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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5760273
(24)【登録日】2015年6月19日
(45)【発行日】2015年8月5日
(54)【発明の名称】抗体を産生するトランスジェニックカイコとその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20150716BHJP
A01K 67/033 20060101ALI20150716BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20150716BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20150716BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
A01K67/033 501
C12P21/08
!C07K16/00
【請求項の数】42
【全頁数】49
(21)【出願番号】特願2013-129087(P2013-129087)
(22)【出願日】2013年6月20日
(62)【分割の表示】特願2007-541022(P2007-541022)の分割
【原出願日】2006年10月18日
(65)【公開番号】特開2013-230155(P2013-230155A)
(43)【公開日】2013年11月14日
【審査請求日】2013年7月19日
(31)【優先権主張番号】特願2005-302906(P2005-302906)
(32)【優先日】2005年10月18日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】501167644
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業生物資源研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】000003975
【氏名又は名称】日東紡績株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(72)【発明者】
【氏名】田村 俊樹
(72)【発明者】
【氏名】小林 功
(72)【発明者】
【氏名】神田 俊男
(72)【発明者】
【氏名】内野 恵郎
(72)【発明者】
【氏名】片山 勝博
(72)【発明者】
【氏名】大橋 建也
(72)【発明者】
【氏名】清川 巌
(72)【発明者】
【氏名】新井 久枝
(72)【発明者】
【氏名】船橋 範行
【審査官】
柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】
特開２００５−０９５０６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００２−３１５５８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Bio. Ind., (2004), 21, [3], p.28-35
【文献】
J. Immunol. Methods, (1996), 195, [1-2], p.93-101
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８
Ａ０１Ｋ ６７／０３３
Ａ０１Ｋ ６７／０４
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、可溶性で活性を有する組換え抗体の製造方法；
（ａ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするＤＮＡを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
（ａ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするＤＮＡを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
【請求項2】
トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のＤＮＡを有するトランスジェニックカイコである、請求項１に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
【請求項3】
トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項１に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
【請求項4】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、可溶性で活性を有する組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
【請求項9】
トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、請求項８に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
【請求項10】
トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項８に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
【請求項11】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、可溶性で活性を有する組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコ。
【請求項16】
以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有する、請求項１５に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
【請求項17】
以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項１５に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
【請求項18】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項１５〜１７のいずれかに記載のカイコ。
【請求項19】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項１５〜１７のいずれかに記載のカイコ。
【請求項20】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項１５〜１７のいずれかに記載のカイコ。
【請求項21】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項１５〜２０のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
【請求項22】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、可溶性で活性を有する組換え抗体の製造方法；
（ａ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
（ａ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
【請求項23】
トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、請求項２２に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
【請求項24】
トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項２２に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
【請求項25】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項28】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項29】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、可溶性で活性を有する組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
【請求項30】
トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、請求項２９に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
【請求項31】
トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項２９に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
【請求項32】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項33】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項34】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項35】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項２９〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項36】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、可溶性で活性を有する組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコ。
【請求項37】
以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有する、請求項３６に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
【請求項38】
以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項３６に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
【請求項39】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項３６〜３８のいずれかに記載のカイコ。
【請求項40】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項３６〜３８のいずれかに記載のカイコ。
【請求項41】
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項３６〜３８のいずれかに記載のカイコ。
【請求項42】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項３６〜４１のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳類が作る抗体に近い抗体を大量に生産することが可能な、カイコを利用した組換え抗体の製造方法に関する。本発明はまた、該組換え抗体を産生するトランスジェニックカイコに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、医薬品や診断薬の分野において、病気の治療や診断に特異性の高い抗体が大量に必要とされている。抗体は一般に、マウスやラット、ウサギ等の哺乳動物を用いて作られるが、近年、微生物や哺乳類の細胞、組換え動物、組換え植物などによる抗体の生産が行われるようになってきた。組換え抗体には、同じ品質のものを大量に作れる、ウイルス等の病気が持ち込まれないため安全、等の特徴があり、今後重要性が増すと考えられている。
【0003】
しかしその一方で、問題点も多く抱えている。たとえば、大腸菌等の微生物においては抗体の一部のみしか生産されず、また、作られた抗体自体も糖鎖やリン酸化が不十分なため、医療品や診断薬用途としては十分に適切であるとは言えない。さらに、ヒトの抗体は一般に、大腸菌などで作った場合は不溶化することが知られている。そのため、精製にあたっては、SDS等の変性剤でタンパク質を可溶化させる工程や、溶液中の変性剤を透析などで徐々に取り除きタンパク質としての活性を取り戻させる工程が必要である。
【0004】
また、哺乳類の細胞を用いると生産コストが高くなるため、大量生産は困難な状況である。そのため、組換え動物や植物などを用いた抗体生産が試みられているが、いずれも研究段階に止まっている。他の真核生物の細胞などを用いた場合でも、細胞の外に分泌させるため、特殊なシグナルが必要である。
【0005】
カイコは絹糸腺という器官を有し、一匹当たり最大で0.5ｇのタンパク質を作る能力がある。近年、組み換えカイコの作出技術が開発され、外来遺伝子の導入法や導入遺伝子の発現制御法の開発が進んだため、絹糸腺で導入遺伝子を発現させ、組換えタンパク質を生産することが可能になってきた。カイコは真核生物であるため、大腸菌等の微生物や植物と比較すると、哺乳類に近い型のタンパク質を作ることが出来る。また、人工飼料を用いた清浄飼育が可能で、数万頭レベルの大量飼育を容易に行うことが出来る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開2006-137739 田村俊樹，瀬筒秀樹，小林功，小島桂，神田俊男，内野恵郎（2005）カイコ中部絹糸腺特異的遺伝子発現系を利用したタンパク質の製造方法．出願日：2005年3月15日．出願人：農業生物資源研究所
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】田村俊樹（1999）トランスポソンを利用した形質転換カイコの作出方法.第7回昆虫機能研究会講演要旨、p10-22.
【非特許文献2】Tamura, T., Thibert, C., Royer ,C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P. （2000） A piggyBac element-derived vector efficiently promotes germ-line transformation in the silkworm Bombyx mori L. Nature Biotechnology 18, 81-84.
【非特許文献3】Tomita M, M. H., Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K.,（2003）Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol 21, 52-56
【非特許文献4】田村俊樹（2000）トランスジェニックカイコ：現状と展望.日蚕雑69、1-12．
【非特許文献5】田村俊樹（2000）カイコ発生における有用遺伝子導入．第21回基礎育種シンポジウム報告：動植物分子育種における発生工学的手法の展開。ｐ23-29.
【非特許文献6】Tamura, T., Quan, G.X., Kanda, T., and Kuwabara, N. （2001） Transgenic silkworm research in Japan: Recent progress and future. Proceeding of Joint International Symposium of Insect COE Research Program and Insect Factory Research Project. p77-82.
【非特許文献7】Imamura, M., Nakai, J., Inoue, S., Quan, G-X., Kanda T., and Tamura, T.（2003）Targeted gene expression using the Gal4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Genetics, 165, 1329-1340.
【非特許文献8】田村俊樹（2004）組換え体カイコを利用した有用物質の生産系の開発とその展望．バイオインダストリー20（3）、28-35.
【非特許文献9】田村俊樹・内野恵郎・神田俊男・小林功・小島桂（2004）酵母のGAL4/UAS系を利用した中部絹糸腺特異的遺伝子の発現系の作出．日蚕講要74、p51.
【非特許文献10】田村俊樹（2004）トランスジェニックカイコ作出法が確立！新しい機能をもつ繊維の生産に期待．化学と生物42，634-635．
【非特許文献11】田村俊樹（2004）トランスジェニックカイコの作出と有用物質の生産．バイオロジクス：生体由来物質を用いた製品開発（高分子学会編）pp45-68.
【非特許文献12】植田克美（2004）抗体エンジニアリングの最前線．ｐ122．シーエムシー出版、東京
【非特許文献13】I. Kiyokawa, I. Kobayashi, K. Uchino, H. Sezutsu, T. Kanda, T. Tamura, T. Miura, T. Ohashi, K. Katayama (2006) Production of hexokinase and anti-human transferrin antibody for clinical diagnostic reagent using transgenic silkworm. Abstract of 7th International Workshop on the Molecular Biology and Genetics of the Lepidoptera,p94.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
このように、組換え抗体の重要性が増しているにもかかわらず、組換え抗体の製造には数多くの課題がある。本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、組換えカイコを利用して、哺乳類が作る抗体に近い組換え抗体を大量に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。具体的には、絹糸腺特異的に発現する遺伝子の上流をプロモーター領域として用い、これをGAL4遺伝子の上流に挿入した。さらに、組換えカイコ作出用のベクタープラスミドにこの融合遺伝子を挿入した。組換えカイコの作出はTamura ら（2000）の方法によって行った。得られた組換えカイコを、Imamuraら（2003）の方法で作出されたGAL4の標的配列UASの下流にTransferrinと反応するscFv型抗体遺伝子をもつUASFvaTf系統と交配した。交配によって得られた組換えカイコの吐糸期の絹糸腺から抽出したサンプルについて、ウエスタンブロテッティングを行った結果、絹糸腺において抗体が生産されていることが確認された。また、同じように得られた抽出サンプルを抗原と反応させた結果、絹糸腺抽出物の量が増加するに伴って抗原との反応物の量が増加し、抗体としての活性を有していることが分かった。
【0010】
すなわち本発明は、カイコの絹糸線における組換えタンパク質の製造方法に関し、以下の〔１〕〜〔４９〕を提供するものである。〔１〕以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法；
（ａ）シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔２〕以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法；
（ａ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔３〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔２〕に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔４〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔２〕に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔５〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔３〕又は〔４〕に記載の方法。
〔６〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔２〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔６〕に記載の方法。
〔７−１〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔７〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１６に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１６に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔７−２〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔７〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１７に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１７に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔８〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔６〕に記載の方法。
〔８−１〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔８〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１８に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔９〕シグナル配列を有する組換え抗体。
〔９−１〕シグナル配列が動物由来である、〔９〕に記載の抗体。
〔９−２〕シグナル配列が動物抗体由来である、〔９〕に記載の抗体。
〔９−３〕シグナル配列がヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列、またはマウスIgG1のシグナル配列である、〔９〕に記載の抗体。
〔１０〕全長抗体または低分子抗体である、〔９〕に記載の抗体。
〔１０−１〕低分子化抗体がscFv型抗体である、〔１０〕に記載の抗体。
〔１０−２〕一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点として、シグナル配列、VH、リンカー、VL、又はシグナル配列、VL、リンカー、VHの順に並んでいることを特徴とする、〔１０−１〕に記載のscFv型抗体。
〔１０−３〕抗原がトランスフェリン、CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、アルブミン、プレアルブミン、補体C3、補体C4、α-1 マイクログロブリン、β-2マイクログロブリン、AFP、CA 19-9、CA15-3、PSA、アポリポプロテイン、腫瘍壊死因子、インターロイキン、インターフェロン、オステオポンチン、HBs抗原、RF、HCG、コラーゲン、Hb、HbA1c、HCV抗体、トロポニン、ミオグロビン、FDP、CEA、c-erbB-2、haptoglobinである、〔１０〕に記載のscFv型抗体。
〔１０−４〕VH、リンカー、VLがそれぞれ、配列番号：６、９、１２に記載のアミノ酸配列を含む、〔１０−３〕に記載のscFv型抗体。
〔１０−５〕シグナル配列が配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、〔１０−３〕に記載のscFv型抗体。
〔１０−６〕配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を含む、scFv型抗体。
〔１０−７〕シグナル配列として配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するL鎖、及び、シグナル配列として配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体。
〔１０−８〕シグナル配列として配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列、L鎖可変領域として配列番号：２３に記載のアミノ酸配列、Jκセグメントとして配列番号：２５に記載のアミノ酸配列、κ鎖定常領域として配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、及び、シグナル配列として配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列、H鎖可変領域として配列番号：３１に記載のアミノ酸配列、CH1として配列番号：３３に記載のアミノ酸配列、ヒンジ領域として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、CH2として配列番号：３７に記載のアミノ酸配列、CH3として配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体。
〔１０−９〕配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、および、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体。
〔１１〕〔９〕〜〔１０−９〕のいずれかに記載の抗体をコードするDNA。
〔１１−１〕シグナル配列として配列番号：２、２０、および２８のいずれかに記載の塩基配列、VHとして配列番号：５に記載の塩基配列、リンカーとして配列番号：８に記載の塩基配列、VLとして配列番号：１１に記載の塩基配列を含む、scFv型抗体をコードするDNA。
〔１１−２〕シグナル配列として配列番号：１、２０、および２８のいずれかに記載の塩基配列、VHとして配列番号：４に記載の塩基配列、リンカーとして配列番号：７に記載の塩基配列、VLとして配列番号：１０に記載の塩基配列を含む、scFv型抗体をコードするDNA。
〔１１−３〕配列番号：１４に記載の塩基配列を含む、scFv型抗体をコードするDNA。
〔１１−４〕配列番号：１３に記載の塩基配列を含む、scFv型抗体をコードするDNA。
〔１１−５〕シグナル配列として配列番号：１、２、２０、および２８のいずれかに記載の塩基配列を有するDNAであって抗体L鎖をコードするDNA、及び、シグナル配列として配列番号：１、２、２０、および２８のいずれかに記載の塩基配列を有するDNAであって抗体H鎖をコードするDNA、を含むDNA。
〔１１−６〕シグナル配列として配列番号：１、２、２０、および２８のいずれかに記載の塩基配列、L鎖可変領域として配列番号：２２に記載の塩基配列、Jκセグメントとして配列番号：２４に記載の塩基配列、κ鎖定常領域として配列番号：２６に記載の塩基配列を有するDNAであって抗体L鎖をコードするDNA、及び、シグナル配列として配列番号：１、２、２０、および２８のいずれかに記載の塩基配列、H鎖可変領域として配列番号：３０に記載の塩基配列、CH1として配列番号：３２に記載の塩基配列、ヒンジ領域として配列番号：３４に記載の塩基配列、CH2として配列番号：３６に記載の塩基配列列、CH3として配列番号：３８に記載の塩基配列を有するDNAであって抗体H鎖をコードするDNA、を含むDNA。
〔１１−７〕抗体L鎖として配列番号：４８に記載の塩基配列を有するDNA、および、抗体H鎖として配列番号：５０に記載の塩基配列を有するDNA、を含むDNA。
〔１２〕〔１１〕〜〔１１−７〕のいずれかに記載のDNAを有するベクター。
〔１３〕〔１２〕に記載のベクターを保持する細胞。
〔１４〕シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔１５〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔１６〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔１５〕に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔１７〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔１５〕に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔１８〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔１６〕又は〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔１５〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔１９〕に記載の方法。
〔２０−１〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔２０〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１６に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１６に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔２０−２〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔２０〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１７に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１７に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔２１〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔１９〕に記載の方法。
〔２１−１〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔２１〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１８に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔２２〕シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコ。
〔２３〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔２４〕以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有する、〔２３〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔２５〕以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔２３〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔２６〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔２４〕又は〔２５〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔２７〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔２３〕〜〔２６〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔２８〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔２７〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔２８−１〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔２８〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ａ）配列番号：１６に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１６に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔２８−２〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔２８〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ａ）配列番号：１７に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１７に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔２９〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔２７〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔２９−１〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔２９〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ａ）配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１８に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔３０〕転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔３１〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔３０〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔３２〕以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法；
（ａ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔３３〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔３２〕に記載の方法；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔３４〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔３２〕に記載の方法；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔３５〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔３３〕又は〔３４〕に記載の方法。
〔３５−１〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔３５〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１９に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔３６〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔３７〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔３６〕に記載の方法；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔３８〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔３６〕に記載の方法；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔３９〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔３７〕又は〔３８〕に記載の方法。
〔３９−１〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔３９〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１９に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔４０〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔４１〕以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有する、〔４０〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔４２〕以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔４０〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔４３〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔４１〕又は〔４２〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔４３−１〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔４３〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１９に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔４４〕以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、生体中のトランスフェリンの量を測定する方法；
（ａ）〔９〕〜〔１０−９〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔１〕〜〔８−１〕、〔３２〕〜〔３５−１〕、〔５０〕〜〔５７−１〕もしくは〔７６〕〜〔７９−１〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体と、被検者由来の生体試料を接触させる工程、
（ｂ）生体試料中のトランスフェリンと抗体の結合を検出する工程。
〔４５〕正常である対照と比較してトランスフェリンの量が多いときに、糖尿病性腎症に罹患している、又は罹患リスクが高いと判定されることを特徴とする、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、糖尿病性腎症を診断する方法；
（ａ）〔９〕〜〔１０−９〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔１〕〜〔８−１〕、〔３２〕〜〔３５−１〕、〔５０〕〜〔５７−１〕もしくは〔７６〕〜〔７９−１〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体と、被検者から得た生体試料を接触させる工程、
（ｂ）生体試料中のトランスフェリンと結合した抗体を検出する工程。
〔４６〕糖尿病性腎症に罹患していることが明らかな対照と比較してトランスフェリンの量が同程度であるときに、糖尿病性腎症に罹患している、又は罹患リスクが高いと判定されることを特徴とする、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、糖尿病性腎症を診断する方法；
（ａ）〔９〕〜〔１０−９〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔１〕〜〔８−１〕、〔３２〕〜〔３５−１〕、〔５０〕〜〔５７−１〕もしくは〔７６〕〜〔７９−１〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体と、被検者から得た生体試料を接触させる工程、
（ｂ）生体試料中のトランスフェリンと結合した抗体を検出する工程。
〔４７〕正常である対照と比較してトランスフェリンの量が少ないときに、栄養障害のリスクが高い、または栄養障害に陥っていると判定されることを特徴とする、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、栄養状態を評価する方法；
（ａ）〔９〕〜〔１０−９〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔１〕〜〔８−１〕、〔３２〕〜〔３５−１〕、〔５０〕〜〔５７−１〕もしくは〔７６〕〜〔７９−１〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体と、被検者から得た生体試料を接触させる工程、
（ｂ）生体試料中のトランスフェリンと結合した抗体を検出する工程。
〔４８〕〔９〕〜〔１０−９〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔１〕〜〔８−１〕、〔３２〕〜〔３５−１〕、〔５０〕〜〔５７−１〕もしくは〔７６〕〜〔７９−１〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体を有効成分として含有する、糖尿病性腎症の診断薬。
〔４９〕〔９〕〜〔１０−９〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔１〕〜〔８−１〕、〔３２〕〜〔３５−１〕、〔５０〕〜〔５７−１〕もしくは〔７６〕〜〔７９−１〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体を有効成分として含有する、栄養状態を評価するための試薬。
〔５０〕以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法；
（ａ）組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔５１〕以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法；
（ａ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔５２〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔５１〕に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔５３〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔５１〕に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔５４〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔５２〕又は〔５３〕に記載の方法。
〔５５〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔５１〕〜〔５４〕のいずれかに記載の方法。
〔５６〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔５５〕に記載の方法。
〔５６−１〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔５６〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１６に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１６に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔５６−２〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔５６〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１７に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１７に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔５７〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔５５〕に記載の方法。
〔５７−１〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔５７〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１８に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔５８〕組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔５９〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔６０〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔５９〕に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔６１〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔５９〕に記載の方法；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔６２〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔６０〕又は〔６１〕に記載の方法。
〔６３〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔５９〕〜〔６２〕のいずれかに記載の方法。
〔６４〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである〔６３〕に記載の方法。
〔６４−１〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔６４〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１６に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１６に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔６４−２〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔６４〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１７に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１７に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔６５〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔６３〕に記載の方法。
〔６５−１〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔６５〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１８に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔６６〕組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコ。
〔６７〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔６８〕以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有する、〔６７〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔６９〕以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔６７〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔７０〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔６８〕又は〔６９〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔７１〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔６７〕〜〔７０〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔７２〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔７１〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔７２−１〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔７２〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ａ）配列番号：１６に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１６に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔７２−２〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔７２〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ａ）配列番号：１７に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１７に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔７３〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔７１〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔７３−１〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔７３〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ａ）配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１８に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔７４〕転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔７５〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔７４〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔７６〕以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法；
（ａ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔７７〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔７６〕に記載の方法；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔７８〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔７６〕に記載の方法；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔７９〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔７７〕又は〔７８〕に記載の方法。
〔７９−１〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔７９〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１９に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔８０〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔８１〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔８０〕に記載の方法；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔８２〕トランスジェニックカイコが、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔８０〕に記載の方法；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔８３〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔８１〕又は〔８２〕に記載の方法。
〔８３−１〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔８３〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１９に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔８４〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔８５〕以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のDNAを有する、〔８４〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔８６〕以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔８４〕に記載のトランスジェニックカイコ；
（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔８７〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔８５〕又は〔８６〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔８７−１〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の（ａ）又は（ｂ）である、〔８７〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１９に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔８８〕〔１〕〜〔８−１〕、〔３２〕〜〔３５−１〕、〔５０〕〜〔５７−１〕もしくは〔７６〕〜〔８７−１〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】組換えカイコ作出のためのベクターpUASFvaTfの構造及びその構築手順を示す図である。
【図2】Ser1GAL4系統とUASFvaTf系統の交配による抗体発現カイコの作出を示す図である。
【図3】GAL4遺伝子を持つ個体とUASを持つ個体の実体蛍光顕微鏡写真である。
【図4】RT-PCRによる交雑系統におけるFvaTf遺伝子の転写確認を示す写真である。
【図5】ウェスタンブロッティングによる抗体タンパク質の同定を示す写真である。
【図6】ELISAによる組換え抗体の抗原に対する活性の測定結果を示す図である。
【図7】組換えカイコ作出のための抗体遺伝子のL鎖をコードするプラスミドベクターpBacN/lox p UASIgL SV40の構造及びその構築手順を示す図である。
【図8】組換えカイコ作出のための抗体遺伝子のH鎖をコードするプラスミドベクターpDNA/UAS IgH SV40の構造及びその構築手順を示す図である。
【図9】抗体遺伝子組換えカイコ作出のためのベクターpBacN/lox p UASIgH UASIgHの構造及びその構築手順を示す図である。
【図10】Ser1GAL4系統とUASIgL-UASIgH系統の交配による抗体発現カイコの作出を示す図である。
【図11】GAL4遺伝子を持つ個体とUASを持つ個体の実体蛍光顕微鏡写真である。
【図12】RT-PCRによる交雑系統におけるIgL遺伝子及びIgH遺伝子の転写確認を示す写真である。
【図13】交雑系統が発現した組換え抗体がIgG1かつL鎖としての免疫原性がkappaであることを示す写真である。
【図14】ELISAによる組換え抗体の抗原に対する活性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、カイコを利用した組換え抗体の製造方法に関する。本発明は、本発明者らが、組換えカイコの体内において活性を有する抗体を産生させることに成功したことに基づく。すなわち本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法を提供する。（ａ）組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程。
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
また本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法を提供する。
（ａ）シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程。
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
【0013】
本発明の組換え抗体の製造方法の１つの具体的な態様においては、組換え抗体は、カイコの絹糸腺において産生されることを特徴とする。すなわち本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法に関する。（ａ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程。
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
また本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法に関する。
（ａ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程。
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
【0014】
本発明のトランスジェニックカイコを製造する工程においては、まず、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体（好ましくはシグナル配列を有する組換え抗体）をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する。次いで、製造されたカイコ卵から生じたカイコの中から、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを選択する。
【0015】
本発明において、トランスジェニックカイコを選択するには、例えば、選択マーカーを用いて行うことができる。本発明における選択マーカーとしては、当業者において一般的に使用されるマーカー、例えば、CFP、GFP、YFP、DsRed等の蛍光タンパク質を使用することができる。これらのマーカーを用いることにより、実体蛍光顕微鏡で観察するだけでトランスジェニックカイコを検出することができる。また、蛍光色が異なるので、複数のマーカーを同時に使用することもできる。
【0016】
本発明の方法によって製造することが可能である抗体には、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)および低分子化された抗体の両方が含まれる。本発明において、全長抗体の由来は特に限定されず、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコなどに由来する抗体を製造することが可能である。また抗体のisotypeも限定されず、例えばヒトの場合、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMのisotypeの抗体を製造することが可能である。本発明の全長抗体は、実施例および図１３に示すように、定常領域、例えば、補体依存性細胞障害活性や抗体依存性細胞障害活性を持つ定常領域、及び図１４に示すように抗原を認識する可変領域とを含む抗体である。
【0017】
一方本発明の低分子化抗体は、全長抗体の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（VH）又は／及び軽鎖可変領域（VL）を含んでいることが好ましい。VH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入がされていてもよい。さらに抗原への結合能を有する限り、VH又は/及びVLの一部を欠損させてもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、Diabody、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。本発明において特に好ましい低分子化抗体は、scFv抗体である。
【0018】
ここで、「Fv」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。「Fv」断片は1つのVH及びVLが非共有結合により強く連結されたダイマー（VH-VLダイマー）である。各可変領域の3つの相補鎖決定領域（complementarity determining region；CDR）が相互作用し、VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。6つのCDRが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、1つの可変領域（又は、抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【0019】
scFvには、抗体のVH及びVLが含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、FvポリペプチドはさらにVH及びVLの間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりscFvは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（scFvの総説については、Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113（Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994）を参照）。本発明におけるリンカーは、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。
【0020】
VHとVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置を挙げることができる。N末端-シグナル配列-［VH］-リンカー-［VL］-C末端
N末端-シグナル配列-［VL］-リンカー-［VH］-C末端
【0021】
本発明のscFv抗体は、１つのVH及び１つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL（［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。本発明のscFvは、全長抗体や他の低分子化抗体と比較して、特に高い抗体活性を示す。
【0022】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカー等）を用いることができるが、本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは3〜50アミノ酸、更に好ましくは5〜30アミノ酸、特に好ましくは12〜18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。本発明におけるリンカーとしては、例えば、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を含むリンカーが挙げられる。
【0023】
また、本発明の組換え抗体の好ましい態様として、ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト及びマウス以外の抗体等の改変抗体が挙げられる。
【0024】
キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体V領域をコードするDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
【0025】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
【0026】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDR及びFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する(WO98/13388号公報に記載の方法を参照)。
【0027】
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.etal., CancerRes.（1993）53, 851-856）。
【0028】
キメラ抗体及びヒト化抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体定常領域を修飾してもよい。
【0029】
一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域及び定常領域とからなる。
【0030】
なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、FR）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
【0031】
キメラ抗体における可変領域、又はヒト化抗体におけるCDRの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能である。本発明においては、これに限定するものではないが、好ましい抗体としてマウス抗体が挙げられる。
【0032】
本発明において製造される抗体（全長抗体、低分子抗体）が結合する抗原も、特に限定されるものではない。当業者であれば、周知の技術を用いて目的の抗原に結合する抗体を設計することが出来る。本発明は、このように、周知の技術によって所望の抗原に結合するよう設計された抗体を製造する方法に関する。また、該方法によって製造される抗体に関する。
【0033】
なお本発明においては、１つの例として、ヒトTransferrinに結合する抗体を製造した。scFv型抗ヒトTransferrin抗体のH鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：６に、scFv型抗ヒトTransferrin抗体のL鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：１２に示した。また、IgG1抗体のH鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：３１に、L鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：２３に示した。このような抗体は、後述するように、例えば糖尿病性腎症の診断薬、生体中のトランスフェリンの量の測定、栄養アセスメントの評価などの疾患の診断などの用途に用いることが出来る。
【0034】
一方、本発明において提供される抗体の他の態様の１つの例として、CEA(carcinoembryonic antigen)に結合する抗体を挙げることも出来る。CEAは今日、広く腫瘍マーカーとして用いられている。腫瘍マーカースペクトルは胃癌、食道癌などの消化器系腫瘍のみならず、肺癌などの呼吸器循環器系腫瘍など多様な臓器に発現する。従ってCEAに結合する抗体は、腫瘍再発の発見や治療経過観察に有用である。その他に、c-erbB-2に結合する抗体を挙げることもできる。c-erbB-2は幼若化した腺組織の腫瘍細胞に発現する。これに結合する抗体は病理組織学的に腫瘍を検出するのに有用である。また、haptoglobinに結合する抗体を挙げることもできる。haptoglobinは肝臓から血液中に分泌される蛋白質の一種である。この蛋白質は、遊離状態のヘモグロビンと結合する。よってhaptoglobinと結合する抗体は血漿中haptoglobinの測定に有用である。本発明で作製される抗体は、例えばCRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、アルブミン、プレアルブミン、補体C3、補体C4、α-1 マイクログロブリン、β-2マイクログロブリン、AFP、CA 19-9、CA15-3、PSA、アポリポプロテイン、腫瘍壊死因子、インターロイキン、インターフェロン、オステオポンチン、HBs抗原、RF、HCG、コラーゲン、Hb、HbA1c、HCV抗体、トロポニン、ミオグロビン、FDPに対する抗体が挙げられるが、ここに挙げるものだけでなく、医療の分野に応用できる物質と結合する抗体であれば特に制限はされない。さらに、蛋白質に結合する抗体に限られず、環境ホルモンなど低分子化合物に対する抗体も含まれる。実施例に記載のヒトTransferrinに結合する抗体のH鎖またはL鎖の可変領域や超可変領域を適宜変更することによって、所望の抗原に結合する抗体を作成することが可能である。
【0035】
なお本発明においては、産生される組換え抗体の活性を保持するためまたは分泌を促進し回収量を多くするために分泌シグナル（シグナル配列）を用いることが好ましい。分泌タンパク質や膜内在性タンパク質は、小胞体膜結合性のリボソーム上で合成された後に、脂質二重層を通り抜けなければならない。シグナル配列とは、この時に必要な、タンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸残基である。
【0036】
本発明におけるシグナル配列は、上記機能を有する配列であれば特に限定されるものではない。一例としては、例えば、動物由来のシグナル配列が挙げられる。また、動物抗体由来のシグナル配列が挙げられる。ここで動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫が挙げられる。また本発明の好ましいシグナル配列として、例えば、酸性フォスファターゼのシグナル配列を挙げることも出来る。酸性フォスファターゼの由来は特に制限されず、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫由来の酸性フォスファターゼが挙げられる。
【0037】
本発明において特に好ましいシグナル配列は、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列、およびマウスIgG1のシグナル配列である。これらのシグナル配列を用いることにより、発現した組換え抗体の絹糸腺内腔への移行を促進させることができる。このように本発明においては、シグナル配列を用いることが好ましい。
【0038】
シグナル配列を使用する場合、本発明において好ましいヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列として、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、本発明において好ましいマウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列として、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。さらに、本発明において好ましいマウスIgG1のシグナル配列として、配列番号：２９に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のタンパク質と同等の活性を有するものであれば、配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されていてもよい。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同様の生物学的あるいは生化学的活性を有することを指す。
【0039】
本発明におけるシグナル配列は、これに制限されるものではないが、組換え抗体のN末端に結合していることが好ましい。
【0040】
以上より、本発明において特に好ましい抗体の態様として、Transferrin又はCEA、c-erbB-2、haptoglobinに結合する抗体であって、ヒト酸性フォスファターゼ、マウスイムノグロブリンL鎖κ、またはマウスIgG1のシグナル配列を有する抗体が挙げられる。その中でも特に、Transferrinに結合するヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列を有するscFv型マウス抗体が、本発明の抗体として特に好ましい。このような抗体は、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を含む抗体である。また、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入され、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を含む抗体と同等の活性を有する抗体も、本発明の抗体として好ましい。また本発明においては、Transferrin又はCEA、c-erbB-2、haptoglobinに結合する抗体であって、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列を有するL鎖、および、マウスIgG1のシグナル配列を有するH鎖を含む抗体も特に好ましい。このような抗体は、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、および、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体である。また、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入され、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を含む抗体と同等の活性を有するL鎖、および、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入され、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を含む抗体と同等の活性を有するH鎖を含む抗体も、本発明の抗体として特に好ましい。
【0041】
また、Transferrinに結合するヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列を有するscFv型マウス抗体をコードするDNAの好ましい態様としては、配列番号：１３、より好ましくは配列番号：１４に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。また、配列番号：１３（より好ましくは配列番号：１４）に記載の塩基配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入され、配列番号：１３（より好ましくは配列番号：１４）に記載のDNAと同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。また、Transferrinに結合する抗体のL鎖をコードするDNAであって、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列を有するL鎖をコードするDNAの好ましい態様としては、配列番号：４８に記載の塩基配列を有するDNAが挙げられる。また、配列番号：４８に記載の塩基配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入され、配列番号：４８に記載のDNAと同等の機能を有するDNAが挙げられる。
さらに、Transferrinに結合する抗体のH鎖をコードするDNAであって、マウスIgG1のシグナル配列を有するH鎖をコードするDNAの好ましい態様としては、配列番号：５０に記載の塩基配列を有するDNAが挙げられる。また、配列番号：５０に記載の塩基配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入され、配列番号：５０に記載のDNAと同等の機能を有するDNAが挙げられる。
【0042】
本発明における抗体（好ましくはシグナル配列を有する抗体）をコードするDNAは、該DNAを設計するにあたり、コドンを昆虫型に変換することが好ましい。コドンを昆虫型に変換することにより、組換え抗体の発現量を増加させることが可能となる。例として、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列を有するscFv型マウス抗体の場合において、シグナル配列のコドン変換前の塩基配列を配列番号：１に、コドン変換後の塩基配列を配列番号：２に示した。同様に、H鎖可変領域（VH）のコドン変換前の塩基配列を配列番号：４に、コドン変換後の塩基配列を配列番号：５に、L鎖可変領域（VL）のコドン変換前の塩基配列を配列番号：１０に、コドン変換後の塩基配列を配列番号：１１に、リンカー配列の塩基配列を配列番号：７に、コドン変換後の塩基配列を配列番号：８に、抗体全長のコドン変換前の塩基配列を配列番号：１３に、コドン変換後の塩基配列を配列番号：１４に示した。
【0043】
本発明におけるヒトのTransferrinに対するscFv型マウス抗体においては、抗体のH鎖とL鎖の領域のコドンを脊椎動物であるマウスのそれから、昆虫で使用されているそれに変換した。より具体的には、本発明においては、ヒトのTransferrinに対するscFv型マウス抗体のコドンをカイコと同じ昆虫であるハスモンヨトウの近縁種Spodoptera frugiperdaにおいて使用頻度の高いコドンへ適合化した。さらにscFv型抗体のリンカー部分にもSpodoptera frugiperdaにおいて使用頻度の高いコドンを用いた。
【0044】
より具体的には、本発明においては、ヒト及びマウス由来のコドン並びにリンカー部分のコドンにおいて、表1に記載の通り、全部で153アミノ酸に対応するコドンをハスモンヨトウの近縁種Spodoptera frugiperdaで使用頻度の高いコドンへ変換した（変換前の配列は配列番号：１３、変換後の配列は配列番号：１４に対応する。なお、表1中「1stコドン」とは、コドンの1つ目の塩基が配列番号：１３の塩基配列において何番目の塩基に該当するかを意味する。例えば、1stコドン「13」とあるのは、配列番号：１３の13〜15番目の塩基で構成されるコドンが変換されている（この場合、15番目のGがCに変換されている）ことを意味する）。本発明の抗体をコードするDNAは、これらのコドンの変換のうち、少なくとも１つのコドンの変換を行ったDNAが含まれる。また本発明においては、ショウジョウバエ、カイコ、ミツバチ等で使用頻度の高いコドンへ変換することも可能であり、これらの昆虫において使用頻度の高いコドンに変換されたDNAもまた、本発明に含まれる。これらの昆虫において使用頻度の高いコドンは周知である。このように本発明においては、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列を有するscFv型マウス抗体をコードするDNAを設計するにあたり、コドンが昆虫型に変換されたDNAも含まれる。
【0045】
【表1】
【0046】
本発明においては、上記組換え抗体は絹糸腺に分泌される。絹糸腺とはカイコの体内に２本1組として存在する器官であり、絹糸タンパク質の合成器官である。絹糸腺は後部絹糸腺、中部絹糸腺、前部絹糸腺に分けられ、絹タンパク質の合成は後部絹糸腺及び中部絹糸腺にて行われる。本発明において好ましい絹糸腺は、中部絹糸腺及び後部絹糸腺である。なお、本発明の方法によって製造される抗体は、本発明の方法によって製造される限りなんら限定されず、シグナル配列を有していても、有していなくてもよい。即ち、本発明の抗体の製造方法によって製造される抗体には、シグナル配列を有している抗体、シグナル配列を有していない抗体の両方が含まれる。
【0047】
本発明における絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵としては、例えば、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNAを有するカイコ卵が挙げられる。このようなカイコ卵は、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNAをカイコ卵に導入することで製造できる。
【0048】
また、本発明における絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって間接的に発現制御される組換え抗体タンパク質をコードするDNAを有するカイコ卵としては、例えば、（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、転写制御因子をコードするDNAが機能的に結合したDNA、及び（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNA、を有するカイコ卵が挙げられる。なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするためシグナル配列を有するものが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。。
【0049】
上記「機能的に結合した」とは、プロモーターに転写制御因子が結合することにより、プロモーターの下流に存在するDNAの発現が誘導されるように、該プロモーターと該DNAとが結合していることをいう。従って、該DNAが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、該プロモーターに転写制御因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【0050】
上記転写制御因子と標的配列の組み合わせとしては、GAL4とUAS、TetRとTREなどが挙げられる。GAL4とUAS、又はTetRとTREを用いることにより、目的とする遺伝子の発現部位や時期、量を正確に制御でき、多くの組織で容易に発現させることができる。また、発現させる遺伝子が致死性の遺伝子でも系統の作出が可能である。
【0051】
上記カイコ卵を製造する方法としては、種々の方法を選択できる。例えば、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のDNAを別々のカイコ卵に導入する。両方のDNAを有するカイコ卵は、それぞれのDNAが導入されたカイコ卵から生じたトランスジェニックカイコ同士を交配させることで得ることができる。この場合、転写制御因子により、発現する組織、時期、量などを決めることができるため、発現させたい遺伝子を導入した系統と交配することにより、多くの系統を作ることなく、各組織や時期、量などを変えることができる利点がある。また、目的遺伝子を発現させた場合、不妊になる場合でも実験が可能である。さらに、単独のプロモーターを使った場合より、導入遺伝子からの生産物の量が増えるという利点もある。また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のDNAを有するカイコ卵は、片方のDNAが導入されたトランスジェニックカイコが産卵した卵に、もう片方のDNAを人為的に導入することで得ることもできる。また、上記（ｉ）のDNAと上記（ｉｉ）のDNAを、同じ卵に導入することによっても、両方のDNAを有するカイコ卵を得ることが出来る（Imamura, M., Nakai, J., Inoue, S., Quan, G.-X., Kanda, T. and Tamura, T.（2003）Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Fourth International Workshop on Transgenesis and Genomics of Invertegrate Organisms, Asilomar, P53.）。
【0052】
カイコ卵へのDNAの導入は、例えば、カイコの発生初期卵へ、トランスポゾンをベクターとして注射する方法（Tamura, T., Thibert, C., Royer ,C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P., 2000, Nature Biotechnology 18, 81-84）に従って行うことができる。例えば、トランスポゾンの逆位末端反復配列（Handler AM, McCombs SD, Fraser MJ, Saul SH.（1998） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95（13）:7520-5）の間に上記DNAを挿入したベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するベクター（ヘルパーベクター）をカイコ卵に導入する。ヘルパーベクターとしては、pHA3PIG （Tamura, T., Thibert, C., Royer ,C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P., 2000, Nature Biotechnology 18, 81-84）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0053】
本発明におけるトランスポゾンとしては、piggyBacが好ましいが、これに限定されるものではなく、マリーナ（mariner）、ミノス（minos）等を用いることもできる（Shimizu, K., Kamba, M., Sonobe, H., Kanda, T., Klinakis, A. G., Savakis, C. and Tamura, T. （2000） Insect Mol. Biol., 9, 277-281；Wang W, Swevers L, Iatrou K.（2000） Insect Mol Biol 9（2）:145-55）。
【0054】
また、本発明では、バキュロウイルスベクターを使用することによりトランスジェニックカイコを作出することも可能である（Yamao, M., N. Katayama, H. Nakazawa, M. Yamakawa, Y. Hayashi et al., 1999, Genes Dev 13: 511-516）。
【0055】
また本発明における絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターとしては、中部絹糸腺においては、例えばセリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが挙げられる。セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターとしては、配列番号：１６又は１７に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。配列番号：１６又は１７に記載の塩基配列を含むDNAとしては、配列番号：１６又は１７に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号：１６又は１７に記載の塩基配列からなるDNAの上流域や下流域を含むDNAなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。配列番号：１６又は１７に記載の塩基配列からなるDNAの上流域や下流域は、文献（Okamoto, H., Ishikawa, E. and Suzuki, Y. (1982) Structural analysis of sericin genes. Homologies with fibroin gene in the 5' flanking nucleotide sequences. J Biol Chem, 257, 15192-15199.、Garel, A., Deleage, G. and Prudhomme, J.C. (1997) Structure and organization of the Bombyx mori sericin 1 gene and of the sericins 1 deduced from the sequence of the Ser 1B cDNA. Insect Biochem Mol Biol, 27, 469-477.、Michaille, J.J., Garel, A. and Prudhomme, J.C. (1990) Cloning and characterization of the highly polymorphic Ser2 gene of Bombyx mori. Gene, 86, 177-184.）に開示されている。
【0056】
また、本発明における中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターとしては、配列番号：１６又は１７に記載の塩基配列を含むDNAと構造的に類似しており、かつ、配列番号：１６又は１７に記載の塩基配列を含むDNAと同等あるいは改善されたプロモーター活性能を持つDNAも挙げられる。このようなDNAとしては、例えば、配列番号：１６又は１７に記載の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列を含むDNAが例示できる。該DNAは、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術、site-directed mutagenesis法、DNA合成等の方法により調製することが可能である。調製されたDNAがプロモーター活性を有するか否かは、当業者においてはレポーター遺伝子を用いた周知のレポーターアッセイ等により検討することが可能である。
【0057】
該レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）及びGFP遺伝子等を挙げることができる。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-クロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【0058】
一方、本発明における後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターとしては、例えばフィブロインL鎖タンパク質をコードするDNAのプロモーターが挙げられる。フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターとしては、配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNAとしては、配列番号：１８に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号：１８に記載の塩基配列からなるDNAの上流域や下流域を含むDNAなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。配列番号：１８に記載の塩基配列からなるDNAの上流域や下流域は、文献（KIKUCHI, Y., K. MORI, S. SUZUKI, K. YAMAGUCHI and S. MIZUNO, 1992 Structure of the Bombyx mori fibroin light-chain-encoding gene: upstream sequence elements common to the light and heavy chain. Gene 110: 151-158.）に開示されている。
【0059】
また、本発明における後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターとして、配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNAと構造的に類似しており、かつ、配列番号：１８に記載の塩基配列を含むDNAと同等あるいは改善されたプロモーター活性能を持つDNAも挙げられる。これらのプロモーターは、上述の方法により調整することが可能である。
【0060】
本発明の組換え抗体の製造方法は、カイコ体内で合成された抗体を回収する工程を含む。合成された抗体は、不溶化せずに、活性のある状態で、中部絹糸腺又は後部絹糸腺に分泌される。従って、組換え抗体は、中部絹糸腺又は後部絹糸腺から回収することが可能である。組換え抗体を中部絹糸腺又は後部絹糸腺から回収する方法としては、例えば、吐糸期になったカイコを解剖し、中部絹糸腺又は後部絹糸腺を20mM Tris-HCl pH7.4中に摘出し、絹糸腺をピンセットやメスで傷をいれる事により絹糸腺中の組換え抗体を回収できる。
【0061】
また、本発明の組換え抗体は、例えば、トランスジェニックカイコが吐糸した繭から回収することも可能である。回収方法としては、当業者に周知の方法、例えば、繭を60%LiSCNで溶かし、20mMTris、5M ureaで透析することによって回収する方法（Inoue, S., Tsuda, H., Tanaka, H., Magoshi, Y and Mizuno （2001） Sericologia 4, 157-163. ）を使用することができる。また、その他のタンパク質回収法としては、例えば界面活性剤を用いる方法や水溶液で溶かす方法等が可能である。
【0062】
また、本発明におけるカイコとしては、特に制限はないが、組換え抗体の大量生産のためには、フィブロインタンパク質などの絹糸を構成するタンパク質をコードするDNA領域（コード領域、プロモーター領域、非翻訳領域を含む）の変異によって、絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されているカイコを用いることが好ましい。このようなカイコとしては、絹糸を構成するタンパク質をコードするDNA領域の変異によって絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されている突然変異系統のカイコ、好ましくは該変異によって絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されている裸蛹系統のカイコ、より好ましくはNd-sDが挙げられるが、絹糸を構成するタンパク質の生産抑制の原因が、人為的か否か、また、自然界において生じた変異に依存するか否かに関わらず、絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されているカイコであればよい。
【0063】
このようなカイコの１つの態様は、セリシン蚕として当業者には周知のカイコである。セリシン蚕を利用することによって、中部絹糸腺における組換え抗体の大量生産が可能となり、染色体に導入された組み換え抗体をコードするDNAから合成される抗体の精製も容易になる。また、後部絹糸腺において組換え抗体を産生させる際にも、生産量の点でセリシン蚕を用いることが好ましい。
【0064】
また、本発明におけるカイコとしては、非休眠卵を産下する性質を有するカイコ、休眠卵を産下する性質を有するカイコ（例えば実用品種であるぐんま、２００、春嶺、鐘月、錦秋、鐘和等）を使用することができる。ここで、休眠卵とは産卵後胚発生が一時的に停止する卵を言い、非休眠卵とは産卵後胚発生が停止せず、幼虫が孵化する卵を言う。
【0065】
休眠卵を産下する性質を有するカイコを用いる場合は、非休眠卵を産下させ、該非休眠卵にDNAを導入する。非休眠卵を産下させる方法としては、例えばぐんまにおいては、休眠卵を15℃〜21℃で培養することで該休眠卵から生じた成虫に非休眠卵を産下させる方法、好ましくは休眠卵を16℃〜20℃で培養することで該休眠卵から生じた成虫に非休眠卵を産下させる方法、より好ましくは休眠卵を18℃で培養することで該休眠卵から生じた成虫に非休眠卵を産下させる方法、最も好ましくは休眠卵を18℃で培養することで該休眠卵から生じた幼虫を全明で飼育し、生育した成虫に非休眠卵を産下させる方法を挙げることができる。また、２００においては、休眠卵を15℃〜21℃で培養することで該休眠卵から生じた成虫に非休眠卵を産下させる方法、好ましくは休眠卵を16℃〜20℃で培養することで該休眠卵から生じた成虫に非休眠卵を産下させる方法、より好ましくは休眠卵を18℃で培養することで該休眠卵から生じた成虫に非休眠卵を産下させる方法、又は休眠卵から生じた幼虫を全明で飼育し、生育した成虫に非休眠卵を産下させる方法、最も好ましくは休眠卵を25℃で培養することで該休眠卵から生じた幼虫を全明で飼育し、生育した成虫に非休眠卵を産下させる方法が挙げられる。
【0066】
卵の培養は、例えば、18℃〜25℃のインキュベーター、又は定温の部屋に入れることによって行うことができ、幼虫の飼育は20℃〜29℃の飼育室で人工飼料を用いて行うことができる。
【0067】
本発明の上記休眠卵の培養は、当業者においては、一般的なカイコ卵の培養法に従って行うことができる。例えば、「文部省（1978）蚕種製造.pp193、実教出版社、東京」に記載の方法に従って培養を行う。また、本発明におけるカイコ幼虫の飼育は、当業者においては、周知の方法によって行うことができる。例えば、「文部省（1978）蚕種製造.pp193、実教出版社、東京」に記載の方法に従って飼育を行う。
【0068】
本発明において、産卵された卵が非休眠卵であるか否かは、卵の色で判定することができる。一般に、休眠卵は濃い茶褐色に着色し、非休眠卵は黄白色であることが知られている。よって、本発明においては、濃い茶褐色ではないこと、より好ましくは黄白色であることをもって産卵された卵が非休眠卵であると判定する。
【0069】
以下、カイコ卵へのDNAの導入方法の具体例を記すが、本発明におけるカイコ卵へのDNAの導入方法は、この方法に限定されるものでない。例えば、カイコ卵へDNA注入用の管を使用して直接卵内へDNAを導入することが可能であるが、好ましい態様としては、前もって物理的又は化学的に卵殻に穴を空け、該穴からDNAを導入する。この際、DNA注入用の管を挿入角度が該卵の腹側の側面に対してほぼ垂直となるように該穴から卵内に挿入することができる。
【0070】
本発明において、物理的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば針、微小レーザー等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。好適には針を用いた方法によって卵殻に穴を空けることができる。該針は、カイコの卵殻に穴を空けることができるものであれば、その針の材質、強度等は、特に制限されない。なお、本発明における針とは、通常、先端が尖った棒状の針を指すが、この形状に限定されず、卵殻に穴を空けることができるものであれば、全体の形状は特に制限されない。例えば、先端の尖ったピラミッド型の物質、又は先端の尖った三角錐の形状の物質もまた、本発明の「針」に含まれる。本発明においては、タングステン針を好適に使用することができる。本発明の針の太さ（直径）は、後述のキャピラリーが通過可能な穴を空けることができる程度の太さであればよく、通常2〜20μm、好ましくは5〜10μmである。一方、化学的に卵殻に穴を空ける方法としては、例えば薬品（次亜塩素酸等）等を用いて穴を空ける方法が挙げられる。
【0071】
本発明において、穴を空ける位置としては、該穴からDNA注入用の管を挿入した場合に卵の腹側の側面に対する挿入角度を、ほぼ垂直にできる位置ならば特に制限はないが、好ましくは腹側の側面又はその反対側であり、より好ましくは腹側の側面であり、よりさらに好ましくは卵の腹側側面のやや後端よりの中央部である。
【0072】
本発明において、「ほぼ垂直」とは、70°〜120°を意味し、好ましくは80°〜90°を意味する。本発明において、「将来的に生殖細胞になる位置」としては、通常、卵の腹側の卵表に近い位置（通常、卵表から0.01mm〜0.05mmの位置）であり、好ましくは、卵の腹側中央の卵表に近い位置でやや後極よりの位置である。
【0073】
本発明のDNA注入用の管は、その管の材質、強度、内径等は特に制限されないが、DNA注入用の管を挿入する前に、物理的又は化学的に卵殻に穴を空ける場合は、空けられた穴を通過できる太さ（外径）であることが好ましい。本発明のDNA注入用の管としては、例えば、ガラスキャピラリー等を挙げることができる。
【0074】
本発明のDNAの導入方法において、好ましい態様としては、上記のカイコ卵に物理的又は化学的に穴を空け、DNA注入用の管を挿入角度が該卵の腹側の側面に対してほぼ垂直となるように該穴から卵内に挿入し、DNAを注入する工程を、針とDNA注入用の管が一体型となったマニュピュレーターを使用して行う。通常、該マニュピュレーターを構成要素の1つとする装置を使用して本発明は好適に実施される。
【0075】
このような装置としては、解剖顕微鏡、照明装置、可動式のステージ、顕微鏡に金具で固定した粗動マニュピュレーター、このマニュピュレーターに付けたマイクロマニュピュレーター、DNAを注射するための空気圧を調整するインジェクターから構成されている。インジェクターに用いる圧力は窒素ボンベから供給され、圧力のスイッチはフットスイッチによっていれることができる。注射はガラススライド等の基板上に固定した卵に対して行い、卵の位置は移動式のステージによって決める。また、マイクロマニュピュレーターのガラスキャピラリーは4本のチューブで繋がれた操作部によって操作する。実際の手順は、卵に対するタングステン針の位置を粗動マニュピュレーターで決め、ステージのレバーで水平方向に卵を動かし穴を空ける。続いて、マイクロマニュピュレーターの操作部のレバーを操作して、穴の位置にガラスキャピラリーの先端を誘導し、再びステージのレバーによりキャピラリーを卵に挿入する。この場合、卵の腹側の側面に対し垂直にガラスキャピラリーが挿入される必要がある。フットスイッチを入れDNAを注射し、レバーを操作して卵からキャピラリーを抜く。空けた穴を瞬間接着剤等でふさぎ、一定の温度及び、一定の湿度のインキュベーターで保護する。本発明に使用される装置としては、好適には、特許第1654050号に記載の装置又は該装置を改良した装置が挙げられる。
【0076】
また、本発明の態様においては、DNAの導入に用いるカイコ卵が基板に固定されていることが好ましい。本発明の基板として、例えば、スライドグラス、プラスチック板等を用いることができるが、これらに特に制限されない。本発明の上記態様においては、カイコ卵内の将来的に生殖細胞になる位置に正確にDNAを注射するために、卵の方向を揃えて固定することが望ましい。また、上記態様においては、基板へ固定するカイコ卵の数には、特に制限はない。また、複数個のカイコ卵を用いる場合、カイコ卵を基板へ固定する方向性としては、好ましくは背腹の向きが一定となるような方向である。本発明の上記カイコ卵の基板への固定は、例えば、水性の糊をあらかじめ塗布した市販の台紙（バラ種台紙）の上に産卵させ、台紙に水を加えて卵をはがし、次いで濡れた状態の卵を基板に整列させ、風乾することによって行う。卵はスライドグラス上に卵の方向を揃えて固定することが好ましい。また、卵の基盤への固定は両面テープや接着剤等を用いることによっても可能である。
【0077】
カイコ卵にDNAが導入されたか否かは、例えば、注射したDNAを卵から再度抽出して測定する方法（Nagaraju, J., Kanda, T., Yukuhiro, K., Chavancy, G., Tamura, T. and Couble, P.（1996）Attempt of transgenesis of the silkworm（Bombyx mori L） by egg-injection of foreign DNA. Appl. Entomol. Zool., 31, 589-598）や、注射したDNAの卵内での発現を見る方法（Tamura, T., Kanda, T., Takiya, S., Okano, K. and Maekawa, H. （1990）. Transient expression of chimeric CAT genes injected into early embryos of the domesticated silkworm, Bombyx mori. Jpn. J. Genet., 65, 401-410）等によって確認することができる。
【0078】
また、本発明の方法において回収された組換え抗体と医薬上許容される担体とを混合することで、医薬組成物を製造することもできる。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【0079】
本発明の組換え抗体の製造方法の別の具体的な態様においては、組換え抗体は、カイコの脂肪体において産生されることを特徴とする。すなわち本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法に関する。（ａ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程。
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
また本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、組換え抗体の製造方法に関する。
（ａ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程。
（ｂ）製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
【0080】
本発明のトランスジェニックカイコを製造する工程においては、まず、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する。次いで、製造されたカイコ卵から生じたカイコの中から、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを選択する。トランスジェニックカイコの選択は、上述の方法によって行うことが出来る。
【0081】
本発明における細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵としては、例えば、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNAを有するカイコ卵が挙げられる。このようなカイコ卵は、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNAをカイコ卵に導入することで製造できる。
【0082】
また、本発明における細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって間接的に発現制御される組換え抗体タンパク質をコードするDNAを有するカイコ卵としては、例えば、（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、転写制御因子をコードするDNAが機能的に結合したDNA、及び（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNA、を有するカイコ卵が挙げられる。「機能的に結合した」の定義は、上述の通りである。また、転写制御因子と標的配列の組み合わせも、上述のものが挙げられる。
【0083】
カイコ卵の製造は上述の方法によって行うことが可能である。例えば、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のDNAを別々のカイコ卵に導入する。両方のDNAを有するカイコ卵は、それぞれのDNAが導入されたカイコ卵から生じたトランスジェニックカイコ同士を交配させることで得ることができる。また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のDNAを有するカイコ卵は、片方のDNAが導入されたトランスジェニックカイコが産卵した卵に、もう片方のDNAを人為的に導入することで得ることが出来る。さらには、上記（ｉ）のDNAと上記（ｉｉ）のDNAを、同じ卵に導入することによっても、両方のDNAを有するカイコ卵を得ることが出来る。
【0084】
カイコ卵へのDNAの導入も、上述の方法によって行うことが出来る。また、カイコの脂肪体において組換え抗体を産生する場合においても、バキュロウイルスベクターを使用することによりトランスジェニックカイコを作出することも可能である（Yamao, M., N. Katayama, H. Nakazawa, M. Yamakawa, Y. Hayashi et al., 1999, Genes Dev 13: 511-516）。
【0085】
上記細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターとしては、配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNAとしては、配列番号：１９に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号：１９に記載の塩基配列からなるDNAの上流域や下流域を含むDNAなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【0086】
また、本発明における細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターとして、配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNAと構造的に類似しており、かつ、配列番号：１９に記載の塩基配列を含むDNAと同等あるいは改善されたプロモーター活性能を持つDNAも挙げられる。これらのプロモーターもまた、上述の方法により調整することが可能である。配列番号：１９に記載の塩基配列からなるDNAの上流域や下流域は、文献（MANGE, A., E. JULIEN, J. C. PRUDHOMME and P. COUBLE, 1997 A strong inhibitory element down-regulates SRE-stimulated transcription of the A3 cytoplasmic actin gene of Bombyx mori. J Mol Biol 265: 266-274.）に開示されている。
【0087】
上記転写制御因子と標的配列の組み合わせは、上述のものを使用することが可能である。なお、細胞質アクチンをコードするDNAのプロモーターの下流にGAL4遺伝子を繋いだものをカイコゲノムに挿入したトランスジェニックカイコ（上記（ｉ）のDNAを有するカイコ卵から作出されたトランスジェニックカイコ）の具体的な態様および作出方法は、文献（IMAMURA, M., J. NAKAI, S. INOUE, G. X. QUAN, T. KANDA et al., 2003 Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Genetics 165: 1329-1340.）に開示されている。なお本発明においては、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、シグナル配列を有することが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。
【0088】
上記の方法によって産生される組換え抗体は、例えば脂肪体から回収することが出来る。脂肪体からの組換え抗体の回収は、当業者であれば公知の方法、例えば幼虫体内から脂肪体を摘出し、タンパク質抽出のための緩衝液でホモジェナイズすることや脂肪体から体液に分泌させ、体液を分取することによって行うことが可能である。なお、本発明の方法によって製造される抗体は、本発明の方法によって製造される限りなんら限定されず、シグナル配列を有していても、有していなくてもよい。即ち、本発明の抗体の製造方法によって製造される抗体には、シグナル配列を有している抗体、シグナル配列を有していない抗体の両方が含まれる。
【0089】
本発明はまた、組換え抗体をコードするDNAに関する。本発明はさらに好ましくは、シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAに関する。より具体的には、ヒトの酸性フォスファターゼを有するscFv抗体をコードするDNAに関する。このようなDNAとしては、配列番号：１３に記載のDNA又は配列番号：１４に記載のDNAが挙げられる。さらに、配列番号：１３又は１４に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが挙げられる。本発明はさらに、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列を有するL鎖およびマウスIgG1のシグナル配列を有するH鎖を含む抗体をコードするDNAに関する。マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列を有するL鎖をコードするDNAとしては、配列番号：４８に記載のDNAが挙げられる。さらに、配列番号：４８に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号：４８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが挙げられる。一方、マウスIgG1のシグナル配列を有するH鎖をコードするDNAとしては、配列番号：５０に記載のDNAが挙げられる。さらに、配列番号：５０に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号：５０に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
【0090】
本発明は、組換え抗体をコードするDNAを含むベクターならびに形質転換細胞を提供する。また本発明は、シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを含むベクターならびに形質転換細胞を提供する。本発明において使用されるベクターとしては、特に制限されるものではないが、例えば、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7等が挙げられる。本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等の大腸菌とした場合においては、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、又はT7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、又はpET等が挙げられる。
【0091】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていることが好ましい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【0092】
大腸菌以外にも、例えば、本発明の抗体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）等が挙げられる。
【0093】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等が挙げられる。
【0094】
組換え抗体をコードするDNAの細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）などにより実施することができる。
【0095】
また、本発明は、組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコに関する。具体的には、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコに関する。もしくは、（ｉ）絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、及び（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、又は絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNAを有するトランスジェニックカイコを提供する。なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするためシグナル配列を有していることが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。
【0096】
さらに本発明は、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコに関する。具体的には、（ｉ）細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、及び（ｉｉ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、又は細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNAを有するトランスジェニックカイコを提供する。なお本発明においては、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするためシグナル配列を有していることが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。
【0097】
これらのトランスジェニックカイコは、上述の方法によって作成することが出来る。また本発明のトランスジェニックカイコの状態に特に制限はなく、例えば卵の状態であってもよい。本発明のトランスジェニックカイコを使用することで、目的の組換え抗体を大量に生産することができる。
【0098】
また、本発明は、転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコも提供する。転写制御因子、標的プロモーターとしては、上述のものが挙げられる。このようなカイコは、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のDNAを有するトランスジェニックカイコの製造や、その卵の製造に利用できる。なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していることが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。
【0099】
さらに、本発明は、本発明のトランスジェニックカイコによって吐糸された繭を提供する。このような繭は、目的の組換え抗体を大量に含有する繭として有用である。また、本発明は、該繭から製造される絹糸であって、組換え抗体を含む絹糸を提供する。また、公知の手法により、本発明の絹糸を含有する絹織物、例えば組換え抗体を含有する絹織物を作製することができる。本発明はこのような絹織物も提供するものである。
【0100】
また、本発明は、本発明の方法に用いるためのDNAを提供する。このようなDNAとしては、（ａ）セリシン又はフィブロインをコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、（ｂ）該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA、（ｃ）セリシン又はフィブロインをコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNA、などが挙げられ、これらの組み合わせからなるキットとして提供してもよい。また、本発明は、トランスポゾンの逆位末端反復配列の間に、（ａ）〜（ｃ）のDNAを挿入したベクターを提供する。さらに、該ベクターとトランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するベクター（ヘルパーベクター）を含むキットを提供する。なお、転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA、及び、セリシン又はフィブロインをコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していることが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。
【0101】
さらに本発明は、本発明の抗体の製造方法によって得られる組換え抗トランスフェリン抗体を有効成分として含有する、糖尿病性腎症の診断薬および栄養状態を評価するための試薬に関する。本発明の抗体の製造方法によって得られる組換え抗トランスフェリン抗体には、シグナル配列を有している抗体と、有していない抗体の両方が含まれる。シグナル配列を使用した場合、その好ましい例は上述の通りである。
【0102】
また、本発明の抗トランスフェリン抗体には全長抗体及び低分子化抗体の両方が含まれる。全長抗体の具体例としては、シグナル配列として配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列、L鎖可変領域として配列番号：２３に記載のアミノ酸配列、Jκセグメントとして配列番号：２５に記載のアミノ酸配列、κ鎖定常領域として配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、及び、シグナル配列として配列番号：３、２１、および２９のいずれかに記載のアミノ酸配列、H鎖可変領域として配列番号：３１に記載のアミノ酸配列、CH1として配列番号：３３に記載のアミノ酸配列、ヒンジ領域として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、CH2として配列番号：３７に記載のアミノ酸配列、CH3として配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体が挙げられる。より具体的には、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、および、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体が挙げられる。
【0103】
一方低分子化抗体の具体例としては、上述したように、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、Diabody、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。本発明において特に好ましい低分子化抗体は、scFv抗体である。scFv抗体において、シグナル配列、VL、リンカー、VHは、一本鎖ポリペプチドのN末端を基点として、この順番に並んでいることが好ましい。VL、リンカー、VHの具体的な態様はそれぞれ、配列番号：６、９、１２に示す通りである。したがって、本発明において特に好ましい抗トランスフェリン抗体は、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を含む、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列を有するscFv抗体である。
【0104】
さらに本発明は、被験者から得た生体試料中におけるトランスフェリンの量を測定する方法に関する。トランスフェリンは血液や尿などに含まれる分子量７９，０００の蛋白質であり、鉄代謝と造血の重要な指標である。生体中のトランスフェリンの量は、消化器、腎臓などの疾患ならびに腫瘍や炎症などの病態生理を反映するため、トランスフェリンの量を測定すれば、それらの疾患の診断を行うことが出来る。
【0105】
本発明の生体試料中のトランスフェリンの測定方法においては、まず、トランスフェリンの量を測定したい被検者から生体試料を得る。そして、該生体試料と本発明の抗トランスフェリン抗体を接触させる。本発明の測定方法における生体試料は特に制限されるものではないが、例えば、血液（血清）、尿などが挙げられる。本発明の測定方法において好ましい抗体の態様は上述の通りである。本発明の測定においては、次に、生体試料中のトランスフェリンと抗体との結合を検出する。トランスフェリンと抗体との結合は、これらに限定されるものではないが、例えばELISA法やEIA法など、当業者に周知の方法によって行うことが出来る。本発明の測定方法は、生体試料中のトランスフェリンと抗体の結合を検出することによって、該試料中のトランスフェリンの量を測定することを特徴とする。すなわち、トランスフェリンと抗体の結合が全く検出されなければ、該生体試料中にはトランスフェリンが存在していないと判定される。逆に、トランスフェリンと抗体との結合が検出されれば、該生体試料中にトランスフェリンが存在していると判定される。また、当業者であれば、検出されるトランスフェリンと抗体との結合の程度に応じて、生体試料中のトランスフェリンの量を判定することが可能である。このように、本発明におけるトランスフェリンの量の測定には、生体試料中のトランスフェリンの有無の測定のみならず、結合の程度に応じて生体試料中のトランスフェリンの量を定量化することも含まれる。
【0106】
本発明はさらに、糖尿病性腎症を診断する方法に関する。本発明の診断方法においては、まず、上述したトランスフェリンの量を測定する方法に記載された方法に従い、生体試料中のトランスフェリンの量を測定する。次に、測定されたトランスフェリンの量を、糖尿病性腎症に罹患していないことが明らかな被験者に由来する生体試料中のトランスフェリンの量と比較する。正常である対照と比較して、測定されたトランスフェリンの量が多いときに、該生体試料を提供した被験者が糖尿病性腎症に罹患している、又は将来糖尿病性腎症に罹患するリスクが高いと判定される。
【0107】
また、本発明の糖尿病性腎症を診断する方法においては、測定されたトランスフェリンの量を、糖尿病性腎症に罹患していることが明らかな被験者に由来する生体試料におけるトランスフェリンの量と比較してもよい。比較の結果、トランスフェリンの量が糖尿病性腎症に罹患していることが明らかな被験者の生体試料中のそれと同程度であれば、該生体試料を提供した被験者が糖尿病性腎症に罹患していると判定される。ここで同程度とは、トランスフェリンの量が完全に同一である場合のみならず、実質的に同一である場合も含まれる。実質的に同一であるか否かは、当業者であれば、被験者の病状やその他の特徴に応じて適宜判断することが可能である。このような判定の基準が記載された文献の例としては、例えば以下のものが挙げられる。山口哲司：日本臨床、53（増刊号）、227−229 （1995）
安藤康雄：ホルモンと臨床、42（6）、91−95 （1994）
今野 稔：医学と薬学、32（3）、555−565 （1994）
石橋不可止：糖尿病、35（12）、949−954 （1992）
青木芳和：臨床病理レビュー 特集第127号,12-16,（2003,10)
櫻林郁之介 山田俊幸他：月刊Medical Technology 別冊臨床検査項辞典, (2003)
東高志 五嶋博道他：Medical Technology Vol30 906-911 No8（2002.8）
【0108】
本発明の糖尿病性腎症を診断する方法は、それ単独で用いても、他の様々な糖尿病性腎症の診断方法と組み合わせて、補助的に用いてもよい。他の様々な糖尿病性腎症の診断方法と組み合わせて用いることによって、糖尿病性腎症の診断をより確実、かつ効果的に行うことが可能となる。このように、本発明の糖尿病性腎症の診断方法によって得られる所見は、糖尿病性腎症の患者に特有な様々な臨床的所見とともに、総合的に用いられることが好ましい。
【0109】
本発明はまた、被験者の栄養状態を評価する方法に関する。本発明の栄養状態を評価する方法においては、被験者のトランスフェリンの量が正常である対照と比較して減少しているときに、栄養障害のリスクが高い、または栄養障害に罹患していると判定される。本発明においては、トランスフェリンの量の減少の程度が著しければ著しいほど、栄養障害のリスクが高い、または重篤な栄養障害に罹患していると判定される。当業者であれば、トランスフェリンの量の減少の程度から、被験者の栄養障害のリスクや栄養障害の程度を判定することが可能である。例えば、被験者においてトランスフェリンが全く検出されない、又は実質的に検出されないに等しい場合は、被験者が重篤な栄養障害に罹患していると判定される。
【0110】
本発明の栄養状態を評価する方法においても、まず、生体試料中のトランスフェリンの量を測定する。次に、測定されたトランスフェリンの量を、正常である対照と比較する。生体試料中のトランスフェリンの量の測定は、上述の方法に従って行うことが可能である。また、栄養障害のリスクが高いか否か、または栄養障害に罹患しているか否かの判定もまた、上述したように、当業者が通常採用する基準に従って行うことが可能である。
【0111】
発明における栄養状態を評価する方法は、臨床診査、身体計測、食事調査などと組み合わせて、総合的に、個人あるいは特定集団の栄養状態を評価・判定すること（栄養アセスメント（「臨床栄養」臨時増刊号第99巻5号、「実践栄養アセスメント）」に使用することが可能である。本発明の栄養状態を評価する方法において、被験者は、任意の個人であっても任意の集団であってもよい。本発明の栄養状態を評価する方法を実施することによって、個人又は集団の栄養状態を測定することが可能となる。上述したように、当業者であれば、測定された結果から被験者の栄養障害の有無または程度を判定することが可能である。なお、本発明において栄養障害とは、特定の、あるいは数種の栄養素が欠乏した状態、過剰となった状態、または栄養素相互のバランスが崩れた状態を意味する。
【0112】
本発明の栄養状態を評価する方法の実施の一例として、例えば、入院中である被験者に対して、本発明の栄養状態を評価する方法を実施することが挙げられる。例えば、入院中である被験者に由来する試料中のトランスフェリンの測定値が、該被験者個人の正常時におけるトランスフェリンの測定値（ある変動幅を有している場合はそれを考慮して）と比較して減少している場合に、該被験者は栄養障害のリスクが高い、または栄養障害に罹患していると判定することが可能である。
【0113】
本発明の製造方法によって産生される抗体は、組換え抗体抽出物に目的の抗体以外の抗体が含まれる可能性がない。このため、交差反応が起きる可能性が低く、目的とする抗原と反応した抗体のみを正確に測定することが可能となる。このように、本発明の生体試料中のトランスフェリンの量を測定する方法、糖尿病性腎症の診断する方法、栄養状態を評価する方法においては、トランスフェリンの量を正確に測定することが可能である。なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【0114】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。〔実施例１〕
材料および方法
１．プラスミドベクターの構築
本研究ではヒトTransferrinと反応するマウス抗ヒトTransferrin抗体のscFv型抗体(scFv型anti transferrin antibody:以下aTf)を組換えカイコで生産するため、プラスミドベクターpUASFvaTf（図１）を作成した。この組み換えカイコ作出のためのベクターは、酵母の転写制御因子GAL4の存在下で遺伝子発現を促すプロモーターUASと融合した抗体タンパク質遺伝子FvaTfを、トランスポゾンpiggyBacの逆位末端反復配列の間に挿入したものである。
【0115】
scFv型抗ヒトTransferrin 抗体は、以下のように設計した。ヒトの酸性フォスファターゼの分泌性シグナル配列の下流に抗体のH鎖可変領域（VH）、次いでフレキシブルのあるリンカーペプチド（Linker）、そして抗体のL鎖可変領域（VL）を連結した構造を有するDNAを設計した。VH-Linker-VLのアミノ酸配列は、各遺伝子のつながりも含め、公知の配列を使用した。本実験で使用したscFv型抗体の遺伝子の塩基配列（コドン変換前後）ならびに該塩基配列から生成されるアミノ酸配列と配列番号の関係は、表２に示すとおりである。なお、遺伝子コドンは、昆虫での発現に適したコドンに変換した（pUC57/FvaTf）。
【0116】
【表2】
【0117】
GAL4/UASシステムにおける遺伝子プラスミドは、図１に示す手順によって構築した。すなわち、制限酵素Bln Iで消化したドナーベクターpBluescript II/UAS-SV40にpUC57/FvaTfから制限酵素Spe Iで消化したFvaTfフラグメントを挿入した（pBluescript II/UAS - FvaTf -SV40UTR）。
【0118】
この遺伝子を目的部位に発現させるため、既に系統化されているSer1GAL4/3XP3DsRed系統のカイコ（田村ら、2004）を用いた。この組み換えカイコでは中部絹糸腺でのみGAL4遺伝子が発現し、UASに制御される導入遺伝子を発現させることが確認されている（田村ら、2004）。導入した抗体遺伝子を発現させるため、得られた抗体遺伝子を持つUASFvaTf系統を上記のGAL４系統と交配した（図２）。
【0119】
なお、本プラスミドベクターは組換えカイコを同定するためのマーカー遺伝子として、胚の単眼や蛾の複眼、神経由来の組織での発現を促すプロモーターを持つ緑色蛍光タンパク質遺伝子3XP3GFPを有している（Horn, C., and E. A. Wimmer,（2000）Dev Genes Evol 210: 630-637;Murizio et al.(1994) Protein Science,3:1476-1484）。
【0120】
２．ウェスタンブロッティングウェスタンブロッティングは次のようにして行った。Ser1GAL4/3XP3DsRed系統とUASFvaTr系統を交配して得られた次世代の産卵後6日目の卵を実体蛍光顕微鏡で観察し、GAL4/UAS個体を同定した（図3）。両方の遺伝子を持つ個体のみ飼育し、５令吐糸０日目、５令吐糸１日目、５令吐糸２日目のカイコから絹糸腺を摘出し、細胞層を2% ドデシル硫酸リチウム 5mM EDTA 50mM Tris-HCl pH7.4で蛋白質を抽出した。同様に、陰性コントロールとしてUASFvaTfを持たないSer1GAL4系統の５令吐糸０日目のカイコについても絹糸腺を摘出し蛋白質を抽出した。この抽出試料２容に対しSDSサンプルバッファー（6% SDS、24%グリセロール、12% 2-メルカプトエタノール、0.1% BPB）を１容加え、SuperSep 5-20%（和光純薬工業社）にてSDS-PAGE後、以下のようにウェスタンブロットを行った。SDS-PAGE終了後、PVDF膜(ミリポア社製)に0.8mA/cm2、 1時間通電することにより蛋白質を転写し、ブロックエース（大日本製薬社）を用いてブロッキングを行った。これをPBS-T(0.05% Tween、 150mM NaCl、10mM リン酸バッファー、pH7.4)で洗浄した後、ウサギ抗マウスIg-HRP標識抗体（アマシャムバイオサイエンス社）をブロックエースで100倍希釈した溶液を作製し、6時間室温で振とうした。ウサギ抗マウスIg-HRP標識抗体反応後、上述と同様の洗浄操作を行い、PODイムノステインセット（和光純薬工業社）で検出した。
【0121】
３．RT-PCRRT-PCRは以下のように行った。上述した通り、GAL4/UASの両方の遺伝子を持つ個体を飼育し、５令吐糸０日目、５令吐糸１日目、５令吐糸２日目のカイコから中部絹糸腺を摘出した。同様に、陰性コントロールとしてUASFvaTfを持たないSer1GAL4系統の５令吐糸０日目のカイコについても絹糸腺を摘出した。続いて摘出した中部絹糸腺をガラスホモジナイザー（WHEATON社）へ移し、ISOGEN（ニッポンジーン社）を用いてtotal RNAを抽出した。このtotal RNAをDPEC水で50μg/20μlに調製し、First-strand cDNA Synthesis Kit（アマシャムバイオサイエンス社）を使用し、添付文書に従ってcDNAへの逆転写を行った。この逆転写産物を鋳型として以下のPCRを行った。KODplus（東洋紡社）に添付の10×PCRバッファーを5μl、150μMのプライマー（配列番号：16）、150μMのプライマー（配列番号：17）、１mM MgSO4、0.2mM dNTPs、２単位KODplusとなるように各試薬を加え、全量50μlとし、eppendorf社のDNAサーマルサイクラーにて94℃ 2min 1回、94℃ 15sec、62℃ 15sec、72℃ 30secのサイクルを35回、72℃ 1min 1回の伸長反応を行った。またPCRの陽性コントロールにはプラスミドベクターpUASFvaTfを鋳型に用いた。
【0122】
４．組換え抗体の活性測定ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）による組換え抗体の抗原に対する活性の測定は以下の手順で行った。Ser1GAL4/UASFvaTf系統とUASFvaTfを持たないSer1GAL4系統の５令吐糸０日目のカイコから中部絹糸腺を摘出し、摘出した組織200mg当たり1ｍｌの Trisバッファー（20mM Tris-HCl pH7.4）を添加した。これをガラスホモジナイザーで粉砕し、さらに14000rpm 20分間の遠心後、上清をTrisバッファーで５倍(40mg/ml)と１０倍(10mg/ml)に希釈した。これら及び無希釈の試料（原倍；200mg/ml）をELISA測定用試料とした。また、陰性コントロールとしてSer1GAL4系統のカイコについても同様の操作でELISA測定用試料を調製した。予めTransferrin（Biogenesis社）を100μg/wellで感作したマイクロタイタープレート（ヌンク社）に上記で作製したELISA測定用試料の100μL分注し、室温で２時間、振とうさせた。次いで、ELISA測定用試料をwellから捨て200μLのPBS-Tでwellを3回洗浄し、予めウサギ抗マウスIg-HRP標識抗体をPBS（150mM NaCl、10mM リン酸バッファー、pH7.4）で１００倍希釈した溶液をwellに100μL分注し、室温で６時間、振とうさせた。続いて洗浄操作を行い100μLの３，３’,５，５’―テトラメチルベンジジン（日本ロシュ社）を加え発色させた。３，３’,５，５’-テトラメチルベンジジンを加えてから正確に３分後に１N硫酸を１００μL分注し、発色を停止させた。発色停止後、モデル５５０マイクロプレートリーダー（BioRad）にて450nmの吸光度を測定した。
【0123】
結果および考察上記の方法で作製したプラスミドと、転移酵素遺伝子をコードするヘルパープラスミドpA3PIG（Tamura et al., 2000）を一緒に約1000粒の発生初期のカイコ卵に注射し、次世代の胚の単眼におけるGFPの発現を調べた。その結果、表３に示したように、2蛾区においてGFPを発現する個体が出現した。
【0124】
【表3】
【0125】
これらの組換えカイコを飼育した結果、1系統についてのみ系統化するのに成功した。得られたUASFvaTf/3XP3GFP系統をSer1GAL4/3XP3DｓRed系統と交配し、次世代における各蛍光タンパク質遺伝子を持つ個体の分離比を表４に示した。
【0126】
【表4】
【0127】
この値はいずれの遺伝子もヘテロにもつ個体同士を交配した場合の理論値と一致することから、両方の遺伝子は別の染色体上に挿入されており、それぞれ独立遺伝することが分かった。この場合、３XP3GFPや３XP３DsReD並びに両方の遺伝子を持つ組み換えカイコは図３に示したように胚期において、実体蛍光顕微鏡で観察すると単眼や神経由来の組織が蛍光を持つことから、容易に同定することができた。
【0128】
次に、この様にして3XP3GFP及び3XP3DsRed遺伝子を持つ個体をUASFvTrとSer1GAL4遺伝子の両方を持つ個体として飼育し、吐糸期の幼虫の中部絹糸腺から抽出したサンプルのウエスタンブロテッティングを行った。その結果、図5に示したように、絹糸腺において抗体が生産されていることが確認された。また同じように得られた抽出を抗体反応させた結果、図６に示したように絹糸腺抽出物の量が増加するに伴って抗原との反応物の量が増加し、抗体としての活性を有していることが分かった。
【0129】
ウエスタンブロッティングと同様に吐糸期の中部絹糸腺からtotal RNAを抽出し、RT-PCRを行った。その結果、図4に示すように５令５日で最も導入遺伝子の転写が多く、経時的に転写が抑えられていく様が分かった。従って、５令５日目に遺伝子の転写が活発となり、次いで吐糸期に蛋白質に翻訳され中部絹糸腺に存在する事が明らかとなった。
【0130】
〔実施例２〕材料および方法
１．プラスミドベクターの構築
本研究では、ヒトTransferrinと反応するIgG型マウス抗ヒトTransferrin抗体を組換えカイコで生産するため、プラスミドベクターpBacN/lox p UASIgL UASIgH（図７〜９）を作製した。この組換えカイコ作出のためのベクターは、酵母の転写制御因子GAL4の存在下で遺伝子発現を促すプロモーターUASと融合した抗体タンパク質遺伝子のL鎖およびH鎖をトランスポゾンpiggyBacの逆位末端反復配列の間に挿入したものである。
【0131】
IgG型マウス抗ヒトTransferrin抗体のL鎖は、以下のように設計した。先ず、抗体のL鎖はマウスのイムノグロブリンL鎖κのシグナルペプチドの下流に抗ヒトTransferrin抗体のLκ鎖可変領域、次いでマウスのL鎖Jセグメント、マウスのLκ鎖定常領域を連結した構造（IgL）を有するDNAを設計した。続いて、IgG型マウス抗ヒトTransferrin抗体のH鎖は、マウスのIgG1のシグナルペプチドの下流に抗ヒトTransferrin抗体のH鎖可変領域、次いでマウスIgG1のH鎖定常領域1（CH1）、マウスIgG1のヒンジ領域、マウスIgG1のH鎖定常領域2（CH2）、マウスIgG1のH鎖定常領域3（CH3）を連結した構造（IgH）を有するDNAを設計した。本実験で設計したIgG型抗体のサブクラスはIgG1で、かつκ鎖の抗原性を有し、L鎖およびH鎖のアミノ酸配列は公知の配列を連結した。ここで使用した遺伝子の塩基配列ならびに該塩基配列から生成されるアミノ酸配列と配列番号の関係は、表５に示す通りである。
【0132】
【表5】
【0133】
２．プラスミドベクターの構築GAL4/UASシステムにおける遺伝子プラスミドは、図７〜９に示す手順によって構築した。すなわち、制限酵素Bln Iで消化したドナーベクターpBluescript II UAS-SV40へpUC57/IgLから制限酵素Nhe Iで消化したIgLフラグメントを挿入し、pBluescript II/UAS IgL SV40を得た。次いで、制限酵素Bln Iで消化したプラスミドベクターpBacN/lox pへpBluescript II/UAS IgL SV40から制限酵素Spe Iで消化したUAS IgL SV40UTRフラグメントを挿入し、pBacN/ lox p UAS IgL SV40を得た（図７）。また、制限酵素Bln Iで消化したドナーベクターpDNR/UAS-SV40へpUC57/IgHから制限酵素Nhe Iで消化したIgHフラグメントを挿入し、pDNR/UAS IgH SV40を得た（図８）。次いで、Cre Recombinaseを用いてUAS IgH SV40UTRフラグメントをpBacN/lox p UAS IgL SV40へ挿入した（図９：pBacN/loxp UASIgL UASIgH）。
【0134】
３．組換えタンパク質発現系統の樹立この遺伝子を目的部位に発現させるため、既に系統化されているSer1GAL4/3xP3DsRed系統のカイコ（田村ら、2004）を用いた。この組換えカイコでは中部絹糸腺でのみGAL4遺伝子が発現し、UASに制御される導入遺伝子を発現させることが確認されている（田村ら、2004）。導入したIgG型抗ヒトTransferrin抗体を発現させるため、得られたIgG型抗ヒトTransferrin抗体遺伝子を持つUASIgL-UASIgH系統を上記のGAL4系統と交配した（図１０）。
【0135】
なお、本プラスミドベクターは組換えカイコを同定するためのマーカー遺伝子として、胚の単眼や蛾の複眼、神経由来の組織での発現を促すプロモーターを持つ緑色蛍光タンパク質3xP3GFPを有している（Horn, C., and E. A. Wimmer, (2000) Dev Genes Evol 210: 630-637 ;Murizio et al. (1994) Protein Science, 3:1476-1484）
【0136】
４．RT-PCRRT-PCRは以下のように行った。上述した通り、GAL4/UASの両方の遺伝子を持つ個体を飼育し、5令吐糸期直前のカイコから中部絹糸腺を摘出した。続いて摘出した中部絹糸腺をガラスホモジナイザー（WHEATON社）へ移し、ISOGEN（ニッポンジーン社）を用いてtotal RNAを抽出した。このtotal RNAをDEPEC水で50μg/20μlに調製し、First-strand cDNA Synthesis kit（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を使用し、添付文書に従ってcDNAへの逆転写を行った。この逆転写産物を鋳型として、表６に示すプライマーの組み合わせでIgL、IgH、GAL4、細胞内アクチンについて以下のPCRを行った。TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（タカラバイオ社）に添付の10×PCRバッファーを5μl、100μMのForward primer（表６）、100μMのReverse primer（表６）、0.2μM dNTP、2.5単位TaKaRa Ex Taq Hot Start Versionとなるように各試薬を加え、全量50μlとし、eppendorf社のサーマルサイクラーにて、94℃ 2min 1回、94℃ 15sec、60℃ 15sec、72℃ 30secのサイクルを40回、72℃ 1minの伸長反応を行った。
【0137】
【表6】
【0138】
５．IgG1型抗体の検出IgG型マウス抗体の検出は次のようにして行った。Ser1GAL4/3xP3DsRed系統とUASIgL-UASIgH系統を交配して得られた次世代の産卵後6日目の卵を実体蛍光顕微鏡で観察し、GAL4/UAS個体を同定した（図１１）。両方の遺伝子を持つ個体のみを飼育し、5令吐糸期のカイコから絹糸腺を摘出し、20mM Tris-HCl pH7.4（Trisバッファー）で絹糸腺のタンパク質を抽出した。このタンパク質溶液について、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて抗体を検出した。具体的にはカイコの絹糸腺から抽出したタンパク質溶液にTyping stickを浸し、室温で18時間振とうした。次いで、添付文書の通り洗浄操作後、Peroxidase labeled anti-mouse antibodyを加え、室温で6時間振とうした。続いて、洗浄操作を行った後、基質溶液に浸しバンドを確認した。
【0139】
６．組換え抗体の抗原との反応性試験ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）による組換えIgG型抗体の抗原に対する反応性の測定は以下の手順で行った。Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH系統とUASIgL-UASIgHを持たないSer1GAL4系統の吐糸期のカイコから中部絹糸腺を摘出し、3mlのTrisバッファーを添加した。これをガラスホモジナイザーで粉砕し、さらに12000rpm 20分間の遠心後、上清を中部絹糸腺抽出試料の原液とした。この原液をTrisバッファーで2倍と4倍に希釈した。これら及び無希釈の試料（原液）をELISA測定用試料とした。また、陰性コントロールとしてSer1GAL4系統のカイコについても同様の操作でELISA測定用試料を調製した。なお、Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH系統及びSer1GAL4系統の原液試料について、Bradford法（Quick Start プロテインアッセイ染色液：BIO-RAD社）でタンパク質を定量した（表７）。
【0140】
予めTransferrin（Biogenesis社）を1μg/wellで感作したマイクロタイタープレート（ヌンク社）に上記で作製したELISA測定用試料の100μlを分注し、室温で3時間、振とうさせた。次いで、ELISA測定用試料をwellから捨て200μlのPBS-Tでwellを3回洗浄した。続いて、パーオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン・ヤギポリクローナル抗体（ダコ社）の100μlを分注し、室温で4時間、振とうさせた後、200μlのPBS-Tでwellを5回洗浄した。3, 3’, 5, 5’ −テトラメチルベンジジン（日本ロシュ）を加え発色させた。3, 3’, 5, 5’−テトラメチルベンジジンを加えてから正確に4分後に1N硫酸を100μL分注し、発色を停止させた。発色停止後、モデル550マイクロプレートリーダー（BioRad社）にて450nmの吸光度を測定した。
【0141】
【表7】
上記の方法で作製したプラスミドと、転移酵素遺伝子をコードするヘルパープラスミドpA3PIG（Tamura et al., 2000）を一緒に約700粒の発生初期のカイコ卵に注射し、次世代の胚の単眼におけるGFPの発現を調べた。その結果、表８に示したように、7蛾区においてGFPを発現する個体が出現した。
【0142】
【表8】
【0143】
これらの組換えカイコを飼育した結果、3系統について系統化する事に成功した。さらに系統化されたUASIgL-IgH系統の中から1系統をSer1GAL4系統と交配し、次世代における各蛍光タンパク質遺伝子を持つ個体の分離比を表９に示した。
【0144】
【表9】
【0145】
次に、この様にして3xP3GFP及び3xP3DsRed遺伝子を持つ個体をUASIgL UASIgH遺伝子とSer1GAL4遺伝子の両方を持つ個体として飼育し、吐糸期の幼虫の絹糸腺から抽出したサンプルにIgG1型抗体が含まれるかをMouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit で確認を行った。その結果、図１３に示す通り、絹糸腺において、κ鎖を持つマウスIgG1型抗体が生産されていることが明らかとなった。また、同様にこの絹糸腺から抽出したサンプルを抗原と反応させたところ、図１４に示すように、組換えカイコが生産した組換えタンパク質が抗体として作用することが明らかになった。
【0146】
IgG1型抗体の検出と同様に、中部絹糸腺からtotal RNAを抽出し、RT-PCRを行った。その結果、図１２に示す通り、抗体のL鎖およびH鎖の両方の遺伝子が転写されている事が分かった。
【産業上の利用可能性】
【0147】
本発明によって、カイコを利用した組換え抗体の製造方法が提供された。昆虫は抗体分子を有さない。従って、カイコを利用して組換え抗体を製造する利点として、組換え抗体の抽出物に目的の抗体以外の抗体が含まれる可能性が無いことが挙げられる。このことは、マウス等の哺乳動物と異なり、ノックアウト個体を作成する必要がないことを意味する。哺乳動物由来の培養細胞等を用いた場合、製造される組換え抗体の精製品に動物細胞由来の抗体が含まれる可能性がある。これは交叉反応の原因となり、抗原の正確な量の測定を妨げる。カイコ由来の組換え抗体では交差反応が起きる可能性が低く、目的とする抗原と反応した抗体だけを正確に測定することが可能となる。また、カイコを利用することによって、大量の抗体を製造することが可能となる。本発明は、特異性の高い抗体が大量に必要とされる、医薬品や診断薬の分野において特に有用である。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]