特許 5756151 トランスチレチンの安定化及びトランスチレチンの誤った折り畳みの阻害のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5756151

(24)【登録日】2015年6月5日

(45)【発行日】2015年7月29日

(54)【発明の名称】トランスチレチンの安定化及びトランスチレチンの誤った折り畳みの阻害のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/603 20060101AFI20150709BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150709BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/603

   A61P9/00

   A61P25/00

   A61P43/00 111

   A61P43/00

【請求項の数】5

【全頁数】73

(21)【出願番号】特願2013-170867(P2013-170867)

(22)【出願日】2013年8月21日

(62)【分割の表示】特願2010-162800(P2010-162800)の分割

【原出願日】2003年12月19日

(65)【公開番号】特開2013-256521(P2013-256521A)

(43)【公開日】2013年12月26日

【審査請求日】2013年8月21日

(31)【優先権主張番号】60/435,079

(32)【優先日】2002年12月19日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/465,435

(32)【優先日】2003年4月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】501244222

【氏名又は名称】ザ スクリプス リサーチ インスティテュート

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100096183

【弁理士】

【氏名又は名称】石井 貞次

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(72)【発明者】

【氏名】ケリー，ジェフリー，ダブリュ．

(72)【発明者】

【氏名】関島 良樹

【審査官】 近藤 政克

(56)【参考文献】

【文献】 Bioorganic & Medicinal Chemistry，１９９９年，7，p.1339-1347

【文献】 Br. J. clin. Pharmac.，１９７７年，4，p.31S-36S

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／６０３

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

トランスチレチンアミロイド病を治療するための薬剤であって、1日2回250mgのジフルニサルを投与するように調製されている上記薬剤。

【請求項2】

トランスチレチンアミロイド病が家族性アミロイド多発性神経障害である、請求項１に記載の薬剤。

【請求項3】

トランスチレチンアミロイド病が家族性アミロイド心筋症である、請求項１に記載の薬剤。

【請求項4】

トランスチレチンアミロイド病が老人性全身性アミロイド症である、請求項１に記載の薬剤。

【請求項5】

トランスチレチンアミロイド病が肝臓移植後の心アミロイド症である、請求項１に記載の薬剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２００２年１２月１９日出願の米国仮出願番号６０／４３５,０７９に基づく優先権を主張しており、その全内容は参照により全体として本明細書に組み入れられる。

【0002】

連邦政府委託研究に関する陳述
本明細書に開示した研究の幾つかを支援するために用いられた資金は、国立衛生研究所により裁定された認可番号ＮＩＨ ＤＫ ４６３３５によって提供された。政府は本発明における一定の権利を有することがある。

【0003】

技術分野
本発明は、一般的にタンパク質の誤った折り畳み（misfolding）に関する。より詳しくは、本発明は、トランスチレチンの安定化、トランスチレチンの誤った折り畳みの阻害、及びそれに関連するアミロイド病の治療のための組成物及び方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

トランスチレチン（ＴＴＲ）は、血清及び脳脊髄液中に存在する５５ｋＤのホモテトラマータンパク質である。ＴＴＲの機能は、Ｌ-チロキシン（Ｔ_４）及びホロ-レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）を輸送することである。ＴＴＲは、ヒトにおける疾患の病理に導くフィブリル及び他の凝集物に変換され得る２０種を超える非相同アミロイド生成タンパク質の一つである。これらの疾患は、タンパク質が凝集したための機能喪失によって引き起こされるようには思われない。それどころか、凝集は、まだ明らかにされていない機構によってニューロン／細胞性機能障害を引き起こすように思われる。

【0005】

変性条件下では、律速的な野生型ＴＴＲテトラマーの解離及び迅速なモノマーの誤った折り畳みは、アミロイドへの集合ミスを可能にし、老人性全身性アミロイド症（ＳＳＡ）の原因となると推定される。８０種より多いＴＴＲ変異体の一つが解離して誤って折り畳まれると、結果として家族性アミロイド多発性神経障害（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）を招く。

【0006】

ＴＴＲテトラマーは、二つのＣ_２ 対称Ｔ_４ 結合部位を有する。負に共同するＴ_４の結合はＴＴＲテトラマーを安定化し、そしてアミロイドフィブリル形成を阻害することが知られている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

残念ながら、ＴＴＲの１％未満がヒト血清中でそれと結合したＴ_４を有する。なぜならば、甲状腺結合グロブリン（ＴＢＧ）はＴＴＲと比較してＴ_４に対する親和性の程度が高いからである。さらに、Ｔ_４の血清濃度は、ＴＴＲの血清濃度（３．６〜７．２μＭ）と比較して相対的に低い（０．１μＭ）。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、少なくとも一部は、トランスチレチンテトラマーの天然状態の動力学的安定化がタンパク質の誤った折り畳みを阻害するという発見に基づいている。この発見は、タンパク質の誤った折り畳みが、トランスチレチンアミロイド病を含む種々の疾患の過程において果たす役割のために重要である。トランスチレチンの誤った折り畳みを阻害することにより、このような疾患を抑制し、症状を軽減し、そして／又は若干の場合には該疾患を予防又は治癒することができる。

【0009】

トランスチレチンの天然状態の動力学的安定化が誤った折り畳みを効果的に阻害するという発見は、潜在的に高い特異性及び低い毒性を有する治療用組成物の開発を可能にする。従って、トランスチレチンの安定化能を有する典型的なビアリール試薬を本明細書に開示するが、タンパク質を選択的に安定化する他の試薬を設計することができる。例えば、本明細書に記載するように、トランスチレチンへの結合に対して高度に選択的であり、かつトランスチレチンの天然状態を安定化するポリ塩化ビフェニル、ジフルニサル類似体又はベンゾオキサゾールを設計及び製造することが可能である。

【0010】

一つの態様において、本発明は、トランスチレチンテトラマーの解離を防止又は減少する化合物のスクリーニング方法を特徴とする。本方法は、次の段階：トランスチレチンテトラマーを候補化合物と接触させること；及び該候補化合物がトランスチレチンテトラマーの解離に関連する活性化エネルギーを増加させるかどうか、これによってトランスチレチンテトラマーの解離を防止又は減少するかを決定することを含むことができる。本方法は、場合により、候補化合物がフィブリル形成（fibril formation）を阻害する能力を測定する追加の段階を含むことができる。

【0011】

一つの実施形態において、本方法は、上記化合物が、トランスチレチンテトラマーの解離遷移状態の不安定化によりトランスチレチンテトラマーの解離を防止するかどうかを決定する段階を含む。別の実施形態において、本方法は、上記化合物が、トランスチレチンテトラマーを解離遷移状態より異常に安定化することによりトランスチレチンテトラマーの解離を防止するかどうかを決定する段階を含む。

【0012】

このような方法に使用される候補化合物は、場合により小分子であってよい。このような小分子は、テトラマー結合によりトランスチレチンの天然状態を安定化し、これによって変性及び生理的条件下での解離及びアミロイド症を動力学的機構により遅らせることができる。この化合物は、場合により、１０．６μＭの濃度で投与したときに、ヒト血中のＴＴＲに０．１を超える結合化学量を示す。

【0013】

小分子は、場合により、１５００未満の分子量を有してよく、そして非共同的又は正共同的にトランスチレチンに結合することができ、そして＞２．３ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを与えることができる。小分子は、Ｋ_ｄ１ 及びＫ_ｄ２ ＜１００ｎＭ（例えば、＜１０ｎＭ）及び／又は高い血漿濃度を示すことができ、これら両者は２．０ｋｃａｌ/ｍｏｌを超えるタンパク質安定化に寄与する。また、小分子は、アミロイド症の発生率を減少させ、そして酸媒介又はＭｅＯＨ媒介アミロイド生成速度の減速／又は尿素媒介ＴＴＲ解離速度の減速が可能である。

【0014】

幾つかの実施形態において、小分子は、ビフェニルアミン、ビフェニル、オキシムエーテル、ベンズアゾール、又は二つの芳香族環からなる他の構造であって、その一方の環が酸若しくはフェノールのような親水性基を有し、他方がハロゲン若しくはアルキルのような疎水性基を有するものを含む。

【0015】

一つの実施形態において、候補化合物は、一方の環が親水性置換基を有し、他方が疎水性置換基を有するビアリール、又は両方の環が少なくとも１個の親水性置換基を有するビアリールである。親水性基は、フェノール、ＣＯＯＨ、ベンジルアルコール、ボロン酸若しくはエステル、テトラゾール、アルデヒド若しくは水和アルデヒド、又は直接に若しくは水媒介Ｈ結合によってタンパク質に対してＨ結合供与体又は受容体として作用する官能基であってよい。ビアリールは、両方の環がフェノール、カルボキシレート及びアルコール並びに若干の場合にはＴＴＲのハロゲン結合ポケットを補完するハロゲンを含む親水性官能基で置換された対称ビアリール、例えば、次の官能基：３-Ｃｌ、４-ＯＨ、５-Ｃｌ及び３’-Ｃｌ、４’-ＯＨ、５’-Ｃｌを有するビアリールであってよい。一つの実施形態において、ビアリールの少なくとも一方の環は、２,４-ジフルオロ又は３,５-ジフルオロ又は２,６-ジクロ又は３,５-ジクロ又は３-Ｃｌ、４-ＯＨ、５-Ｃｌ又は３-Ｆ、４-ＯＨ、５-Ｆ、３-ＣＯＯＨ、４-ＯＨ又は３-ＯＨ又は３-ＣＯＯＨ又は４-ＣＯＯＨ又は３-ＣＨ２ＯＨ又は４-ＣＨ_２ＯＨ置換基で置換されている。典型的なビアリールはポリ塩化ビフェニル、例えばヒドロキシル化ポリ塩化ビフェニルであり、ここで、少なくとも一方の環はＯＨ及び／又はＣｌ置換基を有し、該置換基は３-Ｃｌ、４-ＯＨ、５-Ｃｌ又は２-Ｃｌ、３-Ｃｌ、４-ＯＨ、５-Ｃｌ又は３,４-ジＣｌ、又は２,３,４-トリクロロ又は２,３,４,５-テトラクロロを含む。塩素以外のハロゲンを候補化合物に使用することができる。候補化合物はベンゾオキサゾールであってもよい。

【0016】

一つの実施形態において、候補化合物はジフルニサル類似体である。ジフルニサル並びに種々のジフルニサル類似体の構造を本明細書に記載する。ジフルニサル類似体は、場合により、ジフルニサルと比較して減少又は消失したＮＳＡＩＤ活性を有することができる。例えば、ジフルニサル類似体は、ジフルニサルと比較して減少又は消失したシクロオキシゲナーゼ阻害剤活性を有することができる。

【0017】

一つの実施形態において、本方法は、ジフルニサル類似体がＮＳＡＩＤ活性を示すかどうかを決定する追加の段階を含む。例えば、本方法は、ジフルニサル類似体がシクロオキシゲナーゼ阻害剤活性を示すかどうかを決定する追加の段階を含むことができる。

【0018】

本スクリーニング方法に使用されるトランスチレチンは、野生型トランスチレチン又は突然変異体トランスチレチン、例えば、トランスチレチンアミロイド病、例えば家族性アミロイド多発性神経障害又は家族性アミロイド心筋症の発症に原因として関連する自然発生突然変異体トランスチレチンであってよい。典型的な自然発生突然変異体トランスチレチンは、Ｖ１２２Ｉ、Ｖ３０Ｍ、Ｌ５５Ｐを含むが、これらに限定されるものではない（突然変異体の命名は、野生型に対して、示したアミノ酸の位置での置換を記述する；例えば、Saraiva et al. (2001) Hum. Mut. 17:493-503 参照）。

【0019】

また、本発明は、組織又は生体液（biological fluid）中のトランスチレチンを安定化し、これによって誤った折り畳みを阻害する方法を提供する。一般的に、本方法は、組織又は生物学的液体に、トランスチレチンと結合してトランスチレチンテトラマーの天然状態の動力学的安定化によりトランスチレチンテトラマーの解離を防止する本明細書に記載した化合物の安定化量を投与することを含む。

【0020】

このように、病変組織中のトランスチレチンを安定化する方法は、誤った折り畳みを改善し、そして関連する疾患の症状を軽減し、そして疾患に応じて疾患の治癒に寄与することができる。本発明は、組織中及び／又は細胞内でのトランスチレチンの誤った折り畳みを阻害することを想定している。誤った折り畳みの程度、従って本発明の方法により達成される阻害の程度は、種々の方法、例えば実施例に記載の方法により評価することができる。

【0021】

従って、別の態様において、本発明は、トランスチレチンアミロイド病に罹患したと診断された被験者に、トランスチレチンテトラマーの天然状態の動力学的安定化によりトランスチレチンテトラマーの解離を防止する化合物の治療有効量を投与することを含む、トランスチレチンアミロイド病の治療方法を含む。

【0022】

一つの実施形態において、本発明は、トランスチレチンアミロイド病に罹患したと診断された被験者に、トランスチレチンテトラマーの解離を防止するジフルニサル類似体（例えば、トランスチレチンテトラマーの解離を防止するジフルニサル類似体）の治療有効量を投与することを含む、トランスチレチンアミロイド病の治療方法を特徴とする。ジフルニサル類似体は、場合により、ジフルニサルと比較して減少又は消失したＮＳＡＩＤ活性（例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤活性）を有することができる。

【0023】

別の実施形態において、本発明は、トランスチレチンアミロイド病に罹患したと診断された被験者に、トランスチレチンテトラマーの解離を防止するポリ塩化ビフェニル（例えば、トランスチレチンテトラマーの解離を防止するポリ塩化ビフェニル）の治療有効量を投与することを含む、トランスチレチンアミロイド病の治療方法を特徴とする。ポリ塩化ビフェニルは、ヒドロキシル化ポリ塩化ビフェニルであってよい。

【0024】

別の実施形態において、本発明は、トランスチレチンアミロイド病に罹患したと診断された被験者に、トランスチレチンテトラマーの解離を防止するジベンゾオキサゾール（例えば、トランスチレチンテトラマーの解離を防止するジベンゾオキサゾール）の治療有効量を投与することを含む、トランスチレチンアミロイド病の治療方法を特徴とする。

【0025】

トランスチレチンアミロイド病は、例えば、家族性アミロイド多発性神経障害（familia amyloid polyneuropathy）、家族性アミロイド心筋症（cardiomyopathy）又は老人性全身性アミロイド症であってよい。

【0026】

本発明の方法により治療される被験者はヒト被験者であってよいが、本発明の原理は、本発明が全ての哺乳類に関して有効であることを示すと理解すべきである。この文脈において、「哺乳類」は、トランスチレチンの誤った折り畳みに関連する疾患の治療が望まれる全ての哺乳類の種、特に農業用及び家畜哺乳類の種を含むと理解される。

【0027】

本明細書に記載した化合物（例えば、ジフルニサル類似体、ポリ塩化ビフェニル又はジベンゾオキサゾールのようなビアリール化合物）は、該化合物を含む医薬組成物の製造に薬学的に許容されるものと共に製剤化することができる。本明細書で用いられるように、「薬学的に許容される」、「生理的に許容される」という用語及びその文法的変化は、それらが組成物、担体、希釈剤及び試薬を指すように、互換的に使用され、そしてこれらの材料が望ましくない生理的作用を生じることなく哺乳類に投与できることを表す。

【0028】

また、本発明は、トランスチレチンアミロイド病（例えば、家族性アミロイド多発性神経障害、家族性アミロイド心筋症又は老人性全身性アミロイド症）を治療するための、本明細書に記載した化合物又は医薬組成物の何れかの使用を含む。

【0029】

また、本発明は、トランスチレチンアミロイド病（例えば、家族性アミロイド多発性神経障害、家族性アミロイド心筋症又は老人性全身性アミロイド症）を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載した化合物又は医薬組成物の何れかの使用を含む。

【0030】

本明細書に記載した化合物及び治療方法は、ＴＴＲアミロイド症に現在利用可能な治療法の選択肢に対して著しい利点を提供する。ＴＴＲアミロイド症は典型的に１０歳代までに死を招き、そして最近まで不治と考えられた。肝臓移植術は、家族性症例の疾患関連対立遺伝子をＷＴ対立遺伝子で置き換える効果的な手段である。なぜならば、肝臓は典型的にアミロイドを生成するＴＴＲ源だからである。肝臓移植術は遺伝子療法の形態として有効ではあるが、それには問題がないわけではない。移植術は、レシピエント及びドナーの両者への侵襲的手術の必要性、長期の移植後免疫抑制療法、ドナー不足、その高いコスト、そして疾患が進行するために適切な候補ではないＴＴＲアミロイド症患者が多いことによって複雑化される。残念ながら、ＷＴ ＴＴＲはしばしば沈着し続けるので、心アミロイド症（cardiac amyloidosis）は若干の家族性患者では肝臓移植後でさえ進行する。そしてまた、ＴＴＲの中枢神経系（ＣＮＳ）沈着も、それが脈絡叢により合成されるので、移植術によっては軽減されない。ＷＴ ＴＴＲが沈着するため８０歳を過ぎた人々の約２５％が侵される最も普及しているＴＴＲ疾患、すなわち老人性全身性アミロイド症（ＳＳＡ）に対して、移植術は実現可能な選択肢ではない。

【0031】

別に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験において、本明細書に記載したのと同様又は等価の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で挙げた全ての刊行物、特許出願、特許及び他の文献は、参照により全体として組み入れられる。対立する場合には、定義を含めて本願が支配するだろう。加えて、材料、方法及び実施例は説明にすぎず、限定を意図するものではない。
本発明は、具体的には以下の発明を含む。
（１）トランスチレチンテトラマーの解離を防止又は減少する化合物のスクリーニング方法であって：
トランスチレチンテトラマーを候補化合物と接触させること；及び、
該候補化合物がトランスチレチンテトラマーの解離に関連する活性化エネルギーを増加させ、これによってトランスチレチンテトラマーの解離を防止又は減少するかどうかを決定すること；
を含む前記方法。
（２）上記化合物が、トランスチレチンテトラマーの解離遷移状態の不安定化によりトランスチレチンテトラマーの解離を防止するかどうかを決定することを含む、（１）に記載の方法。
（３）上記化合物が、トランスチレチンテトラマーの安定化によりトランスチレチンテトラマーの解離を防止するかどうかを決定することを含む、（１）に記載の方法。
（４）上記候補化合物のフィブリル形成阻害能を測定することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（５）トランスチレチンテトラマーが野生型トランスチレチンを含む、（１）に記載の方法。
（６）トランスチレチンテトラマーが自然発生突然変異体トランスチレチンを含む、（１）に記載の方法。
（７）トランスチレチンテトラマーが、原因として家族性アミロイド多発性神経障害の発症に関連する自然発生突然変異体トランスチレチンを含む、（１）に記載の方法。
（８）トランスチレチンテトラマーが、原因として家族性アミロイド心筋症の発症に関連する自然発生突然変異体トランスチレチンを含む、（１）に記載の方法。
（９）トランスチレチンテトラマーが突然変異体トランスチレチンＶ１２２Ｉを含む、（１）に記載の方法。
（１０）トランスチレチンテトラマーが突然変異体トランスチレチンＶ３０Ｍを含む、（１）に記載の方法。
（１１）トランスチレチンテトラマーが突然変異体トランスチレチンＬ５５Ｐを含む、（１）に記載の方法。
（１２）上記候補化合物が小分子である、（１）に記載の方法。
（１３）上記候補化合物がジフルニサル類似体である、（１）に記載の方法。
（１４）上記ジフルニサル類似体がジフルニサルと比較して減少又は消失したＮＳＡＩＤ活性を有する、（１３）に記載の方法。
（１５）上記ジフルニサル類似体がジフルニサルと比較して減少又は消失したシクロオキシゲナーゼ阻害剤活性を有する、（１３）に記載の方法。
（１６）上記ジフルニサル類似体がＮＳＡＩＤ活性を示すかどうかを決定することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（１７）上記ジフルニサル類似体がシクロオキシゲナーゼ阻害剤活性を示すかどうかを決定することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（１８）上記候補化合物がポリ塩化ビフェニルである、（１）に記載の方法。
（１９）上記ポリ塩化ビフェニルがヒドロキシル化ポリ塩化ビフェニルである、（１８）に記載の方法。
（２０）トランスチレチンアミロイド病と診断された被験者に、トランスチレチンテトラマーの解離を防止するジフルニサル類似体の治療有効量を投与することを含む、トランスチレチンアミロイド病の治療方法。
（２１）上記ジフルニサル類似体が、トランスチレチンテトラマーの天然状態の動力学的安定化によりトランスチレチンテトラマーの解離を防止する、（２０）に記載の方法。
（２２）上記トランスチレチンアミロイド病が家族性アミロイド多発性神経障害である、（２０）に記載の方法。
（２３）上記トランスチレチンアミロイド病が家族性アミロイド心筋症である、（２０）に記載の方法。
（２４）上記トランスチレチンアミロイド病が老人性全身性アミロイド症である、（２０）に記載の方法。
（２５）上記ジフルニサル類似体がジフルニサルと比較して減少又は消失したＮＳＡＩＤ活性を有する、（２０）に記載の方法。
（２６）上記ジフルニサル類似体がジフルニサルと比較して減少又は消失したシクロオキシゲナーゼ阻害剤活性を有する、（２０）に記載の方法。
（２７）トランスチレチンアミロイド病の治療方法であって、トランスチレチンアミロイド病と診断された被験者に、トランスチレチンテトラマーの解離を防止するポリ塩化ビフェニルの治療有効量を投与することを含む前記治療方法。
（２８）上記ポリ塩化ビフェニルが、トランスチレチンテトラマーの天然状態の動力学的安定化によりトランスチレチンテトラマーの解離を防止する、（２７）に記載の方法。
（２９）上記ポリ塩化ビフェニルがヒドロキシル化ポリ塩化ビフェニルである、（２７）に記載の方法。
（３０）上記トランスチレチンアミロイド病が家族性アミロイド多発性神経障害である、（２７）に記載の方法。
（３１）上記トランスチレチンアミロイド病が家族性アミロイド心筋症である、（２７）に記載の方法。
（３２）上記トランスチレチンアミロイド病が老人性全身性アミロイド症である、（２７）に記載の方法。

【0032】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求項から明らかにされる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】Ｆｉｇ．１は、トランスチレチンのＴ４結合部位を示す概略図である。

【図2】Ｆｉｇ．２Ａ及び２Ｂは、異なる阻害剤の存在下でのトランスチレチンの展開（折り畳まれていない状態）の時間経過を示すグラフである。

【図3】Ｆｉｇ．３Ａ及び３Ｂは、異なる阻害剤の存在下でのフィブリル形成の時間経過を示すグラフである。

【図4】Ｆｉｇ．４Ａ及び４Ｂは、異なる阻害剤の存在下でのフィブリル形成の時間経過を示すグラフである。

【図5】Ｆｉｇ．５は、血漿中のトランスチレチンへの結合に関してスクリーニングしたポリ塩化ビフェニルの構造を示す。

【図6】Ｆｉｇ．６は、ヒドロキシル化ポリ塩化ビフェニルの構造を示し、血漿中のトランスチレチンへのヒドロキシル化ポリ塩化ビフェニルの結合を、それらのアミロイドフィブリル阻害特性と共にインビトロで評価した。

【図7】Ｆｉｇ．７は、ベンゾオキサゾール化合物によるトランスチレチンフィブリル形成の抑制を示すグラフである。ベンゾオキサゾール上のカルボキシルの位置は左側に示されているが、Ｃ（２）フェニル環は下に沿って示されている。バーはパーセントフィブリル形成（ｆｆ）、すなわち、阻害剤の非存在下でトランスチレチンにより形成された量（これは１００％と定義される）に対して、ベンゾオキサゾール化合物（７．２μＭ）の存在下でトランスチレチン（３．６μＭ）から形成されたフィブリルの量を示す。

【図8】Ｆｉｇ．８は、ヒト血漿中でインキュベートした後にトランスチレチンに結合したベンゾオキサゾールの化学量（ｓ）を示すグラフである。樹脂結合抗体による免疫沈降を用いてトランスチレチンを捕獲した。トランスチレチンを樹脂から遊離させた後、トランスチレチン及び阻害剤の量を、ＨＰＬＣクロマトグラム中のそれらのピーク下の面積から定量した。ｓの最大可能な値は２である。化合物番号は底部の軸に沿って示されている。細い縦線は測定誤差を示す。

【図9】Ｆｉｇ．９は、時間（ｔ）の関数としての、阻害剤を含まないか、又は３．６μＭの化合物２０、２１若しくは２７又は１．８μＭの化合物２０の存在下の６Ｍ尿素中でのｗｔトランスチレチン（１．８μＭ）の解離を示すグラフである。

【図10】Ｆｉｇ．１０は、トランスチレチンに結合した化合物２０のＸ線共結晶構造を示す。異なるサブユニット中の同等な残基はダッシュ付き及びダッシュ無しの残基番号で区別され、ハロゲン結合ポケット対でそうしたのと同様である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

発明の詳細な説明
少なくとも幾つかのアミロイド病は、２０種を超える非相同タンパク質又はタンパク質断片の何れか一つの沈着によって引き起こされるように思われ、究極的にはクロス-β-シート四次構造を与える。トランスチレチンのように正常に折り畳まれたタンパク質からのアミロイドフィブリルの形成は、集合成分の中間体を生成するタンパク質の誤った折り畳みを必要とする。トランスチレチン（ＴＴＲ）アミロイド生成の過程は、三つの異なるアミロイド病 -- 老人性全身性アミロイド症（ＳＳＡ）、家族性アミロイド多発性神経障害（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）を引き起こすように思われる。ＳＳＡは野生型トランスチレチンの沈着に関連する一方で、ＦＡＰ及びＦＡＣは８０種を超えるＴＴＲ変異体の一つのアミロイド生成により引き起こされる。例えば、Colon, W.; Kelly, J. W. Biochemistry 1992, 31, 8654-60; Kelly, J. W. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996, 6, 11-7; Liu, K.; et al. Nat. Struct. Biol. 2000, 7, 754-7; Westermark, P.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990, 87, 2843-5; Saraiva, M. J.; et al. J. Clin. Invest. 1985, 76, 2171-7; Jacobson, D. R.; et al. N. Engl. J. Med. 1997, 336, 466-73; Buxbaum, J. N.; Tagoe, C. E. Ann. Rev. Med. 2000, 51, 543-569; 及び Saraiva, M. J. Hum. Mutat. 1995, 5, 191-6 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【0035】

ＴＴＲは２,２,２対称を特徴とする５５ｋＤのホモテトラマーであり、ダイマー-ダイマー界面に二つの同一のロート状結合部位を有し、これらの部位において、チロイドホルモン（Ｔ４）は血漿及びＣＳＦ中で結合することができる。ＴＴＲはホロレチノール結合タンパク質の１当量未満に典型的に結合する。テトラマーがモノマーに解離した後のモノマー内での三次構造変化を含むＴＴＲの誤った折り畳みは、タンパク質の集合ミスを可能にし、究極的にはアミロイドを与える。ＦＡＰに対して利用可能な治療は、血中の変異体ＴＴＲを野生型（ＷＴ）タンパク質で置き換える肝臓移植術により媒介される遺伝子療法を採用する。このアプローチは、ＷＴ ＴＴＲが沈着し続けるのでＦＡＣに対しては有効とは思われず、ＷＴ ＴＴＲ沈着の過程が原因であるように見えるＳＳＡの治療にも有用ではないだろう。また、肝臓移植療法は、脳軟膜中にアミロイドフィブリルを沈着し、ＣＮＳ疾患を招く約１０種のＴＴＲに対しても、このＴＴＲが脈絡叢により合成されるので、失敗するだろう。それ故に、一般的な非侵入的な薬剤に基づく治療方策を開発することが望ましい。この薬剤は、基礎が非タンパク質、非ペプチド又は非核酸であることが望ましいことがある。例えば、Blake, C. C.; et al. J. Mol. Biol. 1978, 121, 339-56; Wojtczak, A.; et al. Acta Crystallogr., Sect. D 1996, 758-810; Monaco, H. L.; Rizzi, M.; Coda, A. Science 1995, 268, 1039-41; Lai, Z.; Colon, W.; Delly, J. W. Biochemistry 1996, 35, 6470-82; Holmgren, G.; et al. Lancet 1993, 341, 1113-6; Suhr, O. B.; Ericzon, B. G.; Friman, S. Liver Transpl. 2002, 8, 787-94; Dubrey, S. W.; et al. Transplantation 1997, 64, 74-80; Yazaki, M.; et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 274, 702-6; 及び Comwell, C. G. III; et al. Am. J. of Med. 1983, 75, 618-623 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【0036】

トランスチレチンアミロイドフィブリル形成を阻害するジフルニサル類似体の合成
アミロイドフィブリル形成を招くＴＴＲの誤った折り畳みは、テトラマーのＴ４媒介安定化により防止することができる。テトラマー安定剤の幾つかの構造豊富なファミリーは、ＴＴＲ内の一方又は両方のＴ４部位に結合してアミロイド症を予防し、ホルモンＴ４の起こりそうな副作用がない。これらのテトラマー安定化化合物は、幾つかの非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）、例えばフルフェナミン酸、ジクロフェナク、フルルビプロフェン及びジフルニサルを含み、これらは基底状態の結合及び安定化によってテトラマー解離に関連する動力学的バリアを増強することにより機能するように思われる。ＴＴＲは血漿中のＴ４の二次的運搬体であるので、ＴＴＲのＴ４結合能の９５％より多くは利用されないままであり、これらの部位を標的にするテトラマー安定化化合物の投与を可能にする。ジフルニサルはシクロオキシゲナーゼ-２であるので、長期投与は胃腸の副作用を招くことがある。従って、減少又は消失したＮＳＡＩＤ活性を有するが、血漿中のＴＴＲに対して高親和性を有するジフルニサル類似体が望ましい。この目標に向けた第一段階は、ジフルニサル類似体をアミロイドフィブリル形成の阻害剤として設計及び合成することである。例えば、Miroy, G. J.; et al. Proc. Sci. U. S. A. 1996, 93,15051-6; Klabunde, T.; et al, Nat. Struct. Biol. 2000, 7, 312-21; Baures, P. W.; Peterson, S. A.; Kelly, J. W. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1389-4-1; Petrassi, H. M.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2178-2192; Baures, P. W.; et al. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1339-47; Sacchettini, J. W. Nat. Rev. Drug Disc. 2002, 1, 267-275; Oza, V. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-32; Bartalena, L. Clin. Lab. Med, 1993, 13, 583-98; Aldred, A. R.; Brack, C. M.; Schreiber, G. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 1995, 111, 1-15; 及び Mao, H. Y.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 10429-10435 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【0037】

ＴＴＲテトラマーのサブユニットは三つの直交するＣ_２-軸により関連付けられる。図１は、トランスチレチンのＴ４結合部位の概略描写であり、阻害剤カルボキシレートがＬｙｓ １５及びＬｙｓ １５’ のε-アンモニウムとの静電相互作用に関与する前部結合モードを示す。四次構造の界面により作られた二つの同等なＴ４結合部位は、対称の結晶Ｃ_２ 軸に対して直交する二つのＣ_２ 軸によって相互に交換される。各Ｔ４結合部位は内部及び外部結合キャビティに分類することができる。例えば、Blake, C. C.; Oatley, S. J. Nature 1977, 268, 115-20参照、これは全体として参照により組み入れられる。内部結合キャビティは、１対のハロゲン結合ポケット（ＨＢＰ）、すなわちＨＢＰ３及びＨＢＰ３’ で表されるものを含み、これらはＬｅｕ １７、Ａｌａ １０８、Ｖａｌ １２１及びＴｈｒ １１９の側鎖により作られる。各サブユニットからの四つのＳｅｒ １１７側鎖の収束は、最も奥の領域及び二つの同一結合部位間の界面を定める。Ｓｅｒ １１７ヒドロキシル基は、化合物（例えば、アミロイド形成の阻害剤）上の補完性官能基への水素結合供与体又は受容体として役立つことができるか、又は水分子によって該化合物との静電相互作用を媒介することができる。外部結合部位はＨＢＰ１及び１’ からなる一方で、ＨＢＰ２及び２’ は内部及び外部結合部位の界面に位置している。Ｌｙｓ １５及びＬｙｓ １５’ のε-アンモニウム基は外部結合キャビティの最も外側の距離を定め、化合物上のアニオン性置換基との静電相互作用を可能にする。ＴＴＲテトラマー安定化化合物の多くは前部結合モードで結合し、このモードでは、外部結合ポケットに位置する親水性フェニル環上のアニオン性置換基がＬｙｓ １５のε-アンモニウム基との静電相互作用に従事する。前部結合モードにおいて、疎水性フェニル環（しばしばハロゲンで置換されている）は、内部結合ポケットを占めることができる。しかしながら、反対方向の結合（背部結合モード）の例も観察された。背部結合モードにおいて、親水性芳香族環は内部キャビティに位置することができ、カルボキシレートがＳｅｒ １１７及びＳｅｒ １１７’ と水素結合するのを可能にする。背部結合モードにおいて、ハロゲン置換疎水性環は、外部キャビティに位置することができる。

【0038】

ジフルニサルはＴＴＲの酸媒介アミロイド生成を減少することができる。ジフルニサルの構造（実施例２参照）は、ＴＴＲアミロイド生成を阻害できる新規化合物の設計のための基礎として使用することができる。例えば、Verbeeck, R. K.; et al. Biochem. Pharm. 1980. 29, 571-576; 及び Nuernberg, B.; Koehler, G.; Brune, K. Clin. Pharmacokin. 1991, 20, 81-89 参照。

【0039】

上記化合物は式：

【化1】

【0040】

を有することができ、
式中、Ａｒ^１はアリール又はヘテロアリール基であり、Ａｒ^１はハロ、-Ｒ^１、-ＯＲ^１、-ＯＣ(=Ｏ)Ｒ^１、-ＯＣ(=Ｏ)ＯＲ^１、-ＯＣ(=Ｏ)ＮＨＲ^１、-ＳＲ^１、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ^１、-Ｓ(=Ｏ)_２Ｒ^１、-Ｃ(=Ｏ)Ｒ^１、-ＣＯ_２Ｒ^１、-Ｃ(=Ｏ)ＮＨＲ^１、-ＮＲ^１Ｒ^２、-ＮＨＣ(=Ｏ)Ｒ^１、-ＮＨＣ(=Ｏ)ＮＨＲ^１、-ＮＨＣ(=Ｏ)ＯＲ^１又は-ＮＨＳ(=Ｏ)_２Ｒ^１の１個以上で場合により置換されており、
Ａｒ^２はアリール又はヘテロアリール基であり、Ａｒ^２はハロ、-Ｒ^１、-ＯＲ^１、-ＯＣ(=Ｏ)Ｒ^１、-ＯＣ(=Ｏ)ＯＲ^１、-ＯＣ(=Ｏ)ＮＨＲ^１、-ＳＲ^１、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ^１、-Ｓ(=Ｏ)_２Ｒ^１、-Ｃ(=Ｏ)Ｒ^１、-ＣＯ_２Ｒ^１、-Ｃ(=Ｏ)ＮＨＲ^１、-ＮＲ^１Ｒ^２、-ＮＨＣ(=Ｏ)Ｒ^１、-ＮＨＣ(=Ｏ)ＮＨＲ^１、-ＮＨＣ(=Ｏ)ＯＲ^１又は-ＮＨＳ(=Ｏ)_２Ｒ^１の１個以上で場合により置換されている。

【0041】

各Ｒ^１は独立して、水素、又は置換若しくは非置換のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール基である。

【0042】

各Ｒ^２は独立して、水素、又は置換若しくは非置換のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール基である。

【0043】

一定の状況において、Ａｒ^１は置換又は非置換のフェニルであってよい。Ａｒ^２は独立して、置換又は非置換のフェニルであってよい。Ａｒ^１及びＡｒ^２は同時に置換又は非置換のフェニルであってよい。置換基はフルオロ、クロロ、ヒドロキシ、-ＣＯ_２Ｈ、-ＣＯ_２Ｍｅ、-ＯＭｅ、-ＣＨ_２ＯＨ又はホルミルであってよい。Ｒ^１は低級アルキルであってよい。

【0044】

本化合物は、無機又は有機の酸及び塩基から誘導される薬学的に許容される塩の形態で使用することができる。このような酸塩には、次のものが含まれる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスバラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンフォスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコペンタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３-フェニル-プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート及びウンデカン酸塩。塩基塩は、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム及びカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム及びマグネシウム塩、有機塩基との塩、例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ-メチル-Ｄ-グルカミン、並びにアミノ酸、例えばアルギニン、リジンその他との塩を含む。また、塩基性窒素含有基は、ハロゲン化低級アルキル、例えば塩化、臭化及びヨウ化メチル、エチル、プロピル及びブチル；硫酸ジアルキル、例えば硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル及びジアミル、長鎖ハロゲン化物、例えば塩化、臭化及びヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチル及びステアリル、ハロゲン化アラルキル、例えば臭化ベンジル及びフェネチルその他のような物質で四級化することができる。これによって、水又は油に溶解又は分散する生成物が得られる。

【0045】

本化合物は、ＴＴＲテトラマーを安定化することができ、かつＴＴＲアミロイドの形成を阻害することができる。本化合物は、僅かな構造的変化を特徴とするジフルニサルの類似体であってよい。本化合物は、それらがＴＴＲアミロイド阻害に関与するので、構造-活性相関関係を評価するために使用することができる。置換パターン、並びにハロゲン、カルボキシレート、アシル、アルコキシ及びヒドロキシルを含む置換基の数は変動することができる。他のクラスの化合物からの構造-活性データは、カルボキシレート置換基又は類似のアニオン性基若しくはＨ結合基が重要であるように思われ、多分、Ｌｙｓ １５及び１５’ のε-アンモニウム基との静電相互作用、又はＳｅｒ １１７及び１１７’ との水素結合相互作用に関与する一方で、ハロゲン置換疎水性環はＴＴＲのハロゲン結合ポケットを補完することが明らかにする。２-フルオロ-、４-フルオロ-、３,５-ジフルオロ-、２,４-ジフルオロ-及び２,６-ジフルオロ-を含む、フッ素及び塩素の両方で置換されたアリールを評価することができる。ヨウ素置換アリール基は、チロキシン作用剤としての作用に対するそれらの不安定性及び潜在性のためにあまり望ましくないだろう。カルボキシレート（アニオン性）置換基は、フィブリル阻害及び血漿結合選択性に対するその影響を評価するための幾つかの類似体には、存在していなくてもよい。アルデヒド又はアルコール官能基を有する化合物は、結合選択性及びアミロイドフィブリル阻害に対する非荷電水素結合受容体及び供与体の影響を評価するために合成することができる。アルデヒドのgem-ジオール形態が本質的な結合の種であってよい。

【0046】

一般的に、本化合物は当業者に公知の方法により合成することができる。本化合物を合成する一つの方法は、Suzukiカップリングである：

【化2】

【0047】

例えば、フェニルボロン酸とブロモベンゼン又はヨードベンゼンとの Suzukiカップリングにより、ビフェニル化合物を形成することができる。化合物の製造中に副生物の形成を避けるために、適切な保護基が必要なことがある。例えば、アミノ置換基は、好適なアミノ保護基、例えばトリフルオロアセチル又はtert-ブトキシカルボニルにより保護することができる。他の保護基及び反応条件は、T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, (3rd, 1999, John Wiley & Sons, New York, N. Y.) に見出すことができる。

【0048】

医薬組成物
本明細書に記載した化合物（例えば、ジフルニサル類似体、ポリ塩化ビフェニル又はベンゾオキサゾール）は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直量に、鼻に、頬側に、膣に又は移植したリザーバーを介して投与できる医薬組成物に製剤化することができる。本明細書で用いられるように、「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝臓内、病巣内及び頭蓋内の注射又は注入技術を含む。

【0049】

医薬組成物は、任意の本化合物又はその薬学的に許容される誘導体を、薬学的に許容される任意の担体と一緒に含むことができる。本明細書で用いられるように、「担体」という用語は、許容される助剤及びビヒクルを含む。本発明の医薬組成物に使用できる薬学的に許容される単体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックコポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含むが、これらに限定されるものではない。

【0050】

医薬組成物は、滅菌注射用調製物、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液の形態にあってよい。この懸濁液は、当技術分野で公知の技術により、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて製剤化することができる。また、滅菌注射用調製物は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶剤中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であってよく、例えば１,３-ブタンジオール中の溶液として存在することができる。許容されるビヒクル及び溶剤の中で、採用できるものは、水、リンゲル液、及び等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌硬化油が溶剤又は懸濁媒質として一般的に採用される。この目的で、合成モノ-又はジ-グリセリドを含む全ての銘柄の硬化油を採用することができる。脂肪酸、例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体は注射用製剤の製造に有用であると同時に、薬学的に許容される天然油、例えばオリーブ油又はヒマシ油は特にそれらのポリオキシエチル化物として有用である。また、これらの油性溶液又は懸濁液は長鎖アルコール希釈剤又は分散剤を含有することができる。

【0051】

医薬組成物は、全ての経口投与可能な用量形態で投与することができ、用量形態は、カプセル、錠剤、巣姿勢懸濁液又は溶液を含むが、これらに限定されるものではない。経口使用のための錠剤の場合、慣用される担体は乳糖及びトウモロコシ澱粉を含む。滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも典型的に添加される。カプセル形態での経口使用のために、有用な希釈剤は乳糖及び乾燥トウモロコシ澱粉を含む。経口使用のために水性懸濁液が必要な場合には、活性成分は乳化剤及び懸濁剤と混合される。所望ならば、一定の甘味料、香味剤又は着色剤を添加することもできる。

【0052】

別法として、医薬組成物は直腸投与のために坐剤の形態で投与することができる。これらは、薬剤を、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って直腸内で溶融して薬剤を放出する、好適な非刺激性賦形剤と混合することにより製造することができる。このような材料は、カカオ脂、蜜蝋及びポリエチレングリコールを含む。

【0053】

また、医薬組成物は、治療の標的が局所適用により容易に到達できる部分又は器官を含む場合には特に、局所的に投与することができ、眼、皮膚又は腸管下部の疾患を含む。好適な局所用製剤は、これらの部分又は器官のそれぞれのために容易に製造される。

【0054】

胃腸管下部のための局所適用は、直腸坐剤製剤（上記参照）又は好適な浣腸製剤として行うことができる。局所的経皮貼付剤を使用することもできる。

【0055】

局所適用のために、医薬組成物は、１種以上の担体中に懸濁又は溶解した活性成分を含む好適な軟膏中に製剤化することができる。本化合物の局所適用のための担体は、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン配合物、乳化ワックス及び水を含むが、これらに限定されるものではない。別法として、医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容される担体中に懸濁又は溶解した活性成分を含む好適なローション又はクリーム中に製剤化することができる。好適な担体は、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セタリルアルコール、２-オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を含むが、これらに限定されるものではない。

【0056】

眼科使用のために、医薬組成物は、塩化ベンザルコニウムのような保存剤を用いるか又は用いることなく、等張性のｐＨ調節した滅菌食塩水中の微粒懸濁液として、又は好ましくは等張性のｐＨ調節した滅菌食塩水中の溶液として製剤化することができる。別法として、眼科使用のために、医薬組成物はワセリンのような軟膏中に製剤化することができる。

【0057】

また、医薬組成物は、鼻エアゾール、又は噴霧器、ドライパウダー吸入器若しくは計量式吸入器の使用による吸入によって投与することができる。このような組成物は、医薬製剤の分野で周知の技術により製造され、そしてベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、生物学的利用率を高める吸収促進剤、フッ化炭素、及び／又は他の慣用の可溶化剤又は分散剤を採用して、食塩水中の溶液として製造することができる。単回投与形態を製造するために担体材料と混合できる活性成分の量は、治療されるホスト、及び特定の投与方式に応じて変動するだろう。しかしながら、任意の個々の患者のための特定の用量及び治療計画は、採用する特定化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、ダイエット、投与時間、排泄速度、薬剤併用、並びに治療医師の判断及び治療される個々の疾患の重症度を含む種々の要因に依存すると考えるべきである。また、活性成分の量は、もしあるとすれば、上記成分と共に併用投与される治療剤又は予防剤に依存することがある。

【0058】

医薬組成物の有効量は、治療される患者に対して治療効果を与えるために必要とされる量であり、種々の要因、例えば阻害剤の性質、患者のサイズ、治療目標、治療すべき病理学的性質、使用される特定の医薬組成物、及び治療医師の判断に依存するだろう。参考のため、Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 1966, 50, 219 及び Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537 参照。１日当たり約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、１日当たり約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物の投与レベルが有用であろう。

【実施例】

【0059】

下記は本発明の実施例である。それらが本発明の範囲を限定するとは決して解釈してはならない。

【0060】

実施例１： タンパク質の誤った折り畳みのエネルギー量の変化によるトランスチレチンアミロイド病の予防
アミロイド症を含む数百のヒトの疾患は、タンパク質の誤った折り畳みに関連している。８０の家族性突然変異体であって、トランスチレチン（ＴＴＲ）アミロイド病理を悪化させるもの［例えば、Ｖａｌ ３０→Ｍｅｔ ３０（Ｖ３０Ｍ）及びＬｅｕ ５５→Ｐｒｏ ５５（Ｌ５５Ｐ）］、又は改善するもの［Ｔｈｒ １１９→Ｍｅｔ １１９（Ｔ１１９Ｍ）］は、貴重な力学的洞察を提供する。これまでに特性決定された全ての疾患関連突然変異体は、ＴＴＲテトラマーを不安定化し、そして多くは律速テトラマー解離の速度に影響を与え、速い速度はアミロイド症を促進し、遅い速度は遅らせる。我々は、Ｔ１１９ＭがＶ３０Ｍ複合ヘテロ接合体における疾患を予防する機構を利用して、小分子ＴＴＲアミロイド阻害剤を開発した。これらの阻害剤は、初期の誤った折り畳みのイベント（テトラマー解離）が部分的なモノマー変性にとって必要であり、アミロイド及び他の凝集物への集合ミスを可能にすることを劇的に示した。

【0061】

トランス抑制の機構をより良く理解するために、ハイブリッドテトラマーを単離した。Ｖ３０Ｍ［又はＬ５５Ｐ］に対して増加したＴ１１９Ｍサブユニット化学量は、酸媒介フィブリル形成の最大をより低いｐＨにシフトさせ、生理的に利用可能なｐＨ（＞０．４）におけるアミロイドの全体的生成率を増加させ、そして酸誘導（ｐＨ４．４）及びメタノール媒介アミロイド生成の速度を減速た。幾つかの小分子ＴＴＲアミロイドフィブリル阻害剤を発見し、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可された２種の薬剤（阻害剤８及び１０）を含めて、そのサブセットをここで研究した (Sacchettini et al., Nature Rev. Drug Discovery 1, 267 (2002))。野生型（ＷＴ）ＴＴＲフィブリル形成の生成率及び速度に対する小分子阻害剤結合の影響は、Ｔ１１９Ｍサブユニット取り込みに対する影響と同様であった。しかしながら、フィブリル形成にとってより低い最適ｐＨへのシフトは、全ての阻害剤で観察されなかった。これらの阻害剤は、モノマーよりはむしろ、ＴＴＲテトラマー内の二つの同等なチロキシン（Ｔ４）部位に結合することによって機能する。

【0062】

遅い四次構造変化を解離速度の５×１０^５倍の速度を有する展開（折り畳まれていない状態）への遷移に関連付けることにより、テトラマー解離速度を測定した (Hammarstroem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 16427 (2002))。変性で検出した解離は、使用した尿素の濃度（＞６．０Ｍ）が再折り畳みを支持しないので、非可逆的である。Ｖ３０Ｍ［又はＬ５５Ｐ］サブユニット対して増加したＴ１１９Ｍサブユニット化学量は、３種の異なる変性環境（酸性ｐＨ、水性メタノール又は尿素）において、劇的なＴＴＲ（１．８μＭ）テトラマー解離速度の低下（アミロイド生成にとって律速的）を明らかにし、疾患予防の起源を説明した。

【0063】

阻害剤６〜１０（１．８及び３．６μＭ）の存在下でのＷＴ ＴＴＲテトラマー（１．８μＭ）解離速度の測定値は、全てのＴＴＲ-阻害剤複合体に関して用量依存的減速を示した。テトラマー解離の初期速度は、二つの阻害剤に結合したモル分画（Ｔ・Ｉ_２）にほぼ逆比例した。阻害剤６、７及び９（１．８μＭ）の場合、単一指数関数の幅は、リガンドのないテトラマー（及び少ない程度まではＴ・Ｉ）の解離と主に相関関係があり、Ｔ・Ｉ_２ が６Ｍ尿素中でテトラマー解離を防止したことを暗示した。これとは対照的に、阻害剤８及び１０に関してＴ・Ｉ及びＴ・Ｉ_２ の形成は、テトラマーが尿素中で解離するのを実質的に保護せず、結合だけでは不十分であることを明らかにした。阻害剤６、７及び９（３．６μＭ）の場合に観察された効果的な阻害は、結合エネルギーが、Ｔ・Ｉ_２ 複合体を２．３ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える自由エネルギー量だけ安定化した結果であった（デルタ G1 = RT ln([T・I]/[T]) = RT ln([I]/[Kd1]) 及びデルタ G2 = R T ln([T・I₂]/[T]) = RT ln{([I]2/[Kd1 ^*Kd2] )}）。Ｔに対して２．７ｋｃａｌ/ｍｏｌだけＴ・Ｉ_２ を安定化することは、ＴＴＲテトラマー解離速度が２程度に減速すると解釈されるだろう。阻害剤８及び１０(３．６μＭ)の強い負共同的結合は、第二部位への結合（Ｔ・Ｉ_２、μＭ解離定数）が第一部位への結合（Ｔ・Ｉ）に対してＴＴＲをさらに安定化しないだろうことを決定付ける。阻害剤６、７及び９のｎＭ解離定数（Ｋｄ１及びＫｄ２）は、これらの阻害剤が解離的遷移状態に結合せず、かつこの状態を同様に安定化しなかったならば、基底状態安定化（＞２．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が、ＴＴＲテトラマー解離に対する活性化バリアを実質的に増大するのに十分であることを保証するだろう。また、Ｔ・Ｉ_２ 及びＴ・Ｉ複合体からの阻害剤の解離速度は、阻害剤６、７及び９の効力において役割を演じることができるだろう。阻害剤で飽和されたＴＴＲテトラマーを抗体樹脂により固定化し、その上に水性緩衝液を５．０ｍｌ／分で通過させ、阻害剤６〜１０の有効解離速度を評価した。最良の阻害剤は、最低の見かけ解離速度を有するものであった。

【0064】

阻害剤の存在下でのアミロイド生成速度（酸性条件）とテトラマー解離速度（尿素中）との間には一般的に極めて良好な相関関係があるが、これが事実である必要はない。アミロイド生成には、解離後の濃度依存性の誤った折り畳みが必要である。従って、フィブリル形成の防止において、阻害剤がモノマーアミロイド生成中間体の濃度を低く保つことができ（＜３．６μＭ）、フィブリル形成が極めて非効率的である場合には特に、小分子はフィブリル形成の防止においてテトラマーよりも一般的にいっそう効果的であろう。時として、尿素中で測定したテトラマー解離速度は、酸性条件下での阻害剤効力の順位を正確に予測しないだろう。例えば、ＦＤＡ認可薬剤ジフルニサル（８）は、テトラマー解離阻害剤よりもはるかに良好なアミロイド阻害剤であった。この観察に対するありそうな説明は、Ｋｄ１及び／又はＫｄ２が尿素中でよりも酸中で低いということである（１８）。加えて、幾つかの阻害剤は、生理的条件化で測定したそれらの結合定数が示唆するだあろうよりも変性条件下ではるかに良好に機能する。例えば、化合物９は、テトラマー解離（尿素）及びフィブリル形成（酸）の防止において、阻害剤９が阻害剤７のそれぞれ１０倍及び８３倍のＫｄ１及びＫｄ２値（生理的条件下で測定）を有したにも拘らず、阻害剤７よりも効率的であったか又はそれと等しかった。従って、生理的条件下だけではなく、種々の変性条件下での誤った折り畳みの阻害剤の効力を判断することが重要である。

【0065】

そのほかの点では疾患関連サブユニットからなるテトラマー中へのＴ１１９Ｍトランスサプレッサの取り込みは、テトラマー基底状態を遷移状態よりも大きな程度で安定化することにより（小分子阻害剤による場合のように）、そして／又は解離の遷移状態を不安定化することにより、テトラマー解離速度を減速することができるだろう。これらの可能性を区別するために、我々は、ＷＴ及びＴ１１９Ｍホモテトラマーの再構築速度を比較した。Ｔ１１９Ｍモノマーの再折り畳みは迅速であり、そしてＷＴ ＴＴＲモノマーの折り畳み速度の誤差範囲内であった。しかしながら、Ｔ１１９Ｍの折り畳まれたモノマーの再集合は、尿素希釈により開始したＷＴ ＴＴＲモノマーのテトラマー化よりも２程度だけ遅かった。再集合過程は二相性であり、これは集合経路に観測可能な中間体（おそらくダイマー）が存在することによって説明することができる。反対方向では、Ｔ１１９ＭテトラマーはＷＴ ＴＴＲテトラマーにより示された速度の１／３７で解離する。この動力学的効果を、四次構造の安定性及び／又はテトラマーの安定性に帰することはできない。ＷＴ及びＴ１１９Ｍモノマーの熱力学的安定性の直接比較（工学的に作成したモノマーＴＴＲ構築物（Ｍ-ＴＴＲ）を採用）は、展開（折り畳まれていない）状態に関する自由エネルギーデルタ・デルタＧの差が僅かに０．４ｋａｌ／ｍｏｌであり、それぞれ解離及び集合速度の差を説明するために必要であった２．１及び２．７ｋａｌ/ｍｏｌよりもはるかに低いことを明らかにした。Ｔ１１９Ｍ及びＷＴ ＴＴＲの熱力学的サイクル分析は、Ｔ１１９Ｍが、解離の遷移状態を約３．１ｋａｌ/ｍｏｌだけ不安定化することによって防止し、テトラマーの安定化によるのではないことを明らかにした。この分析によれば、Ｔ１１９ＭテトラマーはＷＴに対して０．９ｋａｌ/ｍｏｌだけ実際に不安定化され、動力学的安定化機構がさらに支持される。ＷＴ及びＴ１１９Ｍテトラマー解離の間の自由エネルギーの差は、尿素媒介の展開によっては測定することができない。なぜならば、尿素中でのＴ１１９Ｍの解離には著しく長いインキュベーション期間（数週間）を必要とし、その間にＴＴＲが修飾されるようになるからである。グアニジニウムクロリド（ＧｄｍＣｌ）及びグアニジニウムチオシアネート（ＧｄｍＳＣＮ）変性曲線の比較は、ＷＴ ＴＴＲがＧｄｍＣｌ変性に対してＴ１１９Ｍよりも抵抗性であった一方で、ＧｄｍＳＣＮ中ではその逆が真実であったことを明らかにした。変性の中間点でのこれらの差は、差別的なアニオン安定化に帰することができ、これらのタンパク質の真の熱力学的安定化は、これらのカオトロープでは定量分析が不可能であるが、極めて類似していることを示唆する。

【0066】

Ｔ１１９Ｍトランス抑制は、解離的遷移状態の不安定化によって主としてに媒介され、Ｔ１１９Ｍがダイマー-ダイマー界面に存在することと一致する。解離的遷移状態のエネルギーが３．１ｋａｌ/ｍｏｌだけ増加すると、活性化バリアが乗り越えられないようになる（解離半減期ｔ１／２が約４２時間から＞１５００時間に増加する）ので、テトラマーの解離を防止する。小分子の結合は用量依存性の様式でテトラマーの解離に関連する活性化バリアを同様に増加させるが、これはテトラマーの安定化（遷移状態の安定化に対して）によって媒介される。安定化の程度は、小分子の解離定数Ｋｄ１及びＫｄ２が可能な限り低く、かつ阻害剤の濃度が可能な限り高い場合に最大である。基底状態の安定化に関する我々の実験で使用した濃度は、多数の経口使用可能な薬剤について血漿中で観察された濃度と比較可能である。

【0067】

小分子結合及びトランス抑制は、ＴＴＲフィブリル形成の律速段階であるテトラマーの解離に関連する活性化エネルギーを増加させる。この類似性を確立することは、トランス抑制がＶ３０Ｍ複合ヘテロ接合体における疾患を予防することが知られているので、重要である。天然状態の動力学的安定化は、誤った折り畳まれた小さいオリゴマーが神経毒性であるという新たに生じた証拠を考慮すると、特に魅力的な方策である。誤った折り畳みの傾向が強い他の病理関連タンパク質のエネルギー展望を調整するための、小分子阻害剤の発見及びトランス抑制アプローチの開発を、今や考えるべきである。

【0068】

実施例２： ジフルニサル類似体はトランスチレチンの天然状態を安定化し、かつトランスチレチンアミロイドフィブリル形成の阻害剤である
ジフルニサル（１）はトランスチレチン（ＴＴＲ）アミロイド生成を減速することができる。例えば、一定の条件（例えば、３．６μＭ ＴＴＲ、３．６μＭジフルニサル、ｐＨ４．４、７２時間、３７℃）において、ジフルニサルはＴＴＲアミロイド生成を６３％だけ減速する。これらの条件において、ジフルニサル濃度を倍増（７．２μＭに）すると、アミロイド生成を９７％だけ減速する。ジフルニサルは、今日までに報告された良好なアミロイドフィブリル阻害剤の一つであり、経口投与したジフルニサルは生物学的利用率が高く、毎日２回２５０ｍｇの用量で１００μＭを超える持続した血漿濃度を与える。ジフルニサルはシクロオキシゲナーゼ-２阻害剤であるので、長期投与は胃腸副作用をもたらすことがある。それ故に、減速又は消失したＮＳＡＩＤ活性を有するが血漿中でＴＴＲに対して高親和性を有するジフルニサル類似体が、場合により望ましい。従って、ジフルニサルの構造を、ＴＴＲアミロイド生成を阻害できる新規化合物を設計するための基礎として使用することができる。例えば、Verbeeck, R. K.; et al. Biochem. Parm. 1980, 29, 571-576; 及び Nuernberg, B.; Koehler, G.; Brune, K. Clin. Pharmacokin. 1991, 20, 81-89 参照。

【0069】

ジフルニサル類似体は、ハロゲン化アリールとアリールボロン酸との間のＰｄ-媒介 Suzuki カップリングを用いて合成した。ジフルニサル類似体２〜１０の合成は、スキーム１に示すように、３-又は４-ヨードフェノールの何れかを無水酢酸及びピリジンでアセチル化し、続いて標準的な Suzuki カップリング条件下で適切なフルオロフェニルボロン酸と Suzuki カップリングさせることにより行った。Ｎａ^０及びＭｅＯＨによるエステルの除去（Zemlen 条件）は、フェノール２〜１０を与えた。例えば、Miyaura, N.; Yanagi, T.; Suzuki, A. Synth. Commun. 1981, 11, 513-519; Sharp, M. J.; Snieckus, V. Tetrahedron Lett. 1985, 26, 5997-6000; Sharp, M. J.; Cheng, W.; Snieckus, V. Tetrahedron Lett. 1987, 28, 5093-5096; Pozsgay, V.; Nanasi, P.; Neszmelyi A. Carbohydr. Re. 1981, 90, 215-231; Jendralla, H.; Chen, L.-J. Synthesis 1990, 827-833; 及び Strauss, K. Spectrochim. Acta, Part A 1981, 37, 689-692 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【化3】

【0070】

ジフルニサル類似体１１は、スキーム２に示すように、固相方法を用いて合成した。３-ヨード安息香酸をエステル結合により Wang 樹脂に結合させ、樹脂結合ヨウ化フェニルを与え、次いでこれを２,４-ジフルニサルフェニルボロン酸に結合させ、ＴＦＡ：ＣＨ_２Ｃｌ_２の１：１混合物で樹脂から切り離した。例えば、Guiles, J. W.; Johnson, S.G.; Murray, W. V. J. Org. Chem. 1996, 61, 5169-5171 参照、これは全体として参照により組み入れられる。

【化4】

【0071】

カルボキシレート含有基質１２〜２２は、スキーム４に示すように、標準的な Suzuki カップリング条件を利用してメチル−３-ブロモベンゾエート又はメチル−４-ブロモベンゾエートの何れか（両者は市販されている）と適切なフルオロフェニルボロン酸との Suzuki カップリング（上記参照）により組み立てた。次いで、エステルをＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏで鹸化して対応のカルボキシレートを与えた。例えば、Bumagin, N. A.; Bykov, V. V. Tetrahedron, 1997, 53, 14437-14450; Ananthakrishnanadar P.; Kannan, N. J. Chem. Soc., Parkin Trans. 2 1982, 1305-1308; Homsi, F.; Hiyama, T. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 5869-6872; 及び Hajduk P. J.; et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 3144-3150 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【化5】

【0072】

スキーム４に示すように、ＴＭＳ-ＣＨ_２Ｎ_２を用いて５-ヨードサリチル酸をエステル化し、ＭｅＩを採用してフェノールをメチルエーテルに変換した。保護したサリチル酸を種々のフルオロフェニルボロン酸とカップリングさせ、続いてＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ鹸化及びＢＢｒ_３脱メチル化により脱保護してサリチル酸誘導体２３〜２７を与えた。例えば、Nicolaou, K. C.; et al. Chem. Eur. J. 1999, 5, 2602-2621; 及び Chu-Moyer, M. Y.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 511-528 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【化6】

【0073】

３’,５’-ジハロ-４’-ヒドロキシ含有類似体２８〜３１は、最初に市販のブロモフェノールをメチルエーテルとして保護すること（ＭｅＩ及びＫ_２ＣＯ_３）により合成した。（メトキシカルボニルフェニル）ボロン酸との Suzuki カップリングは、完全に保護されたビフェニル基質の形成をもたらした。スキーム５に示すように、ＢＢｒ_３媒介メチルエーテル開裂及びＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏでの鹸化は、完全に官能化したジフルニサル類似体２８〜３１を与えた。

【化7】

【0074】

ジフルニサルのメチルエーテル及びメチルエステル類似体は、カルボン酸をＴＭＳ-ジアゾメタンでエステル化して３２を与え、次いで場合によりＭｅＩ及びＫ_２ＣＯ_３でエステル化し、ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏでエステルを加水分解して３３を与えることにより合成した。スキーム６参照。

【化8】

【0075】

一連のハロゲン化ビフェニル３４〜３８は、スキーム７に示すように、ヨードベンゼンと一連のハロゲン含有ボロン酸との Suzuki カップリングにより組み立てた。例えば、Patrick, T. B.; Willaredt, R. P. DeGonia, D. J. J. Org. Chem. 1985, 50, 2232-2235; Kuchar, M.; et al. Collection of Czechoslovak Chemical Communications 1998, 53, 1862-1872; Allen K. J.; Bolton R.; Williams G. H. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1983, 691-695; Nakada, M.; et al. Bull. Chem. Soc. Upn. 1989, 62, 3122-3126; 及び Weingarten, H. J. Org. Chem, 1961, 26, 730-733 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【化9】

【0076】

塩素化ビアリールアルデヒドは、スキーム８に示すように、３,５-ジクロロヨードベンゼン及び２-、３-又は４-ホルミルフェニルボロン酸の何れかを用いて組み立てた。ハロゲンを含まないアルデヒド４２〜４４は、同様に製造した。アルデヒド３９〜４１を、アセトン／水中のＫＭｎＯ_４により酸化して対応のカルボン酸４５〜４７を与えたか、又はＭｅＯＨ中のＮａＢＨ_４により還元して対応のベンジルアルコール４８〜５０を与えた、スキーム８。非塩素化アルデヒド４２〜４４をＮａＢＨ_４及びＭｅＯＨで還元して、ビフェニルベンジルアルコール５１〜５３を生成した。例えば、Song, X. P.; He, H. T.; Siahaan, T. J. Org. Lett. 2002, 4, 549-552; 及び Nicokaou, K. C.; et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9313-9323; Hashizume, H.; et al. Chem. Pharm. Bull. 1994, 42, 512-520; Indoese, A. F. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 3513-3516; Pridgen, L. N.; Snyder, L.; Prol. J. J. Org. Chem. 1989, 54, 1523-1526; Haung, C. G.; Beveridge, K. A.; Wang, P. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7676-7684; Wendeborn, S.; et al. Synlett. 1998, 6, 671-675; Stevens, C. V.; Peristeropoulou, M.; De Kimpe, N. Tetrahedron 2001, 57, 7865-7870; Tanaka, K.; Kishigami, S.; Toda, F. J. Org. Chem. 1990, 55, 2981-2983; 及び Clive, D. L. J.; Kang, S. Z. J. Org. Chem. 2001, 66, 6083-^6091 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【化10】

【0077】

３’,５’-ジフルオロホルミル-官能化ビフェニル５４及び５５は、スキーム９に示すように、３,５-ジフルオロフェニルボロン酸と２-又は３-ヨードベンズアルデヒドの何れかとのSuzuki カップリングにより合成した。他の全ての阻害剤は、同様の方法により合成し、上記で報告した。化合物１０、２１、３５、３６及び４３は、市販されている。

【化11】

【0078】

試薬及び溶剤は、Aldrich、Lancaster、Acros、Combi-Slocks、Matrix 及び Pfaltz-Bauer から購入した。ＴＨＦ及びＣＨ_２Ｃｌ_２は、Ａｌ_２ＣＯ_３上に通過させて乾燥した。他の溶剤及び試薬は営利供給業者から入手し、別に述べない限りさらに精製することなく使用した。反応は、EM Scienceから購入した蛍光指示薬で予備コートしたシリカゲル 60 F₂₅₄ プレート上の分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により監視した。ＴＬＣプレートの可視化は、ＵＶ照射、リンモリブデン酸処理、次いで熱処理又はモリブデン酸セリウムアンモニウム処理、次いで加熱により行った。フラッシュクロマトグラフィーは、集合性 からのシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）を用いて行った。本文で導き出した結論にとって不可欠である新規化合物の純度は、ＨＰＬＣにより決定した。標準相ＨＰＬＣは、Waters 600 ポンプ／コントローラ、Waters 996 発光ダイオードアレイ検出器及び Waters NovaPak シリカカラムを用いて行った。採用した溶剤系はヘキサン及び酢酸エチルであり、勾配は５０：５０のヘキサン：酢酸エチルから０：１００のヘキサン：酢酸エチルまで３０分間にわたって行った。逆相ＨＰＬＣは、Waters 600 ポンプ／コントローラ、Waters 2487 二波長検出器並びに Vydac タンパク質及びペプチド C18 カラムを用いて行った。溶剤系Ａは０．５％のトリフルオロ酢酸を含む９５：５の水：アセトニトリルであり、Ｂは０．５％のトリフルオロ酢酸を含む５：９５の水：アセトニトリルであった。勾配は１００：０のＡ：Ｂから０：１００のＡ：Ｂまで２０分間にわたり行い、１００％のＢをさらに１０分間保持した。円偏光二色性分光法は、AVIV Instruments 分光計、モデル 202SF を用いて行った。ＮＭＲスペクトルは、Varian FT NMR分光計により４００ＭＨｚのプロトン周波数で記録した。プロトン化学シフトは、別に述べない限り、内部プロトン化学シフト標準（７．２６ｐｐｍ）としてのＣＨＣｌ_３を基準にして百万分の一（ｐｐｍ）で報告される。カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）で報告される。炭素化学シフトは、別に述べない限り、化学シフト標準（７７．２３ｐｐ
ｍ）としてのＣＤＣｌ_３を基準にして百万分の一（ｐｐｍ）で報告される。全ての質量スペクトルは、The Scripps Research Institute Center for Mass Spectrometry 又は the University of Illinois Mass Spectrometry Laboratory で得た。

【0079】

化合物２〜１０はスキーム1に従って製造した。適切な酢酸-ヨードフェニルエステル（１．０当量）を十分量のトルエンに溶解して０．０５Ｍの濃度にした溶液に、フェニルボロン酸（１．１当量）をＥｔＯＨに溶解して該ボロン酸に関して０．６Ｍにした溶液を加えた。Ｎａ_２ＣＯ_３の２Ｍ水溶液を加えて、酢酸-ヨードフェニルエステルに関して０．０３Ｍの最終反応濃度にし、次いでＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（４．０ｍｏｌ％）を加えた。反応物をＡｒ下に２０時間加熱還流し、その終了時に室温に冷却し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出し、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１０：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、アセチル化ビフェニルを得た。触媒量のＮａ^０をＭｅＯＨ中のアセチル化ビフェニルの溶液に加えて、０．３Ｍの最終濃度にした。反応物をＡｒ下に室温で１２時間攪拌し、その後、Dowex 50W-X8 カチオン交換体を加えて反応混合物を中和した。樹脂を濾過し、濾液を真空濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（３：１のヘキサン：酢酸エチル）で処理して、ヒドロキシビフェニル生成物を白色固体として２２〜７５％の収率で得た。

【0080】

2',4'-ジフルオロビフェニル-3-オール(2). ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz)δ 9.63 (br s,1H), 7.54 (td,1H, J= 8.9, 6.7 Hz), 7.34 (ddd,1H, J= 11. 1, 9.2, 2.6 Hz), 7.27(m,1H), 7.17 (tdd,1H, J= 8.3, 2.6, 1.2 Hz), 6.92(m, 2H), 6.81 (ddd, 1H, J= 8.1, 2.5, 1.0Hz).¹³C NMR(DMSO-d₆, 100MHz) δ 162.8, 160.3, 157.4, 135.4, 131.8, 129.7, 119.4, 115.6, 114.9, 111.9, 104.4. HRESIMS C₁₂H₈F₂O (M-H) 計算値205.0466, 実測値205.0465. 順相HPLC保持時間: 10.5 min. 逆相HPLC保持時間: 1.3 min. > 99 ％純度。

【0081】

2',4'-ジフルオロビフェニル-4-オール(3). ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz)δ 7.49 (td, 1H,J= 9.4, 8.6 Hz), 7.34 (AA'XX', 2H,J_AA’= J_XX’ = 2.5 Hz, J_XA= 8. 7 Hz,J_X’A’= 8.5 Hz,J_X’A= 0.3 Hz,J_XA= 0.3 Hz, ν_A =ν_A'= 2934.1 Hz,ν_X =ν_X' = 2746. 2 Hz), 7.28 (ddd, 2H,J= 11. 3, 9.4, 2.6 Hz), 7.13 (dddd, 1H,J= 8.3, 7.5, 2.8, 1.0 Hz), 6.87 (AA'XX', 2H, 上記のとおり). ¹³C NMR (DMSO-d₆,100 MHz) δ 162.3, 160.0, 157.2, 131.4, 129.9, 124.8, 115.4, 111.8, 104.3. HRESIMS ：C12H8F20 (M-H) 計算値205.0464, 実測値205.0465. 順相HPLC保持時間: 11.2 min. 逆相HPLC保持時間: 12.6 min. > 98 ％純度。

【0082】

3', 5'-ジフルオロビフェニル-3-オール(8).¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz)δ 9.65 (br s,1H), 7.34(m, 2H), 7.28 (t, 1H, J= 7.9 Hz), 7.19 (tt, 1H, J= 9.1, 2.2 Hz), 7.13 (ddd, 1H, J= 7.8, 1.8, 1.0 Hz), 7.08 (t, 1H, J= 2.1 Hz), 6.86 (ddd, 1H, J= 8.0, 2.4, 1.0Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆,100 MHz) δ 162.9, 158.0, 144.1, 139.1, 130.1, 117.6, 115.7, 109.7, 102.6. HRESIMS ：C12H8F2O(M-H) 計算値205.0465, 実測値205.0468. 順相HPLC保持時間: 11.4 min. 逆相HPLC保持時間: 12.9 min. > 99 ％純度。

【0083】

3',5'-ジフルオロビフェニル-4-オール(9). ¹H NMR(CDC13, 400 MHz) δ 7.44(AA'XX', 2H, J_AA’ = J_XX’ = 3.0 Hz, J_XA= 8.0 Hz, J_X’A’ = 8.5 Hz, J_X’A= 0.7 Hz, J_XA’= 0.5 Hz, ν_A = ν_A' = 2973.8 Hz,ν_X =ν_X'-= 2766. 0 Hz), 7.05 (dtd, 2H,J= 6.6, 2.4, 0.7 Hz), 6.92 (AA'XX', 2H, 上記のとおり), 6.74 (tt, 1H, J= 8.9, 2.4 Hz), 5.11(s, 1H). ¹³C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ 164.7, 156.1, 144.2, 131.8, 128.6, 116.1, 109.6, 102.1. HRESIMS ：Cl3H8Cl2O2 (M-H) 計算値205.0465, 実測値205.0465. 順相HPLC保持時間: 10.8 min. 逆相HPLC保持時間: 12.9 min. > 99 ％純度。

【0084】

2', 4'-ジフルオロビフェニル-3-カルボン酸 (11). 化合物１１はスキーム２に従って製造した。３-ヨード安息香酸（２００ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４０μＬ、０．８１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣｌ・ＨＣｌ及びＨＯＢｔを、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）で膨潤させた Wang 樹脂（２６５ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ、２．５３ｍｍｏｌ／ｇ）の溶液に加えた。ペプチド振盪機上で室温で２２時間激しく振盪した後、溶剤を除去し、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（３×１０ｍＬ）で洗浄し、十分に真空乾燥した。

【0085】

２,４−ジフルオロフェニルボロン酸（１１２ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３（９８ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）及びＰｄ_２（ｄｂａ）_３（４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）中で膨潤させた官能化 Wang 樹脂（１４０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。室温で攪拌した後、反応物を濾過し、樹脂をＤＭＦ（３×）、Ｈ_２Ｏ（３×）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×）及びＭｅＯＨ（３×）で洗浄し、十分に真空乾燥した。

【0086】

ＴＦＡ：ＣＨ_２Ｃｌ_２の溶液（３ｍＬ １：１）を、官能化樹脂（１４０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）に加え、ペプチド振盪機上で室温で１３時間激しく振盪した。その終了後、反応物を濾過し、樹脂をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×）で洗浄し、濾液を真空濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（２：１のヘキサン：酢酸エチル、０．５％の酢酸）により精製して、１１（８１ｍｇ、１００％）を白色固体として得た。¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz)δ 13.19 (br s,1H), 8.07 (q,1H, J= 1. 7 Hz), 7.99 (dt,1H, J= 7.9, 1.6 Hz), 7.78 (dq, 1H, J = 7.8, 1.3 Hz), 7.64(m, 2H), 7.40 (ddd, 1H,J= 11. 1,8. 8,2. 5 Hz), 7.22 (tdd, 1H, J= 8.4, 2.8, 1.0 Hz).¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz)δ 167.0, 160.7, 160.4, 134.5, 133.0, 132.0, 131.3, 129.4, 129.1, 128.7, 123.9, 112.2, 104.6. HRESIMS ：Cl3H8F202 (M-H) 計算値233.0414, 実測値233.0426. 順相HPLC保持時間: 13.7 min. 逆相HPLC保持時間: 12.5 min. > 99 ％純度。

【0087】

化合物１２〜２２はスキーム３に従って製造した。適切なブロモ安息香酸メチル（１．０当量）を十分量のトルエンに溶解して０．１Ｍの濃度にした溶液に、フェニルボロン酸（２．０当量）をＥｔＯＨに溶解して該ボロン酸に関して１．０Ｍにした溶液を加えた。Ｎａ_２ＣＯ_３の２Ｍ水溶液を加えて、該ブロモ安息香酸エステルに関して０．０６Ｍの最終反応濃度にし、次いでＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（１０．０ｍｏｌ％）を加えた。反応物をＡｒ下に２５時間攪拌し、その終了時に室温に冷却し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出し、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１０：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、メチルエステルを得た。

【0088】

ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（１：１：１）中の０．０６Ｍ濃度のメチルエステル（１．０当量）の溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（３．０当量）を加えた。反応物を室温で４時間攪拌し、その終了時に３０％ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチル（３×５ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２、１％ＭｅＯＨ、０．２％酢酸）により精製して、ビフェニルカルボン酸を白色固体として６〜９３％の収率で得た。

【0089】

2',4'-ジフルオロビフェニル-4-カルボン酸(12). ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 13.09 (br s, 1H), 8.04 (AA'XX',2H, J_AA’=J_XX’= 2.0 Hz, J_XA= J_X’A’ = 8. 0 Hz, J_X’A= J_XA’= 0.7 Hz,νA = νA'= 3213.3 Hz, ν_X =ν_X', = 3056.2 Hz), 7.65(AA'XX', 2H, 上記のとおり), 7.63(m, 1H), 7.38 (ddd,1H, J= 11.2, 9.0, 2.8 Hz), 7.21 (td,1H, J= 8.4, 2.2 Hz).¹³C NMR (DMSO- d6,100 MHz) δ 167.1, 160.8, 158.0, 138.6, 132.1, 130.1, 129.6, 129.0, 123.9, 112.2, 104.7. HRESIMS ：Cl3H8F202 (M-H) 計算値233.0414, 実測値233.0407. 順相HPLC保持時間: 13.3 min. 逆相HPLC保持時間: 12.6 min. > 99 ％純度。

【0090】

2'-フルオロビフェニル-3-カルボン酸(15). ¹H NMR (CD30D, 400 MHz) δ 8.18 (q, 1H, J= 1.4 Hz), 8.03 (dt,1H, J= 7.8, 1.3 Hz), 7.76 (dq, 1H, J= 7.7, 1.5 Hz), 7.55 (t, 1H, J= 7.8 Hz), 7.48 (td, 1H, J= 7.8, 1.7 Hz), 7.38 (dddd, 1H, J= 8.3, 7.5, 5.1, 1.8 Hz), 7.26 (td, 1H, J= 7.6, 1.3 Hz), 7.20 (ddd, 1H,J= 11. 0,8. 2,1. 2 Hz).^l3C NMR (CD30D, 100 MHz) δ 169.7, 161.2, 137.5, 134.6, 132.4, 132.0, 131.3, 130.1, 129.9, 129.5, 126.0, 117.2. HRESIMS ： C13H9FO2 (M-H) 計算値215.0508, 実測値215.0498. 順相HPLC保持時間: 10.6 min. 逆相HPLC保持時間: 12.1 min. > 99 ％純度。

【0091】

2'-フルオロビフェニル-4-カルボン酸(16). ¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz)δ 13. 10 (br s, 1H), 8.05(AA'XX', 2H, J_AA’ = J_XX’ = 1.7 Hz, J_XA= J_X’A’ = 8.5 Hz,J_X’A= J_XA'= 0-3 Hz, ν_A =ν_A' = 3217.9 Hz,ν_X =ν_X' = 3070.0 Hz), 7.67 (AA'XX', 2H, 上記のとおり), 7.58 (td, 1H, J= 8.0, 1.8 Hz), 7.34 (m,1H). ¹³C NMR (DMSO-d₆,100 MHz) δ 167.1, 159.1,139. 4, 130.8, 130.3, 130.2, 129.6, 129.0, 127.3, 125.1, 116.2. HRESIMS ：C13H9FO2 (M-H) 計算値215.0508, 実測値215.0515. 順相HPLC保持時間: 12.3 min. 逆相HPLC保持時間: 12.2 min. > 99 ％純度。

【0092】

3', 5'-ジフルオロビフェニル-3-カルボン酸 (17).'H NMR (アセトン-d6,400 MHz) δ 8.30 (td, 1H, J= 2,0. 5 Hz), 8.10 (dtd, 1H, J= 7.6, 1.1, 0.5 Hz), 7.97 (ddd, 1H, J= 7.8, 2.0, 1.1 Hz), 7.64 (td,1H, J= 7.8, 0.6 Hz), 7.39 (m, 2H), 7.06 (tt, 1H, J= 9.3, 2.4 Hz). ¹³C NMR (アセトン-d6, 100 MHz) δ 167.4, 165.6, 163.2, 144.6, 139.8, 132.5, 132.4, 130.6, 130.3, 128.9, 111.0, 103.7. HRESIMS ：C13H8F202 (M-H)計算値233. 0414, 実測値233.0425. 順相HPLC保持時間: 13.5 min. 逆相HPLC保持時間: 12.7 min. > 99 ％純度。

【0093】

3', 5'-ジフルオロビフェニル-4-カルボン酸(18). ¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz) δ 13.15 (br s, 1H), 8.02 (d, 2H, J= 8.2 Hz), 7.85 (d, 2H, J= 8.5 Hz), 7.49 (m, 2H), 7.26 (tt,1H, J= 9.4, 2.4 Hz). ¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz) δ166.4, 164.1, 161.7, 142.6, 141.6, 130.9, 130.0, 127.1, 110.2, 103.5.HRESIMS ： 計算値C13H8F202 (M-H) 233.0414, 実測値233.0423. 順相HPLC保持時間: 13.0 min. 逆相HPLC保持時間: 12.8 min. > 99 ％純度。

【0094】

2',6'-ジフルオロビフェニル-3-カルボン酸(19). ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 8.03 (dt,1H, J= 7. 8,1. 6 Hz), 8.00 (m, 1H), 7.72 (dt, 1H, J = 7. 8,1. 4 Hz), 7.64 (t, 1H, J = 7.7 Hz), 7.53 (m, 1H), 7.26 (t, 2H,J= 8.3 Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆,100 MHz) δ 167.7, 158.7, 135.0, 132.2, 131.4, 131.1, 129.9, 129.5, 129.5, 112.8, 110.9. HRESIMS ：C13H8F202 (M-H) 計算値233.0414, 実測値233.0410. 順相HPLC保持時間: 12.1 min. 逆相HPLC保持時間: 12.1 min. > 97 ％純度。

【0095】

2',6'-ジフルオロビフェニル-4-カルボン酸(20). ¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 8.06(AA'XX', 2H, J_AA’ = J_XX’ = 2.0 Hz, J_XA= J_X’A’ = 8.0 Hz, J_X’A= J_XA’= 0.7 Hz, ν_A = ν_A'= 3243. 6 Hz, ν_X =ν_X', = 3018.6 Hz), 7.60 (AA'XX', 2H, 上記のとおり), 7.54 (m,1H), 7.27 (t, 2H,J= 8.3 Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆,100 MHz) δ 171.0, 164.0, 134.1, 125.7, 122.0, 121.9, 121.1, 103.4. HRESIMS ：C 13H8F202 (M-H) 計算値233.0414, 実測値233.0425. 順相HPLC保持時間: 14.5 min. 逆相HPLC保持時間:12. 1 min. > 99 ％純度。

【0096】

ビフェニル-4-カルボン酸(22). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 13.07 (br s, 1H), 8.03(AA'XX', 2H,J_AA’= J_XX = 1.8 Hz,J_XA= J_X’A’= 8.3 Hz, J_X’A= J_XA’= 0.3 Hz, ν_A =ν_A'= 3210. 7 Hz, ν_X =ν_X' = 3122. 0 Hz), 7.81 (AA'XX', 2H, 上記のとおり), 7.75 (m,2H), 7.51 (tt, 2H,J= 7.2, 1.1 Hz), 7.43(tt, 1H, J = 7.4, 1.2 Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 167.2, 144.2, 139.0, 130.0, 129.8, 129.1, 128.3, 127.0, 126.8.HREIMS ：Cl3H1002 (M+) 計算値198.0683, 実測値198.0683. 順相HPLC保持時間: 13.8 min. 逆相HPLC保持時間: 12.2 min. > 99％純度。

【0097】

メチル-5-ヨード-2-メトキシベンゾエート. ＴＭＳ-ジアゾメタン（１９．２５ｍＬ、３８．５０ｍｍｏｌ、ヘキサン中の２Ｍ溶液）を、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の５-ヨードサリチル酸（５．０８ｇ、１９．２４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、室温で１１時間攪拌した。その終了時に反応物を真空濃縮し、残留物をさらに精製することなく次の段階に持ち越した。

【0098】

ヨウ化メチル（２．４０ｍＬ、３８．４８ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（１０．０６ｇ、７６．９６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）なかの５-ヨード-２-メトキシベンゾエート（５．３７ｇ、１９．２４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、Ａｒ下に室温で２４時間攪拌した。その終了時に酢酸エチルを加え、反応物を１％ＨＣｌ（２×２０ｍＬ）、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（３：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、メチル-５-ヨード-２-メトキシベンゾエート（４．９３ｇ、８８％）を白色固体として得た。例えば、Corey, E. J.; Myers, A. G. J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 5574-5576 参照、これは全体として参照により組み入れられる。¹H NMR (DMSO-d₆,400 MHz) δ 7.90 (d, 1H, J= 2.4 Hz), 7.80 (dd, 1H, J= 8.8, 2.4 Hz), 6.96 (d, 1H, J= 9.0 Hz), 3.81 (s, 3H), 3.79 (s, 3H). ¹³C NMR(DMSO-d6, 100 MHz) δ 164.7, 158.0, 141.6, 138. 5,122. 2,115. 2,82. 1,55. 9,52. 0. HREIMS ：C9H9I03 (M+) 計算値291.9608, 実測値291.9596。

【0099】

化合物２３〜２７はスキーム４に従って製造した。メチル-５-ヨード-２-メトキシベンゾエート（１．０当量）を十分量のトルエンに溶解して０．０８Ｍの濃度にした溶液に、フェニルボロン酸（２．０当量）をＥｔＯＨに溶解して該ボロン酸に関して０．８Ｍにした溶液を加えた。Ｎａ_２ＣＯ_３の２Ｍ水溶液を加えて、メトキシベンゾエートに関して０．０６Ｍの最終反応濃度にし、次いでＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（１０．０ｍｏｌ％）を加えた。反応物をＡｒ下に６０℃で１５時間攪拌し、その終了時に室温に冷却し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出し、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（３：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、メチル化サリチレートを得た。

【0100】

メチル化サリチレート（１．０当量）を十分量のＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解して０．０６Ｍの濃度にした溶液に、ＢＢｒ_３（２．０当量、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１Ｍ溶液）を加えた。反応物を室温でＡｒ下に４時間攪拌し、その終了時にＨ_２Ｏ（１０ｍＬ）で停止し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出し、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をさらに精製することなく次の段階に持ち越した。

【0101】

ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（１：１：１）中の０．０６Ｍ濃度のメチルエステル（１．０当量）の溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（３．０当量）を加えた。反応物を室温で４時間攪拌し、その終了時に３０％ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチル（３×５ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２、１％ＭｅＯＨ、０．２％酢酸）により精製して、ビフェニルサリチレートを白色固体として１２〜４２％の収率で得た。

【0102】

4'-フルオロ-4-ヒドロキシビフェニル-3-カルボン酸(23).'H NMR (CD30D, 400 MHz)5 8.01 (d, 1H, J= 2.5Hz), 7.65 (dd, 1H, J= 8.7, 2.5 Hz), 7.51 (m, 2H), 7.11(tt, 2H,J= 10. 0, 3.0Hz), 6.97 (d, 1H,J= 8. 7 Hz. ¹³C NMR (CD30D, 100 MHz) δ173.5, 165.0, 162.7, 137.7, 135.1, 132.6, 129.6, 129.3, 118.9, 116.7, 116.6, 114.2.HRESIMS ： C13H9FO3(M-H) 計算値231.0459, 実測値231.0457. 順相HPLC保持時間: 14.2 min. 逆相HPLC保持時間: 12.8 min. > 99 ％純度。

【0103】

2'-フルオロ-4-ヒドロキシビフェニル-3-カルボン酸(24). ¹H NMR (CD30D, 400 MHz) δ 7.98 (dd,1H, J= 2.2, 1. 4 Hz), 7.59 (ddd,1H, J= 8.7, 2.4, 1.7 Hz), 7.36 (td,1H, J= 7.8, 1.7 Hz), 7.26 (dddd,lH, J=9. 9,7. 4,4. 9,1.7 Hz), 7.16 (td,1H, J=7. 5,1.2 Hz), 7.10 (ddd, 1H, J =11.1,8.2,1.3 Hz), 6.95 (d, 1H,J= 8. 5Hz). ¹³C NMR (CD30D,100 MHz) δ 173.5,162.9, 162.4, 137.2, 131.8, 130.2, 130.1, 129.1, 128.1, 125.8, 118.5, 117.1, 114.0. HRESIMS ：C13H9FO3(M-H) 計算値231.0457, 実測値231.0446. 順相HPLC保持時間: 13.8 min. 逆相HPLC保持時間: 12.7 min. > 99 ％純度。

【0104】

3',5'-ジフルオロ-4-ヒドロキシビフェニル-3-カルボン酸 (25). ¹H NMR (CD30D, 400 MHz) δ 8.07 (d,1H, J= 2.5 Hz), 7.73 (dd,1H, J= 8.5, 2.7 Hz), 7.15(m, 2H), 7.01 (d, 1H,J= 8. 9 Hz), 6.86(tt,1H, J= 9.0, 2.5 Hz). ¹³C NMR (CD30D, 100 MHz) δ 173.3,166.3,163.8,145.1,135.2,131.0,129.8,119.2,114.4,110.4,103.0. HRESIMS ：C13H8F203(M-H) 249.0363,実測値249. 0356. 順相HPLC保持時間: 14.5 min. 逆相HPLC保持時間: 13.3 min. > 99 ％純度。

【0105】

2', 4'-ジクロロ-4-ヒドロキシビフェニル-3-カルボン酸(26). ¹H NMR (CD30D, 400 MHz) δ 7.83 (d,1H, J= 2.2 Hz), 7.70 (d, 1H, J= 2.0 Hz), 7.58 (dd,1H, J= 8.6, 2.4 Hz), 7.48(ABX,1H, J_AB = 8.4Hz,J_AX = 2.2 Hz, J_BX = 0. 0 Hz, ν_A = 2989.4 Hz,ν_B = 2973.0 Hz), 7.44(ABX, 1H, 上記のとおり), 7.06 (d,1H, J= 8.7Hz). CD30D, 100 MHz) δ 171.6, 160.8, 137.5, 136.4, 132.8, 132.6,132.4,130.8,129.2,128.5,127.7,117.2,112.9. HRESIMS ：C13H8CI203 (M-H) 計算値280.9772, 実測値280.9782. 順相HPLC保持時間: 13.1 min. 逆相HPLC保持時間: 14.4 min. > 99 ％純度。

【0106】

4-ヒドロキシビフェニル-3-カルボン酸(27). ¹H NMR (CD30D, 400 MHz)δ 8.08 (d, 1H, J= 2.4 Hz), 7.73 (dd, 1H, J= 8.7, 2. 3 Hz), 7.54(m, 2H), 7.41 (tt, 2H, J= 7.3, 1.8 Hz), 7.29 (tt, 1H,J= 7.8, 1.7 Hz), 7.38 (dddd,1H, J= 8.8, 6.4 Hz), 7.05 (d,1H, J= 8.7 Hz), 6.93(m, 1H), 6.90 (ddd,1H, J= 7.3, 1.9 Hz), 7.00 (d, 1H, J= 8.5 Hz). ¹³C NMR (CD30D, 100 MHz) δ161.5, 140.1, 134.0, 132.4, 128.7, 128.3, 126.9, 126.3, 117.5, 112.9. HRESIMS ：Cl3Hl003(M-H) 計算値213.0552, 実測値213.0545. 順相HPLC保持時間: 12.9 min. 逆相HPLC保持時間: 12.6 min. > 99 ％純度。

【0107】

４-ブロモ-２,６-ジフルオロアニソール ヨウ化メチル（５８０μＬ、１０．０６ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（２．８０ｇ、２０．１２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の４-ブロモ-２,６-ジフルオロフェノール（１．０５ｇ、５．０３ｍｍｏｌ）の溶液に加え、Ａｒ下に室温で２４時間攪拌した。その終了時に酢酸エチルを加え、反応物を１％ＨＣｌ（２×２０ｍＬ）、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン）により精製して、４-ブロモ-２,６-ジフルオロアニソール（７４７ｍｇ、６７％）を白色固体として得た。例えば、Chambers, R. D.; et al. J. Fluorine Chem. 2000, 102, 169-174 参照、これは全体として参照により組み入れられる。¹H NMR (CDC13, 400 MHz) δ 7.06(m, 2H), 3.97 (q, 3H, J = 1. 1 Hz). ¹³C NMR(CDC13,100 MHz) δ 155.8, 136.3, 116.2, 113.8, 61.9. LREIMS 実測値C7H5F20Br (M+) 223.0。

【0108】

４-ブロモ-２,６-ジクロロアニソール ヨウ化メチル（４６７μＬ、８．１２ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（２．２４ｇ、１６．２４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の４-ブロモ-２,６-ジクロロフェノール（９８２ｍｇ、４．０６ｍｍｏｌ）の溶液に加え、Ａｒ下に室温で４０分間攪拌した。その終了時に酢酸エチルを加え、反応物を１％ＨＣｌ（２×２０ｍＬ）、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン）により精製して、４-ブロモ-２,６-ジクロロアニソール（７７８ｍｇ、７４％）を白色固体として得た。例えば、Li, J.; et al. J. Med. Chem.1996, 39, 1846-1856 参照、これは全体として参照により組み入れられる。¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7.75(s, 2H), 3.81 (s, 3H). ¹³C NMR(DMSO-d₆,100 MHz) δ 151.3, 131.5, 129.6, 116.5, 60.6. HREIMS 実測値C7H5BrCl20 (M+) 253.8905, 実測値253.8901。

【0109】

化合物２８〜３１はスキーム５に従って製造した。適切なハロ-アニソール（１．０当量）を十分量のトルエンに溶解して０．２５Ｍの濃度にした溶液に、フェニルボロン酸（２．０当量）をＥｔＯＨに溶解して該ボロン酸に関して１．５Ｍにした溶液を加えた。Ｎａ_２ＣＯ_３の２Ｍ水溶液を加えて、ハロ-アニソールに関して０．０８Ｍの最終反応濃度にし、次いでＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（１０．０ｍｏｌ％）を加えた。反応物を６５℃で１７時間攪拌し、その終了時に室温に冷却し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出し、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２０：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、メチル化ビフェニルを白色固体として得た。

【0110】

メチル化ビフェニル（１．０当量）を十分量のＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解して０．２０Ｍの濃度にした溶液に、ＢＢｒ_３（２．０当量、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１Ｍ溶液）を加えた。反応物を室温でＡｒ下に３時間攪拌し、その終了時にＨ_２Ｏ（１０ｍＬ）で停止し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出し、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をさらに精製することなく次の段階に持ち越した。

【0111】

ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（１：１：１）中の０．０４Ｍ濃度のメチルエステル（１．０当量）の溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（３．０当量）を加えた。反応物を室温で５時間攪拌し、その終了時に３０％ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチル（３×５ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２、１％ＭｅＯＨ、０．２％酢酸）により精製して、ビフェニル生成物を白色固体として１４〜３９％の収率で得た。

【0112】

3',5'-ジフルオロ-4'-ヒドロキシビフェニル-3-カルボン酸 (28). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz)δ 10.60 (br s, 1H), 8.14 (t, 1H,J = 1. 7 Hz), 7.91 (dt,1H,J= 7.7, 1.1 Hz), 7.88 (ddd, 1H, J= 8.0, 2.0,1. 1 Hz), 7.55 (t, 1H,J= 7.9 Hz), 7.41 (m, 2H). ¹³C NMR (DMSO-d₆,100 MHz) δ167.3, 154.0, 151.5, 138.4, 133.6, 131.6, 130.8, 129.9, 129.4, 128.4, 127.1, 110.3. HRESIMS ：C13H8F203 (M-H)計算値249.0363, 実測値249.0358. 順相HPLC保持時間: 18.3 min. 逆相HPLC保持時間: 10.5 min. > 98 ％純度。

【0113】

3',5'-ジフルオロ-4'-ヒドロキシビフェニル-4-カルボン酸 (29). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7.98(AA'XX', 2H, J_AA’= J_XX’ = 1.7 Hz,J_XA =J_X’A’ = 8.2 Hz, J_X’A= J_XA’= 0 5 Hz, ν_A =ν_A'=3189. 9 Hz,ν_X =ν_X' = 3122.0 Hz), 7.81 (AA'XX', 2H, 上記のとおり), 7.51 (m,2H). ¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz) δ 167.7, 154.5, 142.5, 136.0, 130.5, 130.5, 130.4, 126.9, 111.0. HRESIMS ：C13H8F203 (M-H) 計算値249.0363, 実測値249.0375. 順相HPLC保持時間: 18.9 min. 逆相HPLC保持時間: 10.2 min. > 99 ％純度。

【0114】

3', 5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシビフェニル-3-カルボン酸 (30). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8.13 (t, 1H,J= 1. 6 Hz), 7.91 (m, 2H), 7.70 (s, 2H), 7.56 (t, 1H,J= 7.8 Hz). ¹³C NMR (DMSO-d₆,100 MHz) δ 167.2, 149.0, 137.9, 132.2, 131.6, 130.8, 129.3, 128.4, 127.1, 126.8, 122.9, 123.0. HRESIMS ：C13H8Cl203(M-H) 計算値280.9772, 実測値280.9767. 順相HPLC保持時間: 16.2 min. 逆相HPLC保持時間: 11.6 min. > 99 ％純度。

【0115】

3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシビフェニル-4-カルボン酸 (31). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7.98 (AA'XX', 2H, J_AA’ = J_XX’ = 1.7 Hz, J_XA= J_X’A’ = 8.1 Hz,J_X’A= J_XA’= 0.5 Hz, ν_A =ν_A'= 3189.9 Hz, ν_X =ν_X' = 3110.0 Hz), 7.81(AA'XX', 2H, 上記のとおり), 7.78 (s, 2H). 13C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) 6 167.2, 141.8, 141.7, 134.7, 129.9, 129.7, 126.9, 126.4, 123.0. HRESIMS ： C13H8Cl203 (M-H) 計算値280. 9772, 実測値280.9785. 順相HPLC保持時間: 15.9 min. 逆相HPLC保持時間: 11.4 min. > 97 ％純度。

【0116】

メチル-2', 4'-ジフルオロ-4-ヒドロキシビフェニル-3-カルボキシレート(32). 化合物３２及び３３はスキーム６に従って製造した。ＴＭＳ-ジアゾメタン（５．８７ｍＬ、１１．７５ｍｍｏｌ、ヘキサン中の２Ｍ溶液）を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のジフルニサル（１．０３ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。その終了時に反応物を真空濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１０：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、３２（７７４ｍｇ、７１％）を白色固体として得た。¹H NMR(CDC13, 400 MHz) δ 7.97 (dd,1H, J= 2.2, 1.3 Hz), 7.59 (dt, 1H,J= 8.8, 2.1 Hz), 7.36 (dq, 1H,J= 7.7, 1.5 Hz), 7.48 (td,1H, J= 7.8, 1.7 Hz), 7.38 (dddd, 1H, J= 8.8, 6.4 Hz), 7.05 (d, 1H, J= 8.7 Hz), 6.93(m, 1H), 6.90 (ddd,1H,J= 10. 6,8. 9,2. 5 Hz), 3.96 (s, 3H). ¹³C NMR (CDC13,100 MHz) δ 170.6, 163.6, 161.3, 158.5, 136.4, 131.2, 130.3, 126.2, 124.2, 118.0, 112.6, 111.8, 104.6, 52.6, 124.2.HRFABMS ：C14H10F203 (M+) 計算値264.0596, 実測値264.0598. 順相HPLC保持時間: 6.9 min. 逆相HPLC保持時間: 14.7 min. > 99 ％純度。

【0117】

２’,４’-ジフルオロ-４-メトキシビフェニル-３-カルボン酸（３３） ヨウ化メチル（３５０μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（３２０ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４ｍＬ）中の３２（１５２ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の溶液に加え、Ａｒ下に室温で１４時間攪拌した。その終了時に酢酸エチルを加え、反応物を１％ＨＣｌ（２×２０ｍＬ）、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をさらに精製することなく次の段階に持ち越した。

【0118】

ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（６０ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（４．５ｍＬ １：１：１）中の完全メチル化ジフルニサル（１４０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に加え、室温で４時間攪拌した。その終了時に反応物を３０％ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチル（３×５ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２：１の酢酸エチル：ヘキサン、１％酢酸）により精製して、３３（１２２ｍｇ、９３％）を白色固体として得た。¹H NMR(CDC13, 400 MHz) δ 10.77 (br s, 1H), 8.31 (dd, 1H, J= 2.5, 0.9 Hz), 7.75(dt,1H, J= 8.6, 2.1 Hz), 7.41 (dt,1H, J= 8.9, 6.6 Hz), 7.15 (d,1H, J= 8.8 Hz), 6.94(m, 1H), 4.13 (s, 3H). ¹³C NMR(CDC13, 100 MHz) δ 177.7, 161.4, 158.2, 135.7, 133.9, 131.4, 129.0, 123.5, 118.1, 112.2, 112.0, 104.6, 56.9. HRESIMS ：Cl4H10F203 (M-H) 計算値263.0520, 実測値263.0514. 順相HPLC保持時間: 21.6 min. 逆相HPLC保持時間: 11.9 min. > 99 ％純度。

【0119】

化合物３４〜３８はスキーム７に従って製造した。化合物３９〜４４はスキーム８に従って製造した。ヨウ化アリール（１．０当量）を十分量のトルエンに溶解して０．０７Ｍの濃度にした溶液に、適切なホルミルフェニルボロン酸をＥｔＯＨに溶解して該ボロン酸０．４Ｍの濃度にした溶液を加えた。Ｎａ_２ＣＯ_３の２Ｍ水溶液を加えて、ヨウ化アリールに関して０．０４Ｍの最終反応濃度にし、次いでＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（３．０ｍｏｌ％）を加えた。反応物をＡｒ下に１８時間加熱還流し、その終了時に室温に冷却し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出し、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（４０：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、ビフェニルアルデヒドをを白色固体として４０〜９１％の収率で得た。

【0120】

3',5'-ジクロロ-3-ホルミルビフェニル(39). ¹H NMR(CDC13, 400 MHz) δ 10.09 (s, 1H), 8.04 (t, 1H, J = 1. 8 Hz), 7.91 (dt, 1H, J= 7.6, 1.3 Hz), 7.80 (ddd,1H, J= 7.8, 2.0, 1.3 Hz), 7.64 (t,1H, J= 7.8 Hz), 7.49 (d, 2H, J = 1. 8 Hz), 7. 38 (t, 1H, J = 1. 9 Hz).¹³C NMR(CDC13, 100 MHz) δ 192.0, 142.8, 139.7, 137.2, 135.8, 133.0, 130.1, 130.0, 128.1, 128.0, 125.9. HRFABMS ：Cl3H8C120 (M + H) 計算値251. 0027, 実測値251.0027. 順相HPLC保持時間: 8,0 min. 逆相HPLC保持時間: 15.2 min. > 99 ％純度。

【0121】

3', 5'-ジクロロ-4-ホルミルビフェニル (40). ¹H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.99 (AA'XX', 2H, J_AA’ = J_XX’ = 2. 1 Hz, J_XA= J_X’A’ = 8.5 Hz,J_X’A = J_XA’= 0 7 Hz,ν_A = ν_A’ = 3193.7 Hz, ν_X =ν_X' = 3077.8 Hz), 7.70(AA'XX', 2H, 上記のとおり), 7.47 (t,1H,J= 1. 9 Hz),7. 39 (d, 2H, J = 1. 9 Hz). ¹³C NMR(CDC13, 100 MHz) δ 191.8, 144.4, 142.9, 136.2, 135.8, 130.6, 128.5, 127.9, 126.1.HREIMS ：C13H8Cl2O (M-H) 計算値248.9873, 実測値248.9874. 順相HPLC保持時間: 7.9 min. 逆相HPLC保持時間: 15.2 min. > 99 ％純度。

【0122】

3', 5'-ジクロロ-2-ホルミルビフェニル(41). ¹H NMR (CDC13, 400 MHz) δ 9.98 (s, 1H), 8.03 (dd, 1H,J= 7. 8,1. 3 Hz), 7.66 (td, 1H,J= 7. 6,1. 5 Hz), 7.55(tt, 1H,J= 7. 6,1. 0 Hz), 7.44 (t, 1H,J= 1. 9 Hz), 7.39 (dd, 1H, J= 7.7, 1.0 Hz), 7.27 (d, 2H,J= 1. 9 Hz). ¹³C NMR(CDC13, 100 MHz) δ 191.4, 142.9, 141.0, 135.3, 134.0, 133.7, 130.7, 129.0, 128.5, 128.4, 128.4.HRFABMS ：Cl3H8Cl2O (M+H) 計算値251.0030, 実測値251.0029. 順相HPLC保持時間: 7.0 min. 逆相HPLC保持時間: 14.9 min. > 99 ％純度。

【0123】

化合物４５〜４７はスキーム８に従って製造した。ビフェニルアルデヒド（１．０当量）を十分量のアセトンに溶解して０．０７Ｍの濃度にした溶液に、十分量のＨ_２Ｏ中で０．２Ｍの過マンガン酸塩の濃度にしたＫＭｎＯ_４（２．０当量）を加えた。反応物を室温で１６時間攪拌し、その終了時に真空濃縮し、生成した残留物を１０：１のＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨに再溶解し、ガラスウールの栓に通して濾過した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１０：１のＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ）により精製して、カルボン酸（５８ｍｇ、１００％）を白色固体として８２〜１００％の収率で得た。

【0124】

2',4'-ジクロロビフェニル-3-カルボン酸(45). ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8.22 (br s, 1H), 8.00 (br s,1H), 7.94 (d, 1H, J= 7.5 Hz), 7.76 (s, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.60 (br s,1H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 168.0, 143.7, 138.1, 135.4, 131.6, 129.9, 127.9, 126.2. HRESIMS ：Cl3H8Cl2O2 (M-H) 計算値264.9823, 実測値264.9810. 順相HPLC保持時間: 12.3 min. 逆相HPLC保持時間: 14.2 min. > 99 ％純度。

【0125】

2',4'-ジクロロビフェニル-4-カルボン酸(46). ¹H NMR (CD30D, 400 MHz)δ 8. 11 (br s, 2H) 7.72 (m, 2H), 7.64 (d, 2H, J = 1. 9 Hz), 7.46 (t, 1H,J= 1. 7 Hz).¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz) δ 170.3, 140.6, 135.2, 127.2, 126.4, 119.3, 118.6, 117.4. HRESIMS ：C13H8Cl202(M-H) 計算値264.9830, 実測値264.9823. 順相HPLC保持時間: 12.5 min. 逆相HPLC保持時間: 14.4 min. > 99 ％純度。

【0126】

2', 4'-ジクロロビフェニル-2-カルボン酸 (47). ¹H NMR (DMSO-d₆,400MHz) δ 7.75 (br s, 1H), 7.56 (s, 2H), 7.48 (m, 2H), 7.36 (m,2H). ¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz) δ 170.1, 152.5, 145.2, 133.3, 130.0, 129.6, 128.0, 127.2, 126.3. HRESIMS ：C13H8Cl202 (M-H) 計算値264.9823, 実測値264.9834. 順相HPLC保持時間: 11.4 min. 逆相HPLC保持時間: 13.6 min. > 99 ％純度。

【0127】

化合物４８〜５３はスキーム８に従って製造した。ビフェニルアルデヒド（１．０当量）を十分量のＭｅＯＨに溶解して０．１Ｍの濃度にした溶液に、十分量のＭｅＯＨ中で０．３Ｍの水素化ホウ素塩の濃度にしたＮａＢＨ_４（２．０当量）を加えた。反応物を０℃で攪拌し、徐々に室温に温め、１６時間攪拌した後、真空濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（３：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、ビフェニルアルコールを白色固体として９４〜１００％の収率で得た。

【0128】

3',5'-ジクロロビフェニル-3-イル-メタノール (48). ¹H NMR(CDC13, 400 MHz)δ 7.54 (m, 1H), 7.46 (d, 2H,J= 1. 8 Hz), 7.45 (m, 2H), 7.39 (m, 1H), 7.34 (t, 1H, J = 1. 9 Hz), 4.77 (s, 2H), 1.90 (br s, 1H). ¹³C NMR (CDC13, 100 MHz) δ 144.1, 141.9,139. 0,135. 5,129. 5,127. 4, 127.1, 126.5, 125.8, 125.7, 65.3.HREIMS ：C13HIOC120 (M+) 計算値252.0103, 実測値252.0109. 順相HPLC保持時間: 13.9 min. 逆相HPLC保持時間: 14.0 min. > 99 ％純度。

【0129】

3',5'-ジクロロビフェニル-4-イル-メタノール (49).'H NMR (CDC13, 400 MHz) δ 7.53(AA'XX', 2H,J_AA'=1.9 Hz, J_XX’ = 3.1 Hz,J_XA= 8. 7 Hz, J_X’A’= 6. 4 Hz, J_X’A=J_XA’=0. 5 Hz,ν_A = ν_A' = 3009.8 Hz, ν_X =ν_X’, = 2977.8 Hz), 7.45 (AA'XX', 2H, 上記のとおり), 7.45 (d, 2H, J= 1. 9 Hz), 7.33 (t, 1H,J= 1. 9 Hz), 4.75 (br d, 2H, J= 4.8Hz), 1.81 (br t, 1H, J= 5.2 Hz). ¹³C NMR (CDC13, 100 MHz) δ 144.0, 141.4, 138.0, 135.5, 127.8, 127.4, 127.4, 125.8, 65.1. HREIMS ：C13H10C120 (M+) 計算値251.0110, 実測値252.0109. 順相HPLC保持時間: 15.4 min. 逆相HPLC保持時間: 14.0 min. > 97 ％純度。

【0130】

3',5'-ジクロロビフェニル-2-イル-メタノール (50). 1H NMR (CDC13, 400 MHz) δ7.55 (dd,1H, J= 7.5, 1.3 Hz), 7.43 (td, 2H, J= 7.5, 1.4 Hz), 7.38 (m, 2H), 7.29 (d, 2H,J= 1. 9 Hz), 7.24 (dd, 1H, J= 7.4, 1.4 Hz), 4.58 (s, 2H), 1.79 (s, 1H).¹³C NMR(CDC13, 100 MHz) δ 143.7, 138.9, 137.9, 134.9, 130.0, 129.0, 128.9, 128.2, 127.9, 127.6, 63.0. HREIMS ：C13H10C120 (M+) 計算値252.0110, 実測値252.0109. 順相HPLC保持時間: 11.5 min. 逆相HPLC保持時間: 14.0 min. > 99 ％純度。

【0131】

化合物５４及び５５はスキーム９に従って製造した。適切なヨードベンズアルデヒド（１．０当量）を十分量のトルエンに溶解して０．０７Ｍの濃度にした溶液に、３,５-ジフルオロフェニルボロン酸（２．０当量）をＥｔＯＨに溶解して該ボロン酸に関して１．０Ｍにした溶液を加えた。Ｎａ_２ＣＯ_３の２Ｍ水溶液を加えて、該ヨードベンズアルデヒドに関して０．０４Ｍの最終反応濃度にし、次いでＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（４．０ｍｏｌ％）を加えた。反応物を６０℃で１７時間攪拌し、その終了時に室温に冷却し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出し、ブライン（１×）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１０：１のヘキサン：酢酸エチル）により精製して、ビフェニルアルデヒドを白色固体として７８〜８０％の収率で得た。

【0132】

3',5'-ジフルオロ-3-ホルミルビフェニル(54). 1H NMR (CDC13,400 MHz) δ 10.06 (s, 1H), 8.02 (t,1H,J= 1. 4 Hz), 7.88 (dt, 1H, J= 7.8, 1.4 Hz), 7.78 (ddd, 2H, J= 7.8, 2.0, 1.2 Hz), 7.61 (t, 2H,J= 7.7), 7.10(m, 2H), 6.80 (tt, 1H, J= 8. 8,2. 3 Hz.¹³C NMR(CDC13, 100 MHz) δ192.0, 164.8, 162.3, 143.0, 139. 8, 137.1, 132.9, 129.9, 127.9, 110.4, 103.5.HRFABMS ：C13H8F20 (M+H) 計算値219.0620, 実測値219.0621. 順相HPLC保持時間: 8.9 min. 逆相HPLC保持時間: 13.7 min. > 99 ％純度。

【0133】

3',5'-ジフルオロ-4-ホルミルビフェニル (55).'H NMR(CDC13, 400 MHz) δ 9.98 (s, 1H), 8.02 (dd,1H, J= 7.8, 1.5 Hz), 7.65 (td,1H, J= 7.3, 1.4 Hz), 7.54 (t, 1H, J= 7.8 Hz), 7.40 (dd,1H, J= 7.6, 1.2 Hz), 6.90(m, 3H).¹³C NMR(CDC13, 100 MHz) δ 191.5, 164.1, 161.6, 143.4, 141.3, 134.0, 133.7, 130.6, 129.0, 128.3, 113.3, 103.8. HRFABMS ：Cl3H8F2O(M+H) 計算値219.0620, 実測値219.0621. 順相HPLC保持時間: 7.0 min. 逆相HPLC保持時間: 13.4 min. > 99 ％純度。

【0134】

本化合物をそれらがトランスチレチンテトラマーを安定化するか又はフィブリル形成を防止する能力について評価するために、多数のインビトロ試験を使用することができる。これらの試験は、フィブリル形成アッセイ、血漿選択性アッセイ、トランスチレチン：化合物複合体の三次元構造の決定（例えばＸ線結晶学による）、トランスチレチンテトラマー解離又はフィブリル形成の動力学、並びに例えば遠心分離又は熱量測定によるトランスチレチン：化合物相互作用の化学量及びエネルギー量の決定を含むことができる。インビトロアッセイにおける模範例の詳細は以下に提示される。

【0135】

各化合物を停滞フィブリル形成アッセイに付した。化合物をＰ_２Ｏ_５上で一夜乾燥し、ＤＭＳＯに７．２ｍＭの最終濃度に溶解して、一次ストック溶液を与えた（１０× ストック）。一次ストック溶液をＤＭＳＯで５倍希釈して１．４４ｍＭの最終濃度にすることによって、二次ストック溶液を調製した（２× ストック）。阻害剤（１．４４ｍＭ）の存在下でのＴＴＲ（３．６μＭ）の酸媒介アミロイド生成を、次のように測定した：使い捨てＵＶキュベットに、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＫＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）中の０．４ｍｇ／ｍＬのＷＴ ＴＴＲタンパク質溶液の４９５μＬ、並びにＤＭＳＯ中の１．４４ｍＭの二次ストック阻害剤溶液の５μＬを加えた（２× ストック）。この混合物を旋回し、３０分間インキュベートし（２５℃）、このとき２００ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭ ＫＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ４．２）の５００μＬでｐＨを４．４に下げた。この最終１ｍＬ溶液を旋回し、攪拌することなく３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、キュベットを旋回して存在する全てのフィブリルを懸濁させ、この懸濁液の濁度を、ＵＶ-vis 分光計を用いて３５０及び４００ｎｍで測定した。パーセントフィブリル形成は、各ＴＴＲプラス阻害剤サンプルに関する観測濁度の、同じ方法で調製したが阻害剤を含まないサンプルの濁度に対する比に１００を乗じることによって得た。阻害剤及びＴＴＲの等モル濃度（３．６μＭ）を採用するフィブリル形成アッセイは、１× 二次ストック溶液を用いて上記のように行った。この１× 二次ストック溶液を、７．２ｍＭ １０× 一次ストック溶液をＤＭＳＯで１０倍希釈して０．７２ｍＭの最終濃度にすることによって調製し、上記のようにフィブリル形成アッセイに使用した。全てのアッセイを三重で行い、野生型ＴＴＲを用いて全ての化合物をアッセイした。全ての化合物は、ＷＴ ＴＴＲの非存在下での溶液の濁度を試験することにより、実験の経過全体を通して可溶性であることが認められ、濁度がＴＴＲアミロイド形成の結果であることを保証した。

【0136】

血漿中のＴＴＲへの潜在的阻害剤の結合化学量は、抗体捕獲／ＨＰＬＣ法により評価した。１．５ｍＬ容量のエッペンドルフ型管に、１．０ｍＬのヒト血漿及び阻害剤の１．４４ｍＭ ＤＭＳＯ溶液の７．５μＬを充填した。この溶液を３７℃で２４時間インキュベートして穏やかに振動した。停止したセファロースの１：１のゲル：ＴＳＡ（トリス食塩水）スラリー（１２５μＬ）を上記溶液に加え、４℃で１時間穏やかに振動した。この溶液を遠心分離し（１６,０００×ｇ）、上澄み液を二つの４００μＬアリコートに分割し、次いでこれらを、抗ＴＴＲ抗体に複合したセファロースの１：１のゲル：ＴＳＡスラリーの種々の２００μＬサンプルに加えた。この溶液を４℃で２０分間穏やかに振動し、遠心分離し（１６,０００×ｇ）、上澄み液を除去した。ゲルを１ｍＬのＴＳＡ／０．０５％サポニンを用いて４℃で洗浄し、次いでＴＳＡを用いて４℃で洗浄した（２×、それぞれ１０分間）。サンプルを遠心分離し（１６,０００×ｇ）、最終洗浄液を除去し、１５５μＬの１００ｍＭトリエチルアミン、ｐＨ１１．５を加えて、ＴＴＲ及び結合した阻害剤を抗体から溶離した。４℃で３０分間穏やかに振動した後、溶離サンプルを遠心分離し（１６,０００×ｇ）、ＴＴＲ及び阻害剤を含む上澄み液の１４５μＬを除去した。次いで上澄み液を、上記のように逆相ＨＰＬＣにより分析した。例えば、Purkey, H. E.; Dorrell, M. I.; Kelly, J. W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001, 98, 5566-71 参照、これは全体として参照により組み入れられる。

【0137】

ＷＴ ＴＴＲの結晶は、２Ｍ硫酸アンモニウムに対して平衡化した７ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．３５〜０．５０Ｍ硫酸アンモニウム中）から得た。ＴＴＲ-リガンド複合体は、１０倍モル過剰量のリガンドで３週間より長く浸漬した結晶から得た。化合物２０又は２６で浸漬した結晶のデータ収集のために、RU200 回転陽極Ｘ線発生器を結合した CCD-PXL-L600 検出器 (Bruker instruments) を使用した。化合物１又は１８で浸漬した結晶のデータ収集のために、14-BM-C, BIOCARS, Advance Photon Source の単色高エネルギー線源における Quantum-4 を使用した。結晶を凍結保護剤としてのパラトーン (paratone) 油に入れ、回折実験のために冷却した（２０及び２６では１２０Ｋ、並びに１及び１８では１００Ｋ）。ＴＴＲ・リガンド複合体構造の結晶は、ａ＝４３Å、ｂ＝８５Å及びｃ＝６６Å；非対称単位中に二つのモノマーを含む空間群Ｐ２_１２_１２に近似した単位格子寸法を有するアポ結晶形態と同形である。１及び１８のデータセットを DENZO 及び SCALEPAC で整理した。例えば、Otwinowski, Z.; Minor W. Macromolecular Crystallography, Part A, in Method in Enzymology; Carter, C. W., Sweet, R. M. Eds.; Academic Press; 1997, Vol. 276, p 307-326 参照、これは全体として参照により組み入れられる。 ２０及び２６のデータセットを SAINT 及び PROSCALFE (Bruker AXS, nc.) で整理した。

【0138】

The Protein Data Bank からのタンパク質原子配位 (受入番号 1BMZ) を、EPMR による分子置換サーチの間に出発モデルとして使用した。EPMR からの最良の解を、ＣＮＳの分子動力学及びエネルギー最小化プロトコールにより精密化した。得られたフーリエの差の分布図は、ＴＴＲの各結合ポケット中でのリガンドの結合（１８、２０及び２６では二つの立体配座、並びに１では四つの立体配座）を明らかにした。これらの分布図を用いて、リガンドを密度に明確に配置することができ、結晶学的精密化に含めた。模倣アニーリングの数サイクル、並びに後続の位置及び温度因子精密化の後、水分子をフーリエの差の分布図に配置した。振動／ゆがみバイアス除去プロトコールにより計算した不偏加重電子密度図を用いて、図のフィッティングの最終サイクルを行った。リガンドの全ての立体配座は、不偏アニール省略図、並びに阻害剤の非存在下で同期させた振動／ゆがみの不偏加重図と良く一致した。精密化の最終サイクルは、Refinac の制限精密化プロトコールにより行った。最終の図には解釈できる電子密度が欠如していたので、９個のＮ末端残基及び３個のＣ末端残基は最終モデルに含めなかった。結晶学的分析の概要は表２に示されている。例えば、Kissinger, C. R.; Gehlhaar, D. B. Acta Crystallogr., Sect. D 1999, 55, 484-491; Brunger, A. T.; et al. Acta Crystallogr., Sect. D 1998, 54, 905-921; Kantardjieff, K.; et. Al. Acta Crystallogr., Sect. D 2002, 58, 725-743; Bailey, S. Acta Crystallogr., Sect. D 1994, 50, 760-763; 及び Murshudov, G. N.; Vagin, A. A.; Dodson, E. J. Acta Crystallogr., Sect. D 1997, 53, 240-255 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【0139】

ＴＴＲテトラマー解離の動力学は、尿素中でのモノマー展開と関連付けることによって評価した。遅いテトラマー解離は far-ＵＶ ＣＤ分光法によっては検出されないが、上記のように far-ＵＶ ＣＤ分光法によって容易に検出できる急速な（５００,０００倍速い）展開段階に関連している。阻害剤（３．６μＭ）の関数としてのＴＴＲテトラマー（３．６μＭ）解離動力学は、関心のある阻害剤の１ｍＭ溶液（エタノール中）の３．６μＬを、１２７．４μＬのリン酸塩緩衝液を加えた６９μＬのＷＴ ＴＴＲ（２．９０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を加えることによって評価した。ＴＴＲ濃度（３．６μＭ）の２倍である阻害剤濃度（７．２μＭ）のために、関心のある阻害剤の１ｍＭ溶液（エタノール中）の７．２μＬを、１２３．８μＬのリン酸塩緩衝液を加えた６９μＬのＷＴ ＴＴＲ（２．９０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を加えた。１００μＬの関心のあるタンパク質-阻害剤溶液を、１００μＬの１０．３Ｍ尿素及び３００μＬのリン酸塩緩衝液の溶液に加えて、６．５Ｍの最終尿素濃度にした。これらの溶液を旋回させ、円偏光二色性スペクトルを次の間隔：０、５、８、２３、４６、７１、９５、１１８、１４４及び１６８時間で収集した。阻害剤よりはむしろ７．２μＬのエタノールを含むコントロールサンプルを比較のために調製し、スペクトルを上記の時点で収集した。ＣＤスペクトルを２２０〜２１３ｎｍで収集し、０．５ｎｍ毎に走査し、平均時間は１０秒であった。各波長を１回走査した。振幅に関する値を２２０〜２１３ｎｍで平均して、実験全体を通してのβ-シート損失の程度を決定した。

【0140】

酸媒介フィブリル形成の速度を濁度によりｐＨ４．４で追跡した。化合物をＰ_２Ｏ_５上で一夜乾燥し、ＤＭＳＯに７．２ｍＭの最終濃度に溶解して、一次ストック溶液を与えた（１０× ストック）。一次ストック溶液をＤＭＳＯで５倍希釈して１．４４ｍＭの最終濃度にすることによって、二次一次ストック溶液を調製した（２× ストック）。３．６μＭのＴＴＲ（テトラマー）に対して７．２μＭの阻害剤濃度を採用するフィブリル形成を、次のように行った：使い捨てＵＶキュベットに、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＫＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）中の０．４ｍｇ／ｍＬのＷＴ ＴＴＲタンパク質溶液の４９５μＬ、並びにＤＭＳＯ中の１．４４ｍＭの二次ストック阻害剤溶液の５μＬを加えた（２× ストック）。この混合物を旋回し、３０分間インキュベートした（２５℃）。３０分後、２００ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭ ＫＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ４．２）の５００μＬでｐＨを４．４に下げた。この最終１ｍＬ溶液を旋回し、攪拌することなく３７℃で７２時間インキュベートした。ＵＶスペクトルを次に間隔：酸性化後０、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８及び１９２時間で収集した。５μＬのＤＭＳＯを含むコントロールサンプルを比較のために調製し、スペクトルを上記の時点で週数した。測定値を記録する前のキュベットの障害を防止するために、各阻害剤溶液を１０個の群で調製した。ＵＶ吸光度を得た後、その時点に対応するキュベットを捨てた。等モル（３．６μＭ）のＴＴＲ及び阻害剤を採用するフィブリル形成アッセイは、次のように調製した１× 二次ストック溶液を用いて、上記のように行った：７．２ｍＭ １０× 一次ストック溶液をＤＭＳＯで１０倍希釈して０．７２ｍＭの最終濃度にすることによってストック溶液を調製し、上記のようにフィブリル形成アッセイに使用した。全ての化合物は実験の経過全体を通して可溶性であることが認められ、濁度がＴＴＲアミロイド形成の結果であることを保証した。

【0141】

ｐＨ４．４で阻害剤の存在下でのＴＴＲ四次構造を分析した。１８及び２０がＴＴＲを安定化する機構を、３．６μＭ又は７．２μＭの阻害剤の何れかの存在下での停滞フィブリル形成の条件下でタンパク質（３．６μＭ）を７２時間インキュベートすることによって評価した。７２時間後、サンプルを遠心分離し（１４,０００×ｇ）、アッセイで生成した全ての固体から上澄み液を除去した。平衡及び速度超遠心分析を、Beckman XL-I 分析用遠心分離機を用いて行った。データの取得及び分析は、以前に記載されたように行った。例えば、Lashuele, H. S.; Lai, S.; Kelly J. W. Biochemistry 1998, 37, 1785-64; 及び Lashuele, H. S.; et al. Biochemistry 1999, 38, 1356-73 参照、これらの各々は全体として参照により組み入れられる。

【0142】

ＷＴ ＴＴＲへの１８及び２０の結合を特徴付ける解離定数を、Microcal 装置 (Microcal Inc., Northhampton, MD) を用いて等温滴定熱量測定法により決定した。阻害剤の溶液（２５ｍＭトリス緩衝液中３００μＭ又は５００μＭ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２％ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０）を調製し、ＷＴ ＴＴＲ（２５ｍＭトリス緩衝液中１５μＭ又は２５μＭ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２％ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０）を含むＩＴＣセル中に滴定した。２．５μＬの最初の注入に続いて、それぞれ５．０μＬを５０回注入した（２５℃）。ブランク値を減算した後の積分は、負共同性を有する二つの逐次的結合部位のモデルに最も良く当てはまる結合等温線を生じた。データは、Microcal により提供された ORIGIN version 2.9 のＩＴＣ データモジュールを用いて、四つのパラメーター、すなわち、Ｋ_１、ΔＨ_１、Ｋ_２、ΔＨ_２を用いる非線形最小面積アプローチによってフィットされた。

【0143】

上記の本化合物を、濁度アッセイを用いてＴＴＲアミロイドフィブリル阻害剤として評価した。ＷＴ ＴＴＲアミロイドーシスを、ｐＨを４．４の最終値にジャンプさせる緩衝液添加を採用して、阻害剤と共に予備インキュベート（２５℃）したＴＴＲの酸性化によって開始した。各混合物を７２時間インキュベートした（３７℃）後、濁度を３５０〜４００ｎｍでＵＶ-vis 分光計を用いて測定した。全てのアミロイドフィブリル形成データを、阻害剤の非存在下でのＷＴ ＴＴＲアミロイド生成に正規化し、１００％フィブリル形成に割り当てた。それ故に、５％フィブリル形成は、７２時間後に９５％のＷＴ ＴＴＲフィブリル形成を阻害する化合物に対応する。各潜在的阻害剤を、３．６μＭのＴＴＲテトラマー濃度に対して７．２μＭの濃度で最初に評価した。１５％未満のフィブリル形成を可能にする化合物を、ＴＴＲ濃度と等しい濃度（３．６μＭ）で再評価して、最高効力を有する阻害剤を選択した。これらの条件下で２０％未満のフィブリル形成は、非常に良好な阻害剤の特徴である一方で、４０〜７０％阻害は適度な化合物を示す。フィブリル形成データを表１に示す。

【表1】

【0144】

【0145】

【0146】

【0147】

【0148】

【0149】

【0150】

【0151】

化合物２〜５５の阻害剤効力データに基づいて、ジハロゲン官能化疎水性環に直接結合したカルボキシレート置換親水性環は、優れた活性にとって十分であるように見える（表１）。カルボキシレートの代わりにフェノール性置換基（２〜１０）は、かなり活性の低い阻害剤を与え、親化合物１よりもはるかに劣っている。疎水性環のオルト位又はメタ位にあるハロゲンは、ハロゲンが欠如した化合物、又は単一のパラハロゲンを有するものよりも優れている。これは、メタ及びパラハロゲン化ビアリールと同じ手段でＨＢＰを補完しないことを示唆する。全てのハロゲンの完全な除去は劣った阻害剤をもたらすことがあり、おそらく、ハロゲン結合ポケットを満たすための立体的補完性が欠如しているからである（例えば、化合物１０、２１〜２２、２７、４２〜４４及び５１〜５３）。試験した条件において、最良のフェノール性化合物（８）は、親水性環上にフェノール性及びカルボキシレート官能基の両者を有する１よりも劣っている。単一カルボキシレートで安定化されたビアリール化合物（例えば１１〜２２）は、優れたアミロイドフィブリル阻害剤であることがあり、例えば、化合物１１、１２及び１５〜２０である。これらは、パラハロゲンだけを含むもの（例えば化合物１３及び１４）を除いて、阻害に関してジフルニサルの好敵手である。メタ又はパラ置換アリールカルボキシレートは、優れた阻害特性を賦与するのに十分であることがあり、１におけるヒドロキシ置換基は、良好な阻害剤活性にとって必要でないことを示唆する。加えて、パラカルボキシレート配置は優れた阻害剤を与えるようであり、パラカルボキシレートが、化合物２０の場合のように、Ｌｙｓ １５及び１５’ のε-アンモニウム基との静電相互作用（前部結合モード）を、又は化合物１８の場合のように、Ｓｅｒ １１７及び１１７’ ヒドロキシル基との水素結合相互作用（背部結合モード）をより良く利用できることを示唆する。疎水性環がパラ位以外の位置でハロゲンにより置換されており、かつ親水性環がメタ及び特にパラカルボキシレートにより置換されているビアリールは、著しく効果的なＴＴＲアミロイドフィブリル形成阻害剤を生じる。

【0152】

また、カルボキシレート置換基を含む環へのヒドロキシル置換基の付加（サリチル酸置換基、例えば、化合物２３〜２７）は、ジフルニサルと同様の高い活性を有する阻害剤をもたらすことがある。サリチル酸コアを有するビアリールにおいて、ハロゲンの正確な配置は前の場合のように不可欠であるようには見えず、この環が結合エネルギーに不均衡に寄与することを示唆する。パラヒドロキシルは、Ｌｙｓ １５及び１５’ のε-アンモニウム基との水素結合（前部結合モード）、又はＳｅｒ １１７及び１１７’ ヒドロキシルとの水素結合（背部結合モード）に関与することができる。１におけるフッ素の塩素による置換（２６）は、同等又は優れた活性を有する阻害剤をもたらすことがある一方で、ハロゲンの完全な除去（２７）は適度な阻害剤をもたらすことがある。２７はインビトロでパラカルボキシレート２２よりも僅かに優れており、そして両者はメタ位にカルボキシレートを有するハロゲン不含の阻害剤２１、及びヒドロキシル含有類似体１０よりも優れていることに注目すべきである。

【0153】

パラ位又はメタ位の何れかにカルボキシレートを有するハロゲン含有環上への３’,５’-ジハロ-４’-カルボキシル置換基の加入（２８〜３１）は、ジフルニサルと同様の高い活性をもたらすことがある。４-ヒドロキシルは、ＴＴＲの天然リガンドであるチロキシンをより綿密に模倣させるために加えられた。また、これらの阻害剤は、チロキシンのホルモン活性をより綿密に模倣することができ、それ故にチロイド作用剤又は拮抗剤（望ましくないことのある効果）として作用することができる。

【0154】

カルボキシレートをメチルエステルとして保護するか又はヒドロキシルをメチルエーテルとして保護すると（３２及び３３）、１よりも劣った阻害剤をもたらすことがある。電荷の喪失と立体的嵩の増加との組み合わせが、これらの観察をおそらく説明する。全ての親水性置換基の除去（例えば、３４〜３８）は、劣った阻害剤をもたらすことがある。メタ塩素置換だけを含むビアリール化合物（例えば、３８）は、適度な阻害剤であることがあり、塩素はフッ素含有ビアリール（３７）と比較して、ハロゲン結合ポケット中での向上した接触を作ることを示唆する。

【0155】

幾つかの塩素含有阻害剤を合成し、それらのＴＴＲフィブリル阻害活性を評価した。この阻害剤のクラスのメンバーがメタ位又はパラ位にカルボキシレートを含む場合には（例えば、４５及び４６）、それらは高い活性を有することがある一方で、オルトカルボキシレートを有するもの（例えば４７）は劣った阻害剤であることがある。この観察は、オルトカルボキシレートが、好ましい静電相互作用（前部結合モード）を作るためにはＬｙｓ １５及び１５’ のε-アンモニウム基から、又は水素結合相互作用（背部結合モード）を行うためにはＳｅｒ １１７及び１１７’ ヒドロキシル基から遠すぎるかもしれないことを示唆する。ベンジルアルコール４８〜５０は、驚くべきことに、フィブリル形成の優れた阻害剤であることを証明した。一方の環上のメタジクロロ置換は、オルト位、メタ位又はパラ位の何れかにあるベンジルアルコールによって補完されるように見え、場合によっては水素結合又は水媒介水素結合のためである。-ＣＨ_２ＯＨ基をアルデヒド官能基で置き換えた一連のアルデヒド類似体（３９〜４１）は、パラアルデヒド４１の場合を除いて、良好な阻害を示し、おそらくアルデヒドが水和してジェム型ジオールになるためである。ベンジルアルコール及びカルボキシレートは、ポケット中で異なる機構により結合することが可能である。しかしながら、構造の情報がなくては、類似する結合モードを排除することはできない。アルデヒドは、Ｓｅｒ １１７（１１７’）にヘミアセタールを介して、又はＬｙｓ １５（１５’）にイミン結合を介しての何れかで結合することも可能である。アルデヒドの場合にフッ素による塩素の置換（５４及び５５）は、むしろ劣った阻害剤をもたらすことがある（３９及び４１）。上記のように、ハロゲンの完全な除去は、活性が適度であるメタアルデヒド４３の場合を除いて、劣った活性を有する阻害剤をもたらすことがある（４２及び４４）。この適度な活性は高度の水和に起因するかもしれない。３’,５’-ジフルオロ-メタアルデヒド（５４）が、ハロゲンが欠如したアルデヒド（４２）よりも劣ることは驚くべきである。

【0156】

ＴＴＲの濃度（３．６μＭ）と等しい濃度でＴＴＲフィブリル形成を５０％未満に保持する阻害剤を、それらが血漿中の他の全てのタンパク質に対して選択的に結合する能力についてさらに評価した。ジフルニサルの血中濃度は、単回５００ｍｇの投与後２０時間に３０μＭ、又は同じ投与後４時間後に３００μＭを超えることがある。この高レベルの持続血漿濃度は優れた生物学的利用率を示唆するが、より選択的な阻害剤はより低い用量及び潜在的により少ない副作用を可能にするだろう；それ故に、ヒト血漿を阻害剤のこのサブセットと共に１０．８μＭの最終濃度でインキュベートした（ヒト血漿中の平均ＴＴＲ濃度は約５μＭである）。次いでＴＴＲを、樹脂結合抗体を用いて捕獲し、固定化したＴＴＲをＴＳＡ（トリス食塩水）／０．０５％サポニンの溶液で３回洗浄し、続いてＴＳＡで２回洗浄した。ＴＴＲ-阻害剤複合体を１００ｍＭトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）で樹脂から遊離させ、存在する阻害剤のＴＴＲに対する化学量を逆相ＨＰＬＣにより決定した。ＴＴＲテトラマー当たり最高で２当量の阻害剤が、結合することができる。洗浄関連損失のためにより低い限界を表す、洗浄後の血漿中結合の化学量は、表１にまとめて示されている。塩素含有ビフェニルは、ヒト血漿中のＴＴＲの結合に対して選択的であることがある（平均化学量は０．８、理論的に最高の化学量は２．０、表１参照）。観察された平均化学量は、試験した全ての阻害剤について０．４であった。フッ素含有阻害剤、１８及び２０は、それぞれ極めて良好かつ許容できるＴＴＲに対する結合選択性を示し、同じ条件下で１により示された０．１３の化学量よりも優れていた。表１に報告した化学量の値は、多クローン性抗体樹脂上に留められたＴＴＲからの阻害剤の洗浄関連損失のために、より低い表すことがある。３０及び４１に関するＴＴＲ結合選択性の結果は、これらの化合物が上記のようにＴＴＲに共有結合できるので、慎重に考慮すべきである。

【0157】

インビトロで優れたＴＴＲアミロイドフィブリル阻害データを示すが、それにもかかわらず劣った血漿選択性を示す阻害剤は、アルブミン中の薬剤結合部位及び／又は血漿中に存在する他のタンパク質中の同様の結合部位に優先的に結合することがある。このような阻害剤が、血漿又はＣＳＦのような複雑な環境においてＴＴＲの誤った折り畳み及びアミロイド沈着を防止することはありそうにない。

【0158】

ＴＴＲに結合した１並びにその３種の類似体２６、１８及び２０の高分解能Ｘ線共結晶構造は、ＴＴＲを１０倍モル過剰量の阻害剤で３週間を超えて浸漬することによって得た。結晶学的統計値を表２にまとめて示す。

【表2】

【0159】

ジフルニサル（１）は前面及び背面モードの両方でＴＴＲに結合する。ＴＴＲの各ホルモン結合部位において、ジフルニサルの四つの異なる結合立体配座は、ほぼ等しい占有期間を有することが見出された -- 二つの対称的に等価な結合様式を有する前面及び背面結合モード。ジフルニサルのジアリール系は、ホルモン結合ポケットの中心から離れていた、そして二つの明確な位置を占めて、ＴＴＲのホルモン結合ポケット中の電子密度の「Ｖ」字形の円錐を形成する。この結合モードは、阻害剤と、Ｌｅｕ１７、Ａｌａ １０８、Ｌｅｕ１１０、Ｔｈｒ １１９及びＶａｌ １２１により形成されたＴＴＲの疎水性ポケットとの、疎水性及びファン・デル・ワールス相互作用の両者を増強する。背面結合モードは、カルボキシル基と、内部結合ポケットにおけるＴｈｒ １１９の側鎖酸素及びＡｌａ １０８の主鎖酸素との水素結合相互作用により増補された。驚くべきことに、Ｓｅｒ １１７は、多重立体配座を取ることも、阻害剤との静電相互作用を形成することもない。背面結合モードにおいて、ジフルニサルのフッ素置換基の一方は、Ｔｈｒ １１９側鎖酸素から水素結合距離内にあった（３．３Å）。外部結合ポケットにおいて、Ｌｙｓ １５’ の側鎖原子に関する電子密度は、低いシグマレベルでしか目に見えず、それが一つより多い立体配座であるかもしれないことを示した。Ｌｙｓ １５残基に関して最も可能な立体配座を、前面結合モードにおけるジフルニサルのカルボキシル基からの水素結合距離でモデル化した。

【0160】

化合物２０は、前面結合モードでＴＴＲに結合し、カルボキシレート置換親水性環は外部結合ポケット内に配向してＬｙｓ １５及び１５’ と電気的に相互作用する。フッ素化アリール環は、ハロゲンがＨＢＰ２及び２’ 中に配置された内部結合ポケット中に位置する。興味深いことに、両方の結合部位の綿密な調査は、ビフェニル環の配位に有意な相違があることを明らかにした。フェニル環の平面間の角度は、一方の結合部位で３２．６度から他方で６３．８度に変化する。この観察は、２０がＴＴＲと負共同的に結合する結果であるかもしれない。

【0161】

化合物１８は、背面結合モードでＴＴＲに結合し、カルボキシレート置換親水性環は、Ｓｅｒ １１７及びＳｅｒ １１７’ の水素結合距離内で、内部結合ポケット内に配向している。両方の環は相互に関して３４度回転されて、Ｌｅｕ１７、Ａｌａ １０８、Ｖａｌ １２１及びＴｈｒ １１９との疎水性相互作用を利用する。フッ素はハロゲン結合ポケット１及び１’ 中に位置する。背面結合モードは予期されず、それどころか、カルボキシレートは外部ポケット中に位置してＬｙｓ １５及び１５’ との静電相互作用を利用したことが想定され、フッ素がハロゲン結合ポケット２及び２’ 中に留められた。しかしながら、背面結合モードは、それが以前にジクロフェナク（ビアリールアミン）及び幾つかのジクロフェナク類似体で観察されたので、全く驚くべきことではなかった。

【0162】

ジフルニサルにおけるフッ素の塩素による置換は、ＴＴＲへの２６の結合に有意な相違を誘発した。化合物２６はＴＴＲに背面結合モードで結合し、カルボキシル置換アリール環は内部結合ポケット中に配向し、そして塩素はハロゲン結合ポケット２及び２’ 内に留められる。１８及び２０のように、化合物２６もまた、ホルモン結合ポケットの中心を占める。ＴＴＲプロモーターの残基Ａｌａ １０８、Ｌｙｓ １５、Ｌｅｕ１７、Ｌｅｕ１１０、Ｌｙｓ １７及びＴｈｒ １１９は、阻害剤とのファン・デル・ワールス及び疎水性相互作用を形成する。内部結合ポケットにおいて、Ｓｅｒ １１７の側鎖は二つの立体配座で存在して、２６のカルボキシル置換基及び他方のモノマーのＳｅｒ １１７と相互作用する。２６の同じカルボキシル酸素もまた、Ｓｅｒ １１７の主鎖酸素との水素結合相互作用を形成する。２６の他方のカルボキシル酸素は、Ａｌａ １０８の主鎖酸素と水素結合を形成する。ジフルニサルとは対照的に、Ｔｈｒ １１９残基は、阻害剤から離れて配向し、阻害剤との水素結合よりはむしろ、結合ポケットの疎水性に寄与する。

【0163】

これらの阻害剤の作用機構を精査するために、それらが時間の関数としてＴＴＲを尿素媒介解離に対して保護する能力を評価した。テトラマーの解離速度を、モノマーの再折り畳みを可能にする濃度を超える尿素濃度を採用して、急速な容易に監視できるモノマーの展開に非可逆的に関連付けた。展開で監視した解離を、６．５Ｍ尿素中で far ＵＶ-ＣＤによって精査し、酸媒介アミロイド生成の良好な阻害剤全てがテトラマーの解離速度を用量依存性の様式で減速したことを明らかにした（図２Ａ及び２Ｂ）。２０、４６及び４８を含む幾つかの阻害剤は、アミロイド生成の律速段階であるＴＴＲテトラマーの解離に対して劇的な効果を示す。例えば、Hammarstroem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 16427-32 参照、これは全体として参照により組み入れられる。

【0164】

これらの化合物によるＴＴＲフィブリル形成の阻害モードは、基底状態の安定化によるテトラマー解離バリアの用量依存性チューニングではないかと疑われるので、最良の阻害剤はテトラマー解離を最大に減速すべきである。フィブリル形成の速度を、４．４の最終ｐＨでの濁度により１９２時間にわたって監視した。図３Ａ、３Ｂ、４Ａ及び４Ｂ参照。テトラマーＴＴＲを低いｐＨで安定化する能力を有する阻害剤は、テトラマーの解離、誤った折り畳み及びアミロイドへの集合ミスを防止するだろう。アミロイドフィブリル形成の最良の阻害剤は、テトラマーの解離を最大に減速するものである（図２Ａ及び２Ｂ参照）。しかしながら、幾つかの阻害剤は酸性条件でよりも尿素中で良く結合し、その逆でもあるので、相関関係は完全でない。

【0165】

阻害剤がＴＴＲのテトラマー形態を安定化していることを確実にするために（３．６μＭ）、ＴＴＲの四次構造を、平衡及び速度分析超遠心研究により精査した。１８及び２０（３．６μＭ又は７．２μＭ）と共に７２時間インキュベートした後の四次構造を決定した。テトラマーは、平衡ＡＵＣ並びに速度研究において３．６μＭ又は７．２μＭの阻害剤濃度で優勢な種であった。

【0166】

等温滴定熱量測定法を、ＴＴＲへの１８及び２０の結合定数をｐＨ８．０（２５℃）で決定するために採用した。ジフルニサル及びこれら２種の類似体は、多くの他の類似体により示される特性である負共同性でＴＴＲに結合する。第一部位での結合は、ジフルニサル及び２０の場合には、第二部位での結合よりも１５倍強い。ビアリール１８は、Ｋｄ_２ よりも１２０倍低いＫｄ_１ を有する（表３）。表３は、ＩＴＣにより決定したＷＴ型ＴＴＲへの１、１８及び２０の結合に関する第一及び第二解離定数をまとめて示している。１に関する解離定数は先に報告したが、ここには比較のために提供する。実施例１参照。

【表3】

【0167】

テトラマーＷＴ ＴＴＲは、４２時間のｔ１／２で解離し、そして５００,０００倍速く展開する。それ故に、その解離定数は、それを６．５Ｍ尿素中で非可逆的である展開と関連付けることにより精査することができる。テトラマーの解離はアミロイド生成にとって律速的なので、優れたインビトロ活性及び血清中で０．５０を超える化学量を示す全ての阻害剤は、推定した作用機構、すなわち野生状態への選択的結合による動力学的安定化が正しいならば、テトラマーの解離を減速するはずである（図２Ａ及び２Ｂ参照）。

【0168】

ＴＴＲテトラマーの解離速度を、６．５Ｍ尿素中で１６８時間の経過にわたって阻害剤濃度の関数として測定した。選択した阻害剤、具体的には１８、２０、３９、４１、４５、４６、４８及び４９は、阻害剤なしでＴＴＲに対する振幅の変化に反映されるように、テトラマー解離の程度の全体的な減速を１６０時間にわたって示した。また、テトラマーの解離速度は、時間経過の傾斜に反映されるように、阻害剤の存在下で劇的に減速される。阻害剤２０、４５、４６及び４８が優れており、おそらく、これらの阻害剤の結合親和性が尿素中で高いので、ＴＴＲ・Ｉ及びＴＴＲ・Ｉ_２ から非常にゆっくりと解離するからである。ＴＴＲ・Ｉ及びＴＴＲ・Ｉ_２ の形成は、実質的に２０、４５、４６及び４８の場合に、このような複合体のＫ_ｄが低いため天然状態を有意に安定化することがあり、そしてテトラマーの解離に対する動力学的バリアを上昇させることがある。１６及び１８はＴＴＲに結合するとしても、それらの親和性は動力学的安定化に影響を与えるには不十分であるように見える。同様に、３．６μＭの阻害剤濃度（３．６μＭタンパク質）において尿素中での阻害剤効力のランク順序付けは、２０ ≒４５＞４６ ≒４８＞であり、これは７．２μＭの阻害剤濃度とは異なる（２０ ≒４６＞４５ ≒４８＞）。これは尿素中でのＫｄ_２ の相違を反映しているようである。

【0169】

天然状態の動力学的安定化は、誤った折り畳まれたオリゴマーがアミロイド経路をオンにしようとオフにしようと、神経毒性である。阻害剤による動力学的安定化の達成は、ＳＳＡ、ＦＰＡ及びＦＡＣに対して非侵襲性治療を提供することができる。

【0170】

所定の阻害剤の存在下での尿素中のテトラマーの解離速度は、低いｐＨでアミロイド症を抑制する阻害剤の能力を必ずしも予言しない。アミロイドがヒトにおいてどのように及びどこで生成するのかはまだ明らかでないので、種々の変性環境で良く機能するＴＴＲテトラマー安定化剤が望ましい。阻害剤濃度の関数としてのＴＴＲフィブリル形成速度を、酸性条件下で探求した（図３Ａ，３Ｂ，４Ａ及び４Ｂ参照）。阻害剤２０、４５及び４８は、この環境でも格別に良く機能する。阻害剤４６は酸中でよりも尿素中で、より良好なテトラマー安定化剤である一方で、１は尿素中でよりも酸中ではるかに良好である。所定の環境でＴＴＲ・Ｉ及びＴＴＲ・Ｉ_２ 複合体の形成に関連する安定化の自由エネルギーは、基底状態の安定化及びテトラマーの解離のための活性化自由エネルギーの関連した減少の程度を決定する。これらのデータは、阻害剤が６．５Ｍ尿素中でＴＴＲテトラマーの解離を減速するよりもはるかに効率的に、低いｐＨでＴＴＲアミロイド沈着を減速する。これは、アミロイド生成が解離後に濃度依存性再集合を必要とするからであるかもしれない。より効果的な阻害剤は、ＴＴＲのモノマーアミロイド生成中間体の濃度を、フィブリル形成を極めて非効率的にするのに十分低いレベルに保持できるものである。阻害剤の存在下でＴＴＲの尿素変性において観察されたように、低いｐＨでの阻害剤効力のランク順序付けは、３．６μＭ阻害剤（図３Ａ及び３Ｂ）と７．２μＭ阻害剤濃度（図４Ａ及び４Ｂ）とで有意に異なる。この観察は同様に、低いｐＨにおける阻害剤のそれぞれのＫ_ｄ２ 値の相違を反映する。最も劇的な例は、ジフルニサルのものであり − そのＫ_ｄ２ が比較的に高いため、３．６μＭでフィブリル形成の最も効力ある阻害剤の一つであるが、７．２μＭで最も効力の低いものの一つである。

【0171】

ジフルニサル類似体は、ＴＴＲアミロイド症を治療するための化合物の有望なクラスを表す。幾つかのジクロフェナク類似体はフィブリル形成の極めて良好な阻害剤であるが、ジフルニサル類似体は著しく有効なＴＴＲテトラマー安定化剤の追加のクラスを提供する。幾つかのジクロフェナク類似体は、２種のＴＴＲ突然変異体 − Ｖａｌ ３０Ｍｅｔ及びＬｅｕ ５５Ｐｒｏの解離及び誤った折り畳みに起因するフィブリル形成を阻害する能力を提供する。Ｘ線共結晶構造は、ジクロフェナク類似体が主に背面結合モードで結合するが、ジクロフェナク類似体の構造における僅かな乱れは、前面又は背面結合の何れかを可能にすることを実証した。加えて、ジフルニサルは前面又は背面結合モードの何れかで結合することができ、占有期間は両方のモードでほとんど等しい。ジクロフェナクについて得られた解離定数（Ｋ_ｄ１ に関して６０ｎＭ及びＫ_ｄ２ に関して１２００ｎＭ）を、ジフルニサル及び２０について得られたのと比較可能であり、１８は、そのＫ_ｄ２ 値により説明されるように、第一結合イベントについてほぼ１０倍強固な結合を実証した。加えて、両方の阻害剤クラスは、負共同結合を示した。最も顕著には、幾つかのジフルニサル類似体はヒト血漿中のＴＴＲに対して極めて選択的であり、減少した毒性及び副作用の可能性を提供した。例えば、Oza, V. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 321-32 参照、これは全体として参照により組み入れられる。

【0172】

１２種の合成した化合物は、ＴＴＲアミロイド生成を実質的に阻害することができる。もちろん、幾つかは、ヒト血漿中で０．５０を超える結合化学量を示した。良好な阻害剤の塩素化及びフッ素化アリール基礎構造の両方は公知の薬剤に見出され、それ故に、これらの化合物又はそれらの類似体が、１のＮＳＡＩＤ活性を示さない薬剤に発展できると信じるだけの十分な理由がある。フッ素化化合物１８及び２０は、６．５Ｍ尿素中でテトラマーＴＴＲに結合してそれを安定化することができ、誤った折り畳み及びアミロイド生成の第一段階、すなわちＴＴＲテトラマーの解離を劇的に減速させる。これらの化合物、及び他のものもまた、酸媒介ＴＴＲアミロイド生成を劇的に減速させる。試験した化合物のうち、１８、２０、３９、４１、４５、４６、４８及び４９は、尿素中及び酸性条件下でのＴＴＲテトラマーの安定化において最も良く機能した。これらのビアリール化合物は、アミロイド形成にとって律速段階であるテトラマー解離に関連する活性化バリアを基底状態の安定化によって増大させるように見える。

【0173】

実施例３： 経口投与したジフルニサルはトランスチレチンを変性に対して安定化する
トランスチレチン（ＴＴＲ）は、チロキシン及びホロレチノール結合タンパク質を輸送するホモテトラマータンパク質である。変性条件において、律速的テトラマー解離及び急速なモノマーの誤った折り畳みは、集合ミスさせてアミロイドが原因となる老人性アミロイド症、家族性アミロイド多発性神経障害及び家族性アミロイド心筋症にすることがある。ＴＴＲ中の二つの未占有チロキシン結合部位の少なくとも一方へのジフルニサルの結合は、ＴＴＲテトラマーを安定化し、またインビトロで解離活性化バリアを増大させることが知られている。ＴＴＲアミロイド症の治療のためにジフルニサルを使用する実現可能性を調査した。

【0174】

方法
３０人の健康ボランティア（男性２５人、女性５人）を、インフォームドコンセントを与えた後に登録した。被験者は年齢２３〜５３歳の範囲にあり（平均年齢、３７．６±８．８）、平均体重は７８．０±１２．１ｋｇであった。各被験者を、ジフルニサル（Dolobid (登録商標)）を用いて、１２５、２５０又は５００ｍｇの用量を毎日２回（１２時間毎に）、７日間治療した（合計１３用量）。治療前の第１日目は治療前に、そして第８日目はジフルニサル服用後の４及び１２時間に、採血した。この研究計画は、Human Subjects Committee of Scripps Clinic、Scripps Green Hospital、The Scripps Research Indtitutem 及び The Scripps General Clinical Research Center により認可された。

【0175】

血清ジフルニサルレベルを測定した。１００μＬの血清を、９００μＬのアセトニトリルに加えてタンパク質を沈殿させた。遠心分離した後、１００μＬの上澄み液を９００μＬの１００ｍＭ水性トリエチルアミン、ｐＨ１１．５に加えた。濾過した後、１００ｍｌの各サンプルを、溶液Ｂの４０〜１００％勾配を１０分間にわたって用いて Keystone 3-cm C18 逆相カラム上に注入し(溶液Ａ：９４．８％水／５％アセトニトリル／０．２％トリフルオロ酢酸；溶液Ｂ：９４．８％アセトニトリル／５％水／０．２％トリフルオロ酢酸)、Waters 600E 多溶剤配送装置により集めた。検出は、２８０ｎｍで Waters 486 チューナブル検出器により行い、ピークを積分して標準曲線からジフルニサル濃度を得た。

【0176】

ヒト血清中のＴＴＲへのジフルニサル結合の化学量を分析した。セファロースの１：１のゲル／１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０／１４０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２５％ＮａＮ_３（ＴＳＡ）スラリー（６２．５μＬ）を、５００μＬの血清に加え、４℃で１時間インキュベートした。遠心分離した後、４００μＬの上澄み液を抗ＴＴＲ抗体と結合したセファロースの１：１のゲル／ＴＳＡスラリーの２００μＬに加え、４℃で２０分間ゆっくりと振動した。遠心分離した後、ゲルを１ｍＬのＴＳＡ／０．０５％サポニン(Fisher Scientific) (２回、それぞれ１０分間)、さらに４℃で１ｍＬのＴＳＡで洗浄した（１回、１０分間）。次いで１５５μＬの１００ｍＭ水性トリエチルアミン、ｐＨ１１．５を加えて、ＴＴＲ及び結合したジフルニサルを抗体から溶離した。４℃で３０分間穏やかに振動した後、サンプルを遠心分離し、１４５μＬの上澄み液を分離した。サンプルの１３５μＬ注入分を分離し、上記のように分析した (Purkey et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5566-71)。

【0177】

尿素変性に対する血清ＴＴＲテトラマー安定性を評価した。１０μＬの血清サンプルを５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０；１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中の９０μＬの種々の濃度の尿素中でインキュベートした(２５℃)。尿素溶液を屈折率によりチェックして、用意した濃度を重量で確認した。タンパク質のグルタルアルデヒド交差反応を、１０μＬのグルタルアルデヒド（２５％）の添加により行った。交差反応を４分間進行させた後、１０μＬのＮａＢＨ_４（０．１Ｍ ＮａＯＨ中７％）の添加により停止した。サンプルを１２０μＬのＳＤＳ還元ゲル負荷カクテル(最終ＳＤＳ濃度＝２．５％)と混合し、５分間沸騰させた。１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いてサンプルを分離し、抗ＴＴＲ抗血清を用いる免疫ブロッティングにより分析した (Purkey, supra)。

【0178】

酸変性に対する血清ＴＴＲテトラマー安定性を評価した。１０μＬの血清サンプルを９０μＬの１００ｍＭ酸性化緩衝液中でインキュベートした(３７℃)。＜３．８の最終ｐＨが望ましい場合にはクエン酸塩緩衝液を用い；評価するｐＨ範囲が４．２〜５．４である場合には酢酸塩緩衝液を採用した。交差反応の後、サンプルを上記のようにＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びる免疫ブロッティングにより分析した。

【0179】

組み換えＷＴ ＴＴＲ及び変異体を、ＴＴＲ及びアンピシリン耐性遺伝子を含むｐｍｍＨαプラスミドで形質転換した BL21/DE3 Epicurian gold Escherichia coli (Stratagene) 中で発現させた。発現及び精製を上記のように行った (Lashuel et al., Biochemistry 1999; 13560-73)。

【0180】

ＴＴＲテトラマーの解離速度を、円偏光二色性分光法により測定した。テトラマー解離速度の評価を、６．５Ｍ尿素中の組み換えＴＴＲ(３．６μＭ)、すなわち四次構造変化のための遷移後領域の濃度を用いて行った (Hammarstroem et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99, 16427)。時間の関数としてのＴＴＲの far-ＵＶ ＣＤスペクトル（２１０〜２２０ｎｍ）を測定して、遅いテトラマー解離を速い四次構造に関連付けることにより、遅いテトラマー解離を評価した。

【0181】

フィブリル形成アッセイを次のように行った。組み換えＴＴＲストック溶液（７．２μＭ）を１００ｍＭ酸性化緩衝液で１：１に希釈した。＜３．８の最終ｐＨが望ましい場合にはクエン酸塩緩衝液を用い；評価するｐＨ範囲が４．２〜６．０である場合には酢酸塩緩衝液を採用し、ｐＨ６．５でのアミロイド生成を評価するためにはリン酸塩緩衝液を利用した。フィブリル形成の程度を、４００ｎｍでの濁度測定値により精査した。

【0182】

フィブリル形成の動力学を次のように測定した。組み換えＴＴＲの溶液（７．２μＭ）を、等量の１００ｍＭ酢酸塩緩衝液と混合して４．４の最終ｐＨにした。サンプルを３７℃でインキュベートし、４００ｎｍでの濁度を１６８時間の経過にわたって監視した。別々のサンプルを各時点のために作った。

【0183】

尿素媒介テトラマー解離及びｐＨ媒介フィブリル形成に対するジフルニサルの効果は、ＴＴＲ溶液にジフルニサルを加え、これを３時間インキュベートした（３７℃）後、タンパク質を尿素変性又はｐＨ媒介アミロイドーシスに付することによって評価した。

【0184】

結果
１３回目の用量を服用した後の４及び１２時間にＨＰＬＣにより測定した平均血清ジフルニサル濃度は、毎日２回１２５ｍｇのグループでは２０．１±７．１及び６．９±３．０μＭ、毎日２回２５０ｍｇのグループでは２３３．５±７６．０及び１４５．８±３８．９μＭ、そして毎日２回５００ｍｇのグループでは５１７．０±７９．５及び４２１．９±７８．１μＭであった。毎日２回２５０ｍｇ及び毎日２回５００ｍｇのグループで観察されたこれらの濃度は、血清中のＴＴＲ濃度（３．６〜７．２μＭ）に対して極めて高く、そして小分子のための複数の結合部位を有する競争タンパク質、例えばＴＢＧ（０．３〜０．５μＭ）及び／又はアルブミン（５８０〜７２５μＭ）への結合が高親和性結合でないならば、２の最高値に近いジフルニサル結合化学量を生じるはずである。

【0185】

ジフルニサルは少なくとも１、そして最大動力学的安定化を観察するためには理想的に２の化学量で血中テトラマーＴＴＲに結合する。各被験者におけるジフルニサルの化学量に関する下限を設定するために、上記のように、固定化樹脂に結合した多クローン性抗体からトランスチレチンを免疫沈降させた (Purkey, supra)。固定化したＴＴＲを３回洗浄して非特異的結合を除去した後、ＴＴＲ-ジフルニサル複合体を樹脂から分離し、標準曲線を採用するＨＰＬＣにより化学量を決定した。服用後の４及び１２時間に血清中のＴＴＲに結合したジフルニサルの化学量は、毎日２回１２５ｍｇのグループでは０．４５±０．１１及び０．３１±０．１２ｍｇ、毎日２回２５０ｍｇのグループでは１．１２±０．０８及び０．９５±０．１３ｍｇ、そして毎日２回５００ｍｇのグループでは１．５１±０．０９及び１．４８±０．０８ｍｇであった。ジフルニサル化学量は≒３００μＭまでその血清濃度が増加した。３００μＭの血清濃度で１．５の予想最大化学量より低い値は、方法の制限（洗浄関連損失）及び／又は他の血漿タンパク質へのジフルニサルの結合に起因し、それ故にジフルニサル結合化学量の研究を組み換えＴＴＲで行った。洗浄関連損失は、主に低親和性部位から解離するために、１．５の最大化学量を説明する。ジフルニサルはＴＴＲに負の共同性で結合し、それ故に、低親和性部位からの解離は劇的に早い。緩衝液中での予想結合化学量は、等温滴定熱量法により決定した解離定数（Ｋ_ｄ１、７５ｎＭ；Ｋ_ｄ２、１．１μＭ）に基づいて計算した。計算した化学量及び実験的に決定した化学量（後者は免疫沈降（３回の洗浄）及びＨＰＬＣから導いた）を一緒にプロットすると、真の化学量が毎日２回２５０ｍｇにおいて１．７５〜１．９１であると推定することを可能にする。

【0186】

被験者におけるジフルニサル（１００μＭ）結合化学量（０．８〜１）と組み換えＴＴＲ（１．５）との比較は、ＴＴＲのほかに血清タンパク質への有意な結合を明らかにし、ＴＴＲにいっそう選択的に結合するジフルニサル類似体を開発する動機を与える。全てのグループにおいてジフルニサル投与後に、ＴＴＲの血清レベルは増加し、そして全Ｔ_４及びＲＢＰの血清レベルは減少した。これらの知見は、ジフルニサルがＴＴＲの代謝に影響を与えることを示唆する。しかしながら、毎日２回５００ｍｇのグループにおいて、アルブミンの血清レベルは有意に減少し、そしてＢＵＮ及びクレアチニンは僅かに減少した。毎日２回２５０ｍｇのグループにおいて、アルブミンの血清レベルは中程度に減少し、そしてＢＵＮ及びクレアチニンは僅かに減少した。

【0187】

経口投与したジフルニサルが血清ＴＴＲをアミロイドーシスを含む変性ストレスに対して安定化すことを実証するために、新しい方法を開発した。この方法は、ＴＴＲの誤った折り畳みの疾患を予防するであろう化合物を同定するための代理マーカーとして役立つ。被験者からの全血清を、尿素（０〜９Ｍ）の添加又は酸（ｐＨ３．８〜５．４）の添加の何れかによる変性に付した。ＴＴＲは変性のために解離するはずなので、四次構造の変化を用いて回転の程度を監視することができる (Hammarstroem et al, supra)。グルタルアルデヒドを加えて変性ストレスに付し、かつＴＴＲのどの分画が正常に折り畳まれるか（テトラマー又はダイマー）に対してどの分画が変性されるか（モノマー）を確立した後の血清中の全てのタンパク質を交差反応させた。全血清のＳＤＳ-ＰＡＧＥは、交差反応したＴＴＲテトラマー及びダイマー（これらは折り畳まれたＴＴＲを表す）をモノマーから分離する。免疫ブロッティングは、折り畳まれたＴＴＲの量の定量的比較を可能にする。多クローン性抗体は、展開したＴＴＲモノマー並びに折り畳まれたＴＴＲにはほとんど結合せず、それ故に、ジフルニサルの非存在下及び存在下でのテトラマー及びダイマーのバンドの密度を比較することが最も有用である。また、ＴＴＲ変性のジフルニサル阻害の時間依存性を、この方法により評価することもできる。この方法がジフルニサルの存在下でほとんど時間依存性でないことは、ジフルニサルによる基底状態の安定化がテトラマー解離バリアを乗り越えられなくする動力学的安定化機構を強く支持する（実施例１参照）。これらの変性時間経過におけるジフルニサル（毎日２回２５０ｍｇ）の効力は、測定した化学量（０．８〜１．２）が予想したよりも良好であり、免疫沈降法が実際の結合化学量を、それが１を超える場合には特に、過小評価するというさらなる証拠を与える。

【0188】

ヒトにおけるジフルニサル結合化学量の範囲、及び試験管中でこれらの化学量を模倣するのに必要なジフルニサルの濃度を知ることは、ＴＴＲ・ジフルニサル及びＴＴＲ・ジフルニサル_２ 複合体が解離及びアミロイドーシスを防止する機構を精査するための適切なインビトロ生物物理学的研究を行うことを可能にする。尿素媒介（６．５Ｍ）解離速度及び酸媒介（ｐＨ４．４）アミロイドフィブリル形成速度を、ジフルニサル濃度（５、１０、２０及び６０μＭ）の関数として研究し、用量依存性減速を明らかにした。テトラマー解離はアミロイドフィブリル形成にとって律速的であるので、尿素中でのテトラマー解離速度は酸性化により媒介されたアミロイドフィブリル形成の程度の指標となるはずであるという結果となる。ジフルニサルは尿素媒介解離の阻害よりもアミロイドーシスの阻害が良好である。なぜならば、アミロイドーシスには濃度依存性の類似性が必要だからである。ＴＴＲへのジフルニサル結合に関連するＫ_ｄ１及びＫ_ｄ２が、尿素中でよりも酸中で低いことも可能である。

【0189】

８０種を超えるＴＴＲ突然変異体が、変性エネルギー展望の配列依存性変化により、個体を遺伝性アミロイドーシスにかかりやすくする。これらのうち、Ｖ１２２Ｉのアミロイド沈着は、アフリカ系アメリカ人の３〜４％で家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）をもたらす一方で、Ｖ３０Ｍは著名な家族性アミロイド多発性神経障害（ＦＡＰ）の突然変異体である。ジフルニサルはＶ１２２Ｉ及びＶ３０Ｍアミロイド生成の両方を用量依存性様式で阻害し、このアプローチの一般性を実証する。

【0190】

ＴＴＲアミロイド生成を軽減するための一般的な非侵襲的治療方策を開発することが望ましい。本明細書で概説した結果は、ジフルニサルの経口投与が、非アミロイド生成性の天然状態への結合及びその安定化によりテトラマー解離を減速できることを示す。アミロイドフィブリルではなく、誤った折り畳まれたオリゴマーが神経変性を引き起こすという最近の報告を考慮すれば、天然状態の安定化は特に魅力的な方策である。関節リウマチ及び変形性関節症に対するジフルニサル（毎日２回２５０〜５００ｍｇ）の臨床的使用は、長期使用にとってその低い毒性を実証する。ＴＴＲの血清半減期は１２〜１５時間であり、それ故に、ジフルニサルの半減期が８〜１０時間であることを考慮すれば、毎日２回の投与が最適のようである。ジフルニサルはＳＳＡ、ＦＡＣ及びＦＡＰに対して有効であろう。なぜならば、ジフルニサルは、そのほかの点では疾患関連サブユニットからなるＴＴＲテトラマー中へのトランスサプレッサの取り込みにより利用される機構であってヒトの疾患を軽減することが知られている機構と同様に、動力学的安定化を与えるＷＴ及び変異体のＴＴＲの両者に結合するからである。ジフルニサルは、血液脳関門を乗り越えることができないのでＣＮＳアミロイドーシスに対してはあまり有効でないかもしれないが、ジフルニサル類似体（例えば、本明細書に記載した類似体）はこのような能力を有するかもしれない。

【0191】

実施例４： ヒドロキシル化ポリ塩化ビフェニルは血中のトランスチレチンを選択的に結合し、かつアミロイド生成を阻害する
ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）は、げっ歯類及び多分ヒトに毒性があると報告されている持続性の環境汚染物質である。これらの化合物の環境中での長寿は、それらの遅い分解及び高脂質親和性のためであり、これは、それらが食物連鎖の上方に移動するので生物に蓄積及び濃縮するようになる。ヒドロキシル化ＰＣＢ（ＯＨ-ＰＣＢ）はＰ４５０モノオキシゲナーゼによるＰＣＢの酸化によって形成される代謝物である。個々のＰＣＢ化合物のヒトにおける毒性に関する決定的なデータを見出すことは、市販のＰＣＢが一般的に多くの異なる異性体並びに痕跡量の公知のトキシン、例えば塩素化ジベンゾフランを含む混合物であるという事実のために困難である。しかしながら、幾つかの精製ＰＣＢの毒性は実験動物で決定されている。ＯＨ-ＰＣＢのエストロゲン性に加えて、骨損失、免疫学的毒性、神経毒性及び低下した甲状腺ホルモンは、これらの化合物の投与に関連する。

【0192】

多数の研究は、ＰＣＢ及びＯＨ-ＰＣＢがインビトロでトランスチレチン（ＴＴＲ）に結合することを実証している。ＴＴＲは、曝露された個体中でのＯＨ-ＰＣＢの持続性に寄与するヒト血液中のタンパク質標的であることが示唆されている。多数の報告はＴＴＲをインビボでのＰＣＢ結合タンパク質として示唆しているが、ＰＣＢが血漿中のトランスチレチンに結合するという決定的な証拠はない。我々は、生物学的液体中のＴＴＲへの小分子の結合化学量に下限を設定するために使用できる免疫沈降法を開発した。ここで、ヒト血漿ＴＴＲへのＰＣＢ及びＯＨ-ＰＣＢの結合化学量を評価した。

【0193】

律速的テトラマー解離、モノマーの誤った折り畳み及び集合ミスを必要とする血漿ＴＴＲの分泌後アミロイド生成は、おそらく老人性アミロイドーシス、家族性アミロイド心筋症及び家族性多発性神経障害を引き起こす。それ故に、幾つかのＯＨ-ＰＣＢがヒト血漿中のＴＴＲに選択的に結合すること、及び天然状態の部分的又は完全な動力学的安定化に導くテトラマー安定化によってアミロイドフィブリル形成を阻害することが実証される。４種の代表的なＴＴＲ・（ＯＨ-ＰＣＢ）_２ 複合体を、結合の分子基盤をより良く理解するため、そして最適化したＴＴＲアミロイド生成阻害剤の設計の基盤を与えるために、Ｘ線結晶学により特性決定した。

【0194】

ヒト血漿中のトランスチレチンに対するＰＣＢ及びＯＨ-ＰＣＢの結合選択性
８種のＰＣＢ（化合物１〜８、図５）、すなわち甲状腺ホルモンを５０ｎＭ未満のＩＣ_５０ でＴＴＲから押しのけると報告されたもの、及び１４種のＯＨ-ＰＣＢ（化合物９〜２２、図６）、すなわちマウス又はラットにおいてＴＴＲ又はより低いチロキシンレベルに結合すると報告された公知のＰＣＢ代謝物を評価した。血漿中のＴＴＲへのＰＣＢ結合化学量の下限は、ＰＣＢ又はＯＨ-ＰＣＢ（１０．８μＭ）で前処理したヒト血漿と混合したセファロース樹脂に共有結合させた多クローン性ＴＴＲ抗体を用いて確立した。洗浄した後、ＴＴＲへのＰＣＢ又はＯＨ-ＰＣＢ結合化学量（≒５μＭ）を、逆相ＨＰＬＣにより評価した。二つまでのＰＣＢが、ＴＴＲテトラマー中の二つの同一チロイドホルモン結合部位に結合することができる。ＰＣＢ１及び３を除いて、残りのヒドロキシル化されていないＰＣＢは、血漿ＴＴＲに対して比較的低い結合選択性を示した（表４）。これとは対照的に、ＯＨ-ＰＣＢは、血漿ＴＴＲに対して良好ないし優れた結合選択性を示した（表５）。幾つかのヒドロキシル化ＰＣＢ（例えば、１６及び２２）は、２の結合化学量に近づく。全血液中でのＯＨ-ＰＣＢの結合選択性は、血漿中で観察したものと極めて類似しており、それ故に赤血球膜は研究したＯＨ-ＰＣＢを有意に留めない。

【表4】

【表5】

【0195】

ＴＴＲ・ＰＣＢ複合体の抗体捕獲は、５回の洗浄段階中にＰＣＢがＴＴＲから解離するため、ＰＣＢ結合化学量を過小評価する可能性を有する。ＰＣＢ及びＯＨ-ＰＣＢ（１０．８μＭ）を組み換えＴＴＲ（３．６μＭ）と共にインキュベートして、各洗浄後に固定化ＴＴＲに結合した小分子の化学量を評価した。化学量は、ＰＣＢ２及びＯＨ-ＰＣＢ１８では５回の洗浄後に１０〜１７％だけ減少した一方で、ＰＣＢ４の化学量は４５％だけ減少した。洗浄関連損失の定量は、血漿中のＰＣＢ及びＯＨ-ＰＣＢの真の結合化学量の推定を可能にする。さらに、組み換えＴＴＲに結合したＯＨ-ＰＣＢの最終化学量と血漿中のＴＴＲに結合した量との良好な相関関係は、化合物、例えばＯＨ-ＰＣＢ１８が血漿中で高度に選択的なＴＴＲ結合剤であることを示す。これとは対照的に、ＰＣＢ２及び４は、血漿中でよりも緩衝液中で高い結合化学量を示し、それらが血漿中の競争タンパク質並びにＴＴＲに結合することを強く示唆する。

【0196】

ヒドロキシル化ＰＣＢによるＴＴＲアミロイドフィブリルの阻害
ＯＨ-ＰＣＢ及びＰＣＢ３がインビトロでＴＴＲフィブリル形成を阻害する能力を評価した。なぜならば、これらの化合物が血中のＴＴＲへの良好な結合選択性を示すからである。肝臓から血中に分泌されたＴＴＲは、全身性ＴＴＲアミロイドの源であるように見える。ヒトにおいてアミロイドがどこで又はどのように形成されるのかはまだ明らかではないが、細胞中の典型的な変性物質は酸であり、これはほとんど全てのアミロイド生成ペプチド及びタンパク質をアミロイド及び／又は関連凝集物に変換するのに有効である。それ故に、濁度により監視した酸媒介（ｐＨ４．４）フィブリル形成を採用して、阻害剤としてのＰＣＢの有効性を監視した。ヒドロキシル化ＯＨ-ＰＣＢ及びＰＣＢ３は、ＴＴＲフィブリル阻害剤として著しく効果的であった。ＷＴ ＴＴＲ濃度（３．６μＭ）と等しい阻害剤濃度において、フィブリル形成の正常量の僅かに１２〜１５％が７２時間のインキュベーション期間の後に観察された。この活性は、今日までに発見された最良のフィブリル阻害剤、例えばフルフェナミン酸（Ｆｌｕ）によって示された活性と同等であり、これを正のコントロールとして含めた。

【0197】

ＴＴＲへのＯＨ-ＰＣＢ１８の結合
前の質量分析実験は、ＯＨ-ＰＣＢ１８がＴＴＲの二つのＣ_２ 関連甲状腺ホルモン結合部位への正の結合共同性を示すことを示唆する。１８の化学量以下（＜１：１）の量をＴＴＲに加えると、質量分析計で観察された優勢な種は、アポＴＴＲ及びＴＴＲ・１８_２ 複合体であり、正共同結合と一致する。１８のＴＴＲ結合特性は、負共同性で結合する多数の他のＴＴＲアミロイドフィブリル阻害剤により示された特性とは対照的である。生理的条件下で行った等温滴定熱量研究は、ＷＴ ＴＴＲへのＯＨ-ＰＣＢ１８の結合が、解離定数が同一Ｋ_ｄ値（３．２±１．８ｎＭ）であるモデルに最もよくフィットすることを明らかにする。この結果は、正共同性結合の反証を挙げるものではない。なぜならば、不十分な熱放出のために負共同性を精査するのに十分低いＴＴＲ濃度を達成できないからである。補正したデータを正又は負共同性結合のモデルにフィットさせる試みは、劣ったフィットを生じた。

【0198】

ＯＨ-ＰＣＢ１２、１６、１７及び１８の共結晶構造
ＷＲ ＴＴＲに結合したＯＨ-ＰＣＢ１２、１６、１７及び１８の共結晶は、ＴＴＲ結晶を１０倍過剰量の阻害剤で４週間浸漬することによって得た。次いで、Ｘ線構造を複合体のそれぞれについて解いた。結晶学的不斉単位内のＴＴＲダイマーは、リガンド結合ポケットの半分を形成する。両方の結合部位は、同じ２回回転対称軸によって二分されるので、阻害剤の二つの対称等価結合モードが典型的に観察される。各ＴＴＲ結合部位は、内部及び外部キャビティに細分することができる。これらのキャビティは、それらがチロキシンの二つの芳香族環上のヨウ素により占有されるので、三つのいわゆるハロゲン結合ポケット（ＨＢＰ）を含む。ＨＢＰ３及び３’ は内部結合キャビティの奥深くに位置し、ＨＢＰ２及び２’ は内部及び外部結合キャビティ間の境界を定める一方で、ＨＢＰ１及び１’ は外部結合キャビティの周辺に位置する。共結晶構造は、ＯＨ-ＰＣＢの二つの芳香族環を結合するＣ-Ｃ結合が、２回回転対称軸上にほぼ集中しており、単結合立体配座の外観を与えることを明らかにする。二つのフェニル環の間の二面角は、１２では５９^ｏ、１６及び１７の両者では３７^ｏ、そして１８では４４^ｏである。ＯＨ-ＰＣＢの全ては内部及び外部結合ポケット中で同様に占有する。ビアリール環系のファン・デル・ワールス補完性は、各結合部位を含む一方のサブユニットに残基Ｘ’、Ｙ’ 及びＺ’ を、他方のサブユニットに残基ｎ’ ｍ’ 及びｏ’ を伴う幾つかのサブユニット間相互作用を容易にする。フェニル環上の置換基の幾つかは軸外であり、そして観察した電子密度内の複数位置にモデル化することができる。

【0199】

ＴＴＲに結合したＯＨ-ＰＣＢ１８
ＴＴＲ・１８_２ の１．８Å Ｘ線構造は、阻害剤がＴＴＲ結合部位との優れた立体補完性を有することを実証する。分子力学 (Insight II, Accelrys) は、１８の結合していない立体配座がその結合した構造に近似することを示す。精密化した構造は、１８の高親和性結合に寄与する直接又は水媒介の静電相互作用を定める。３-Ｃｌ、４-ＯＨ及び５-Ｃｌで同一に置換された芳香族環の一方は、内部結合ポケットを占め、その塩素置換基はＨＢＰ３及び３’ 内に突き出ている。Ｓｅｒ １１７及びＴｈｒ １１９の側鎖は、不偏電子密度図により識別されるように、それらのＣα-Ｃβ結合の周りでの回転によって代替立体配座を取る。Ｓｅｒ １１７の側鎖は、電子密度の分布により識別されるように、三つの回転異性体立体配座の全てを取る。興味深いことに、二つの水分子は、２回回転対称軸において隣接するＳｅｒ １１７の間に５０％の占有率で位置し、Ｓｅｒ １１７、付近の水分子及び１８のフェノール官能基をつなぐ水素結合のネットワークを容易にする。この構造の検討からは、なぜ１８が非共同的又は正共同的挙動で結合するのかは明らかでない。他方の同一に置換された環は、外部ＴＴＲ結合ポケットを占め、そのハロゲンはＨＢＰ１及び１’ 内に突き出ている。

【0200】

ＴＴＲに結合したＯＨ-ＰＣＢ１６
１６の３-Ｃｌ、４-ＯＨ及び５-Ｃｌでトリ置換されたフェノール環は、ＴＴＲの内部結合部位内に配位し、この環が上記のＴＴＲ・１８_２ 構造において作るものと同一のＴＴＲとの静電及び疎水性相互作用を作る。３，４-ジ塩素化芳香族環は外部結合ポケットを占め、ハロゲンはＨＢＰ１及び１’ 内に向いており、対称等価結合モードはこれに依存すると考えられる。ＯＨ-ＰＣＢ１８の電子密度と同様に、１６の電子密度は対称的であり、従って電子密度図に明確に基づいて、パラＯＨ及びパラＣｌを配置することは不可能である。不偏電子密度図は、Ｓｅｒ １１７の三つの回転異性体立体配座と一致し、ＴＴＲ・１８_２ 構造と同様に、Ｓｅｒ １１７残基間に二つの水分子を含む。

【0201】

ＴＴＲに結合したＯＨ-ＰＣＢ１７
阻害剤１７は、内部結合ポケット内に配向した３-Ｃｌ、４-ＯＨ及び５-Ｃｌで置換されたアリール環により、この環が上記のようにＴＴＲ・１６_２ 及びＴＴＲ・１８_２ 構造で使用したのと同じ相互作用を利用して結合する。２，３，４-トリ塩素化された環は、二つの対称的等価結合モードでＨＢＰ１、ＨＢＰ１’、ＨＢＰ２、ＨＢＰ１’ との相互作用を利用して外部結合ポケットを占める。Ｓｅｒ １１７及び二つの保存された水分子の複数の立体配座もまた、ＴＴＲ・１７_２ 構造の特色である。Ｔｈｒ １１９側鎖の立体配座の変化は、不偏電子密度図からの明らかであった。

【0202】

ＴＴＲに結合したＯＨ-ＰＣＢ１２
ビアリール１２は、その３-Ｃｌ、４-ＯＨで置換されたアリール間を外部結合ポケットに配置し、その二つの塩素はＨＢＰ１及び１’ と相互作用する。これは、フェノールが内部結合ポケット中に位置するＴＴＲ・１６_２ 及びＴＴＲ・１７_２ とは対照的である。ヒドロキシル基は（おそらくイオン化形態で）、Ｌｙｓ １５側鎖の水素結合距離内にある。テトラ置換された環は内部結合ポケット中に位置し、そこでハロゲンはＨＢＰ２及び２’ 並びにＨＢＰ３及び３’ 中に配向する。Ｓｅｒ １１７及びＴｈｒ １１９側鎖は、１６、１７及び１８の状況とは異なり、アポＴＴＲ構造において見出されたのと同一である立体配座を取る。

【0203】

ここで、先に５０ｎＭ未満のＩＣ_５０ でＴ４を押しのけると報告された８種のＰＣＢのうち、１及び３だけが、ヒト血漿中でＴＴＲにかなりの化学量で結合することが示された。これとは対照的に、先にＴＴＲに結合すると報告された１４種のＯＨ-ＰＣＢ全ては、血漿中のＴＴＲへの有意な結合選択性を示した。これは、ＯＨ-ＰＣＢが主に血漿中で観察され、ＰＣＢが典型的に蓄積する脂質及び他の組織中に保持されるのとは逆に、血漿中に選択的に保持されるように見えるという観察と一致する。ＯＨ-ＰＣＢはまた、全血液中のＴＴＲに選択的に結合し、脂質膜内に分配しないという考えと一致する。

【0204】

洗浄段階中に抗体・ＴＴＲ・ＰＣＢ複合体から流失するＰＣＢ（又はＯＨ-ＰＣＢ）の量を、組み換えＷＴ ＴＴＲを用いて評価した。洗浄関連ＰＣＢ解離の程度は分子特異的である。幾つかの化合物は洗浄後に高い結合化学量を示し、有意な初期結合及び低い洗浄関連損失と一致し、遅い解離速度を暗示する。低い結合化学量を示す化合物は、少なくとも二つのカテゴリー：有意な洗浄関連損失のある高い結合化学量又は有意な洗浄関連損失のない低い初期結合化学量に分類され、後者のシナリオは、ＴＴＲに高結合親和性で結合するが、別の血漿タンパク質にさらに高い親和性で結合する化合物に適用することができる。ＰＣＢ２及び４は両者とも、組み換えＴＴＲへの低い洗浄後の結合化学量を示す。ＰＣＢ４の４５％は洗浄のために失われた一方で、ＰＣＢ２は、最小の洗浄関連損失（１０％）を有する劣った初期結合化学量を示す。洗浄後の選択性の値は、血漿中で最初に結合されるＰＣＢの量の下限を反映する。高い洗浄後の結合化学量を特徴とするＰＣＢ１８のような化合物は、観察した遅いオフ速度と一致して、高い結合親和性及び選択性を有するはずである。

【0205】

血漿ＴＴＲに対するそれらの高い結合選択性に加えて、ＯＨ-ＰＣＢ及びＰＣＢ３はまた、インビトロでのＴＴＲフィブリル形成の優れた阻害を示す。阻害剤１４、１５及び１８の効力は、等モルの阻害剤及びＴＴＲ濃度（３．６μＭ）で現在まで観察された中で最高である。これは、それらの高結合親和性（それらの低いオフ速度とも一致する）、及び普通ではないそれらの非共同的又は共同的ＴＴＲ結合特性に帰せられるようである。最良の阻害剤、すなわちＯＨ-ＰＣＢ１８により示されたｎＭ Ｋ_ｄ２ は、ＴＴＲの天然状態が＞３ｋｃａｌ／ｍｏｌだけ安定化されるだろうと決定づける。基底状態の安定化は、テトラマー解離バリア（ＴＴＲアミロイド生成における律速段階）を、テトラマーが生物学的に適切な時間規模で解離できないように、実質的に高める。基底状態への１８の結合により媒介された天然の非アミロイド生成状態の動力学的安定化を、６Ｍ尿素中で劇的に減速したテトラマー解離及びｐＨ４．４で停滞したアミロイド生成性によって確認した。ＯＨ-ＰＣＢ１８（３．６μＭ）は、それがテトラマーＴＴＲの優れた動力学的安定剤であるので、目覚しい阻害剤であると信じられ、すなわち、ＴＴＲ・１８及びＴＴＲ・１８_２ がアミロイド形成に非競争的であるので、３．６μＭ ＴＴＲの２／３をｐＨ４．４でアミロイド生成性にならないように防止し、残りのＴＴＲ（１．１８μＭ）はその低い濃度のためにアミロイドを極めて非効率的に形成する。また、最良のＯＨ-ＰＣＢ阻害剤の解離速度は、ＯＨ-ＰＣＢ付近でのＴＴＲ構造アニーリングのために予想したよりも遅いかもしれないが、これは必要とされる可能な限り注意深くは、まだ評価されていない。これらの化合物は、例外的な阻害剤の合成の指針を提供するか、又はそれら自身がそれらの毒性プロフィールに応じて阻害剤として有用であることを少なくとも証明するかもしれない。

【0206】

ＯＨ-ＰＣＢ１２、１６、１７及び１８に結合したＴＴＲに関する構造の情報は、これらのビアリールが結晶学的２回回転対称軸に沿って一般的に結合することを明らかにする。二つの環の間の二面角は約４０〜６０^ｏの範囲であり、二つの隣接するサブユニットが同時に嵌まり込むのを可能にし、テトラマー四次構造界面の安定化に導く。ヒドロキシル化ＰＣＢ１８は、その塩素がＨＢＰ１及び１’ 並びにＨＢＰ３及び３’ に同時に結合できるので、ＴＴＲとの最適な構造補完性を有する。塩素がＨＢＰ１、１’、３及び３’ 内に伸びるために両方の対称等価結合モードを必要とする１６及び１７では、事実はそうでない。

【0207】

内部結合ポケット内へのフェノール性環の配向は、この環が、これと隣接ＴＴＲサブユニットとの間での水媒介水素結合ネットワークの形成を可能にするのに重要な役割を演じるように見え、このネットワークがＴＴＲの天然四次構造を多分さらに安定化する。Ｓｅｒ １１７、阻害剤のフェノール性基及び保存された二つの水分子の、三つのねじれ立体配座を伴うＨ結合ネットワークは、ＰＣＢ結合部位を形成する二つのサブユニットを相互に結合させる静電ネットワークを作り出す。三つの構造の全てにおいて、Ｔｈｒ １１９も複数の回転異性体立体配座を占める。これとは対照的に、静電相互作用のこのネットワークは、ヒドロキシル置換ェニル環が、外部結合ポケット中に配向し、そしてＳｅｒ １１７及びＴｈｒ １１９はアポ側鎖立体配座を取る１２_２・ＴＴＲ複合体には存在しない。

【0208】

ＯＨ-ＰＣＢの毒性は文献で十分に確立されていない。種々のインビトロ及び動物研究において、ＯＨ-ＰＣＢは穏やかにエストロゲン性又は抗エストロゲン性であるように見える。他の毒性機構が示唆されており、これらの化合物に曝露された動物では甲状腺ホルモンのレベルが低下するという報告もある。ＴＴＲへのＯＨ-ＰＣＢの結合がＴ４レベルを低下させ、そして低下したＴ４レベルが小分子のＴＴＲ結合を反映するという示唆は、直接支持することが困難である。Ｔ４のほぼ半分がアルブミンにより運ばれるので、アルブミン結合部位からのＴ４の押しのけがＰＣＢに暴露された個体において低下したＴ４レベルの原因であることは、いっそうありそうのことのようである。甲状腺結合グロブリンはチロキシンに対して最高の親和性を有し、ヒトにおいて主な運搬体であるが、これらの化合物の毒物学的プロフィールの多くが研究されているラット及びマウスを含めた多くの下等動物には存在しない。従って、これらの種において、ＴＴＲへの化合物の結合がＴ４の全体的な結合及び輸送に対して影響を与えるようである。ＴＢＧへのＰＣＢの結合を示すデータは、１種又は２種の弱く結合する化合物を除いて、ほとんど相互作用しないことを示唆する。それ故に、ヒト甲状腺レベルに対するＯＨ-ＰＣＢの効果は、それらがアルブミンに結合しなければ最小であるはずである。これらの化合物が甲状腺ホルモンを妨害できるか、又はＴ４の硫酸化、従ってその不活性化速度を加速できるという報告もある。ＯＨ-ＰＣＢは甲状腺ホルモン受容体を含めた他の甲状腺ホルモン標的にも結合できるだろうが、これはＴ４との構造類似性を考慮すればもっともと思われる。

【0209】

特にヒトにおけるヒドロキシル化ＰＣＢの毒性に関しては、ほとんどが確立されていないことが明らかである。げっ歯類における毒物学は、甲状腺ホルモン輸送体としてのＴＴＲの役割のため、いっそう過酷であると予想される。明らかなことは、ヒドロキシル化ＰＣＢがトランスチレチンフィブリル形成の阻害剤として優れた活性を示すことであり、このクラスの化合物がアミロイドフィブリル形成を阻害するために有用であるという可能性を有することを示唆する。

【0210】

材料及び方法
トランスチレチン抗体の精製及びセファロースへの結合
抗体を製造し、精製し、セファロースに結合させた。樹脂はＴＳＡ（１ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１４０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２５％ＮａＮ_３）中の１：１のスラリーとして貯蔵した。加えて、停止したセファロースは、２００ｍＭトリス、ｐＨ８．０を抗体の代わりに樹脂に結合させることにより調製した。

【0211】

ヒト血漿の調製
全血液を、健康ボランティアから Scripps General Clinical Research Center’s Normal Blood-Drawing Program で採血し、円錐管に移した。管を、旋回式バケットロータを備えた Sorvall RT7 ベンチトップ型遠心分離機により３０００ＲＰＭ（１７３０×ｇ）において２５℃で１０分間遠心分離した。血漿上澄み液を除去し、再び３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離して残りの細胞を除去した。ナトリウムアジドを加えて０．０５％溶液にした。血漿は使用するまで４℃で貯蔵した。

【0212】

トランスチレチン及び結合したＰＣＢの免疫沈降
２ｍＬエッペンドルフ管に、１．５ｍＬのヒト血漿及び評価するＰＣＢの２．１６ｍＭ ＤＭＳＯ溶液の７．５μＬを満たした。この溶液を３７℃で２４時間インキュベートした。この溶液に、停止したセファロースの１：１の樹脂／ＴＳＡスラリー（１８７μＬ）を加え、４℃で１時間穏やかに振動した。この溶液を遠心分離し（１６,０００×ｇ）、上澄み液をそれぞれ４００μＬの三つのアリコートに分けた。これらをそれぞれ、抗トランスチレチン抗体結合セファロースの１：１の樹脂／ＴＳＡスラリの２００μＬに加え、４℃で２０分間ゆっくりと振動した。サンプルを遠心分離し（１６,０００×ｇ）、上澄み液を除去した。樹脂を１ｍＬのＴＳＡ／０．０５％サポニン (Acros)（３×１０分間）を用いて４℃で、さらに１ｍＬのＴＳＡ（２×１０分間）を用いて４℃で洗浄した。サンプルを遠心分離し（１６,０００×ｇ）、最終洗浄液を除去し、１５５μＬの１００ｍＭトリエチルアミン、ｐＨ１１．５を加えてＴＴＲ及び結合した小分子を抗体から溶離した。４℃で３０分間穏やかに振動した後、サンプルを遠心分離し（１６,０００×ｇ）、ＴＴＲ及び阻害剤を含む１４５μＬの上澄み液を除去した。

【0213】

トランスチレチン及び結合したＰＣＢのＨＰＬＣ分析及び定量
ＴＴＲ抗体ビーズからの上澄み液溶離サンプル（１４５μＬ）を、Waters 71P 自動サンプラー上に負荷した。各サンプルの１３５μＬ注入分を、Keystone 3 cm C18 逆相カラム上で、Waters 600E 多溶剤配送装置により制御して、４０〜１００％のＢ勾配を利用して８分間にわたって分離した（Ａ：９４．８％Ｈ_２Ｏ／５％アセトニトリル／０．２％ＴＦＡ；Ｂ：９４．８％アセトニトリル／５％Ｈ_２Ｏ／０．２％ＴＦＡ）。検出は、２８０ｎｍで Waters 486 チューナブル吸光度検出器により行い、ピークを積分してＴＴＲ及び小分子の両者の面積を得た。それぞれの種の量を決定するために、既知量のテトラマーＴＴＲ又はＰＣＢをＨＰＬＣ上に注入した。ピークを積分して、Kaleidatraph (Synergy Software) を用いてデータの線形回帰から検量線を作成した。検量線を用いて、サンプル中に存在するそれぞれの種のモル数を決定した。小分子とタンパク質との比は、血漿中のＴＴＲに結合した小分子の化学量を得た。

【0214】

トランスチレチンアミロイドフィブリル形成アッセイ
化合物をＤＭＳＯに７２０μＭの濃度で溶解した。評価する化合物の溶液の５μＬを、１ｍＭリン酸塩ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中の７．２μＭＴＴＲ溶液の０．５ｍＬに加え、化合物をＴＴＲと共に３０分間インキュベートするのを可能にした。０．２ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡの４９５μＬを加えて、それぞれ３．６μＭの最終タンパク質及び阻害剤濃度並びに４．４のｐＨにした。次いでこの混合物を３７℃で７２時間インキュベートし、その後、管を３秒間旋回し、光学密度を４００ｎｍで測定した。フィブリル形成の程度は、阻害剤なしのＴＴＲの光学密度により各光学密度を正規化し、１００％フィブリル形成を定めた。ＴＴＲ非存在下の各化合物のコントロール溶液も試験したが、４００ｎｍで何も認めうるほど吸収されなかった。

【0215】

ＰＣＢ１８及びＴＴＲの等温滴定熱量測定(isosthermal titration calorimetry)
組み換えＴＴＲの結晶は、２Ｍ硫酸アンモニウムに対して懸滴実験で平衡化した５ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４、１Ｍ硫酸アンモニウム中）から得た。ＴＴＲ・リガンド複合体は、両方の結合部位の完全な飽和を確保するために１０倍モル過剰量のリガンドで２週間浸漬した結晶から調製した。１：１のアセトン：水を浸漬剤として使用した。RU200 回転陽極型Ｘ線発生装置に結合したDIP2030b イメージ板装置 (MAC Science, Yokohama, Japan) をデータ収集のために使用した。結晶を凍結保護剤としてのパラトーン油に入れ、回折実験のために１２０Ｋに冷却した。ＴＴＲ・リガンド複合体の全ての結晶は、単位格子寸法ａ＝４３Å、ｂ＝８６Å及びｃ＝６５Åを有するアポ結晶形態と同形である。それらは空間群Ｐ２_１２_１２に属し、非対称単位中にホモテトラマーの半分を含む。データセットは DENZO 及び SCALEPAC で整理した。例えば、Otwinowski, Z.; Minor W. Macromolecular Crystallography, Part A, in Method in Enzymology; Carter, C. W., Sweet, R. M. Eds.; Academic Press; 1997, Vol. 276, p 307-326 参照、これは全体として参照により組み入れられる。 ２０及び２６のデータセットを SAINT 及び PROSCALFE (Bruker AXS, nc.) で整理した。

【0216】

構造決定及び精密化(refinement)
The Protein Data Bank からのＴＴＲに関するタンパク質原子配位 (受入番号 1BMZ) を、プログラムＣＮＳを用いる分子動力学及びエネルギー最小化による天然ＴＴＲ及びＴＴＲ-リガンド複合体の精密化のための出発モデルとして使用した。ＰＣＢで浸漬したか又は同時に共結晶化したかの何れかのＴＴＲ結晶について収集した回折データから、図を計算した。ＴＴＲとＰＣＢとの複合体について、得られた図はＴＴＲテトラマーの両方の結合ポケット中のリガンドのおよその位置を明らかにし、ピーク高は５〜９ r.m.s. を超えた。小分子の電子密度をさらに改善し、かつモデルの偏向を除去するために、モデルをゆがみ／振動プロトコールの数サイクル付すると、特に阻害剤の付近で図の著しい改善が生じた。後続のモデルのフィッティングはこれらの図を用いて行い、リガンド分子を濃度に配置した。三つの全ての場合に、プログラム InsightII (Accelrys) により計算した阻害剤の最小エネルギー立体配座は、図と良く一致した。結合チャンネルに沿った２回回転結晶学的対称軸のため、統計上の不規則モデルを適用する必要があり、テトラマーＴＴＲの二つの結合部位のそれぞれにおける二つのリガンド結合モデルを生じた。水分子は、不偏電子密度図に基づいて加えた。最終の図には解釈できる電子密度が欠如していたので、９個のＮ末端残基及び３個のＣ末端残基は最終モデルに含めなかった。

【0217】

実施例５： トランスチレチンアミロイドフィブリル阻害剤としてのベンゾオキサゾール
トランスチレチンの二つのチロキシン結合部位は、その四次構造界面によって作り出される。これらの部位に小分子が結合することによりテトラマーを安定化することができ、る。ＴＴＲアミロイド病を小分子で治療する手段を提供する可能性がある。化合物の多くのファミリーは、それらの結合が小分子解離定数Ｋ_ｄ１及びＫ_ｄ２に比例する程度でテトラマー基底状態を安定化することを発見した。これは解離活性化バリアを効果的に増大し、動力学的安定化によってアミロイドーシスを阻害する。このような阻害剤は、一方の環がハロゲン置換基を有し、他方が疎水性置換基を有する芳香族環から典型的に構成される。Ｃ（４）〜Ｃ（７）においてカルボン酸で置換されたベンゾオキサゾール、そしてハロゲン化フェニル環も、ＴＴＲチロキシン結合部位を補完するようである。それ故に、これらの化合物の小さなライブラリーを、スキーム1で説明するように、Ｎ-アシルアミノヒドロキシ安息香酸の脱水環化反応によって作成した。

【化12】

【0218】

スキーム１： ベンゾオキサゾールの一般的合成
試薬：（ａ）ＡｒＣＯＣｌ、ＴＨＦ、ピリジン（Ａｒ＝フェニル、３,５-ジフルオロフェニル、２,６-ジフルオロフェニル、３,５-ジクロロフェニル、２,６-ジクロロフェニル、２-(トリフルオロメチル)フェニル及び３-(トリフルオロメチル)フェニル；（ｂ）ＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ、還流キシレン；（ｃ）ＴＭＳＣＨＮ_２、ベンゼン、ＭｅＯＨ；（ｄ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、ＭｅＯＨ、Ｈ_２Ｏ(４段階にわたって８〜２７％の収率)。

【0219】

ベンゾオキサゾールを、一連の増加ストリンジェント(increasing stringency)分析により評価した。WT TTR (3.6μM)を試験化合物(7.2μM)とともに30分インキュベートした(pH 7,37℃)。試験化合物の少なくとも1分子がTTRテトラマーの各分子に結合してそれが安定下可能になるようにしなければならないので、試験化合物濃度7.2μMは最小有効濃度の2倍にすぎない。次いで、pHをフィブリル化（fibrilization）に最適なpHである4.4に調整した。試験化合物の存在下で37℃で72時間後のアミロイド形成量を400 nmでの濁度により決定し、そしてフィブリル形成(ff)（％）で表した（100％はTTR単独により形成された量である）。28の試験化合物のうち、11の化合物がフィブリル形成を無視できるレベルまで減少させた(ff < 10％; FIG 7)。

【0220】

次いで、最も活性である11の化合物を、血中の他の全てのタンパク質に対するTTRへの選択的結合能について評価した。人血漿(TTR濃度3.6- 5.4μM)を試験化合物(10.8μM)とともに37℃で24時間インキュベートした。TTR及び結合した任意の阻害剤を、セファロース結合ポリクローナルTTR抗体を用いて免疫沈降した。結合阻害剤と一緒の又は一緒ではないTTRを高pHで樹脂及び阻害剤から遊離させ：TTR化学量論についてHPLC分析により確認した(FIG. 8)。5-又は6-位にカルボン酸を有し、そして2,6-ジクロロフェニル(13,20)、又は2-トリフルオロメチルフェニル(11,18)置換基を2位に有するベンゾオキサゾールは、高い結合化学量論量を示した。特に、20は顕著な阻害活性及び結合選択性を示した。それゆえ、作用機構はさらに特徴付けられた。

【0221】

20がテトラマーに協力に結合することによりTTRフィブリル形成を阻害することを確認するために、等温滴定熱量測定（isothermal titration calorimetry (ITC)）及び沈降速度実験をwt TTRを用いて行った。ITCによると、生理学的条件下で、2当量の20が平均解離定数K_d1 =K_d2 = 55(± 10) nMで結合していることが示された。これらは、多くの他の有効なTTRアミロイド形成阻害剤に匹敵する。沈降速度実験については、TTR (3.6μM)を20（3.6μM、7.2μM、36μM）と最適フィブリル化条件（72時間、pH4.4、37℃）でインキュベートした。テトラマー(55kDa)が、7.2μM又は36μMの20との溶液において唯一の検出可能な断片であった。

【0222】

T119Mサブユニット取り込み（inclusion）及び小分子結合は、ともにテトラマー解離の活性化障壁を引き上げることによりTTRアミロイド形成を防止する。阻害剤のこれをする能力は、厳しい変性ストレスである6M尿素でのテトラマー解離の遅延化効果の測定により最も厳密に試験される。このようにして、２０、２１若しくは２７の存在下又は非存在下における6M尿素中のTTRテトラマー解離速度が比較された(FIG.9)。TTR(1.8μM)は6M尿素中、168時間で完全に変性した。対照的に、20は3.6μMで少なくとも168時間（>3x 人血漿中のTTRの半減期)、テトラマー解離を防止した。1当量の20により、たった27％のTTRが168時間で変性した。化合物27 (3.6μM)は、フィブリル形成アッセイでは活性であるが、テトラマー解離を防ぐ能力がそれよりは弱い(168時間後に90％の折りたたみ構造がほどける)。化合物21はTTRの解離を全く防止しない。これらの結果は、強力な変性条件下では、TTRに結合する阻害剤が必要であるが、TTRテトラマーを動力学的に安定化させるには不十分であることを示している; その解離定数は非常に低い（又はオフ速度が非常に遅い）ことも重要である。また、20の官能基の配置はTTRテトラマーの安定化に明らかに最適である; 即ち、27中のように、カルボン酸をC(6)からC(7)へ移動し、又は21中のように、塩素を除去することによりその活性がひどく低下する。

【0223】

20中の置換基の役割はTTRとの共結晶構造(FIG. 10)から明らかである。化合物20は2及び2'のポケットに結合するハロゲンの近くに2つの塩素を配置している(なぜなら、それらは、チロキシンがTTRに結合するときにヨウ素に占有されるからである)。そのフェニル環上の2,6置換パターンによりベンゾオキサゾール及びフェニル環は平面性を失うことを余儀なくされ、ベンゾオキサゾール上のカルボン酸をLys 15/15'のε-NH₃⁺基に結合したハロゲンへ最適に配置する。20の芳香環とLeu 17、Leu 110、Ser 117、及びVal 121の側鎖との間の疎水的相互作用は追加的な結合エネルギーに寄与する。

【0224】

方法
ベンゾオキサゾール合成の一般的手順及び生成物の特性決定（^１Ｈ-及び^１３Ｃ-ＮＭＲ及び高分解能質量スペクトル）を下記に詳述する。

【0225】

分析用超遠心分離
２０の存在下のＴＴＲの四次構造を、沈降速度分析用超遠心分離を用いて観察した。サンプルを３．６、７．２又は３６μＭの２０と共に７２時間インキュベートした。データは、温度制御 Beckman XL-I 分析用超遠心分離器（An60Ti ローター及び光電走査機を備えた）で収集した。１２ｍｍの Epon センターピース及びサファイア窓を備えたダブルセクターセルに、シリンジを用いて４００〜４２０μＬのサンプルを負荷した。データは、３０００〜５００００ｒｐｍのローター速度で連続モードにより２５℃で補正し、０．００５ｃｍのステップサイズでポイント当たり１走査の平均を採用した。検出は、２８０ｎｍで行った。データは、Philo により開発されたプログラムＤＣＤＴ＋ (Philo, 2000; Stafford, 1992) を用いて時間-微分分析に付した。分析は、溶液中の種の分布がｓ値の範囲で表したことを示した。次いでこの分布を、系内の種に関する沈降及び拡散係数を決定するために、種々のモデルにフィットさせた。それぞれの種の分子量を、先に報告された方法により決定した (petrassi, et al 2000)。ＴＴＲについて見出されたｓ値は、ＴＴＲが７．２及び３６μＭの２０の存在下でテトラマーのままであった一方で、３．６μＭでは溶液中に残ったＴＴＲは、幾分かの凝集物を形成下にもかかわらずテトラマーであったことを示した。

【0226】

結晶化及びＸ線データ収集
ｗｔ ＴＴＲの結晶は、２Ｍ硫酸アンモニウムに対して懸滴（hanging drop）実験で平衡化した１２ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．３５Ｍ硫酸アンモニウム中）から得た。ＴＴＲ-２０複合体は、両方の結合部位の完全な飽和を確保するために１０倍モル過剰量のリガンドで３週間浸漬した結晶から調製した。リガンドで浸漬した結晶は、14-BM-C, BIOCARS, Advanced Photon Source の単色高エネルギー源での Quantum-4 検出器 (Argonne National Laboratory) により１．５５Åまで回折した。結晶をパラトーン油に入れ、回折実験のために１２０Ｋにフラッシュ冷却した。ＴＴＲ-２０複合体の結晶は、単位格子寸法ａ＝４３Å、ｂ＝８４．７Å及びｃ＝６４．７Åを有するアポ結晶形態と同形であり、非対称単位中に二つのＴＴＲサブユニットを含む空間群Ｐ２_１２_１２であった。データは HKL2000 の DENZO 及び SCALEPAC で整理した (Otwinowski, 1997)。

【0227】

構造決定及び精密化
The Protein Data Bank からのＴＴＲに関するタンパク質原子配位 (受入番号 1BMZ) を、分子置換調査のための出発モデルとして使用した。ＴＴＲ-２０複合体の精密化は、ＣＮＳの分子動力学及びエネルギー最小化プロトコールを用いて行った。得られたフーリエの差の分布図は、ＴＴＲテトラマーの両方の結合ポケット中でリガンドが結合していることを明らかにした。これらの分布図を用いて、リガンドを密度に明確に配置することができ、結晶学的精密化に含めた。プログラム InsightII (Accelrys Inc.) により計算した阻害剤の最小エネルギー立体配座を、結晶学的精密化のための初期モデルとして使用した。２回回転結晶学的対称軸が結合チャンネルに沿っていたので、統計上の不規則モデルを適用する必要があり、テトラマーＴＴＲの二つの結合部位のそれぞれにおける二つのリガンド結合モデルを生じた。模倣アニーリングの数サイクル、並びに後続の位置及び温度因子精密化の後、水分子をフーリエの差の分布図に配置した。図のフィッティングの最終サイクルは、振動ｎ’ ゆがみバイアス除去プロトコールにより計算した不偏加重電子密度図を用いて行った。リガンドの対称関連結合立体配座は、不偏アニール省略図、並びに阻害剤の非存在下で同期させた振動ｎ’ ゆがみの不偏加重図と良く一致した。精密化の最終サイクルは、Refinac の制限精密化プロトコールにより行った。最終の図には解釈できる電子密度が欠如していたので、９個のＮ末端残基及び３個のＣ末端残基は最終モデルに含めなかった。結晶学的分析の概要を表６に示す。

【表6】

【0228】

ベンゾオキサゾールの合成 − 一般的方法
別に述べない限り、全ての反応は、オーブン乾燥したガラス製品中でアルゴン雰囲気下に FirstMate Organic Synthesizer (Argonaut Technologies) を用いて行った。全ての溶剤（無水）及び試薬は Ardrich から購入し、さらに精製することなく使用した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Bruker DRX-500 分光計により５００ＭＨｚで、又は Bruker DRX-600 分光計により６００ＭＨｚで測定し、内部ＣＨＤ_２-Ｓ(Ｏ)-ＣＤ_３（２．４９ｐｐｍ）を基準とした。^１３Ｃスペクトルは、Bruker DRX-500により１２５ＭＨｚで、又はBruker DRX-600により１５０ＭＨｚで行い、(ＣＤ_３) _２ＳＯ（３９．５ｐｐｍ）を基準とした。薄層クロマトグラフィー分析は、ガラス裏打ちした分析用薄層プレート (Kieselgel 60 F₂₅₄ 、０．２５ｍｍ、EM Science no. 5715-7) 上で行った。可視化は、ＵＶ級光度又はエタノール中の１０％リンモリブデン酸を用いて行った。クロマトグラフィーは、chromatotron (Harrison Research, Model 7924T、２ｍｍプレート) 又は分取用シリカゲルプレート (Kieselgel 60 F₂₅₄ 、１ｍｍ、EM Science no. 13895-7) 上で行った。

【0229】

ベンゾオキサゾールの合成のための一般的手順
ＴＨＦ（３ｍＬ）中のアミノヒドロキシ安息香酸（０．２ｍｍｏｌ）の混合物を、順にピリジン（５００μｌ、０．６ｍｍｏｌ）及び所望の酸クロリド（０．２ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を周囲温度で１０時間攪拌し、１時間還流し、真空濃縮し、精製することなく次の段階に使用した。

【0230】

ｐ-トルエンスルホン酸（３８０．４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、キシレン（５ｍＬ）中の粗反応混合物に加え、得られた混合物を還流温度で一夜攪拌した。１２時間後、反応物を周囲温度に冷却し、ＮａＯＨ（２ｍＬ、１Ｎ）で停止し、相を分離した。水層をＨＣｌ（１Ｎ）でｐＨ２に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（４×３ｍＬ）で抽出した。一緒にした有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空濃縮した。得られた残留物をＭｅＯＨ：ベンゼンの混合物（２ｍＬ、１：４）に溶解し、ＴＭＳ-ＣＨＮ_２（ヘキサン中の２．０Ｍ溶液の２００μＬ）を用いて２５℃で処理し、反応の進行をＴＬＣにより監視した（通常は０．５時間後に終了する）。反応混合物を真空濃縮し、残留物をクロマトグラフィー（１０〜２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配）により処理して、所望のベンゾオキサゾールメチルエステルを得た。

【0231】

ベンゾオキサゾールメチルエステルをＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏの混合物（３：１：１，０．０７Ｍ）に溶解し、ＬｉＯＨ・Ｈ_２Ｏ（４当量）で処理した。反応物を周囲温度で攪拌し、ＴＬＣにより監視した。終了したとき、この混合物を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（４×）で抽出した。一緒にした有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、真空濃縮した。残留物を分取用薄層クロマトグラフィー（４．９％ＭｅＯＨ、９５％ＣＨ_２Ｃｌ、０．１％ＨＯＡｃ）により精製して、生成物を白色固体として得た。

【0232】

4-カルボキシ-2- (3, 5-ジフルオロフェニル) -ベンゾオキサゾール (1). 一般的手順により3-ヒドロキシアントラニル酸から調製して、１を白色固体として得る(7.0 mg,13 ％)。 1のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13. 70-12.50 (br. s, 1H,CO2H), 8.04(AMX,1H, J = 8.1 Hz, Ar), 7.94 (AMX, 1H,J= 7. 3 Hz, Ar), 7.84(br. d, 2H,J= 5. 6 Hz,Ar), 7.62-7. 58 (m, 1H, Ar), 7.56 (AMX, 1H,J= 7. 3,8. 1 Hz, Ar); ¹³C NMR(125MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 162.7(d, J=248Hz), 162.6(d, J=248Hz), 161.1, 151.0, 140.3, 129.3, 127.0, 125.8, 123.6, 115.2, 110.8, (d, J=28Hz), 107.8(t, J=26Hz); HRMS(MALDI-FTMS) : C14H7F2NO3(MH+) 計算値276.0467, 実測値276.0463。

【0233】

4-カルボキシ-2- (2,6-ジフルオロフェニル) -ベンゾオキサゾール (2). 一般的手順により3-ヒドロキシアントラニル酸から調製して、2を白色固体として得る(8.2 mg,15 ％)。 2のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.00(br. s, 1H,CO2H), 8.06(AMX,1H, J = 8.1 Hz, Ar), 7.94 (AMX, 1H,J= 7.6 Hz, Ar), 7.80-7.74(m, 1H, Ar), 7.57(AMX, 1H,J= 7.6, 8.1 Hz, Ar), 7.40-7.38(m, 2H, Ar); ¹³C NMR(125MHz, DMSO-d₆) δ 166.1, 160.4(d, J=256Hz), 160.3(d, J=256Hz), 154.9, 150.60, 139.6, 134.7(t, J=10Hz), 126.8, 125.8, 114.8, 112.8(d, J=22Hz), 105.2(t, J=16Hz); HRMS(MALDI-FTMS) : C14H7F2NO3(MH+) 計算値276.0467, 実測値276.0461。

【0234】

4-カルボキシ-2-[(3-トリフルオロメチル)フェニル] -ベンゾオキサゾール (3). 一般的手順により3-ヒドロキシアントラニル酸から調製して、3を白色固体として得る(9.5 mg,15 ％)。 3のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.70-12.80(br. s, 1H,CO2H), 8.50(ABX,1H, J = 7.8 Hz, Ar), 8.43(s,1H,Ar), 8.06(AMX, 1H,J= 8.1 Hz, Ar), 8.03(ABX,1H, J = 8.1 Hz, Ar), 7.94(AMX, 1H,J= 7.8 Hz, Ar), 7.88(ABX,1H, J = 7.8Hz, Ar), 7.54(AMX, 1H,J= 8.1Hz, Ar); ¹³C NMR(125MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 161.9, 151.0, 140.6, 131.4, 130.8, 130.0(q, J=33Hz), 128.7(d, J=4Hz), 127.7, 127.0, 125.5, 123.8, 123.7(q,J=273Hz), 123.2, 115.2; HRMS(MALDI-FTMS) : C15H8F3NO3(MH+) 計算値308.0529, 実測値308.0535。

【0235】

4-カルボキシ-2-[(2-トリフルオロメチル)フェニル] -ベンゾオキサゾール (4). 一般的手順により3-ヒドロキシアントラニル酸から調製して、4を白色固体として得る(15.2 mg,25 ％)。 4のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δ 13.15(br. s, 1H,CO2H), 8.18(d, 1H, J=7.6, Ar), 8.06(AMX,1H, J =0.9, 8.2 Hz, Ar), 8.02(d, 1H, J=7.9Hz, Ar), 7.96(AMX, 1H,J= 0.9, 7.9Hz, Ar), 7.94-7.87(m,2H,Ar), 7.58(ABX,1H, J = 8.2Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 161.6, 151.2, 140.0, 133.0, 132.6, 132.3, 127.6 (q,J= 32 Hz), 127.2 (q,J= 6 Hz), 127.0, 125.6, 124.9, 123.5, 123.4 (q,J= 273 Hz), 115.2 ; HRMS(MALDI-FTMS) ：C15H8F3NO3(MH+) 308.0529, 実測値308.0531。

【0236】

4-カルボキシ-2- (3, 5-ジクロロフェニル)-ベンゾオキサゾール (5). 一般的手順により3-ヒドロキシアントラニル酸から調製して、5を白色固体として得る(8.0 mg,13％)。 5のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.60-12. 60 (br. s,1H, CO2H), 8. 16(A₂M, 2H, J= 2. 0 Hz, Ar), 8.05 (AMX, 1H, J = 0.9, 8.2 Hz, Ar), 7.96(A₂M,1H, J= 2.0 Hz, Ar), 7.94 (AMX, 1H,J= 0. 9,7. 6 Hz, Ar), 7.56 (AMX, 1H, J= 7.9 Hz, Ar) ; ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 160.8, 151.0, 140.4, 135.2, 131.5, 129.4, 127.0, 126.3, 125.9, 125.8, 123.6, 115.2 ; HRMS(MALDI-FTMS) ： C14H7Cl2NO3 (MH+) 307.9876, 実測値307.9876。

【0237】

4-カルボキシ-2-(2,6-ジクロロフェニル)-ベンゾオキサゾール (6). 一般的手順により3-ヒドロキシアントラニル酸から調製して、６を白色固体として得る(5.2 mg, 8％)。 ６のデータ: ¹H NMR(600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.80-12. 50 (br. s,1H, CO2H), 8.07 (AMX, 1H, J= 8.2 Hz, Ar), 7.95 (AMX, 1H,J= 7.9 Hz, Ar), 7.77-7. 71 (m, 3H, Ar), 7.59 (AMX, 1H,J= 7. 9,8. 2 Hz, Ar) ; ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 165.8, 158.2, 150.8, 139.3, 134.8, 134.0, 128.7, 126.8, 126.7, 125.9, 122.4 ; HRMS (MALDI-FTMS) ：C14H7Cl2NO3 (MH+) 307.9876, 実測値307.9880。

【0238】

4-カルボキシ-2-フェニル-ベンゾオキサゾール (7). 一般的手順により3-ヒドロキシアントラニル酸から調製して、７を白色固体として得る(10.2 mg,21％)。 7のデータ：¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.50-12. 60 (br. s,1H,CO2H), 8.24-8. 22(m, 2H, Ar), 8.03 (AMX, 1H,J= 0. 9 ; 8.2 Hz, Ar), 7.91 (AMX, 1H, J= 0.9, 7.9 Hz, Ar), 7.68-7. 61 (m, 3H, Ar), 7.51 (AMX, 1H, J = 7.9, 8.2 Hz, Ar);¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.0, 163.4, 151.0, 140.8, 132.4, 129.4, 127.6, 126.7, 126.1, 125.0, 123.0, 115.0 ; HRMS(MALDI- FTMS) ：C14H9NO3(MH+) 240.0655, 実測値240.0656。

【0239】

5-カルボキシ-2- (3, 5-ジフルオロフェニル)-ベンゾオキサゾール (8). 一般的手順により3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸から調製して、８を白色固体として得る(10.2 mg, 19％)。8のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.60-12. 80 (br. s, 1H,CO2H), 8.32 (ABM, 1H, J = 1. 5Hz, Ar), 8.07 (ABM,1H,J= 1. 5,8. 5 Hz,Ar), 7. 90 (ABM, 1H, J= 8.5 Hz, Ar), 7.86-7. 85 (m, 2H, Ar), 7.60 (tt, 1H, J= 2.4, 9.2 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 162.8 (d, J=248Hz), 161.5 153.0, 141.2, 129.1, (t, J=11Hz), 128.2, 127.7, 121.4, 111.2, 110.8(d, J=23Hz), 110.7(d, J=22Hz), 107.8(t, J=26Hz); HRMS(MALDI-FTMS) : C14H7F2NO3 (MH+) 276.0467, 実測値276.0469。

【0240】

5-カルボキシ-2- (2,6-ジフルオロフェニル)-ベンゾオキサゾール (9). 一般的手順により3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸から調製して、9を白色固体として得る(6.8 mg, 12％)。9のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.50-12. 80 (br. s, 1H,CO2H), 8.39 (ABM, 1H, J = 0.7,1.6Hz, Ar), 8.10 (ABM,1H,J= 1.5,8.7Hz,Ar), 7.95(ABM, 1H, J= 0.7,8.7 Hz, Ar), 7.77(m, 1H, Ar), 7.40 (t, 2H, J= 8.8Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 160.4(d, J=257Hz), 160.3(d, J=257Hz), 155.4, 152.6, 140.8, 134.8(t, J=11Hz), 128.2, 127.7, 121.6, 113.0(d, J=22Hz), 112.9(d, J=22Hz), 111.2, 104.9; HRMS(MALDI-FTMS) : C14H7F2NO3 (MH+) 276.0467, 実測値276.0467。

【0241】

5-カルボキシ-2-[(3-トリフルオロメチル)フェニル] -ベンゾオキサゾール (10). 一般的手順により3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸から調製して、10を白色固体として得る(6.7 mg, 11％)。 10のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.30-12.80(br. s, 1H,CO2H), 8.51(ABX,1H, J = 7.8 Hz, Ar), 8.45(s,1H,Ar), 8.35(ABM, 1H, J = 1.7Hz, Ar), 8.08(ABM, 1H,J= 1.7,8.6Hz, Ar), 8.04(ABX,1H, J = 7.8Hz, Ar), 7.93(ABM 1H,J= 8.6Hz, Ar), 7.89(ABX,1H, J = 7.8Hz, Ar); ¹³C NMR(125MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 162.2, 153.1, 141.4, 131.4, 130.9, 130.1(q, J=33Hz), 128.8, 128.2, 127.5, 127.1, 123.8(q,J=4Hz), 123.7(q,J=273Hz), 121.3, 111.2; HRMS(MALDI-FTMS) : C15H8F3NO3(MH+) 計算値308.0529, 実測値308.0530。

【0242】

5-カルボキシ-2-[(2-トリフルオロメチル)フェニル] -ベンゾオキサゾール (11). 一般的手順により3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸から調製して、11を白色固体として得る(10.3 mg, 17％)。 11のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.19(br. s, 1H,CO2H), 8.38(m,1H, Ar), 8.19(d, 1H, J=7.6 Hz, Ar), 8.009(dd, 1H, J=1.8, 8.5Hz, Ar), 8.03(d,1H, J = 7.9Hz, Ar), 7.94-7.88(m, 3H, Ar); ¹³C NMR(150MHz, DMSO-d₆) δ 166.8, 161.6, 153.2, 141.1, 133.1, 132.5, 132.4, 128.2, 127.6, 127.5(q, J=33Hz), 127.2(q,J=6Hz), 124.7, 123.4(q,J=274Hz), 121.6, 111.2; HRMS(MALDI-FTMS) : C15H8F3NO3(MH+) 計算値308.0529, 実測値308.0531。

【0243】

5-カルボキシ-2-(3,5-ジクロロフェニル)-ベンゾオキサゾール (12). 一般的手順により3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸から調製して、12を白色固体として得る(7.3mg,12％)。12のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δ 13.14 (br. s, 1H,CO2H), 8.33 (AMX, 1H,J= 0. 6,1. 8 Hz, Ar), 8.16(AM,2H,J= 1.8 Hz, Ar), 8.08(AMX, 1H, J = 1.8,8.5 Hz, Ar), 7.95 (AM, 1H；J= 1.8 Hz, Ar), 7.91(AMX, 1H, J= 0.6, 8.5 Hz, Ar) ; ¹³C NMR (150 MHz,DMSO-d₆)δ 166.7, 161.1, 153.0, 141.3, 135.2, 131.6, 129.2, 128. 2,127. 7,125. 9, 121.4, 111.3 ; HRMS(MALDI-FTMS) ：C14H7Cl2NO3 (MH+) 307.9876, 実測値307.9879。

【0244】

5-カルボキシ-2- (2, 6-ジクロロフェニル)-ベンゾオキサゾール (13). 一般的手順により3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸から調製して、13を白色固体として得る(10.8 mg, 18％)。13のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.08 (br. s,1H, CO2H), 8.43 (AMX, 1H,J= 0.6, 1.8 Hz, Ar), 8.13 (AMX, 1H,J= 1. 8,8. 5 Hz, Ar),7. 98 (AMX,1H, J= 0.6, 8.5 Hz, Ar), 7.77-7. 72 (m, 3H, Ar) ; ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.7, 158.6, 152.8, 140.4, 134.8, 134.2, 128.8, 128.4, 127.8, 126.2, 121.8, 111.5 ; HRMS (MALDI- FTMS) ：C14H7Cl2NO3 (MH+) 307.9876, 実測値307.9879。

【0245】

5-カルボキシ-2-フェニル-ベンゾオキサゾール (14). 一般的手順により3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸から調製して、14を白色固体として得る(11.5 mg,24％)。14のデータ: ¹H NMR (600 MHz,DMSO-d₆)8 13.12 (br. s, 1H, CO2H), 8.30 (ABX, 1H,J= 1. 8 Hz, Ar), 8.20 (dt,2H,J= 1. 5,6. 7 Hz, Ar), 8.03 (ABX,1H,J= 1. 8,8. 5 Hz, Ar), 7.87(ABX, 1H,J= 8. 5 Hz, Ar), 7.67-7. 60 (m, 3H, Ar);¹³C NMR (150 MHz,DMSO-d₆) 8166. 9,163. 6, 153.0, 141.6, 132.4, 129.4, 127.9, 127.5, 127.0, 126.0, 121.0, 111.0; HRMS(MALDI- FTMS) ：C14H9NO3 (MH+) 240. 0655, 実測値240.0656。

【0246】

6-カルボキシ-2- (3, 5-ジフルオロフェニル)-ベンゾオキサゾール (15). 一般的手順により4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸から調製して、15を白色固体として得る(10.3 mg, 19％)。15のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.22 (br. s, 1H,C02H), 8.20 (ABM, 1H,J= 1. 5 Hz, Ar), 7.98(ABM, 1H, J= 1. 5,8. 2 Hz,Ar), 7. 86(ABM, 1H,J= 8. 2 Hz, Ar), 7.79-7. 78 (m, 2H, Ar), 7.57 (tt,1H, J = 2.4, 9.4 Hz, Ar);¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 166.7, 162.7 (d,J= 248 Hz), 162.6 (d,J= 248 Hz), 162.4, 150.0, 144.7, 129.0(t, J = 11 Hz), 128.7, 126.5, 120.0, 112.1, 110.9 (d,J= 23 Hz), 110.8 (d, J = 22 Hz), 108.0 (t,J= 26 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) :C14H7F2NO3(MH+) 276.0467, 実測値276.0468。

【0247】

6-カルボキシ-2- (2, 6-ジフルオロフェニル)-ベンゾオキサゾール (16). 一般的手順により4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸から調製して、16を白色固体として得る(8.5mg,15％)。16のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δ 13.25 (br. s, 1H, CO2H), 8.30 (ABM, 1H,J= 0. 6,1. 5 Hz, Ar), 8.04(ABM,1H,J= 1. 5,8. 2 Hz, Ar), 7.96(ABM, 1H,J= 0. 6, 8.2 Hz, Ar), 7.76 (m, 1H, Ar), 7.39 (t, 2H,J= 8. 8 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆)δ 166.7, 160.4(d, J=257Hz), 160.3(d, J=257Hz), 156.6, 149.7, 144.2, 134.9(t, J = 11 Hz), 128.8, 126.4, 120.1, 113.1, 112.9, 112.2(d, J=5Hz), 105.0(t, J=16Hz); HRMS (MALDI-FTMS) :C14H7F2NO3(MH+) 276.0467, 実測値276.0466。

【0248】

6-カルボキシ-2-[(3-トリフルオロメチル)フェニル] -ベンゾオキサゾール (17). 一般的手順により4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸から調製して、17を白色固体として得る(7.4 mg, 12％)。 17のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.20(br. s, 1H,CO2H), 8.48(ABX,1H, J = 7.9 Hz, Ar), 8.41(s,1H,Ar), 8.28(ABM, 1H, J = 1.5Hz, Ar), 8.03(ABM, 1H,J= 7.9Hz, Ar), 8.02(ABX,1H, J = 1.5, 8.2Hz, Ar), 7.90(ABM 1H,J= 8.2Hz, Ar), 7.86(ABX,1H, J = 7.9Hz, Ar); ¹³C NMR(150MHz, DMSO-d₆) δ 168.0, 164.6, 151.4, 146.2, 132.8, 132.2, 131.4(q, J=32Hz), 130.2, 129.8, 128.4, 127.8, 125.2, 125.0(q,J=272Hz), 121.2, 113.6; HRMS(MALDI-FTMS) : C15H8F3NO3(MH+) 計算値308.0529, 実測値308.0531。

【0249】

6-カルボキシ-2-[(2-トリフルオロメチル)フェニル] -ベンゾオキサゾール (18). 一般的手順により4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸から調製して、18を白色固体として得る(6.6 mg, 11％)。 18のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.22(br. s, 1H,CO2H), 8.30(ABX,1H, J = 0.6, 1.5Hz, Ar), 8.20(d, 1H, J=7.3Hz, Ar), 8.06(ABX, 1H,J= 1.5, 8.2Hz, Ar), 8.04(d, 1H, J = 7.9Hz, Ar), 7.98(ABX 1H,J= 0.6, 8.2Hz, Ar), 7.94(t,1H, J = 7.3Hz, Ar), 7.90(t,1H, J = 7.9Hz, Ar); ¹³C NMR(150MHz, DMSO-d₆) δ 168.0, 164.0, 151.6, 145.9, 133.8, 130.0, 129.0(q, J=32Hz), 128.6(q, J=6), 127.7, 126.0, 124.7(q,J=272Hz), 121.6, 113.6; HRMS(MALDI-FTMS) : C15H8F3NO3(MH+) 計算値308.0529, 実測値308.0530。

【0250】

6-カルボキシ-2- (3, 5-ジクロロフェニル)-ベンゾオキサゾール (19). 一般的手順により4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸から調製して、19を白色固体として得る(6.0 mg, 10％)。19のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.20 (br. s, 1H,C02H), 8.17 (ABX, 1H,J= 0.6, 1.5Hz, Ar), 8.00(AB, 1H, J= 2.0Hz,Ar), 7.96(ABX, 1H,J= 1.5,8.5Hz, Ar), 7.83(AB,1H,J=2.0Hz, Ar), 7.82(ABX, 1H,J= 0.6,8.5Hz, Ar);¹³C NMR (150MHz, DMSO-d₆)δ 166.6, 161.9, 150.0, 144.6, 135.1, 131.6, 129.0, 128.7, 126.4, 125.8, 119.9, 112.1 ; HRMS (MALDI-FTMS) ：C14H7Cl2NO3(MH+) 307.9876, 実測値307.9879。

【0251】

6-カルボキシ-2- (2, 6-ジクロロフェニル) -ベンゾオキサゾール (20). 一般的手順により4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸から調製して、20を白色固体として得る (12.7 mg,21％)。20のデータ:1H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.27 (br. s, 1H, CO2H), 8.38 (ABX, 1H, J= 0.5, 1.5 Hz, Ar), 8.09 (ABX,1H,J= 1. 5,8. 3 Hz, Ar), 8.02(ABX,1H,J= 8. 3, 0.5 Hz, Ar), 7.78-7. 71 (m, 3H, Ar); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 166.6, 159.8, 150.0, 143.8, 134.8, 134.2, 129.1, 128.8, 126.4, 126.3, 120.4, 112.6 ; HRMS (MALDI-FTMS) ：C14H7Cl2NO3 (MH+) 307.9876, 実測値307.9877。

【0252】

6-カルボキシ-2-フェニル-ベンゾオキサゾール (21). 一般的手順により4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸から調製して、21を白色固体として得る(7.0 mg, 15％)。21のデータ:1H NMR (600 MHz,DMSO-d₆) δ 13.16 (br. s, 1H,CCH), 8.27 (d, 1H,J= 0. 9 Hz, Ar), 8.25-8. 22 (m, 2H, Ar), 8.01(dd, 1H,J= 1. 5,8. 5 Hz, Ar), 7.89 (d,1H,J= 8. 5 Hz, Ar), 7.69-7. 62 (m, 3H, Ar) ; ¹³C NMR (150 MHz,DMSO-d₆)8 166. 8,164. 7,150. 0,145. 2,132. 6, 129.4, 128.0, 127.6, 126.3, 126.0, 119.6, 112.0 ; HRMS (MALDI-FTMS) ：C14H9N03(MH+) 240.0655, 実測値240.0655。

【0253】

7-カルボキシ-2- (3,5-ジフルオロフェニル)-ベンゾオキサゾール (22). 一般的手順により3-アミノサリチル酸から調製して、22を白色固体として得る(8.8 mg, 16％)。22のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δ 13. 55 (br. s,C02H), 8.10 (AMX, 1H,J= 1. 2, 7. 9 Hz, Ar), 7.97 (AMX, 1H,J= 1. 2,7. 9 Hz, Ar), 7.80-7. 79 (m, 2H, Ar), 7.63 (tt,1H,J= 2. 4,9. 2 Hz, Ar), 7.55(AMX,1H,J= 7. 9 Hz, Ar) ; ¹³C NMR (150 MHz,DMSO-d₆) δ 164.5, 162.8 (d, J = 248 Hz), 162.6 (d,J= 248 Hz), 160.9, 149.2, 142.6, 129.2, 128.0, 125.2, 124.9, 116.1, 110.6 (d,J= 28 Hz), 107.7 (q,J= 25 Hz); HRMS (MALDI-FTMS) ：C14H7F2NO3 (MH+) 276.0467, 実測値276.0469。

【0254】

7-カルボキシ-2- (2, 6-ジフルオロフェニル)-ベンゾオキサゾール (23). 一般的手順により3-アミノサリチル酸から調製して、23を白色固体として得る(7.3 mg,13％)。23のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δ 13.48 (br. s, 1H, CO2H), 8.16(ABX, 1H,J= 1. 2,8. 2Hz, Ar), 8.00(ABX, 1H,J= 1. 2,7. 6 Hz, Ar), 7.78 (m,1H, Ar), 7.57 (ABX,1H,J= 7.6, 8.2 Hz, Ar), 7.40 (t, 2H,J= 8.5 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.5, 160.4 (d, J=256Hz), 160.3 (d, J = 257 Hz), 154.9, 148.9, 142.1, 134.8 (t, J = 10 Hz), 128.0, 125.1, 125.0, 116.0, 113.0(d, J=22Hz), 112.9(d, J=21Hz), 105.1(t, J=17Hz); HRMS (MALDI-FTMS) ：C14H7F2NO3 (MH+) 276.0467, 実測値276.0469。

【0255】

7-カルボキシ-2-[(3-トリフルオロメチル)フェニル] -ベンゾオキサゾール (24). 一般的手順により3-アミノサリチル酸から調製して、24を白色固体として得る(7.9 mg, 13％)。 24のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.51(br. s, 1H,CO2H), 8.48(ABX,1H, J = 8.2 Hz, Ar), 8.40(s,1H,Ar), 8.10(AMX, 1H, J = 1.2, 7.9Hz, Ar), 8.05(ABX, 1H,J= 7.9Hz, Ar), 7.96(AMX,1H, J = 1.2, 7.6Hz, Ar), 7.94(ABX 1H,J= 7.9Hz, Ar), 7.54(AMX,1H, J = 7.9, 7.6Hz, Ar); ¹³C NMR(150MHz, DMSO-d₆) δ 164.6, 161.7, 149.3, 142.7, 131.3, 131.0, 130.0(q, J=32Hz), 128.6(ｄ, J=3Hz), 127.7、127.2、125.0、124.8、123.7(q, J=272Hz), 123.5, 116.0; HRMS(MALDI-FTMS) : C15H8F3NO3(MH+) 計算値308.0529, 実測値308.0531。

【0256】

7-カルボキシ-2-[(2-トリフルオロメチル)フェニル] -ベンゾオキサゾール (25). 一般的手順により3-アミノサリチル酸から調製して、25を白色固体として得る(13.8 mg, 22％)。 25のデータ: ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆)δ 13.46(br. s, 1H,CO2H), 8.18(d, 1H, J=7.6Hz, Ar) 8.14(AMX,1H, J = 1.2, 7.9Hz, Ar), 8.03(d, 1H, J=7.9Hz, Ar), 7.98(AMX, 1H,J= 1.2, 7.6Hz, Ar), 7.94(t, 1H, J = 7.3Hz, Ar), 7.89(t, 1H,J= 7.6Hz, Ar), 7.56(AMX, 1H, J = 7.9Hz, Ar); ¹³C NMR(150MHz, DMSO-d₆) δ 164.6, 161.1, 149.3, 142.173Hz), 116.2; HRMS(MALDI-FTMS) : C15H8F3NO3(MH+) 計算値308.0529, 実測値308.0534。

【0257】

7-カルボキシ-2- (3,5-ジクロロフェニル)-ベンゾオキサゾール (26). 一般的手順により3-アミノサリチル酸から調製して、26を白色固体として得る(7.0 mg, 11％)。26のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δ 14.00-12.80(br. s,C02H), 8.10-8.08 (m, 3H, Ar), 7.98-7.96 (m, 2H,, Ar), 7.55(t,1H,J= 7.8Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz,DMSO-d₆) δ 164.5, 160.5, 149.2, 142.6, 135.2, 131.5, 129.4, 128.0, 125.6, 125.2, 124.8, 116.2; HRMS (MALDI-FTMS) ：C14H7Cl2NO3 (MH+) 307.9876, 実測値307.9874。

【0258】

7-カルボキシ-2- (2, 6-ジクロロフェニル)-ベンゾオキサゾール (27). 一般的手順により3-アミノサリチル酸から調製して、27を白色固体として得る(10.3 mg,17％)。27のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δ 13.90-13.10 (br. s, 1H, CO2H), 8.16(AMX, 1H,J= 1. 7.9Hz, Ar), 8.02(AMX, 1H,J= 7.9Hz, Ar), 7.78-7.72 (m, 3H, Ar), 7.60(AMX,1H, J= 7.9 Hz, Ar) ; ¹³C NMR (150 MHz,DMSO-d₆)δ 164.4, 158.3, 149.1, 141.7, 134.9, 134.2, 128.8, 128.2, 126.5, 125.3, 125.2,116. 2; HRMS (MALDI-FTMS) :C14H7Cl2N03(MH+) 307.9876, 実測値307.9875.
7-カルボキシ-2-フェニル-ベンゾオキサゾール (28). 一般的手順により3-アミノサリチル酸から調製して、28を白色固体として得る (13.1 mg, 27％)。28のデータ: ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 13.48 (br. s, 1H,CO2H), 8.20-8.19(m, 2H, Ar), 8.05 (AMX, 1H,J= 1. 2,7. 9 Hz, Ar), 7.92 (AMX, 1H,J= 1. 2,7. 6 Hz, Ar), 7.66-7. 62 (m, 3H, Ar), 7.50 (AMX, 1H,J= 7. 9 Hz, Ar); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ 164.8, 163.1, 149.2, 142.9, 132.2, 129.4,127. 4,127. 2,126. 0,124. 7,124. 4,115. 8; HRMS (MALDI-FTMS) ：C14H9NO3 (MH+) 240.0655, 実測値240.0656。

【0259】

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記の記載は説明を意図したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の他の態様、利点及び修正は請求項に記載した範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】