特許 5763894 細胞の分離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5763894

(24)【登録日】2015年6月19日

(45)【発行日】2015年8月12日

(54)【発明の名称】細胞の分離方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/02 20060101AFI20150723BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20150723BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20150723BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALN20150723BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20150723BHJP

   C12N 5/0787 20100101ALN20150723BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/02

   !C12N5/00 202K

   !C12N5/00 202L

   !C12N5/00 202M

   !C12N5/00 202N

   !C12N5/00 202P

【請求項の数】8

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2010-148954(P2010-148954)

(22)【出願日】2010年6月30日

(65)【公開番号】特開2011-24575(P2011-24575A)

(43)【公開日】2011年2月10日

【審査請求日】2013年6月20日

(31)【優先権主張番号】特願2009-156568(P2009-156568)

(32)【優先日】2009年7月1日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】302019245

【氏名又は名称】タカラバイオ株式会社

(72)【発明者】

【氏名】出野 美津子

(72)【発明者】

【氏名】榎 竜嗣

(72)【発明者】

【氏名】加藤 郁之進

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５０１０１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１７０７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５０２８９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０７−５００５０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１０−５０８１９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−３３４０６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１３９０９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０５６３５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−００３７８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Analytical Biochemistry，２００４年，vol.332，p.226-233

【文献】 J. Equine Sci.，２００４年，vol.15, no.1，p.1-5

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００，５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）血液又は血液から回収されたＢｕｆｆｙ ｃｏａｔ層と血清アルブミン、カゼイン、又は血清アルブミンもしくはカゼインのいずれかを含有する溶液とで細胞液を調製する工程、
２）工程１）で得られた細胞液を密度勾配形成用媒体の上に重層する工程、及び
３）密度勾配遠心分離を行い、分離された末梢血単核球を回収する工程、
を包含することを特徴とする末梢血単核球の分離方法。

【請求項2】

さらに、
４）工程３）で回収した末梢血単核球を洗浄する工程、を包含する請求項１記載の方法。

【請求項3】

工程４）において、血清アルブミン又はカゼインを含有する溶液を用いて、回収した末梢血単核球を洗浄することを特徴とする請求項２記載の方法。

【請求項4】

さらに、
５）工程４）で洗浄した末梢血単核球を保存する工程、
を包含する請求項２記載の方法。

【請求項5】

工程５）において、血清アルブミン又はカゼインを含有する溶液を用いて末梢血単核球を未凍結下で保存することを特徴とする請求項４の方法。

【請求項6】

血清アルブミンを含有する溶液が、血漿、血清又はそれらの希釈物である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

密度勾配形成用媒体が、ショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール及びニコデンツからなる群より選択される媒体である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

下記１）及び２）を含有する請求項１〜５のいずれかに記載の方法に用いるためのキット；
１）密度勾配形成用媒体、
２）血清アルブミン及び／又はカゼイン。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液等から細胞を分離する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、医学の進歩に伴い、血液中から必要な細胞又は成分のみを分離し、当該細胞を用いた基礎研究や治療への応用が行われるようになってきた。血液から必要とする細胞又は成分を分離・回収する方法には、細胞をその比重に基づいて分離する密度勾配遠心法（例えば、特許文献１）、細胞のサイズや膜表面の抗原を利用し、フィルターや粒子状の担体で細胞を分離する方法（例えば、特許文献２）が用いられている。特に、密度勾配遠心法は、液体状もしくは流動状の密度勾配形成用媒体の上に血液、希釈血液又は血液から事前に回収した細胞を含む溶液等を重層して遠心した後、分離された層のうちの所望の細胞を含有する層のみを回収する事で、必要としない細胞又は成分を実質的に含まないようにすることができるため、より多く用いられてきている。

【0003】

しかしながら密度勾配遠心法において、より多くの細胞や成分を分離・回収するためには、使用する血液の量も多くする必要があるため、更なる効率の良い分離・回収方法が望まれていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第１９９７／０２１４８８号パンフレット

【特許文献2】特開２００４−１２１１４４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、細胞含有液から必要とする細胞や成分を効率よく分離する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、密度勾配遠心法を用いた細胞含有液から細胞を分離する方法において、密度勾配形成用媒体の上に重層する細胞液にあらかじめ血液由来タンパク質又は乳タンパク質を添加しておくことにより、従来の方法に比べて、必要とする細胞の回収率が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成させた。

【0007】

すなわち本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は密度勾配遠心法による細胞からの細胞の分離方法に関し、
１）細胞含有液と血液由来タンパク質、乳タンパク質、又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液とで細胞液を調製する工程、
２）工程１）で得られた細胞液を密度勾配形成用媒体の上に重層する工程、及び
３）密度勾配遠心分離を行い、分離された細胞を回収する工程、
を包含することを特徴とする。前記方法は、更に、
４）工程３）で回収した細胞を洗浄する工程、及び
５）工程４）で洗浄した細胞を保存する工程
を包含してもよい。
第１の発明の態様としては、血液由来タンパク質が血漿由来タンパク質又は血清由来タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンである方法が提供される。また、乳タンパク質がカゼインである方法が提供される。更に、血液由来タンパク質含有する溶液が、血漿、血清又はそれらの希釈物である方法が提供される。更に、上記工程４）において、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液を用いて回収した細胞を洗浄、及び工程５）において、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液を用いて細胞を保存する方法が提供される。
第１の発明の細胞含有液としては、血液、希釈血液、骨髄液、臍帯血及び成分採血液からなる群より選択される試料が挙げられ、また、血液、希釈血液、骨髄液、臍帯血及び成分採血液からなる群より選択される試料から事前に分離された細胞を含む画分が挙げられる。更に、第１の発明の密度勾配形成用媒体としては、ショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール及びニコデンツからなる群より選択される媒体が挙げられる。

【0008】

本発明の第２の発明は、密度勾配遠心法による細胞の分離方法における、密度勾配形成用媒体の上に重層する細胞液の調製時の血液由来タンパク質、乳タンパク質、又はそれらタンパク質を含有する溶液の使用に関する。第２の発明の態様としては、血液由来タンパク質が血漿由来タンパク質又は血清由来タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンである使用が提供される。また、乳タンパク質がカゼインである使用が提供される。また、血液由来タンパク質を含有する溶液が血漿、血清又はそれらの希釈物である使用が提供される。

【0009】

本発明の第３の発明は、第１の発明の方法に用いるためのキットに関し、
１）密度勾配形成用媒体、及び
２）血液由来タンパク質及び／又は乳タンパク質、
を含有することを特徴とする。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、細胞含有液、特に血液から必要とする細胞を高効率で分離できる事から、採血時の血液量を少なくすることが可能であり、自己の細胞を用いる治療において、患者の負担を軽減することが可能となる。また、血液から効率よく細胞を回収できることから、本発明の方法は基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下に本発明について詳細に説明する。

【0012】

本願明細書において「密度勾配形成用媒体」とは、それ自身で又は遠心分離によって密度勾配を形成する液体状又は粒子状の物質を示す。例えば、ショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体（例えば後述のＦｉｃｏｌｌ）、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子（例えば後述のＰｅｒｃｏｌｌ）、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソール、ニコデンツ（ｎｙｃｏｄｅｎｚ）が挙げられ、イオン性又は非イオン性のいずれのものも使用できる。また、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅやＰｅｒｃｏｌｌ（いずれもＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ社製）、Ｌｙｍｐｈｏｓｅｐａｒｌ（免疫生物研究所製）等の密度勾配形成用として市販されている媒体も好適に使用できる。

【0013】

本願明細書において「血液由来タンパク質」とは、血液に含有されるタンパク質を示す。例えば、血液に含有されるタンパク質として血漿由来タンパク質及び／又は血清由来タンパク質が挙げられ、具体的には、血清アルブミン、血清グロブリン等が挙げられる。また血清アルブミンとしては、ヒト血清アルブミン又はウシ血清アルブミンが挙げられる。

【0014】

本願明細書において「乳タンパク質」とは、乳に含有されるタンパク質を示す。例えば、牛乳の約８０％を占めるカゼインが挙げられる。

【0015】

前記のタンパク質は天然由来の材料より単離、精製されたものでもよく、組換え体（微生物や培養細胞）を利用して製造されたものでもよい。

【0016】

本発明の方法においては、血液由来タンパク質又は乳タンパク質は１種のみを使用してもよく、複数のものを混合して使用してもよい。好ましくは単離された血液由来タンパク質又は乳タンパク質、すなわち血液由来又は乳由来の他の成分を実質的に含有しない血液由来タンパク質又は乳タンパク質が本発明に使用される。また、入手可能な組換え血液由来タンパク質又は乳タンパク質を使用してもよい。本発明において、血液由来タンパク質又は乳タンパク質は固体状態のものを直接使用してもよく、これらタンパク質を緩衝液に溶解又は懸濁させ、「血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液」として使用してもよい。また、血漿、血清又はそれらの希釈物を「血液由来タンパク質含有する溶液」として本発明に使用することもできる。

【0017】

本願明細書において「細胞含有液」とは、細胞を含有する液状の組成物を意味する。その種類に限定はなく、任意の細胞含有液に本発明の方法を適用することができる。血液系の細胞の分離を目的とする場合、本発明に使用される細胞含有液としては血液、希釈血液、骨髄液、臍帯血又は成分血液等、生体由来の細胞を含有する試料が例示される。また、組織を材料として調製された細胞懸濁液や培養細胞の懸濁液にも本発明を適用することができる。

【0018】

前記の細胞含有液は生体試料を公知の操作で分画することにより調製された「細胞含有画分」であってもよい。例えば、血液、希釈血液、骨髄液、臍帯血又は成分採血液（単核球、顆粒球、末梢血幹細胞など、細胞成分を採取することを目的とする成分採血で得られる細胞含有液）等の試料から事前に分離した細胞を含む画分を本発明に使用することができる。

【0019】

本発明は、当該細胞含有液を材料とした、所望の細胞の分離に利用することができる。本発明により分離される細胞には特に限定はない。特に血液中に存在する細胞が本発明には好適であり、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、多核球、顆粒球、赤血球、造血幹細胞等が挙げられる。

【0020】

以下、血液からＰＢＭＣを分離回収する方法について説明するが、本発明はこの説明の内容に限定されるものではない。

【0021】

まず、ドナー（ヒト又は動物）より採血を実施する。得られた血液（例えばヘパリン血）又はその希釈物を常法に従い、例えば２００〜１０００×ｇで５〜４０分間、０〜４０℃にて遠心分離を行い、上清である血漿と分離された細胞含有画分、例えば赤血球層及びＢｕｆｆｙ ｃｏａｔ層を回収する。ＰＢＭＣの製造のためにはＢｕｆｆｙ ｃｏａｔ層を細胞含有液として使用する。
工程１）では、得られた画分、すなわちＢｕｆｆｙ ｃｏａｔ層と、血液由来タンパク質を含有する溶液、例えばヒト血清アルブミンを含む溶液とを混合することで細胞液を調製する。あるいは乳タンパク質を含有する溶液、例えばカゼインを含む溶液と混合し細胞液を調製してもよい。当該溶液は、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含む以外は常法で用いられるもの、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液、細胞培養用培地、無血清培地等が使用できるのは当然のことである。血液由来タンパク質を含有する溶液として、血漿、血清又はそれらの希釈液も使用することができる。例えば、前記の遠心分離操作で得ることができる血漿もしくはその希釈液、血液又はその希釈液に抗凝固成分を加えずに凝固させた後に回収した上澄み液（血清）もしくはその希釈液を血液由来タンパク質を含有する溶液として使用してもよい。好ましくは、血漿、血清は非働化処理を行った後に使用される。これら血漿又は血清は、市販されている血漿（製品名：正常ヒト血漿、コージンバイオ社製）又は血清（製品名：Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ，ＡＢ、Ｌｏｎｚａ社製）等を使用いてもよい。また、特に細胞と同じドナー由来の血漿又は血清の使用は、安全性の観点から特に好適である。

【0022】

上記調製した細胞液中の血液由来タンパク質又は乳タンパク質の最終濃度は、添加もしくは希釈に用いた血液由来タンパク質、乳タンパク質又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液により細胞液にもたらされる血液由来タンパク質又は乳タンパク質の最終濃度として０．０１〜２５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、好適には０．０５〜１０％（Ｗ／Ｖ）である。また、血液由来タンパク質を含有する溶液として、血漿、血清又はそれらいずれかの希釈物を用いる場合、細胞含有液の液量に対して、０．１〜１００％（Ｖ／Ｖ）に相当する液量を添加すればよく、好適には０．５〜１００％（Ｖ／Ｖ）に相当する液量である。また、血漿、血清の希釈物は、常法で用いられるもの、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液、細胞培養用培地、無血清培地等を用いた希釈により調製し、上記液量で細胞含有液に添加すればよい。

【0023】

次に、工程２）として、調製した細胞液を適切な遠心分離用容器内の密度勾配形成用媒体上に重層し、例えば２００〜１０００×ｇで５〜４０分間、０〜４０℃にて遠心分離を行う。さらに工程３）として、分離された層のうちＰＢＭＣを含む画分である中間層をピペットで回収する。こうして得られたＰＢＭＣ含有画分は、適当な溶液、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養用培地等に当該回収した中間層を懸濁し、次いで遠心分離を行って上清を除去することにより洗浄を行う。

【0024】

また、本発明の好適な態様としては、上記記載の工程３）において血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液が使用できる。例えば、前記の中間層をピペットで回収後、まず初めに血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液に懸濁し、次いで遠心分離を行って上清を除去する。この操作を数回繰り返すことにより洗浄を行う。この場合、全ての洗浄工程において血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液を用いてもよく、２回目以降の洗浄時に適当な溶液に変えて行ってもよい。

【0025】

こうして得られたＰＢＭＣの生細胞数及び死細胞数を、例えば自動血球計測装置を用いて算出することにより、ＰＢＭＣの生存率が測定できる。

【0026】

上記の操作に準じて、ＰＢＭＣ以外の血液由来細胞も分離することができる。更に、こうして取得された細胞もしくは細胞集団は、他の細胞分離操作（例えば表面抗原を指標とした分離）に供するための材料としてもよい。

【0027】

ＰＢＭＣ以外の細胞の調製においては、所望の細胞を含有する試料（体液、組織等）に応じて細胞液の調製を行い、適切な密度勾配形成用媒体、血液由来タンパク質、乳タンパク質又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液とそれらの濃度、使用条件を適宜設定することにより、本発明の細胞の分離方法を実施することができる。

【0028】

以上、本発明から、細胞含有液に血液由来タンパク質、乳タンパク質又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液を別途添加することにより、従来法に比べて必要とする細胞を効率よく分離・回収することが可能となる。

【0029】

また、本発明により分離・回収した細胞を、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含む溶液で保存することにより、不要な他の成分を含有することなく、細胞濃度を高く保持し、かつ細胞生存率を維持したまま、未凍結状態で長時間保存することが可能である。当該保存方法も本願に包含される。細胞の保存に用いる血液由来タンパク質を含有する溶液として、血漿、血清の希釈物を用いる場合、０．０１〜２５％（Ｖ／Ｖ）の溶液が好ましく、好適には０．０５〜１０％（Ｖ／Ｖ）の溶液である。また、血漿、血清の希釈には、常法で用いられるもの、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液、細胞培養用培地、無血清培地等を用いた希釈により調製すればよいが、不要な他の成分を含有しない点から、生理食塩水が好ましい。未凍結状態とは、１〜１０℃、好ましくは４℃である。本発明の保存方法を用いることにより、例えば、４℃で１〜５日間、好適には１〜２日間、細胞濃度を高く保持し、細胞生存率を維持したまま細胞を保存することが可能である。こうして保存された細胞は、使用前に再度工程４）と同様の方法で細胞を洗浄し、使用してもよい。また、血漿及び血清は不要な他の成分を含有していないことから、そのまま使用してもよい。通常、細胞の保存は凍結状態で行い、融解後、洗浄操作を行う必要があるが、本発明の保存方法を用いることにより、これら融解及び洗浄操作を行う必要がないため、これら操作による細胞生存率の低下を防ぐことができ、細胞生存率を維持したまま培養等に使用可能となる。

【0030】

本発明の第２の発明は、密度勾配遠心法による細胞の分離方法における、密度勾配形成用媒体の上に重層する細胞液の調製時の血液由来タンパク質、乳タンパク質又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液の使用である。すなわち、本発明により開示された、血液由来タンパク質、乳タンパク質又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液を、密度勾配遠心法による細胞の分離に供される細胞液の調製に使用する行為は本願発明に包含される。

【0031】

本発明の第３の発明のキットは、本発明の第１の発明の方法に使用される密度勾配形成用媒体、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する。好適な態様として、前記の各構成成分に加えてこれらの本発明の第１の発明の細胞分離方法における使用方法を指示する指示書を含むキットが例示される。本発明のキットにおいて、密度勾配形成用媒体、血液由来タンパク質又は乳タンパク質を含有する溶液は、いずれも本発明の細胞分離方法に適した濃度とされていてもよく、用時に希釈して使用される高濃度溶液や用時に溶解又は懸濁して使用される乾燥物もしくは凍結乾燥物とされていてもよい。さらに、本発明のキットは、構成成分の希釈や溶解に使用される溶媒、回収された細胞を洗浄するための洗浄液等を含有してもよい。

【実施例】

【0032】

以下に実施例をもって本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。

【0033】

実施例１ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離
（１）ＰＢＭＣの分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、６０ｍＬ分のへパリン加採血を実施した。得られた血液を約１５ｍＬずつコニカルチューブ（ベクトン・ディッキンソン社製又はグライナ―社製）に分注後、７００×ｇ、室温で２０分間遠心し、遠心後の上清である血漿画分とＰＢＭＣを含む細胞画分とに分離した。ＰＢＭＣを含む細胞画分は、ダルベッコＰＢＳ（以下、ＤＰＢＳと記載する。インビトロジェン社製又はニッスイ社製）、０．９６％（Ｗ／Ｖ）ＨＳＡを含む生理食塩水（以下、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水と記載する）、ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社製又は和光純薬社製）、又は生理食塩水（テルモ社製）を用いて、それぞれ２０ｍＬにフィルアップし希釈した。得られた希釈細胞液を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）２０ｍＬの上にそれぞれ重層して、７００×ｇ、室温で２０分間遠心した。遠心後、分離した層のうち、ＰＢＭＣ層をピペットで回収し、ＲＰＭＩ１６４０、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水又はリンパ球培養用培地ＧＴ−Ｔ５５１（タカラバイオ社製）をそれぞれ用いて３０ｍＬにフィルアップした後、６５０×ｇ、４℃にて１０分間遠心し、上清を除去した。同様に、６００×ｇ、５００×ｇと段階的に遠心力を落としながら順次遠心操作を行い、計３回洗浄を繰り返した。得られたＰＢＭＣの生細胞数及び生存率（％）を自動血球計測装置（ヌクレオカウンター Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）を用いて算出し、以下の式に準じて細胞回収率（％）を算出した。Ｆｉｃｏｌｌ重層時の希釈溶媒と洗浄時の溶媒との関係と得られた結果を表１に示す。表中、ドナー１及び２は異なるドナーの血液を用いて比較を行った結果である。
式：細胞回収率（％）＝各条件で分離した際の回収ＰＢＭＣ細胞数／基本法^※で分離した際の回収ＰＢＭＣ細胞数×１００（※基本法とは、Ｆｉｃｏｌｌ重層時の希釈溶媒としてＤＰＢＳを、洗浄時の溶媒としてＲＰＭＩ１６４０を使用する方法を示す。）

【0034】

【表1】

【0035】

表１に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、すなわち約１％のＨＳＡを含有する生理食塩水を使用することで、基本法、ＲＰＭＩ１６４０の組合せ、生理食塩水とＧＴ−Ｔ５５１の組合せと比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。また、この効果は複数のドナー血液を用いたＰＢＭＣ分離について確認された。従って、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0036】

（２）回収ＰＢＭＣの細胞集団の解析
実施例１−（１）で基本法により分離して得られたＰＢＭＣ又は０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて分離して得られたＰＢＭＣを、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社製）を含むＤＰＢＳ（以下１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳと記載する）で洗浄した。その後、それぞれのＰＢＭＣを１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳに細胞を懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体／ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体／ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター社製）、あるいはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマンコールター社製）及びＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体（ベックマンコールター社製）を添加した。ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ_１抗体／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ_１抗体／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ_１抗体（ベックマンコールター社製）を添加した。氷上で３０分間インキュベートした後、ＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、残存赤血球を溶血した。次に、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含むＤＰＢＳで細胞を洗浄し、再度ＤＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）に供し、各々の細胞集団について、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞の含有率を算出した。ここで含有率（％）は、全細胞数に占める陽性細胞数の占める割合を示す。結果を表２に示す。表中、ドナー１及び２は異なるドナーのＰＢＭＣを用いて比較を行った結果である。

【0037】

【表2】

【0038】

表２に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、すなわち約１％のＨＳＡを含有する生理食塩水を使用して回収されたＰＢＭＣと、基本法で回収されたＰＢＭＣとの間では、そこに含有される各抗原陽性の細胞の割合にほとんど差はなかった。また、複数のドナー血液を用いた場合でも同様な結果であった。すなわち、基本法で回収されたＰＢＭＣと本発明の方法により分離されたＰＢＭＣは、細胞として同じ性質を有するものであることが明らかとなった。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0039】

実施例２ ＨＳＡ含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離
（１）ＰＢＭＣの分離
実施例１−（１）と同様の方法でインフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、生理食塩水又はソルデム３Ａ（ブドウ糖、電解質液を含有する維持液、テルモ社製）を用いてそれぞれ別々に希釈を行った。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、ＲＰＭＩ１６４０、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、生理食塩水又はソルデム３Ａをそれぞれ用いて３回行った。Ｆｉｃｏｌｌ重層時の希釈溶媒と洗浄時の溶媒との関係と、得られた結果を表３に示す。表中、Ｅｘｐ．Ａ及びＢは同一ドナーの血液を用いた実施時期の異なる実験の結果を示す。

【0040】

【表3】

【0041】

表３に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、すなわち約１％のＨＳＡを含有する生理食塩水を使用することで、基本法や生理食塩水又はソルデム３Ａの組合わせと比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。一方、生理食塩水及びソルデム３Ａの組合せでは、細胞の生存率が低下した。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0042】

実施例３ 得られたＰＢＭＣからのＴ細胞拡大培養
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。その結果を表４に示す。

【0043】

【表4】

【0044】

（２）回収したＰＢＭＣの細胞集団の解析
実施例３−（１）で得られたＰＢＭＣを実施例１−（２）と同様の方法で細胞集団の解析を行った。ただし、実施例１−（２）で使用した抗体に加え、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１９抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１５抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）も使用した。その結果を表５に示す。すなわち表５は、各々の細胞集団について、ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ１９陽性細胞、ＣＤ１４陽性細胞及びＣＤ１５陽性細胞の含有率を算出した結果である。

【0045】

【表5】

【0046】

表５に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、すなわち約１％のＨＳＡを含有する生理食塩水を使用して回収されたＰＢＭＣと、基本法で回収されたＰＢＭＣとの間では、そこに含有される各抗原陽性の細胞の割合に大きな差はなかった。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0047】

（３）Ｔ細胞の拡大培養
実施例３−（１）で得られたＰＢＭＣを用いて、Ｔ細胞の拡大培養をおこなった。
抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（終濃度５μｇ／ｍＬ、ヤンセンファーマ社製）及びレトロネクチン（終濃度２５μｇ／ｍＬ、登録商標、タカラバイオ社製）を含むＡＣＤ−Ａ液（テルモ社製）を培養面積８６ｃｍ^２にしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）２１５（タカラバイオ社製）に１０．４ｍＬ／バッグずつ添加し、ＣＯ_２濃度が５％（以下、５％ＣＯ_２と記載する）中、３７℃で５時間インキュベートした。更に、上記のバッグは使用前にＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄した後、ＯＫＴ３及びレトロネクチン固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ２１５として実験に供した。

【0048】

実施例３−（１）で分離したＰＢＭＣ １．２×１０^７ｃｅｌｌｓを、１．０％（Ｖ／Ｖ）非働化済み血漿を含むＧＴ−Ｔ５５１（以下血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１と記載）１２０ｍＬに懸濁し、上記で作製したＯＫＴ３及びレトロネクチン固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ２１５に添加した。終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２（製剤名；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、カイロン社製）を添加し、５％ＣＯ_２中３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養開始４日目に、各ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ２１５内の細胞液を均一な懸濁液とし、一部を希釈して、培養面積を４３０ｃｍ^２にした何も固定化していないガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）Ｅｖａ（タカラバイオ社製）に移した。この際、細胞液を４０ｍＬ添加し、血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１を２９６ｍＬ添加した。終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ_２中３７℃で培養した。培養を継続し、培養開始７日目には各ＣｕｌｔｉＬｉｆｅＥｖａに細胞液と等量の血漿を含まないＧＴ−Ｔ５５１を添加し２倍希釈した後、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１０日目に自動血球計測装置（ヌクレオカウンター、Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）を用いて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較し、拡大培養率を算出した。また、得られた培養後の細胞の細胞集団を実施例１−（２）と同様の方法で解析し、ＣＤ３陽性細胞含有率、ＣＤ４陽性細胞含有率、ＣＤ８陽性細胞含有率、及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞含有率を算出した。その結果を表６に示す。

【0049】

【表6】

【0050】

表６に示すように、どちらの血液分離方法で得られたＰＢＭＣもスタート細胞数を同じとした拡大培養において、拡大培養率、培養後の細胞の構成に差はなかった。すなわち、基本法で回収されたＰＢＭＣと本発明の方法により分離されたＰＢＭＣは、細胞として同じ性質を有するものであることが明らかとなった。従って、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0051】

実施例４ ＨＳＡ含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、０．１％（Ｖ／Ｗ）ＨＳＡを含む生理食塩水又は０．３％（Ｖ／Ｗ）ＨＳＡを含む生理食塩水（以下、０．１％ＨＳＡ／生理食塩水、０．３％ＨＳＡ／生理食塩水とそれぞれ記載する）、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、それぞれＲＰＭＩ１６４０、０．１％ＨＳＡ／生理食塩水、０．３％ＨＳＡ／生理食塩水、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて３回行った。その結果を表７に示す。表中、ドナー３及び４は異なるドナーの血液を用いて比較を行った結果である。

【0052】

【表7】

【0053】

表７に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に０．１％〜約１％の範囲でＨＳＡを含む生理食塩水を使用することで、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。また、複数のドナー血液を用いた場合でも同様な結果であった。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0054】

実施例５ ＨＳＡ含有生理食塩水を用いた成分採血液からのＰＢＭＣ分離回収
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、成分採血を実施した。ここでいう成分採血とは、単核球採取を目的とした採血である。得られた成分採血液をＤＰＢＳ又は０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水で希釈後、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ上に重層して７００×ｇで２０分間遠心した。中間層のＰＢＭＣをピペットで回収後、それぞれＲＰＭＩ１６４０又は０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて３回洗浄した。その結果を表８に示す。表中、ドナー５及び６は異なるドナーの成分採血液を用いて比較を行った結果である。

【0055】

【表8】

【0056】

表８に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、すなわち約１％のＨＳＡを含有する生理食塩水を使用することで、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。また、複数のドナーの成分採血液を用いた場合でも同様な結果であった。このことから、本発明の方法は細胞含有液の違いに関係なく、成分採血液からのＰＢＭＣ分離回収時においても好適に使用できることが明らかとなった。

【0057】

実施例６ ＨＳＡ含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水又は４．２％（Ｗ／Ｖ）ＨＳＡを含む生理食塩水（以下、４．２％ＨＳＡ／生理食塩水と記載する）を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、それぞれＲＰＭＩ１６４０、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、４．２％ＨＳＡ/生理食塩水を用いて３回行った。その結果を表９に示す。

【0058】

【表9】

【0059】

表９に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に０．９６％〜４．２％の範囲でＨＳＡを含む生理食塩水を使用することで、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用されることが明らかとなった。

【0060】

実施例７ ＢＳＡ含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、又は１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む生理食塩水（以下、１％ＢＳＡ／生理食塩水と記載する）を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、それぞれＲＰＭＩ１６４０、１％ＢＳＡ／生理食塩水を用いて３回行った。その結果を表１０に示す。

【0061】

【表10】

【0062】

表１０に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に１％ＢＳＡ／生理食塩水を使用することで、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用されることが明らかとなった。

【0063】

実施例８ ＨＳＡ含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、５％（Ｗ／Ｖ）ＨＳＡを含む生理食塩水（以下５％ＨＳＡ／生理食塩水と記載する）及びＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭの添付資料に血液分離時の推奨バッファーとして記載されているＢｌａｎｃｅｄ ｓｏｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、推奨バッファーと記載する）を用いてそれぞれ別々に希釈した。推奨バッファーは、１ｇのＤ−グルコース（ナカライテスク社製）、０．００７４ｇの塩化カルシウム２水和物（ナカライテスク社製）、０．１９９２ｇの塩化マグネシウム６水和物（ナカライテスク社製）、０．４０２６ｇの塩化カリウム（ナカライテスク社製）、１７．５６５ｇのＴｒｉｓ（ナカライテスク社製）を蒸留水（大塚製薬社製）で溶解し、５Ｎ塩酸（和光純薬社製）でｐＨ７．６に調製後、蒸留水で１Ｌにメスアップしてからフィルターユニット（旭テクノグラス社製）で滅菌したバッファーＡと、８．１９ｇの塩化ナトリウム（ナカライテスク社製）を蒸留水で１Ｌにメスアップしてからオートクレーブ滅菌したバッファーＢとを１：９の割合で混合して調製した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、それぞれＲＰＭＩ１６４０、５％ＨＳＡ／生理食塩水及び推奨バッファーを用いて３回行った。その結果を表１１に示す。

【0064】

【表11】

【0065】

表１１に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に５％のＨＳＡを含む生理食塩水を使用することで、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。また、実施例４、実施例６及び実施例８の結果から、０．１％〜５％の範囲でＨＳＡを含む生理食塩水を使用する事で、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げられることが明らかとなった。さらにはＨＳＡを含む生理食塩水を使用することは、分離媒体（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ）販売元が血液分離時に推奨するバッファーと比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0066】

（２）回収したＰＢＭＣの細胞集団の解析
実施例８−（１）で得られたＰＢＭＣを実施例２−（２）と同様の方法で細胞集団の解析を行った。ただし、ＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで残存赤血球の溶血処理は行わなかった。その結果を表１２に示す。

【0067】

【表12】

【0068】

表１２に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に５％ＨＳＡ／生理食塩水、推奨バッファーを使用して回収されたＰＢＭＣと、基本法で回収されたＰＢＭＣとの間では、含有される各抗原陽性の細胞の割合にほとんど差はなかった。また同様に５％のＨＳＡを含む生理食塩水を使用することは、推奨バッファーと比較しても、含有される各抗原陽性細胞の割合にほとんど差はなかった。すなわち、基本法で回収されたＰＢＭＣと本発明の方法により分離されたＰＢＭＣは、得られる各細胞の含有率がほぼ同じものであることが明らかとなった。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用されることが明らかとなった。

【0069】

実施例９ カゼインナトリウム含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、１％のカゼインナトリウム（和光純薬社製）を含む生理食塩水（以下、１％カゼインＮａ／生理食塩水と記載する）及び０．２％のカゼインナトリウムを含む生理食塩水（以下、０．２％カゼインＮａ／生理食塩水と記載する）を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、それぞれＲＰＭＩ１６４０、１％カゼインＮａ／生理食塩水及び０．２％カゼインＮａ／生理食塩水を用いて３回行った。その結果を表１３に示す。

【0070】

【表13】

【0071】

表１３に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に１％又は０．２％のカゼインナトリウムを含む生理食塩水を使用することで、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。また、複数のドナー血液を用いた場合でも同様な結果であった。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0072】

（２）回収したＰＢＭＣの細胞集団の解析
実施例９−（１）で得られたＰＢＭＣを実施例２−（２）と同様の方法で細胞集団の解析を行った。ただし、ＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで残存赤血球の溶血処理を行わなかった。その結果を表１４に示す。

【0073】

【表14】

【0074】

表１４に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に５％ＨＳＡ／生理食塩水、１％又は０．２％のカゼインナトリウムを含有する生理食塩水を使用して回収されたＰＢＭＣと、基本法で回収されたＰＢＭＣとの間では、そこに含有される各抗原陽性の細胞の割合にほとんど差はなかった。また、複数のドナー血液を用いた場合でも同様な結果であった。すなわち、基本法で回収されたＰＢＭＣと本発明の方法により分離されたＰＢＭＣは、得られる各細胞の含有率がほぼ同じものであることが明らかとなった。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0075】

（３）ＰＢＭＣの保存
実施例９−（１）で得られたドナー８のＰＢＭＣをＲＰＭＩ１６４０に懸濁後、ＣＰ−１（極東製薬工業社製）と２５％ＨＳＡ（製剤名ブミネート、バクスター社製）を１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて液体窒素中にて保存した。使用時には、これら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１（タカラバイオ社製）で洗浄後、各実験に供した。

【0076】

（４）Ｔ細胞の拡大培養
実施例９−（３）で得られたドナー８のＰＢＭＣを用いて、Ｔ細胞の拡大培養を行った。
ＯＫＴ３（終濃度０．３μｇ／ｍＬ）を含むＤＰＢＳを培養面積３．８ｃｍ^２の１２ウエルプレート（コーニング社製）に０．４５ｍＬ／ウエルずつ添加し、５％ＣＯ_２中３７℃で５時間インキュベートした。また、上記の１２ウエルプレートは使用前に培養器材から当該ＤＰＢＳを吸引除去後、各ウエルをＤＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄し各実験に供した。

【0077】

実施例９−（３）で得られたドナー８のＰＢＭＣ ０．５３×１０^６ｃｅｌｌｓを、血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１ ５．３ｍＬに懸濁し、上記で作製したＯＫＴ３固定化１２ウエルプレートに添加した。終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ_２中３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養開始４日目に、各１２ウエルプレート内の細胞液を均一な懸濁液とし、一部を血漿含有ＧＴ−Ｔ５５１で約１２倍希釈して、この希釈液約７．８ｍＬを培養面積が１０ｃｍ^２の何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコ（コーニング社製）を立てたものに移した。終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ_２中３７℃で培養した。培養を継続し、培養開始７日目には各フラスコに細胞液と等量の血漿を含まないＧＴ−Ｔ５５１を添加し２倍希釈した後、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１１日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較し、拡大培養率を算出した。また、得られた培養後の細胞の細胞集団を実施例１−（２）と同様の方法で解析し、ＣＤ３陽性細胞含有率、ＣＤ４陽性細胞含有率、ＣＤ８陽性細胞含有率、及びＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞含有率を算出した。表中の基本法の値はＮ＝２の平均値を示し、１％カゼインＮａ／生理食塩水はＮ＝１の値を示す。その結果を表１５に示す。

【0078】

【表15】

【0079】

表１５に示すように、１％カゼインＮａ／生理食塩水を用いた血液分離方法で得られたＰＢＭＣもスタート細胞数を同じとした拡大培養において、拡大培養率、培養後の細胞の構成に差はなかった。すなわち、基本法で回収されたＰＢＭＣと本発明の方法により分離されたＰＢＭＣは、細胞として同じ性質を有するものであることが明らかとなった。従って、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用されることが明らかとなった。

【0080】

実施例１０ ＮｙｃｏＰｒｅｐ １．０７７での新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、密度勾配形成用媒体としてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ、及びＮｙｃｏＰｒｅｐ １．０７７（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いた。また、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、５％ＨＳＡ／生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、分離剤ごとにそれぞれＲＰＭＩ１６４０、５％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて３回行った。その結果を表１６に示す。

【0081】

【表16】

【0082】

表１６に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭを密度勾配形成用媒体として使用した場合と同等に、ＮｙｃｏＰｒｅｐ １．０７７重層時及びその後の細胞洗浄時に５％ＨＳＡ／生理食塩水を使用することで、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。このことから、密度勾配形成用媒体によらず本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0083】

実施例１１ ＨＳＡ含有生理食塩水を用いた成分採血液からのＰＢＭＣ分離回収
（１）ＰＢＭＣの分離回収
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、成分採血を実施した。得られた成分採血液を０．９６％又は５％ＨＳＡ／生理食塩水で希釈後、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ上に重層して７００×ｇで２０分間遠心した。中間層のＰＢＭＣをピペットで回収後、それぞれ０．９６％又は５％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて３回洗浄した。結果を表１７に示す。

【0084】

【表17】

＊本実施例のみ、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水を使用した際の回収ＰＢＭＣ数と比較し算出した。

【0085】

表１７に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に５％ＨＳＡ／生理食塩水を使用することで、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、すなわち約１％のＨＳＡを含有する生理食塩水を使用した場合と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。なお両条件とも基本法に比べ高い細胞回収率を示した。これらのことから、本発明の方法は成分採血液からのＰＢＭＣ分離回収時においても好適に使用できることが明らかとなった。

【0086】

実施例１２ ＨＳＡ含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、０．９６％ＨＳＡ（製剤名ブミネート、バクスター社製）／生理食塩水又は０．９６％ＨＳＡ（製剤名アルブミナー、ＣＳＬベーリング社製）／生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、表１８記載の洗浄時溶媒を用いて３回行った。その結果を表１８に示す。

【0087】

【表18】

【0088】

表１８に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水、すなわち約１％のＨＳＡを含有する生理食塩水を使用することで、ＨＳＡの製造元によらず、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0089】

実施例１３ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １．０７７での新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、密度勾配形成用媒体としてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭとＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １．０７７（シグマ社製）を用いた。また、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、５％ＨＳＡ／生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、分離剤ごとにそれぞれＲＰＭＩ１６４０、５％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて３回行った。その結果を表１９に示す。

【0090】

【表19】

【0091】

表１９に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭを密度勾配形成用媒体として使用した場合と同等に、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １．０７７重層時及びその後の細胞洗浄時に５％ＨＳＡ／生理食塩水を使用することで、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。このことから、密度勾配形成用媒体によらず本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収時に好適に使用できることが明らかとなった。

【0092】

実施例１４ ＨＳＡ含有生理食塩水を用いたＰＢＭＣの保存
（１）ＰＢＭＣの分離回収と保存
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて２５ｍＬにフィルアップし希釈し、中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、０．９６％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて３回行った。この際、遠心はすべて室温で行った。得られたＰＢＭＣを３本のコニカルチューブに分注し、５００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除去した。各コニカルチューブについて、細胞濃度が１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように２．５％ＨＳＡ／生理食塩水、ＣＰＳ−１（細胞科学研究所社製）、２．５％ＨＳＡ／ＣＰＳ−１に懸濁し、４℃暗所で保存した。各溶媒で保存当日、１日後、２日後の細胞濃度及び生存率を表２０に示す。

【0093】

【表20】

【0094】

表２０に示すように、ＰＢＭＣを４℃保存する際に、２．５％ＨＳＡ／生理食塩水、２．５％ＨＳＡを添加したＣＰＳ−１溶液を使用することで、添加していないＣＰＳ−１と比較して、細胞濃度を高く保持した状態で保存可能であることが示された。このことから、２．５％ＨＳＡは細胞の４℃保存時に好適に使用できることが明らかとなった。ＰＢＭＣの保存は、凍結状態で行われることが常法であるが、4℃という未凍結状態での保存時に本方法は好適に使用される。また、ＨＳＡ／生理食塩水で保存可能なことから、保存後に細胞を使用する際、ＣＰＳ−１の成分を除く洗浄工程が不要であり、保存していた細胞をそのまま使用可能であることが明らかとなった。

【0095】

（２）４℃保存ＰＢＭＣの細胞集団の解析
実施例１４−（１）で保存したＰＢＭＣを実施例１−（２）と同様の方法で細胞集団の解析を行った。ただし、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、あるいはＥＣＤ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体を使用し、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ_１抗体／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ_１抗体／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ_１抗体及びＥＣＤ標識マウスＩｇＧ_１抗体を使用した。結果を表２１に示す。

【0096】

【表21】

【0097】

表２１に示すように、２．５％ＨＳＡを添加した保存液中のＰＢＭＣと添加していない保存液中のＰＢＭＣとの間では、含有される各抗原陽性の細胞の割合に大きな差はなかった。このことから、ＨＳＡはＰＢＭＣ４℃保存時に好適に使用されることが明らかとなった。

【0098】

実施例１５ カゼインナトリウム含有生理食塩水を用いた新鮮血からのＰＢＭＣ分離回収（血液分離工程別）
（１）ＰＢＭＣの分離回収
実施例１−（１）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナー血液からＰＢＭＣを分離した。ただし、血漿分離後のＰＢＭＣを含む細胞画分は、ＤＰＢＳ、１％カゼインＮａ／生理食塩水及び１％ＨＳＡ／生理食塩水を用いてそれぞれ別々に希釈した。中間層のＰＢＭＣの回収後の洗浄は、それぞれＲＰＭＩ１６４０、１％カゼインＮａ／生理食塩水又は１％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて行った。このとき、各洗浄溶媒を用いて４５ｍＬにフィルアップし、遠心は全て室温で行った。結果を表２２に示す。

【0099】

【表22】

【0100】

表２２に示すように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時及びその後の細胞洗浄時に１％カゼインナトリウムおよび１％ＨＳＡを含む生理食塩水を使用することで、基本法と比較して、細胞の生存率への影響なく、細胞回収率を上げることができた。また、１％カゼインＮａ／生理食塩水は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ重層時または細胞洗浄時のいずれかに使用した場合でも、基本法と比較して細胞回収率を上げることが示された。このことから、本発明の方法は血液からのＰＢＭＣ分離回収の分離工程にかかわらず好適に使用されることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0101】

本発明により、従来の分離方法と比べ、高い効率で必要とする細胞を分離する方法が提供される。本発明により、細胞含有液と血液由来タンパク質、乳タンパク質、又は血液由来タンパク質もしくは乳タンパク質のいずれかを含有する溶液で細胞液を調製する工程を付加するだけという簡便な方法で、細胞液から必要とする細胞を効率よく分離できることから、本発明は基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。