特許 5764072 改変非細胞毒性プロテアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5764072

(24)【登録日】2015年6月19日

(45)【発行日】2015年8月12日

(54)【発明の名称】改変非細胞毒性プロテアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150723BHJP

   C12N 9/50 20060101ALI20150723BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20150723BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20150723BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20150723BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20150723BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20150723BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20150723BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20150723BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20150723BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20150723BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20150723BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20150723BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20150723BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/50

   C07K19/00

   A61K37/02

   A61P27/02

   A61P25/00

   A61P5/14

   A61P21/00

   A61P25/16

   A61P19/00

   A61K8/64

   A61Q19/00

   A61K37/54

   A61P17/00

【請求項の数】18

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2011-550638(P2011-550638)

(86)(22)【出願日】2009年12月16日

(65)【公表番号】特表2012-518403(P2012-518403A)

(43)【公表日】2012年8月16日

(86)【国際出願番号】GB2009002892

(87)【国際公開番号】WO2010094905

(87)【国際公開日】20100826

【審査請求日】2012年12月17日

(31)【優先権主張番号】0903006.5

(32)【優先日】2009年2月23日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】510319889

【氏名又は名称】シンタクシン リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＹＮＴＡＸＩＮ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】チャドック ジョン アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】フォスター キース アラン

【審査官】 吉門 沙央里

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５２１４２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０６０３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０８３６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１１３３８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ．ＳＮＡＲＥタンパク質を切断可能な非細胞毒性プロテアーゼと、
ｂ．哺乳動物細胞のエンドソームの中から、該エンドソームの膜を横切って、前記哺乳動物細胞のサイトゾル中に前記非細胞毒性プロテアーゼを転移可能な転移ドメインと、
ｃ．第２プロテアーゼにより切断可能であるが前記非細胞毒性プロテアーゼにより切断可能でなく、前記第２プロテアーゼによるその切断後にポリペプチドの効力が低下し、並びに、循環性プロテアーゼ、組織関連プロテアーゼ、及び細胞内プロテアーゼから選択されるプロテアーゼにより切断可能である第１破壊性切断部位であって、前記効力の低下が、前記ＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力の低下及び／又は前記非細胞毒性プロテアーゼを転移させる能力の低下により測定可能である、第１破壊性切断部位と、
ｄ．エンドサイトーシスを受けて、神経筋接合部の神経細胞内のエンドソーム中に組み込まれることが可能である、前記神経細胞上の結合部位と結合するターゲティング部分（ＴＭ）と
を含むポリペプチドであって、
ｅ．前記第１破壊性切断部位が前記ＴＭ内にないことを条件とし、
ｆ．前記非細胞毒性プロテアーゼの構成要素に、少なくとも１つの第１破壊性切断部位が存在し、及び／又は、前記転移ドメインに、少なくとも１つの第１破壊性切断部位が存在することを条件とする
ポリペプチド。

【請求項2】

循環性プロテアーゼが細胞外プロテアーゼである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

細胞外プロテアーゼが血清プロテアーゼ又は血液凝固カスケードのプロテアーゼである、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

組織関連プロテアーゼが、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）である、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項5】

ＭＭＰが筋肉のＭＭＰである、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

細胞内プロテアーゼが、標的細胞に存在しないプロテアーゼである、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項7】

プロテアーゼが、トロンビン、第Ｘａ因子、ＡＤＡＭ１７、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ（ＨＡＴ）、ＡＣＥ（ペプチジルジペプチダーゼＡ）、エラスターゼ、フューリン、グランザイム、カスパーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＴＡＣＥ、アダマライシン、セラライシン、アスタシン、凝固第VIIａ因子、凝固第IXａ因子、凝固第XIａ因子、凝固第XIIａ因子、カリクレイン、プロテインＣ又はＭＢＰ関連セリンプロテアーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項8】

カスパーゼがカスパーゼ１〜１０のうちの１つである、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

非細胞毒性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒Ｌ鎖、若しくはＳＮＡＲＥタンパク質を切断可能なそのフラグメントを含むか、又はＩｇＡプロテアーゼ、若しくはＳＮＡＲＥタンパク質を切断可能なそのフラグメントを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項10】

転移ドメインが、クロストリジウム神経毒転移ドメインを含む、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項11】

ＴＭが、クロストリジウム神経毒のＨ_Ｃドメイン若しくはＨ_ＣＣドメイン、又はニューロンと結合可能なそのフラグメントを含むか、或いは
グルカゴン様ホルモン、ニューロホルモン、神経調節性サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、軸索ガイダンスシグナル伝達分子、糖結合性タンパク質、ニューレキシンと選択的に結合するリガンド、ニューレキシン２αのリガンド、ニューレキシン２βのリガンド、ニューレキシン３αのリガンド、ニューレキシン３βのリガンド、ＷＮＴ、Ｎｇ−ＣＡＭ（ＬＩ）、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、ＶＩＰペプチド、ＰＡＣＡＰペプチド、アグリン−ＭＵＳＫ、基底膜ポリペプチド、及び前記ポリペプチドのいずれかのバリアント；神経調節性サイトカイン、及び前記神経調節性サイトカインのバリアントから選択されるペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項12】

神経調節性サイトカインが、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、オノスタチンＭ、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、ニューロロイキン、ＶＥＧＦ、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）から選択される、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項13】

破壊性切断部位での切断の後に、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力が低下している、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項14】

請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。

【請求項15】

請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチドを含む、斜視、眼瞼痙攣、藪睨、ジストニア、斜頚、（ＳＮＡＲＥの下方制御又は不活性化による）細胞／筋肉の無能力化により利益を受ける美化療法（美容）の用途、眼球運動の神経筋異常又は疾患、書痙、眼瞼痙攣、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス；攣縮、慢性多発性硬化症による痙攣、異常膀胱制御をもたらす痙攣、アニスムス、背部攣縮、筋肉のつり、筋収縮性頭痛、挙筋骨盤症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病及び吃音症から選択される異常又は疾患の抑制剤。

【請求項16】

ジストニアが、痙攣性ジストニア、顎口腔ジストニア、限局性ジストニア、遅発性ジストニア、喉頭ジストニア、及び四肢ジストニアから選択される、請求項１５に記載の抑制剤。

【請求項17】

斜頚が、痙攣性斜頚である、請求項１５又は１６に記載の抑制剤。

【請求項18】

眼球運動の神経筋異常又は疾患が、共動斜視、上下斜視、外側直筋麻痺、眼振、及び甲状腺不全性筋疾患から選択される、請求項１５〜１７のいずれかに記載の抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、効力が改善された非細胞毒性プロテアーゼ及びその構築に関する。

【背景技術】

【0002】

非細胞毒性プロテアーゼは、よく理解されたプロテアーゼの群であり、細胞機能を無能力化することにより標的細胞に対して作用する。重要なことに、非細胞毒性プロテアーゼは、それらが作用することにより標的細胞を死滅させない。非細胞毒性プロテアーゼの最もよく知られている例のいくつかは、クロストリジウム神経毒（例えばボツリヌス神経毒、BOTOX（商標）としても知られる）及びＩｇＡプロテアーゼを含む。

【0003】

非細胞毒性プロテアーゼは、ＳＮＡＲＥタンパク質（例えばＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ又はシンタキシン）として知られるタンパク質切断細胞内輸送タンパク質により作用する。Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい。頭字語であるＳＮＡＲＥは、可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体（Soluble NSF Attachment Receptor）の用語に由来し、ここで、ＮＳＦは、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（N-ethylmaleimide-Sensitive Factor）を意味する。ＳＮＡＲＥタンパク質は、細胞内小胞形成にとって、よって細胞からの小胞輸送による分子の分泌にとって必須である。よって、所望の標的細胞に一旦送達されると、非細胞毒性プロテアーゼは、標的細胞からの細胞性分泌を阻害できる。

【0004】

非細胞毒性プロテアーゼは、それらの天然の形態又は実質的に天然の形態（すなわち、BOTOX（商標）などのホロトキシン）で用いることができ、この場合、特定の細胞タイプへのプロテアーゼのターゲティングは、（ｉ）プロテアーゼの局在化された投与及び／又は（ii）天然プロテアーゼの固有の結合能力に依存する。代わりに、ターゲティング部分（Targeting Moiety、ＴＭ）として知られる外因性リガンドを含むように天然プロテアーゼが改変されている再ターゲティングされた形態で、非細胞毒性プロテアーゼを用いることができる。ＴＭは、所望の標的細胞についての結合特異性をもたらすように選択され、再ターゲティングプロセスの一部として、その非細胞毒性プロテアーゼの天然の結合性部分は除去されることがある。再ターゲティング技術は、例えば欧州特許第０６８９４５９号明細書；欧州特許第０９３９８１８号明細書；米国特許第６，４６１，６１７号明細書；米国特許第７，１９２，５９６号明細書；欧州特許第０８２６０５１号明細書；米国特許第５，９８９，５４５号明細書；米国特許第６，３９５，５１３号明細書；米国特許第６，９６２，７０３号明細書；欧州特許第０９９６４６８号明細書；米国特許第７，０５２，７０２号明細書；欧州特許第１１０７７９４号明細書；及び米国特許第６，６３２，４４０号明細書（これらの全ては、それらを参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0005】

ＳＮＡＲＥタンパク質の遍在的な性質の観点において、非細胞毒性プロテアーゼは、広範囲の療法においてうまく採用されている。

【0006】

例えば、本発明者らは、William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin（Slack, Inc., 2004）を参照するが、これは、ボツリヌス神経毒（botulinum neurotoxin、ＢｏＮＴ）、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇ並びに破傷風神経毒（tetanus neurotoxin、ＴｅＮＴ）などのクロストリジウム毒素の、広く多様な治療用及び美容用の用途において神経伝達を阻害するための使用について記載している。例えば、BOTOX（商標）は、以下の適応症についての治療剤として、現在、承認されている：食道アカラシア、成人痙攣、裂肛、背部痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、痙性斜頚、本態性振戦、眉間のしわ又は多動性の顔のしわ、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の運動亢進、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス性障害、鼻口唇のしわ、痙攣性発声障害、斜視及び第７神経障害。さらに、クロストリジウム毒素療法は、神経筋障害を治療するため（米国特許第６，８７２，３９７号明細書を参照されたい）；子宮障害を治療するため（米国特許出願公開第２００４／０１７５３９９号明細書を参照されたい）；潰瘍及び胃食道逆流疾患を治療するため（米国特許出願公開第２００４／００８６５３１号明細書を参照されたい）；ジストニアを治療するため（米国特許第６，３１９，５０５号明細書を参照されたい）；眼障害を治療するため（米国特許出願公開第２００４／０２３４５３２号明細書を参照されたい）；眼瞼痙攣を治療するため（米国特許出願公開第２００４／０１５１７４０号明細書を参照されたい）；斜視を治療するため（米国特許出願公開第２００４／０１２６３９６号明細書を参照されたい）；疼痛を治療するため（米国特許第６，８６９，６１０号明細書、米国特許第６，６４１，８２０号明細書、米国特許第６，４６４，９８６号明細書、米国特許第６，１１３，９１５号明細書を参照されたい）；線維筋痛症を治療するため（米国特許第６，６２３，７４２号明細書、米国特許出願公開第２００４／００６２７７６号明細書を参照されたい）；腰痛を治療するため（米国特許出願公開第２００４／００３７８５２号明細書を参照されたい）；筋肉損傷を治療するため（米国特許第６，４２３，３１９号明細書を参照されたい）；副鼻腔炎性頭痛を治療するため（米国特許第６，８３８，４３４号明細書を参照されたい）；筋収縮性頭痛を治療するため（米国特許第６，７７６，９９２号明細書を参照されたい）；頭痛を治療するため（米国特許第６，４５８，３６５号明細書を参照されたい）；片頭痛の疼痛を低減するため（米国特許第５，７１４，４６９号明細書を参照されたい）；循環器疾患を治療するため（米国特許第６，７６７，５４４号明細書を参照されたい）；パーキンソン病などの神経障害を治療するため（米国特許第６，６２０，４１５号明細書、米国特許第６，３０６，４０３号明細書を参照されたい）；精神神経障害を治療するため（米国特許出願公開第２００４／０１８００６１号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２１１１２１号明細書を参照されたい）；内分泌障害を治療するため（米国特許第６，８２７，９３１号明細書を参照されたい）；甲状腺障害を治療するため（米国特許第６，７４０，３２１号明細書を参照されたい）；コリン作動的に影響を受けた汗腺を治療するため（米国特許第６，６８３，０４９号明細書を参照されたい）；糖尿病を治療するため（米国特許第６，３３７，０７５号明細書、米国特許第６，４１６，７６５号明細書を参照されたい）；膵臓障害を治療するため（米国特許第６，２６１，５７２号明細書、米国特許第６，１４３，３０６号明細書を参照されたい）；骨腫瘍などの癌を治療するため（米国特許第６，５６５，８７０号明細書、米国特許第６，３６８，６０５号明細書、米国特許第６，１３９，８４５号明細書、米国特許出願公開第２００５／００３１６４８号明細書を参照されたい）；耳障害を治療するため（米国特許第６，３５８，９２６号明細書、米国特許第６，２６５，３７９号明細書を参照されたい）；胃腸筋障害及びその他の平滑筋機能障害などの自律神経障害を治療するため（米国特許第５，４３７，２９１号明細書を参照されたい）；皮膚細胞増殖障害に伴う皮膚の損傷を治療するため（米国特許第５，６７０，４８４号明細書を参照されたい）；神経原性炎症性障害を管理するため（米国特許第６，０６３，７６８号明細書を参照されたい）；脱毛を低減させ、発毛を刺激するため（米国特許第６，２９９，８９３号明細書を参照されたい）；下向きの口を治療するため（米国特許第６，３５８，９１７号明細書を参照されたい）；食欲を低減させるため（米国特許出願公開第２００４／４０２５３２７４号明細書を参照されたい）；歯科の治療及び処置のため（米国特許出願公開第２００４／０１１５１３９号明細書を参照されたい）；神経筋の障害及び状態を治療するため（米国特許出願公開第２００２／００１０１３８号明細書を参照されたい）；種々の障害及び状態、並びに付随する疼痛を治療するため（米国特許出願公開第２００４／００１３６９２号明細書を参照されたい）、疼痛を治療するため（国際公開第９６／３３２７４号パンフレットを参照されたい）；喘息及びＣＯＰＤなどの粘液分泌過多に起因する状態を治療するため（国際公開第００／１０５９８号パンフレットを参照されたい）；炎症、内分泌の状態、外分泌の状態、免疫学的状態、循環器の状態、骨の状態などの非神経性の状態を治療するため（国際公開第０１／２１２１３号パンフレットを参照されたい）について記載されている。上記の公報の全ては、それらを参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0007】

ヒト及びその他の哺乳類の治療用及び美容用の処置におけるクロストリジウム神経毒（例えばＢｏＮＴ及びＴｅＮＴ）などの非細胞毒性プロテアーゼの使用は、これらの毒素の特性から利益を受けることができる、ますます拡大する範囲の疾患及び病気に拡大することが予測される。

【0008】

非細胞毒性プロテアーゼ（天然クロストリジウム神経毒の臨床製品を含む）の投与は、有益な効果を達成するためにより多い用量が必要であるので、困難が伴い得る。より多い用量により、プロテアーゼが、例えば体の間質液及び循環系（例えば循環器及びリンパ系）を通って移動し、治療の標的でない領域へのプロテアーゼの望ましくない拡散をもたらす可能性が増加し得る。この拡散は、治療の標的でない細胞における細胞性分泌の阻害（例えば、治療の標的でないニューロンにおける神経伝達物質の放出の阻害、又は治療の標的でない筋肉の麻痺）などの望ましくない副作用を導き得る。具体例として、斜頚のために頚筋に治療上有効な量のＢｏＮＴを投与された患者は、中咽頭へのプロテアーゼの拡散により、嚥下障害を発生し得る。同様に、神経筋障害を治療するために非細胞毒性プロテアーゼを投与された患者は、筋肉へのプロテアーゼの拡散により、望ましくない筋組織不活化を患うことがある。

【0009】

その他のあらゆる薬物成分とも共通して、安全で効果的な療法の下限と上限を規定する治療量範囲が存在する。頻繁に、上限は、薬物治療の望ましくない（例えば潜在的に有害な）副作用を導くオフターゲットの効果の重要性が増加することにより決定される。非細胞毒性プロテアーゼ（特にＢｏＮＴ）の場合、これは、オフターゲットの細胞における細胞性分泌の麻痺を導くことができ、これは、次いで、致命的であり得る。

【0010】

より多い用量を必要とする療法における非細胞毒性プロテアーゼの臨床用、治療用及び美容用の使用が成長しているので、製薬産業の部分に対して、プロテアーゼの効力を維持しながらオフターゲットの効果を最小限にするための手段を開発することについての要求が拡大しており、このことにより、治療量範囲を増加させることができ、よって、患者に、増加した用量を与え、そして治療効力の増加を導くことができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】欧州特許第０６８９４５９号明細書

【特許文献2】欧州特許第０９３９８１８号明細書

【特許文献3】米国特許第６，４６１，６１７号明細書

【特許文献4】米国特許第７，１９２，５９６号明細書

【特許文献5】欧州特許第０８２６０５１号明細書

【特許文献6】米国特許第５，９８９，５４５号明細書

【特許文献7】米国特許第６，３９５，５１３号明細書

【特許文献8】米国特許第６，９６２，７０３号明細書

【特許文献9】欧州特許第０９９６４６８号明細書

【特許文献10】米国特許第７，０５２，７０２号明細書

【特許文献11】欧州特許第１１０７７９４号明細書

【特許文献12】米国特許第６，６３２，４４０号明細書

【特許文献13】米国特許第６，８７２，３９７号明細書

【特許文献14】米国特許出願公開第２００４／０１７５３９９号明細書

【特許文献15】米国特許出願公開第２００４／００８６５３１号明細書

【特許文献16】米国特許第６，３１９，５０５号明細書

【特許文献17】米国特許出願公開第２００４／０２３４５３２号明細書

【特許文献18】米国特許出願公開第２００４／０１５１７４０号明細書

【特許文献19】米国特許出願公開第２００４／０１２６３９６号明細書

【特許文献20】米国特許第６，８６９，６１０号明細書

【特許文献21】米国特許第６，６４１，８２０号明細書

【特許文献22】米国特許第６，４６４，９８６号明細書

【特許文献23】米国特許第６，１１３，９１５号明細書

【特許文献24】米国特許第６，６２３，７４２号明細書

【特許文献25】米国特許出願公開第２００４／００６２７７６号明細書

【特許文献26】米国特許出願公開第２００４／００３７８５２号明細書

【特許文献27】米国特許第６，４２３，３１９号明細書

【特許文献28】米国特許第６，８３８，４３４号明細書

【特許文献29】米国特許第６，７７６，９９２号明細書

【特許文献30】米国特許第６，４５８，３６５号明細書

【特許文献31】米国特許第５，７１４，４６９号明細書

【特許文献32】米国特許第６，７６７，５４４号明細書

【特許文献33】米国特許第６，６２０，４１５号明細書

【特許文献34】米国特許第６，３０６，４０３号明細書

【特許文献35】米国特許出願公開第２００４／０１８００６１号明細書

【特許文献36】米国特許出願公開第２００３／０２１１１２１号明細書

【特許文献37】米国特許第６，８２７，９３１号明細書

【特許文献38】米国特許第６，７４０，３２１号明細書

【特許文献39】米国特許第６，６８３，０４９号明細書

【特許文献40】米国特許第６，３３７，０７５号明細書

【特許文献41】米国特許第６，４１６，７６５号明細書

【特許文献42】米国特許第６，２６１，５７２号明細書

【特許文献43】米国特許第６，１４３，３０６号明細書

【特許文献44】米国特許第６，５６５，８７０号明細書

【特許文献45】米国特許第６，３６８，６０５号明細書

【特許文献46】米国特許第６，１３９，８４５号明細書

【特許文献47】米国特許出願公開第２００５／００３１６４８号明細書

【特許文献48】米国特許第６，３５８，９２６号明細書

【特許文献49】米国特許第６，２６５，３７９号明細書

【特許文献50】米国特許第５，４３７，２９１号明細書

【特許文献51】米国特許第５，６７０，４８４号明細書

【特許文献52】米国特許第６，０６３，７６８号明細書

【特許文献53】米国特許第６，２９９，８９３号明細書

【特許文献54】米国特許第６，３５８，９１７号明細書

【特許文献55】米国特許出願公開第２００４／４０２５３２７４号明細書

【特許文献56】米国特許出願公開第２００４／０１１５１３９号明細書

【特許文献57】米国特許出願公開第２００２／００１０１３８号明細書

【特許文献58】米国特許出願公開第２００４／００１３６９２号明細書

【特許文献59】国際公開第９６／３３２７４号パンフレット

【特許文献60】国際公開第００／１０５９８号パンフレット

【特許文献61】国際公開第０１／２１２１３号パンフレット

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.

【非特許文献2】William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004)

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

よって、望ましくないオフサイトターゲティングの影響に特異的に対処できる新しい療法及び／又は新しい治療剤に対する必要性が、当該技術において存在する。この必要性は、上記の問題点の１又は２以上を解決する本発明により対処される。

【0014】

国際公開第０２／０４４１９９号パンフレットにおいて、Lin, Wei-Jen et al.は、神経毒の結合ドメイン中に血液プロテアーゼ切断部位（すなわち、血液中に存在するプロテアーゼが切断できる部位）を含有し、そのことにより血液プロテアーゼとの接触が神経毒を選択的に不活性化するように改変されたクロストリジウム神経毒を提供することによりこの問題を解決することを試みている。上記の結合ドメイン（Ｈ_Ｃドメインともいう）は、Lin, Wei-Jen, et al.の図１Ｂに、アミノ酸残基８７３から開始する領域として示されている。しかしLin, et al.による上記の解決法は、いくつかの問題点を有し、オフサイトターゲティングの影響の問題を適切に解決しない。この関係において、本発明者らは、結合（Ｈ_Ｃ）ドメインが除去された（又は不活性化された）クロストリジウム神経毒が、まだ毒性であり、それらの標的ニューロンにてまだ阻害をもたらし得ることを同定した。このことは、本出願の図１（実施例３９を参照されたい）により確認され、この図は、結合（Ｈ_Ｃ）を欠くクロストリジウム神経毒分子（ＬＨＮ）によりＳＮＡＲＥタンパク質が切断されることを示している。国際公開第０２／０４４１９９号パンフレット（Lin, Wei-Jen, et al.）に関連するさらなる欠陥は、記載される技術が、Ｈ_Ｃ結合ドメインを有するクロストリジウム神経毒分子（すなわち、クロストリジウムホロトキシン分子）に限定されることである。しかし、既に論じたように、非細胞毒性プロテアーゼは、所望の標的細胞についての結合特異性を提供するターゲティング部分（ＴＭ）として知られる外因性リガンドを含むように天然プロテアーゼが改変されている再ターゲティングされた形態で用いることができる。よって、再ターゲティングされた非細胞毒性プロテアーゼの関係において、Lin, et al.の開示は、オフサイトターゲティングの影響の問題に対処できていない。

【0015】

本発明は、Lin, et al.の欠陥に対処し、標的でない領域への拡散に伴う望ましくない副作用を低減又は妨げる非細胞毒性プロテアーゼを提供する。これらの及び関連する利点は、神経筋障害、神経障害性障害、眼障害、疼痛、筋肉損傷、頭痛、循環器疾患、精神神経障害、内分泌障害、外分泌障害、喘息及びＣＯＰＤなどの粘液分泌関連障害、癌、耳障害並びに多動性の顔のしわ、並びに哺乳類への非細胞毒性プロテアーゼの投与が有益な影響を生じ得るその他の障害の治療（例えば本明細書の２〜３頁に記載される全ての療法）などの、種々の臨床用、治療用及び美容用の用途にとって有用である。

【0016】

より詳細には、本発明の第１の態様は：
ａ．ＳＮＡＲＥタンパク質を切断可能な非細胞毒性プロテアーゼと、
ｂ．哺乳動物細胞のエンドソームの中から、エンドソーム膜を横切って、哺乳動物細胞のサイトゾル中に非細胞毒性プロテアーゼを転移（translocation）可能な転移ドメインと、
ｃ．第２プロテアーゼにより切断可能であるが非細胞毒性プロテアーゼにより切断可能でない第１破壊性切断部位と、
ｄ．エンドサイトーシスを受けて、哺乳動物ニューロン内のエンドソーム中に組み込まれることが可能である、哺乳動物ニューロン上に存在する結合部位と結合するターゲティング部分（ＴＭ）と
を含むポリペプチドであって、
第２プロテアーゼによるその切断後に、上記のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する能力の低下及び／又はエンドソーム膜を横切って上記の非細胞毒性プロテアーゼを転移させる能力の低下により測定可能な効力の低下を有し、
ｅ．上記の第１破壊性切断部位が、上記のＴＭ内にないことを条件とする
ポリペプチドを提供する。

【0017】

よって、本発明は、制御可能に不活性化され、かつ／又はオフサイトの位置にて破壊され得るポリペプチドを提供する。

【0018】

ある実施形態において、破壊性切断部位は、循環性プロテアーゼ（例えば、血清プロテアーゼ又は血液凝固カスケードのプロテアーゼなどの細胞外プロテアーゼ）、組織関連プロテアーゼ（例えば、筋肉のマトリクスメタロプロテアーゼ（matrix metalloprotease、ＭＭＰ）などのＭＭＰ）、及び細胞内プロテアーゼ（好ましくは、標的細胞に存在しないプロテアーゼ））から選択される第２プロテアーゼ（すなわち破壊性プロテアーゼ）により認識され、切断される。

【0019】

つまり、使用にあたって、本発明のポリペプチドは、その意図する標的細胞から離れて拡散し、且つ／又は標的でない細胞により取り込まれるようになるが、該ポリペプチドは、破壊性切断部位の（第２プロテアーゼによる）切断により不活性化される。

【0020】

ある実施形態において、破壊性切断部位は、オフサイトの細胞タイプ中に存在する第２プロテアーゼにより認識され、切断される。この実施形態において、オフサイト細胞及び標的細胞は、好ましくは異なる細胞タイプである。代わりに（又はそれに加えて）、破壊性切断部位は、オフサイトの位置（例えば標的細胞から遠位）に存在する第２プロテアーゼにより認識され、切断される。よって、破壊性の切断が細胞外で生じる場合、標的細胞とオフサイト細胞とは、同じ又は異なる細胞タイプのいずれかであってよい。この関係において、標的細胞とオフサイト細胞とはそれぞれ、本発明の同じポリペプチドが結合する受容体を有してよい。

【0021】

例えば、神経筋障害を治療する場合に、本発明のポリペプチドは、所望の標的細胞（例えば運動ニューロン）を標的にし、筋肉組織中及び／又は筋肉組織の近傍に存在する第２プロテアーゼにより切断される破壊性プロテアーゼ切断部位を含む。よって、ポリペプチドは、筋肉組織に対して最小限の有害な影響を示し、患者により現在許容可能な用量よりも多い用量で用いることができるので、臨床効力が増進される。

【0022】

本発明の破壊性切断部位は、ポリペプチドがオフサイトの位置中又はオフサイトの位置にある場合に、ポリペプチドの不活性化／破壊をもたらす。この関係において、破壊性切断部位での切断は、（サイトゾルの方向に向けて哺乳動物細胞のエンドソーム膜を横切って）非細胞毒性構成要素を転移させ、且つ／又はＳＮＡＲＥタンパク質切断をもたらすポリペプチドの固有の能力を（同じ破壊性切断部位を欠くか、又は切断されない形態で同じ破壊性部位を有する同一ポリペプチドと比較した場合に）低減することにより、ポリペプチドの効力を最小限にする。

【0023】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、第２（又は後続の）不活性化／破壊部位を含んでよい。上記の（又は後続の）第２部位は、ポリペプチド内のどの位置にあってもよい（ＴＭ構成要素内を含む）。上記の第２（又は後続の）部位は、同じ又は異なるプロテアーゼにより切断され得る。上記の第２（又は後続の）部位は、第１不活性化／破壊部位とは異なるアミノ酸認識配列を有してよく、同じ又は異なるプロテアーゼにより切断されてよい。

【0024】

上記の低減したＳＮＡＲＥ切断及び／又は低減した転移能力は、本発明のポリペプチドを、同一のポリペプチド（同じ破壊性切断部位を欠くか、又は切断されない形態で同じ破壊性部位を有する）と直接比較することにより容易に測定できる。より詳細には、本発明のポリペプチド及び対応する切断されない対応物は、多様な従来の全細胞又は無細胞アッセイのいずれか１つにおいて並行してアッセイしてよい。例えば、実施例１〜４を参照する。上記のアッセイ中に、本発明のポリペプチドは不活性化されるが（破壊性切断部位での切断により）、対応ポリペプチドは、完全な能力を実質的に保持する。よって、本発明の関係において、破壊性切断部位にて切断される場合に、本発明のポリペプチドは、切断されない対応ポリペプチドと比較すると、５０％未満若しくは２５％未満、１０％未満若しくは５％未満、１％未満若しくは０．５％未満、０．１％未満若しくは０．０１％未満、又は０．００１％未満若しくは０．０００１％未満のＳＮＡＲＥタンパク質切断能力及び／又は低減した転移能力を有する。

【0025】

全細胞アッセイの関係において、低減したＳＮＡＲＥ切断及び／又は低減した転移能力は、哺乳動物細胞における相対的ＳＮＡＲＥタンパク質切断を測定することにより決定し得る。これは、哺乳動物細胞のサイトゾルにＳＮＡＲＥタンパク質を転移し、その後、サイトゾル内でこれを切断するポリペプチドの全体的な能力を反映する。例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びウェスタンブロッティングとその後の切断生成物のデンシトメータ分析のように、ＳＮＡＲＥタンパク質切断を測定するために多様な方法がある。

【0026】

無細胞アッセイの関係において、能力は、相対的ＳＮＡＲＥタンパク質切断の点で、又は相対的転移機能の点で（例えばリポソームからのＫ^＋若しくはＮＡＤの放出、又は膜コンダクタンス測定）測定できる。

【0027】

好ましいオフサイト標的（及び上記のアッセイについて好ましい哺乳動物細胞）は、上皮細胞、特に肺上皮細胞、運動ニューロンでないニューロン、及び筋細胞を含む。

【0028】

実施例３９に関して、改変クロストリジウム神経毒（ＬＨ_Ｎ／Ｃ）が提供された。この神経毒は、機能的Ｈ_Ｃ結合ドメインを欠くので、Lin, et al.の改変神経毒（すなわち、本明細書の背景技術の部分で論じたような）を模倣する。上記の改変神経毒を、哺乳動物細胞（例えば、胚性脊髄ニューロン（embryonic spinal cord neuron、ｅＳＣＮ））の存在下でインキュベートして、ＳＮＡＲＥタンパク質切断の形態のクロストリジウム神経毒残存活性を示すその能力を評価した。並行して、Ｃ型ボツリヌス神経毒（ＬＣ／Ｃ）のエンドペプチダーゼドメインのみからなる対照神経毒を、同じ様式でインキュベートした。対照神経毒は、よって、機能的Ｈ_Ｎ転移ドメインを欠いていた。２つのポリペプチドのそれぞれを、次いで、試験細胞におけるＳＮＡＲＥタンパク質の切断について評価した。驚くべきことに、ＬＨ_Ｎ／Ｃ改変クロストリジウム神経毒はＳＮＡＲＥ切断を示し（図１を参照されたい）、よって、ボツリヌス神経毒のＨ_Ｃ結合ドメインの不活性化が、オフサイト活性を低減させるために適切でないことが確認された。これとは対照的に、対照神経毒（機能的転移構成要素を欠く）は、ＳＮＡＲＥ切断の欠如を示した。

【0029】

上記のように、本発明のポリペプチドは、１又は２以上（例えば２、３、４、５以上）の破壊性プロテアーゼ切断部位を含み得る。１より多い破壊性切断部位が含まれる場合、各切断部位は、同じ又は異なっていてよい。この関係において、１より多い破壊性切断部位の使用は、オフサイト不活性化の改善をもたらす。同様に、２以上の異なる破壊性切断部位の使用は、さらなる設計の柔軟性をもたらす。例えば、筋肉組織においてオフサイト標的の影響を最小限にする場合、本発明のポリペプチドは、２つの異なる筋肉組織関連プロテアーゼにより認識されて切断される２つの異なる破壊性部位を含み得る。

【0030】

第１破壊性切断部位（複数可）は、非細胞毒性プロテアーゼ構成要素又は転移構成要素中に工学的に作製してよい。第２（又は後続の）部位（複数可）は、ポリペプチド中のどこに工学的に作製してもよい。この関係において、破壊性切断部位（複数可）は、ポリペプチドがその標的部位／標的細胞から離れていては不安定であることを確実にしながら、（例えば、転移ドメイン及び／又は非細胞毒性プロテアーゼドメインに対する影響を最小限にすることにより）ポリペプチドの能力に対する最小限の有害な影響を確実にするように選択される。

【0031】

好ましい破壊性切断部位（及び対応する第２プロテアーゼ）を、直後の表に列挙する。列挙された切断部位は、単純に説明のためであり、本発明を限定することを意図しない。

【0032】

【表1】

【0033】

本発明は、トロンビン、凝固第VIIａ因子、凝固第IXａ因子、凝固第Ｘａ因子、凝固第XIａ因子、凝固第XIIａ因子、カリクレイン、プロテインＣ及びＭＢＰ関連セリンプロテアーゼなどの哺乳動物血液プロテアーゼにより切断可能な破壊性切断部位を採用し得る。

【0034】

Lin, et al.は、クロストリジウムホロトキシンのＨ_Ｃ結合ドメインを不活性化するためのトロンビン切断部位又は第Ｘａ因子切断部位の使用について記載している。上で論じたように、しかし、Ｈ_Ｃ不活性化は、所望のオフサイト不活性化を達成するために不適切である。さらに、開示される切断部位が少数である（pausity）ために、Lin, et al.により記載される方法は、例えばトロンビン及び第Ｘａ因子が存在しない（又は低濃度でのみ存在する）オフサイト環境において有用性が限定される。

【0035】

マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、本発明の関係において好ましい破壊性プロテアーゼの群である。この群において、ＴＡＣＥとしても知られるＡＤＡＭ１７（ＥＣ３．４．２４．８６）が好ましく、これは、多様な膜繋留細胞表面タンパク質を切断して、細胞外ドメインを「切り落とす」。さらに、好ましいＭＭＰは、アダマライシン、セラライシン及びアスタシンを含む。

【0036】

本発明のある実施形態において、上記の破壊性切断部位（複数可）は、少なくとも３又は４、好ましくは５又は６、より好ましくは６又は７、特に好ましくは少なくとも８の連続アミノ酸残基を有する認識配列を含む。この関係において、認識配列が長ければ長いほど（連続アミノ酸残基の点で）、意図しない第２プロテアーゼによる破壊性部位の非特異的切断が起こりにくい。

【0037】

本発明のポリペプチドは、ニューロン（例えば神経細胞）上の結合部位と結合することにより、他の細胞よりも標的細胞のこの種に対するポリペプチドの選択性をもたらすターゲティング部分（ＴＭ）を含んでいてもよい。ある実施形態において、ニューロンは、神経筋接合部又はシナプス前コリン作動性末梢神経終末の細胞である。

【0038】

本発明の第１（及び後続の）破壊性切断部位（複数可）は、好ましくは、プロテアーゼ構成要素及び／又は転移構成要素中に導入される。これらの２つの構成要素のうち、プロテアーゼ構成要素が好ましい。よって、ポリペプチドは、非細胞毒性プロテアーゼ及び／又は転移構成要素の直接の破壊により迅速に不活性化され得る。これらの挿入位置は、ＴＭ挿入位置よりも好ましい。なぜなら、完全なＴＭ不活性化の場合でさえ、得られたポリペプチドは、オフサイト細胞に対して適切に低減された能力を示さないことがあることが示されているからである［Chaddock, JA., et al. Protein Expression Purification 2002, 25, 219-228及びSutton, JM, et al. Protein Expression & Purification 2005, 40(1), 31-41］。

【0039】

よって、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのターゲティング部分構成要素内だけに破壊性切断部位（複数可）を含むことはない。いずれの理論に拘束されることも望まないが、ＴＭ構成要素単独の中に破壊部位を用いることは、オフサイト標的細胞による非特異的取り込みに対して対処しないと考えられる。実施例３９（図１も参照されたい）は、結合ドメインＨ_Ｃを欠くＣ型ボツリヌス神経毒のフラグメントがなお、ｅＳＣＮに侵入し、その基質であるＳＮＡＲＥタンパク質（シンタキシン）を切断できることを示す。さらなる可能性は、ＴＭ構成要素内での切断が、オフサイト細胞に対する結合親和性が増加したＴＭを、例えばＴＭ内のより高い親和性結合領域の露出により導く可能性があるということである。まとめると、ＴＭ構成要素単独の中で破壊性切断部位（複数可）を用いることは、不満足であると考えられる。第１に、オフサイトターゲティングが適切に対処されておらず、第２に、オフサイト細胞に一旦送達されると、ポリペプチドは、依然として、（野生型／天然の）転移活性及び／又はＳＮＡＲＥタンパク質切断活性を示すことができる。

【0040】

ＴＭは、破壊性切断部位を有さないことが好ましい。この関係において、ＴＭ構成要素が、ポリペプチドの所望の結合に不利に影響する有害な立体構造変化（破壊性切断部位の挿入による）に対して特に感受性であり得ることが示されている。このことは、ＴＭが、クロストリジウム神経毒の天然のターゲティング部分（すなわちＨ_Ｃ）である場合に、特に問題となることが示されている。

【0041】

本発明のポリペプチドにおいて用いるために適切なＴＭは、サイトカイン、成長因子、神経ペプチド、レクチン、タンパク質結合スカフォールド及び抗体を含み、抗体という用語は、モノクローナル抗体、及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’_２、Ｆｖ、ＳｃＦｖなどの抗体フラグメントを含む。

【0042】

ＴＭは、ニューロン、好ましくは神経筋接合部のニューロンと結合するリガンド（好ましくはペプチド）である。この関係において、ある実施形態において、ＴＭは、クロストリジウム神経毒（例えばＢｏＮＴ、ＴｅＮＴ又はその他のクロストリジウム種（Clostridium spp.）から）の結合ドメイン（Ｈ_ＣＣ若しくはＨ_Ｃ）、又は天然の神経毒結合能力を有するそのフラグメントを含む。クロストリジウムＨ_Ｃドメインは、非常に効果的な様式で、ニューロン上に存在する受容体と結合するように進化してきた。この後者の実施形態に従って、本発明は、BOTOX（商標）を改変して、その臨床上有用性を改善するための使用及び対応する方法を提供する。例えば、適切なＴＭクロストリジウムＨ_ＣＣ参照配列は、以下のものを含む：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１１１〜Ｌ１２９６）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１０９８〜Ｅ１２９１）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１１２〜Ｅ１２９１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１０９９〜Ｅ１２７６）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１０８６〜Ｋ１２５２）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１０６〜Ｅ１２７４）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１０６〜Ｅ１２９７）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１２８〜Ｄ１３１５）。

【0043】

上で同定される参照配列は、サブ血清型によってわずかな変動が生じ得るので、手引きとみなすべきである。

【0044】

同様に、例えば、参照配列の適切なＴＭクロストリジウムＨ_Ｃドメインは、ＢｏＮＴ／Ａ−Ｎ８７２〜Ｌ１２９６；ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｅ８５９〜Ｅ１２９１；ＢｏＮＴ／Ｃ１−Ｎ８６７〜Ｅ１２９１；ＢｏＮＴ／Ｄ−Ｓ８６３〜Ｅ１２７６；ＢｏＮＴ／Ｅ−Ｒ８４６〜Ｋ１２５２；ＢｏＮＴ／Ｆ−Ｋ８６５〜Ｅ１２７４；ＢｏＮＴ／Ｇ−Ｎ８６４〜Ｅ１２９７；及びＴｅＮＴ−Ｉ８８０〜Ｄ１３１５を含む。

【0045】

別の実施形態において、ＴＭは、神経筋接合部との所望の結合をもたらすように選択される。適切なＴＭは、国際公開第２００６／０９９５９０号パンフレット（これは、それを参照することにより本明細書に組み込まれる）に列挙され、グルカゴン様ホルモン、ニューロホルモン、神経調節性サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、軸索ガイダンスシグナル伝達分子、糖結合性タンパク質、ニューレキシンと選択的に結合するリガンド、ニューレキシン２αのリガンド、ニューレキシン２βのリガンド、ニューレキシン３αのリガンド、ニューレキシン３βのリガンド、ＷＮＴ、Ｎｇ−ＣＡＭ（ＬＩ）、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、ＶＩＰペプチドなどのＰＡＣＡＰペプチド、アグリン−ＭＵＳＫ、基底膜ポリペプチド、及び上記のポリペプチドのいずれかのバリアント、毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor、ＣＮＴＦ）、グリコホリンＡ（glycophorin-A、ＧＰＡ）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor、ＬＩＦ）、インターロイキン（interleukin、ＩＬ）、オノスタチン（onostatin）Ｍ、カルジオトロフィン１（cardiotrophin-1、ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（cardiotrophin-like cytokine、ＣＬＣ）、ニューロロイキン、ＶＥＧＦ、インスリン様成長因子（insulin-like growth factor、ＩＧＦ）、上皮成長因子（epidermal growth factor、ＥＧＦ）、及び上記の神経調節性サイトカインのいずれかのバリアントなどの神経調節性サイトカインを含む。これら及びその他のＴＭは、クロストリジウム神経毒の結合能力を模倣するので、本発明において用いるために選択される。

【0046】

上記のように、破壊性切断部位（複数可）は、ポリペプチドの生物学的特性（特に、エンドペプチダーゼ活性及び／又は膜転移活性）に対する有害な影響を最小限にして導入される。この関係において、ポリペプチドの能力における可能性のあるいかなる減少も（上記の破壊性切断部位（複数可）を欠く同じポリペプチドと比較して）、未改変の元のタンパク質の２５％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは５％未満であることが好ましい。ここでいう能力は、実施例１〜４に記載するような比較アッセイにより測定し得る。

【0047】

本発明の関係において破壊性切断部位（複数可）を選択する場合、破壊性切断部位（複数可）は、本発明のポリペプチドの製造プロセスの一部としてその翻訳後修飾のために別個に用いる可能性があるいずれのプロテアーゼの基質でもないことが好ましい。この関係において、本発明の非細胞毒性プロテアーゼは、（本発明の破壊性切断部位とは構造的に異なる別個の「活性化」プロテアーゼ切断部位による）プロテアーゼ活性化事象を典型的に採用する。活性化切断部位の目的は、非細胞毒性プロテアーゼと、本発明のポリペプチドの転移又はＴＭ構成要素との間のペプチド結合を切断することにより、これらの２つの構成要素がジスルフィド結合により一緒に連結された「活性化された」２本鎖ポリペプチドを提供することである。

【0048】

天然のクロストリジウムホロトキシンにおいて、２本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、ＢｏＮＴ／ＡについてＫ４４８〜Ａ４４９、ＢｏＮＴ／ＢについてＫ４４１〜Ａ４４２、ＢｏＮＴ／Ｃ１についてＫ４４９〜Ｔ４５０、ＢｏＮＴ／ＤについてＲ４４５〜Ｄ４４６、ＢｏＮＴ／ＥについてＲ４２２〜Ｋ４２３、ＢｏＮＴ／ＦについてＫ４３９〜Ａ４４０、ＢｏＮＴ／ＧについてＫ４４６〜Ｓ４４７、及びＴｅＮＴについてＡ４５７〜Ｓ４５８に存在する。よって、本発明のポリペプチドの破壊性切断部位が「活性化」切断部位及び後続のジスルフィド結合形成に不利に影響しないことを確実にすることを補助するために、前者を、本発明のポリペプチドに、「活性化」切断部位から少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、及びより好ましくは少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０（連続）アミノ酸残基離れた位置に導入することが好ましい。この関係において、本発明のポリペプチドの活性化部位は、クロストリジウムホロトキシンの活性化部位の位置（上で列挙した）と容易に位置合わせできる（単純な１次配列アラインメントにより）。

【0049】

破壊性切断部位（複数可）は、ポリペプチドの天然の構成要素に関して外因性（すなわち工学的に操作された／人工）であることが好ましい。言い換えると、上記の切断部位は、ポリペプチドの対応する天然の構成要素に固有でないのが好ましい。例えば、ＢｏＮＴ／ＡのＬ鎖又はＨ鎖（それぞれ）に基づくプロテアーゼ又は転移構成要素を、切断部位（複数可）を含むように本発明に従って工学的に操作し得る。上記の切断部位（複数可）は、しかし、対応するＢｏＮＴの天然のＬ鎖又はＨ鎖には存在しない。

【0050】

本発明の好ましい実施形態において、破壊性切断部位（複数可）及び「活性化」切断部位は、同じプロテアーゼにより切断されない。ある実施形態において、２つの切断部位は、それぞれの認識配列内の少なくとも１、より好ましくは少なくとも２、特に好ましくは少なくとも３、最も好ましくは少なくとも４の許容されるアミノ酸が異なるように互いに異なっている。

【0051】

例えば、クロストリジウムＬ鎖とＨ_Ｎ構成要素との間に第Ｘａ因子「活性化」部位を含有するポリペプチドキメラの場合において、第Ｘａ因子部位以外の部位である破壊性切断部位（複数可）を用いることが好ましく、これは、Ｌ鎖及び／又はＨ_Ｎ構成要素（複数可）内の他の場所に挿入され得る。この筋書きにおいて、ポリペプチドは、Ｌ鎖とＨ_Ｎ構成要素との間に代替の「活性化」部位（例えばエンテロキナーゼ切断部位）を収容できるように改変されてよく、この場合、別個の第Ｘａ因子切断部位（複数可）を、ポリペプチドの他の場所に、破壊性切断部位として組み込むことができる。代わりに、現存する第Ｘａ因子「活性化」部位をＬ鎖とＨ_Ｎ構成要素との間に保持して、トロンビン切断部位などの代替の切断部位を、破壊性切断部位（複数可）として組み込むことができる。

【0052】

切断部位（複数可）を含めるために本発明の構成要素のいずれかの１次配列内に適切な部位を同定する場合、挿入されることとなる、提案される切断部位（複数可）と密接に一致する１次配列を選択することが好ましい。このようにすることにより、最小限の構造変化がポリペプチドに導入される。例えば、切断部位は、典型的には、少なくとも３の連続アミノ酸残基を含む。よって、好ましい実施形態において、新しい切断部位を導入するために必要なアミノ酸残基の少なくとも１、好ましくは少なくとも２を（対応する位置（複数可）に）既に有する切断部位が、選択される。例えば、カスパーゼ３切断部位（DMQD）が導入される場合、例えばDxxx、xMxx、xxQx、xxxD、DMxx、DxQx、DxxD、xMQx、xMxD、xxQD、DMQx、xMQD、DxQD及びDMxDから選択される１次配列を既に含む好ましい挿入位置が同定され得る。

【0053】

クロストリジウム神経毒の３次元構造の分析により、本発明者らは、破壊性部位配列（複数可）の挿入のための一連の適切な露出領域（特に露出ループ領域）を同定した。この分析は、主にCell & Molecular Life Sciences中のChaddock & Marks (2006), 63, 540-551と、付加的な参考としてhttp://pathema.tigr.org/pathema/BoNT_structures.shtml；Lacy and Stevens, 1999, J. Mol Biol., 291, 1091-1104と、以下の表とに基づいている。

【0054】

【表2】

【0055】

上記のＰＤＢ識別は、構造データベースへの具体的なエントリーを同定するために、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）により用いられている４文字コードである。

【0056】

採用されるさらなる技術は、ペプチド／抗体マッピング情報、例えばＨＣ／Ａ（Dolimbek, BZ, 2007, Mol Immunol., 44(5): 1029-41）、ＨＮ／Ａ（Atassi MZ, 2004, Protein J. 23(1):39-52）、Ｈ_Ｃ／Ａ（Oshima M., 1998, Immunol Lett., 60(1):7-12; Bavari, S 1998, Vaccine, 16(19): 1850-6）、ＨＣ／Ｅ（Kubota T, 1997, Appl Environ Microbiol. 63(4): 1214-8）の表面上の部位の抗体マッピングを用いること（ＢｏＮＴ血清型内のエピトープのリストは、http://pathema.tigr.org/pathema/BoNT_epitopes.shtmlにて維持され、公共に利用可能である）、及び具体的なペプチド領域の溶媒露出度を予測するための構造予測ソフトウェアを用いること（公共に利用可能なソフトウェアの例は、Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org）；ESyPred3D（http://www.fundp.ac.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/esypred）及びGeno3D（http://geno3d-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/geno3d_automat.pl?page=/GENO3D/geno3d_home.html）を含む）を含む。

【0057】

本発明のある実施形態において、破壊性切断部位（複数可）は、ＢｏＮＴ／Ａの１次アミノ酸配列に基づく（便宜上）、以下の位置（複数可）の１又は２以上にて導入される。挿入位置はＢｏＮＴ／Ａを参照して同定するが、ＢｏＮＴ／Ｂ〜Ｇなどについての対応するプロテアーゼドメイン及び／又は転移ドメインの１次アミノ酸配列は、上記のＢｏＮＴ／Ａの位置と容易に位置合わせできる。例えば、我々は、図２に示す血清型アラインメントを参照する。

【0058】

プロテアーゼ構成要素について、以下の位置の１又は２以上が好ましい：２７位〜３１位、５６位〜６３位、７３位〜７５位、７８位〜８１位、９９位〜１０５位、１２０位〜１２４位、１３７位〜１４４位、１６１位〜１６５位、１６９位〜１７３位、１８７位〜１９４位、２０２位〜２１４位、２３７位〜２４１位、２４３位〜２５０位、３００位〜３０４位、３２３位〜３３５位、３７５位〜３８２位、３９１位〜４００位及び４１３位〜４２３位。上記の番号付けは、好ましくは、本発明のプロテアーゼ構成要素のＮ末端から開始する。これらの位置のうち、９９位〜１０５位及び／又は２０２位〜２１４位が最も好ましい。この関係において、図２を参照して、９９位〜１０５位は、Ａ血清型について「YSTDLGR」の配列に相当し、これは、Ｂ血清型について領域「KSKPLGE」、Ｃ_１血清型について「NSREIGE」、Ｄ血清型について「NERDIGK」、Ｅ血清型について「NNNLSGG」、Ｆ血清型について「NSNPAGQ」、そしてＧ血清型について「NSKPSGQ」と等しい。同様に、図２を参照して、２０２位〜２１４位は、Ａ血清型について「VDTNPLLGAGKFA」の配列に相当し、これは、Ｂ血清型について領域「NKGASIFNRRGYF」、Ｃ_１血清型について「DVGEGRFSKSEFC」、Ｄ血清型について「NQSSAVLGKSIFC」、Ｅ血清型について「DNC ----MN--EFI」、Ｆ血清型について「DN-----TD--LFI」、そしてＧ血清型について「ENKDTSIFSRRAYF」と等しい。そして、それぞれ、図２の上部の番号付けを用いて「Ｐ」（２０２）は「Ｐ」。

【0059】

好ましい実施形態において、破壊性切断部位（複数可）は、プロテアーゼ構成要素のＮ末端から８アミノ酸残基超、好ましくは１０アミノ酸残基超、より好ましくは２５アミノ酸残基超、特に好ましくは５０アミノ酸残基超の位置にある。同様に、好ましい実施形態において、破壊性切断部位（複数可）は、プロテアーゼ構成要素のＣ末端から２０アミノ酸残基超、好ましくは３０アミノ酸残基超、より好ましくは４０アミノ酸残基超、特に好ましくは５０アミノ酸残基超の位置にある。

【0060】

転移構成要素について、以下の位置の１又は２以上が好ましい：４７４位〜４７９位、４８３位〜４９５位、５０７位〜５４３位、５５７位〜５６７位、５７６位〜５８０位、６１８位〜６３１位、６４３位〜６５０位、６６９位〜６７７位、７５１位〜７６７位、８２３位〜８３４位、８４５位〜８５９位。上記の番号付けは、好ましくは、本発明の転移ドメイン構成要素のＮ末端についての４４９位の開始位置、及びＨ_Ｎ構成要素のＣ末端についての８７１位の開始位置を確認する。これらの位置のうち、５５７位〜５６７位及び／又は７５１位〜７６７位が最も好ましい。この関係において、図２を参照して、５５７位〜５６７位は、Ａ血清型について「QEFEHGKSRIA」の配列に相当し、これは、Ｂ血清型について領域「QTFPLDIRDIS」、Ｃ_１血清型について「QKLSDNVEDFT」、Ｄ血清型について「QKLSNNVENIT、Ｅ血清型について「QKVPEGENNVN」、Ｆ血清型について「QKAPEGESAIS」、そしてＧ血清型について「QTFPSNIENLQ」と等しい。同様に、図２を参照して、７５１位〜７６７位は、Ａ血清型について「YNQYTEEEKNNINNID」の配列に相当し、これは、Ｂ血清型について領域「YNIYSEKEKSNIN--IDFN」、Ｃ_１血清型について「YKKYSGSDKENIKS--QVE」、Ｄ血清型について「YKKYSGSDKENIKS--QVE」、Ｅ血清型について「YNSYTLEEKNELTNKYDIK」、Ｆ血清型について「YNNYTLDEKNRLRAEYNIY」、そしてＧ血清型について「YNRYSEEDKMNIN--IDFN」と等しい。

【0061】

好ましい実施形態において、破壊性切断部位（複数可）は、転移構成要素のＮ末端から１０アミノ酸残基超、好ましくは２５アミノ酸残基超、より好ましくは４０アミノ酸残基超、特に好ましくは５０アミノ酸残基超の位置にある。同様に、好ましい実施形態において、破壊性切断部位（複数可）は、転移構成要素のＣ末端から１０アミノ酸残基超、好ましくは２５アミノ酸残基超、より好ましくは４０アミノ酸残基超、特に好ましくは５０アミノ酸残基超の位置にある。

【0062】

本発明の第２の態様によると、一連の多様な医療状態及び疾患を治療するための非細胞毒性ポリペプチドの使用が提供される。上記の異常及び疾患は、非常に密接に関連する（しかし、本発明によると未改変である）非細胞毒性ポリペプチドに基づいて療法が確立されている（本明細書の背景技術の部分を参照されたい）。よって、本発明は、破壊性切断部位を有し、そのことによりオフサイトの影響が低減された改変非細胞毒性ポリペプチドを用いることにより、上記の療法を改善する。

【0063】

特に、本発明は、斜視（strabismus）、眼瞼痙攣、藪睨（squint）、痙攣性及び顎口腔ジストニア、斜頚の治療、並びに（ＳＮＡＲＥの下方制御又は不活性化による）細胞／筋肉の無能力化により利益を受けるその他の美化療法（美容）の用途のための使用及び対応する方法を提供する。

【0064】

さらに、眼球運動の神経筋異常（condition）又は疾患、例えば共動及び上下斜視、外側直筋麻痺、眼振、甲状腺不全性筋疾患など；ジストニア、例えば痙攣性斜頚、書痙、眼瞼痙攣、顎口腔ジストニア及びその症状、例えば歯ぎしり、ウィルソン病、遅発性ジストニア、喉頭ジストニアなどの限局性ジストニア；その他のジストニア、例えば振戦、チック、分節性ミオクローヌス；慢性多発性硬化症による痙攣、例えば脊髄損傷の患者における異常膀胱制御をもたらす痙攣、アニスムス（anismus）、背部攣縮、筋肉のつりなどの攣縮；筋収縮性頭痛；挙筋骨盤症候群；二分脊椎症、遅発性ジスキネジア；パーキンソン病及び四肢（限局性）ジストニア並びに吃音症などの治療のための関連する療法が提供される。

【0065】

使用において、本発明のポリペプチドは、標的細胞上に存在し、好ましくは標的細胞に特徴的である表面構造（結合部位）と結合する。結合の後に、ポリペプチド（少なくともそのプロテアーゼ構成要素）は、小胞中に飲食され、次いで、転移構成要素が、エンドソーム膜を横切って標的細胞のサイトゾル中へのプロテアーゼ構成要素の輸送を導く。標的細胞の内部に一旦入ると、非細胞毒性プロテアーゼは、細胞性開口分泌融合プロセスを阻害し、そのことにより、標的細胞からの放出／分泌を阻害する。

【0066】

本発明のポリペプチドの生物活性構成要素は、非細胞毒性プロテアーゼである。非細胞毒性プロテアーゼは、細胞を死滅させない分子の孤立したクラスである。代わりに、これらは、タンパク質合成以外の細胞性プロセスを阻害することにより作用する。非細胞毒性プロテアーゼは、多様な植物により、そしてクロストリジウム種及びナイセリア種（Neisseria sp.）などの多様な微生物により、より大きい毒素分子の一部として生成される。

【0067】

クロストリジウム神経毒は、非細胞毒性毒素分子の主要な群であり、ジスルフィド結合により一緒に連結された２つのポリペプチド鎖を含む。２つの鎖は、およそ１００ｋＤａの分子質量を有する重鎖（Ｈ鎖）と、およそ５０ｋＤａの分子質量を有する軽鎖（Ｌ鎖）と命名されている。プロテアーゼ機能を有し、小胞及び／又は開口分泌プロセスに関与する細胞膜関連（ＳＮＡＲＥ）タンパク質（例えばシナプトブレビン、シンタキシン又はＳＮＡＰ−２５）に対する高い基質特異性を示すのは、Ｌ鎖である。これらの基質は、神経分泌機構の重要な構成要素である。

【0068】

最も重要には淋菌（N. gonorrhoeae）の種からのナイセリア種は、機能的に類似する非細胞毒性毒素分子を生成する。このような非細胞毒性プロテアーゼの例は、ＩｇＡプロテアーゼである（国際公開第９９／５８５７１号パンフレットを参照されたい）。

【0069】

ＴＭの選択は、ポリペプチドの特異性を決定する。例えば、同じ（又は類似する）受容体が、１つのＴＭが異なる細胞タイプと結合するようにいくつかの異なる細胞上に存在することがある。この筋書きにおいて、単一の細胞タイプを標的にすることが望まれる可能性がある。よって、本発明のポリペプチド中に、１又は２以上の望ましくない細胞（及び／又はその環境）に特異的なプロテアーゼにより切断される第２プロテアーゼ（「破壊」）切断部位を採用することにより、望ましくない細胞におけるオフターゲット副作用を最小限にすることができる。

【0070】

別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、異なる標的細胞タイプと結合可能な２以上の異なるＴＭを含み得る。代わりに（又はさらに）、異なる標的細胞タイプの連係したターゲティングをもたらすように異なるＴＭを有するポリペプチドの組合せを採用してよい。

【0071】

ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、４つの主要な構成要素、すなわちＴＭと、非細胞毒性プロテアーゼと、転移ドメインと、破壊性プロテアーゼ切断部位とを含む。上記のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒などの非細胞毒性ホロトキシンと、外因性ＴＭが存在する場合に、再ターゲティングされたキメラ（再ターゲティングされたプロテアーゼとしばしばよばれる）とを包含する。これらの分子の調製は、従来のものである。例えば、我々は、国際公開第９４／２１３００号パンフレット；国際公開第９６／３３２７３号パンフレット；国際公開第９８／０７８６４号パンフレット；国際公開第００／１０５９８号パンフレット；国際公開第０１／２１２１３号パンフレット；国際公開第０６／０５９０９３号パンフレット；国際公開第００／６２８１４号パンフレット；国際公開第００／０４９２６号パンフレット；国際公開第９３／１５７６６号パンフレット；国際公開第００／６１１９２号パンフレット；及び国際公開第９９／５８５７１号パンフレットを参照する。これらの公報の全ては、それらを参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0072】

より詳細には、本発明のＴＭ構成要素は、本発明のプロテアーゼ構成要素又は転移構成要素のいずれかと融合してよい。上記の融合は、例えば直接的共有結合又はスペーサー／リンカー分子を介するいずれかの共有結合によることが好ましい。プロテアーゼ構成要素と転移構成要素とは、例えば直接的共有結合又はスペーサー／リンカー分子を介するいずれかの共有結合により一緒に連結されることが好ましい。適切なスペーサー／リンカー分子は、当該技術において公知であり、典型的には、５〜４０、好ましくは１０〜３０アミノ酸残基長のアミノ酸ベースの配列を含む。

【0073】

使用において、ポリペプチドは、２本鎖立体構造を有し、ここで、プロテアーゼ構成要素と転移構成要素とは、好ましくはジスルフィド結合により一緒に連結される。

【0074】

本発明のポリペプチドは、当業者に公知の従来の化学結合技術により調製し得る。例えば、Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press、及びWong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Pressが参照される。

【0075】

代わりに、ポリペプチドは、単一ポリペプチド融合タンパク質の組換え調製により調製し得る（例えば、国際公開第９８／０７８６４号パンフレットを参照されたい）。この技術は、それにより天然クロストリジウム神経毒（すなわちホロトキシン）が調製されるインビボ細菌機構に基づき、以下の「単純化された」構造的配置を有する融合タンパク質をもたらす：
ＮＨ_２−［プロテアーゼ構成要素］−［転移構成要素］−［ＴＭ］−ＣＯＯＨ

【0076】

国際公開第９８／０７８６４号パンフレットによると、ＴＭは、融合タンパク質のＣ末端に向かって配置される。融合タンパク質は、次いで、プロテアーゼ構成要素と転移構成要素との間の部位を切断するプロテアーゼでの処理により「活性化」される。よって、転移構成要素とＴＭとを含有する別の単一ポリペプチド鎖と（ジスルフィドブリッジにより）共有付着した単一ポリペプチド鎖としてのプロテアーゼ構成要素を含む２本鎖タンパク質が生成される。

【0077】

国際公開第９８／０７８６４号パンフレットの系は、標的細胞上の結合部位との相互作用のために「遊離」であるＣ末端ドメインを必要とするＴＭを有する融合タンパク質の調製のために特に適切である。

【0078】

標的細胞上の結合部位との相互作用のために「遊離」であるＮ末端ドメインを必要とするＴＭを有する融合タンパク質について、国際公開第０６／０５９１１３号パンフレットに記載されるような改変系を採用してよい。

【0079】

この改変系において、融合タンパク質のＴＭ構成要素は、直鎖状融合タンパク質配列の中央に向かって、プロテアーゼ切断部位と転移構成要素との間にある。このことにより、ＴＭが、転移ドメイン（すなわち天然クロストリジウムホロトキシンにおいて生じるのと同様に）に付着することが確実になるが、この場合、２つの構成要素は、天然ホロトキシンと比べて順序が逆である。プロテアーゼ切断部位でのその後の切断により、ＴＭのＮ末端部分が露出され、２本鎖ポリペプチド融合タンパク質が得られる。

【0080】

上記のプロテアーゼ切断配列（複数可）は、ＤＮＡレベルにて、部位特異的突然変異誘発などの従来の手段により導入してよい（且つ／又はいかなる固有の切断配列も除去してよい）。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは、手動で、又はコンピュータソフトウェア（例えばDNASTAR, Inc.社製MapDrawプログラム）の支援により行ってよい。いかなるプロテアーゼ切断部位も採用してよい（すなわち、クロストリジウムのもの、又は非クロストリジウムのもの）が、以下のものが好ましい（「破壊性」切断部位又は「活性化」切断部位のいずれかとして）：
エンテロキナーゼ（DDDDK↓）
第Ｘａ因子（IEGR↓/IDGR↓）
タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ、Tobacco Etch virus）（ENLYFQ↓G）
トロンビン（LVPR↓GS）
PreScission（LEVLFQ↓GP）。

【0081】

自己切断性配列であるインテインも、プロテアーゼ切断部位の用語に包含される。自己スプライシング反応は、例えば存在する還元剤の濃度を変動させることにより制御可能である。

【0082】

好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、１又は２以上のＮ末端及び／又はＣ末端精製タグを含んでよい。いかなる精製タグも採用し得るが、以下のものが好ましい：
好ましくはＣ末端及び／又はＮ末端タグとしてのＨｉｓタグ（例えば６×ヒスチジン）
好ましくはＮ末端タグとしてのマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ、maltose binding protein）タグ
好ましくはＮ末端タグとしてのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ、glutathione-S-transferase）タグ
好ましくはＮ末端タグとしてのＨｉｓ−ＭＢＰタグ
好ましくはＮ末端タグとしてのＧＳＴ−ＭＢＰタグ
好ましくはＮ末端タグとしてのチオレドキシンタグ
好ましくはＮ末端タグとしてのキチン結合ドメイン（ＣＢＤ、Chitin Binding Domain）タグ。

【0083】

１又は２以上のペプチドスペーサー／リンカー分子を、融合タンパク質に含めてよい。例えば、ペプチドスペーサーを、精製タグと融合タンパク質分子の残りとの間に採用してよい。

【0084】

よって、本発明の第３の態様は、上記のようなポリペプチドをコードする核酸（例えばＤＮＡ）配列を提供する。

【0085】

上記の核酸は、プラスミドなどのベクターの形態に含まれてよく、これは、１又は２以上の複製起点、核酸組み込み部位、プロモーター、ターミネーター及びリボソーム結合部位を含んでいてもよい。

【0086】

本発明は、宿主細胞、特に大腸菌（E. coli）において、又はバキュロウイルス発現系により上記の核酸配列（すなわち本発明の第３の態様）を発現するための方法も含む。

【0087】

本発明は、本発明のポリペプチドを活性化するための方法であって、ポリペプチドを、非細胞毒性プロテアーゼ構成要素と転移構成要素との間にある認識部位（切断部位）にてポリペプチドを切断するプロテアーゼと接触させ、そのことによりポリペプチドを２本鎖ポリペプチドに変換するステップを含み、非細胞毒性プロテアーゼと転移構成要素とが、ジスルフィド結合により一緒に連結されている方法も含む。好ましい実施形態において、認識部位は、天然に存在するクロストリジウム神経毒及び／又は天然に存在するＩｇＡプロテアーゼにとって固有でない。

【0088】

ポリペプチド送達
使用において、本発明は、ポリペプチドを、薬学的に許容される担体、賦形剤、アジュバント、噴射剤及び／又は塩から選択される少なくとも１つの構成要素と一緒に含む医薬組成物を採用する。

【0089】

本発明のポリペプチドは、経口、非経口、連続注入、吸入又は局所での投与のために処方され得る。注射用に適する組成物は、液剤、懸濁剤若しくは乳剤、又は使用前に適切な媒体に溶解若しくは懸濁される乾燥散剤の形態であってよい。

【0090】

局在送達されるポリペプチドの場合、ポリペプチドは、クリーム（例えば局所塗布のため）として、又は皮下注射のために処方され得る。

【0091】

局在送達とは、エアロゾル又はその他の噴霧剤（例えば噴霧吸入器）を含み得る。この関係において、ポリペプチドのエアロゾル製剤は、肺並びに／或いはその他の鼻及び／又は気管支若しくは気道の経路への送達を可能にする。

【0092】

本発明のポリペプチドは、患部器官の神経支配に関与する脊髄分節のレベルで脊柱にくも膜下内又は硬膜外注射することにより患者に投与してよい。

【0093】

好ましい投与経路は、腹腔鏡（laproscopic）による及び／又は局在化された、特に筋内の注射による。

【0094】

注射用の製剤の場合において、投与部位でのポリペプチドの滞留を援助するか、又は投与部位からのポリペプチドの除去を低減するために薬学的活性物質を含んでいてもよい。このような薬学的活性物質のある例は、アドレナリンなどの血管収縮薬である。このような製剤は、投与後のポリペプチドの滞留時間を増加し、よって、その効果を増加且つ／又は増進する利点を与える。

【0095】

本発明のポリペプチドの投与についての投与量範囲は、望ましい治療効果を生じるものである。必要とされる投与量範囲は、ポリペプチド又は組成物の厳密な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度又は重症度、存在するならば禁忌、及び主治医の判断に依存することが認識される。これらの投与量レベルにおける変動は、最適化のための標準的な経験的慣例を用いて調節できる。

【0096】

適切な１日投与量（患者の体重１ｋｇ当たり）は、０．０００１〜１ｎｇ／ｋｇ、好ましくは０．０００１〜０．５ｎｇ／ｋｇ、より好ましくは０．００２〜０．５ｎｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．００４〜０．５ｎｇ／ｋｇの範囲である。単位投与量は、１ピコグラム未満〜３０ｎｇで変動できるが、典型的には、投与当たり０．０１〜１ｎｇの領域にあり、これを、毎日、又は好ましくは毎週若しくは６カ月毎などのより少ない頻度で投与し得る。

【0097】

特に好ましい投与計画は、１×用量として０．２５ｎｇのポリペプチドを基本とする。この関係において、好ましい投与量は、１×〜１００×（すなわち０．２５〜２５ｎｇ）の範囲にある。

【0098】

流体投与形態は、ポリペプチドと発熱物質除去滅菌媒体とを用いて典型的に調製される。媒体及び用いる濃度に依存して、ポリペプチドは、媒体に溶解又は懸濁できる。溶液の調製において、ポリペプチドは、媒体に溶解でき、溶液を、必要であれば、塩化ナトリウムの添加により等張にし、無菌的技術を用いて滅菌フィルタを通してろ過することにより滅菌した後に、適切な滅菌バイアル又はアンプルに充填して密閉する。代わりに、溶液の安定性が適切であれば、密閉容器中の溶液を、高圧蒸気殺菌法により滅菌してよい。有利には、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤若しくは殺菌剤、懸濁化剤若しくは乳化剤、及び又は局所麻酔薬などの添加剤を、媒体に溶解してよい。

【0099】

使用前の適切な媒体に溶解又は懸濁される乾燥散剤は、滅菌領域において無菌的技術を用いて滅菌済みの成分を滅菌容器に充填することにより調製し得る。代わりに、成分は、滅菌領域において無菌的技術を用いて適切な容器中に溶解してよい。生成物を、次いで、凍結乾燥し、容器を無菌的に密閉する。

【0100】

筋内、皮下又は皮内注射に適する非経口懸濁剤は、滅菌構成要素を溶解する代わりに滅菌媒体中に懸濁し、滅菌をろ過により達成できないこと以外は、実質的に同じ様式で調製される。構成要素は、滅菌状態で単離してよいか、代わりに、単離の後に例えばガンマ照射により滅菌してよい。

【0101】

有利には、懸濁化剤、例えばポリビニルピロリドンを組成物／複数可に含めて、構成要素の均一な分配を促進する。

【0102】

本発明による投与は、微小粒子封入、ウイルス送達系又は高圧エアロゾル衝撃を含む多様な送達技術を用いてよい。

【0103】

定義の部
ターゲティング部分（ＴＭ）は、結合部位と機能的に相互作用して、本発明のポリペプチドと標的細胞の表面との間の物理的会合をもたらす任意の化学構造を意味する。ＴＭとの用語は、標的細胞上の結合部位と結合可能な任意の分子（すなわち天然に存在する分子、又は化学的／物理的に改変されたそのバリアント）を包含し、この結合部位は、内在化されることが可能である（例えばエンドソーム形成）。このことは、受容体媒介飲食作用ともよばれる。ＴＭは、エンドソーム膜転移機能を有してよく、この場合、別々のＴＭと転移ドメイン構成要素とが、本発明の物質中に存在する必要はない。上記の記載を通して、具体的なＴＭについて記載した。上記のＴＭについての言及は単に例示のためであり、本発明は、例示されるＴＭの基本的な結合（すなわちターゲティング）能力を保持するその全てのバリアント及び誘導体を包含する。

【0104】

上記のように、好ましいＴＭは、抗体（例えば抗体フラグメント）及び結合性スカフォールド、特に、神経細胞との（例えば特異的な）結合の目的のために設計された商業的に入手可能な抗体／フラグメント及びスカフォールドを含む。

【0105】

タンパク質スカフォールドは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ分子、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、ダイアボディ及びミニボディ（このそれぞれは、本発明のＴＭとして採用し得る）などの治療用モノクローナル抗体及び誘導体の拡大するレパートリーを補足するための、新世代の普遍的結合フレームワークである。スカフォールドの系は、新規なスカフォールドの創出によるか又は既知のタンパク質結合ドメインの改変により、既知のタンパク質認識ドメインを創出するか又は改変する。このようなスカフォールドは、それらに限定されないが以下のものを含む：
（ｉ）プロテインＡに基づくスカフォールド−アフィボディ（Nord, K. et al 1997 "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain". Nat Biotechnol 15, 772-777）；
（ii）リポカリンに基づくスカフォールド−アンチカリン（Skerra 2008 "Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities". FEBS J. 275:2677-83）；
（iii）フィブロネクチンに基づくスカフォールド−アドネクチン（Dineen et al 2008 "The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer". BMC Cancer 8:352）；
（iv）アビマー（Silverman et al 2005 "Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains". Nat Biotechnol 23:1556-61）；
（ｖ）アンキリンに基づくスカフォールド−ダルピン（darpin）（Zahnd et al 2006 "Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins". J Biol Chem. 281:35167-75）；及び
（vi）センチリン（centyrin）スカフォールド−ＣＤＲと相似するループを有するＩｇドメインとの著しい構造的相同性を有するタンパク質折り畳みに基づく。Ｉｇドメインは、ヒトタンパク質における共通したモジュールであり、代替スカフォールドタンパク質として広く用いられている。上記のそれぞれの「スカフォールド」出版物は、それらを参照することにより（その全体が）本明細書に組み込まれる。

【0106】

結合性スカフォールドは、特異的細胞表面タンパク質、受容体又は糖基などのその他の細胞表面エピトープとの相互作用により特定の細胞タイプを標的にするために用いることができる。このような改変スカフォールドは、本発明の非細胞毒性プロテアーゼに基づく組換えポリペプチド上に工学的に操作して、所望の特異的な神経細胞のタイプを標的にすることができる。

【0107】

本発明のＴＭは、問題の標的細胞と結合する（好ましくは特異的に結合する）。「特異的に結合する」との用語は、所定のＴＭが、１０^６Ｍ^−１以上、好ましくは１０^７Ｍ^−１以上、より好ましくは１０^８Ｍ^−１以上、最も好ましくは１０^９Ｍ^−１以上の結合親和性（Ｋａ）で標的細胞と結合することを意味することが好ましい。

【0108】

本明細書においてＴＭと言う場合、問題の標的細胞と結合する能力を保持するそのフラグメント及びバリアントを包含する。例えば、バリアントは、参照ＴＭと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７又は少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し得る。つまり、バリアントは、１若しくは２以上のアミノ酸アナログ（例えば非天然アミノ酸）又は置換結合を含んでよい。また、例えば、ＴＭとの関係で用いる場合のフラグメントとの用語は、参照ＴＭの少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、最も好ましくは少なくとも４０アミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントとの用語は、上記のバリアントにも関連する。つまり、例えば、本発明のフラグメントは、少なくとも１０、２０、３０又は４０アミノ酸を有するペプチド配列を含んでよく、該ペプチド配列は、参照ペプチドの対応するペプチド配列（連続）アミノ酸全体にわたって少なくとも８０％の配列相同性を有する。

【0109】

例えば、ＥｒｂＢペプチドＴＭ（例えばＥＧＦ）を改変して、安定性の増加などの特性が改善されたムテインＥｒｂＢリガンドを作製してよい。例えば、ＥｒｂＢ ＴＭムテインは、細胞性プロテアーゼに対する安定性を与える４６位又は４７位のバリン残基（ＥＧＦＶａｌ４６又は４７）などのアミノ酸改変を有するＥｒｂＢペプチドを含む。ＥｒｂＢ ＴＭは、アミノ酸が欠失していてもよいし、さらなるアミノ酸が挿入されていてもよい。これは、それらに限定されないが、２つのＣ末端アミノ酸の欠失と５１位での中性アミノ酸置換を有するＥＧＦ（特にＥＧＦ５１Ｇｌｎ５１；米国特許出願公開第２００２００９８１７８号明細書を参照されたい）、及びアミノ酸が欠失したＥＧＦ（例えばｒＥＧＦ２−４８；ｒＥＧＦ３−４８及びｒＥＧＦ４−４８）を含む。ＥｒｂＢ ＴＭのフラグメントは、予測されるβターン領域（例えば、Ac-C-H-S-G-Y-V-G-A-R-C-O-OMeの配列のペプチド）と、［Ａｌａ２０］ＥＧＦ（１４−３１）などのＥＧＦのフラグメントと、ペプチドYHWYGYTPQNVI又はＧＥ１１とを含有するＴＧＦαのフラグメントを含み得る。上記の特許明細書の全ては、それらを参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0110】

ＴＭが選択された標的細胞と結合することを確認することは、慣例である。例えば、単純な放射活性置換実験を採用してよく、ここでは、標的細胞の標本である組織又は細胞を、過剰の未標識ＴＭの存在下に、標識化（例えばトリチウム化）ＴＭに曝露する。このような実験において、非特異的結合と特異的結合の相対的な割合を評価することにより、ＴＭが標的細胞と結合することを確認できる。アッセイは、１又は２以上の結合アンタゴニストを含んでいてもよく、アッセイは、ＴＭ結合の喪失を観察するステップをさらに含んでいてもよい。このタイプの実験の例は、Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press中のHulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311で見出すことができる。

【0111】

本発明の関係において、ペプチドＴＭと言う場合、ペプチドアナログが対応する「参照」ＴＭと同じ受容体と結合する限り、そのアナログを包含する。上記のアナログは、以下のような合成残基を含み得る：
β−Ｎａｌ＝β−ナフチルアラニン
β−Ｐａｌ＝β−ピリジルアラニン
ｈＡｒｇ（Ｂｕ）＝Ｎ−グアニジノ−（ブチル）−ホモアルギニン
ｈＡｒｇ（Ｅｔ）_２＝Ｎ，Ｎ’−グアニジノ−（ジメチル）−ホモアルギニン
ｈＡｒｇ（ＣＨ_２ＣＦ_３）_２＝Ｎ，Ｎ’−グアニジノ−ビス−（２，２，２，−トリフルオロエチル）−ホモアルギニン
ｈＡｒｇ（ＣＨ_３，ヘキシル）＝Ｎ，Ｎ’−グアニジノ−（メチル，ヘキシル）−ホモアルギニン
Ｌｙｓ（Ｍｅ）＝Ｎ^ｅ−メチルリジン
Ｌｙｓ（ｉＰｒ）＝Ｎ^ｅ−イソプロピルリジン
ＡｍＰｈｅ＝アミノメチルフェニルアラニン
ＡＣｈｘＡｌａ＝アミノシクロヘキシルアラニン
Ａｂｕ＝α−アミノ酪酸
Ｔｐｏ＝４−チアプロリン
ＭｅＬｅｕ＝Ｎ−メチルロイシン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｎｌｅ−ノルロイシン
Ｎｖａ＝ノルバリン
Ｔｒｐ（Ｂｒ）＝５−ブロモ−トリプトファン
Ｔｒｐ（Ｆ）＝５−フルオロ−トリプトファン
Ｔｒｐ（ＮＯ_２）＝５−ニトロ−トリプトファン
Ｇａｂａ＝γ−アミノ酪酸
Ｂｍｐ＝Ｊ−メルカプトプロピオニル
Ａｃ＝アセチル
Ｐｅｎ−ペンシラミン

【0112】

本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の機能的Ｈ_Ｃ（又はＨ_ＣＣ）ドメインを欠いていてよく、この場合、非クロストリジウムＴＭが典型的に存在して、神経細胞上の結合部位にポリペプチドを結合させる。天然のクロストリジウム神経毒のＨ_Ｃペプチドは、およそ４００〜４４０アミノ酸残基を含み、それぞれおよそ２５ｋＤａの２つの機能的に異なるドメイン、すなわちＮ末端領域（一般に、Ｈ_ＣＮペプチド又はドメインとよばれる）及びＣ末端領域（一般に、Ｈ_ＣＣペプチド又はドメインとよばれる）からなる。Ｃ末端の１６０〜２００アミノ酸残基を構成するＣ末端領域（Ｈ_ＣＣ）は、クロストリジウム神経毒がその天然の細胞受容体、すなわち神経筋接合部での神経終末と結合することを担うことが詳細に記録されている。この事実は、上記の出版物によっても確認されている。よって、本明細書を通して、機能的重鎖Ｈ_Ｃペプチド（又はドメイン）を欠くクロストリジウム重鎖と言う場合、クロストリジウム重鎖が機能的Ｈ_ＣＣペプチドを単純に欠くことを意味する。言い換えると、Ｈ_ＣＣペプチド領域は、部分的若しくは全体的に欠失しているか、又はそうでなければ神経細胞についてのその天然の結合能力を不活性化するように（例えば従来の化学的及びタンパク質分解処理により）改変されている。

【0113】

代わりに、本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の機能的Ｈ_Ｃ（又はＨ_ＣＣ）ドメインをＴＭとして含有してよい。結合ドメインを含む多様なクロストリジウム神経毒のＨ_ＣＣ又はＨ_Ｃ領域が、本発明の態様において有用であり得るが、但し、これらの活性フラグメントが、天然神経毒の結合活性及び結合特異性をもたらすことを条件とする。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨ_Ｃ領域は、およそ４００〜４４０アミノ酸長であり、結合ドメインを含む。クロストリジウム毒素重鎖からのＨ_Ｃ領域の全長が、結合ドメインの結合活性にとって必要でないことが、研究で示されている。つまり、この実施形態の態様は、例えば少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、及び少なくとも４２５アミノ酸長を有する結合ドメインを含むクロストリジウム毒素Ｈ_Ｃ領域を含み得る。この実施形態のその他の態様は、例えば多くて３５０アミノ酸、多くて３７５アミノ酸、多くて４００アミノ酸、及び多くて４２５アミノ酸長を有する結合ドメインを含むクロストリジウム毒素Ｈ_Ｃ領域を含み得る。

【0114】

本発明のプロテアーゼは、真核細胞における開口分泌融合装置の１又は２以上のタンパク質を切断できる全ての非細胞毒性プロテアーゼを包含する。

【0115】

本発明のプロテアーゼは、好ましくは、細菌プロテアーゼ（又はそのフラグメント）である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム又はナイセリア／ストレプトコッカス（Streptococcus）属から選択される（例えばクロストリジウムＬ鎖、又はナイセリアＩｇＡプロテアーゼ、好ましくは淋菌又は肺炎球菌（S. pneumoniae）から）。

【0116】

本発明は、バリアント非細胞毒性プロテアーゼ（すなわち、天然に存在するプロテアーゼ分子のバリアント）も、バリアントプロテアーゼが必須のプロテアーゼ活性を示す限りは包含する。例えば、バリアントは、参照プロテアーゼ配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５又は少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有し得る。つまり、バリアントとの用語は、エンドペプチダーゼ活性が増進（又は減少）した非細胞毒性プロテアーゼを含む。ここでは特に、ＢｏＮＴ／Ａ変異体Ｑ１６１Ａ、Ｅ５４Ａ及びＫ１６５ＬのＫ_ｃａｔ／Ｋ_ｍの増加が挙げられる。Ahmed, S.A.(2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8（これは、それを参照することにより組み込まれる）を参照されたい。プロテアーゼとの関係で用いる場合のフラグメントとの用語は、参照プロテアーゼの少なくとも１５０、好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも２５０、最も好ましくは少なくとも３００アミノ酸残基を有するペプチドを典型的に意味する。ＴＭ「フラグメント」構成要素（上で論じた）と同様に、本発明のプロテアーゼ「フラグメント」は、参照配列に基づくバリアントプロテアーゼのフラグメントを包含する。

【0117】

本発明のプロテアーゼは、セリン又はメタロプロテアーゼ活性（例えばエンドペプチダーゼ活性）を示すことが好ましい。プロテアーゼは、好ましくは、ＳＮＡＲＥタンパク質（例えばＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ又はシンタキシン）に特異的である。

【0118】

神経毒のプロテアーゼドメイン、例えば細菌神経毒のプロテアーゼドメインが特に挙げられる。つまり、本発明は、天然に存在する神経毒ドメイン、及び該天然に存在する神経毒の組換えにより調製されたバージョンの使用を包含する。

【0119】

例示的な神経毒は、クロストリジウムにより生成され、クロストリジウム神経毒との用語は、破傷風菌（C. tetani）（ＴｅＮＴ）及びＡ〜Ｇ血清型ボツリヌス菌により生成される神経毒（ＢｏＮＴ）、並びにシー・バラティイ（C. baratii）及び酪酸菌（C. butyricum）により生成される密接に関連するＢｏＮＴ様神経毒を包含する。上記の略語は、本明細書を通して用いられる。例えば、ＢｏＮＴ／Ａとの命名は、神経毒の供給源がＢｏＮＴ（Ａ血清型）であることを示す。対応する命名法が、その他のＢｏＮＴ血清型について用いられる。

【0120】

ＢｏＮＴは、既知の最も効力が高い毒素であり、マウスに対する半数致死量（ＬＤ５０）の値は、血清型に依存して０．５〜５ｎｇ／ｋｇの範囲である。ＢｏＮＴは、胃腸管に吸着され、全身循環に入った後にコリン作動性神経終末のシナプス前膜と結合して、それらの神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を妨げる。ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇは、シナプトブレビン／小胞関連膜タンパク質（vesicle-associated membrane protein、ＶＡＭＰ）を切断し、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（synaptosomal-associated protein of 25 kDa、ＳＮＡＰ−２５）を切断し、ＢｏＮＴ／Ｃは、シンタキシンを切断する。

【0121】

ＢｏＮＴは、およそ５０ｋＤａの軽鎖（Ｌ鎖）と単一ジスルフィド結合により共有結合したおよそ１００ｋＤａの重鎖（Ｈ鎖）からなるおよそ１５０ｋＤａの２本鎖タンパク質である共通の構造を共有する。Ｈ鎖は、それぞれおよそ５０ｋＤａの２つのドメインからなる。Ｃ末端ドメイン（Ｈ_Ｃ）は、高親和性のニューロンの結合に必要であり、Ｎ末端ドメイン（Ｈ_Ｎ）は、膜転移に関与することが提案されている。Ｌ鎖は、基質であるＳＮＡＲＥタンパク質の切断を担う亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。

【0122】

Ｌ鎖フラグメントとの用語は、神経毒のＬ鎖の構成要素を意味し、このフラグメントは、メタロプロテアーゼ活性を示し、細胞性開口分泌に関与する小胞及び／又は細胞膜関連タンパク質をタンパク質分解することが可能である。

【0123】

適切なプロテアーゼ（参照）配列の例は、以下のものを含む：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１〜４４８）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１〜４４０）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１〜４４１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１〜４４５）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１〜４２２）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１〜４３９）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１〜４４１）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（１〜４５７）
ＩｇＡプロテアーゼ−アミノ酸残基（１〜９５９）^＊
＊Pohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462（これは、それを参照することにより本明細書に組み込まれる）。

【0124】

上で同定される参照配列は、サブ血清型によってわずかな変動が生じ得るので、手引きとみなすべきである。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１６６３３２号明細書（それを参照することにより本明細書に組み込まれる）は、わずかに異なるクロストリジウム配列を引用している：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１〜Ｋ４４８）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１〜Ｋ４４１）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１〜Ｋ４４９）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１〜Ｒ４４５）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１〜Ｒ４２２）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１〜Ｋ４３９）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１〜Ｋ４４６）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１〜Ａ４５７）

【0125】

軽鎖を含む多様なクロストリジウム毒素フラグメントは、本発明の態様において有用であり得るが、但し、これらの軽鎖フラグメントが、神経伝達物質放出装置の核となる構成要素を特異的に標的にし、よって、それによりクロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解する全体的な細胞機構の達成に参加できることを条件とする。クロストリジウム毒素の軽鎖は、およそ４２０〜４６０アミノ酸長であり、酵素ドメインを含む。クロストリジウム毒素軽鎖の全長が、酵素ドメインの酵素活性にとって必要でないことが、研究で示されている。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最初の８アミノ酸は、酵素活性にとって必要でない。別の非限定的な例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最初の８アミノ酸は、酵素活性にとって必要でない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は、活性にとって必要でない。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最後の３２アミノ酸（残基４１７〜４４８）は、酵素活性にとって必要でない。別の非限定的な例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最後の３１アミノ酸（残基４２７〜４５７）は、酵素活性にとって必要でない。つまり、この実施形態の態様は、例えば少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４２５アミノ酸及び少なくとも４５０アミノ酸長を有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含み得る。この実施形態の別の態様は、例えば多くて３５０アミノ酸、多くて３７５アミノ酸、多くて４００アミノ酸、多くて４２５アミノ酸、及び多くて４５０アミノ酸長を有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含み得る。

【0126】

本発明のポリペプチド、特にそのプロテアーゼ構成要素は、ＰＥＧ化されていてよい。このことは、安定性、例えばプロテアーゼ構成要素の作用の持続期間を増加させる助けとなり得る。ＰＥＧ化は、プロテアーゼがＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ又はＣ_１プロテアーゼを含む場合に特に好ましい。ＰＥＧ化は、プロテアーゼ構成要素のＮ末端へのＰＥＧの付加を含むことが好ましい。例えば、プロテアーゼのＮ末端は、１又は２以上のアミノ酸（例えばシステイン）残基を用いて伸長してよく、該残基は同じ又は異なっていてよい。上記のアミノ酸残基の１又は２以上は、それに付着した（例えば共有付着）それ自体のＰＥＧ分子を有してよい。この技術の例は、国際公開第２００７／１０４５６７号パンフレット（これは、それを参照することによりその全体が組み込まれる）に記載されている。

【0127】

転移ドメインは、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように標的細胞へプロテアーゼを転移させることができる分子である。任意の分子（例えばタンパク質又はペプチド）が本発明の必須の転移機能を有するかどうかは、いくつかの従来のアッセイのいずれか１つにより確認し得る。

【0128】

例えば、Shone C. (1987)は、被検分子で攻撃されたリポソームを用いるインビトロアッセイについて記載している。必須の転移機能の存在は、リポソームからのＫ^＋及び／又は標識ＮＡＤの放出により確認され、これらは容易にモニターできる［Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180を参照されたい］。

【0129】

さらなる例は、Blaustein R. (1987)により提供され、これは、平面状リン脂質二重膜を用いる単純なインビトロアッセイについて記載している。被検分子を用いて膜を攻撃し、必須の転移機能は、上記の膜を挟むコンダクタンスの増加により確認される［Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no.1: pp. 115-120を参照されたい］。

【0130】

膜融合の評価を可能にし、よって、本発明において用いるために適する転移ドメインの同定を可能にするさらなる方法は、Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993で提供される。

【0131】

本発明は、バリアントドメインが必須の転移活性をまだ示す限りは、バリアント転移ドメインも包含する。例えば、バリアントは、参照転移ドメインと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有し得る。転移ドメインとの関係で用いる場合のフラグメントとの用語は、参照転移ドメインの少なくとも２０、好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも８０、最も好ましくは少なくとも１００アミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウム転移ドメインの場合、フラグメントは、参照転移ドメイン（例えばＨ_Ｎドメイン）の少なくとも１００、好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸残基を有することが好ましい。ＴＭ「フラグメント」構成要素（上で論じた）と同様に、本発明の転移「フラグメント」は、参照配列に基づくバリアント転移ドメインのフラグメントを包含する。

【0132】

転移ドメインは、低ｐＨ条件下で脂質膜にイオン透過可能な孔の形成を可能にすることが好ましい。好ましくは、孔を形成可能なタンパク質分子のこれらの部分のみをエンドソーム膜内で用いることが見出されている。

【0133】

転移ドメインは、微生物タンパク質供給源、特に細菌又はウイルスのタンパク質供給源から得ることができる。よって、ある実施形態において、転移ドメインは、細菌毒素又はウイルスタンパク質などの、酵素の転移性ドメインである。

【0134】

細菌毒素分子のあるいくつかのドメインが、このような孔を形成可能であることが詳細に記録されている。ウイルスにより発現される膜融合タンパク質のあるいくつかの転移ドメインが、このような孔を形成可能であることも知られている。このようなドメインを、本発明において採用してよい。

【0135】

転移ドメインは、Ｈ_Ｎドメイン（又はその機能的構成要素）のようにクロストリジウム起源のものであってよい。Ｈ_Ｎは、Ｈ鎖のアミノ末端側の半分とほぼ等しいクロストリジウム神経毒のＨ鎖の部分若しくはフラグメント、又はインタクトなＨ鎖におけるそのフラグメントに相当するドメインを意味する。Ｈ鎖は、Ｈ鎖のＨ_Ｃ構成要素の天然の結合機能を欠いている。この関係において、Ｈ_Ｃ機能は、Ｈ_Ｃアミノ酸配列の欠失（ＤＮＡ合成レベル又はヌクレアーゼ若しくはプロテアーゼ処理による合成後レベルのいずれかで）により除去してよい。代わりに、Ｈ_Ｃ機能は、化学的又は生物学的処理により不活性化してよい。つまり、Ｈ鎖は、天然のクロストリジウム神経毒（すなわちホロトキシン）が結合する標的細胞上の結合部位に結合できない。

【0136】

適切な（参照）転移ドメインの例は、以下のものを含む：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４９〜８７１）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４１〜８５８）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４２〜８６６）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４６〜８６２）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４２３〜８４５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４０〜８６４）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４２〜８６３）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（４５８〜８７９）

【0137】

上で同定される参照配列は、サブ血清型によってわずかな変動が生じ得るので、手引きとみなすべきである。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１６６３３２号明細書（それを参照することにより本明細書に組み込まれる）は、わずかに異なるクロストリジウム配列を引用している：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ａ４４９〜Ｋ８７１）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ａ４４２〜Ｓ８５８）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｔ４５０〜Ｎ８６６）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｄ４４６〜Ｎ８６２）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｋ４２３〜Ｋ８４５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ａ４４０〜Ｋ８６４）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｓ４４７〜Ｓ８６３）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（Ｓ４５８〜Ｖ８７９）

【0138】

本発明の関係において、転移ドメインを含む多様なクロストリジウム毒素Ｈ_Ｎ領域は、本発明の態様において有用であり得るが、但し、これらの活性フラグメントが、非細胞毒性プロテアーゼ（例えば、クロストリジウムＬ鎖）を細胞内小胞から標的細胞の細胞質へ放出することを促進し、よって、それによりクロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解する全体的な細胞機構の達成に参加できることを条件とする。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨ_Ｎ領域は、およそ４１０〜４３０アミノ酸長であり、転移ドメインを含む。クロストリジウム毒素重鎖からのＨ_Ｎ領域の全長が、転移ドメインの転移活性にとって必要でないことが、研究で示されている。よって、この実施形態の態様は、例えば少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸及び少なくとも４２５アミノ酸長を有する転移ドメインを含むクロストリジウム毒素Ｈ_Ｎ領域を含み得る。この実施形態のその他の態様は、例えば多くて３５０アミノ酸、多くて３７５アミノ酸、多くて４００アミノ酸及び多くて４２５アミノ酸長を有する転移ドメインを含むクロストリジウム毒素Ｈ_Ｎ領域を含み得る。

【0139】

ボツリヌス菌及び破傷風菌における毒素生成の遺伝子的基礎についてのさらなる詳細のために、我々は、The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press中のHenderson et al (1997)を参照する。

【0140】

Ｈ_Ｎとの用語は、天然に存在する神経毒Ｈ_Ｎ部分、並びに天然に存在しないアミノ酸配列及び／又は合成アミノ酸残基を有する改変Ｈ_Ｎ部分を、改変Ｈ_Ｎ部分が上記の転移機能をまだ示す限り含む。

【0141】

代わりに、転移ドメインは、非クロストリジウム起源のものであってよい。非クロストリジウム（参照）転移ドメイン起源の例は、それらに限定されないが、ジフテリア毒素の転移ドメイン［O=Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206；Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532；及びLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51］、シュードモナス（Pseudomonas）Ａ型外毒素の転移ドメイン［Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559］、炭疽毒素の転移ドメイン［Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442］、転移機能を有する多様な融合性又は疎水性ペプチド［Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924；及びWagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938］、及び両親媒性ペプチド［Murata et al (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992］を含む。転移ドメインは、天然に存在するタンパク質中に存在する転移ドメインを反映してよいか、又はアミノ酸変動を、該変動が転移ドメインの転移能力を破壊しない限り含んでよい。

【0142】

本発明において用いるために適するウイルス（参照）転移ドメインの特定の例は、ウイルスにより発現される膜融合タンパク質のあるいくつかの転移性ドメインを含む。例えば、Wagner et al.（1992）及びMurata et al.（1992）は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＮ末端領域に由来するいくつかの融合性及び両親媒性ペプチドの転移（すなわち膜融合及び小胞形成）機能について記載している。所望の転移活性を有することが知られているその他のウイルスにより発現される膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス（Semliki Forest Virus、ＳＦＶ）の融合性ペプチドの転移性ドメイン、水泡性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus、ＶＳＶ）糖タンパク質Ｇの転移性ドメイン、ＳＥＲウイルスＦタンパク質の転移性ドメイン、及び泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質の転移性ドメインである。ウイルスによりコードされるアスパイク（Aspike）タンパク質、例えばＳＦＶのＥ１タンパク質並びにＶＳＶのＧタンパク質のＧタンパク質は、本発明の関係において特に用いられる。

【0143】

表（下記）に列挙される（参照）転移ドメインの使用は、その配列バリアントの使用を含む。バリアントは、１又は２以上の保存的核酸置換及び／又は核酸欠失若しくは挿入を、バリアントが必須の転移機能を有することを条件として含んでよい。バリアントは、１又は２以上のアミノ酸置換及び／又はアミノ酸欠失若しくは挿入を、バリアントが必須の転移機能を有する限り含んでもよい。

【0144】

【表3】

【0145】

本発明のポリペプチドは、転移促進性ドメインをさらに含んでよい。上記のドメインは、標的細胞のサイトゾルへの非細胞毒性プロテアーゼの送達を促進し、例えば国際公開第０８／００８８０３号パンフレット及び国際公開第０８／００８８０５号パンフレット（これらのそれぞれは、それを参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0146】

例えば、適切な転移促進性ドメインは、エンベロープウイルス融合性ペプチドドメインを含み、例えば、適切な融合性ペプチドドメインは、インフルエンザウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば２３アミノ酸のＡ型インフルエンザウイルス融合性ペプチドドメイン）、アルファウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば２６アミノ酸のセムリキ森林ウイルス融合性ペプチドドメイン）、ベシクロウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば２１アミノ酸の水泡性口内炎ウイルス融合性ペプチドドメイン）、レスピロウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば２５アミノ酸のセンダイウイルス融合性ペプチドドメイン）、モルビリウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば２５アミノ酸のイヌジステンパーウイルス融合性ペプチドドメイン）、アブラウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば２５アミノ酸のニューカッスル病ウイルス融合性ペプチドドメイン）、ヘニパウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば２５アミノ酸のヘンドラウイルス融合性ペプチドドメイン）、メタニューモウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば２５アミノ酸のヒトメタニューモウイルス融合性ペプチドドメイン）、若しくはサル泡沫状ウイルス融合性ペプチドドメインなどのスプーマウイルス融合性ペプチドドメイン、又はそのフラグメント若しくはバリアントを含む。

【0147】

さらなる例として、転移促進性ドメインは、クロストリジウム毒素Ｈ_ＣＮドメイン又はそのフラグメント若しくはバリアントを含んでよい。より詳細には、クロストリジウム毒素Ｈ_ＣＮ転移促進性ドメインは、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２７５アミノ酸長を有し得る。この関係において、クロストリジウム毒素Ｈ_ＣＮ転移促進性ドメインは、多くて２００アミノ酸、多くて２２５アミノ酸、多くて２５０アミノ酸、又は多くて２７５アミノ酸長を有することが好ましい。

【0148】

具体的な（参照）例は、以下のものを含む：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８７２〜１１１０）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８５９〜１０９７）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６７〜１１１１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６３〜１０９８）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８４６〜１０８５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６５〜１１０５）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６４〜１１０５）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（８８０〜１１２７）

【0149】

上記の配列の位置は、血清型／サブタイプにより少し変動することがあり、適切な（参照）クロストリジウム毒素Ｈ_ＣＮドメインのさらなる例は、以下のものを含む：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８７４〜１１１０）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６１〜１０９７）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６９〜１１１１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６５〜１０９８）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８４８〜１０８５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６７〜１１０５）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６６〜１１０５）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（８８２〜１１２７）

【0150】

上記の促進性ドメインのいずれも、本発明において用いるために適する以前に記載したいかなる転移ドメインペプチドとも組み合わせてよい。よって、例えば、非クロストリジウム促進性ドメインは、非クロストリジウム転移ドメインペプチド又はクロストリジウム転移ドメインペプチドと組み合わせてよい。代わりに、クロストリジウム毒素Ｈ_ＣＮ転移促進性ドメインは、非クロストリジウム転移ドメインペプチドと組み合わせてよい。代わりに、クロストリジウム毒素Ｈ_ＣＮ促進性ドメインは、その例を以下に示すクロストリジウム転移ドメインペプチドと組み合わせてよい：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４９〜１１１０）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４２〜１０９７）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４５０〜１１１１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４６〜１０９８）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４２３〜１０８５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４０〜１１０５）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４７〜１１０５）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（４５８〜１１２７）

【0151】

配列相同性：
それらに限定されないが、全体法、局限法及び例えばセグメントアプローチ法などのハイブリッド法を含む多様な配列アラインメント法のいずれを用いても、パーセント同一性を決定できる。パーセント同一性を決定するためのプロトコルは、当業者の範囲内の慣例の手順である。全体法は、分子の最初から最後までの配列を整列させて、個別の残基対のスコアを加算し、ギャップペナルティを課すことにより最適アラインメントを決定する。非限定的な方法は、例えばCLUSTAL W（例えばJulie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照されたい）、及び反復精密化（例えばOsamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照されたい）を含む。局限法は、入力配列の全てが共有する１又は２以上の保存されたモチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法は、例えばマッチボックス（例えばEric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)を参照されたい）、ギブスサンプリング（例えばC. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)を参照されたい）、Ａｌｉｇｎ−Ｍ（例えばIvo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照されたい）を含む。

【0152】

よって、パーセント配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。簡単に述べると、１０のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ及び以下に示すようなHenikoff and Henikoff（同上）の「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコア行列（アミノ酸は、標準の１文字コードで示す）を用いてアラインメントスコアを最適化するように２つのアミノ酸配列を整列させる。

【0153】

配列同一性を決定するためのアラインメントスコア
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4

【0154】

パーセント同一性は、次いで、以下のようにして算出される：
（同一マッチの合計数）／［長いほうの配列の長さ＋２つの配列を整列させるために長いほうの配列に導入したギャップの数］×１００

【0155】

実質的に相同なポリペプチドは、１又は２以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を有することによって特徴づけられる。これらの変化は、重要でない性質のものが好ましく、すなわち、保存的アミノ酸置換（下記を参照されたい）及びポリペプチドの折り畳み又は活性に著しく影響しないその他の置換；典型的には１〜約３０アミノ酸の小さい欠失；並びにアミノ末端メチオニン残基、約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド若しくはアフィニティタグなどの小さいアミノ又はカルボキシル末端伸長である。

【0156】

保存的アミノ酸置換
塩基性：アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性：グルタミン酸
アスパラギン酸
極性：グルタミン
アスパラギン
疎水性：ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族：フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型：グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン

【0157】

２０の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）で、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換してよい。クロストリジウムポリペプチドアミノ酸残基は、限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸及び非天然アミノ酸により置換してよい。本発明のポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸残基も含むことができる。

【0158】

天然に存在しないアミノ酸は、限定することなく、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノ−プロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチル−スレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン及び４−フルオロフェニルアラニンを含む。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためのいくつかの方法が、当該技術において知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いてナンセンス変異が抑制されたインビトロ系を採用できる。アミノ酸及びアミノアシル化ｔＲＮＡを合成するための方法は、当該技術において知られている。ナンセンス変異を含有するプラスミドの転写及び翻訳は、大腸菌Ｓ３０抽出物と商業的に入手可能な酵素及びその他の試薬とを含む無細胞系において行われる。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991；Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991；Chung et al., Science 259:806-9, 1993；及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993を参照されたい。第２の方法において、翻訳は、ツメガエル卵母細胞において、変異ｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡをマイクロインジェクションすることにより行われる（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271 :19991-8, 1996）。第３の方法において、大腸菌細胞を、置き換えられる天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）の非存在下、且つ所望の天然に存在しないアミノ酸（複数可）（例えば２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。天然に存在しないアミノ酸は、その天然の対応物の代わりにポリペプチドに取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、天然に存在しない種に、インビトロ化学修飾により変換できる。化学修飾は、置換の範囲をさらに拡大するために部位特異的突然変異誘発と組み合わせることができる（Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993）。

【0159】

本発明のポリペプチドのアミノ酸残基は、限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸及び非天然アミノ酸で置換してよい。

【0160】

本発明のポリペプチド中の必須のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発などの当該技術において既知の手順に従って同定できる（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989）。生物学的相互作用の部位は、推定接触部位アミノ酸の変異と組み合わせた核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性標識などの技術により決定されるように、構造の物理的解析により決定することもできる。例えばde Vos et al., Science 255:306-12, 1992；Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照されたい。必須のアミノ酸の同定は、本発明のポリペプチドの関連する構成要素（例えば転移又はプロテアーゼ構成要素）との相同性の分析から推測することもできる。

【0161】

多重アミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer（Science 241:53-7, 1988）又はBowie and Sauer（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6. 1989）により開示されるものなどの突然変異誘発及びスクリーニングの既知の方法を用いて作製して試験できる。簡単に述べると、これらの著者らは、ポリペプチド中の２以上の位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、それぞれの位置での許容され得る置換の範囲を決定する方法を開示している。用いることができるその他の方法は、ファージディスプレイ（例えばLowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991；Ladner et al.、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Huse、国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988）を含む。

【0162】

多重アミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer（Science 241:53-7, 1988）又はBowie and Sauer（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6. 1989）により開示されるものなどの突然変異誘発及びスクリーニングの既知の方法を用いて作製して試験できる。簡単に述べると、これらの著者らは、ポリペプチド中の２以上の位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、それぞれの位置での許容され得る置換の範囲を決定する方法を開示している。用いることができるその他の方法は、ファージディスプレイ（例えばLowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991；Ladner et al.、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Huse、国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988）を含む。

【0163】

ここで、以下に、本発明の態様及び／又は実施形態を説明する図面の簡単な説明を記載する。

【図面の簡単な説明】

【0164】

【図1】改変クロストリジウム神経毒（ＬＨ_Ｎ）が保持する驚くべき神経毒活性を示す図である。上記の改変神経毒は、機能的Ｈ_Ｃ結合ドメインを欠くので、LIN, et al.（国際公開第０２／０４４１９９号パンフレット）により記載される改変クロストリジウム神経毒と等価である。これとは対照的に、神経毒活性は、機能的Ｈ_Ｎ転移ドメインを欠く改変クロストリジウム神経毒（ＬＣ／Ｃ）について検出されなかった。

【図2】種々のＢｏＮＴ血清型についての単純アミノ酸配列相同性アラインメントを示す図である。このアラインメントから、ある血清型（例えばＡ血清型）からのアミノ酸残基又は領域を、単純な垂直方向のアラインメントにより、血清型全体にわたって対応する残基／領域と比較できる。

【図3】Ｌ（＃ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は、清澄化した細胞可溶化液を示し、レーン２は、カラム通過画分を示し、レーン３は、カラムの洗浄後に溶出された画分を示し、レーン４、６〜１２は、２５０ｍＭイミダゾールの添加の際に溶出された画分であり、レーン５は、分子質量マーカー（Benchmark）である。

【図4】ＦＸａによるＬ（＃ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質のタンパク質分解のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１及び２は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化前の精製タンパク質を示し、レーン３及び４は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化後のタンパク質を示し、レーン５は、分子質量マーカー（Benchmark）であり、レーン６及び７は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、第Ｘａ因子で処理したエンテロキナーゼ活性化タンパク質を示し、レーン８及び９は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、エンテロキナーゼで活性化していないタンパク質のＦＸａ処理の結果を示す。レーン６及び８において、第Ｘａ因子での処理の後のタンパク質のフラグメント化が明確に観察される。

【図5】ＬＨ（＃ＦＸａ）Ｃ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例２０で調製した）の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は、清澄化した細胞可溶化液を示し、レーン２は、分子質量マーカー（Benchmark）であり、レーン３は、カラム通過画分を示し、レーン４は、カラムの洗浄後に溶出された画分を示し、レーン５〜１２は、２５０ｍＭイミダゾールの添加の際に溶出された画分である。

【図6】ＬＨ（＃ＦＸａ）Ｃ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例２１で調製した）の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は、清澄化した細胞可溶化液を示し、レーン２は、カラム通過画分を示し、レーン３は、分子質量マーカー（Benchmark）であり、レーン４は、カラムの洗浄後に溶出された画分を示し、レーン５〜１２は、２５０ｍＭイミダゾールの添加の際に溶出された画分である。

【図7】ＦＸａによるＬＨ（＃ＦＸａ）Ｃ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例２０で調製した）のタンパク質分解のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１及び３は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化前の精製タンパク質を示し、レーン４及び５は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化後のタンパク質を示し、レーン６及び７は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、第Ｘａ因子で処理したエンテロキナーゼ活性化タンパク質を示し、レーン８及び９は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、エンテロキナーゼで活性化していないタンパク質のＦＸａ処理の結果を示す。レーン７及び９において、第Ｘａ因子での処理の後のタンパク質のフラグメント化が明確に観察される。レーン２は、分子質量マーカー（Benchmark）である。

【図8】ＦＸａによるＬＨ（＃ＦＸａ）Ｃ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例２０で調製した）のタンパク質分解のウェスタンブロット分析を示す図である。レーン１及び３は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化前の精製タンパク質を示し、レーン４及び５は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化後のタンパク質を示し、レーン６及び７は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、第Ｘａ因子で処理したエンテロキナーゼ活性化タンパク質を示し、レーン８及び９は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、エンテロキナーゼで活性化していないタンパク質のＦＸａ処理の結果を示す。レーン６、７、８及び９において、予測されるサイズにてヒスチジン免疫反応性バンドが視覚化されることにより、第Ｘａ因子での処理の後のタンパク質のフラグメント化が明確に観察される。レーン２は、染色による検出のために適する分子質量マーカー（Benchmark）である。レーン１０は、ウェスタンブロット視覚化のために適する分子質量マーカー（Magic Markers）である。

【図9】ＦＸａによるＬＨ（＃ＦＸａ）Ｃ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例２１で調製した）のタンパク質分解のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１及び２は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化前の精製タンパク質を示し、レーン４及び５は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化後のタンパク質を示し、レーン６及び７は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、第Ｘａ因子で処理したエンテロキナーゼ活性化タンパク質を示し、レーン８及び９は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、エンテロキナーゼで活性化していないタンパク質のＦＸａ処理の結果を示す。レーン７及び９において、第Ｘａ因子での処理の後のタンパク質のフラグメント化が明確に観察される。レーン３は、分子質量マーカー（Benchmark）である。

【図10】Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例１９で調製した）の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は、分子質量マーカー（Benchmark）であり、レーン２は、清澄化した細胞可溶化液を示し、レーン３は、カラム通過画分を示し、レーン４は、カラムの洗浄後に溶出された画分を示し、レーン５〜１２は、２５０ｍＭイミダゾールの添加の際に溶出された画分である。

【図11】トロンビンによるＬ（＃Ｔｈｒ）ＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例１９で調製した）のタンパク質分解のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は、分子質量マーカー（Benchmark）であり、レーン２及び３は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化前の精製タンパク質を示し、レーン４及び５は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化後のタンパク質を示し、レーン６及び７は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、第Ｘａ因子で処理したエンテロキナーゼ活性化タンパク質を示し、レーン８及び９は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、エンテロキナーゼで活性化していないタンパク質のＦＸａ処理の結果を示す。レーン６、７、８、及び９において、トロンビンでの処理の後のタンパク質のフラグメント化が明確に観察される。

【図12】トロンビンによるＬ（＃Ｔｈｒ）ＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例１９で調製した）のタンパク質分解のウェスタンブロット分析を示す図である。レーン１は、分子質量マーカー（Benchmark）であり、これは、ウェスタンブロッティングにより見えにくい。レーン２及び３は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化前の精製タンパク質を示し、レーン４及び５は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化後のタンパク質を示し、レーン６及び７は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、第Ｘａ因子で処理したエンテロキナーゼ活性化タンパク質を示し、レーン８及び９は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、エンテロキナーゼで活性化していないタンパク質のＦＸａ処理の結果を示す。レーン８及び９において、ＥＧＦドメインを保持するがおよそ２０ＫｄａのＬＣのＮ末端を欠くおよそ８５ｋＤａのフラグメントを放出するトロンビンでの処理後のタンパク質のフラグメント化が明確に観察される。

【図13】Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例２４で調製した）の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は、清澄化した細胞可溶化液を示し、レーン２は、カラム通過画分を示し、レーン３は、カラムの洗浄後に溶出された画分を示し、レーン４は、分子質量マーカー（Benchmark）であり、レーン５〜１１は、２５０ｍＭイミダゾールの添加の際に溶出された画分である。

【図14】トロンビンによるＬ（＃Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例２４で調製した）のタンパク質分解のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン４は、分子質量マーカー（Benchmark）である。レーン１及び２は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化前の精製タンパク質を示し、レーン３及び５は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化後のタンパク質を示し、レーン６及び７は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、トロンビンで処理したエンテロキナーゼ活性化タンパク質を示し、レーン８及び９は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、エンテロキナーゼで活性化していないタンパク質のトロンビン処理の結果を示す。レーン６、７、８、及び９において、トロンビンでの処理の後のタンパク質のフラグメント化が明確に観察される。

【図15】トロンビンによるＬ（＃Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質（実施例２４で調製した）のタンパク質分解のウェスタンブロット分析を示す図である。レーン４は、分子質量マーカー（Benchmark）である。レーン１及び２は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化前の精製タンパク質を示し、レーン３及び５は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、ＬＣ−Ｈ_Ｎ接合部でのエンテロキナーゼ活性化後のタンパク質を示し、レーン６及び７は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、トロンビンで処理したエンテロキナーゼ活性化タンパク質を示し、レーン８及び９は、それぞれＤＴＴの非存在下及び存在下での、エンテロキナーゼで活性化していないタンパク質のトロンビン処理の結果を示す。レーン７及び９において、トロンビンでの処理後のタンパク質のフラグメント化が明確に観察される。

【図16】未処理のＬ（ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦと比較した、ＦＸａ処理Ｌ（ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦへのＳＣＮの曝露後に得られた結果を示す図である。第Ｘａ因子で処理したタンパク質は、ＦＸａで処理しなかったタンパク質よりも、シンタキシンの切断について明らかにより効果が低い。本発明は、よって、改変タンパク質の効力の低減を可能にする。

【図17】１０ｎＭの未処理Ｌ（Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦと比較した、１０ｎＭのトロンビン処理Ｌ（Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦへのＳＣＮの曝露後に得られた結果を示す図である。トロンビンで処理したタンパク質は、トロンビンで処理しなかったタンパク質よりも、ＳＮＡＰ−２５の切断について明らかに効果がより低い。本発明は、よって、改変タンパク質の効力の低減を可能にする。

【0165】

ここで、以下に、実施例により説明される本発明の具体的な実施形態を記載する。

【0166】

実施例１−哺乳動物細胞（筋肉）に曝露した場合の本発明のポリペプチドの評価。
実施例２−本発明のポリペプチドを循環性プロテアーゼにまず曝露し、哺乳動物細胞に曝露した場合の該ポリペプチドの評価。
実施例３−本発明のポリペプチドの触媒活性の評価。
実施例４−本発明のポリペプチドの転移能力の評価。
実施例５−ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例６−ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の精製。
実施例７−ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質におけるプロテアーゼ感受性の増進の証明。
実施例８−ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例９−ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例１０−ＬＣ中にフューリン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例１１−Ｈ_Ｎドメイン中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例１２−ＬＣドメイン中にＡＤＡＭ１７認識部位を組み込んだＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例１３−ＬＣドメイン中にＡＤＡＭ１７認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出。
実施例１４−Ｈ_Ｎ中にフューリン認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出。
実施例１５−ジストニア（痙攣性斜頚）を患う患者の治療。
実施例１６−眼瞼痙攣を患う患者の治療。
実施例１７−ＬＣ中の２１０位に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例１８−ＬＣ中の１９５位にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例１９−ＬＣ中の２１０位にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例２０−Ｈ_Ｎの７４２位にてＨ_Ｎドメイン中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例２１−Ｈ_Ｎの７５０位にてＨ_Ｎドメイン中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例２２−Ｈ_Ｎの７５０位にてＨ_Ｎドメイン中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例２３−Ｈ_Ｎの７９８位にてＨ_Ｎドメイン中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＤ−ＶＩＰｒキメラタンパク質の創出。
実施例２４−ＬＣドメイン中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出。
実施例２５−ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込むように工学的に操作された精製ＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の特異的切断の証明。
実施例２６−Ｈ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込むように工学的に操作された精製ＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の特異的切断の証明。
実施例２７−ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込むように工学的に操作された精製ＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の特異的切断の証明。
実施例２８−ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込むように工学的に操作された精製ＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の特異的切断の証明。
実施例２９−Ｌ（ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦのＬＣドメイン中に第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を組み込むように工学的に作製されたタンパク質のインビトロ細胞活性の低減の証明。
実施例３０−Ｌ（Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦのＬＣドメイン中にトロンビンプロテアーゼ切断部位を組み込むように工学的に作製されたタンパク質のインビトロ細胞活性の低減の証明。
実施例３１−ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出。
実施例３２−ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出。
実施例３３−Ｈ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出。
実施例３４−ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ｅタンパク質の創出。
実施例３５−Ｈ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ｅタンパク質の創出。
実施例３６−ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＥ−ＶＩＰｒキメラタンパク質の創出。
実施例３７−Ｈ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＥ−ＶＩＰｒキメラタンパク質の創出。
実施例３８−ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＥ−ＶＩＰｒキメラタンパク質の創出。
実施例３９−LIN, et al.（国際公開第０２／０４４１９９号パンフレット）に記載される特性を有する改変クロストリジウム神経毒（ＬＨ_Ｎ）によるＳＮＡＲＥタンパク質の切断。

【0167】

配列番号のまとめ
配列番号１ ＬＨＣ−ＥＧＦのＤＮＡ配列
配列番号２ ＬＨＣ−ＥＧＦのタンパク質配列
配列番号３ Ｌ（＃ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦのＤＮＡ配列
配列番号４ Ｌ（＃ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦのタンパク質配列
配列番号５ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＣ−ＥＧＦのＤＮＡ配列
配列番号６ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＣ−ＥＧＦのタンパク質配列
配列番号７ ＬＨＡ−ＥＧＦのＤＮＡ配列
配列番号８ ＬＨＡ−ＥＧＦのタンパク質配列
配列番号９ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦのＤＮＡ配列
配列番号１０ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦのタンパク質配列
配列番号１１ Ｌ（＃フューリン）ＨＣ−ＥＧＦのＤＮＡ配列
配列番号１２ Ｌ（＃フューリン）ＨＣ−ＥＧＦのタンパク質配列
配列番号１３ ＬＨ（＃ＦＸａ）Ａ−ＥＧＦのＤＮＡ配列
配列番号１４ ＬＨ（＃ＦＸａ）Ａ−ＥＧＦのタンパク質配列
配列番号１５ Ｌ（＃ＡＤＡＭ１７）ＨＡ−ＥＧＦのＤＮＡ配列
配列番号１６ Ｌ（＃ＡＤＡＭ１７）ＨＡ−ＥＧＦのタンパク質配列
配列番号１７ ＬＨＡ−Ｈ_Ｃ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号１８ ＬＨＡ−Ｈ_Ｃ／Ａのタンパク質配列
配列番号１９ Ｌ（＃ＡＤＡＭ１７）ＨＡ−Ｈ_Ｃ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号２０ Ｌ（＃ＡＤＡＭ１７）ＨＡ−Ｈ_Ｃ／Ａのタンパク質配列
配列番号２１ Ｌ（＃フューリン）ＨＡ−Ｈ_Ｃ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号２２ Ｌ（＃フューリン）ＨＡ−Ｈ_Ｃ／Ａのタンパク質配列
配列番号２３ Ｌ（＃ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦ（ＳＸＮ１９７５）のＤＮＡ配列
配列番号２４ Ｌ（＃ＦＸａ）ＨＣ−ＥＧＦ（ＳＸＮ１９７５）のタンパク質配列
配列番号２５ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＣ−ＥＧＦ（ＳＸＮ１９３１）のタンパク質配列
配列番号２６ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＣ−ＥＧＦ（ＳＸＮ１９３２）のタンパク質配列
配列番号２７ ＬＨ（＃ＦＸａ）Ｃ−ＥＧＦ（ＳＸＮ１９３７）のタンパク質配列
配列番号２８ ＬＨ（＃ＦＸａ）Ｃ−ＥＧＦ（ＳＸＮ１９３８）のタンパク質配列
配列番号２９ ＬＨ（＃Ｔｈｒ）Ｃ−ＥＧＦ（ＳＸＮ１９３９）のタンパク質配列
配列番号３０ ＬＨ（＃ＦＸａ）Ｄ−ＶＩＰｒ（ＳＸＮ１９３０）のタンパク質配列
配列番号３１ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦ（ＳＸＮ１９７４）のタンパク質配列
配列番号３２ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＡ−Ｈ_Ｃ／Ａのタンパク質配列
配列番号３３ Ｌ（＃ＦＸａ）ＨＡ−Ｈ_Ｃ／Ａのタンパク質配列
配列番号３４ ＬＨ（ＦＸａ）Ａ−Ｈ_Ｃ／Ａのタンパク質配列
配列番号３５ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＥ−Ｈ_Ｃ／Ｅのタンパク質配列
配列番号３６ ＬＨ（＃ＦＸａ）Ｅ−Ｈ_Ｃ／Ｅのタンパク質配列
配列番号３７ Ｌ（＃Ｔｈｒ）ＨＥ−ＶＩＰｒのタンパク質配列
配列番号３８ ＬＨ（＃ＦＸａ）Ｅ−ＶＩＰｒのタンパク質配列
配列番号３９ Ｌ（＃ＦＸａ）ＨＥ−ＶＩＰｒ（Ｋ２２８Ｄでの変異）のタンパク質配列
［実施例］

【実施例1】

【0168】

哺乳動物筋細胞に曝露した場合の本発明のポリペプチドの評価
実施例１３に従って創出した精製タンパク質を、哺乳動物筋細胞（冠血管平滑筋初代培養又はＨＳｋＭＣ（１５０−０５ｆ）細胞（ＥＣＡＣＣから入手可能））の存在下でインキュベートする。並行して、第２ポリペプチド（同じ破壊性切断部位を欠くこと以外は第１ポリペプチドと同一）を、同じ被検細胞タイプの存在下で同一条件下にてインキュベートする。

【0169】

２つのポリペプチドのそれぞれを、次いで、ＡＤＡＭ１７（冠血管平滑筋初代培養／ＨＳｋＭＣ細胞に固有）による切断について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び後続のウェスタンブロット分析により評価する。この関係において、第１ポリペプチドについて観察された切断が、第２ポリペプチドについて観察されたものより大きいことにより、本発明の制御可能な不活性化が確認される。

【実施例2】

【0170】

本発明のポリペプチドを循環性プロテアーゼにまず曝露し、哺乳動物細胞に曝露した場合の該ポリペプチドの評価
本発明の実施例５に従って調製した第１ポリペプチド（配列番号４）を取り、まずポリペプチドを循環性プロテアーゼ（例えば第Ｘａ因子、トロンビン）にインビトロで曝露して、標的細胞の存在下でインキュベートする。並行して、第２ポリペプチド（配列番号２；プロテアーゼ切断部位を欠くこと以外は第１ポリペプチドと同一）を、第１ポリペプチドと同じ様式でインキュベートする。

【0171】

２つのポリペプチドのそれぞれを、次いで、胚性脊髄ニューロン（ｅＳＣＮ）におけるシンタキシンの切断について評価する。この関係において、第１ポリペプチドについて観察された切断が、第２ポリペプチドについて観察されたものより小さいことにより、本発明の制御可能な不活性化が確認される。

【実施例3】

【0172】

本発明のポリペプチドの触媒活性の評価
第１ポリペプチド（配列番号１０；本発明の実施例９に従って調製）を、インビトロで、ポリペプチドのプロテアーゼドメインに導入された破壊性切断部位にてポリペプチドを切断するプロテアーゼ（トロンビン）の存在下でインキュベートする。並行して、第２ポリペプチド（配列番号８：プロテアーゼ切断部位を欠くこと以外は第１ポリペプチドと同一）を、同じプロテアーゼの存在下にて同一様式でインキュベートする。

【0173】

２つのポリペプチドのそれぞれを、次いで、固定化ＳＮＡＰ−２５を含有するインビトロ無細胞系（Hallis et al 1996, J. Clin. Microbiol. 34 1934-1938に記載されるような）において攻撃し、ＳＮＡＰ−２５タンパク質の切断を、切断生成物に対して産生された特異的抗血清を用いることにより測定する。この関係において、第１ポリペプチドについて観察されたＳＮＡＲＥタンパク質切断が、第２ポリペプチドについて観察されたものより小さいことにより、本発明の制御可能な不活性化が確認される。

【実施例4】

【0174】

本発明のポリペプチドの転移能力の評価
第１ポリペプチド（本発明による）を、転移（例えばＨ_Ｎ）ドメインに導入された破壊性切断部位にてポリペプチドを切断するプロテアーゼの存在下でインキュベートする。並行して、第２ポリペプチド（プロテアーゼ切断部位を欠くこと以外は第１ポリペプチドと同一）を、同じプロテアーゼの存在下にて同一様式でインキュベートする。

【0175】

２つのポリペプチドのそれぞれを、次いで、脂質二重膜を含有するインビトロ系において攻撃し、膜を横切る輸送を測定する。例えば、Shone C.（1987）は、被検分子で攻撃されたリポソームを用いるインビトロアッセイについて記載している。必須の転移機能の存在は、リポソームからのＫ^＋及び／又は標識ＮＡＤの放出により確認され、これらは容易にモニターできる［Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180を参照されたい］。さらなる例は、Blaustein R.（1987）により提供され、これは、平面状脂質二重膜を用いる単純なインビトロアッセイについて記載している。被検分子を用いて膜を攻撃し、必須の転移機能は、上記の膜を挟むコンダクタンスの増加により確認される［Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120を参照されたい］。

【0176】

この方法は、Ｄ血清型ＢｏＮＴのＨ_Ｎドメインのプロテアーゼ不活性化を研究するために用いられる。実施例２３のタンパク質を発現させ、精製し、第Ｘａ因子に曝露して、タンパク質をＨ_Ｎドメイン内で切断する。切断されたタンパク質は、上記のインビトロ系で評価し、第Ｘａ因子で処理していないタンパク質と比較する。この実験は、第Ｘａ因子で処理したポリペプチドについての膜を横切る輸送が、未処理ポリペプチドのものよりも著しく低いことを決定する。

【実施例5】

【0177】

ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を、第Ｘａ因子についての基本形の認識部位（IEGR）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、ＬＣドメイン中に配列₂₁₀GEGR₂₁₃が同定された。ＬＣ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＬＣ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣ／Ａ等価ペプチド配列が、ＬＣの表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0178】

Ｇ２１０についてのコドン（GGC）を、Ｉｌｅをコードするもの（ATC）に交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発を、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にした。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換した。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認した。第Ｘａ因子部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号３として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号４に示す。

【実施例6】

【0179】

ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の精製
実施例１７で創出したＯＲＦを、大腸菌発現ベクター（動員欠損を確実にするように改変されたpET（Novagen社製）ベクター）にクローニングし、大腸菌宿主株、最も一般的にはBL21を形質転換した。ベクターを改変して、ＬＨＣ−ＥＧＦ ＯＲＦのＮ末端にてヒスチジンタグの発現を含めた。

【0180】

ＬＨＣ−ＥＧＦ融合タンパク質の発現を、以下のプロトコルを用いて達成する。２５０ｍｌフラスコ中の０．２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１００ｍｌの改変ＴＢに、ＬＨＣ−ＥＧＦ発現株からの単一コロニーを接種する。培養物を３７℃、２２５ｒｐｍにて１６時間成長させる。２Ｌフラスコ中の０．２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１Ｌの改変ＴＢに、１０ｍｌの一晩培養物を接種する。培養物を３７℃にて、およそ０．５のＯＤ６００ｎｍに到達するまで成長させ、この時点で温度を１６℃に低下させる。１時間後に、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、１６℃にてさらに１６時間成長させる。

【0181】

ＬＨＣ−ＥＧＦ融合体の精製は、アフィニティクロマトグラフィーにより達成する。詳細に、２５ｍｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、２００ｍＭのＮａＣｌ及びおよそ１０ｇの大腸菌BL21細胞ペーストを含有するファルコンチューブを解凍する。細胞ペーストを、氷上にて３０秒間の稼働及び３０秒間の休止を１０サイクルで、２２ミクロンの力で試料が冷たいままであることを確実にして、超音波処理する。溶解された細胞を１８０００ｒｐｍ、４℃にて３０分間スピンする。上清を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した、０．１ＭのＮｉＳＯ_４を装填したキレートカラム（２０〜３０ｍｌのカラムで十分である）に載せる。１０及び４０ｍＭイミダゾールの段階勾配を用い、非特異的結合したタンパク質を洗い流し、融合タンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出する。溶出された融合タンパク質を、５Ｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、２００ｍＭ ＮａＣｌに対して４℃にて一晩透析し、透析された融合タンパク質のＯＤを測定する。融合タンパク質１ｍｇ当たり６．４ｎｇのエンテロキナーゼを加え、２５℃にて静的に一晩インキュベートする。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した、０．１Ｍ ＮｉＳＯ_４を装填したキレートカラム（２０〜３０ｍｌのカラムで十分である）に載せる。カラムを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、２００ｍＭ ＮａＣｌでベースラインまで洗浄する。１０及び４０ｍＭイミダゾールの段階勾配を用い、非特異的結合したタンパク質を洗い流し、融合タンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出する。溶出された融合タンパク質を、５Ｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、２００ｍＭ ＮａＣｌに対して４℃にて一晩透析し、融合体を約２ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、試料を一定量に分け、−２０℃にて凍結する。精製タンパク質を、ＯＤ、ＢＣＡ及び純度分析を用いて試験する。

【実施例7】

【0182】

ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質におけるプロテアーゼ感受性の増進の証明
実施例６の精製キメラタンパク質を、プロテアーゼの存在下でのその安定性について、実施例２及び３に概説した方法を用いて評価する。まとめると、ＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質を、一連の濃度の第Ｘａ因子プロテアーゼ（例えばNew England Biolabs社製、＃Ｐ８０１０Ｌから得る）に、インビトロにて１〜１２０分の期間にわたって曝露する。タンパク質分解を、第Ｘａ因子の特異的阻害物質（例えばダンシル−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ−クロロメチルケトン（CALBIOCHEM社製、＃２５１７００））の添加により終結させる。さらなる第Ｘａ因子部位を含まないＬＨＣ−ＥＧＦの対照タンパク質キメラを用いて、ＬＣ活性に対するプロテアーゼの影響（実施例３を用いる）、及び標的細胞に曝露した場合のキメラの機能性（実施例２を用い、且つ胚性脊髄ニューロン（ｅＳＣＮ）におけるシンタキシン切断を測定する）を比較する。

【実施例8】

【0183】

ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を、トロンビンについての基本形の認識部位（LVPRGS）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、ＬＣドメイン中に配列₁₉₄ISPRFM₁₉₉が同定された。ＬＣ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＬＣ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣ／Ａ等価ペプチド配列が、ＬＣの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0184】

Ｓ_１９５についてのコドンをＶａｌ（TCTからGTT）に、及びＭ_１９５についてのコドンをＳｅｒ（ATGからTCC）に交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発は、領域₁₉₄ISPRFM₁₉₉をIVPRFSに変更して、これをトロンビン切断についての基質にする。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。トロンビン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号５として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号６に示す。

【実施例9】

【0185】

ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＡのＬＨ_ＮフラグメントとＥＧＦ配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号８）を、トロンビンについての基本形の認識部位（GRG）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、ＬＣドメイン中に配列₁₀₃GRM₁₀₅が同定された。ＬＣ／Ａの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣ／Ａペプチド配列が、表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0186】

Ｍｅｔ１０５についてのコドン（ATG）を、Ｇｌｙをコードするもの（GGT）に交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号７（配列番号８のＯＲＦをコードする）の部位特異的突然変異誘発を、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。トロンビン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号９として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号１０に示す。

【実施例10】

【0187】

ＬＣ中にフューリン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を、フューリンについての基本形の認識部位（RXR▼K/R）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、ＬＣドメイン中に配列₂₁₀GEGR₂₁₃が同定された。ＬＣ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＬＣ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣ／Ａ等価ペプチド配列が、ＬＣの表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0188】

ペプチド領域GEGRをRSRRに交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発を、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。フューリン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号１１として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号１２に示す。

【実施例11】

【0189】

Ｈ_Ｎドメイン中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＡのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号８）を、第Ｘａ因子についての基本形の認識部位（IEGR）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、Ｈ_Ｎドメイン中に配列₅₆₂GKSR₅₆₅が同定された。Ｈ_Ｎ／Ａの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、Ｈ_Ｎペプチド配列が、表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0190】

ペプチド領域GKSRをIEGRに交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号７（配列番号８をコードする）の部位特異的突然変異誘発を、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。第Ｘａ因子部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号１３として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号１４に示す。

【実施例12】

【0191】

ＬＣドメイン中にＡＤＡＭ１７認識部位を組み込んだＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＡのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号８）を、ＡＤＡＭ１７についての基本形の認識部位（PLAQAVRSSS）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適する構造の領域（ＬＣドメイン中の₂₀₆PLLGAGKFAT₂₁₅）が同定される。ＬＣの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。

【0192】

配列番号７（配列番号８をコードする）の部位特異的突然変異誘発を、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。ＬＣの突然変異誘発を行って、コード領域₂₀₆PLLGAGKFAT₂₁₅をPLAQAVRSSSに改変した。

【0193】

大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。さらなるＡＤＡＭ１７部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号１５として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号１６に示す。

【実施例13】

【0194】

ＬＣドメイン中にＡＤＡＭ１７認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性ＢｏＮＴ／Ａの１次配列（配列番号１８）を、ＡＤＡＭ１７についての基本形の認識部位（PLAQAVRSSS）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するＢｏＮＴ構造の領域（ＬＣドメイン中の₂₀₆PLLGAGKFAT₂₁₅）が同定される。ＬＣの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。

【0195】

配列番号１７（配列番号１８をコードする）の部位特異的突然変異誘発を、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。ＬＣの突然変異誘発を行って、コード領域₂₀₆PLLGAGKFAT₂₁₅をPLAQAVRSSSに改変した。

【0196】

大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。さらなるＡＤＡＭ１７部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号１９として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号２０に示す。

【実施例14】

【0197】

Ｈ_Ｎ中にフューリン認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性ＢｏＮＴ／Ａの１次配列（配列番号１８）を、フューリンについての基本形の認識部位（RXR▼K/R）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するＨ_Ｎドメイン内の配列₅₆₃KSR₅₆₅が同定された。Ｈ_Ｎドメインの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、Ｈ_Ｎペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。

【0198】

Ｋ_５６３についてのコドン（AAA）をＡｒｇ（CGT）に交換し、Ａｒｇ（CGC）を現存するＲ_５６５の後に挿入するように設計されたプライマーを用いる配列番号１７（配列番号１８をコードする）の部位特異的突然変異誘発は、配列₅₆₃KSR₅₆₅を、フューリンによる切断についての基質であるRSRRに変更する。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。

【0199】

大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。さらなるＡＤＡＭ１７部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号２１として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号２２に示す。

【実施例15】

【0200】

ジストニア（痙攣性斜頚）を患う患者の治療
頚部筋系の痙攣性又は強直性の収縮により顕在化され、頭部の常同的な異常偏位を生じ、頤が片側に回転し、頭部が回転している側に向かって肩部が上昇している痙攣性斜頚を患う男性は、斜頚のために頚筋への治療上有効な量のＢｏＮＴ／Ａを用いて以前に処置されたが、中咽頭内へのプロテアーゼの拡散のために、嚥下障害を発現した。患者は、ジストニアの頚筋への、約３００単位まで又はそれより多い本発明のポリペプチド（例えば第Ｘａ因子プロテアーゼ感受性部位を含むように改変されたＡ型ボツリヌス毒素神経毒）の注射により、その後処置される。３〜７日後に、症状は実質的に緩和され、患者は、頭部及び肩部を正常な位置に少なくとも３カ月保持することができる。改変神経毒での処置の後に、患者は、嚥下障害を経験しない。改変Ａ型ボツリヌス毒素を用いることにより、医師は、副作用の増加の恐れなく、治療を必要とする領域により多量の製品を注射できる。用量の増進は、作用の持続期間を増進し、よって、治療を改善する。

【実施例16】

【0201】

眼瞼痙攣を患う患者の治療
眼瞼痙攣を患う５８歳の女性を、上眼瞼の外側瞼板前部眼輪筋及び下眼瞼の外側瞼板前部眼輪筋への、約１〜約５単位の本発明のポリペプチド（例えば実施例１３に記載されるようなＡＤＡＭ１７プロテアーゼ感受性部位を含むように改変されたＡ型ボツリヌス毒素神経毒）の注射により処置し、注射する量は、注射される筋肉のサイズ及び所望の筋肉麻痺の程度の両方に基づいて変動する。眼瞼痙攣の緩和は、約１〜約７日に生じる。改変Ａ型ボツリヌス毒素を用いることにより、医師は、副作用の増加の恐れなく、治療を必要とする領域により多量の製品を注射できる。用量の増進は、作用の持続期間を増進し、よって、治療を改善する。

【実施例17】

【0202】

ＬＣ中の２１０位に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出［ＳＸＮ１０１９７５］
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を、第Ｘａ因子についての基本形の認識部位（IEGR）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。第Ｘａ因子部位の挿入部位は、ＬＣドメイン内の１次配列₂₁₀GEGRに同定される。ＬＣ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＬＣ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣ／Ａ等価ペプチド配列が、ＬＣの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0203】

配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発を、_２１０ＧについてのコドンをＩに交換してこれを第Ｘａ因子切断についての基質にするように設計されたプライマーを用いて達成した。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。第Ｘａ因子部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号２３として示し、発現生成物のアミノ酸配列を、配列番号２４に示す。

【実施例18】

【0204】

ＬＣ中の１９５位にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出［ＳＸＮ１０１９３１］
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を、トロンビンについての基本形の認識部位との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。トロンビン部位の挿入部位は、ＬＣドメイン内の１次配列₁₉₄ISPRFM₁₉₉に同定される。ＬＣ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＬＣ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣ／Ａ等価ペプチド配列が、ＬＣの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0205】

Ｓ_１９５についてのコドンをＶａｌ（TCTからGTT）に、及びＭ_１９５についてのコドンをＳｅｒ（ATGからTCC）に交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発は、領域₁₉₄ISPRFM₁₉₉をIVPRFSに変更して、これをトロンビン切断についての基質にする。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いたトロンビン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号２５に示す。

【実施例19】

【0206】

ＬＣ中の２１０位にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出［ＳＸＮ１０１９３２］
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を、トロンビンについての基本形の認識部位との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。トロンビン部位の挿入部位は、ＬＣドメイン内の１次配列₂₁₀GEGRFSに同定される。ＬＣ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＬＣ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣ／Ａ等価ペプチド配列が、ＬＣの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0207】

コドン₂₁₁EGRをTPRに交換して、トロンビン切断についての基質である配列GTPRFSを創出するように設計されたプライマーを用いる配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いたトロンビン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号２６に示す。

【実施例20】

【0208】

Ｈ_Ｎの７４２位にてＨ_Ｎドメイン中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出［ＳＸＮ１０１９３７］
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を詳しく調査し、第Ｘａ因子部位の挿入のための部位を、Ｈ_Ｎドメイン中の１次配列₇₄₂IDLE₇₅₅に同定する。Ｈ_Ｎ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＨ_Ｎ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、Ｈ_Ｎ／Ａ等価ペプチド配列が、Ｈ_Ｎの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0209】

_７４２ＬＥについてのコドンをＧＲに交換してこれを第Ｘａ因子切断についての基質にするように設計されたプライマーを用いる配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いたトロンビン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号２７に示す。

【実施例21】

【0210】

Ｈ_Ｎの７５０位にてＨ_Ｎドメイン中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出［ＳＸＮ１０１９３８］
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を詳しく調査し、第Ｘａ因子部位の挿入のための部位を、Ｈ_Ｎドメイン中の１次配列₇₅₀SGSD₇₅₃に同定する。Ｈ_Ｎ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＨ_Ｎ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、Ｈ_Ｎ／Ａ等価ペプチド配列が、Ｈ_Ｎの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0211】

₇₅₀SGSDについてのコドンをIDGRに交換してこれを第Ｘａ因子切断についての基質にするように設計されたプライマーを用いる配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いた第Ｘａ因子部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号２８に示す。

【実施例22】

【0212】

Ｈ_Ｎの７５０位にてＨ_Ｎドメイン中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出［ＳＸＮ１０１９３９］
ＢｏＮＴ／ＣのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号２）を詳しく調査し、トロンビン部位の挿入のための部位を、Ｈ_Ｎドメイン中の１次配列₇₅₀SGSD₇₅₃に同定する。Ｈ_Ｎ／Ｃの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＨ_Ｎ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、Ｈ_Ｎ／Ａ等価ペプチド配列が、Ｈ_Ｎの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0213】

SGSDについてのコドンをGVPRに交換してこれをトロンビン切断についての基質にするように設計されたプライマーを用いる配列番号１（配列番号２をコードする）の部位特異的突然変異誘発。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いたトロンビン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号２９に示す。

【実施例23】

【0214】

Ｈ_Ｎの７９８位にてＨ_Ｎドメイン中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＤ−ＶＩＰｒキメラタンパク質の創出［ＳＸＮ１０１９３０］
ＢｏＮＴ／ＤのＬＨ_Ｎフラグメントと、ヒト血管作用性小腸ペプチドのアナログ（ＶＩＰｒ）の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列を詳しく調査し、第Ｘａ因子部位の挿入のための部位を、Ｈ_Ｎドメイン中の１次配列₇₉₈SGSDに同定する。Ｈ_Ｎ／Ｄの３次構造内のペプチドの位置は、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）を手引きとして用いるＨ_Ｎ／Ａ中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、Ｈ_Ｎ／Ａ等価ペプチド配列が、Ｈ_Ｎの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0215】

₇₉₈SGSDについてのコドンをIDGRに交換してこれを第Ｘａ因子切断についての基質にするように設計されたプライマーを用いる、遺伝子の部位特異的突然変異誘発を行う。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いた第Ｘａ因子部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号３０に示す。

【実施例24】

【0216】

ＬＣドメイン中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の創出［ＳＸＮ１９７４］
ＢｏＮＴ／ＡのＬＨ_Ｎフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列（配列番号８）を、トロンビンについての基本形の認識部位（GRG）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、ＬＣドメイン中に配列₁₀₃GRM₁₀₅が同定された。ＬＣの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣペプチド配列が、表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0217】

ペプチド領域GRMをGRGに交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号７（配列番号８をコードする）の部位特異的突然変異誘発を、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いたトロンビン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号３１に示す。

【実施例25】

【0218】

ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込むように工学的に操作された精製ＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の特異的切断の証明［ＳＸＮ１９７５］
ＬＨＣ−ＥＧＦのＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ新規な分子を、実施例１７に従って構築する。実施例６に記載するものと同様の方法を用いて、実施例１７のタンパク質を発現させて精製する。方法は、AKTA Xpress精製システムでの使用のために適合させた。本質的に、清澄化した大腸菌可溶化液を、Xpressシステム上の５ｍｌのHisTrap FF Crudeカラムにアプライした。プログラムを、１０カラム容量の結合緩衝液（５０ｍＭ Tris ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ）及び１０カラム容量の結合緩衝液中の４０ｍＭイミダゾールでカラムを洗浄するように設定した（一緒に通過画分で回収した）。溶出は、５カラム容量の結合緩衝液中の２５０ｍＭイミダゾールを用いた。タンパク質をループ中に回収し、システムを脱塩する準備ができるまで保持した（５０ｍＭ Tris ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で）。脱塩されたタンパク質を、２ｍｌ ９６ウェルプレート中に回収した。図３は、大腸菌からのＬＨＣ−ＥＧＦの精製を示す。

【0219】

実施例７に記載する方法を用いて、タンパク質を第Ｘａ因子プロテアーゼで処理し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。図４は、第Ｘａ因子の存在下でのタンパク質の切断を示す。切断生成物を、非還元及び還元試料中で観察する。切断生成物の推定質量は、工学的に操作されたタンパク質の予測される切断点と一致する。

【実施例26】

【0220】

Ｈ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込むように工学的に操作された精製ＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の特異的切断の証明［ＳＸＮ１９３７及びＳＸＮ１９３８］
ＬＨＣ−ＥＧＦのＨ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ新規な分子を、実施例２０に従って構築し、ＬＨＣ−ＥＧＦのＨ_Ｎ中の異なる位置に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ第２の新規な分子を、実施例２１に従って構築する。実施例２４に記載するものと同様の方法を用いて、実施例２０及び２１のタンパク質を発現させて精製する。図５は、大腸菌からの実施例２０のＬＨＣ−ＥＧＦの精製を示し、図６は、大腸菌からの実施例２１のＬＨＣ−ＥＧＦの精製を示す。

【0221】

実施例７に記載する方法を用いて、実施例２０のタンパク質を第Ｘａ因子プロテアーゼで処理し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの染色により評価されるように、第Ｘａ因子の存在下でのタンパク質の切断を示す。図８は、Ｈｉｓタグの存在を調べるための抗Ｈｉｓタグ抗体を用いるウェスタンブロッティングにより評価した場合の試料のプロファイルを示す。切断生成物の推定質量は、工学的に操作されたタンパク質の予測される切断点と一致する。

【0222】

実施例７に記載する方法を用いて、実施例２１のタンパク質を第Ｘａ因子プロテアーゼで処理し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。図９は、第Ｘａ因子の存在下でのタンパク質の切断を示す。切断生成物の推定質量は、工学的に操作されたタンパク質の予測される切断点と一致する。

【実施例27】

【0223】

ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込むように工学的に操作された精製ＬＨＣ−ＥＧＦキメラタンパク質の特異的切断の証明［ＳＸＮ１９３２］
ＬＨＣ−ＥＧＦのＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだ新規な分子を、実施例１９に従って構築する。実施例２５に記載するものと同様の方法を用いて、実施例１９のタンパク質を発現させて精製する。図１０は、大腸菌からのＬＨＣ−ＥＧＦの精製を示す。

【0224】

実施例７に記載する方法を用いて、タンパク質をトロンビンプロテアーゼで処理し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価されるように、トロンビンの存在下でのタンパク質の切断を示す。図１２は、抗ＥＧＦ抗体を用いるウェスタンブロッティングにより評価されるように、トロンビンの存在下でのタンパク質の切断を示す。切断生成物の推定質量は、工学的に操作されたタンパク質の予測される切断点と一致する。

【実施例28】

【0225】

ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込むように工学的に操作された精製ＬＨＡ−ＥＧＦキメラタンパク質の特異的切断の証明［ＳＸＮ１９７４］
ＬＨＡ−ＥＧＦのＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ新規な分子を、実施例２４に従って構築する。実施例２５に記載するものと同様の方法を用いて、実施例２４のタンパク質を発現させて精製する。図１３は、大腸菌からのＬＨＡ−ＥＧＦの精製を示す。

【0226】

実施例７に記載する方法を用いて、タンパク質をトロンビンプロテアーゼで処理し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。図１４は、トロンビンの存在下でのタンパク質の切断を示す。図１５は、１次抗体として抗ＥＧＦを用いる同じＰＡＧＥのウェスタンブロットプロファイルを示す。切断生成物の推定質量は、工学的に操作されたタンパク質の予測される切断点と一致する。

【実施例29】

【0227】

ＬＨＣ−ＥＧＦのＬＣドメイン中にＦＸａプロテアーゼ切断部位を組み込むように工学的に作製されたタンパク質のインビトロ細胞活性の低減の証明［ＳＸＮ１９７５］
実施例２５のタンパク質生成物を発現させて精製する。精製タンパク質を、ＦＸａプロテアーゼに曝露した後に、インビトロ脊髄ニューロン（spinal cord neuron、ＳＣＮ）アッセイにおいて評価する。ＳＣＮの調製は、十分に確立された技術であり、文献に記載されている［B.R. Ransom, E. Neale, M. Henkart, P.N. Bullock, P.G. Nelson, Mouse spinal cord in cell culture. I. Morphology and intrinsic neuronal electrophysiologic properties, J. Neurophysiol. 40 (1977) 1132-1150；S.C. Fitzgerald, A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System, Alan R. Liss Inc, New York, 1989］。被検タンパク質を、多様な濃度にて、培養培地中での希釈により調製する。ＳＣＮを、被検タンパク質に２４時間曝露した後に培地を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによる分析のための細胞材料を調製する。細胞タンパク質をNovex４〜２０％Tris−グリシンポリアクリルアミドゲルで分離した後に、タンパク質をニトロセルロースに移し、その後、適切なＳＮＡＲＥタンパク質の存在について、商業的供給源から得た抗体を用いて調べる。この場合、抗体は、ＳＮＡＲＥシンタキシンに特異的であった。

【0228】

図１６を参照して、第Ｘａ因子で処理したタンパク質は、ＦＸａで処理しなかったタンパク質よりも、シンタキシンの切断について明らかに効果がより低い。本発明は、よって、改変タンパク質の効力の低減を可能にする。

【実施例30】

【0229】

ＬＨＡ−ＥＧＦのＬＣドメイン中にトロンビンプロテアーゼ切断部位を組み込むように工学的に作製されたタンパク質のインビトロ細胞活性の低減の証明［ＳＸＮ１９７４］
実施例２４のタンパク質生成物を発現させて精製する。精製タンパク質を、トロンビンプロテアーゼに曝露した後に、インビトロ脊髄ニューロン（ＳＣＮ）アッセイにおいて評価する。ＳＣＮの調製は、十分に確立された技術であり、文献に記載されている［B.R. Ransom, E. Neale, M. Henkart, P.N. Bullock, P.G. Nelson, Mouse spinal cord in cell culture. I. Morphology and intrinsic neuronal electrophysiologic properties, J. Neurophysiol. 40 (1977) 1132-1150；S.C. Fitzgerald, A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System, Alan R. Liss Inc, New York, 1989］。被検タンパク質を、多様な濃度にて、培養培地中での希釈により調製する。ＳＣＮを、被検タンパク質に２４時間曝露した後に培地を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによる分析のための細胞材料を調製する。細胞タンパク質をNovex４〜２０％Tris−グリシンポリアクリルアミドゲルで分離した後に、タンパク質をニトロセルロースに移し、その後、適切なＳＮＡＲＥタンパク質の存在について、商業的供給源から得た抗体を用いて調べる。この場合、抗体は、ＳＮＡＲＥ ＳＮＡＰ−２５に特異的であった。図１７は、未処理Ｌ（Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦと比較した、トロンビン処理Ｌ（Ｔｈｒ）ＨＡ−ＥＧＦによるＳＮＡＰ−２５切断を示す。

【実施例31】

【0230】

ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性ＢｏＮＴ／Ａの１次配列（配列番号１８）を、トロンビンについての基本形の認識部位（GRG）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するＬＣドメイン内の配列₁₀₃GRM₁₀₅が同定された。Ｈ_Ｎドメインの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、Ｈ_Ｎペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。

【0231】

Ｍ_１０５についてのコドンをＧに交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号１７（配列番号１８をコードする）の部位特異的突然変異誘発は、配列₁₀₃GRM₁₀₅を、トロンビンによる切断についての基質であるGRGに変更する。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。

【0232】

大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物の最終アミノ酸配列を、配列番号３２に示す。

【実施例32】

【0233】

ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性ＢｏＮＴ／Ａの１次配列（配列番号１８）を、第Ｘａ因子についての基本形の認識部位（IEGR）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するＬＣドメイン内の配列IDSLが同定された。ＬＣドメインの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。

【0234】

_２７６ＳＬについてのコドンをＧＲに交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号１７（配列番号１８をコードする）の部位特異的突然変異誘発は、配列IDSLを、第Ｘａ因子による切断についての基質であるIDGRに変更する。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。

【0235】

大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物の最終アミノ酸配列を、配列番号３３に示す。

【実施例33】

【0236】

Ｈ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ａタンパク質の創出
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性ＢｏＮＴ／Ａの１次配列（配列番号１８）を、第Ｘａ因子についての基本形の認識部位（IEGR）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するＨ_Ｎドメイン内の配列₅₆₂GKSR₅₆₅が同定された。Ｈ_Ｎドメインの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。

【0237】

ペプチド領域GKSRを、第Ｘａ因子による切断についての基質であるIEGRに交換するように設計されたプライマーを用いる配列番号１７（配列番号１８をコードする）の部位特異的突然変異誘発。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。

【0238】

大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物の最終アミノ酸配列を、配列番号３４に示す。

【実施例34】

【0239】

ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ｅタンパク質の創出
組換えエンドペプチダーゼ活性ＢｏＮＴ／Ｅの１次配列［ヌクレオチド受託番号ＡＭ６９５７５５；Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ａ８Ｙ８６７］を、トロンビンについての基本形の認識部位（LVPRGS）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するＬＣドメイン内の配列₁₈₆FSPEYS₁₉₁が同定された。Ｈ_Ｎドメイン中の３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。

【0240】

部位特異的突然変異誘発を、ペプチド領域FSPEYSを、トロンビンによる切断についての基質であるIVPRFSに交換するように設計されたプライマーを用いて達成する。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。

【0241】

大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物の最終アミノ酸配列を、配列番号３５に示す。

【実施例35】

【0242】

Ｈ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだ組換えＢｏＮＴ／Ｅタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／Ｅの１次配列［ヌクレオチド受託番号ＡＭ６９５７５５；Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ａ８Ｙ８６７］を、第Ｘａ因子認識ペプチドについての可能性のある挿入部位（IEGR）について詳しく調査する。ＢｏＮＴ／Ｅの１次配列の、ＢｏＮＴ／Ａのものとの比較と、ＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測されるＨ_Ｎドメインの３次構造内のペプチドの対応する位置とから、領域₇₂₇TLEEが、IEGRへのタンパク質工学のために適すると結論付ける。

【0243】

部位特異的突然変異誘発を、ペプチド領域TLEEを、第Ｘａ因子による切断についての基質であるIEGRに交換するように設計されたプライマーを用いて達成する。突然変異誘発は、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成した。

【0244】

大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物の最終アミノ酸配列を、配列番号３６に示す。

【実施例36】

【0245】

ＬＣ中にトロンビン認識部位を組み込んだＬＨＥ−ＶＩＰｒキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＥのＬＨ_Ｎフラグメントと、ヒト血管作用性小腸ペプチドのアナログ（ＶＩＰｒ）の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列を、トロンビンについての基本形の認識部位（GRG）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。１次配列の単純な文字データ符号分析により、キメラのＬＣドメイン内に配列₁₀₃GGI₁₀₅が同定された。ＬＣ／Ｅの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＬＣ／ＥのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：１Ｔ３Ａ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばJmol（http://www.rcsb.org/pdb/explore/jmol.do?structureId=1T3A&bionumber=1））を用いて、ＬＣペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0246】

部位特異的突然変異誘発を、ペプチド領域GGIをGRGに交換するように設計されたプライマーを用い、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成する。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いたトロンビン部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号３７に示す。

【実施例37】

【0247】

Ｈ_Ｎ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＥ−ＶＩＰｒキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＥのＬＨ_Ｎフラグメントと、血管作用性小腸ペプチドのアナログ（ＶＩＰｒ）の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列を、第Ｘａ因子についての基本形の認識部位（IEGR）との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。

【0248】

１次配列の単純な文字データ符号分析により、Ｈ_Ｎドメイン内に配列₅₈₅GENNが同定された。Ｈ_Ｎ／Ｅの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＡのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：３ＢＴＡ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばFirstGlance in Jmol（http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta））を用いて、ＬＣペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0249】

部位特異的突然変異誘発を、ペプチド領域GENNをIEGRに交換するように設計されたプライマーを用い、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成する。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いた第Ｘａ因子部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号３８に示す。

【実施例38】

【0250】

ＬＣ中に第Ｘａ因子認識部位を組み込んだＬＨＥ−ＶＩＰｒキメラタンパク質の創出
ＢｏＮＴ／ＥのＬＨ_Ｎフラグメント（変異基質認識ドメイン（Ｋ２２８Ｄ）を組み込んだ）と、ヒト血管作用性小腸ペプチドのアナログ（ＶＩＰｒ）の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の１次配列を、タンパク質の表面上に露出され、第Ｘａ因子についての基本形の認識部位（IEGR）と類似するように工学的に操作できる一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。

【0251】

１次配列の分析により、ＬＣドメイン内に配列₂₆₈VAQYが同定された。ＬＣ／Ｅの３次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのＢｏＮＴ／ＥのＸ線結晶構造（ｐｄｂ：１Ｔ３Ａ）から予測する。無料で利用可能なソフトウェア（例えばJmol（http://www.rcsb.org/pdb/explore/jmol.do?structureId=1T3A&bionumber=1））を用いて、ＬＣペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。

【0252】

部位特異的突然変異誘発を、ペプチド領域VAQYをIEGRに交換するように設計されたプライマーを用い、突然変異誘発を行うための標準的な分子ツール（例えば、Stratagene Quickchange突然変異誘発法）を用いて達成する。大腸菌のコドン使用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart社製）などのソフトウェアプログラムを参照することにより評価し、％ＧＣ含量及びコドン使用比率を、発表されたコドン使用の表（例えばGenBank Release 143, September 13 2004）を参照することにより評価して、突然変異誘発が、乏しいコドン使用をもたらさないことを確実にする。突然変異誘発ＤＮＡを、標準的なクローニングベクター、例えばpCR4に組み込んだ後に、大腸菌ホストを形質転換する。ＯＲＦ ＤＮＡの完全性を、配列決定により確認する。発現生成物のアミノ酸配列をコードするために用いた第Ｘａ因子部位を組み込んだ最終ＯＲＦを、配列番号３９に示す。

【実施例39】

【0253】

LIN, et al.（国際公開第０２／０４４１９９号パンフレット）に記載される特性を有する改変クロストリジウム神経毒（ＬＨ_Ｎ）によるＳＮＡＲＥタンパク質の切断
胚性脊髄ニューロンを、Ｅ１５ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットからの解剖により調製し、解離させた後にMatrigel被覆９６ウェルプレートに、ウェル当たり１２５，０００細胞にて培地（重炭酸ナトリウムで緩衝したＭＥＭ、５％不活化ウマ血清、０．６％Ｄ−グルコース、２％Ｎ１培地補充物、４０ｎｇ／ｍｌコルチコステロン、２０ｎｇ／ｍｌトリヨードチロニン）中で培養した。

【0254】

３週間後に、細胞を、Ｃ血清型の組換え軽鎖（ＬＣ／Ｃ）、又はＣ血清型の転移鎖及び軽鎖からなる改変クロストリジウム神経毒（ＬＨｎ／Ｃ）のいずれかを、１８０ｎＭ〜０．１８ｎＭの半対数濃度にて含有する新鮮な培地で２４時間、３７℃にて、湿潤５％ＣＯ_２雰囲気でインキュベートした。

【0255】

細胞を、ＤＴＴを含有するＳＤＳ ＰＡＧＥローディング緩衝液で溶解した。タンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥ（１２％Tris-Bis）により分離し、ニトロセルロースメンブレンに移し、シンタキシンを、ウサギ抗シンタキシン２抗体（Synaptic Systems社製、ｃａｔ＃１１００２２）を用いて検出した。結合した抗体を、抗ウサギＩｇＧ抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートと、その後に、蛍光シグナルのためのWestduraとを用いて検出した。画像を走査し、Syngeneソフトウェア（GeneTools社製）を用いて定量した。図１は、全シンタキシンのパーセンテージとしての切断されたシンタキシンを示し、機能的Ｈ_Ｃ結合ドメインを欠く改変クロストリジウム神経毒（ＬＨｎ／Ｃ）についての神経毒活性が確認されるが、機能的Ｈ_Ｎ転移ドメインを欠く改変クロストリジウム神経毒（ＬＣ／Ｃ）についての神経毒活性は検出可能でないことが確認される。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]