特許 5757639 セルピンフィンガー融合ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5757639

(24)【登録日】2015年6月12日

(45)【発行日】2015年7月29日

(54)【発明の名称】セルピンフィンガー融合ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/81 20060101AFI20150709BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20150709BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150709BHJP

   A61K 38/55 20060101ALI20150709BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150709BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/81ZNA

   C07K19/00

   A61K37/02

   A61P31/12

   A61P31/18

   A61P7/02

   A61P43/00 111

   A61K37/64

   !C12N15/00 A

【請求項の数】10

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2013-528643(P2013-528643)

(86)(22)【出願日】2011年9月13日

(65)【公表番号】特表2013-542186(P2013-542186A)

(43)【公表日】2013年11月21日

(86)【国際出願番号】EP2011065884

(87)【国際公開番号】WO2012035034

(87)【国際公開日】20120322

【審査請求日】2013年4月26日

(31)【優先権主張番号】10176617.8

(32)【優先日】2010年9月14日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】エング リチャード

(72)【発明者】

【氏名】コペツッキ エンハード

(72)【発明者】

【氏名】シュロタウアー ティルマン

【審査官】 吉門 沙央里

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５３７９７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５０３８３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０２１０５２８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０１２９４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Jan Munch, et al，Cell，２００７年，Vol.129，p.263-275

【文献】 A.J.SCHULZE, et al，Eur.J.Biochem，１９９０年，Vol.194，p.51-56

【文献】 R.Skinner, et al，J.Mol.Biol.，１９９８年，Vol.283，p.9-14

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

N末端からC末端の方向に、セルピンフィンガーポリペプチドSEAAASTAVVIA（SEQ ID NO: 07）またはSEAAASMFLEAI（SEQ ID NO: 11）を、ペプチド性リンカーポリペプチドを介して異種の生物学的活性ポリペプチドに融合して含む、融合ポリペプチド。

【請求項2】

生物学的活性ポリペプチドが、HIV融合インヒビターポリペプチドであることを特徴とする、請求項1記載の融合ポリペプチド。

【請求項3】

生物学的活性ポリペプチドが、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン結合体であることを特徴とする、請求項1記載の融合ポリペプチド。

【請求項4】

セルピンフィンガーポリペプチドと生物学的活性ポリペプチドとの間に、GGSGG（SEQ ID NO: 12）のアミノ酸配列を有するペプチド性リンカーポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項5】

HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列が、MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFであることを特徴とする、請求項2または4記載の融合ポリペプチド。

【請求項6】

請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチドとα1-アンチトリプシンとのタンパク質複合体。

【請求項7】

薬剤としての使用のための、請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項6記載のタンパク質複合体。

【請求項8】

ウイルス感染症の処置における使用のための、請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項6記載のタンパク質複合体。

【請求項9】

HIV感染症の処置における使用のための、請求項2〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項6記載のタンパク質複合体。

【請求項10】

請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチドとのタンパク質複合体の製造のための、α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビンの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、セルピンフィンガーポリペプチドと、第2のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とを含む融合ポリペプチド、ならびにそのような融合ポリペプチドの使用を対象とする。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
セリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）は、多数の生理学的経路、例えば、炎症、凝固、線維素溶解、アポトーシス、および細胞外マトリクスリモデリングを制御する。セルピンの反応性ループは、セリンプロテアーゼにより切断され、セリンプロテアーゼは、触媒部位の破壊を介して不活性化される。

【0003】

α1-アンチトリプシンは、肝細胞、マクロファージ、ならびに、腸管および気管支上皮細胞により合成される、394アミノ酸、52 kDaの糖タンパク質である。結晶構造により、α1-アンチトリプシンは、5個のβシート、9個のαヘリックス、および、標的プロテアーゼについての偽基質としてペプチド配列を提示する14残基を含む露出した可動の反応性ループからなることが、示されている。P1-P1'として表される切れやすい反応性結合の切断は、ループのN末端残基がα1-アンチトリプシンのβシートの中央の中に鎖4aとして完全に組み込まれている不可逆的な立体配座変化を、結果としてもたらす（Schechter, I., and Berger, A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967) 157-162（非特許文献1）；Loebermann, H., et al., J. Mol. Biol. 177 (1984) 531-557（非特許文献2）；Baumann, U., et al., J. Mol. Biol. 218 (1991) 595-606（非特許文献3）；Baumann, U., et al., J. Mol. Biol. 226 (1992) 1207-1218（非特許文献4）；Mourey, L., et al., Biochim. 72 (1990) 599-608（非特許文献5）；Mourey, L., et al., J. Mol. Biol. 232 (1993) 223-241（非特許文献6））。

【0004】

その標的プロテアーゼによるタンパク質分解性切断の後、P1 MetおよびP1' Serは分離され、プライミングされていない活性部位ループが、逆平行βシートAに鎖4aとして挿入される。鎖4aのアミノ酸配列を有するペプチドである、ヒトα1-アンチトリプシンの345〜358残基、Thr-Glu-Ala-Ala-Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-Val-Metは、無傷のα1-アンチトリプシンと会合し、切断されたα1-アンチトリプシンと同様の特性を有する化学量論的複合体を形成する（Schulze, A.J., et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990) 51-56（非特許文献7））。

【0005】

国際公開公報第97/024453号（特許文献1）において、ウイルスおよび粒子の組み込みならびに標的細胞における内部移行のための、受容体特異的キメラウイルス表面ポリペプチドが報告されている。α1-アンチトリプシン-プロテアーゼインヒビターの水溶性ポリマーと共有結合している複合体が、欧州特許第0 147 761号（特許文献2）において報告されている。米国特許出願公開第2006/0040867号（特許文献3）において、細菌感染症の処置のための方法および組成物における、セリンプロテアーゼ活性のインヒビターおよびそれらの使用が報告されている。

【0006】

Schulze, A.J.らは、結果的にβ鎖S4Aと同様のペプチドによるα-1アンチトリプシンの構造転移を報告している（Eur. J. Biochem. 194 (1990) 51-56（非特許文献7））。セルピンのC末端ペプチド中に存在するアミノ酸配列に基づく多機能性の抗HIV剤が、Congote, L.F.により、Anti-infective agents in medicinal chemistry, Bentham Science publishers, Hilversum (NL), 7 (2008) 126-133（非特許文献8）において報告されている。Qi, Z.ら（J. Biol. Chem. 283 (2008) 30376-30384（非特許文献9））は、第1および第2世代のHIV融合インヒビターの作用の機構を研究するために、分子プローブとして多機能性ドメインを含有する、合理的に設計された抗HIVペプチドを報告している。HIVの伝染を含む、膜融合に関連した事象の阻害のための方法および組成物が、国際公開公報第01/51673号（特許文献4）において報告されている。国際公開公報第02/063017号（特許文献5）において、インテグリンに結合するキメラが報告されている。抗HIV作用を有するヘパリン断片および分画が、欧州特許第0 355 905号（特許文献6）において報告されている。国際公開公報第00/52034号（特許文献7）および米国特許第6,849,605号（特許文献8）において、ウイルス感染症の処置のための、セリンプロテアーゼ活性のインヒビター、方法、および組成物が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開公報第97/024453号

【特許文献2】欧州特許第0 147 761号

【特許文献3】米国特許出願公開第2006/0040867号

【特許文献4】国際公開公報第01/51673号

【特許文献5】国際公開公報第02/063017号

【特許文献6】欧州特許第0 355 905号

【特許文献7】国際公開公報第00/52034号

【特許文献8】米国特許第6,849,605号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Schechter, I., and Berger, A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967) 157-162

【非特許文献2】Loebermann, H., et al., J. Mol. Biol. 177 (1984) 531-557

【非特許文献3】Baumann, U., et al., J. Mol. Biol. 218 (1991) 595-606

【非特許文献4】Baumann, U., et al., J. Mol. Biol. 226 (1992) 1207-1218

【非特許文献5】Mourey, L., et al., Biochim. 72 (1990) 599-608

【非特許文献6】Mourey, L., et al., J. Mol. Biol. 232 (1993) 223-241

【非特許文献7】Schulze, A.J., et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990) 51-56

【非特許文献8】Congote, L.F., Anti-infective agents in medicinal chemistry, Bentham Science publishers, Hilversum (NL), 7 (2008) 126-133

【非特許文献9】Qi, Z., et al., J. Biol. Chem. 283 (2008) 30376-30384

【発明の概要】

【0009】

セルピンフィンガーポリペプチドは、セルピンとの十分に速い会合を可能にするために最小数のアミノ酸残基を有さなければならないことが、見出されている。さらに、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸2位（セルピンフィンガーポリペプチドのN末端から数えて）のアミノ酸残基がグルタミン酸であると有益であることが、見出されている。

【0010】

本明細書において、
‐セルピンフィンガーポリペプチド、および
‐さらなるポリペプチド
を含み、該さらなるポリペプチドが、阻害、活性化、結合、または標識などの生物学的活性を発揮する任意のポリペプチドであり得る、セルピンフィンガー融合ポリペプチドが報告される。

【0011】

一つの態様において、セルピンフィンガー融合ポリペプチドは、少なくとも一つの
‐ペプチド性リンカーポリペプチド、
‐プロテアーゼ切断部位、
‐タグ
をさらに含む。

【0012】

一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、

より選択される。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、

より選択される。

【0013】

一つの態様において、ペプチド性リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は、

である。

【0014】

一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸2位（セルピンフィンガーポリペプチドのN末端から数えて）のアミノ酸残基は、グルタミン酸である。

【0015】

一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドは、8〜14個のアミノ酸残基からなり、一つの態様において、10〜14個のアミノ酸残基からなり、および一つの態様において、11〜13個のアミノ酸残基からなる。

【0016】

一つの態様において、さらなるポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体リガンド、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、酵素リガンド、酵素アゴニスト、酵素アンタゴニスト、細胞傷害剤、抗ウイルス剤、造影剤、および酵素活性調節物質より選択される。

【0017】

本明細書において、一つの局面として、任意で間のペプチド性リンカーポリペプチドで、N末端からC末端の方向に生物学的活性ポリペプチドに融合されたセルピンフィンガーポリペプチドを含む、融合ポリペプチドが報告される。

【0018】

一つの態様において、生物学的活性ポリペプチドは、抗ウイルス剤である。

【0019】

一つの態様において、抗ウイルス剤は、HIV融合インヒビターポリペプチドである。一つの態様において、HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列は、

である。

【0020】

本明細書において報告される別の局面は、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドと、セルピンまたはその断片とのタンパク質複合体であり、該融合ポリペプチドは、鎖4aとしてセルピンのβシートAの中央の中に組み込まれる。

【0021】

本明細書において報告される別の局面は、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドまたは本明細書において報告されるタンパク質複合体、および任意で、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。一つの態様において、薬学的組成物は、追加的な治療剤をさらに含む。

【0022】

また、本明細書において報告される一つの局面は、薬剤としての使用のための、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドまたは本明細書において報告されるタンパク質複合体である。

【0023】

本明細書において報告される別の局面は、ウイルス感染症を処置する段階における使用のための、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドまたは本明細書において報告されるタンパク質複合体である。

【0024】

本明細書において報告される一つの局面において、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドまたは本明細書において報告されるタンパク質複合体は、細胞間膜融合を阻害する段階、またはウイルスによる細胞の感染を阻害する段階における使用のためである。一つの態様において、ウイルスによる細胞の感染は、HIV感染であり、かつ、セルピンフィンガー融合ポリペプチドは、セルピンフィンガーHIV融合インヒビターポリペプチド融合ポリペプチドである。

【0025】

本明細書において報告される一つの局面は、薬剤の製造における、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドまたは本明細書において報告されるタンパク質複合体の使用である。一つの態様において、薬剤は、ウイルス感染症の処置のためである。別の態様において、薬剤は、細胞間膜融合を阻害するため、またはウイルスによる細胞の感染を阻害するためである。一つの態様において、ウイルス感染症は、HIV感染症であり、かつ、セルピンフィンガー融合ポリペプチドは、セルピンフィンガーHIV融合インヒビターポリペプチド融合ポリペプチドである。

【0026】

また、本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドまたは本明細書において報告されるタンパク質複合体の有効量を個体に投与する段階を含む、ウイルス感染症を有する個体を処置する方法である。一つの態様において、ウイルス感染症は、HIV感染症であり、かつ、セルピンフィンガー融合ポリペプチドは、セルピンフィンガーHIV融合インヒビターポリペプチド融合ポリペプチドである。

【0027】

本明細書において報告されるさらなる局面は、細胞間膜融合を阻害するため、またはウイルスによる細胞の感染を阻害するために、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドまたは本明細書において報告されるタンパク質複合体の有効量を個体に投与する段階を含む、個体において、細胞間膜融合を阻害する方法、またはウイルスによる細胞の感染を阻害する方法である。

【0028】

本明細書において報告される別の局面は、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチド、およびセルピンまたはその断片を含む混合物、この混合物を含む薬学的組成物、ならびに薬剤としてのその使用である。

【0029】

本明細書において報告される一つの局面は、N末端からC末端の方向に生物学的活性ポリペプチドに融合されたセルピンフィンガーポリペプチドを含むセルピンフィンガー融合ポリペプチドとのタンパク質複合体の製造のための、セルピンまたはその断片の使用である。

【0030】

本明細書において報告される別の局面は、別々の容器中にセルピンフィンガー融合ポリペプチドおよびセルピンを含み、任意でこれらの2種の成分を混合するためのさらなる容器、ならびにまた任意で指示シートを含むキットである。一つの態様において、キットは、試料における融合ポリペプチドを検出するための手段を、さらに含む。
[本発明1001]
セルピンフィンガーポリペプチドおよび生物学的活性ポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
[本発明1002]
セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸2位のアミノ酸残基がグルタミン酸であることを特徴とする、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1003]
セルピンフィンガーポリペプチドが、8〜14個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を有することを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1004]
生物学的活性ポリペプチドが、HIV融合インヒビターポリペプチドであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1005]
セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列が、TEAAGAMFLEAIVM（SEQ ID NO: 03）、TEAAGAMFFEAIPM（SEQ ID NO: 05）、SEAAASTAVVIA（SEQ ID NO: 07）、TEAAGATAVVIA（SEQ ID NO: 08）、またはSEAAASMFLEAI（SEQ ID NO: 11）より選択されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1006]
セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列が、SEAAASTAVVIA（SEQ ID NO: 07）、またはSEAAASMFLEAI（SEQ ID NO: 11）であることを特徴とする、本発明1005の融合ポリペプチド。
[本発明1007]
セルピンフィンガーポリペプチドと生物学的活性ポリペプチドとの間に、GGSGG（SEQ ID NO: 12）のアミノ酸配列を有するペプチド性リンカーポリペプチドを含むことを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1008]
HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列が、MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF（SEQ ID NO: 13）であることを特徴とする、本発明1004〜1007のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1009]
本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチドとセルピンとのタンパク質複合体。
[本発明1010]
セルピンがα1-アンチトリプシンおよびアンチトロンビンより選択されることを特徴とする、本発明1009のタンパク質複合体。
[本発明1011]
薬剤としての使用のための、本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチド、または、本発明1009もしくは1010のいずれかのタンパク質複合体。
[本発明1012]
ウイルス感染症の処置における使用のための、本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチド、または、本発明1009もしくは1010のいずれかのタンパク質複合体。
[本発明1013]
HIV感染症の処置における使用のための、本発明1004〜1008のいずれかの融合ポリペプチド、または、本発明1009もしくは1010のいずれかのタンパク質複合体。
[本発明1014]
本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチドとのタンパク質複合体の製造のための、α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビンの使用。
[本発明1015]
‐本発明1001〜1008のいずれかの融合ポリペプチド、または、本発明1009もしくは1010のいずれかのタンパク質複合体、および
‐α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビン
を含む、キット。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】融合ポリペプチドおよびα1-アンチトリプシンのタンパク質複合体形成の解析：37℃での1週間のインキュベーション後の8M尿素PAGE-SDSゲル（1-分子量マーカー；3-FP-1-AAT；4-FP-2-AAT；5-FP-3-AAT；6-FP-1-AAT；7-FP-2-AAT）およびインキュベーションのゲル濾過分離の12％SDS-PAGE（1-分子量マーカー；2-AAT；3-FP-1-AAT；4-FP-2-AAT；5-FP-3-AAT）。［AAT＝α1-アンチトリプシン］

【図2】8M尿素PAGE-SDSゲル（4日インキュベーション：1＝37℃＋FP-2；2＝37℃＋FP-3；3＝45℃＋FP-2；4＝45℃＋FP-3；5＝37℃＋FP-2；6＝37℃＋FP-3；7＝45℃＋FP-2；8＝45℃＋FP-3；9＝AAT 37℃）およびウエスタンブロット（1＝FP-2；2＝FP-3；3＝AAT 45℃；4＝AAT RT；5＝タンパク質複合体FP-2 37℃；6＝SECにより精製したタンパク質FP-2 45℃；7＝タンパク質複合体FP-3 37℃；8＝タンパク質複合体FP-3 45℃；9＝タンパク質複合体FP-2＋ゲル濾過；10＝タンパク質複合体FP-3＋SEC精製）。

【図3】遊離の融合ポリペプチドおよびタンパク質複合体の分離の例示的なサイズ排除クロマトグラム。

【図4】固定化されたHIV HR1ポリペプチドに対する、a）遊離のFP-2、ならびにb）FP-2およびα1-アンチトリプシンのタンパク質複合体、の結合を示すBIAcoreダイアグラム；c）固定化されたHIV HR1ポリペプチドに対する、FP-2およびFP-3を含有するタンパク質複合体の結合を示すBIAcoreダイアグラム。

【発明を実施するための形態】

【0032】

発明の詳細な説明
本明細書において、
‐セルピンフィンガーポリペプチド、および
‐さらなるポリペプチド
を含み、該さらなるポリペプチドが、阻害、活性化、結合、または標識などの生物学的活性を発揮する任意のポリペプチドであり得る、セルピンフィンガー融合ポリペプチドが報告される。

【0033】

本明細書における一つの局面において、セルピンフィンガー融合ポリペプチドおよびセルピンを含み、該融合ポリペプチドが、セルピンの鎖4aとしてβシートAの中央の中に組み込まれる、タンパク質複合体が報告される。

【0034】

セルピンフィンガー融合ポリペプチドは、セルピンに対して高親和性および機能的空間配向で、融合されたさらなるポリペプチドを標的とし、かつ固定する。

【0035】

一つの態様において、ペプチド性リンカーポリペプチドを介してHIV融合インヒビターポリペプチドに融合されたセルピンフィンガーポリペプチドを含む、セルピンフィンガー融合ポリペプチドが報告される。

【0036】

本発明内で使用される「セルピンフィンガーポリペプチド」という用語は、セルピンの天然の反応性中央ループか、またはその合成類似体のいずれかに由来する、8〜16個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを表す。一つの態様において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、11〜13個のアミノ酸残基からなる。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、

より選択される。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、

である。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドは、α1-アンチトリプシンまたはアンチトロンビン由来である。

【0037】

「セルピン」という用語は、多様な機能を有するタンパク質のスーパーファミリーを表す。セルピンスーパーファミリーの例示的なメンバーを、以下に列挙する。一つの態様において、セルピンは、α1-アンチトリプシン（セルピンA1）、アンチトリプシン関連タンパク質（セルピンA2）、α1-アンチキモトリプシン（セルピンA3）、カリスタチン（セルピンA4）、プロテインCインヒビター（セルピンA5）、コルチゾール結合グロブリン（セルピンA6）、チロキシン結合グロブリン（セルピンA7）、アンジオテンシノーゲン（セルピンA8）、センテリン（centerin）（セルピンA9）、プロテインZ関連プロテアーゼインヒビター（セルピンA10）、セルピンA11、バスピン（vaspin）（セルピンA12）、セルピンA13、単球好中球エラスターゼインヒビター（セルピンB1）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-2（セルピンB2）、扁平上皮癌抗原-1および-2（セルピンB3およびB4）、マスピン（セルピンB5）、PI-6（セルピンB6）、メグシン（megsin）（セルピンB7）、PI-8（セルピンB8）、PI-9（セルピンB9）、ボマピン（bomapin）（セルピンB10）、セルピンB11、ユコピン（yukopin）（セルピンB12）、ハーピン（hurpin）／ヘッドピン（headpin）（セルピンB13）、アンチトロンビン（セルピンC1）、ヘパリン補因子II（セルピンD1）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1（セルピンE1）、グリア由来ネキシン／プロテアーゼネキシンI（セルピンE2）、色素上皮由来因子（セルピンF1）、α2-アンチプラスミン（セルピンF2）、補体1-インヒビター（セルピンG1）、HSP47（セルピンH1）、ニューロセルピン（セルピンI1）、およびパンクピン（pancpin）（セルピンI2）より選択される。セルピンの断片とは、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドを、セルピン断片の鎖4aとしてβシートAの中央の中に組み込む機能を依然として発揮する分子である。

【0038】

本明細書において使用される「生物学的活性ポリペプチド」という用語は、例えば細胞株およびウイルスを用いるバイオアッセイなどの、人工的な生物系においてもしくはそれに対して、または、鳥、もしくはヒトを含む哺乳動物を含むがそれに限定されない動物に対してインビボで、投与された時に生物学的効果を引き起こす、有機分子、例えば、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドまたはタンパク質などの生体高分子を指す。この生物学的効果は、酵素阻害または活性化、受容体またはリガンドへの結合、結合部位または周囲のいずれかでのシグナル誘発またはシグナル調節であり得るが、それらに限定されない。生物学的活性分子は、非限定的に、例えば、免疫グロブリン、またはホルモン、またはサイトカイン、または増殖因子、または受容体リガンド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト、または細胞傷害剤、または抗ウイルス剤、または造影剤、または酵素インヒビター、酵素アクチベーター、もしくはアロステリック基質などの酵素活性調節物質である。一つの態様において、生物学的活性ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン結合体、またはHIV融合インヒビターポリペプチドである。

【0039】

「HIV融合インヒビターポリペプチド」とは、とりわけ、膜融合が原因のHIウイルスによる感染していない細胞の感染の阻害を含む、膜融合に関連する事象または膜融合事象自体を阻害するポリペプチドである。HIV融合インヒビターポリペプチドは、一つの態様において、直鎖状ポリペプチドである。例えば、それは、一つの態様におけるように、HIV gp41外部ドメイン由来である。例えば、DP107またはDP178などである。HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列は、5〜100個のアミノ酸残基からなり、一つの態様において、10〜75個のアミノ酸残基からなり、さらなる態様において、15〜50個のアミノ酸残基からなる。一つの態様において、HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 32〜42からなる群より選択される。HIV融合インヒビターポリペプチドのさらなる例は、米国特許第5,464,933号、米国特許第5,656,480号、米国特許第6,013,263号、米国特許第6,017,536号、米国特許第6,020,459号、米国特許第6,093,794号、米国特許第6,060,065号、米国特許第6,258,782号、米国特許第6,348,568号、米国特許第6,479,055号、米国特許第6,656,906号、国際公開公報第1996/19495号、国際公開公報第1996/40191号、国際公開公報第1999/59615号、国際公開公報第2000/69902号、および国際公開公報第2005/067960号において見出され得る。例えば、HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列は、米国特許第5,464,933号のSEQ ID NO: 1〜10；米国特許第5,656,480号のSEQ ID NO: 1〜15；米国特許第6,013,263号のSEQ ID NO: 1〜10および16〜83；米国特許第6,017,536号のSEQ ID NO: 1〜10、20〜83、および139〜149；米国特許第6,093,794号のSEQ ID NO: 1〜10、17〜83、および210〜214；米国特許第6,060,065号のSEQ ID NO: 1〜10、16〜83、および210〜211；米国特許第6,258,782号のSEQ ID NO: 1286および1310；米国特許第6,348,568号のSEQ ID NO: 1129、1278〜1309、1311、および1433；米国特許第6,479,055号のSEQ ID NO: 1〜10、および210〜238；米国特許第6,656,906号のSEQ ID NO: 1〜171、173〜216、218〜219、222〜228、231、233〜366、372〜398、400〜456、458〜498、500〜570、572〜620、622〜651、653〜736、739〜785、787〜811、813〜823、825、827〜863、865〜875、877〜883、885、887〜890、892〜981、986〜999、1001〜1003、1006〜1018、1022〜1024、1026〜1028、1030〜1032、1037〜1076、1078〜1079、1082〜1117、1120〜1176、1179〜1213、1218〜1223、1227〜1237、1244〜1245、1256〜1268、1271〜1275、1277、1345〜1348、1350〜1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374〜1376、1378〜1379、1381〜1385、1412〜1417、1421〜1426、1428〜1430、1432、1439〜1542、1670〜1682、1684〜1709、1712〜1719、1721〜1753、1755〜1757；または国際公開公報第2005/067960号のSEQ ID NO: 5〜95を含む群より選択され得る。

【0040】

（表１）HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列

【0041】

本出願内で使用される「ペプチド性リンカーポリペプチド」という用語は、天然および／または合成起源のペプチド性リンカーポリペプチドを表す。それは、20個の天然に存在するアミノ酸が単量体構成要素である、直鎖状アミノ酸残基鎖からなる。鎖は、1〜50個のアミノ酸残基の長さ、一つの態様において、1〜28個のアミノ酸残基の長さ、別の態様において、3〜25個のアミノ酸残基の長さを有する。ペプチド性リンカーポリペプチドは、反復アミノ酸配列、またはヒンジ機能を有するポリペプチドなどの、天然に存在するポリペプチドの配列を含有してもよい。ペプチド性リンカーポリペプチドは、ポリペプチドの各々が正確にフォールディングし、かつ適切に提示されるのを可能にすることにより、結合された／融合されたポリペプチドの結合体または融合体各々におけるポリペプチドが、その生物学的活性を果たせることを確実にする機能を有する。一つの態様において、ペプチド性リンカーポリペプチドは、グリシン、グルタミン、および／またはセリン残基に富むように設計されている「合成ペプチド性リンカーポリペプチド」である。残基は、例えば、

などの、5個までのアミノ酸残基の小さな反復単位において配置される。反復単位は、多量体単位を形成するように2〜5回反復されてもよい。多量体単位のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に、6個までの追加的な任意の天然に存在するアミノ酸残基が付加されてもよい。他の合成ペプチド性リンカーポリペプチドは、例えば、リンカー

におけるセリンのように、10〜20回反復される単一のアミノ酸残基から構成され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に、6個までの追加的な任意の天然に存在するアミノ酸残基を含んでもよい。一つの態様において、ペプチド性リンカーポリペプチドは、抗体ヒンジ領域、

より選択される。すべてのペプチド性リンカーポリペプチドは、核酸分子によりコードされ得、かつ従って、組み換えで発現させることができる。ペプチド性リンカーポリペプチドは、それ自体ポリペプチドであるため、セルピンフィンガーポリペプチドは、2個のアミノ酸の間に形成されるペプチド結合を介してペプチド性リンカーポリペプチドに連結される。

【0042】

（表２）ペプチド性リンカーポリペプチドのアミノ酸配列

【0043】

「鎖4aとしてβシートAの中央の中に」という用語は、セルピンのβシートA、例えばα1-アンチトリプシン、またはアンチトロンビンのβシートAの鎖4および5の間の、セルピンフィンガー融合ポリペプチドの挿入を表す。

【0044】

（任意でペプチド性リンカーを介して）生物学的活性を有するポリペプチドに融合されたセルピンフィンガーポリペプチドを含む融合ポリペプチドにおいて、融合された生物学的活性を有するポリペプチドは、単離されたポリペプチドと比較して改善された特性を有する。融合ポリペプチドは、例えば、α1-アンチトリプシンなどのセルピンのβシートA中に挿入され、融合された生物学的活性を有するポリペプチドのインビボ半減期を改善することができる。アンチトロンビン由来のセルピンフィンガーポリペプチドは、α1-アンチトリプシンのβシート中に良好に挿入することが見出されている。この組み合わせは、本発明の局面の一つの態様である。これは、例えば、表3に提示されるインビトロの会合データから見ることができる。

【0045】

さらに、6個のアミノ酸残基の最短のアミノ酸配列を有するセルピンフィンガーポリペプチドは、最速で挿入しないが、11〜13個のアミノ酸残基の長さのより長いものは、最速で挿入することが、見出されている。さらに、セルピンフィンガーポリペプチドの2番目のアミノ酸（セルピンフィンガーポリペプチドのN末端から数えて）としてのアミノ酸であるグルタミン酸は、セルピンフィンガー融合ポリペプチドのセルピンβシート中への挿入効率を増大させる。

【0046】

（表３）セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列およびセルピンα1-アンチトリプシンとのインビトロの会合T_1/2

【0047】

以下に、本明細書において報告される局面を、ペプチド性リンカーポリペプチド、および生物学的活性ポリペプチドとしてHIV融合インヒビターポリペプチドを含む、セルピンフィンガー融合ポリペプチドで例証する。以下は、単に本明細書において報告される主題を例証するために提示され、かつ、限定または制限として扱われるべきではない。

【0048】

様々な融合ポリペプチドが調製されている。コードする遺伝子は、化学的遺伝子合成により取得され、かつポリペプチドは、大腸菌（E. coli）において組み換えで生産されている。様々な融合ポリペプチドが、精製タグとしてのストレプトアビジン担体タンパク質、トリプシン切断部位、セルピンフィンガーポリペプチド、ペプチド性リンカーポリペプチド、およびHIV融合インヒビターポリペプチドを含む構築物として、発現されている。

【0049】

一つの態様において、トリプシン切断部位のアミノ酸配列は、GRである。

【0050】

セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、一つの態様において、

であり、N末端および／またはC末端のリンカーを有するかまたは有さないかのいずれかであり、該リンカーは、独立してかつ個々に、S、またはG、またはSGより選択される。

【0051】

ペプチド性リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は、一つの態様において、

である。

【0052】

融合ポリペプチドFP-1のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 76であり、融合ポリペプチドFP-2のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 77であり、かつ融合ポリペプチドFP-3のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 78である。融合ポリペプチドFP-1〜FP-3において、同一のセルピンフィンガーポリペプチドが、異なるHIV融合インヒビターポリペプチドに結合されている。融合ポリペプチドFP-3は、大腸菌においてFP-2よりも良好に発現され、次に、FP-2は、融合ポリペプチドFP-1よりも良好に発現される。BIAcoreアッセイにおける、標的HIV HR-1ポリペプチドに対する結合について、融合ポリペプチドの同一の配列が得られる（FP-3＞FP-2＞FP-1）。同一の配列はまた、細胞間融合アッセイ（CCFアッセイ）における抗ウイルス活性についても見出されている。

【0053】

ゲル電気泳動（尿素-PAGE）により、本発明による融合ポリペプチドおよびα1-アンチトリプシンのタンパク質複合体が形成されることが示されている。個々のFP-X融合ポリペプチドとα1-アンチトリプシンとの間の安定な複合体形成を、図1に示す。

【0054】

タンパク質複合体および遊離のα1-アンチトリプシンは、SDS-PAGEゲル電気泳動により分離することができないため、HR1-ポリペプチド-ビオチン結合体とのインキュベーションを伴うウェスタンブロットによる、タンパク質複合体の形成の測定を行わなければならない。例示的なブロットを、図2に示す。遊離の融合ポリペプチドおよびタンパク質複合体の調製用分離のために、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することができる。個々の分画のSDS-PAGE分析と共に、例示的なクロマトグラムを、図3に示す。

【0055】

様々なセルピンフィンガー融合ポリペプチドを、セルピンα1-アンチトリプシンとの会合速度についてアッセイしている。最速の結合物質は、1〜4時間のインビトロの会合T1/2を有する。

【0056】

表4に、単離されたHIV融合インヒビターポリペプチドと比較した、FP-1〜FP-3融合ポリペプチドの結合特性を示す。

【0057】

（表４）FP-1〜FP-3のHIV HR1ポリペプチドに対する結合特性

【0058】

表面プラズモン共鳴により測定した結合親和性は、遊離の融合インヒビターおよび3種の融合ペプチドについて同様の結合定数を呈する。図4に示すBIAcore結合ダイアグラムより、一方で、タンパク質複合体がHIV HR1ポリペプチドに結合していること（図4b）、かつ他方で、FP-2を含有するタンパク質複合体が、固定化されたHR1ポリペプチドについて3種の複合体のうちで最高の親和性を有することが、見られ得る。

【0059】

表5より、融合ポリペプチドFP-1〜FP-3は、単離されたHIV融合インヒビターポリペプチドのように匹敵する抗ウイルス活性を有することが、見られ得る。

【0060】

（表５）CCFアッセイにおける融合ポリペプチドの抗ウイルス活性

【0061】

以下の実施例、配列表、および図面は、本発明の理解を手助けするために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示される手順において改変が作製され得ることが、理解される。

【0062】

配列表の説明

【実施例】

【0063】

材料および方法
組み換えDNA技術
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されているような標準的な方法を用いて、DNAを操作した。分子生物学用試薬を、製造業者の指示に従って使用した。

【0064】

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、化学合成により調製した。所望の遺伝子セグメントを、遺伝子合成により調製した。合成した遺伝子断片を、特定の発現ベクター中にクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列を、DNA塩基配列決定法により確認した。

【0065】

タンパク質測定
結合体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280 nmでの光学密度（OD）を測定することにより決定した。

【0066】

実施例1
発現プラスミドの作製
融合ポリペプチドFP-1、FP-2、およびFP-3を、組み換え手段により調製した。それらを、大腸菌における高レベル発現のための担体タンパク質としてコアストレプトアビジンを用い、大腸菌においてより大きな融合タンパク質として発現させた。トリプシン（FP-1およびFP-2）またはエンドプロテイナーゼLysC（FP-3）のいずれかを用いたインビトロの酵素的切断により、所望のポリペプチドを放出させた。

【0067】

コアストレプトアビジン担体融合タンパク質の設計
ポリペプチドFP-1（SEQ ID NO: 76＝GR＋SEQ ID NO: 05＋SEQ ID NO: 52＋SEQ ID NO: 37）、FP-2（SEQ ID NO: 77＝GR＋SEQ ID NO: 82＋SEQ ID NO: 75＋SEQ ID NO: 13）、およびFP-3（SEQ ID NO: 78＝GR＋SEQ ID NO: 83＋SEQ ID NO: 50＋SEQ ID NO: 40）を、それぞれ独自のトリプシンまたはLysCエンドプロテイナーゼ切断部位を含有するGRまたはGKプロテアーゼリンカーを介して、コアストレプトアビジン配列（SEQ ID NO: 81）に融合させた。

【0068】

コアストレプトアビジンをコードする核酸、短いエンドプロテイナーゼリンカー（GR）をコードする核酸、セルピンフィンガーポリペプチドをコードする核酸、リンカーをコードする核酸、およびHIV融合インヒビターペプチドをコードする核酸を含むコアストレプトアビジン融合遺伝子を、応じた核酸セグメントの連結により、公知の組み換え方法および技術で構築した。ポリペプチドF1、F2、およびF3をコードする核酸配列は、化学合成により作製し、その後、増幅のために大腸菌プラスミド中にライゲーションした。サブクローニングした核酸配列を、DNA塩基配列決定法により検証した。

【0069】

基礎の／出発となる大腸菌発現プラスミド4980の作製および説明
プラスミド4980（4980-pBRori-URA3-LACI-SAC）は、大腸菌におけるコアストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、プラスミド1966（1966-pBRori-URA3-LACI-T-リピート；EP-B 1 422 237において報告されている）由来の3142塩基対の長さのEcoRI/CelII断片の、435塩基対の長さのコアストレプトアビジンをコードするEcoRI/CelII断片とのライゲーションにより生成した。

【0070】

コアストレプトアビジン大腸菌発現プラスミドは、以下の要素を含む：
‐大腸菌における複製のための、ベクターpBR322由来の複製開始点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90による2517-3160位の塩基対に対応する）、
‐大腸菌pyrF変異体株の相補によるプラスミド選択を可能にする（ウラシル栄養要求性）、オロチジン5'-ホスファートデカルボキシラーゼをコードするサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のURA3遺伝子（Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124）、
‐以下で作られているコアストレプトアビジン発現カセット
‐Stueber, D.ら（下記参照）による合成リボゾーム結合部位を含む、T5ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター）、
‐コアストレプトアビジン遺伝子、および
‐2種のバクテリオファージ由来転写ターミネーターである、λ-T0ターミネーター（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414）およびfdターミネーター（Beck, E., and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58）、ならびに
‐大腸菌由来のlacI抑制遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）。

【0071】

FP-1、FP-2、およびFP-3融合ポリペプチド発現プラスミドの作製
a）プラスミド4981
プラスミド4981（4981-SAC-セルピン1-T1249）は、大腸菌におけるコアストレプトアビジン-FP-1タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の232塩基対の長さのNheI/CelII-F1遺伝子セグメント（F1ポリペプチドをコードするSEQ ID NO: 84）

の、3547塩基対の長さのNheI/CelII-4980プラスミド断片中への挿入により調製した。

【0072】

b）プラスミド4982
プラスミド4982（4982-SAC-セルピン2-T651）は、大腸菌におけるコアストレプトアビジン-FP-2タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の181塩基対の長さのNheI/CelII-F2遺伝子セグメント（F2ポリペプチドをコードするSEQ ID NO: 85）

の、3547塩基対の長さのNheI/CelII-4980プラスミド断片中への挿入により調製した。

【0073】

c）プラスミド4983
プラスミド4983（4983-SAC-セルピン3-T2635）は、大腸菌におけるコアストレプトアビジン-FP-3タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の232塩基対の長さのNheI/CelII-F3遺伝子セグメント（F3ポリペプチドをコードするSEQ ID NO: 86）

の、3547塩基対の長さのNheI/CelII-4980プラスミド断片中への挿入により調製した。

【0074】

実施例2
大腸菌におけるコアストレプトアビジン融合タンパク質の発現
コアストレプトアビジン融合タンパク質4981、4982、および4983の発現のために、大腸菌栄養要求性（PyrF）の相補により抗生物質フリーのプラスミド選択を可能にする大腸菌宿主／ベクター系を使用した（例えば、EP-B 0 972 838および米国特許第6,291,245号参照）。

【0075】

融合タンパク質を、大腸菌株CSPZ-2（leuB, proC, trpE, thi-1, ΔpyrF）において発現させた。

【0076】

選択培地におけるpyrF栄養要求性の相補による形質転換および細胞培養
大腸菌K12株CSPZ-2（leuB, proC, trpE, thi-1, ΔpyrF）を、前の段階において得られた発現プラスミド（それぞれ4981、4982、および4983）で形質転換させた。形質転換したCSPZ-2細胞を、最初に37℃で寒天プレート上で増殖させ、その後、0.5％カザミノ酸（Difco）を含有するM9最小培地中で振盪培養において0.6〜0.9の550 nmでの光学密度（OD550）まで増殖させ、続いて、IPTG（1〜5 mmol/lの最終濃度）で誘導した。

【0077】

37℃での4〜16時間の誘導期の後、細胞を遠心分離により収集し、50 mmol/lリン酸カリウム緩衝液、pH 6.5で洗浄し、さらなる加工処理まで-20℃で保存した。

【0078】

発現解析
発現解析のために、3 OD550nm単位（1 OD550nm＝1の550 nmでのODを有する1 mlの細胞懸濁液）の遠心分離した培養培地由来の細胞沈殿物を、0.25 mlの10 mmol/lリン酸カリウム緩衝液、pH 6.5に再懸濁し、超音波処理（50％強度での30秒の2パルス）により細胞を溶解した。不溶性の細胞成分を沈降させ（遠心分離、14,000 rpm、5分）、上清を1/5の容積の5×SDS試料緩衝液と混合した（1×SDS試料緩衝液：50 mmol/lトリス-HCl、pH6.8、1％ SDS、50 mmol/l DTT、10％グリセロール、0.001％ブロモフェノールブルー）。不溶性の細胞破片分画（沈殿物）を、0.3 mlの1×SDS試料緩衝液に再懸濁し、試料を5分間、95℃でインキュベーションして、再び遠心分離した。続いて、タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）により分離し、クマシーブリリアントブルーR色素で染色した。

【0079】

合成したコアストレプトアビジン融合タンパク質は均質であり、不溶性のタンパク質凝集物、いわゆる封入体（IB）の形態で、不溶性の細胞破片分画のみにおいて見出された。発現率は、すべてのクローンにおいて測定精度の範囲内で匹敵し、大腸菌タンパク質全体に対して30％〜60％の間であった。

【0080】

実施例3
コアストレプトアビジン融合タンパク質の組み換え生産のための大腸菌の10 lの高細胞密度発酵
前培養：
前培養物を調製するために、1000 mlエルレンマイヤーフラスコにおいて、300 mlのM9プラス培地（0.5％カザミノ酸、ならびに各々0.9 g/lのTrp、Pro、およびLeuを追加したM9培地）に、それぞれプラスミド4981、4982、および4983で形質転換した大腸菌CSPZ-2の1 mlのグリセロールストックを接種した。3.0のOD578nmに達するまで、約6時間、37℃で、150 rpmの傍心振盪機上で培養物をインキュベーションした。

【0081】

10 lの流加主発酵：
発酵の初めに、前培養物を10リットルの発酵槽中に移した。主培養を、グルコースの代わりに1.4％グリセロール、2％カザミノ酸、ならびに各々0.1％のアミノ酸Trp、Leu、およびProを含有する、規定されたM9塩培地において、20のOD578nmまで増殖させた。続いて、培養へのグリセロール酵母用量（ストック溶液：30％酵母エキスおよび33％グリセロール）の供給を開始し、その流速を、培養物のpH値の動向に応じて0.8〜3.5 ml/分の間で変動させ、それにより補正液（H₃PO₄、KOH）のいかなるさらなる添加も回避した。pHは、pH 7.0に維持し、撹拌機速度を制御することにより、pO₂値を50％に保持した。70のOD578nmで、1.5 mmol/l IPTGを添加した。160〜180のOD578nmで、発酵を終了した。

【0082】

生物体量の収集：
発酵槽の内容物を、フロースルー遠心分離（13,000 rpm、13 l/h）で遠心分離し、収集した生物体量を、さらなる加工処理まで-20℃で保存した。

【0083】

実施例4
細胞溶解およびIBの調製
200 g大腸菌細胞（湿重量）を1リットルの0.1 mol/lトリス-HCl、pH7.0に0℃で懸濁し、300 mgリゾチームを添加して、20分間、0℃でインキュベーションした。続いて、高圧分散により機械的に、細胞を完全に溶解し、2 mlの1 mol/l MgCl₂および10 mg DNAseを添加することにより、30分間、25℃で、DNAを消化した。その後、500 mlの60 mmol/l EDTA、6％Triton X-100、および1.5 mol/l NaCl、pH 7.0を溶解溶液と混合し、さらに30分間、0℃でインキュベーションした。続いて、不溶性成分（細胞破片およびIB）を、遠心分離により沈降させた。沈殿物を、1リットルの0.1 mol/lトリス-HCl、20 mmol/l EDTA、pH 6.5に懸濁し、30分間、25℃でインキュベーションして、遠心分離により、IB調製物を単離した。

【0084】

実施例5
F1、F2、およびF3を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質の可溶化、酵素による放出、ならびにF1、F2、およびF3ポリペプチドの精製
前実施例において得られた封入体を、2回、各々100mMリン酸カリウム緩衝液、pH 6.5、500 mM塩化ナトリウム、20 mM EDTA、および再蒸留水で、洗浄した。10 mlの30 mM水酸化カリウム溶液の添加により、1グラム（湿重量）の沈殿した封入体を溶解させた。30分の撹拌後、1 Mホウ酸の添加により、pH値をpH 8.9に変化させた。可溶化およびpH調整の後、F1およびF2を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質を、トリプシン（1:25000 w/w）で酵素的に消化し、他方、F3を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質を、LysC（1:20000 w/w；10μlの10μM LysC溶液）で酵素的に消化した。溶液を、15℃で一晩インキュベーションした。10倍モル過剰のアプロチニンの添加により、トリプシン消化を停止させた。rec SerETIアフィニティークロマトグラフィーにより、残留プロテアーゼを精製して除去した。F3のLysC消化は、rec SerETIアフィニティークロマトグラフィーのみにより停止させた。

【0085】

放出されたF1、F2、およびF3融合ポリペプチドを、Eurospher C8クロマトグラフィーカラムを用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。

【0086】

実施例6
融合ポリペプチドおよびα1-アンチトリプシンのタンパク質複合体の形成
PBS（リン酸緩衝生理食塩水、1 mM KH₂PO₄、10 mM Na₂HPO₄、105 mM NaCl、2.7 mM KCl）中の25μMα1-アンチトリプシンを、37℃で、4〜5倍過剰の融合ポリペプチド（例えば、125μM）と共に24時間インキュベーションした。より長いインキュベーション時間を用いても、タンパク質複合体のさらなる形成はもたらされなかった。インキュベーション後、サイズ排除濾過により、タンパク質複合体を、複合体形成していないセルピンフィンガーポリペプチドから分離した。ほぼ同一の分子量の分子を含む分画を、混ぜ合わせた。混ぜ合わせた分画を濃縮し、試料をSDS-PAGEゲルにアプライした。SDS-PAGEゲル上の個々のバンドを、1D-Image-Master（Amersham Bioscience）を用いて分析し、タンパク質複合体の分画を定量化して、分子量の差を測定した。混ぜ合わせて濃縮した分画の活性を、BIAcoreにより測定した（図3参照）。反応混合物において、二量体α1-アンチトリプシン（125 kDa、約14％）、タンパク質複合体（60 kDa、約15％）、および単量体α1-アンチトリプシン（55 kDa）が検出された。

【0087】

実施例7
BIAcore解析
すべての表面プラズモン共鳴測定を、BIAcore 3000機器（GE Healthcare Biosciences AB, Sweden）上で、25℃で行った。化学的に調製したHIV HR1ペプチド

を、製造業者の指示（GE Healthcare Biosciences AB, Sweden）に従って、CM5バイオセンサーチップ上に固定化した。融合ポリペプチドを25 nMの濃度に希釈し、50μl/分の流速で5分にわたって注入した。その後、様々な混ぜ合わせた分画から得られたタンパク質複合体を、250 nMおよび80 nMの濃度になるよう同一緩衝液中に希釈し、50μl/分の流速で5分にわたって注入した。後に、センサーチップを、1分間、PBS、pH 8.0、0.005％（v/v）Tween 20で再生させた。データ解析を、BIAevaluationソフトウェア（BIAcore, Sweden）で行った（図4参照）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]