特許 5763664 有機ジカルボン酸、その塩およびそれらの調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5763664

(24)【登録日】2015年6月19日

(45)【発行日】2015年8月12日

(54)【発明の名称】有機ジカルボン酸、その塩およびそれらの調製方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 231/56 20060101AFI20150723BHJP

   A61K 31/416 20060101ALN20150723BHJP

   A61P 27/12 20060101ALN20150723BHJP

【ＦＩ】

   C07D231/56 E

   !A61K31/416

   !A61P27/12

【請求項の数】5

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2012-538181(P2012-538181)

(86)(22)【出願日】2010年11月12日

(65)【公表番号】特表2013-510802(P2013-510802A)

(43)【公表日】2013年3月28日

(86)【国際出願番号】CN2010078691

(87)【国際公開番号】WO2011057580

(87)【国際公開日】20110519

【審査請求日】2013年8月5日

(31)【優先権主張番号】200910212692.5

(32)【優先日】2009年11月16日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】502041886

【氏名又は名称】▲東▼南大学

【氏名又は名称原語表記】ＳＯＵＴＨＥＡＳＴ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(73)【特許権者】

【識別番号】512127408

【氏名又は名称】南京医科大学

【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＪＩＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(73)【特許権者】

【識別番号】512127419

【氏名又は名称】浙江莎普▲愛▼思▲薬▼▲業▼股▲分▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＳＨＡＰＵＡＩＳＩ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001243

【氏名又は名称】特許業務法人 谷・阿部特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ゴウ シャオフー

(72)【発明者】

【氏名】シェン ホン

(72)【発明者】

【氏名】チャン インディ

(72)【発明者】

【氏名】シェン ジェンピン

(72)【発明者】

【氏名】チュ ヤンチン

(72)【発明者】

【氏名】フェン ルーチョン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ジェンウェイ

(72)【発明者】

【氏名】チェン テカン

【審査官】 早乙女 智美

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６１−２３３６７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−１１２４６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Li Yanyan et al.，Chemical Industry Times，２００６年，20(4)，p. 38-39

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有機ジカルボン酸基を含有する一群の化合物であって、前記化合物の一般構造式は以下に示す通りであり、

【化1】

式中、Ｒは、水素原子、Ｃ_1~3アルキル、Ｃ_1~3アルコキシルまたはハロゲン原子を表す、ことを特徴とする化合物。

【請求項2】

請求項１に記載の有機ジカルボン酸基を含有する化合物のジカルボン酸塩であって、前記ジカルボン酸塩は、前記構造式中の前記ジカルボン酸基と一価のカチオンＭとの反応を経て形成され、式中、Ｍは、Ｎａ⁺、Ｋ⁺またはＮＨ₄⁺を表す
ことを特徴とするジカルボン酸塩。

【請求項3】

請求項１に記載の有機ジカルボン酸基を含有する化合物のジカルボン酸塩であって、前記ジカルボン酸塩は、前記構造式中の前記ジカルボン酸基とアミノ酸との反応を経て形成され、式中、Ａは、アミノ酸を表し、前記アミノ酸は、リジンまたはヒスチジンであり、前記リジンは、Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、またはＬ−リジンとＤ−リジンとからなるラセミ体であり、前記ヒスチジンは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、またはＬ−ヒスチジンとＤ−ヒスチジンとからなるラセミ体である
ことを特徴とするジカルボン酸塩。

【請求項4】

請求項１に記載の有機ジカルボン酸基を含有する化合物を調製するための方法であって、

【化2】

を、アルカリ性条件下でＸＣＨ（ＣＯ₂Ｒ’）₂と反応させて、

【化3】

を得た後、これを、アルカリ性条件下で加水分解し、酸性化することにより、

【化4】

（式中、Ｘは、Ｃｌ原子、Ｂｒ原子またはＩ原子を表し、Ｒは、水素原子、Ｃ_1~3アルキル、Ｃ_1~3アルコキシルまたはハロゲン原子を表し、Ｒ’は、Ｃ_1~4アルキルを表す）、
を得ることを特徴とする方法。

【請求項5】

請求項４に記載の方法であって、１．０モルの

【化5】

を、グリコールジメチルエーテル溶媒中の炭酸カリウム２．５モルの存在下に、１．２モルのＸＣＨ（ＣＯ₂Ｒ’)₂と還流下で反応させ、

【化6】

を得て、これを、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウム溶液中に還流下で加水分解し、次いで、希塩酸によってｐＨ約２に酸性化して、最終的に、

【化7】

（Ｘは、Ｃｌ原子、Ｂｒ原子またはＩ原子を表し、Ｒは、水素原子、Ｃ_1~3アルキル、Ｃ_1~3アルコキシルまたはハロゲン原子を表し、Ｒ’は、Ｃ_1~4アルキルを表す）、
を得ることを特徴とする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、有機ジカルボン酸、その塩およびそれらの調製方法、ならびに、前記塩のいくつかの典型的化合物の水晶体への酸化障害抵抗活性に関する。

【背景技術】

【0002】

白内障は、失明につながる最も一般的な眼病の１つである。白内障が原因の失明は、全世界の盲目者の約４０％を占める。高齢化社会の到来により、老人性白内障の発症率が徐々に増加し、この結果、白内障は、世界中で一般的かつ頻繁に起きる病気となっている。視力を失った水晶体は、手術によって除去して人工水晶体と交換できるが、このような手術の費用は高く、ある種の危険性に直面する可能性がある。したがって、より多くの患者は、視力の喪失を回避して手術を延期または回避するため、初期段階の時点で水晶体の混濁化の進行を遅らせる薬物療法を必要とする。ベンダザックリジンは、白内障に抵抗するある種の効果を有し、アルドース還元酵素阻害剤として使用した場合には、多糖性白内障（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃａｔａｒａｃｔ）に対してある種の治癒力も有すると知られているが、この薬物は、眼に対して刺激性であり、その治癒力は、依然として不十分である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

したがって、新世代の白内障治療用薬物を開発することは必須である。

【課題を解決するための手段】

【0004】

発明の目的
本発明は、有機ジカルボン酸、その塩およびそれらの調製方法を提供し、ここでは、それら化合物は、白内障治療用の薬物として使用することができる。

【0005】

技術的解決法
本発明は、２−（１−ベンジル（または置換ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸を設計および合成するものであり、この酸は、有機二価酸として使用すると、卑金属イオン、アンモニウムイオンまたはアミノ酸と反応して、新規な構造を有する一連の有機マロン酸塩が調製される。本目的は、ヒトの白内障を治療するために必要な弱毒性と、低刺激性と、優れた水溶性と、水晶体の有効な酸化防止活性とを満たすことである。本発明は、新規な構造を有する一群のジカルボン酸およびその塩を開示している。２−（１−ベンジル（または置換ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸を有機ジカルボン酸として使用する際、これらの化合物の構造は、式（１）によって示すことができ、

【0006】

【化1】

【0007】

式中、Ｒは、水素原子、Ｃ_1~3アルキル基、Ｃ_1~3アルコキシルまたはハロゲン原子であり、式（１）で示される化合物は、Ｈ₂Ｌと略記する。

【0008】

式（１）で示される有機二酸が、カチオンＭと反応して塩を形成する場合、この塩は、式（２）によって表すことができ、
Ｍ₂Ｌ 式（２）
式中、Ｍは、一価のカチオン、例えば、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ４⁺などを表す。

【0009】

式（１）で示される有機二酸が、アミノ酸と反応して塩を形成する場合、この塩は、式（３）によって表すことができ、
Ａ₂Ｈ₂Ｌ 式（３）
式中、Ａは、アミノ酸、例えば、リジン（Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、およびＬ−リジンとＤ−リジンとからなるラセミ体を含む）、ヒスチジン（Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、およびＬ−ヒスチジンとＤ−ヒスチジンとからなるラセミ体を含む）などを表す。

【0010】

本発明の別の目的は、式（１）で示される有機ジカルボン酸の調製方法を提供することであり、この酸は、式（４）で示される反応から得ることができ、

【0011】

【化2】

【0012】

式中、Ｘは、Ｃｌ原子、Ｂｒ原子またはＩ原子を表し、Ｒの定義は、式（１）における定義と同一であり、Ｒ’は、Ｃ_1~4アルキル基を表す。これらの有機二価酸の合成では、１−ベンジル（または置換ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−アルコール（Ｓ１と略記する）が、アルカリの存在下に、αハロゲン化マロン酸ジエステルと反応して、２−（１−ベンジル（または置換ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸ジエステル（Ｓ₂と略記する）が得られる。その後、このエステルをアルカリ性条件下で加水分解し、次いで酸性化した後には、対応する有機二価酸（Ｈ₂Ｌ）が得られる。

【0013】

詳細な合成プロセスは、次の通りである。１．０モルのＳ１を、グリコールジメチルエーテル溶媒中の炭酸カリウム２．５モルの存在下に、１．２モルのＸＣＨ（ＣＯ₂Ｒ’）₂と還流下で反応させて、Ｓ２を得て、続いて、Ｓ２を、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウム溶液中に、還流下で加水分解し、次いで、希塩酸によってｐＨ約２に酸性化すると、最終的には、Ｈ₂Ｌが得られる。

【0014】

式（１）で示される有機二価酸（Ｈ₂Ｌ）を、対応するアルカリ、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水などと反応させて、式（２）で示される塩（Ｍ₂Ｌ）を得る。式（１）で示される有機二価酸（Ｈ₂Ｌ）を、対応するアミノ酸、例えば、リジン（Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、およびＬ−リジンとＤ−リジンとからなるラセミ体を含む）、ヒスチジン（Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、およびＬ−ヒスチジンとＤ−ヒスチジンとからなるラセミ体を含む）または他のアミノ酸と反応させて、式（３）で示される塩（Ａ₂Ｈ₂Ｌ）を生成する。

【0015】

本発明において調製した化合物の構造は、赤外スペクトル、プロトン核磁気共鳴スペクトル、有機質量分析法またはエレクトロスプレーイオン化質量分析法などの、様々な分析方法によって確認した。

【発明の効果】

【0016】

有益な効果
本発明は、１種の有機ジカルボン酸、その塩および調製方法を提供し、かつ、水晶体への酸化障害抵抗性を有する、いくつかの典型的な有機ジカルボン酸塩化合物の活性と、既存薬物より低い、眼に対する刺激性と、より良好な治癒力とを開示している。

【発明を実施するための形態】

【0017】

実施形態
本発明を下記の実施形態によってさらに説明するが、本発明は、これらの実施形態に制限されるものではない。

【実施例1】

【0018】

２−（１−ベンジル（または置換ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸エステルの調製
１２ｇ（０．０９０ｍｏｌ）の３−ヒドロキシル−インダゾール（Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、３．９４ｇ（０．０９８ｍｏｌ）の水酸化ナトリウムおよび９０ｍＬの水を、２５０ｍＬの三口ビン中に加え、４０℃で１０分間撹拌し、次いで、０．０９０ｍｏｌの塩化ベンジル（または置換された塩化ベンジル）を滴下によりその中に加え、この混合物を７０℃で２時間、固形物の析出を伴いながら反応させ、ろ過して、ろ過ケーキを水で洗浄し、最終的には、１−ベンジル（または置換ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−アルコールが得られる。

【0019】

４０ｍＬのグリコールジメチルエーテル（溶媒）を、１００ｍＬの四口ビン中に加え、次いで、１−ベンジル（または置換ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−アルコール（１０．５ｍｍｏｌ）および３．６ｇ（２６．１ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムを、四口ビン中に入れて混合する。この混合物を室温で１０分間撹拌し、続いて、３．０ｇ（１２．６ｍｍｏｌ）の臭化ジエチルマロン酸塩（Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を滴下により加え、その後、この混合物を加熱して４時間還流させ、溶液が黄色から赤褐色に変化した後にろ過する。そのろ液を濃縮して、カラムクロマトグラフィー（展開剤：石油エーテル（６０〜９０℃）：酢酸エチル＝１：１）を施すと、下記の生成物を得ることができる。

【0020】

（１）２−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）ジエチルマロン酸塩（Ｓ２−１）
収率：３９％
IR (KBr, cm^-1): 2981 (m), 1768 (s), 1748 (s), 1619 (m), 1235 (s), 744 (m)
EI-MS: 382 [M⁺]
¹HNMR (500MHz, CDCｌ₃), δ (ppm): 1.29〜1.33 (t, 6H, CH₂CH₃), 4.29〜4.33 (dd, 4H, CH₂CH₃), 5.34 (s, 2H, CH₂C₆H₅), 5.77 (s, 1H, CH(COOH)₂), 7.08〜7.83 (m, 9H, 2Ar)
（２）２−［１−（４−メチル−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］ジエチルマロン酸塩（Ｓ２−２）
収率：２９％
IR (KBr, cm^-1): 2985 (w), 1764 (s), 1743 (s), 1617 (m), 1225 (s), 749 (m)
EI-MS: 396 [M⁺]
¹HNMR (500MHz, CDCｌ₃), δ (ppm): 1.28〜1.31 (t, 6H, CH₂CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₂C₆H₄CH₃), 4.29〜4.33 (dd, 4H, CH₂CH₃), 5.36 (s, 2H, CH₂C₆H₄CH₃), 5.79 (s, 1H, CH(COOH)₂), 7.02〜7.80 (m, 8H, 2Ar)
（３）２−［１−（３−フッ素−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］ジエチルマロン酸塩（Ｓ２−３）
収率：５６％
IR (KBr, cm^-1): 2983 (w), 1767 (s), 1748 (s), 1618 (m), 1253 (s), 745 (m)
EI-MS: 400 [M⁺]
¹HNMR (500MHz, CDCｌ₃), δ (ppm): 1.28〜1.33 (t, 6H, CH₂CH₃), 4.27〜4.34 (dd, 4H, CH₂CH₃), 5.33 (s, 2H, CH₂C₆H₄F), 5.76 (s, 1H, CH(COOH)₂), 6.80〜7.83 (m, 8H, 2Ar)
（４）２−［１−（３−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］ジエチルマロン酸塩（Ｓ２−４）
収率：５１％
IR (KBr, cm^-1): 2984 (m), 1735 (s), 1619 (w), 1247 (s), 747 (m)
ESI-MS: 439 [M+Na]^+
1HNMR (500MHz, CDCｌ₃), δ (ppm): 1.28〜1.33 (t, 6H, CH₂CH₃), 4.31〜4.35 (dd, 4H, CH₂CH₃), 5.29 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 5.76 (s, 1H, CH(COOH)₂), 7.02〜7.83 (m, 8H, 2Ar)
（５）２−［１−（４−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］ジエチルマロン酸塩（Ｓ２−５）
収率：１８％
IR (KBr, cm^-1): 2982 (w), 1764 (s), 1740 (s), 1616 (w), 1222 (s), 746 (m)
ESI-MS: 439[M+Na]^+
1HNMR (500MHz, CDCｌ₃), δ (ppm): 1.27〜1.34 (t, 6H, CH₂CH₃), 4.28〜4.32 (dd, 4H, CH₂CH₃), 5.29 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 5.74 (s, 1H, CH(COOH)₂), 7.04〜7.81 (m, 8H, 2Ar)

【実施例2】

【0021】

２−（１−ベンジル（または置換ベンジル）−ｌＨ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸の調製
実施例１から得られたエステル（２．７ｍｍｏｌ）を、それぞれ、水酸化カリウム（５．４ｍｍｏｌ）０．３ｇの水溶液１０ｍｌ中に加え、この混合物を加熱して２時間還流し、続いて、この混合物のｐＨを、１Ｍの塩酸によって２に調節し、沈殿した白色固形物をろ過して、少量の水で洗浄すると、乾燥後に下記の化合物を得ることができる。

【0022】

（１）２−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸（Ｈ₂L¹）
収率：９３％
融点：１８２〜１８６℃（分解）
IR (KBr, cm^-1): 3033 (m), 2934 (m), 1741 (s), 1620 (m), 1257 (s), 746 (m), 711 (m)
ESI-MS: 325 [M-H]^-
1HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.30 (s, 2H, CH₂C₆H₅), 5.36 (s, 1H, CH(COOH)₂), 7.00〜7.73 (m, 9H, 2Ar);
（２）２−［１−（４−メチル−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸（Ｈ₂Ｌ²）
収率：９８％
融点：１４４〜１４６℃
IR (KBr, cm^-1): 3023 (m), 2920 (m), 1755 (s), 1618 (m), 1255 (s), 744 (s), 727 (m)
ESI-MS: 379 [M+K]^+
1HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 2.16 (s, 3H, CH₂C₆H₄CH₃), 5.29 (s, 2H, CH₂C₆H₄CH₃), 5.46 (s, 1H, CH(COOH)₂), 6.97〜7.75 (m, 8H, 2Ar);
（３）２−［１−（３−フッ素−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸（Ｈ₂Ｌ³）
収率：９６％
融点：１３８〜１４０℃
IR (KBr, cm^-1): 3065 (m), 2925 (w), 1732 (s), 1618 (m), 1254 (s), 743 (s)
ESI-MS: 383 [M+K]⁺, 367 [M+Na]⁺, 345 [M+H]^+
1HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.41 (s, 2H, CH₂C₆H₄F), 5.49 (s, 1H, CH(COOH)₂), 6.82〜7.85 (m, 8H, 2Ar);
（４）２−［１−（３−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸（Ｈ₂Ｌ⁴）
収率：９８％
融点：１３７〜１３９℃
IR (KBr, cm^-1): 3063 (m), 2940 (m), 1749 (s), 1619 (m), 1247 (s), 745 (s), 725 (m)
ESI-MS: 399 [M+K]⁺, 361 [M+H]^+
1HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.40 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 5.51(s, 1H, CH(COOH)₂), 7.04〜7.85 (m, 8H, 2Ar);
（５）２−［１−（４−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸（Ｈ₂Ｌ⁵）
収率：８８％
融点：１１４〜１１６℃
ESI-MS: 399 [M+K]⁺, 361 [M+H]⁺
IR (KBr, cm^-1): 3064 (m), 2921 (m), 1747 (s), 1619 (m), 1251 (s), 740 (s)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.32 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 5.46 (s, 1H, CH(COOH)₂), 7.01〜7.78 (m, 8H, 2Ar)

【実施例3】

【0023】

２−（１−ベンジル（または置換ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸塩の調製
実施例２から得られた２．０ｍｍｏｌの酸を、それぞれ、５ｍＬの水に加え、５分間撹拌し、アルカリ４．０ｍｍｏｌまたはアミノ酸４．０ｍｍｏｌの水溶液５ｍＬを滴下により加え、続いて、この混合物を室温で４時間撹拌し、減圧下で濃縮して水を除去し、次いで、オイル状物質が得られ、その後、２０ｍＬの無水アルコールを加え、この混合物を、固形物が沈殿した後にろ過して、ろ過ケーキを２ｍＬの無水アルコールによって洗浄し、次いで、真空乾燥を施すと、最終的には、下記の生成物を得ることができる。

【0024】

（１）２−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二ナトリウム塩（Ｙ１）
収率：７５％
IR (KBr, cm^-1): 2983 (w), 1643 (s), 1334 (m), 741 (m), 723 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.21 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.33 (s, 2H, CH₂C₆H₅), 7.03〜7.79 (m, 9H, 2Ar)
（２）２−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二カリウム塩（Ｙ２）
収率：８６％
IR (KBr, cm^-1): 2978 (w), 1639 (s), 1328 (m), 740 (m), 721 (m)
1HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.23 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.35 (s, 2H, CH₂C₆H₅), 6.97〜7.78 (m, 9H, 2Ar)
（３）２−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二アンモニウム塩（Ｙ３）
収率：７５％
IR (KBr, cm^-1): 3197 (s), 1593 (s), 1326 (s), 1105 (m), 771 (s), 746 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.22 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.34 (s, 2H, CH₂C₆H₅), 7.03〜7.81(m, 9H, 2Ar)
（４）２−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二ヒスチジン塩（Ｙ４）
収率：９２％
IR (KBr, cm^-1): 3128 (m), 3026 (m), 1618 (s), 1329 (m), 1259 (w), 744 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 3.10〜3.24 (m, 4H, ヒスチジンの2CH₂), 3.89〜3.94 (m, 2H, ヒスチジンの2CHNH₂COOH), 5.28 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.34 (s, 2H, CH₂C₆H₅), 7.05〜7.80 (m, 11H, 2Arの9H, および2イミダゾールの2H), 8.27 (s, 2H, 2イミダゾールの2H)
（５）２−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二リシン塩（Ｙ５）
収率：８６％
IR (KBr, cm^-1): 3031 (s), 2941 (s), 1615 (s), 1325 (m), 741 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 1.30〜1.43 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.60〜1.63 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.78〜1.82 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 2.90〜2.93 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 3.65 (m, 2H, リシンの2CH(NH₂)COOH), 5.24 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.36 (s, 2H, CH₂C₆H₅), 7.09〜7.81 (m, 9H, 2Ar)
（６）２−［１−（４−メチル−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二ナトリウム塩（Ｙ６）
収率：７６％
IR (KBr, cm^-1): 2983 (m), 1621 (s), 1336 (s), 1256 (m), 746 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 2.15 (s,3H, C₆H₄CH₃), 5.22 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.27 (s, 2H, CH₂C₆H₄CH₃), 6.97〜7.80 (m, 8H, 2Ar)
（７）２−［１−（４−メチル−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二カリウム塩（Ｙ７）
収率：８０％
IR (KBr, cm^-1): 2986 (m), 1625 (s), 1338 (m), 1255 (m), 744 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 2.17 (s, 3H, C₆H₄CH₃), 5.25 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.30 (s, 2H, CH₂C₆H₄CH₃), 6.99〜7.85 (m, 8H, 2Ar)
（８）２−［１−（４−メチル−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二アンモニウム塩（Ｙ８）
収率：７０％
IR (KBr, cm^-1): 3330 (s), 2983 (m), 1600 (s), 1331 (m), 746 (m)
¹¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 2.13 (s, 3H, C₆H₄CH₃), 5.21 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.28 (s, 2H, CH₂C₆H₄CH₃), 6.89〜7.80 (m, 8H, 2Ar)
（９）２−［１−（４−メチル−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二リシン塩（Ｙ９）
収率：８８％
IR (KBr, cm^-1): 3432 (s), 2930 (s), 1619 (s), 1335 (m), 743 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 1.30〜1.38 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.54〜1.64 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.74〜1.81 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 2.12 (s, 3H, CH₂C₆H₄CH₃), 2.86〜2.91 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 3.61〜3.65 (m, 2H, リシンの2CH(NH₂)COOH), 5.20 (s, 2H, CH₂C₆H₅CH₃), 5.28 (s, 1H, CH (COO^-)₂), 6.92〜7.76 (m, 8H, 2Ar)
（１０）２−［１−（３−フルオロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二ナトリウム塩（Ｙ１０）
収率：８３％
IR (KBr, cm^-1): 2927 (w), 1619 (s), 1337 (m), 739 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.22 (s, 1H, CH (COOH)₂), 5.34 (s, 2H, CH₂C₆H₄F), 6.77〜7.80 (m, 8H, 2Ar)
（１１）２−［１−（３−フルオロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二カリウム塩（Ｙ１１）
収率：８０％
IR (KBr, cm^-1): 2929 (w), 1605 (s), 1331 (m), 741 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.22 (s, 1H, CH (COOH)₂), 5.30 (s, 2H, CH₂C₆H₄F), 6.75〜7.80 (m, 8H, 2Ar)
（１２）２−［１−（３−フルオロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二アンモニウム塩（Ｙ１２）
収率：７５％
IR (KBr, cm^-1): 3340 (s), 2931 (w), 1641 (s), 1336 (m), 743 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.35 (s, 1H, CH(COOH)₂), 5.43 (s, 2H, CH₂C₆H₄F), 6.77〜7.78 (m, 8H, 2Ar)
（１３）２−［１−（３−フルオロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二ヒスチジン塩（Ｙ１３）
収率：８４％
IR (KBr, cm^-1): 3154 (s), 3012 (m), 1600 (s), 1331 (m), 1226 (w), 741 (m)
¹HNMR(500MHz, D₂O), δ (ppm): 3.10〜3.13 (d, 4H, ヒスチジンの2CH₂), 3.83〜3.87 (m, 2H, Histidineの2CHNH₂COOH), 5.22 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.26 (s, 2H, CH₂C₆H₄F), 6.71〜7.73 (m, 10H, 2Arおよびヒスチジンの2イミダゾールの2H), 8.33 (s, 2H, ヒスチジンの2イミダゾール)
（１４）２−［１−（３−フルオロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル）マロン酸二リシン塩（Ｙ１４）
収率：８５％
IR (KBr, cm^-1): 3435 (s), 2931 (s), 1622 (s), 1328 (m), 744 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 1.32〜1.46 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.55〜1.66 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.72〜1.79 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 2.89〜2.93 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 3.55〜3.59 (m, 2H, リシンの2CH(NH₂)COOH), 5.25 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.35 (s, 2H, CH₂C₆H₄F), 6.80〜7.87 (m, 8H, 2Ar)
（１５）２−［１−（３−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二ナトリウム塩（Ｙ１５）
収率：８０％
IR (KBr, cm^-1): 2937 (w), 1619 (s), 1336 (s), 744 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.22 (s, 1H, CH(COOH)₂), 5.26 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 6.94〜7.80 (m, 8H, 2Ar)
（１６）２−［１−（３−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二カリウム塩（Ｙ１６）
収率：７８％
IR (KBr, cm^-1): 2940 (w), 1605 (s), 1337 (s), 746 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.39 (s, 1H, CH (COOH)₂), 5.43 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 7.08〜7.95 (m, 8H, 2Ar)
（１７）２−［１−（３−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二アンモニウム塩（Ｙ１７）
収率：７１％
IR (KBr, cm^-1） : 3250 (s), 2942 (m), 1641 (s), 1322 (m), 746 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.23 (s, 1H, CH (COOH)₂), 5.33 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 6.76〜7.81 (m, 8H, 2Ar)
（１８）２−［１−（３−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二ヒスチジン塩（Ｙ１８）
収率：８２％
IR (KBr, cm^-1） : 3132 (s), 2932 (m), 1640 (s), 1326 (m), 742 (m)
¹HNMR (300MHz, D2O), δ (ppm): 3.10 (m, 4H, ヒスチジンの2CH₂), 3.81〜3.83 (m, 2H, ヒスチジンの2CHNH₂COOH), 5.16 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.22 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 6.86〜7.69 (m, 10H, 2Ar の8Hおよびヒスチジンの2イミダゾールの2H), 8.32 (s, 2H, ヒスチジンの2イミダゾール)
（１９）２−［１−（３−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二リシン塩（Ｙ１９）
収率：９１％
IR (KBr, cm^-1): 2934 (m₂), 1613 (s),, 1320 (m), 1105 (m), 741 (m₄)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 1.26〜1.34 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.49〜1.56 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.72〜1.74 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 2.81〜2.86 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 3.52〜3.62 (m, 2H, リシンの2CH(NH₂)COOH), 5.13 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 5.21 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 6.88〜7.76 (m, 8H, 2Ar)
（２０）２−［１−（４−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二ナトリウム塩（Ｙ２０）
収率：８４％
IR (KBr, cm^-1): 2980 (w), 1642 (s), 1336 (m), 739 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.16 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 5.22 (s, 1H, CH(COOH)₂), 6.92〜7.76 (m, 8H, 2Ar)
（２１）２−［１−（４−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二カリウム塩（Ｙ２１）
収率：８２％
IR (KBr, cm^-1): 2982 (w), 1636 (s), 1325 (m), 741 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.18 (s, 1H, CH(COOH)₂), 5.24 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cl), 6.99〜7.83 (m, 8H, 2Ar)
（２２）２−［１−（４−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二アンモニウム塩（Ｙ２２）
収率：７８％
IR (KBr, cm^-1): 3232 (s), 2985 (w), 1612 (s), 1323 (m), 743 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 5.24 (s, 1H, CH(COOH)₂), 5.31 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 7.08〜7.96 (m, 8H, 2Ar)
（２３）２−［１−（４−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二ヒスチジン塩（Ｙ２３）
収率：９４％
IR (KBr, cm^-1): 3162 (m), 2978 (m), 1638 (s), 1315 (m), 746 (m)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 3.00〜3.14 (m, 4H, ヒスチジンの2CH₂), 3.81〜3.85 (m, 2H, ヒスチジンの2CHNH₂COOH), 5.19 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.25 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 6.93〜7.71 (m, 10H, 2Arの8Hおよびヒスチジンの2イミダゾールの2H), 812 (s, 2H, ヒスチジンの2イミダゾール)
（２４）２−［１−（４−クロロ−ベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−オキシル］マロン酸二リシン塩（Ｙ２４）
収率：９３％
IR (KBr, cm^-1): 2930 (m), 1619 (s), 1316 (m), 1108 (m), 740 (s)
¹HNMR (500MHz, D₂O), δ (ppm): 1.24〜1.32 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.48〜1.58 (m, 4H, リシンの2H₂NC₂H₄CH₂CH₂), 1.65〜1.67 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 2.80〜2.85 (m, 4H, リシンの2H₂NCH₂CH₂C₂H₄), 3.45〜3.53 (m, 2H, リシンの2CH(NH₂)COOH), 5.19 (s, 1H, CH(COO^-)₂), 5.21 (s, 2H, CH₂C₆H₄Cｌ), 6.95〜7.75 (m, 8H, 2Ar)

【0025】

典型的な化合物の活性
水晶体に対してＨ₂Ｏ₂が引き起こす酸化障害にｉｎ ｖｉｔｒｏで抵抗する能力について調査するために、いくつかの典型的な化合物を選択する。この実験については以下に説明する。

【0026】

１．眼水晶体の培養
ラットおよびウサギを屠殺し、それらの眼球を取り出して、５００ｕ／ｍＬのペニシリンを含有する食塩水で洗浄し、眼球をその後部から分割して眼球壁および硝子体を取り除き、提靱帯を取り去り、水晶体を取り出して、５００ｕ／ｍＬのペニシリンと０．５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンとを含有するＰＢＳ溶液によって５分間洗浄する。実験前には、解剖鏡（ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｌｅｎｓ）を用いて調べることにより、上記水晶体中に混濁化または他の異常状態がないことを確認し、次いで、上記水晶体を、２ｍＬのＤＭＥＭ／高グルコース（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．の製品）無菌培養液（これは、１００ｕ／ｍＬのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する）を含有する滅菌済み１２ウェルプレート内に入れ、スクリーニングのために様々な化合物を加え、温度３７℃、湿度９５％およびＣＯ₂５％のインキュベーター中で１時間前培養し、続いて、Ｈ₂Ｏ₂とＦｅＣｌ₃とを含有する２ｍＬのＤＥＭＥ培養液を加え（すなわち、各ウェル中に合計４ｍＬの培養液）（各ウェル中のＨ₂Ｏ₂の合計濃度は、ウサギに対しては２％、ラットに対しては５％であり、ＦｅＣｌ₃の濃度はすべて０．０２％である）、同一条件下で２４時間培養する。これらの実験は、以下のように数群に分け、バッチで実施し、各バッチには、陰性対照群とモデル群とが備わる。

【0027】

Ａ．陰性対照群：Ｈ₂Ｏ₂を含有しないＤＭＥＭ培養液。
Ｂ．モデル群（酸化障害群）：Ｈ₂Ｏ₂およびＦｅＣｌ₃を含有するＤＭＥＭ培養液。
Ｃ．ビタミンＣ群：モデル群の成分に加えて、ビタミンＣをさらに含有する（最終的な濃度は１ｍｍｏｌ／Ｌ）。
Ｄ．ベンダザックリジン（ＢＤＬ）群（ＢＤＬは、Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｈａｐｕａｉｓｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．によって提供され、その純度は９８．５％を超えている）：モデル群の成分に加えて、ＢＤＬ（最終的な濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌである）をさらに含有する。
Ｅ．検体群：モデル群の成分に加えて、検体（最終的な濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌである）をさらに含有する。

【0028】

２．形態観察
２４時間の培養後、眼水晶体の混濁化の程度を観察し、１２ウェルプレート下の白色下地上に太さの異なる黒色の「＋」を有する背景のもとで、写真を撮り、採点して３つの異なるグレードに分ける。
−は、正常で透明な水晶体を示す。
＋は、軽度の混濁度（第１の「＋」は、わずかに不明瞭であるが依然として明確に視認可能であり、第２の「＋」は判然としている）を示し、等級Ｉである。
＋＋は、中程度の混濁度（第２の「＋」は、わずかに不明瞭であるが依然として明確に視認可能であり、第３の「＋」は判然としている）を示し、等級ＩＩである。
＋＋＋は、水晶体が完全に混濁化している（第３の「＋」が明確に視認できない）ことを示し、等級ＩＩＩである。

【0029】

３．結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウサギの眼水晶体に対してＨ₂Ｏ₂が引き起こす酸化障害に抵抗する検体化合物の能力についての結果は、表１に示しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのラットの眼水晶体に対してＨ₂０₂によって引き起こされる酸化障害に抵抗する検体化合物の能力についての結果は、表２に示している。

【0030】

表１によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウサギの眼水晶体に対してＨ₂Ｏ₂が引き起こす酸化障害の阻害効果を示す化合物は、Ｙ４およびＹ１０であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウサギの眼水晶体に対してＨ₂Ｏ₂が引き起こす酸化障害のＹ１、Ｙ２、Ｙ５およびＹ１９の阻害効果は、顕著ではない。

【0031】

表２によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのラットの眼水晶体に対してＨ₂Ｏ₂が引き起こす酸化障害の阻害効果を示す化合物は、Ｙ１、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ１４およびＹ１９であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのラットの眼水晶体に対してＨ₂Ｏ₂が引き起こす酸化障害のＹ２およびＹ１０の阻害効果は、顕著ではない。

【0032】

【表1】

【0033】

評価基準
モデル群に対する大量の実験によれば、上記群中の水晶体混濁化の異なる等級のパーセントと、上記モデル群中の水晶体混濁化の異なる等級のパーセントとの比率を定義として利用し、ここでは、わずかな改善（ν）に関しては、＋＋（等級ＩＩ、ＩＩＩ）のパーセントは６７％未満にすべきであり、かつ、＋（等級Ｉ）のパーセントは３３％を超えているべきであり、中程度の改善（νν）に関しては、＋＋（等級ＩＩ、ＩＩＩ）のパーセントはさらに低下し、かつ、０（−）のパーセントが出現し、顕著な改善（ννν）に関しては、＋＋（等級ＩＩ、ＩＩＩ）および＋（等級Ｉ）のパーセントが消え、水晶体は、ほぼ透明である。

【0034】

【表2】

【0035】

評価基準
モデル群に対する膨大な実験によれば、上記群中の水晶体濁度の異なる等級のパーセントと、上記モデル群中の水晶体濁度の異なる等級のパーセントとの比率を定義として利用し、ここでは、わずかな改善（ν）に関しては、＋＋（等級ＩＩ ＩＩＩ）のパーセントは、７２％未満にすべきであり、かつ、＋（等級Ｉ）のパーセントは、２０％を超えているべきであり、中程度の改善（νν）に関しては、＋＋（等級ＩＩ ＩＩＩ）のパーセントは、さらに低下し、かつ、０（−）のパーセントが出現し、顕著な改善（ννν）に関しては、＋＋（等級ＩＩ ＩＩＩ）および＋（等級Ｉ）のパーセントが消え、水晶体は、ほぼ透明である。