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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】5768174
(24)【登録日】2015年6月26日
(45)【発行日】2015年8月26日
(54)【発明の名称】培養容器
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20150806BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20150806BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 C
C12M3/00 A
【請求項の数】6
【全頁数】21
(21)【出願番号】特願2014-181097(P2014-181097)
(22)【出願日】2014年9月5日
【審査請求日】2014年11月21日
(31)【優先権主張番号】特願2014-129567(P2014-129567)
(32)【優先日】2014年6月24日
(33)【優先権主張国】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000231361
【氏名又は名称】日本写真印刷株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100149216
【弁理士】
【氏名又は名称】浅津 治司
(74)【代理人】
【識別番号】100158610
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 新吾
(74)【代理人】
【識別番号】100121120
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 尚
(72)【発明者】
【氏名】小尾 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】大西 厚史
(72)【発明者】
【氏名】伊賀 敏洋
【審査官】
田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】
特開２００６−３２０３２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１４−０７９２２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１０−５２７５８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平０５−１８１０６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００６−０２３６４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
実開昭６３−１８６２９８（ＪＰ，Ｕ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
培養液を収容するための凹部を有する容器本体と、
前記凹部の上側に取り外し可能に嵌められる部材であって、前記培養液内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部を有し、嵌められた状態で下面が前記培養液の上面に当接するように前記培養液を押さえる押さえ部材とを備えた、培養容器。
前記凹部の上側に取り外し可能に嵌められる部材であって、前記培養液内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部を有し、嵌められた状態で下面が前記培養液の上面に当接するように前記培養液を押さえる押さえ部材とを備えた、培養容器。
【請求項2】
前記押さえ部材の前記下面は、前記培養液内の気泡を前記気泡放出部に向けて誘導するための傾斜面を少なくとも部分的に有している、請求項１に記載の培養容器。
【請求項3】
前記押さえ部材の前記下面は少なくとも部分的に親水化処理されている、請求項１又は２に記載の培養容器。
【請求項4】
前記押さえ部材には、液体を前記培養液内に注入することで前記培養液内の気泡を前記気泡放出部側に移動させるのに用いられる液体供給部がさらに形成されている、請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器。
【請求項5】
前記凹部の底部は、複数のマイクロウェルが形成された第１部分を有しており、
前記押さえ部材の前記下面は、前記培養液の上面に当接する、請求項１に記載の培養容器。
前記押さえ部材の前記下面は、前記培養液の上面に当接する、請求項１に記載の培養容器。
【請求項6】
前記凹部の底部は、前記複数のマイクロウェルが形成されていない第２部分を有しており、
前記押さえ部材の前記気泡放出部は前記第２部分に対応して設けられている、請求項５に記載の培養容器。
前記押さえ部材の前記気泡放出部は前記第２部分に対応して設けられている、請求項５に記載の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、培養容器、特に、顕微鏡観察に用いられる培養液を収容する培養容器に関する。
【背景技術】
【0002】
医学及び生物の分野において、細胞や菌の培養が幅広く行われている。また、目的に合った容器を用いて培養を行うために、様々な形状及びサイズの培養容器が開発されている。
【0003】
しかし、容器の培養液を収容する凹部の内径が例えば１６．５ｍｍ以下になると、容器中の培養液の液面が表面張力で湾曲する現象（以下、メニスカス）が、顕微鏡観察において問題を引き起こす。つまり、細胞や菌を光学顕微鏡で観察するときに、メニスカスに起因したレンズ効果によって像が劣化してしまう。そのため、凹部の中心部以外の観察が困難になる。そのような問題を解決するために、特許文献１に記載の細胞培養容器では、容器の中にメニスカス制御用平板を浮かせている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開平５−１８１０６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
特許文献１に記載の細胞培養容器では、実際にはメニスカス制御用平板の設計、取り外し等に技術的問題が多く、そのためこの細胞培養容器は実用的ではない。
【0006】
本発明の課題は、培養容器におけるメニスカスを取り除くことで、正確な観察を可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
以下に、課題を解決するための手段として複数の態様を説明する。これら態様は、必要に応じて任意に組み合せることができる。
【0008】
本発明の一見地に係る培養容器は、容器本体と、押さえ部材とを備えている。容器本体は、培養液を収容するための凹部を有する。
押さえ部材は、凹部の上側に取り外し可能に嵌められる部材である。押さえ部材は、嵌められた状態で培養液の上面に当接する下面と、培養液内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部とを有する。
この容器では、容器本体の凹部に培養液を収容した状態で、押さえ部材が凹部の上側に嵌められる。すると、押さえ部材の下面が培養液の上面に当接することで、メニスカスが解消される。この状態で、培養液内の気泡は、押さえ部材の気泡放出部から外部に放出される。この結果、培養容器において細胞を正確に観察できる。
【0009】
押さえ部材の下面は、培養液内の気泡を気泡放出部に向けて誘導するための傾斜面を少なくとも部分的に有していてもよい。この容器では、培養液内の気泡は、押さえ部材の下面の傾斜面によって気泡放出部に誘導される。したがって、押さえ部材の下面近傍に気泡が滞留しにくい。
押さえ部材の下面は、少なくとも部分的に親水化処理されていてもよい。
この容器では、押さえ部材の下面近傍に気泡が滞留しにくい。
【0010】
押さえ部材には、液体を培養液内に注入することで培養液内の気泡を気泡放出部側に移動させるのに用いられる液体供給部がさらに形成されていてもよい。この容器では、液体が液体供給部から培養液内に注入されると、培養液内の気泡が気泡放出部側に移動させられる。したがって、押さえ部材の下面近傍に気泡が滞留しにくい。
凹部の底部は、複数のマイクロウェルが形成された第１部分を有していてもよい。その場合、押さえ部材の下面は、培養液の上面に当接する。
メニスカスが防止されることにより、複数のマイクロウェルで成長したスフェロイドを正確に観察できる。
【0011】
凹部の底部は、複数のマイクロウェルが形成されていない第２部分を有していてもよい。その場合、押さえ部材の気泡放出部は第２部分に対応して設けられている。底部において複数のマイクロウェルに対応する位置には気泡放出部が形成されていないので、複数のマイクロウェルで成長したスフェロイドを正確に観察できる。
【発明の効果】
【0012】
本発明に係る培養容器では、メニスカスを取り除くことで、正確な観察が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】細胞培養容器の容器本体の斜視図。
【図2】細胞培養容器の押さえ部材付き板の斜視図。
【図3】細胞培養容器の押さえ部材付き板の斜視図。
【図4】細胞培養容器の断面図。
【図5】細胞培養容器の一部の平面図（第１実施形態）。
【図8】細胞培養容器の一部の平面図（第２実施形態）。
【図10】細胞培養容器の一部の平面図（第３実施形態）。
【図12】細胞培養容器の一部の平面図（第４実施形態）。
【図14】細胞培養容器の一部の平面図（第５実施形態）。
【図16】細胞培養容器の一部の平面図（第６実施形態）。
【図18】細胞培養容器の一部の平面図（第７実施形態）。
【図20】細胞培養容器の断面図（第８実施形態）。
【図21】細胞培養容器の断面図（第９実施形態）。
【図22】細胞培養容器の断面図。
【図23】細胞培養容器の断面図。
【図24】細胞培養容器の断面図。
【図25】押さえ部材の上面図。
【図26】押さえ部材の上面図（第１０実施形態）。
【図27】細胞培養容器の断面図（第１１実施形態）。
【図28】細胞培養容器の容器本体の断面図（第１２実施形態）。
【図29】細胞培養容器の断面図（第１３実施形態）。
【図30】細胞培養容器の容器本体の斜視図（第１５実施形態）。
【発明を実施するための形態】
【0014】
１．第１実施形態（１）全体構造
図１〜図３を用いて、本発明の一実施形態としての培養容器としての細胞培養容器１を説明する。
図１は、細胞培養容器の容器本体の斜視図である。図２及び図３は、細胞培養容器の押さえ部材付き板の斜視図である。
【0015】
図に示すように、細胞培養容器１は、容器本体３と、押さえ部材付き板５とを備えている。容器本体３は、平面視で長方形状であり、培養液としての細胞培養液Ｃを収容するための複数の凹部（ウェル）７を有する。容器本体３は、肉厚は薄く、透明性の部材であり、例えば透明プラスチック製である。容器本体３は、公知のものであり、例えば、一般的なウェルプレートである。押さえ部材付き板５は、容器本体３に対応する長方形形状であり、凹部７に対応する複数の押さえ部材９を有している。押さえ部材付き板５は、肉厚は薄く、透明性の部材であり、例えば透明プラスチック製である。押さえ部材付き板５は、平板状の本体５ａと、その外周面に形成された枠５ｂとを有している。押さえ部材付き板５の本体５ａには、複数の押さえ部材９が設けられている。押さえ部材９は、凹部７の上側に取り外し可能に嵌め込まれる部材である。
なお、図２に示す押さえ部材付き板５は６×４合計２４個の押さえ部材９を有しており、図３に示す押さえ部材付き板５Ａは６×１合計６個の押さえ部材９を有している。図３に示す押さえ部材付き板５Ａは、図１に示す容器本体３に対しては４個が用いられる。
【0016】
図４は、細胞培養容器の断面図である。図４に示すように、押さえ部材付き板５が容器本体３に嵌められた状態では、複数の押さえ部材９が複数の凹部７内にそれぞれ入り込み、細胞培養液Ｃが入った凹部７を封止している。これにより、細胞培養液Ｃの揮発による減少が抑えられている。特に、小径の凹部に関しては、細胞培養液Ｃの揮発による減少を抑えることが重要である。
【0017】
なお、図示していないが、細胞培養中には、細胞培養容器１の上方から（つまり、押さえ部材付き板５の上方から）、蓋が被される。蓋は、容器本体３及び押さえ部材付き板５の上部を覆う。これにより、細胞培養液に対するコンタミネーションが防止される。細胞培養容器１における細胞の観察は、各凹部７の下方から各種顕微鏡を用いて行われる。具体的には、細胞は凹部７の底部に接着した状態になっていることが多いので、そのような状態で細胞は観察される。ただし、浮遊培養を行う場合は、細胞培養液Ｃ内を浮遊している細胞を観察することもある。
【0018】
（２）詳細構造次に、図５〜図７を用いて、凹部７と押さえ部材９の構造及び両者の関係を詳細に説明する。図５は、細胞培養容器の一部の平面図である。図６は図５のＶＩ−ＶＩ断面図であり、図７は図５のＶＩＩ−ＶＩＩ断面図である。
【0019】
押さえ部材９は、嵌められた状態で細胞培養液Ｃの上面に当接する下面２３ａ（後述）を有している。さらに、押さえ部材９は、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部１３を有している。この実施形態では、気泡放出部１３は、筒状部２５の外周面に形成された、下面２３ａ（後述）の外周側と押さえ部材９の外部とを連通する凹部である。
【0020】
凹部７は、底部１７と、筒状部１９とを有している。筒状部１９の内周面１９ａは、縦断面において概ね鉛直に延びている。
【0021】
押さえ部材９は、主に、下面部２３と、筒状部２５とを有している。下面部２３は、平面視で円形状の平板である。筒状部２５は、凹部７の筒状部１９内にわずかな隙間で嵌まり込んでいる。つまり、筒状部２５の外周面２５ａは、筒状部１９の内周面１９ａに近接した状態で対向している。筒状部２５の下端には、下面部２３の外周縁が接続されている。
【0022】
押さえ部材９は、さらにフランジ部２７を有している。この実施形態では説明の便宜のために、フランジ部２７は、押さえ部材付き板５の本体５ａに固定された部材として説明しているが、本体５ａと一体に形成されていてもよい。フランジ部２７は、筒状部２５から外周側に延びており、凹部７の筒状部１９の上面に着座している。このように、押さえ部材９にフランジ部２７が設けられているので、押さえ部材９を凹部７から取り外すことが容易になっている。
【0023】
図に示すように、押さえ部材９の一部に、気泡放出部１３が形成されている。気泡放出部１３は、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする構造である。この実施形態では、気泡放出部１３は、筒状部２５の外周面２５ａの一部が切り欠かれて形成された凹部であり、この凹部は、図７に示すように、下面部２３の下面２３ａから細胞培養容器１の外部まで延びている。なお、この実施形態では、フランジ部２７は平面視で円弧状に切り欠かれている。このように気泡放出部１３が押さえ部材９に設けられていることで、押さえ部材９によってメニスカスを解消すると共に、気泡の滞留も防止している。したがって、正確にかつ広い面積にわたって、つまり凹部７の外周縁までの広い範囲で、細胞を観察できる。
【0024】
下面部２３の下面２３ａは、平面形状であるが、水平ではなく、斜めになっている（図７の角度θを参照。）。より具体的には、下面２３ａは、気泡放出部１３付近が最も高くなるように傾斜している。これにより、下面２３ａ付近にある気泡は、下面２３ａに沿って気泡放出部１３に向けて誘導される。なお、下面２３ａの傾斜角度θは、１〜３０度であり、より好ましくは１〜５度である。
【0025】
下面部２３の下面２３ａには、親水化処理が施されている。したがって、下面２３ａ近傍に気泡が滞留しにくい。親水化処理は公知技術（例えば、親水性ポリマーの塗布）が用いられる。また、親水化処理によって、浮遊培養で培養する細胞が下面部２３の下面２３ａに付着することが防止されている。
【0026】
押さえ部材９には、液体供給部３１が形成されている。液体供給部３１は、液体を細胞培養液Ｃ内に注入することで細胞培養液Ｃ内の気泡を気泡放出部１３側に移動させるのに用いられる。この実施形態では、液体供給部３１は、筒状部２５の外周面２５ａの一部が切り欠かれて形成された凹部であり、この凹部は、下面部２３の下面２３ａから細胞培養容器１の外部まで延びている。
【0027】
また、液体供給部３１は、気泡放出部１３に対して径方向に対向する位置に形成されている。つまり、液体供給部３１は、下面２３ａの最も低い位置に配置されている。液体が液体供給部３１から細胞培養液Ｃ内に注入されると、細胞培養液Ｃ内の気泡が気泡放出部１３側に移動させられる。したがって、押さえ部材９の下面２３ａ近傍に気泡が滞留しにくい。液体供給には、例えば、ピペットが用いられる。さらに、気泡放出部１３及び液体供給部３１は、ピペットによる差し込み播種を可能にしている。これにより、押さえ部材９をかぶせた後に、細胞全体の数量及び成長状況を調整できる。
【0028】
以上に述べたように、押さえ部材９の下面部２３が細胞培養液Ｃの上面に当接しているので、メニスカス問題が解消されている。さらに、下面部２３の外周縁が凹部７の内周面１９ａ近傍まで延びているので、観察面積が増大している。従来であれば、例えば直径７ｍｍ程度の凹部においてメニスカスの影響を受けずに観察できる範囲は直径１〜３ｍｍ程度であったが、本実施形態では押さえ部材９の肉厚を除いて直径５ｍｍ程度の範囲で観察可能になる。これにより、従来では推察によって判断していた領域の確認ができるようになり、正確な経時変化及び状態観察が可能になる。
【0029】
スリットによる押さえ部材９の開口部分の面積は、下面部２３の面積に対して、１〜５０％、好ましくは３〜３０％である。これにより、細胞の観察に不具合を生じさせることがない広い観察面積を確保でき、かつ、細胞培養液Ｃ及び気泡を下面部２３の下方から取り除くことができる。さらに、気泡放出部１３によって、細胞培養液Ｃ内の気泡を細胞培養容器１の外部に放出できる。また、下面２３ａの傾斜及び親水化処理、さらには液体供給部３１によって、気泡の排出が確実かつ速やかに行われるようになっている。
【0030】
押さえ部材９を凹部７に嵌める動作を簡単に説明する。最初に凹部７内に細胞培養液Ｃを注入する。このときの細胞培養液Ｃの量は、例えば、押さえ部材９の下面２３ａが細胞培養液の上面に当接する位置である。次に、押さえ部材９を凹部７に嵌める。すると、例えば図７に示すように、細胞培養液Ｃの液面は下面２３ａに押された状態になる。そして、細胞培養液Ｃの一部は、気泡放出部１３及び液体供給部３１内に入り込む。
【0031】
なお、下面２３ａの傾斜は、省略されてもよいし、他の形状であってもよい。例えば、下面２３ａは、気泡放出部付近の傾斜角度が大きい２段階の傾斜面であってもよい。また下面２３ａの親水化処理は、省略されてもよいし、部分的に行われていてもよい。さらには、液体供給部３１は省略されてもよいし、他の形状であってもよい。
【0032】
上記実施形態における押さえ部材及び凹部の寸法について、具体例を説明する。なお、以下の具体例は、メニスカスが顕著になるウェルのサイズを例示するものであって、本発明はこれら数値に限定されない。一般的には、容器本体の種類としては、６、１２、２４、４８、９６、３８４ウェルがある。２４ウェルの場合は、押さえ部材の内径は８．０〜１４．０ｍｍであり、押さえ部材の縦方向長さ（フランジを除く）は３．０〜１０．０ｍｍであり、押さえ部材の外径は８．０〜１４．０ｍｍであり、凹部の底面内径は１４．０〜１７．０ｍｍである。９６ウェルの場合は、押さえ部材の内径は４．０〜５．０ｍｍであり、押さえ部材の縦方向長さ（フランジを除く）は３．０〜１０．０ｍｍであり、押さえ部材の外径は４．０〜５．０ｍｍであり、凹部の底面内径は５．０〜７．０ｍｍである。
【0033】
２．第２実施形態以下、図８及び図９を用いて、第２実施形態を説明する。図８は、細胞培養容器の一部の平面図である。図９は、図８のＩＸ−ＩＸ断面図である。
なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
【0034】
押さえ部材９は、嵌められた状態で細胞培養液Ｃの上面に当接する下面４１ａ（後述）を有している。さらに、押さえ部材９は、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部４３を有している。この実施形態では、気泡放出部４３は、下面部４１の外周縁に形成された円弧状に延びかつ上下方向に貫通する複数の溝である。具体的には、気泡放出部４３は、図右側の一対の第１溝４３ａと、図左側の一対の第２溝４３ｂとを有している。図右側の一対の第１溝４３ａは、下面部４１の図右側半分の外周縁全体にわたって延びている。また、図左側の一対の第２溝４３ｂは、下面部４１の図左側半分の外周縁全体にわたって延びている。
【0035】
このように気泡放出部４３が押さえ部材９に設けられていることで、押さえ部材９によってメニスカスを解消すると共に、気泡の滞留も防止している。したがって、正確にかつ広い面積にわたって、つまり凹部７の外周縁までの広い範囲で、細胞を観察できる。
【0036】
下面部４１の下面４１ａは、図左右に二分割されており、図左右中心からそれぞれ左右両側に斜めの平面形状を有している（図９の角度θを参照。）。より具体的には、下面４１ａの図右側部分は、一対の第１溝４３ａの中間付近が最も高くなるように傾斜している。下面４１ａの図左側部分は、一対の第２溝４３ｂの中間付近が最も高くなるように傾斜している。これにより、下面４１ａ付近にある気泡は、下面４１ａに沿って、一対の第１溝４３ａと一対の第２溝４３ｂとに向けて誘導される。
【0037】
押さえ部材９を凹部７に嵌める動作を簡単に説明する。最初に凹部７内に細胞培養液Ｃを注入する。このときの細胞培養液Ｃの量は、例えば、押さえ部材９の下面４１ａが細胞培養液Ｃの上面に当接する位置である。次に、押さえ部材９を凹部７に嵌める。すると、例えば図９に示すように、細胞培養液Ｃの液面は下面４１ａに押された状態になる。この場合、細胞培養液Ｃの一部は、気泡放出部４３の第１溝４３ａ及び第２溝４３ｂに入り込む。なお、図９では、細胞培養液の液面は第１溝４３ａ及び第２溝４３ｂの中に位置にしているが、細胞培養液Ｃは第１溝４３ａ及び第２溝４３ｂを超えて、一部が下面部４１の上側にこぼれてもよい。
【0038】
この実施形態で得られる効果は、第１実施形態で得られる効果と同じである。また、気泡放出部としての溝の数、位置、形状は必要に応じて変更可能である。また、下面部に形成された気泡放出部は、溝形状ではなく、孔形状であってもよい。
下面２３ａの形状は前記実施形態に限定されない。下面は、全体が水平に延びる平面であってもよいし、各溝に対応して形成された複数の傾斜平面であってもよい。
【0039】
３．第３実施形態以下、図１０及び図１１を用いて、第３実施形態を説明する。図１０は、細胞培養容器の一部の平面図である。図１１は、図１０のＸＩ−ＸＩ断面図である。
なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
【0040】
押さえ部材９は、嵌められた状態で細胞培養液Ｃの上面に当接する下面４５ａ（後述）を有している。さらに、押さえ部材９は、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部４７を有している。この実施形態では、気泡放出部４７は、下面部４１の左右中心に形成された直線状に延びる溝である。具体的には、気泡放出部４７は、図において、下面部４１の外周縁から外周縁まで延びている。
【0041】
このように気泡放出部４７が押さえ部材９に設けられていることで、押さえ部材９によってメニスカスを解消すると共に、気泡の滞留も防止している。したがって、正確にかつ広い面積にわたって、つまり凹部７の外周縁までの広い範囲で、細胞を観察できる。
【0042】
下面部４５の下面４５ａは、図左右に二分割されており、図左右中心からそれぞれ左右両側に斜めの平面形状を有している（図１１の角度θを参照。）。より具体的には、下面４５ａの図右側部分は、気泡放出部４７付近が最も高くなるように傾斜している。下面４５ａの図左側部分は、気泡放出部４７付近が最も高くなるように傾斜している。これにより、下面４５ａ付近にある気泡は、下面４５ａに沿って、気泡放出部４７に向けて誘導される。この実施形態で得られる効果は、第１〜第２実施形態で得られる効果と同じである。
【0043】
また、気泡放出部としての溝の数、位置、形状は必要に応じて変更可能である。また、下面部に形成された気泡放出部は、溝形状ではなく、孔形状であってもよい。下面４５ａの形状は前記実施形態に限定されない。下面は、全体が水平に延びる平面であってもよい。
【0044】
４．第４実施形態以下、図１２及び図１３を用いて、第４実施形態を説明する。図１２は、細胞培養容器の一部の平面図である。図１３は、図１２のＸＩＩＩ−ＸＩＩＩ断面図である。
なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
【0045】
押さえ部材９は、嵌められた状態で細胞培養液Ｃの上面に当接する下面４９ａ（後述）を有している。さらに、押さえ部材９は、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部５１を有している。この実施形態では、気泡放出部５１は、下面部４９の外周縁に形成された円弧状に延びる溝である。具体的には、気泡放出部５１は、図において、図右側の一対の第１溝５１ａを有している。一対の第１溝５１ａは、下面部４９の外周縁の図右側半分全体にわたって延びている。
【0046】
このように気泡放出部５１が押さえ部材９に設けられていることで、気泡の滞留も防止している。したがって、正確にかつ広い面積にわたって、つまり凹部７の外周縁までの広い範囲で、細胞を観察できる。
【0047】
下面部４９の下面４９ａは、平面形状であるが、水平ではなく、斜めになっている（図１３の角度θを参照。）。より具体的には、下面４９ａは、気泡放出部５１一対の第１溝５１ａ同士の中間付近が最も高くなるように傾斜している。これにより、下面４９ａ付近にある気泡は、下面４９ａに沿って気泡放出部５１に向けて誘導される。
【0048】
押さえ部材９には、液体供給部５２が形成されている。液体供給部５２は、液体を細胞培養液Ｃ内に注入することで細胞培養液Ｃ内の気泡を気泡放出部５１側に移動させるのに用いられる。この実施形態は、液体供給部５２は、下面部４９の外周縁に形成された円弧状に延びる溝である。具体的には、液体供給部５２は、図において、図左側の一対の第２溝５２ａを有している。一対の第２溝５２ａは、下面部４９の外周縁の図左側半分全体にわたって延びている。
【0049】
また、液体供給部５２は、気泡放出部５１に対して径方向に対向する位置に形成されている。つまり、液体供給部５２の一対の第２溝５２ａ同士の中間が、下面４９ａの最も低い位置となっている。液体が液体供給部５２から細胞培養液Ｃ内に注入されると、細胞培養液Ｃ内の気泡が気泡放出部５１側に移動させられる。したがって、押さえ部材９の下面４９ａ近傍に気泡が滞留しにくい。液体供給には、例えば、ピペットが用いられる。
【0050】
この実施形態で得られる効果は、第１〜第３実施形態で得られる効果と同じである。なお、下面４９ａの傾斜は、省略されてもよいし、他の形状であってもよい。また、下面４９ａの親水化処理は、省略されてもよいし、部分的に行われてもよい。さらには、液体供給部５２は、省略されてもよいし、他の形状であってもよい。
【0051】
５．第５実施形態以下、図１４及び図１５を用いて、第５実施形態を説明する。図１４は、細胞培養容器の一部の平面図である。図１５は、図１４のＸＶ−ＸＶ断面図である。
なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
【0052】
押さえ部材９は、嵌められた状態で細胞培養液Ｃの上面に当接する下面５３ａ（後述）を有している。さらに、押さえ部材９は、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部５５を有している。この実施形態では、気泡放出部５５は、下面部５３の外周縁に形成された円弧状に延びる溝である。具体的には、気泡放出部５５は、下面部５３の図右側半分の外周縁に沿って延びる溝である。
【0053】
このように気泡放出部５５が押さえ部材９に設けられていることで、押さえ部材９によってメニスカスを解消すると共に、気泡の滞留も防止している。したがって、正確にかつ広い面積にわたって、つまり凹部７の外周縁までの広い範囲で、細胞を観察できる。
【0054】
下面部５３の下面５３ａは、平面形状であるが、水平ではなく、斜めになっている（図１５の角度θを参照。）。より具体的には、下面５３ａは、気泡放出部５５の中間部付近が最も高くなるように傾斜している。これにより、下面５３ａ付近にある気泡は、下面５３ａに沿って気泡放出部５５に向けて誘導される。
【0055】
この実施形態で得られる効果は、第１〜第４実施形態で得られる効果と同じである。気泡放出部としての溝の数、位置、形状は必要に応じて変更可能である。また、下面部に形成された気泡放出部は、溝形状ではなく、孔形状であってもよい。
下面部の下面の形状は前記実施形態に限定されない。下面は、全体が水平に延びる平面であってもよい。
【0056】
６．第６実施形態以下、図１６及び図１７を用いて、第６実施形態を説明する。図１６は、細胞培養容器の一部の平面図である。図１７は、図１６のＸＶＩＩ−ＸＶＩＩ断面図である。
なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
【0057】
押さえ部材９は、嵌められた状態で細胞培養液Ｃの上面に当接する下面５７ａ（後述）を有している。さらに、押さえ部材９は、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部５９を有している。この実施形態では、気泡放出部５９は、下面部５７の外周縁に形成された円弧状に延びる複数の溝である。具体的には、合計４本の溝が形成されている。
【0058】
このように気泡放出部５９が押さえ部材９に設けられていることで、押さえ部材９によってメニスカスを解消すると共に、気泡の滞留も防止している。したがって、正確にかつ広い面積にわたって、つまり凹部７の外周縁までの広い範囲で、細胞を観察できる。
【0059】
下面部５７の下面５７ａは、水平に延びる平端面である。なお、この実施形態では、複数の気泡放出部５９のいずれかを液体供給部として用いることができる。
【0060】
この実施形態で得られる効果は、第１〜第５実施形態で得られる効果と同じである。また、気泡放出部である溝の数、位置、形状は必要に応じて変更可能である。また、下面部に形成された気泡放出部は、溝形状ではなく、孔形状であってもよい。
【0061】
７．第７実施形態次に、図１８及び図１９を用いて、第７実施形態を説明する。図１８は、細胞培養容器の一部の平面図である。図１９は図１８のＸＩＸ−ＸＩＸ断面図である。
なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
【0062】
押さえ部材９は、嵌められた状態で細胞培養液Ｃの上面に当接する下面６１ａ（後述）を有している。さらに、押さえ部材９は、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部６３を有している。
【0063】
この実施形態では、気泡放出部６３は、筒状部２５の外周面２５ａの一部が切り欠かれて形成された凹部であり、この凹部は、下面部６１の下面６１ａから細胞培養容器１の外部まで延びている。なお、この実施形態では、フランジ部２７は平面視で直線状に切り欠かれている。このように気泡放出部６３が押さえ部材９に設けられていることで、押さえ部材９によってメニスカスを解消すると共に、気泡の滞留も防止している。したがって、正確にかつ広い面積にわたって、つまり凹部７の外周縁までの広い範囲で、細胞を観察できる。
【0064】
下面部６１の下面６１ａは、平面形状であるが、水平ではなく、斜めになっている（図１９の角度θを参照。）。より具体的には、下面６１ａは、気泡放出部６３付近が最も高くなるように傾斜している。これにより、下面６１ａ付近にある気泡は、下面６１ａに沿って気泡放出部６３に向けて誘導される。この実施形態で得られる効果は、第１〜第６実施形態で得られる効果と同じである。
【0065】
８．第８実施形態第１〜第７実施形態では、下面部２３、５３，６３は、底部１７から比較的離れた位置に配置されていたが、この位置は特に限定されない。
【0066】
図２０を用いて、第９実施形態を説明する。図２０は、細胞培養容器の断面図である。なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。図から明らかなように、下面部２３Ａは、底部１７に近接して配置されている。この構造は、第１〜第８実施形態のいずれにも適用可能であり、それら実施形態と同じ効果が得られる。
【0067】
９．第９実施形態第１〜第８実施形態では培養液内の細胞を観察する容器に本発明を適用していたが、
本発明は他の種類の容器にも適用可能である。
図２１〜図２４を用いて、スフェロイド形成用の細胞培養容器を説明する。図２１〜図２４は細胞培養容器の断面図である。図２５は、押さえ部材の上面図である。
なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
【0068】
図２１は、細胞培養容器の容器本体１０３を示している。容器本体１０３は、上側が開口した容器であり、細胞培養液Ｃを保持している。細胞培養液Ｃは、多数の種細胞ｃを含んでいる。凹部１０７の底部１１７には、マイクロウェル部材１３１が設置されている。マイクロウェル部材１３１は、複数のマイクロウェル１３１ａを有する部材である。具体的には、マイクロウェル部材１３１は、上面（第１部分に相当）に多数のマイクロウェル１３１ａを有している。マイクロウェル１３１ａの径は、例えば３０〜１５００μｍであり、好ましくは５０〜３００μｍである。マイクロウェル１３１ａの深さは、例えば、３０〜１５００μｍであり、好ましくは５０〜３００μｍである。
この実施形態では、マイクロウェル部材１３１は底部１１７の中心に設けられ、その上面は底部１１７から比較的離れた上方に配置されている。そのため、底部１１７においてマイクロウェル部材１３１の外周側はマイクロウェル部材１３１の上面より低い面（第２部分に相当）となっている。
【0069】
図２２に示すように、押さえ部材１０９が容器本体１０３の凹部１０７内に挿入される。押さえ部材１０９は、図２２及び図２５に示すように、円板状の下面部１２３を有している。下面部１２３の下面１２３ａは、マイクロウェル部材１３１の上面（マイクロウェル１３１ａが形成された部分）に近接して配置される。下面部１２３の下面１２３ａとマイクロウェル部材１３１の上面との間の寸法は、スフェロイドＳの径より短ければよく、例えば、０〜３００μｍである。また、下面部１２３において、マイクロウェル部材１３１よりさらに外周側の部分には、複数の気泡放出部１２３ｂが形成されている。つまり、気泡放出部１２３ｂは、底部１１７の第２部分（マイクロウェル１３１ａがない部分）に対応して設けられている。気泡放出部１２３ｂは、点状の貫通孔である。したがって、下面部１２３より下方の空間（例えば、複数のマイクロウェル１３１ａ、マイクロウェル部材１３１の周囲）における気泡は、容易に外部に排出される。
【0070】
最初に、種細胞ｃの播種を行う。具体的には、図２１に示すように、細胞培養液Ｃを凹部１０７内に注入する。細胞培養液Ｃは、液体の培地と、培地に均一に拡散された種細胞ｃとからなる懸濁液である。種細胞ｃは、付着性を有しており、例えば、ヒト骨肉腫細胞などのガン細胞や肝細胞である。培地は、付着性細胞の培養に適した公知のものが用いられる。以上の場合、個々の種細胞ｃが、マイクロウェル１３１ａにまで降下し着床する。
【0071】
続いて、図２２に示すように押さえ部材１０９が凹部１０７に嵌められる。そして、図２３に示すように、マイクロウェル１３１ａ内で、複数の種細胞ｃが凝集することで、スフェロイドＳを形成する。この細胞培養容器では、下面部１２３が、凹部１０７内で複数のマイクロウェル１３１ａの上方に配置され、マイクロウェル１３１ａ内で成長したスフェロイドＳが当該マイクロウェル１３１ａから離脱しないように移動を制限している。したがって、細胞培養容器においてスフェロイドＳが安定的に形成される。
【0072】
図示しない管及びポンプを用いて、凹部１０７内部へ培地を供給及び排出する装置を設けてもよい。これにより、流入口を通じて新たな培地を凹部１０７内へ注入し、かつ流出口を通じて細胞培養容器内の培地を排出できる。つまり、種細胞ｃがマイクロウェル１３１ａにおいてスフェロイドＳを形成している際に、凹部１０７内の培地交換が行われる。上記の培地交換において、凹部１０７内において培地の流れが生じるが、このとき、下面部１２３によってスフェロイドＳを押さえているので、スフェロイドＳがマイクロウェル１３１ａから飛び出さない。したがって、スフェロイドＳの流出が防止されている。
【0073】
前述された培地交換によって、培地循環によって、培養中にも細胞に栄養分及び酸素が供給され、細胞が健康に成長する。その結果、比較的長い培養期間を要する大きなスフェロイドＳを形成することができ、さらに、形成されたスフェロイドSを長期間保存できる。また、培地交換によって、スフェロイドＳにならなかった細胞ゴミ及び老廃物が取り除かれる。
【0074】
図２４に示すように、細胞培養液Ｃを減らして、下面部１２３より上側に細胞培養液Ｃが存在しないようにした上で、容器本体１０３の下方からスフェロイドＳを観察する。このとき、下面部１２３の下面１２３ａが細胞培養液Ｃの上面に当接していることで、メニスカスが解消される。この結果、容器本体１０３において、複数のマイクロウェル１３１ａで成長したスフェロイドＳを正確に観察できる。
【0075】
また、下面部１２３において複数のマイクロウェル１３１ａに対応する位置には気泡放出部が形成されていないので、複数のマイクロウェル１３１ａで成長したスフェロイドＳを正確に観察できる。
【0076】
１０．第１０実施形態第９実施形態では気泡放出部は複数の孔であったが、気泡放出部の形態はそれに限定されない。
図２６を用いて、押さえ部材の他の実施形態を説明する。図２６は、押さえ部材の上面図である。なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
下面部１２３において、マイクロウェル部材１３１よりさらに外周側の部分には複数の気泡放出部１２３ｃが形成されている。気泡放出部１２３ｃは、円周方向に延びる弧状の貫通溝である。
【0077】
下面部に形成される気泡放出部としての貫通孔の形状、個数、位置は特に限定されない。また、気泡放出部は、下面部に形成される貫通孔に限定されない。気泡放出部は、押さえ部材１０９の筒状部１２５と容器本体１０３の筒状部１１９との間に形成された切り欠き、スリット、貫通孔であってもよい。下面部１２３において複数のマイクロウェル１３１ａに対応する位置(つまり中心部及び半径方向中間部）には気泡放出部が形成されていないので、複数のマイクロウェル１３１ａで成長したスフェロイドＳを正確に観察できる。
【0078】
１１．第１１実施形態第９実施形態では押さえ部材の下面部は平坦な形状であったが、下面部の形状は特に限定されない。
図２７を用いて、押さえ部材１０９の他の実施形態を説明する。図２７は、細胞培養容器の断面図である。なお、押さえ部材及び凹部の基本的な構成は前記実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。
【0079】
図に示すように、押さえ部材１０９の下面部は、平坦な押さえ部１２３Ａと、環状の突出部１２３Ｂとを有している。押さえ部１２３Ａは、マイクロウェル部材１３１の上面に近接して配置されている。環状の突出部１２３Ｂは、押さえ部１２３Ａの外周縁に形成され、下方に延びている。つまり、突出部１２３Ｂは、マイクロウェル部材１３１の外周側を囲むように配置されている。突出部１２３Ｂの底面には、複数の気泡放出部１２３ｂが形成されている。気泡放出部１２３ｂの形状は、点状又は弧状の貫通孔又はそれらの組合せである。下面部において複数のマイクロウェル１３１ａに対応する位置（つまり、押さえ部１２３Ａ）には気泡放出部が形成されていないので、複数のマイクロウェル１３１ａで成長したスフェロイドＳを正確に観察できる。
【0080】
１２．第１２実施形態特に、第８〜第１１実施形態では、押さえ部材の下面部とその下方の部材との間の寸法を正確に管理することが求められる。しかし、押さえ部材は培養容器の培地に押し込んで使用されるので、浮力で押さえ部材が浮いてしまうという問題が考えられる。
そこで、図２８を用いて、そのような課題を解決するための構造を説明する。図２８は、細胞培養容器の断面図である。
【0081】
図に示すように、押さえ部材付き板５の上方には、蓋１１が配置されている。蓋１１は、押さえ部材付き板５の上側全体を覆っている。蓋１１は、平坦な本体１１ａと、その外周縁から下方に延びる筒状部１１ｂとを有している。蓋１１の本体１１ａと、押さえ部材付き板５のフランジ部２７との間には、クッション部材１２が配置されている。クッション部材１２は、バネ、ゴム、スポンジ等の弾性部材である。
【0082】
クッション部材１２は、押さえ部材付き板５と蓋１１との間で圧縮されることで、弾性力を発生する。これにより、押さえ部材付き板５が浮き上がることが防止され、容器本体３内に固定できる。これにより、例えば、スフェロイドを形成するような場合でも、マイクロウェルとメッシュとの間の隙間を十分に短くでき、それによりスフェロイド固定効果が得られる。
【0083】
１３．第１３実施形態第１２実施形態では、蓋は自重のみによって弾性部材を圧縮していたが、他の構造によって弾性部材を圧縮してもよい。
そこで、図２９を用いて、そのような課題を解決するための構造を説明する。図２９は、細胞培養容器の断面図である。
【0084】
基本的な構造は第１２実施形態と同じである。この実施形態では、容器本体３の外周部に第１係合部１５が形成され、さらに蓋１１の筒状部１１ｂに第２係合部１６が形成されている。第１係合部１５と第２係合部１６は互いに係合しており、それにより蓋１１が容器本体３から離れないようになっている。
この実施形態では、クッション部材１２は、押さえ部材付き板５と蓋１１との間で圧縮されることで、弾性力を発生する。これにより、押さえ部材付き板５の浮きが防止され、容器本体３内に固定できる。これにより、例えば、スフェロイドを形成するような場合でも、マイクロウェルとメッシュとの間の隙間を十分に短くでき、それによりスフェロイド固定効果が得られる。
【0085】
１４．第１４実施形態第１２実施形態及び第１３実施形態では、蓋及びクッション部材を用いることで押さえ部材付き板５の浮き上がりを防止していたが、他の手段によっても浮き上がり防止は可能である。例えば、押さえ部材付き板５の重量を増加することで、浮力による浮きを防止できる。具体的には、金属製材料を一部に使うことでで、押さえ部材付き板５自体を重くする。又は、押さえ部材付き板５の一部に錘を付ける。
【0086】
１５．第１５実施形態複数の押さえ部材が複数の凹部にスムーズに嵌まるように両者に位置決め構造を設けた実施形態を説明する。
【0088】
容器本体３の上側の隅には、複数のピン７１が立設されている。具体的には、ピン７１は、容器本体３の凹部７が形成された本体部分の外側部分の四隅に配置されている。押さえ部材付き板５には、ピン７１に対応する位置に孔７３が形成されている。具体的には、孔７３は、枠５ｂの四隅に形成されている。
【0089】
押さえ部材付き板５を容器本体３に嵌めるときに、ピン７１と孔７３によって位置決めすることで、複数の押さえ部材９が凹部７にスムーズに嵌まり込む。なお、ピンと孔の数は前記実施形態に限定されない。さらに、容器本体３と押さえ部材付き板５との位置決め構造は、ピンと孔に限定されない。
【0090】
１６．実施形態の共通事項上記第１〜第１５実施形態は、下記の構成及び機能を共通に有している。
培養容器（例えば、細胞培養容器１）は、容器本体（例えば、容器本体３，容器本体１０３）と、押さえ部材（例えば、押さえ部材９、押さえ部材１０９）とを備えている。
容器本体は、培養液（例えば、細胞培養液Ｃ）を収容するための凹部（例えば、凹部７、凹部１０７）を有する。
【0091】
押さえ部材は、凹部の上側に取り外し可能に嵌められる部材である。押さえ部材は、嵌められた状態で培養液の上面に当接する下面（例えば、下面２３ａ、下面４１ａ、下面４５ａ、下面４９ａ、下面５３ａ、下面５７ａ、下面６１ａ、下面１２３ａ）と、培養液内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部（例えば、気泡放出部１３、気泡放出部４３、気泡放出部４７、気泡放出部５１、気泡放出部５５、気泡放出部５９、気泡放出部６３、気泡放出部１２３ｂ、気泡放出部１２３ｃ）とを有する。
【0092】
この容器では、容器本体の凹部に培養液を収容した状態で、押さえ部材が凹部の上側に嵌められる。すると、押さえ部材の下面が培養液の上面に当接することで、メニスカスが解消される。この状態で、培養液内の気泡は、押さえ部材の気泡放出部から外部に放出される。この結果、培養容器において細胞を正確に観察できる。
【0093】
１７．他の実施形態以上、本発明の複数の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。特に、本明細書に書かれた複数の実施形態及び変形例は必要に応じて任意に組み合せ可能である。
【0094】
凹部及び押さえ部材の平面視形状、及びそれらの組合せは前記実施形態に限定されない。凹部及び押さえ部材の個数は、前記実施形態に限定されない。
【0095】
押さえ部材の下面の親水化処理は、部分的に又は全面的に行われていてもよいし、必ずしも行われなくてもよい。押さえ部材の下面を傾斜面にすること、部分的に又は全面的に行われていてもよいし、必ずしも行われなくてもよい。
前記実施形態では、培養容器の一例として細胞培養液を用いた細胞培養容器を説明した。しかし、本発明に係る培養容器では、例えば、動物細胞、植物細胞、菌、細菌も培養可能である。
【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明は、顕微鏡観察に用いられる培養液を収容する培養容器に広く適用できる。
【符号の説明】
【0097】
１ ：細胞培養容器３ ：容器本体
５ ：押さえ部材付き板
７ ：凹部
９ ：押さえ部材
１３ ：気泡放出部
１７ ：底部
１９ ：筒状部
１９ａ ：内周面
２３ ：下面部
２３ａ ：下面
２５ ：筒状部
２５ａ ：外周面
２７ ：フランジ部
３１ ：液体供給部
【要約】 （修正有）
【課題】顕微鏡観察に用いられる培養容器における培養液の液面が表面張力で湾曲する現象（メニスカス）を取り除き、正確な観察を可能にする方法の提供。【解決手段】容器本体３と、押さえ部材９とを備えており、容器本体３は、細胞培養液Ｃを収容するための凹部７を有し、押さえ部材９が、凹部７の上側に取り外し可能に嵌められる部材であり、嵌められた状態で細胞培養液Ｃの上面に当接する下面２３ａと、細胞培養液Ｃ内の気泡を外部に放出可能にする気泡放出部１３とを有する細胞培養容器。
【選択図】図７