特許 5763113 モラクセラ・カタラーリスと上皮細胞、細胞外マトリックス蛋白質及び補体系の相互作用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5763113

(24)【登録日】2015年6月19日

(45)【発行日】2015年8月12日

(54)【発明の名称】モラクセラ・カタラーリスと上皮細胞、細胞外マトリックス蛋白質及び補体系の相互作用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150723BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20150723BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20150723BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20150723BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20150723BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/195

   C07K19/00

   A61K37/02

   A61P31/04

【請求項の数】11

【外国語出願】

【全頁数】63

(21)【出願番号】特願2013-36921(P2013-36921)

(22)【出願日】2013年2月27日

(62)【分割の表示】特願2008-525959(P2008-525959)の分割

【原出願日】2006年8月8日

(65)【公開番号】特開2013-150614(P2013-150614A)

(43)【公開日】2013年8月8日

【審査請求日】2013年3月28日

(31)【優先権主張番号】60/706,745

(32)【優先日】2005年8月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/707,148

(32)【優先日】2005年8月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508041998

【氏名又は名称】アルネ・フオシユグレン・アー・ベー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アルネ・フオシユグレン

(72)【発明者】

【氏名】クリステイアン・リエスベツク

【審査官】 渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】 J.Immunol.,2004 Oct 1,173(7),p.4598-606

【文献】 Infect.Immun.,2005 Jun,73(6),p.3471-8

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号７から構成されるペプチド、又はラミニン結合特性を保持するそのフラグメント、水酸化物、スルホン化物若しくは糖化物。

【請求項2】

配列番号８から構成されるペプチド、又はラミニン結合特性を保持するそのフラグメント、水酸化物、スルホン化物若しくは糖化物。

【請求項3】

配列番号９から構成されるペプチド、又はＣ３若しくはＣ３ｍｅｔ結合特性を保持するそのフラグメント、水酸化物、スルホン化物若しくは糖化物。

【請求項4】

配列番号１０から構成されるペプチド、又はＣ３若しくはＣ３ｍｅｔ結合特性を保持するそのフラグメント、水酸化物、スルホン化物若しくは糖化物。

【請求項5】

感染症の治療又は予防用医薬の製造における請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のペプチドの使用。

【請求項6】

感染症がモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）に起因する請求項５に記載の使用。

【請求項7】

感染症が中耳炎、副鼻腔炎又は下気道感染症である請求項５又は６に記載の使用。

【請求項8】

ラミニン結合領域及び／又はＣ３若しくはＣ３ｍｅｔ結合領域を含むリガンドであって、配列番号７〜１０から構成される群から選択されるアミノ酸配列、又はラミニン及び／又はＣ３若しくはＣ３ｍｅｔ結合特性を保持するそのフラグメント、水酸化物、スルホン化物若しくは糖化物から構成される前記リガンド。

【請求項9】

請求項８に記載の１種以上のリガンドを含む融合蛋白質。

【請求項10】

請求項８に記載の１種以上のリガンド又は請求項９に記載の融合蛋白質と、１種以上の医薬的に許容可能なアジュバント、ビヒクル、賦形剤、結合剤、キャリヤー又は防腐剤とを含有する医薬。

【請求項11】

請求項８に記載のリガンド、請求項９に記載の蛋白質、又は請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）と、フィブロネクチンやラミニン等の細胞外マトリックス蛋白質を介して上皮細胞と相互作用するその能力に関し、更には補体系を阻害するその能力にも関する。これらの細胞外蛋白質との相互作用はワクチンの製造に有用である。

【背景技術】

【0002】

上皮細胞との結合能は数種の細菌種に極めて重要である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓは近縁配列構成をもつフィブロネクチン結合蛋白質（ＦｎＢＰ）をもつ。これらのＦｎＢＰは「接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ＭＳＣＲＡＭＭＳ）」と呼ばれる。これらの蛋白質はフィブロネクチンと結合する際に長いタンデム型βジッパーを形成するフィブロネクチンモジュラー構造を利用する［２７，３９，４７，７３］。その機能は宿主細胞への細菌接着及び侵入を媒介することである。

【0003】

重要な粘膜病原菌であるＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは小児の急性中耳炎の病原細菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに次いで第３位に位置する［１４，４０，５５］。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは健常小児の最も一般的な咽頭寄生菌の１種でもある。

【0004】

更に、Ｍｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）をもつ成人で副鼻腔炎と下気道感染症の一般的な原因でもある［７４］。ＣＯＰＤ患者におけるこの種の繁殖はアドヘシンのレパートリーが多いことが一因であると思われる。

【0005】

近年、外膜蛋白質及びヒト宿主とのその相互作用が研究の焦点になっている［６，４８，５６］。これらの外膜蛋白質には、接着機能をもつものがあると思われ、特にＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＩｇＤ結合蛋白質（ＭＩＤ、別称Ｈａｇ）、蛋白質ＣＤ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ接着蛋白質（ＭｃａＰ）及びユビキタス表面蛋白質（Ｕｓｐ）がこれに該当する［１，２２，３３，４８，６１，８１，８４］。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

発明の概要
Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは上下気道感染症の主原因であることが分かっているので、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対して使用することができるワクチンの開発が現在必要になっている。

【0007】

従って、本発明の目的はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓがどのように体内の上皮細胞と相互作用して免疫系に作用するかを突き止めることであった。こうして、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対するワクチンとして作用することが可能な物質を開発することができる。

【0008】

この研究では、臨床単離株に由来するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ突然変異体を使用し、ＵｓｐＡ１及びＡ２の両者がフィブロネクチンとラミニンに結合することを明らかにすることができた。更に、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが補体系の古典経路を阻害することを明らかにすると共に、どのように阻害するかも解明することができた。

【0009】

多くの細菌はフィブロネクチンと結合するＭＳＣＲＡＭＭＳを介して上皮細胞に接着する［５４，７７］。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは鼻腔上皮細胞で細胞性フィブロネクチンと結合するＦｎＢＰをもつ［６９］。この細菌とフィブロネクチン蛋白質の相互作用を阻害すると、宿主組織の感染防除を助長できると思われる。実際に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＦｎＢＰに対する抗体は感染マウスでこの細菌の迅速なクリアランスを生じたと報告されている［７１］。

【0010】

組換えトランケート型ＵｓｐＡ１／Ａ２蛋白質と全長分子をカバーする短いフラグメントを本発明に従ってフィブロネクチン結合について試験した。ＵｓｐＡ１及びＡ２はいずれもフィブロネクチンと結合し、フィブロネクチン結合領域はＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}とＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}に位置することが分かった。これらの２種のトランケート型蛋白質はいずれも抗フィブロネクチン抗体と同程度までＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣｈａｎｇ結膜上皮細胞の結合を阻害した。この結果、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ１及びＡ２はいずれも細胞性フィブロネクチンを介する上皮細胞との結合に関与していることが分かった。従って、ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}内の生物活性部位はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対するワクチンに加える潜在的候補として提案される。

【0011】

更に、本発明者らはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとラミニンの結合について試験し、特性決定した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＣＯＰＤ患者における感染症増悪の一般的な原因である。ＣＯＰＤ患者におけるこの種の繁殖はアドヘシンのレパートリーが多いことが一因であると思われる。更に、喫煙者ではラミニン層自体が肥厚して基底膜が露出し、上皮完全性の低下等の病的変化が生じる［４］。所定の病原菌はラミニンと結合できることが分かっているので、このような損傷して露出した粘膜表面と接着できると考えられる。このような病原菌としては、特にＳ．ａｕｒｅｕｓやＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等の重大な気道疾患を誘発することが知られている病原菌が挙げられる［７，６３］。本発明者らはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓユビキタス表面蛋白質（Ｕｓｐ）Ａ１及びＡ２もラミニンと結合することを実証することができた。ＵｓｐＡ１及びＡ２のラミニン結合領域は特にＵｓｐＡ１^{５０−４９１}及びＵｓｐＡ２^{３０−３５１}のＮ末端側半分に検出された。これらの領域はフィブロネクチン結合領域も含んでいる。他方、フィブロネクチンと結合した最小フラグメントであるＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}は容易に検出可能な程度までラミニンと結合しなかった。ＵｓｐＡ１のＮ末端側半分（ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}）よりも小さいフラグメントはその全ラミニン結合能を失い、ＵｓｐＡ２では、全長組換え蛋白質（ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}）よりも程度は低いが、ＵｓｐＡ２^{３０−１７０}のみがラミニンと結合した。これらの結果は分子の部分によって機能的役割が異なることを示唆している。ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}もラミニン結合特性をもつことが分かった。

【0012】

しかし、ＵｓｐＡ１及びＡ２の最小ラミニン結合領域を比較した処、ＵｓｐＡ２^{３０−１７０}及びＵｓｐＡ１^{５０−４９１}のアミノ酸ホモロジーによる類似性は殆どないことが分かった（データは示せず）。両者のＮ末端側半分の一致度は２２％に過ぎないが、どちらの蛋白質も「ロリポップ」形の球形ヘッド構造をもつことが定説である［２，３２］ので、これは意外ではない。

【0013】

ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}内の生物活性部位はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対するワクチンに加える潜在的候補として提案される。

【0014】

最後に、本発明者らはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓユビキタス表面蛋白質Ａ１及びＡ２と先天免疫系の相互作用について検討し、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが補体系を阻害することを突き止めた。補体系は病原微生物に対する先天性防御の最前線の１つであり、この系の活性化は細菌表面への蛋白質付着のカスケードをもたらし、その結果、膜攻撃複合体の形成又は病原菌のオプソニン化後に貪食作用を生じる［８５，８６］。最も重要な補体蛋白質の１つはＣ３であり、所定の免疫グロブリンと同等濃度（１〜１．２ｍｇ／ｍｌ）で循環中に存在する。Ｃ３はオプソニンとして重要な役割を果たすのみならず、補体活性化の古典経路、レクチン経路及び代替経路の共通接点でもある。代替経路は古典経路とレクチン経路の増幅ループとして機能し、補体阻害剤の不在下でＣ３と微生物表面の共有結合により自発的に活性化することもできる。Ｃ３付着にはＣ３α鎖上のスルフヒドリル基（Ｃｙｓ^１０１０）とグルタミルカルボニル基（Ｇｌｎ^１０１２）の近接により天然蛋白質で形成される内部チオエステル結合の存在が必要である［７６］。Ｃ３α鎖のアミノ末端から７７残基ペプチドを蛋白分解により開裂すると、Ｃ３ａ（アナフィラトキシン）とＣ３ｂを生じる。その後、準安定チオエステルのカルボニル基とアクチベーター表面の蛋白質又は糖鎖構造の−ＮＨ_２又は−ＯＨ基の共有結合によりＣ３ｂが付着する［３６，３７］。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ１及びＡ２はＥＤＴＡで処理した血清に由来する補体第３成分（Ｃ３）とメチルアミンで処理したＣ３（Ｃ３ｍｅｔ）の両者と用量依存的に非共有的に結合することが分かった。ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}はＣ３及びＣ３ｍｅｔと結合することが分かった。ＵｓｐＡ２のＣ３結合領域は主にＵｓｐＡ２^{２００−４５８}に位置することが分かった。他方、ＵｓｐＡ１は相互作用に果たす役割が小さいことが分かった。ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}内の生物活性部位はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対するワクチンに加える潜在的候補として提案される。

【0015】

ＵｓｐＡファミリーはＵｓｐＡ１（分子量８８ｋＤａ）、ＵｓｐＡ２（６２ｋＤａ）、及びハイブリッド蛋白質ＵｓｐＡ２Ｈ（９２ｋＤａ）から構成される［２，４３］。これらの蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで高分子量複合体として移動し、比較的保存されているため、重要なワクチン候補である。ＵｓｐＡ１及びＡ２のアミノ酸配列は４３％一致しており、１４０アミノ酸残基が９３％一致している［２］。中耳炎をもつ幼児に由来する１０８個のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ鼻咽頭単離株群では、単離株の夫々１０７個（９９％）と１０８個（１００％）にｕｓｐＡ１及びｕｓｐＡ２遺伝子が検出された。２１％がハイブリッド変異体遺伝子ｕｓｐＡ２Ｈをもつことが確認された［５０］。更に、ＵｓｐＡ１及びＡ２に対する自然獲得抗体は細菌性であることが知られている［１５］。

【0016】

ＵｓｐＡファミリーの蛋白質は数種の機能をもつと考えられている。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣｈａｎｇ結膜上皮細胞及びＨｅｐ−２咽頭上皮細胞の結合にはＵｓｐＡ１発現が不可欠である［４３，４９］。更に最近の研究では、ＵｓｐＡ１は肺上皮細胞株Ａ５４９で発現される癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）と結合することが報告されている［３１］。精製ＵｓｐＡ１はドットブロット実験でフィブロネクチンと結合するが、精製ＵｓｐＡ２は結合しないことも報告されている［４９］。ＵｓｐＡ１及びＡ２はいずれもＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ血清抵抗性に重要な役割を果たすらしい［１，５，５８，６０］。

【0017】

本発明はＵｓｐＡ１及びＡ２の両者が臨床単離株Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８及びＲＨ４におけるＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとフィブロネクチン及びラミニンの結合の決定基であることを実証する。興味深いことに、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ Ｂｃ５に由来する組換えＵｓｐＡ１及びＡ２はいずれも同程度までフィブロネクチンと結合した。フィブロネクチンの結合領域はＵｓｐＡ１のアミノ酸残基２９９〜４５２及びＵｓｐＡ２の１６５〜３１８に検出された。これらの２種の領域は３１アミノ酸残基配列が一致する。重要な点として、これらの残基を含むＵｓｐＡ１とＵｓｐＡ２のトランケート型蛋白質フラグメントはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣｈａｎｇ上皮細胞の結合を阻害することができ、これらの細胞との相互作用が細胞性フィブロネクチンを介在することが示唆された。

【0018】

ラミニンの結合領域は上記アミノ酸残基の範囲内に検出された。組換え蛋白質との結合アッセイによると、主要な結合領域は両者蛋白質が球状ヘッドを形成するＮ末端に位置することが判明した。

【0019】

組織及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分との接着を媒介する細菌因子は「接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）」と呼ばれる単一ファミリーに一括分類される。ＵｓｐＡ１／Ａ２はいずれもフィブロネクチン及びラミニンと結合するので、これらの蛋白質はＭＳＣＲＡＭＭＳと言うことができる。

【課題を解決するための手段】

【0020】

１側面によると、本発明は配列番号１をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0021】

別の側面によると、本発明は配列番号２をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0022】

別の側面によると、本発明は配列番号３をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0023】

別の側面によると、本発明は配列番号４をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0024】

別の側面によると、本発明は配列番号５をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0025】

別の側面によると、本発明は配列番号６をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0026】

別の側面によると、本発明は配列番号７をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0027】

別の側面によると、本発明は配列番号８をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0028】

別の側面によると、本発明は配列番号９をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0029】

別の側面によると、本発明は配列番号１０をもつペプチドと、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物を提供する。

【0030】

別の側面によると、本発明は感染症、好ましくはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに起因する感染症、特にＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの粘膜表面輸送に起因する感染症の治療又は予防用医薬の製造における少なくとも１種の本発明のペプチドの使用を提供する。

【0031】

別の側面によると、本発明は更にフィブロネクチン結合領域を含むリガンドを提供し、前記リガンドは配列番号１、配列番号２及び配列番号３から構成される群から選択されるアミノ酸配列と、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物から構成される。

【0032】

本発明は更にラミニン結合領域を含むリガンドを提供し、前記リガンドは配列番号４〜配列番号８から構成される群から選択されるアミノ酸配列と、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物から構成される。

【0033】

更に、本発明はＣ３又はＣ３ｍｅｔ結合領域を含むリガンドを提供し、前記リガンドは配列番号４、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０から構成される群から選択されるアミノ酸配列と、そのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物及び他の二次処理物から構成される。

【0034】

更に、本発明は本発明の１種以上のリガンドと、１種以上の医薬的に許容可能なアジュバント、ビヒクル、賦形剤、結合剤、キャリヤー又は防腐剤を含有する医薬を提供する。

【0035】

本発明は更に本発明の１種以上のリガンドと、１種以上の医薬的に許容可能なアジュバント、ビヒクル、賦形剤、結合剤、キャリヤー又は防腐剤を含有するワクチンを提供する。

【0036】

本発明は更に医薬的に有効な量の本発明の医薬又はリガンドを投与する段階を含む個体における感染症、好ましくはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに起因する感染症、特にＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの粘膜表面輸送に起因する感染症の治療又は予防方法を提供する。

【0037】

最後に、本発明は本発明のリガンド、蛋白質又はペプチドと、そのホモログ、多形体、縮重変異体及びスプライス変異体をコードする核酸配列も提供する。

【0038】

本発明の目的、課題、解決手段及び特徴に関する他の開示は図面及び特許請求の範囲を参照して以下の発明の詳細な説明から理解されよう。

【0039】

本明細書で使用するリガンドなる用語は受容体と結合する全長分子と、受容体結合特性を保持するように受容体結合領域を含むその任意部分の両者を意味するものとする。等価受容体結合領域を含むリガンドも本発明に含まれる。

【0040】

フラグメント、ホモログ、機能的等価物及び誘導体なる用語は所望フィブロネクチン、ラミニン、Ｃ３又はＣ３ｍｅｔ結合特性を保持する本発明のペプチド及び蛋白質フラグメントの変異体、改変体及び／又は部分を意味する。

【0041】

本発明のＵｓｐＡ１のホモログは下表１から明らかなように、少なくとも７２％の配列一致度をもつ配列として定義される。

【0042】

本発明のフラグメントはＮ末端が１、２、５、１０、１５、２０アミノ酸短縮もしくは延長した相同配列及び／又はＣ末端が１、２、５、１０、１５、２０アミノ酸短縮もしくは延長した相同配列の任意のものとして定義される。

【0043】

縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物又は他の二次処理物なる用語は所望フィブロネクチン、ラミニン、Ｃ３又はＣ３ｍｅｔ結合特性を保持しながら、縮重、水酸化、スルホン化又は糖化により元のペプチド又は蛋白質フラグメントに比較して改変された本発明のペプチド及び蛋白質フラグメントの変異体及び／又は改変体を意味する。

【0044】

本発明は特にＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに起因する感染症に関する。本発明のペプチドは中耳炎、副鼻腔炎又は下気道感染症の治療又は予防に使用することができる。

【0045】

【表1】

【0046】

【表2】

【0047】

従って、本発明はラミニン及び／又はフィブロネクチン及び／又はＣ３結合特性をもつＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ外膜蛋白質から単離されたリガンドを提供し、前記リガンドは下記全長Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＣ５ ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２配列に由来する配列番号１〜１０から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むかもしくは前記アミノ酸配列から構成されるポリペプチド、又はそのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物もしくは他の二次処理物である。

【0048】

【化1】

【0049】

好ましい１態様では、リガンドは配列番号１〜１０から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むかもしくは前記アミノ酸配列から構成されるポリペプチド［又は野生型ポリペプチドに対するポリペプチドトランケート］、又はそのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物もしくは他の二次処理物である。

【0050】

リガンドなる用語は本明細書ではラミニン及び／又はフィブロネクチン及び／又はＣ３と結合する全長分子と、夫々の結合特性を保持するようにラミニン及び／又はフィブロネクチン及び／又はＣ３結合領域を含むその任意部分の意味で使用する。従って、「リガンド」はラミニン及び／又はフィブロネクチン及び／又はＣ３結合領域、即ち結合に必要な１個以上のペプチド領域のみから構成される分子を含む。

【0051】

本発明の趣旨では、ポリペプチドのラミニン、フィブロネクチン又はＣ３結合特性は以下のように確認することができる。

【0052】

本発明の趣旨では、ポリペプチドのラミニン、フィブロネクチン又はＣ３結合特性は以下のように確認することができる。ポリペプチドを^１２５ヨウ素又は他の放射性化合物で標識し、流体相又は固相（例えばドットブロット）としてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で結合を試験することができる。更に、適当な抗体と検出システムを使用して酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はフローサイトメトリーでポリペプチドの結合を分析することができる。ポリペプチドとラミニン、フィブロネクチン又はＣ３の相互作用は更に表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ）により試験することができる。方法の例は材料と方法のセクションに詳細に例示する。

【0053】

別の好ましい態様では、ポリペプチド［又は野生型ポリペプチドに対するポリペプチドトランケート］は本明細書に示すアラインメントで同定される配列番号１〜１０内からの保存配列の少なくとも１種を含むか又は前記配列から構成される。従って、本態様では、ポリペプチド［又は野生型ポリペプチドに対するポリペプチドトランケート］は、
ＵｓｐＡ１に由来する保存配列（フィブロネクチン結合領域に由来する保存フラグメント−「／」は１個の位置におけるアミノ酸の代替選択肢の区切りである）

【0054】

【化2】

【0055】

ＵｓｐＡ２に由来する保存配列（フィブロネクチン結合領域に由来する保存フラグメント−「／」は１個の位置におけるアミノ酸の代替選択肢の区切りである）
Ｋ Ａ Ｄ Ｉ Ｄ Ｎ Ｎ Ｉ Ｎ Ｎ／Ｈ Ｉ Ｙ Ｅ Ｌ Ａ Ｑ Ｑ Ｑ Ｄ Ｑ Ｈ Ｓ Ｓ Ｄ
Ｉ Ｋ／Ｑ Ｔ／Ａ Ｌ Ｋ／Ｅ Ｋ／Ｎ／Ｓ Ｎ Ｖ／Ｉ Ｅ／Ｖ Ｅ Ｇ／Ｅ Ｌ Ｌ／Ｆ Ｅ／Ｎ Ｌ Ｓ Ｄ／Ｇ Ｈ／Ｒ Ｉ／Ｌ Ｉ Ｄ Ｑ Ｋ Ｔ／Ａ Ｄ Ｉ／Ｌ Ａ／Ｔ Ｑ／Ｋ Ｎ／Ｄ

【0056】

ＵｓｐＡ２に由来する保存配列（Ｃ３結合領域に由来する保存フラグメント−「／」は１個の位置におけるアミノ酸の代替選択肢の区切りである）

【0057】

【化3】

の少なくとも１種を含むか又は前記配列から構成される。

【0058】

当然のことながら、本発明のポリペプチドリガンドはＮ又はＣ末端の一方又は両方で本明細書に記載する配列にアミノ酸残基を付加又は欠失させることにより改変された本明細書に記載する配列のラミニン及び／又はフィブロネクチン及び／又はＣ３結合領域を含むことができ、前記改変ペプチドは夫々ラミニン及び／又はフィブロネクチン及び／又はＣ３と結合する能力を保持する。従って、本発明は更に、Ｎ又はＣ末端の一方又は両方で本明細書に記載するアミノ酸配列に５０、４０、３０、２０、１０、５、３又は１アミノ酸残基を付加又は欠失させたポリペプチドを含むか又は前記ポリペプチドから構成されるリガンドを提供し、前記改変ポリペプチドはラミニン及び／又はフィブロネクチン及び／又はＣ３と結合する能力；及び／又は非改変ペプチドに対して免疫応答を誘発する能力を保持する。延長とは、元の全長アミノ酸配列からペプチドのコンテキストを使用して配列を延ばすことを意味する。

【0059】

本発明のポリペプチドのフラグメントについては、フラグメントがラミニン及び／又はフィブロネクチン及び／又はＣ３と結合する能力を保持する限り、本発明では（本明細書に記載する相同配列／保存領域／機能的領域に対して）任意寸法のフラグメントを使用することができる。受容体結合に必要な領域のみを含む最小ペプチドを単離することが望ましいと思われる。

【0060】

本発明のポリペプチドリガンドはＮ及びＣ末端の一方又は両方のトランケーションにより公知Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ１又はＵｓｐＡ２蛋白質から誘導することができる。トランケートは全長天然ＵｓｐＡ１又はＡ２分子以外のものである。従って、本発明は更に、Ｎ末端から少なくとも（又は厳密に）２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０個等〜２９８個のアミノ酸を欠失するか、及び／又はＣ末端から少なくとも（又は厳密に）２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００個等〜４５０個のアミノ酸を欠失する野生型ＵｓｐＡ１配列を提供する。トランケートはフィブロネクチン結合機能（及び場合によりラミニン及び／又はＣ３結合機能）を保持することが好ましい。

【0061】

【表3】

【0062】

従って、本発明は更に、Ｎ末端から少なくとも（又は厳密に）２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１６４個のアミノ酸を欠失するか、及び／又はＣ末端から少なくとも（又は厳密に）２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１８０、２００個等〜３１２個のアミノ酸を欠失する野生型ＵｓｐＡ２配列を提供する。トランケートはフィブロネクチン結合機能（及び場合によりラミニン及び／又はＣ３結合機能）を保持することが好ましい。可能なトランケートは下表に示すものから選択することができ、その全てが本発明の範囲に含まれる。

【0063】

【表4】

【0064】

従って、本発明は更に、Ｎ末端から少なくとも（又は厳密に）５、１０、１５、２０、２５又は２９個のアミノ酸を欠失するか、及び／又はＣ末端から少なくとも（又は厳密に）２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００個等〜４５３個のアミノ酸を欠失する野生型ＵｓｐＡ２配列を提供する。トランケートはラミニン結合機能（及び場合によりフィブロネクチン及び／又はＣ３結合機能）を保持することが好ましい。可能なトランケートは下表に示すものから選択することができ、その全てが本発明の範囲に含まれる。

【0065】

【表5】

【0066】

従って、本発明は更に、Ｎ末端から少なくとも（又は厳密に）２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０個等〜３０１個のアミノ酸を欠失するか、及び／又はＣ末端から少なくとも（又は厳密に）２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０又は１７２個のアミノ酸を欠失する野生型ＵｓｐＡ２配列を提供する。トランケートはＣ３結合機能（及び場合によりフィブロネクチン及び／又はラミニン結合機能）を保持することが好ましい。可能なトランケートは下表に示すものから選択することができ、その全てが本発明の範囲に含まれる。

【0067】

【表6】

【0068】

このように短縮することができる公知野生型ＵｓｐＡ１配列はＡＴＣＣ２５２３８（ＭＸ２；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＤ４３４６５）、Ｐ４４（ＡＡＮ８４８９５）、Ｏ３５Ｅ（ＡＡＢ９６３５９）、ＴＴＡ３７（ＡＡＦ４０１２２）、Ｏ１２Ｅ（ＡＡＦ４０１１８）、Ｏ４６Ｅ（ＡＡＦ３６４１６）、Ｖ１１７１（ＡＡＤ４３４６９）、ＴＴＡ２４（ＡＡＤ４３４６７）（表１／図１９参照）；又はＢＣ５（上記参照）株の配列である。このように短縮することができる公知野生型ＵｓｐＡ２配列はＯ３５Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｏ４４０７）、ＭＣ３１７（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ５８ＸＰ４）、Ｅ２２（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ８４８Ｓ１）、Ｖ１１２２（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ８４８Ｓ２）、Ｐ４４（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ８ＧＨ８６）、ＴＴＡ３７（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ９Ｌ９６１）、Ｏ４６Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ９Ｌ９６２）、Ｏ１２Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ９Ｌ９６３）、Ｖ１１７１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ９ＸＤ５１）、ＴＴＡ２４（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ９ＸＤ５３）、ＳＰ１２−５（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ８ＲＴＢ２）、ＡＴＣＣ２５２３８（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｑ９ＸＤ５５）（表２／図２０参照）；又はＢＣ５［Ｆｏｒｓｇｒｅｎ＿ＵｓｐＡ２］（上記参照）株の配列である。

【0069】

理想的には、本態様のＵｓｐＡ１又はＵｓｐＡ２トランケートは配列番号１〜１０から構成される群から選択されるアミノ酸配列、又はそのフラグメント、ホモログ、機能的等価物、誘導体、縮重変異体、水酸化物、スルホン化物、糖化物もしくは他の二次処理物を含むか又は前記アミノ酸配列等から構成され；あるいは本明細書に示すアラインメントで同定されるこれらの領域内からの保存配列、例えば、
ＵｓｐＡ１に由来する保存配列（フィブロネクチン結合領域に由来する保存フラグメント−「／」は１個の位置におけるアミノ酸の代替選択肢の区切りである）

【0070】

【化4】

【0071】

ＵｓｐＡ２に由来する保存配列（フィブロネクチン結合領域に由来する保存フラグメント−「／」は１個の位置におけるアミノ酸の代替選択肢の区切りである）
Ｋ Ａ Ｄ Ｉ Ｄ Ｎ Ｎ Ｉ Ｎ Ｎ／Ｈ Ｉ Ｙ Ｅ Ｌ Ａ Ｑ Ｑ Ｑ Ｄ Ｑ Ｈ Ｓ Ｓ Ｄ
Ｉ Ｋ／Ｑ Ｔ／Ａ Ｌ Ｋ／Ｅ Ｋ／Ｎ／Ｓ Ｎ Ｖ／Ｉ Ｅ／Ｖ Ｅ Ｇ／Ｅ Ｌ Ｌ／Ｆ Ｅ／Ｎ Ｌ Ｓ Ｄ／Ｇ Ｈ／Ｒ Ｉ／Ｌ Ｉ Ｄ Ｑ Ｋ Ｔ／Ａ Ｄ Ｉ／Ｌ Ａ／Ｔ Ｑ／Ｋ Ｎ／Ｄ

【0072】

ＵｓｐＡ２に由来する保存配列（Ｃ３結合領域に由来する保存フラグメント−「／」は１個の位置におけるアミノ酸の代替選択肢の区切りである）

【0073】

【化5】

の少なくとも１種を含むか又は前記配列から構成される。

【0074】

本明細書に記載するようなポリペプチドリガンドを含む融合蛋白質を作製すると適切であると思われる。従って、別の態様では、本発明は本発明のポリペプチドリガンドを含む融合蛋白質を提供する。本態様の融合蛋白質は任意公知全長配列に対する一致度がその全長にわたって５０％未満であることが好ましい。このような融合蛋白質は本発明のポリペプチドの誘導体を構成することができる。別の誘導体としては、ペプチド又は糖部分を共有結合するためのキャリヤーとしての本発明のポリペプチドの使用が挙げられる。これらの部分は例えば肺炎球菌莢膜オリゴ糖類もしくは多糖類、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓリポオリゴ糖類、又は無莢膜型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅリポオリゴ糖類と結合することができる。

【0075】

本発明の相同ペプチドは配列比較により同定することができる。相同ペプチドは本明細書に開示するペプチド配列又は本発明のそのフラグメントもしくはトランケートに対してその全長にわたって少なくとも６０％一致していることが好ましく、昇順に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％一致していることがより好ましい。相同ペプチドはフィブロネクチン及び／又はラミニン及び／又はＣ３と結合する能力；及び／又は本明細書に開示するペプチド配列又はそのフラグメントに対して免疫応答を誘発する能力を保持することが好ましい。

【0076】

図１９及び２０は異なる起源のＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２のペプチド配列のアラインメントを示し、機能（即ちフィブロネクチン及び／又はラミニン及び／又はＣ３結合能）を保持しながら相同配列を形成するように改変可能な配列領域を示す。配列番号１〜１０のＢＣ５ペプチドの相同ペプチドは例えば図１９及び２０の他の株に由来するＢＣ５配列に対応する配列である。

【0077】

本発明のワクチン
本発明のポリペプチド／ペプチド／機能的領域／ホモログ／フラグメント／トランケート／誘導体は有効量の前記成分と医薬的に許容可能な賦形剤を含有するワクチンとして製剤化すると理想的である。

【0078】

本発明のワクチンはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ感染症又は中耳炎又は副鼻腔炎又は下気道感染症を予防又は治療するために患者に投与するために使用することができる。ワクチンは筋肉内、非経口、粘膜及び鼻腔内等の任意公知方法で投与することができる。

【0079】

本発明の併用ワクチン
本発明のワクチンは上記疾患を予防又は治療するために他のＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原と併用することができる。

【0080】

本発明者らは特にＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが宿主免疫系による攻撃を妨害する少なくとも２種類の手段をもつことを見いだした。下記実施例に記載するＣ３（及びＣ４ＢＰ）との相互作用に加え、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは蛋白質ＭＩＤ（ＯＭＰ１０６とも言う）を介して可溶性又は膜結合ヒトＩｇＤに対して強い親和性をもつ。Ｂリンパ球とのモラクセラ依存的ＩｇＤ結合の結果、特異的抗モラクセラモノクローナル抗体の産生を妨げるポリクローナル免疫グロブリンが合成される。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが数種の手段でヒト免疫系を妨害するという事実は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが気道の非常に一般的な寄生菌である理由を説明するものである。

【0081】

本発明者らはＩｇＤ結合機能（ＭＩＤ）とＣ３結合機能（ＵｓｐＡ１及び／又はＵｓｐＡ２）に関与する抗原の併用により、モラクセラのヒト免疫系妨害に対して高い防御能を宿主に与える免疫原組成物が得られ、従って、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの粘膜表面輸送の低減を助長できると考える。

【0082】

従って、本発明の別の側面は有効量のＵｓｐＡ１及び／又はＵｓｐＡ２（特に後者）（例えば全長ポリペプチド又は好ましくはＣ３結合機能を保持する本明細書に記載するような本発明のポリペプチド／ペプチド／機能的領域／ホモログ／フラグメント／トランケート／誘導体）と、有効量の蛋白質ＭＩＤ（例えば全長ポリペプチド又は好ましくはヒトＩｇＤ結合機能を保持するそのポリペプチド／ペプチド／機能的領域／ホモログ／フラグメント／トランケート／誘導体）と、医薬的に許容可能な賦形剤を含有するワクチン組成物である。

【0083】

蛋白質ＭＩＤと、そのＩｇＤ結合性ホモログ／フラグメント／トランケートは（参照により本明細書に組込む）ＷＯ０３／００４６５１に記載されている。この目的に特に適切なフラグメントはＷＯ０３／００４６５１に記載されているＦ２フラグメントを含む（又は前記フラグメントから構成される）ポリペプチド又は前記ポリペプチドに対して少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９９％の一致度をもち、好ましくはヒトＩｇＤ結合活性を保持する配列である。

【0084】

この併用ワクチンのＭＩＤ及びＵｓｐＡ成分は相互に分離していてもよいが、公知分子生物学技術により相互に融合すると適切であると思われる。

【図面の簡単な説明】

【0085】

【図1】フィブロネクチン結合について試験した１３種のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株を示す（Ａ）。抗ＵｓｐＡ１／Ａ２ ｐＡｂにより検出した処、強いフィブロネクチン結合がＵｓｐＡ１／Ａ２発現と相関した（Ｂ−Ｉ）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８野生型及びＵｓｐＡ１／Ａ２欠損突然変異体のフローサイトメトリープロファイルは可溶性フィブロネクチンとのＵｓｐＡ１／Ａ２依存的結合を示す。野生型臨床単離株（Ｂ及びＦ）と対応するＵｓｐＡ１（Ｃ及びＧ）又はＵｓｐＡ２（Ｄ及びＨ）欠損突然変異体及びＵｓｐＡ１とＵｓｐＡ２の両者を欠損する二重突然変異体（Ｅ及びＩ）のプロファイルを示す。細菌をウサギ抗ＵｓｐＡ１／Ａ２又はフィブロネクチンと共にインキュベートした後に、抗フィブロネクチンｐＡｂと共にインキュベートした。次に、ＦＩＴＣ標識ウサギｐＡｂを加えた後にフローサイトメトリー分析した。プロファイル毎に３回の実験のうちの典型的な１回と平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【図2】Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ ＵｓｐＡ２欠損突然変異体が^１２５Ｉ標識フィブロネクチンと結合しないことを示す。フィブロネクチンと結合しない陰性対照として大腸菌ＢＬ２１を加えた。細菌を^１２５Ｉ標識フィブロネクチンと共にインキュベートした後に数回洗浄し、ガンマカウンターで分析した。ＵｓｐＡ１及びＡ２の両者を発現するＲＨ４野生型とフィブロネクチンの結合を１００％とした。３回の独立した実験の平均値を示す。誤差線は標準偏差（ＳＤ）を表す。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８でも同様の結果が得られた。

【図3】ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２を欠損するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ突然変異体が固定化フィブロネクチンと結合しないことを実証する写真である。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ野生型はフィブロネクチンをコートしたガラススライドに高密度で接着することができた（Ａ）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ΔｕｓｐＡ１突然変異体も高密度で保持された（Ｂ）が、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ΔｕｓｐＡ２及びΔｕｓｐＡ１／Ａ２二重突然変異体は接着が不良であった（Ｃ及びＤ）。ガラススライドにフィブロネクチンをコートし、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４とその対応するＵｓｐＡ１／Ａ２突然変異体を加えてインキュベートした。数回洗浄後に、細菌をグラム染色した。

【図4】組換えＵｓｐＡ１及びＡ２が用量依存的にフィブロネクチンと結合することを示すグラフである。ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}とＵｓｐＡ２^{３０−５３９}の相対フィブロネクチン結合度を示す。両者ＵｓｐＡ蛋白質（４０ｎＭ）をマイクロタイタープレートにコートし、フィブロネクチン濃度を増加しながらインキュベートした後に、ウサギ抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂとＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂで検出した。３回の別々の実験の平均値を示し、誤差線はＳＤを表す。

【図5】ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２の活性フィブロネクチン結合領域は夫々アミノ酸２９９〜４５２と１６５〜３１８に位置する。ＵｓｐＡ１（Ａ）及びＵｓｐＡ２（Ｂ）に由来するトランケート型蛋白質を示す。全フラグメントをＥＬＩＳＡでフィブロネクチン結合について試験した。各トランケート型フラグメント４０ｎＭをマイクロタイタープレートにコートし、ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２に夫々８０μｇ／ｍｌ及び１２０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンを加えてインキュベートした。結合したフィブロネクチンをウサギ抗フィブロネクチンｐＡｂで検出した後にＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂで検出した。結果は３組の実験の代表値である。誤差線はＳＤを表す。

【図6】配列番号１の配列と、ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}の配列ホモロジーを示す。３１個の同一アミノ酸残基を四角で囲んだ。

【図7】トランケート型ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}及びＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}フラグメントがＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ依存的フィブロネクチン結合を競合的に阻害することを示す。フィブロネクチンと結合しないＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓΔｕｓｐＡ１／Ａ２二重突然変異体を陰性対照として加えた。ＵｓｐＡ１組換え蛋白質をフィブロネクチン２ｍｇ／１００ｍｌと共にプレインキュベートした後にＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと共にインキュベートした。フローサイトメトリーでＦＩＴＣ標識抗フィブロネクチンｐＡｂにより検出した場合にフィブロネクチンと結合したＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの平均蛍光値（ＭＦＩ）を示す。ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}及びＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}は夫々９５％及び６３％の阻害を生じた。誤差線は３回の独立した実験の±ＳＤを表す。

【図8】ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}が細胞性フィブロネクチンを介するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのＣｈａｎｇ結膜細胞接着を阻害することを示す。抗フィブロネクチンｐＡｂとフローサイトメトリーにより検出した処、Ｃｈａｎｇ上皮細胞は表面にフィブロネクチンを発現した（Ａ）。フィブロネクチン結合蛋白質ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}、ＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}又は抗フィブロネクチンｐＡｂと共にプレインキュベートした結果、対照組換え蛋白質（ＵｓｐＡ１^{４３３−５８０}及びＵｓｐＡ２^{３０−１７７}）及び対照抗体（抗ＩＣＡＭ１ ｍＡｂ）に比較してＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４の結合は有意に低下した（Ｂ）。対応のあるスチューデントの両側ｔ検定によると、Ｐ＜０．０５であった。３回の別々の試験の平均値を示し、誤差線はＳＤを表す。

【図9A】ＵｓｐＡ１及びＡ２を介するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４とラミニンの結合を示す。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４野生型（ｗｔ）は固定化ラミニンと強く結合し、平均ＯＤは１．２７であった。ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１は１．１４の平均ＯＤ（野生型の８９．８％）を示した。ＲＨ４ΔｕｓｐＡ２と二重突然変異体ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２は平均ＯＤが夫々０．１９及び０．２３（野生型の１５．０％及び１８．１％）であった。これはウシ血清アルブミンをコートしたプレートとの残留接着と有意差がなかった。ラミニン又はウシ血清アルブミン３０μｇ／ｍｌをマイクロタイタープレートにコートした。プレートをブロッキングした後に細菌懸濁液を加えてインキュベートし、最後に洗浄した。結合した細菌を抗ＭＩＤ ｐＡｂとＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂで検出した。３回の代表的実験の平均結果を示す。誤差線は標準偏差（ＳＤ）を表す。

【図9B】組換えＵｓｐＡ１及びＡ２がラミニンと用量依存的に結合することを示す。ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}の相対ラミニン結合度を示す。両者ＵｓｐＡ蛋白質（４０ｎＭ）をマイクロタイタープレートにコートし、ラミニン濃度を増加しながらインキュベートした後に、ウサギ抗ラミニンｐＡｂとＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂで検出した。３回の別々の実験の平均値を示し、誤差線はＳＤを表す。

【図10A】ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}（Ａ）及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}（Ｂ）の活性ラミニン結合領域がＮ末端側半分に位置することを示す。４０ｎＭ組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}とトランケート型蛋白質をマイクロタイタープレートにコートし、ラミニン２０μｇ／ｍｌを加えてインキュベートした後にウサギ抗ラミニンｐＡｂとＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂで検出した。３回の別々の実験の平均値を示し、誤差線はＳＤを表す。

【図10B】ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}（Ａ）及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}（Ｂ）の活性ラミニン結合領域がＮ末端側半分に位置することを示す。４０ｎＭ組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}とトランケート型蛋白質をマイクロタイタープレートにコートし、ラミニン２０μｇ／ｍｌを加えてインキュベートした後にウサギ抗ラミニンｐＡｂとＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂで検出した。３回の別々の実験の平均値を示し、誤差線はＳＤを表す。

【図11】Ｃ３、共有結合Ｃ３ｂ及びＣ３ｍｅｔの模式図である。（Ａ）血清中のＣ３分子はα鎖１本とβ鎖１本から構成される。（Ｂ）α鎖は活性化後に微生物表面に共有結合することができる内部チオエステル部位を含む。（Ｃ）Ｃ３をメチルアミンで処理すると、チオエステルと共有結合する。

【図12】Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが外膜蛋白質ＵｓｐＡ１及びＡ２により補体系の古典経路と代替経路を阻害することを示す。（Ａ）Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４野生型（ｗｔ）、ΔｕｓｐＡ１、ΔｕｓｐＡ２又はΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体を１０％ ＮＨＳの存在下でインキュベートした。（Ｂ）ＥＤＴＡ又はＭｇ−ＥＧＴＡを添加した１０％ ＮＨＳの存在下でΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体をインキュベートした。指定時点で細菌を採取した。一晩インキュベーション後、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を計数した。実験開始時の細菌数を１００％とした。３回の別々の実験の平均値を示し、誤差線はＳ．Ｄ．を表す。（Ａ）ΔｕｓｐＡ１、ΔｕｓｐＡ２又はΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体の５分後の平均値は野生型と有意差があった（Ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体の５分後とＭｇ−ＥＧＴＡの存在下でインキュベートしたΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体の１０分後の平均値は野生型と有意差があった（Ｐ＜０．０５）。

【図13】Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが補体活性化から独立して血清中のＣ３と結合することを示す。Ｃ３と（Ａ）Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４又は（Ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの結合を示すフローサイトメトリープロファイルを示す。細菌をＮＨＳ又はＥＤＴＡで前処理したＮＨＳと共にインキュベートした。その後、ウサギ抗ヒトＣ３ｄ ｐＡｂと二次層としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギｐＡｂを加えた後にフローサイトメトリー分析した。ＮＨＳの不在下で且つ両者ｐＡｂの存在下の細菌をバックグラウンド蛍光とした。３回のうちの１回の代表的実験を示す。

【図14】Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓがメチルアミンで処理した精製Ｃ３と用量依存的に非共有的に結合し、結合がイオン相互作用によることを示す。（Ａ）Ｃ３ｍｅｔ濃度の増加に伴う結合を示すフローサイトメトリープロファイルを示す。（Ｂ）パネル（Ａ）の各プロファイルの平均蛍光強度（ｍｆｉ）を示す。（Ｃ）ＲＨ４のＣ３ｍｅｔ結合はＮａＣｌ濃度の増加と共に低下する。細菌を指定通りにＮａＣｌの存在下又は不在下でＣ３ｍｅｔと共にインキュベートした。Ｃ３ｍｅｔ結合を図３に記載したようにフローサイトメトリーにより測定した。誤差線はＳＤを表す。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。

【図15】Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４野生型及びＵｓｐＡ１／Ａ２欠損突然変異体のフローサイトメトリープロファイルがＵｓｐＡ１／ＵｓｐＡ２依存的Ｃ３ｍｅｔ／Ｃ３結合を示すことを例証する。野生型臨床株（Ａ，Ｆ，Ｋ）と、蛋白質ＭＩＤ（Ｂ，Ｇ，Ｌ）、ＵｓｐＡ１（Ｃ，Ｈ，Ｍ）、ＵｓｐＡ２（Ｄ，Ｉ，Ｎ）又はＵｓｐＡ１とＵｓｐＡ２の両者（Ｅ，Ｊ，Ｏ）を欠損する対応する突然変異体のプロファイルを示す。細菌をＣ３ｍｅｔ（Ａ−Ｅ）、ＮＨＳ−ＥＤＴＡ（Ｆ−Ｊ）又はＮＨＳ（Ｋ−Ｏ）と共にインキュベートし、図３に概説したように検出した。プロファイル毎に３回の実験のうちの典型的な１回と平均蛍光強度（ｍｆｉ）を示す。

【図16】Ｃ３ｍｅｔは精製組換えＵｓｐＡ２^{３０−５３９}と結合するが、ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}とは弱いＣ３ｍｅｔ結合しか観察されないことを示す。更に、ＵｓｐＡ２のＣ３ｍｅｔ結合領域はアミノ酸残基２００〜４５８に位置することが分かった。（Ａ）組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}をニトロセルロース膜に固定化した。膜に［^１２５Ｉ］標識Ｃ３ｍｅｔを加えて一晩インキュベートし、増感紙を使用して結合した蛋白質をＰｅｒｓｏｎａｌ ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で視覚化した。組換え蛋白質ＭＩＤ^{９６２−１２００}を陰性対照として加えた。（Ｂ）ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}、ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}及び一連のトランケート型ＵｓｐＡ２蛋白質をマイクロタイタープレートにコートし、Ｃ３ｍｅｔを加えてインキュベートした後に、ヤギ抗ヒトＣ３ ｐＡｂ及びＨＲＰ標識抗ヤギｐＡｂを加えてインキュベートした。３回の実験の平均値を示す。全サンプルからバックグラウンド結合を差し引いた。誤差線はＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。

【図17】血清に組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}を添加すると、代替経路によるＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのＣ３ｂ付着及び殺傷が阻害されることを示す。フローサイトメトリープロファイルは（Ａ）ＮＨＳもしくは組換え（ｒｅｃ．）ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}と共にプレインキュベートしたＮＨＳ、又は（Ｂ）ＮＨＳ−Ｍｇ−ＥＧＴＡもしくはＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}と共にプレインキュベートしたＮＨＳ−Ｍｇ−ＥＧＴＡと共にインキュベーション後のＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２へのＣ３ｂ付着を示す。各種ＮＨＳ組み合わせの添加後、図１３に記載したように細菌を分析した。（Ｃ）ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２を１０％ ＮＨＳ又はＮＨＳ−Ｍｇ−ＥＧＴＡと共にインキュベートした。阻害のために、細菌の添加前にＮＨＳ−Ｍｇ−ＥＧＴＡを１００ｎＭ ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及び／又はＵｓｐＡ２^{３０−５３９}と共にインキュベートした。指定時点で細菌を採取した。実験開始時の細菌数を１００％とした。３回の別々の実験の平均値を示し、誤差線はＳ．Ｄ．を表す。組換え蛋白質と共にプレインキュベートしたΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体の１０分、２０分及び３０分時点の結果はＭｇ−ＥＧＴＡ単独の存在下でインキュベートしたΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体と有意差があった（Ｐ＜０．０５）。

【図18】組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}が代替経路の阻害によりウサギ赤血球の溶血を低下させることを示す。ＮＨＳを１００ｎＭ ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及び／又はＵｓｐＡ２^{３０−５３９}の存在下又は不在下に３７℃で３０分間インキュベートした。その後、指定濃度のＮＨＳをウサギ赤血球に加えた。３０分間インキュベーション後、懸濁液を遠心し、上清を分光分析法により測定した。各実験の最大溶血を１００％とした。３回の別々の実験の平均値を示し、誤差線はＳ．Ｄ．に対応する。２、３及び４％のＮＨＳ濃度でＮＨＳ＋ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}及びＮＨＳ＋ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}／ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}で得られた結果はＮＨＳ対照と有意差があった（Ｐ＜０．０５）。

【図19A】ＵｓｐＡ１の異なる部分のホモロジーを示すために、８種の異なる株のＵｓｐＡ１のパイルアップ分析を示す。

【図19B】ＵｓｐＡ１の異なる部分のホモロジーを示すために、８種の異なる株のＵｓｐＡ１のパイルアップ分析を示す。

【図19C】ＵｓｐＡ１の異なる部分のホモロジーを示すために、８種の異なる株のＵｓｐＡ１のパイルアップ分析を示す。

【図19D】ＵｓｐＡ１の異なる部分のホモロジーを示すために、８種の異なる株のＵｓｐＡ１のパイルアップ分析を示す。

【図20A】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20B】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20C】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20D】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20E】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20F】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20G】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20H】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20I】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図20J】ＵｓｐＡ２の異なる部分のホモロジーを示すために、１３種の異なる株のＵｓｐＡ２のパイルアップ分析を示す。

【図21】厳密なマッチ数と領域アラインメント長の比として計算したＦｏｒｓｇｒｅｎ配列で同定された領域の％一致度を示し、領域アラインメントは上記全アラインメントのうちのＦｏｒｓｇｒｅｎ領域を含む部分である。

【発明を実施するための形態】

【0086】

材料と方法
Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとフィブロネクチンの相互作用
細菌株及び培養条件
臨床Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株のソースを表７に示す。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８及びＲＨ４突然変異体は先に文献に記載したように構築した［２３，５８］。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株はブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）液体ブロス又はＢＨＩ寒天プレートで３７℃にて常法により培養した。ＵｓｐＡ１欠損突然変異体はクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１．５μｇ／ｍｌを添加したＢＨＩで培養し、ＵｓｐＡ２欠損突然変異体はゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）７μｇ／ｍｌの存在下でインキュベートした。二重突然変異体の増殖にはクロラムフェニコールとゼオシンの両方を使用した。

【0087】

【表7】

注：株Ｃ１０、Ｒ４はｕｓｐＡ１遺伝子を欠損しており、Ｆ１６、Ｒ１４、Ｚ１４はｕｓｐＡ２遺伝子を欠損していた［１０］。その他の株はｕｓｐＡ１及びＡ２遺伝子の両方を含んでいた（データは示せず）。

【0088】

ＤＮＡ法
ｕｓｐＡ１、Ａ２及びＡ２Ｈ遺伝子の有無が不明であった株でこれらの遺伝子の存在を検出するために、Ｍｅｉｅｒら［５０］により記載されているようなプライマーとＰＣＲ条件を使用した。ＲＨ４及びＢＢＨ１８の夫々のｕｓｐＡ１及びｕｓｐＡ２遺伝子のＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}５’及び３’プライマーを使用して部分的配列決定を実施した。アミノ酸残基「ＤＱＫＡＤＩＤＮＮＩＮＮＩＹＥＬＡＱＱＱＤＱＨＳＳＤＩＫＴＬＫ」の存在の確認もＰＣＲにより実施し、その場合には、この配列の５’末端からデザインしたプライマー（５’−ＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧ−３’）とＭｅｉｅｒら［５０］により記載されているようなｕｓｐＡ１及びＡ２の３’プライマーを使用した。

【0089】

組換え蛋白質構築及び発現
その疎水性Ｃ末端を欠損する組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}については最近文献に記載している［５８］。ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を使用してＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ Ｂｃ５からゲノムＤＮＡを抽出した。更に、ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}をカバーする多重領域に対応する組換え蛋白質も同一方法により構築した。使用したプライマーを表８に示す。全構築物を標準方法に従って配列決定した。組換え蛋白質の発現及び精製は先に文献に記載したように実施した［５９］。天然条件の製造業者の指示に従ってニッケル樹脂を充填したカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して蛋白質を精製した。組換え蛋白質は先に文献に記載したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した［２１］。

【0090】

【表8】

【0091】

抗体
ウサギ抗ＵｓｐＡ１／Ａ２ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）については最近文献に詳細に記載している［５８］。使用した他の抗体はウサギ抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂ、ブタＦＩＴＣ標識抗ウサギｐＡｂ、ブタ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギｐＡｂ及びマウス抗ヒトＣＤ５４（ＩＣＡＭ１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とした。抗体はＤａｋｏｐａｔｔｓ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，デンマーク）から入手した。

【0092】

フローサイトメトリー分析
ＵｓｐＡ１／Ａ２蛋白質発現とＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのフィブロネクチン結合能はフローサイトメトリーにより分析した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ野生型株及びＵｓｐＡ１／Ａ２欠損突然変異体を一晩増殖させ、３％魚ゼラチンを添加したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−ゼラチン）で２回洗浄した。次に細菌（１０^８）を抗ＵｓｐＡ１／Ａ２抗血清又はフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５μｇと共にインキュベートした。次に洗浄し、（製造業者の指示に従って希釈した）ＦＩＴＣ標識抗ウサギｐＡｂと共に室温で３０分間又は（先にフィブロネクチンを加えた場合には）ウサギ抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂの１００倍希釈液と共に室温で３０分間インキュベートした後、ＦＩＴＣ標識抗ウサギｐＡｂと共にインキュベートした。更に３回洗浄後、細菌をフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ，ＸＬ−ＭＣＬ，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）により分析した。全インキュベーションは最終容量１００μｌのＰＢＳ−ゼラチン中で実施し、洗浄は同一緩衝液で実施した。抗フィブロネクチンｐＡｂとＦＩＴＣ標識抗ウサギｐＡｂを各分析株の陰性対照として別々に加えた。フィブロネクチン阻害試験はＵｓｐＡフラグメント０．２５μｍｏｌをフィブロネクチン２μｇと共に１時間プレインキュベートした後にＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細菌（１０^８）と共にインキュベートすることにより実施した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと結合した残留遊離フィブロネクチン量を上記に概説したようにフローサイトメトリーにより測定した。

【0093】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと固定化フィブロネクチンの結合
ガラススライドにフィブロネクチン（１ｍｇ／ｍｌ）の３０μｌアリコートをコートし、室温で風乾した。ＰＢＳで１回洗浄後、予め冷却しておいた後期対数期の細菌（６００ｎｍの光学密度（ＯＤ）＝０．９）を入れたシャーレでスライドをインキュベートした。室温で２時間後、ガラススライドをＰＢＳで１回洗浄した後、グラム染色した。

【0094】

蛋白質標識及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
フィブロネクチンはクロラミンＴ法［２１］により高比活性（蛋白質１モル当たりヨウ素０．０５モル）まで^１２５ヨウ素標識した（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株ＢＢＨ１８及びＲＨ４とその対応する突然変異体は固体培地で一晩増殖させ、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したＰＢＳで洗浄した。２％ ＢＳＡを添加したＰＢＳ中、^１２５Ｉ標識フィブロネクチン（１６００ｋｃｐｍ／サンプル）と共に細菌（１０^８）を３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋２％ ＢＳＡで３回洗浄後、細菌に結合した^１２５Ｉ標識フィブロネクチンをガンマカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。

【0095】

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ；Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）に７５ｍＭ炭酸ナトリウム，ｐＨ９．６中４０ｎＭ精製組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}蛋白質を４℃で一晩コートした。プレートを洗浄用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．５）で４回洗浄し、３％魚ゼラチンを添加した洗浄用緩衝液で２時間室温にてブロッキングした。更に４回洗浄後、（洗浄用緩衝液中）１．５％魚ゼラチンで３倍系列希釈したフィブロネクチン（１２０μｇ／ｍｌ）を加えてウェルを１時間室温にてインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ウサギ抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂを加えて１時間インキュベートした。更に洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂを加え、１時間室温でインキュベートした。１．５％魚ゼラチンを添加した洗浄用緩衝液で抗ヒトフィブロネクチンとＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂの両者を１，０００倍に希釈した。ウェルを４回洗浄し、プレートを展開し、ＯＤ_４５０を測定した。ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}をカバーするトランケート型蛋白質のＥＬＩＳＡは夫々８０μｇ／ｍｌ及び１２０μｇ／ｍｌの一定用量のフィブロネクチンを用いて実施した。

【0096】

細胞株接着阻害アッセイ
１０％胎仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及びゲンタマイシン１２μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）でＣｈａｎｇ結膜細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２０．２）を培養した。接着阻害実験の前日に細胞を回収し、ゲンタマイシン非添加ＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、ゲンタマイシン非添加培地２００μｌ中細胞１０^４個／ウェルの終濃度で９６ウェル組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）に加えた。その後、５％ ＣＯ_２及び９５％空気の加湿雰囲気で細胞を一晩３７℃にてインキュベートした。実験日に、フィブロネクチン結合領域（ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}）を含む組換えＵｓｐＡ１／Ａ２トランケート型蛋白質又はウサギ抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂ（５０倍希釈）の濃度を増加しながら１時間プレインキュベートすることによりＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ接着の阻害を実施した。フィブロネクチンと結合しない組換え蛋白質（ＵｓｐＡ１^{４３３−５８０}及びＵｓｐＡ２^{３０−１７７}）を対照として使用した。Ｃｈａｎｇ上皮細胞はＩＣＡＭ１を発現することが知られている［１８］。そこで、抗ＩＣＡＭ１抗体を使用して抗フィブロネクチン抗体の阻害作用が立体障害の二次作用であるか否かを調べた。次に、ＰＢＳ−ゼラチン中のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４（１０^６）をコンフルエントな単層に接種した。全実験で、組織培養プレートは３，０００×ｇで５分間遠心し、５％ ＣＯ_２中、３７℃でインキュベートした。３０分後に、感染させた単層をＰＢＳ−ゼラチンで数回リンスして非接着細菌を除去した後、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン＋０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で処理し、プラスチック支持体からＣｈａｎｇ細胞を遊離させた。その後、ＢＨＩを添加した寒天プレートに得られた細胞／細菌懸濁液を希釈液として播種し、５％ ＣＯ_２中、３７℃で一晩インキュベートした。

【0097】

Ｃｈａｎｇ結膜上皮細胞におけるフィブロネクチン発現の測定
スクレーピングによりＣｈａｎｇ結膜上皮細胞を回収した後にＰＢＳ−ゼラチンに再懸濁した。細胞（１×１０^６／ｍｌ）をウサギ抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂで標識した後に洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ウサギｐＡｂと共にインキュベートした。更に３回洗浄後、細胞を上記に概説したようにフローサイトメトリーにより分析した。

【0098】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとラミニンの相互作用
細菌株及び培養条件
臨床Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株ＢＢＨ１８及びＲＨ４とその対応する突然変異体については先に文献に記載している［５８］。どちらの株もＵｓｐＡ１に比較してＵｓｐＡ２の発現度が比較的高い［５８］。突然変異体は野生型株に比較して等量のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ免疫グロブリンＤ結合蛋白質（ＭＩＤ）を発現した。細菌はブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）ブロス又はＢＨＩ寒天プレートで３７℃にて常法により培養した。ＵｓｐＡ１欠損、ＵｓｐＡ２欠損及び二重突然変異体は文献に記載したように抗生物質を添加したＢＨＩで培養した［５８］。

【0099】

組換え蛋白質構築及び発現
その疎水性Ｃ末端を欠損する組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}を作製した［５８］。更に、ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}をカバーする多重領域に対応する組換え蛋白質も使用した［７８］。

【0100】

抗体
ウサギ抗ＵｓｐＡ１／Ａ２及び抗ＭＩＤポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用した［２２，５８］。ウサギ抗ラミニンｐＡｂはＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）から入手した。ブタ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギｐＡｂはＤａｋｏｐａｔｔｓ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，デンマーク）から入手した。

【0101】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと固定化ラミニンの結合
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ；Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）にＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ９．０中、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫ラミニン（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，米国）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３０μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩コートした。プレートをリン酸緩衝食塩水＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．２（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した後、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．２中２％ ＢＳＡでブロッキングした。次に１００μｌ中Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４及びＢＢＨ１８（１０^８）を加えた後に１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄することにより未結合細菌を除去した。残留結合細菌を抗ＭＩＤ ｐＡｂにより検出した後、ＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂで検出した。プレートを展開し、標準プロトコールに従ってＯＤ_４５０を測定した。

【0102】

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ）に７５ｍＭ炭酸ナトリウム，ｐＨ９．６中４０ｎＭ精製組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}蛋白質を４℃でコートした。プレートを洗浄用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．５）で４回洗浄し、３％魚ゼラチンを添加した洗浄用緩衝液で室温にてブロッキングした。更に洗浄後、（洗浄用緩衝液中）１．５％魚ゼラチンで各種指定希釈倍率に希釈したラミニンを加えてウェルを１時間室温でインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ウサギ抗ラミニンｐＡｂを加えてインキュベートした。更に洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂを加え、室温でインキュベートした。１．５％魚ゼラチンを添加した洗浄用緩衝液で抗ラミニン及びＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂの両者を１，０００倍に希釈した。ウェルを洗浄し、プレートを展開し、ＯＤ_４５０を測定した。未コートウェルに同一のラミニン希釈液を加えてインキュベートし、バックグラウンド対照として使用した。ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}をカバーするトランケート型蛋白質のＥＬＩＳＡは一定用量（２０μｇ／ｍｌ）のラミニンを用いて実施した。

【0103】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣ３及びＣ３ｍｅｔの相互作用
細菌株及び培養条件
臨床Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株と近縁亜種については最近文献に詳細に記載している［２１，５３］。典型的な株であるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ ＣＣＵＧ １５８２１、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＣＵＧ ２５５７０及び２５５７１、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ＣＣＵＧ ４２０８、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ４９６１９、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ３３１５２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１３、並びにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３はＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ（ＣＣＵＧ；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，スウェーデン）、又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）から入手した。表９のその他の株はＭｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｌｍｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，スウェーデンから入手した臨床単離株とした。

【0104】

【表9】

【0105】

各種非モラクセラ種は適当な標準培地で増殖させた。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株はブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）液体ブロス又はＢＨＩ寒天プレートで３７℃にて常法により培養した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８及びＲＨ４突然変異体は先に文献に記載したように作製した［２２，２３，５８］。ＭＩＤ欠損突然変異体はカナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＢＨＩ中で増殖させた。ＵｓｐＡ１欠損突然変異体はクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１．５μｇ／ｍｌを添加したＢＨＩで培養し、ＵｓｐＡ２欠損突然変異体はゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）７μｇ／ｍｌの存在下でインキュベートした。ＵｓｐＡ１／Ａ２二重突然変異体にはクロラムフェニコールとゼオシンの両方を使用した。

【0106】

抗体
完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）で乳化した組換え全長ＵｓｐＡ１（２００μｇ）をウサギに筋肉内免疫し、１８日目と３６日目に不完全フロイントアジュバントに乳化した同一用量の蛋白質をブースター免疫した［２２］。３週間後に採血した。特異性を増すために、標識組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}を固定したセファロースを用いて抗ＵｓｐＡ１抗血清をアフィニティー精製した［５８］。抗血清はＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２に同等に結合したので、抗ＵｓｐＡ１／Ａ２ｐＡｂと命名した。ウサギ抗ヒトＣ３ｄ ｐＡｂとＦＩＴＣ標識ブタ抗ウサギｐＡｂはＤａｋｏｐａｔｔｓ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，デンマーク）から購入し、ヤギ抗ヒトＣ３はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ロバ抗ヤギｐＡｂはＳｅｒｏｔｅｃ（Ｏｘｆｏｒｄ，英国）から入手した。

【0107】

蛋白質及びヨウ素標識
その疎水性Ｃ末端を欠損する組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}の作製については最近文献に記載している［２３］。トランケート型ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２蛋白質はＴａｎら［７８］により詳細に記載されているように作製した。Ｃ３ｂはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。Ｃ３（Ｈ_２Ｏ）は精製Ｃ３の凍結解凍により取得した。Ｃ３ｂ様分子（Ｃ３ｍｅｔ）は精製Ｃ３を１００ｍＭメチルアミン（ｐＨ８．０）の存在下に２時間３７℃でインキュベートした後に１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌで透析することにより作製した。結合試験では、クロラミンＴ法を使用してＣ３ｍｅｔを蛋白質１モル当たり^１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）０．０５モルで標識した［２５］。

【0108】

フローサイトメトリー分析
Ｃ３とＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ及び他の種との結合はフローサイトメトリーにより分析した。細菌を固体培地で一晩増殖させ、２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で２回洗浄した。その後、細菌（１０^８コロニー形成単位；ｃｆｕ）をＰＢＳ−ＢＳＡ中、Ｃ３ｍｅｔ、Ｃ３ｂ、Ｃ３（Ｈ_２Ｏ）、又は１０％ ＮＨＳもしくはＮＨＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡもしくはＮＨＳ＋４ｍＭ ＭｇＣｌ_２＋１０ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｍｇ−ＥＧＴＡ）と共に３０分間３７℃でインキュベートした。洗浄後、細菌を抗ヒトＣ３ｄ ｐＡｂと共に３０分間氷上でインキュベートした後、洗浄し、更に３０分間氷上でＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギｐＡｂと共にインキュベートした。更に３回洗浄後、細菌をフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ，ＸＬ−ＭＣＬ，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）により分析した。全インキュベーションは最終容量１００μｌのＰＢＳ−ＢＳＡ中で実施し、洗浄は同一緩衝液で実施した。抗ヒトＣ３ｄ ｐＡｂとＦＩＴＣ標識抗ウサギｐＡｂを各分析株の陰性対照として別々に加えた。阻害試験では、血清を組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}蛋白質１００ｎＭと共に３０分間３７℃でプレインキュベートした。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣ３の相互作用の特徴を分析するために、濃度を増加しながらＮａＣｌ（０−１．０Ｍ）を細菌とＣ３ｍｅｔに加えた。ＵｓｐＡ１／Ａ２発現を分析するために、細菌（１０^８ｃｆｕ）を抗ＵｓｐＡ１／Ａ２ ｐＡｂと共にインキュベートし、上記のように洗浄した。製造業者の指示に従って希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギｐＡｂを検出に使用した。ＥＤＴＡが外膜蛋白質ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２を破壊しなかったことを確証するために、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓをＥＤＴＡの存在下又は不在下でインキュベートした後にＵｓｐＡ１／Ａ２発現を検出した。ＥＤＴＡはＮＨＳ−ＥＤＴＡ実験で使用した濃度ではＵｓｐＡ１／Ａ２の密度を変化させなかった。

【0109】

血清及び血清殺菌アッセイ
正常ヒト血清（ＮＨＳ）は５人の健常ボランティアから採取した。血液を３０分間室温で凝固させた後、氷上で６０分間インキュベートした。遠心後、血清をプールし、分取し、−７０℃で保存した。古典経路と代替経路の両方を不活性化するために、１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えた。他方、古典経路を不活性化するためにＭｇ−ＥＧＴＡを加えた。Ｃ４ＢＰのα鎖のＣＣＰ１に対するマウスｍＡｂであるｍＡｂ １０４を固定化したＨｉＴｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に新鮮血清を通すことによりＣ４ＢＰを欠損するヒト血清を調製した［４１］。フロースルーを採取し、欠乏血清をアリコートに分けて−７０℃で保存した。Ｂｉｏｒｅｘ ７０イオン交換クロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してＣ１ｑ精製の第１段階［７９］によりＣ１ｑ欠乏血清を得た。得られた血清は正常溶血活性を示した。Ｄ因子及びプロパージン欠損血清はＡｎｄｅｒｓ Ｓｊｏｈｏｌｍ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｕｎｄ，スウェーデン）から寄贈された。０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチン，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１５ｍＭ ＣａＣｌ_２，及び２．５％デキストロースを添加した２．５ｍＭベロナール緩衝液，ｐＨ７．３（ＤＧＶＢ^＋＋）でＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株を希釈した。細菌（１０^３ｃｆｕ）を最終容量１００μｌ中、１０％ ＮＨＳ＋ＥＤＴＡ又はＭｇ−ＥＧＴＡと共にインキュベートした。細菌／ＮＨＳを３７℃でインキュベートし、各種時点で１０μｌアリコートを取り出し、ＢＨＩ寒天プレートに撒いた。阻害試験では、細菌を添加する前に１０％血清を１００ｎＭ組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}蛋白質と共に３０分間３７℃でインキュベートした。

【0110】

ドットブロットアッセイ
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０（１００μｌ）で３倍系列（１．９−１５０ｎＭ）希釈した精製組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}をドットブロット装置によりニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）にスポットした。飽和後、５％粉乳を添加したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに膜を浸して２時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。その後、２％粉乳を添加したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈した５ｋｃｐｍ［^１２５Ｉ］標識Ｃ３ｍｅｔを一晩４℃で加えた。増感紙を使用して結合した蛋白質をＰｅｒｓｏｎａｌ ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で視覚化した。

【0111】

表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ）
ＵｓｐＡ１／２とＣ４ＢＰの相互作用について最近文献［５８］に記載したように、ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}又はＵｓｐＡ２^{３０−５３９}とＣ３の相互作用を表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００；Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）により更に分析した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）により提供される定常状態親和性モデルを使用して濃度に対してプロットした平衡状態の応答を示す結合曲線からＫ_Ｄ（平衡解離定数）を計算した。

【0112】

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ；Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）に精製組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}、ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}、又はトランケート型ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２フラグメント（７５ｍＭ炭酸ナトリウム，ｐＨ９．６中４０ｎＭ）の３種類を４℃で一晩コートした。プレートを洗浄用緩衝液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したＰＢＳ，ｐＨ７．２）で４回洗浄し、１．５％オボアルブミンを添加した洗浄用緩衝液（ブロッキングバッファー）で２時間室温にてブロッキングした。洗浄後、ブロッキングバッファーで希釈したＣ３ｍｅｔ ０．２５μｇをウェルに加えて一晩４℃でインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈したヤギ抗ヒトＣ３を加えて１時間室温でインキュベートした。更に洗浄後、ＨＲＰ標識ロバ抗ヤギｐＡｂを更に１時間室温で加えた。ウェルを４回洗浄し、プレートを展開し、ＯＤ_４５０を測定した。

【0113】

溶血アッセイ
０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチン，７ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，及び２．５％デキストロースを添加した氷冷２．５ｍＭベロナール緩衝液，ｐＨ７．３（Ｍｇ^＋＋ＥＧＴＡ）でウサギ赤血球を３回洗浄し、０．５×１０^９個／ｍｌの濃度で再懸濁した。Ｍｇ^＋＋ＥＧＴＡで希釈した各種濃度（０〜４％）の血清を赤血球に加えてインキュベートした。３７℃で１時間後、赤血球を遠心し、４０５ｎｍで遊離ヘモグロビンの分光光度測定により溶解赤血球量を測定した。ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２で阻害するために、１０％血清を１００ｎＭ組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及び／又はＵｓｐＡ２^{３０−５３９}蛋白質の存在下に３０分間３７℃でプレインキュベートした後に、０〜４％で赤血球に添加した。

【0114】

多形核白血球の単離と貪食作用
ｍａｃｒｏｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｌｉｎｋ ＡＢ，Ｕｐｐｌａｎｄｓ Ｖａｓｂｙ，スウェーデン）を使用して健常ボランティアの新鮮血からヒト多形核白血球（ＰＭＮ）を単離した。ＰＭＮを１０分間３００ｇで遠心し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，スコットランド）に再懸濁した。細胞懸濁液（０．５×１０^８）を３％ ＮＨＳもしくはＮＨＳ−ＥＤＴＡ、又は精製Ｃ３ｍｅｔ ２０μｇで１５分間３７℃にてオプソニン化した。洗浄後、１０：１の細菌／ＰＭＮ比で細菌をＰＭＮ（１×１０^７個／ｍｌ）と混合した後、振盪下に３７℃でインキュベートした。０分間、３０分間、６０分間及び１２０分間インキュベーション後の生存細菌を生菌数により測定した。貪食されたＮＨＳ処理細菌数をＮＨＳの不在下で貪食された細菌数に比較した。ＮＨＳでオプソニン化したＳ．ａｕｒｅｕｓを陽性対照として使用した。

【0115】

実施例及び結果
Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとフィブロネクチンの相互作用
ＵｓｐＡ１及びＡ２を欠損するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは可溶性又は固定化フィブロネクチンと結合しない。

【0116】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ臨床株のランダム群（ｎ＝１３）（表７）を選択し、そのＵｓｐＡ１／Ａ２発現との相関においてフィブロネクチン結合をフローサイトメトリーにより試験した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）が高い場合にＵｓｐＡ１／Ａ２発現強度が高いものとみなし、ＵｓｐＡ１／Ａ２発現に相関させた（ピアソン相関係数０．７７，Ｐ＜０．０５）（図１Ａ）。しかし、本発明の抗ＵｓｐＡ１／Ａ２ ｐＡｂでＵｓｐＡ１及びＡ２発現を区別することはできなかった。更に、本試験で使用した株にｕｓｐＡ２Ｈ遺伝子は検出されなかったので、ＵｓｐＡ２Ｈ蛋白質の存在は結合に寄与しないと思われる（データは示せず）。

【0117】

２種のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ単離株（ＢＢＨ１８及びＲＨ４）とＵｓｐＡ１、ＵｓｐＡ２又は両者蛋白質を欠損するその特異的突然変異体もフローサイトメトリーにより分析した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８はフィブロネクチンと強く結合し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は９６．１であった（図１Ｆ）。他方、ＢＢＨ１８ΔｕｓｐＡ１はフィブロネクチン結合の低下を示し、ＭＦＩは６８．６であった（図１Ｇ）。ＢＢＨ１８ΔｕｓｐＡ２及び二重突然変異体ＢＢＨ１８ΔｕｓｐＡ１／Ａ２とフィブロネクチンの結合は夫々ＭＦＩが１０．７及び１１．５に過ぎないことが判明した（図１Ｈ，１Ｊ）。臨床株Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４のＵｓｐＡ１／Ａ２突然変異体でも同様の結果が得られた。これらの結果をまとめると、ＵｓｐＡ１及びＡ２はフィブロネクチンと結合し、細菌のフィブロネクチン結合能はＵｓｐＡ１／Ａ２発現に強く依存すると予想された。

【0118】

フィブロネクチンとＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの相互作用を更に分析するために、^１２５Ｉ標識フィブロネクチンを加え、２種の臨床Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ単離株（ＢＢＨ１８及びＲＨ４）と夫々の突然変異体をインキュベートした。野生型Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４は^１２５Ｉ−フィブロネクチンと強く結合し、対応するΔｕｓｐＡ１突然変異体は野生型の８０％の結合を示した。他方、ΔｕｓｐＡ２及び二重突然変異体は^１２５Ｉ−フィブロネクチンとの結合が夫々１４％及び１２％であり、バックグラウンドレベル（５．０〜１０％）を僅かに上回るだけであった（図２）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８と対応するＵｓｐＡ１／Ａ２突然変異体でも同様の結果が得られた。以上の結果から、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと可溶性フィブロネクチンの結合を最大にするためにはＵｓｐＡ１及びＡ２の両方が必要であると予想される。

【0119】

細菌と固定化フィブロネクチンの結合を更に検討するために、フィブロネクチンをコートしたガラススライドにＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４とその対応するΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体をスポットした。２時間インキュベーション後、スライドを洗浄した後、グラム染色した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ野生型及びΔｕｓｐＡ１突然変異体はフィブロネクチンをコートしたガラススライドに強く接着することが分かった（図３Ａ及び３Ｂ）。他方、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓΔｕｓｐＡ２及びΔｕｐＡ１／Ａ２二重突然変異体はフィブロネクチンをコートしたガラススライドとの接着が弱く、洗浄後に数個の細菌しか残らなかった（夫々図３Ｃ及び３Ｄ）。別のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ臨床単離株（ＢＢＨ１８）とその突然変異体による実験も同様の結果を示し、ＵｓｐＡ２はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと固定化フィブロネクチンの結合に特に重要であることが分かった。

【0120】

フィブロネクチン結合領域はＵｓｐＡ１の２９９〜４５２とＵｓｐＡ２の１６５〜３１８に位置するアミノ酸残基を含む。

【0121】

ＵｓｐＡ１及びＡ２とフィブロネクチンの相互作用を更に分析するために、トランケート型ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}を大腸菌で組換えにより作製し、マイクロタイタープレートにコートし、フィブロネクチン濃度を増加しながらインキュベートした。結合したフィブロネクチンを抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂで検出した後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギｐＡｂを加えてインキュベートした。組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}はいずれも可溶性フィブロネクチンと結合し、相互作用は用量依存的であった（図４）。

【0122】

ＵｓｐＡ１のフィブロネクチン結合領域を決定するために、全長ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}分子をカバーする組換え蛋白質を作製した。フィブロネクチンを固定化ＵｓｐＡ１蛋白質フラグメントと共にインキュベートし、相互作用をＥＬＩＳＡにより定量した。ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}はＵｓｐＡ１^{５０−７７０}とほぼ同等効率でフィブロネクチンと結合し、結合領域が蛋白質のこの部分に含まれることが示唆された。他のトランケート型フラグメントでは、ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}が高い効率でフィブロネクチンと結合した（図５Ａ）。同時に、フィブロネクチンとアミノ酸ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}を含む数個の組換えＵｓｐＡ２フラグメントの相互作用も分析した。２個のフラグメントＵｓｐＡ２^{１０１−３１８}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}はフィブロネクチンと強く結合した（図５Ｂ）。以上の結果から、結合領域はＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}に存在する残基を含むことが極めて明白である。これらの２個の結合フラグメントの配列比較の結果、３１個のアミノ酸残基「ＤＱＫＡＤＩＤＮＮＩＮＮＩＹＥＬＡＱＱＱＤＱＨＳＳＤＩＫＴＬＫ」がｕｓｐＡ１及びＡ２で一致していることが判明した（図６）。更に、この反復配列はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８及びＲＨ４のｕｓｐＡ１及びＡ２遺伝子にも検出された（データは示せず）。

【0123】

ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}及びＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}フラグメントはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとフィブロネクチンの結合を競合的に阻害する。

【0124】

ＵｓｐＡ１／Ａ２のフィブロネクチン結合領域に関する上記結果を更に確証するために、フィブロネクチンとＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの結合を阻害する能力について組換えトランケート型ＵｓｐＡ１蛋白質を試験した。フィブロネクチン（２μｇ）を組換えＵｓｐＡ１フラグメント０．２５μｍｏｌと共にプレインキュベートした後にＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと共にインキュベートした。最後に、ＵｓｐＡ依存的なＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとフィブロネクチンの結合をフローサイトメトリーにより測定した。ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}及びＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}と共にプレインキュベートした結果、フィブロネクチン結合度は低下し、ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}では９５％低下し、ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}では６３％低下した（図７）。フィブロネクチンをトランケート型ＵｓｐＡ２^{１０１−３１８}と共にプレインキュベートした場合には、５０％の阻害が得られた。

【0125】

従って、ＵｓｐＡ１及びＡ２のフィブロネクチン結合領域はフィブロネクチンとＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの相互作用を阻害する。

【0126】

ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣｈａｎｇ上皮細胞の接着を阻害する。

【0127】

上皮細胞はフィブロネクチンを発現することが知られており、多くの細菌は細胞性フィブロネクチンを介して上皮細胞に付着する［４６，５４，６９，７７］。従来の研究によると、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは上皮細胞と接着することが分かっている［４３，４９］。本実施例では呼吸器病原菌の接着実験で頻用されているＣｈａｎ結膜細胞を分析した。フローサイトメトリー分析によると、Ｃｈａｎｇ細胞はフィブロネクチンを高度に発現した（図８Ａ）。

【0128】

ＵｓｐＡ依存的フィブロネクチン結合が細菌接着に重要であるか否かを分析するために、Ｃｈａｎｇ上皮細胞を抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂ、又は組換え蛋白質ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}と共にプレインキュベートした。その後、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４を加え、細菌接着を分析した。ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}、ＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}、又は抗ヒトフィブロネクチンｐＡｂ ０．４μｍｏｌ／２００μｌの存在下のプレインキュベーション後の（コロニー形成単位数により測定した）相対接着率は夫々３６％、３５％及び３２％であった。組換えペプチドの濃度を増加しても、阻害率は増加しなかった。他方、非フィブロネクチン結合フラグメントＵｓｐＡ１^{４３３−５８０}及びＵｓｐＡ２^{３０−１７７}はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣｈａｎｇ上皮細胞の相互作用を阻害しなかった（図８Ｂ）。従って、Ｃｈａｎｇ上皮細胞表面のフィブロネクチンはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの受容体として機能すると思われ、ＵｓｐＡ１の２９９〜４５２位及びＵｓｐＡ２の１６５〜３１８位のアミノ酸残基は相互作用に関与するリガンドを含む。

【0129】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとラミニンの相互作用
Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＵｓｐＡ１及びＡ２を介してラミニンと結合する。

【0130】

２種の臨床Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ単離株（ＢＢＨ１８及びＲＨ４）と、ＵｓｐＡ１、ＵｓｐＡ２又は両者蛋白質を欠損するその特異的突然変異体を全細胞ＥＬＩＳＡにより分析した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４は固定化ラミニンと強く結合した（図９Ａ）。他方、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ ｕｓｐＡ１突然変異体（ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１）は野生型の８９．９％のラミニン結合度を示した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ ｕｓｐＡ２突然変異体（ＲＨ４ΔｕｓｐＡ２）と二重突然変異体ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２は夫々野生型の１５．２％及び１８．１％の結合能であった。これはＢＳＡをコートしたプレートの残留接着と有意差がなかった。臨床株Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８に由来するＵｓｐＡ１／Ａ２突然変異体でも同様の結果が得られた。これらの２種の株（ＢＢＨ１８及びＲＨ４）において、ＵｓｐＡ２はＵｓｐＡ１よりも優先的に発現される蛋白質であるので、野生型とＲＨ４ΔｕｓｐＡ１の結合度の差が最小であることを説明できる。以上の結果をまとめると、ＵｓｐＡ１及びＡ２はラミニンと結合したことが明らかである。

【0131】

ＵｓｐＡ１／Ａ２とラミニンの結合を更に分析するために、トランケート型ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}を大腸菌で作製した。組換え蛋白質をマイクロタイタープレートにコートし、ラミニン濃度を増加しながらインキュベートした。結合したラミニンをウサギ抗ラミニンｐＡｂで検出した後、ＨＲＰ標識抗ウサギｐＡｂを加えてインキュベートした。組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}はいずれも可溶性ラミニンと強く結合し、結合は用量依存的且つ飽和性であった（図９Ｂ）。

【0132】

ラミニン結合領域を決定するために、全長分子をカバーする組換えＵｓｐＡ１及びＡ２を作製した。ラミニンを固定化トランケート型ＵｓｐＡ１及びＡ２フラグメントと共にインキュベートした後、ＥＬＩＳＡにより定量した。ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}はＵｓｐＡ１^{５０−７７０}とほぼ同等効率でラミニンと結合し、結合領域が蛋白質のこの部分に含まれることが示唆された。他方、この領域をカバーする他のトランケート型フラグメントのうちで、ラミニンと結合すると思われる他のフラグメントは皆無であった。Ｎ末端部分であるＵｓｐＡ２^{３０−３５１}は全長蛋白質に比較して４４．７％の結合能を維持することができた。もっと短い蛋白質ＵｓｐＡ２^{３０−１７７}は４３．７％の結合能を示した（図１０Ｂ）。これらの結果から、結合領域はＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２の両者のＮ末端内に存在する残基を含むことが明らかである。

【0133】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣ３及びＣ３ｍｅｔの相互作用
Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ外膜蛋白質ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２は補体カスケードの古典経路と代替経路の両者を阻害する。

【0134】

正常ヒト血清（ＮＨＳ）中でＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが生存するにはＵｓｐＡ２表面発現が不可欠であり［１，５８］、即ちモラクセラＵｓｐＡ２欠損突然変異体はＮＨＳに暴露されると迅速に死滅する。本発明者らはＵｓｐＡ１及びＡ２がいずれもＣ４ＢＰと結合するので補体活性化の古典経路を阻害するらしいということを最近報告している［５８］。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと補体系の相互作用を更に解明するために、ＭｇＣｌ_２を添加したＥＧＴＡ（Ｍｇ−ＥＧＴＡ）又はＥＤＴＡで処理した血清中でＵｓｐＡ１／Ａ２二重突然変異体の生存を試験した。Ｍｇ−ＥＧＴＡは古典経路とレクチン経路を阻害するので、代替経路を別個に分析することができる。他方、ＥＤＴＡは２価カチオン（Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋）を吸収することにより全補体経路を阻害する。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４野生型は３０分間インキュベーション後に生存していたが、ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２二重突然変異体は１０分後に無傷のＮＨＳにより死滅した（図１２）。古典経路を阻害した場合（ＮＨＳ＋Ｍｇ−ＥＧＴＡ）には、ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体はキレート剤を加えないＮＨＳに比較して有意に長時間生存したが、野生型細菌ほど長時間ではなかった。更に、古典経路と代替経路の両者をＥＤＴＡで阻害した場合には、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２は生存した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８単離株とその対応するＢＢＨ１８ΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体でも同様の結果が得られた（図示せず）。同時に、Ｃ１ｑ及びＤ因子／プロパージン欠損血清の実験の結果、古典経路と代替経路はいずれもＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓにより阻害されることが分かった（図示せず）。従って、ヒト気道に定着することが多い病原菌であるＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは外膜蛋白質ＵｓｐＡ１及びＡ２により補体系の古典経路のみならず代替経路をも阻害する。

【0135】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＥＤＴＡで不活化した血清からＣ３を吸収する。

【0136】

Ｃ３ｂは微生物の表面と共有結合するので、代替経路を誘導する（図１１Ｂ）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓがＣ３と相互作用できるか否かを分析するために、ＮＨＳ又はＥＤＴＡで処理したＮＨＳと共に本実施例のＲＨ４野生型株をインキュベートした。Ｃ３とＣ３ｂの両者を認識する抗Ｃ３ｄポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用してフローサイトメトリーによりＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４の細菌表面のＣ３／Ｃ３ｂの（共有結合による）結合又は付着を検出した。無傷の補体を含むＮＨＳと共に細菌をインキュベートすると、Ｃ３が付着した（図１３）。興味深いことに、ＥＤＴＡの存在下で補体カスケードを不活性化しても、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４はＣ３と結合した（図１３Ａ）。比較のために加えたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはＥＤＴＡで処理した血清からＣ３を吸収しなかった（図１３Ｂ）。肺炎球菌とは対照的に、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはこのように補体不活性化とは無関係にＣ３と結合した。Ｃ３の内部チオエステルは流体相でＣ３（Ｈ_２Ｏ）に自発的に加水分解する。従って、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと相互作用する可能性が最も高いＣ３形態は無傷のＣ３又はＣ３（Ｈ_２Ｏ）であった。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＣ４ＢＰとも結合する［５８］ので、Ｃ４ＢＰがＣ３結合に加わるのを避けたいと思い、このために、Ｃ４ＢＰ欠乏血清を使用した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＮＨＳと同程度までＣ４ＢＰ欠乏血清からＣ３を吸収した（図示せず）。

【0137】

Ｃ３ｍｅｔとＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの結合は用量依存的且つ非共有的である。

【0138】

本実験によると、Ｃ３は補体活性化とは無関係にＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの表面に結合するようであった。そこで、非機能的なＣ３変換体がこの細菌と結合できるか否かを分析した。天然Ｃ３をヒト血清から精製し、メチルアミンで処理し、Ｃ３ｂと等価であるが、微生物と共有結合できないＣ３ｍｅｔ分子にＣ３を変換した（図１１Ｃ）。フローサイトメトリー分析の結果、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４野生型株は用量依存的且つ飽和性にＣ３ｍｅｔと高い効率で結合することが判明した（図１４Ａ及びＢ）。Ｃ３ｂとＣ３（Ｈ_２Ｏ）もＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに結合した（図示せず）ので、この相互作用はＣ３分子のＣ３ａ部分を介在していなかった。ＮａＣｌ濃度を増加すると相互作用が低下したので、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４とＣ３ｍｅｔの結合は相当程度までイオン相互作用に依存していた（図１４Ｃ）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８野生型株でも同様の結果が得られた（図示せず）。

【0139】

Ｃ３の結合が全Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株の一般特徴であるか否かを調べるために、臨床単離株のランダム群（ｎ＝１３）を選択し、それらのＣ３ｍｅｔ結合能を分析した。抗Ｃ３ｄ ｐＡｂを用いたフローサイトメトリー分析によると、全Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株はＣ３ｍｅｔと結合することが判明した。ｍｆｉ値は４〜３９であった。他方、比較のために加えたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと大腸菌はＣ３ｍｅｔと結合しなかった。

【0140】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはユニークなＣ３及びＣ３ｍｅｔ結合細菌である。

【0141】

ＮＨＳからの細菌Ｃ３吸収の分析を拡張するために、近縁モラクセラ亜種（ｎ＝１３）と一般的なヒト病原菌（ｎ＝１３）をＮＨＳ−ＥＤＴＡの存在下でインキュベートした。興味深いことに、試験した全細菌種のうちで、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは補体不活性化血清中でＣ３と結合した唯一の細菌であった（表９）。全近縁モラクセラ株と他のヒト病原菌もＣ３ｍｅｔの結合を分析した。Ｃ３結合と同様に、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＣ３ｍｅｔと結合した唯一の種であった。以上の結果をまとめると、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＣ３及びＣ３ｍｅｔと非共有的に強く結合するユニークな特徴をもつ。

【0142】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは外膜蛋白質ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２を介してＣ３ｍｅｔと結合する。

【0143】

Ｃ３結合に関与するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ蛋白質を決定するために、外膜蛋白質ＭＩＤ、ＵｓｐＡ１及び／又はＵｓｐＡ２を欠損する細菌突然変異体群を試験した［２２，５８］。興味深いことに、Ｃ３ｍｅｔの結合はＵｓｐ発現と有意に相関した（図１５）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４Δｍｉｄは野生型対応株と同程度までＣ３ｍｅｔと結合した（図１５Ａ−Ｂ）。ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１突然変異体は結合の低下が僅かであったが、ＲＨ４ΔｕｓｐＡ２は野生型対応株に比較して弱い結合剤であった（図１５Ｃ−Ｄ）。同時に、Ｃ３ｍｅｔと二重ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２突然変異体の結合は完全に消滅した（図１５Ｅ）。更に、ＮＨＳ−ＥＤＴＡを使用して同一実験を実施した処、同一パターンが認められた（図１５Ｆ−Ｊ）。正常ヒト血清を使用した場合には、Ｃ３の共有付着及び結合の混合物であったので、全突然変異体がその表面に同等量のＣ３を示した（図１５Ｋ−Ｏ）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８単離株と対応するＢＢＨ１８突然変異体でも同様の結果が得られた。

【0144】

Ｃ３とＵｓｐＡ１／Ａ２の相互作用を更に分析するために、ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}を大腸菌で作製し、精製した。組換え蛋白質をニトロセネロース膜にドットブロットした後に、ヨウ素で標識したＣ３ｍｅｔと共にインキュベートした。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ外膜蛋白質ＭＩＤに由来する組換えＭＩＤ^{９６２−１２００}［５９］を陰性対照として加えた。ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}とは弱い結合しか検出されなかったが、［^１２５Ｉ］−Ｃ３ｍｅｔはＵｓｐＡ２^{３０−５３９}と強く結合した（図１６Ａ）。これらの結果は表面プラズモン共鳴法（即ちＢｉａｃｏｒｅ）により更に裏付けられた。アミノカップリングを使用してＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}をＣＭ５チップの表面に固定化し、飽和に達するまでＣ３ｍｅｔを注入した。Ｃ３ｍｅｔとＵｓｐＡ２^{３０−５３９}又はＵｓｐＡ１^{５０−７７０}の相互作用のＫ_Ｄは夫々３及び１４μＭであった。結論として、ＵｓｐＡ２はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの主要なＣ３ｍｅｔ結合蛋白質であるが、ＵｓｐＡ１は結合に関与する程度が低いことが分かった。

【0145】

Ｃ３結合領域はＵｓｐＡ２のアミノ酸残基２００〜４５８に位置する。

【0146】

ＵｓｐＡ２のＣ３結合領域を決定するために、全長ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}分子をカバーする組換え蛋白質を作製した。Ｃ３ｍｅｔを固定化全長ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}、ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}及び一連のトランケート型ＵｓｐＡ２蛋白質と共にインキュベートした。その後、相互作用をＥＬＩＳＡにより定量した。ドットブロット実験（図１６Ａ）に一致し、ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}はＥＬＩＳＡでＵｓｐＡ２^{３０−５３９}よりも著しく低い程度にしかＣ３ｍｅｔと結合しなかった（図１６Ｂ）。トランケート型蛋白質フラグメントのうちで、ＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}、ＵｓｐＡ２^{２００−５３９}及びＵｓｐＡ２^{３０２−４５８}はＣ３ｍｅｔと高い効率で結合し、結合領域がアミノ酸残基２００〜４５８に位置することが示唆された。

【0147】

組換えＵｓｐＡ１／Ａ２はＣ３活性を中和する。

【0148】

代替経路のＵｓｐＡ１／Ａ２依存的阻害を詳細に検討するために、１０％ ＮＨＳ又は１００ｎＭ 組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}と共にプレインキュベートしておいた血清と共にインキュベートした細菌で一連のフローサイトメトリー実験を実施した。興味深いことに、ＮＨＳをＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}で前処理した場合にはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２の表面のＣ３付着／結合の有意低下が観察された（図１７Ａ）。古典経路をＭｇ−ＥＧＴＡで阻害した場合にも同様の結果が得られた（図１７Ｂ）。従って、組換え蛋白質ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}はＣ３をＮＨＳから吸収し、Ｃ３の付着／結合を阻害した。

【0149】

組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}によるＣ３の吸収が細菌生存率を増加したか否かを調べるために、ＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}を添加した血清と共に二重突然変異体Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ΔｕｓｐＡ１／Ａ２をインキュベートした後に生存細菌数を測定した。古典経路を阻害するために、Ｍｇ−ＥＧＴＡを反応に加えた。興味深いことに、組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及びＵｓｐＡ２^{３０−５３９}をＮＨＳに加えると、ＵｓｐＡ１／Ａ２欠損Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの死滅が抑制された（図１７Ｃ）。ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}はＵｓｐＡ１^{５０−７７０}に比較して細菌死滅の抑制効率が高かった。両者組換え蛋白質を混合しても、代替経路のそれ以上の阻害は検出されなかった。１０％ ＮＨＳが約６００ｎＭ Ｃ３に対応する。ＵｓｐＡ１分子を増やすとＣ３活性を中和できるか否かを調べるために、６００ｎＭまでのＵｓｐＡ１^{５０−７７０}及び／又はＵｓｐＡ２^{３０−５３９}を加えた。しかし、組換え蛋白質濃度を増加しても、阻害はそれ以上増加しなかった（図示せず）。

【0150】

代替経路の阻害剤としてのＵｓｐＡ１及びＡ２の役割を立証するために、ウサギ赤血球とＮＨＳから構成される代替経路溶血アッセイも実施した。ＮＨＳを組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}、ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}、又は両者蛋白質と共にプレインキュベートした後に赤血球に加えた。１時間インキュベーション後に、赤血球溶解量を測定した。興味深いことに、ＮＨＳをＵｓｐＡ１^{５０−７７０}又はＵｓｐＡ２^{３０−５３９}と共にプレインキュベートした場合には未処理ＮＨＳに比較して溶血の有意低下が観察された（図１８）。ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}又はＵｓｐＡ１^{５０−７７０}の存在下で細菌生存率は上昇した（図１７Ｃ）が、ＮＨＳをＵｓｐＡ１^{５０−７７０}と共にプレインキュベートした場合に比較してＵｓｐＡ２^{３０−５３９}単独の存在下でプレインキュベートしたほうが代替経路の阻害効率は上昇した。結論として、組換えＵｓｐＡ１^{５０−７７０}又はＵｓｐＡ２^{３０−５３９}はそのＣ３結合能により代替経路の活性を阻害した。

【0151】

補体カスケードにおける主要分子であることに加え、付着したＣ３ｂ及びｉＣ３ｂ（不活性化Ｃ３ｂ）はオプソニン貪食作用プロセスで除去するために微生物をターゲットとする。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの表面に非共有的に結合したＣ３又はＣ３ｍｅｔもオプソニンとして機能できるか否かを調べるために、一連の貪食作用実験を実施した。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓをＣ３ｍｅｔ、ＮＨＳ又はＥＤＴＡで処理したＮＨＳと共にプレインキュベートした後に多形核白血球を加えた。興味深いことに、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＣ３ｍｅｔの存在下で貪食されなかったが、ＮＨＳは貪食作用を強く促進した（データは示せず）。他方、ＮＨＳをＥＤＴＡで前処理した場合には、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは多形核白血球により貪食されなかった。従って、Ｃ３／Ｃ３ｍｅｔはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細胞表面で不活性であり、オプソニンとして機能しなかった。

【0152】

考察
Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとフィブロネクチンの相互作用
臨床Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株Ｂｃ５に由来するＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}はフィブロネクチンと結合した最短フラグメントであった。興味深いことに、ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}内に存在するアミノ酸配列を含むもっと長いフラグメントはより効率の高いフィブロネクチンとの結合を示した（図５Ａ及びＢ）。これは、これらの２つの領域が部分的結合領域に相当するか又は結合部位が特定分子構造に高度に依存することを意味すると思われる。ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}とＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}は２３残基「ＮＮＩＮＮＩＹＥＬＡＱＱＱＤＱＨＳＳＤＩＫＴＬ」を含む３１個の共通のアミノ酸残基の配列（ＮＮＩＮＮＩＹ配列）をもつ。この配列は普遍的反応性が存在する防御モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１７Ｃ７のエピトープを含む［２，５０，３０］。マウスモデルでは、ｍＡｂ １７Ｃ７で受動免疫すると、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対する防御が得られ、肺クリアランスが改善された［３０］。従って、最も興味深い点として、ＵｓｐＡ１／Ａ２フィブロネクチン結合領域はこれらの残基を含み、この領域はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ気道感染症の病因に重要であると言える。

【0153】

本実験で使用したフィブロネクチンと結合するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８及びＲＨ４もそのＵｓｐＡ１／Ａ２蛋白質にこれらの３１アミノ酸残基をもつ。大半のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはこの配列（即ちＮＮＩＮＮＩＹ配列）の一部をもつ。しかし、そのＵｓｐＡ２遺伝子にＮＮＩＮＮＩＹをもつＯ３５Ｅ等の株はフィブロネクチンと結合するＵｓｐＡ２蛋白質を発現しない［４９］。その理由として、フランキング領域の変異がフィブロネクチンとの相互作用を変化させていると考えられる。また、保存ＮＮＩＮＮＩＹ配列自体に小さな一塩基アミノ酸置換が生じている可能性もある［２８］。従って、フィブロネクチン結合はＵｓｐＡ１／Ａ２発現だけでなく、各ＵｓｐＡ蛋白質の個々の構成にも依存すると思われる。興味深いことに、接着特性をもつハイブリッドＵｓｐＡ２Ｈ蛋白質［Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＴＴＡ３７及びＯ４６Ｅ）にはほぼ同一のアミノ酸配列が認められる［４３］。このことも３１アミノ酸配列が接着に重要であるという本発明の知見を裏付けている。

【0154】

最後の実験系列では、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣｈａｎｇ結膜細胞の接着をフィブロネクチン結合フラグメント（ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}）により阻害できるか否かを試験した（図８Ｂ）。ＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}、ＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}又は抗フィブロネクチンｐＡｂと共にプレインキュベートした結果、Ｃｈａｎｇ上皮細胞との結合は低下した。これらの結果はＵｓｐＡ１／Ａ２とＣｈａｎｇ上皮細胞の相互作用におけるこれらの結合領域の重要性を確認し、更にフィブロネクチンがＵｓｐＡの重要な受容体であることを示唆している。更に、ＦｎＢＰは未分化及び損傷状態の気道への細菌の接着を助長することが知られている［５４，６９］。肺繊維芽細胞によるフィブロネクチン発現はタバコ煙抽出物によっても増加する［８７］。従って、ＥＣＭフィブロネクチン又は上皮細胞性フィブロネクチンと結合するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ１／Ａ２の役割はＣＯＰＤ患者において非常に重要であり、この患者群におけるＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ感染症の頻発を説明することができる［４０］。

【0155】

結論すると、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＢＢＨ１８、ＲＨ４及びＢｃ５のＵｓｐＡ１／Ａ２は非常に重要なＦｎＢＰであることが分かった。Ｂｃ５に由来する組換えＵｓｐＡ１及びＡ２はいずれもフィブロネクチンと結合し、結合領域は保存ＮＮＩＮＮＩＹ配列を含む共通のアミノ酸残基をもつ。更に、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ１／Ａ２と上皮細胞の相互作用は細胞性フィブロネクチンを介在する。従って、これらのフィブロネクチン結合領域の決定はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対するワクチンの開発を大きく前進させるものである。

【0156】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとラミニンの相互作用
Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＣＯＰＤ患者における感染症増悪の一般的な原因である。ＣＯＰＤ患者におけるこの種の繁殖はアドヘシンのレパートリーが多いことが一因であると思われる。更に、喫煙者ではラミニン層自体が肥厚して基底膜が露出し、上皮完全性の低下等の病的変化が生じる［４］。所定の病原菌はラミニンと結合できることが分かっているので、このような損傷して露出した粘膜表面と接着できると考えられる。このような病原菌としては、特にＳ．ａｕｒｅｕｓやＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等の重大な気道疾患を誘発することが知られている病原菌が挙げられる［７，６３］。

【0157】

本発明者らはＵｓｐＡ１及びＡ２の両者がフィブロネクチンと結合することを最近明らかにした［７８］。フィブロネクチン結合領域はＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}内に位置していた。本試験では、（フィブロネクチン領域を含む）Ｎ末端半分ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}及びＵｓｐＡ２^{３０−３５１}もラミニンと結合した。他方、フィブロネクチンと結合した最小フラグメントであるＵｓｐＡ１^{２９９−４５２}及びＵｓｐＡ２^{１６５−３１８}は容易に検出可能な程度までラミニンと結合しなかった。実際に、ＵｓｐＡ１のＮ末端側半分（ＵｓｐＡ１^{５０−４９１}）よりも小さいフラグメントはその全ラミニン結合能を失い、ＵｓｐＡ２では、全長組換え蛋白質（ＵｓｐＡ２^{３０−５３９}）よりも程度は低いが、ＵｓｐＡ２^{３０−１７０}のみがラミニンと結合した。これらの結果は恐らく分子の部分によって機能的役割が異なることを示唆している。

【0158】

しかし、ＵｓｐＡ１及びＡ２の最小ラミニン結合領域を比較した処、ＵｓｐＡ２^{３０−１７０}及びＵｓｐＡ１^{５０−４９１}のアミノ酸ホモロジーによる類似性は殆どないことが分かった（データは示せず）。両者のＮ末端側半分の一致度は２２％に過ぎないが、どちらの蛋白質も「ロリポップ」形の球形ヘッド構造をもつことが定説である［２，３２］ので、これは意外ではない。三次構造がヘッド領域におけるラミニンとのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用に関与している可能性が高いと予想される。Ｎ末端は最も露出し、ヒト基底膜とｉｎ ｖｉｖｏ接触するので、結合領域がＮ末端に位置するとみなすのは論理的である。

【0159】

組織及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分との接着を媒介する細菌因子は「接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）」と呼ばれる単一ファミリーに一括分類される。ＵｓｐＡ１／Ａ２はフィブロネクチンとラミニンの両者に結合するので、これらの蛋白質はＭＳＣＲＡＭＭＳと言うことができる。本試験の結果から、ＵｓｐＡ１及びＡ２は気道で異なるリガンドと相互作用する異なる領域をもつ多機能アドヘシンであると予想される。ＵｓｐＡ１及びＡ２が構造的に関連するＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａのＹａｄＡ等の他の細菌蛋白質でも同様の広域スペクトル結合プロファイルが報告されている［４５，７０］。ＹａｄＡもフィブロネクチンとラミニンの両者と結合する［３２］。

【0160】

以上をまとめると、ＵｓｐＡ１／Ａ２はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと基底膜糖蛋白質ラミニンの相互作用に不可欠であり、ＣＯＰＤ患者における感染症病因に重要な役割を果たしていることが分かった［７４］。

【0161】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとＣ３及びＣ３ｍｅｔの相互作用
補体抵抗性は最も重要な細菌ビルレンス因子の１つである［６６］。下気道感染症患者に由来するＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ単離株の大半（８９％）は補体による殺傷に抵抗性である［３４］。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ１及びＡ２はヒト血清におけるｉｎ ｖｉｖｏ細菌生存に不可欠であり［１，１５］、これらの２種の外膜蛋白質は古典経路の補体流体相レギュレーターであるＣ４ＢＰと結合することが分かった［５８］。本試験では、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓがＣ３の非共有的結合により代替経路を阻害できることを立証する（図１７及び１８）。Ｃ３の結合は古典経路も阻害する可能性が非常に高い。しかし、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＣ４ＢＰとも結合するので、これを詳細に分析することはできなかった。興味深いことに、数種の近縁モラクセラ亜種と一般的なヒト病原細菌はＣ３と結合しないので、Ｍ．ｃａｔａｒｒｉａｌｉｓ依存的Ｃ３結合はユニークである（表９）。Ｃ３及びメチルアミンで処理したＣ３との相互作用は主にＵｓｐＡ２に媒介され、ＵｓｐＡ１の役割は小さい（図１５及び１６）。ＵｓｐＡ２のＣ３結合領域はアミノ酸残基２００〜４５８に位置していた。この領域はＵｓｐＡ１の１領域に９３％一致する１４０アミノ酸残基配列を含む［２］。他方、この配列類似性にも拘わらず、ＵｓｐＡ１がＣ３と結合する程度は著しく低い。これは蛋白質間の立体配座の固有差に起因すると思われる。ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２のＣ３結合の差はＵｓｐＡ１／Ａ２とＣ４ＢＰの相互作用と対照的である［５８］。

【0162】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは古典経路と代替経路に等しく抵抗性である（図１２Ｂ）。この細菌は古典経路を阻害するＣ４ＢＰと結合し［５８］、本発明では代替経路との相互作用がＣ３の結合を介在することを立証する。これらのメカニズムのうちのどれが各種ｉｎ ｖｉｖｏ状況でＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ血清抵抗性に最も重要であるかを決めるのは困難である。例えば、古典経路の重要度はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ感染暦と補体活性化抗体の産生能に強く依存するであろう。他方、病原菌には補体から防御する全メカニズムが確実に有益である。Ｃ３は補体系における主要分子であるので、Ｃ３の結合が全３種の活性化経路を制御している可能性が非常に高く、血清抵抗性の最大要因であると思われる。

【0163】

一次防御メカニズムとしての補体系の重要性は微生物が補体系の成分を阻害及び／又は中和するための各種ストラテジーを講じているという事実により明らかである［４２，３５，８８］。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ以外に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、大腸菌Ｋ１、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅもＣ４ＢＰと結合する特異的表面分子を発現し、その結果、古典補体経路から細菌を防御する［８，９，５２，５８，６４，６５，８０］。古典経路の阻害に加え、数種の細菌（例えばＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；詳細については［６８，８９］参照）はＨ因子及びＨ因子様分子と結合するので、代替補体経路から部分的に防御される。

【0164】

ＵｓｐＡ１及びＡ２は血清からＣ３を吸収するので補体活性化を阻害する可能性が非常に大きい。同様に、肺炎球菌表面蛋白質（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ（ＰｓｐＡ）もｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両者で代替経路を阻害すると思われる。ＰｓｐＡはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの重要なビルレンス因子である。ＰｓｐＡ欠損肺炎球菌株は血液から容易に除去されるが、ＰｓｐＡを発現する株は生存する［８２］。更に、菌血症のマウスモデルにおいて、ＰｓｐＡ欠損肺炎球菌はＰｓｐＡを発現する肺炎球菌に比較してビルレンスが有意に低い［１１］。ＰｓｐＡ陽性肺炎球菌よりもＰｓｐＡ陰性肺炎球菌に多くのＣ３ｂが付着することが立証されている［６７，８２］。従って、ＰｓｐＡの発現はＣ３ｂによるオプソニン化を制限することにより補体によるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのクリアランスと貪食作用を低下させる［１２，６７］。正常マウスで非毒性のＰｓｐＡ欠損肺炎球菌がＣ３欠損Ｂ因子欠損マウスでは毒性になる［８２］。

【0165】

我々の知る限りでは、Ｃ３と非共有的に結合することにより補体機能を阻害する細菌蛋白質は２例しかない。第１の例はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの細胞外フィブリノーゲン結合蛋白質（Ｅｆｂ）であり、Ｃ３ｂと結合することが分かっている［４４］。Ｅｆｂはチオエステル立体配座に関係なく古典経路と代替経路の両者を阻害し、即ちＣ３ｂとの結合は非共有的である。第２の例は肺炎球菌コリン結合蛋白質（ＣｂｐＡ）であり、メチルアミンで処理したＣ３と結合することが分かっており、補体活性化に依存しない非共有的相互作用であることが示唆される［１６］。ＣｂｐＡは肺炎球菌細胞壁の成分であるが、ＣｂｐＡは分泌されると、Ｃ３のみと結合するらしい。文献で確証されていないこの仮説を試験するために、１１種の異なる肺炎球菌単離株をフローサイトメトリーによりＣ３結合（メチルアミンで処理したＣ３又はＮＨＳ−ＥＤＴＡ）について分析した（図１２Ｂ及び表９）。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの表面に結合したＣ３を検出することはできなかった。メチルアミンで処理したＣ３を使用した後に抗ヒトＣ３ ｐＡｂを使用してＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの溶解液と培養上清をウェスタンブロットで分析した処、Ｃｈｅｎｇら［１６］の結果が確認された（図示せず）。ＥｆｂとＣｂｐＡがどちらもグラム陽性菌により分泌されるＣ３結合蛋白質であることを踏まえると、グラム陰性菌であるＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓはＣ３と結合して細菌表面の代替経路を阻害する膜固定蛋白質をもつユニークな種である。

【0166】

酵母Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓはＣ３ｂ、ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄと結合することが分かっている。しかし、Ｃ３ｂに結合親和性はｉＣ３ｂ及びＣ３ｄよりもかなり低い［２９］。本発明者らはＣ３とＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの結合に大差があり（図示せず）、カンジダ菌はＣ３ｍｅｔと結合した（５６％陽性細胞）が、平均蛍光強度（ｍｆｉ）はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのｍｆｉ ３６．９に比較して＜２．０に過ぎないことを見出した。更に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓをＥＤＴＡで処理した血清と共にインキュベートした処、検出可能な結合は認められなかった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓから２種のＣ３ｄ結合蛋白質が単離されており、最も詳細に特性決定されている蛋白質はヒト補体受容体２（ＣＤ２１）に対する抗体により最初に認識された６０ｋＤａマンノ蛋白質である［１３］。他方、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ１及びＡ２はＣＤ２１に対するポリクローナル抗体により認識されなかった（図示せず）。ブドウ球菌及び肺炎球菌［５２，６４］に加え、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来する分泌型Ｃ３ｄ結合蛋白質も存在する［７２］。最後に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ｉＣ３ｂ受容体は単離されており、ヒトＣＲ３（ＣＤ１１ｂ）と構造的に類似している［３］。これらの受容体が病因に関与するメカニズムは完全には分かっていない。

【0167】

Ｃ３結合病原菌の上記例はこれらの種が血流から単離されることが多いという点でＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと著しく相違する。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは粘膜病原菌であり、菌血症感染例は稀である。従って、Ｃ３との結合とその不活性化は粘膜表面で行われる可能性が高い。これは急性中耳炎等の疾患状態では進行中の強い補体活性化とそれに伴う炎症が生じるという事実により裏付けられる［５７］。補体蛋白質は血漿滲出により粘膜表面に輸送されると考えられる［２６，６２］。例えば幼児からの中耳貯留液（ＭＥＥ）でも非常に高濃度のＣ３産物を検出することができる［５１］。更に、ＭＥＥ液中の補体因子は無莢膜型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ等の他の粘膜病原菌に対する殺菌活性に重要であることが示されている［７５］。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは厳密なヒト病原菌である。この細菌は動物には中耳炎や肺炎等の疾患を誘発しない。マウス肺クリアランスモデルとチンチラ中耳炎モデルが数回使用されている。しかし、中耳炎も肺炎も発症せず、細菌は迅速に除去される［１９，８３］。従って、細菌Ｃ３結合の生物学的意義をｉｎ ｖｉｖｏで試験することは困難である。ＵｓｐＡ１及びＡ２は多機能性蛋白質である［１，１５，３１，４３，５８，７８］ので、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのクリアランスの差をＣ３結合と相関させるのは不可能であると思われる。特に、ＵｓｐＡ１がＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの重要なアドヘシンであり、ＣＥＡＣＡＭ１とフィブロネクチンの両者に結合するという事実［３１，７８］はクリアランスに影響を与える可能性が高い。しかし、中耳炎等の疾患状態における強い補体活性化により、Ｃ３のモラクセラ依存的結合は粘膜防御に対抗する重要な手段であると思われる。

【0168】

Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが数種の手段でヒト免疫系を妨害するという事実は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが気道の非常に一般的な寄生菌である理由を説明するものである［７３］。結論として、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは体液性及び先天性免疫系の両者に対抗する高度な手段を講じている。本データから明らかなように、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは他の細菌種に検出できないユニークな細菌細胞表面へのＣ３結合能をもつ。

【0169】

【表10】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図20E】

【図20F】

【図20G】

【図20H】

【図20I】

【図20J】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]