特許 5756158 ＭＩＦ分泌抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5756158

(24)【登録日】2015年6月5日

(45)【発行日】2015年7月29日

(54)【発明の名称】ＭＩＦ分泌抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/20 20060101AFI20150709BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20150709BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/20

   A61P43/00 111

   A61P17/00

   A61P29/00

   A61P37/08

   A61P17/04

   A61P17/06

   A61P17/16

   A61P35/00

   A61P9/00

   A61P31/04

   A61P11/00

   A61P1/04

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P13/12

   A61P37/06

   A61P7/06

【請求項の数】1

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2013-223071(P2013-223071)

(22)【出願日】2013年10月28日

(62)【分割の表示】特願2008-239013(P2008-239013)の分割

【原出願日】2008年9月18日

(65)【公開番号】特開2014-15485(P2014-15485A)

(43)【公開日】2014年1月30日

【審査請求日】2013年11月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】593106918

【氏名又は名称】株式会社ファンケル

(72)【発明者】

【氏名】榎本 有希子

【審査官】 鶴見 秀紀

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５２８３４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−１７５８５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−３３５４５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−００２２６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Zhao, Chunyang et al，Inhibition of FAS activity and correlation with total flavonoids from Acer truncatum bunge leaves in different seasons，Shoudu Yike Daxue Xuebao ，２００８年 ２月，29(1)，pp.60-63

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １／０４

Ａ６１Ｐ ７／０６

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ １１／００

Ａ６１Ｐ １３／１２

Ａ６１Ｐ １７／００

Ａ６１Ｐ １７／０４

Ａ６１Ｐ １７／０６

Ａ６１Ｐ １７／１６

Ａ６１Ｐ １９／０２

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３１／０４

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３７／０６

Ａ６１Ｐ ３７／０８

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

シナヤグルマカエデ(学名Acer truncatum)の枯葉の水又はエタノール抽出物を有効成分とするマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤を含むマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制用の皮膚外用剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）分泌抑制剤、炎症性疾患の改善剤に関するものである。

【背景技術】

【0002】

マクロファージ遊走阻止因子（以下、ＭＩＦと記載する）は、炎症・免疫のメディエーターの１つであり、マクロファージの遊走を制御し、炎症部位にマクロファージを集め、貪食能を高める液性因子である。ＭＩＦは慢性関節リウマチ(非特許文献１：Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003)、腎炎(非特許文献２：Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003)、アトピー性皮膚炎(非特許文献３：Biochem Biophys Res Commun, 240, 11, 173-8, 1997)、乾癬（非特許文献４：B J Dermatol, 141, 1061-66, 1999）、潰瘍性大腸炎、敗血症、接触性皮膚炎(非特許文献５：Eur J Immunol, 33, 1478-87, 2003)、紫外線による炎症(非特許文献６：J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999)、遅延性アレルギー(非特許文献７：Pro Natl Acad Sci USA, 93, 7849-54, 1996)などの急性・慢性炎症疾患(J End, 179, 15-23, 2003)、関節炎、移植片拒絶反応、腫瘍成長、血管新生、貧血、脳脊髄炎等の炎症性疾患の病理過程に関与しており、ＭＩＦを阻害することにより、これら炎症性疾患を軽減させることが期待される。
ＭＩＦの活性阻害剤は種々開発されている（特許文献１：特表２００３−５１３０６５号公報、特許文献２：特表２００５−５００２６６号公報、特許文献３：特表２００６−５１７９７７号公報）が、ＭＩＦの分泌抑制剤は知られていない。
本発明者は、ＭＩＦの分泌抑制に着目し、ＭＩＦの分泌抑制剤に関する研究開発を継続しているが、先に本発明者は、ヒメジョオン又はその抽出物をＭＩＦの分泌抑制剤とする技術を特願２００８−０２２５８８号に提案した。
シナヤグルマカエデは民間薬として知られており、冠状動脈硬化や脳血管疾患への治療に使用されてきた。また、その抗酸化や抗炎症、脂肪酸合成酵素阻害活性が知られている（非特許文献８：J Chromato A, 1070, 211-214, 2006）。しかし、シナヤグルマカエデによるＭＩＦの分泌抑制効果は知られていない。なかでもシナヤグルマカエデの葉に優れたＭＩＦの分泌抑制効果があることは全く知られていない。

【0003】

【特許文献1】特表２００３−５１３０６５号公報

【特許文献2】特表２００５−５００２６６号公報

【特許文献3】特表２００６−５１７９７７号公報

【非特許文献1】Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164,2003

【非特許文献2】Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164,2003

【非特許文献3】Biochem Biophys res Commun, 240, 11,173-8, 1997

【非特許文献4】B J Dermatol, 141, 1061-66, 1999

【非特許文献5】Eur J Immunol, 33, 1478-87, 2003

【非特許文献6】J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999

【非特許文献7】Pro Natl Acad Sci USA, 93, 7849-54, 1996

【非特許文献8】J Chromato A, 1070, 211-214, 2006

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明はＭIF分泌抑制剤の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

シナヤグルマカエデ（学名Acer truncatum）の葉抽出物が、マクロファージ遊走阻止因子分泌抑制作用に優れることを見出し、本発明を完成させた。
本発明の主な構成は、次のとおりである。
１．シナヤグルマカエデ（学名Acer truncatum）の葉の抽出物を含むマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
２．１．記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤を含む皮膚外用剤。
３．１．記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤を含む炎症性疾患の改善剤。

【発明の効果】

【0006】

本発明により、MIF異常分泌が認められるアトピー性皮膚炎への新たな治療剤または予防剤の提供が可能となった。
アトピー性皮膚炎以外にMIFの異常分泌や関与が示唆されている、乾癬や紫外線による皮膚炎症、血管腫、蕁麻疹、敗血症、呼吸器炎症、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、腎炎、接触性皮膚炎、遅延性アレルギーなどの急性・慢性炎症疾患、関節炎、移植片拒絶反応、腫瘍成長、血管新生、貧血、脳脊髄炎、その他菌感染による炎症への治療や予防にも効果を期待できる。ＭIF分泌抑制剤を皮膚外用剤として局所に処方することにより、マクロファージ遊走阻止因子の働きを抑えて、皮膚の炎症部位におけるマクロファージの機能を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】ケラチノサイトを用いたシナヤグルマカエデ熱水抽出物のＵＶＢ誘導性ＭＩＦ分泌抑制試験結果の表1をグラフ化したものである。

【図2】ＴＨＰ−１細胞を用いたシナヤグルマカエデ熱水抽出物のＬＰＳ誘導性ＭＩ Ｆ分泌抑制試験結果の表２をグラフ化したものである。

【図3】ＴＨＰ−１細胞を用いたシナヤグルマカエデエタノール抽出物のＬＰＳ誘導 性ＭＩＦ分泌抑制試験結果の表３をグラフ化したものである。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明で使用されるシナヤグルマカエデ（学名 Acer truncatum）は、ムクロジ科 カエデ属の植物である。本発明ではシナヤグルマカエデの葉を用いるが、特に枯葉が好ましい。枯葉とは落葉樹の葉が秋になり自然に落葉したものを指すが、落葉せず枝に残った葉の色が緑色ではない黄色や赤色、茶色に変色した葉でも構わない。すなわち、自然に老熟した葉であればよい。

【0009】

シナヤグルマカエデの葉の抽出物としてはシナヤグルマカエデの葉又は枯葉をそのまま粉砕し、あるいは乾燥させた後に粉砕して、水あるいはエタノール等のアルコール、エーテル、アセトン、1,3−ブチレングリコール、1,2−ペンタンジオール、プロピレングリコール、酢酸エチルなどの有機溶媒により抽出した粗抽出物、および粗抽出物を分配抽出やカラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分を含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。シナヤグルマカエデの葉又は枯葉を生のまま抽出操作に供しても良いが、細切、乾燥、粉砕等の処理を行なった後、抽出を行なう方が効率がよい。抽出は抽出溶媒に浸漬して行なうことができる。抽出効率を上げる為に、抽出溶媒を攪拌したり、抽出溶媒中で破砕均一化したり、抽出溶媒中で圧力をかけることもできる。抽出温度は５〜１００℃程度が適切であり、抽出時間は５分〜1ヶ月程度である。これらの条件は適宜設定することができる。
前記シナヤグルマカエデ抽出物はそのまま、また、水、エタノール等の有機溶媒にけんだくさせた状態で、ＭIF分泌抑制剤、炎症性疾患の改善剤、特に皮膚の炎症性疾患改善剤として使用できる。また、必要に応じて抽出溶媒を留去し、その乾燥物を用いてもよい。

【0010】

シナヤグルマカエデ葉又は枯葉抽出物は、乾燥物として、0.0001〜1000mg／日の範囲で適用することができ、さらに、この範囲に限らず、対象、適用形態、症状に応じてその量を適宜設定することができる。
本発明のシナヤグルマカエデ葉又は枯葉抽出物の配合量としては、0.0001〜10重量％程度が好ましいが、用いる剤型、使用対象等の様々の条件に応じて、１００重量％までの広範囲でその配合量を適宜設定できる。

【0011】

本発明の製剤は、経口で又は非経口で投与することができる。
本発明の製剤は、例えば水溶液、油剤、乳液、けんだく液等の液剤、ゲル、クリーム等の半固形剤、粉末、顆粒、カプセル、マイクロカプセル、固形等の固形剤の形態で適用可能である。従来から公知の方法でこれらの形態に調製し、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、硬膏、ハップ剤、エアゾル剤、坐剤、注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等の種々の剤型とすることができる。これらを身体に塗布、貼付、噴霧、飲用等により適用することができる。特にこれら剤型の中で、皮膚外用剤であるローション剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾル剤等が適している。
通常、医薬において使用される製剤化方法にしたがって、これらの剤型、組成物として製造することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。

【実施例1】

【0012】

シナヤグルマカエデエタノール抽出物の調製
シナヤグルマカエデ葉乾燥物１００gを６Lの９９．５%エタノールに1週間浸漬し、得られたエタノール抽出液の溶媒を留去して、２gのシナヤグルマカエデ抽出物を得た。

【実施例2】

【0013】

シナヤグルマカエデ熱水抽出物の調製
シナヤグルマカエデ葉乾燥物１００gを６Lの蒸留水に入れ100℃で10分煮沸した。得られた熱水抽出液を凍結乾燥し、９gのシナヤグルマカエデ抽出物を得た。

【実施例3】

【0014】

シナヤグルマカエデ枯葉エタノール抽出物の調製
シナヤグルマカエデ枯葉乾燥物１００ｇを６Ｌの９９．５％エタノールに１週間浸漬し、得られたエタノール抽出液の溶媒を留去して、1ｇのシナヤグルマカエデ枯葉抽出物を得た。

【実施例4】

【0015】

シナヤグルマカエデ枯葉熱水抽出物の調製
シナヤグルマカエデ枯葉乾燥物１００ｇを６Lの蒸留水に入れ100℃で10分煮沸した。得られた熱水抽出液を凍結乾燥し、４gのシナヤグルマカエデ抽出物を得た。

【0016】

シナヤグルマカエデ抽出物のＭＩＦ分泌抑制試験
１．ケラチノサイトを用いたＵＶＢ誘導性ＭＩＦ分泌抑制試験
ＭＩＦは皮膚の構成細胞の一つであるケラチノサイトで強く発現することが知られている。そして、ケラチノサイトにUVBを照射することにより、ＭＩＦの分泌が促進されることが知られている(J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999)。そこで、ケラチノサイトにＵＶＢを照射したときのＭＩＦの分泌を、シナヤグルマカエデ抽出物が抑制するか調べた。
ヒトケラチノサイトを7.0×104cells/cm2でφ35mm dishに播種し、KBM・KGM培地（LONZA社製）で5日間培養した。各サンプルの入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、1晩培養後、HANKS(-)存在下で、UVBを1.0 W/m2、20 mJ/m2照射し、それぞれ各サンプルの入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、6時間培養した。培養上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。さらに、細胞をCell Lysis Bufferで溶解し、溶解液中の蛋白質をプロテインアッセイキットで測定し、dishあたりの蛋白量を算出した。サンプル無添加、UVB(-)処理を100%とし、サンプル添加時の単位蛋白質当たりのMIF分泌率の比較を行った。結果を表１に示す。又、表１の結果をグラフ化し図１に示す。なお、本試験におけるコントロールとサンプル添加の細胞のタンパク質量を比較した結果、両者におけるタンパク質量に差は認められず、各サンプルの細胞毒性は本試験系において認められなかった。

【0017】

【表1】

枯れていないシナヤグルマカエデの熱水抽出物（実施例２）を添加したdishでも、コントロール（ＭＩＦ分泌率860％）と比較してＭＩＦ分泌率が492％と低くなり、ＭＩＦ分泌を抑制する効果が認められたが、枯れたシナヤグルマカエデの熱水抽出物（実施例４）を添加したdishのＭＩＦ分泌率は365％とより低い値であり、実施例２の３／４に抑制されている。
このことから、シナヤグルマカエデにおいては、特に枯葉の抽出物の方がＭＩＦ分泌を抑制する効果に優れることが分かった。

【0018】

ケラチノサイトにシナヤグルマカエデ枯葉抽出物を添加することにより、ＭＩＦの分泌が顕著に抑制された。ＭＩＦの発現が増加し、症状が悪化することが知られている紫外線による皮膚障害・炎症、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等の皮膚の炎症性疾患に対して、シナヤグルマカエデ枯葉抽出物はより優れた改善効果が期待できる。

【0019】

２．THP-1細胞を用いたLPS誘導性ＭＩＦ分泌抑制試験
菌感染や異物などの刺激によりマクロファージからのＭＩＦ分泌が促進されることが知られている。マクロファージのモデル細胞であるヒト単球性白血病細胞であるTHP-1細胞は、菌感染モデルのLPSの刺激により、MIFを分泌する (FEBS Let 551, 78-88, 2003)。そこで、LPSで刺激したTHP-1細胞のMIF分泌を、シナヤグルマカエデ抽出物が抑制するか調べた。

【0020】

THP-1細胞を1%血清・RPMI培地中で3時間培養後、同培地で1×106cells/well(12well plate)で播種し、各サンプルを添加した。各サンプル添加45分後に、LPSを終濃度10μg/mlで添加し、4時間培養した。培養後に400×gで遠心し、細胞上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。サンプル無添加、LPS(-)処理を100%とし、サンプル添加時のMIF分泌率の比較を行った。
実施例２および実施例４のサンプル添加時の結果を表２に示す。又、表２の結果をグラフ化し図２に示す。

【0021】

【表2】

枯れていないシナヤグルマカエデ熱水抽出物（実施例２）を添加したwellでは、コントロールがＭＩＦ分泌率１５８％であるのに対し、ＭＩＦ分泌率が１１８％であった。
これに対し、シナヤグルマカエデ枯葉熱水抽出物（実施例４）を添加したwellでは、ＭＩＦ分泌率が６９％と抑えられ、実施例２と比べて著しいＭＩＦ分泌抑制効果が認められた。

【0022】

実施例１および実施例３の抽出物はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解して添加したので、同量のＤＭＳＯを添加し、サンプル無添加、ＬＰＳ（−）処理を１００％として、サンプル添加時のＭＩＦ分泌率の比較を行った。
実施例１および実施例３のサンプル添加時の結果を表３に示す。又、表３の結果をグラフ化し図３に示す。

【0023】

【表3】

枯れていないシナヤグルマカエデエタノール抽出物（実施例１）を添加したwellでは、ＤＭＳＯがＭＩＦ分泌率１４６％であるのに対し、ＭＩＦ分泌率が１５１％であり、ＭＩＦ分泌を抑制する効果は全く認められなかった。
これに対し、シナヤグルマカエデ枯葉エタノール抽出物（実施例３）を添加したwellでは、ＭＩＦ分泌率が４５％と抑えられ、実施例１と比べて著しいＭＩＦ分泌抑制効果が認められた。

【0024】

THP-1細胞にシナヤグルマカエデ枯葉抽出物を添加することにより、顕著にＭＩＦの分泌が抑制された。ニキビ、敗血症、などの菌感染による炎症や、浸潤性炎症、アレルギー、慢性関節リウマチなどの慢性炎症疾患に対して、シナヤグルマカエデ枯葉抽出物はより優れた予防や改善が期待できる。

【図1】

【図2】

【図3】