特許 5756019 効率的で普遍的な多能性幹細胞から神経細胞への分化誘導方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5756019

(24)【登録日】2015年6月5日

(45)【発行日】2015年7月29日

(54)【発明の名称】効率的で普遍的な多能性幹細胞から神経細胞への分化誘導方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0735 20100101AFI20150709BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20150709BHJP

   C12N 5/0793 20100101ALI20150709BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20150709BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20150709BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20150709BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/00 202C

   C12N5/00 202Q

   C12N5/00 202S

   A61K35/28

   A61K35/30

   A61P21/00

   A61P25/16

   A61P25/28

【請求項の数】3

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2011-539458(P2011-539458)

(86)(22)【出願日】2010年8月31日

(65)【公表番号】特表2012-501194(P2012-501194A)

(43)【公表日】2012年1月19日

(86)【国際出願番号】KR2010005892

(87)【国際公開番号】WO2011055899

(87)【国際公開日】20110512

【審査請求日】2011年2月16日

【審判番号】不服2013-25516(P2013-25516/J1)

【審判請求日】2013年12月26日

(31)【優先権主張番号】10-2009-0107235

(32)【優先日】2009年11月6日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】507175175

【氏名又は名称】インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション，ヨンセイ ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(72)【発明者】

【氏名】キム・ドン−ウク

(72)【発明者】

【氏名】キム・テ−ソン

【合議体】

【審判長】 中島 庸子

【審判官】 植原 克典

【審判官】 高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／５６１６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｊａｎ １；３１３（１）：１０７−１１７，Ｅｐｕｂ ２００７ Ｏｃｔ １１

【文献】 Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００８ Ａｕｇ １；１８（１５）：４３８８−４３９２，Ｅｐｕｂ ２００８ Ｊｕｎ ２７

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC C12N 1/00 - 5/10

A61K 35/00-76

A61L 27/00

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

幹細胞から神経細胞への分化誘導方法であって、前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞及びヒト誘導多能性幹細胞のいずれかであり、
（ａ）前記幹細胞の骨形成蛋白質信号伝達経路及びアクチビン／ノダル信号伝達経路を、ドルソモルフィン及び４−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンズアミドを用いて抑制する工程と、
（ｂ）前記幹細胞を培養する工程と、
を含み、
前記工程（ｂ）での幹細胞が、ドルソモルフィン及び４−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンズアミドを処理していない幹細胞よりもＳｏＸ１、Ｐａｘ６及びネスチンを高発現することを特徴とする幹細胞から神経細胞への分化誘導方法。

【請求項2】

工程（ｂ）が、（ｂ−１）神経外胚葉が増加された工程（ａ）で得られた幹細胞をｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）の存在下で培養し、神経前駆細胞を増殖させる工程と、
（ｂ−２）前記神経前駆細胞をソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）及びＦＧＦ８（線維芽細胞増殖因子８）の存在下で培養し、ドーパミン前駆細胞に誘導させる工程と、
（ｂ−３）前記ドーパミン前駆細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びアスコルビン酸の存在下で培養し、ドーパミン神経細胞を形成させる工程と、
を含む請求項１に記載の幹細胞から神経細胞への分化誘導方法。

【請求項3】

工程（ｂ）での幹細胞が、ドルソモルフィン及び４−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンズアミドを処理していない幹細胞よりもＩｄ１、Ｉｄ３、ＧＣＭ１及びＧＡＴＡ２を低発現する請求項１に記載の幹細胞から神経細胞への分化誘導方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、幹細胞から神経細胞への分化誘導方法に関する。より具体的には、本発明は、幹細胞の骨形成蛋白質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）信号伝達経路及びアクチビン／ノダル（Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ）信号伝達経路を抑制して幹細胞から神経細胞への分化を誘導する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＢＭＰは、ＴＧＦ−beta（トランスフォーミング増殖因子−β：ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属するサブファミリーである。ＴＧＦ−β経路は、脊椎動物及び無脊椎動物の成長と分化とを調節する様々な信号伝達において中心的な位置を占めている。ＴＧＦ−βファミリーは、大きく２つのグループに分けられる。一つは、ＢＭＰグループであり、もう一つは、ＴＧＦ−β／アクチビングループである。ＢＭＰは、最初は生体で骨と軟骨形成を誘導する蛋白質として分離されたが、その後これらのＢＭＰが脊椎動物及び無脊椎動物の発生過程のうち、形態形成の様々な調節活性を有することが発見された、今までにショウジョウバエ、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）及びカエルを含む複数の種から３０個以上のＢＭＰが発見されてきた（非特許文献１参照）。

【0003】

ＢＭＰは、骨及び軟骨形成を誘導する蛋白質として最初に発見されたが、様々なＢＭＰは、神経細胞を含む様々な種類の細胞において生物学的に重要な活性を有する。例えば、ＢＭＰは、細胞の増殖と分化、細胞の死滅、神経外胚葉の形成、中胚葉の形成、神経系の分化、複数の器官の発達（例えば、精巣、腎臓、消化器官、肺、歯など）、右左の非対称性などに関与する（非特許文献２参照）。
アクチビン／ノダル（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）信号伝達経路は、ヒト胚性幹細胞及びマウスエピブラスト幹細胞での多分化能を維持するために不可欠である。また、アクチビン／ノダル信号伝達経路は、脊椎動物中胚葉の発生に重要な役割を担う。

【0004】

幹細胞は、組織を構成する各細胞に分化する前の段階の未分化細胞の総称であり、特定の分化刺激（環境）によって特定の細胞に分化する。幹細胞は、細胞分裂が停止した分化細胞とは異なり、細胞分裂によって、自分と同じ細胞を生産することができるという増殖特性を有し、また、分化刺激が加わると特定の細胞に分化するが、他の環境や他の分化刺激によって別の細胞にも分化でき、分化に柔軟性を持っているのが特徴である。
現在、幹細胞は、細胞の治療剤として脚光を浴びているが、神経細胞の損傷によって誘発される様々な神経疾患の細胞治療剤としても多くの研究が行われている。特に、脳神経系疾患は、他のどの病気よりも細胞移植治療に最もふさわしい対象とされるが、これは、脳神経系の組織が他の組織とは異なり、免疫拒絶反応がほとんどなく、外部から細胞を移植したときに移植された細胞の長期生存が期待できるからである。
これに関連して、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、脱髄疾患及び脊髄損傷などの疾患の治療に幹細胞を適用しようとする試みが現在進行中である（非特許文献３及び４参照）。

【0005】

一方、細胞治療剤としての幹細胞の有用性を高めるためには、幹細胞を効率的に特定の細胞に分化させる技術が必要である。
特許文献１には、幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法が開示されており、より詳細には、（ａ）幹細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子と共に培養する工程と、（ｂ）工程（ａ）の細胞を線維芽細胞増殖因子８及びソニックヘッジホッグと共に培養する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の細胞を脳由来神経栄養因子と共に培養する工程と、（ｄ）工程（ｃ）の細胞を神経膠星状細胞と共培養する工程と、を含む方法を開示している。特許文献２には、特定の化学構造式を有する化合物が、胚性幹細胞が神経細胞に分化する際に誘導剤として作用できることが開示されている。
また、特許文献３には、幹細胞でＴＧＦ−βシグナル伝達経路を阻害することにより、ドーパミン神経細胞を生産する方法が開示されている。

【0006】

しかしながら、現在までに、すべての幹細胞を高効率で、特定の細胞（特に、神経細胞）に分化させる技術は開発されていない状況である。

【0007】

この明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文と特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野の水準、及び本発明の内容がより明確に説明される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２００５／００３３２０号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２００４／０９３８１２号パンフレット

【特許文献3】国際公開第２００４／０５３０８号パンフレット

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｄｕｃｙ Ｐ ｅｔ ａｌ、Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．；５７（６）：２２０７−１４（２０００）

【非特許文献2】Ｗｏｚｎｅｙ ＪＭ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ：ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ ａｄｕｌｔ． Ｅｕｒ Ｊｏｒａｌ Ｓｃｉ．， １０６：１６０−６（１９９８）

【非特許文献3】Ｉｓａｃｏｎ Ｏ， Ｄｅａｃｏｎ Ｔ，Ｔｒｅｎｄｓ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １０：４７７−４８２（１９９７）

【非特許文献4】Ｓｔｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １：２９０−２９５（１９９８）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者は、様々な分化特徴を持つ幹細胞を高収率で神経前駆細胞に分化誘導させ得る効率的な方法を発明しようと努力した。その結果、幹細胞から分化した細胞において、他の系列の細胞及び未分化細胞の混在可能性を最小限に抑え、移植時に引き起これる奇形腫の可能性を低減できる神経前駆細胞への分化誘導を究明することにより、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、幹細胞から神経細胞への分化誘導方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、幹細胞から神経細胞への分化誘導用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、本願の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面に基づいて、より明確にする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の一様態によれば、本発明は、（ａ）幹細胞のＢＭＰ（骨形成蛋白質）信号伝達経路及びアクチビン／ノダル信号伝達経路を抑制する工程と；（ｂ）上記幹細胞を培養する工程と、を含む幹細胞から神経細胞への分化誘導方法を提供する。

【0012】

本発明の他の様態によれば、本発明は、ＢＭＰ信号伝達経路抑制剤及びアクチビン／ノダル信号伝達経路抑制剤を含む、幹細胞から神経細胞への分化誘導用組成物を提供する。

【0013】

本発明者らは、多分化能幹細胞を含む幹細胞を効率的に神経細胞に分化誘導させ得る方法を開発しようと努力してきた。その結果、幹細胞から分化した細胞で、他の系列の細胞及び未分化細胞の混在可能性を最小限に抑え、移植時に引き起これる奇形腫（ｔｅｒａｔｏｍａ）の可能性を低減できる神経細胞への分化誘導方法を見出した。

【0014】

本明細書では、用語「幹細胞から神経細胞への分化誘導」とは、幹細胞から特定の細胞に完全に分化が誘導された場合だけでなく、幹細胞から特定の細胞へ完全分化する前の中間段階で形成される神経前駆体（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）の形成も含むものである。つまり、本発明の幹細胞の分化誘導方法は、幹細胞が、特定の細胞に完全に分化することを効果的に達成されるようにするだけでなく、幹細胞から神経前駆体を形成させる際にも非常に高い効率性を示す。特に、ＢＭＰ信号伝達経路抑制剤及びアクチビン／ノダル信号伝達経路を抑制して分化させる場合、神経前駆体を形成するための技術的な方法の制限がなく、既存のいずれの神経前駆体分化法とも併用可能であり、また、その効率を高めることができる。

【0015】

本発明によって分化され得る幹細胞としては、制限はなく、幹細胞の特性、つまり、未分化であり、無限増殖能及び特定の細胞への分化能を持つ細胞は、本発明が適用可能な細胞である。幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性生殖細胞及び胚性腫瘍細胞を含み、好ましくは、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞である。用語「誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、非−全分化能細胞（例えば、体細胞）から特定の遺伝子を挿入して、人工的に由来した全分化能幹細胞の一つである。誘導多能性幹細胞は、幹細胞遺伝子及び蛋白質の発現、染色体のメチル化、倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）、胚形成、テラトーマ形成、生存性キメラ形成、交雑性及び分化性を持つ点から、全分化能幹細胞（例えば、胚性幹細胞）と同じであると当業界で判断されている。

【0016】

本発明の利点の一つは、下記の実施例で立証しているように、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞など、すべての幹細胞に適用可能な分化プロトコルを提供するということである。

【0017】

本発明によれば、幹細胞で神経細胞の分化のために、ＢＭＰ信号伝達経路及びアクチビン／ノダル信号伝達経路を抑制する。

【0018】

ＢＭＰ信号伝達経路を阻害する物質としては、当業界に公知されている様々なＢＭＰ信号伝達経路抑制剤を含む。本明細書の用語「ＢＭＰ信号伝達経路抑制剤」は、好ましくは、ＢＭＰ自体を抑制するか、又はＢＭＰをＢＭＰ受容体に結合することを抑制する物質を意味する。本発明で用いられるＢＭＰ信号伝達経路抑制剤としては、ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ｓｍａｄ６、ｓｍａｄ７、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、コルディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、グレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）、Ｓｏｇ（ｓｈｏｒｔ ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）、ホリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、ＤＡＮ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ａｂｅｒｒａｎｔ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、ダンテ（Ｄａｎｔｅ）、又はＰＲＤＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＤＡＮ ａｎｄ Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）を含んでいることが好ましい。より好ましくは、上記ＢＭＰ信号伝達経路抑制剤は、ドルソモルフィン、ノギン、コルディン又はグレムリンであり、更に好ましくは、ドルソモルフィン又はノギンであり、最も好ましくは、ドルソモルフィンである。

【0019】

本発明の幹細胞での骨形成蛋白質信号伝達経路を抑制するために添加されるドルソモルフィンの濃度としては、１μＭ〜２０μＭが好ましく、より好ましくは、３μＭ〜１０μＭであり、最も好ましくは、４μＭ〜６μＭである。

【0020】

アクチビン／ノダル信号伝達経路を抑制する物質としては、当業界に公知されている様々なアクチビン／ノダル信号伝達経路抑制剤を含む。本明細書の用語「アクチビン／ノダル信号伝達経路」は、アクチビン信号伝達経路及び／又はノダル信号伝達経路を意味する。本明細書の用語「アクチビン／ノダル信号伝達経路抑制剤」は、好ましくは、アクチビン／ノダル自体を抑制するか、又はアクチビン／ノダルイが、その受容体に結合することを抑制する物質を意味する。本発明で用いられるアクチビン／ノダル信号伝達経路抑制剤、好ましくは、４−（５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンツアミド〔４−（５−Ｂｅｎｚｏ[１，３]ｄｉｏｘｏｌ−５−yl−４−ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ〕、ｓｍａｄ６、ｓｍａｄ７、及びホリスタチンから選ばれる抑制剤を用いて、アクチビン／ノダル信号伝達経路を抑制する。より好ましくは、上記抑制剤は、４−（５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンズアミド又はｓｍａｄ７であり、最も好ましくは、４−（５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンツアミドのような蛋白質ではなく、低分子化合物であり、これらの物質は、当業界でＳＢ４３１５４２として知られている。蛋白質の処理よりも上記低分子化合物の処理がより効果的である。

【0021】

本発明の幹細胞のアクチビン／ノダル信号伝達経路を抑制するために添加される４−（５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンツアミドの濃度としては、１μＭ〜５０μＭが好ましく、より好ましくは、５μＭ〜３０μＭであり、更により好ましくは、８μＭ〜２０μＭであり、最も好ましくは、９μＭ〜１１μＭである。

【0022】

上記４−（５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンズアミドは、以下の構造式１で表すことができる：

【化1】

・・・（１）

【0023】

本発明の詳細な説明において、上記構造式１で表される構造物は、ＳＢ４３１５４２と併用して使用される。

【0024】

本発明の好ましい実施形態によれば、上記幹細胞のＢＭＰ信号伝達経路及びアクチビン／ノダル信号伝達経路を抑制する工程は、幹細胞を培養して胚を形成する過程、又は形成された胚を培養する過程で実施され、上記工程（ａ）により神経外胚葉が増加された胚が形成される工程を更に含む。

【0025】

本発明の好ましい実施形態によれば、上記幹細胞を培養する工程は、（ｂ−１）神経外胚葉が増加された胚をｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の存在下で培養し、神経前駆細胞を増殖させる工程と;（ｂ−２）上記神経前駆細胞をソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）及びＦＧＦ８（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ８）の存在下で培養し、ドーパミン前駆細胞に誘導させる工程と；（ｂ−３）上記ドーパミン前駆細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）及びアスコルビン酸の存在下で培養し、ドーパミン神経細胞を形成させる工程と、を更に含む。

【0026】

上記神経前駆細胞を増殖させる段階で添加するｂＦＧＦの濃度としては、５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬであり、更により好ましくは、１５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、１９ｎｇ／ｍＬ〜２１ｎｇ／ｍＬである。

【0027】

上記ドーパミン前駆細胞を増殖させる段階で添加するソニックヘッジホッグの濃度としては、５０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは、１００ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬであり、更により好ましくは、１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、１９０ｎｇ／ｍＬ〜２１０ｎｇ／ｍＬである。

【0028】

上記ドーパミン前駆細胞を増殖させる段階で添加するＦＧＦ８の濃度としては、１０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは、５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬであり、更により好ましくは、８０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、９０ｎｇ／ｍＬ〜１１０ｎｇ／ｍＬである。

【0029】

上記ドーパミン神経細胞を形成させる段階で添加するＢＤＮＦの濃度としては、５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬであり、更により好ましくは、１５ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、１９ｎｇ／ｍＬ〜２１ｎｇ／ｍＬである。

【0030】

上記ドーパミン神経細胞を形成させる段階で添加するＧＤＮＦの濃度としては、５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬであり、更により好ましくは、１５ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、１９ｎｇ／ｍＬ〜２１ｎｇ／ｍＬである。

【0031】

また、上記ドーパミン神経細胞を形成させる段階で添加するアスコルビン酸の濃度としては、５０μＭ〜５００μＭが好ましく、より好ましくは、１００μＭ〜３００μＭであり、更により好ましくは、１５０μＭ〜２５０μＭであり、最も好ましくは、１９０μＭ〜２１０μＭである。

【0032】

本発明の好ましい実施形態によれば、本発明を用いて、幹細胞を神経細胞に分化する場合は、ドルソモルフィン及び４−（５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンズアミドを処理していない幹細胞よりもＳｏＸ１、Ｐａｘ６及びネスチンが高発現される。

【0033】

本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の方法を用いて、幹細胞を神経細胞に分化する場合は、ドルソモルフィン及び４−（５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２イル）−ベンズアミドを処理していない幹細胞よりもＩｄ１、Ｉｄ３、ＧＣＭ１及びＧＡＴＡ２が低発現される。

【発明の効果】

【0034】

本発明によれば、様々な幹細胞（例えば、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞）を、ほぼ同じレベルのドーパミン神経細胞まで分化させることができる。
本発明によって収得した神経細胞は、特に神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンティントン病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症に適用して、これらの疾患を治すことができる。

【0035】

本発明の特徴と利点をまとめると、以下の通りである：
（ｉ）本発明は、幹細胞から神経細胞への分化誘導方法及び分化誘導用組成物を提供する。
（ｉｉ）本発明は、浮遊培養（ｆｌｏａｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）及び付着培養（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）などを含む従来の幹細胞の分化に使用された方法に関係なく、すべての幹細胞を効率的に神経前駆細胞に分化させることができるという長所がある。
（ｉｉｉ）また、本発明に係る分化誘導された神経前駆細胞は、特定の細胞（例えば、ドーパミン神経細胞、オリゴデンドロサイトなど）に高効率で分化することができるので、今後、難治性の神経系疾患（例えば、パーキンソン病、脊髄損傷）に適用することができ、新薬開発において基礎的なデータを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】図１ａ〜１ｄは、自発的な分化過程を経た後、１０日目に６つのｈＥＳＣ細胞株（Ｈ９、Ｍｉｚ−ｈＥＳ４、Ｍｉｚ−ｈＥＳ６、ＳＮＵ−ｈＥＳ３、ＳＮＵ−ｈＥＳ１６、ＣＨＡ−ｈＥＳ３）及び３つのヒトｉＰＳＣ細胞株（ＢＪ１−ｉＰＳ１２、ＭＳＣ−ｉＰＳ２−３、ｄＨ１ｆ−ｉＰＳ２−２）の分化傾向を、ｐＲＴ−ＰＣＲを用いて調査した結果である。図１ａは、神経外胚葉のＳｏｘ１とＰａｘ６の発現水準を示したものであり、図１ｂは、中胚葉のＢｒａｃｈｙｕｒｙとＣｅｒｂｅｒｕｓの発現水準を示したものであり、図１ｃは、内胚葉のＡＦＰとＧＡＴＡ４の発現水準を示したものであり、図１ｄは、未分化マーカーであるＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの発現を示したものである。ｙ軸は、テストした細胞株で各遺伝子の相対的な発現を、平均±標準誤差で示したものである（基準を任意に１に指定）。上記細胞株をＯｎｅ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（変化分析）で多重比較して、統計的有意性を評価した。タイプＩの誤差率を減らすために、事後分析（Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ）としてボンフェローニ補正法（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を適用している（Ｍｉｚ６、Ｍｉｚ−ｈＥＳ６;Ｍｉｚ４、Ｍｉｚ−ｈＥＳ４;ＳＮＵ３、ＳＮＵ−ｈＥＳ３;ＳＮＵ１６、ＳＮＵ−ｈＥＳ１６;ＣＨＡ３、ＣＨＡ−ｈＥＳ３;ＢＪ１−１２、ＢＪ１−ｉＰＳ１２;ＭＳＣ２−３、ＭＳＣ−ｉＰＳ２−３;ｄＨ１ｆ２−２、ｄＨ１ｆ−ｉＰＳ２−２）。

【図2】図２ａ〜２ｂは、内在性のＢＭＰ信号の流れを効果的に抑制するＤＭを幹細胞に処理し、神経細胞への分化を減少させた結果である。ＤＭの存在又は不存在下で、自発的な胚様体分化後、４日目に各マーカーのｍＲＮＡを、ｐＲＴ−ＰＣＲを用いて定量化した。図２ａは、用量−依存方法でＤＭを処理することによって、ＢＭＰ信号活性の指標であるＩｄ１とＩｄ３遺伝子の発現が減少したことを示す結果である（０.１−５μM）。陽性対照群は、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）１μｇ／ｍＬを用いた。図２ｂは、用量−依存方法でＤＭを処理することによって、神経外胚葉マーカーであるＰａｘ６とＮｅｓｔｉｎの発現が増加したことを示す結果である。グラフにおいて、ｙ軸は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）の処理と比較して、ＤＭやＮｏｇｇｉｎを処理した後の各遺伝子の相対的な発現を示したものである。ＤＭは、ドルソモルフィンを意味し、ＮＯＧは、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）を意味する（＊ｐ<０.０５、＊＊ｐ<０.０１、ＡＮＯＶＡテスト）。

【図3】図３は、ｈＥＳＣsのＢＭＰとアクチビン／ノダル信号伝達経路を二重に抑制させ、ｈＥＳＣsが栄養膜（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）に分化することを抑制した結果である。胚様体をＤＭ（５μＭ）とＳＢ４３１５４２（５μＭ〜１０μＭ）で処理又は非処理した後、１０日間培養しており、２つの代表的な栄養膜マーカーであるＧＡＴＡ２とＧＣＭ１の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて検出した。

【図4】図４ａ〜４ｃは、ＢＭＰとアクチビン／ノダル信号の二重抑制が、誘導神経細胞の分化工程と共に、神経系統への分化を更に促進させた結果を示したものである。ＤＭとＳＢ４３１５４２で処理又は未処理した後、４日間培養された胚様体は、培養皿に接着され、追加的に６日間、神経誘導培地（２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが添加されたＮ２培地）で成長させた。Ｈ９とＭｉｚ−ｈＥＳ６は、約９０％の神経ロゼット構造（矢印の頭部）を持った多くのコロニーに発達した（図４ａ〜４ｂ）。一方、Ｍｉｚ−ｈＥＳ４、ＢＪ１−ｉＰＳ１２とＭＳＣ−ｉＰＳ２−３細胞から発生した２.６−２５.５％のコロニーは、多様な非−神経細胞の形態であるが、神経ロゼット構造を示した。これらの結果は、自発的な分化だけでなく、誘導分化プロトコルを使用した後も、ｈＰＳＣｓの分化傾向が依然として存在するということを意味する（図４ａの上位対照群）。しかしながら、驚いたことに、４日間胚様態に処理したＤＭとＳＢ４３１５４２は、実験に用いられた細胞から、ほとんどのコロニーに効率的及び同じ神経ロゼット形成を誘導した（図４ａの下位パネル）。抗−Ｎｅｓｔｉｎ（グリーン）と抗−Ｓｏｘ１（レッド）の抗体で神経ロゼット構造を染色した（図４ａに挿入）。図４ｂは、ＤＭ及びＳＢ４３１５４２の処理又は非処理下で、５つのｈＰＳＣ細胞株の神経分化後、神経ロゼット構造を持つコロニーの割合を示した結果である。図４ｃは、ＤＭＳＯを処理した細胞と比較して、誘導分化工程時に、ＤＭとＳＢ４３１５４２で処理されたＭｉｚ−ｈＥＳ４、ＢＪ１−ｉＰＳ１２及びＭＳＣ−ｉＰＳ２−３で神経外胚葉マーカーであるＳｏｘ１、Ｐａｘ６及びＮｅｓｔｉｎが有意に増加したことを、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて示した結果である。逆に、内胚葉、中胚葉、栄養膜及び未分化マーカーの発現は、ＤＭＳＯを処理した細胞と比較して減少した。ＤＭＳＯで処理されたグループに対して、ＤＭとＳＢ４３１５４２を処理したグループで発現された遺伝子の相対的な倍率の増加をログ指標上に示した。少なくとも３回以上すべての実験を繰り返した（スケールバー：２０μｍ）。

【図5】図５ａ〜５ｃは、ＢＭＰとアクチビン／ノダル経路の抑制によって生産された神経前駆細胞からＤＡニューロンの効果的な分化を示した結果である。図５ａは、本研究で用いたドーパミン性神経分化プロトコルの概略図を示したものである。図５ｂは、対照群と比較した場合、ＤＭとＳＢ４３１５４２の処理によってＴｕｊ１−及びＴＨ−陽性ニューロン（ドーパミンを合成する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼを発現するニューロン）が非常に増加した状態を、免疫細胞化学分析を通じて示した図である。図５ｃは、ＤＭＳＯを処理した細胞（３回の実験から計算された合計９,２３３個の細胞の２.６±０.５％）と比較して、ＤＭとＳＢ４３１５４２で処理されたＭＳＣ−Ｙ２−３−ｉＰＳ細胞（３回の独立した実験から計算された合計１７,７１１個の細胞のうち、５０.７±２.２％）からニューロン（Ｔｕｊ１発現）数の増加を示した結果である。Ｔｕｊ１−陽性細胞のかなりの部分（４９.５±６.８％）は、ＴＨ^＋ニューロンである。ＴＨ^＋神経細胞は、ＤＭＳＯで処理された対照グループでほとんど検出されていない（＊＊ｐ＜０.０１、スケールバー：５０μｍ）。図５ａ で、 Ｎｅｕｒａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ： 神経インダクション; Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ： 神経前駆体エクスパンジョン; Ｒｅｇｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ： リージョナリゼーション; Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ： ニューロン成熟である。

【図6】図６ａ〜６ｄは、ＢＭＰとアクチビン／ノダル信号伝達経路の調節によってｈＥＳＣs（Ｈ９）の神経外胚葉系統へ分化することを示した結果である。図６ａは、ＥＢ培地にＤＭを添加した後、１０日間培養した場合、神経外胚葉マーカー（Ｓｏｘ１及びｎｅｓｔｉｎ）の発現は増加した一方、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＣｅｒｂｅｒｕｓ）、内胚葉（ＧＡＴＡ４とＡＦＰ）、及び未分化マーカー（Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ）は、抑制された結果を示したものである。図６ｂは、未分化の細胞（Ｏｃｔ４−とＳＳＥＡ４−の二重陽性）及び内胚葉細胞（ＡＦＰ−陽性;赤矢印の頭）が１０日間の５μＭＤＭを処理した胚様態の部分で検出された結果を、免疫細胞化学分析を通じて示したものである。図６ｃは、同時に、ＤＭ及びＳＢ４３１５４２を１０日間処理した場合、神経マーカーの発現が更に促進されることを示した結果である。逆に、他の組織及び未分化マーカーの発現は、著しく減少した。図６ｄは、ＤＭＳＯで処理された胚様態と比較して、ＤＭ及びＳＢ４３１５４２で処理された胚様態でＰａｘ６とＮｅｓｔｉｎの発現が増加することを確認した免疫細胞化学分析の結果である。図６ａと図６ｃのグラフにおいて、ｙ軸は、各々の３回の実験において、化学処理及び対照群のサンプルで遺伝子発現に際して増加倍率（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を示したものである。ＤＭは、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎを意味し、ＳＢは、ＳＢ４３１５４２を意味する（スケールバー：１００μｍ）。

【図7】図７ａ〜７ｂは、誘導の分化傾向を持った様々なｈＰＳＣ細胞株にＢＭＰとアクチビン／ノダル信号伝達経路を同時に抑制して神経細胞の分化を誘導させた結果を示したものである。図７ａは、ｈＰＳＣ細胞株にＤＭとＳＢ４３１５４２を処理した場合、神経外胚葉マーカーの発現が非常に増加した一方、中胚葉／内胚葉及び未分化マーカーの発現は有意に減少した結果を示したものである。ログ指標において、ｙ軸は、小さな分子で処理した細胞及びＤＭＳＯを処理した細胞での遺伝子発現の相対的な増加率を平均±標準誤差で示したものである（基準を１に任意に指定）。図７ｂは、４つのｈＰＳＣ細胞株（Ｈ９、Ｍｉｚ−ｈＥＳ４、ＢＪ１−ｉＰＳ１２、ＭＳＣｉＰＳ２−３）から胚様態区画を抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体で免疫染色して示したものである。ＤＭは、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎを意味し、ＳＢは、ＳＢ４３１５４２を意味する（スケールバー：１００μｍ）。

【図8】図８は、ヒト胚性幹細胞（Ｍｉｚ−ｈＥＳ６）とヒト逆分化幹細胞（ＢＪ１−ｉＰＳ１２）から、各々ＢＭＰ、アクチビン／ノダル信号の調節によって神経前駆細胞を収得し、これらから神経細胞（Ｔｕｊ１）、神経膠細胞（ＧＦＡＰ）及び稀突起膠細胞（オリゴデンドロサイト、Ｏ４）が分化されていることを確認した結果である（スケールバー：２５μｍ）。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0037】

以下、実施例に基づいて、本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は、単に、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の主旨に従って、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されないことは、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。

【0038】

＜材料及び方法＞
＜＜ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）の培養＞＞
合計６つのヒト胚性幹細胞株Ｈ９（Ｐ３１−４５、ＷｉＣｅｌｌＩｎｃ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）、Ｍｉｚ−ｈＥＳ４（Ｐ６７−７５）、Ｍｉｚ−ｈＥＳ６（Ｐ３４−４５）（ミズメディ病院、大韓民国）、ＣＨＡ−ｈＥＳ３（Ｐ８８−９３、ＣＨＡ病院、大韓民国）、ＳＮＵ−ｈＥＳ３（Ｐ３０−３６）及びＳＮＵ−ｈＥＳ１６（Ｐ７１−７６）（ソウル大学病院、大韓民国）を、２０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ;Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）、０.１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、及び４ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）が添加されたＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で培養した。ＳＴＯ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）フィーダー細胞層で培養させたＳＮＵ−ｈＥＳ３（Ｐ３０−３６）とＳＮＵ−ｈＥＳ１６細胞株とを除いて、ほとんどのｈＥＳＣ株を有糸分裂を停止されたマウスの胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＭＥＦｓ、ＭＣＴＴ社、ソウル、韓国）層で成長させた。５日間〜７日間、毎日公知の継代培養方法（Ｏｈ，Ｓ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３， ６０５−６０９（２００５）参照）によって、ｈＥＳＣコロニーは、新鮮なフィーダー層に移した。また、３つのヒト誘導多能性細胞株（ｉＰＳＣｓ）、つまり、ｄＨ１ｆ−ｉＰＳ２−２、ＭＳＣ−ｉＰＳ２−３及びＢＪ１−ｉＰＳ１２細胞株（Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４５１， １４１−１４６（２００７）参照）を、上記ｈＥＳＣと同じ培地組成を有する培地で培養した（上記の３種のヒト誘導多能性細胞株は、ハーバード大学のＧｅｏｒｇｅ Ｑ． Ｄａｌｅｙ博士から分譲されており、それについての参考文献は、次の通りである;Ｎａｔｕｒｅ、２００８ Ｊａｎ １０；４５１（７１７５）：１４１−６， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２００８；３（７）：１１８０−６）。

【0039】

＜＜ヒト全分化能幹細胞の自発的分化＞＞
３０分間、ＩＶ型のコラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を２ｍｇ／ｍＬで処理した後、フィーダー細胞層からｈＥＳＣs及びヒトｉＰＳＣsコロニーを分離させ、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｉｅｓ：ＥＢ）を形成するようにしており、当業界で通常に使用するｂＦＧＦを含まないｈＥＳＣ培地（ＥＢ培地）が含まれているペトリディッシュに移動させた。胚様態を形成させる間、様々な濃度のＤＭ（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ；Ｓｉｇｍａ社、米国）及びＳＢ４３１５４２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を培地に添加し、約１０日間、１日置きに培地を交換した。ｑＲＴ−ＰＣＴ及び免疫細胞化学を通じて数種類のマーカーの発現を分析した。

【0040】

＜＜ヒト全分化能幹細胞のＤＡ（Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ）ニューロンへの分化＞＞
１０日間の自発的な分化の後、神経前駆細胞（ＮＰｓ）への進行のために、８日間〜１０日間、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が添加されたＮ２培地（（ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）及び１×Ｎ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で胚様体を追加的に培養し、進行過程の間、１日置きに培地を交換した。ピペットで優しくピペッティングして増殖した神経前駆細胞を別個に分離させ、その次に、０.５×１０^６細胞数／ｃｍ^２〜２×１０^６細胞数／ｃｍ^２の密度となるようにマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ；ＢＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＵＳＡ）でコーティングされたプレートにシーディングした。２００ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬのソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）、及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８（線維芽細胞増殖因子８；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が補充されたＮ２培地で８日間培養してＤＡ（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ）前駆細胞を発生させた。完全に成熟したＤＡニューロンを発生させるために、１×Ｎ２、２０ｎｇ／ｍＬの神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、２０ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び２００μＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社）が補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２培地又はニューロベイサル培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＤＡ前駆細胞を培養した。

【0041】

＜＜ヒト全分化能幹細胞の神経細胞の分化誘導＞＞
公知の方法（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．， Ｗｅｒｎｉｇ， Ｍ．， Ｄｕｎｃａｎ， Ｉ.Ｄ．， Ｂｒ， Ｏ．＆Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ．Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９， １１２９−１１３３（２００１）参照）を一部修正して、ヒトの全分化能幹細胞を神経細胞へ分化させた。つまり、５μＭのＤＭ及び５μＭ〜１０μＭのＳＢ４３１５４２の存在下又は不存在下のＥＢ培地で、胚様体を４日間培養し、その次に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが補充されたＮ２培地が含まれているマトリゲルがコートされたディッシュ上で６日間追加的に培養した。次に、コロニーカウント、免疫細胞化学及びｑＲＴ−ＰＣＲを用いてサンプルを分析した。

【0042】

＜＜免疫染色及び定量分析＞＞
１０分間４％パラ−ホルムアルデヒド−ＰＢＳを用いて細胞を固定した。また、胚様態を同じ固定液で固定させ、２０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）を添加して凍結を防止し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、米国）で凍結した後、クリオスタットを用いて、１０μｍの厚さの切片を作製した。前記切片は、０.０１％トリトンＸ−１００／ＰＢＳ（細胞内のマーカー）で処理し、室温で１時間の間、５％ロバ血清（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ＣＡ、米国）でブロックさせた後、４℃で一次抗体を用いて一晩反応させた。本研究で用いた一次抗体は、以下の通りである：Ｏｃｔ４（１:１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、ＣＡ、米国）；ＳＳＥＡ４（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）;Ｓｏｘ１（１:２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）；Ｐａｘ６（１:２００、ＤＳＨＢ、Ｉｏｗａ、ＩＡ、米国）、ネスチン（１:１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）；α−フェトプロティン（ＡＦＰ；１:１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）；Ｔｕｊ１（１：１，０００、Ｃｏｖａｎｃｅ社、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、米国）；ＧＦＡＰ（１:３００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、Ｏ４（１:２００、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、又は１:３００、Ｐｅｌｆｒｅｅｚ社、Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＲ、米国）。一次抗体のインキュベーション後、結合させた一次抗体を検出するために、蛍光（Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−４８８又は５９４）結合２次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）を用いた。核を検出するために、ＤＡＰＩ（４’,６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、Ｖｅｃｔｏｒ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、米国）を加えた。オリンパスＩＸ７１顕微鏡とＤＰ７１デジタルカメラで細胞イメージを観察し、イメージ−プロ プラス バージョン５.１（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ、米国）で分析した。３つの独立した実験で免疫標識された細胞又はコロニーをカウントして、定量的評価を実施した。平均±標準誤差で値を表した。統計的有意性は、スチューデントｔ−テストやＳＰＳＳのソフトウェア バージョン １２.０を用いるＯｎｅ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡテストを用いた。

【0043】

＜＜定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）及びデータ分析＞＞
メーカーのプロトコルに応じて、イージー−スピン（登録商標）のトータルＲＮＡ精製キット（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｓｅｏｕｌ、大韓民国）を用いて、細胞内に存在する総ＲＮＡを抽出した後、パワーｃＤＮＡ合成キット（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて、１μｇのＲＮＡを逆転写した。ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ、Ｓｈｉｇａ、日本）を用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＭｙｉＱ又はＣＦＸ９６リアル−タイムシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）を用いて反応させた。ｑＲＴ−ＰＣＲの条件は、次の通りである：９５℃１分間（１段階）、９５℃２０秒間、６３℃２０秒間、及び７２℃２０秒間を１サイクルとして、合計４０サイクル（２段階）、７２℃１分間の最終エクステンション（３段階）。特異的マーカー遺伝子の発現値（Ｃｔ ｖａｌｕｅｓ）を求め、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）の値に従って標準化した。その次に、ΔΔＣｔ法（Ｐｆａｆｆｌ，Ｍ．Ｗ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９， ４５（２００１）参照）で標準化されたマーカーの発現水準を化学的処理されたサンプル、及びローディング対照郡サンプルと比較した。少なくとも３回以上の独立した実験をして、すべてのデータを最終確認した。プライマー配列は、表１に表した。

【0044】

【表1】

【0045】

上記上添え字は、本実施例に含まれる参照文献を意味する。
２０： Ｘｕ，Ｒ−．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２， １８５−１９０（２００５）
２１： Ｋｒｏｏｎ，Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２６， ４４３−４５２（２００８）
２２： Ｘｉａｏ，Ｌ．， Ｙｕａｎ，Ｘ． ａｎｄ Ｓｈａｒｋｉｓ，Ｓ． Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２４， １４７６４８６（２００６）

【0046】

＜結果＞
ヒト全分化能幹細胞（例えば、ｈＥＳＣsとヒトｉＰＳＣs）が特定の細胞タイプに効率的に分化できる能力が、幹細胞を治療に応用するための前提条件である。最近の報告書では、ヒト胚性幹細胞株が、特定の細胞系統に分化する傾向を持っていると報告した（Ｏｓａｆｕｎｅ，Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６， ３１３−３１５（２００８）参照）。また、本発明者らは、４つの機関から樹立された６つのｈＥＳＣで分化傾向の有意な違いが発見されており、他の種類の体細胞から由来する３つのヒト誘導多能性細胞が特定の細胞系統に分化できる潜在性を維持していることが追加的に分かった（図１）。これらの分化内在的傾向性が存在するというのは、目的の細胞系統に分化させる際に、陰性的に影響を与えるので、細胞治療法への応用において、適切な細胞株を選択するために、すべてのｈＥＳＣとｉＰＳＣの分化の傾向についての調査が必要とされた。そのためのスクリーニング工程は、多くの努力、時間及びコストがかかるため、元々持っていた分化の傾向とは関係なく、すべてのｈＰＳＣを特定の細胞組織に分化誘導できる方法があれば、非常に大きな助けとなるだろう。予備研究の実験により、本発明者らは、多様な分化傾向を持っているすべてのｈＰＳＣの神経系統（例えば、神経前駆細胞（ＮＰｓ）の形成）に分化させる普遍的なプロトコルを確立しようとした。本研究は、神経分化に際して幅広く適用可能なプロトコルを作成するために、低分子化合物を用いて胚発生過程のうち神経誘導が密接に関連しているシグナル伝達経路を操作することを計画した。

【0047】

まず、神経分化を誘導するために、Ｈ９ ｈＥＳＣコロニーを酵素処理法によって胚様体（ＥＢｓ）を形成させて浮遊培養した。一般に、分化効率の変化が、各々のｈＥＳＣの分化の傾向によって左右されるとしても、どのような分化系列誘導増殖因子も含まれていない自発的な分化条件下で培養された胚様態は、低い神経細胞分化効率を持つ。他の細胞系への分化ではなく、神経細胞のみの分化を促進させるために、初期の胚様態形成期間の間、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）信号伝達経路を抑制した。ＢＭＰ信号の抑制は、初期胚の発達期間の間、神経誘導に重要な役割を果たすことが知られている（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ｉ ＆ Ｅｄｌｕｎｄ， Ｔ． Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｓｕｐｐｌ：１１６１−１１６８（２００１）及びＭｕ，Ｉ． ＆ Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，Ａ．Ｈ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３，２７１−２８０（２００２）参照）。ＢＭＰ信号の抑制のために、既存の発明者らは、ポリペプチドＢＭＰの抑制剤であるノギン（ｎｏｇｇｉｎ）を主に使用したが、本発明者らは、この物質の代わりに、低分子化合物が胚様態（Ｄｉｎｇ，Ｓ． ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２， ８３３−８４０（２００４）参照）の中により容易にアクセス可能であり、細胞の信号伝達を効果的に調節できるという点に着目して、低分子化合物形態の選択的ＢＭＰ拮抗剤ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ：ＤＭ）（Ｙｕ，Ｐ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ４， ３３−４１（２００８）参照）を用いた。まず、ＤＭ（０.１μＭ〜５μＭ）を４日投与された胚様態でＢＭＰシグナル活性の指標となるＩｄ１及びＩｄ３遺伝子の発現水準がＤＭの含有量に依存して減少することを通じて、ＤＭの効果を検証した（図２ａ）。その後、ＤＭ処理が用量−依存的に分化する胚様態でＰａｘ６とＮｅｓｔｉｎのような神経マーカーの発現を増加させ、ＤＭ処理によるＢＭＰ信号伝達経路の抑制が、Ｈ９ ｈＥＳＣsの神経系統への分化を促進することを確認した（図２ｂ）。

【0048】

ＢＭＰ経路の抑制は、神経細胞の分化を十分に誘導させると共に、他の系統への分化を減らすか否かを調べるため、ｈＥＳＣsの分化運命の変化におけるＤＭの効果をより綿密に検証した。１０日間、ＤＭ（１μＭ及び５μＭ）が含まれている自発的分化培地で胚様態を培養し、未分化なｈＥＳＣsだけでなく、３胚葉層の代表的なマーカーの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）及び免疫細胞化学方法を用いて確認した（図６ａ及び６ｂ）。胚様態形成時にＤＭを処理する場合、ＤＭの容量依存的に神経細胞のマーカー（Ｓｏｘ１及びＮｅｓｔｉｎ）の発現を有意に増加させる一方、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＣｅｒｂｅｒｕｓ）、内胚葉（α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＧＡＴＡ４）及び未分化であるｈＥＳＣs（Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ）マーカーの発現は減少した（図６ａ）。しかしながら、内胚葉（例えば、ＡＦＰ）と未分化細胞のマーカー（例えば、Ｏｃｔ４及びＳＳＥＡ４）は依然として検出された（図６ｂ）。これらの結果は、ＢＭＰ経路の抑制だけでは、内胚葉、中胚葉及び残りの未分化の細胞が最小限しか含まれていない純粋な神経細胞群を多く生産できないということを意味する。これに基づいて、本発明者らは、ｈＥＳＣsの神経系統への分化をより促進できる付加的な信号伝達経路の抑制方法について研究した。アクチビン／ノダル（Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ）経路は、内胚葉及び中胚葉分化誘導による初期胚の発達過程において極めて重要な役割を果たし（Ｓｃｈｉｅｒ，Ａ．Ｆ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １９， ５８９２１（２００３）参照）、一方、神経外胚葉系統への分化は抑制することが知られている（Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．， Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｄ． ＆ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ａ． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． ２７５， ４０３−４２１（２００４）及びＣａｍｕｓ，Ａ．， Ｐｅｒｅａ−Ｇｏｍｅｚ，Ａ．， Ｍｏｒｅａｕ，Ａ． ＆ Ｃｏｌｌｉｇｎｏｎ，Ｊ． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． ２９５， ７４３−７５５（２００６）参照）。また、最近、アクチビン／ノダル信号伝達が、ｈＥＳＣの幹細胞性を維持させるのに重要な役割をすることが報告された（Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｍ． ＆ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ａ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １１８， ４４９５−４５０９（２００５）及びＸｉａｏ，Ｌ．， Ｙｕａｎ，Ｘ． ａｎｄ Ｓｈａｒｋｉｓ，Ｓ． Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４， １４７６４８６（２００６）参照）。そこで、本発明者らは、アクチビン／ノダル信号伝達の抑制が、他の分化系統及び未分化の細胞を減少させながら、ｈＥＳＣsを神経外胚葉に分化させることに更に有利に作用すると推定した。

【0049】

この考えに基づいて、ＢＭＰ経路の抑制だけでなく、アクチビン／ノダル信号伝達の抑制を伴うことが、不要な細胞への分化を最小限に抑えながら、神経細胞に分化誘導できるか否かをテストした。アクチビン／ノダル信号伝達の特異的抑制剤であるＳＢ４３１５４２（５μＭ又は１０μＭ）とＤＭ（５μＭ）とを含む自発的分化培地に胚様態を培養する場合、神経細胞のマーカー（Ｓｏｘ１、Ｐａｘ６及びＮｅｓｔｉｎ）の発現が有意に増加する一方、内胚葉（ＡＦＰ及びＧＡＴＡ４）と中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＣｅｒｂｅｒｕｓ）のマーカーは、目立つほど減少した（図６ｃ）。何より重要なことは、未分化の全分化能細胞に対するマーカー（Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ）が非常に減少したことである（図６ｃ）。また、本実施例では、神経細胞の増加を免疫細胞化学により同定した（図６ｄ）。

【0050】

ＢＭＰ経路単独を抑制（ＤＭで処理）、又はＢＭＰ経路及びアクチビン／ノダル経路を両方抑制（ＤＭ及びＳＭ４３１５４２で処理）することで、栄養膜マーカー（ＧＡＴＡ２及びＧＣＭ１）の発現が減少した（図３）。これらの結果は、ＢＭＰ経路が、活性化している場合にのみアクチビン／ノダル経路が、ｈＥＳＣsの栄養膜への分化を誘導すると報告された先行文献と一致する（Ｗｕ，Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８３， ２４９９１５００２（２００８）参照）。
しかも、本発明では、ｈＰＳＣｓから効率的かつ排他的な神経細胞への誘導には、ＢＭＰ及びアクチビン／ノダル信号伝達経路の両方の抑制が要求されるというデータを提示した。これらの結果は、ＢＭＰ及びアクチビン／ノダル信号伝達経路の同時的及び連続的な抑制が、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚の発達において神経誘導のために要求されると報告された最近の研究と一致する（Ｃｈａｎｇ，Ｃ． ＆ Ｈａｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｍ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４， ３８６１−３８７２（２００７）参照）。

【0051】

その次の疑問点は、内在的分化の傾向（ｉｎｎａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）とは関係なく、ＤＭとＳＢ４３１５４２とによる同時処理が、ｈＥＳＣ及びｉＰＳＣの両方の細胞系統において神経系への分化を誘導するものか否かである。この疑問点を解決するために、９つのｈＰＳＣ（６つのｈＥＳＣ及び３つのヒトｉＰＳＣ）から産生された胚様態を自発的分化条件で培養しながら、ＤＭ（５μＭ）及びＳＢ４３１５４２（１０μＭ）で処理した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析から、ＤＭとＳＢ４３１５４２とを処理したことが、他の分化系統の細胞への分化を減少させながら、神経細胞への誘導を有意に向上していることが分かった（図７ａ）。興味深いことに、対照群（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理された細胞）と、ＤＭ及びＳＭ４３１５４２で処理された細胞株との間での神経細胞のマーカー発現の増加幅は、Ｍｉｚ−ｈＥＳ４、ＳＮＵ−ｈＥＳ３、ＳＮＵ−ｈＥＳ１６、ＣＨＡ−ｈＥＳ３及びＢＪ１−ｉＰＳ１２細胞のような神経細胞に分化しない内在的分化傾向を持った細胞株での発現増加幅が高く示された（図１ａ及び図７ａ）。免疫細胞化学分析からは、ＢＭＰ及びアクチビン／ノダル信号伝達経路が抑制された際に、より多くの細胞が神経前駆細胞のマーカーＮｅｓｔｉｎを発現していることが分かった（図７ｂ）。ＤＭ及びＳＢ４３１５４２で処理した後は、いずれの未分化の細胞も免疫細胞化学によって検出されなかった（図示しない）。

【0052】

自発的分化過程におけるこれらの効果だけでなく、ｈＥＳＣsから神経細胞分化を誘導するように設計された神経誘導分化プロトコルを使用する場合でも、ＤＭ及びＳＢ４３１５４２は、神経細胞の発生を増加させた（図４ａ〜４ｃ）（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．， Ｗｅｒｎｉｇ，Ｍ．， Ｄｕｎｃａｎ，Ｉ．Ｄ．， Ｂｒ，Ｏ． ＆ Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ．Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９， １１２９−１１３３参照）。本発明により発生した神経前駆細胞は、神経細胞（ニューロン）、星状細胞（アストロサイト）及び乏突起膠細胞（オリゴデンドロサイト）になり得る多分化能を持っていることが分かった（図８）。

【0053】

まとめると、これらの結果は、ｈＥＳＣ細胞系とｉＰＳＣ細胞系とでは分化傾向にかなりの相違があるが、この分化傾向の相違は、分化過程が自発的であるか定向的であるかにかかわらず、ＢＭＰ及びアクチビン／ノダル信号伝達経路の同時調節を通じて克服できることを示す。つまり、いずれの両条件の下においても、すべてのｈＰＳＣｓは、効率的に神経細胞系統に分化した。

【0054】

ＢＭＰ信号伝達経路及びアクチビン／ノダル信号伝達経路を同時に抑制して発生された神経前駆細胞が、特定の神経細胞のサブタイプになり得る能力を維持しているのかを調査するために、本発明者らは、更に、従来のプロトコルを調整して、ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへの分化を試みた（図５ａ）（Ｃｈｏ，Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １０５， ３３９２−３３９７（２００８）及びＹａｎ，Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３， ７８１−７９０（２００５）参照）。免疫細胞化学分析では、ＤＭＳＯで処理された細胞から分化したＴｕｊ１陽性神経細胞の数（総細胞数の２.６±０.５％）と比較して、ＤＭ及びＳＢ４３１５４２で処理されたヒトｉＰＳＣ（ＭＳＣ−ｉＰＳ２−３）から分化したＴｕｊ１陽性神経細胞の数が顕著に増加した（総細胞数の５０.７±２.２％）（図５ｂ〜５ｃ）。Ｔｕｊ１陽性細胞のかなりの部分（４９.５±６.８％）は、ＴＨ^＋ニューロン（ドーパミンを合成する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼを発現するニューロン）であった。また、これらの結果は、ＢＭＰ及びアクチビン／ノダル信号伝達経路の操作によって発生した神経細胞が、ＤＡニューロンのような特異的神経タイプへ分化できる能力を持っていることを意味する。

【0055】

まとめると、本発明では、多様な分化傾向を持つｈＰＳＣｓがＢＭＰ信号伝達経路とアクチビン／ノダル信号伝達経路とを操作することによって神経系列に効果的に分化できること、及び前記信号伝達経路の操作を通じてｈＥＳＣsとヒトｉＰＳＣsの内在的分化の潜在性を克服できることを提示する。これにより、細胞の代替療法を必要とする患者からの、複雑で独立したｉＰＳＣ細胞株を大量生産すべき必要性は簡素化される。

【0056】

以上で、本発明の特定の部分を詳細に述べたが、当業界の通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な技術は、単に好ましい実施例にすぎず、これにより本発明の範囲が制限されるわけではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項及びその等価物によって定義されると言える。

【図4b】

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4a】

【図4c】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図7a】

【図7b】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]