【文献】
RESLAN LINA,UNDERSTANDING AND CIRCUMVENTING RESISTANCE TO ANTICANCER MONOCLONAL ANTIBODIES,MABS 2009,2009年 5月,V1 N3,P222-229
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
前記癌が、白血病、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎臓癌、多発性骨髄腫またはホジキンリンパ腫である、請求項5に記載の医薬組成物。
癌を有する被験体が抗CSF−1R抗体ベースの癌治療レジメンのための候補かどうかを決定する方法であって、該抗体が請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体であり、該方法が、
サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、前記被験体の前記サンプルにおけるCSF−1もしくはIL−34または両者のレベルをエクスビボまたはインビトロで決定することを含み、
癌を患わない個体におけるCSF−1もしくはIL−34または両者のレベルと比較して、CSF−1もしくはIL−34または両者のレベルの増加は前記被験体が抗CSF−1R抗体ベースの癌治療レジメンのための候補であることを示す、方法。
【実施例】
【0083】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、いかなる手段においても本発明の範囲を限定するように解釈されるべきでなく;それらは本発明の広範囲の限定として全く解釈されるべきではない。従来の方法(ベクターおよびプラスミドの構築、かかるベクターおよびプラスミドの中へのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、宿主細胞の中へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物のその発現および決定において用いられるもの等)の詳細な説明は、Sambrook,J.et al.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、およびColigan,J.et al.、Current Protocols in Immunology、Wiley & Sons,Incorporated(2007)を含む多数の出版物から得ることができる。
【0084】
ヒト抗CSF−1R抗体の発現および精製
各々の抗体については、PCRクローニング等の好適な方法によって、好適な発現プラスミド(例えばpGSHC)の中へ好適な重鎖ヌクレオチド配列(例えば抗体1については配列番号13)を操作し、好適な発現プラスミド(pGSLC等)の中へ好適な軽鎖ヌクレオチド配列(例えば抗体1については配列番号14)を操作する。安定した細胞株を樹立するために、直線化した重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドを好適な宿主細胞線(NSOまたはCHOの細胞等)中にエレクトロポレーションによってコトランスフェクションし、透析したウシ胎仔血清およびグルタミン合成酵素を補充した好適な培地(グルタミン不含有ダルベッコ変法イーグル培地等)中で培養する。酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)によって抗体発現についてクローンをスクリーニングし、スピナーフラスコ中での培養が最高の産生株を選択する。プロテインA親和性クロマトグラフィー等の好適な方法によって抗体を精製する。
【0085】
表1は、本発明の抗体1の様々なCDRのアミノ酸配列および配列番号を提供する。CDR配列はすべてKabatの慣例を使用して決定される。表2は、本発明に関連する様々な配列の配列番号を提供する。以下に開示されたアミノ酸配列をコードするポリ核酸配列も本発明の範囲内に含まれる。
【0086】
【表1】
【0087】
【表2】
【0088】
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)結合アッセイ
CSF−1R結合アッセイについては、可溶性組換えヒトCSF−1R−Fc融合タンパク質(R&D Systems)(1μg/mL×100μL)により96ウェルプレートをコートし、プレートを密封し、4℃で一晩インキュベーションする。0.2%TWEEN−20(登録商標)を含むPBS(リン酸緩衝生理食塩水)(PBS/T)によりウェルを3回洗浄し、次いで3%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで室温(20〜25℃)(RT)で1時間ブロッキングする。BSA−PBS混合物を吸引し、PBS/Tでプレートを3回洗浄する。抗体1または対照IgGの連続的な希釈を行い(3μg/mLで開始し3倍希釈をする)、100μLをRTで1時間ウェルに添加する。PBS/Tでウェルを3回洗浄する。洗浄後に、100μLのPBS中の抗ヒトF(ab’)
2断片特異的HRPコンジュゲート(Jackson ImmunoResearch)(1:5000希釈)によりプレートをRTで1時間インキュベーションする。PBS/Tでプレートを5回洗浄し、次いで100μLのTMBペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液B(KPL)の1:1調製物によりRTで15分間インキュベーションする。100μLの0.1M H
2SO
4を添加して比色反応を停止する。450nmに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、データを採取する。GraphPad Prismソフトウェアで吸光度データを分析してED
50を計算する。ED
50(すなわち2分の1最大有効用量)は最大結合の50%を達成するのに必要な用量である。
【0089】
ヒトCSF−1Rに対する抗体1のED
50は8.7×10
−11Mであり、0.09nMとして報告される。抗体1はCSF−1Rに対して強い結合を示す。
【0090】
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)ブロッキングアッセイ
抗体がCSF−1/CSF−1R相互作用をブロックすることを示すELISA
CSF−1(R&D Systems)(0.5μg/mL×100μL)により96ウェルマイクロタイタープレートを4℃で一晩コートする。PBS/Tでウェルを3回洗浄し、次いで100μLの3%BSA/PBSでRTで1時間ブロッキングする。PBS/Tで再び3回洗浄する。0.250μg/mLの最終的な濃度までPBS中で可溶性ヒトrh−CSF−1R−Fc融合タンパク質(R&D Systems)を希釈する。同時に、200nMの最終的な濃度までPBS中で抗体1を希釈する。最初は200nMから3×10
−12Mまで1:3で増加させて抗体1を連続的に希釈する。100μLの各希釈の抗体1と100μLのrh−CSF−1R−FcをRTで30分間合わせる。CSF−1をコートしたウェル中で100μLの抗体1:CSF−1R−Fc混合物をRTで1時間インキュベーションする。RTで1時間のインキュベーション後に、PBS/Tで3回洗浄し、抗ヒトIgG−FcHRPコンジュゲート抗体の1:5000希釈をRTで1時間プレートに添加する。PBS/Tでプレートを5回洗浄し、次いで100μLのTMBペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液B(KPL)の1:1調製物によりRTで15分間インキュベーションする。100μLの0.1M H
2SO
4を添加して比色反応を停止する。450nmに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、データを採取する。GraphPad Prismソフトウェアで吸光度データを分析してIC
50を計算する。IC
50(すなわち2分の1最大阻害濃度)は受容体に対するリガンド結合の50%阻害を引き起こす抗体の濃度である。
【0091】
ヒトCSF−1Rに対する抗体1の結合のIC
50は8.1×10
−10Mであり、0.81nMとして報告される。抗体1はCSF−1Rに対するCSF−1結合を阻害し、それによってCSF−1リガンドによるCSF−1R活性化を防止する。
【0092】
抗体がIL−34/CSF−1R相互作用をブロックすることを示すELISA
IL−34(R&D Systems)(0.5μg/mL×100μL)により96ウェルマイクロタイタープレートを4℃で一晩コートする。PBS/Tでウェルを3回洗浄し、次いで100μLの3%BSA/PBSでRTで1時間ブロッキングする。PBS/Tで再び3回洗浄する。0.250μg/mLの最終的な濃度までPBS中で可溶性ヒトrh−CSF−1R−Fc融合タンパク質(R&D Systems)を希釈する。同時に、200nMの最終的な濃度までPBS中で抗体1を希釈する。最初は200nMから3×10
−12Mまで1:3で増加させて抗体1を連続的に希釈する。100μLの各希釈の抗体1と100μLのrh−CSF−1R−FcをRTで30分間合わせる。IL−34をコートしたウェル中で100μLの抗体1とCSF−1R−Fc混合物をRTで1時間インキュベーションする。RTで1時間のインキュベーション後に、PBS/Tで3回洗浄し、抗ヒトIgG−FcHRPコンジュゲート抗体の1:5000希釈をRTで1時間プレートに添加する。PBS/Tでプレートを5回洗浄し、次いで100μLのTMBペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液B(KPL)の1:1調製物によりRTで15分間インキュベーションする。100μLの0.1M H
2SO
4を添加して比色反応を停止する。450nmに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、データを採取する。GraphPad Prismソフトウェアで吸光度データを分析してIC
50を計算する。IC
50(すなわち2分の1最大阻害濃度)は受容体に対するリガンド結合の50%阻害を引き起こす抗体の濃度である。
【0093】
ヒトCSF−1Rに対する抗体1の結合のIC
50は7.0×10
−10Mであり、0.71nMとして報告される。抗体1はCSF−1Rに対するIL−34結合を阻害し、それによってIL−34リガンドによるCSF−1R活性化を防止する。
【0094】
表面プラズモン共鳴/Biacore(登録商標)分析による結合反応速度分析
Biacore(登録商標)2000 SPR Biosensor(GE Healthcare)で25℃でCSF−1R−Fcに対する抗体1の結合反応速度を測定する。標準的なアミンカップリングプロトコルを使用して、CM5チップ上で395〜1200の応答単位で、可溶性CSF−1R−Fc融合タンパク質(10μg/mLの濃度でpH5)を固定化した。結合親和性測定の間のランニングバッファーとしてHBS−EP(0.01Mヘペス(pH7.4)、0.15mM NaClおよび3mM EDTA、0.005%v/v界面活性剤P20)を使用する。溶液中の抗体がCM5センサーチップの準備された表面の上に1.5〜100nMの範囲の濃度で注入されるようにして相互作用分析を実行する。結合のために3分間にわたり抗体を注入し、15分間解離させる。10μL/分の20mM HCLの注入によって固定化タンパク質の再生を実行する。BIAevaluationバージョン4.1ソフトウェアを使用して、1:1 Langmuirモデルに対してデータを同時に全体的にフィッティングさせることによって複合体形成のK
a(k
on)およびK
d(k
off)を決定する。モーラー(1/M)における測定した1/K
Dの比から平衡会合定数(kA)を計算する。モーラー(M)における測定した速度定数K
d/K
aの比から平衡解離定数(K
D)を計算する。
【0095】
ヒトCSF−1Rによる抗体1の多重Biacore(登録商標)分析についての平均のK
a、K
dおよびK
Dの値は表3に要約される。
【0096】
【表3】
【0097】
抗体1はCSF−1Rに対する高い結合親和性を実証する。
【0098】
ウエスタンブロットによって検出されるCSF−1Rのリン酸化
CSF−1Rを安定的にトランスフェクションしたNIH3T3細胞を播種し、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1mg/mLのジェネティシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の1mLのウェル中で5×10
5細胞/ウェルの密度で12ウェルプレート中に細胞を5時間置く。PBS中で単層を2回洗浄し、0.9mL/ウェルの1%FBS含有DMEM中で一晩培養する。DMEM中で抗体1の連続的な希釈を行い(1μg/mLで開始し3倍希釈をする)、100μLを37℃で2時間ウェルに添加する。100ng/mLのCSF−1またはIL−34リガンドにより細胞を10分間刺激し、次いで氷上に置き、氷冷PBSで洗浄する。細胞を、100μLの50mMヘペス(pH7.5、150mM NaCl、0.5%トリトンX−100、1mM Na
3VO
4、10mM NaPPi、50mM NaF)およびプロテアーゼ阻害剤の錠剤(Roche)中で10分間氷上で溶解する。溶解した細胞を4℃で遠心分離によって清澄化する。20μLのライセートを変性電気泳動ゲルにロードし、ニトロセルロース膜上にブロッティングする。1μg/mLで抗リン酸化CSF−1R抗体(Cell Signaling)を使用することによって、ブロット上のチロシンがリン酸化されたCSF−1Rを検出する。抗リン酸化−MAPK(1:500希釈)または抗リン酸化−Akt(1:1000)(Cell Signaling)のいずれかによるブロットのプロービングによって、CSF−1Rシグナル伝達を決定する。レーンの等しいローディングを保証するために、抗CSF−1R抗体(1μg/mL;R&D Systems)または抗アクチン抗体(1:2000;Sigma)によりブロットをプロービングする。すべての一次抗体をRTで1時間振動しながら、続いてHRPをコンジュゲートした対応する二次抗体もRTで1時間振動しながらインキュベーションした。化学発光試薬(GE Healthcare)によりバンドを可視化する。
【0099】
CSF−1またはIL−34のいずれかで刺激された場合、CSF−1Rを安定的にトランスフェクションしたNIH3T3細胞はCSF−1Rの迅速なリン酸化を示す。抗体のレベルが1nMである場合でさえ、抗体1の存在はCSF−1Rリン酸化を阻害し、CSF−1Rに対する抗体1の結合がCSF−1またはIL−34のいずれかによる受容体の活性化を防止することを示す。CSF−1Rリン酸化の阻害は、CSF−1またはIL−34経路のどちらかによって使用されるシグナル分子のリン酸化の減退ももたらす。細胞を100nM〜1nMの抗体1によりインキュベーションする場合、AktおよびMAPK(CSF1−Rの下流である)の両方のリン酸化レベルは減少した。それゆえ、抗体1は、CSF−1R活性化およびCSF−1R刺激に続くキナーゼカスケードの活性化を防止する。ブロットをアクチンおよびCSF−1R分子に対する抗体でプロービングした場合に観察される各レーン中の等しい化学発光シグナルによって証明されるように、レーンの間のアクチンおよびCSF−1Rのタンパク質レベルに差はなかった。したがって、CSF−1Rリン酸化の阻害はタンパク質サンプルの不均等なローディングによる技術的問題点のためではなく、シグナル伝達が低下したことが真に示されている。
【0100】
内部移行および分解のアッセイ
抗体1はCSF−1R受容体の内部移行を誘導する
8ウェルチャンバー付スライド(Nunc)上にNIH−3T3−CSF−1R細胞をプレーティングし、細胞がウェルの表面積の50%を覆うまで37℃でインキュベーションする。実験の開始前に水:氷スラリー混合物中で4℃までスライドを冷却する。5μg/mLの抗体1により細胞をインキュベーションし、直ちに37℃に15分間〜4時間移して内部移行を生じさせる。スライドの別のセットを、対照として、5μg/mL抗体1により15分間〜4時間、水:氷スラリー混合物中でインキュベーションし続ける。4℃インキュベーションはCSF−1受容体の内部移行を防止し、それゆえこの細胞内で観察されるいかなるシグナルもアーティファクトである。インキュベーション後に、冷PBSで2回細胞を洗浄してから、氷冷1%パラホルムアルデヒドで細胞を15分間固定する。冷PBSで3回洗浄した後に、0.5%サポニンおよび1%BSAを含むPBS中で細胞を5分間透過性にし、次いで1%BSAを含むPBS中で再び洗浄する。ヤギCy3抗ヒトIgG(1:5000希釈)により1時間標識して抗体1を蛍光標識する。PBSで最終的な洗浄を3回実行してから、GelMount(Biomeda)中でマウントし、カバーグラスでスライドを覆う。蛍光標識した抗体1を顕微鏡で観察して、上述された様々な条件下の細胞内局在を決定できる。
【0101】
顕微鏡検査で、抗体1は実験の開始前の4℃では細胞の周囲で観察される。37℃への細胞のスイッチは、通常15分間以内に観察される抗体1/CSF−1R複合体の迅速な内部移行を可能にする。抗体1による1または2時間のインキュベーション後に、抗体/CSF−1R複合体はすべて核周囲に存在し、原形質膜上でほとんど観察されず、CSF−1Rに対する抗体1結合が、受容体の迅速な内部移行および細胞の内側での残存を誘導することを示す。最大2時間4℃で維持した細胞は、抗体1の内部移行なしで細胞周囲のみの染色を示す。したがって、抗体/CSF−1Rの内部移行は、細胞への抗体添加の15分以内に生じるATP依存性のプロセスである。
【0102】
抗体1はCSF−1R受容体の分解を誘導する
12ウェルプレート中の10%FBSおよび1mg/mLのジェニティシン(geniticin)を含む1mLのDMEM培地中に、5×10
5細胞/ウェルでNIH−3T3−CSF−1R細胞を播種する。細胞を37℃で5時間インキュベーションした後に、100ng/mLのCSF−1または15μg/mLの抗体1のいずれかをプレートへ添加する。CSF−1はCSF−1Rの内部移行および分解を誘導し、そのために実験の陽性対照として働くことが公知である。細胞の回収前の1および5時間、CSF−1を細胞上に残存するようにする。他のウェルにおいて、細胞の回収前に抗体1により24および48時間インキュベーションする。培地を吸引し、細胞を溶解し、清澄化した溶解物をゲル上で泳動する(上記のように)。転写したタンパク質を抗CSF−1R抗体によりプロービングして、各条件についての受容体の量を決定する。抗アクチン抗体により同じブロットをプロービングして、タンパク質レベルを正規化する。ウエスタンブロット上のバンド密度を測定するMulti−Gaugeプログラムを使用して、CSF−1Rおよびアクチンレベルを定量する。相対的全CSF−1Rタンパク質レベルは、対応するアクチンバンド密度で割った全CSF−1Rバンド密度によって表わされる。
【0103】
NIH−3T3−CSF−1R細胞のCSF−1インキュベーションは処理の1時間以内にCSF−1Rの分解をもたらし、CSF−1Rレベルは5時間までに半分になる。抗体1によりインキュベーションした場合CSF−1Rの分解は前述のようではなく;抗体1は4分の1までCSF−1Rレベルを減少させる。48時間後に分解レベルは同じままであり、分解速度が一定のままであることを示す。それゆえ、CSF−1Rへ結合する抗体1は細胞中で受容体の分解をもたらす。
【0104】
抗体1による抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)
CSF−1RへのCSF−1結合の阻害ならびにCSF−1Rの内部移行および分解の誘導に加えて、抗体1は、ADCC応答の誘導によってもCSF−1Rを阻害する。
【0105】
NKM−1ヒト白血病細胞を、96ウェルプレート中の10% Ultra−Low IgG FBSおよび3ng/mLのヒトIL−2を含む25μL RPMI培地中に、2×10
5細胞/mLで播種する。IgG1またはIgG2いずれかの骨格中の抗体1の1μg/mLを1:3で連続的に希釈し、25μL/ウェルで添加する。15分間のインキュベーション後に、25μLの3×10
6細胞/mLのヒトNK細胞(Lonza)を播種し、37℃で追加の4時間インキュベーションする。aCella−TOXキット(Cell Technology)からのLysis Bufferを10μL添加し、15分間RTにする。125μLの低IgG FBSを添加し、750×gで1分間プレートを遠心分離する。Optiplates(Perkin Elmer)において、aCella−TOXキットからの50μLのEnzyme Assay Diluentを添加し、50μLの細胞上清をOptiplatesへ慎重に移す。キット説明書に従って酵素アッセイ試薬および検出試薬を調製し、100μLの酵素アッセイ試薬を、直ちに続いて50μLの検出試薬をOptiplatesへ添加する。試薬の添加20分間後にルミノメーター中のプレートを読み取る。
【0106】
ADCC活性は抗体1用量依存的様式で増加し、抗体1濃度が1μg/mLに到達する場合NKM−1細胞の9%が死滅した。これとは対照的に、抗体1がIgG2骨格の中へクローン化された場合、抗体1の量を増加させてもADCC活性の変化はない。それゆえ、抗体1(IgG1分子)は結合する細胞のADCCを誘導する。
【0107】
エピトープマッピング
先の出版物は、CSF−1Rの最初の3個のIgドメインへCSF−1が結合することを決定した(Wang et al.,Mol.Cell.Biol.13:5348(1993))。抗体1はCSF−1Rを結合し、ヒトCSF−1RへのCSF−1結合を阻害し、したがってそれはCSF−1Rの最初の3個のIgドメインまたはそのドメインの近くに結合するに違いない。CSF−1R分子上のどのエピトープに抗体1が結合するかを決定するために、マウスおよびヒトの最初の3個のIgドメインを取り替える(表4を参照されたい)。マウスIgドメインがヒトCSF−1Rの重要な結合領域中に挿入されるならば、それゆえ抗体1はマウスCSF−1Rを認識せず、抗体の結合は生じないだろう。
【0108】
最初の3個のIgドメインの修飾物を、細胞外ドメインの最もC末端の残りの2個のIgドメインを含むヒトCSF−1R骨格の中へ挿入する。タンパク質産生および分子の安定性の容易性のためにこれらのコンストラクトをIgG分子のFc部分へ融合させる。
【0109】
【表4】
【0110】
したがってキメラ1は、マウスIgドメイン1、ヒトIgドメイン2およびヒトIgドメイン3(m、h、h)、ヒトIgドメイン4および5を含み、Fcタグへ融合される。キメラ2〜キメラ7は以下の通りである。m、m、h(キメラ2)、m、m、m(キメラ3)、h、m、h(キメラ4)、h、m、m(キメラ5)、h、h、m(キメラ6)およびm、h、m(キメラ7)を、ヒトCSF−1Rの最後の2個のIgドメインおよび次いでFcタグへ融合する。
【0111】
キメラCSF−1Rタンパク質への抗体1結合は、結合ELISAおよびBiacore(登録商標)によって上記のように決定する。簡潔には、200ng/mLのヒト、マウスまたはキメラ1〜7のタンパク質を100μL用いてプレートを一晩コートする。プレートの洗浄およびブロッキングの後に、抗体1を100nM濃度で重複して添加する。HRPコンジュゲート抗ヒトFab二次抗体を1:10,000の濃度で添加して、CSF−1R分子と結合する抗体1を検出する。
【0112】
予想されるように、抗体1は、ELISA結合アッセイにおいてヒトCSF−1Rへ結合するが、マウスCSF−1Rには結合しない。抗体1は、第1または第2のヒトIgドメインを含むキメラへ弱く結合するが、第1または第2のマウスIgドメインを含むキメラには結合しない。抗体1は、ヒトCSF−1Rの第1および第2のIgドメインを含むキメラへ強く結合する。他のすべてのコンストラクトは抗体1を結合しない。したがって、結合アッセイにおいて評価した場合、抗体1はIgドメイン1および2へ結合するが、ヒトCSF−1Rへの強い抗体結合のためには両方のドメインを必要とする。Biacore(登録商標)データはELISAデータを再現する。抗体レベルが1μMの場合でさえ、ヒト第2のIgドメインを含まないキメラコンストラクトはどれも抗体1を結合せず、第2のIgドメインが抗体1結合に必要なことが示された。第1のIgドメインもヒト起源の場合、抗体1の結合はさらに促進された。それゆえ、抗体1は主としてCSF−1Rの第2のIgドメインへ結合するが、第1のIgドメインとある程度の有用な接触を有する。
【0113】
分化および増殖のアッセイ
CSF−1によるマクロファージ分化
8チャンバースライドの各チャンバー中の10%FBSおよび100ng/mLのhCSF−1を含む900μL Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地中に4×10
5細胞/mLの密度で単球(Lonza)を播種する。RPMI中で抗体1の連続的な希釈を行い(1μg/mLで開始し3倍希釈をする)、100μLをウェルに添加する。単球のプレートへの接着および伸長(マクロファージ分化の特性である)が明らかに観察されるまで、3日ごとに培地を交換して37℃でインキュベーションする。
【0114】
CSF−1の存在下において2nM以上の濃度の抗体1で処理した単球はマクロファージへと分化することができず、単球の丸い形態特性を保持する。単球のマクロファージ分化へのCSF−1による誘導は、0.25nMのIC
50で抗体1により阻害することができる。加えて、多くのものが処理の間に死滅し、CSF−1による連続的な刺激なしには生き残ることができない。
【0115】
IL−34によるマクロファージ分化
8チャンバースライドの各チャンバー中の10%FBSおよび100ng/mLのhIL−34を含む900μL Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地中に、4×10
5細胞/mLの密度で単球(Lonza)を播種する。RPMI中で抗体1の連続的な希釈を行い(1μg/mLで開始し3倍希釈をする)、100μLをウェルに添加する。単球のプレートへの接着および伸長(マクロファージ分化の特性である)が明らかに観察されるまで、3日ごとに培地を交換して37℃でインキュベーションする。
【0116】
IL−34の存在下において2nM以上の濃度の抗体1により処理した単球はマクロファージへと分化することができず、単球の丸い形態特性を保持する。単球のマクロファージ分化へのIL−34による誘導は、0.3nMのIC
50で抗体1により阻害することができる。加えて、多くのものが処理の間に死滅し、CSF−1による連続的な刺激なしには生き残ることができない。
【0117】
CSF−1による単球の増殖
10%FBSおよび100ng/mLのCSF−1を含むRPMI 1640培地の存在下において96ウェルプレート中に3000細胞/ウェルの密度で単球(Lonza)を播種する。翌日、培地を交換し、20nM〜0.01nMに連続的に希釈した抗体1(1:3倍希釈)を添加する。3日後に、10%FBS、100ng/mLのCSF−1、および抗体を含む新鮮培地と培地を交換し、細胞を追加の5日間増殖させる。100μLのCellTiter Glo Luminecent緩衝液および基質(Promega)の添加と同時に、細胞を10分間振盪し、発光を生存率の指標として読み取る。
【0118】
単球増殖の50%を阻害する抗体1のIC
50は1.4×10
−10Mであり、0.1nMとして報告される。抗体1の存在下における単球増殖のCSF−1による誘導についてのIC
50は、抗体1が培養中の単球の増殖を阻害することを示す。
【0119】
IL−34による単球の増殖
10%FBSおよび100ng/mLのIL−34を含むRPMI 1640培地の存在下において96ウェルプレート中に3000細胞/ウェルの密度で単球(Lonza)を播種する。翌日、培地を交換し、20nM〜0.01nMに連続的に希釈した抗体1(1:3倍希釈)を添加する。3日後に、10%FBS、100ng/mLのIL−34、および抗体を含む新鮮培地と培地を交換し、細胞を追加の5日を増殖させる。100μLのCellTiter Glo Luminecent緩衝液および基質(Promega)の添加と同時に、細胞を10分間振盪し、発光を生存率の指標として読み取る。
【0120】
単球増殖の50%を阻害する抗体1のIC
50は、0.5nMである。抗体1の存在下における単球増殖のIL−34による誘導についてのIC
50は、抗体1が培養中の単球の増殖を阻害することを示す。
【0121】
CSF−1による腫瘍細胞株の増殖アッセイ
96ウェルプレート中の1%FBSを含む100μLのRPMI 1640培地中に、1×10
4細胞/mLでNKM−1白血病細胞を一晩播種する。1%FBSおよび20nM〜0.01nMに連続的に希釈した抗体1(1:3倍希釈)を含むRPMI 1640培地中の細胞に20ng/mLのCSF−1を添加する。追加の3日間37℃でインキュベーションする。100μLのCellTiter Glo Luminecent緩衝液および基質(Promega)の添加と同時に、細胞を10分間振盪してから、発光(生存率の指標として)を読み取る。
【0122】
抗体1の存在下におけるNKM−1増殖についてのIC
50は7.6×10
−11Mであり、0.07nMとして報告される。これは抗体1が培養においてNKM−1細胞の増殖を阻害することを示す。
【0123】
CSF−1Rが腫瘍の表面上で発現される、インビボの腫瘍モデル
抗体1により処理したNKM−1ヒト白血病を有するマウスの生存延長
Nu/nuマウスを致死量以下の200rad/マウスで24時間照射してから、2.5×10
6のNKM−1白血病細胞を静脈注射する。さらに24時間後、60mg/kgのヒトIgG、60mg/kg、20mg/kgまたは5mg/kgの抗体1のいずれかを毎週2回投与される4群へと、マウスをランダムに分ける。マウスを生存について毎日モニターする。ログランクMantel Cox検定によって確率を決定する。
【0124】
【表5】
【0125】
腫瘍体積は、式、体積=[(π/6)l×w
2]によって計算され、式中、πは3.14と等しく、wは幅を表わし、lは長さを表わす。対照のパーセントまたは%T/C=100
*(処理体積)/(対照体積)。p値が0.05以下だったならば、統計的有意性があるとみなされた。
【0126】
表5中で見られるように、抗体1はNKM−1白血病細胞を有するマウスの生存を増加させる。
【0127】
CSF−1Rが腫瘍関連マクロファージの表面上で発現されるインビボの腫瘍モデル
抗CSF−1R抗体1は、CSF−1Rのヒト型を認識するが、この受容体のマウス型を認識しない完全ヒト抗体である。それゆえ、CSF−1Rがマクロファージ上で発現される場合のインビボの研究の概念実証を行うために、抗マウス抗体が必要とされる。これらの研究は、マウス異種移植モデルにおけるヒト腫瘍の増殖に対するマウスマクロファージの役割を検討する。抗マウス抗体は腫瘍ではなくマウスマクロファージに影響を与え、この能力は腫瘍増殖に対する間質マクロファージの効果を測定することを可能にする。以下の実験は、抗体2(ラット抗マウスCSF−1R抗体)で行なわれる。
【0128】
ヒト子宮内膜癌のAN3CA異種移植モデルにおける抗マウスCSF−1RmAbの有効性
Nu/nuマウス(メス、7〜8週齢)に5×10
6のAN3CA細胞/マウスを左脇腹へ皮下注射する。腫瘍が約200mm
3に到達した時に、マウスを12マウス/処理の群へとランダム化する。
【0129】
抗体2およびラットIgGを6mg/mLの濃度で生理食塩水中で調製し、40mg/kgで1週間に3回皮下投与する。15日目に、腫瘍体積を記録し、%T/Cを計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。ラットIgG対照群に対する、抗体2による処理群についての66%のT/C%を計算する。これらの結果は抗体2により処理した動物における有意な腫瘍阻止(p=0.045)を示す。
【0130】
ヒト乳癌のHCC1954異種移植モデルにおける抗マウスCSF−1RmAbの有効性
Nu/nu(メス、7〜8週;Charles River Laboratories)マウスに、1×10
7のHCC1954細胞/マウスで皮下注射する。腫瘍が300mm
3のサイズに到達した時に、腫瘍サイズによりマウスをランダム化し、各処理群に12動物を割り付ける。ラットIgGおよび抗体2を6mg/mLの濃度で生理食塩水中で調製し、1週間に3回皮下投与する。40mg/kgでラットIgGを動物に与え、各注入を40mg/kgまたは10mg/kgのいずれかで抗体2を動物に与える。毎週2回の腫瘍測定を記録し;第1の注入の37日後にT/C%を計算する。反復測定分散分析を使用して、腫瘍体積を分析する。
【0131】
表6中で示されるように、37日目に77%のT/C%は10mg/kgを投与した処理群について、および56%のT/C%は40mg/kgを投与した処理群について、生理食塩水対照群に対する相対的腫瘍体積の比としてて計算した。結果は40mg/kgの抗体2により処理した動物における有意な腫瘍阻止(p=0.0014)を示す。
【0132】
DU145ヒト前立腺異種移植モデルにおける抗マウスCSF−1RmAbの抗腫瘍効果
Nu/nuマウス(オス、7〜8週齢)に15×10
6のDU145細胞/マウスを左脇腹へ皮下注射する。腫瘍が約250mm
3に到達した時に、マウスを12マウス/処理の群へランダム化する。
【0133】
抗体2およびラットIgGを6mg/mLの濃度で生理食塩水中で調製し、40および10mg/kgで1週間に3回皮下投与する。21日目に、腫瘍体積を記録し、10mg/kgおよび40mg/kgについての%T/Cを計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【0134】
表6中で示されるように、ラットIgG対照群に対する、処理群(10mg/kgおよび40mg/kg)それぞれについての50のT/C%および43のT/C%を計算する。これらの結果は抗体2により処理した動物における有意な腫瘍阻止(両方の濃度についてp=<0.0001)を示す。
【0135】
【表6】
【0136】
抗マウスCSF−1RmAbにより処理されたHCC1954乳房腫瘍およびDU145前立腺腫瘍におけるマクロファージインフィルトレーションの低下
上述されたHCC1954(乳房)およびDU145(前立腺)の動物試験中の動物から腫瘍を取り出す。最長の軸に沿って腫瘍を切断し、振動させながら4℃で一晩10%ホルマリン中に置く。24時間後に、PBS中で20分間にわたって2回洗い、次いで腫瘍が100%エタノール中に存在するまで、エタノール溶液の濃度を漸増させて添加する。100%のキシレン中の複数回のインキュベーションによりエタノールをキシレンと交換し、パラフィン中に腫瘍を包埋する。パラフィンブロックを4μmで切片にし、スライドグラス上に置く。キシレン、続いて水濃度を増加させたエタノール中の漸進的なインキュベーションによって組織を脱パラフィンおよび再水和する。target retrieval solution(Dako)中で腫瘍スライドをマイクロ波で3分間加熱してから、3%H
2O
2により内因性のペルオキシダーゼをRTで10分間ブロッキングする。Protein Block(Dako)で非特異的タンパク質結合を10分間ブロッキングしてから、ビオチンにコンジュゲートしたラット抗マウスマクロファージ特異的抗体(F4/80(2μg/mL;Serotec))を添加し、4℃で一晩インキュベーションする。HRPストレプトアビジン(1:1000希釈;Jackson ImmunoResearch)中でRTで45分間インキュベーションし、3回洗浄する。キットの説明書通りにDAB(Dako)中で顕色させ、水中で2回洗浄することにより反応を停止する。マイヤーのヘマトキシリン(10分間;Dako)で短時間対比染色し、続いて水洗浄、酸アルコール浸漬、第2の水洗浄およびアンモニア水を使用する青味付を行う。脱水し、透明化し、および永久封入剤を使用してカバーグラスをかける。各処理群につき3匹の動物からの5画像を分析する。ImageProソフトウェアを使用して、各処理群についてのマクロファージ数/領域を決定する。
【0137】
【表7】
【0138】
表7中で見られるように、マクロファージ数は特に周囲に沿って両方の腫瘍モデルにおいて低下している。したがって抗体2による処理は腫瘍のマクロファージインフィルトレーションの減少をもたらし、抗マウスCSF−1R抗体がこれらの腫瘍中のマクロファージ集団を枯渇させる原因であることを示す。
【0139】
腫瘍進行に対するマクロファージおよびCSF−1レベルの重要性
乳房腫瘍および前立腺腫瘍の他の腫瘍の増殖の阻害と同様に、多くの癌の治療は、抗体1の投与によって有益に達成することができる。腎臓癌等いくつかの腫瘍タイプは細胞表面上でCSF−1Rを発現し、抗体1処理により増殖することを直接阻害することができた(Soares,et al.,Modern Pathol.22:744−752(2009))。腫瘍増殖を誘導するマクロファージを抗体1が除去することができる場合には、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫(多くの腫瘍関連マクロファージ集団を有する)等の他の腫瘍タイプは、抗体1処理から利益を得ることができる(Steidl,et al.New Engl.J.Med.362:875−885(2010);Zheng,et al.,Blood 114:3625−3628(2009))。加えて、結腸直腸癌等のCSF−1を分泌する腫瘍は、抗CSF−1処理または抗CSF−1R処理に対して感受性が高く(Aharinejad,et al.,Cancer Res.62:5317−5324(2002))、抗体1処理に適切だろう。さらに、CSF−1の高発現が予後不良と相関する卵巣癌、肝細胞癌および腎細胞癌はすべて抗体1処理のための候補になるだろう(Toy,et al.,Gyn.Oncol.80:194−200(2001);Zhang,et al.,Gyn.Oncol.107:526−531(2007);Zhu,et al.,J.Clin.Oncol.26:2707−2716(2008);Gerharz,et al.,Urol.58:821−827(2001))。
【0140】
腫瘍関連マクロファージを保持する非CSF−1R発現腫瘍は、CSF−1を分泌する場合のみ、抗CSF−1R抗体によって増殖阻害される
5×10
5細胞/mLで、腫瘍細胞株HCC1954(乳房)、DU145(前立腺)およびPc3(前立腺)を1%FBSを含む増殖培地中で48時間播種する。培地を回収し、清澄化し、R&D Quantikine Human M−CSF Assay Kit(R&D Systems)を使用して分析する。時刻0時間および48時間でpg/mLとしてCSF−1レベルを決定する。
【0141】
0時間では、予想されるように培地中に認識できるCSF−1は存在しなかった。しかしながら、48時間以内に、HCC1954細胞は3613pg/mLのCSF−1を分泌し、一方DU145細胞は4019pg/mLのCSF−1を産生した。これとは対照的に、Pc3細胞培地はわずか39pg/mLのCSF−1を含んでいた。
【0142】
CSF−1発現の欠如が抗CSF−1R処理への抵抗性と相関しているのかを検証するために、前立腺細胞株Pc3をマウスにおいて増殖させる
ヌードマウス(オス、7〜8週齢)に5×10
6のPc3前立腺細胞を皮下注射し、腫瘍を300mm
3に到達させてから12匹の各マウスを処理群へと細分する。対照腫瘍が2000mm
3に到達するまで、40mg/kgのラットIgG、40mg/kgの抗体2、または10mg/kgの抗体2のいずれかを動物に1週間に3回与える。腫瘍体積を測定し、18日目にラットIgG対照群に対する相対的腫瘍体積の比として処理群についてのT/C%を計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【0143】
【表8】
【0144】
ラットのIgG処理対照群と抗体2処理群との間に増殖の差はなく、CSF−1レベルの上昇は抗CSF−1R抗体による処理のためのバイオマーカーであり得ることを示す。
【0145】
CSF−1Rが腫瘍関連マクロファージの表面上で発現される場合、CSF−1分泌は抗CSF−1R処理の感受性に相関する
表9および10中で以下で詳述されるように、ヌードマウスへ細胞を皮下注射し、腫瘍が300mm
3を到達させてから12匹の各マウスを処理群へと細分する。対照腫瘍が2000mm
3に到達するまで、表9および10中で以下に詳述される処理レジメントに従って、動物に1週間に3回投薬する。腫瘍体積を測定し、ラットIgG対照群に対する相対的腫瘍体積の比として各処理群についてのT/C%を計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【0146】
【表9】
【0147】
【表10】
【0148】
CSF−1分泌腫瘍(表9)はすべて、抗体2による抗CSF−1R処理に応答するが、CSF−1を分泌しない腫瘍(表10)は抗CSF−1R抗体2に応答しないかまたは弱く応答する。CSF−1分泌は、CSF−1Rが腫瘍関連マクロファージの表面上で発現される腫瘍モデルにおける抗CSF−1R処理の感受性に相関する。したがって、CSF−1Rが腫瘍関連マクロファージの表面上で発現する場合、CSF−1レベルの上昇は感受性指標またはバイオマーカーとして機能する可能性がある。
【0149】
CSF−1Rは腫瘍細胞の表面上でも発現し得る。CSF−1分泌は、CSF−1R腫瘍細胞表面発現のための抗CSF−1R処理の感受性に相関しない。
【0150】
腫瘍および患者血清サンプルにおけるIL−34レベル
CSF−1に加えて、IL−34もCSF−1Rに結合することができ、受容体のリン酸化を誘導し、下流のシグナル分子を活性化し、これらはマクロファージ分化および生存をもたらす。CSF−1およびIL−34の両方はCSF−1Rの細胞外領域中のIgGドメインに結合し(Lin,et al.,Science,320:807−11(2008))、両方のリガンドのCSF−1Rへの結合は抗体1によって阻害することができる(抗体1によるCSF−1およびIL−34の結合の阻害については、それぞれ上で論じられたようにIC
50=0.81nMおよびIC
50=0.71nM)。CSF−1Rにより安定的にトランスフェクションされたNIH3T3細胞の抗体1による処理は、IL−34によるCSF−1Rのリン酸化を阻害する(上で論じられたように)。さらに、単球からマクロファージへの分化およびマクロファージ増殖のIL−34誘導は、それぞれ0.3nMおよび0.5nMのIC
50で抗体1により阻害することができ(上で論じられたように)、それはCSF−1で観察された結果と同等である。それゆえ、IL−34活性および抗体1によるその阻害はCSF−1により観察されたものに類似する。
【0151】
IL−34レベルは、乳房腫瘍株、前立腺腫瘍株および子宮内膜腫瘍細胞株を含む多くの腫瘍細胞において上昇する。加えて、前立腺および乳房の患者の亜集団は血清中で高IL−34タンパク質レベルを有する。したがって、IL−34はCSF−1とほぼ同一に機能し、CSF−1分泌は抗CSF−1R処理の感受性に相関するので、IL−34レベルの上昇も感受性指標またはバイオマーカーとして機能する。
【0152】
乳房腫瘍組合わせ研究
Nu/nuマウス(メス、7〜8週齢)に1×10
7のHCC−1954乳腺細胞/マウスを皮下注射し、腫瘍を処理の前に300mm
3に到達させる。マウスを12群へとランダム化して、以下のように処理する。
【0153】
【表11】
【0154】
腫瘍体積を測定し、対照群に対する相対的腫瘍体積の比として各処理群についてT/C%を計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【0155】
表11中に示されるすべての研究において、抗体2、Herceptin(登録商標)、ドキソルビシンおよびパクリタキセルは単一薬剤として腫瘍増殖を阻害する。しかしながら、腫瘍標的剤と抗体2の組合わせは相加効果を有し、化学療法剤または腫瘍に影響を与える他の薬剤と抗CSF−1R抗体の組合わせは、単独のこれらの薬剤よりも効果的であることを示す。
【0156】
前立腺組合せ研究
Nu/nuマウス(オス、7〜8週齢)に1.5×10
7のDU145前立腺細胞/マウスを皮下注射し、腫瘍を処理の前に300mm
3に到達させる。マウスを10群へとランダム化して、以下のように処理する。
【0157】
【表12】
【0158】
腫瘍体積を測定し、対照群に対する相対的腫瘍体積の比として各処理についてT/C%を計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【0159】
ドセタキセルと抗体2の組合わせは相加効果を有し、前立腺癌の化学療法薬との組合わせは単独の化学療法薬よりも効果的であることを示す。
追加配列
配列番号9
Gln Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
配列番号10
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
配列番号11
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp Val
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
配列番号12
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile
35 40 45
Ser Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser
100 105 110
Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
配列番号13
atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattcacag 60
gaccagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcgaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac actgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggtgactac 360
gaggtcgact acggaatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt cgcctcagct 420
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtat 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccaag actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aagtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctattcc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggcaaa 1407
配列番号14
atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggagt acattcagcc 60
atccagttga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 120
acttgccggg caagtcaggg cattagcaat gctttagcct ggtatcagca gaaaccaggg 180
aaagctccta agctcctgat ctatgatgcc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 240
ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa 300
gattttgcaa cttattactg tcaacagttt aatagttacc cgtggacgtt cggccaaggg 360
accaaggtgg aaatcaaacg tgagttctag aggatccatc tgggataagc atgctgtttt 420
ctgtctgtcc ctaacatgcc ctgtgattat ccgcaaacaa cacacccaag ggcagaactt 480
tgttacttaa acaccatcct gtttgcttct ttcctcagga actgtggctg caccatctgt 540
cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct 600
gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca 660
atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct 720
cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga 780
agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 838
配列番号15
Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His
1 5 10 15
Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val
35 40 45
Glu Trp Asp Gly Pro Ala Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala
85 90 95
Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala
100 105 110
Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu
115 120 125
Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg
130 135 140
Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His
145 150 155 160
Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln
165 170 175
Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg
180 185 190
Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val
195 200 205
Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys
210 215 220
Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn
225 230 235 240
Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg
245 250 255
Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His
260 265 270
Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser
275 280 285
Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser
290 295 300
Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn
305 310 315 320
Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp
325 330 335
Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala
340 345 350
Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu
355 360 365
Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg
370 375 380
Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr
385 390 395 400
Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr
405 410 415
Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu
420 425 430
Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln
435 440 445
Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His
450 455 460
Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp
485 490 495
Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu
500 505 510
Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu
515 520 525
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro
530 535 540
Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser
545 550 555 560
Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu
565 570 575
Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala
580 585 590
Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp
595 600 605
Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala
610 615 620
Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu
625 630 635 640
Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly
645 650 655
Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu
660 665 670
Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser
675 680 685
Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu
690 695 700
Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val
705 710 715 720
Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser
725 730 735
Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu
740 745 750
Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe
755 760 765
Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val
770 775 780
Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala
785 790 795 800
Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg
805 810 815
Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr
820 825 830
Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile
835 840 845
Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys
850 855 860
Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe
865 870 875 880
Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu
885 890 895
Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu
900 905 910
Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser
915 920 925
Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu
930 935 940
Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala
945 950 955 960
Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys
965 970
配列番号16
Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His
1 5 10 15
Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val
35 40 45
Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala
85 90 95
Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala
100 105 110
Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu
115 120 125
Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg
130 135 140
Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His
145 150 155 160
Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln
165 170 175
Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg
180 185 190
Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val
195 200 205
Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys
210 215 220
Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn
225 230 235 240
Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg
245 250 255
Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His
260 265 270
Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser
275 280 285
Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser
290 295 300
Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn
305 310 315 320
Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp
325 330 335
Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala
340 345 350
Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu
355 360 365
Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg
370 375 380
Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr
385 390 395 400
Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr
405 410 415
Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu
420 425 430
Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln
435 440 445
Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His
450 455 460
Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp
485 490 495
Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu
500 505 510
Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu
515 520 525
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro
530 535 540
Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser
545 550 555 560
Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu
565 570 575
Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala
580 585 590
Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp
595 600 605
Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala
610 615 620
Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu
625 630 635 640
Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly
645 650 655
Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu
660 665 670
Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser
675 680 685
Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu
690 695 700
Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val
705 710 715 720
Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser
725 730 735
Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu
740 745 750
Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe
755 760 765
Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val
770 775 780
Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala
785 790 795 800
Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg
805 810 815
Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr
820 825 830
Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile
835 840 845
Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys
850 855 860
Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe
865 870 875 880
Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu
885 890 895
Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu
900 905 910
Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser
915 920 925
Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu
930 935 940
Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala
945 950 955 960
Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys
965 970
配列番号17
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr
20 25 30
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu
35 40 45
Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln
50 55 60
Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr
85 90 95
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu
100 105 110
Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu
115 120 125
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln
130 135 140
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
145 150 155 160
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala
165 170 175
Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu
180 185 190
Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His
195 200 205
Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu
210 215 220
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro
225 230 235 240
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser
245 250 255
Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser
260 265 270
Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn
275 280 285
Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val
290 295 300
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly
305 310 315 320
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu
325 330 335
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala
340 345 350
Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro
355 360 365
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro
370 375 380
Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro
385 390 395 400
Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro
405 410 415
Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly
420 425 430
Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp
435 440 445
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly
465 470 475 480
His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser
485 490 495
Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val
500 505 510
Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro
515 520 525
Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr
530 535 540
Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val
545 550
配列番号18
Met Pro Arg Gly Phe Thr Trp Leu Arg Tyr Leu Gly Ile Phe Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Leu Gly Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn
20 25 30
Glu Glu Cys Thr Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg
35 40 45
Ser Arg Leu Gln Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile
50 55 60
Ser Val Pro Tyr Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu
65 70 75 80
Gln Arg Ala Gln Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu
85 90 95
Val Ser Leu Ser Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Glu Gly
100 105 110
His Pro Ser Trp Lys Tyr Leu Gln Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn
115 120 125
Val Gln Gln Gly Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser
130 135 140
Val Leu Ser Leu Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg
145 150 155 160
Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr
165 170 175
Cys Ser Cys Cys Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu
180 185 190
Val Pro Ser Pro Gln Ser Cys Ser Pro Glu Pro Ser Leu Gln Tyr Ala
195 200 205
Ala Thr Gln Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Trp Ser Pro Ser Ser Pro Pro
210 215 220
His Ser Thr Gly Ser Val Arg Pro Val Arg Ala Gln Gly Glu Gly Leu
225 230 235 240
Leu Pro