特許 5766610 質量分析法による核酸分子の配列決定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5766610

(24)【登録日】2015年6月26日

(45)【発行日】2015年8月19日

(54)【発明の名称】質量分析法による核酸分子の配列決定

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150730BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20150730BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20150730BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20150730BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20150730BHJP

   G01N 27/62 20060101ALI20150730BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20150730BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 Z

   G01N33/53 M

   G01N33/543 501F

   G01N30/88 D

   G01N27/62 B

   G01N30/72 C

【請求項の数】19

【全頁数】110

(21)【出願番号】特願2011-533609(P2011-533609)

(86)(22)【出願日】2009年10月29日

(65)【公表番号】特表2012-506709(P2012-506709A)

(43)【公表日】2012年3月22日

(86)【国際出願番号】EP2009007754

(87)【国際公開番号】WO2010049156

(87)【国際公開日】20100506

【審査請求日】2012年3月26日

(31)【優先権主張番号】08018916.0

(32)【優先日】2008年10月29日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】511085275

【氏名又は名称】ノクソン ファーマ エージー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(72)【発明者】

【氏名】ターナー，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】フース，ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】クラスマン，スヴェン

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０９７３６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Anal. Chem.，１９９９年，vol.71, no.13，pp.2266-2269

【文献】 Chem. Rev.，２００５年，vol.105, no.5，pp.1869-1915

【文献】 Nucleic Acids Symp. Ser.，２００８年 ９月，no.52，pp.61-62

【文献】 Anal. Chem.，２００８年１０月 １日，vol.80, no.19，pp.7414-7421

【文献】 Nucleic Acids Res.，１９９８年，vol.26, no.2，pp.446-451

【文献】 Nucleic Acids Symp. Ser.，２００４年，no.48，pp.263-264

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｇ０１Ｎ ２７／６２−２７／７０

Ｇ０１Ｎ ３３／５０−３３／９８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片とを提供する工程であって、切断により断片の混合物を提供し、そのような断片の混合物が、前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む工程；
ｃ）前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子断片から分離する工程であって、前記修飾核酸分子断片が、修飾と、支持体に連結された相互作用パートナーとの相互作用によって非修飾核酸分子断片から分離されるか、または、前記修飾核酸分子断片が、質量識別、サイズ識別、および／または疎水性識別、電荷識別、イオン識別、水素結合識別、あるいは液相によって仲介される抽出による分離によって、前記非修飾核酸分子から分離される、工程；
ｄ）前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される工程；ならびに
ｅ）任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程；
ｆ）前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程；
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
前記修飾が核酸分子断片の５’末端に存在し、かつ工程ｂ）の断片の混合物の中で最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端５’ヌクレオチドを含むか、または、前記修飾が核酸分子断片の３’末端に存在し、かつ工程ｂ）の断片の混合物の中で最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端３’ヌクレオチドを含み、
工程（ｃ）において、前記非修飾核酸分子断片が除去される、
核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。

【請求項2】

前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、前記方法が、前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記修飾核酸分子断片が、質量またはサイズ識別のための方法によって分離または分別される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記質量またはサイズ識別のための方法が、濾過および透析およびクロマトグラフィーおよび質量分析法を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記質量またはサイズ識別のための方法が、ＭＳ、ＬＣＭＳまたはＥＳＩ ＭＳである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡ、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子、ならびにそれらの組合せの群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

以下の工程：
ａ）質量タグ、核酸分子よりも顕著に大きい所与の波長でのＵＶ吸光度を有する部分、親油性部分、規定の分子質量を有するポリマー、放射性標識およびイオン移動度の変化を与える部分を含む群から選択される少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片を提供する工程であって、切断により断片の混合物を提供し、そのような断片の混合物が、前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む工程；
ｃ）前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別が修飾核酸断片のパターンを生成させる、工程；ならびに
ｄ）任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程であって、前記修飾核酸断片のパターンの可視化が、前記修飾を利用して、該修飾を有する核酸分子と該修飾を有さない核酸分子を識別する工程；
ｅ）前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
前記修飾が前記核酸分子断片の５’末端に存在し、かつ工程ｂ）の断片の混合物の中で最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端５’ヌクレオチドを含むか、または前記修飾が前記核酸分子断片の３’末端に存在し、かつ工程ｂ）の断片の混合物の中で最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端３’ヌクレオチドを含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。

【請求項13】

前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、前記方法が前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡ、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子、およびそれらの組合せの群から選択される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群から選択される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸分子のヌクレオチド配列を解析および／または決定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸分子は、診断ツールとしておよび／または治療薬として使用されており、これらの核酸分子は、部分的にもしくは完全にランダム化された核酸分子ライブラリーのスクリーニングにより同定するか、またはアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに対して行なわれるようなコンピュータアルゴリズムによって支援される相補的配列により予想することができる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖分子であることができ、構造化されていることも構造化されていないこともあり、ペプチド、タンパク質、多糖およびその他のより大きな分子にコンジュゲートさせることができ、その糖骨格は、リボース、デオキシリボースおよび／またはそれらの修飾誘導体からなることができる。

【0003】

核酸分子の機能は、
ａ）アンチセンス核酸分子、触媒的核酸分子、ｓｉＲＮＡ分子およびマイクロＲＮＡ分子の形態でのｍＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーションおよびｍＲＮＡのスイッチオフ（Ｃｏｕｚｉｎ，２００４；Ｃｒｏｏｋｅ，２００４；Ｈａｒｍｏｎ，２００２；Ｊｕｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｓｃｈｅｒｅｒ ＆ Ｒｏｓｓｉ，２００３；Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｕｓｍａｎ ＆ Ｂｌａｔｔ，２０００；Ｗｅｉｇａｎｄ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｚｈａｎｇ ＆ Ｆａｒｗｅｌｌ，２００８）；
ｂ）あるいは核酸分子の標的分子への結合および／または核酸分子による標的分子の機能の阻止、ここで、これらの核酸分子は、アプタマー、シュピーゲルマーおよびデコイ核酸を含む（Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ，２００６；Ｃｌｏａｄ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｅｕｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｍａｎｎ ＆ Ｄｚａｕ，２０００；Ｎｉｍｊｅｅ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｒｅａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ，２００６）；
ｃ）あるいは例えば、ＣｐＧ−ＤＮＡ（Ｗｅｉｎｅｒ，２０００）およびランダムオリゴヌクレオチドの形態での、免疫系に対するその刺激効果
に基づくことができる。

【0004】

このような核酸分子の診断ツールとしてのおよび／または治療薬としての生産、開発および使用は、核酸分子のアイデンティティーを確認する方法を必要とし、そのため、感度がよく、正確で、かつ再現性のある分析が必要とされている。アイデンティティーの確認には、核酸分子の分子質量と分子長ならびにその塩基組成、配列、および糖部分とヌクレオチド間連結のアイデンティティーの決定が必要とされる。使用される方法は、特異的であるべきであり、それにより、修飾塩基および修飾糖部分、付加または欠失産物、ならびに脱プリン化産物の同定が可能になる。ヌクレオチド配列の決定は完全でなければならず、どの化学的または酵素的操作も塩基または骨格に悪影響を及ぼさないことが示されなければならない。修飾核酸分子がヌクレアーゼ安定性である場合、修飾核酸分子の特徴解析は特に困難である。このようなヌクレアーゼ安定性の核酸分子は、糖骨格の２’位で修飾されているか、または鏡像ヌクレオチドからなる。しかしながら、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するために、とりわけ、電気泳動、酵素的および化学的分析、アレイ技術および質量分析法をはじめとする、いくつかの技術が開発されている。

【0005】

酵素的および化学的分析による核酸のヌクレオチド配列決定
１９７０年代、３つの核酸分子配列決定技術が開発されたが、これらは、多くの実験室で実施される一般的でかつ比較的迅速な方法である。

【0006】

ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔによるＤＮＡ配列決定方法。ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔによって記載された方法には、末端標識ＤＮＡ分子がヌクレオ塩基特異的な様式で化学的に切断されるプロセスが記載されている。核酸分子配列中の各々の塩基位置は、その後、ヌクレオ塩基特異的切断によって生じた断片の分子量から決定される。個々の反応は、グアニン、アデニン、シトシンとチミン、およびシトシンでのみ選択的に切断するように考案された。これら４つの反応の産物が、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、増加する断片サイズの増加する負電荷によって分子量で分別されたとき、分別されたゲル上の断片のパターンからＤＮＡ分子の配列を解読することができる（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９７７）。

【0007】

ＳａｎｇｅｒによるＤＮＡ配列決定方法。もう１つの方法−Ｓａｎｇｅｒらによって開発された方法−は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（略称、ｄｄＮＴＰ）の鎖停止能と、ＤＮＡポリメラーゼの天然基質である、デオキシヌクレオシド三リン酸（略称、ｄＮＴＰ）とほぼ同じ忠実さでｄｄＮＴＰを取り込むＤＮＡポリメラーゼの能力とを利用する。簡潔には、通常オリゴヌクレオチド分子である、プライマー分子と鋳型ＤＮＡ分子とを、有用な濃度の４つ全てのｄＮＴＰと限られた量の単一のｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。ＤＮＡポリメラーゼは時々、成長する増幅鎖の中に鎖伸長を停止させるジデオキシヌクレオチドを取り込む。ジデオキシヌクレオチドには３’−ヒドロキシルがないので、このポリメラーゼ酵素の開始点は失われる。ポリメライゼーションにより、全てが同一の５’末端を有する、様々なサイズの核酸分子断片の混合物が生じる。例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるこの混合物の分画により、核酸分子中の各々のヌクレオチドの存在と位置を示すパターンが生じる。４つのｄｄＮＴＰの各々を用いる反応により、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔによって開発された技術（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９７７）を用いてなされるのと同じ様に分別されたゲルから核酸分子配列を解読することが可能になる（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７７）。

【0008】

ＰｅａｔｔｉｅによるＲＮＡ配列決定方法。ＤＮＡ分子と比較して、ＲＮＡ分子の化学的特性が異なっており、かつＲＮＡ分子の不安定性がより大きいために、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの化学的方法はＲＮＡ分子には適用できない。Ｐｅａｔｔｉｅは、ＲＮＡ分子の配列を決定する化学的方法を開発した。この方法では、ＲＮＡ分子を３’放射性標識し、ヌクレオ塩基特異的な様式で化学的に切断する。核酸分子の核酸配列中の各々のヌクレオチド位置は、その後、ヌクレオ塩基特異的切断により生じた核酸分子断片の分子量から決定される。個々の反応は、グアニン、アデニンまたはグアニン、シトシンとウラシル、およびウラシルでのみ選択的に切断するように考案された。これら４つの反応の産物が、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による移動度識別を用いて、分子量により分別されたとき、分別されたゲル上の断片のパターンからＲＮＡ分子の配列を解読することができる（Ｐｅａｔｔｉｅ，１９７９）。

【0009】

Ｓａｎｇｅｒ法に基づくＲＮＡ配列決定方法。ＲＮＡ分子の配列を同定する最も一般的な方法は、上記のＳａｎｇｅｒによる方法である。ＲＮＡ分子の場合、ジデオキシ鎖停止反応は、ＲＮＡ分子鋳型を解読し、相補的デオキシヌクレオチドを挿入する逆転写酵素によって触媒される。ＤＮＡ配列決定で使用されるポリメラーゼの場合と同様に、逆転写反応は、ジデオキシヌクレオチドによって阻害される（Ｚｉｍｍｅｒｎ ＆ Ｋａｅｓｂｅｒｇ，１９７８）。

【0010】

ＲＮＡフィンガープリンティング。ＲＮＡフィンガープリンティングアプローチでは、ＲＮＡ分子は、２以上のエンドヌクレアーゼによって別々に消化される。これらのエンドヌクレアーゼは特異的に切断する。各々の切断反応から得られるＲＮＡ分子の断片は、電荷によって（第１の次元）および長さ（第２の次元）によって分離される。電荷による分離は、セルロースアセテートストリップ上での高圧電気泳動の使用によってなされる。その後、ＲＮＡ分子断片は、第２の次元での分離のためにＤＥＡＥセルロース紙に転写される。配列は、別々の酵素的消化反応に由来するクロマトグラフィーで分別された断片を重ね合わせることにより決定される（Ｂｒａｎｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８９）。

【0011】

Ｓａｎｇｅｒ、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔ、およびＰｅａｔｔｉｅの方法（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９７７；Ｐｅａｔｔｉｅ，１９７９；Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７７）に基づいておよび／またはこれらの方法に関連して、これらのプロセスのいくつかの改良および／または修正、すなわち、放射性標識に代わる蛍光標識、ポストラベリング法、化学的切断に代わる酵素的切断、段階的ワンダリングスポット法、ＲＮＡとＤＮＡの代替切断反応が開発された（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７７；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ，１９７６；Ｇｕｐｔａ ＆ Ｒａｎｄｅｒａｔｈ，１９７７；Ｌｏｃｋａｒｄ ｅｔ ａｌ，１９７８；Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖ ＆ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，１９９６；Ｓｔａｎｌｅｙ ＆ Ｖａｓｓｉｌｅｎｋｏ，１９７８；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，１９８０；Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，１９８７；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，１９９６）。

【0012】

しかしながら、各々の技術には固有の限界がある。例えば、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔ（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９７７）およびＰｅａｔｔｉｅ（Ｐｅａｔｔｉｅ，１９７９）は、化学的分解アプローチを開示し、Ｓａｎｇｅｒら（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７７）は、相補鎖プライマー伸長を用いた鎖停止法を開示している。これらの技術の各々は、４つの別々の反応混合物を用いて、結果として完全なヌクレオチド配列となる、長さが１ヌクレオチドだけ異なる入れ子状の断片の組を生み出す。そのサイズと停止ヌクレオチドとに基づく断片の分別をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって行ない、これらの断片の順番、したがって、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する。ゲルの作製および核酸分子の電気泳動による分離は時間がかかる操作である。核酸分子の配列を決定するためのゲル電気泳動の使用は、バンド圧縮効果による誤差の潜在的な原因であり、この場合、核酸分子の近接断片が分別されず、各々の個々の鎖の同定は、相対値、すなわち、移動時間の測定に基づく。誤差の潜在的な原因は、例えば、核酸分子およびその断片の構造である。例えば、薄層クロマトグラフィー（略称、ＴＬＣ）を使用するＲＮＡフィンガープリンティングアプローチは、未知（修飾）構造の特徴解析には適さない（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６）。

【0013】

したがって、質量分析法による核酸分子の配列決定が、これらの限界を克服するための有望なアプローチとなった（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６）。

【0014】

質量分析法による核酸のヌクレオチド配列決定
質量分析法（略称、ＭＳ）は、化合物の分子質量を分析するための強力なツールである。核酸分子分析に関しては、ＭＳは核酸分子配列決定、核酸分子修飾検出および核酸分子断片の決定に適用可能である。ＭＳによる核酸の分析は、主に、イオン化効率によっておよびいくつかの適用可能な検出方法の分解能によって制限される。

【0015】

荷電分子しか質量検出器によって分析することができない。それゆえ、分析される分子は、質量分析計に導入される前に、効率的にイオン化される必要がある。質量分析前の核酸分子の効率的なイオン化のために、以下の技術：エレクトロスプレーイオン化（略称、ＥＳＩ）（Ｆｅｎｎ ｅｔ ａｌ，１９８９）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（略称、ＭＡＬＤＩ）（Ｋａｒａｓ ＆ Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，１９８８）が一般に使用される。ＥＳＩは、主に溶液の帯電した液滴の気化による、溶液状態の分子またはイオンの気相イオンへの変換である。ＥＳＩは、市販の質量分析計の線形範囲内の質量電荷比を有する複数の荷電イオンの分布を生み出すことができる。溶液中に存在する化合物の混合物をＥＳＩ−ＭＳで直接分析することはできるが、この処理は、様々な化合物の複数の帯電、過剰な電荷の競合および塩付加物による干渉のために、例えば、複素スペクトルに悩まされることがある。それゆえ、エレクトロスプレーイオン化は、多くの場合、分離機構の下流に直接カップリングされる。流速、イオン化モード、緩衝剤、および溶媒付加物などの様々な臨界パラメータが最適化されたときに、この処理によって効率的なイオン化が促進される。

【0016】

ＥＳＩ−ＭＳは感度がよく、フェムトモル量の試料しか必要としないが、効率的なイオン化を達成するために複数の電荷に依拠しており、単純な核酸分子についてさえも複雑でかつ解釈が難しい多価スペクトルを生じさせる。それゆえ、実際には、ＥＳＩ−ＭＳの適用は、データの「デコンボリューション」を可能にするソフトウェアパッケージの利用可能性に依存する。デコンボリューションは、多価質量スペクトルデータから分子の非荷電（中性）質量を決定するためのアルゴリズムに基づく計算プロセスの使用を含む。

【0017】

例えば、飛行時間型（略称、ＴＯＦ）質量分析計とともに使用されるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（略称、ＭＡＬＤＩ）は、その質量範囲が比較的幅広くかつサンプリング速度が高いために、核酸分子の配列を決定する大きな潜在的可能性がある。質量の大きい生体分子は容易にイオン化し、分析することができるので、核酸分子のような質量の大きい生体分子のルーチン分析のためには、ＥＳＩ−ＭＳと比較してＭＡＬＤＩ−ＭＳが一般に好ましい。さらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、主に、一価の種を生成させ、これにより、スペクトル、特にオリゴヌクレオチドの混合物を含有するスペクトルの解釈が大いに単純化される。

【0018】

しかしながら、一般に、核酸分子のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、高分子量核酸分子断片の分別不足、核酸の不安定性、および試料調製試薬による干渉によって悩まされ得る。ＭＡＬＤＩによって高分子量のイオンにより大きい運動エネルギーが与えられるため、より長い核酸分子は、より幅広く、あまり強くないシグナルを与えることがある。高分子量核酸を分析するためにＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用し得るが、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは核酸分子骨格の切断を誘導することがあり、これによって、得られるスペクトルがさらに複雑になる。ＭＡＬＤＩは、ＥＳＩよりもイオン抑制に対して感度が低いが、イオン抑制は依然としてＭＡＬＤＩ分析の問題であり、試料浄化戦略の使用、および／またはクロマトグラフィーによる分離を必要とする。しかしながら、ＭＡＬＤＩは、簡単には溶液ベースの技術と直接カップリングすることができず、通常はオフラインモードまたはアットラインモードで操作される。

【0019】

配列決定のための直接的質量分析法
外部反応に依存しないで配列特異的イオンを生成させる質量分析法のアプローチはいずれも直接的な配列決定方法とみなされる。上記のように、ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩは、核酸分子用に選択されるイオン化方法である（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６）。この方法の詳細な概略は、ＬｉｍｂａｃｈおよびＮｏｒｄｈｏｆｆら（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６；Ｎｏｒｄｈｏｆｆｅｔ ａｌ，１９９６）により示されている。

【0020】

脱離／イオン化誘導性断片化。核酸分子の解離は、脱離／イオン化プロセスの間に核酸分子に与えられる過剰なエネルギーの結果として起こることがある。この解離は、比較的速い時間スケールで起こり、正確に同定することが通常は難しいイオンを生じさせる。ＥＳＩは主に、安定な、インタクトの分子イオンを生じさせる。脱離／イオン化誘導性解離のほとんどはＭＡＬＤＩで見られ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳには、脱離／イオン化誘導性解離のための４つの異なる時間スケール：迅速、高速、高速準安定および準安定が存在する。理論上は、これらの時間スケールのいずれか１つの間に起こる解離によって、核酸分子の配列を決定するために使用し得る核酸分子断片イオンが生成されることになる。実際は、分析者が断片化の程度を制御することはほとんどできない。これらの断片の大部分は、分子イオンピークの広がりを生じさせ、分解能と感度の損失をもたらす（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６）。

【0021】

タンデム質量分析法。ＭＳ−ＭＳ（タンデム質量分析法とも呼ばれる）は、質量分析計内で起こる化学反応の前後のイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）の測定を含み、ｍ／ｚの変化が関与する（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｂｏｓｃｈｅｎｏｋ ＆ Ｓｈｅｉｌ，１９９６；Ｋａｗａｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９１；Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｍａｒｚｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，１９９８ｂ、Ｗ．Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，２００２）。化学反応前に、ｍ／ｚ値が、第１段階の質量分析計で選択される（このイオンを前駆体イオンまたは親イオンと呼ぶ）。次に、通常は中性ガス分子との衝突を伴う化学反応（衝突誘導性解離またはＣＩＤと呼ばれるプロセス）が起こる。主に、ヘリウムまたはアルゴンが衝突ガスに使用される。この反応は、２つの質量段階の質量分析計の間の中間帯（衝突セル）で起こり得る。この反応により、前駆体イオンの分解が様々な生成物イオンで生じ得る（これらは娘イオンまたは生成物イオンと呼ばれる）。荷電断片は、その後、第２段階の質量分析計によって検出することができる。ＭＳ−ＭＳは、２つのモードで行なうことができる。第１に、「空間型」ＭＳ−ＭＳ、すなわち、２つの質量分析計を、例えば、ＱＴＯＦ（四重極−飛行時間型）機器によって、空間的に隔てることができる。第２に、「時間型」ＭＳ−ＭＳ、すなわち、プロセス中の異なる工程は同じ空間で起こることができるが、例えば、イオントラップ機器の中で、時間的に隔てられている。ＣＩＤプロセスの正確な説明は、Ｗ．Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ（２００６）により記載されている。

【0022】

核酸分子の配列同定のためのタンデム質量分析法の適用可能性については、ＬｉｍｂａｃｈおよびＮｏｒｄｈｏｆｆらの総説（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６；Ｎｏｒｄｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ，１９９６）で調べることができる。ＣＩＤは、ＭＳ−ＭＳにおける断片化を誘導するために最も広く適用されている方法である。多価アニオン性ヌクレオチドの解離に基づき、この方法は、オリゴヌクレオチドの骨格が鎖に沿って順次解離するという仮定の下、両末端からの「双方向」配列決定という概念を利用している。得られる断片は、うまく適用されたときに、配列特異的な断片化パターンを表す。ＲＮＡの断片化に関する最初の報告の１つは、Ｃｅｒｎｙら（１９８７）によって示された。現在の知識による「双方向」概念では、５’→３’方向の配列を構築するｃシリーズイオンと３’→５’方向の配列を構築するｙシリーズイオンが利用される（Ｓｃｈｕｒｃｈ ｅｔ．ａｌ，２００２）。にもかかわらず、他の娘イオンが形成されることがあり、この娘イオンによって、配列決定プロセスが複雑化するか、支援されるかまたは可能になる場合がある。断片化がリン酸、糖および塩基部位で起こり得るという事実のために、得られるスペクトルの解釈が複雑化し、この方法は２５個未満のヌクレオチドを有する核酸に制限される（Ａｌａｚａｒｄ ｅｔ ａｌ，２００２）。この制限は、ニュートラルロス（イオン化されていない娘イオンは検出することができない）、検出限界の問題または検出器の限られた分解能などの様々な要因に帰することができる。衝突エネルギーも重要な役割を果たす。低い衝突エネルギーが、より少ない配列関連イオンを生じさせる一方、より高い衝突エネルギーは、データ解釈を複雑化する他のイオンシリーズを生じさせる場合がある。ここ数年、徹底的に研究されてきた、ＤＮＡのＣＩＤとは対照的に、ＲＮＡを用いたＣＩＤの態様は、まだ完全には解決されていない。

【0023】

ＭＳで核酸分子の配列を決定する「直接法」に限界があるので、質量分析法で核酸分子の配列を決定するために、以下の間接法が開発され、利用されている。

【0024】

配列決定のための間接的質量分析法
本明細書で使用されることが好ましい配列決定のための「間接的質量分析法」とは、配列が決定されるべき核酸分子の調製が、試料の気相イオンが生成される前に行なわれることを意味する。

【0025】

予測された核酸分子組成を確認するツールとしての質量測定のための間接的質量分析法は、本明細書で論じられていない。さらなる情報は、Ｌｉｍｂａｃｈの総説（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６）に示されている。

【0026】

連続的な骨格切断に依拠する任意の質量分析配列決定法の有用性は、質量ラダーの形成に依存する。配列情報は、質量スペクトル中の連続するピーク間の質量差を決定することによって得られる。オリゴデオキシヌクレオチドの場合、連続するピーク間の予想される質量差は、ｄＣ＝２８９．０５、ｄＴ＝３０４．０５、ｄＡ＝３１３．０６、およびｄＧ＝３２９．０５（精密質量に基づく値）の損失に対応する。オリゴリボヌクレオチドの場合、質量差は、Ｃ＝３０５．０４、Ｕ＝３０６．０３、Ａ＝３２９．０５、およびｄＧ＝３４５．０５（精密質量に基づく値）である。核酸配列決定方法は連続するｎ量体の質量測定に依拠しているので、４つのＤＮＡ分子残基間の質量差が比較的大きいゆえに、ＤＮＡ分子はＲＮＡ分子よりも特徴解析が容易である。リボヌクレオチドのＵとＣの質量差がわずか１ダルトン単位と小さいために、ＵとＣを正確に区別するための測定に要求される精度はずっと高い。質量ラダー法には、所望の情報をもたらす２つの質量測定値の差によって、ヌクレオチド残基のアイデンティティーが与えられるという配列決定にとっての１つの明確な利点がある（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６）。

【0027】

ヌクレアーゼ消化後の核酸分子ラダーの分析。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子断片は、５’→３’ホスホジエステラーゼおよび／または３’→５’ホスホジエステラーゼを用いるヌクレオチドの加水分解によって生成される。通常、これら２つの組合せを用いて、全てのヌクレオチドを同定する。切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）および／または切断された（ｃｌｅａｖｅｄ）核酸分子は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳまたはＥＳＩ−ＭＳで分析される。ディレイド・エクストラクション、試料浄化、酵素、緩衝液ｐＨおよびマトリックスの最適化などの技術の改良（Ｂｅｎｔｚｌｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｂｅｎｔｚｌｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｆａｕｌｓｔｉｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｋｉｒｐｅｋａｒ ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｐｉｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｓｃｈｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｗｕ ＆ Ａｂｏｌｅｎｅｅｎ，２００１；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，１９９８ａ）によって、最大３５ヌクレオチドまでの分解能の増強が達成された（Ａｌａｚａｒｄ ｅｔ ａｌ，２００２）。

【0028】

しかしながら、酵素的配列決定は、その糖骨格に修飾を含まない核酸分子に限られる。その上、いくつかのヌクレアーゼは一本鎖特異的である。いくつかの核酸分子、とりわけ、アプタマーなどの長いオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化のより悪い基質となる分子内および／または分子間構造を生じさせる二本鎖配列部分を示す。

【0029】

化学的消化後の核酸分子ラダーの分析。エキソヌクレアーゼに加えて、化学薬剤を質量分析測定前の核酸分子の制御分解に使用することができる。化学薬剤は、核酸分子が修飾されている場合に、特に必要とされる。この修飾は、酵素的消化に対する核酸分子の安定性を増加させるために特異的に選択される。酵素的消化方法と同様に、化学的切断反応は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に対するその特異性や異なるヌクレオ塩基に対するその特異性によって分類される。ＭＳ分析前に使用することができるＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対する塩基特異的反応は、ＰｅａｔｔｉｅおよびＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９７７；Ｐｅａｔｔｉｅ，１９７９）により記載されている。しかしながら、ＤＮＡ分子のホスホジエステル骨格の非特異的な（ランダムな）切断は、酸加水分解によって行なわれ（Ｓｈａｐｉｒｏ ＆ Ｄａｎｚｉｇ，１９７２）；ＲＮＡ分子のホスホジエステル骨格の非特異的な（ランダムな）切断は、酸（例えば、ギ酸）（Ｆａｒａｎｄ ＆ Ｂｅｖｅｒｌｙ，２００８）や、生理的ｐＨのポリアミン（Ｋｏｍｉｙａｍａ ＆ Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，１９９７）を用いて、塩基加水分解によって行なわれる。

【0030】

任意の連結部位が化学薬剤によって切断される可能性があるので、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のホスホジエステル骨格の非特異的な（ランダムな）切断を用いる配列決定のための核酸分子の質量ラダーの生成は複雑化することがある。ヌクレオ塩基特異的な化学的切断も、それぞれのヌクレオ塩基がある核酸分子の全ての位置でランダムに起こることがある。単一の切断部位が生成されれば、５’末端から１つ、３’末端から１つの、２つの特異的断片が生じる。両方の断片が質量スペクトル中に検出されるならば、核酸分子の配列決定に必要とされるものよりも多くの情報が存在する。これら２つのイオンシリーズは、混乱のもとになり得る。他の混乱のもとは、内部切断から生じる。前述のように、核酸分子の骨格に沿った単一の切断によって、２つの断片−５’末端から生じる１つの断片と、３’末端から生じるもう１つの断片が生成される。核酸分子の骨格に沿ったもう１つの切断反応によって、３つの断片が生成される：第１の断片は５’末端であり、第２の断片は３’末端であり、第３の断片はどちらの末端も含まない。５’または３’末端が参照点として使用されるので、５’または３’末端を含む断片は質量ラダーの構築に使用することができる。対照的に、内部断片は質量ラダーの構築に使用することができない。加えて、内部断片と末端断片のうちの１つの質量が同一である場合、不正確な解釈が行なわれ得る。さらに、これらの内部断片の存在は、所望の５’または３’末端断片のイオン抑制をもたらすことがある。それゆえ、化学的消化のための反応条件を単一切断条件に注意深く合わせる必要があるが（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６）、ランダムな切断反応の場合、これを制御する能力は限られている。

【0031】

核酸配列決定は、化学的切断反応と、それに次ぐ質量分析法による切断反応の分析によって行なうことができる（Ｆａｒａｎｄ ＆ Ｂｅｖｅｒｌｙ，２００８）。ＦａｒｒａｎｄとＢｅｒｖｅｒｌｙは、２’デオキシリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、無塩基リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの混合物を含有する高度に修飾された核酸分子を使用し、ギ酸を用いて、リボヌクレオチドを分解し；水酸化ナトリウムを用いて、リボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよび無塩基残基を分解し；ピペリジンをリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチドおよびデオキシグアノシンに用いた。また、（Ｐｅａｔｔｉｅ、Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔにより報告されたような）塩基特異的反応を用いて断片を得た。正確な質量分析の間、鎖の最後のヌクレオチドを含有する短い断片（１〜３ヌクレオチド長）は、ＬＣ−ＭＳで保持されにくい。それゆえ、３’末端ヒドロキシルを含有する最後の２または３個のヌクレオチドを確認するために、タンデム質量分析法が必要とされた（Ｆａｒａｎｄ ＆ Ｂｅｖｅｒｌｙ，２００８）。

【0032】

エンドヌクレアーゼ消化および化学的消化後の核酸分子ラダーの分析。ＲＮＡ分子中のＵとＣの質量差が小さい（１Ｄａ）ために、部分的エキソヌクレアーゼ消化と、それに次ぐＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて（ＤＮＡ分子で示されるような）一義的な帰属をすることが難しい。エキソヌクレアーゼ消化からは、曖昧な配列帰属が生じ、その場合、ピリミジン塩基のＣとＵを互いに区別することができない。それゆえ、ＴｏｌｓｏｎとＮｉｃｈｏｌｓｏｎは、こうしたＲＮＡ分子の配列の曖昧性を解決するために、配列特異的エンドヌクレアーゼと化学的方法とを組み合わせた方法を開発した（Ｔｏｌｓｏｎ ＆ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，１９９８）。酵素的反応の特異性が予想した通りではなかったので、著者らは、Ｕでの切断によって形成される特徴的断片を生じさせるＲＮＡのヒドラジン／アニリン処置を用いた（Ｔｏｌｓｏｎ ＆ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，１９９８）。

【0033】

Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ停止反応後の核酸分子ラダーの分析。Ｓａｎｇｅｒの配列決定戦略により、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ質量分析法などの質量分析法を用いて、ヌクレオ塩基特異的な鎖停止によって得られる入れ子状の断片をその異なる分子質量により分析することで、配列情報をまとめることが可能になる。この方法は、サイクルシークエンシングを用いて停止群の量を増加させること、反応条件を最適化すること、伸長産物を精製すること、塩付加物を除去すること、およびより良好な分別のためにディレイド・エクストラクションを利用することによって改良された（Ｆｕ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｈａｒｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｋｉｒｐｅｋａｒ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｍｏｎｆｏｒｔｅ ＆ Ｂｅｃｋｅｒ，１９９７；Ｍｏｕｒａｄｉａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｒｏｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｓｈａｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｔａｒａｎｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｔａｒａｎｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ，１９９７）。

【0034】

このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ配列決定方法を用いて、１００個よりも多いヌクレオチドからなるＤＮＡ分子の配列を分析することができた（Ｔａｒａｎｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ，１９９８）。

【0035】

あるいは、米国特許第５，５４７，８３５号に示されるように、上記の方法の１つは、鋳型がビオチンで標識され、ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズと結合される固相配列決定アプローチと一体化されている。スループットは、オリゴヌクレオチドプライマー、鎖停止ヌクレオシド三リン酸および／または鎖伸長ヌクレオシド三リン酸に質量修飾を導入すること、ならびに質量が差別化された分子量を有するタグ特異的プローブのハイブリダイゼーションによる多重化を可能にする統合タグ配列を使用することによって増加させることができる。しかしながら、これらの「Ｓａｎｇｅｒベースの」配列決定方法は全て、標的配列に関するいくらかの予備知識またはプライマー結合部位としての役割を果たす既知配列の導入のどちらかを必要とする。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0036】

したがって、本発明の根底にある問題は、特に、核酸分子がＬ−ヌクレオチドを含むまたはＬ−ヌクレオチドからなる場合に、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法を提供することであった。

【0037】

本発明の根底にあるさらなる問題は、核酸分子の、特に、Ｌ−ヌクレオチドを含むまたはＬ−ヌクレオチドからなる核酸分子の、ヌクレオチド配列を決定する方法を提供することであった。このような方法は、従来技術の方法の欠点の少なくとも一部を克服または回避する。

【0038】

この問題は、独立クレームの内容によって解決される。好ましい実施形態は、従属クレームから導き出され得る。

【0039】

本発明の根底にある問題は、以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片とを提供する工程；
ｃ）修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離する工程；
ｄ）修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される工程；
ｅ）任意で修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法によって、第１の態様の第１の実施形態でもある、第１の態様において解決される。

【0040】

第１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２の実施形態では、本方法は、
ｆ）修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む。

【0041】

第１の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３の実施形態では、複数の分子の個々の核酸分子は、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の５’末端に、３’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも１つの修飾を有する。

【0042】

第１の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４の実施形態では、切断は、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および／または二価カチオンの使用による切断によって行なわれる。

【0043】

第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５の実施形態では、切断は、化学的切断、好ましくはヌクレオチド非特異的切断である。

【0044】

第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６の実施形態では、切断は限定的切断である。

【0045】

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５および第６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７の実施形態では、切断は、限定的なランダム切断、好ましくは限定的で化学的なランダム切断である。

【0046】

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６および第７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８の実施形態では、切断する工程は、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、そのような断片の混合物は、核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む。

【0047】

第１の態様の第８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第９の実施形態では、混合物は、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の核酸分子を含む。

【0048】

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８および第９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１０の実施形態では、修飾核酸分子断片は、修飾と相互作用パートナーとの相互作用によって非修飾核酸分子断片から分離され、このような相互作用パートナーは支持体に連結されている。

【0049】

第１の態様の第１０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１１の実施形態では、支持体は固体支持体である。

【0050】

第１の態様の第１０および第１１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１２の実施形態では、非修飾核酸分子断片は、好ましくは洗浄によって、相互作用パートナーと相互作用する修飾核酸分子断片から除去される。

【0051】

第１の態様の第１０、第１１および第１２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１３の実施形態では、修飾核酸分子断片は、好ましくは相互作用パートナーからの修飾の放出によるか、支持体からの相互作用パートナーからの放出によるか、あるいは核酸分子断片から修飾またはその一部もしくは部分を切断することによって、支持体から放出される。

【0052】

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８および第９実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１４の実施形態では、修飾核酸分子断片は、質量識別、サイズ識別、疎水性識別、電荷識別、イオン識別、水素結合識別、およびまたは液相によって仲介される抽出による分離によって、非修飾核酸分子から分離され、好ましくは非標識核酸分子断片が除去される。

【0053】

第１の態様の第１〜第１４の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第１５の実施形態では、修飾核酸断片のパターンは修飾核酸断片のラダーを含む。

【0054】

第１の態様の第１〜第１５の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第１６の実施形態では、修飾核酸断片のパターンは、質量分析法によって生成され、好ましくは、核酸分子の核酸配列が推定される。

【0055】

第１の態様の第１〜第１５の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第１７の実施形態では、修飾核酸断片のパターンが生成され、個々の断片の質量が質量分析法によって決定され、好ましくは、核酸分子の核酸配列が推定される。

【0056】

第１の態様の第１〜第１７の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第１８の実施形態では、核酸分子のヌクレオチド配列は未知である。

【0057】

第１の態様の第１〜第１８の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第１９の実施形態では、修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程は、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列を決定する工程；
ｆｂ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｃ）修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｄ）質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む。

【0058】

第１の態様の第１９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２０の実施形態では、工程ｆｂ）〜ｆｄ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆｂ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｃ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、かつ工程ｆｄ）において、質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、個別のヌクレオチド種を修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される。

【0059】

第１の態様の第２０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２１の実施形態では、工程ｆｂ）〜ｆｄ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる。

【0060】

第１〜第１７の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第２２の実施形態では、核酸分子のヌクレオチド配列は既知であり、好ましくはこの方法は核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである。

【0061】

第１の態様の第２２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２３の実施形態では、修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程は、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｃ）質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む。

【0062】

第１の態様の第２３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２４の実施形態では、工程ｆａ）〜ｆｃ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｂ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）質量の質量差が決定され、かつ工程ｆｃ）において、質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、個別のヌクレオチド種を修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される。

【0063】

第１の態様の第２４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２５の実施形態では、工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる。

【0064】

第１の態様の第２２、第２３、第２４および第２５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２６の実施形態では、最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列は既知である。

【0065】

第１の態様の第２２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２７の実施形態では、修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程は、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させ、かつ個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む。

【0066】

第１の態様の第２７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２８の実施形態では、工程ｆａ）〜ｆｂ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、かつ工程ｆｂ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量が、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させられ、かつ個別のヌクレオチド種を修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの修飾核酸分子配列が生成される。

【0067】

第１の態様の第２８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２９の実施形態では、工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる。

【0068】

第１の態様の第１９〜第２９の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第３０の実施形態では、修飾が核酸分子断片の５’末端に存在し、かつ最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端５’ヌクレオチドを含むか、または修飾が核酸分子断片の３’末端に存在し、かつ最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端３’ヌクレオチドを含む。

【0069】

第１の態様の第１〜第３０の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第３１の実施形態では、修飾は、１つの部分を含む一成分修飾である。

【0070】

第１の態様の第３１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３２の実施形態では、部分は、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子から分離するときに使用される。

【0071】

第１の態様の第３２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３３の実施形態では、部分は、パターンの生成において修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される。

【0072】

第１の態様の第１〜第３０の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第３４の実施形態では、修飾は、少なくとも第１の部分と第２の部分を含む多成分修飾を含み、任意で少なくとも第１の部分と第２の部分がリンカーで連結されている。

【0073】

第１の態様の第３４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３５の実施形態では、第１の部分は、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子から分離するときに使用され、第２の部分は、パターンの生成において修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される。

【0074】

第１の態様の第３１〜第３５の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第３６の実施形態では、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子から分離するときに使用される部分は、相互作用パートナーに対するリガンドを含み、そのような相互作用パートナーは支持体上に存在し、好ましくはそのような支持体に連結されており、リガンドと相互作用パートナーの相互作用は支持体上への修飾核酸分子断片の固定を仲介する。

【0075】

第１の態様の第３６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３７の実施形態では、固定は、化学的固定、親和性固定、磁気固定を含む群から選択される。

【0076】

第１の態様の第３７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３８の実施形態では、固定は親和性固定である。

【0077】

第１の態様の第３８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３９の実施形態では、支持体上への核酸分子および核酸分子断片の固定を仲介する相互作用は、ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ニュートロアビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、抗原−抗体相互作用、核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはその組合せからなる、２つのオリゴヌクレオチドの相互作用、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドの相互作用、アルブミンとシバクロンブルーの相互作用、金属キレーター剤と金属キレート化支持体の相互作用を含む群から選択される。

【0078】

第１の態様の第３１〜第３９の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第４０の実施形態では、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子から分離するときに使用される部分は、ビオチン、オリゴヌクレオチド、カルモジュリン結合ペプチド、アルブミンおよび金属キレーター剤を含む群から選択される。

【0079】

第１の態様の第１〜第４０の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第４１の実施形態では、修飾核酸分子断片は、濾過、透析、クロマトグラフィー、磁場、遠心分離および沈殿を含む群から選択される手段によって非修飾核酸分子から分離される。

【0080】

第１の態様の第４１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４２の実施形態では、クロマトグラフィーはサイズ排除クロマトグラフィーであり、修飾核酸断片はそのサイズによるかまたは修飾によってそれに与えられる修飾断片のサイズの増加によって、非修飾核酸分子から分離される。

【0081】

第１の態様の第３１〜第４２の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第４３の実施形態では、パターンの生成において修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される部分は、質量タグまたは親油性タグから選択される。

【0082】

第１の態様の第１〜第４３の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第４４の実施形態では、修飾核酸分子断片は、好ましくは濾過および透析およびクロマトグラフィーおよび質量分析法を含む群から選択される質量またはサイズ識別のための方法によって分離または分別され、好ましくはそのような方法は、ＭＳ、ＬＣＭＳまたはＥＳＩ ＭＳである。

【0083】

第１の態様の第１〜第４４の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第４５の実施形態では、修飾核酸分子断片は、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣである疎水性相互作用に基づく方法によって分離または分別される。

【0084】

第１の態様の第３４〜第４５の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第４６の実施形態では、リンカーは疎水性リンカーである。

【0085】

第１の態様の第３４〜第４６の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第４７の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。

【0086】

第１の態様の第４７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４８の実施形態では、リンカーは、選択的に切断可能なリンカーであり、より好ましくは、選択的に切断可能なリンカーは、酵素的に切断可能、化学的に切断可能、光切断可能または熱切断可能なものである。

【0087】

第１の態様の第１〜第４８の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第４９の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡならびにそれらの組合せ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される。

【0088】

第１の態様の第１〜第４９の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第５０の実施形態では、核酸分子は、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される。

【0089】

第１の態様の第１〜第５０の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第５１の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である。

【0090】

第１の態様の第５１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５２の実施形態では、切断は、アルカリ加水分解、アミン、またはポリアミンによってなされるＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の化学的切断である。

【0091】

第１の態様の第５１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５３の実施形態では、切断は、ヌクレアーゼ、好ましくはリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされるＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の酵素的切断である。

【0092】

第１の態様の第５１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５４の実施形態では、切断は、熱によるＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の切断である。

【0093】

第１の態様の第５１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５５の実施形態では、切断は、二価カチオンの使用によるＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の切断である。

【0094】

第１の態様の第１〜第５０の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第５６の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子である。

【0095】

第１の態様の第５６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５７の実施形態では、切断は、酸加水分解の使用によってなされるＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の化学的切断である。

【0096】

第１の態様の第５６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５８の実施形態では、切断は、ヌクレアーゼ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされるＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の酵素的切断である。

【0097】

第１の態様の第１６〜第５８の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第５９の実施形態では、質量分析法は、直接的質量分析法、ＬＣ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを含む群から選択される。

【0098】

第１の態様の第１〜第５９の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第６０の実施形態では、核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される。

【0099】

第１の態様の第６０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６１の実施形態では、特異的なマスフィンガープリントは、核酸分子の同定および／または品質管理に使用される。

【0100】

第１の態様の第１〜第６１の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第６２の実施形態では、核酸分子または核酸分子の複数の分子の少なくとも１つの修飾は、工程ａ）またはｂ）の前に、核酸分子の５’末端または３’末端に付加される。

【0101】

第１の態様の第１〜第６２の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第１の態様の第６３の実施形態では、核酸分子または核酸分子の複数の分子は非核酸部分を含む。

【0102】

第１の態様の第６３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６４の実施形態では、非核酸部分は、工程ａ）またはｂ）の前に、核酸分子または核酸分子の複数の分子から除去される。

【0103】

第１の態様の第６４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６５の実施形態では、第１の工程において、非核酸部分が、核酸分子または核酸分子の複数の分子から除去され、第２の工程において、核酸分子または核酸分子の複数の分子の修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、核酸分子または核酸分子の複数の分子の５’末端、３’末端またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドに付加される。

【0104】

本発明の根底にある問題は、以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片を提供する工程；
ｃ）修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別が修飾核酸断片のパターンを生成させる工程；ならびに
ｄ）任意で修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法によって、第２の態様の第１の実施形態でもある、第２の態様において解決される。

【0105】

第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２の実施形態では、工程ｂ）またはｃ）の後に得られる反応混合物は、該少なくとも１つの修飾を有さない１以上の核酸分子またはその断片を含有する。

【0106】

第２の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３の実施形態では、修飾核酸断片のパターンの可視化は、少なくとも１つの修飾を利用し、好ましくは修飾は、該修飾を有する核酸分子と該修飾を有さない核酸分子の識別を可能にする。

【0107】

第２の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４の実施形態では、修飾は、質量タグ、核酸分子の親油性部分よりも顕著に大きい所与の波長でのＵＶ吸光度を有する部分、規定の分子質量を有するポリマー、放射性標識およびイオン移動度の変化を与える部分を含む群から選択される。

【0108】

第２の態様の第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第５の実施形態では、核酸分子よりも顕著に大きい所与の波長でのＵＶ吸光度を有する部分は、発色団、色素および蛍光標識を含む群から選択される。

【0109】

第２の態様の第１〜第５の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第６の実施形態では、方法は、
ｅ）修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む

【0110】

第２の態様の第１〜第６の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第７の実施形態では、複数の分子の個々の核酸分子は、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の５’末端に、３’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも１つの修飾を有する。

【0111】

第２の態様の第１〜第７の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第８の実施形態では、切断は、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および／または二価カチオンの使用による切断によって行なわれる。

【0112】

第２の態様の第１〜第８の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第９の実施形態では、切断は、化学的切断、好ましくはヌクレオチド非特異的切断である。

【0113】

第２の態様の第１〜第９の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第１０の実施形態では、切断は限定的切断である。

【0114】

第２の態様の第１〜第１０の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第１１の実施形態では、切断は、限定的なランダム切断、好ましくは限定的で化学的なランダム切断である

【0115】

第２の態様の第１〜第１１の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第１２の実施形態では、切断する工程は、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、そのような断片の混合物は、核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む。

【0116】

第２の態様の第１２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１３の実施形態では、混合物は、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の核酸分子を含む。

【0117】

第２の態様の第１〜第１３の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第１４の実施形態では、修飾核酸断片のパターンは、修飾核酸断片のラダーを含む。

【0118】

第２の態様の第１〜第１４の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第１５の実施形態では、修飾核酸断片のパターンは、質量分析法、好ましくはＬＣ−ＭＳによって生成され、好ましくは核酸分子の核酸配列が推定される。

【0119】

第２の態様の第１〜第１４の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第１６の実施形態では、修飾核酸断片のパターンが生成され、個々の断片の質量が質量分析法によって決定され、好ましくは核酸分子の核酸配列が推定される。

【0120】

第２の態様の第１〜第１６の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第１７の実施形態では、核酸分子のヌクレオチド配列は未知である。

【0121】

第２の態様の第１〜第１７の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第１８の実施形態では、修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程は、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列を決定する工程；
ｆｂ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋１、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｃ）修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｄ）質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む。

【0122】

第２の態様の第１８の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１９の実施形態では、工程ｆｂ）〜ｆｄ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆｂ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｃ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、かつ工程ｆｄ）において、質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、個別のヌクレオチド種を修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される。

【0123】

第２の態様の第１９の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２０の実施形態では、工程ｆｂ）〜ｆｄ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる。

【0124】

第２の態様の第１〜第１６の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第２１の実施形態では、核酸分子のヌクレオチド配列は既知であり、好ましくはこの方法は核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである。

【0125】

第２の態様の第２１の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２２の実施形態では、修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程は、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｃ）質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む。

【0126】

第２の態様の第２２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２３の実施形態では、工程ｆａ）〜ｆｃ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｂ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量差が決定され、かつ工程ｆｃ）において、質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、個別のヌクレオチド種を修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの配列が生成される。

【0127】

第２の態様の第２３の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２４の実施形態では、工程ｆａ）〜ｆｂ）のｍ回目の反復で、ｘは次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる。

【0128】

第２の態様の第２１〜第２４の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第２５の実施形態では、最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列は既知である。

【0129】

第２の態様の第２１の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２６の実施形態では、修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程は、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させ、かつ個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む。

【0130】

第２の態様の第２６の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２７の実施形態では、工程ｆａ）〜ｆｂ）を反復し、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、かつ工程ｆｂ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量が、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させられ、個別のヌクレオチド種を修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの修飾核酸分子配列が生成される。

【0131】

第２の態様の第２７の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２８の実施形態では、工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘは次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる。

【0132】

第２の態様の第１８〜第２８の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第２９の実施形態では、修飾が核酸分子断片の５’末端に存在し、かつ最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端５’ヌクレオチドを含むか、または修飾が核酸分子断片の３’末端に存在し、かつ最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端３’ヌクレオチドを含む。

【0133】

第２の態様の第１〜第２９の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第３０の実施形態では、修飾は、パターンの生成において修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される。

【0134】

第２の態様の第１〜第３０の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第３１の実施形態では、修飾は、その波長吸光度が核酸分子のヌクレオ塩基の波長吸光度とは異なる、蛍光標識である。

【0135】

第２の態様の第１〜第３１の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第３２の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびそれらの組み合わせ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される。

【0136】

第２の態様の第１〜第３２の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第３３の実施形態では、核酸は、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される。

【0137】

第２の態様の第１〜第３３の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第３４の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である。

【0138】

第２の態様の第３４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３５の実施形態では、切断は、ＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の化学的切断であり、そのような切断はアルカリ加水分解によってなされる。

【0139】

第２の態様の第３４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３６の実施形態では、切断は、ヌクレアーゼ、好ましくはリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされるＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の酵素的切断である。

【0140】

第２の態様の第３４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３７の実施形態では、切断は、熱によるＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の切断である。

【0141】

第２の態様の第３４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３８の実施形態では、切断は、二価カチオンの使用によるＲＮＡ分子および／または修飾ＲＮＡ分子の切断、あるいは熱および切断剤による切断の組合せである。

【0142】

第２の態様の第１〜第３３の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第３９の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子である。

【0143】

第２の態様の第３９の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４０の実施形態では、切断は、酸加水分解の使用によってなされるＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の化学的切断である。

【0144】

第２の態様の第３９の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４１の実施形態では、切断は、ヌクレアーゼ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされるＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の酵素的切断である。

【0145】

第２の態様の第１〜第４１の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第４２の実施形態では、核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される。

【0146】

第２の態様の第４２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４３の実施形態では、特異的なマスフィンガープリントは、核酸分子の同定および／または品質管理に使用される。

【0147】

第２の態様の第１〜第４３の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第４４の実施形態では、核酸分子または核酸分子の複数の分子の少なくとも１つの修飾は、工程ａ）またはｂ）の前に、核酸分子の５’末端または３’末端に付加される。

【0148】

第２の態様の第１〜第４４の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第２の態様の第４５の実施形態では、核酸分子または核酸分子の複数の分子は非核酸部分を含む。

【0149】

第２の態様の第４５の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４６の実施形態では、非核酸部分は、工程ａ）またはｂ）の前に、核酸分子または核酸分子の複数の分子から除去される。

【0150】

第２の態様の第４６の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４７の実施形態では第１の工程において、非核酸部分が、核酸分子または核酸分子の複数の分子から除去され、第２の工程において、核酸分子または核酸分子の複数の分子の修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、核酸分子または核酸分子の複数の分子の５’末端、３’末端またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドに付加される。

【0151】

本発明の根底にある問題は、以下の工程：
ａ）核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）核酸分子の複数の分子をヌクレオ塩基選択的処置に供し、核酸分子を形成する１個または数個のヌクレオ塩基種を選択的に修飾し、そのようなヌクレオ塩基選択的処置の後で、核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオ塩基のいくつかを修飾し、核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオチドまたはヌクレオ塩基のいくつかを非修飾のままにする工程；
ｃ）修飾ヌクレオ塩基の３’で選択的に核酸リン酸骨格を化学的に切断し、修飾ヌクレオ塩基の全てではない核酸リン酸骨格を切断する工程；
ｄ）核酸分子断片をＬＣ−ＭＳおよび／またはＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する工程；ならびに
ｅ）インタクトの末端を有する核酸分子断片をサイズが増加する順に同定し、それから核酸分子の配列を生成させ、ここで、好ましくは核酸分子断片が、同じインタクトの末端、より好ましくは同じインタクトの３’末端を有する、工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法によって、第３の態様の第１の実施形態でもある、第３の態様において解決される。

【0152】

第３の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第２の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡ、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む核酸分子、ならびにそれらの組合せ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の群から選択される。

【0153】

第３の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第３の実施形態では、核酸分子は、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される。

【0154】

第３の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第４の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である。

【0155】

第３の態様の第１〜第４の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第３の態様の第５の実施形態では、選択的に処置可能なヌクレオ塩基は、グアノシン、アデノシン、シチジン、チミジンおよびウラシルを含む群から選択される。

【0156】

第３の態様の第１〜第５の実施形態のいずれか１つの一実施形態でもある第３の態様の第６の実施形態では、ヌクレオ塩基Ｕは、ヒドラジンと酢酸とアニリンの組合せで選択的に処置され、５’リン酸付加３’断片とアニリン修飾リボース５’断片とを生じさせる。

【0157】

第３の態様の第６の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第７の実施形態では、５’リン酸付加３’断片とインタクトの核酸分子は、請求項１１３に記載の工程ｄ）においてアニリン修飾リボース５’断片よりも効率的にイオン化される。

【0158】

第３の態様の第７の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第８の実施形態では、５’リン酸付加３’断片は、請求項１１３に記載の工程ｄ）においてアニリン修飾リボース５’断片よりも効率的にイオン化される。

【0159】

第３の態様の８の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第９の実施形態では、５’リン酸付加３’断片は、請求項１１３に記載の工程ｅ）において使用される。

【0160】

本発明の第１、第２および第３の態様のいずれかの各々のおよびいずれかの一実施形態では、核酸分子は２５個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む。

【0161】

本発明の第１、第２および第３の態様のいずれかの各々のおよびいずれかの一実施形態では、核酸分子は３５個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む。

【0162】

本発明の第１、第２および第３の態様のいずれかの各々のおよびいずれかの一実施形態では、核酸分子は、２６個〜５０個のヌクレオ塩基、または３６個〜５０個のヌクレオ塩基、好ましくは２６個〜４５個のヌクレオ塩基、または３６個〜４５個のヌクレオ塩基を含む。ヌクレオ塩基およびヌクレオチドという用語は、本発明に関連して、互換的に使用され得ることが認識されるであろう。

【0163】

本発明の第１、第２および第３の態様のいずれかの各々のおよびいずれかの一実施形態では、核酸分子の複数の分子の核酸分子の凝集が軽減される。

【0164】

本発明の第１、第２および第３の態様のいずれかの各々のおよびいずれかの一実施形態では、凝集は、工程ａ）〜ｅ）のいずれか、好ましくは工程ａ）およびｂ）のいずれかへのカオトロピック溶液の添加によって軽減される。

【0165】

本発明者らは、驚くべきことに、複数の該核酸分子を不完全な形でランダムに切断することによりおよびこのようにして生成された該核酸分子の断片の混合物を核酸分子の断片のパターンに分別することにより、核酸分子のヌクレオチド配列を推定または決定することが可能であり、そのような断片のパターンから、該核酸分子の核酸配列を推定または決定することができることを発見した。断片の混合物は、通常、核酸分子の修飾断片も含み、核酸分子の該修飾断片は、通常、複数の該核酸分子から生成された、複数の該核酸分子の該ランダムでかつ不完全な切断によっても生成され、該核酸分子は修飾を含む。そのような核酸分子の断片のパターンは、核酸分子の修飾断片により形成または提示される。言い換えれば、ヌクレオチド配列が直接的にまたは間接的に推定されることに基づくパターンは、修飾核酸断片のパターンである。この方法に関連して、不完全な、好ましくはランダムな切断が、互いに１ヌクレオチドだけ異なる該核酸の全てのあり得る断片に相当するものを生成させることが好ましい。

【0166】

本出願に関連して、核酸分子の断片および核酸分子断片という用語は、それとは矛盾することが明示されない限り、互換的に使用される。

【0167】

この原則に基づき、本発明は、３つの基本的手順を包含する。第１の態様による本発明の方法の対象としての第１の手順では、修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片は分離される。この分離により、修飾核酸分子断片のパターンを生じさせる分離および／または分別工程に供される修飾核酸分子断片の混合物が得られる。この第１の手順では、修飾は、とりわけ、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子から分離するために直接的にまたは間接的に使用される可能性がある。

【0168】

第２の態様による本発明の方法の対象としての第２の手順では、切断工程後に修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片は分離されない。それどころか、修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片の混合物は、修飾核酸分子断片のパターンを生じさせる分離および／または分別工程に供される。この第２の手順では、修飾は、とりわけ、アドレス指定プロセスで直接的にまたは間接的に使用される可能性がある。このようなアドレス指定プロセスは、混合物の個々の修飾核酸分子断片のターゲッティングを可能にするプロセスである。ターゲッティングは、通常、パターンを生じさせる分離工程または分別工程の後に、修飾核酸分子断片だけを提示し、その一方、混合物中にまだ存在するにもかかわらず、非修飾核酸分子を提示しないことである。好ましくは、このような提示は、少なくとも１つの修飾によって仲介されるかまたは生じる。したがって、その意味では、このターゲッティングのために、修飾核酸分子断片だけが、事実上、本発明による方法のさらなる工程の対象である。

【0169】

第３の態様による本発明の方法の対象としての第３の手順では、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の複数の分子は処置を受ける。基本的には、このような処置は、核酸分子を形成するヌクレオ塩基の１つの種を選択的な方法で修飾することである。例えば、処置は、核酸分子のＵだけが−選択的に−修飾されるようなものである。しかしながら、核酸分子の全てのＵが修飾されるわけではないことが重要である。しかしながら、核酸分子の複数の分子を考慮するならば、統計的には、このような核酸分子の選択的に修飾されたヌクレオ塩基の各々が修飾される。その後、核酸分子の複数の分子のこのように修飾された核酸分子は、核酸の骨格、好ましくは核酸リン酸骨格が、個々の修飾ヌクレオ塩基の３’方向で選択的に切断されるように、切断され、好ましくは化学的に切断される。そうすることによって、好ましくはその長さに関して直接的または間接的な分析の対象となり得る全てのあり得る断片が生成される。好ましい一実施形態では、この分析は、ＬＣ−ＭＳおよび／またはＬＣ−ＭＳ−ＭＳによって行なわれる。

【0170】

本発明による方法、より具体的には、それぞれ、本発明の３つの手順および態様のうちの１つに関連した方法の潜在的な特徴（これらは、該３つの態様のうちの１つに関連して本明細書で概説されている）は、本発明の任意の態様、ひいては手順、および本明細書で概説されている本発明の核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための任意の方法の一部を形成し得ることが認識されるであろう。

【0171】

本明細書で好ましく使用されるとき、分離とは、物質の混合物を２以上の個別の産物に変換、分割または単離することである。特定の実施形態では、分離は、５’断片と３’断片と内部断片の混合物を５’断片または３’断片だけの混合物に変換することを含む。他の実施形態では、分離は、例えば、ピークにより個々の断片または小さい断片群が表されるＬＣを用いてなされるように、５’断片または３’断片の混合物を、個々の成分などの、さらなる分割物に分割することを含む。他の実施形態では、分離は、５’断片と３’断片と内部断片の混合物から５’断片または３’断片を単離することを含み、その場合、例えば、ＬＣにより上記の変換工程と分割工程の両方が行なわれる。分離が完全なものでない可能性があることが当業者に認識されるであろう。それどころか、分離された産物は、分離の対象であった出発材料にも含まれていた化合物を、レベルが減っているとはいえ、まだ含有している可能性がある。

【0172】

本明細書で好ましく使用されるとき、分別は、個別の産物を物質の混合物からおよび／または互いに区別するか、検出するかまたは提示する能力である。特定の実施形態では、分別は、標識断片を非標識断片から区別／検出／提示する。他の実施形態では、分別は、標識断片を互いに区別するために、例えば、質量分析法だけでなく、断片２とは異なる保持時間の断片１を示すＬＣでも使用される。両方の実施形態は、原理上は、同じ工程で同時に達成することができる。

【0173】

本明細書で好ましく使用されるとき、「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」および「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」は、デオキシリボ核酸（略称、ＤＮＡ）やリボ核酸（略称、ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。さらに、「核酸分子（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、複数の核酸分子も含む。「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」および「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」という用語は、ヌクレオチド類似体、一本鎖（センスもしくはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドでできているＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの変異体および類似体を等価物として含むことが理解されるべきである。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。リボヌクレオチドには、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンが含まれる。「ポリヌクレオチド」としての核酸分子への言及は、一本鎖または二本鎖分子を含む、共有結合で連結された２以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を意味するためにその最も広い意味で使用される。「オリゴヌクレオチド」という用語も、共有結合で連結された２以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を意味するために本明細書で使用されるが、本明細書で定義されるように、オリゴヌクレオチドは１００個未満のヌクレオチドを含む。

【0174】

本明細書で使用されるとき、核酸分子という用語は、一実施形態において、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む。この種の核酸分子は、ハイブリッド、ハイブリッド核酸分子またはキメラ核酸分子とも呼ばれる。

【0175】

本明細書に記載の本発明の方法による核酸分子の配列決定は、ＲＮＡと以下のもの：２’−Ｏ−メチル、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アリルのような２’官能化ＲＮＡ；ＤＮＡ、ＬＮＡ、Ｄ形核酸分子とＬ形核酸分子の組合せ、リンを含む位置で修飾を有するヌクレオチドのいずれかまたは全てとからなるハイブリッド、例えば、ＤＮＡ＋ＲＮＡである核酸分子を合成するための他の技術と組み合わせることもでき、交互になっていれば、アルカリ加水分解で半分の断片しか得られないが、これらの断片に対してＭＳ／ＭＳ技術を使用することができ、分子全体の配列を確かに決定することができることが当業者に認識されるであろう。これが、ＤＮＡと、それに次ぐＲＮＡのストレッチであるならば、ＲＮＡの配列を決定することができ、ＤＮＡに対してＭＳ／ＭＳを行なうことができ、などということになる。本発明を踏まえて、多くのバリエーションが当業者に直ちに明白になることも認識されるであろう。

【0176】

修飾が３’または５’末端にはないが、このような末端から最大２５ヌクレオチド離れたところにあり得る本明細書に記載の本発明の方法に従って核酸分子の配列を決定する可能性が残っていることも当業者に認識されるであろう。これは、標識が、例えば、ＤＮＡ−ＭＯＤ−ＲＮＡであるならば可能である。すなわち、修飾が、例えば、末端から５ヌクレオチド離れたところにあるならば、配列を決定することができる最小の断片は１１ｍｅｒであり、残りの１１ｍｅｒは、ＭＳ／ＭＳで配列が決定される。最後に、修飾が、この実施形態または任意の他の実施形態のヌクレオ塩基上にあることができることも当業者に認識されるであろう。

【0177】

また、本明細書で好ましく使用されるとき、本発明の方法の対象となる核酸は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含むことができる。本発明の方法の一実施形態では、核酸は、ＬＮＡヌクレオチドからなる。

【0178】

また、本明細書で好ましく使用されるとき、本発明の方法の対象となる核酸は、少なくとも１つのＰＮＡヌクレオチドを含むことができる。本発明の方法の一実施形態では、核酸は、ＰＮＡヌクレオチドからなる。

【0179】

核酸分子は、核酸分子を形成する連続するヌクレオチドが全て、１または２以上の共有結合によって互いに連結または接続されることを特徴とする。より具体的には、このようなヌクレオチドは各々、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を介して、２つの他のヌクレオチドに連結または接続され、連続するヌクレオチドのストレッチを形成する。しかしながら、このような配置において、２つの末端ヌクレオチド、すなわち、好ましくは５’末端のヌクレオチドと３’末端のヌクレオチドは各々、このような配置が、環状配置ではなく、線状配置であり、したがって、環状分子ではなく、線状分子であるという条件下では、単一のヌクレオチドのみに連結されている。

【0180】

本出願の別の実施形態では、核酸分子は、少なくとも２つの連続するヌクレオチドの群を含み、各々の連続するヌクレオチドの群の中で、各々のヌクレオチドは、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を介して、２つの他のヌクレオチドに連結または接続され、連続するヌクレオチドのストレッチを形成する。しかしながら、このような配置において、２つの末端ヌクレオチド、すなわち、好ましくは５’末端のヌクレオチドと３’末端のヌクレオチドは各々、単一のヌクレオチドのみに連結される。しかしながら、このような実施形態では、２つの連続するヌクレオチドの群は、ある群の１つのヌクレオチドと別のまたは他の群の１つのヌクレオチドとを、共有結合、好ましくは、該２つのヌクレオチドのうちの一方の糖部分と該２つのヌクレオチドまたはヌクレオシドのうちのもう一方のリン部分との間で形成される共有結合を介して連結させる共有結合を介して互いに連結または接続されない。しかしながら、代わりの一実施形態では、２つの連続するヌクレオチドの群は、ある群の１つのヌクレオチドと別のまたは他の群の１つのヌクレオチドとを、共有結合、好ましくは、該２つのヌクレオチドのうちの一方の糖部分と該２つのヌクレオチドまたはヌクレオシドのうちのもう一方のリン部分との間で形成される共有結合を介して連結させる共有結合を介して互いに連結または接続される。好ましくは、少なくとも２つの連続するヌクレオチドの群は、どの共有結合によっても連結されない。別の好ましい実施形態では、少なくとも２つの群は、ホスホジエステル結合とは異なる共有結合を介して連結される。

【0181】

核酸分子という用語は、好ましくは、Ｄ−核酸分子またはＬ−核酸分子も包含する。好ましくは、核酸分子はＬ−核酸分子である。さらに、核酸分子の１つまたはいくつかの部分がＤ−核酸分子として存在し、核酸分子の少なくとも１つまたはいくつかの部分がＬ−核酸分子であることが可能である。核酸分子の「部分」という用語は、最低１個のヌクレオチドを意味するものとする。このような核酸分子は、通常、それぞれ、Ｄ−核酸分子およびＬ−核酸分子と本明細書で呼ばれる。それゆえ、好ましい一実施形態では、本発明による核酸分子はＬ−ヌクレオチドからなり、かつ少なくとも１つのＤ−ヌクレオチドを含む。このようなＤ−ヌクレオチドは、好ましくは、核酸分子を規定するストレッチとは異なる部分、好ましくは、核酸分子の他の部分との相互作用に関与するその部分に付加される。好ましくは、このようなＤ−ヌクレオチドは、任意のストレッチのおよび任意の核酸の末端で付加される。

【0182】

本明細書で使用されるＬ−核酸分子は、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくはＬ−ヌクレオチドから完全になる、核酸分子である。

【0183】

本明細書で使用されるＤ−核酸分子は、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくはＤ−ヌクレオチドから完全になる、核酸分子である。

【0184】

また、それとは矛盾することが示されない限り、任意のヌクレオチド配列は、本明細書において、５’→３’方向で示される。

【0185】

核酸分子がＤ−ヌクレオチドからなるか、Ｌ−ヌクレオチドからなるか、または両方の組合せからなるか、その組合せが、例えば、ランダムな組合せであるか、または少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドと少なくとも１つのＤ−核酸とからなるストレッチの規定の配列であるかに関係なく、核酸分子は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはその組合せからなり得る。

【0186】

核酸分子が、Ｄ−核酸であるか、Ｌ−核酸であるか、その混合物であるか、ＤＮＡであるか、もしくはＲＮＡであるか、またはその各々のおよび任意の組合せであるかに関係なく、本明細書で好ましく使用される核酸分子という用語は、一本鎖核酸分子および二本鎖核酸分子も包含するものとし、好ましくは本発明による方法に供される核酸分子は、一本鎖核酸である。そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子は、２つの別々の鎖、すなわち、第１の鎖と第２の鎖からなる二本鎖構造であり、このような鎖は、好ましくは分離され、各々の分離された鎖は、その後、本発明による方法に供される。あるいは、このような二本鎖核酸の分離は、該２つの鎖のうちの第１の鎖のみが、本発明による方法の第１の手順に従って、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離するために使用され、かつ本発明による方法の第２の手順に従って、アドレス指定プロセスで使用される修飾を示す場合は、必要でない。このような二本鎖核酸分子の第２の鎖のヌクレオチド配列は、好ましくは同時並行のアプローチで、該第２の鎖がこの種の修飾を示し、その一方で、第１の鎖が修飾を示さないように、決定することができることが理解されるであろう。さらに代わりのアプローチでは、第１の鎖の修飾と第２の鎖の修飾は異なる。

【0187】

本明細書で好ましく使用される核酸分子という用語は、内部スペーサーを有する核酸分子も包含するものとする。好ましくは、内部スペーサーは、核酸分子の２つのヌクレオチドストレッチを連結するために使用される。このような内部スペーサーは、好ましくは、少なくとも１つの、好ましくは多数のエチレングリコール部分を含む親水性スペーサーである。様々な内部スペーサーは、それぞれ、当業者に公知であり、例えば、ＰｉＩｓとＭｉｃｕｒａ（ＰｉＩｓ ＆ Ｍｉｃｕｒａ，２０００）によって記載された以下の基準を用いて選択することができる。内部スペーサーは、塩基対それ自体を妨げるべきではないまたは塩基対それ自体を妨げるものではない。芳香族炭素環を含有するスペーサータイプは末端塩基対に重なり、それゆえに、あまり好適ではない（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９９）。しかしながら、エチレングリコールベースのまたはエチレングリコール誘導性のスペーサーは、良好な水溶解性と高い立体構造柔軟性という利点を有するので、塩基対を妨げないという要件を満たす（Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９０；Ｍａ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９３）。好ましくは、スペーサーは、酸素がＣＨ_２、リン酸または硫黄に交換または置換されている、１つもしくはいくつかのエチレングリコール部分を含むかまたはこれらの部分からなる。

【0188】

本明細書で好ましく使用される核酸分子という用語は、ヌクレオチド修飾核酸分子も包含するものとする。核酸分子は、ヌクレオチド修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子であることができ、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈによる修飾によって安定性を増強するために、個々のヌクレオチドで広範囲に修飾されている（参考のために、Ｕｓｍａｎ ＆ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２を参照されたい）。

【0189】

塩基、糖骨格および／またはリン酸結合を含むヌクレオチドの修飾を有する核酸分子を化学合成することにより、血清リボヌクレアーゼによるその分解を防ぐことができ、それにより、核酸分子のインビボ効力を増加させることができる。

【0190】

核酸分子に導入し、そのヌクレアーゼ安定性と効力を顕著に増強させることができる糖、塩基およびリン酸修飾を記載しているいくつかの例が当該技術分野にある。例えば、核酸分子が、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈによる修飾、およびヌクレオチド塩基修飾によって安定性を増強するおよび／または生物活性を増強するよう、修飾されている（参考のために、Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｕｓｍａｎ ＆ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２を参照されたい）。核酸分子の糖修飾は当該技術分野で広く記載されている（国際特許出願ＷＯ９１／０３１６２号、ＷＯ９２／０７０６５号、ＷＯ９３／１５１８７号、ＷＯ９７／２６２７０号；ＷＯ９８／１３５２６号；米国特許ＵＳ５，３３４，７１１号、ＵＳ５，７１６，８２４号；ＵＳ５，６２７，０５３号；（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９１；Ｕｓｍａｎ ＆ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２を参照されたい）。このような刊行物は、触媒作用を調節することなく、糖、塩基および／またはリン酸修飾などを核酸分子に組み込む位置を決定するための一般的な方法および戦略を記載しており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。このような教示を考慮して、このような核酸分子がそのそれぞれの標的に結合することができる限り、本発明の核酸分子を修飾するために同様の修飾を本明細書で記載の通りに使用することができる。

【0191】

ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／または５’−メチルホスホネート連結によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結の化学的修飾は安定性を改善させるが、過剰な修飾は、何らかの毒性または活性の低下を引き起こすことがある。それゆえ、核酸分子を設計する場合には、これらのヌクレオチド間連結の量を最小限に抑えるべきである。これらの連結の濃度を減らすことにより、毒性が低下するはずである。

【0192】

本明細書で好ましく使用される核酸分子という用語は、完全に閉じた核酸分子も包含するものとする。核酸分子の完全に閉じた、すなわち、環状の構造は、本発明に従ってそのヌクレオチド配列が決定される核酸分子が、好ましくは共有結合を介して閉じている場合に実現され、このような共有結合は、本明細書で開示される核酸分子配列の５’末端と３’末端の間でなされることがより好ましい。

【0193】

好ましく使用される核酸分子という用語は、非核酸分子部分を含む任意の核酸分子も包含するものとする。このような非核酸分子部分は、以下でより詳細に概説されるようなペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、様々な基を含む群から選択されてもよい。核酸分子という用語は、したがって、少なくとも１つの核酸部分と、細胞などの生物学的システムに核酸分子を送達しやすくするために使用することができる少なくとも１つのさらなる部分とを含むコンジュゲートおよび／または複合体も包含するものとする。提供されるコンジュゲートおよび複合体は、治療的化合物を細胞膜の向こうに運ぶこと、薬物動態を変化させること、および／または本発明の核酸分子の局在を調節することによって、治療活性を与えることができる。これらの種類のコンジュゲートおよび複合体は、好ましくは、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負の電荷を帯びたポリマーおよび他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミンを含むが、これらに限定されない、分子を細胞膜の向こうに送達するのに好適である。一般に、記載された輸送体は、分解性リンカーとともにまたは分解性リンカーなしで、個々にまたは多成分システムの一部として使用されるようにデザインされている。これらの化合物は、血清の存在下または非存在下で、異なる組織から生じたいくつかの細胞型への核酸分子の送達および／または局在を改善させることが予想される（米国特許ＵＳ５，８５４，０３８号を参照されたい）。本明細書で記載される分子のコンジュゲートは、生体分解性のリンカー、例えば、生体分解性の核酸リンカー分子を介して、生物活性分子に付加することができる。

【0194】

その配列が決定される核酸分子に関連して以下で詳細に説明するように、非核酸部分は、ＰＥＧ部分、すなわち、ポリ（エチレングリコール）部分、またはＨＥＳ部分、すなわち、ヒドロキシエチルスターチ部分であってもよい。

【0195】

非核酸部分、好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分は、直接的にまたはリンカーを介して核酸分子に付加することができる。核酸分子が１以上の修飾、好ましくは１以上のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含むことも本発明の範囲内である。一実施形態では、個々のリンカー分子は、２以上のＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を核酸分子に付加する。本発明に関連して使用されるリンカーは、それ自体、線状または環状のいずれかであることができる。これらの種類のリンカーは当業者に公知であり、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３号およびＷＯ２００３／０３５６６５号でさらに記載されている。

【0196】

好ましい一実施形態では、リンカーは生体分解性リンカーである。生体分解性リンカーは、核酸分子から修飾を放出することによって、とりわけ、動物体内、好ましくはヒト体内での滞留時間に関して、核酸分子の特徴を改変することを可能にする。生体分解性リンカーの使用は、核酸分子の滞留時間のより良い制御を可能にし得る。このような生体分解性リンカーの好ましい一実施形態は、限定されるものではないが、国際特許出願ＷＯ２００６／０５２７９０号、ＷＯ２００８／０３４１２２号、ＷＯ２００４／０９２１９１号およびＷＯ２００５／０９９７６８号に記載されているような生体分解性リンカーであり、国際特許出願ＷＯ２００４／０９２１９１号およびＷＯ２００５／０９９７６８号では、リンカーは、本明細書に記載の１つまたは２つの修飾と核酸分子とその間の生体分解性リンカーとからなるポリマー状のオリゴヌクレオチドプロドラッグの一部である。

【0197】

本明細書で好ましく使用されるとき、「ヌクレオチド」は、天然のＤＮＡヌクレオシド一リン酸、二リン酸、および三リン酸：デオキシアデノシン一リン酸、二リン酸、および三リン酸；デオキシグアノシン一リン酸、二リン酸、および三リン酸；デオキシチミジン一リン酸、二リン酸、および三リン酸；ならびにデオキシシチジン一リン酸、二リン酸、および三リン酸（本明細書では、それぞれ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＣまたはＡ、Ｇ、ＴおよびＣと呼ぶ）を含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドという用語はまた、天然のＲＮＡヌクレオシド一リン酸、二リン酸、および三リン酸：アデノシン一リン酸、二リン酸、および三リン酸；グアニン一リン酸、二リン酸、および三リン酸；ウリジン一リン酸、二リン酸、および三リン酸；ならびにシチジン一リン酸、二リン酸、および三リン酸（本明細書では、それぞれ、Ａ、Ｇ、ＵおよびＣと呼ぶ）を含み、核酸分子、すなわち、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の単量体単位である塩基−糖−リン酸の組合せを指す。しかしながら、言い換えれば、「ヌクレオチド」という用語は、５’位でリン酸化され、かつ−グリコシルＣ１’−Ｎ連結を介してＣ−１’糖位置で付加されたプリン型またはピリミジン型のいずれかの塩基を有する、環状のフラノシド型糖（ＲＮＡ中のｐ−Ｄ／Ｌ−リボースおよびＤＮＡ中のＰ−Ｄ／Ｌ−２’−デオキシリボース）を含有する任意の化合物を指す。ヌクレオチドは天然のものであっても合成されたものであってもよく、合成されたものには、とりわけ、修飾塩基（例えば、５−メチルシトシン）および修飾糖基（例えば、２’−Ｏ−メチルリボシル、２’−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−アミノリボシルなど）を含む修飾ヌクレオシドを有するヌクレオチドをはじめとする、質量修飾されたヌクレオチドが含まれる。

【0198】

「ヌクレオ塩基」という用語は、天然ヌクレオ塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）ならびに非天然ヌクレオ塩基、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよび米国特許ＵＳ５，４３２，２７２号、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎの刊行物（Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７）に記載の「非天然」ヌクレオ塩基を含む。「ヌクレオ塩基」という用語は、したがって、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体も含む。

【0199】

第１の工程では、その配列が決定される複数の核酸分子を提供する。複数の核酸分子は、好ましくは、該複数の核酸分子のランダム切断によって、核酸分子の全てのあり得る断片または全ての関連する断片に相当するものを生成させるいくつかの個々の分子を含む。本明細書で好ましく使用される狭義の断片という用語は、全長核酸分子と比較して、ヌクレオチド配列に関して、全長核酸分子の１または２以上のヌクレオチドだけ短いヌクレオチド配列を含むかまたはこれらのヌクレオチド配列からなる核酸分子を指す。

【0200】

その配列が決定される核酸分子は、本明細書で親核酸分子とも呼ばれる。

【0201】

本明細書で好ましく使用される５’断片という用語は、インタクトの５’末端を有する断片、特に、親核酸分子の５’末端ヌクレオチドを含む断片を指す。同様に、本明細書で使用される３’断片という用語は、インタクトの３’末端を有する断片、すなわち、親核酸分子の３’末端ヌクレオチドを含む断片を指す。本明細書で使用される内部断片という用語は、インタクトの末端を含有せず、したがって、５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドの両方を欠く断片を指す。

【0202】

５’末端および３’末端に関連して本明細書で好ましく使用されるインタクトという用語は、５’末端の場合、好ましくはそのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の５’末端ヌクレオチドが、核酸分子に、より好ましくは核酸分子の複数の分子、またはその断片に存在し、３’末端の場合、好ましくはそのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の３’末端ヌクレオチドが、核酸分子に、より好ましくは核酸分子の複数の分子、またはその断片に存在することを意味する。

【0203】

断片という用語は、本発明を説明しやすくするために、好ましくは全長核酸分子も包含するものとする。したがって、核酸分子の断片は、最短で１ヌクレオチドであり得、かつ最長で全長核酸分子であり得る。

【0204】

複数の断片は必ずしも核酸分子の全てのあり得る断片を含む必要がないことが当業者に理解されるであろう。本明細書に記載の方法のさらなる目的によっては、核酸分子のフィンガープリントの確立を可能にする限られた数の断片を有することで十分であり得、そのようなフィンガープリントは、核酸分子の同定に十分である。

【0205】

本明細書で好ましく使用されるとき、「核酸分子の複数の分子」という用語は、核酸分子の複数のコピーおよびより好ましくは親核酸分子の複数のコピーを意味する。好ましくは、それに関連して、複数のコピーは、本発明の方法の実施を可能にするいくつかのコピーを意味する。必要とされるコピーの正確な数は、本発明の方法および工程の特定の実施形態ならびにそのような工程および方法と関連してそれぞれ使用される技術によって決まる。個々の断片の必要とされるコピー数の下限は、好ましくは該断片の核酸配列のパターンの生成と該断片の核酸配列の推定を依然として可能にする数である。一般的なコピー範囲は、１×１０^−１８〜１×１０^−３モルである。

【0206】

本明細書で好ましく使用されるとき、核酸分子のコピーは、本質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸分子である。より好ましくは、核酸分子のコピーは、そのコピーが調製される核酸分子の物理化学的特徴の全てが同一である。

【0207】

核酸分子の複数の分子は修飾を担持するまたは有する。本発明による第１の手順と第２の手順の両方に関連して、複数の該分子は、上で概説したように、該複数の分子のランダム切断によって、各々のあり得る断片または各々の関連する断片がこのような修飾を担持するまたは有する程度まで、修飾を担持するまたは有する。このような断片は、核酸分子の１つの種であり、このような種は、通常、単一コピーとしてだけでなく、複数の個々のコピーまたは分子としても存在するということも当業者に理解されるであろう。このような断片の１つ１つのコピーがこのような修飾を担持するまたは有する必要があるわけではないということも理解されるであろう。さらに、修飾を担持するまたは有する個々の断片のいくつかのコピーが存在すれば十分である。個々の断片の最小コピー数は、本発明による方法の後の工程で使用される方法、通常、パターンの生成で使用される方法によって決まる。個々の断片の必要とされるコピー数の下限は、好ましくは該断片の核酸配列のパターンの生成と該断片の核酸配列の推定を依然として可能にする数である。

【0208】

本明細書における方法に記載されるように配列決定されるために、本明細書に記載の配列決定方法を通過する核酸分子は、そのヌクレオチド配列の５’または３’末端に修飾を含むかまたはそのヌクレオチド配列の５’または３’末端にある修飾で修飾されているかのいずれかである。それゆえ、未修飾核酸分子は、本明細書に記載の方法で配列決定されることができる前に、前もって修飾されていなければならない。

【0209】

核酸分子の複数の分子が有する修飾を、合成中または合成前にオリゴヌクレオチドに直接的に組み込んでもよい（例えば、米国特許ＵＳ５，７３６，６２６号および同ＵＳ５，１４１，８１３号）。あるいは、例えば、１級脂肪族アミンなどの求核官能基を、核酸分子上の修飾付加部位、例えば、核酸分子の５’末端または３’末端に導入する。核酸分子の固体支持体合成が完了した後、核酸分子を支持体から切断し、全ての保護基を除去する。合成プロセスの後、核酸分子は修飾を含むが、この修飾は、別の実施形態では、別の修飾を付加するために使用することができる。合成された求核剤−核酸分子を、例えば、均一な溶液状態の下で求電子部分を含有する過剰の修飾試薬と反応させる。求電子部分を含有する修飾試薬は、例えば、イソチオシアネートまたはＮ−ヒドロキシスクシニミド（略称、ＮＨＳ）（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６）などの活性化エステルである。

【0210】

核酸分子の複数の分子が有する修飾を、オリゴヌクレオチドの合成後かつ核酸分子が本明細書に記載の方法によって配列決定される前にオリゴヌクレオチドにさらに組み込んでもよい。非修飾核酸分子の上に修飾を取り付けるために利用される方法の例としては、酵素的および化学的操作が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ヌクレオチドに付加される修飾を、リガーゼを用いて核酸分子に連結することが可能である。１つのそのような例は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、修飾を担持するヌクレオチドまたはアミノ官能基を含有するヌクレオチドを核酸分子の５’末端に連結するものである（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ，１９９７）。例えば、オリゴヌクレオチドを付加するために臭化シアンを使用することによる化学的連結の使用も、確立された技術である（Ｄｏｌｉｎｎａｙａ ｅｔ ａｌ，１９９１；Ｅｌｏｖ ｅｔ ａｌ，１９８９）。この毒性のある化学物質を使用しないで核酸分子を修飾する他の方法が、最近開発された（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，２００７）。

【0211】

ＲＮＡ分子の３’末端に修飾を導入するための確立された技術は、末端２’、３’シスジオールを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、ジアルデヒドを生成させ、次に、これをジアミンまたは標識官能化アミンで二重に還元アミノ化するという技術である（Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖ ＆ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，１９９６）。前者の場合、修飾は、結果として生じる３’アミンを反応性修飾として用いて導入される。あるいは、ジアルデヒドを修飾カルバジド誘導体と反応させて、後の還元を必要とせずに修飾を取り付けることができる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，１９９６）。

【0212】

そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の長さに関して基本的に制限はない。したがって、核酸分子の長さは、最短で２ヌクレオチド、最長で数千ヌクレオチドである。好ましくは、核酸分子の長さは、１５〜１２０ヌクレオチドである。１５〜１２０の任意の整数が核酸分子の可能な長さであることが当業者に認識されるであろう。核酸分子の長さのより好ましい範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５０ヌクレオチドおよび約３０〜５０ヌクレオチドの長さである。

【0213】

修飾は、本発明に関連して必要とされる効果を与えるのに好適な任意の修飾であることができる。より具体的には、本発明の方法の第１の手順に関連して必要とされる修飾は、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離することを可能にする。それとは対照的に、本発明の方法の第２の手順に関連して必要とされる修飾は、アドレス指定プロセスの実施を可能にする。第１の手順と第２の手順の両方において、修飾は、修飾核酸分子断片の分離または分別に関与することが認識されるべきである。修飾が二重の機能を有し得るまたは２つの機能を提供し得ることは本発明の範囲内である。そのような場合、修飾は、一成分修飾であり得る。あるいはおよび特に、二重の機能が必要とされる場合、修飾は、二成分または多成分修飾であり得る。二成分または多成分機能は、互いに直接またはリンカーの使用を介して接続され得る第１の部分と第２の部分を含む。このような場合、第１の部分または第２の部分のいずれかが、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離するために使用され、その一方で、第２の部分または第１の部分は修飾核酸分子断片の分離または分別に使用される。

【0214】

さらなる工程では、複数の修飾核酸分子はランダムに切断される。このような切断によって、修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片が、それぞれ、生成および提供される。そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の化学的性質に応じて、様々な技術が適用可能であり、これらの技術は、それ自体として当該技術分野で公知である。切断は、以下の技術のいずれかまたはその組合せであり得る：物理的断片化、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および／または二価カチオンの使用による切断。これらの様々の技術は、核酸分子中の特定のかつ予測可能な部位での切断を提供し、本明細書で概説されるような切断工程のさらなる要件と一致する限りにおいて、適用可能である。

【0215】

核酸分子配列中の特定の位置での核酸分子の切断は、核酸分子の構造、核酸分子の特定のヌクレオチド間の共有結合の物理化学的性質、核酸分子の糖骨格の物理化学的性質、核酸分子の塩基の物理化学的性質、核酸分子の特定の塩基と糖骨格の間の共有結合の物理化学的性質、核酸分子の特定の原子；核酸分子の特定の塩基および／または修飾塩基に対する切断試薬の特異性；あるいはその組合せに依存する。

【0216】

核酸分子の物理的断片化は、共有結合を壊すことができる任意の物理的力の使用によって達成することができ、好ましくは特定のかつ予測可能な断片化が起こる。このような物理的力としては、熱、Ｘ線、ＵＶ線、γ線などの電離放射線が挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子断片のサイズは、放射線への曝露の強度や期間を調整することによって、調整することができる。曝露の強度や期間は、核酸分子への放射線の望ましくない影響を最小限に抑えるためにも調整することができる。

【0217】

好ましくは水の沸騰間近の熱も、核酸分子の断片を生じさせることができる。核酸分子の溶液を加熱することによる核酸分子の断片化は、好ましくは、種々の標準的な緩衝液、例えば、限定するものではないが、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）などの１級アルキルアミン、トリシン（Ｎ−（トリ（ヒドロキシメチル）メチル）グリシン）などの２級アミン、トリエチルアミン、ビス−トリス（ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン）などの３級アミン、スペルミジンなどのポリアミン、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）およびＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、テトラブチルアンモニウムおよびテトラエチルアンモニウムなどの４級イオンの中でなされる。イミダゾールなどの芳香族アミンを含有する緩衝液も当該技術分野で公知である。このような緩衝液は、塩酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、リン酸、クエン酸、フタル酸、酒石酸、ホウ酸および当該技術分野で公知の他の酸とともに使用することができる。アルカリ金属をを含有する他の好適な緩衝剤／溶液も当該技術分野で公知である。その例としては、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、フタル酸塩、酒石酸塩、ホウ酸塩および酢酸塩がある。好ましいｐＨ範囲は、ｐＨ１〜ｐＨ１５、より好ましくはｐＨ４〜ｐＨ１０である。好ましい濃度は、０．０１〜１０００００ＯＤ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１０００ＯＤ／ｍＬである。反応は、０．１〜５０００分、より好ましくは５〜１００分行なわれる。

【0218】

核酸分子の化学的切断は、二価カチオンにより触媒される核酸分子のホスホジエステル結合の切断によって、アルキル化によっておよび／または塩基加水分解や酸加水分解をはじめとする加水分解反応によって達成することができる。

【0219】

二価カチオンにより触媒されるＲＮＡのホスホジエステル結合の切断は、好ましくは、限定するものではないが、０．０００００１〜１０Ｍ、より好ましくは０．００００１〜１ＭのＭｇ^２＋ Ｃａ^２＋、Ｂｅ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｐｂ^２＋の存在下でなされる。反応温度は、０℃〜１５０℃、より好ましくは１０〜１００℃である。反応は、０．１〜５０００分間、より好ましくは１分〜１２０分間行なわれる。

【0220】

ＲＮＡのホスホジエステル結合の切断は、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）などの１級アルキルアミン、トリシン（Ｎ−（トリ（ヒドロキシメチル）メチル）グリシン）などの２級アミン、トリエチルアミン、ビス−トリス（ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン）などの３級アミン、スペルミジンなどのポリアミン、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）およびＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、テトラブチルアンモニウムおよびテトラエチルアンモニウムなどの４級イオンを含有する溶液を用いて達成することもできる。イミダゾールなどの芳香族アミンを含有する緩衝液も当該技術分野で公知である。０．０００００１〜１０Ｍ、より好ましくは０．００００１〜１Ｍ。反応温度は、０℃〜１５０℃、より好ましくは１０〜１００℃である。反応は、０．１〜５０００分間、より好ましくは１分〜１２０分間行なわれる。

【0221】

核酸分子の断片化の方法としての核酸分子のアルキル化は、ＢｒｏｗｎｅおよびＧｕｔ ＆ Ｂｅｃｋによって記載された（Ｂｒｏｗｎｅ，２００２；Ｇｕｔ ＆ Ｂｅｃｋ，１９９５）。

【0222】

ＲＮＡはアルカリ条件下で不安定なので、塩基加水分解を用いてＲＮＡ分子を切断することができる（Ｎｏｒｄｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ，１９９３）。ＲＮＡ分子の塩基加水分解は、好ましくは７．５〜１５のｐＨ範囲で、より好ましくは９〜１５のｐＨ範囲でなされる。反応温度は、０℃〜１５０℃、より好ましくは５０〜１５０℃である。反応は、０．１〜５０００分間、より好ましくは１〜１００分間行なわれる。

【0223】

ＲＮＡは、酸の存在下で、好ましくは、ＨＣｌのような鉱酸、およびパラ−トルエン−スルホン酸などの有機酸などの強酸の存在下で加水分解することができるので、酸加水分解を用いてＲＮＡ分子を切断することもできる。ＲＮＡ分子の酸加水分解は、好ましくは−１〜６．５のｐＨ範囲で、より好ましくは１〜４のｐＨ範囲でなされる。反応温度は、好ましくは０℃〜１５０℃、より好ましくは２０〜１００℃である。反応は、０．１〜５０００分間、より好ましくは１〜１００分間行なわれる。厳しい条件下では、加水分解によって、両方のリン酸エステル結合、またリボースとプリンおよびピリミジン塩基との間のＮ−グリコシド結合が壊れることがある。

【0224】

ＤＮＡは、酸の存在下で、好ましくは、ＨＣｌのような鉱酸、およびパラ−トルエン−スルホン酸などの有機酸などの強酸の存在下で加水分解することができるので、酸加水分解を用いてＤＮＡ分子を切断することができる。ＤＮＡ分子の酸加水分解は、好ましくは０〜５．５のｐＨ範囲で、より好ましくは１〜２のｐＨ範囲でなされる。反応温度は、０℃〜１５０℃、より好ましくは２０〜１００℃である。反応は、０．１〜５０００分間、より好ましくは１〜１００分間行なわれる。条件や反応時間の長さ次第で、核酸分子を、１ヌクレオチドの断片を含む様々なサイズに断片化することができる。特に、厳しい条件下では、加水分解によって、両方のリン酸エステル結合、またデオキシリボースとプリンおよびピリミジン塩基との間のＮ−グリコシド結合が壊れることがある。

【0225】

酸加水分解および／または塩基加水分解に基づいて核酸分子の断片を生じさせるプロトコルは以前に記載された（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９７７；Ｐｅａｔｔｉｅ，１９７９；Ｓａｒｇｅｎｔ，１９８８）。

【0226】

酵素は核酸分子の断片化に有用であり、ＭＳによる核酸の配列決定に関連して使用されることが多い（Ａｌａｚａｒｄ ｅｔ ａｌ，２００２；Ｂｅｎｔｚｌｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｂｅｎｔｚｌｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｆａｕｌｓｔｉｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｋｉｒｐｅｋａｒ ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｐｉｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｓｃｈｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｗｕ ＆ Ａｂｏｌｅｎｅｅｎ，２００１；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，１９９８ａ）。核酸分子を切断する酵素は当該技術分野で公知であり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００１）かつ市販されている。使用される酵素次第で、核酸分子は、非特異的にかまたは特定のヌクレオチド配列で切断される。エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リボザイム、およびＤＮＡザイムを含むが、これらに限定されない、核酸分子を切断することができる任意の酵素を使用することができる。

【0227】

エンドヌクレアーゼには核酸分子鎖内の結合を切断する能力があり、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子のいずれかに特異的であることができる。核酸分子の切断は、核酸分子内でランダムに起こることもあるし、または核酸分子の特定の配列で切断することもある。核酸分子の特異的な断片化は、１以上の酵素を用いて連続的な反応でまたは同時に達成することができる。制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子内の特定の配列を認識し、通常、認識配列の内部かまたは認識配列の近くで両方の鎖を切断するエンドヌクレアーゼのサブクラスである。エンドヌクレアーゼは、特定のタイプの核酸分子に特異的であり、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ分子に特異的であることができる。ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に特異的なエンドヌクレアーゼの例には、リボヌクレアーゼＨ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴｉ、リボヌクレアーゼＵ_２、リボヌクレアーゼＰおよび国際特許出願ＷＯ２００４／０９７３６９号、４３ページ、５行目から４４ページ、４行目に論じられているリボヌクレアーゼがある。

【0228】

配列決定における曖昧性を軽減するために、追加の限定的アルカリ加水分解を行なうことができる。これらの条件下では全てのホスホジエステル結合が切断される可能性があるので、省略された切断および／または特異的な切断に関する情報をこの方法で得ることができる（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７７）。

【0229】

エンドヌクレアーゼの代わりとして、ＤＮＡ分子の断片化に、ＤＮＡグリコシラーゼを使用することができる。ＤＮＡグリコシラーゼは、特定のタイプのヌクレオ塩基を所与のＤＮＡ核酸分子から特異的に除去する。それによって、これらの酵素は、核酸分子の配列中に無塩基部位を生じさせることができ、無塩基部位は、露出したリン酸骨格を無塩基部位で特異的に切断し、この配列を示す１組のヌクレオ塩基特異的断片を生じさせる別の切断酵素によるか、あるいはアルカリ溶液およびまたは熱などの、化学的手段によるかのいずれかで認識され得る。ＤＮＡグリコシラーゼとその標的とされるヌクレオチドの１つの組合せを使用すれば、核酸分子の塩基特異的シグネチャーパターンを生成させるのに十分である。多くのＤＮＡグリコシラーゼが公知であり、国際特許出願ＷＯ２００４／０９７３６９号、４４ページ、１３行目から４５ページ、７行目に論じられている。

【0230】

しかしながら、ＤＮＡ分子の塩基は、修飾塩基が特異的なＤＮＡグリコシラーゼによって認識されるように特定の化学物質で修飾することができる（国際特許出願ＷＯ２００４／０９７３６９号、４５ページ、８行目から４５ページ、２６行目を参照されたい）。核酸分子の断片は、グリコシラーゼ処理とその後の無塩基部位の切断によって生じる。

【0231】

本明細書における核酸分子の断片化は、当業者に公知でかつ参照により本明細書に組み込まれるジヌクレオチド特異的切断試薬によって達成することもできる（ＷＯ９４／２１６６３号；Ｃａｎｎｉｓｔｒａｒｏ ＆ Ｋｅｎｎｅｌｌ，１９８９）。

【0232】

デオキシリボヌクレアーゼ（略称、ＤＮアーゼ）を用いて、ＤＮＡ分子断片を生成させることもできる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９８１）。ＤＮアーゼＩは、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを消化してポリヌクレオチドおよびモノヌクレオチドにするエンドヌクレアーゼである。他のＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩＩ、ＤＮアーゼＨ、ＤＮアーゼＩＴ、ＤＮアーゼＩＸなどであり、国際特許出願ＷＯ２００４／０９７３６９号、４６ページ、２６行目から４７ページ、６行目に論じられている。

【0233】

エキソヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子の末端からヌクレオチドを切断する酵素である。５’エキソヌクレアーゼ（ＤＮＡ分子をその５’末端から切断する）と３’エキソヌクレアーゼ（ＤＮＡ分子をその３’末端から切断する）がある。

【0234】

上記のタンパク質ベースの酵素に加えて、ＤＮＡザイムとＲＮＡザイムが当該技術分野で公知であり、これらを用いて核酸分子を切断し、核酸分子断片を生じさせることができる（Ｓａｎｔｏｒｏ ＆ Ｊｏｙｃｅ，１９９７；Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ，２００８ａ；Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ，２００８ｂ）；米国特許ＵＳ６，３２６，１７４号、同ＵＳ６，１９４，１８０号、同ＵＳ６，２６５，１６７号、同ＵＳ６，０９６，７１５；同ＵＳ５，６４６，０２０号）。

【0235】

核酸分子のイオン化断片化は、ランダムに切断するためのさらなる選択肢であり、例えば、質量分析計のイオン源の中で高圧を用いて、イオントラップ中での衝突誘導性解離を用いるＭＳによって断片化することによって質量分析法による分析で達成される。（Ｂｉｅｍａｎｎ，１９９０）。塩基配列は、ＭＳ中の個々のヌクレオチド残基と関連する公表されている質量を用いて核酸分子の得られるＭＳ断片化パターン中に観測される分子量の差から推定される。

【0236】

核酸分子の断片は、断片化方法の任意の組合せおよび酵素の任意の組合せを用いて形成することができる。したがって、全てのこれらの切断反応の任意の組合せ、例えば、熱、塩基性ｐＨ、ジアミン、または特に高温でＲＮＡを分解することができる酸性ｐＨ、イオン化および１つまたはいくつかの酵素ならびに上記の組合せによるものが本発明に包含されることが当業者に認識されるであろう。さらに、核酸分子の特定の断片を生じさせる方法は、核酸分子のランダムな断片を生じさせる方法と組み合わせることができる。さらに、核酸分子を特定の部位で切断する１以上の酵素は、核酸分子を異なる部位で特異的に切断する１以上の酵素と組み合わせて使用することができる。別の例では、特定の種類の核酸分子を切断する酵素を組み合わせて使用することができる。別の例では、核酸分子をランダムに切断する酵素を、核酸分子を特異的に切断する酵素と組み合わせて使用することができる。組み合わせて使用するというのは、核酸分子に対して１つまたは複数の方法を次々にまたは同時に実施することを意味する。

【0237】

本発明に関連して、切断または断片化工程は、複数の修飾核酸分子をランダムに切断することを含む。本明細書で好ましく使用されるとき、「ランダムに」という用語は、各々の核酸分子が、そのヌクレオチド配列内、すなわち、その一次核酸構造内の１つまたはいくつかの部位で切断されることを示す。それに関連して、切断は、既知の部位で、統計的とはいえ、再現可能な形で起こることが必要不可欠である。本発明の実施については、全体としての切断によって、核酸分子の全てのあり得る断片または全ての関連する断片に相当するものが提供される限り、個々の分子が１回または数回切断されるかどうかということは重要でない。該切断に関連して、通常およびそれぞれの反応物中に存在する場合、修飾核酸分子種が切断されるだけでなく、このような修飾を担持しないまたは有さない核酸分子の種も切断されることが認識されるであろう。

【0238】

その限りにおいて、非限定的な切断または完全な切断であれば、そのような全てのあり得る断片または全ての関連する断片に相当するものを提供するのに好適ではない単一のヌクレオチドまたは断片が生成されるので、切断は、ランダムな切断であるだけでなく、限定的な切断でもある。

【0239】

さらなる工程では、本発明による方法は、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離する工程を含む。当業者に認識されるように、この工程は、好ましくは本発明による方法の第１の手順にのみ包含される。

【0240】

この分離工程は、好ましくは全体としての修飾核酸分子断片を、これも好ましくは全体としての非修飾核酸分子断片から識別する原理に基づいて行なわれる。このような識別は、修飾核酸分子断片に付与された修飾に固有であるかもしくはこのような修飾に起因する、または修飾のために非核酸分子断片には存在しない質量、サイズまたは疎水性相互作用に基づくものであり得る。このような分離を可能にする技術は、とりわけ、濾過、透析およびその最も広義のクロマトグラフィー、すなわち、リガンドと該リガンドに対する相互作用パートナーの相互作用に基づく分離を含む。核酸分子の全てのあり得る断片または全ての関連する断片に相当するものが、基本的には、この分離工程で維持されることが好ましいことが認識されるであろう。

【0241】

修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離するための特に好ましい原理は、リガンドを修飾として使用することであり、これは、リガンドを二成分または多成分修飾の第１または第２の部分として使用することを含む。

【0242】

好ましい一実施形態では、修飾核酸分子の修飾は、核酸分子の５’または３’末端ヌクレオチドに直接的または間接的に連結されたリガンドである。間接的に連結されたとは、本明細書では、リガンドと核酸分子の５’または３’末端ヌクレオチドの間にリンカーが取り付けられていることを意味する。リガンドとは結合する何かを意味する。本明細書で使用されるリガンドは、核酸分子に連結された部分であり、リガンドは、リガンドと結合パートナーとの結合を可能にする結合パートナーと相互作用し、リガンドと結合パートナーの結合の結果として、リガンドに連結された核酸分子は固定される。

【0243】

一実施形態では、相互作用パートナーは相に付着しており、このような相は、修飾核酸分子断片、好ましくは非修飾核酸分子断片も含む相とは異なるものである。好ましくは、このような相は固相である。このような固相は、例えば、固体支持体によって形成される。固体支持体は、好ましくは、ポリマー、好ましくはプラスチック、ガラス、アガロース、および金属を含む群から選択される。

【0244】

リガンドと相互作用パートナーの相互作用によって、リガンド、ひいては修飾核酸分子断片が、相互作用パートナーが付着している相に固定される。リガンドと相互作用パートナーによって生成される相互作用の種類によって、固定は、好ましくは化学的固定、親和性固定、または磁気固定であり得る。

【0245】

特に好ましい固定の形態は、以下の相互作用に基づく化学的固定であり、このような相互作用を与える一方の要素はリガンドであるが、このような相互作用を与えるもう一方の要素は相互作用パートナーである。当業者に公知の実施される例としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：
アミンおよび活性化カルボン酸、
アミン＋活性化カルバメート、
アミンおよびイソシアネート／イソチオシアネート、
アミン＋ハライド、
アミン＋マレイミド部分、
アミン＋アルデヒド／ケトン、
ヒドロキシルアミンまたはヒドラジン＋ケトン／アルデヒド、
ヒドラジン誘導体および活性化カルボン酸、
ヒドラジンおよびイソシアネート／イソチオシアネート、
ヒドラジン＋ハライド、
ヒドラジン＋マレイミド部分、
ヒドラジン＋アルデヒド／ケトン：
ヒドラジン＋アルデヒド／ケトン、それに次ぐ還元アミノ化、
チオール＋ハライド、
チオール＋マレイミド、
チオール＋活性化チオール、
チオール＋ビニルスルホンおよび他のマイケル付加反応
アジド＋アルキン＋Ｃｕ塩および他の「クリック化学反応」相互作用パートナー（Ｋｏｌｂ ｅｔ．Ａｌ．２００１）、
アルキルまたはアリールＰ（ＩＩＩ）部分を用いたシュタウディンガー反応によるアジド＋活性化カルボン酸、
アジド＋求電子トラップに付着した三価ホスフィン（シュタウディンガーライゲーション）、
アジド＋ホスフィノチオールエステル−無痕跡のシュタウディンガーライゲーション、
イミンを形成するアジド＋アルデヒド／ケトン＋ＰＰｈ_３（シュタウディンガー）、このイミンはその後、任意で対応するアミンに還元することができる、
アミン＋カルボキシル基
カルボン酸官能基＋アミン、ヒドラジンなどのアミノ官能基、
酸化されてジアルデヒドになるシス−ジオール（例えば、ＲＮＡ分子の３’末端に見られるもの）、このジアルデヒドは、その後、例えば、ホウ化水素を介する還元の後で、例えば、アミンまたはヒドラジン誘導体のいずれかとともに環状アミンを形成する、
チオエステル＋システイン−ネイティブライゲーションおよび誘導体、
ホスホチオエート＋α−ハロカルボニル含有結合体（ｃｏｎｊｕｇａｎｔ）、
例えば、ホスフェート活性化を介してホスホロアミデートとなるホスフェート＋アミン
例えば、活性化を介してホスホジエステルとなるホスフェート＋アルコール、
（ホウ化水素で還元した後）２級アミンを形成するアルデヒド、ヒドラゾンを形成するヒドラジド基、セミカルバゾンを形成するセミカルバジド、
システイン誘導体＋チオエステルペプチド
エポキシド＋アミン
ディールズ・アルダー反応、および他のペリ環状反応のためのアルケン／アルキン＋ジエン／ジイン
アルデヒドとヒドロキシアミンとを反応させることによるオキシム形成
ヒドロキシまたはアミノ＋エポキシド。

【0246】

上の反応または少なくともその一部は、とりわけ、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，２００７およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，２００８に記載されている。

【0247】

標識／タグまたはリガンドの化学的付加も、限定するものではないが、上記の官能基相互作用に基づいて達成することができ、このような相互作用を与える要素の一方は核酸分子に付加されるが、このような相互作用を与えるもう一方の要素は、標識、相互作用パートナーに付加されることも認識される。

【0248】

特に好ましい固定の形態は、以下の相互作用：ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ニュートロアビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、抗体と抗原またはハプテンの相互作用、核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはその組合せからなる２つのオリゴヌクレオチドの相互作用、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドの相互作用、アルブミンとシバクロンブルーの相互作用、金属キレーター剤と金属キレート化支持体の相互作用に基づく親和性固定であり、このような相互作用を与える要素の一方はリガンドであり、このような相互作用を与える要素の一方は相互作用パートナーである。

【0249】

修飾核酸分子断片の固定により、非修飾核酸分子断片は、修飾核酸分子断片から除去される。このような除去は当業者に公知の標準的な手順である。好ましくは、非修飾核酸分子断片は、洗浄によるかまたはリガンドの相互作用が付着した相に固定された修飾核酸分子断片を含む相を、それぞれ、分離工程が行なわれている、反応液および反応容器から、それぞれ、新しい反応液および反応容器に移すことによって除去される。

【0250】

本明細書で使用される洗浄という用語は、修飾断片が隔離されている相から非修飾断片または他の化学的実体を除去するために液体媒体を適用することを指す。

【0251】

さらなるサブ工程では、固定された修飾核酸分子断片は、相互作用パートナーが付着している相から除去され、それにより修飾核酸分子断片が放出される。このような放出は、当業者に公知の任意の手段によって影響を及ぼすことができる。より具体的には、このような放出は、相に付着している相互作用パートナーへのリガンドの結合に競合するリガンドを相互作用パートナーを過剰に添加することによって影響を及ぼすことができる。この手順の代わりのものは、放出される修飾核酸分子断片が、このような放出の前に付着していた相からその時に放出される相互作用パートナーも含むように、相から相互作用パートナーを切り離すことである。さらなる実施形態では、相互作用パートナーとリガンドの相互作用は共有結合によって形成され、相互作用パートナーはリガンドから除去され、共有結合は、化学的におよび／または酵素的に切断されるか、あるいは光によって切断される。代わりの一実施形態では、相互作用パートナーとリガンドの相互作用は非共有結合によって形成され、相互作用パートナーはリガンドから除去され、非共有結合は、ｐＨ、温度および／またはイオン力の変化によって、リガンドおよび／または相互作用パートナーの変性によって、競合分子による溶出によって、有機溶媒およびカオトロピック剤の使用によって切断される。別の実施形態では、修飾核酸分子断片は、リガンドの（修飾）核酸分子断片への結合に使用されるリンカーを切断することによって相互作用パートナーが付着している相から除去される。このような実施形態では、修飾核酸分子断片が、修飾核酸分子断片の分離または分別を可能にする修飾を依然として含むことが保証されなければならない。

【0252】

第１手順と第２の手順の両方に適用可能な、本発明による方法の次の工程では、修飾核酸分子断片は、その長さ、質量および／または電荷によって分離または分別され、このような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される。このような分離は、修飾核酸分子断片の一部であるそのまたは１つの修飾を使用することによって起こる。

【0253】

このような分別工程では、非修飾核酸分子断片から分離した後に混合物として存在する修飾核酸分子断片である、個々の断片、すなわち、個々の断片種は、アドレス指定可能にされなければならない。この個々の断片種をアドレス指定可能にする工程は、その長さ、質量および／または電荷に関する該断片種の違いに基づくものである。したがって、個々の種が互いに分離されるように混合物を分別する技術が、修飾核酸分子断片の混合物に適用される。このような分離は、時間、空間、質量および／または質量電荷比での分離であってもよい。このような分離の実施方法は当業者に公知であり、序論をはじめ、本明細書にも記載されており、その開示は、不要な繰り返しを避けるために、本説明のこの部分に組み込まれるものとする。本明細書で好ましく使用されるとき、時間での分離は、ディスプレー中で、時間が経つと、断片の１つの種が別の種に続いて現れる分離である。所与の時点で、時間ウィンドウの幅やこのようなディスプレーが包含する時間ウィンドウによって、１つだけまたは限られた数のこのような種が、その時ディスプレー中に存在する。本明細書で好ましく使用されるとき、空間での分離は、ディスプレー中で、断片の１つの種が、２次元または３次元空間の場所に配置されるかまたは存在する分離であり、このような場所は、修飾核酸分子の様々な断片ごとに異なる。ディスプレーに含まれる空間によって、断片の全ての種またはそのほんの一部が含まれ得る、すなわち、提示され得る。

【0254】

その限りにおいて、本明細書で好ましく使用されるパターンという用語は分別工程の結果を指し、好ましくはディスプレーに示される経時的な修飾核酸分子断片の配列か、あるいは２次元もしくは３次元空間での修飾核酸分子断片の配列の配置または質量もしくは質量電荷比のいずれかに基づく修飾核酸分子断片の配列の配置かのいずれかを示す。その限りにおいて、パターンは、好ましくは、時間軸に沿って配置されているか、２次元もしくは３次元空間に配置されているか、またはその組合せの修飾核酸分子断片のラダーである。

【0255】

修飾核酸分子断片のパターンを利用する核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程は、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離する工程で使用された修飾を欠く修飾核酸分子断片を実際に利用することであることが本発明の範囲内である。より具体的には、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離した後、修飾を修飾核酸分子断片から除去し、それにより修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離するために使用された修飾を欠く修飾核酸分子断片のパターンを生成させる。修飾を欠くこのような修飾核酸分子断片は、修飾を修飾核酸分子断片に付加する無痕跡リンカーを使用することにより生成させ得る。このような無痕跡リンカーは、切断されたときに、修飾と核酸分子断片の両方を、一度は無痕跡リンカーを形成していた原子（複数可）、原子の基（複数可）または部分／部分（複数）を全て欠いた状態にするものである。このため、修飾と核酸分子断片は、無痕跡リンカーが切断され、除去された後、それぞれ、長さ、質量および／または電荷に何の変化も示さない。このような無痕跡リンカーの例を以下の式で模式的に示す。

【化1】

【0256】

修飾核酸分子断片の１つの修飾またはそのような修飾の１つの部分を、好ましくは、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離した後に、修飾核酸分子断片から除去し得、さらなる修飾または該修飾の部分が、なおも核酸分子断片に付加されていることは本発明の範囲内である。さらなる実施形態では、修飾の除去によって、修飾を核酸分子断片に付加するリンカー、または核酸分子断片に付加されたその部分が残り、そのような核酸分子断片は、好ましくはそのようなリンカーおよびその部分が、それぞれ、そのような核酸分子に修飾核酸分子断片の特徴を付与するのに好適であるという条件で、リンカーまたはその部分が存在するために、やはり修飾核酸分子断片とみなされ得る。

【0257】

本発明による方法の第１の手順では、パターンが修飾核酸分子断片のみから本質的になることが当業者に認識されるであろう。しかしながら、いくつかの非修飾核酸分子断片も、通常は非修飾核酸分子断片からの修飾核酸分子断片の不完全な分別による副産物として、分別工程に供される反応液に含まれることが排除できない。

【0258】

本発明による方法の第２の手順に関連して、パターンが、修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片の両方によって形成されることも当業者に認識されるであろう。しかしながら、この修飾核酸分子断片を分別する工程という意味でのパターンは、これらの修飾核酸分子断片のみが、アドレス指定プロセスで使用され得る修飾を含むとき、修飾核酸分子断片のみから構成される。したがって、修飾核酸分子断片のパターンを生成させるために、修飾核酸分子断片のみが、時間、空間、質量、および／または質量電荷比で提示される可能性がある。

【0259】

分別工程を可能にする、すなわち、修飾核酸分子断片、すなわち、種を、分離または分別するときに使用される修飾は、本明細書で定義された一成分修飾または二成分もしくは多成分修飾の部分であってもよい。

【0260】

このような修飾は、好ましくは、標識、質量タグ、親油性タグまたは親和性タグである。

【0261】

好ましい一実施形態では、修飾核酸分子の修飾は、核酸分子の５’または３’末端ヌクレオチドに直接的または間接的に連結された標識である。間接的に連結されたとは、本明細書では、標識と核酸分子の５’または３’末端ヌクレオチドの間にリンカーが取り付けられていることを意味する。本明細書で使用される「標識」という用語は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために使用することができ、かつ核酸分子のヌクレオチドに付着させることができる任意の原子、分子および／または部分を指す。標識は、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能、比色分析、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供し得る。検出標識としては、蛍光基［特定の波長の電磁放射線、例えば、光またはＸ線を吸収することができ、かつその後、吸収されたエネルギーをより長い波長の放射線として再放出する基；実例となる例は、ＤＡＮＳＹＬ（５−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）、ＤＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−４，４−ジメチルオキサゾリジン）、ＰＲＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン）、ＴＥＭＰＯ（Ｎ−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）、ジニトロフェニル、アクリジン、クマリン、Ｃｙ３およびＣｙ５、エリスロシン、クマリン酸、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ローダミン、テトラメチルローダミン、ロックス、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレン、フルオレセイン、ユーロピウム、ランテニウム、サマリウム、および他の希土類金属である］、シアニン色素（国際特許出願ＷＯ１９９７／４５５３９号、米国特許ＵＳ５，３６６，８６０号および同ＵＳ５，１８．９３４号）および化学発光色素（米国特許ＵＳ４，９３１，２２３号；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９４）、放射性同位体標識、ならびに化学発光標識（米国特許ＵＳ４，９３１，２２３号；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９４に示されているような化学反応中の光の放出によって検出可能な標識）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0262】

フルオレセイン色素の例としては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が挙げられる。

【0263】

この種の修飾、すなわち、標識は、本発明による方法の第２の手順に関連して特に有用であることが当業者に認識されるであろう。より好ましくは、このような標識は、核酸分子一般のうちの１つと異なる吸収または蛍光特性を示す。この種の修飾のために、修飾核酸分子断片は、非修飾核酸分子から識別されることができ、好ましくはディスプレーに提示され、アドレス指定プロセスに回される。

【0264】

好ましい一実施形態では、修飾核酸分子の修飾は質量タグである。好ましい一実施形態では、修飾核酸分子の修飾は、核酸分子の５’または３’末端ヌクレオチドに直接的または間接的に連結される質量タグである。間接的に連結されたとは、本明細書では、質量タグと核酸分子の５’または３’末端ヌクレオチドの間にリンカーが取り付けられていることを意味する。質量タグは、その分子量が、配列決定される核酸分子の分子量よりも大きい何かを意味する。それゆえ、核酸分子に連結された質量タグ、すなわち、修飾が質量タグである修飾核酸分子は、未修飾核酸分子から修飾核酸分子を分離することを可能にする。未修飾核酸分子からの質量タグ分離修飾核酸分子の分離は、濾過、透析および／またはクロマトグラフィー法によって行なうことができる。

【0265】

質量タグは、核酸分子に永久的に付加される部分を含み、そのタグ化断片は、正確な配列決定が可能になるような規定の質量である。このようなタグの例は、ペプチド、ＤＮＡ、ＰＮＡなどの規定の親水性ポリマーである。質量タグは、単にタグ化断片を非タグ化断片から分離しやすくするために使用することもできる。分離されると、これらの質量タグは除去されて、所望の核酸分子断片だけを残す。非タグ化断片からの分離後に切断される質量タグは、規定の質量である必要はない。それゆえ、限定されるものではないが、ＰＥＧ、タンパク質、抗体、多糖などの親水性ポリマーを、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびペプチドなどの規定のポリマーと同様に使用することができる。

【0266】

質量タグは、その質量で区別可能なタグであるとみなすこともできる。このような区別を用いて、タグ化断片を同定することができる。同定は、ＭＳ／ＭＳ断片化を用いてタグの固有の質量を遊離させ、それにより親分子がタグ化されていたことを示すことにより達成することができる。このような概念は、「娘イオン」質量タグアプローチとして知られている。さらなる実施形態では、質量タグは、タグのアイデンティティーをさらに確立するために、規定の同位体分布からなっていてもよい。

【0267】

さらに好ましい実施形態では、修飾は、核酸分子の５’または３’末端ヌクレオチドに直接的または間接的に連結される親油性タグである。間接的に連結されたとは、本明細書では、親油性タグと核酸分子の５’または３’末端ヌクレオチドの間にリンカーが取り付けられていることを意味する。親油性タグは、配列決定される核酸分子よりも親油性の高い何かを意味する。それゆえ、核酸分子に連結された親油性タグ、すなわち、修飾が親油性タグである修飾核酸分子は、未修飾核酸分子から修飾核酸分子を分離することを可能にする。未修飾核酸分子からの親油性タグ分離修飾核酸分子の分離は、濾過、透析および／またはクロマトグラフィー法によって行なうことができる。

【0268】

親油性タグは、限定されるものではないが、２〜５０個の炭素を有する脂肪族鎖、ステロイド、アルカロイド、芳香族環系から構成される。本明細書で使用される、「脂肪族」という用語は、１以上の官能基で任意に置換されている、飽和と不飽和の両方の、直鎖状（すなわち、非分岐状）、分岐状、非環式、環式、または多環式脂肪族炭化水素を含む。当業者に理解されるように、「脂肪族」は、限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニル部分を含むことが本明細書で意図される。したがって、本明細書で使用されるとき、「アルキル」という用語は、直鎖、分岐および環式アルキル基を含む。類似の慣例は、「アルケニル」、「アルキニル」などの他の一般用語にも当てはまる。さらに、本明細書で使用されるとき、「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などの用語は、飽和基と不飽和基の両方を包含する。したがって、実例となる脂肪族基としては、限定されるものではないが、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、−ＣＨ_２−シクロプロピル、ビニル、アリル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、−ＣＨｂ−シクロブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、−ＣＨ_２−シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、シクロヘキシル、−ＣＨ_２−シクロヘキシル部分などが挙げられ、これらもやはり、１以上の置換基を担持していてもよい。アルケニル基としては、限定されるものではないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられる。代表的なアルキニル基としては、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニルなどが挙げられる。一般に、本明細書で使用される、「アリール」および「ヘテロアリール」という用語は、安定な単環式または多環式、複素環式、多環式、および多複素環式の不飽和部分を指す。置換基としては、限定されるものではないが、先に述べた置換基、すなわち、脂肪族部分について、または本明細書に開示されている他の部分について列挙された、安定な化合物を形成させる置換基のいずれかが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、「アリール」は、限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどを含む、１または２個の芳香環を有する単環式または二環式炭素環系を指す。本発明の特定の実施形態では、本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、５〜１０個の環原子を有する環式芳香族ラジカルを指し、これらの環原子のうち、１個の環原子は、Ｓ、Ｏ、およびＮから選択され；０，１，または２個の環原子は、Ｓ、Ｏ、およびＮから独立に選択される追加のヘテロ原子であり；残りの環原子は炭素であり、ラジカルは、これらの環原子のいずれかを介して、例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなどのような、分子の残りの部分に接続している。アリールおよびヘテロアリール基は、置換されていなくても置換されていてもよく、置換には、その上の１、２、３個、またはそれより多くの水素原子を、以下の部分、すなわち、限定されるものではないが、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ_２；−ＣＮ；−ＣＦ_３；−ＣＨ_２ＣＦ_３；−ＣＨＣｌ_２；−ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＮＨ_２；−ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_３；−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｘ；−ＣＯ_２（Ｒ_ｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）_２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ_ｘ；−ＯＣＯ_２Ｒ_ｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒ_Ｘ）_２；−Ｎ（Ｒｘ）_２；−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｘ；−ＮＲ_ｘ（ＣＯ）Ｒ_ｘ（ここで、各々のＲ_ｘの存在について、Ｒ_ｘは、好ましくは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルから個別にかつ独立に選択され、上記のおよび本明細書中の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよく、分岐状であっても非分岐状であってもよく、環式であっても非環式であってもよく、上記のおよび本明細書中のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよい）のいずれか１つまたは複数と独立に置換することが含まれることが理解されるであろう。本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、具体的には、３〜７個、好ましくは３〜１０個の炭素原子を有する基を指す。好適なシクロアルキルとしては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが挙げられ、これは、他の脂肪族、ヘテロ脂肪族、または複素環式部分の場合と同様に、限定されるものではないが、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−ＣＩ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ_２；−ＣＮ；−ＣＦ_３；−ＣＨ_２ＣＦ_３；−ＣＨＣｌ_２；−ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＮＨ_２；−ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_３；−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｘ；−ＣＯ_２（Ｒ_ｘ）；−ＣＯＮ（Ｒ_ｘ）_２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ_ｘ；−ＯＣＯ_２Ｒ_ｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒ_ｘ）_２；−Ｎ（Ｒｘ）_２；−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｘ；−ＮＲ_ｘ（ＣＯ）Ｒ_ｘ（ここで、各々のＲ_ｘの存在について、Ｒ_ｘは、好ましくは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルから個別にかつ独立に選択され、上記のおよび本明細書中の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよく、分岐状であっても非分岐状であってもよく、環式であっても非環式であってもよく、上記のおよび本明細書中のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよい）を含む置換基で任意に置換されていてもよい。通常適用される置換基のさらなる例は、本明細書に記載される実施例に示された特定の実施形態により説明されている。本明細書で使用される、「ヘテロ脂肪族」という用語は、例えば、炭素原子の代わりに１以上の酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素原子を含有する脂肪族部分を指す。ヘテロ脂肪族部分は、分岐状、非分岐状、環式または非環式であってもよく、また、飽和および不飽和複素環、例えば、モルホリノ、ピロリジニルなどを含んでいてもよい。特定の実施形態では、ヘテロ脂肪族部分は、その上の１以上の水素原子を、限定されるものではないが、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ_２；−ＣＮ；−ＣＦ_３；−ＣＨ_２ＣＦ_３；−ＣＨＣｌ_２；−ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＮＨ_２；−ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_３；−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｘ；−ＣＯ_２（Ｒ_ｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）_２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ_ｘ；−ＯＣＯ_２Ｒ_ｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒ_ｘ）_２；−Ｎ（Ｒｘ）_２；−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｘ；−ＮＲ_ｘ（ＣＯ）Ｒ_ｘ（ここで、各々のＲ_ｘの存在について、Ｒ_ｘは、好ましくは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルから個別にかつ独立に選択され、上記のおよび本明細書中の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよく、分岐状であっても非分岐状であってもよく、環式であっても非環式であってもよく、上記のおよび本明細書中のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよい）を含む１以上の部分と独立に置換することによって置換される。分別工程を可能にする、すなわち、修飾核酸分子断片、すなわち、種を分離または分別するときに使用される、本明細書で定義される一成分修飾は、リンカーによって核酸分子に連結されてもよい。

【0269】

分別工程を可能にする、すなわち、修飾核酸分子断片、すなわち、種を分離または分別するときに使用される、本明細書で定義される二成分または多成分修飾は、リンカーによって、互いにまたは核酸分子に連結されてもよい。

【0270】

「リンカー」は、それぞれ、核酸分子を修飾もしくはその部分／部分（複数）に接続する連結部分を形成するか、または互いに対するおよび核酸分子に対する修飾を形成する１以上の原子を指す。リンカーの機能は、恒久的にまたは非恒久的に該部分または分子を接続させることである。一実施形態では、非恒久的連結は切断可能な連結である。リンカーは、特性が、非環式、環式、アリール、ヘテロアリール、またはこれらの組合せである。リンカーは、炭素原子骨格のみを含むものであってもよいし、または上で定義されたヘテロ脂肪族であってもよい。リンカーは、他の部分、例えば、限定されるものではないが、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ_２；−ＣＮ；−ＣＦ_３；−ＣＨ_２ＣＦ_３；−ＣＨＣｌ_２；−ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＮＨ_２；−ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_３；−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｘ；−ＣＯ_２（Ｒ_ｘ）；−ＣＯＮ（Ｒ_ｘ）_２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ_ｘ；−ＯＣＯ_２Ｒ_ｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒ_ｘ）_２；−Ｎ（Ｒｘ）_２；−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｘ；−ＮＲ_ｘ（ＣＯ）Ｒ_ｘ（ここで、各々のＲ_ｘの存在について、Ｒ_ｘは、好ましくは、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルから個別にかつ独立に選択され、上記のおよび本明細書中の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよく、分岐状であっても非分岐状であってもよく、環式であっても非環式であってもよく、上記のおよび本明細書中のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよい）を含有していてもよい。リンカーは、それぞれ、該リンカーによって接続または連結されている、分子および部分の分離を可能にする切断部位または切断可能部分を、好ましくはその骨格中に含有していてもよい。例えば、リンカーの切断によって、一実施形態では、標識などの修飾が、それぞれ、核酸分子および核酸分子断片から分離される。このような切断可能なリンカーは、酸、アルカリ、または還元条件の下で切断され得る。それらは、酵素的にまたは光によっても切断され得る。後者の場合、それらは光切断可能なリンカーである。

【0271】

本発明に関連して、様々な核酸分子断片種が、その長さ、質量または電荷によって修飾により分別される分別工程では、その限りにおいて好適な任意の技術が使用され得る。このような技術は、限定されるものではないが、クロマトグラフィーおよび質量分析法を含み、本発明による方法の第１の手順と第２の手順の両方に関連して使用され得る。特に好ましい技術は、クロマトグラフィーと組み合わせ得る質量分析技術である。

【0272】

本明細書で使用されるとき、質量分析法に対する言及は、当業者に公知の任意の好適な質量分析フォーマットを包含する。核酸分子の正確な分析を可能にする質量分析技術が好ましい。例えば、核酸分子の過度の断片化が起こるため、電子イオン化および高速原子衝撃（ＦＡＢ）イオン化の方法などのいわゆる「ハードな」イオン化技術は、核酸分子の分析には好適ではない。ソフトなイオン化技術を用いた、様々な質量分析フォーマット（様々な質量分析計と組み合わせたイオン化原理）が当業者に公知である。このようなフォーマットとしては、エレクトロスプレー、大気圧光イオン化（略称、ＡＰＰＩ）、大気圧化学イオン化（略称、ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（略称、ＭＡＬＤＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（略称、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、赤外マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（略称、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ）、直交−ＴＯＦ（略称、Ｏ−ＴＯＦ）、軸方向−Ｔｏｆ（略称、Ａ−ＴＯＦ）、イオンサイクロトロン共鳴（略称、ＩＣＲ）、フーリエ変換線形／レフレクトロン（略称、ＲＥＴＯＦ）、レーザー脱離イオン化（略称、ＬＤＩ）、高速原子衝撃（略称、ＦＡＢ）、脱離エレクトロスプレーイオン化（略称、ＤＥＳＩ）、シリカ上脱離イオン化（略称、ＤＩＯＳ）、液体二次イオン質量分析法（略称、ＬＳＩＭＳ）が挙げられる。

【0273】

エレクトロスプレーイオン化（略称、ＥＳＩ）は、高電位が印加されるキャピラリーの先端から分析物の希釈溶液を噴霧することを含む。次に、噴霧は、液体表面で電荷を分離させ、それにより出現した液滴（テイラーコーン）を変形させる静電力によって達成される。これが最終的に崩壊して、多数のマイクロメートルサイズの液滴を生じさせ、これがさらに、電荷を帯びた分子に発展し、次に、これが分析される。この技術は穏やかでかつ極性化合物やイオン性化合物を好むので、生体ポリマー分析の分野ですぐに適用された。

【0274】

大気圧光イオン化（略称、ＡＰＰＩ）は、イオン化が困難なステロイドなどの非極性実体のイオン化に用いられることが多いが、この技術は、極性実体に適用することもできる。これは、大気圧で加熱器を用いてＬＣ溶離液を蒸発させるＬＣ／ＭＳイオン化技術である。得られた気体は、放電ランプ（例えば、ＵＶランプ）により発生した光子のビームの中に通され、このビームによって気体分子がイオン化される。

【0275】

大気圧化学イオン化（略称、ＡＰＣＩ）は、分析物を含有する溶液（通常、ＨＰＬＣの移動相）を４００℃を超える温度に加熱し、高流速の窒素で噴霧し、得られたエアロゾル雲をコロナ放電生成イオンに供することを含む。これは、液相のイオン化プロセスではなく、気相のイオン化プロセスであるという点でＥＳＩとは異なる。通常、ＡＰＣＩは、ＥＳＩよりも多くの断片化を生じさせる。

【0276】

高速原子衝撃（略称、ＦＡＢ）は、固体マトリックスを含有する試料に衝突して、脱離とイオン化を生じさせる中性原子、通常、ＸｅまたはＡｒの高エネルギービームの使用を含む。これは、気相になりにくい大きい生体分子に用いられる。原子ビームは、イオン源から電荷交換セルを通してイオンを加速させることによって生成される。イオンは、中性原子との衝突で電子を獲得し、高エネルギー原子のビームを形成させる。ＦＡＢスペクトルは、通常、わずかな断片と疑似分子イオン（例えば、［Ｍ＋Ｈ］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋、付加物）のシグナルとを含み、このために、ＦＡＢは分子量決定に有用なものとなっている。しかしながら、マトリックスは、多くの低ｍ／ｚシグナルの一因となっており、シグナルの再現性がないために、スペクトルの解釈が複雑になる。さらに、この方法は、わずかな不純物による抑制効果を受けやすい。

【0277】

マトリックス支援レーザー脱離イオン化（略称、ＭＡＬＤＩ）は、レーザーを介してタンパク質またはＤＮＡ断片などの大きい生体分子を蒸発させ、イオン化する方法である。生体分子を３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）などの固体マトリックスに分散させる。ＵＶレーザーパルスにより、大きい分子の一部を担持するマトリックスが切断されてイオン化形態で気相に入り、そのため、これらの分子を質量分析計に抽出することができる。ＭＡＬＤＩの範囲が広いので、分析器次第で、最大５００ｋＤａの分子量、通常は５〜１００ｋＤａの分子量（すなわち、例えば、ポリマー、生体分子、複合体、酵素）を決定することができる。ＭＡＬＤＩ技術は、例えば、飛行時間型分析器またはフーリエ変換質量分析計と合わせることができる。前者は分解能と精度が低く、一方、後者は非常に精度が高いが、ダイナミックレンジは低く、その操作はより複雑である。

【0278】

レーザー脱離イオン化（略称、ＬＤＩ）は、分子に高強度レーザーパルスを照射して、後に分析されるイオンを形成させることである。この初期の技術の限界は、約５〜１０ｋＤａと質量のカットオフが鋭いことであり、ＴＯＦ質量分析器と合わせる必要がある。

【0279】

脱離エレクトロスプレーイオン化（略称、ＤＥＳＩ）、は、エレクトロスプレー源が、数ミリメートルから数センチメートル離れた固体試料に向けられる帯電した液滴を生成させるイオン化技術である。帯電した液滴は、表面との相互作用を通して試料を獲得し、その後、質量分析計に抽出することができる高度に帯電したイオンを形成させる。

【0280】

シリカ上脱離イオン化（略称、ＤＩＯＳ）は、多孔質シリコン表面上に沈着した試料のレーザー脱離／イオン化である。

【0281】

改良型の表面増強レーザー脱離／イオン化（略称、ＳＥＬＤＩ）は、ＭＡＬＤＩと似ているが、生化学的親和性標的を使用する。

【0282】

表面増強ニート脱離（略称、ＳＥＮＤ）は、マトリックスが標的表面に共有結合される、改良型のＭＡＬＤＩである。

【0283】

表面支援レーザー脱離／イオン化（略称、ＳＡＬＤＩ）は、液体＋微粒子マトリックスを使用するＭＡＬＤＩと説明することができる。

【0284】

二次イオン質量分析法（略称、ＳＩＭＳ）は、分析物をコーティングした表面に高エネルギーの一次イオンを衝突させて、試料（二次）イオンを生成させることを含む。エネルギー移動により、試料分子が脱離して気相に入り、そこで、イオン／分子反応を受けて二次イオンを形成させる。ひとたび形成されれば、高電圧を印加することによって、試料をその源から抽出および集束レンズへと加速させることができる。液体二次イオン質量分析法（略称、ＬＳＩＭＳ）として知られる、この方法の一般的な変法では、プローブ先端に置く前に、分析物を不揮発性の液体マトリックスに溶解させる。この混合物を一次イオン（通常３５ｋｅＶのＣｓ＋）に衝突させると、マトリックスイオンが形成され、間接的に試料がイオン化される。この点で、ＬＳＩＭＳは、同じくマトリックスを使用する高速原子衝突（略称、ＦＡＢ）として知られるより古い技術とよく似ている。その名が示すように、ＦＡＢイオン化は、イオンビームではなく、高速中性原子（例えば、Ａｒ）のビームを利用するが、ＦＡＢとＬＳＩＭＳにおけるイオン化のメカニズムは同じであり、実際、この２つの用語は混同されることが多い。

【0285】

上記のようなイオン源は、一定期間、溶離剤とともに生じ得るが、この溶離剤は、液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動によって混合物から分離されたものである。

【0286】

断片のアイデンティティーのさらなる確認の役割を果たすために、タンデム質量分析法を用いて、上記の方法を強化することもできる。ＭＳ／ＭＳとしても知られるタンデム質量分析法は、何らかの形態の断片化が段階と段階の間に生じる、複数の質量分析選別工程を含む。核酸分子の配列同定のためのタンデム質量分析法の適用性については、いくつかの総説で調べることができる（Ｌｉｍｂａｃｈ，１９９６；Ｎｏｒｄｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｗｕ ＆ ＭｃＬｕｃｋｅｙ，２００４）。衝突誘導性解離（ＣＩＤ）による気相断片化は、例えば、イオントラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型および三連四重極型の分析器を用いるタンデム質量分析法を用いて行なうことができる（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｂｏｓｃｈｅｎｏｋ ＆ Ｓｈｅｉｌ，１９９６；Ｋａｗａｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９１；Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ，１９９５；Ｍａｒｚｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）。このような未修飾および修飾核酸分子の断片は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ後のポストソース分解と迅速な断片化によって生成させることができる（Ｊｕｈａｓｚ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｓｔｅｍｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｔａｌｂｏ ＆ Ｍａｎｎ，１９９６）。

【0287】

液体クロマトグラフィー−質量分析法（略称、ＬＣ−ＭＳ）は、質量分析計への導入前に非揮発性化合物の複合混合物を分離することを可能にする。これは、高分子量の化合物または熱に対する感受性が高すぎてＧＣでは分析できない化合物に広く用いられている。ＬＣに接続される最も一般的なイオン化方法は、ポジティブイオンモードおよびネガティブイオンモードのＥＳＩおよび大気圧化学イオン化（略称、ＡＰＣＩ）である。ＬＣは、ほとんどの場合、逆相高速液体クロマトグラフィー（略称、ＲＰ−ＨＰＬＣ）で行なわれる。

【0288】

様々な種の修飾核酸分子種を分別するときにも使用され得るフーリエ変換質量分析法（略称、ＦＴＭＳ）の基盤は、電子衝突イオン化、化学イオン化、ＭＡＬＤＩ、およびＥＳＩのような技術によって形成されたイオンを蓄積し、何分間も保存することを可能にするイオントラップ（ペニングセル）である。この間、イオンと中性分子との反応を追跡することができる。この方法は、質量分析の分解能が最も高く、質量の上限が高く、感度が高く、検出が非破壊的で、かつ質量測定の精度が高い。これはフーリエ変換検出を用いるので、シグナルを平均化することや同時に広範な質量を検出することが可能である。

【0289】

質量スペクトルが、質量分析法による核酸分子またはその断片の分析から得られたデータを（グラフまたは暗号化された数値のいずれかで）示すものであることも本発明の範囲内である。質量スペクトルが、分離または分別工程で生成されるパターンの一実施形態であることも本発明の範囲内である。

【0290】

質量スペクトルに関する核酸分子の断片化パターンは、特徴的な分布とシグナルの数（例えば、ピークまたはそのデジタル表示）を指す。一般に、本明細書で使用される断片化パターンは、核酸分子の特異的切断によって生成される１組の断片を指す。このような断片パターンは、分離または分別工程で生成されるパターンの一実施形態である。

【0291】

連続的な骨格切断に依拠する任意の質量分析による配列決定法の有用性は、質量ラダーの形成に依存する。配列情報は、質量スペクトル中の連続するピーク間の質量差を決定することによって得られる。オリゴデオキシヌクレオチドの場合、連続するピーク間の予想される質量差は、ｄＣ＝２８９．０５、ｄＴ＝３０４．０５、ｄＡ＝３１３．０６、およびｄＧ＝３２９．０５（精密質量に基づく値）の損失に対応する。オリゴリボヌクレオチドの場合、質量差は、Ｃ＝３０５．０４、Ｕ＝３０６．０３、Ａ＝３２９．０５、およびｄＧ＝３４５．０５（精密質量に基づく値）である。

【0292】

本明細書で使用するとき、質量分析法に関連する質量シグナルは、特定の質量を有する分子の数または相対数である、出力データを指す。シグナルには、「ピーク」およびそのデジタル表示が含まれる。質量分析計が、試料成分の実際の「分子質量」の代わりに「質量電荷比」（ｍ／ｚ）を測定することは周知である。使用される特定の質量分析計のキャリブレーションは、実験前に行なわれるべきである。多価分子を検出する質量分析計では（例えば、エレクトロスプレーイオン化を用いる場合）、例えば、得られた質量電荷値に分子上の電荷の数を掛けることによって、大雑把な推定質量を決定することができる。実際には、中性分子質量の計算は、デコンボリューションと呼ばれるプロセスを用いるソフトウェアパッケージを適用することによって行なわれる。したがって、質量を検出、決定および／または計算する当該技術分野で公知の方法の各々を、本明細書に提供された方法により包含される質量を得るために使用することができる。

【0293】

本明細書で使用するとき、「デコンボリューションされた質量」は、平均分子質量またはモノアイソトピック精密分子質量のいずれかを指す。精密分子質量の使用は、質量分析器の分解能によって制限される。より大きい分子質量の分子を分析する場合、化合物の同位体パターンを解明することはより難しくなる。このような場合、平均質量を、より大きい分子質量を示す化合物の同定に使用することができる。しかしながら、精密質量を使用する場合、モノアイソトピック質量を適用する必要があるが、それは、これによってＣとＵの識別が可能になるからである。しかしながら、同定されるためには、モノアイソトピック質量が好適な存在量で存在することが確認されなければならない。

【0294】

本明細書で使用するとき、「ピーク」という用語は、質量分析計スペクトル（「質量スペクトル」）のベースラインシグナルから突き出した上向きの突起を指し、これは、断片の質量と強度に対応する。ピークは、手動または自動の「ピーク発見」手順によって質量スペクトルから抽出することができる。

【0295】

本明細書で使用するとき、質量スペクトル中のピークの質量は、「ピーク発見」手順によって計算される質量を指す。

【0296】

本明細書で使用するとき、質量スペクトル中のピークの強度は、「ピーク発見」手順によって計算される強度を指し、これは、限定されるものではないが、質量スペクトル中のピークの高さやそのシグナル・ノイズ比を含むパラメータによって決まる。

【0297】

本明細書で好ましく使用される計算質量は、その分子式により決定される、分子が構成されている個々の元素からの質量寄与を合計することによって決定される分子または断片の理論質量として定義される。計算される質量は、元素の精密質量が使用されるか、それとも平均質量が使用されるかによって、精密質量または分子質量のいずれかとなり得る。例えば、分子式Ｃ３Ｈ６Ｏ２の分子の計算質量は、方程式：（３×１２．０００）＋（６×１．００７８）＋（２×１５．９９４９）から導かれる、７４．０３７ダルトンという計算されたモノアイソトピック精密質量を有するが、天然に最も多く存在する同位体を考慮すると、平均質量は７４．０７９ダルトンである。

【0298】

本明細書で好ましく使用される観測質量は、質量分析計で実験的に見出される質量値である。

【0299】

本明細書で好ましく使用される精密質量は、分子の精密分子質量であり、この場合、各原子の原子質量は、各元素について最も多く見られる同位体のモノアイソトピック形態に基づく。

【0300】

本明細書で好ましく使用される観測される精密質量は、質量分析計を用いて実験的に決定される、分子の精密モノアイソトピック分子質量である。

【0301】

本明細書で好ましく使用される計算される精密質量は、その分子式により決定される、分子が構成されている個々のモノアイソトピック元素からの質量寄与を合計することによって理論的に決定される、分子の精密モノアイソトピック分子質量である。

【0302】

本明細書で好ましく使用される平均分子量は、構造体の平均分子質量であり、この場合、原子質量は、元素の全ての同位体の天然存在度に基づく。

【0303】

本明細書で好ましく使用される観測される平均分子量は、質量分析計を用いて実験的に決定される、分子の平均分子質量である。

【0304】

本明細書で好ましく使用される計算される平均分子量は、その分子式により決定される、分子が構成されている全ての元素の原子質量を用いて理論的に決定される、分子の平均分子質量である。

【0305】

本発明による方法は、特定の核酸分子に関連しても使用し得ることが認識されるであろう。このような特定の核酸分子は、例えば、アプタマー、シュピーゲルマー、アンチセンス分子、リボザイム、デコイオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ分子である。好ましい実施形態では、この種の特定の核酸分子は、治療、診断および／または美容の分野で使用される。

【0306】

一本鎖核酸分子が個別的でかつ安定な３次元構造を形成し、抗体のように標的分子に特異的に結合することができることは本発明の範囲内である。Ｄ−ヌクレオチドから構成されるこのような核酸分子は、アプタマーと呼ばれる。いくつかの標的分子、例えば、小分子、タンパク質、核酸に対するアプタマーや、細胞、組織および生物に対するアプタマーすら同定することができ、これらは、特定の標的分子のインビトロおよび／またはインビボ機能を阻害することができる。アプタマーは、インビトロ選択または指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（略称、ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる標的指向性の選択プロセスによって同定される（Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ，１９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９０；Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ，１９９０）。アプタマーが元来低分子量である結果として、主にヌクレアーゼ分解されたり、腎臓によって体内からクリアランスされるために、修飾されていないアプタマーは、数分から数時間の半減期で血流から速やかに排除される。したがって、アプタマーを治療的に使用するために、それらを糖（例えば、リボース）骨格の２’位で修飾する必要がある（Ｃｌｏａｄ ｅｔ ａｌ，２００６）。

【0307】

アプタマーの不安定性の原因となる遍在するヌクレアーゼは、キラルな構成要素、すなわち、Ｌ−アミノ酸からなる。その結果として、ヌクレアーゼの構造は、そもそも同様にキラルとなり、立体特異的に基質を認識することになる。したがって、これらの酵素は、適切なキラル形状の基質分子のみを受容する。アプタマーや天然の核酸分子はＤ−ヌクレオチドから構成されるので、Ｌ−オリゴヌクレオチドは、酵素による認識やその後の分解から逃れるはずである。同じ原理により、この場合は残念なことであるが、自然は、このような鏡像核酸を増幅する酵素活性を発達させなかった。したがって、Ｌ−核酸アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスを用いて直接得ることができない。しかし、立体化学の原理により、最終的には所望の機能的なＬ−核酸アプタマーにたどり着く迂回路が明らかにされている。

【0308】

インビトロ選択された（Ｄ−）アプタマーがその天然の標的に結合する場合、このアプタマーの構造的鏡像は、同じ特徴をもって、天然の標的の鏡像に結合する。このとき、両方の相互作用パートナーは同じ（非天然の）キラリティーを有する。生命に関する、最も生化学的な化合物のホモキラリティーのために、このようなエナンチオ−ＲＮＡリガンドは、当然、実用が限定されるであろう。他方、ＳＥＬＥＸプロセスが（非天然の）鏡像標的に対して行なわれた場合、この（非天然の）標的を認識するアプタマーが得られるであろう。同じく、該アプタマー−所望のＬ−アプタマー−の対応する鏡像形状は、天然の標的を認識する。生体安定性核酸分子を作製するためのこの鏡像選択プロセスは、１９９６年に最初に発表され（Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｎｏｌｔｅ ｅｔ ａｌ，１９９６）、所与の標的分子に対する高い親和性と特異性だけでなく、生物学的安定性も同時に示す機能的な鏡像核酸分子リガンドを生み出すことになった。一本鎖核酸分子が、「シュピーゲルマー」と呼ばれる（ドイツ語の単語、「シュピーゲル」、鏡に由来する）（Ｅｕｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，２００６）ようなリガンド結合性Ｌ−核酸分子であることは本発明の範囲内である。

【0309】

本明細書に開示されている核酸分子、好ましくは、シュピーゲルマーまたはアプタマーが、好ましくは高分子量部分であるおよび／または好ましくは、とりわけ、動物体内、好ましくはヒト体内での滞留時間に関して核酸分子の特徴を改変することが可能である部分を含むことは本発明の範囲内である。このような修飾の特に好ましい一実施形態は、本明細書で使用される核酸分子のＰＥＧ化およびＨＥＳ化であり、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を表し、ＨＥＳはヒドロキシエチルスターチを表す。本明細書で好ましく使用されるＰＥＧ化は、核酸分子の修飾であり、このような修飾は、核酸分子に付着したＰＥＧ部分からなる。本明細書で好ましく使用されるＨＥＳ化は、核酸分子の修飾であり、このような修飾は、核酸分子に付着したＨＥＳ部分からなる。これらの修飾およびこのような修飾を用いて核酸分子を修飾するプロセスは、欧州特許出願ＥＰ １ ３０６ ３８２号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0310】

好ましくは、高分子量部分からなるかまたは高分子量部分を含む修飾の分子量は、約２，０００〜２５０，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００〜２００，０００Ｄａである。ＰＥＧがこのような高分子量部分である場合、分子量は、好ましくは２０，０００〜１２０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００〜８０，０００Ｄａである。ＨＥＳがこのような高分子量部分である場合、分子量は、好ましくは２０，０００〜２００，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００〜１５０，０００Ｄａである。ＨＥＳ修飾のプロセスは、例えば、ドイツ特許出願ＤＥ １ ２００４ ００６ ２４９．８号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0311】

ＰＥＧおよびＨＥＳのいずれかが、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３号およびＷＯ２００３／０３５６６５号にさらに記載されているような線状形態または分岐状形態のいずれかで使用され得ることは本発明の範囲内である。このような修飾は、原理上、核酸分子に対して任意のその位置で行なうことができる。好ましくは、このような修飾は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチドおよび／または核酸分子の５’ヌクレオチドと３’ヌクレオチドの間の任意のヌクレオチドに対して行なわれる。

【0312】

修飾および好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分は、直接的にまたはリンカーを介して本発明の核酸分子に付着させることができる。本発明による核酸分子が、１以上の修飾、好ましくは１以上のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含むことも本発明の範囲内である。一実施形態では、個々のリンカー分子は、２以上のＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を本発明による核酸分子に付着させる。本発明に関連して使用されるリンカーは、それ自体、線状または分岐状のいずれかであることができる。この種のリンカーは当業者に公知であり、特許出願ＷＯ２００５０７４９９３号およびＷＯ２００３０３５６６５号にさらに記載されている。

【0313】

好ましい一実施形態では、リンカーは生体分解性リンカーである。生体分解性リンカーは、本発明による核酸から修飾を放出するので、とりわけ、動物体内、好ましくはヒト体内での滞留時間に関して、本発明による核酸の特徴を改変することを可能にする。生体分解性リンカーの使用は、本発明による核酸の滞留時間のより良好な制御を可能にし得る。このような生体分解性リンカーの好ましい一実施形態は、限定されるものではないが、国際特許出願ＷＯ２００６／０５２７９０号、ＷＯ２００８／０３４１２２号、ＷＯ２００４／０９２１９１号およびＷＯ２００５／０９９７６８号に記載されているような生体分解性リンカーであり、国際特許出願ＷＯ２００４／０９２１９１号およびＷＯ２００５／０９９７６８号では、リンカーは、本明細書に記載の１つまたは２つの修飾と核酸分子とその間の生体分解性リンカーとからなるポリマー状のオリゴヌクレオチドプロドラッグの一部である。

【0314】

核酸分子の修飾は生体分解性修飾であり、生体分解性修飾は、直接的にまたはリンカーを介して本発明の核酸分子に付着させることができることは本発明の範囲内である。生体分解性修飾は、核酸分子から修飾を放出するので、とりわけ、動物体内、好ましくはヒト体内での滞留時間に関して、核酸分子の特徴を改変することを可能にする。生体分解性修飾の使用は、核酸分子の滞留時間のより良好な制御を可能にし得る。このような生体分解性修飾の好ましい一実施形態は、限定されるものではないが、国際特許出願ＷＯ２００２／０６５９６３号、ＷＯ２００３／０７０８２３号、ＷＯ２００４／１１３３９４号およびＷＯ２０００／４１６４７号に記載されているような生体分解性のものである。

【0315】

本明細書で使用される「生体分解性」という用語は、生物学的システムにおける分解、例えば、酵素的分解または化学的分解を指す。

【0316】

上記の修飾に加えて、他の修飾を用いて、本発明による核酸の特徴を改変することができ、このような修飾は、タンパク質、コレステロールなどの脂質およびアミラーゼ、デキストランなどの糖鎖の群から選択される。

【0317】

アンチセンス核酸分子もまた、一本鎖核酸分子である。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡ鎖に特異的に結合し、それにより、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの遺伝子産物への転写が阻止される。さらに、ｍＲＮＡは、ＲＮアーゼＨ消化によって分解される（Ｓｃｈｅｒｅｒ ＆ Ｒｏｓｓｉ，２００３）。アンチセンス核酸分子は、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびそれらの組合せのようなＤ−核酸分子から構成される。

【0318】

リボザイムは、化学的反応を触媒する一本鎖Ｄ−核酸分子である。多くの天然リボザイムは、それ自身の切断または他のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの切断を触媒する。リボザイムは、ｍＲＮＡ鎖に結合し、それを特異的に切断する。こうした標的特異的ｍＲＮＡ分子の切断または分解によって、標的分子の発現が無効にされる（Ｕｓｍａｎ ＆ Ｂｌａｔｔ，２０００）。

【0319】

遺伝子発現の変化が正常発生や疾患病因のより良く理解された構成要素になるにつれて、転写因子や他の遺伝子発現の調節因子は、潜在的な治療的介入のますます魅力的な標的となってきた。転写因子は、通常、遺伝子調節において重要な役割を果たし、遺伝子発現に正または負のいずれかの効果を及ぼすことができる核タンパク質である。これらの調節タンパク質は、その標的遺伝子のプロモーター領域に見られる特異的配列に結合する。これらの結合配列は、通常、長さ６〜１０塩基対であり、複数反復して見られることもある。転写因子は、周囲のゲノムＤＮＡがなくても、その比較的短い結合配列を認識することができるので、コンセンサス結合部位を担持する短い放射性標識オリゴデオキシヌクレオチド（略称、ＯＤＮ）は、核抽出物中の転写因子結合活性を同定および定量する電気泳動移動度シフトアッセイにおいてプローブとしての役割を果たすことができる。最近では、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を担持するＯＤＮは、生きた細胞で遺伝子発現を操作するためのツールとして検証されている。この戦略は、後に標的因子により認識および結合されるこのような「デコイ」ＯＤＮの細胞内送達を含む。デコイが転写因子のＤＮＡ結合部位を占めることで、タンパク質はその後、標的遺伝子のプロモーター領域に結合することができなくなる（Ｍａｎｎ ＆ Ｄｚａｕ，２０００）。遺伝子発現の治療的操作へのデコイＯＤＮの使用は、１９９５年に、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａらによって最初に記載された（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ，１９９５）。彼らは、Ｅ２Ｆファミリーの転写因子のコンセンサス結合部位を担持するＯＤＮによるバルーン障害時のラット頸動脈の処置を報告し、Ｅ２Ｆ−１に特異的なデコイによってこの上方調節が抑制され、障害血管における平滑筋増殖と新生内膜過形成が阻止されることを発見した（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ，１９９５）。この初期のインビボ適用に加えて、転写因子デコイが、マウス顎下腺においてレニン遺伝子のプロモーター内の負の調節エレメントを遮断するために使用され、デコイが、インビボでの遺伝子活性の増大および抑制に使用することができることが示された（Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ，１９９９）。

【0320】

主にサイズが異なる、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子またはＲＮＡｉ分子の基本的なデザインは、基本的には、核酸分子が二本鎖構造を含むようにするということである。二本鎖構造は、第１の鎖と第２の鎖を含む。より好ましくは、第１の鎖は、第１の連続するヌクレオチドのストレッチを含み、第２の鎖は、第２の連続するヌクレオチドのストレッチを含む。少なくとも第１のストレッチと第２のストレッチは、互いに本質的に相補的である。このような相補性は、通常、ワトソン−クリック塩基対合または限定されるものではないが、フーグスティーン塩基対合や他の塩基対合を含む、当業者に公知の他の塩基対合メカニズムに基づく。このような二本鎖構造の長さによっては、塩基相補性に関する完全一致が必ずしも必要とされないことが当業者に認識されるであろう。しかしながら、このような完全な相補性は、いくつかの実施形態では好ましい。主に、二本鎖構造が、ＲＮＡ干渉メカニズムを誘発するためになおも好適であり、かつ好ましくはこのような二本鎖構造が、それぞれ、このような細胞、組織および器官を含有するまたは原理上は含有する細胞、組織および生物で見られる生理的条件下でなおも安定に形成される条件では、ミスマッチも許容される。より好ましくは、二本鎖構造は、生理的緩衝液中、３７℃で安定である。

【0321】

第１のストレッチは、通常、少なくとも部分的に標的核酸に相補的であり、第２のストレッチは、特に、塩基相補性に関して、それぞれ第１のストレッチと第２のストレッチの関係を所与として、少なくとも部分的に標的核酸と同一である。標的核酸は、好ましくはｍＲＮＡであるが、ｈｎＲＮＡなどの他の形態のＲＮＡもこのような目的に好適である。このようなｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子およびＲＮＡｉ分子は、それぞれ、標的分子のｍＲＮＡのノックダウンをもたらすＲＮＡ干渉応答を誘発するのに好適である。その限りにおいて、この種の核酸分子は、ｍＲＮＡのレベルで発現を減少させることにより標的分子の発現を減少させるのに好適である。

【0322】

ＲＮＡ干渉は、それぞれ、数十個および時には数百個のヌクレオチドおよびヌクレオチド対さえも含む長い核酸分子を使用したときに見られるが、より短いｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子およびＲＮＡｉ分子が通常好ましい。第１のストレッチおよび／または第２のストレッチの長さのより好ましい範囲は、約１５〜２９個の連続するヌクレオチド、好ましくは１９〜２５個の連続するヌクレオチドおよびより好ましくは１９〜２３個の連続するヌクレオチドである。より好ましくは、第１のストレッチと第２のストレッチの両方の長さは同じである。さらなる実施形態では、二本鎖構造は、好ましくは１５〜２９個、好ましくは１８〜２５個、より好ましくは１９〜２３個および最も好ましくは１９〜２１個の塩基対を含む。

【0323】

ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子およびＲＮＡｉを仲介する他の核酸の特定のデザインは、それぞれ、現在および将来のデザイン原理によって変り得ることが当業者に認識されるであろう。現在のところ、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子およびＲＮＡｉを仲介する他の核酸のいくつかのデザイン原理が、それぞれ存在する。ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子およびＲＮＡｉを仲介する他の核酸のデザイン原理は、国際特許出願ＷＯ／２００８／０５２７７４号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0324】

ｓｉＲＮＡのこれらの様々なデザインとは無関係に、その起源または機能によって、３つのタイプの天然の小ＲＮＡ、すなわち、短干渉ＲＮＡ（略称、ｓｉＲＮＡ）、反復関連短干渉ＲＮＡ（略称、ｒａｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（略称、ｍｉＲＮＡ）が記載されていることが当業者に認識されるであろう。本来、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡを鋳型にしたＲＮＡポリメライゼーション（例えば、ウイルスによるもの）によるか、または重なり合う転写物のハイブリダイゼーション（例えば、トランスジーン配列またはトランスポゾンなどの反復配列によるもの）によって生成され得る。このようなｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはｒａｓｉＲＮＡを生じさせ、通常、これによって、ｍＲＮＡ分解および／またはクロマチン修飾が導かれる。さらに、相補的またはほとんど相補的な２０〜５０塩基対の逆向き反復を含有する内在性転写物は、それ自身に折り重なって、ｄｓＲＮＡヘアピンを形成させる。これらのｄｓＲＮＡは、翻訳の抑制を仲介するｍｉＲＮＡへとプロセッシングされるが、それらはｍＲＮＡ分解も導き得る。最後に、長いｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの人為的導入は、培養細胞と生きた生物の両方において、遺伝子発現を不活性化するためのツールとして採用されている（Ｍｅｉｓｔｅｒ ＆ Ｔｕｓｃｈｌ，２００４）。

【0325】

好ましく使用されるとき、質量識別という用語は、未修飾または非修飾核酸分子断片からの修飾核酸分子断片の分離が、修飾核酸分子断片と未修飾核酸断片の両方の間の質量の差に基づき、かつこのような差に対して行なわれることを意味する。

【0326】

好ましく使用されるとき、サイズ識別という用語は、未修飾または非修飾核酸分子断片からの修飾核酸分子断片の分離が、修飾核酸分子断片と未修飾核酸断片の両方の間のサイズの差に基づき、かつこのような差に対して行なわれることを意味する。

【0327】

好ましく使用されるとき、疎水性識別という用語は、未修飾または非修飾核酸分子断片からの修飾核酸分子断片の分離が、修飾核酸分子断片と未修飾核酸断片の両方の間の疎水性の差に基づき、かつこのような差に対して行なわれることを意味する。

【0328】

好ましく使用されるとき、電荷識別という用語は、未修飾または非修飾核酸分子断片からの修飾核酸分子断片の分離が、修飾核酸分子断片と未修飾核酸断片の両方の間の電荷の差に基づき、かつこのこのような差に対して行なわれることを意味する。

【0329】

好ましく使用されるとき、イオン識別という用語は、未修飾または非修飾核酸分子断片からの修飾核酸分子断片の分離が、修飾核酸分子断片と未修飾核酸断片の両方の間のイオン強度の差に基づき、かつこのような差に対して行なわれることを意味する。

【0330】

好ましく使用されるとき、水素結合識別という用語は、未修飾または非修飾核酸分子断片からの修飾核酸分子断片の分離が、修飾核酸分子断片と未修飾核酸断片の両方の間の水素結合の差、好ましくはこのような水素結合の程度の差に基づき、かつこのような水素結合の差や水素結合の程度の差に対して行なわれることを意味する。

【0331】

好ましく使用されるとき、質量識別という用語は、未修飾または非修飾核酸分子断片からの修飾核酸分子断片の分離が、修飾核酸分子断片と未修飾核酸断片の両方の間の質量の差に基づき、かつこの質量の差に対して行なわれることを意味する。

【0332】

この種の特定の核酸分子が、治療、診断および／または美容の分野で使用されるという事実に関して、本発明による方法は、核酸分子のヌクレオチド配列の決定だけでなく、この種の特定の核酸分子の１つまたはいくつかを含有する調製物の品質管理にも使用され得る。その限りにおいて、本発明は、本発明による核酸分子のヌクレオチド配列を決定する工程を含む品質管理の方法に関するものでもあり、このような核酸分子は、調製物または試料に含まれ、この調製物または試料は、それぞれ、前の工程で提供される。

【0333】

そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子が必ずしも全長核酸分子である必要はないことは本発明の範囲内である。それどころか、このような全長核酸分子の１つまたはいくつかの部分だけが、本発明による方法によってそのヌクレオチド配列が決定される核酸分子として使用されるだけで十分な場合がある。

【0334】

本発明の方法が、核酸分子のフィンガープリントを決定するための方法であることも本発明の範囲内である。本明細書で好ましく使用される核酸分子のフィンガープリントは、核酸分子の断片の特徴的なパターンである。言い換えれば、核酸分子またはそのフィンガープリントを同定するために、正確なヌクレオチド配列を知ることが必要なのではなく、このような特徴的パターンを知ることが必要なこともある。このような特徴的パターンは、好ましい一実施形態では、それぞれ、修飾核酸分子断片が分別および分離される本発明による方法の工程で得られるパターンである。核酸分子のフィンガープリントを同定または決定するためのこのような方法が、別の形で、本発明によるヌクレオチド配列を決定するための方法と同じ工程を含むことも認識されるべきである。

【0335】

様々な配列番号、本明細書で使用される核酸分子の化学的性質、その実際の配列および内部参照番号を以下の表にまとめる。
表１（Ａ）本出願で参照されるオリゴヌクレオチド配列

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【化2】

上記は、本発明に関連して使用された分子に相当するものであることが理解されるであろう。添付の配列表は、その単なるヌクレオチド配列を反映するものであって、上記の表に示すような該分子のさらなる特徴を何ら反映するものではない。

【0336】

さらなる特徴、実施形態および利点を得ることのできる図面、実施例および配列表により、本発明をさらに説明する。

【図面の簡単な説明】

【0337】

【図1】この図は、ＲＮＡ分子をヒドラジン、次いで酢酸／アニリンで連続的に処理することによって生じる切断産物を表したものである。Ｅｈｒｅｓｍａｎｎらによって提唱されているように、ウリジン部分は、リン酸骨格を切断し、ウリジン位置で５’リン酸付加型３’断片とアニリン誘導性シッフ塩基を有する５’断片とを生じさせる修飾を受けやすい（「修飾ウリジン」、略称、Ｕｍｏｄ）（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，１９８７）。

【図2】Ａ：ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）をヒドラジン、次いで酢酸／アニリンで連続的に処理することによって生成させることができる全てのあり得る３’末端断片（配列番号４〜１０）を示す。矢印は、標準的なＭＳ／ＭＳ配列決定技術を用いて通常得ることができる配列情報（１０〜１５ヌクレオ塩基）を示す。断片が短くなるにつれて、断片全体の配列を決定する能力が増す。Ｂ．ヒドラジン処理が注意深く制御されない場合、親分子の完全な切断が起こる。これらの断片は、断片間の関係性が壊されるので、配列決定に用いることができない。

【図3A】この図は、インタクトの核酸分子のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）のトータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）を示す。

【図3B】この図は、図３Ａ中の４．２分のメインピークの質量スペクトルから得られるインタクトの核酸分子のシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）のデコンボリューションされた質量を示す。この質量は、配列番号２の質量と一致する。

【図4】この図は、逆相ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーによって認識される、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体の明確に規定された断片を示す。

【図5】この図は、断片５（観測可能な精密質量＝７４９４．０３Ｄａ）、断片６（観測可能な平均分子質量＝９７３８．８３Ｄａ）およびインタクトの核酸分子のＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２、観測可能な平均分子質量＝１２９９５．８４Ｄａ）について示された個々のピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図6】ヒドラジン−アニリン／酢酸処理（実施例２）により生成された核酸分子ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の断片を示す表を示し、この表は、断片を同定するためのＴＩＣ（図４および５）からの配列、計算質量および観測質量を含む。

【図7】核酸分子および選択されたその断片の固定を伴う核酸分子の配列決定を示す。この核酸分子および選択された断片は、親和性標識またはタグを有する。核酸分子は、親和性標識もしくはタグを付加するのに使用される選択的反応性官能基（Ｉ）を有するか、または一般的な標識／タグ化核酸構造で示されるような親和性標識（ＩＩ）を既に有しているかのいずれかである。標識核酸分子ＩＩは、化学的切断による限定的なランダム切断を受けて、ランダム鎖切断物＋未切断全長材料に相当する断片の混合物を生じさせる。その後、標識断片を、この例では、相互作用パートナーとの相互作用を通じて固体支持体上に固定し、非標識断片を洗い流す。その後、標識断片を固体支持体から放出させ、ＬＣＭＳまたは他の適切な技術によって分析することができる。

【図8】この図は、核酸分子の固定を伴う核酸分子の配列決定の例のスキームを示す。核酸分子は、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１）の５’−アミノ修飾誘導体である、核酸分子シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）である。ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の５’−アミノ部分をビオチン親和性タグで修飾した後、塩基性溶液を用いて、ビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号６３）を化学的にランダムに切断した。切断が最後まで進まないように、切断を注意深く制御した。ビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号６４）の５’断片、３’断片およびランダムな内部断片を生じさせるランダムな断片化が起こることより、ＮＯＸ−Ｅ３６中間体の全てのビオチン化５’断片と残りのビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号６３）（すなわち、全長産物［略称、ＦＬＰ］）が固定用のタグ特異的な固体支持体（この場合、ニュートロアビジンビーズ）を用いて、親和性タグ（この場合、ビオチン）によって混合物から選択的に抜き出された。結合していない断片、すなわち、親和性タグを有さない３’断片およびランダムな内部断片を洗い流すことができ、その後、ビオチン部分と核酸を接続するリンカー内のジスルフィド結合を還元的に切断することにより、結合した５’断片をビーズから遊離させる。これらの断片は、全てのリボヌクレオシド位置間の鎖切断物に対応する。このスキーム中の５’断片は、式“Ｒ”−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｇ（Ｘ）_ｙｃｐを用いて網羅されており、式中、“Ｒ”は、構造に描かれている切断可能なビオチン親和性タグまたは切断された断片であり、太字および下線付きの文字は、それぞれ、核酸配列を表し、Ｘは、この配列の５’から３’へと読み取られた特定のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のアイデンティティーを示し、ｙは、何個の追加のヌクレオチドが第１の断片よりも多く断片中に存在するかを示す。例えば、断片２は、ｙ＝１（１個の追加のヌクレオチド）である。第１の断片よりも多い追加のヌクレオチドＸは１個（Ｃ）であり、それゆえ、断片の断片２は、“Ｒ”−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）−ＧＣｃｐである。同様に、断片１５は、ｙ＝１４であり、それゆえ、第１の断片を上回る追加のヌクレオチドＸは１４個（ＣＡＣＧＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧ）であり、それゆえ、断片１５のアイデンティティーは、“Ｒ”−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）−ＧＣＡＣＧＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧｃｐである。放出された５’断片をさらに表したものが図１３に見られる。

【図9】この図は、ビオチン化反応に使用された粗ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の陰イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図10】この図は、６０分の反応時間後の粗ビオチン化反応物の陰イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図11】この図は、ビオチン標識ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号６３）が実施例３に示すプロトコルの工程３．３．２〜３．３．５に供された後、ＬＣＭＳ実験から得られたトータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）を示す。

【図12】この図は、断片（質量ピーク値＝１０２３７．１８９７ Ｄａ）、この場合、断片３１（図１３Ｄ、［配列番号４１］）のデコンボリューションされた分子量の例を示す。２’，３’−環状リン酸が加水分解された断片２９（図１３Ｃ、配列番号３９）の少量のデコンボリューションされた分子量（質量ピーク値＝９６０３．７７）を検出することもできる。

【図13A】この図は、放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体、配列番号５０の全ての予想される５’断片（配列番号１１〜５０）を示す。この表は、既知分子の配列確認のために観測質量値を比較するために使用することができる。

【図13B】この図は、放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体、配列番号５０の全ての予想される５’断片（配列番号１１〜５０）を示す。この表は、既知分子の配列確認のために観測質量値を比較するために使用することができる。

【図13C】この図は、放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体、配列番号５０の全ての予想される５’断片（配列番号１１〜５０）を示す。この表は、既知分子の配列確認のために観測質量値を比較するために使用することができる。

【図13D】この図は、放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体、配列番号５０の全ての予想される５’断片（配列番号１１〜５０）を示す。この表は、既知分子の配列確認のために観測質量値を比較するために使用することができる。

【図13E】この図は、放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体、配列番号５０の全ての予想される５’断片（配列番号１１〜５０）を示す。この表は、既知分子の配列確認のために観測質量値を比較するために使用することができる。

【図14A】この図は、ＴＩＣから得られたデコンボリューションされた観測可能な質量、およびこれらの質量が観測された保持時間が記載された配列確認表を示す。図１３Ａ〜Ｅに示される各々の予想される断片の精密質量または分子量が含まれ、これらの断片が同定されている。

【図14B】この図は、ＴＩＣから得られたデコンボリューションされた観測可能な質量、およびこれらの質量が観測された保持時間が記載された配列確認表を示す。図１３Ａ〜Ｅに示される各々の予想される断片の精密質量または分子量が含まれ、これらの断片が同定されている。

【図15】この図は、図１１の注釈付きのバージョンを示す。同定された環状リン酸断片および放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体のピークが示されている。各々の断片について、対応する２’，３’−環状リン酸が対応する２’（３’）リン酸誘導体よりもたくさんあるので、クロマトグラムが大いに単純化され、同定や配列決定がより簡単にできる。

【図16】配列決定／確認のフローチャートを示す。このフローチャートは、配列に関する予備知識を持たない配列同定に使用することができる。

【図17】この図は、ＮＯＸ−Ｅ３６ミスマッチ対照０１（配列番号３）が実施例３に示すプロトコルの工程３．３．１〜３．３．５に供された後、ＬＣＭＳから得られたトータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）を示す。

【図18A】この図は、配列決定表を示す。図１６に示されるフローチャートは、図１７のＴＩＣから得られる観測質量に適用される。親配列のＮＯＸ−Ｅ３６と比較して、交換されたＣ／Ｕ対を強調した。

【図18B】この図は、配列決定表を示す。図１６に示されるフローチャートは、図１７のＴＩＣから得られる観測質量に適用される。親配列のＮＯＸ−Ｅ３６と比較して、交換されたＣ／Ｕ対を強調した。

【図18C】この図は、配列決定表を示す。図１６に示されるフローチャートは、図１７のＴＩＣから得られる観測質量に適用される。親配列のＮＯＸ−Ｅ３６と比較して、交換されたＣ／Ｕ対を強調した。

【図19A】この図は、塩基を介する限定的なランダム切断後のＦＩＴＣ標識ＮＯＸ−Ｅ３６中間体のＬＣＭＳを示す。標識は、４９５ｎｍで選択的な波長吸光度を有する。図１９Ａには、４９５ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラムが示されている。図１９Ｂには、２６０ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラムが示されている。図１９Ｃには、トータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）が示されている。

【図19B】この図は、塩基を介する限定的なランダム切断後のＦＩＴＣ標識ＮＯＸ−Ｅ３６中間体のＬＣＭＳを示す。標識は、４９５ｎｍで選択的な波長吸光度を有する。図１９Ａには、４９５ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラムが示されている。図１９Ｂには、２６０ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラムが示されている。図１９Ｃには、トータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）が示されている。

【図19C】この図は、塩基を介する限定的なランダム切断後のＦＩＴＣ標識ＮＯＸ−Ｅ３６中間体のＬＣＭＳを示す。標識は、４９５ｎｍで選択的な波長吸光度を有する。図１９Ａには、４９５ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラムが示されている。図１９Ｂには、２６０ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラムが示されている。図１９Ｃには、トータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）が示されている。

【図20】Ａは、図１９Ｂの拡大を示す。Ｂは、図１９Ａの拡大を示す。

【図21】Ａは、それぞれ、６．３１分および７．１３分に見られるＡ：断片１（配列番号５１、図２３Ａ）、およびＢ：断片２（配列番号５２、図２３Ａ）のデコンボリューションされた精密質量を示す。Ｂは、それぞれ、６．３１分および７．１３分に見られるＡ：断片１（配列番号５１、図２３Ａ）、およびＢ：断片２（配列番号５２、図２３Ａ）のデコンボリューションされた精密質量を示す。

【図22A】この図は、それぞれ、５．５４分（４１０６．５５Ｄａ）、６．５３分（４４５１．６０Ｄａ）、７．７７分（４７８０．６４Ｄａ）に見られる非標識断片のデコンボリューションされた精密質量を示す。

【図22B】この図は、それぞれ、５．５４分（４１０６．５５Ｄａ）、６．５３分（４４５１．６０Ｄａ）、７．７７分（４７８０．６４Ｄａ）に見られる非標識断片のデコンボリューションされた精密質量を示す。

【図22C】この図は、それぞれ、５．５４分（４１０６．５５Ｄａ）、６．５３分（４４５１．６０Ｄａ）、７．７７分（４７８０．６４Ｄａ）に見られる非標識断片のデコンボリューションされた精密質量を示す。

【図25】図２５Ａ−Ｃは、図１９Ａ〜Ｃ（１６．６〜１８．５分）の拡大を示し、ＦＩＴＣ標識とＦＩＴＣ非標識断片の共溶出を示している。Ａ：ＦＩＴＣ標識核酸断片を示す４９５ｎｍにおける抽出された波長クロマトグラム。Ｂ：全ての核酸断片（標識および非標識）を示す２６０ｎｍにおける抽出された波長クロマトグラム。Ｃ：試料材料中の全てのイオンを示すＴＩＣ。２５Ａで決定されるような、標識断片のマークした部分（破線を参照）に、他の種が存在し（図２５Ｂ）、それがイオンを産生する（図２５Ｃ）ことがはっきりと分かる。

【図26】この図は、図２５中の破線と破線の間の部分の未加工の質量スペクトルを示す。

【図27】この図は、対応する未加工の質量スペクトル（図２６）のデコンボリューションされた平均質量スペクトルを示す。矢印付きのピークは、標識断片（４６６６．２１Ｄａ、断片１３、図２３、配列番号７３）である。他の質量は、配列決定ラダーの漸進的増加により予想されるものよりも著しく値が高い（７６９３．２６、９３３５．４８、９６６４．９０Ｄａ）ので、無視することができる。

【図23A】この図は、（図１３の表と似た）ＦＩＴＣ標識断片（配列番号５１〜５５、６６〜１００）の配列確認用の例示的な表を示す。

【図23B】この図は、（図１３の表と似た）ＦＩＴＣ標識断片（配列番号５１〜５５、６６〜１００）の配列確認用の例示的な表を示す。

【図24】この図は、（図１６のフローチャートと似た）ＦＩＴＣ標識ＲＮＡ分子の配列決定用の例示的なフローチャートを示す。

【図28A】ＴＩＣから得られたデコンボリューションされた精密質量または分子量質量および（４９５ｎｍの抽出された波クロマトグラムから得られる）これらの質量が観測された保持時間が記載された配列決定表を示す。図２４に示すフローチャートを用い、観測質量を用いて配列を決定する。

【図28B】ＴＩＣから得られたデコンボリューションされた精密質量または分子量質量および（４９５ｎｍの抽出された波クロマトグラムから得られる）これらの質量が観測された保持時間が記載された配列決定表を示す。図２４に示すフローチャートを用い、観測質量を用いて配列を決定する。

【図28C】ＴＩＣから得られたデコンボリューションされた精密質量または分子量質量および（４９５ｎｍの抽出された波クロマトグラムから得られる）これらの質量が観測された保持時間が記載された配列決定表を示す。図２４に示すフローチャートを用い、観測質量を用いて配列を決定する。

【図29】この図は、ビオチン化反応に使用された粗ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）の陰イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ショートマーの存在は、工程５．３．１〜５．３．５を実施する能力やＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）の配列を決定する能力に影響を及ぼさない。

【図30】この図は、６０分の反応および脱塩後のビオチン化反応物の陰イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図31】この図は、ビオチン標識ＮＯＸ−Ａ１２中間体が工程５．３．２〜５．３．５に供された後のＬＣＭＳからのトータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）を示す。

【図32】この図は、断片（質量ピーク値＝１０９１０．６５Ｄａ）、この場合、断片３３（図３３Ｃおよび３４Ａ、［配列番号１３３］）のデコンボリューションされた分子量の例を示す。

【図33A】この図は、ＴＩＣから得られたデコンボリューションされた精密質量または分子量質量およびこれらの質量が観測された保持時間が記載された配列決定表を示す。図１６に示すフローチャートを用い、観測質量を用いて配列を決定する。提案される断片アイデンティティーの予想質量に関する誤差を示す絶対誤差が含まれる。

【図33B】この図は、ＴＩＣから得られたデコンボリューションされた精密質量または分子量質量およびこれらの質量が観測された保持時間が記載された配列決定表を示す。図１６に示すフローチャートを用い、観測質量を用いて配列を決定する。提案される断片アイデンティティーの予想質量に関する誤差を示す絶対誤差が含まれる。

【図33C】この図は、ＴＩＣから得られたデコンボリューションされた精密質量または分子量質量およびこれらの質量が観測された保持時間が記載された配列決定表を示す。図１６に示すフローチャートを用い、観測質量を用いて配列を決定する。提案される断片アイデンティティーの予想質量に関する誤差を示す絶対誤差が含まれる。

【図34A】この図は、ＮＯＸＡ１２の配列確認表を示す。放出されるアシル化ＮＯＸ−Ａ１２中間体、配列番号１４５の全ての予想される５’断片（配列番号１０１〜１４５）が記載されている。この表は、配列が既知の核酸分子の配列確認のために観測質量値と比較するために使用することができる。

【図34B】この図は、ＮＯＸＡ１２の配列確認表を示す。放出されるアシル化ＮＯＸ−Ａ１２中間体、配列番号１４５の全ての予想される５’断片（配列番号１０１〜１４５）が記載されている。この表は、配列が既知の核酸分子の配列確認のために観測質量値と比較するために使用することができる。

【図35】この図は、図３１の注釈付きのバージョンを示す。同定された環状リン酸断片および放出されるアシル化ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号１４５）のピークがその対応する断片番号に割り当てられている。

【0338】

図面を参照しながら、実施例３、４および５により詳細に記載される２つの特に好ましい実施形態を以下の節で説明する。

【0339】

本明細書および実施例３（シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６）および実施例５（ＮＯＸ−Ａ１２）でより詳細に概説されるように、ただし、以下では、実施例３に対してのみ言及するものであるが、質量分析法で核酸分子の配列を決定する方法であって、核酸および選択される断片が配列決定のプロセスを用いて固定される方法が提供される。本発明によれば、第１の工程で、核酸分子およびその断片の固定に使用することができる親和性標識またはタグなどの修飾（図７、Ｉ）が核酸分子に与えられる。第２の工程は、（原理的には図７に示すような）ランダムな鎖切断物に相当する断片と未切断の全長材料の混合物を生成させるための化学的切断による核酸分子の限定的なランダム切断である。このランダムな混合物から、固体支持体に結合しているか、カラム中にあるか、チップ上にあるか、またはビーズフォーマットの、親和性標識またはタグを手段として用いて、標識を含有する未切断の全長材料の断片と分子を混合物から抜き出す。標識を含有しない他の断片は洗い流される。第３の工程で、固定された断片を固相からの切断または溶出によって放出させ、ＬＣＭＳ、直接注入ＭＳまたはＭＡＬＤＩおよび本明細書に記載の他のＭＳ法により分析される断片を提供する。結果は、核酸分子の全てのヌクレオチドの３’での切断物に相当する全てのあり得る断片を表す質量ラダーである。修飾が５’末端に付加されているならば、得られる質量ラダーは５’断片のみからなるであろうし、同様に修飾が３’末端付加されているならば、得られる質量ラダーは３’ 断片のみからなるであろう。該質量ラダーは、実際に、ひと並びの５’断片または３’断片から形成されるかまたは生じている。

【0340】

この方法を試験するために、４０ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）を用いた（実施例１に従って合成した）。ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）は、ＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１）の５’−アミノ修飾誘導体である。ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の５’−アミノ部分をビオチン親和性タグで修飾した後、塩基性溶液を用いて、ビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号６３）を化学的にランダムに切断した（反応スキームは図８に示す）。切断が最後まで進まないように、切断を注意深く制御した。ランダムな断片化が起こることより、ビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号６３）の５’断片、３’断片およびランダムな内部断片が生成された。全てのビオチン化５’断片（図８、シリーズ１）と残りのビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号６３）を、固定用のタグ特異的な固体支持体を用いて、親和性タグ（この場合、ビオチン）によって混合物から選択的に抜き出した。結合していない断片、すなわち、親和性タグを有さない３’断片およびランダムな内部断片を洗い流す。その後、ビオチン部分とＮＯＸ−Ｅ３６中間体を接続するリンカー内のジスルフィド結合を還元的に切断することにより、結合した５’断片および全長分子をビーズから遊離させる。これらの放出された断片は、全てのリボヌクレオシド位置間の鎖切断物に対応する（図８および１３参照）。鎖切断は、２’，３’−環状リン酸を含有する断片をまず形成させ、この環状リン酸は、２’（３’）リン酸にゆっくりと加水分解される。その後、遊離した断片をＬＣ−（ＥＳＩ）ＭＳにより分析し、トータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）を分析した。試料クロマトグラムは、図１１に示すように、生成された全ての５’−断片とインタクトの放出されたアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号５０）に対応する個別のピークを示す。その後、各々の個別のピークに関する得られた質量スペクトルのデコンボリューションによって、個別のピークに含まれる質量を得た。その後、この質量情報を用いて、親オリゴヌクレオチドと呼ばれることもある親核酸配列の配列を決定することができる。

【0341】

通常、見られる質量は、２’，３’−環状リン酸の質量であるが、場合によっては、加水分解された２’（３’）リン酸を含有する少量の断片を検出することもでき、これらの断片は、生成された断片のアイデンティティーをさらに確認するのに役立つ。通常、記載された分析パラメータ（実施例３）を用いると、これらの加水分解断片は、親２’，３’−環状リン酸よりも後に溶出される。

【0342】

まず第１に、生成された断片の質量を、放出されたＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号５０）の計算された５’断片の予想質量と比較して、配列を確認することができる。あるいは、生成された断片間の違いによって、配列に関する予備知識を持たずに、配列を得ることができる。このシナリオでは、修飾（ＨＳ−（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（ＣＨ_２）_６−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）−）が既知であるので、核酸分子の第１の断片を容易に予測することができ、それゆえ、この断片については、限られた個別の質量値しかあり得ない（例えば、未修飾のＤ−またはＬ−ＲＮＡの場合、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕを表す４つ）。次に、図１６および実施例３の「配列決定／確認用のフローチャート」に示すように、後で得られる断片の増分差を用いて、核酸分子の配列を決定することができる。断片１が同定されれば、計算された精密質量および分子量を用いて、次の断片の断片２が同定される。次の断片の断片２のアイデンティティー、したがって、その配列は、断片２と断片１の計算された精密質量または分子量との質量差から得られる。質量差は、（図１６に示すように）各ヌクレオシドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕに固有である。断片２が同定されれば、計算された精密質量および分子量を用いて、次の断片の断片３が同定される。断片２を同定するために使用したものと同一の手順で、断片３のアイデンティティーが、断片３と断片２の計算された精密質量または分子量との質量差から得られる。この反復プロセスを用いて、全ての５’断片を同定する。前の断片の計算された質量値を使用する必要性は、観測値のみを使用したときに生じ得る潜在的蓄積誤差に起因する。例えば、０．３Ｄａの誤差であれば、断片の一義的な同定がなおも可能であろうが、この誤差をリセットしなければ、同定された断片の計算値を用いることで、さらに０．３Ｄａの誤差が蓄積し、ＣヌクレオシドとＵヌクレオシドの質量差がわずか１Ｄａであるために、一義的な同定ができない可能性がある。

【0343】

最後のヌクレオシドを同定するために、同じプロセスを用い、このプロセスでは、インタクトの放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号５０）と最後の環状リン酸を含有する断片の計算質量の間の質量差を用いて、最後のヌクレオチドのアイデンティティーを確認する。放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体は２’，３’環状リン酸を有さないので、質量差は、前に計算された断片についてのものと同じではない。質量差は、最後のヌクレオシドの質量に対応する。

【0344】

この方法の能力を示す試験として、２カ所でシトシンとウリジンの配置が入れ替えられていることを除けば、ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）と配列が同一である、ＮＯＸ−Ｅ３６ミスマッチ対照０１（配列番号３）を、実施例３に記載のプロトコルを用いて処理し、図１６に示す「配列決定／確認用のフローチャート」を用いて配列を同定した。シトシン／ウリジン交換は最も検出しづらいものなので、これが選ばれた。記載される方法は、親配列に対する２つの突然変異を容易に同定することができた（実施例３，図１７および１８参照）。

【0345】

特許請求の範囲および実施例４でさらに詳細に概説されるように、質量分析法で核酸分子の配列を決定する代わりの方法であって、核酸が固定されない方法が、本明細書で提供される。本発明によれば、第１の工程で、修飾、この例では、ヌクレオ塩基が吸収しない選択的な波長吸光度を有する標識が核酸分子に与えられる。次の工程は、ランダムな鎖切断物に相当する断片とインタクトの全長材料の混合物を生成させるための化学的切断による核酸分子の限定的なランダム切断である。その後、この粗反応混合物をＬＣ−ＭＳで分析する。標識の選択的な波長吸光度では、この分子またはその断片の核酸成分に起因するＵＶ吸光度はない。それゆえ、この波長で、核酸分子の全てのヌクレオチドの３’での切断物に相当する全てのあり得る断片を示す質量ラダーが選択的に観測される。これらの５’断片の保持時間を同定し、かつこれらの５’断片の保持時間における質量スペクトルを得、デコンボリューションすることにより、核酸分子の配列を確認することまたは配列に関する予備知識を持たずにそれを決定することができる。標識断片は単離されないので、非標識断片の存在のために、ＴＩＣは複雑である。すなわち、より小さい断片はカラムで十分に分別され、非標識断片から標識断片を完全に分離することができるのに対し、より大きな標識断片は、非標識断片（これもまた、質量シグナルを発生させる）と共溶出し、それゆえ、所望の５’断片の同定を妨害する可能性がある。しかしながら、標識が親油性であるために、特定の質量値の標識断片は、通常、同様の質量値の非標識断片よりも後に溶出する。したがって、この理由により、共溶出する非標識断片から得られた偽の質量を排除し、意図した標識断片を同定することができる。

【0346】

この方法の実行可能性を示すために、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ異性体Ｉ）標識をＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）に付加し、ＦＩＴＣ−ＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１００）を生じさせた。ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）は、ＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１）の５’−アミノ修飾誘導体である。次に、標識されたＮＯＸ−Ｅ３６中間体を、塩基を介する限定的なランダム切断に供し、試料をＬＣＭＳで分析した。標識は、その最大値が約４９５ｎｍにある選択的な波長吸光度を有しており、それゆえ、インタクトの５’末端を含有する核酸分子だけが、この吸光度で観測される。４９５ｎｍで抽出されるＵＶクロマトグラム（図１９Ａ）と、２６０ｎｍ（この波長で全ての核酸が検出される）で抽出される対応するＵＶクロマトグラム（図１９Ｂ）とを比較することにより、後者のＵＶクロマトグラム上に、核酸分子の５’断片ではない多くの断片が試料中に存在することがはっきりと分かる。図１９Ｂと図１９Ｃ（図１９Ａと１９Ｂの対応するＴＩＣ）とを比較することにより、標識があるまたは標識がない核酸分子の全ての断片が質量データを生成させることが分かる。４９５ｎｍで抽出されるクロマトグラムから決定されるように、核酸分子の第１の５’断片は、６．３１分で溶出する断片であると容易に同定することができる（図１９Ａおよび引き伸ばした図２０Ｂ、デコンボリューションされた精密質量図２１Ａ）。図１９Ａと１９Ｂとを比較することにより（また、拡大図の図２０Ａと２０Ｂを用いてより容易に）、このピークよりも早く溶出する非標識断片がたくさんあることがはっきりと分かる。しかしながら、これらは、その観測質量によって推定したとき長さ８〜１４ヌクレオチドの断片に相当する（１つのこのようなピークの例については、図２２Ａを参照されたい）。それゆえ、標識断片に与えられた親油性のために、特定の断片サイズに対して予想された質量との相当な質量差（約２０００〜６０００Ｄａ）によって、標識断片と共溶出する任意の非標識断片を排除することができる（図２５〜２７、実施例４参照）。偽の質量を無視するこの能力、または言い換えれば、非標識断片と共溶出する場合に標識断片の質量を決定する能力によって、この方法による核酸分子の配列確認（図２４）と配列決定（図２８Ａ〜Ｃ）の両方が可能になる。

【0347】

それゆえ、断片間の個別の質量差から配列を決定する原理は、実施例３で提供される原理と類似しているので、実施例３と同様の方法で、配列確認または配列に関する予備知識を持たない配列決定（図２８）のための類似の配列確認表または類似のフローチャートを作成することができる（図２３および２４参照）。

【0348】

４０個のヌクレオチドを含むシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の代わりに、４５個のヌクレオチドを含むシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２の配列決定が記載されていることを除き、実施例５は実施例３と類似している。

【実施例】

【0349】

実施例１：シュピーゲルマーの合成および誘導体化
１．１ 小規模合成
シュピーゲルマーは、２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホロアミダイト化学（Ｄａｍｈａ ａｎｄ Ｏｇｉｌｖｉｅ，１９９３）を用いて、ＡＢＩ３９４合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、固相合成により作製した。Ｌ形のｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｒＣ（Ａｃ）−、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびｒＵ−ホスホロアミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから購入した。シュピーゲルマーは、ゲル電気泳動により精製した。

【0350】

１．２ 大規模合成＋修飾
シュピーゲルマーは、２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホロアミダイト化学（Ｄａｍｈａ ＆ Ｏｇｉｌｖｉｅ，１９９３）を用いて、ＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００合成器（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）で、固相合成により作製した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびＬ−ｒＵ−ホスホロアミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。５’−アミノ−修飾物質は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。シュピーゲルマーの合成は、それぞれ、Ｌ−リボＧ；Ｌ−リボＣ、Ｌ−リボＡ、Ｌ−リボＵで修飾されたＣＰＧ、細孔径１０００Å（Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）の上で開始された。カップリングするために（１サイクルにつき１５分間）、アセトニトリル中の０．３Ｍベンジルチオテトラゾール（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、および３．５当量のそれぞれのアセトニトリル中の０．２Ｍホスホロアミダイト溶液を用いた。酸化−キャッピングサイクルを用いた。オリゴヌクレオチド合成用のさらなる標準的な溶媒および試薬は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ，ＮＬ）から購入した。シュピーゲルマーを、ＤＭＴ−ＯＮを用いて合成し；脱保護した後、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣミディアム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，１９９５）で精製した。５’ＤＭＴ基を８０％酢酸（ＲＴで９０分）で除去した。その後、２Ｍ ＮａＯＡｃ水溶液を添加し、５Ｋ再生セルロースカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、接線流濾過でシュピーゲルマーを脱塩した。

【0351】

実施例２：ヌクレオ塩基特異的切断反応を用いた核酸分子の固定を伴わない核酸分子の配列決定
２．１ 本方法の原理
核酸分子を固定せずに核酸分子の配列を決定するために、以下の工程を行なった。
１）具体的に選択されたヌクレオ塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）を修飾するための、核酸分子の塩基選択的処理、次いで、核酸リン酸骨格を修飾ヌクレオ塩基の３’で選択的に化学的に切断する第２の工程。この場合、非修飾ヌクレオ塩基を含有する核酸分子の断片がなおも存在する（このことは、修飾および／または化学的切断の核心ではなかった）ように、断片化反応を最後までは促進しない条件を開発する必要がある。
２）ＬＣＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳで生成される、核酸分子の断片の分析。

【0352】

断片化の結果は、修飾ヌクレオ塩基の全ての存在の３’での切断物に相当する１組の核酸分子の断片である。１組の生成された予想断片（例えば、核酸分子の３’断片または５’断片）を同定することにより、これらの断片に対するタンデム質量分析実験を行なうことができ、これらの断片の重複する性質、およびインタクトの核酸分子（すなわち、全長分子）との関係によって、核酸分子の配列を確認することができる。この場合、この関係性が保存されるように化学的切断の程度を制御することや、好ましくはＭＳ／ＭＳ実験が実施可能なインタクトの５’または３’末端を有する特定の組の断片を同定することが必要である。

【0353】

２．２ シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の配列決定
記載した方法を試験するために、ＲＮＡ分子のＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）を用いた。ＮＯＸ−Ｅ３６中間体はシュピーゲルマーであり、ＮＯＸ−Ｅ３６中間体は、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１）の５’−アミノ修飾誘導体である。選択的に修飾するためにウリジンヌクレオ塩基が選ばれた。修飾は、ウリジン部分の後ろでＲＮＡ分子を化学的に切断し、ＲＮＡ分子の断片を生じさせる２工程のヒドラジン−酢酸／アニリン処理を用いて達成される。通常、ヒドラジン−酢酸／アニリン処理後の反応産物は、ＲＮＡ分子の５’リン酸付加３’断片と、図１および２Ｂに示すような修飾リボース部分［略称、Ｕｍｏｄ（ヌクレオ塩基切断部位を強調する）］を担持するＲＮＡ分子のアニリン修飾リボース５’断片の反応産物である。このような構造は、Ｅｈｒｅｓｍａｎｎら（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，１９８７）によって提唱されている（図１参照）。シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）をヒドラジン−酢酸／アニリン処理に供し、断片化産物を分析することにより、驚くべきことに、３’断片とインタクトの核酸分子（図２Ａ）が、５’断片と内部断片よりも効率的にイオン化され、したがって、生成されるデータの解釈が大いに単純化され、目的の断片が同定されることが明らかになった（図４〜６）。結果として、毎回ウリジンヌクレオチドが出現する後ろの切断に相当する５’リン酸を含有する重なり合う３’断片とインタクトの出発分子ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）を、各ピークに関する得られた質量データ（例えば、図５参照）のデコンボリューションによって容易に同定することができる（図６）。デコンボリューションは当業者に周知の一般的な技術である。デコンボリューションでは、アルゴリズムを質量スペクトルに適用して、単一種の多価イオンを同定し、それらをこの種の質量とするよう再構成する。この技術は、大きい分子を多価イオンの分布として観測するＥＳＩや他のイオン化技術と組み合わせると極めて有用である。適用されるアルゴリズムによって、（精密質量を得るための）同位体分解質量または分子量のいずれかが得られる。通常、オリゴヌクレオチドについて、５ｐｐｍで校正される質量分析計は、イオン化効率次第で、約６〜１０ｋＤａまでの分解同位体スペクトルを生成させることができる。この質量を超えると、通常、種の分子量（平均分子質量）に対してデコンボリューションするための、Ｍａｘｅｎｔアルゴリズムなどの、アルゴリズムを用いる。

【0354】

当業者によく知られているＭＳ／ＭＳ技術（説明を参照）を用いることにより、最小の断片の配列確認を達成することができる。次に、参照として生成されたデータを用いて、「重複原理」を次の核酸分子断片に利用することができ、その結果、追加の配列情報、すなわち、次の断片の未知の部分だけが、この断片の配列確認に必要とされる。このような方法で、この重複原理を、分子全体の配列を確認するために利用することができるが、それは、どの１つの特定のヌクレオ塩基（ＲＮＡシリーズ中のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）間の間隔も、通常せいぜい１０〜１５ヌクレオ塩基であるからである（図２Ａ）。さらに、この重複原理は、核酸分子の断片またはインタクトの分子が（５’先端と３’先端の両方とは対照的に）その５’先端から配列決定されることしか必要としないようにし、したがって、ＭＳ／ＭＳ分析をより単純なものにする。この重複原理が利用されるためには、断片のこの重複関係が壊されないように化学的切断の程度を制御する必要がある。反応が最後まで促進されると（図２Ｂ）、断片間の関係性を解明することができない、すなわち、断片の位置を確認することができず、それゆえ、配列を確認することができない。したがって、本明細書に記載のプロトコルは、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の制御された断片化を表す。これらの断片のＭＳ／ＭＳは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるかまたは標準的な液体クロマトグラフィーで個々の３’断片を単離し、その後、それらをＭＳ／ＭＳ実験用の質量分析計に注入することによって達成することができる。

【0355】

２．３ プロトコル
８μｌ（０．８５ＯＤ／μｌ水）シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）、すなわち、５’アミノリンカーを有するシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１）の誘導体を、５００μｌ微量遠心チューブに入れ、氷上で冷やし、その後すぐに、２４μｌのヒドラジン水和物５０〜６０％（２２，５８１−９，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。４５分後、４μｌの１０Ｍ酢酸アンモニウムｐ．ａ．（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、溶液を短くボルテックスし、冷エタノール（３００μｌ）を添加した。この溶液を再度ボルテックスし、冷凍庫の中で−１８℃で２時間冷やし、その後すぐに、４℃で１５分間遠心分離し（１２，０００ｇ）、上清をデカントで捨てた。ペレットを３００μｌの冷エタノールでボルテックスにより洗浄し、５分間遠心分離した（１２，０００ｇ）。上清を除去し、ペレットをＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ５３０１（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の中で乾燥させ、その後、反応液から光を排除しながら、６５℃で４０分間、１７０μｌの水、１８μｌのアニリン（＞９９．５％，２４２２８４ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１１μｌの酢酸（＞９９％ Ａ６２８３，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の溶液で処理した。その後、溶液をＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ５３０１（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の中で乾燥させ、滅菌水（７０μｌ）に再懸濁し、ＬＣＭＳ分析に供した。

【0356】

ＬＣＭＳ分析：上のプロトコルから生成された断片のＬＣＭＳ分析を、高速分別ポンプを備えた６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ ＬＣＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ，１３０Å孔径，２．１×３０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｓｃｈｅｎｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いて分析した。勾配は７．７分で０〜７０％Ｂである。緩衝液Ａ：水中の１０ｍＭトリエチルアミン、１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、１０μＭ ＥＤＴＡ（ＮＨ_４^＋形態）、１％メタノール、緩衝液Ｂ：水中の１０ｍＭトリエチルアミン、１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、１０μＭ ＥＤＴＡ（ＮＨ_４^＋形態）、５０％メタノール。カラム温度６５℃、流速１．２ｍｌ／分。

【0357】

２．４ 結果
図３Ａは、１つの主要ピークを表示するインタクトの核酸分子シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）のトータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）を示す。このピークのデコンボリューションされた観測質量は１２９９５．８４Ｄａである（図３Ｂ）。上のプロトコル（第２．３節参照）に記載されたようなシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の処理とＬＣＭＳを用いた分析とにより、ＴＩＣで明らかにされ（図４）、その後、断片５、６およびインタクトの核酸分子ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）に対して示された個々のピークのデコンボリューションされた質量スペクトルから同定される（図５）ように質量分析法と組み合わせた逆相ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーでまず第１に識別可能な明確に規定された断片が得られた。驚くべきことに、様々な産物（５’断片、３’断片および内部断片）が可能であるにもかかわらず、３’末端に由来する断片が主要な産物であり、５’断片や内部断片などの他の断片が存在するにもかかわらず、明確に区別可能であることが観察されることが分かった。結果的に、予想された３’断片、すなわち、ウリジン部分での３’の鎖切断から得られた断片は全て、質量値を予測された断片から計算される質量値と比較することにより、容易に同定された（図６）。したがって、先に記載したような３’断片に対してタンデムＭＳ／ＭＳ実験を行ない、以下のように配列の確認を得ることが可能であろう。

【0358】

ＥＳＩ−ＭＳ機器などの当該技術水準の質量分析機器により、通常、確立したＭＳ／ＭＳ技術を用いて核酸分子の各末端から最初の１０〜１５ヌクレオチドの配列確認が可能である。それゆえ、最小の断片（断片１、配列番号４）に対してＭＳ／ＭＳを行なうことにより、この断片の配列を容易に確認することができる。次に、断片２（配列番号５）の配列アイデンティティーも確認することができる。断片２の場合、しかしながら、その３’先端で重複するので、３’断片の５’先端上の追加のヌクレオチドに関する情報を得ることだけが必要である（図２Ａ）。断片３の配列を同様の方法で確認することができる。この反復プロセスを用いて、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）全体の配列を確認することができる。

【0359】

要約すると、ヌクレオ塩基特異的鎖切断を誘導する化学反応を用いて、断片が互いに明確な関係性をもって産生されるように注意深く制御された方法で核酸分子を断片化することが可能であり、この関係性を用いて、上記の「重複原理」に従って核酸分子の配列を決定することができることが示されている。これは、相当な量の５’および内部断片が存在するにもかかわらず、粗混合物をＬＣＭＳで分析したときに、１組の断片（３’断片）だけがＴＩＣに主に現れるという驚くべき発見のおかげで、非常にやり易くなっている。

【0360】

実施例３：核酸分子および選択されたその断片の固定を伴う核酸分子の配列決定
３．１ 原理
核酸分子および選択されたその断片を固定せずに核酸分子の配列を決定するために、以下の工程を行なった：（まだ付加されていない場合）親和性標識またはタグによる核酸分子の標識、図７に示すスキームによるランダムな鎖切断物に相当する断片＋未切断の全長材料の混合物を生成させるための化学的切断による核酸分子の限定的なランダム切断。このランダムな混合物から、固体支持体に結合しているか、カラム中にあるか、チップ上にあるか、またはビーズフォーマットの、親和性標識を手段として用いて、標識を含有する核酸分子の断片を混合物から抜き出し、他の断片を洗い流す。所望の核酸分子断片の切断または溶出による固相からの放出により、質量分析法で分析される分子が提供される。この例は、核酸分子の配列決定に好適な質量分析技術としてのＬＣＭＳの使用を示している。得られる結果は、全てのあり得る核酸分子の断片に相当する、より正確には、核酸分子の全てのヌクレオチドの３’での切断に相当するラダーである。この例で使用される分析方法により、まず液体クロマトグラフィー、すなわち、ＬＣＭＳのＬＣ部分による、およびその後の質量分析によるこれらの断片の分離が可能になる。この２次元アプローチにより、個々の断片が同定しやすくなり、それにより、容易に分離される断片の２次元同定が可能にある。

【0361】

３．２ シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の配列決定
この方法を試験するために、核酸分子シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）を用いた。ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）は、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１）の５’−アミノ修飾誘導体である。図８に示すように、ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の５’−アミノ部分をビオチン親和性タグで修飾した後、塩基性溶液を用いて、ビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号６３）を化学的にランダムに切断した。切断が最後まで進まないように、切断を注意深く制御した。ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の５’断片、３’断片およびランダムな内部断片を生じさせるランダムな断片化が起こることより、ＮＯＸ−Ｅ３６中間体の全てのビオチン化５’断片（図８，シリーズ１）と残りのビオチン化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（すなわち、全長産物［略称、ＦＬＰ］）が固定用のタグ特異的な固体支持体（この場合、ニュートロアビジンビーズ）を用いて、親和性タグ（この場合、ビオチン）によって混合物から選択的に抜き出された。結合していない断片、すなわち、親和性タグを有さない３’断片およびランダムな内部断片を洗い流すことができる。その後、ビオチン部分とＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）を接続するリンカー内のジスルフィド結合を還元的に切断することにより、結合したシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の５’断片とＦＬＰ（配列番号６３）をビーズから遊離させる。これらの放出された断片は、全てのリボヌクレオシド位置間での鎖切断に対応する（図８および１３参照）。鎖切断は、２’，３’−環状リン酸を含有する断片をまず形成させ、この環状リン酸は、２’（３’）リン酸にゆっくりと加水分解される。その後、遊離した断片をＬＣ−（ＥＳＩ）ＭＳにより分析し、トータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）を分析した。試料クロマトグラムは、図１１に示すように、生成された全ての５’断片とインタクトの放出されたアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号５０）に対応する個別のピークを提示する。その後、各々の個別のピークに関する得られた質量スペクトルのデコンボリューションによって、個別のピークに含まれる質量を得た。

【0362】

デコンボリューションは当業者に周知の一般的な技術である。デコンボリューションでは、アルゴリズムを質量スペクトルに適用して、単一種の多価イオンを同定し、それらをこの種の質量とするよう再構成する。この技術は、大きい分子を多価イオンの分布として観測するＥＳＩや他のイオン化技術と組み合わせると極めて有用である。適用されるアルゴリズムによって、（精密質量を得るための）モノアイソトピック分解質量または分子量のいずれかが得られる。通常、オリゴヌクレオチドについて、５ｐｐｍで校正される質量分析計は、約６〜１０ｋＤａまでの分解同位体スペクトルを生成させることができる。この質量を超えると、通常、種の分子量に対してデコンボリューションするＭａｘｅｎｔアルゴリズムなどのアルゴリズムを用いる。

【0363】

通常、見られる質量は、２’，３’−環状リン酸の質量であるが、場合によっては、加水分解された２’（３’）リン酸を含有する少量の断片を検出することもでき、この断片は、生成された断片のアイデンティティーをさらに確認するのに役立つ。通常、これらの加水分解断片は、親２’，３’−環状リン酸よりも後に溶出される。

【0364】

まず第１に、生成された断片の質量を、放出されたＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号５０）の予測された５’断片の計算質量と比較して、配列を確認することができる（図１３Ａ〜Ｅ）。あるいは、生成された断片間の違いによって、配列に関する予備知識を持たずに、配列を得ることができる。このシナリオでは、核酸分子の第１の断片を容易に予測することができ、「配列決定／確認用のフローチャート」（図１６）に示すように、後で得られる断片の増分差を用いて、核酸分子の配列を決定することができる。このフローチャートには段階的なプロセスが記載されているが、このプロセスでは、最小の断片（断片１と命名する）がまず同定される。第１の断片は、図８（シリーズ２、ｙ＝０）および図１３Ａ（配列番号１１）に示すような５’−付加アシル化アミノヘキシルリンカーと２’，３’−環状リン酸の両方を有する第１の５’ヌクレオチドに相当する。結果的に、第１の断片について、全てのあり得るＲＮＡ順列（Ａ、Ｃ、ＧまたはＵ）を計算するのが簡単である（図１６）。ＩＰ ＲＰ−ＨＰＬＣの技術（Ａｚａｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００１およびその中に引用されている参考文献）を熟知する者には知られているように、イオン対逆相ＨＰＬＣ（略称、ＩＰ ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いると、断片１が最も早く溶出する５’断片となることを知っていれば、この第１の断片の同定は容易になる。断片１が同定されれば、計算された精密質量および分子量を用いて、次の断片の断片２が同定される。次の断片の断片２のアイデンティティー、したがって、その配列は、断片２と断片１の計算された精密質量または分子量との質量差から導き出される。質量差は、各ヌクレオシドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕに固有である（図１６）。断片２が同定されれば、計算された精密質量および分子量を用いて、次の断片の断片３が同定される。断片２を同定するために使用したものと同一の手順で、断片３のアイデンティティーが、断片３と断片２の計算された精密質量または分子量との質量差から導き出される。この反復プロセスを用いて、全ての５’断片を同定する。前の断片の計算質量値を使用する必要性は、観測値のみを使用したときに生じ得る潜在的蓄積誤差に起因する。例えば、０．３Ｄａの誤差であれば、断片の一義的な同定がなおも可能であろうが、この誤差をリセットしなければ、同定された断片の計算値を用いることで、さらに０．３Ｄａの誤差が蓄積し、ＣヌクレオシドとＵヌクレオシドの質量差がわずか１Ｄａであるために、一義的な同定ができない可能性がある。

【0365】

最後のヌクレオシドを同定するために、同じプロセスを用い、このプロセスでは、インタクトの放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（図８）と最後の環状リン酸を含有する断片の計算質量の間の質量差（長さ４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの場合、Ｘ＝３９、シリーズ２、図８）を用いて、最後のヌクレオチドのアイデンティティーを確認する。放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体は２’，３’環状リン酸を有さないので、質量差は、前に計算された断片についてのものと同じではない。質量差は、最後のヌクレオシドの質量に対応する（図１６）。

【0366】

この方法の能力を示す試験として、２カ所でシトシンとウリジンの配置が入れ替えられていることを除けば、ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）と配列が同一である、ＮＯＸ−Ｅ３６ミスマッチ対照０１（配列番号３）を、本実施例に記載のプロトコルを用いて処理し、「配列決定／確認用のフローチャート」（図１６）を用いて配列を同定した。シトシン／ウリジン交換は最も検出しづらいものなので、これが選ばれた。記載された方法は、親配列に対する２つの突然変異を容易に同定することができた（クロマトグラムについては図１７および配列決定については図１８を参照されたい）。

【0367】

３．３ プロトコル
３．３．１ シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体のビオチン化
１０ｍｇ（２５０ＯＤ）の粗シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）、すなわち、５’アミノリンカーを有するシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１）の誘導体を反応チューブに入れ、２６０μｌのＴｈｅｏｒｅｌｌ ａｎｄ Ｓｔｅｎｈａｇｅｎの汎用緩衝液ｐＨ８．５（３３ｍＭクエン酸ナトリウム、３３ｎＭリン酸ナトリウム、５７ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５）に溶解させた。これに、２００μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（略称、ＤＭＦ）を添加した。この溶液をボルテックスし、スピンダウンし、その後すぐに、５０μｌのＤＭＦに予め溶解させた２．２ｍｇのビオチンジスルフィドΝ−ヒドロキシ−スクシニミドエステル（Ｓｉｇｍａ Ｂ４５３１，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。この溶液を室温で６０分間インキュベートし、その後すぐに、アリコートを取って、陰イオン交換ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡ−Ｐａｃ ２００カラム、緩衝液Ａ：Ｈ_２Ｏ中の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ；１０％ＡＣＮ 緩衝液Ｂ：Ｈ_２Ｏ中の１Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ；２５ｍＭ ＮａＣｌＯ_４；１０％ＡＣＮ。勾配は６分で１０〜３０％Ｂ、次いで、３５分で３０〜７０％Ｂ、カラム温度８０℃）で分析し、これにより、反応が完了したことが明らかにされた。粗反応混合物をＮＡＰ２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて脱塩し、凍結乾燥させた。

【0368】

３．３．２ ビオチン標識シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体の塩基加水分解
２０μｌのビオチン化シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）（０．５４ＯＤ／μｌ）に、３０μｌの滅菌水および２．５μｌの０．５Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３を室温で添加した。この溶液をボルテックスし、その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔマシーン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、７０℃、１３５０ｒｐｍで、１２．５分間インキュベートし、その後すぐに、液体窒素中で凍結させ、そして解凍させておいた。その後、４μｌの１Ｍ ＡｃＯＨを添加して（約ｐＨ７）、反応をクエンチし、溶液をボルテックスし、スピンダウンした。

【0369】

３．３．３ ニュートロアビジンビーズに対するビオチン化断片の結合
ニュートロアビジンアガロースビーズを以下のように処理した：１５０μｌのニュートロアビジンビーズスラリー（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＭＩ，ＵＳＡ）を５００μｌ反応チューブに入れた。ビーズをスピンダウンし、上清を注意深く除去した。その後すぐに、３００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０（Ａｍｂｉｏｎ；Ｈｕｎｔｉｎｄｏｎ，ＵＫ）を添加した。スラリーをボルテックスし、スピンダウンし、上清を注意深く除去した。その後、ビーズを２×３００μｌの滅菌Ｈ_２Ｏで同じように洗浄した。その後、上記のように調製したクエンチした加水分解混合物をビーズに添加し、得られたスラリーを１０℃で２時間激しく（１３５０ｒｐｍ）混合した。その後、ビーズを回転微量遠心チューブ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ ＧＶ，０，２２μｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた濾過により単離し、２×３００μｌの滅菌Ｈ_２Ｏで洗浄した。

【0370】

３．３．４ ニュートロアビジンビーズからのビオチン化断片の切断
ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）のビオチン標識断片のジスルフィドリンカーを、５μｌの１Ｍ ＤＴＴ溶液を含む１００μｌの０．０５Ｍリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて切断した。これをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔマシーンにて、２５℃で２時間激しく混合した。スラリーを回転微量遠心チューブ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ ＧＶ，０，２２μｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて濾過し、ビーズを５０μｌ滅菌水でさらに洗浄した。ＵＶ測定を行なって、２６０ｎｍでの光学密度単位を決定し、そのうち、０．２５ＯＤをＬＣＭＳで分析した。

【0371】

３．３．５ 断片のＬＣＭＳ分析
上記のプロトコルから生成されたＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の５’断片のＬＣＭＳ分析を、高速分別ポンプを備えた６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ ＬＣＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＡｃｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ，１３０ Å孔径，２．１×３０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いて分析した。勾配は２２分で０〜２０％Ｂ、４０分で２０〜３０％Ｂである。緩衝液Ａ：水中の１０ｍＭトリエチルアミン、１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、１０μＭ ＥＤＴＡ（ＮＨ_４^＋形態）、１％メタノール、緩衝液Ｂ：水中の１０ｍＭトリエチルアミン、１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、１０μＭ ＥＤＴＡ（ＮＨ_４^＋形態）、５０％メタノール。カラム温度６５℃、流速０．２ｍｌ／分：各ピークについてＴＩＣからの質量スペクトルを得、その後、当業者に公知の標準的な技術に従ってデコンボリューションした。

【0372】

３．４ 結果
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、後から溶出するピーク（３０．６５分、参考までに、出発材料の溶出時間は２８．８２分、図９）の出現から明らかにされるように、粗ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）（図９）は、実験の節で記載された切断可能なビオチン部分（図１０）で効率的に標識された。ＮＯＸ−Ｅ３６中間体［配列番号２］の固相合成からの破損配列、および他の不純物の存在によって、工程３．３．１〜３．３．５を実施する能力や核酸分子の配列を決定する能力は影響を受けない。粗標識混合物は、サイズ排除精製カラム（ＮＡＰ２５、実験参照）を用いた初歩的な脱塩工程を除いて、精製されなかった。その後、この粗材料を断片化し、標識断片を固定し、洗浄し、その後、記載したような固体支持体から放出させた（第３．３．２節〜第３．３．４節）。その後、得られた反応混合物をＬＣＭＳを用いて分析した（第３．３．５節）。トータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ、図１１）は、各々のあり得る５’断片（配列番号１１〜５０、図１３Ａ〜Ｅ）に相当するピークパターンを示す。ＴＩＣで観測される個別のピークの各々について、生の質量データ、およびその後の対応するデコンボリューションされた質量を得た。図１２は、断片（質量ピーク値＝１０２３７．１８９７Ｄａ）、この場合、断片３１（図１３Ｄ、［配列番号４１］）のデコンボリューションされた分子量の例を示す。その２’，３’−環状リン酸が加水分解されている（質量ピーク値＝９６０３．７７）断片２９（図１３Ｃ、配列番号３９）の少量のデコンボリューションされた分子量も検出することができる。

【0373】

得られた／観測された質量と、図１３Ａ〜Ｅに示す計算質量とを比較することにより、ＮＯＸ−Ｅ３６の配列を確認した（図１４）。

【0374】

図１５は、断片を図１１のＴＩＣ中のピークに帰属させることによって利用される２次元（ＬＣ＋ＭＳ）アプローチの能力を示す。帰属は、放出されるアシル化ＮＯＸ−Ｅ３６中間体と対応する同定された環状リン酸断片に限定される。各断片について、対応する２’，３’−環状リン酸は対応する２’（３’）リン酸誘導体よりも多く、したがって、クロマトグラムを大いに単純化し、より簡単な同定と配列決定を可能にする。図に見られるように、保持時間が増加するにつれて断片サイズが増加する明瞭な傾向がある。このような傾向は、ＴＩＣ処理から実際の質量を得る前に断片のサイズの目視による推定を可能にすることによって、未知分子の配列決定を容易にする。

【0375】

本実施例で記載した配列決定方法の能力を試験するために、２つの特定のＣ／Ｕ交換だけ親ＮＯＸ−Ｅ３６配列と異なるＮＯＸ−Ｅ３６ミスマッチ対照０１（配列番号３）を、実験の節でＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）について記載した配列決定プロトコルに供した。工程３．３．１〜３．３．５を記載されたのと同じように正確に実施して、対応するトータルイオンクロマトグラム（図１７）を得た。先の通りに、断片の質量スペクトルを得、デコンボリューションしたが、今回は、化合物を未知として処理した。図１６に記載のフローチャートに従って、得られた質量を用いて配列を一義的に決定し、図１８Ａ〜Ｃに示される配列決定表で例示されているように、親ＮＯＸ−Ｅ３６配列と比較した配列中の２つのＣ／Ｕ交換（強調付き、図１８Ａ〜Ｃ）を明らかにした。提案される断片アイデンティティーの予想質量との関連で誤差を示す絶対誤差も含まれている。

【0376】

要約すると、上記の固定の原理を適用することにより、ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の配列が容易に決定され、かつＮＯＸ−Ｅ３６ミスマッチ対照０１（配列番号３）の配列が、一義的な決定の許容限界の十分に範囲内の誤差をもって容易に決定された。

【0377】

実施例４：選択的な波長吸光度標識を用いた、核酸分子またはその断片の固定を伴わない核酸分子の配列決定
４．１ 原理
核酸分子を固定せずに核酸分子の配列を決定するために、以下の工程を行なった：ヌクレオ塩基が吸収しない選択的な波長吸光度を有する標識による核酸の標識、（図７に示すものと同様の）ランダムな鎖切断物に相当する断片とインタクトの全長材料の混合物を生成させるための化学的切断による核酸分子の限定的なランダム切断。粗反応混合物をＬＣＭＳで分析する。標識の選択的な波長吸光度では、核酸分子またはその断片に起因するＵＶ吸光度はない。それゆえ、この波長で、核酸分子の全てのヌクレオチドの３’での切断物に相当する全てのあり得る断片を示す質量ラダーが、付着した標識の選択的な波長吸光度によって選択的に観測される。これらの５’断片の保持時間を同定し、かつこれらの５’断片の保持時間における質量スペクトルを得、デコンボリューションすることにより、核酸分子の配列を確認することまたは配列に関する予備知識を持たずにそれを決定することができる。標識断片は単離されないので、非標識断片の存在のために、質量スペクトルは複雑である。すなわち、より小さい断片はカラムで十分に分別され、非標識断片から標識断片を完全に分離する（図１９、Ａ〜Ｃ）ことができるのに対し、より大きな標識断片は、非標識断片（これもまた、質量シグナルを発生させる）と共溶出し、所望の５’断片の同定を妨害する可能性がある（図２５〜２７）。しかしながら、標識が親油性であるために、特定の質量値の標識断片は、通常、同様の質量値の非標識断片よりも後に溶出する。（図２１、２２、２６、２７）。したがって、この理由により、共溶出する特定の質量を排除し、意図した標識断片を同定することができる。

【0378】

４．２ シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６の配列決定
この方法の実行可能性を示すために、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ異性体Ｉ）標識をＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）に付加した。その後、標識されたＮＯＸ−Ｅ３６中間体を、塩基を介する限定的なランダム切断に供し、試料をＬＣＭＳで分析した。標識は、４９５ｎｍでの選択的な波長吸光度を有する（供給業者によって提供されたデータ）。それゆえ、４９５ｎｍでは、インタクトの５’末端を含有する核酸分子（核酸分子の５’断片および全長産物［略称、ＦＬＰ］）だけが観測される。図１９Ａから分かるように、このクロマトグラムは、実施例３（図１１）の観測されたクロマトグラムによく似ている。しかしながら、４９５ｎｍで抽出されるＵＶクロマトグラム（図１９Ａ）と、２６０ｎｍで抽出される対応するＵＶクロマトグラム（図１９、Ｂ）とを比較すると、核酸分子の５’断片ではない多くの断片が存在することがはっきりと分かる。２６０ｎｍで抽出されるＵＶクロマトグラムとトータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）（図１９、Ｃ）とを比較することにより、２つのクロマトグラムＢとＣがよく似ていることが示される。これは、標識があるまたは標識がない全ての断片が質量データを生成させることを示す。４９５ｎｍで抽出されるクロマトグラムから決定されるように、第１の５’断片（この例では、ＦＩＴＣ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｇｃｐ、図２３Ａ、断片１、配列番号５１に相当する）は、６．３１分で溶出する断片であると容易に同定することができる（図１９Ａおよび引き伸ばした図２０Ｂ）。図１９Ａと１９Ｂとを比較することにより（また、拡大図の図２０Ａと２０Ｂを用いてより容易に）、このピークよりも早く溶出する非標識断片がたくさんあることもはっきりと分かるが、これらは、その観測質量によって推定したとき長さ８〜１４ヌクレオチドの断片に相当する。それゆえ、標識断片に与えられた親油性のために、特定の断片サイズに対して予想された質量との相当な質量差（約２０００〜６０００Ｄａ大きい）によって、標識断片と共溶出する任意の非標識断片を排除することができる。この説明を図２５に示す。ここで、図２５Ａは、抽出される波長が４９５ｎｍなので、ＦＩＴＣ標識核酸断片を表し、図２５Ｂは、抽出される波長が２６０ｎｍなので、ＴＩＣ（図２５Ｃ）と同様に、全ての核酸断片を表す。標識断片の質量スペクトルを取得し、このスペクトルをデコンボリューションするための典型的なイオンウインドウを表す２つの点線（図２６）でマークされた範囲内のイオンについての質量スペクトルを得ることによって、２以上のピークを観測することが可能となる。しかしながら、ピークの質量値は非常に様々であり、したがって、１つの、この場合、平均分子質量のデコンボリューションされた値４６６６．２０５Ｄａだけを標識断片の候補とする。偽の質量を無視するこの能力、または言い換えれば、非標識断片と共溶出する場合に標識断片の質量を決定する能力によって、この方法による核酸分子の配列確認（図２４）と配列決定（図２８Ａ〜Ｃ）の両方が可能になる。それゆえ、断片間の個別の質量差から配列を決定する原理が実施例３で適用される原理と類似しているので、実施例３と同じような方法で、配列に関する予備知識を持たない配列の確認または決定（図２８Ａ〜Ｃ参照）のための類似の配列確認表または類似のフローチャートを作成することができる（図２３および図２４参照）。

【0379】

４．３ プロトコル
４．３．１ シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体のフルオレセイン−５−イソチオシアネート標識
８４８ＯＤの粗シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）、すなわち、５’アミノリンカーを有するシュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６（配列番号１）の誘導体を反応チューブに入れ、２５０μｌのＨ_２Ｏに溶解させた。これに、２５０μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（略称、ＤＭＦ）に予め溶解させた３ｍｇのフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ異性体Ｉ）（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。この溶液をボルテックスし、スピンダウンし、その後すぐに、６ｍｇの重炭酸ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。この溶液を室温で６時間インキュベートし、その後すぐに、粗混合物を、ＮＡＰ２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーで脱塩し、凍結乾燥させた。凍結乾燥物を水に再溶解させ、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣミディアム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，１９９５）で精製し、ＮＡＰ２５カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて脱塩した。

【0380】

４．３．２ フルオレセイン−５−イソチオシアネート標識シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体の限定的なランダム塩基加水分解
１３．５μｌ（１ＯＤ）のＦＩＴＣ標識シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）に、室温で１．５μｌの０．５ Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３を添加した。この溶液をボルテックスし、その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔマシーン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、７０℃、１３５０ｒｐｍで、５分間インキュベートし、その後すぐに、液体窒素中で凍結させ、そして解凍させておいた。その後、２．５μｌの１Ｍ ＡｃＯＨを添加して（最終ｐＨ約７）、反応をクエンチし、溶液をボルテックスし、スピンダウンし、ＬＣＭＳで分析した。

【0381】

４．３．３ 断片のＬＣＭＳ分析
上記のプロトコルから生成されたＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の５’断片のＬＣＭＳ分析を、高速分別ポンプを備えた６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ ＬＣＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＡｃｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ，１３０ Å孔径，２．１×３０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いて分析した。勾配は２２分で０−２０％のＢ、４０分で２０−３０％のＢである。緩衝液Ａ：水中の１０ｍＭトリエチルアミン、１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、１０μＭ ＥＤＴＡ（ＮＨ_４^＋形態）、１％メタノール、緩衝液Ｂ：水中の１０ｍＭトリエチルアミン、１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、１０μＭ ＥＤＴＡ（ＮＨ_４^＋形態）、５０％メタノール。カラム温度６５℃、流速１．２ｍｌ／分。４９５ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラムからの各ピークについてＴＩＣからの質量スペクトルを得、その後、デコンボリューションした。

【0382】

４．４ 結果
ＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）を工程４．３．１〜４．３．３に示す配列決定プロトコルに供して、図１９Ａ〜Ｃに示すように以下のデータを得た：
Ａ）４９５ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラム。
Ｂ）２６０ｎｍで抽出されたＵＶクロマトグラム。
Ｃ）トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）。

【0383】

標識（５’）断片の位置／保持時間が４９５ｎｍで明らかになっており（図１９、Ａ）、６．３１分での第１の５’断片の位置がはっきりと分かる。２６０ｎｍで抽出された対応するＵＶクロマトグラム（図１９、Ｂ）は、全ての断片：５’（標識）断片、３’断片および内部断片を示している。第１の標識断片よりも早く溶出する断片がたくさん存在することが分かる。これらは、３’断片または内部断片に相当する。ＴＩＣ（図１９、Ｃ）により、２６０ｎｍのＵＶクロマトグラムで観測される全ての断片がＴＩＣでシグナルを生じさせる、または言い換えれば、全ての核酸断片が質量データを生じさせることが明らかになっている。

【0384】

４９５ｎｍで抽出されたクロマトグラムから決定されるように、第１の５’断片は、６．３１分で溶出する断片であると容易に同定することができる（図１９Ａ、図２０Ｂ）。ＴＩＣ（図２１Ａ）中の対応するピークの質量スペクトルをデコンボリューションし、その質量値と配列確認表（断片１、図２３Ａ）中の第１の断片の予想質量値とを比較するか、または図２４に示す配列決定フローチャートに従うかのいずれかによって確認が得られた（ラダー断片１、図２８Ａ）。４９５ｎｍで抽出されるクロマトグラム中の７．１３分で観測される次の５’断片を繰り返し処理し、第２の断片を同定した（図２１Ｂ；断片２ 図２３Ａおよびラダー断片２ 図２８Ａ）。全ての他の５’断片についてこのプロセスを反復した。このプロセスでは、記載されたフローチャート（図２４）および構築された配列決定表（図２８Ａ〜Ｃ）を用いて配列を決定し、それにより、配列を決定することができた。配列が既知である場合、（図２４で説明されているように）配列確認表を用いることもできた。図２８Ａ〜Ｃから分かるように、配列決定に伴う誤差は完全に、一義的な配列決定の範囲内である。本実施例でこれまで論じたように、図２５に示すような、共溶出する非標識断片という事象において、このような非標識断片は、配列が既知であるか、それとも未知であるかを問わず、標識断片の予想される質量値の範囲よりも有意に高い質量値を有する。図２１、２２、２６、２７を比較することにより分かるように、この質量差は、通常、３〜６ｋＤａの範囲である。要約すると、選択的修飾、この特定の実施例では、選択的な波長吸光度が与えられた修飾を用いた核酸分子の配列決定は、一義的な決定の許容限界の十分に範囲内の実験を用いてデノボの方法でそのＦＩＴＣ誘導体（配列番号１００）を介してＮＯＸ−Ｅ３６中間体（配列番号２）の配列を決定することにより示すことができた。

【0385】

実施例５：核酸分子および選択されたその断片の固定を伴う核酸分子の配列決定。ＮＯＸ Ａ１２
５．１ 原理
核酸分子および選択されたその断片の固定を伴う核酸分子の配列決定については、その原理が、これまでに実施例３で記載されている。この追加の実施例では、異なる核酸配列である、ＮＯＸ−Ａ１２（配列番号６４）の核酸配列を用いる。この追加の実施例は、オリゴヌクレオチドの凝集特性のために標識断片と共固定され得る（第５．３．３節参照）非標識断片の完全な除去を確実にするために修正された洗浄工程も有する。これを達成するために、カオトロピック溶液、本実施例では、８Ｍ尿素を用いる。

【0386】

５．２ シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２の配列決定
この方法を試験するために、核酸分子シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）を用いた。ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）は、シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２（配列番号６４）の５’−アミノ修飾誘導体である。ＮＯＸ−Ｅ３６について図８で示したように、ビオチン親和性タグで５’−アミノ部分を修飾した後、塩基性溶液を用いて、ビオチン化シュピーゲルマーを化学的にランダムに切断する。切断が最後まで進まないように、切断を注意深く制御した。５’断片、３’断片およびランダムな内部断片を生じさせるランダムな断片化が起こることより、ＮＯＸ−Ａ１２中間体の全てのビオチン化５’断片と残りのビオチン化ＮＯＸ−Ａ１２中間体（すなわち、全長産物［略称、ＦＬＰ］）が固定用のタグ特異的な固体支持体（この場合、ニュートロアビジンビーズ）を用いて、親和性タグ（この場合、ビオチン）によって混合物から選択的に抜き出される。結合していない断片、すなわち、親和性タグを有さない３’断片およびランダムな内部断片を洗い流すことができる。いくつかの配列、特に、自己凝集する傾向のある配列の場合、固定された標識断片に結合するので、非標識断片が共固定されることがあり得る。その除去を確実にするために、結合断片をカオトロピック剤で洗浄する。その後、ビオチン部分とＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）を接続するリンカー内のジスルフィド結合を還元的に切断することにより、結合したシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２の５’断片とＦＬＰ（配列番号６３）をビーズから遊離させて、断片（１０１〜１４５）を提供する。これらの断片は、全てのリボヌクレオシド位置間の鎖切断に対応する（ＮＯＸ−Ｅ３６の例については、図８参照）。鎖切断は、２’，３’−環状リン酸を含有する断片をまず形成させ、この環状リン酸は、２’（３’）リン酸にゆっくりと加水分解される。その後、遊離した断片をＬＣ−（ＥＳＩ）ＭＳにより分析し、トータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ）を分析する。見出されるのは、生成された全ての５’断片とインタクトの放出されたアシル化ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号１０１〜１４５）に対応する個別のピークである（試料クロマトグラムについては図３１参照）。その後、各々の個別のピークに関する得られた質量スペクトルのデコンボリューションによって、個別のピークに含まれる質量を得る（例えば、図３２参照）。デコンボリューションは当業者に周知の一般的な技術である。デコンボリューションでは、アルゴリズムを質量スペクトルに適用して、単一種の多価イオンを同定し、それらをこの種の質量とするよう再構成する。この技術は、大きい分子を多価イオンの分布として観測するＥＳＩや他のイオン化技術と組み合わせると極めて有用である。適用されるアルゴリズムによって、（精密質量を得るための）同位体分解質量または分子量のいずれかが得られる。通常、オリゴヌクレオチドについて、５ｐｐｍで校正される質量分析計は、約６〜１０ｋＤａまでの分解同位体スペクトルを生成させることができる。この質量を超えると、通常、種の分子量に対してデコンボリューションするＭａｘｅｎｔアルゴリズムなどのアルゴリズムを用いる。

【0387】

通常、見られる質量は、２’，３’−環状リン酸の質量であるが、場合によっては、加水分解された２’（３’）リン酸を含有する少量の断片を検出することもでき、この断片は、生成された断片のアイデンティティーをさらに確認するのに役立つ。通常、これらの加水分解断片は、親２’，３’−環状リン酸よりも後に溶出される。

【0388】

まず第１に、生成された断片の質量を、ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号３４Ａ＋Ｂ）の５’断片の計算質量と比較して、配列を確認することができる（ＮＯＸ−Ｅ３６の例、図１３Ａ〜Ｅと同様である）。あるいは、生成された断片間の違いによって、配列に関する予備知識を持たずに、配列を得ることができる。このシナリオでは、核酸分子の第１の断片を容易に予測することができ、「配列決定／確認用のフローチャート」（図１６）に示すように、後で得られる断片の増分差を用いて、核酸分子の配列を決定することができる。このフローチャートには段階的なプロセスが記載されているが、このプロセスでは、最小の断片（断片１と命名する）がまず同定される。第１の断片は、図３４ Ａ（配列番号１０１）に示すような５’−付加アシル化アミノヘキシルリンカーと２’，３’−環状リン酸の両方を有する第１の５’ヌクレオチドに相当する。結果的に、第１の断片について、全てのあり得るＲＮＡ順列（Ａ、Ｃ、ＧまたはＵ）を計算するのが簡単である（図１６）。ＩＰ ＲＰ−ＨＰＬＣの技術を熟知する者には知られているように、イオン対逆相ＨＰＬＣ（略称、ＩＰ ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いると、断片１が最も早く溶出する５’断片となることを知っていれば、この第１の断片の同定は容易になる。断片１が同定されれば、計算された精密質量および分子量を用いて、次の断片の断片２が同定される。次の断片の断片２のアイデンティティー、したがって、その配列は、断片２と断片１の計算された精密質量または分子量との質量差から導き出される。質量差は、各ヌクレオシドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕに固有である（図１６）。断片２が同定されれば、計算された精密質量および分子量を用いて、次の断片の断片３が同定される。断片２を同定するために使用したものと同一の手順で、断片３のアイデンティティーが、断片３と断片２の計算された精密質量または分子量との質量差から導き出される。この反復プロセスを用いて、全ての５’断片を同定する。前の断片の計算質量値を使用する必要性は、観測値のみを使用したときに生じ得る潜在的蓄積誤差に起因する。例えば、０．３Ｄａの誤差であれば、断片の一義的な同定がなおも可能であろうが、この誤差をリセットしなければ、同定された断片の計算値を用いることで、さらに０．３Ｄａの誤差が蓄積し、その結果、ＣヌクレオシドとＵヌクレオシドの質量差がわずか１Ｄａであるために、一義的な同定ができない可能性がある。

【0389】

最後のヌクレオシドを同定するために、同じプロセスを用い、このプロセスでは、インタクトの放出されるアシル化ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号１４５）と最後の環状リン酸を含有する断片の計算質量の間の質量差を用いて、最後のヌクレオチドのアイデンティティーを確認する。放出されるアシル化ＮＯＸ−Ａ１２中間体は２’，３’環状リン酸を有さないので、質量差は、前に計算された断片についてのものと同じではない。質量差は、最後のヌクレオシドの質量に対応する（図１６）。

【0390】

ＮＯＸ−Ｅ３６よりも長いシュピーゲルマーであるＮＯＸ−Ａ１２をさらなる試験物として用いて、この配列決定法を評価した。本実施例に記載のプロトコルを用いてＮＯＸ−Ａ１２を処理した。「配列決定／確認用のフローチャート」（図１６）を用いて、配列を同定し、この結果を配列決定表に蓄積した（図３３Ａ〜Ｃ）。

【0391】

５．３ プロトコル
５．３．１ シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２中間体のビオチン化
１０ｍｇ（２５０ＯＤ）の粗シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）、すなわち、５’アミノリンカーを有するシュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２（配列番号６４）の誘導体を反応チューブに入れ、２６０μｌのＴｈｅｏｒｅｌｌ ａｎｄ Ｓｔｅｎｈａｇｅｎの汎用緩衝液ｐＨ８．５（３３ｍＭクエン酸ナトリウム、３３ｎＭリン酸ナトリウム、５７ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５）に溶解させた。これに、２００μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（略称、ＤＭＦ）を添加した。この溶液をボルテックスし、スピンダウンし、その後すぐに、５０μｌのＤＭＦに予め溶解させた２．２ｍｇのビオチンジスルフィドΝ−ヒドロキシ−スクシニミドエステル（Ｓｉｇｍａ Ｂ４５３１，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。この溶液を室温で６０分間インキュベートし、その後すぐに、アリコートを取って、陰イオン交換ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡ−Ｐａｃ ２００カラム、緩衝液Ａ：Ｈ_２Ｏ中の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ；１０％ＡＣＮ。緩衝液Ｂ：Ｈ_２Ｏ中の１Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ；２５ｍＭ ＮａＣｌＯ_４；１０％ＡＣＮ。勾配は６分で１０〜３０％Ｂ、次いで、３５分で３０〜７０％Ｂ、カラム温度８０℃）で分析し、これにより、反応が完了したことが明らかにされた。粗反応混合物をＮＡＰ２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて脱塩し、凍結乾燥させた。

【0392】

５．３．２ ビオチン標識シュピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６中間体の塩基加水分解
２０μｌのビオチン化シュピーゲルマーＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）（０．５ＯＤ／μｌ）に、３０μｌの滅菌水および２．５μｌの０．５Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３を室温で添加した。この溶液をボルテックスし、その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔマシーン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、７０℃、１３５０ｒｐｍで、２０分間インキュベートした。その後すぐに、これを液体窒素中で凍結させ、そして解凍させておいた。その後、４μｌの１Ｍ ＡｃＯＨを添加して（約ｐＨ７）、反応をクエンチし、溶液をボルテックスし、スピンダウンした。

【0393】

５．３．３ ニュートロアビジンビーズに対するビオチン化断片の結合
ニュートロアビジンアガロースビーズを以下のように処理した：１５０μｌのニュートロアビジンビーズスラリー（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＭＩ，ＵＳＡ）を５００μｌ反応チューブに入れた。ビーズをスピンダウンし、上清を注意深く除去した。その後すぐに、３００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０（Ａｍｂｉｏｎ；Ｈｕｎｔｉｎｄｏｎ，ＵＫ）を添加した。スラリーをボルテックスし、スピンダウンし、上清を注意深く除去した。その後、ビーズを２×３００μｌの滅菌Ｈ_２Ｏで同じように洗浄した。その後、上記のように調製したクエンチした加水分解混合物をビーズに添加し、得られたスラリーを１０℃で２時間激しく（１３５０ｒｐｍ）混合した。その後、ビーズをスピンダウンし、上清を除去した。１×３００μｌの８Ｍ尿素を添加し、混合物をボルテックスし、スピンダウンした。上清を注意深く除去し、ビーズを滅菌水でさらに４回洗浄した。

【0394】

５．３．４ ニュートロアビジンビーズからのビオチン化断片の切断
ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）のビオチン標識断片のジスルフィドリンカーを、５μｌの１Ｍ ＤＴＴ溶液を含む１００μｌの０．０５Ｍリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて切断した。これをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔマシーンにて、２５℃で２時間激しく混合した。スラリーを回転微量遠心チューブ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ ＧＶ，０，２２μｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて濾過し、ビーズを５０μｌ滅菌水でさらに洗浄した。ＵＶ測定を行なって、２６０ｎｍでの光学密度単位を決定し、そのうち、０．２５ＯＤをＬＣＭＳで分析した。

【0395】

５．３．５ 断片のＬＣＭＳ分析
上記のプロトコルから生成されたＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）の５’断片のＬＣＭＳ分析を、高速分別ポンプを備えた６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ ＬＣＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＡｃｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ，１３０Å孔径，２．１×３０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いて分析した。勾配は２２分で０〜２０％Ｂ、４０分で２０〜３０％Ｂである。緩衝液Ａ：水中の１０ｍＭトリエチルアミン、１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、１０μＭ ＥＤＴＡ（ＮＨ_４^＋形態）、１％メタノール、緩衝液Ｂ：水中の１０ｍＭトリエチルアミン、１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、１０μＭ ＥＤＴＡ（ＮＨ_４^＋形態）、５０％メタノール。カラム温度６５℃、流速０．２ｍｌ／分：各ピークについてＴＩＣからの質量スペクトルを得、その後、デコンボリューションした。

【0396】

５．４ 結果
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、出発材料（図２９、２８．２１分）と比較して粗反応混合物中の後から溶出するピーク（図３０、２９．８２分）の出現から明らかにされるように、粗ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）は、実験の節で記載された切断可能なビオチン部分で効率的に標識された。ＮＯＸ−Ａ１２中間体［配列番号６５］の固相合成からの破損配列、および他の不純物の存在によって、標識またはその後の工程５．３．２〜５．３．５を実施する能力や核酸分子の配列を決定する能力は影響を受けない。粗標識混合物は、サイズ排除精製カラム（ＮＡＰ２５、実験参照）を用いた初歩的な脱塩工程を除いて、精製されなかった。その後、この粗材料を断片化し、標識断片を固定し、洗浄し、その後、記載したような固体支持体から放出させた（第５．３．２節〜第５．３．４節）。その後、得られた反応混合物をＬＣＭＳを用いて分析した（第５．３．５節）。得られたトータルイオンクロマトグラム（略称、ＴＩＣ、図３１）は、各々のあり得る５’断片（配列番号１０１〜１４５、図３４）に相当するピークパターンを示す。ＴＩＣで観測される個別のピークの各々について、生の質量データ、およびその後の対応するデコンボリューションされた質量を得た。図３２は、断片（質量ピーク値＝１０９１０．６５Ｄａ）、この場合、断片３３（図３４Ａ、［配列番号１３３］）のデコンボリューションされた分子量の例を示す。図１６に記載のフローチャートに従って、観測質量を用いてＮＯＸ−Ａ１２（図３３Ａ〜Ｃ）の配列を一義的に決定した。図３４Ａ＋Ｂは対応する配列確認表を示し、図３５は注釈付きＴＩＣを示し、ピークは、配列決定表（図３３Ａ〜Ｃ）と配列確認表（図３４Ａ＋Ｂ）中の対応する断片番号に帰属させられる。

【0397】

要約すると、上記の固定の原理を適用することにより、ＮＯＸ−Ａ１２中間体（配列番号６５）の配列が、一義的な決定の許容限界の十分に範囲内の誤差をもって容易に決定された。

【0398】

参考文献
本明細書に列挙された文書の完全な書誌データは、それとは矛盾することが示されない限り、以下の通りである。該参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
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【0399】

本明細書、特許請求の範囲および／または図面に開示された本発明の特徴は、別々および任意のその組合せの両方で、本発明をその様々な形態で実現するための材料であり得る。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23A】

【図23B】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図34A】

【図34B】

【図35】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]