ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性並びに早期ＩＦＮ−γ産生のための連続的蓄積により説明され得る。

【0126】

総合的に考えると、指数的漸増免疫原用量によるクローン型Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激は、全ての他の抗原プロファイルより多量のＩＬ−２及びＩＦＮ−γを産生し、その後の時点でＩＬ−１０を刺激した。これらの観察は、漸増抗原刺激によりもたらされる免疫応答増強がクローン型レベルで働く、という結論と一致する。これらの現象は、より高いＴ細胞結合力を伴うことも示されており、これは、Ｔ細胞及び樹状細胞間の効率的相互作用にとって極めて重要である（Bousso and Robey. 2003. Nat Immunol 4: 579-585）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。

【0127】

ＩＬ−２の産生はＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞活性化の証明であり、そしてＴ細胞応答のいくつかの段階を調節するに際して重要な役割を果たす。ＴＣＲ（シグナル１）及び共刺激性分子（シグナル２）の結合は、Ｔ細胞の限定されたクローン展開のみを誘導する。Ｔ細胞の広範な増幅、並びに産生性Ｔ細胞応答を備えるためのエフェクター細胞への分化は、ＩＬ−２Ｒを介したシグナル伝達を必要とし（シグナル３；Malek, T.R. and Bayer, A.L., Nat. Rev. Immunol., 4, 665-74, 2004）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）、そしてＣＤ８⁺Ｔ細胞による自己分泌ＩＬ−２産生はｉｎ ｖｉｖｏＣＤ８⁺Ｔ細胞展開の重要な動因である（Malek, T.R. & Bayer, A.L., Nat. Rev. Immunol., 4, 665-74, 2004、上記；D'Souza, W.N., et al., J Immunol., 168, 5566-72, 2002（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される））。他方、ＩＬ−１０は、普通は樹状細胞の調整を介したＴ細胞増殖の主要阻害剤である（Moore, K.W.,
et al., Annu. Rev. Immunol., 19, 683-765, 2001）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書中で援用される）。したがって、本発明のｉｎ ｖｉｖｏデータは、クローンレベルで、Ｔ細胞が抗原曝露の動態を復号し得る、ということを示した。

【0128】

実施例１０
線形的漸増抗原刺激はＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を増強する
Ｔ細胞応答が漸増抗原刺激により増強され得るか否かを確定するために、調査を実行した。一実験において、１×１０⁶個のトランスジェニックｇｐ３３特異的Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６野生型レシピエントマウス中に移して、前駆体Ｔ細胞頻度を増大し、免疫応答の査定を促した。

【0129】

以下のような異なるワクチン接種プロトコールを用いて、ＣｐＧ ＯＤＮ（総量で１２５μｇのｇｐ３３及び１２．５ｎｍｏｌのＣｐＧ）と混合した同一累積用量のｇｐ３３ペプチドで、全マウスを免疫感作する：ｓ１）０日目にボーラス注射で単回用量；ｓ２）４日間にわたって４等用量；ｓ３）４日間にわたって線形的漸減用量；そしてｓ４）４日間にわたって線形的漸増用量。付加的に、マウスの群を１回用量のＣｐＧで免疫感作し、その後、線形的漸増用量のｇｐ３３ペプチドで免疫感作する（ｓ５）か、又は１回用量のｇｐ３３で免疫感作し、その後、線形的漸増用量のＣｐＧで免疫感作する（ｓ６）。０日目に２５０ｐｆｕのＬＣＭＶウイルスに静脈内感染させたマウスを、陽性対照として役立てる。６日目、１２日目及び８日目に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｇｐ３３ペプチドで再刺激した血中リンパ球の細胞内ＩＦＮ−γ染色により、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を定量した。

【0130】

ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を強力に増強するため、ＣｐＧ ＯＤＮをアジュバントとして選択した（Krieg, A.M., Annu Rev Immunol 20, 709-60, 2002；Schwarz, K. et al., Eur J Immunol 33, 1465-70, 2003、上記）。ホスホロチオエート安定化ＯＤＮは、３０分〜６０分の半減期で血漿から除去される（Farman, C.A. & Kornbrust, D.J., Toxicol Pathol
31 Suppl, 119-22, 2003、上記）。しかしながら、組織中では、ＣｐＧ ＯＤＮは相対的に安定しており、半減期は４８時間であった（Mutwiri, G.K., et al., J Control Release 97, 1-17, 2004、上記）。さらに、６０分以内に、血清プロテアーゼは検出レベルより低い値に遊離ペプチドを分解させる、ということが文献中で注目される（Falo, L.D., Jr., et al., Proc Natl Acad Sci USA 89, 8347-50, 1992；Widmann, C., et al., J Immunol 147, 3745-51, 1991、上記）。

【0131】

ＬＣＭＶ野生型による感染に匹敵する大きさのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答をもたらす免疫感作は、線形漸増様式でのｇｐ３３及びＣｐＧの両方の投与により提供される、ということが観察される。ｇｐ３３及びＣｐＧの均一１日用量を用いた免疫感作は、強力なＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導するが、しかし用量段階的増大刺激より有意に弱い、ということも観察される。さらに、ワクチン構成成分のうちのいずれか１つが１回用量として送達される場合、免疫感作の効力は有意に低減されるが、しかしナイーブ対照と比較して有意である、ということが観察される。

【0132】

同様の観察は、ＴＣＲトランスジェニック細胞を施されないナイーブ野生型マウスにおいてなされる。線形的漸増ワクチン（ｇｐ３３及びＣｐＧ）用量で免疫感作されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞のかろうじて検出可能な頻度を誘導する他のワクチン接種プロトコールと比較して、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の有意に増強された誘導を示す。これらの結果は、全体的用量とは関係なく、ワクチン接種の動態は免疫原性の重要なパラメーターである、ということを示す。

【0133】

実施例１１
線形的漸増抗原刺激は防御的抗ウイルス応答を増強する
漸増抗原刺激によって防御的抗ウイルス応答を増強することができるか否かを確定するために調査を実行した。一実験では、異なるレジメン（実施例１０に記載したｓ１〜ｓ４）に従って固定累積用量のｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧ（総量で１２５μｇのｇｐ３３及び１２．５ｎｍｏｌのＣｐＧ）で雌野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫感作し、次に、Ｔ細胞応答がすでに収縮又は記憶期にある時点でＬＣＭＶ又はＬＣＭＶ糖タンパク質（ｖａｃｃ−ｇｐ）を発現する組換えワクシニアウイルスで攻撃誘発した（Kaech, S.M., et al., Nat Rev Immunol 2, 251-62, 2002、上記）。両ウイルスに対する防御は、専らＣＤ８⁺Ｔ細胞によって変わる（Binder, D. and Kundig, T.M., J Immunol 146, 4301-7, 1991；Kundig, T.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA: 93, 9716-23, 1996、上記）。

【0134】

実施例１０に記載のように、線形的漸増量（ｓ４）で、又はｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧのボーラス注射（ｓ１）で、マウス（ｎ＝４）を免疫感作した。陰性対照マウスは未処置（ナイーブ）のままにし、そして陽性対照マウスはＬＣＭＶ（２５０ｐｆｕ）に感染させた。ｇｐ３３−ＭＨＣ四量体並びにフローサイトメトリーを用いたｇｐ３３特異的エフェクター又は記憶ＣＴＬの分析のために、１０日目及び３０日目に、或いはｇｐ３３でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの再刺激後のＩＦＮ−γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞の分析のために３０日目に、マウスを採血した。線形的漸増用量のペプチド（ｇｐ３３）及びＣｐＧは、１回注射ワクチン接種の場合より有意に高い頻度のＩＦＮ−γ産生エフェクター及び記憶細胞並びにｇｐ３３−四量体陽性記憶（ＣＤ４４^hi）細胞を誘導することが観察された。３０日目に、２５０ｐｆｕのＬＣＭＶでの腹腔内注射により全マウスを攻撃誘発した。４日後に、脾臓でウイルス力価を測定した。３０日目に、２５０ｐｆｕのＬＣＭＶでマウスを腹腔内攻撃誘発した。４又は５日後に、脾臓又は卵巣をＬＣＭＶの確定のために採取した。ボーラス（ｓ１）ワクチン接種マウスはウイルス複製に対して有意に防御されなかったが、一方、線形的漸増ワクチン接種は、ナイーブ又はボーラスワクチン接種マウスと比較して、ＬＣＭＶ力価の抑制において有意の防御を誘導する（ｐ＜０．０１）。

【0135】

別の組の実験では、異なるレジメンを用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫感作し、次に１．５×１０⁶ｐｆｕの組換えワクシニアウイルス（ｖａｃｃ−ｇｐ）で、８日目又は２４日目に静脈内攻撃誘発した。その５日後に、ｖａｃｃ−ｇｐ複製を卵巣で確定する。用量段階的増大様式で免疫感作したマウスのみが、有意の防御的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を備えて、他のペプチド免疫感作プロトコールよりも数オーダーの大きさでウイルス複製を抑制することができることが観察された。

【0136】

実施例１２
線形的漸増抗原刺激はＴ細胞刺激延長に好都合である
免疫感作の動態がＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖にどのように影響を及ぼすかを試験するために、実施例１０に記載したように、ｇｐ３３ペプチド及びＣｐＧの１回用量（ｓ１）で、均一１日用量（ｓ２）で、又は線形的漸増用量（ｓ４）を、マウスに注射する。マウスの一群は、陰性対照として未処置のままである。増殖をモニタリングするために、全てのマウスに、初回免疫感作の１日前に、トランスジェニックＴＣＲ３１８マウスからの１０⁷個のＣＦＳＥ標識脾臓細胞を静脈内投与する。異なる時点で、尾からの採血によりリンパ球を単離し、そしてフローサイトメトリーによりＣＤ８発現及びＣＦＳＥ染色に関して分析する。線形的漸増刺激は、１回ボーラス注射刺激プロトコールに比して、Ｔ細胞増殖を顕著に延長する、ということが観察される。

【0137】

実施例１３
線形的漸増数のペプチドパルス標識ＤＣはＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を増強する
異なる数のＡＰＣの寄与を調べるために、同一総数のペプチドパルス標識ＤＣで、しかし異なる動態を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫感作した。骨髄由来ＤＣにＨＰＶ Ｅ７（ａａ４９〜５７、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号２）ペプチドを負荷し、総量１．
２×１０⁵細胞を、１日目にボーラスとして鼠径リンパ節中に注射し（ｓ１）、或いは同一総量の細胞を、１日目（２×１０⁴細胞）、３日目（４×１０⁴細胞）及び６日目（６×１０⁴細胞）に線形的漸増（ｓ４）パターンで投与する。さらに、Ｔ細胞初回免疫に利用可能なＤＣの一定総数を保証するために、ワクチンをリンパ内投与する。ナイーブマウスを、陰性対照として用いる。１７日目及び２２日目に、末梢血中のＥ７四量体陽性ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーにより分析し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを脾臓から分析する。２１日目に、３匹のワクチン接種マウス及び１０匹のナイーブマウスを、ＨＰＶ形質転換腫瘍細胞株Ｃ３．４３で攻撃誘発する。腫瘍進行を内径測定（ｍｍ）によりモニタリングし、これから、腫瘍容積を算定する。ＶＳＶ ｎｐ５２ペプチドを負荷したＤＣの皮下注射により免疫感作したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、攻撃誘発後の生存を試験する。

【0138】

それぞれ１７日目及び２２日目に測定されるＭＨＣ−Ｅ７四量体陽性及びＩＦＮ−γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度の両方により明らかにされるように、線形的漸増用量（ｓ４）は、ワクチンのボーラス注射（ｓ１）より多数の抗原特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を誘導する、ということが観察される。用量段階的増大プロトコールでワクチン接種されたマウスは、ＨＰＶ形質転換腫瘍細胞株Ｃ３．４３による攻撃誘発を拒絶するが、一方、１回ボーラスで単にワクチン接種されたマウスは防御されない、ということも観察される。

【0139】

さらなる実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＶＳＶ ｎｐ５２ペプチドを負荷したＤＣの皮下注射により免疫感作する。１．２×１０⁵のＤＣを、１日目にボーラスとして（ｓ１）、或いは１、３及び６日目に等用量として（ｓ２）、又は用量段階的増大（ｓ４）用量として、投与する。ナイーブマウスを、対照として用いる。１４日目に、全マウスを用量１０⁶のＥＬ−４ Ｎ．１細胞で腹腔内攻撃誘発する（Kundig et al., J Immunol. 150, 4450-4456, 1993、上記）。ＶＳＶ ｎｐ５２ペプチドを負荷されたＤＣの（ｓ４）プロトコールで免疫感作されたマウスの生存は、３日目に一定数で投与されたＤＣを用いて（ｓ１）又は（ｓ２）プロトコールに従って免疫感作されたマウスより有意に良好である、ということが観察される。

【0140】

上記の種々の方法及び技術は、本発明を実行するための多数のやり方を提供する。もちろん、必ずしも全ての記載された目的又は利点が本明細書中に記載された任意の特定の実施形態に従って達成され得るわけではない、と理解されるべきである。したがって、例えば、該方法は、本明細書中に教示されるか又は示唆され得るような他の目的又は利点を必ずしも達成せずに、本明細書中に教示されるような一利点又は利点群を達成するか又は最適化するやり方で実施され得る、と当業者は認識する。種々の有益な及び不利益な代替物が、本明細書中で言及される。いくつかの好ましい実施形態は特に、１つの、別の又はいくつかの有益な特徴を包含するが、一方、他の実施形態は特に、１つの、別の又はいくつかの不利益な特徴を排除し、さらに他の実施形態は特に、１つの、別の又はいくつかの有益な特徴を含めることにより、本発明の不利益な特徴を軽減する、と理解されるべきである。

【0141】

さらに、異なる実施形態からの種々の特徴の適用可能性を当業者は認識するであろう。同様に、上記の種々の要素、特徴及び工程、並びに各々のこのような要素、特徴又は工程のその他の既知の均等物は、本明細書中に記載される原理に従って方法を実施するように当業者により組合わせられ、適合されることができる。種々の要素、特徴及び工程の中で、或るものは多様な実施形態に特定的に含まれ、そしてその他は特定的に排除される。

【0142】

本発明を或る実施形態及び実施例の文脈で開示してきたが、本発明は、特定的に開示された実施形態を越えて、他の代替的実施形態並びに／又はその使用及び修正及び均等物にまで及ぶ、と当業者により理解される。

【0143】

本発明の多数の変形及び代替的要素を開示してきた。さらなる変形及び代替的要素が当業者に明らかであろう。これらの変形の１つは、スクリーニングパネル中の又は治療製品により標的化される特定数の抗原、抗原の型、癌の型、及び明記される特定抗原（複数可）であるがこれらに限定されない。本発明の種々の実施形態は、これらの変形又は要素のいずれかを特定的に含むか又は排除し得る。

【0144】

いくつかの実施形態では、本発明の或る実施形態を記載し、特許請求するために用いられる成分の量、特性、例えば分子量、反応条件等を表す数は、「およそ」という用語によりいくつかの場合に修正されるものであると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、明細書並びに添付の特許請求の範囲に記述された数値パラメーターは、特定の一実施形態により得ようとされる所望の特性によって変わり得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメーターは、報告された有効数字の数に鑑みて、そして普通の四捨五入技法を適用することにより、解釈されるべきである。広範囲の本発明のいくつかの実施形態を記述する数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定実施例に記述される数値はできるだけ正確に報告される。本発明のいくつかの実施形態に提示される数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見出される標準偏差に必然的に起因する或る種の誤差を含有し得る。

【0145】

いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲のいくつかの文脈で）用いられる「１つの（"a" and "an"）」及び「前記（the）」並びに類似の指示語は、単数及び複数の両方を包含すると解釈され得る。本明細書中の値の範囲の記載は、単に、その範囲内に入る各々の別個の値に個別に言及する略記法として役立つよう意図される。本明細書中で別記しない限り、各々の個々の値は、それが本明細書中で個別に記載されるように、本明細書中に組入れられる。本明細書中に記載される方法は全て、本明細書中で別記しない限り、又は文脈により明らかに否認されない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中の或る実施形態に関して提供される任意の及び全ての実施例、又は例示的用語（例えば「〜のような」）の使用は、単に本発明をより良好に例証するものであって、他に特許請求される本発明の範囲を限定しない。本明細書中の用語は何れも、本発明の実行に不可欠な任意の特許請求されない要素を示すものと解釈されるべきでない。

【0146】

本明細書中に開示される本発明の代替的要素又は実施形態の群分けは、限定されたものであると解釈されるべきでない。各群成員は、独立して、或いは本明細書中に見出される群の他の成員又は他の要素との任意の組合せで言及されるか又は特許請求され得る。群の１つ又は複数の成員は、便宜性及び／又は特許可能性の理由のために一群に包含されるか、或いはそれから削除され得る、と予測される。任意のこのような包含又は削除が起こる場合、本明細書は、修正され、添付の特許請求の範囲に用いられる全てのマーカッシュ群の記載要件を満たすような群を含むと思われる。

【0147】

本発明の好ましい実施形態は、本発明を実行するために本発明者らが最良のやり方であると分かっているものを含めて、本明細書中に記載されている。その好ましい実施形態に関する変更は、上記の説明を読めば、当業者には明らかになるであろう。当業者は適切な場合このような変更を用いることができ、そして本発明は、本明細書中に特定的に記載された以外の別のやり方で実行することができる、と意図される。したがって本発明の多数の実施形態は、準拠法により許されるように、添付された特許請求の範囲に記載された主題の全ての修正及び均等物を包含する。さらに、その全ての考え得る変更における上記の要素の任意の組合せは、別記しない限り、又は文脈により明らかに否認されない限り、本発明に包含される。

【0148】

さらに、本明細書全体を通して、特許及び印刷刊行物に対して多くの参照がなされてきた。上記引用参考文献及び印刷刊行物の各々は、独立して、参照によりその全体が本明細書中で援用される。

【0149】

最後に、本明細書中に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例証するものである、と理解されるべきである。用いられ得るその他の修正が本発明の範囲内にあり得る。したがって例として、限定するものではなく、本発明の代替的構成を本明細書中の教示に従って利用することができる。したがって本発明は、まさに示されそして説明されたものに限定されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】