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特許5769361高血糖症および関連障害の処置のための、ヒトＧタンパク質共役レセプターおよびそのモジュレーター

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5769361

(24)【登録日】2015年7月3日

(45)【発行日】2015年8月26日

(54)【発明の名称】高血糖症および関連障害の処置のための、ヒトＧタンパク質共役レセプターおよびそのモジュレーター

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20150806BHJP

A61K 31/454 20060101ALI20150806BHJP

A61K 31/4709 20060101ALI20150806BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20150806BHJP

A61P 5/48 20060101ALI20150806BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20150806BHJP

A61P 9/02 20060101ALI20150806BHJP

A61P 9/10 20060101ALI20150806BHJP

A61P 9/12 20060101ALI20150806BHJP

A61P 13/12 20060101ALI20150806BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20150806BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20150806BHJP

C12Q 1/02 20060101ALI20150806BHJP

G01N 33/15 20060101ALI20150806BHJP

G01N 33/50 20060101ALI20150806BHJP

【ＦＩ】

C12N15/00 AZNA

A61K31/454

A61K31/4709

A61P3/10

A61P5/48

A61P9/00

A61P9/02

A61P9/10 101

A61P9/12

A61P13/12

A61P25/00

A61P27/02

C12Q1/02

G01N33/15 Z

G01N33/50 Z

【請求項の数】28

【全頁数】148

(21)【出願番号】特願2008-104153(P2008-104153)

(22)【出願日】2008年4月11日

(62)【分割の表示】特願2007-508478(P2007-508478)の分割

【原出願日】2005年4月12日

(65)【公開番号】特開2008-263979(P2008-263979A)

(43)【公開日】2008年11月6日

【審査請求日】2008年4月11日

【審判番号】不服2011-22273(P2011-22273/J1)

【審判請求日】2011年10月14日

(31)【優先権主張番号】60/561,954

(32)【優先日】2004年4月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500478097

【氏名又は名称】アリーナファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107489

【弁理士】

【氏名又は名称】大塩竹志

(72)【発明者】

【氏名】ジュンキュー

(72)【発明者】

【氏名】ロバートアール．ウェッブ

(72)【発明者】

【氏名】デイビッドジェイ．ウネット

(72)【発明者】

【氏名】ジョエルイー．ガトリン

(72)【発明者】

【氏名】ダニエルティー．コノリー

【合議体】

【審判長】今村玲英子

【審判官】植原克典

【審判官】高堀栄二

(56)【参考文献】

【文献】特開２００３−３１５３３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２−０００２８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４−３４６０５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９６年７月１３日，Ｖｏｌ．１３１２，Ｎｏ．２，ｐｐ．１３２−１３６

【文献】Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，１９９７年９月，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．９，ｐｐ．４１７−４２１

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-15/90

C12Q1/00-1/70

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ）

ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）候補化合物を、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧタンパク質共役レセプターと接触させる工程であって、該Ｇタンパク質共役レセプターは、細胞上または単離された細胞膜上に存在する、工程；
（ｂ）該化合物が、該Ｇタンパク質共役レセプターと接触した後にＧｓ共役経路を活性化する能力を決定する工程；および
（ｃ）該化合物がグルコース代謝を増加するか否かを決定する工程；
を包含する、グルコース代謝を増加する化合物をスクリーニングするための方法。

【請求項2】

（ａ）試験リガンドを、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧタンパク質共役レセプターを発現する脂肪細胞または骨格筋細胞と接触させる工程；
（ｂ）該Ｇタンパク質共役レセプターに結合したリガンドを検出する工程；および
（ｃ）該リガンドがグルコース代謝を増加するか否かを決定する工程；
を包含する、グルコース代謝を増加するリガンドをスクリーニングするための方法。

【請求項3】

以下の工程：
（ａ）候補化合物をＧタンパク質共役レセプターと接触させる工程であって、該Ｇタンパク質共役レセプターは以下：
（ａ’）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号２のアミノ酸２〜３３０；
（ｃ’）配列番号２のアミノ酸２〜３３０であって、該Ｇタンパク質共役レセプターは配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜３３０；
（ｄ’）（ａ’）、（ｂ’）または（ｃ’）のアミノ酸配列であって、配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンで置換されている、アミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ’）配列番号２のアミノ酸配列における１個または数個のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加によって配列番号２から誘導されたアミノ酸配列を有する、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列；
（ｇ’）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列；または
（ｈ’）配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列を含み、該Ｇタンパク質共役レセプターは、細胞または単離されたその膜に存在する、工程；
（ｂ）該化合物が、該Ｇタンパク質共役レセプターと接触した後にＧｓ共役経路を活性化する能力を決定する工程；および
（ｃ）該化合物がグルコース代謝を増加するか否かを決定する工程
を包含する、グルコース代謝を増加する化合物をスクリーニングするための方法。

【請求項4】

以下の工程：
（ａ）試験リガンドをＧタンパク質共役レセプターを発現する脂肪細胞または骨格筋細胞と接触させる工程であって、該Ｇタンパク質共役レセプターは、以下：
（ａ’）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号２のアミノ酸２〜３３０；
（ｃ’）配列番号２のアミノ酸２〜３３０であって、該Ｇタンパク質共役レセプターは配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜３３０；
（ｄ’）（ａ’）、（ｂ’）または（ｃ’）のアミノ酸配列であって、配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンで置換されている、アミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ’）配列番号２のアミノ酸配列における１個または数個のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加によって配列番号２から誘導されたアミノ酸配列を有する、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列；
（ｇ’）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列；
（ｈ’）配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列；または
（ｉ’）配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＲＵＰ４３ＧＰＣＲの対立遺伝子または哺乳動物オルソログの、アミノ酸配列
を含む、工程；
（ｂ）該Ｇタンパク質共役レセプターに結合したリガンドを検出する工程；および
（ｃ）該リガンドがグルコース代謝を増加するか否かを決定する工程
を包含する、グルコース代謝を増加するリガンドをスクリーニングするための方法。

【請求項5】

（ａ）候補化合物と、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＧタンパク質レセプターを発現する細胞を接触させる工程；および
（ｂ）該化合物が、該Ｇタンパク質共役レセプターを発現する該細胞におけるグルコース取り込みを増加するかどうかを決定する工程
を包含する、Ｇタンパク質共役レセプターを発現する細胞におけるグルコース取り込みを増加する化合物をスクリーニングするための方法。

【請求項6】

以下の工程：
（ａ）候補化合物をＧタンパク質共役レセプターを発現する細胞と接触させる工程であって、該Ｇタンパク質共役レセプターは以下：
（ａ’）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号２のアミノ酸２〜３３０；
（ｃ’）配列番号２のアミノ酸２〜３３０であって、該Ｇタンパク質共役レセプターは配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２〜３３０；
（ｄ’）（ａ’）、（ｂ’）または（ｃ’）のアミノ酸配列であって、配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンで置換されている、アミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ’）配列番号２のアミノ酸配列における１個または数個のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加によって配列番号２から誘導されたアミノ酸配列を有する、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列；
（ｇ’）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列；
（ｈ’）配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列；または
（ｉ’）配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＲＵＰ４３ＧＰＣＲの対立遺伝子または哺乳動物オルソログの、アミノ酸配列
を含む、工程；および
（ｂ）該化合物が、該Ｇタンパク質共役レセプターを発現する該細胞におけるグルコース取り込みを増加するかどうかを決定する工程
を包含する、Ｇタンパク質共役レセプターを発現する細胞におけるグルコース取り込みを増加する化合物をスクリーニングするための方法。

【請求項7】

前記Ｇタンパク質共役レセプターを発現する前記細胞は脂肪細胞である、請求項１または３に記載の方法。

【請求項8】

前記Ｇタンパク質共役レセプターを発現する前記細胞は骨格筋細胞である、請求項１または３に記載の方法。

【請求項9】

前記化合物が、前記Ｇタンパク質共役レセプターと接触した後にＧｓ共役経路を活性化する能力を決定する前記工程が、ｃＡＭＰの増加を検出することを包含する、請求項１または３に記載の方法。

【請求項10】

前記化合物が、前記Ｇタンパク質共役レセプターと接触した後にＧｓ共役経路を活性化する能力を決定する前記工程が、レセプターアッセイの使用を包含する、請求項１または３に記載の方法。

【請求項11】

前記化合物がグルコース代謝を増加するか否かを決定する前記工程が、哺乳動物において低下した血中グルコース濃度を検出することを包含する、請求項１または３に記載の方法。

【請求項12】

前記化合物がグルコース代謝を増加するか否かを決定する前記工程が、哺乳動物において低下したインスリン抵抗を検出することを包含する、請求項１または３に記載の方法。

【請求項13】

前記化合物がグルコース代謝を増加するか否かを決定する前記工程が、増加したグルコース取り込みを検出することを包含する、請求項１または３に記載の方法。

【請求項14】

前記脂肪細胞または骨格筋細胞が脂肪細胞である、請求項２または４に記載の方法。

【請求項15】

前記脂肪細胞または骨格筋細胞は骨格筋細胞である、請求項２または４に記載の方法。

【請求項16】

前記リガンドがグルコース代謝を増加するか否かを決定する前記工程は、哺乳動物において低下した血中グルコース濃度を検出することを包含する、請求項２または４に記載の方法。

【請求項17】

前記リガンドがグルコース代謝を増加するか否かを決定する前記工程は、哺乳動物において低下したインスリン抵抗を検出することを包含する、請求項２または４に記載の方法。

【請求項18】

前記リガンドがグルコース代謝を増加するか否かを決定する前記工程は、増加したグルコース取り込みを検出することを包含する、請求項１または３に記載の方法。

【請求項19】

前記Ｇタンパク質共役レセプターを発現する前記細胞が脂肪細胞である、請求項５または６に記載の方法。

【請求項20】

前記Ｇタンパク質共役レセプターを発現する前記細胞は骨格筋細胞である、請求項５または６に記載の方法。

【請求項21】

前記方法は、
（ｃ）前記化合物が、前記Ｇタンパク質共役レセプターと接触した後にＧｓ共役経路を活性化する能力を決定する工程
をさらに包含する、請求項５または６に記載の方法。

【請求項22】

前記方法は、
（ｃ）前記Ｇタンパク質共役レセプターに結合した化合物を検出する工程
をさらに包含する、請求項５または６に記載の方法。

【請求項23】

前記候補化合物は胆汁酸ではない、請求項１、３、５〜１３、または１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記リガンドは胆汁酸ではない、請求項２、４、または１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記方法は、高血糖、糖尿病、グルコース寛容減損、インスリン抵抗性および高インスリン血症から選択される代謝障害を予防または処置するための薬剤として試験リガンドをスクリーニングするための方法である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心臓病、高血圧症、発作、ニューロパシー、網膜症、腎症および末梢脈管疾患からなる群より選択される、上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するための薬剤として試験リガンドをスクリーニングするための方法である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記Ｇタンパク質共役レセプターは組換え体である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記Ｇタンパク質共役レセプターは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、示した日に、米国速達郵便によって米国特許商標庁に出願した以下の仮出願に
よる優先権の利益を主張する：２００４年４月１３日に出願した米国仮出願第６０／５６
１，９５４号。上記仮出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、１以上の候補化合物がＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のモジュレ
ーターであるか、または血中グルコース濃度のモジュレーターであるかを同定する方法に
関する。特定の実施形態では、ＧＰＣＲはヒトＧＰＣＲである。本発明はまた、ＧＰＣＲ
のモジュレーターを用いる方法に関する。好ましいモジュレーターはアゴニストである。
本発明のアゴニストは、血中グルコース濃度を低下させるための治療剤として、特定の代
謝障害（例えば、インスリン抵抗性、グルコース寛容減損、および糖尿病）を予防または
処置するための治療剤として、そして上昇した血中グルコース濃度の合併症（例えば、ア
テローム性動脈硬化症、心臓病、発作、高血圧症および末梢脈管疾患）を予防または処置
するための治療剤として、有用である。

【背景技術】

【0003】

（発明の背景）
以下の考察は、本発明の理解を促進することを意図するが、本発明の先行技術であるこ
とを意図するわけでも認めるわけでもない。

【0004】

（Ａ．高血糖症）
血中グルコース濃度は、代表的に、狭い範囲に維持される。血中グルコース濃度の上昇
は通常、インスリンの放出増加をもたらし、次いでこれは、標的細胞に作用して、グルコ
ース取り込みを増加させる。血中グルコースホメオスタシスの調節不全は、血中グルコー
ス濃度の持続した上昇、すなわち、高血糖症をもたらし得る。高血糖症を有する一部の個
体は、２型糖尿病を発症することになり得る。組織が高血糖に慢性的にさらされることに
より、ニューロパシー、網膜症および腎症の微小血管の問題ならびに発作、冠状心臓病、
および末梢脈管疾患の大血管（ｍａｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）合併症を含む多様な合併症
がもたらされ得る。高血糖症は、より良好な管理選択肢を必要とする、主な、そして増え
つつある医療問題である［非特許文献１；この開示は、その全体が本明細書中に参考とし
て援用される］。

【0005】

（Ｂ．Ｇタンパク質共役レセプター）
多数のレセプタークラスがヒトに存在するが、これまでのところ、最も豊富でかつ治療
的に適切であるのは、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）クラスによって表される
。約３０，０００〜約４０，０００の遺伝子がヒトゲノムに存在すると見積もられ、そし
てこれらのうち、約２％がＧＰＣＲをコードすると見積もられる。

【0006】

ＧＰＣＲは、薬学的製品の開発のための重要な領域を表す；１００の公知のＧＰＣＲの
うち約２０から、全ての処方薬剤のうちの約６０％が開発された。例えば、１９９９年に
は、上位１００位のブランド名の処方薬物のうち、以下の薬物は、ＧＰＣＲと相互作用す
る（薬物に関連する処置される原発性疾患および／または原発性障害は、カッコ内に示さ
れる）：

【0007】

【表1】

ＧＰＣＲは、共通の構造モチーフを共有し、７つのαらせんを形成する、２２と２４と
の間の疎水性アミノ酸の７つの配列を有し、これらのαらせんの各々は、膜を貫通する（
各貫通は、数字によって同定される、すなわち、膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（
ＴＭ−２）など）。これらの膜貫通らせんは、細胞膜の外側（すなわち、「細胞外」側）
において、膜貫通−２と膜貫通−３との間、膜貫通−４と膜貫通−５との間、そして膜貫
通−６と膜貫通−７との間でアミノ酸鎖によって連結される（これらは、それぞれ、「細
胞外」領域１、２および３（ＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３）と呼ばれる）。これら
の膜貫通らせんはまた、細胞膜の内側（すなわち「細胞内」側）において、膜貫通−１と
膜貫通−２との間、膜貫通−３と膜貫通−４との間、そして膜貫通−５と膜貫通−６との
間でアミノ酸鎖によって連結される（これらは、それぞれ、「細胞内」領域１、２および
３（ＩＣ−１、ＩＣ−２およびＩＣ−３）と呼ばれる）。これらのレセプターの「カルボ
キシ」（「Ｃ」）末端は、細胞内の細胞内腔に位置し、そしてこれらのレセプターの「ア
ミノ」（「Ｎ」）末端は細胞外の細胞外腔に位置する。

【0008】

一般に、リガンドがレセプター（しばしば、レセプターの「活性化」と呼ばれる）と結
合した場合、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」との間での共役を促進する、そのレセ
プターのコンホメーション変化が存在する。ＧＰＣＲがＧタンパク質に関して「無差別」
であること、すなわち、ＧＰＣＲが１種より多くのＧタンパク質と相互作用し得ることが
報告されている。非特許文献２を参照のこと。他のＧタンパク質が存在するとはいえ、現
在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏは、同定されたＧタンパク質である。Ｇタンパク
質とのリガンド活性化ＧＰＣＲ共役は、シグナル伝達カスケードプロセスを示す（「シグ
ナル伝達」といわれる）。正常な条件下で、シグナル伝達は最終的に、細胞の活性化また
は細胞阻害をもたらす。理論によって束縛されることを望まないが、レセプターのＩＣ−
３ループならびにカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられる。

【0009】

ホスホリパーゼＣ経路へのいくつかのクラスのＧＰＣＲと共役するようである、無差別
のＧタンパク質（例えば、Ｇα１５またはＧα１６［非特許文献３］）または同じ経路へ
の多数の異なるＧＰＣＲと共役するように設計されたキメラＧタンパク質（例えば、ホス
ホリパーゼＣ［非特許文献４］）もまた存在する。

【0010】

生理学的条件下で、ＧＰＣＲは、２つの異なるコンホメーション（「不活性」状態およ
び「活性」状態）の間で平衡して細胞膜中に存在する。不活性状態のレセプターは、細胞
内シグナル伝達経路に連結して、シグナル伝達を開始して生物学的応答をもたらすことが
できない。レセプターのコンホメーションを活性状態に変更することにより、（Ｇタンパ
ク質による）シグナル伝達経路への連結が可能により、生物学的応答を生じる。

【0011】

レセプターは、リガンドまたは化合物（例えば、薬物）によって活性状態で安定化され
得る。近年の知見（このレセプターのアミノ酸配列への改変を含むが、排他的に限定しな
い）は、活性状態のコンホメーションのこのレセプターを促進して安定化する、リガンド
または薬物以外の手段を提供する。これらの手段は、このレセプターへのリガンド結合の
効果をシミュレートすることにより、活性状態のこのレセプターを効果的に安定化する。
このようなリガンド依存性手段による安定化は、「構成的レセプター活性化」と呼ばれる
。

【0012】

（ＲＵＰ４３）
ＲＵＰ４３（ここで、内因性ＲＵＰ４３がＧＰＲ１３１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登
録商標）登録番号ＮＭ＿１７０６９９）であり得ることが理解される）は、胆汁酸につい
てのレセプターとして作用すると近年報告された［特許文献１として２００４年１月７日
に公開された欧州特許出願第０２７１７１１４．９号；および非特許文献５；これらの各
々の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される］。白血球内でのＲＵＰ４３
発現は、単球に特異的であることが報告され、そして単球のＲＵＰ４３において作用する
胆汁酸は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の発現を阻害することが報告された。特許文献１
に開示される化合物は、本発明の方法において用いられ得る。

【特許文献1】欧州特許公開１３７８７４９号明細書

【非特許文献1】Ｎｅｓｔｏ，ＲｅｖｉｅｗｓｉｎＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）４：Ｓ１１−Ｓ１８

【非特許文献2】Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔ．，４３ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ１０９５（１９８８）

【非特許文献3】ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９９５）２７０：１５１７５−８０

【非特許文献4】ＭｉｌｌｉｇａｎおよびＲｅｅｓ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９９９）２０：１１８−２４

【非特許文献5】Ｋａｗａｍａｔａら，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（２００３）２７８：９４３５−９４４０

【発明の開示】

【課題を解決するための手段】

【0013】

（発明の要旨）
出願人は、ＲＵＰ４３のアゴニストが脂肪細胞および骨格筋細胞におけるグルコース取
り込みを増加させることを予想外に見出した。出願人は、ＲＵＰ４３のアゴニストが、哺
乳動物において血中グルコース濃度を低下させる予想外の有用性を有することを開示する
。出願人はさらに、ＲＵＰ４３においてアゴニスト活性を有する新規化合物およびそのた
めの用途を開示する。

【0014】

第一の局面では、本発明は、１以上の候補化合物をＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレー
ターとして同定する方法を特徴とし、このレセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
み、このレセプターは、Ｇタンパク質と共役し；この方法は、工程：（ａ）候補化合物を
このレセプターと接触させる工程；および（ｂ）このレセプターの機能性が調節されるか
否かを決定する工程；を包含し、ここで、レセプターの機能性における変化は、この候補
化合物がＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターであることを示す。

【0015】

特定の実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、以下からなる群より選択され
る：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｃ）ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオ
ニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｄ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号
３のプライマーおよび配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセス
によって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号
７のプライマーおよび配列番号８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセス
によって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸２−３３０；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、
ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン残基
を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；および
（ｊ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列。

【0016】

特定の実施形態では、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲは、組換え体である。特定の実施形態
では、上記接触させる工程が、このＧＰＣＲを発現する宿主細胞またはこのＧＰＣＲを発
現する宿主細胞の膜と接触させることを含み、上記宿主細胞は、上記レセプターをコード
するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、上記接触させる工程は、このＧＰＣＲの公知のリガンドの存
在下で実施される。いくつかの実施形態では、上記接触させる工程は、このＧＰＣＲの公
知のモジュレーターの存在下で実施される。いくつかの実施形態では、上記接触させる工
程は、このＧＰＣＲの公知のアゴニストの存在下で実施される。いくつかの実施形態では
、このＧＰＣＲの上記公知のアゴニストは、化合物１、化合物２、または化合物３である
。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲの上記公知のアゴニストは、化合物１である。いく
つかの実施形態では、このＧＰＣＲの上記公知のアゴニストは、化合物２である。いくつ
かの実施形態では、このＧＰＣＲの上記公知のアゴニストは、化合物３である。いくつか
の実施形態では、上記公知のアゴニストは、上記決定する工程のために、約ＥＣ５０〜約
ＥＣ７５で存在する。

【0018】

本発明はまた、１以上の候補化合物を哺乳動物における血中グルコース濃度のモジュレ
ーターと同定する方法に関し、この方法は、工程：
候補化合物を、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含むＧＰＣＲと接触させる工程であって、
ここでこのレセプターがＧタンパク質と共役する、工程；および
このレセプターの機能性が調節されるか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、レセプターの機能性における変化は、この候補化合物が、哺乳動物に
おける血中グルコース濃度のモジュレーターであることを示す。

【0019】

【0020】

特定の実施形態では、レセプターの機能性の上昇は、この候補化合物が、哺乳動物にお
ける血中グルコース濃度を低下させる化合物であることを示す。

【0021】

特定の実施形態では、上記ＧＰＣＲは組換え体である。特定の実施形態では、上記接触
させる工程は、このＧＰＣＲを発現する宿主細胞またはこのＧＰＣＲを発現する宿主細胞
の膜と接触させることを含み、上記宿主細胞は、このレセプターをコードするポリヌクレ
オチドを含む発現ベクターを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、上記接触させる工程は、このＧＰＣＲの公知のリガンドの存
在下で実施される。いくつかの実施形態では、上記接触させる工程は、このＧＰＣＲの公
知のモジュレーターの存在下で実施される。いくつかの実施形態では、上記接触させる工
程は、このＧＰＣＲの公知のアゴニストの存在下で実施される。いくつかの実施形態では
、このＧＰＣＲの上記公知のアゴニストは、化合物１、化合物２、または化合物３である
。いくつかの実施形態では、このＧＰＣＲの上記公知のアゴニストは、化合物１である。
いくつかの実施形態では、このＧＰＣＲの上記公知のアゴニストは、化合物２である。い
くつかの実施形態では、このＧＰＣＲの上記公知のアゴニストは、化合物３である。いく
つかの実施形態では、上記公知のアゴニストは、上記決定する工程のために、約ＥＣ５０
〜約ＥＣ７５で存在する。

【0023】

特定の実施形態では、上記１以上の候補化合物は、抗体でもその抗原結合誘導体でもな
い。

【0024】

特定の実施形態では、上記１以上の候補化合物はペプチドではない。

【0025】

特定の実施形態では、上記１以上の候補化合物は胆汁酸ではない。

【0026】

いくつかの実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配
列である。いくつかの実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、配列番号２のア
ミノ酸配列の改変体である。いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列の上記
改変体は、上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体または哺乳動物オルソログである。いく
つかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列の上記改変体は、上記アミノ酸配列また
は上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オルソログの非内因性の構成的
に活性化された変異体である。特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列の上記改
変体は、上記アミノ酸配列または上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物
オルソログの生物学的に活性なフラグメントである。特定の実施形態では、配列番号２の
アミノ酸配列または上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オルソログの
上記生物学的に活性なフラグメントは、Ｎ末端メチオニンがない、配列番号２または上記
アミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オルソログのアミノ酸配列である。特
定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列の上記改変体は、配列番号２のアミノ酸配
列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくと
も約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくと
も約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくと
も約９８％または少なくとも約９９％同一である。いくつかの実施形態では、配列番号２
のアミノ酸配列の上記改変体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約９０
％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４
％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８
％または少なくとも約９９％同一である。

【0027】

特定の実施形態では、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲは、
１以上のエピトープタグをさらに含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、
上記１以上のエピトープタグを含む融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列である
。

【0028】

特定の実施形態では、上記Ｇタンパク質は、細胞内ｃＡＭＰのレベルの上昇をもたらす
。いくつかの好ましい実施形態では、上記Ｇタンパク質はＧｓである。

【0029】

特定の実施形態では、上記Ｇタンパク質は、百日咳毒素感受性である。特定の実施形態
では、上記Ｇタンパク質はＧｉまたはＧｏである。特定の実施形態では、上記Ｇタンパク
質はＧｉである。特定の実施形態では、上記Ｇタンパク質はＧｏである。

【0030】

特定の実施形態では、上記Ｇタンパク質はＧα１５またはＧα１６である。特定の実施
形態では、上記Ｇタンパク質はＧα１５である。特定の実施形態では、上記Ｇタンパク質
はＧα１６である。

【0031】

特定の実施形態では、上記Ｇタンパク質はＧｑである。

【0032】

特定の実施形態では、上記方法は、候補化合物によって引き起こされるレセプターの調
節を、このレセプターを公知のレセプターモジュレーターと接触させることにより引き起
こされるこのレセプターの第２の調節に対して比較する工程をさらに包含する。特定の実
施形態では、上記公知のモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、上記
アゴニストは、化合物１、化合物２、または化合物３である。特定の実施形態では、上記
アゴニストは化合物１である。特定の実施形態では、上記アゴニストは化合物２である。
特定の実施形態では、上記アゴニストは化合物３である。

【0033】

いくつかの好ましい実施形態では、上記決定する工程または上記比較する工程は、上記
ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳ結合の測定を通してである。特定の実施形態では、上記
ＧＴＰγＳは、［^３５Ｓ］で標識される。

【0034】

特定の実施形態では、上記決定する工程または上記比較する工程は、サイクリックＡＭ
Ｐ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ_３）、
ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼ活性、およびＣａ^２＋からなる群より
選択されるセカンドメッセンジャーのレベルの測定を通してである。特定の好ましい実施
形態では、上記セカンドメッセンジャーはｃＡＭＰである。特定の好ましい実施形態では
、ｃＡＭＰのレベルが上昇する。特定の実施形態では、ｃＡＭＰの上記測定は、細胞全体
のアデニリルシクラーゼアッセイを用いて実施される。特定の実施形態では、ｃＡＭＰの
上記測定は、上記ＧＰＣＲを含む膜を用いて実施される。特定の実施形態では、上記セカ
ンドメッセンジャーはＭＡＰキナーゼ活性である。特定の実施形態では、ＭＡＰキナーゼ
活性のレベルが上昇する。

【0035】

いくつかの好ましい実施形態では、上記決定する工程または上記比較する工程は、ＣＲ
Ｅ−レポーターアッセイを通してである。特定の実施形態では、上記レポーターはルシフ
ェラーゼである。いくつかの実施形態では、上記レポーターはβ−ガラクトシダーゼであ
る。

【0036】

特定の実施形態では、上記決定する工程または上記比較する工程は、細胞内ＩＰ_３の測
定を通してである。

【0037】

特定の実施形態では、上記決定する工程または上記比較する工程は、細胞内Ｃａ^２＋の
測定を通してである。

【0038】

特定の実施形態では、上記決定する工程または上記比較する工程は、哺乳動物から得ら
れた脂肪細胞によるグルコース取り込みの測定を通してである。

【0039】

特定の実施形態では、上記決定する工程または上記比較する工程は、哺乳動物から得ら
れた骨格筋細胞によるグルコース取り込みの測定を通してである。

【0040】

特定の好ましい実施形態では、上記決定する工程または上記比較する工程は、メラニン
保有細胞アッセイの使用を通してである。

【0041】

第二の局面では、本発明は、以下の式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に受容可能な
塩を特徴とし：

【0042】

【化2】

ここで：
Ｒ_１は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ_２は、２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−インダゾール−３−イル
基である；または
Ｒ_１およびＲ_２は、それらが結合する窒素と一緒になって、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−
キノリン−１−イル基を形成し；そして
Ｒ_１０およびＲ_１１は、各々独立して、Ｈまたはハロゲンである
第三の局面では、本発明は、第一の局面の方法に従って同定されたＧＰＣＲのモジュレ
ーターを特徴とする。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗原結
合誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定
の実施形態では、このモジュレーターは胆汁酸ではない。特定の実施形態では、このモジ
ュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化
合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨格筋
細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である。

【0043】

本発明はまた、第一の局面の方法に従って同定可能なＧＰＣＲのモジュレーターを特徴
とする。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗原結合誘導体でも
ない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定の実施形態で
は、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを
増加させる化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得
られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である。

【0044】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニ
ストおよびアンタゴニストからなる群より選択される。特定の実施形態では、上記モジュ
レーターはアゴニストである。特定の実施形態では、上記モジュレーターは部分アゴニス
トである。特定の実施形態では、上記モジュレーターは逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニスト
である。特定の実施形態では、上記モジュレーターはアンタゴニストである。

【0045】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは好ましくはアゴニストである。特定の実施
形態では、上記アゴニストは、第二の局面による化合物である。

【0046】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形
態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ
_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０
ｎＭ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつ
かの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される
値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、配
列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペ
プチドを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体
のｃＡＭＰアッセイ；および配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換
えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細
胞を用いて実施されるメラニン保有細胞アッセイからなる群より選択されるアッセイを用
いて決定される。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおい
て１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するア
ゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおい
て１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８μＭ未
満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、上記ア
ッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイにおい
て３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μＭ未満
の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の、上記
アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上記アッ
セイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記アッセイ
において１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイにおい
て８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６０ｎ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ未満の
、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、または
上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満の、ＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの
実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭの区
間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では
、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択され
る値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレ
ーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未満の
ＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0047】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、ＧＰＣＲに選択的である。

【0048】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、化合物１（「Ｃｍｐｄ＃１」，表１
を参照のこと）、化合物２（「Ｃｍｐｄ＃２」、表１を参照のこと）、または化合物３（
「Ｃｍｐｄ＃３」、表１を参照のこと）である。いくつかの実施形態では、上記モジュレ
ーターは化合物１である。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは化合物２であ
る。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは化合物３である。

【0049】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能（ｂｉｏ
ａｖａｉｌａｂｌｅ）である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は
、腹腔内投与と比較して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なく
とも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５
％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記
経口での生物学的利用能は、腹腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５
％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％
である。

【0050】

いくつかの実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、
血液−脳関門を越えることができる。

【0051】

第四の局面では、本発明は、薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を調製す
る方法を特徴とし、この方法は、キャリアとＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターとを
混合する工程を包含し、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実
施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗原結合誘導体でもない。特定の実施
形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定の実施形態では、このモジュレ
ーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物
である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨格筋細胞
によるグルコース取り込みを増加させる化合物である。特定の実施形態では、このモジュ
レーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからな
る群より選択される。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特
定の実施形態では、このモジュレーターは部分アゴニストである。特定の実施形態では、
このモジュレーターは逆アゴニストである。特定の実施形態では、このモジュレーターは
アンタゴニストである。特定の実施形態では、このモジュレーターは好ましくはアゴニス
トである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局面による化合物である。

【0052】

本発明はまた、薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を調製する方法を特徴
とし、この方法は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを同定する工程であって、上
記レセプターがＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む工程、次いでキャリアとこのモジュレー
ターとを混合する工程であって、このモジュレーターが、第一の局面に従った方法により
同定可能である工程を包含する。特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局
面に従って同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターは抗体でもその抗原結
合誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定
の実施形態では、このモジュレーターは、好ましくはアゴニストである。特定の実施形態
では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込み
を増加させる化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から
得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である。特定の実施形
態では、このモジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびア
ンタゴニストからなる群より選択される。特定の実施形態では、このモジュレーターはア
ゴニストである。特定の実施形態では、このモジュレーターは部分アゴニストである。特
定の実施形態では、このモジュレーターは逆アゴニストである。特定の実施形態では、こ
のモジュレーターはアンタゴニストである。特定の実施形態では、このモジュレーターは
好ましくはアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局面によ
る化合物である。

【0053】

特定の実施形態では、上記組成物は薬学的組成物である。特定の実施形態では、上記組
成物は薬学的に受容可能である。

【0054】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、配列
番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプ
チドを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体の
ｃＡＭＰアッセイ；および配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換え
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞
を用いて実施されるメラニン保有細胞アッセイからなる群より選択されるアッセイを用い
て決定される。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて
１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴ
ニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて
１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８μＭ未満
の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、上記アッ
セイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイにおいて
３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μＭ未満の
、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未満の、上
記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の、上記ア
ッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上記アッセ
イにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記アッセイに
おいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて
８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６０ｎＭ
未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、または上
記アッセイにおいて１０ｎＭ未満の、ＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実
施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭの区間
から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、
上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択される
値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレー
ターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未満のＥ
Ｃ_５０を有するアゴニストである。

【0055】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、ＧＰＣＲに選択的である。

【0056】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、化合物１、化合物２、または化合物
３である。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは化合物１である。いくつかの
実施形態では、上記モジュレーターは化合物２である。いくつかの実施形態では、上記モ
ジュレーターは化合物３である。

【0057】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は、腹腔内投与と比較して、少な
くとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または
少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は、腹
腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0058】

いくつかの実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、
血液−脳関門を越えることができる。

【0059】

第五の局面では、本発明は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし、
上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、この方法は、このレセプターとこの
レセプターのモジュレーターとを接触させる工程を包含する。特定の実施形態では、この
モジュレーターは、第一の局面の方法に従う方法により同定可能である。特定の実施形態
では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に従って同定される。特定の実施形態で
は、このモジュレーターは抗体でもその抗原結合誘導体でもない。特定の実施形態では、
このモジュレーターはペプチドではない。特定の実施形態では、このモジュレーターは、
アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群より選択
される。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態
では、このモジュレーターは部分アゴニストである。特定の実施形態では、このモジュレ
ーターは逆アゴニストである。特定の実施形態では、このモジュレーターはアンタゴニス
トである。特定の実施形態では、このモジュレーターは、好ましくはアゴニストである。
特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグル
コース取り込みを増加させる化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは
、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを増加させる化合物である
。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局面による化合物である。

【0060】

本発明はまた、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし、上記レセプタ
ーはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、この方法は、このレセプターをこのレセプターの
モジュレーターと接触させる工程を包含し、このモジュレーターは、第一の局面の方法に
より同定可能である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に
従って同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗原結合
誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定の
実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース
取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動
物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実
施形態では、このモジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およ
びアンタゴニストからなる群より選択される。特定の実施形態では、このモジュレーター
はアゴニストである。特定の実施形態では、このモジュレーターは部分アゴニストである
。特定の実施形態では、このモジュレーターは逆アゴニストである。特定の実施形態では
、このモジュレーターはアンタゴニストである。特定の実施形態では、このモジュレータ
ーは好ましくはアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局面
による化合物である。

【0061】

【0062】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、ＧＰＣＲに選択的である。

【0063】

【0064】

【0065】

いくつかの実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、
血液−脳関門を越えることができる。

【0066】

特定の実施形態では、上記接触させる工程は、このレセプターを含む膜へのこのモジュ
レーターの投与を包含する。

【0067】

特定の実施形態では、上記接触させる工程は、このモジュレーターを、このレセプター
を含む細胞に投与することを含む。

【0068】

特定の実施形態では、上記接触させる工程は、このモジュレーターを、このレセプター
を含む組織に投与することを含む。

【0069】

特定の実施形態では、上記接触させる工程は、このモジュレーターを、このレセプター
を含む個体に投与することを含む。特定の実施形態では、このレセプターを含む個体への
モジュレーターの上記投与は、経口投与である。特定の実施形態では、上記個体は哺乳動
物である。特定の実施形態では、上記個体は非ヒト哺乳動物である。特定の実施形態では
、上記哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、
非ヒト霊長類またはヒトである。特定の実施形態では、上記哺乳動物は、マウス、ラット
、非ヒト霊長類、またはヒトである。最も好ましいのはヒトである。

【0070】

第六の局面では、本発明は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし、
上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで上記調節は、上記調節を必要
とする個体において血中グルコース濃度を低下させるためであり、この方法は、上記レセ
プターを該レセプターの治療有効量のモジュレーターと接触させる工程を包含する。特定
の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。

【0071】

本発明はまた、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし、上記レセプタ
ーはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで上記調節は、上記調節を必要とする個体に
おいて代謝障害を予防または処置するためであり、この方法は、上記レセプターを該レセ
プターの治療有効量のモジュレーターと接触させる工程を包含する。特定の実施形態では
、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、この代謝障害は、以下
からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0072】

いくつかの実施形態では、糖尿病は１型糖尿病である。特定の好ましい実施形態では、
糖尿病は２型糖尿病である。特定の実施形態では、この代謝障害は糖尿病である。特定の
実施形態では、この代謝障害は１型糖尿病である。特定の実施形態では、この代謝障害は
２型糖尿病である。特定の実施形態では、この代謝障害はグルコース寛容減損である。特
定の実施形態では、この代謝障害はインスリン抵抗性である。特定の実施形態では、この
代謝障害は高インスリン血症である。特定の実施形態では、この代謝障害は、この個体に
おける上昇した血中グルコース濃度に関連する。

【0073】

本発明はまた、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし、上記レセプタ
ーはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで上記調節は、上記調節を必要とする個体に
おいて上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためであり、この方法
は、上記レセプターを該レセプターの治療有効量のモジュレーターと接触させる工程を包
含する。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態
では、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0074】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧である
。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特定の実施形態では、この合併症
は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形
態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では、この合併症はニューロパシー
である。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患である。特定の実施形態では、
この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態では、この合併症は高脂血症で
ある。

【0075】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に従った方法により同
定可能である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に従って
同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターは抗体でもその抗原結合誘導体で
もない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定の実施形態
では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込み
を刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得
られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態で
は、上記モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタ
ゴニストからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態では、上記モジュレーター
はアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局面による化合物
である。

【0076】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはＧＰＣＲに選択的である。

【0077】

【0078】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。いく
つかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少な
くとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または
少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は
、腹腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少
なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0079】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0080】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、配列
番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプ
チドを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体の
ｃＡＭＰアッセイ；および配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換え
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞
を用いて実施されるメラニン保有細胞アッセイからなる群より選択されるアッセイを用い
て決定される。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて
１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴ
ニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて
１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８μＭ未満
の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、上記アッ
セイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイにおいて
３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μＭ未満の
、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未満の、上
記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の、上記ア
ッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上記アッセ
イにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記アッセイに
おいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて
８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６０ｎＭ
未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、または上
記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施
形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭの区間か
ら選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上
記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレータ
ーは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未満のＥＣ
_５０を有するアゴニストである。

【0081】

特定の実施形態では、上記接触させる工程は、上記個体への上記モジュレーターの経口
投与を包含する。

【0082】

特定の実施形態では、上記個体は哺乳動物である。特定の実施形態では、上記個体は非
ヒト哺乳動物である。特定の実施形態では、上記哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ
、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトである。特定の実施形
態では、上記哺乳動物は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。最も好ま
しいのはヒトである。

【0083】

第七の局面では、本発明は、上記低下を必要とする個体において血中グルコース濃度を
低下させる方法を特徴とし、この方法は、治療有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレ
ーターを上記レセプターと接触させる工程を包含し、上記ＧＰＣＲはＧＰＲ１３１アミノ
酸配列を含む。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。

【0084】

本発明はさらに、哺乳動物中の血中グルコース濃度を低下させる方法を特徴とし、この
方法は、上記低下を必要とする哺乳動物にＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを提供
または投与する工程を包含し、上記ＧＰＣＲはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の
実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、ＲＵＰ４
３ＧＰＣＲアゴニストはＧＰＲ１３１ＧＰＣＲアゴニストであり、ここで、ＧＰＲ１
３１ＧＰＣＲは内因性ＲＵＰ４３ＧＰＣＲであることが理解される。

【0085】

本発明はまた、代謝障害の予防または処置を必要とする個体における代謝障害を予防ま
たは治療する方法を特徴とし、この方法は、治療有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュ
レーターを上記レセプターと接触させる工程を包含し、上記レセプターはＧＰＲ１３１ア
ミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定
の実施形態では、この代謝障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0086】

本発明はさらに、代謝障害を予防または処置する方法を特徴し、この方法は、上記予防
または処置を必要とする哺乳動物にＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを投与する工
程を包含し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、
このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲア
ゴニストはＧＰＲ１３１ＧＰＣＲアゴニストであり、ここで、ＧＰＲ１３１ＧＰＣＲ
は内因性ＲＵＰ４３ＧＰＣＲであることが理解される。特定の実施形態では、この代謝
障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0087】

【0088】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする個
体において上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法を特徴とし、
この方法は、治療有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを上記レセプターと接
触させる工程を包含し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施
形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、この合併症は
、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0089】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0090】

本発明はさらに、上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法を特
徴とし、この方法は、上記予防または処置を必要とする哺乳動物にＲＵＰ４３ＧＰＣＲ
のモジュレーターを提供または投与する工程を包含し、上記レセプターはＧＰＲ１３１ア
ミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定
の実施形態では、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲアゴニストはＧＰＲ１３１ＧＰＣＲアゴニスト
であり、ここで、ＧＰＲ１３１ＧＰＣＲは内因性ＲＵＰ４３ＧＰＣＲであることが理
解される。特定の実施形態では、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0091】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0092】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に従う方法を実施する
ことにより同定可能である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の
方法に従って同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗
原結合誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。
特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグル
コース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、
哺乳動物から得た脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の
実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコー
ス取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳
動物から得た骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実
施形態では、上記モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およ
びアンタゴニストからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態では、上記モジュ
レーターはアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局面によ
る化合物である。

【0093】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはＧＰＣＲに選択的である。

【0094】

【0095】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。いく
つかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少な
くとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または
少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は、腹
腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0096】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0097】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有す
るアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、上
記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイに
おいて３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μＭ
未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未満
の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上記
アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記アッ
セイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイに
おいて８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６
０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、ま
たは上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭの
区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態で
は、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択さ
れる値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュ
レーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未満
のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0098】

特定の実施形態では、上記接触させる工程は、上記個体への上記モジュレーターの経口
投与を包含する。

【0099】

【0100】

第八の局面では、本発明は、薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を特徴と
し、該薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジ
ュレーターを含むか、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターから本質的になるか、また
はＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターからなり、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１ア
ミノ酸配列を含む。

【0101】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に従う方法を実施する
ことにより同定可能である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の
方法に従って同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗
原結合誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。
特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグル
コース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、
哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特
定の実施形態では、上記モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト
、およびアンタゴニストからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態では、上記
モジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局
面による化合物である。

【0102】

特定の実施形態では、上記組成物は薬学的組成物である。特定の実施形態では、この薬
学的組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを含む。特定の実施形態では、こ
の薬学的組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターから本質的になる。特定の実
施形態では、この薬学的組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターからなる。

【0103】

特定の実施形態では、上記組成物は、薬学的に受容可能である。特定の実施形態では、
この生理学的に受容可能な組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを含む。特
定の実施形態では、この生理学的に受容可能な組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュ
レーターから本質的になる。特定の実施形態では、この生理学的に受容可能な組成物は、
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターからなる。

【0104】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはＧＰＣＲに選択的である。

【0105】

【0106】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。いく
つかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少な
くとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または
少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は、腹
腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0107】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0108】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有
するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイ
において、１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて
８μＭ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の
、上記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセ
イにおいて３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１
μＭ未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ
未満の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満
の、上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記
アッセイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセ
イにおいて８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおい
て６０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の
、または上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いく
つかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μ
Ｍの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形
態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選
択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モ
ジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0109】

第九の局面では、本発明は、血中グルコース濃度を低下させる方法を特徴とし、この方
法は、上記低下を必要とする個体に、第八の局面の上記薬学的組成物または生理学的に受
容可能な組成物を提供または投与する工程を包含する。

【0110】

本発明はまた、代謝障害を予防または処置する方法を特徴とし、この方法は、上記予防
または処置を必要とする個体に、第八の局面の上記薬学的組成物または生理学的に受容可
能な組成物を提供または投与する工程を包含する。特定の実施形態では、この代謝障害は
、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0111】

【0112】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法を特徴
とし、この方法は、上記予防または処置を必要とする個体に、第八の局面の上記薬学的組
成物または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程を包含する。特定の実
施形態では、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0113】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0114】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはアゴニストである。

【0115】

特定の実施形態では、治療有効量の上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成
物は、上記個体に提供または投与される。

【0116】

特定の実施形態では、上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供する
工程または投与する工程は経口的である。

【0117】

【0118】

第十の局面では、本発明は、治療によるヒトまたは動物体の処置方法において使用する
ためのＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを特徴とし、上記レセプターはＧＰＲ１３
１アミノ酸配列を含む。

【0119】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に従う方法を実施する
ことにより同定可能である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の
方法に従って同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗
原結合誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。
特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグル
コース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、
ヒトまたは動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である
.
特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグ
ルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは
、ヒトまたは動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物で
ある。特定の実施形態では、上記モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆ア
ゴニスト、およびアンタゴニストからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態で
は、上記モジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、
第二の局面による化合物である。

【0120】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはＧＰＣＲに選択的である。

【0121】

【0122】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。いく
つかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少な
くとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または
少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は、腹
腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0123】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0124】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有す
るアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、上
記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイに
おいて３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μＭ
未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未満
の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上記
アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記アッ
セイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイに
おいて８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６
０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、ま
たは上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭの
区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態で
は、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択さ
れる値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュ
レーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未満
のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0125】

特定の実施形態では、上記動物は哺乳動物である。特定の実施形態では、上記哺乳動物
は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、または非ヒト霊
長類である。ヒトまたは動物のうちでより好ましいのはヒトである。

【0126】

第十一の局面では、本発明は、治療によってヒトまたは動物体の血中グルコース濃度を
低下させる方法において使用するためのＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを特徴と
し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、このモジ
ュレーターはアゴニストである。

【0127】

本発明はまた、治療によってヒトまたは動物体における代謝障害を予防または処置する
方法において使用するためのＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを特徴とし、上記レ
セプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、このモジュレーター
はアゴニストである。特定の実施形態では、この代謝障害は、以下からなる群より選択さ
れる：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0128】

【0129】

本発明はまた、治療によってヒトまたは動物体における上昇した血中グルコース濃度の
合併症を予防または処置する方法において使用するためのＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュ
レーターを特徴とし、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形
態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、この合併症は、
以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0130】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0131】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に従う方法を実施する
ことにより同定可能である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の
方法に従って同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗
原結合誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。
特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグル
コース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、
ヒトまたは動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である
。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨格筋細胞による
グルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーター
は、ヒトまたは動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物
である。特定の実施形態では、上記モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆
アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態
では、上記モジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは
、第二の局面による化合物である。

【0132】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはＧＰＣＲに選択的である。

【0133】

【0134】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。いく
つかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少な
くとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または
少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は、腹
腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0135】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0136】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有す
るアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、上
記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイに
おいて３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μＭ
未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未満
の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上記
アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記アッ
セイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイに
おいて８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６
０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、ま
たは上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭの
区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態で
は、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択され
る値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレ
ーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未満の
ＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0137】

【0138】

第十二の局面では、本発明は、血中グルコース濃度を低下させるための医薬の調製のた
めにＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを使用する方法を特徴とし、上記レセプター
はＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニ
ストである。特定の実施形態では、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲアゴニストはＧＰＲ１３１Ｇ
ＰＣＲアゴニストであり、ここで、ＧＰＲ１３１ＧＰＣＲは内因性ＲＵＰ４３ＧＰＣ
Ｒであることが理解される。

【0139】

本発明はまた、代謝障害の予防または処置のための医薬の調製のためにＲＵＰ４３Ｇ
ＰＣＲのモジュレーターを使用する方法を特徴とし、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミ
ノ酸配列を含む。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定の
実施形態では、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲアゴニストはＧＰＲ１３１ＧＰＣＲアゴニストで
あり、ここで、ＧＰＲ１３１ＧＰＣＲは内因性ＲＵＰ４３ＧＰＣＲであることが理解
される。特定の実施形態では、この代謝障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0140】

【0141】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置のための医薬の
調製のためにＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを使用する方法を特徴とし、上記レ
セプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、このモジュレーター
はアゴニストである。特定の実施形態では、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲアゴニストはＧＰＲ１
３１ＧＰＣＲアゴニストであり、ここで、ＧＰＲ１３１ＧＰＣＲは内因性ＲＵＰ４３
ＧＰＣＲであることが理解される。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニ
ストである。特定の実施形態では、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0142】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0143】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の方法に従う方法を実施する
ことにより同定可能である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、第一の局面の
方法に従って同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗
原結合誘導体でもない。特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。
特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグル
コース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、
哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特
定の実施形態では、上記モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト
、およびアンタゴニストからなる群より選択される。特定の好ましい実施形態では、上記
モジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、上記アゴニストは、第二の局
面による化合物である。

【0144】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはＧＰＣＲに選択的である。

【0145】

【0146】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。いく
つかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少な
くとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または
少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は、腹
腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0147】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0148】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有す
るアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、上
記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイに
おいて３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μＭ
未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未満
の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上記
アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記アッ
セイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイに
おいて８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６
０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、ま
たは上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭの
区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態で
は、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択さ
れる値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュ
レーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未満
のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0149】

第十三の局面では、本発明は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし
、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで、上記調節は、上記調節
を必要とする個体において血中グルコースを低下させるためであり、この方法は、上記レ
セプターをこのレセプターの治療有効量のモジュレーターと接触させる工程を包含する。
特定の実施形態では、上記方法は、第一の局面による方法を最初に実施し、それによりこ
のモジュレーターを同定する工程を包含する。特定の実施形態では、このモジュレーター
はアゴニストである。

【0150】

本発明はまた、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし、上記レセプタ
ーは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで、上記調節は、上記調節を必要とする個
体において代謝障害を予防または処置するためであり、この方法は、上記レセプターをこ
のレセプターの治療有効量のモジュレーターと接触させる工程を包含する。特定の実施形
態では、上記方法は、第一の局面による方法を最初に実施し、それによりこのモジュレー
ターを同定する工程を包含する。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニスト
である。特定の実施形態では、この代謝障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0151】

【0152】

本発明はまた、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし、上記レセプタ
ーは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで、上記調節は、上記調節を必要とする個
体において上昇した血中グルコースの合併症を予防または処置するためであり、この方法
は、上記レセプターをこのレセプターの治療有効量のモジュレーターと接触させる工程を
包含する。特定の実施形態では、上記方法は、第一の局面による方法を最初に実施し、そ
れによりこのモジュレーターを同定する工程を包含する。特定の実施形態では、このモジ
ュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、この合併症は、以下からなる群よ
り選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0153】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0154】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗原結合誘導体でもない。
特定の実施形態では、上記モジュレーターペプチドではない。特定の実施形態では、この
モジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを刺激する
化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨格
筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、上記モ
ジュレーターは、第三の局面による。特定の実施形態では、上記モジュレーターは、アゴ
ニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群より選択され
る。特定の好ましい実施形態では、上記モジュレーターはアゴニストである。

【0155】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはＧＰＣＲに選択的である。

【0156】

【0157】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。いく
つかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少な
くとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または
少なくとも４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用能は、腹
腔内投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なく
とも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0158】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0159】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有す
るアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、上
記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイに
おいて３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μＭ
未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未満
の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の、
上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上記
アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記アッ
セイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイに
おいて８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６
０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、ま
たは上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭの
区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態で
は、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択さ
れる値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュ
レーターは、上記アッセイにおいて１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未満の
ＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0160】

特定の実施形態では、上記接触させる工程は、上記個体への上記モジュレーターの経口
投与を包含する。

【0161】

【0162】

第十四の局面では、本発明は、血中グルコースの低下を必要とする個体において血中グ
ルコースを低下させる方法を特徴とし、この方法は、治療有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲ
のモジュレーターを上記レセプターと接触させる工程を包含し、上記ＧＰＣＲは、ＧＰＲ
１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記方法は、第一の局面による方法を
最初に実施し、それによりこのモジュレーターを同定する工程を包含する。特定の実施形
態では、このモジュレーターはアゴニストである。

【0163】

本発明はまた、代謝障害の予防または処置を必要とする個体において代謝障害を予防ま
たは処置する方法を特徴とし、この方法は、治療有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュ
レーターを上記レセプターと接触させる工程を包含し、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１
アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記方法は、第一の局面による方法を最初に
実施し、それによりこのモジュレーターを同定する工程を包含する。特定の実施形態では
、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、この代謝障害は、以下
からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0164】

【0165】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする個
体において上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法を特徴とし、
この方法は、治療有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを上記レセプターと接
触させる工程を包含し、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実
施形態では、上記方法は、第一の局面による方法を最初に実施し、それによりこのモジュ
レーターを同定する工程を包含する。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニ
ストである。特定の実施形態では、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0166】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0167】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗原結合誘導体でもない。
特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定の実施形態では、こ
のモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを刺激す
る化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨
格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、上記
このモジュレーターは、第三の局面による。特定の実施形態では、上記モジュレーターは
、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群より選
択される。特定の好ましい実施形態では、上記モジュレーターはアゴニストである。

【0168】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、ＧＰＣＲに選択的である。

【0169】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、化合物１、化合物２、または化合物
３である。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、化合物１である。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、化合物２である。いくつかの実施形態では、上
記モジュレーターは、化合物３である。

【0170】

【0171】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0172】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有
するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイ
において１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８
μＭ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、
上記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイ
において３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の
、上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上
記アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記ア
ッセイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイ
において８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて
６０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ
未満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、
または上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつ
かの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭ
の区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択
される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジ
ュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未
満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0173】

特定の実施形態では、上記接触させる工程は、上記モジュレーターを上記個体に経口投
与することを含む。

【0174】

【0175】

第十五の局面では、本発明は、上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を
特徴とし、この組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを含むか、このモジュ
レーターから本質的になるか、またはこのモジュレーターからなり、上記レセプターは、
ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記モジュレーターは、第一の
局面の方法に従う方法を実施することにより同定可能である。特定の実施形態では、上記
モジュレーターは、第一の局面に従う方法を実施することにより同定される。

【0176】

特定の実施形態では、このモジュレーターは、抗体でもその抗原結合誘導体でもない。
特定の実施形態では、このモジュレーターはペプチドではない。特定の実施形態では、こ
のモジュレーターは、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを刺激す
る化合物である。特定の実施形態では、このモジュレーターは、哺乳動物から得られた骨
格筋細胞によるグルコース取り込みを刺激する化合物である。特定の実施形態では、上記
モジュレーターは、第三の局面による。特定の実施形態では、上記モジュレーターは、ア
ゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群より選択さ
れる。特定の好ましい実施形態では、上記モジュレーターはアゴニストである。

【0177】

特定の実施形態では、上記組成物は薬学的組成物である。特定の実施形態では、この薬
学的組成物はＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを含む。特定の実施形態では、この
薬学的組成物はＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターから本質的になる。特定の実施形
態では、この薬学的組成物はＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターからなる。

【0178】

特定の実施形態では、上記組成物は生理学的に受容可能である。特定の実施形態では、
この生理学的に受容可能な組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを含む。特
定の実施形態では、この生理学的に受容可能な組成物は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュ
レーターから本質的になる。特定の実施形態では、この生理学的に受容可能な組成物は、
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターからなる。

【0179】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、ＧＰＣＲに選択的である。

【0180】

【0181】

【0182】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0183】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有
するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイ
において１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８
μＭ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、
上記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイ
において３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の
、上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上
記アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記ア
ッセイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイ
において８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて
６０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ
未満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、
または上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつ
かの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭ
の区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択
される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジ
ュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未
満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0184】

第十六の局面では、本発明はさらに、血中グルコース濃度を低下させる方法を特徴とし
、この方法は、上記低下を必要とする個体に、第十五の局面の上記薬学的組成物または生
理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程を包含する。

【0185】

本発明はまた、代謝障害を予防または処置する方法を特徴とし、この方法は、上記予防
または処置を必要とする個体に、第十五の局面の上記薬学的組成物または生理学的に受容
可能な組成物を提供または投与する工程を包含する。特定の実施形態では、この代謝障害
は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0186】

【0187】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法を特徴
とし、この方法は、上記予防または処置を必要とする個体に、第十五の局面の上記薬学的
組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程を包含する。特定の
実施形態では、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0188】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0189】

特定の実施形態では、上記モジュレーターはアゴニストである。

【0190】

特定の実施形態では、治療有効量の上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成
物が上記個体に提供または投与される。

【0191】

特定の実施形態では、上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供する
工程または投与する工程は経口的である。

【0192】

【0193】

第十七の局面では、本発明は、治療によるヒトまたは動物体の処置方法において使用す
るためのＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを特徴とし、上記レセプターはＧＰＲ１
３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記モジュレーターは、第一の局面の方
法に従う方法を実施することにより同定可能である。特定の実施形態では、上記このモジ
ュレーターは、第一の局面に従う方法を実施することにより同定される。

【0194】

【0195】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、ＧＰＣＲに選択的である。

【0196】

【0197】

【0198】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0199】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有
するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイ
において１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８
μＭ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、
上記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイ
において３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の
、上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上
記アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記ア
ッセイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイ
において８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて
６０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ
未満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、
または上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつ
かの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭ
の区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択
される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジ
ュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未
満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0200】

特定の実施形態では、上記動物は哺乳動物である。特定の実施形態では、上記哺乳動物
は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、または非ヒト霊
長類である。ヒトまたは動物のうち、より好ましいのは、ヒトである。

【0201】

第十八の局面では、本発明は、治療によってヒトまたは動物体における血中グルコース
濃度を低下させる方法において使用するためのＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを
特徴とし、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、
上記モジュレーターは、第一の局面の方法に従う方法を実施することにより同定可能であ
る。特定の実施形態では、上記このモジュレーターは、第一の局面に従う方法を実施する
ことにより同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。

【0202】

本発明はまた、治療によってヒトまたは動物体における代謝障害を予防または処置する
方法において使用するためのＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを特徴とし、上記レ
セプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記モジュレータ
ーは、第一の局面の方法に従う方法を実施することにより同定可能である。特定の実施形
態では、上記このモジュレーターは、第一の局面に従う方法を実施することにより同定さ
れる。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態で
は、この代謝障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0203】

【0204】

本発明はまた、治療によってヒトまたは動物体において上昇した血中グルコース濃度の
合併症を予防または処置する方法において使用するための、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジ
ュレーターを特徴とし、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実
施形態では、上記モジュレーターは、第一の局面の方法に従う方法を実施することにより
同定可能である。特定の実施形態では、上記このモジュレーターは、第一の局面に従う方
法を実施することにより同定される。特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニ
ストである。特定の実施形態では、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0205】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0206】

【0207】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、ＧＰＣＲに選択的である。

【0208】

【0209】

【0210】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0211】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有
するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイ
において１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８
μＭ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、
上記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイ
において３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の
、上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上
記アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記ア
ッセイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイ
において８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて
６０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ
未満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、
または上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつ
かの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭ
の区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択
される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジ
ュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未
満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0212】

【0213】

第十九の局面では、本発明は、血中グルコース濃度を低下させるための医薬の調製のた
めにＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを使用する方法を特徴とし、上記レセプター
は、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記方法は、第一の局面に
よる方法を最初に実施し、それによりこのモジュレーターを同定する工程を包含する。特
定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。

【0214】

本発明はまた、代謝障害の予防または処置のための医薬の調製のためにＲＵＰ４３Ｇ
ＰＣＲのモジュレーターを使用する方法を特徴とし、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１ア
ミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記方法は、第一の局面による方法を実施し、
それによりこのモジュレーターを同定する工程を包含する。特定の実施形態では、このモ
ジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、この代謝障害は、以下からなる
群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0215】

【0216】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置のための医薬の
調製のためにＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを使用する方法を特徴とし、上記レ
セプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記方法は、第一
の局面による方法を実施し、それによりこのモジュレーターを同定する工程を包含する。
特定の実施形態では、このモジュレーターはアゴニストである。特定の実施形態では、こ
の合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0217】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0218】

【0219】

特定の実施形態では、上記モジュレーターは、ＧＰＣＲに選択的である。

【0220】

【0221】

【0222】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能なモジュレーターはさらに、血液
−脳関門を越えることができる。

【0223】

いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００
ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１０μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５
_０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎ
Ｍ〜１μＭの区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつか
の実施形態では、上記モジュレーターは、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値
未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。特定の実施形態では、上記ＥＣ５０は、以下
からなる群より選択されるアッセイを用いて決定される：配列番号２もしくは配列番号６
のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリペプチドを発現するトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて実施される細胞全体のｃＡＭＰアッセイ；および
配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４３ＧＰＣＲポリ
ペプチドを発現するトランスフェクトされたメラニン保有細胞を用いて実施されるメラニ
ン保有細胞アッセイ。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイに
おいて、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有
するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイ
において１０μＭ未満の、上記アッセイにおいて９μＭ未満の、上記アッセイにおいて８
μＭ未満の、上記アッセイにおいて７μＭ未満の、上記アッセイにおいて６μＭ未満の、
上記アッセイにおいて５μＭ未満の、上記アッセイにおいて４μＭ未満の、上記アッセイ
において３μＭ未満の、上記アッセイにおいて２μＭ未満の、上記アッセイにおいて１μ
Ｍ未満の、上記アッセイにおいて９００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて８００ｎＭ未
満の、上記アッセイにおいて７００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて６００ｎＭ未満の
、上記アッセイにおいて５００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４００ｎＭ未満の、上
記アッセイにおいて３００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２００ｎＭ未満の、上記ア
ッセイにおいて１００ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて９０ｎＭ未満の、上記アッセイ
において８０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて７０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて
６０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて５０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて４０ｎＭ
未満の、上記アッセイにおいて３０ｎＭ未満の、上記アッセイにおいて２０ｎＭ未満の、
または上記アッセイにおいて１０ｎＭ未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつ
かの実施形態では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１０μＭ
の区間から選択される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態
では、上記モジュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１μＭの区間から選択
される値未満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。いくつかの実施形態では、上記モジ
ュレーターは、上記アッセイにおいて、１０ｎＭ〜１００ｎＭの区間から選択される値未
満のＥＣ_５０を有するアゴニストである。

【0224】

第二十の局面では、本発明は、上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を
調製する方法を特徴とし、この方法は、第二の局面による化合物とキャリアとを混合する
工程を包含する。

【0225】

特定の実施形態では、上記組成物は薬学的組成物である。特定の実施形態では、上記組
成物は、生理学的に受容可能である。

【0226】

特定の実施形態では、上記化合物は経口で生物学的に利用可能である。いくつかの実施
形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少なくとも１％
、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくと
も２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも
４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投
与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３
５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0227】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門
を越えることができる。

【0228】

第二十一の局面では、本発明は、上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物
を特徴とし、この組成物は、第二の局面による化合物を含むか、この化合物から本質的に
なるか、またはこの化合物からなる。

【0229】

特定の実施形態では、上記組成物は薬学的組成物である。特定の実施形態では、この薬
学的組成物は、第二の局面による化合物を含む。特定の実施形態では、この薬学的組成物
は、第二の局面による化合物から本質的になる。特定の実施形態では、この薬学的組成物
は、第二の局面による化合物からなる。

【0230】

特定の実施形態では、上記組成物は生理学的に受容可能である。特定の実施形態では、
この生理学的に受容可能な組成物は、第二の局面による化合物を含む。特定の実施形態で
は、この生理学的に受容可能な組成物は、第二の局面による化合物から本質的になる。特
定の実施形態では、この生理学的に受容可能な組成物は、第二の局面による化合物からな
る。

【0231】

特定の実施形態では、上記化合物は、経口で生物学的に利用可能である。いくつかの実
施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内投与と比較して、少なくとも１
％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なく
とも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくと
も４５％である。いくつかの実施形態では、上記経口での生物学的利用可能性は、腹腔内
投与と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも
３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。

【0232】

特定の実施形態では、上記経口で生物学的に利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門
を越えることができる。

【0233】

第二十二の局面では、本発明は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴と
し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで、上記調節は、上記調節
を必要とする個体における血中グルコースレベルを低下させるためであり、この方法は、
上記レセプターを、治療有効量の第二の局面による化合物または治療有効量の第二十一の
局面による上記薬学的組成物もしくは生理学的に受容可能な組成物と接触させる工程を包
含する。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量の第二の局面による化合物との接
触である。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量の第二十一の局面による上記薬
学的組成物または生理学的に受容可能な組成物との接触である。

【0234】

【0235】

特定の実施形態では、上記経口での生物学的利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門
を越えることができる。

【0236】

【0237】

第二十三の局面では、本発明は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴と
し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで、上記調節は、上記調節
を必要とする個体における代謝障害を予防または処置するためであり、この方法は、上記
レセプターを、治療有効量の第二の局面による化合物または治療有効量の第二十一の局面
による上記薬学的組成物もしくは生理学的に受容可能な組成物と接触させる工程を包含す
る。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量の第二の局面による化合物との接触で
ある。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量の第二十一の局面による上記薬学的
組成物または生理学的に受容可能な組成物との接触である。特定の実施形態では、この代
謝障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0238】

【0239】

本発明はまた、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法を特徴とし、上記レセプタ
ーはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、ここで、上記調節は、上記調節を必要とする個体
における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためであり、この方
法は、上記レセプターを、治療有効量の第二の局面による化合物または治療有効量の第二
十一の局面による上記薬学的組成物もしくは生理学的に受容可能な組成物と接触させる工
程を包含する。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量の第二の局面による化合物
との接触である。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量の第二十一の局面による
上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物との接触である。特定の実施形態で
は、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0240】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0241】

【0242】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0243】

【0244】

第二十四の局面では、本発明は、血中グルコース濃度の低下を必要とする個体において
血中グルコース濃度を低下させる方法を特徴とし、この方法は、上記レセプターを、治療
有効量の第二の局面による化合物または治療有効量の第二十一の局面による上記薬学的組
成物もしくは生理学的に受容可能な組成物をＲＵＰ４３ＧＰＣＲと接触させる工程を包
含し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記接
触は、治療有効量の第二の局面による化合物との接触である。特定の実施形態では、上記
接触は、治療有効量の第二十一の局面による上記薬学的組成物または生理学的に受容可能
な組成物との接触である。

【0245】

【0246】

【0247】

第二十五の局面では、本発明は、上記低減を必要とする個体において代謝障害を予防ま
たは処置する方法を特徴とし、この方法は、上記レセプターを、治療有効量の第二の局面
による化合物または治療有効量の第二十一の局面による上記薬学的組成物もしくは生理学
的に受容可能な組成物と、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、上記レセプ
ターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量
の第二の局面による化合物との接触である。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効
量の第二十一の局面による上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物との接触
である。特定の実施形態では、この代謝障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0248】

【0249】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする個
体において上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法を特徴とし、
この方法は、上記レセプターを、治療有効量の第二の局面による化合物または治療有効量
の第二十一の局面による上記薬学的組成物もしくは生理学的に受容可能な組成物と、ＲＵ
Ｐ４３ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配
列を含む。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量の第二の局面による化合物との
接触である。特定の実施形態では、上記接触は、治療有効量の第二十一の局面による上記
薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物との接触である。特定の実施形態では、
この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0250】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0251】

【0252】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0253】

【0254】

第二十六の局面では、本発明は、血中グルコース濃度を低下させる方法を特徴とし、こ
の方法は、上記低下を必要とする個体に第二の局面による化合物または治療有効量の第二
十一の局面による上記薬学的組成物もしくは生理学的に受容可能な組成物を提供または投
与する工程を包含する。特定の実施形態では、上記化合物を提供または投与する工程は、
第二の局面による化合物を提供または投与することである。特定の実施形態では、上記薬
学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程は、第二十一の
局面による上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与するこ
とである。

【0255】

【0256】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0257】

【0258】

第二十七の局面では、本発明は、代謝障害を処置する方法を特徴とし、この方法は、上
記処置または予防を必要とする個体に、第二の局面による化合物または治療有効量の第二
十一の局面による上記薬学的組成物もしくは生理学的に受容可能な組成物を提供または投
与する工程を包含する。特定の実施形態では、上記化合物を提供または投与する工程は、
第二の局面による化合物を提供または投与することである。特定の実施形態では、上記薬
学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程は、第二十一の
局面による上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与するこ
とである。特定の実施形態では、この代謝障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0259】

【0260】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症を処置する方法を特徴とし、この
方法は、上記処置または予防を必要とする個体に、第二の局面による化合物または治療有
効量の第二十一の局面による上記薬学的組成物もしくは生理学的に受容可能な組成物を提
供または投与する工程を包含する。特定の実施形態では、上記化合物を提供または投与す
る工程は、第二の局面による化合物を提供または投与することである。特定の実施形態で
は、上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程は、
第二十一の局面による上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を提供または
投与することである。特定の実施形態では、この合併症は、以下からなる群より選択され
る：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0261】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0262】

【0263】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0264】

【0265】

第二十八の局面では、本発明は、治療によるヒトまたは動物体の処置方法において使用
するための第二の局面による化合物を特徴とする。

【0266】

【0267】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0268】

【0269】

第二十九の局面では、本発明は、治療によるヒトまたは動物体における血中グルコース
濃度を低下させる方法において使用するための第二の局面による化合物を特徴とする。

【0270】

【0271】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0272】

【0273】

第三十の局面では、本発明は、治療によるヒトまたは動物体における代謝障害の予防ま
たは処置の方法において使用するための第二の局面による化合物を特徴とする。特定の実
施形態では、この代謝障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0274】

【0275】

本発明はまた、治療によるヒトまたは動物体における上昇した血中グルコース濃度の合
併症の予防または処置の方法において使用するための第二の局面による化合物を特徴とす
る。特定の実施形態では、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0276】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0277】

【0278】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0279】

【0280】

第三十一の局面では、本発明は、血中グルコース濃度の低減のための医薬の調製のため
に第二の局面による化合物を使用する方法を特徴とする。

【0281】

【0282】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0283】

第三十二の局面では、本発明は、代謝障害の予防または処置のための医薬の調製のため
に第二の局面による化合物を使用する方法を特徴とする。特定の実施形態では、この代謝
障害は、以下からなる群より選択される：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症。

【0284】

【0285】

本発明はまた、上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するための医薬
の調製のために第二の局面による化合物を使用する方法を特徴とする。特定の実施形態で
は、この合併症は、以下からなる群より選択される：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患。

【0286】

心臓病としては、心不全、冠状動脈不全、冠状動脈疾患、および高血圧が挙げられるが
これらに限定されない。特定の実施形態では、この合併症は症候群Ｘである。特定の実施
形態では、この合併症はアテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態では、この合併
症はアテローム性疾患である。特定の実施形態では、この合併症は心臓病である。特定の
実施形態では、この合併症は心不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈
不全である。特定の実施形態では、この合併症は冠状動脈疾患である。特定の実施形態で
は、この合併症は高血圧である。特定の実施形態では、この合併症は高血圧症である。特
定の実施形態では、この合併症は発作である。特定の実施形態では、この合併症はニュー
ロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は網膜症である。特定の実施形態では
、この合併症はニューロパシーである。特定の実施形態では、この合併症は末梢脈管疾患
である。特定の実施形態では、この合併症は多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態
では、この合併症は高脂血症である。

【0287】

【0288】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0289】

第三十三の局面では、本発明は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを調節する方法を特徴とし、上
記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、この方法は、上記レセプターを、第
二の局面による化合物または第二十一の局面による上記薬学的組成物もしくは生理学的に
受容可能な組成物と接触させる工程を包含する。特定の実施形態では、上記接触は、第二
の局面による化合物との接触である。特定の実施形態では、上記接触は、第二十一の局面
による上記薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物との接触である。

【0290】

【0291】

特定の実施形態では、上記経口で利用可能な化合物はさらに、血液−脳関門を越えるこ
とができる。

【0292】

第三十四の局面では、本発明は、１以上の候補化合物をＲＵＰ４３ＧＰＣＲに結合す
る化合物と同定する方法を特徴とし、このレセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
み、この方法は、（ａ）このレセプターを、この候補化合物の存在下または非存在下で、
該レセプターの検出可能に標識されたＧＦＣＲの公知のリガンドと接触させる工程；およ
び（ｂ）上記標識されたリガンドの結合が、この候補化合物の存在下で阻害されるか否か
を決定する工程を包含し；ここで、上記阻害は、この候補化合物が、ＲＵＰ４３ＧＰＣ
Ｒに結合する化合物であることを示す。

【0293】

特定の実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、以下からなる群より選択され
る：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｃ）ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオ
ニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｄ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号
３のプライマーおよび配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセス
によって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号
７のプライマーおよび配列番号８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセス
によって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸２−３３０；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、
前記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン
残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；および
（ｊ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列。

【0294】

特定の実施形態では、このＲＵＰ４３ＧＰＣＲは組換え体である。特定の実施形態で
は、上記接触させる工程は、このＧＰＣＲを発現する宿主細胞またはこのＧＰＣＲを発現
する宿主細胞の膜と接触させることを含む。特定の実施形態では、上記ＧＰＣＲを発現す
る宿主細胞は、このレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む
。

【0295】

いくつかの実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配
列である。いくつかの実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、配列番号２のア
ミノ酸配列の改変体である。いくつかの実施形態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の
改変体は、上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体または哺乳動物オルソログである。いく
つかの実施形態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の改変体は、上記アミノ酸配列また
は上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オルソログの、非内因性の構成
的に活性化された変異体である。特定の実施形態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の
改変体は、上記アミノ酸配列または上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動
物オルソログの生物学的に活性なフラグメントである。特定の実施形態では、配列番号２
のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オ
ルソログの上記生物学的に活性なフラグメントは、Ｎ末端メチオニンのない、配列番号２
のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オ
ルソログである。特定の実施形態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の改変体は、配列
番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも
約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも
約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも
約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である。いくつかの実施形
態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の改変体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して
、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％
、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％
、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である。

【0296】

特定の実施形態では、上記膜調製物は、ＢｒｉｎｋｍａｎＰｏｌｙｔｒｏｎOでの細
胞の均質化によって作製される。特定の実施形態では、上記膜調製物は、上記ｐｏｌｙｔ
ｒｏｎの各々１０〜２０秒間の持続期間の３回のバーストを用いた均質化によって作製さ
れる。

【0297】

特定の実施形態では、上記候補化合物は抗体でもその誘導体でもない。

【0298】

特定の実施形態では、上記候補化合物はペプチドではない。

【0299】

特定の実施形態では、上記公知のリガンドは第二の局面による化合物である。

【0300】

特定の実施形態では、上記公知のリガンドは、第三の局面によるモジュレーターである
。

【0301】

特定の実施形態では、上記公知のリガンドは、化合物１、化合物２、または化合物３で
ある。特定の実施形態では、上記公知のリガンドは化合物１である。特定の実施形態では
、上記公知のリガンドは化合物２である。特定の実施形態では、上記公知のリガンドは化
合物３である。

【0302】

特定の実施形態では、上記公知のリガンドは、ＧＰＣＲに特異的な抗体、またはこの抗
体の抗原結合誘導体である。

【0303】

特定の実施形態では、上記標識は、以下からなる群より選択される：
（ａ）放射性同位体；
（ｂ）酵素；および
（ｃ）発蛍光団。

【0304】

特定の実施形態では、上記標識は放射性同位体である。特定の実施形態では、上記標識
は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、および^１２５Ｉからなる群より選択される。

【0305】

化合物１、化合物２、または化合物３は、以下の当該分野で公知の技術を用いて放射標
識され得る。特定の実施形態では、化合物１、化合物２、または化合物３は、^３Ｈまたは
^１４Ｃで放射標識される。

【0306】

他の実施形態では、上記方法は、標識された第一の公知のリガンドの結合の、この候補
化合物による阻害レベルを、上記標識された第一の公知のリガンドの結合の、このＧＰＣ
Ｒに結合することが公知の第二のリガンドによる第二の阻害レベルに対して比較する工程
をさらに包含する。

【0307】

第三十五の局面では、本発明は、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲに結合するリガンドを決定する
ための方法を特徴とし、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、この方法
は、以下の工程を包含する：試験リガンドを、上記レセプターと上記試験リガンドとの間
の相互作用を許容する条件下で、上記レセプターを発現する宿主細胞または上記レセプタ
ーを発現する宿主細胞の膜と接触させる工程；および上記レセプターに結合したリガンド
を検出する工程。

【0308】

特定の実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、以下からなる群より選択され
る：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｃ）ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオ
ニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｄ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号
３のプライマーおよび配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセス
によって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、この核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号
７のプライマーおよび配列番号８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセス
によって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸２−３３０；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、
前記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン
残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；および
（ｊ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列。

【0309】

いくつかの実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配
列である。いくつかの実施形態では、このＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、配列番号２のア
ミノ酸配列の改変体である。いくつかの実施形態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の
改変体は、上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体または哺乳動物オルソログである。いく
つかの実施形態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の改変体は、上記アミノ酸配列また
は上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オルソログの非内因性の構成的
に活性化された変異体である。特定の実施形態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の改
変体は、上記アミノ酸配列または上記アミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物
オルソログの生物学的に活性なフラグメントである。特定の実施形態では、配列番号２の
アミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オル
ソログの上記生物学的に活性なフラグメントは、Ｎ末端メチオニンのない、配列番号２の
アミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体もしくは哺乳動物オル
ソログである。特定の実施形態では、上記配列番号２のアミノ酸配列の改変体は、配列番
号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約
８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約
９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約
９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である。いくつかの実施形態
では、上記配列番号２のアミノ酸配列の改変体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、
少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、
少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、
少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である。

【0310】

【0311】

特定の実施形態では、上記試験リガンドは、抗体でもその抗原結合誘導体でもない。

【0312】

特定の実施形態では、上記試験リガンドはペプチドではない。

【0313】

【0314】

特定の実施形態では、上記試験リガンドは標識される。特定の実施形態では、上記標識
は放射性同位体である。特定の実施形態では、上記標識は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、およ
び^１２５Ｉからなる群より選択される。

【0315】

・本発明はまた、以下を提供し得る：
・（項目１）
１以上の候補化合物をＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターと同定する方法であって
、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記レセプターは、Ｇタンパク質と
共役し；上記方法は、工程：
（ａ）候補化合物を上記レセプターと接触させる工程；および
（ｂ）上記レセプターの機能性が調節されるか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、レセプターの機能性における変化は、上記候補化合物がＲＵＰ４３Ｇ
ＰＣＲのモジュレーターであることを示す、方法。
・（項目２）
上記ＧＰＲ１３１アミノ酸配列が：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｃ）上記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメ
チオニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｄ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、上記核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号３
のプライマーおよび配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセスに
よって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、上記核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号７
のプライマーおよび配列番号８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセスに
よって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸２−３３０；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、
上記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン
残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；および
（ｊ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
・（項目３）
上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲが組換え体である、項目１または項目２に記載の方法。
・（項目４）
上記接触させる工程が、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを発現する宿主細胞または上記ＲＵ
Ｐ４３ＧＰＣＲを発現する宿主細胞の膜と接触させることを含み、上記宿主細胞は、上記Ｒ
ＵＰ４３ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、項目１
〜項目３のいずれか１項に記載の方法。
・（項目５）
上記接触させる工程が、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの公知のアゴニストの存在下で実施
される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
・（項目６）
上記接触させる工程が、化合物１、化合物２、または化合物３の存在下で実施される、
項目５に記載の方法。
・（項目７）
１以上の候補化合物を哺乳動物における血中グルコース濃度のモジュレーターと同定す
る方法であって、工程：
（ａ）候補化合物を、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含むＧＰＣＲと接触させる工程であ
って、ここで上記レセプターがＧタンパク質と共役する、工程；および
（ｂ）上記レセプターの機能性が調節されるか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、レセプターの機能性における変化は、上記候補化合物が、哺乳動物にお
ける血中グルコース濃度のモジュレーターであることを示す、方法。
・（項目８）
上記ＧＰＲ１３１アミノ酸配列が：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｃ）上記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメ
チオニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｄ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、上記核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号３
のプライマーおよび配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセスに
よって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、上記核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号７
のプライマーおよび配列番号８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセスに
よって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸２−３３０；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、
上記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン
残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；および
（ｊ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択される、項目７に記載の方法。
・（項目９）
上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲが組換え体である、項目７または項目８に記載の方法。
・（項目１０）
上記接触させる工程が、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを発現する宿主細胞または上記ＲＵ
Ｐ４３ＧＰＣＲを発現する宿主細胞の膜と接触させることを含み、上記宿主細胞は、上記Ｒ
ＵＰ４３ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、項目７
〜項目９のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１１）
上記接触させる工程が、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの公知のアゴニストの存在下で実施
される、項目７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１２）
上記接触させる工程が、化合物１、化合物２、および化合物３の存在下で実施される、
項目１１に記載の方法。
・（項目１３）
レセプター機能性の上昇は、上記候補化合物が、哺乳動物における血中グルコース濃度
を低下させる化合物であることを示す、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１４）
上記決定する工程が、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭ
Ｐ）、イソシトール（ｉｓｏｓｉｔｏｌ）三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（
ＤＡＧ）およびＣａ２＋からなる群より選択されるセカンドメッセンジャーのレベルの測
定を通してである、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１５）
ｃＡＭＰの細胞内レベルが上昇している、項目１４に記載の方法。
・（項目１６）
上記決定する工程が、メラニン保有細胞アッセイの使用を通して、または上記ＲＵＰ４
３ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳ結合の測定を通してである、項目１〜１３のいず
れか１項に記載の方法。
・（項目１７）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを作製するためのプロセスであって、工程：
（ａ）項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法に従って上記モジュレーターを同定す
る工程；および
（ｂ）（ａ）において同定されたモジュレーターを合成する工程
を包含する、プロセス。
・（項目１８）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって同定された、モジュレーター。
・（項目１９）
上記モジュレーターが、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニ
ストからなる群より選択される、項目１８に記載のモジュレーターまたは項目１７に
記載のプロセス。
・（項目２０）
上記モジュレーターがアゴニストである、項目１８に記載のモジュレーターまたは請
求項１７に記載のプロセス。
・（項目２１）
上記アゴニストが部分アゴニストである、項目２０に記載のアゴニスト。
・（項目２２）
上記モジュレーターが、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの機能性を上昇させる、項目１８
に記載のモジュレーターまたは項目１７に記載のプロセス。
・（項目２３）
上記モジュレーターが、ｃＡＭＰの細胞内レベルを上昇させる、項目１８に記載のモ
ジュレーターまたは項目１７に記載のプロセス。
・（項目２４）
式（ＩＩ）
・（化１）

の化合物またはその薬学的に受容可能な塩であって、ここで、：
Ｒ_１は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ_２は、２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−インダゾール−３−イル
基である；または
Ｒ_１およびＲ_２は、それらが結合する窒素と一緒になって、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−
キノリン−１−イル基を形成し；そして
Ｒ_１０およびＲ_１１は、各々独立して、Ｈまたはハロゲンである、化合物またはその薬
学的に受容可能な塩。
・（項目２５）
薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を調製する方法であって、
キャリアとＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを混合する工程を包含し、上記レセプ
ターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む、方法。
・（項目２６）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを調節する方法であって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ
酸配列を含み、上記方法は、上記レセプターと上記レセプターのモジュレーターとを接触させる
工程を包含する、方法。
・（項目２７）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを調節する方法であって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ
酸配列を含み、上記調節は、血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物における血中
グルコース濃度を低下させるためであり、上記方法は、上記レセプターを上記レセプターの治療
有効量のモジュレーターと接触させる工程を包含する、方法。
・（項目２８）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを調節する方法であって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ
酸配列を含み、上記調節は、代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物における代謝
障害を予防または処置するためであり、上記方法は、上記レセプターを、治療有効量の上記レセ
プターのモジュレーターと接触させる工程を包含し、上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目２９）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを調節する方法であって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ
酸配列を含み、上記調節は、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要
とする哺乳動物における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するため
であり、上記方法は、上記レセプターを、治療有効量の上記レセプターのモジュレーターと接触
させる工程を包含し、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目３０）
血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物における血中グルコース濃度の低下方
法であって、上記方法は、治療有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを上記レセプ
ターと接触させる工程を包含し、上記レセプターが、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む、方
法。
・（項目３１）
代謝障害を予防または処置する必要のある哺乳動物における代謝障害を予防または処置
する方法であって、上記方法は、治療有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを上記
レセプターと接触させる工程を包含し、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
み、上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目３２）
上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要する哺乳動物における上
昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、上記方法は、治療
有効量のＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを上記レセプターと接触させる工程を包含
し、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目３３）
哺乳動物における血中グルコースを低下させる方法であって、上記方法は、上記低下を必要
とする哺乳動物にＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを提供または投与する工程を包
含し、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む、方法。
・（項目３４）
代謝障害を予防または処置する方法であって、上記方法は、上記予防または処置を必要とす
る哺乳動物にＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを提供または投与する工程を包含し
、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目３５）
上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、上記方法は、
上記予防または処置を必要とする哺乳動物にＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを提供
または投与する工程を包含し、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記合
併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目３６）
上記哺乳動物がヒトである、項目２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
・（項目３７）
上記モジュレーターが、項目１８〜２３のいずれか１項による、項目２７〜３６の
いずれか１項に記載の方法。
・（項目３８）
上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターが、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのアゴニスト
である、項目２７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
・（項目３９）
上記モジュレーターが、項目２４に記載の化合物である、項目２７〜３６のいずれ
か１項に記載の方法。
・（項目４０）
上記モジュレーターが、化合物１、化合物２、または化合物３である、項目２７〜３
６のいずれか１項に記載の方法。
・（項目４１）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増
加させる化合物である、項目２７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
・（項目４２）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを
増加させる化合物である、項目２７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
・（項目４３）
哺乳動物における血中グルコースを低下させる方法であって、上記方法は、上記低下を必要
とする哺乳動物にＧＰＲ１３１ＧＰＣＲのアゴニストを提供または投与する工程を包含
する、方法。
・（項目４４）
代謝障害を予防または処置する方法であって、上記方法は、上記予防または処置を必要とす
る哺乳動物にＧＰＲ１３１ＧＰＣＲのアゴニストを提供または投与する工程を包含し、
上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目４５）
上記代謝障害が糖尿病である、項目３４に記載の方法。
・（項目４６）
上記代謝障害がグルコース寛容減損である、項目３４に記載の方法。
・（項目４７）
上記代謝障害がインスリン抵抗性である、項目３４に記載の方法。
・（項目４８）
上記代謝障害が高インスリン血症である、項目３４に記載の方法。
・（項目４９）
上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、上記方法は、
上記予防または処置を必要とする哺乳動物にＧＰＲ１３１ＧＰＣＲのアゴニストを提供ま
たは投与する工程を包含し、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目５０）
上記哺乳動物がヒトである、項目２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
・（項目５１）
薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物であって、上記組成物は、ＲＵＰ４３
ＧＰＣＲのモジュレーターを含むか、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターから本質的
になるか、またはＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターからなり、上記レセプターは、Ｇ
ＰＲ１３１アミノ酸配列を含む、組成物。
・（項目５２）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを含む薬学的組成物であって、上記レセプターは
、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
・（項目５３）
上記モジュレーターが、項目１８〜２３のいずれか１項による、項目５２に記載の
薬学的組成物。
・（項目５４）
上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターが、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのアゴニスト
である、項目５２に記載の薬学的組成物。
・（項目５５）
上記モジュレーターが、項目２４に記載の化合物である、項目５２に記載の薬学的
組成物。
・（項目５６）
上記モジュレーターが、化合物１、化合物２、または化合物３である、項目５２に記
載の薬学的組成物。
・（項目５７）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増
加させる化合物である、項目５２〜５６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
・（項目５８）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを
増加させる化合物である、項目５２〜５６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
・（項目５９）
哺乳動物における血中グルコースを低下させる方法であって、上記方法は、上記低下を必要
とする哺乳動物に項目５２〜５８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を提供または投
与する工程を包含する、方法。
・（項目６０）
代謝障害を予防または処置する方法であって、上記方法は、上記予防または処置を必要とす
る哺乳動物に項目５２〜５８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を提供または投与す
る工程を包含し、上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目６１）
上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、上記方法は、
上記予防または処置を必要とする哺乳動物に項目５２〜５８のいずれか１項に記載の薬学
的組成物を提供または投与する工程を包含し、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目６２）
上記哺乳動物がヒトである、項目５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
・（項目６３）
治療によるヒトまたは動物体の処置方法において使用するための、ＲＵＰ４３ＧＰＣ
Ｒのモジュレーターであって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む、モジ
ュレーター。
・（項目６４）
治療によってヒトまたは動物体の血中グルコース濃度を低下させる方法において使用す
るための、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターであって、上記レセプターは、ＧＰＲ１
３１アミノ酸配列を含む、モジュレーター。
・（項目６５）
治療によってヒトまたは動物体における代謝障害を予防または処置する方法において使
用するための、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターであって、上記レセプターは、ＧＰ
Ｒ１３１アミノ酸配列を含み、上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、モジュレーター。
・（項目６６）
治療によってヒトまたは動物体における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防ま
たは処置する方法において使用するための、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターであ
って、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、モジュレーター。
・（項目６７）
上記動物が哺乳動物である、項目６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
・（項目６８）
上記モジュレーターが、項目１８〜２３のいずれか１項による、項目６３〜６７の
いずれか１項に記載のモジュレーター。
・（項目６９）
上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターが、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのアゴニスト
である、項目６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
・（項目７０）
上記モジュレーターが、項目２４に記載の化合物である、項目６３〜６７のいずれ
か１項に記載のモジュレーター。
・（項目７１）
上記モジュレーターが、化合物１、化合物２、または化合物３である、項目６３〜６
７のいずれか１項に記載のモジュレーター。
・（項目７２）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増
加させる化合物である、項目６３〜７１のいずれか１項に記載のモジュレーター。
・（項目７３）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを
増加させる化合物である、項目６３〜７１のいずれか１項に記載のモジュレーター。
・（項目７４）
血中グルコース濃度を低下させるための医薬の調製のためにＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモ
ジュレーターを使用する方法であって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
む、方法。
・（項目７５）
代謝障害を予防または処置するための医薬の調製のためにＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジ
ュレーターを使用する方法であって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み
、上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目７６）
上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置のための医薬の調製のためにＲ
ＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを使用する方法であって、上記レセプターは、ＧＰＲ
１３１アミノ酸配列を含み、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目７７）
上記モジュレーターが、項目１８〜２３のいずれか１項による、項目７４〜７６の
いずれか１項に記載の方法。
・（項目７８）
上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターが、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのアゴニスト
である、項目７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
・（項目７９）
上記モジュレーターが、項目２４に記載の化合物である、項目７４〜７６のいずれ
か１項に記載の方法。
・（項目８０）
上記モジュレーターが、化合物１、化合物２、または化合物３である、項目７４〜７
６のいずれか１項に記載の方法。
・（項目８１）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増
加させる化合物である、項目７４〜８０のいずれか１項に記載の方法。
・（項目８２）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを
増加させる化合物である、項目７４〜８０のいずれか１項に記載の方法。
・（項目８３）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節するためのプロセスであって、上記レセプターは、Ｇ
ＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記プロセスは、工程：
（ａ）上記レセプターのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法
に従って同定する工程；および
（ｂ）上記レセプターを、（ａ）において同定されたモジュレーターと接触させる工程
を包含する、プロセス。
・（項目８４）
薬学的組成物または生理学的に受容可能な組成物を調製するためのプロセスであって、
上記プロセスは、工程：
（ａ）ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記
載の方法に従って同定する工程であって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を
含む、工程；および
（ｂ）キャリアと（ａ）で同定されたモジュレーターとを混合する工程
を包含する、プロセス。
・（項目８５）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節するためのプロセスであって、上記レセプターは、Ｇ
ＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記調節は、血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳
動物における血中グルコース濃度を低下させるためであり、上記プロセスは、工程：
（ａ）上記レセプターのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法
に従って同定する工程；および
（ｂ）上記レセプターを、（ａ）において同定された治療有効量のモジュレーターと接触
させる工程
を包含する、プロセス。
・（項目８６）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節するためのプロセスであって、上記レセプターは、Ｇ
ＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記調節は、代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳
動物において代謝障害を予防または処置するためであり、上記プロセスは、工程：
（ａ）上記レセプターのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法
に従って同定する工程；および
（ｂ）上記レセプターを、（ａ）において同定された治療有効量のモジュレーターと接触
させる工程
を包含し；ここで、上記代謝障害は、以下：
（ｉ）糖尿病；
（ｉｉ）グルコース寛容減損；
（ｉｉｉ）インスリン抵抗性；および
（ｉｖ）高インスリン血症
からなる群より選択される、プロセス。
・（項目８７）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節するためのプロセスであって、上記レセプターは、Ｇ
ＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記調節は、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防
または処置を必要とする哺乳動物において上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防ま
たは処置するためであり、上記プロセスは、工程：
（ａ）上記レセプターのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法
に従って同定する工程；および
（ｂ）上記レセプターを、（ａ）において同定された治療有効量のモジュレーターと接触
させる工程
を包含し；ここで、上記合併症は、以下：
（ｉ）症候群Ｘ；
（ｉｉ）アテローム性動脈硬化症；
（ｉｉｉ）アテローム性疾患；
（ｉｖ）心臓病；
（ｖ）高血圧症；
（ｖｉ）発作；
（ｖｉｉ）ニューロパシー；
（ｖｉｉｉ）網膜症；
（ｉｘ）腎症；および
（ｘ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、プロセス。
・（項目８８）
血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物において血中グルコース濃度を低下さ
せるためのプロセスであって、上記プロセスは、工程：
（ａ）ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記
載の方法に従って同定する工程であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
む、工程；および
（ｂ）（ａ）において同定された治療有効量のモジュレーターを、上記レセプターと接触
させる工程
を包含する、プロセス。
・（項目８９）
代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物において代謝障害を予防または処置す
るためのプロセスであって、上記プロセスは、工程：
（ａ）ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記
載の方法に従って同定する工程であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
む、工程；および
（ｂ）（ａ）において同定された治療有効量のモジュレーターを上記レセプターと接触さ
せる工程
を包含し；ここで、上記代謝障害は、以下：
（ｉ）糖尿病；
（ｉｉ）グルコース寛容減損；
（ｉｉｉ）インスリン抵抗性；および
（ｉｖ）高インスリン血症
からなる群より選択される、プロセス。
・（項目９０）
上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする哺乳動物において
上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためのプロセスであって、上記
プロセスは、工程：
（ａ）ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記
載の方法に従って同定する工程であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
む、工程；および
（ｂ）（ａ）において同定された治療有効量のモジュレーターを上記レセプターと接触さ
せる工程
を包含し；ここで、上記合併症は、以下：
（ｉ）症候群Ｘ；
（ｉｉ）アテローム性動脈硬化症；
（ｉｉｉ）アテローム性疾患；
（ｉｖ）心臓病；
（ｖ）高血圧症；
（ｖｉ）発作；
（ｖｉｉ）ニューロパシー；
（ｖｉｉｉ）網膜症；
（ｉｘ）腎症；および
（ｘ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、プロセス。
・（項目９１）
哺乳動物において血中グルコースを低下させるためのプロセスであって、上記プロセスは
、工程：
（ａ）ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記
載の方法に従って同定する工程であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
む、工程；および
（ｂ）（ａ）において同定されたモジュレーターを、上記低下を必要とする哺乳動物に提
供または投与する工程
を包含する、プロセス。
・（項目９２）
代謝障害を予防または処置するためのプロセスであって、上記プロセスは、工程：
（ａ）ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記
載の方法に従って同定する工程であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
む、工程；および
（ｂ）（ａ）において同定されたモジュレーターを、上記予防または処置を必要とする哺
乳動物に提供または投与する工程
を包含し；ここで、上記代謝障害は、以下：
（ｉ）糖尿病；
（ｉｉ）グルコース寛容減損；
（ｉｉｉ）インスリン抵抗性；および
（ｉｖ）高インスリン血症
からなる群より選択される、プロセス。
・（項目９３）
上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためのプロセスであって、
上記プロセスは、工程：
（ａ）ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを、項目１〜１６のいずれか１項に記
載の方法に従って同定する工程であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含
む、工程；および
（ｂ）（ａ）において同定されたモジュレーターを、上記予防または処置を必要とする哺
乳動物に提供または投与する工程
を包含し；上記合併症は、以下：
（ｉ）症候群Ｘ；
（ｉｉ）アテローム性動脈硬化症；
（ｉｉｉ）アテローム性疾患；
（ｉｖ）心臓病；
（ｖ）高血圧症；
（ｖｉ）発作；
（ｖｉｉ）ニューロパシー；
（ｖｉｉｉ）網膜症；
（ｉｘ）腎症；および
（ｘ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、プロセス。
・（項目９４）
上記哺乳動物がヒトである、項目８５〜９３のいずれか１項に記載のプロセス。
・（項目９５）
血中グルコース濃度を低下させるための医薬の調製のためにＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモ
ジュレーターを使用するプロセスであって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列
を含み、上記プロセスは、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法を実施することによ
り上記モジュレーターを同定する工程を包含する、プロセス。
・（項目９６）
代謝障害を予防または処置するための医薬の調製のためにＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジ
ュレーターを使用するプロセスであって、上記レセプターは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を
含み、上記プロセスは、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法を実施することにより
上記モジュレーターを同定する工程を包含し；上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、プロセス。
・（項目９７）
上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するための医薬の調製のために
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターを使用するプロセスであって、上記レセプターは、
ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記プロセスは、項目１〜１６のいずれか１項に記載
の方法を実施することにより上記モジュレーターを同定する工程を包含し；上記合併症は、以
下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、プロセス。
・（項目９８）
上記モジュレーターが、項目１８〜２３のいずれか１項による、項目８５〜９７の
いずれか１項に記載のプロセス。
・（項目９９）
上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのモジュレーターが上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲのアゴニストで
ある、項目８５〜９７のいずれか１項に記載のプロセス。
・（項目１００）
上記モジュレーターが項目２４に記載の化合物である、項目８５〜９７のいずれか
１項に記載のプロセス。
・（項目１０１）
上記モジュレーターが化合物１、化合物２、または化合物３である、項目８５〜９７
のいずれか１項に記載のプロセス。
・（項目１０２）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増
加させる化合物である、項目８５〜１０１のいずれか１項に記載のプロセス。
・（項目１０３）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを
増加させる化合物である、項目８５〜１０１のいずれか１項に記載のプロセス。
・（項目１０４）
薬学的組成物を調製する方法であって、項目２４に記載の化合物と薬学的に受容可能
なキャリアとを混合する工程を包含する、方法。
・（項目１０５）
上記化合物が化合物１、化合物２、または化合物３である、項目１０４に記載の方法
。
・（項目１０６）
薬学的組成物であって、項目２４に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリア
を含む、薬学的組成物。
・（項目１０７）
上記化合物が化合物１、化合物２、または化合物３である、項目１０６に記載の薬学
的組成物。
・（項目１０８）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを調節する方法であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸
配列を含み、上記方法は、上記レセプターを項目２４に記載の化合物または項目１０６も
しくは項目１０７に記載の薬学的組成物と接触させる工程を包含する、方法。
・（項目１０９）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１ア
ミノ酸配列を含み、上記調節は、血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物における
血中グルコース濃度を低下させるためであり、上記方法は、上記レセプターを、治療有効量の
項目２４に記載の化合物または治療有効量の項目１０６もしくは項目１０７に記載
の薬学的組成物と接触させる工程を包含する、方法。
・（項目１１０）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲの活性を調節する方法であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１ア
ミノ酸配列を含み、上記調節は、代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物における
代謝障害を予防または処置するためであり、上記方法は、上記レセプターを、治療有効量の請
求項２４に記載の化合物または治療有効量の項目１０６もしくは項目１０７に記載の
薬学的組成物と接触させる工程を包含し、上記代謝性障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目１１１）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲを調節する方法であって、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸
配列を含み、上記調節は、上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要と
する哺乳動物における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するためで
あり、上記方法は、上記レセプターを治療有効量の項目２４に記載の化合物または治療有効
量の項目１０６もしくは項目１０７に記載の薬学的組成物と接触させる工程を包含し
、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目１１２）
血中グルコース濃度の低下を必要とする哺乳動物において血中グルコース濃度を低下さ
せる方法であって、上記方法は、治療有効量の項目２４に記載の化合物または治療有効量
の項目１０６もしくは項目１０７に記載の薬学的組成物をＲＵＰ４３ＧＰＣＲと接
触させる工程を包含し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む、方法。
・（項目１１３）
代謝障害の予防または処置を必要とする哺乳動物において代謝障害を予防または処置す
る方法であって、上記方法は、治療有効量の項目２４に記載の化合物または治療有効量の
項目１０６もしくは項目１０７に記載の薬学的組成物をＲＵＰ４３ＧＰＣＲと接触
させる工程を包含し、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記代謝障害は、
以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目１１４）
上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置を必要とする哺乳動物において
上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置する方法であって、上記方法は、治
療有効量の項目２４に記載の化合物または治療有効量の項目１０６もしくは項目１
０７に記載の薬学的組成物をＲＵＰ４３ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、上記レセプ
ターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目１１５）
血中グルコース濃度を低下させる方法であって、上記方法は、上記低下を必要とする哺乳動
物に、治療有効量の項目２４に記載の化合物または治療有効量の項目１０６もしくは
項目１０７に記載の薬学的組成物を提供または投与する工程を包含する、方法。
・（項目１１６）
代謝障害を予防または治療する方法であって、上記方法は、上記予防または処置を必要とす
る哺乳動物に治療有効量の項目２４に記載の化合物または治療有効量の項目１０６も
しくは項目１０７に記載の薬学的組成物を提供または投与する工程を包含し、上記代謝障
害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目１１７）
上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防または処置するための方法であって、上記方
法は、上記予防または処置を必要とする哺乳動物に治療有効量の項目２４に記載の化合物
または治療有効量の項目１０６もしくは項目１０７に記載の薬学的組成物を投与また
は提供する工程を包含し、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目１１８）
上記哺乳動物がヒトである、項目１０９〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１１９）
上記化合物が、化合物１、化合物２、または化合物３である、項目１０８〜１１８の
いずれか１項に記載の方法。
・（項目１２０）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた脂肪細胞によるグルコース取り込みを増
加させる化合物である、項目１０８〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１２１）
上記モジュレーターが、哺乳動物から得られた骨格筋細胞によるグルコース取り込みを
増加させる化合物である、項目１０８〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１２２）
治療によるヒトまたは動物体の処置方法において使用するための、項目２４に記載の
化合物。
・（項目１２３）
治療によってヒトまたは動物体における血中グルコース濃度を低下させる方法において
使用するための、項目２４に記載の化合物。
・（項目１２４）
治療によってヒトまたは動物体における代謝障害を予防または処置する方法において使
用するための、項目２４に記載の化合物であって、上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、化合物。
・（項目１２５）
治療によってヒトまたは動物体における上昇した血中グルコース濃度の合併症を予防ま
たは処置する方法において使用するための、項目２４に記載の化合物であって、上記合併
症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、化合物。
・（項目１２６）
上記化合物が、化合物１、化合物２、または化合物３である、項目１２２〜１２５の
いずれか１項に記載の化合物。
・（項目１２７）
上記動物が哺乳動物である、項目１２２〜１２６のいずれか１項に記載の化合物。
・（項目１２８）
血中グルコース濃度を低下させるための医薬の調製のために項目２４に記載の化合物
を使用する方法。
・（項目１２９）
代謝障害の予防または処置のための医薬の調製のために項目２４に記載の化合物を使
用する方法であって、上記代謝障害は、以下：
（ａ）糖尿病；
（ｂ）グルコース寛容減損；
（ｃ）インスリン抵抗性；および
（ｄ）高インスリン血症
からなる群より選択される、方法。
・（項目１３０）
上昇した血中グルコース濃度の合併症の予防または処置のための医薬の調製のために請
求項２４に記載の化合物を使用する方法であって、上記合併症は、以下：
（ａ）症候群Ｘ；
（ｂ）アテローム性動脈硬化症；
（ｃ）アテローム性疾患；
（ｄ）心臓病；
（ｅ）高血圧症；
（ｆ）発作；
（ｇ）ニューロパシー；
（ｈ）網膜症；
（ｉ）腎症；および
（ｊ）末梢脈管疾患
からなる群より選択される、方法。
・（項目１３１）
上記化合物が、化合物１、化合物２、または化合物３である、項目１２８〜１３０の
いずれか１項に記載の方法。
・（項目１３２）
１以上の候補化合物を、ＲＵＰ４３ＧＰＣＲに結合する化合物と同定する方法であっ
て、上記レセプターはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記方法は、工程：
（ａ）上記レセプターを、上記候補化合物の存在下または非存在下で、上記レセプターの検出
可能に標識された既知のリガンドと接触させる工程；および
（ｂ）上記標識された既知のリガンドの上記レセプターに対する結合が、上記候補化合物の存
在下で阻害されるか否かを決定する工程
を包含し；上記阻害は、上記候補化合物が、上記ＲＵＰ４３ＧＰＣＲに結合する化合物である
ことを示す、方法。
・（項目１３３）
項目１に記載の方法であって、上記ＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｃ）上記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメ
チオニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｄ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、上記核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号３
のプライマーおよび配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセスに
よって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、上記核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号７
のプライマーおよび配列番号８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセスに
よって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸２−３３０；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、
上記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン
残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；および
（ｊ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択される、方法。
・（項目１３４）
上記接触させる工程が、上記ＧＰＣＲを発現する宿主細胞または上記ＧＰＣＲを発現す
る宿主細胞の膜と接触させることを含む、項目１３２または項目１３３に記載の方法
。
・（項目１３５）
上記宿主細胞が、上記レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含
む、項目１３４に記載の方法。
・（項目１３６）
上記既知のリガンドが、化合物１、化合物２、または化合物３である、項目１３２〜
１３５のいずれか１項に記載の方法。
・（項目１３７）
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲに結合するリガンドを検出するための方法であって、上記レセプタ
ーはＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含み、上記方法は、工程：
（ａ）試験リガンドを、上記レセプターと上記試験リガンドとの間の相互作用を許容する条
件下で、上記レセプターを発現する宿主細胞または上記レセプターを発現する宿主細胞の膜と
接触させる工程；および
（ｂ）上記レセプターに結合したリガンドを検出する工程
を包含する、方法。
・（項目１３８）
項目１３７に記載の方法であって、上記ＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｃ）上記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメ
チオニン残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；
（ｄ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、上記核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号３
のプライマーおよび配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセスに
よって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；
（ｆ）核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＧタンパク質共役レセプ
ターのアミノ酸配列であって、上記核酸配列は、ヒトＤＮＡサンプルについて、配列番号７
のプライマーおよび配列番号８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含むプロセスに
よって入手可能である、アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されている、配列番号
２のアミノ酸２−３３０；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンがリジンに置換されており、ただし、
上記ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共役レセプターが配列番号２のアミノ酸１位のメチオニン
残基を含まない、配列番号２のアミノ酸２−３３０；および
（ｊ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズするポリヌク
レオチドによってコードされる、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択される、方法。
・（項目１３９）
上記接触させる工程が、上記ＧＰＣＲを発現する宿主細胞または上記ＧＰＣＲを発現す
る宿主細胞の膜と接触させることを含む、項目１３７または項目１３８に記載の方法
。
・（項目１４０）
上記宿主細胞が、上記レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含
み、上記宿主細胞が、上記レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含
む、項目１３９に記載の方法。
出願人は、本発明の実施形態のいずれからも、あらゆる１以上の候補化合物を排除する
権利を確保する。出願人はまた、本発明の実施形態のいずれからも、あらゆる１以上のモ
ジュレーターを排除する権利を確保する。出願人は、本発明の実施形態のいずれからも、
任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを排除する権利を確保する。出願人はさらに
、あらゆる代謝障害または上昇した血中グルコース濃度のあらゆる合併症を排除する権利
を確保する。本発明の代謝障害が、個々に、または任意の組合せのいずれにおいても、実
施形態に含まれ得ることもまた明白に意図される。本発明の上昇した血中グルコース濃度
の合併症が、個々に、または任意の組合せのいずれにおいても、実施形態に含まれ得るこ
ともまた明白に意図される。

【0316】

本願を通して、種々の刊行物、特許および公開された特許出願が引用される。本願にお
いて参照されたこれらの刊行物、特許および公開された特許出願の開示は、それらの全体
が本開示において参考として援用される。本明細書で出願人が刊行物、特許または公開さ
れた特許出願を引用したことは、出願人が上記刊行物、特許または公開された特許出願を
先行技術として認めたということではない。

【0317】

当業者の範囲内にある、開示された発明の改変および拡張は、上記開示および特許請求
の範囲に含まれる。

【発明を実施するための最良の形態】

【0318】

（詳細な説明）
（定義）
レセプター周辺で発展してきた科学文献は、レセプターに対して種々の影響を有するリ
ガンドを言及するために多数の用語を適応させた。明確さおよび一貫性のために、以下の
定義が、本特許文書全体を通して用いられる。これらの定義がこれらの用語についての他
の定義と矛盾しない程度まで、以下の定義が優先する：
「アゴニスト」は、レセプターに結合した際に細胞内応答を活性化する物質（例えば、
リガンド、候補化合物）を意味するものとする。いくつかの実施形態では、アゴニストは
、レセプターに結合する際に細胞内応答を活性化する（例えば、膜へのＧＴＰγＳ結合を
増強するかまたは細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる）ことが以前には公知でなかった物
質である。いくつかの実施形態では、アゴニストは、レセプターに結合する際に、哺乳動
物から得た脂肪細胞または骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを刺激することが以前
には公知でなかった物質である。

【0319】

本明細書中で用いられるアミノ酸の略号を表Ａに示す：

【0320】

【表1A】

「アンタゴニスト」は、アゴニストと同じ部位でレセプターに競合的に結合するが、細
胞内応答を活性化せず、それによってアゴニストにより誘発される細胞内応答を阻害し得
る、物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味するものとする。アンタゴニストは、
アゴニストの非存在下ではベースラインの細胞内応答を減少させない。いくつかの実施形
態では、アンタゴニストは、レセプターに結合した際にアゴニストと競合して細胞応答を
阻害することが以前には公知でなかった物質である（例えば、細胞応答は、膜へのＧＴＰ
γＳ結合または細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇である）。

【0321】

「抗体」は、本明細書中では、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を包含す
ることが意図される。抗体はさらに、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭを
包含することが意図される。抗体は、抗体全体（単鎖抗体の全体が挙げられる）およびそ
れらの抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２が
挙げられる）を包含する。抗体は、任意の動物期限であり得る。好ましくは、抗体は、ヒ
ト、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ラクダ、ロバ、
ヒツジ、ウマまたはニワトリの抗体である。好ましくは、抗体は、５×１０^−６Ｍ未満、
１０^−６Ｍ未満、５×１０^−７Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、５×１０^−８Ｍ未満、１０^−８
Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、５×１０^−１０Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未
満、５×１０^−１１Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満、５×１０^−１２Ｍ未満、１０^−１２Ｍ未
満、５×１０^−１３Ｍ未満、１０^−１３Ｍ未満、５×１０^−１４Ｍ未満、１０^−１４Ｍ未
満、５×１０^−１５Ｍ未満および１０^−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄ値を有する結
合親和性を有する。本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法により調製され
得る。抗体の誘導体は、抗原結合フラグメントを包含するがこれに限定されないことが意
図される。

【0322】

ＧＰＣＲのポリペプチドまたはアミノ酸配列の「生物学的に活性なフラグメント」とは
、天然に存在するＧＰＣＲの構造的機能および生化学的機能を有する、このポリペプチド
またはアミノ酸配列のフラグメントを意味するものとする。特定の実施形態では、この生
物学的に活性なフラグメントは、Ｇタンパク質と共役する。特定の実施形態では、この生
物学的に活性なフラグメントは、内因性リガンドに結合する。

【0323】

「候補化合物」とは、スクリーニング技術に従う分子（例えば、化合物であるがこれに
限定されない）を意味するものとする。

【0324】

化学基、部分またはラジカル：
用語「Ｃ_１−６アルキル」とは、示した数の炭素を含む、直鎖または分枝鎖の炭素ラジ
カルを示す。例えば、いくつかの実施形態では、アルキルは、「Ｃ_１−４アルキル」であ
り、そしてこの基は１〜４個の炭素を含み、なお他の実施形態では、アルキルは、「Ｃ_２
_−６アルキル」であり、そしてこの基は２〜６個の炭素を含む。アルキルは、いくつかの
実施形態では、１〜３個の炭素を含み、いくつかの実施形態では、１〜２個の炭素を含み
、そしていくつかの実施形態では、１個の炭素を含む。アルキルの例としては、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ｓｅ
ｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、
ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎｅｏ−ヘキシルなどが挙げられるが
これらに限定されない。

【0325】

用語「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基またはヨード基
を示す。

【0326】

「コドン」とは、リン酸基に結合したヌクレオシド［アデノシン（Ａ）、グアノシン（
Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）およびチミジン（Ｔ）］を一般に含み、翻訳され
た場合にアミノ酸をコードする、３ヌクレオチド（またはヌクレオチドの等価物）の群を
意味するものとする。

【0327】

「組成物」とは、少なくとも１つの成分を含む物質を意味する。「薬学的組成物」とは
、組成物の例である。

【0328】

「化合物の効力」とは、レセプターの機能を化合物が阻害または刺激する能力（すなわ
ち、レセプター結合活性とは対照的に、シグナル伝達経路を活性化／阻害する能力）の尺
度を意味するものとする。化合物の効力を検出する例示的な手段は、本特許文書の実施例
の節に開示される。

【0329】

「を含む、から本質的になる、およびからなる」は、それらの標準的な意味に従って本
明細書中で定義される。米国審査便覧（Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．）に示される定義される意味は
、当該分野における定義された意味よりも優先し、そして統制巡回連邦判例法（ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｉｎｇＦｅｄｅｒａｌＣｉｒｃｕｉｔｃａｓｅｌａｗ）に示される定義
された意味は、米国審査便覧に示される意味よりも優先する。

【0330】

「構成的に活性なレセプター」とは、そのリガンドまたはその化学的等価物へのレセプ
ターの結合によること以外の手段により活性状態で安定化されたレセプターを意味するも
のとする。構成的に活性なレセプターは、内因性であってもよく、または非内因性であっ
てもよい。

【0331】

「構成的に活性化されたレセプター」とは、構成的に活性であるように改変された内因
性レセプターを意味する。

【0332】

「構成的なレセプター活性化」とは、そのリガンドまたはその化学的等価物への結合な
しでのレセプターの活性化を意味する。

【0333】

「接触」、または「接触する」とは、インビトロ系においてであろうとインビボ系にお
いてであろうと、少なくとも２つの部分を合わせることを意味する。

【0334】

「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」は、測定可能な量での減少を指すために使用され、
そして用語「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低減する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、「下が
る（ｌｏｗｅｒ）」および「減る（ｌｅｓｓｅｎ）」と同義的に使用される。

【0335】

「上昇した血中グルコース濃度」とは、哺乳動物における、その哺乳動物にとっての正
常な空腹時血中グルコース濃度よりも高い空腹時血中グルコース濃度を意味する。例とし
て、正常ヒト空腹時血中グルコース濃度は、１００ｍｇ／ｄｌ未満である。本明細書にお
いて使用される場合、上昇したヒト血中グルコース濃度は、１００ｍｇ／ｄｌ以上の空腹
時血中グルコース濃度である。例としてであり限定ではなく、上昇した血中グルコース濃
度は、高グルコース血症を包含する。

【0336】

「内因性」とは、哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。内因性に関して、例とし
てであり限定ではなく、用語「レセプター」は、哺乳動物（例としてであり限定ではなく
、ヒト）によって天然に産生されたものを意味する。内因性は、遺伝子の対立遺伝子改変
体ならびにそれにコードされた対立遺伝子のポリペプチド改変体を包含すると理解される
。本明細書において使用される場合、「内因性ＧＰＣＲ」および「ネイティブＧＰＣＲ」
は、交換可能に使用される。対照的に、この状況における用語、非内因性は、哺乳動物（
例としてであり限定ではなく、ヒト）によって天然に産生されないものを意味する。例と
してであり限定ではなく、その内因性形態において構成的に活性でないが、操作される場
合に構成的に活性になるレセプターは、最も好ましくは、本明細書において「非内因性の
、構成的に活性化されたレセプター」と称される。

【0337】

「発現ベクター」は、本明細書において、上記発現ベクターについての適切な宿主細胞
組換え体における、クローニングされたＤＮＡの転写のためおよび転写されたｍＲＮＡの
翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列として定義される。適切に構築された発現ベクター
は、宿主細胞における自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限定された数の有用
な制限酵素部位、高コピー数となる可能性、および活性プロモーターを含む。転写される
べき上記クローニングされたＤＮＡは、上記発現ベクター内で構成的にまたは条件的に活
性なプロモーターに作動可能に結合されている。例示としてであり限定としてではなく、
ｐＣＭＶは発現ベクターである。

【0338】

「Ｇタンパク質共役レセプター融合タンパク質」および「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は
、本明細書において開示される本発明の状況において、各々、少なくとも１つのＧタンパ
ク質（最も好ましくは、このようなＧタンパク質のαサブユニット（これは、ＧＴＰに結
合するサブユニットである））に融合された、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲまたは非
内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲを含む、非内因性タンパク質を意味する（好まし
くは、Ｇタンパク質は、天然で内因性ＧＰＣＲに結合するＧタンパク質と同じ型である）
。例としてであり限定としてではなく、内因性状態において、Ｇタンパク質「Ｇｓα」が
、ＧＰＣＲに結合する優勢なＧタンパク質である場合、特定のＧＰＣＲに基づくＧＰＣＲ
融合タンパク質は、Ｇｓαに融合したＧＰＣＲを含む非内因性タンパク質であり；一部の
環境では、以下に示すように、ＧＰＣＲに融合され得る非優勢のＧタンパク質である。Ｇ
タンパク質は、構成的に活性なＧＰＣＲのＣ末端に直接的に融合され得るか、またはそれ
ら２つの間にスペーサーが存在し得る。

【0339】

「宿主細胞」は、それに組み込まれるベクター有し得る細胞を意味する。特定の実施形
態において、ベクターは、発現ベクターである。例示的宿主細胞としては、２９３細胞、
２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＣＢ３９０１細胞、およびＣＯＳ−７細胞ならびにメラニ
ン保有細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0340】

「予防または処置の必要がある」とは、本明細書において使用される場合、ヒトにおい
ては介護者（例えば、医師、看護士、ナースプラクティショナーなど）によって、動物（
非ヒト哺乳動物が挙げられる）においては獣医によってなされる、個体もしくは動物が処
置を必要とするかまたはその処置から利益を受けるという判断を指す。この判断は、介護
者の専門的意見の領域であるが、個体または動物が病気であるか病気になり、結果として
本発明の化合物によって処置可能な状態であるという知見を含む、種々の要因に基づいて
なされる。

【0341】

本明細書において使用される場合、「個体」とは、哺乳動物（好ましくは、マウス、ラ
ット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、
最も好ましくはヒト）を含む、任意の動物を指す。

【0342】

「阻害」または「阻害する」とは、用語「反応（応答）」に関連して、化合物の非存在
下に対して、化合物の存在下で、反応が減少または防止されることを意味する。

【0343】

「グルコース寛容減損（ＩＧＴ）」は、本明細書において使用される場合、明白な２型
糖尿病と正常なグルコース寛容（ＮＧＴ）との中間であるインスリン抵抗性に関連する条
件を示すことを意図される。ＩＧＴは、罹患した人物の食後グルコース反応が、食後２時
間での血漿グルコースレベルによって評価される場合に異常であると決定される手順によ
って診断される。この試験において、測定された量のグルコースが患者に与えられ、血中
グルコースレベルが、定期的な間隔（通常、最初の２時間は３０分毎、その後１時間毎）
で測定される。「正常」な、または非ＩＧＴの個体において、最初の２時間のグルコース
レベルは、１４０ｍｇ／ｄｌ未満まで上昇し、次いで急速に低下する。ＩＧＴ個体におい
ては、血中グルコースレベルは、より高く上昇し、そしてよりゆっくりとした速度で落ち
る。

【0344】

「インスリン抵抗性」は、本明細書において使用される場合、多くの方法のいずれかに
よって行われるインスリン抵抗性の通常の診断を包含することを意図される。上記方法と
しては、静脈内グルコース寛容試験または空腹時インスリンレベルの測定が挙げられるが
、これらに制限されない。空腹時インスリンレベルとインスリン抵抗性の程度との間に強
い相関が存在することは、周知である。したがって、高い空腹時インスリンレベルを、正
常なグルコース寛容（ＮＧＴ）個体がインスリン抵抗性を有することを同定する目的のた
め、インスリン抵抗性の代理のマーカーとして使用することができる。インスリン抵抗性
の診断はまた、オイグリセミックグルコースクランプ試験を使用して行われ得る。

【0345】

「逆アゴニスト」は、レセプターの内因性形態または構成的に活性化された形態のいず
れかに結合して、アゴニストの非存在下で観察されるそのレセプターのベースラインの細
胞内応答を低下させる物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。

【0346】

「単離された」とは、物質がその本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天
然の環境）から取り出されていること意味する。例えば、生きた動物中に天然に存在する
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系に共存する物質の
一部もしくは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチド
は、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および
／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得る
。そしてベクターもしくは組成物が天然の環境の一部にない場合、やはり単離されている
。

【0347】

「リガンド」とは、ＧＰＣＲに特異的に結合する分子を意味する。リガンドは、例えば
、ポリペプチド、脂質、小分子、抗体であり得る。内因性リガンドは、ネイティブＧＰＣ
Ｒに対する内因性の天然リガンドである。リガンドは、ＧＰＣＲ「アンタゴニスト」、「
アゴニスト」、「部分アゴニスト」、または「逆アゴニスト」などであり得る。

【0348】

本明細書において使用される場合、用語「調節する」または「改変する」は、特に活性
、機能または分子の、量、質、または効果の増加または減少を指すことを意味する。例示
であって限定ではなく、Ｇタンパク質共役レセプターのアゴニスト、部分アゴニスト、逆
アゴニスト、およびアンタゴニストは、そのレセプターのモジュレーターである。

【0349】

「部分アゴニスト」とは、それがレセプターに結合する場合、完全アゴニストが活性化
するより少ない程度で細胞内応答を活性化する物質（例えば、リガンド、候補化合物）を
意味する。

【0350】

「薬学的組成物」とは、少なくとも１種の活性成分を含有する組成物を意味する。これ
によって、この組成物は、哺乳動物（例えば、限定ではなく、ヒト）における特定の効果
のある結果についての調査を受けることができる。当業者は、活性成分が当業者の必要性
に基づく所望の効果のなる結果を有するか否かを決定するのに適切な技術を、理解および
認識する。

【0351】

「ポリヌクレオチド」とは、１より多くのヌクレオチドの、短鎖形態もしくは二重鎖形
態の、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を意味する。本発明の
ポリヌクレオチドは、任意の公知の方法によって（合成、組換え、エキソビボ生成、また
はこれらの組み合わせ、および当該分野で公知の任意の精製方法を使用して）調製され得
る。

【0352】

「ポリペプチド」は、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーを指す。したが
って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。
この用語はまた、ポリペプチドの翻訳後修飾を特定化も排除もしない。例えば、グリコシ
ル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドは、明確に、用
語ポリペプチドによって包含される。

【0353】

「プライマー」は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、標的ヌクレオチド配列にハ
イブリダイズするために使用される、特定のオリゴヌクレオチド配列を示すために、本明
細書において使用される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ま
たは逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として機能する。

【0354】

「精製された」、とは、他の化合物から分離された本発明のポリヌクレオチドまたはポ
リヌクレオチドベクターを記載するために本明細書において使用される。他の化合物とし
ては、他の核酸、炭水化物、脂質およびタンパク質（例えば、ポリヌクレオチドの合成に
使用される酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ポ
リヌクレオチドは、サンプルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約
７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約
９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または、少なく
とも約９９．５％が単一のポリヌクレオチド配列を含む場合、実質的に純粋である。いく
つかの実施形態において、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、代表的に、約５０％、約
６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約
９９％もしくは、約９９．５％重量／重量のポリヌクレオチドサンプルを含む。

【0355】

同様に、用語精製されたとは、他の化合物から分離された本発明のポリペプチドを記載
するために本明細書において使用される。他の化合物としては、核酸、脂質、炭水化物、
および他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において
、ポリペプチドは、サンプルのポリペプチドの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％
、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％
、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％
、もしくは少なくとも約９９．５％が単一のアミノ酸配列を有する場合、実質的に純粋で
ある。いくつかの実施形態において、実質的に純粋なポリペプチドは、代表的に、約５０
％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８
％、約９９％もしくは約９９．５％重量／重量のタンパク質サンプルを含む。

【0356】

同様に、用語精製されたとは、本発明のモジュレーターを記載するために本明細書にお
いて使用される。特定の実施形態において、実質的に純粋なモジュレーターは、代表的に
、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％
、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％
、もしくは少なくとも約９９．５％重量／重量の上記モジュレーターの調製物を含む。特
定の実施形態において、このモジュレーターは、任意の数から小数点以下第３位の範囲に
及ぶ、９０％と１００％との間（例えば、少なくとも９９．９９５％純粋）の「最低」純
度を有する。

【0357】

さらに、本明細書において使用される場合、用語精製されたは、絶対的純度を必要とせ
ず、むしろ相対的な定義であると意図される。

【0358】

「レセプター機能性」は、刺激を受容して細胞の効果（遺伝子転写の調節、イオン流の
調節、触媒作用の実行、および／またはＧタンパク質を介した調節性活性が挙げられるが
、これらに限定されない）を調節する、レセプターの正常な働きを指す。

【0359】

「セカンドメッセンジャー」とは、レセプター活性化の結果として生じる細胞内応答を
意味する。セカンドメッセンジャーとしては、例えば、イノシトール三リン酸（ＩＰ_３）
、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧ
ＭＰ（ｃＧＭＰ）、ＭＡＰキナーゼ活性、およびＣａ^２＋が挙げられ得る。セカンドメッ
センジャー応答は、レセプター活性化の決定に関して測定され得る。さらに、セカンドメ
ッセンジャー応答は、候補化合物を（例えば、逆アゴニスト、部分アゴニスト、アゴニス
ト、およびアンタゴニストとして）同定するために測定され得る。

【0360】

「信号雑音比」とは、活性化、増幅または刺激に応じてシグナルが生成され、このシグ
ナルが、バックグラウンドのノイズまたは非活性化、非増幅、非刺激に応じた基本レベル
より上であることを意味する。

【0361】

「スペーサー」は、遺伝子（例えば、目的のＧＰＣＲ）の最後のコドンもしくは最後の
アミノ酸の後ろに位置するが、その目的のＧタンパク質の開始コドンまたは開始領域の前
に位置する、翻訳された数のアミノ酸を意味する。ここで、この翻訳された数のアミノ酸
は、フレーム内に位置し、目的のＧタンパク質の開始領域を有する。この翻訳されたアミ
ノ酸の数は、１つ、２つ、３つ、４つなどであり得、１２個までであり得る。

【0362】

「刺激」または「刺激する」とは、用語「応答」に関する場合、化合物の非存在下に対
して化合物の存在下で応答が増加することを意味する。

【0363】

「被験体」とは、霊長類（ヒトおよびヒヒがあげられるが、これらに限定されない）、
ならびにペット動物（例えば、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスのような実験室動物）、
ならびにウマ、ヒツジ、および牝ウシのような家畜を意味する。

【0364】

「治療有効量」とは、本明細書において使用される場合、研究者、獣医、医師または他
の医療従事者によって探索されるべき、組織、系、動物、個体もしくはヒトにおいて生物
学的または医学的な反応を誘発する、活性化合物または薬学的因子の量を指す。上記反応
としては、以下の１つ以上が挙げられる：（１）疾患の予防；例えば、その疾患、状態ま
たは障害を被る傾向にあり得るが、まだその疾患の病因または症候を経験または表してい
ない個体における疾患、状態または障害の予防、（２）疾患の阻害；例えば、その疾患の
病因または症候を経験または表していない個体における疾患、状態または障害の阻害（す
なわち、病因および／または症候のさらなる発達の停止）、ならびに（３）疾患の改善；
例えば、その疾患の病因または症候を経験または表していない個体における疾患、状態ま
たは障害の改善（すなわち、病因および／または症候の逆転）。

【0365】

本明細書において使用される用語としての「改変体」は、それぞれ参照ポリヌクレオチ
ドまたは参照ポリペプチドとは異なるが本質的な特徴を保持する、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの代表的改変体は、別の参照ポリヌクレオチド
とヌクレオチド配列が異なる。改変体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させていても、変化させてい
なくともよい。ポリペプチドの代表的改変体は、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が
異なる。改変体ポリペプチドと参照ポリペプチドとは、１つ以上の置換、付加、欠失の任
意の組み合わせによって、アミノ酸配列が異なり得る。ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの改変体は、対立遺伝子改変体のような天然に存在する改変体であり得るか、または
それは、天然に存在することが知られていない改変体であり得る。ポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドの天然に存在しない改変体は、突然変異誘発または直接的合成によって作
製され得る。
（導入）
以下のセクションの順序は、提示上の効果のために示されており、以下の開示または特
許請求の範囲の限定として意図されてはおらず、解釈もされるべきでない。
（Ｂ．レセプター発現）
（１．目的のＧＰＣＲポリペプチド）
本発明のＲＵＰ４３ＧＰＣＲは、ＧＰＲ１３１アミノ酸配列を含む。本明細書におい
て使用される場合、「ＧＰＲ１３１アミノ酸配列」は、配列番号２の内因性ヒトＧＰＲ１
３１アミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも
約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも
約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも
約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％もしくは少なくとも約９９％同一な
、改変体アミノ酸配列を包含することを意図される。言い換えると、配列番号２のアミノ
酸配列の改変体を含むＧＰＣＲはまた、本方法に使用され得る。特定の実施形態において
、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体を含
み得る。特定の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体は、プ
ライマー（配列番号３および配列番号４）を使用してヒトＤＮＡサンプルにおいてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる、内因性ＧＰＲ１３１ヌ
クレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、配列番号２のアミ
ノ酸配列の対立遺伝子改変体は、配列番号３を含むプライマーおよび配列番号４を含むプ
ライマーを使用してヒトＤＮＡサンプルにおいてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う
ことによって得ることができる、内因性ＧＰＲ１３１ヌクレオチド配列によってコードさ
れる。特定の実施形態において、ヒトＤＮＡサンプルは、ヒトゲノムＤＮＡである。特定
の実施形態において、このプロセスは、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）
である。ＲＴ−ＰＣＲ技術は、当業者に周知である。特定の実施形態において、ヒトｃＤ
ＮＡサンプルは、ヒト単球またはヒトマクロファージのｃＤＮＡである。特定の実施形態
において、ヒトｃＤＮＡサンプルは、ヒト脂肪細胞ｃＤＮＡである。特定の実施形態にお
いて、ヒトｃＤＮＡサンプルは、ヒト骨格筋細胞ｃＤＮＡである。特定の実施形態におい
て、ヒトＤＮＡサンプルは、提供される。特定の実施形態において、ヒトＤＮＡサンプル
は、販売元から得ることができる。特定の実施形態において、本方法に使用され得る改変
体アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の哺乳動物オルソログである。例としてで
あり限定ではなく、ウサギ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＢＡＣ５５２
３７）、牝ウシ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＰ＿７７８２１９）、
マウス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＰ＿７７８１５０）およびラッ
ト（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＰ＿８０８７９７）のＧＰＲ１３１
アミノ酸配列が、「ＧＰＲ１３１アミノ酸配列」の範囲内として想定されることが理解さ
れる。本明細書において使用される場合「ＧＰＲ１３１ＧＰＣＲ」は、内因性ＲＵＰ４
３ＧＰＣＲである；例としてであり限定ではなく、内因性ヒトＲＵＰ４３ＧＰＣＲは
、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＭ＿１７０６９９のヒトＧＰＲ１３１（配列番
号２と同一なアミノ酸配列を有する）およびその対立遺伝子改変体であり、内因性ウサギ
ＲＵＰ４３ＧＰＣＲは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＢＡＣ５５２３７のウサ
ギＧＰＲ１３１およびその対立遺伝子改変体であり、内因性牝ウシＲＵＰ４３ＧＰＣＲ
は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号ＮＰ＿７７８２１９の牝ウシＧＰＲ１３１およ
びその対立遺伝子改変体であり、内因性マウスＲＵＰ４３ＧＰＣＲは、ＧｅｎＢａｎｋ
（登録商標）登録番号ＮＰ＿７７８１５０のマウスＧＰＲ１３１およびその対立遺伝子改
変体であり、そして内因性ラットＲＵＰ４３ＧＰＣＲは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）
登録番号ＮＰ＿８０８７９７のラットＧＰＲ１３１およびその対立遺伝子改変体である。

【0366】

特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、非内因性の、構成的に活
性化された配列番号２、配列番号２の対立遺伝子、または配列番号２の哺乳動物オルソロ
グのアミノ酸配列の変異体含み得る。当該分野で公知であるように、構成的に活性化され
たＧＰＣＲは、種々の方法を使用して作製され得る（例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９８／０７４９６、ＷＯ９８／４６９９５として１９９８年１０月２２日に公開；お
よび米国特許第６，５５５，３３９号を参照のこと；これらの各々の開示は、その全体が
本明細書において参考として援用される）。非内因性の、構成的に活性化された内因性Ｇ
ＰＲ１３１の変異体である、配列番号２、配列番号２の対立遺伝子、もしくは配列番号２
の哺乳動物オルソログのアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約
７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約
９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約
９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％もしくは少なく
とも約９９％同一なアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントは、本方法に使用され
得る。例としてであり限定ではなく、Ｎ末端メチオニンまたはＮ末端シグナルペプチドの
欠失は、本方法に使用され得る生物学的に活性なフラグメントを提供することを想定され
る。さらなる例としてであり限定ではなく、本方法に使用され得るＲＵＰ４３ＧＰＣＲ
は、配列番号２のアミノ酸２〜３３０を含み得る（ただし、ＲＵＰ４３Ｇタンパク質共
役レセプターは、配列番号２のアミノ酸１位にメチオニン残基を含まない）。

【0367】

特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配
列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０
％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４
％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８
％もしくは少なくとも約９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において
、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、
少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％もしくは少なくとも約９
９％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧ
ＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約７５％同一なアミノ酸配列を含み得
る。特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸
配列と少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、本
方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一な
アミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の
実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少な
くとも約９１％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、本方法に使用
され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９２％同一なアミノ酸配
列を含み得る。特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２
のアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態に
おいて、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９
４％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧ
ＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一なアミノ酸配列を含み得
る。特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸
配列と少なくとも約９６％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、本
方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９７％同一な
アミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一なアミノ酸配列を含み得る。特定の
実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列と少な
くとも約９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。配列番号２のアミノ酸配列と、例えば少
なくとも９５％「同一な」アミノ酸配列を有することは、そのアミノ酸配列が配列番号２
のアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり５個までのアミ
ノ酸変化を含み得ることを除いて同一であることを意味する。したがって、配列番号２に
対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を得るために、その配列中の５％（
１００のうち５）までのアミノ酸残基が、配列番号２のアミノ酸配列に対して別のアミノ
酸によって挿入、欠失または置換され得る。これらの変更は、アミノ末端またはカルボキ
シル末端またはこれらの末端位置の間のいずれかにおいて、配列中の残基の中で個別にか
、または配列内の１つ以上の連続する群においてかのいずれかで間隔を空けて、起こり得
る。

【0368】

いくつかの実施形態において、本方法に使用され得るＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、フ
ィルタに結合した配列番号１で示される配列を有するＤＮＡに、ストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列に対して相補的な配列によってコードされ
る、Ｇタンパク質共役レセプターのアミノ酸配列である。例としてであり限定ではなく、
本方法に使用され得るＧＰＲ１３１アミノ酸配列は、配列番号１の相補体とストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされた、Ｇタンパク
質共役レセプターのアミノ酸配列である。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知
である。好ましいストリンジェントな条件としては、以下：５０％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０
ｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーシ
ョンに続く、約６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのフィルタの洗浄を含む。

【0369】

（ａ．配列同一性）
クエリ配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）と検索（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）
されるべき配列との間の最も良好に重複したマッチを決定するための好ましい方法はまた
、グローバル配列アラインメントと称され、Ｂｒｕｔｌａｇら［ＣｏｍｐＡｐｐＢｉ
ｏｓｃｉ（１９９０）６：２３７−２４５；この開示は、その全体が本明細書により参考
として援用される］のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用
して決定され得る。配列アラインメントにおいて、クエリ配列および検索配列は、両方と
もアミノ酸配列である。このグローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性
である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメータは、以下
である：マトリクス＝ＰＡＭ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、連
結ペナルティ＝２０、ランダム化グループ＝２５、長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウ
インドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０
５、ウインドウサイズ＝２４７または検索アミノ酸配列の長さ（短いほう）。

【0370】

内部の欠失ではなくＮ末端もしくはＣ末端欠失に起因して検索配列がクエリ配列よりも
短い場合、結果（パーセント同一性）は手動で補正されなければならない。なぜなら、Ｆ
ＡＳＴＤＢプログラムは、グローバルパーセント同一性を計算する場合、検索配列のＮ末
端およびＣ末端の短縮を把握しないからである。Ｎ末端およびＣ末端で短縮された検索配
列に関しては、クエリ配列に対して、パーセント同一性は、検索配列のＮ末端およびＣ末
端である対応する検索配列残基にマッチ／整列しないクエリ配列の残基の数を、クエリ配
列の全塩基のパーセンテージとして計算することによって、補正される。残基がマッチ／
整列するか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで
、このパーセンテージは、特定のパラメータを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって計算されるパーセント同一性から引き算されて、最終のパーセント同一性スコアを
達成する。この最終のパーセント同一性スコアは、本発明の目的のために使用されるもの
である。クエリ配列とマッチ／整列しない検索配列のＮ末端およびＣ末端に対する残基の
みが、パーセント同一性スコアを手動で調節するために考慮される。つまり、検索配列の
最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側にあるクエリアミノ酸残基のみである。

【0371】

例えば、９０アミノ酸残基の検索配列が、１００残基のクエリ配列とアラインメントさ
れて、パーセント同一性を決定する。検索配列のＮ末端に欠失が生じ、したがって、ＦＡ
ＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の残基をマッチ／整列しない。１０個の対形成
しない残基は、配列の１０％（マッチしないＮ末端およびＣ末端における残基数／クエリ
配列の残基の総数）を表し、したがって、１０％がＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算
されたパーセント同一性スコアから引き算される。残りの９０残基が完全にマッチした場
合、最終パーセント同一性は、９０％である。

【0372】

別の例では、９０残基の検索配列が１００残基のクエリ配列と比較される。今回は、欠
失は内部であり、したがって検索配列のＮ末端もしくはＣ末端に、クエリとマッチ／整列
しない残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセント同一性
は、手動で補正されない。やはり、被験配列のＮ末端およびＣ末端の外部の残基の位置の
みが、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで表示され、クエリ配列とマッチ／整列しない場合、
手動で補正される。他の補正は、本発明の目的のために行われない。

【0373】

（ｂ．融合タンパク質）
特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、融合タンパク質であり、例えば、親
和性タグドメインまたはレポータードメインを含み得る。適切な親和性タグとしては、別
の部分（通常、別のポリペプチド、最も通常には、抗体）に特異的に結合し得る任意のア
ミノ酸配列が挙げられる。適切な親和性タグとしては、当該分野で公知であるように、エ
ピトープタグ（例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ（血球凝集素インフルエンザ
ウイルス由来）、ｍｙｃタグなど）が挙げられる。適切な親和性タグとしてはまた、当該
分野で公知であるように、結合する基質が知られているドメイン（例えば、ＨＩＳ、ＧＳ
ＴおよびＭＢＰタグ）、ならびに特定の結合パートナー（例えば、抗体、特にモノクロー
ナル抗体）が利用可能な他のタンパク質由来のドメインが挙げられる。適切な親和性タグ
としてはまた、適切な結合パートナー（例えば、ＩｇＧＦｃレセプター）を使用して特
異的に結合されて検出され得る、任意のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン（例え
ば、ＩｇＧＦｃ領域）が挙げられる。このような融合タンパク質が、代替的アミノ酸で
欠失もしくは置換されたＮ末端メチオニン残基を有していたＧＰＣＲとインフレームで融
合した異種Ｎ末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含み得ることが、明らかに企図
される。

【0374】

適切なレポータードメインとしては、ポリペプチドの存在を報告し得る任意のドメイン
が挙げられる。例えば、タグに特異的に結合する標識抗体を使用してポリペプチドの存在
を報告するために、親和性タグが使用され得ることが認識されるが、発光レポータードメ
インが、より一般的に使用され得る。適切な発光レポータードメインとしては、ルシフェ
ラーゼ（例えば、ホタル、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓもし
くはＲｅｎｉｌｌａｍｕｅｌｌｅｒｉ由来）、またはそれらの発光改変体が挙げられる
。他の適切なレポータードメインとしては、蛍光タンパク質（例えば、クラゲ、サンゴお
よび他の腔腸動物由来のもの、例えば、Ａｅｑｕｏｒｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏ
ｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ種に由来するもの）、またはそれらの発光改変体が挙
げられる。これらのレポータータンパク質の発光改変体は、当該分野で非常に周知であり
、ネイティブレポータータンパク質と比較して、より明るくても、より暗くても、または
異なる励起および／もしくは放射スペクトルを有してもよい。例えば、いくつかの改変体
は、変更されて、もはや緑色には見えず、青色、シアン、黄色、増強された黄赤に見えて
もよく（それぞれ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰおよびＲＦＰと称される）、当該
分野で公知であるような他の放射スペクトルを有してもよい。他の適切なレポータードメ
インとしては、生化学的変化または色の変化を介してポリペプチドの存在を報告し得るド
メインが挙げられ得る（例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌された胚アルカリホスファター
ゼ）。

【0375】

当該分野で公知であるように、親和性タグまたはレポータードメインは、目的のポリペ
プチドの任意の位置に存在し得る。しかし、ほとんどの実施形態において、これらは、目
的のポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端に存在する。

【0376】

（２．目的のＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸）
遺伝暗号および核酸を操作するための組換え技術は公知であり、そして目的のＧＰＣＲ
ポリペプチドのアミノ酸配列が上記されているので、目的のＧＰＣＲポリペプチドをコー
ドする核酸の設計および生成は、十分当業者の技術範囲内である。特定の実施形態におい
て、標準的な組換えＤＮＡ技術法（Ａｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１
９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
，Ｎ．Ｙ．）が使用される。例えば、ＧＰＣＲをコードする配列は、ＧＰＣＲをコードす
る配列のライブラリから、種々の組換え法（本明細書において記載する必要はない）のい
ずれか１つまたはその組み合わせを使用して、単離され得る。その後、タンパク質をコー
ドする核酸配列におけるヌクレオチドの置換、欠失および／もしくは付加が、標準的な組
換えＤＮＡ技術を使用してまた行われ得る。

【0377】

例えば、部位依存性突然変異誘発およびサブクローニングが、目的のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド中の核酸残基を導入／欠失／置換するために使用され得る。他
の実施形態において、ＰＣＲが使用され得る。目的のポリペプチドをコードする核酸はま
た、化学合成によって、オリゴヌクレオチドから全体的に生成され得る（例えば、Ｃｅｌ
ｌｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９７：１０１６−８）。

【0378】

いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定
の種の細胞、特に、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類、ま
たはヒト種）細胞における発現について、最適化される。いくつかの実施形態において、
目的のポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定の種（特に、両生類の種）の細胞
における発現について、最適化される。

【0379】

（ａ．ベクター）
本発明は、本発明の核酸を含むベクター（「構築物」とも称される）をさらに提供する
。本発明の多くの実施形態において、本発明の核酸配列は、配列が発現制御配列（例えば
、プロモーターが挙げられる）に作動可能に連結された後、宿主細胞中で発現される。本
発明の核酸はまた、代表的に、エピソームとしてかまたは宿主の染色体ＤＮＡの組み込ま
れた一部としてのいずれかで宿主細胞中で複製され得る、発現ベクター中に配置される。
一般的に、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、テトラサイクリンもしくはネオマイ
シン）を含み、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする（例えば、米
国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと、これは、本明細書において参考として援用
される）。ベクター（単一および二重発現カセットベクターを含む）は、当該分野で周知
である（Ａｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
第２版，（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。適切なベク
ターとしては、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（ヒト人工染色体
、細菌人工染色体、酵母人工染色体など）、小型染色体などが挙げられる。レトロウイル
ス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが使用され得る。

【0380】

種々の発現ベクターが、細胞で目的のポリペプチドを生成するために、当業者に利用可
能である。１つの適切なベクターは、ｐＣＭＶであり、これは特定の実施形態において使
用される。このベクターは、１９９８年１０月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣ
ｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９ＵＳＡ）に、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に基づいて寄託された。こ
のＤＮＡは、ＡＴＣＣによって試験され、生存が確認された。ＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに、
ＡＴＣＣ＃２０３３５１の登録番号を割り当てた。

【0381】

本発明の核酸は、通常、目的の本発明のポリペプチドをコードする単一のオープンリー
ディングフレームを含む。しかし、特定の実施形態において、目的のポリペプチドの発現
のための宿主細胞は真核生物細胞（例えば、ヒト細胞のような哺乳動物細胞）であり得る
ので、オープンリーディングフレームは、イントロンによって中断され得る。本発明の核
酸は、代表的に、ＲＮＡ安定性、翻訳効率などに関与し得る本発明の核酸の３’および５
’未翻訳領域（ＵＴＲ）に加えて含み得る、転写単位の一部である。本発明の核酸はまた
、本発明の核酸に加えて、目的のポリペプチドの転写および発現に関するプロモーター、
ならびに転写ターミネーターを含む、発現カセットの一部であり得る。

【0382】

真核生物プロモーターは、ウイルスプロモーターおよび真核生物遺伝子由来のプロモー
ターを含む、真核生物宿主細胞で機能性である任意のプロモーターであり得る。例示的な
真核生物プロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウスメ
タロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇ
ｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫ
ｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０早期プロモーター
（Ｂｅｎｏｉｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０，１９８１
）；酵母ｇａｌｌ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒら
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９ＳＳ，１９
８４），ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン反応性プロモーター、
テトラサイクリン反応性プロモーターなど。ウイルスプロモーターは、特に関心のあるも
のであり得る。なぜなら、これらは、一般的に特に強力なプロモーターであるからである
。特定の実施形態において、標的病原体のプロモーターであるプロモーターが使用される
。本発明において使用するためのプロモーターは、それらが導入される細胞型（および／
もしくは動物）において機能性であるように選択される。特定の実施形態において、プロ
モーターは、ＣＭＶプロモーターである。

【0383】

特定の実施形態において、本発明のベクターはまた、選択可能なマーカーの発現を提供
し得る。適切なベクターおよび選択可能なマーカーは、当該分野で周知であり、そして以
下において考察されている：Ａｕｓｕｂｅｌら（ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５
）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第３版ｎ，（２００１）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ，Ｎ．Ｙ．）。種々の異なる遺伝子が選択可能なマーカーとして利用されており、本発
明のベクターにおいて選択可能なマーカーとして利用される特定の遺伝子は、便宜的に選
択される。公知の選択可能なマーカー遺伝子としては、以下が挙げられる：チミジンキナ
ーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンテ
ターゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ｔｅｔｒ、ａｍｐｒ、Ｃｍｒもしくはｃａ
ｔ、ｋａｎｒまたはｎｅｏｒ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハ
イグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子など。

【0384】

上述のように、目的のポリペプチドは、親和性ドメインおよび／またはレポータードメ
インを含む融合タンパク質であり得る。レポーターもしくはタグとＧＰＣＲ（例えば、Ｇ
ＰＣＲのＣ末端もしくはＮ末端）との間に融合を作製するための方法は、十分に当業者の
技術範囲内であり（例えば、ＭｃＬｅａｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．ＭｏｌＰｈａｒ
ｍａｃｏｌ．１９９９５６：１１８２−９１；Ｒａｍｓａｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｙ，２００１，３１５−３２３）、これ以上記載しない。このような融合タ
ンパク質が、Ｎ末端メチオニン残基が代替的アミノ酸で欠失されたか置換されたかのいず
れかであるＧＰＣＲとインフレームで融合した、異種Ｎ末端ドメイン（例えば、エピトー
プタグ）を含み得ることが明確に企図される。目的のポリペプチドがネイティブポリペプ
チドから最初に作製され得、次いで、上記のような適切なレポーター／タグに作動可能に
連結されることが理解される。

【0385】

本発明の核酸はまた、目的のポリペプチドをコードする核酸の構築を促進するために、
制限部位、複数のクローニング部位、プライマー結合部位、ライゲーション末端、組換え
部位などを含み得る。

【0386】

（ｂ．宿主細胞）
本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。適切な宿主
細胞としては、原核生物（例えば、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））ならびに真核生
物細胞（例えば、動物細胞（例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類、もしくは爬
虫類の細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシもしくはシロイヌナズナ細胞）、または
真菌細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞））が挙げられる。特定の実施形態に
おいて、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な任意の細胞が、宿主細胞と
して使用され得る。通常、動物宿主細胞株が使用される例としては、以下である：サル腎
臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−
７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３（「２９３」）
、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ＨＥＫ−２９
３Ｔ（「２９３Ｔ」）細胞；新生仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１
０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４２１６，（１９８０）；シリ
アンゴールデンハムスター細胞ＭＣＢ３９０１（ＡＴＣＣＣＲＬ−９５９５）；マウス
セルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５
１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリ
ザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（Ｈ
ＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）
；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺
細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ｈｅｐＧ２、ＨＢ８０
６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細
胞（Ｍａｔｈｅｒら，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ３８３：４４−６８（
１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５８）；およびマウスＬ細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１）。特定の実施形態において、メラニン保有細胞が使用される
。メラニン保有細胞は、下等脊椎動物に見出される皮膚細胞である。関連する材料および
方法は、米国特許第５，４６２，８５６号および同第６，０５１，３８６号の開示に従う
。これらの特許の開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される。さらなる
細胞株は、当業者に明らかであり、種々の細胞株が、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕ
ｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖ
ａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）から利用可能である。

【0387】

（Ｃ．候補化合物のスクリーニング）
（１．一般的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術）
Ｇタンパク質レセプターが活性になる場合、それは、Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ，Ｇ
ｓ，Ｇｉ，Ｇｚ，Ｇｏ）に結合して、ＧＴＰのＧタンパク質への結合を刺激する。次いで
、Ｇタンパク質は、ＧＴＰａｓｅとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰへとゆっくりと加水分解
する。これによって、レセプターは、通常の条件下で、脱活性化される。しかし、活性化
したレセプターは、ＧＤＰをＧＴＰへと変換し続ける。ＧＴＰの非加水分解性アナログで
ある［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、活性化されたレセプターを発現する膜への増強された結合
をモニタリングするために使用され得る。リガンドの存在下および非存在下で膜へのＧタ
ンパク質共役をモニタリングするために、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳが使用され得ることが報
告されている。とりわけ当業者に周知であり、利用可能であるモニタリングの例は、Ｔｒ
ａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉによって１９９５年に報告された。このアッセイの好
ましい使用は、候補化合物の初期スクリーニングのための使用である。なぜなら、この系
は、特定のＧタンパク質に関わらず、レセプターの細胞内ドメインと相互作用するあらゆ
るＧタンパク質共役レセプターに対して、一般的に適用可能だからである。

【0388】

（２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術）
一旦候補化合物が「一般的」Ｇタンパク質共役レセプターアッセイ（すなわち、アゴニ
ストもしくは逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を使用して同定され
た場合、いくつかの実施形態において、化合物がレセプター部位で相互作用することを確
認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「一般的」アッセイによって
同定される化合物はレセプターに結合していなくともよいが、代わりに、細胞内ドメイン
由来のＧタンパク質に「結合しない」だけでもよい。

【0389】

（Ｇｓ，ＧｚおよびＧｉ）
Ｇｓは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。Ｇｉ（およびＧｚおよびＧｏ）は、一
方で、アデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼは、ＡＴＰからｃＡＭＰ
への変換を触媒する。したがって、Ｇｓタンパク質に結合する活性化されたＧＰＣＲは、
ｃＡＭＰの細胞レベルの増加に関連する。一方、Ｇｉ（またはＧｚ，Ｇｏ）タンパク質に
結合する活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの細胞レベルの減少に関連する。一般的に、
「ＩｎｄｉｒｅｃｔＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＳｙｎａｐｔｉｃＴｒａｎｓｍｉ
ｓｓｉｏｎ」第８章，ＦｒｏｍＮｅｕｒｏｎＴｏＢｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏ
ｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を
参照のこと）。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物（例えば、逆アゴニ
スト）がレセプターに対する（すなわち、このような化合物は、ｃＡＭＰレベルを減少さ
せる）ものか否かを決定するために利用され得る。当該分野で公知のｃＡＭＰを測定する
ための種々のアプローチが、利用され得る。いくつかの実施形態において、好ましいアプ
ローチは、ＥＬＩＳＡベースの形式における抗ｃＡＭＰ抗体の使用に依存する。使用され
得る別の型のアッセイは、全細胞セカンドメッセンジャーレポーターシステムアッセイで
ある。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動す
る。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ反応性ＤＮＡ結合Ｇタンパク質、またはｃＡＭＰ反
応性エレメントと呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合してその遺伝子の発現を駆動
する転写因子（ＣＲＥＢ）への結合を促進することによって、遺伝子発現を駆動する。レ
ポーター遺伝子の前に複数のｃＡＭＰ反応性エレメントを含むプロモーターを有するレポ
ーターシステムが構築され得る（例えば、β−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ
）。したがって、活性化されたＧｓ結合レセプターは、次に遺伝子およびレポータータン
パク質の発現を活性化させるｃＡＭＰの蓄積を引き起こす。レポータータンパク質（例え
ば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼは、次いで、標準的な生化学的アッセイ
を使用して検出され得る（Ｃｈｅｎら１９９５）。

【0390】

（ＧｏおよびＧｑ）
ＧｑおよびＧｏは、酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関与する。これは次に、リン脂質
ＰＩＰ_２を加水分解し、２つの細胞内メッセンジャー（ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）
およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ_３））を放出する。ＩＰ_３の蓄積の増加
は、Ｇｑ関連およびＧｏ関連レセプターの活性化に関する。一般的に、「Ｉｎｄｉｒｅｃ
ｔＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＳｙｎａｐｔｉｃＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」，第
８章，ＦｒｏｍＮｅｕｒｏｎＴｏＢｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．
ら編，ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。Ｉ
Ｐ_３蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、Ｇｑ関連およびＧｏ関連レセプ
ターの逆アゴニストである（すなわち、このような化合物は、ＩＰ_３のレベルを減少させ
る）か否かを決定するために使用され得る。Ｇｑ関連レセプターはまた、ＡＰＩレポータ
ーアッセイを使用して調べられ得る。このアッセイにおいては、Ｇｑ依存性ホスホリパー
ゼＣは、ＡＰＩエレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こし、したがって、活性化され
たＧｑ関連レセプターは、このような遺伝子の発現の増加を証明し、それによってその逆
アゴニストは、このような発現の減少を証明し、そしてアゴニストは、このような発現の
増加を証明する。このような検出のための市販のアッセイが利用可能である。

【0391】

（３．ＧＰＣＲ融合タンパク質）
逆アゴニストもしくはアゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングに使
用するための、内因性の、構成的に活性なＧＰＣＲまたは非内因性の、構成的に活性化さ
れたＧＰＣＲの使用は、興味深いスクリーニングの課題を提供する。ここで、定義による
と、レセプターは、それに結合する内因性リガンドの非存在下でもなお活性である。した
がって、このような化合物が逆アゴニストもしくはアゴニストであり得るか、またはこの
ようなレセプターに何の影響も有さないか否かについて理解することを可能にするために
、例えば、候補化合物の存在下での非内因性レセプターと、その化合物の非存在下での非
内因性レセプターとを区別するため、いくつかの実施形態において、利用されるアプロー
チがそのような区別を増強し得ることが好ましい。いくつかの実施形態において、好まし
いアプローチは、ＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。

【0392】

一般的に、上記のアッセイ技術（および当業者に公知の他の技術）を使用して非内因性
ＧＰＣＲが構成的に活性化されたことが一旦決定されると、内因性ＧＰＣＲに結合する優
勢なＧタンパク質を決定することが可能である。Ｇタンパク質のＧＰＣＲへの結合は、評
価され得るシグナル伝達経路を提供する。いくつかの実施形態において、哺乳動物発現系
を使用してスクリーニングを行うことが好ましい。したがって、系は、その中に内因性Ｇ
タンパク質を有することが予測される。したがって、定義されるように、このような系に
おいては、非内因性の、構成的に活性化されたＧＰＣＲは、継続的にシグナル伝達される
。いくつかの実施形態において、このシグナルが、例えばレセプターに対する逆アゴニス
トの存在下で、特にスクリーニングの状況下で、レセプターが逆アゴニストと接触する場
合にそのレセプター間で、より容易に区別できる可能性が高まるように、増強されること
が好ましい。

【0393】

ＧＰＣＲ融合タンパク質は、非内因性ＧＰＣＲとのＧタンパク質の結合の効力を増強す
ることが意図される。ＧＰＣＲ融合タンパク質は、内因性の、構成的に活性なＧＰＣＲま
たは非内因性の、構成的に活性化されたＧＰＣＲのいずれかによってスクリーニングする
ために好まれ得る。なぜなら、このようなアプローチは、このようなスクリーニング技術
において生成されるシグナルを増加させるからである。これは、顕著な「信号対雑音」比
を促進するために重要である。このような明らかな比は、本明細書において開示される候
補化合物のスクリーニングのために好ましい。

【0394】

ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は、当業者の範囲内である。市販
の発現ベクターおよび発現系は、研究者の特定の必要性に適合し得る種々のアプローチを
提供する。このようなＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の構築における重要な基準としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列の
両方がフレーム内であること（好ましくは、内因性ＧＰＣＲについての配列は、Ｇタンパ
ク質配列の上流である）、およびＧＰＣＲの「停止」コドンが、ＧＰＣＲの発現の際にＧ
タンパク質もまた発現され得るように、削除もしくは置き換えられていること。ＧＰＣＲ
はＧタンパク質に直接的に結合され得るか、または２つの間にスペーサー残基が存在し得
る（好ましくは、約１２以下であるが、この数は当業者によって容易に確認され得る）。
便宜上、スペーサーを使用することが好ましい。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲ
融合タンパク質構築物の作製前に非内因性ＧＰＣＲに結合するＧタンパク質が同定される
ことが好ましい。同定されているＧタンパク質は数個しか存在しないため、Ｇタンパク質
の配列を含む構築物（すなわち、ユニバーサルＧタンパク質構築物、実施例５（ａ）参照
）が、その中への内因性ＧＰＣＲ配列の挿入のために利用可能であることが好ましい。こ
のことは、異なる配列を有する種々の異なる内因性ＧＰＣＲの大規模スクリーニングの状
況で、さらなる有効性を提供する。

【0395】

上記のように、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏに結合する活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの
形成を阻害することが予測され、これらの型のＧＰＣＲ負荷に基づくアッセイを作製する
［すなわち、ｃＡＭＰシグナルは、活性化により減少し、したがって、例えばアゴニスト
（これは、さらにこのシグナルを減少させる）負荷の、直接的同定を行わせる］。本明細
書において開示されるように、これらの型のレセプターに関して、存続可能なシクラーゼ
ベースのアッセイを確立する目的で、ＧＰＣＲの内因性Ｇタンパク質に基づかないＧＰＣ
Ｒ融合タンパク質を生成する可能性があることが確認された。したがって、例えば、内因
性Ｇｉ結合レセプターは、Ｇｓタンパク質に融合され得る。このような融合構築物は、発
現されると、内因性ＧＰＣＲが、例えば、「天然の」Ｇｉタンパク質よりもＧｓに結合す
ることを、「駆動」または「強制」し、その結果シクラーゼベースのアッセイが確立され
得る。したがって、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏ結合レセプターに関しては、いくつかの実施形
態において、ＧＰＣＲ融合タンパク質が使用されて、アッセイがアデニリルシクラーゼ活
性の検出に基づく場合、融合構築物はＧｓ（または、酵素アデニリルシクラーゼの形成を
刺激する等価なＧタンパク質）により確立されることが好ましい。

【0396】

【表2】

同等に有効であるのは、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚまたはＧｏタンパク質に融合されたＧｑタン
パク質を使用するＧタンパク質融合構築物である。いくつかの実施形態において、好まし
い融合構築物は、Ｇタンパク質のαサブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６アミノ酸が欠
失されており、ＧαｑのＣ末端における最後の５アミノ酸が目的のＧタンパク質のＧαの
対応するアミノ酸に置き換えられている、Ｇｑタンパク質によって達成され得る。例えば
、融合構築物は、Ｇｉタンパク質に融合されたＧｑ（６アミノ酸欠失）を有し得る。これ
によって「Ｇｑ／Ｇｉ融合構築物」が得られる。この融合構築物は、内因性Ｇｉ結合レセ
プターをその非内因性Ｇタンパク質（Ｇｑ）に結合させ、その結果セカンドメッセンジャ
ー（例えば、イノシトール三リン酸もしくはジアシルグリセロール）を、ｃＡＭＰ産生の
代わりに測定し得る。

【0397】

（標的Ｇｉ結合ＧＰＣＲとシグナルエンハンサーＧｓ結合ＧＰＣＲとの同時トランスフ
ェクション（ｃＡＭＰベースのアッセイ））
Ｇｉ結合レセプターは、アデニリルシクラーゼを阻害し、それによってｃＡＭＰ産生の
レベルを減少させることが知られている。このことは、ｃＡＭＰレベルの評価をやりがい
のあるものとさせ得る。特定の実施形態において、活性によって優先的にＧｉに結合する
レセプターの活性化の指標としてのｃＡＭＰの産生の減少の測定に有効な技術は、シグナ
ルエンハンサー（例えば、活性化によってＧｓに優先的に結合する非内因性の、構成的に
活性化されたレセプター（例えば、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ；下記参照））とＧｉ結合ＧＰ
ＣＲとの同時トランスフェクションによって達成され得る。明らかであるように、Ｇｓ結
合レセプターの活性化は、ｃＡＭＰの産生の増加に基づいて決定され得る。Ｇｉ結合レセ
プターの活性化は、ｃＡＭＰの産生の減少をもたらす。したがって、これらの「対照的」
影響を有利に活用する同時トランスフェクションアプローチが意図される。例えば、非内
因性の、構成的に活性化されたＧｓ結合レセプター（「シグナルエンハンサー」）と発現
ベクター単独との同時トランスフェクションは、ベースラインｃＡＭＰシグナルを提供す
る（すなわち、Ｇｉ結合レセプターはｃＡＭＰレベルを減少させるが、この「減少」は、
構成的に活性化されたＧｓ結合シグナルエンハンサーによって確立されたｃＡＭＰレベル
の実質的な増加と関連する）。従って、シグナルエンハンサーと「標的」レセプターとの
同時トランスフェクションによって、Ｇｉ結合標的レセプターの逆アゴニストは、測定さ
れたｃＡＭＰシグナルを増加させ、一方Ｇｉ結合標的レセプターのアゴニストは、このシ
グナルを減少させる。

【0398】

このアプローチを使用して直接的に同定される候補化合物は、これらがシグナル増強レ
セプターを標的しないことを確実にするために、独立に評価されるべきである（これは、
同時トランスフェクションされたレセプターに対してスクリーニングする前もしくは後に
行われ得る）。

【0399】

（Ｄ．医薬品化学）
（候補化合物）
当該分野で公知の任意の分子は、本発明のＧＰＣＲの活性を調節（増加もしくは減少）
するその能力について試験され得る。活性を調節する化合物を同定するため、候補化合物
は、レセプターを発現する細胞に直接的に提供され得る。

【0400】

本発明のこの実施形態は、レセプターの量もしくは活性を調節（例えば、阻害、アンタ
ゴナイズ、またはアゴナイズ）する分子の化学ライブラリをスクリーニングするために非
常に適している。化学ライブラリは、ペプチドライブラリ、ペプチド模倣物ライブラリ、
化学的に合成されたライブラリ、組換え（例えば、ファージディスプレイ）ライブラリ、
およびインビトロ翻訳ベースのライブラリ、他の非ペプチド性合成有機物ライブラリなど
であり得る。本発明のこの実施形態はまた、生物学的物質（血漿および組織抽出物が挙げ
られるが、これらに限定されない）を含む内因性候補化合物をスクリーニングするため、
および生物学的活性を有することが公知である内因性化合物のライブラをスクリーニング
するために非常に適している。

【0401】

いくつかの実施形態において、候補化合物の直接同定は、コンビナトリアルケミストリ
技術を介して生成される化合物とあわせて行われ、これによって、数千の化合物は、この
ような分析のために無作為に調製される。候補化合物は、化学ライブラリのメンバーであ
り得る。これは、任意の都合よい数の個別のメンバーを含み得る。メンバーは、例えば、
何十何百何千何百万の適切な化合物、例えば、ペプチド、ペプトイドおよび他のオリゴマ
ー化合物（環状もしくは直鎖状）、ならびにテンプレートベースの小分子（例えば、ベン
ゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、炭素環式化合物および多環式化合物（例えば
、ナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、炭水化物、ならびにア
ミノ酸誘導体）、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリル、ならびに複素環（例えば、トリジ
ン、インドール、チアゾリジンなど）である。引用した数および列挙した化合物の型は、
例示であって限定ではない。好ましい化学ライブラリは、低分子量かつ潜在的な治療因子
である化学化合物を含む。

【0402】

例示的な化学ライブラリは、数箇所の供給元（ＡｒＱｕｌｅ、Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬ
ａｂｓ、ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）から市販されている。い
くつかの場合、これらの化学ライブラリは、メンバー化合物が固定されている基材上のラ
イブラリの各メンバーの識別表示をコードし、したがって有効なモジュレーターである分
子の直接的かつ即時的な同定を可能にする、コンビナトリアル方法を使用して生成される
。したがって、多くのコンビナトリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上の位置
は、化合物の組成を特定する。また、一例では、単一のプレート位置が１〜２０の化学物
質を有し得、これらは目的の相互作用物を含むウェルへの投与によってスクリーニングさ
れ得る。したがって、調節が検出される場合、ずっと少数の相互作用対が活性の調節に関
してアッセイされ得る。このような方法によって、多くの候補分子がスクリーニングされ
得る。

【0403】

使用のための多くの多様なライブラリは、当該分野で公知であり、本発明に従って試験
される化合物を提供するために使用され得る。あるいは、ライブラリは、標準的な方法を
使用して構築され得る。さらに、より一般的には、構造的に制約された、有機物の多様な
（例えば、非ペプチド）ライブラリが、また使用され得る。例として、ベンゾジアゼピン
ライブラリが使用され得る（例えば、Ｂｕｎｉｎら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：４７０８−４７１２を参照のこと）。

【0404】

本発明の別の実施形態において、コンビナトリアルケミストリは、本発明のＧＰＣＲの
モジュレーターを同定するために使用され得る。コンビナトリアルケミストリは、数十万
の化合物を含むライブラリを作製し得る。化合物の多くは、構造的に類似している。ハイ
スループットスクリーニングプログラムは、これらの巨大なライブラリを、既知の標的に
対する親和性についてスクリーニングし得るが、より小規模であるが最大の化学的多様性
を提供するライブラリを実現する、新規のアプローチが開発された（例えば、Ｍａｔｔｅ
ｒ，１９９７，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４０
：１２１９−１２２９を参照のこと）。

【0405】

コンビナトリアルケミストリの１つの方法である親和性フィンガープリンティングは、
規定のタンパク質のパネルに対する結合親和性について個別の小分子のライブラリを試験
するために以前に使用されている。スクリーニングによって得られるフィンガープリント
は、目的の他のタンパク質もしくはレセプター（本発明においては、本発明のレセプター
）に対する個々のライブラリメンバーの親和性を予測するために使用される。フィンガー
プリントは、目的のタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られるフ
ィンガープリントと比較されて、ライブラリ化合物が同様に反応し得るか否かを予測する
。例えば、大きなライブラリ中の全てのリガンドを複合体もしくはタンパク質成分との相
互作用に関して試験するのではなく、その活性を有することが知られている他の化合物と
類似するフィンガープリントを有するリガンドのみが試験され得る。（例えば、Ｋａｕｖ
ａｒら，１９９５，ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ２：１０７−１１８
；Ｋａｕｖａｒ，１９９５，Ａｆｆｉｎｉｔｙｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．
８：２５−２８；ならびにＫａｕｖａｒ，Ｔｏｘｉｃ−ＣｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔ
ｉｏｎｂｙＰａｔｔｅｒｎＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉｎＮｅｗＦｒｏｎｔｉ
ｅｒｓｉｎＡｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｄ．Ｋｕｒｔｚ．
Ｌ．ＳｔａｎｋｅｒおよびＪ．Ｈ．Ｓｋｅｒｒｉｔｔ編，１９９５，ＡＯＡＣ：Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，３０５−３１２を参照のこと）。

【0406】

（モジュレーターとして同定される候補化合物）
一般的に、このようなスクリーニングの結果は、独特のコア構造を有する化合物である
。その後、これらの化合物は、好ましいコア構造の周りでさらなる化学的修飾に供されて
、その医薬特性をさらに増強され得る。このような技術は、当業者に公知であり、本特許
文献においては詳細を扱わない。

【0407】

特定の実施形態において、上記の同定されたモジュレーターは、バイオアベイラビリテ
ィーがある。薬物の経口バイオアベイラビリティーを予測するための、当業者に利用可能
な多くの計算機的アプローチが開発されている（Ｏｏｍｓら，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐ
ｈｙｓＡｃｔａ（２００２）１５８７：１１８−２５；Ｃｌａｒｋ＆Ｇｒｏｏｔｅ
ｎｈｕｉｓ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＤｅｖｅｌ（２００２）５：
３８２−９０；Ｃｈｅｎｇら，ＪＣｏｍｐｕｔＣｈｅｍ（２００２）２３：１７２−
８３；Ｎｏｒｉｎｄｅｒ＆Ｈａｅｂｅｒｌｅｉｎ，ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖ
Ｒｅｖ（２００２）５４：２９１−３１３；Ｍａｔｔｅｒら，ＣｏｍｂＣｈｅｍＨｉ
ｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｃｒｅｅｎ（２００１）４：４５３−７５；Ｐｏｄｌｏ
ｇａｒ＆Ｍｕｅｇｇｅ，ＣｕｒｒＴｏｐＭｅｄＣｈｅｍ（２００１）１：２５
７−７５；これらの各々の開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される）
。さらに、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）は、多数のグループによって、薬物分布の直接的
測定を得るために、成功裏に使用されている（薬物の経口投与後の哺乳動物の体における
（非ヒト霊長類の体およびヒトの体を含む）、経口バイオアベイラビリティーの評価を含
む）［Ｎｏｄａら，ＪＮｕｃｌＭｅｄ（２００３）４４：１０５−８；Ｇｕｌｙａｓ
ら，ＥｕｒＪＮｕｃｌＭｅｄＭｏｌＩｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３
１−８；Ｋａｎｅｒｖａら，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５
：７６−８１；これらの各々の開示は、本明細書によってその全体が参考として援用され
る］。また、実施例２５を含む下記参照。

【0408】

特定の実施形態において、上記のバイオアベイラビリティーのある同定されたモジュレ
ーターは、さらに、血液脳関門を横切ることができる。当業者に利用可能な多数の計算機
的アプローチが、血液脳関門の透過を予測するために開発されている（Ｏｏｍｓら，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ（２００２）１５８７：１１８−２５；Ｃｌａｒ
ｋ＆Ｇｒｏｏｔｅｎｈｕｉｓ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＤｅｖ
ｅｌ（２００２）５：３８２−９０；Ｃｈｅｎｇら，ＪＣｏｍｐｕｔＣｈｅｍ（２０
０２）２３：１７２−８３；Ｎｏｒｉｎｄｅｒ＆Ｈａｅｂｅｒｌｅｉｎ，ＡｄｖＤ
ｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ（２００２）５４：２９１−３１３；Ｍａｔｔｅｒら，Ｃｏ
ｍｂＣｈｅｍＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｃｒｅｅｎ（２００１）４：４５
３−７５；Ｐｏｄｌｏｇａｒ＆Ｍｕｅｇｇｅ，ＣｕｒｒＴｏｐＭｅｄＣｈｅｍ
（２００１）１：２５７−７５；これらの各々の開示は、本明細書によってその全体が参
考として援用される）。多くのインビトロ法が、薬物の血液脳関門透過性を予測するため
に開発されている［Ｌｏｈｍａｎｎら，ＪＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ（２００２）１０：
２６３−７６；Ｈａｎｓｅｎら，ＪＰｈａｒｍＢｉｏｍｅｄＡｎａｌ（２００２）
２７：９４５−５８；Ｏｔｉｓら，ＪＰｈａｒｍｏｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌＭｅｔｈ
ｏｄｓ（２００１）４５：７１−７；Ｄｅｈｏｕｃｋら，ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９
９０）５４：１７９８−８０１；これらの各々の開示は、本明細書によってその全体が参
考として援用される］。さらに、多くの方法が、血液脳関門を横切る薬物送達を増強する
ために開発されている［Ｓｃｈｅｒｒｍａｎｎ，ＶａｓｃｕｌＰｈａｒｍａｃｏｌ（２
００２）３８：３４９−５４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，ＡｒｃｈＮｅｕｒｏｌ（２００２
）５９：３５−４０；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｎｅｕｒｏｎ（２００２）３６：５５５−８
；これらの各々の開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。最後に
、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）は、多くのグループによって、哺乳動物の体（非ヒト霊長
類の体およびヒトの体を含む）における、薬物分布（脳内を含む）の直接測定を得るため
に成功裏に使用されている［Ｎｏｄａら，ＪＮｕｃｌＭｅｄ（２００３）４４：１０
５−８；Ｇｕｌｙａｓら，ＥｕｒＪＮｕｃｌＭｅｄＭｏｌＩｍａｇｉｎｇ（２
００２）２９：１０３１−８；Ｋａｎｅｒｖａら，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ
ｙ（１９９９）１４５：７６−８１；これらの各々の開示は、本明細書によってその全体
が参考として援用される］。また、実施例２６を含む下記参照。

【0409】

（Ｅ．本発明の化合物）
本発明の１つの局面は、式（ＩＩ）の化合物：

【0410】

【化3】

または、その薬学的に受容可能な塩に関し、
ここで、
Ｒ_１は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ_２は、２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−インダゾール−３−イル
基であるか；または、
Ｒ_１およびＲ_２は、それらが結合する窒素と一緒になって、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−
キノリン−１−イル基を形成し；そして
Ｒ_１０およびＲ_１１は、各々独立して、Ｈまたはハロゲンである。

【0411】

（Ｆ．本発明の化合物を生成するための合成方法）
（本発明の化合物の調製−一般的合成方法）
本発明の新規化合物は、種々の合成方法に従って容易に調製され得る。これらの合成方
法の全ては、当業者によく知られている。本発明の化合物の調製のために特定の方法とし
ては、下記のスキーム１〜３に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。

【0412】

新規の２−ピペリジン−４−イル−チアゾールの中間体（ＡＤ）は、スキーム１に示さ
れるように調製され得る。窒素のところで適切な保護基（すなわち、ＰＧ）によって保護
されたチオアミド（ＡＡ）は、３−ハロ−２−オキソ−プロピオン酸（ＡＢ）とのハンチ
様反応を介して環化され、カルボン酸のところで保護されて、ジ−保護化２−ピペリジン
−４−イル−チアゾール（ＡＣ）を生じる。一般的に、２つの保護基は異なっている。環
化のための適切な溶媒としては、例えば、アルコール（例えば、メタノール、エタノール
およびプロパノール）、低級ハロゲン化炭素（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン
およびクロロホルム）、ＤＭＦなどが挙げられる。環化のための反応温度は、およそ室温
からおよそ使用される溶媒の沸点までの範囲であり得る。一般的に、この温度範囲は、約
５０℃〜約９０℃である。

【0413】

チオアミド（ＡＡ）のための適切な保護基としては、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ
）、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）な
どが挙げられる。種々の方法が、チオアミド（ＡＡ）の窒素を保護するために使用され得
る。例えば、ｔ−ブチルカルバメート基は、種々の試薬（例えば、（ＢＯＣ）_２Ｏ）と適
切な塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨもしくはＭｅ_４ＮＯＨ）を使用して、適切な溶媒中
（ＴＨＦ、ＣＨ_３ＣＮ、ＤＭＦ、ＥｔＯＨ、ＭｅＯＨ、Ｈ_２Ｏ、もしくはそれらの混合物
）で、約０℃〜約５０℃の温度で導入され得る。

【0414】

３−ハロ−２−オキソ−プロピオン酸（ＡＢ）のための適切な保護基としては、アルキ
ルエステル（例えば、メチル、エチル、プロピルおよびｔ−ブチル）、置換メチルエステ
ル（例えば、メトキシメチル、メトキシエトキシメチルおよびベンジルオキシメチル）、
必要に応じて置換されたベンジルエステル（例えば、ベンジル、４−メトキシベンジル、
および２，６−ジメトキシベンジル）などが挙げられる。１つの特定の有用な保護化３−
ハロ−２−オキソ−プロピオン酸（ＡＢ）は、３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸エ
チルエステルであり、これはまた一般的に、エチルブロモピルベートとも称される。

【0415】

多岐に渡る合成的変換に適切な他の代表的な保護基は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，
ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第
３版，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９に開示されて
いる（この開示は、その全体が本明細書において参考として援用される）。

【0416】

便宜上、２−ピペリジン−４−イル−チアゾール（ＡＣ）における２つの保護基が選択
され、そして、１つの保護基は、他の保護基に実質的に影響することなく実質的に除去さ
れ得る。この型の方法は、直交保護（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）と
称される。１つの例としては、ＢＯＣ基により窒素を保護し、カルボン酸をメチルエステ
ルもしくはエチルエステルとして保護することが挙げられる。この例において、ＢＯＣ基
は、エステル基に実質的に影響することなく酸性条件下で除去され得る。あるいは、ＢＯ
Ｃ基は、塩基性条件下で実質的に加水分解されないので、エステルがＢＯＣ基に実質的に
影響することなく除去され得る。多くの直交保護スキームが当該分野で公知であり、本明
細書において適用され得る。

【0417】

その後、スキーム１に示されるように、２−ピペリジン−４−イル−チアゾール（ＡＣ
）のための窒素保護基は除去され（すなわち、脱保護され）、一方カルボン酸保護は実質
的に維持されて、一般的中間体（ＡＤ）を生じる。この場合、窒素がＢＯＣ基によって保
護される場合、酸、および必要に応じて適切な溶媒の存在下で、有効な切断が達成され得
る。適切な酸としては、ＨＣｌ（水性もしくは無水）、ＨＢｒ（水性もしくは無水）、Ｈ
_２ＳＯ_４、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられる。存在する場合
、適切な溶媒としては、エステル溶媒（例えば、酢酸エチル）、アルキルアルコール（例
えば、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール、ｎ−プロパノールおよびｎ−ブタノ
ール）、エーテル溶媒（例えば、テトラヒドロフランおよびジオキサン）など、ならびに
これらの混合物が挙げられる。必要に応じて、スカベンジャーが添加されて、遊離カチオ
ンを捕捉し得る。適切なスカベンジャーとしては、チオフェノール、アニソール、チオア
ニソール、チオクレゾール、クレゾール、硫化メチルなどが挙げられる。２−ピペリジン
−４−イル−チアゾール（ＡＣ）中の窒素の脱保護のための反応温度範囲は、約−２０℃
〜およそ使用される溶媒の沸点の範囲であり得る。一般的に、温度範囲は、約−１０℃〜
約５０℃である。

【0418】

【化4】

中間体（ＡＤ）は、スキーム２、方法Ａに示されるように、脱水縮合剤および塩基を有
するかもしくは有さない不活性溶媒の存在下でカルボン酸に結合されて、アミド（ＡＥ）
を提供する。適切な脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ・ＨＣｌ
）、ブロモ−ｔｒｉｓ−ピロリドン−ホスニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢｒｏＰ）
、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロ
ニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＡＴＵ）、１−シクロヘキシル−３−メチルポリスチレ
ン−カルボジイミドなどが挙げられる。適切な塩基としては、第四級アミン（例えば、Ｎ
，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、およびトリエチルアミン
）が挙げられる。適切な不活性溶媒としては、低級ハロゲン化炭素溶媒（好ましくは、ジ
クロロメタン、ジクロロエタン、およびクロロホルム）、エーテル溶媒（例えば、テトラ
ヒドロフランおよびジオキサン）、ニトリル溶媒（例えば、アセトニトリル）、アミド溶
媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）、
またはこれらの混合物が挙げられる。必要に応じて、上記結合反応において他の試薬が使
用され得、そしてこれらの試薬としては、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ
）、ＨＯＢＴ−６−カルボキサミドメチルポリスチレン、１−ヒドロキシ−７−アザベン
ゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）などが挙げられる。適切な反応温度は、約−２５℃〜約６０
℃、および約０℃〜約３５℃の範囲である。

【0419】

【化5】

あるいはアミド（ＡＥ）が、スキーム２、方法Ｂに示されるように、酸ハロゲン化物を
使用して、塩基および不活性溶媒の存在下で、中間体（ＡＤ）とのアミド化反応によって
得られ得る。適切な酸ハロゲン化物としては、酸塩化物もしくは酸臭化物が挙げられる。
適切な塩基としては、アルカリ金属炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム
）、アルカリ金属炭酸水素塩（例えば、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム）、
アルカリ水酸化物（例えば、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウム）、第四級アミン（
例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、およびＮ−メチルモ
ルホリン）、ならびに芳香族アミン（例えば、ピリジン、イミダゾール、およびポリ−（
４−ビニルピリジン））が挙げられる。適切な不活性溶媒としては、低級酸ハロゲン化物
溶媒（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、およびクロロホルム）、エーテル溶媒
（例えば、テトラヒドロフランおよびジオキサン）、アミド溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）、および芳香族溶媒（例えば
、トルエン、ベンゼン、およびピリジン）が挙げられる。適切な反応温度は、約−２５℃
〜約５５℃、好ましくは約−５℃〜約４０℃の範囲である。

【0420】

アミド（ＡＥ）中の保護された酸基は、除去されて、スキーム３に示されるように、対
応するカルボン酸を生じる。カルボン酸を脱保護するために適切な方法は、当業者に公知
である。例えば、アルキルエステル（例えば、メチル、エチル、およびｎ−プロピル）は
、塩基および適切な溶媒の存在下での加水分解を介して、カルボン酸に変換され得る。適
切な塩基としては、アルカリ金属炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム）
、アルカリ金属炭酸水素塩（例えば、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム）、お
よびアルカリ水酸化物（例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウ
ム）が挙げられる。脱保護のための適切な溶媒としては、アルキルアルコール（例えば、
メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール、ｎ−プロパノールおよびｎ−ブタノール）
、エーテル溶媒（例えば、テトラヒドロフランおよびジオキサン）など、ならびにこれら
の混合物が挙げられ、好ましくは、加水分解は、Ｈ_２Ｏの存在下で行われる。アミド（Ａ
Ｅ）中の酸基の脱保護のための反応温度は、およそ室温〜およそ使用される溶媒の沸点の
範囲であり得る。一般的に、温度範囲は、約５０℃〜約９０℃である。エステルのための
他の脱保護法および他のさらなる適切な保護基は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，Ｐｒｏ
ｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９（上記）に記載され
ている。カルボン酸（ＡＦ）は、メチル−（２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ
−２Ｈ−インダゾール−３−イル）−アミンまたは１，２，３，４−テトラヒドロ−キノ
リンのいずれかに結合されて、式（ＡＧ）および式（ＡＨ）の化合物をそれぞれ生じる。
一般的に、結合は、脱水縮合剤および塩基を有するかもしくは有さない不活性溶媒の存在
下で実行され得るか、または塩基および不活性溶媒の存在下で、カルボン酸（ＡＦ）から
生成される酸ハロゲン化物を使用するアミド化反応によって実行され得る。各々の方法は
、上記スキーム２に記載されるとおりである。

【0421】

【化6】

本発明のいくつかの実施形態は、以下に示されるような表１に例示される化合物を包含
する。

【0422】

【表3】

（Ｇ．薬学的組成物）
本発明は、処置（または予防）を必要とする個体に、治療有効量の本発明のモジュレーターを投与することによる処置（および予防）方法を提供する［また、例えばＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１（２００２年８月２９日にＷＯ０２／０６６５０５として公開）を参照のこと；これらの各々の開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。好ましい局面において、上記モジュレーターは、アゴニストである、好ましい局面において、上記モジュレーターは、実質的に精製されている。上記個体は、好ましくは、動物であり（牝ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウスなどのような動物が挙げられるが、これらに限定されない）、好ましくは、哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。

【0423】

本発明のモジュレーターは、非ヒト動物［下記の実施例を参照のこと］および／または
ヒトに、単独で、または薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物中（ここで、これら
は、当業者に公知の適切なキャリアもしくは賦形剤技術と混合されている）において、投
与され得る。適切な薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に利用可能である。例えば、
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版
，１９８０，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，（Ｏｓｌｏら編）を参照のこと
。

【0424】

次いで、薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物が、治療有効用量で提供される。
治療有効用量とは、本明細書において記載される方法によって、限定ではなく例証的に決
定されるような、障害の症状または生理学的状態の予防または改善をもたらすに十分なモ
ジュレーターの量を指す。ここで、障害の症状または生理学的状態の予防または改善とし
ては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血中グルコース濃度の低下、特定の
代謝障害（例えば、インスリン抵抗性、グルコース寛容減損および糖尿病）の予防または
処置、ならびに、上昇した血中グルコース濃度の合併症（アテローム性動脈硬化症、心臓
疾患、発作、高血圧症および末梢血管疾患）の予防または処置。

【0425】

本発明のモジュレーターが単独または他の薬学的もしくは生理学的に受容可能な化合物
と組み合わせて提供され得ることが、明確に考慮される。本発明の障害を処置するための
他の化合物は、当該分野で現在周知である（ここで本発明の障害を処置としては、血中グ
ルコース濃度の低下、特定の代謝障害（例えば、インスリン抵抗性、グルコース寛容減損
および糖尿病）の予防または処置、ならびに、上昇した血中グルコース濃度の合併症（ア
テローム性動脈硬化症、心臓疾患、発作、高血圧症および末梢血管疾患）の予防または処
置が挙げられるが、これらに限定されない）。本発明の１つの局面は、本明細書において
開示される実施形態に従う使用を包含し、さらに以下からなる群より選択される１つ以上
の因子を包含する：スルホニル尿素（例えば、グリベンクラミド、グリピジド、グリクラ
ジド、グリメピリド）、メグリチニド（例えば、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ
）、ナテグリニド）、ビグアナイド（例えば、メトホルミン）、α−グルコシダーゼイン
ヒビター（例えば、アカルボース、エパルレスタット、ミグリトール、ボグリボース）、
チザオリジンジオン（ｔｈｉｚａｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）（例えば、ロシグリタゾン
（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン）、インスリンアナログ（例えば、イ
ンスリンリスプロ、インスリンアスパルト（ａｓｐａｒｔ）、インスリングラルギン（ｇ
ｌａｒｇｉｎｅ））、クロミウムピコリネート／ビオチン、および生物学的因子（例えば
、アディポネクチンもしくはそのＣ末端球状ドメインを含むフラグメント、またはアディ
ポネクチンもしくはそのフラグメントのマルチマー、またはアディポネクチンレセプター
ＡｄｉｐｏＲ１もしくはＡｄｉｐｏＲ２のアゴニスト（好ましくは、このアゴニストは、
経口的にバイオアベイラビリティーがある））。さらに、本発明のモジュレーター（例え
ば、本発明のアゴニストおよび部分アゴニスト）が、単独またはホスホジエステラーゼ（
ＰＤＥ）インヒビター（４型ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ４）に選択的なインヒビター
（例えば、ロフルミラスト（ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ））；ＰＤＥ４Ｂに選択的なインヒ
ビター；およびＰＤＥ４Ｂ２に選択的なインヒビターを含む）と組み合わせて提供され得
ることが、明らかに企図される。

【0426】

特定の実施形態において、代謝障害は、グルコース寛容減損、インスリン抵抗性、高イ
ンスリン血症、および糖尿病からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、
糖尿病は、１型糖尿病である。特定の好ましい実施形態において、糖尿病は、２型糖尿病
である。特定の実施形態において、代謝障害は、糖尿病である。特定の実施形態において
、代謝障害は、１型糖尿病である。特定の実施形態において、代謝障害は、２型糖尿病で
ある。特定の実施形態において、代謝障害は、グルコース寛容減損である。特定の実施形
態において、代謝障害は、インスリン抵抗性である。特定の実施形態において、代謝障害
は、高インスリン血症である。特定の実施形態において、代謝障害は、個体における上昇
した血中グルコース濃度に関連する。

【0427】

特定の実施形態において、上昇した血中グルコース濃度の合併症は、以下からなる群よ
り選択される：症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心臓疾患、高血
圧症、発作、ニューロパシー、網膜症、腎症、および末梢血管疾患。心臓疾患としては、
心不全、冠動脈不全、冠動脈疾患、および高血圧が挙げられるが、これらに限定されない
。特定の実施形態において、合併症は、症候群Ｘである。特定の実施形態において、合併
症は、アテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態において、合併症は、アテローム
性疾患である。特定の実施形態において、合併症は、心臓疾患である。特定の実施形態に
おいて、合併症は、心不全である。特定の実施形態において、合併症は、冠動脈不全であ
る。特定の実施形態において、合併症は、冠動脈疾患である。特定の実施形態において、
合併症は、高血圧である。特定の実施形態において、合併症は、高血圧症である。特定の
実施形態において、合併症は、発作である。特定の実施形態において、合併症は、ニュー
ロパシーである。特定の実施形態において、合併症は、網膜症である。特定の実施形態に
おいて、合併症は、腎症である。特定の実施形態において、合併症は、末梢血管疾患であ
る。特定の実施形態において、合併症は、多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実施形態に
おいて、合併症は、高脂血症である。

【0428】

（投与経路）
適切な投与経路としては、当該分野で公知の方法を使用する、経口投与、経鼻投与、直
腸投与、経粘膜投与、経皮投与または腸管投与、非経口送達（筋肉内注射、皮下注射、髄
内注射）、ならびに髄腔内注入、直接心室内注入、静脈内注入、腹腔内注入、鼻腔内注入
、肺内注入（吸入）または眼内注入が挙げられる。他の特定の好ましい投与経路は、エア
ロゾルおよび貯蔵（ｄｅｐｏｔ）処方である。本発明の医薬の徐放性処方物（特に貯蔵）
は、明確に企図される。特定の実施形態において、投与経路は、経口である。

【0429】

（組成物／処方物）
本発明に従う使用のための薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物および医薬は、
１つ以上の生理学的に受容可能なキャリア（賦形剤および補助剤を包含する）を使用して
、従来の様式で処方され得る。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。

【0430】

本明細書において記載される特定の医薬は、薬学的もしくは生理学的に受容可能なキャ
リアおよび少なくとも１種の本発明のモジュレーターを含む。注射のためには、本発明の
薬剤は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス液、リンゲ
ル液、または生理食塩水緩衝液（例えば、リン酸もしくは重炭酸緩衝液））中に処方され
得る。経粘膜投与のためには、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が処方物中に使用され
得る。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。

【0431】

経口摂取され得る薬学的もしくは生理学的に受容可能な調製物としては、ゼラチンから
作製される押し込みばめカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑化剤（例えば、グリセロ
ールもしくはソルビトール）から作製される軟性の封入カプセルが挙げられる。押し込み
ばめカプセルは、充填剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）および／
または滑沢剤（例えば、滑石もしくはステアリン酸マグネシウム）、ならびに必要に応じ
て安定剤との混合物中に、活性成分を含み得る。軟性カプセルにおいて、活性化合物は、
適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）中に
溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与のための全ての処方
物は、このような投与に適切な投薬中にあるはずである。

【0432】

口腔投与のためには、組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態を
取り得る。

【0433】

吸入投与のためには、本発明に従う使用のための化合物は、噴霧器用の加圧式包装から
の適切なガス噴霧剤（例えば、二酸化炭素）を使用したエアロゾルスプレー提示の形態で
、従来どおりに送達される。加圧式エアロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するため
のバルブを提供することによって決定され得る。吸入器もしくは注入器に使用するための
、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物と適切な粉末ベース（例え
ば、ラクトースもしくはデンプン）との粉末ミックスを含有するように処方され得る。

【0434】

化合物は、注入（例えば、ボーラス注射または持続的注入）による非経口投与のために
処方され得る。注入のための処方物は、例えば、アンプル用、もしくは保存料を添加され
た複数用量容器用の、単位投薬で提示され得る。この組成物は、水性ビヒクル中の懸濁液
、溶液、または乳濁液のような形態を取り得、そして懸濁剤、安定剤、および／または分
散剤のような処方剤を含み得る。

【0435】

非経口投与のための薬学的もしくは生理学的に受容可能な処方物としては、水溶性形態
の活性化合物の水溶液が挙げられる。水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質（例
えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含
み得る。必要に応じて、懸濁液はまた、適切な安定剤または化合物の安定性を増加させる
因子を含み、高濃度の溶液の調製を可能にし得る。

【0436】

あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル（無菌の発熱物質非含有水）と構成
するための、粉末または凍結乾燥形態であり得る。

【0437】

これまでに記載された処方物に加えて、化合物はまた、貯蔵調製物として処方され得る
。このような長期作用処方物は、埋め込み（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内
注射によって投与され得る。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマー材料または
疎水性材料を用いて、例えば、受容可能な油中の乳濁液としてか、またはイオン交換樹脂
としてか、または溶解しにくい誘導体（例えば、溶解しにくい可溶性の塩）として、処方
され得る。

【0438】

特定の実施形態において、化合物は、制御放出系を介して送達され得る。１つの実施形
態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，Ｃ
ＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａ
ｌｄら，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋら，１９８９
，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−５７９）。別の実施形態において、ポリ
マー材料が使用され得る（ＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ編，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，
ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４；ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇ
Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，ＤｒｕｇＰｒｏｄｕｃｔＤｅｓｉｇｎａｎｄ
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ編，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒ
ｋ，１９８４；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ
．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙら．，１９８５，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ
．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：
８５８−８６３）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
９：１５２７−１５３３）による概説において考察される。

【0439】

さらに、化合物は、徐放系（例えば、治療剤を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過
性マトリックス）を使用して送達され得る。種々の徐放性材料が確立されており、当業者
に周知である。徐放性カプセルは、その化学的性質に依存して、数週間〜１００日以上ま
で化合物を放出する。

【0440】

治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、モジュレーター安定化のため
のさらなる方法が利用され得る。

【0441】

薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物はまた、適切な固相またはゲル相のキャリ
アまたは賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシ
ウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリ
マー（例えば、ポリエチレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0442】

（有効投薬量）
本発明における使用に適切な薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物としては、活
性成分が、それらの意図される目的を達成するための有効量で含有されている組成物が挙
げられる。さらに具体的には、治療有効量は、処置されるべき被験体の現存する症状の発
生を予防するか、またはその症状を改善するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、
特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、当業者の能力の範囲内である
。

【0443】

本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイ
から最初に推定され得る。例えば、用量は、動物モデルにおいて、細胞のグルコース取り
込みを刺激すること、特定の代謝障害を予防もしくは処置すること、または上昇したグル
コース濃度の合併症を予防もしくは処置することが示される、濃度点または濃度範囲を含
むか、または包含する、循環濃度範囲を達成するように処方され得る［インビトロアッセ
イおよびインビボ動物モデルについての以下の実施例を参照のこと］。このような情報は
、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。

【0444】

治療有効用量とは、患者の症状の改善をもたらす化合物の量をいう。このような化合物
の毒性および治療効力は、細胞培養物または実験動物における、例えば、ＬＤ_５０（試験
集団の５０％が致死となる用量）およびＥＤ_５０（試験集団の５０％における治療有効用
量）を決定するための、標準的薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間
の用量比は、治療指数であり、これはＬＤ_５０とＥＤ_５０との間の比として表現され得る
。高い治療指数を示す化合物が好ましい。

【0445】

これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用の
ための投薬量範囲を処方するのに使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましく
は、ＥＤ_５０を含む、毒性がほとんどないか全くない循環濃度の範囲内にある。投薬量は
、利用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。
正確な処方、投与経路および投薬量は、個々の医師によって、患者の状態を考慮して選択
され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら，１９７５，「ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ
ｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，第１章を参照のこと）。

【0446】

投薬量および投薬間隔は、特定の状況に依存して、個別に調節されて、本発明の障害を
予防または処置するのに十分な、活性化合物の血漿レベルを提供し得る。これらの効果を
達成するのに必要な投薬量は、個別の特徴および投与経路に依存する。

【0447】

投薬間隔はまた、最小有効濃度に関する値を使用して決定され得る。化合物は、時間の
１０〜９０％の間、好ましくは３０〜９９％の間、そして最も好ましくは５０〜９０％の
間、最小有効濃度を超える血漿レベルを維持するレジメンを使用して投与されるべきであ
る。局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効局所濃度は、血漿濃度に関連しな
くともよい。

【0448】

投与される組成物の量は、当然ながら、処置される被験体、被験体の体重、苦痛の重傷
度、投与様式、および処方医の判断に依存する。

【0449】

所望の結果を達成するための毎日もしくは定期的な基本に基づいて投与され得る本発明
のモジュレーターの量についての好ましい投薬量範囲は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重
である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい
投薬量範囲は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１
〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重である。当然ながら、これらの毎日投薬量は、一日の過程の間に
定期的に少量で送達または投与され得る。これらの投薬範囲は、好ましい範囲というだけ
であり、本発明の限定を意味しないことに注意すること。上記所望の結果としては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない：血中グルコース濃度の低下、特定の代謝障害（
例えば、インスリン抵抗性、グルコース寛容減損、および糖尿病）の予防もしくは処置、
ならびに上昇した血中グルコース濃度の合併症（例えば、アテローム性動脈硬化症、心臓
疾患、発作、高血圧症、および末梢血管疾患）の予防もしくは処置。

【0450】

（Ｈ．処置方法）
本発明は、とりわけ、以下に挙げられる方法に関するが、これらに限定されない：血中
グルコース濃度を低下させる方法、特定の代謝障害（例えば、インスリン抵抗性および糖
尿病）を予防もしくは処置する方法、ならびに上昇した血中グルコース濃度の合併症（例
えば、アテローム性動脈硬化症、心臓疾患、発作、高血圧症、および末梢血管疾患）を予
防もしくは処置する方法。上記方法は、このような処置を必要とする個体に本発明のモジ
ュレーターを提供する工程を包含する。特定の実施形態において、モジュレーターは、ア
ゴニストである。いくつかの実施形態において、モジュレーターは、経口的にバイオアベ
イラビリティーがある。いくつかの実施形態において、この経口的にバイオアベイラビリ
ティーがあるモジュレーターは、さらに血液脳関門を横切ることができる。特定の実施形
態において、モジュレーターは、薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物中において
個体に提供される。特定の実施形態において、モジュレーターは、薬学的組成物中におい
て個体に提供される。特定の実施形態において、モジュレーターは、生理学的に受容可能
な組成物中において個体に提供される。特定の実施形態において、モジュレーターは、経
口的に摂取される薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物中において個体に提供され
る。特定の実施形態において、上記個体は、非ヒト哺乳動物である。特定の実施形態にお
いて、上記個体は、哺乳動物である。特定の実施形態において、上記個体または哺乳動物
は、ヒトである。

【0451】

【0452】

特定の実施形態において、上昇した血中グルコース濃度の合併症は、以下からなる群よ
り選択される：症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心臓疾患、高血
圧症、発作、ニューロパシー、網膜症、腎症、および末梢血管疾患。心臓疾患としては、
心不全、冠動脈不全、冠動脈疾患、および高血圧が挙げられるが、これらに限定されない
。特定の実施形態において、合併症は、症候群Ｘである。特定の実施形態において、合併
症は、アテローム性動脈硬化症である。特定の実施形態において、合併症は、アテローム
性疾患である。特定の実施形態において、合併症は、心臓疾患である。特定の実施形態に
おいて、合併症は、心不全である。特定の実施形態において、合併症は、冠動脈不全であ
る。特定の実施形態において、合併症は、冠動脈疾患である。特定の実施形態において、
合併症は、高血圧である。特定の実施形態において、合併症は、高血圧症である。特定の
実施形態において、合併症は、発作である。特定の実施形態において、合併症は、ニュー
ロパシーである。特定の実施形態において、合併症は、網膜症である。特定の実施形態に
おいて、合併症は、ニューロパシーである。特定の実施形態において、合併症は、末梢血
管疾患である。特定の実施形態において合併症は、多嚢胞性卵巣症候群である。特定の実
施形態において、合併症は、高脂血症である。

【0453】

（Ｉ．他の有用性）
ＲＵＰ４３レセプター機能を調節（すなわち、増加、減少またはブロック）する因子は
、候補化合物とＲＵＰ４３レセプターとを接触させ、そしてＲＵＰ４３レセプター機能に
対する候補化合物の効果を決定することによって同定され得る。ＲＵＰ４３レセプターの
機能を調節する化合物の選択性は、ＲＵＰ４３レセプターに対するその効果を他のＧタン
パク質共役レセプターに対するその効果と比較することによって、評価され得る。例であ
り限定ではなく、内因性ＲＵＰ４３レセプターのモジュレーターは、同じ種に由来する１
つ以上の他の内因性Ｇタンパク質共役レセプターと比較して、選択的であることが示され
得る。例であり限定ではなく、内因性ＲＵＰ４３レセプターのアゴニストは、このアゴニ
ストの内因性ＲＵＰ４３レセプターに対するＥＣ５０が、同じ種に由来する１つ以上の他
の内因性Ｇタンパク質共役レセプターに対するアゴニストのＥＣ５０に対して少なくとも
１００倍低い場合、選択的ＲＵＰ４３アゴニストであることが示され得る。ＲＵＰ４３レ
セプター機能を調節する化合物の同定に続いて、このような候補化合物は、それらの活性
を確認もしくは定量するために、他のアッセイ（インビトロモデルが挙げられるが、これ
らに限定されない）においてさらに試験され得る。ＲＵＰ４３レセプター機能のモジュレ
ーターは、正常または異常なＲＵＰ４３レセプター機能が関与する疾患および生理学的状
態の処置において、治療上有用である。

【0454】

ＲＵＰ４３レセプターのリガンドである因子は、候補化合物をＲＵＰ４３レセプターと
接触させ、そして候補化合物がＲＵＰ４３レセプターに結合するか否かを決定することに
よって同定され得る。ＲＵＰ４３レセプターに結合する化合物の選択性は、ＲＵＰ４３レ
セプターに対するその結合を、他のレセプターに対するその結合と比較することによって
、評価され得る。例であり限定ではなく、内因性ＲＵＰ４３レセプターのリガンドは、同
じ種由来の1つ以上の他の内因性Ｇタンパク質共役レセプターと比較して、選択的である
ことが示され得る。ＲＵＰ４３レセプター機能のモジュレーターであるリガンドは、正常
または異常なＲＵＰ４３レセプター機能が関与する疾患および生理学的状態の処置におい
て、治療上有用である。

【0455】

本発明はまた、モジュレーターまたはＲＵＰ４３レセプターのリガンドとして同定され
た、本発明の化合物の放射性同位体標識バージョンに関する。この放射性同位体標識バー
ジョンは、組織サンプル（ヒトを含む）中のＲＵＰ４３レセプターを局在化および定量化
するため、ならびに放射性同位体標識化合物の結合阻害によってＲＵＰ４３レセプターリ
ガンドを同定するため、放射線画像化だけでなく、インビトロとインビボとの両方におけ
るアッセイにおいても有用である。このような放射性同位体標識化合物を含む新規のＲＵ
Ｐ４３レセプターアッセイを開発することは、本発明のさらなる目的である。

【0456】

本発明は、モジュレーターまたはＲＵＰ４３レセプターのリガンドとして同定された、
本発明の化合物の放射性同位体標識バージョンを包含する。

【0457】

本発明はまた、ＲＵＰ４３レセプターに結合したリガンドを検出するために有用な、試
験リガンドの放射性同位体標識バージョンに関する。いくつかの実施形態において、本発
明は、ＲＵＰ４３レセプターに結合したリガンドを検出するために有用な上記放射性標識
試験リガンドのライブラリを、明確に企図する。特定の実施形態において、上記ライブラ
リは、少なくとも約１０個、少なくとも約１０^２個、少なくとも約１０^３個、少なくとも
約１０^５個または少なくとも約１０^６個の上記放射性標識試験化合物を含む。このような
放射性同位体標識試験リガンドを含む新規のＲＵＰ４３レセプターアッセイを開発するこ
とは、本発明のさらなる目的である。

【0458】

いくつかの実施形態において、化合物の放射性同位体標識バージョンは、１つ以上の原
子が、天然に代表的に見出される（すなわち、天然に存在する）原子量もしくは質量数と
異なる原子量もしくは質量数を有する原子によって置き換えられているか置換されている
という事実を除いて、上記化合物と同一である。本発明の化合物に取り込まれ得る適切な
放射性核種としては、^２Ｈ（ジュウテリウム）、^３Ｈ（トリチウム）、^１１Ｃ、^１３Ｃ、
^１４Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｎ、^１５Ｏ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^１８Ｆ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^８２Ｂ
ｒ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉおよび^１３１Ｉが挙
げられるが、これらに限定されない。本発明の放射性標識化合物に取り込まれる放射性核
種は、放射性標識化合物の特定の用途に依存する。例えば、インビトロＲＵＰ４３レセプ
ター標識および競合アッセイに関して、^３Ｈ、^１４Ｃ、^８２Ｂｒ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、
^３５Ｓを取り込む化合物が、一般的に最も有用である。放射線画像化用途のためには、^１
^１Ｃ、^１８Ｆ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒまたは^７
^７Ｂｒが、一般的に最も有用である。いくつかの実施形態において、放射性核種は、^３Ｈ
、^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓおよび^８２Ｂｒから
なる群より選択される。

【0459】

放射性同位体を有機化合物へ取り込むための合成方法は、本発明の化合物に対して利用
可能であり、当該分野で周知である。これらの合成方法（例えば、活性レベルのトリチウ
ムを標的分子に取り込むこと）は、以下のとおりである：
Ａ．トリチウムガスによる触媒的還元−この手順は、通常、高い比放射能の生成物を生じ
、ハロゲン化されているかもしくは不飽和の前駆物質を必要とする。
Ｂ．水素化ホウ素ナトリウム［^３Ｈ］による還元−この手順は、より費用がかからず、還
元性の官能基（例えば、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなど）を含有する前駆
体を必要とする。
Ｃ．水素化アルミニウムリチウム［^３Ｈ］による還元−この手順は、ほぼ理論どおりの比
放射能にある生成物を提供する。これはまた、還元性官能基（例えば、アルデヒド、ケト
ン、ラクトン、エステルなど）を含有する前駆体を必要とする。
Ｄ．トリチウムガス暴露標識−この手順は、適切な触媒の存在下で、交換可能なプロトン
を含有する前駆体をトリチウムガスに暴露する工程を包含する。
Ｅ．Ｎ−ヨウ化メチル［^３Ｈ］を使用するメチル化−この手順は、高い比放射能のヨウ化
メチル（^３Ｈ）で適切な前駆体を処理することによって、Ｏ−メチルまたはＮ−メチル（
^３Ｈ）生成物を調製するために通常利用される。この方法は、一般的に、高い比放射能（
例えば、約７０〜９０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を可能にする。

【0460】

活性レベルの^１２５Ｉを標的分子に取り込むための合成方法は、以下を包含する：
Ａ．サンドマイヤー反応および類似の反応−この手順は、アリールもしくはヘテロアリー
ルアミンをジアゾニウム塩（例えば、テトラフルオロホウ酸塩）に変換し、次いでＮａ^１
^２５Ｉを使用して^１２５Ｉ標識化合物に変換する。代表的方法は、Ｚｈｕ，Ｄ．−Ｇ．お
よび共同研究者（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８）によって報
告された。
Ｂ．フェノールのオルト^１２５ヨウ素化−この手順は、Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｔ．Ｌ．および
共同研究者（Ｊ．ＬａｂｅｌｅｄＣｏｍｐｄＲａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９９，４２
，Ｓ２６４−Ｓ２６６）に報告されるように、フェノールのオルト位における^１２５Ｉの
取り込みを可能にする。
Ｃ．^１２５Ｉ−による臭化アリールおよび臭化ヘテロアリールの交換−この方法は、一般
的に２工程プロセスである。第一の工程は、臭化アリールもしくは臭化ヘテロアリールの
、対応するトリアルキルスズ中間体への変換である。この変換には、トリアルキルスズハ
ライドもしくはヘキサアルキル二スズ［例えば、（ＣＨ_３）_３ＳｎＳｎ（ＣＨ_３）_３］の
存在下で、例えば、Ｐｄに触媒される反応［すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ_３Ｐ）_４］を使用する
か、またはアリールリチウムもしくはヘテロアリールリチウムを介する。代表的手順は、
Ｂａｓ，Ｍ．−Ｄ．および共同研究者（Ｊ．ＬａｂｅｌｅｄＣｏｍｐｄＲａｄｉｏｐ
ｈａｒｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２）によって報告された。

【0461】

いくつかの実施形態において、化合物の放射性同位体標識バージョンは、上記化合物と
同一である（放射性核種を含有する１つ以上の置換基の付加を除く）。いくつかのさらな
る実施形態において、化合物はポリペプチドである。いくつかのさらなる実施形態におい
て、化合物は、抗体またはそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかのさらなる実
施形態において、上記抗体は、モノクローナルである。適切な上記放射性核種としては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：^２Ｈ（ジュウテリウム）、^３Ｈ（トリチウ
ム）、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｎ、^１５Ｏ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^１８Ｆ、^３
^５Ｓ、^３６Ｃｌ、^８２Ｂｒ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２
^５Ｉおよび^１３１Ｉ。本発明の放射性標識化合物に取り込まれる放射性核種は、その放射
線標識化合物の特定の用途に依存する。例えば、インビトロＲＵＰ４３レセプター標識お
よび競合アッセイのためには、^３Ｈ、^１４Ｃ、^８２Ｂｒ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓを
取り込む化合物が一般的に最も有用である。放射性画像化用途のためには、^１１Ｃ、^１８
Ｆ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒもしくは^７７Ｂｒが
一般的に最も有用である。いくつかの実施形態において、放射性核種は、^３Ｈ、^１１Ｃ、
^１８Ｆ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓおよび^８２Ｂｒからなる群より
選択される。

【0462】

放射性核種を含む１つ以上の置換基を付加するための方法は、当業者の技術範囲内であ
り、そしてこれらの方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：酵素法
による放射性同位体ヨウ素の付加［ＭａｒｃｈａｌｏｎｉｃＪＪ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌＪｏｕｒｎａｌ（１９６９）１１３：２９９−３０５；ＴｈｏｒｅｌｌＪＩおよ
びＪｏｈａｎｓｓｏｎＢＧ，ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡ
ｃｔａ（１９６９）２５１：３６３−９；これらの各々の開示は、本明細書によってその
全体が参考として援用される］、ならびに、またはクロラミン−Ｔ／ヨードゲン／ヨード
ビーズ法（Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ／Ｉｏｄｏｇｅｎ／Ｉｏｄｏｂｅａｄｍｅｔｈｏ
ｄ）による［ＨｕｎｔｅｒＷＭおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄＦＣ，Ｎａｔｕｒｅ（１９
６２）１９４：４９５−６；ＧｒｅｅｎｗｏｏｄＦＣら，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪ
ｏｕｒｎａｌ（１９６３）８９：１１４−２３；これらの各々の開示は、本明細書によっ
てその全体が参考として援用される］。

【0463】

開示されたレセプターおよび方法の他の用途は、特に、本特許文献の精査に基づいて、
当業者に明らかになる。

【実施例】

【0464】

以下の実施例は、本発明の説明の目的のために提示され、限定のためではない。特定の
核酸配列およびアミノ酸配列が本明細書において開示されるが、当業者は、これらの配列
に軽微な改変を行いながら、下記の報告と同一または実質的に類似の結果を達成する能力
があると考えられる。このような改変アプローチは、本開示の範囲内であるとみなされる
。

【0465】

以下の実施例は、説明の目的ために提供され、限定の手段としては提供されない。当業
者は、本明細書における開示に基づいて、等価なアッセイおよび方法を設計することがで
きる。これら全ては、本発明の一部を形成する。

【0466】

本発明の主題に関連し、当業者に周知である組換えＤＮＡ技術は、例えば、以下に見出
され得る：ＭａｎｉａｔｉｓＴら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ；米国特許第６，３９９，３７３号；およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／Ｉ
Ｂ０２／０１４６１号（ＷＯ０２／０６６５０５として、２００２年８月２９日に公開
）；これらの各々の開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される。

【0467】

（実施例１）
（ヒトＧＰＣＲの全長クローニング）
（内因性ヒトＲＵＰ４３（配列番号１および２））
全長内因性ヒトＲＵＰ４３（ＧＰＲ１３１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録
番号ＮＭ＿１７０６９９）をコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書において記載
されるようにクローニングされ得る。配列番号１は、内因性ヒトＲＵＰ４３（ＧＰＲ１３
１）ポリヌクレオチドをコードする配列であり、本明細書において記載されるようにクロ
ーニングされ得る。配列番号２は、対応するコードされた内因性ヒトＲＵＰ４３（ＧＰＲ
１３１）ポリペプチドである。

【0468】

全長内因性ヒトＲＵＰ４３は、ＰｌａｔｉｎｕｍＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１３０６−０１６）および以下の特異的プライマー：
５’−ＧＡＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＧＡＧ−３’（５
’−プライマー；配列番号３）、および
５’−ＣＴＴＧＡＡＴＴＡＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＣ−３’（
３’−プライマー；配列番号４）
を使用して、ヒトＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲによってクローニングされる。この
ヒトＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。使用されるサイクル条件は、９
５℃で４０秒間、６０℃で５０秒間、および７２℃で１分間を２５サイクルである。１．
０ｋｂのＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ^ＴＭベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に
クローニングする。

【0469】

（ＨＡ／Ｖ５Ｈｉｓ二重タグ化内因性ヒトＲＵＰ４３（配列番号５および６））
全長内因性ヒトＲＵＰ４３（ＧＰＲ１３１）ポリペプチド（Ｎ末端メチオニンを欠く）
およびＮ末端ＨＡエピトープタグとＣ末端に置かれたＶ５Ｈｉｓエピトープタグとをコー
ドするポリヌクレオチドを、本明細書において記載されるようにクローニングした。「Ｈ
Ａ」エピトープタグは、アミノ酸配列ＭＹＰＹＤＶＰＤＹＡを含む。「Ｖ５」は、アミノ
酸配列ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴを含む。「Ｈｉｓ」は、アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨ
を含む。配列番号５は、内因性ヒトＲＵＰ４３（ＧＰＲ１３１）ポリヌクレオチドをコー
ドし、５’末端ＨＡエピトープタグと３’末端Ｖ５Ｈｉｓエピトープタグとを有する配列
（Ｎ末端メチオニンをコードするコドンを欠く）である。配列番号６は、対応するコード
されたＨＡ／Ｖ５Ｈｉｓ二重タグ化ＲＵＰ４３ポリペプチドである。

【0470】

ＰＣＲを、ＥＳＴクローン（ＩＭＡＧＥ＃５２２１１２７、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商
標）登録番号ＢＣ０３３６２５）をテンプレートとして用い、そしてｐｆｕポリメラーゼ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、製造者によって提供される、１０％ＤＭＳＯ、０．
２５Ｍの各プライマー、および０．５ｍＭの各４種のヌクレオチドを補充された緩衝液系
を使用して行った。サイクル条件は、９５℃で４０秒間、６０℃で５０秒間、および７２
℃で１分４０間を２５サイクルである。５’ＰＣＲプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を
組み込み、以下の配列を有した：
５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＧＡＧ−３’（配
列番号７）
３’ＰＣＲプライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を組み込み、以下の配列を有した：
５’−ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＣ−３’（
配列番号８）。

【0471】

１．０ｋｂのＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、５’ＨＡ／３
’Ｖ５Ｈｉｓ二重タグ化ｐＣＭＶ発現ベクター中にクローニングした。

【0472】

（実施例２）
（非内因性、構成的に活性化されたヒトＲＵＰ４３の調製）
当業者は、核酸配列の変異のための技術を選択する能力を有すると考えられる。以下に
提示されるのは、非内因性バージョンのヒトＧＰＣＲを作製するために利用され得るアプ
ローチである。本明細書において開示される内因性ヒトＲＵＰ４３（ＧＰＲ１３１）のた
めの変異は保存プロリン（または、それらの内因性構成的置換）残基（ＧＰＣＲのＴＭ６
領域に位置する、ＴＭ６／ＩＣ３界面近く）に対してＮ末端の第１６番アミノ酸（ＧＰＣ
ＲのＩＣ３領域に位置する）が、好ましくはヒスチジンアミノ酸、アルギニンアミノ酸、
またはリジンアミノ酸に、最も好ましくはリジンアミノ酸残基に変異されるアルゴリズム
的アプローチに基づく。

【0473】

限定のためでなく説明のために、内因性ヒトＲＵＰ４３（ＧＰＲ１３１）の非内因性の
、構成的に活性化されたバージョンは、配列番号２のアミノ酸２２３位のアラニンを、好
ましくはリジンに変異させることによって作製され得る。

【0474】

（１．ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ^ＴＭ突然変異誘発）
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製は、ヒトＧＰＣＲにおいて、特に、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅ
ｒＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ^ＴＭＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）を使用して、製造者の指示書に従って、達成され得る。２つの突然変異誘発性プライ
マー、最も好ましくは、リジン変異を引き起こすリジン突然変異誘発オリゴヌクレオチド
および選択マーカーオリゴヌクレオチドが利用される。便宜上、ヒトＧＰＣＲに組み込ま
れるべきコドン変異はまた、標準的な形態で注記される。

【0475】

（２．ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ^ＴＭ突然変異誘発）
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製はまた、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ^ＴＭＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、製造者の指示書
に従う）を使用して達成され得る。内因性ＧＰＣＲは、好ましくは、テンプレートとして
使用され、そして２つの突然変異誘発プライマー、同じく最も好ましくは、リジン突然変
異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチド（キットに含まれる）
が利用される。便宜上、新規のヒトＧＰＣＲに組み込まれるコドン変異およびそれぞれの
オリゴヌクレオチドは、標準的な形態で注記される。

【0476】

（実施例３）
（レセプター発現）
タンパク質の発現のために種々の細胞が当該分野で利用可能であるが、哺乳動物細胞ま
たはメラニン保有細胞は、利用されるのに最も好ましい。この主な理由は、実用性によっ
て断定される。すなわち、例えば、ＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用は、おそらく
、このプロトコールへ、哺乳動物系のために進化したレセプター結合、遺伝的機構および
分泌経路を含まない可能性のある非哺乳動物細胞（酵母の場合は事実含まない）を導入す
るので、非哺乳動物細胞から得られた結果は、潜在的に有用であるが、哺乳動物細胞もし
くはメラニン保有細胞から得られる結果ほど好ましくないからである。哺乳動物細胞のう
ち、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＣＢ３９０１細胞、２９３細胞および２９３Ｔ細胞
は、特に好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は、当業者の特定の必要性によって
決められ得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物由来の脂肪細胞または骨格筋細胞
が使用され得る。実施例１０に含まれるメラニン保有細胞に関する下記を参照のこと。

【0477】

（ａ．一過性トランスフェクション）
第１日目、６×１０^６／１０ｃｍディッシュの２９３細胞がプレートされる。第２日目
、２つの反応チューブが調製される（各チューブについていう割合は、プレートあたりで
ある）：チューブＡは、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で４μｇ
のＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；レセプターｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクターな
ど）を混合することによって調製される；チューブＢは、０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ中で
２４μｌのリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を混合することによって調製される
。チューブＡおよびＢを転倒混和（数回）し、続いて室温で３０〜４５分間インキュベー
ションする。この混合物を、「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレートされた２
９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍｌの無血清ＤＭＥＭで洗浄する。１ｍｌのト
ランスフェクション混合物を細胞に添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュ
ベーションする。このトランスフェクション混合物を吸引によって除去し、続いて１０ｍ
ｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清を添加する。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベ
ートし、４８時間後、細胞を分析のために利用した。

【0478】

（ｂ．安定細胞株）
約１２×１０^６個の２９３細胞を１５ｃｍの組織培養プレートにプレートする。１０％
のウシ胎仔血清および１％のピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ならびに抗生物質
を含有するＤＭＥ高グルコース培地中で増殖させる。２９３細胞のプレーティングの２４
時間後（または約８０％コンフルエントまでにして）、この細胞を、１２μｇのＤＮＡ（
例えば、レセプターｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクター）を用いてトランスフェクトする
。この１２μｇのＤＮＡを、６０μｌのリポフェクタミンおよび２ｍｌの血清を含まない
ＤＭＥ高グルコース培地と合わせる。この培地を、プレートから吸引し、そして細胞を、
血清を含まない培地で一回洗浄し、ＤＮＡ、リポフェクタミンおよび培地混合物を添加し
て、１０ｍｌの血清を含まない培地にプレートする。３７℃で４〜５時間のインキュベー
ション後、培地を吸引して、２５ｍｌの血清含有培地を加える。トランスフェクションの
２４時間後、この培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクシ
ョンの４８時間後、この培地を吸引し、最終濃度でゲネチシン（Ｇ４１８薬物）を含有す
る血清を含む培地を加える。約１２×１０^６の２９３細胞を１５ｃｍの組織培養プレート
にプレートする。１０％のウシ胎仔血清および１％のピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタ
ミン、ならびに抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地中で増殖させる。２９３細胞
のプレーティングの２４時間後（または約８０％コンフルエントまでにして）、この細胞
を、１２μｇのＤＮＡ（例えば、レセプターｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクター）を用い
てトランスフェクトする。この１２μｇのＤＮＡを、６０μｌのリポフェクタミンおよび
２ｍｌの血清を含まないＤＭＥ高グルコース培地と合わせる。この培地を、プレートから
吸引し、そして細胞を、血清を含まない培地で一回洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクタミン
および培地混合物を添加して、１０ｍｌの血清を含まない培地にプレートする。３７℃で
４〜５時間のインキュベーション後、培地を吸引して、２５ｍｌの血清含有培地を加える
。トランスフェクションの２４時間後、この培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を
加える。トランスフェクションの４８時間後、この培地を吸引し、５００μｇ／ｍｌの最
終濃度でゲネチシン（Ｇ４１８薬物）を含有する血清を含む培地を加える。トランスフェ
クトした細胞は、ここでＧ４１８耐性遺伝子を含む陽性にトランスフェクトされた細胞に
ついて、選択を受ける。選択が起こる場合、培地を４〜５日ごとに交換する。選択の間、
細胞を安定なプールを生成するように増殖させるか、または安定なクローン選択のために
分ける。

【0479】

（実施例４）
（ＧＰＣＲ活性化の決定のためのアッセイ）
ヒトＧＰＣＲの活性化の評価のために種々のアプローチが利用可能である。以下は、例
証であり、当業者は、当業者の必要性にとって特に有益なこれらの技術を決定する能力を
有すると考えられる。

【0480】

（１．膜結合アッセイ：［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
Ｇタンパク質共役レセプターがその活性状態にある場合、リガンド結合または構成的活
性のいずれかの結果として、レセプターはＧタンパク質へ結合してＧＤＰの放出およびＧ
タンパク質へのＧＴＰのその後の結合を刺激する。Ｇタンパク質レセプター複合体のαサ
ブユニットはＧＴＰａｓｅとして作用し、そしてＧＴＰをＧＤＰへとゆっくりと加水分解
する。ここで、レセプターは、通常脱活性化される。活性化レセプターは、ＧＤＰをＧＴ
Ｐと交換し続ける。非加水分解性ＧＴＰアナログ、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、活性化レセ
プターを発現する膜への［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの増強された結合を実証するために利用さ
れ得る。活性化を測定するために［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を使用する利点は、以下であ
る：（ａ）全Ｇタンパク質共役レセプターに対して全般的に利用可能であること；（ｂ）
膜表面に近接しており、細胞内カスケードに影響を与える分子を拾う可能性がより低くな
ること。

【0481】

このアッセイは、Ｇタンパク質共役レセプターの能力を利用して、関連するレセプター
を発現する膜への［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激する。したがって、このアッセイは、
内因性ＧＰＣＲおよび非内因性の、構成的に活性化されたＧＰＣＲに対する候補化合物を
スクリーニングするための直接同定法で使用され得る。このアッセイは、一般的であり、
そして、全Ｇタンパク質共役レセプターにおける創薬に対する用途を有する。

【0482】

［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１ｍＭと約２０ｍＭと
の間（この量は、結果の最適化のために調節され得るが、２０ｍＭが好ましい）のＭｇＣ
ｌ_２（ｐＨ７．４）、約０．３と約１．２ｎＭとの間の［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳを有する結
合緩衝液（この量は、結果の最適化のために調節され得るが、１．２が好ましい）、およ
び１２．５〜７５μｇの膜タンパク質（例えば、Ｇｓ融合タンパク質を発現する２９３細
胞；この量は最適化のために調節され得る）、および１０μＭのＧＤＰ（この量は最適化
のために変更され得る）中で、１時間インキュベートされる。次いで、コムギ胚芽凝集素
ビーズ（２５μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、そしてこの混合物をさらに３０分間室
温でインキュベートする。次いで、このチューブを１５００×ｇで５分間、室温で遠心分
離し、次いでシンチレーションカウンターで計数する。

【0483】

（２．アデニリルシクラーゼ）
細胞ベースのアッセイのために設計されたＦｌａｓｈＰｌａｔｅ^ＴＭアデニリルシク
ラーゼキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ
）を、粗細胞膜との使用のために改変し得る。ＦｌａｓｈＰｌａｔｅウェルは、ｃＡＭ
Ｐを認識する特異的抗体をまた含有するシンチラントコーティングを含有し得る。ウェル
中で生成されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射活性ｃＡＭＰトレーサーの結合につい
ての直接競合によって定量化され得る。以下は、レセプターを発現する全細胞におけるｃ
ＡＭＰレベルにおける測定の変化についての簡単なプロトコールとして役立つ。

【0484】

トランスフェクトされた細胞を一過性トランスフェクションの約２４時間後に収集する
。培地を慎重に吸引し、廃棄する。１０ｍｌのＰＢＳを各々の細胞のディッシュに穏やか
に添加し、続いて慎重に吸引する。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍｌのＰ
ＢＳを各プレートに添加する。細胞をプレートからピペットで除き、この細胞懸濁液を５
０ｍｌコニカル遠沈管中に回収する。細胞を、１，１００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分
離する。この細胞ペレットを適切な容量のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）に慎重に再懸濁
する。次いで、細胞を、血球計を使用して計数し、さらなるＰＢＳを添加して、（約５０
μｌ／ウェルの最終容量で）適切な数の細胞を得る。

【0485】

ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー
［^１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μｌ）を含む）を、製造者の指示書に従って調製し、維持す
る。アッセイ緩衝液を、スクリーニングのために新たに調製し、そしてこれは、５０μｌ
の刺激緩衝液、３μｌの試験化合物（１２Ｍ最終アッセイ濃度）および５０μｌの細胞を
含む。アッセイ緩衝液を、使用するまで氷上に保存する。このアッセイは、好ましくは、
例えば、９６ウェルプレートで行われ、適切なウェルに５０μｌのｃＡＭＰ標準を添加し
、続いてＨ−１１およびＨ１２のウェルに５０μｌのＰＢＳＡを添加することによって開
始する。全てのウェルに５０μｌの刺激緩衝液を添加する。ＤＭＳＯ（または選択された
候補化合物）を、３μｌの化合物溶液を分注し得るピンツールを使用して適切なウェルに
添加し、試験化合物の最終アッセイ濃度を１２μＭ、および総アッセイ容量を１００μｌ
とする。次いで、細胞をウェルに添加し、室温で６０分間インキュベートする。次いで、
ｃＡＭＰトレーサーを含有する１００μｌの検出ミックスをウェルに添加する。次いで、
プレートをさらに２時間インキュベートし、続いて、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａ
シンチレーションカウンターで計数する。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値を、各アッセ
イプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。

【0486】

（３．Ｇｉ結合標的ＧＰＣＲについての細胞ベースのｃＡＭＰ）
ＴＳＨＲは、活性の際にｃＡＭＰの蓄積を引き起こすＧｓ結合ＧＰＣＲである。ＴＳＨ
Ｒは、アミノ酸残基６２３を変異すること（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基
に変更すること）によって構成的に活性化される。Ｇｉ結合レセプターは、アデニリルシ
クラーゼを阻害し、それによってｃＡＭＰ生成のレベルを低下させると予測され、ｃＡＭ
Ｐレベルの評価をやりがいのあるものにさせ得る。Ｇｉ結合レセプターの活性化の指標と
してｃＡＭＰの生成の低下を測定するために有効な技術は、最も好ましくは、非内因性の
、構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（もしくは、内因性の、構成
的に活性なＧｓ結合レセプター）を、「シグナルエンハンサー」として、ｃＡＭＰレベル
のベースラインを確立するためのＧｉに連結された標的ＧＰＣＲとともに同時トランスフ
ェクションすることによって達成され得る。Ｇｉ結合レセプターの非内因性バージョンの
生成において、標的ＧＰＣＲのこの非内因性バージョンは、次にシグナルエンハンサーと
ともに同時トランスフェクトされる。スクリーニングに使用され得るのは、この物質であ
る。本発明者らは、ｃＡＭＰアッセイが使用される場合、シグナルを効率的に生成するた
めにこのようなアプローチを使用する。いくつかの実施形態において、このアプローチは
、好ましくは、Ｇｉ結合レセプターに対する候補化合物の直接的同定に使用される。Ｇｉ
結合ＧＰＣＲについては、このアプローチが使用される場合、標的ＧＰＣＲの逆アゴニス
トはｃＡＭＰシグナルを増大させ、そしてアゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少させると
いうことに留意すること。

【0487】

第１日目において、２×１０^４の２９３細胞／ウェルをプレートする。第２日目、２つ
の反応チューブを調製する（各チューブについて従うその割合は、プレートあたりである
）：チューブＡを、１．２ｍｌ無血清ＤＭＥＭ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，
Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中で、哺乳動物細胞にトランスフェクトされた２μｇの各レセプタ
ーのＤＮＡ（全部で４μｇのＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；変異されたＴＨＳＲ（
ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）；ＴＳＨＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＣＲなどを有するｐＣＭＶベ
クター）を混合することによって調製する；チューブＢを、１．２ｍｌ無血清ＤＭＥＭ中
で、１２０μｌのリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を混合することによって調製
する。次いで、チューブＡおよびＢを転倒混和し（数回）、その後室温で３０〜４５分間
インキュベートする。この混合物を、「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレート
した２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭを添加する。次
いで２．４ｍｌのトランスフェクション混合物を細胞に添加し、続いて４時間、３７℃／
５％ＣＯ_２にてインキュベーションする。次いでトランスフェクション混合物を吸引によ
って取り出し、その後２５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清を添加する。次いで細胞
を、３７℃／５％ＣＯ_２にてインキュベーションする。２４時間のインキュベーションの
後、次いで細胞を回収し、そして分析に使用する。

【0488】

ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ^ＴＭアデニリルシクラーゼキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、細胞ベースのアッセイのために設計
されているが、このキットは、当業者の必要性に依存して粗形質膜用に改変され得る。Ｆ
ｌａｓｈＰｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含み、このコーティングは
また、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体を含む。ウェル内で生成されたｃＡＭＰは、放射性
ｃＡＭＰトレーサーのｃＡＭＰ抗体への結合に関する直接的競合によって定量化され得る
。以下は、そのレセプターを発現する全細胞における、ｃＡＭＰレベルの変化の測定のた
めの短いプロトコールとして役立つ。

【0489】

トランスフェクションされた細胞を、一過性トランスフェクションのおよそ２４時間後
に回収する。培地を慎重に吸引し、廃棄する。１０ｍｌのＰＢＳを各細胞のディッシュに
穏やかに添加し、続いて慎重に吸引する。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍ
ｌのＰＢＳを、各プレートに添加する。細胞を、プレートからピペットで取り出し、この
細胞懸濁液を、５０ｍｌのコニカル遠沈管に回収する。次いで、細胞を、室温、１，１０
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適切な容量のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレ
ート）中に慎重に再懸濁する。次いで、細胞を血球計を使用して計数し、さらなるＰＢＳ
を添加して適切な数の細胞（約５０μｌ／ウェルの最終容量）とする。

【0490】

製造者の使用説明書に従って、ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液
に対して１μＣｉのトレーサー［^１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μｌを含む））を調製し、維
持する。アッセイ緩衝液は、スクリーニングのために新たに調製すべきであり、そして５
０μｌの刺激緩衝液、３μｌの試験化合物（１２μＭの最終アッセイ濃度）および５０μ
ｌの細胞を含むべきである。アッセイ緩衝液は、使用まで保存され得る。５０μｌのｃＡ
ＭＰ標準を適切なウェルに添加し、続いて５０μｌのＰＢＳＡをウェルＨ−１１およびＨ
１２に添加することによって、アッセイを開始し得る。５０μｌの刺激緩衝液を全てのウ
ェルに添加する。選択された化合物（例えば、ＴＳＨ）を、３μｌの化合物溶液を分注し
得るピンツールを使用して、適切なウェルに添加する（１２μＭの試験化合物および１０
０μｌの全アッセイ容量の最終アッセイ濃度）。次いで、細胞をウェルに添加し、室温で
６０分間インキュベートする。次に、トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μｌの検出ミ
ックスをウェルに添加する。プレートを次いでさらに２時間インキュベートし、その後Ｗ
ａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数した。次いで、ｃＡ
ＭＰ／ウェルの値を、各アッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。

【0491】

（４．レポーターベースのアッセイ）
（ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ関連レセプター））
２９３細胞および２９３Ｔ細胞を、２×１０^４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレー
トにプレートし、製造者の使用説明書に従って、リポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を使用
してトランスフェクトした。各々６ウェルのトランスフェクションについて、以下のよう
にＤＮＡ／脂質混合物を調製する：１００μｌのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤ
ＮＡを、１００μｌのＤＭＥＭ中の２μｌの脂質とともに穏やかに混合する（この２６０
ｎｇのプラスミドＤＮＡは、２００ｎｇの８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレセプタープラスミド、５
０ｎｇの内因性レセプターもしくは非内因性レセプターを含むｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単
独、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
中のＧＰＲＳ）から構成される。この８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレセプタープラスミドを、以下
のように調製した：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌを、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃベクター
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のＢｇＩＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位においてラットソマトスタチン
プロモーター（−７１／＋５１）をクローニングすることによって得た。８コピーのｃＡ
ＭＰ反応エレメントを、アデノウイルステンプレートＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８からの
ＰＣＲによって得て（Ｓｕｚｕｋｉら，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ（１９９６）７：１
８８３−１８９３を参照のこと；この開示は、その全体が本明細書において参考として援
用される）、ＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクター中にＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位においてクローニ
ングし、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレセプターベクターを得た。８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレセプ
タープラスミドを、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレセプターベクター中のβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢａｍＨＩ部位から得られるルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることによって生成した。
室温でのインキュベーションの３０分後、ＤＮＡ／脂質混合物を４００μｌのＤＭＥＭで
希釈し、そしてこの１００μｌの希釈混合液を、各ウェルに添加する。１０％ＦＣＳを含
む１００μｌのＤＭＥＭを、細胞培養インキュベーター内での４時間のインキュベーショ
ンの後、各ウェルに添加する。翌日、トランスフェクトされた細胞を、２００μｌ／ウェ
ルの１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで交換し、８時間後、ウェルを一回ＰＢＳで洗浄した後
、１００μｌ／ウェルのフェノールレッドを含まないＤＭＥＭと交換する。翌日、Ｌｕｃ
Ｌｉｔｅ^ＴＭレセプター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、製造者の
使用説明書に従ってルシフェラーゼ活性を測定し、１４５０ＭｉｃｒｏＢｅｔａ^ＴＭシ
ンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）で読み取る。

【0492】

（ｂ．ＡＰ１レセプターアッセイ（Ｇｑ関連レセプター））
Ｇｑ刺激を検出する方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣの、そのプロモーター中にＡ
Ｐ１エレメントを含む遺伝子の活性化を引き起こすという公知の性質に依存する。Ｐａｔ
ｈｄｅｔｅｃｔ^ＴＭＡＰ−１ｃｉｓ−ＲｅｐｏｒｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ，カタログ番号２１９０７３）を、リン酸カルシウム沈殿物の成分が４１０ｎ
ｇのｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−レセプター発現プラスミド、および２０ｎ
ｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰであったことを除いて、ＣＲＥＢレセプターアッセイに関する上記
のプロトコールに従って使用し得る。

【0493】

（ｃ．ＳＲＦ−Ｌｕｃレセプターアッセイ（Ｇｑ関連レセプター））
Ｇｑ刺激を検出する方法は、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣが、そのプロモーター中に血
清反応因子を含む遺伝子の活性化を引き起こすという公知の性質に依存する。Ｐａｔｈｄ
ｅｔｅｃｔ^ＴＭＳＲＦ−Ｌｕｃ−ＲｅｐｏｒｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）を、例えば、ＣＯＳ７細胞でのＧｑ結合活性についてのアッセイに使用し得る。細
胞を、製造者の使用説明書に従ってＭａｍｍａｌｉａｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ^ＴＭ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号２００２８５）を使用して、このシステ
ムのプラスミド構成要素および内因性もしくは非内因性ＧＰＣＲをコードする指示された
発現プラスミドでトランスフェクトする。簡単にいうと、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ、
８０ｎｇのｐＣＭＶ−レセプター発現プラスミド、および２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（
分泌性アルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性は、サンプ
ル間でのトランスフェクション効率の変動を制御するために、トランスフェクトされた細
胞の培地中で測定される）を、製造者の使用説明書に従ってリン酸カルシウム沈殿物中に
混合する。沈殿物の半分を、９６ウェルプレートの３つのウェルに等分し、細胞を無血清
培地中に２４時間保存する。最後の５時間、細胞を、例えば１μＭの試験化合物とともに
、インキュベートする。次いで、細胞を溶解し、Ｌｕｃｌｉｔｅ^ＴＭキット（Ｐａｃｋａ
ｒｄ，カタログ番号６０１６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅ
ｔａ」液体シンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を使用して、製造者
の使用説明書に従ってルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、Ｇｒａｐｈ
ＰａｄＰｒｉｓｍ^ＴＭ２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．）を
使用して分析し得る。

【0494】

（細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ関連レセプター））
第１日目、レセプター（内因性もしくは非内因性）を含む細胞を、２４ウェルプレート
に、通常１×１０^５細胞／ウェル（その数は最適化され得る）で配置し得る。第２日目、
最初に５０μｌの無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の０．２５μｇのＤＮＡと５０μｌの無血清
ＤＭＥＭ／ウェル中の２μｌのリポフェクタミンとを混合することによって細胞をトラン
スフェクトし得る。この溶液を、穏やかに混合し、室温で１５〜３０分間インキュベート
する。細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４００μｌの無血清培地をトランスフェクシ
ョン培地と混合して、細胞を添加する。次いで、３〜４時間、３７℃／５％ＣＯ_２で細胞
をインキュベートし、そしてトランスフェクション培地を除去して１ｍｌ／ウェルの通常
の増殖培地で置き換える。第３日目、細胞を^３Ｈ−ｍｙｏ−イノシトールで標識する。簡
単にいうと、培地を除去し、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。次いで、１ウェルあ
たり０．５ｍｌのイノシトール非含有／無血清培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を、０．２５
μＣｉの^３Ｈ−ｍｙｏ−イノシトール／ウェルとともに添加し、細胞を、１６〜１８時間
、３７℃／５％ＣＯ_２でインキュベートする。第４日目、０．５ｍｌのＰＢＳで細胞を洗
浄し、イノシトール非含有／無血清培地を含有する０．４５ｍｌのアッセイ培地に、１０
μＭのパージリン、１０ｍＭの塩化リチウムを添加するか、または０．４ｍｌのアッセイ
培地および５０μｌの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を最終濃度１０μＭとする。次いで
、細胞を３０分間３７℃でインキュベートする。次に細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し
、２００μｌの新鮮な／氷冷された停止溶液（１ＭＫＯＨ；１８ｍＭのホウ酸Ｎａ；３
．８ｍＭのＥＤＴＡ）／ウェルを添加した。溶液を、氷上で５〜１０分間または細胞が溶
解するまで保存し、２００μｌの新鮮な／氷冷された中性化溶液（７．５％ＨＣＬ）に
よって中性化する。溶解物を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１ｍｌのクロ
ロホルム／メタノール（１：２）／チューブを添加する。この溶液を１５秒間ボルテック
スし、上相をＢｉｏｒａｄＡＧ１−Ｘ８^ＴＭアニオン交換樹脂（１００〜２００メッシ
ュ）に付与する。最初に、この樹脂を水（１：１．２５Ｗ／Ｖ）で洗浄し、０．９ｍｌの
上相をカラムにロードする。このカラムを１０ｍｌの５ｍＭｍｙｏ−イノシトールおよ
び１０ｍｌの５ｍＭホウ酸Ｎａ／６０ｍＭのギ酸Ｎａで洗浄する。イノシトールＴｒｉ
ｓリン酸を、２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍのギ酸アンモニウムを含む１０ｍｌのシンチレ
ーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルに溶出する。このカラムを１０ｍ
ｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムで洗浄することによって再生し、ｄｄＨ_２Ｏで
２回リンスし、水中で４℃で保存する。

【0495】

（実施例５）
（融合タンパク質調製）
（ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築物）
ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計を、以下のように達成し得る：ラットＧタン
パク質Ｇｓα（長鎖形態；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ら，８３ＰＮＡＳ３７７６（１９８６））
の５’末端および３’末端の両方を、その上にＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３
’）配列を含むように操作する。正しい配列（隣接するＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む）の確
認に続いて、その配列全体を、ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用してサブクロー
ニングすることによってｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号
Ｖ７９５−２０）にシャトルする。Ｇｓα配列の正確な向きを、ｐｃＤＮＡ３．１（−）
へのサブクローニング後に決定する。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ配列においてラットＧｓα
遺伝子を含むこの改変されたｐｃＤＮＡ３．１（−）を検証する。このベクターは、ここ
で、「汎用」Ｇｓαタンパク質ベクターとして利用可能である。ｐｃＤＮＡ３．１（−）
ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に種々の周知の制限部位を含み、したがってＧｓ
タンパク質の上流に、内因性の、構成的に活性なＧＰＣＲのコード配列を挿入する能力を
都合よく提供する。この同じアプローチを、他の「汎用」Ｇタンパク質ベクターを生成す
るために利用し得、そして当然ながら、当業者に公知の他の市販もしく所有されているベ
クターを使用し得る。重要な基準は、ＧＰＣＲについての配列が、Ｇタンパク質の配列の
上流およびフレーム内にあることである。

【0496】

（Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ融合構築物）
Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ融合構築物の設計を、以下のように達成し得る：Ｇαｑサブユニ
ットのＮ末端の６アミノ酸（アミノ酸２〜７、配列ＴＬＥＳＩＭを有する）を欠失させ、
Ｃ末端の５アミノ酸（配列ＥＹＮＬＶを有する）を、Ｇαｉタンパク質の対応するアミノ
酸（配列ＤＣＧＬＦを有する）で置き換える。この融合構築物を、以下のプライマー：
５’−ｇａｔｃＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧ
−３’（配列番号９）、および
５’−ｇａｔｃＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴ
ＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１０）
ならびに血球凝集素タグを有するマウスＧαｑ野生型バージョンを含むプラスミド６３３
１３をテンプレートとして使用するＰＣＲによって得る。小文字のヌクレオチドは、スペ
ーサーとして含まれる。

【0497】

ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
を以下のサイクルによる増幅のために使用する：工程２〜４の３５回繰り返し：９５℃で
２分間；９５℃で２０秒間；５６℃で２０秒間；７２℃で２分間；および７２℃で７分間
。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニ
ングし、ＡＢＩＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）を使用して配列決定する。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローン由来のイ
ンサートを、２工程クローニングプロセスによって発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）
中ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にシャトルする。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／
０５６２５（２００２年９月６日にＷＯ０２０６８６００として公開）もまた参照のこと
（この開示は、本明細書によりその全体が参考として援用される）。

【0498】

（実施例６［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
（Ａ．膜調製）
いくつかの実施形態において、目的の、候補化合物を（例えば、逆アゴニスト、アゴニ
ストもしくはアンタゴニスト）として同定することに使用するための標的ＧＰＣＲを含む
膜を、好ましくは、以下のように調製する：
（ａ．材料）
「膜擦過緩衝液（ＭｅｍｂｒａｎｅＳｃｒａｐｅＢｕｆｆｅｒ）」は、２０ｍＭの
ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭのＥＤＴＡから構成される（ｐＨ７．４）；「膜洗浄緩衝液」
は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡから構成される（ｐＨ７．４）；
「結合緩衝液」は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ_２から構成される（ｐＨ７．４）。

【0499】

（ｂ．手順）
全ての材料を、手順の間ずっと氷上で保存する。最初に、コンフルエントな細胞単層か
ら培地を吸引し、その後１０ｍｌの冷ＰＢＳでリンスし、続いて吸引する。その後、５ｍ
ｌの膜擦過緩衝液を掻き取った細胞に添加する；続いて、細胞抽出物を５０ｍｌの遠沈管
に移す（２０，０００ｒｐｍで１７分間、４℃で遠心分離）。その後、上清を吸引し、ペ
レットを３０ｍｌの膜洗浄緩衝液で再懸濁し、続いて２０，０００ｒｐｍで１７分間、４
℃で遠心分離する。次いで、上清を吸引し、ペレットを結合緩衝液に再懸濁する。次に、
ＢｒｉｎｋｍａｎＰｏｌｙｔｒｏｎ^ＴＭホモジナイザーを使用してこれをホモジナイズ
する（懸濁液中の全ての物質がつぶれるまで１５〜２０秒間）。これを、本明細書におい
て、「膜タンパク質」と呼ぶ。

【0500】

（ブラッドフォードタンパク質アッセイ）
ホモジナイズに続いて、ブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して膜のタンパク
質濃度を決定する。（タンパク質は、約１．５ｍｇ／ｍｌに希釈され、アリコートにされ
て、後の使用のために凍結され得る（−８０℃）；凍結する場合、使用のためのプロトコ
ールは以下である：アッセイの日、凍結膜タンパク質を室温で解凍し、その後ボルテック
スし、次いで、Ｐｏｌｙｔｒｏｎによって約１２×１，０００ｒｐｍで約５〜１０秒間ホ
モジナイズする。複数の調製のためには、異なる調製物のホモジナイズ間でホモジナイザ
ーを徹底的にきれいにすべきであることに注意すること）
（ａ．材料）
結合緩衝液（上記のとおり）；ブラッドフォード染色試薬；ブラッドフォードタンパク
質標準を、製造者の使用説明書に従って使用する（Ｂｉｏｒａｄ，カタログ番号５００−
０００６）。

【0501】

（ｂ．手順）
２つのチューブを調製する。１つは膜を含み、１つはコントロールとして「ブランク」
である。各々は、８００μｌの結合緩衝液を含む。その後、１０μｌのブラッドフォード
タンパク質標準（１ｍｇ／ｍｌ）を各チューブに添加し、次いで１０μｌの膜タンパク質
を１つのチューブにのみ添加する（ブランクではない）。その後、２００μｌのブラッド
フォード染色試薬を各チューブに添加し、その後各々をボルテックスする。５分後、チュ
ーブを再度ボルテックスし、中の物質をキュベットに移す。キュベットをＣＥＣＩＬ３
０４１分光光度計で、波長５９５にて読み取る。

【0502】

（同定アッセイ）
（ａ．材料）
ＧＤＰ緩衝液は、３７．５ｍｌの結合緩衝液および２ｍｇのＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ，カタ
ログ番号Ｇ−７１２７）から構成され、結合緩衝液で連続希釈され、０．２μＭのＧＤＰ
とされた（各ウェルにおけるＧＤＰの最終濃度は、０．１ＭのＧＤＰ）；候補化合物を含
む各ウェルは、１００μｌのＧＤＰ緩衝液（最終濃度、０．１ＭのＧＤＰ）、結合緩衝液
中の膜タンパク質５０μｌ、ならびに結合緩衝液中の［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ
）、５０μｌ（２．５μｌ［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ／１０ｍｌの結合緩衝液）から構成され
る、２００μｌの最終容量を有する。

【0503】

（ｂ．手順）
候補化合物を、好ましくは、９６ウェルプレート形式（これらは、−８０℃で凍結され
得る）を使用してスクリーニングする。膜タンパク質（もしくは、コントロールとして、
標的ＧＰＣＲ以外の発現ベクターを含む膜）を、懸濁するまで短時間ホモジナイズする。
次いで、上記のブラッドフォードタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を決定す
る。膜タンパク質（およびコントロール）を、次に結合緩衝液中において０．２５ｍｇ／
ｍｌに希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、１００μｌのＧ
ＤＰ緩衝液を、ＷａｌｌａｃＳｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ^ＴＭ（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェル
に添加した。次いで、５μｌのピンツールを使用して、そのようなウェルに５μｌの候補
化合物を移送する（すなわち、２００μｌの総アッセイ容量中５μｌは、１：４０比であ
り、したがって候補化合物の最終スクリーニング濃度は、１０μＭである）。やはり、汚
染を避けるため、各移送工程の後に、ピンツールを３つのレザバ（水（１×）、エタノー
ル（１×）および水（２×）を含む）内でリンスしなければならない。過剰の液体を各リ
ンスの後でツールから振り落とし、紙およびキムワイプで乾燥させる。その後、５０μｌ
の膜タンパク質を各ウェルに添加し（標的ＧＰＣＲを含まない、膜を含むコントロールウ
ェルもまた利用した）、５〜１０分間室温であらかじめインキュベートする。その後、５
０μｌの結合緩衝液中の［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）を各ウェルに添加し、その
後、振盪機で６０分間室温でインキュベートする（再び、この実施例において、プレート
をホイルで覆った）。次いで、プレートを４０００ＲＰＭで１５分間、２２℃でスピンす
ることによってアッセイを停止する。次いで、このプレートを、８チャンネルマニフォー
ルドで吸引し、プレートカバーでシールする。次いで、このプレートをＷａｌｌａｃ１
４５０で「Ｐｒｏｔ．＃３７」の設定を使用して読み取る（製造者の使用説明書どおり）
。

【0504】

（実施例７）
（ＣＹＣＬＩＣＡＭＰアッセイ）
候補化合物を（例えば、逆アゴニスト、アゴニストもしくはアンタゴニストとして）同
定するための別のアッセイアプローチを、シクラーゼベースのアッセイを利用することに
よって達成する。直接同定に加えて、このアッセイアプローチは、独立のアプローチとし
て利用されて、上記の実施例６に示される［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳアプローチからの結果の
確認を提供し得る。

【0505】

好ましくは、改変ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ^ＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を、内因性もしくは非
内因性の、構成的に活性化されたＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストとして
候補化合物を直接的に同定するために、以下のプロトコールに従って利用する。

【0506】

トランスフェクトされた細胞をトランスフェクションの約３日後に回収する。懸濁され
た細胞を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１０ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む緩衝液
中でホモジナイズすることによって、膜を調製する。ホモジナイズを、Ｂｒｉｎｋｍａｎ
Ｐｏｌｙｔｒｏｎ^ＴＭを使用して氷上で約１０秒間行う。得られたホモジネートを、４
９，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離する。次いで、得られたペレットを、２０ｍ
ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中で再懸濁し、
１０秒間ホモジナイズし、続いて４９，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離する。得
られたペレットを次に−８０℃で使用まで保存する。直接同定スクリーニングの日、膜ペ
レットを室温でゆっくりと融解し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１０ｍＭ
のＭｇＣｌ_２を含む緩衝液中で再懸濁して、０．６０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を
得る（再懸濁された膜は、使用まで氷上に置く）。

【0507】

ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液に対して２μＣｉのトレーサー
［^１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μｌ）を含む）を、製造者の使用説明書に従って調製し、
維持する。アッセイ緩衝液を、スクリーニングのために新たに調製し、これは以下を含有
した：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２０ｍＭのホスホ
クレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１単位／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ
）、５０μＭのＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）；アッ
セイ緩衝液を、次いで、使用するまで氷上で保存した。

【0508】

好ましくは、例えば、９６ウェルプレートのウェルに候補化合物（３μｌ／ウェル；１
２μＭの最終アッセイ濃度）を、４０μｌの膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）および５
０μｌのアッセイ緩衝液とともに添加する。次いで、この混合物を、室温で３０分間、穏
やかに振盪しながらインキュベートした。

【0509】

インキュベーション後、１００μｌの検出緩衝液を各ウェルに添加し、２〜２４時間イ
ンキュベーションする。次いで、プレートをＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａ^ＴＭプレ
ートリーダーで、「Ｐｒｏｔ．＃３１」を使用して計数する（製造者の使用説明書に従う
）。

【0510】

例示のためであって限定のためではなく、得られた例示的スクリーニングアッセイプレ
ート（９６ウェル形式）結果を図１に示す。各バーは、各ウェルにおける異なる化合物に
ついての結果を示す。「標的ＧＰＣＲ」は、ＧＰＲ１３１と無関係な、内因性の、構成的
に活性なＧｓ結合ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質構築物である。図１に示される結果は
また、各プレートの平均結果の標準偏差を提供し（「ｍ」）、そしてその平均プラス、一
次スクリーニングから、「リード」として逆アゴニストを選択するための２つの任意優先
（ａｒｂｉｔｒａｒｙｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、少なくともその平均プレート反応マ
イナス２標準偏差までパーセント反応を低下させる候補化合物の選択に関与する。逆に、
一次スクリーニングからの「リード」としてのアゴニストの選択のための任意優先は、少
なくともその平均プレート反応プラス２標準偏差までパーセント反応を増大させる候補化
合物の選択に関する。これらの選択プロセスに基づいて、その後のウェルの候補化合物を
、ウェルＡ２およびＧ９それぞれの上記内因性ＧＰＣＲに対する推定逆アゴニスト（化合
物Ａ）および推定アゴニスト（化合物Ｂ）として直接的に同定した。図１を参照のこと。
明瞭化のため、これらの化合物を、このＧＰＣＲに対する内因性リガンドの知識なしに、
直接的に同定した。化合物の結合親和性ではなくレセプター機能に基づくアッセイ技術に
注目することによって、このレセプター（化合物Ａ）の機能活性を減少し得、かつレセプ
ター（化合物Ｂ）の機能活性を増加し得る化合物を確認することが可能である。

【0511】

（実施例８）
（細胞内カルシウム濃度を測定するためのＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃＩｍａｇｉｎｇ
ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）アッセイ）
標的レセプター（実験的）およびｐＣＭＶ（ネガティブコントロール）を安定にトラン
スフェクトしたそれぞれのクローン株由来の細胞を、ポリ−Ｄ−リジン前処理された９６
ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃３５６６４０）中に５．５×１
０^４細胞／ウェルで、完全培養培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミ
ン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む）とともに、翌日のアッセイのために播種する
。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ，＃Ｆ１４２０２）インキュベー
ション緩衝液ストックを調製するため、１ｍｇのＦｌｕｏ４−ＡＭを４６７μｌのＤＭＳ
Ｏおよび４６７μｌのプルオロニック酸（Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＰｒｏｂｅ，＃Ｐ３０００）に溶解し、−２０℃で１ヶ月保存し得る１ｍＭの
ストック溶液を得る。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウム指標色素である。

【0512】

候補化合物を、洗浄緩衝液中で調製する（１×ＨＢＳＳ／２．５ｍＭＰｒｏｂｅｎｉ
ｃｉｄ／２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）。

【0513】

アッセイ時、培養培地をウェルから除去し、１００μｌの４μＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ／
２．５ｍＭＰｒｏｂｅｎｉｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ８７６１）／２０ｍＭＨＥＰＥ
Ｓ／完全培地（ｐＨ７．４）を使用して細胞をロードする。３７℃／５％ＣＯ_２でのイン
キュベーションを６０分間進める。

【0514】

１時間のインキュベーションの後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーション緩衝液を除去
し、１００μｌの洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄する。各ウェルに、１００μｌの洗浄緩衝
液を残す。プレートをインキュベーターに、３７℃／５％ＣＯ_２で、６０分間戻す。

【0515】

ＦＬＩＰＲ（ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃＩｍａｇｉｎｇＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ
；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）を、５０μｌの候補化合物を３０秒間添加して、
さらに１５０秒間、候補化合物によって誘発される細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ^２＋］
）の一過性の変化を記録するようにプログラムする。ＦＬＩＰＲソフトウェアを使用して
、全体的な蛍光変化の計数をアゴニスト活性を決定するために使用する。機器のソフトウ
ェアは、蛍光の読みを標準化して、初期読み取り値を等しく０にする。

【0516】

いくつかの実施形態において、標的レセプターを含む細胞は、Ｇα１５、Ｇα１６もし
くはキメラＧｑ／Ｇｉαユニットをさらに含む。

【0517】

上記は、安定にトランスフェクトされた細胞を使用する、アゴニスト活性についてのＦ
ＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者は、アンタゴニスト活性を特徴付けるために、こ
のアッセイを容易に改変し得る。当業者はまた、一過性にトランスフェクトされた細胞が
代替的に使用され得ることを容易に理解する。

【0518】

（実施例９）
（ＭＡＰキナーゼアッセイ）
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）をモニタリングして、レセプター活性
化を評価し得る。ＭＡＰキナーゼは、いくつかのアプローチによって検出され得る。１つ
のアプローチは、リン酸化状態（非リン酸化（不活性）もしくはリン酸化（活性）のいず
れか）の評価に基づく。リン酸化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるよりゆっくり
とした移動度を有し、したがって、ウェスタンブロッティングを使用して未刺激タンパク
質と比較され得る。あるいは、リン酸化タンパク質に対する抗体特異性が利用可能である
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）。これは、リン酸化キナーゼの増加を検出
するために使用され得る。いずれの方法においても、細胞を試験化合物で刺激し、次いで
Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で抽出する。可溶性分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付与し、タンパ
ク質を、ニトロセルロースもしくはＩｍｍｏｂｉｌｉｎに電気泳動的に移送する。標準的
なウェスタンブロット技術によって免疫反応性バンドを検出する。可視的シグナルもしく
は化学発光性シグナルをフィルムに記録し、デンシトメトリーによって定量化し得る。

【0519】

別のアプローチは、リン酸化アッセイを介するＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づく。細
胞を試験化合物によって刺激し、可溶性の抽出物を調製する。抽出物を、３０℃で１０分
間、γ−^３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生システム、およびＭＡＰキナーゼのための特異的基
質（例えば、インスリンによって調節されるリン酸化された熱および酸安定性タンパク質
、もしくはＰＨＡＳ−Ｉ）とともにインキュベートする。この反応をＨ_３ＰＯ_４の添加に
よって終了させ、サンプルを氷上に移送する。アリコートを、ＷｈａｔｍａｎＰ８１ク
ロマトグラフィー紙上にスポットし、これは、リン酸化タンパク質を保持する。クロマト
グラフィー紙を洗浄し、^３２Ｐについての計数は、液体シンチレーションカウンターであ
る。あるいは、細胞抽出物を、γ−^３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生システム、およびストレ
プトアビジンによってフィルター支持体に結合されるビオチン化ミエリン塩基性タンパク
質とともにインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質は、活性化ＭＡＰキナーゼに
対する基質である。リン酸化反応を１０分間３０℃で行う。次いで、フィルターを介して
抽出物を吸引し得る。これは、リン酸化ミエリン塩基性タンパク質を保持する。フィルタ
ーを洗浄し、液体シンチレーション計数によって^３２Ｐについて計数する。

【0520】

（実施例１０）
（メラニン保有細胞技術）
メラニン保有細胞は、下等脊椎動物において見出される皮膚細胞である。これらは、メ
ラノソームと称される色素性のオルガネラを含む。メラニン保有細胞は、Ｇタンパク質共
役レセプター（ＧＰＣＲ）活性化によって微小管ネットワークに沿って、これらのメラノ
ソームを再分布させ得る。これらの色素移動の結果は、細胞の明らかな明化もしくは暗化
である。メラニン保有細胞において、Ｇｉ結合レセプターの活性化から生じる細胞内ｃＡ
ＭＰの減少したレベルは、細胞の中央にメラノソームを移動させ、色の劇的な明化をもた
らす。そして、ｃＡＭＰレベルが上昇する場合、Ｇｓ結合レセプターの活性化に続いて、
メラノソームは、再分散され、細胞は再度暗く見える。Ｇｑ結合レセプターの活性化から
生じるジアシルグリセロールの増加したレベルもまた、この再分散を誘導し得る。さらに
、この技術はまた、特定のレセプターチロシンキナーゼの研究に適切である。メラニン保
有細胞の反応は、レセプター活性化の数分以内に起こり、単純で、強力な色の変化を生じ
る。この反応は、従来の吸光マイクロプレートリーダーもしくは適度なビデオ画像化シス
テムを使用して容易に検出され得る。他の皮膚細胞と異なり、メラニン保有細胞は神経冠
に由来し、シグナル伝達タンパク質の全補体を発現するように見える。特に、細胞は、極
度に広い範囲のＧタンパク質を発現し、したがってほぼ全てのＧＰＣＲ機能的に発現し得
る。

【0521】

メラニン保有細胞を利用して、ＧＰＣＲに対する化合物（天然リガンドを含む）を同定
し得る。この方法は、特定の刺激に反応してそれらの色素を分散もしくは凝集させ得、そ
してＧＰＣＲについてコードする外因性クローンを発現する色素細胞株に試験細胞を導入
することによって実行され得る。刺激薬（例えば、メラトニン）は、ＧＰＣＲの活性化が
色素分散を誘導する場合に試験細胞内に色素が凝集される、色素沈着の初期状態を設定す
る。しかし、刺激薬で細胞を刺激してＧＰＣＲの活性化の場合に色素が分散する色素沈着
の初期状態に設定することは、色素凝集を誘導する。試験細胞を、次に化学化合物に接触
させ、細胞内の色素沈着が色素の初期状態から色素沈着に変更されるか否かを決定する。
ＧＰＣＲに結合する候補化合物（リガンドが挙げられるが、これらに限定されない）に起
因する色素細胞の分散は、ペトリ皿上で暗く見える。一方色素の凝集により、細胞は明る
く見える。

【0522】

材料および方法は、米国特許第５，４６２，８５６号および同第６，０５１，３８６号
の開示に従って行われる。これらの特許の開示は、本明細書によりその全体が参考として
援用される。

【0523】

細胞を、例えば９６ウェルプレートにプレートする（プレートあたり１レセプター）。
トランスフェクションの４８時間後、各プレートの細胞の半分を１０ｎＭのメラトニンで
処理する。メラトニンは、メラニン保有細胞中の内因性Ｇｉ結合レセプターを活性化し、
それらの細胞がその色素を凝集するようにさせる。残り半分の細胞を、無血清培地０．７
ＸＬ−１５（Ｇｉｂｃｏ）に移送する。１時間後、無血清培地中の細胞は色素分散状態の
ままであり、一方メラトニン処理細胞は、色素凝集状態である。この点で、細胞をある容
量反応の試験候補化合物で処理する。プレートされたＧＰＣＲが試験／候補化合物に結合
する場合、メラニン保有細胞は化合物に反応して色変化を受けると予測される。レセプタ
ーがＧｓもしくはＧｑ結合レセプターのいずれかであった場合、メラトニン凝集型メラニ
ン保有細胞は、色素分散を受ける。対照的に、レセプターがＧｉ結合レセプターである場
合、色素分散した細胞は、容量依存的な色素凝集を受けると予測される。

【0524】

（実施例１１）
（ヒトおよびマウスＲＵＰ４３の組織分布）
ヒトおよびマウス脂肪細胞および骨格筋細胞によるＲＵＰ４３の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ
によって調べた。ヒト白血球サブセットによるＲＵＰ４３の発現を、ＴａｑＭａｎＲＴ
−ＰＣＲによって調べた。

【0525】

（ａ．）
ヒト前脂肪細胞をＢｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒから購入し、未分化のままにさせたか、文
化に供したかのいずれかとした。ヒトの分化した脂肪細胞を、ＺｅｎＢｉｏから購入し
た。ＲＮＡを、これらの未分化ヒト脂肪細胞および分化したヒト脂肪細胞から調製し、ｃ
ＤＮＡに変換した。次いで、ＲＴ−ＰＣＲを行い、以下の特異的プライマーを使用してＲ
ＵＰ４３の発現を調べた：
５’−ＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＧＡＡＧＴＣＴＡ−３’（センスプライマー；配列
番号１１）、および
５’−ＡＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＴ−３’（アンチセンスプライマー；配
列番号１２）
使用したサイクル条件は、９４℃で２分間、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、お
よび７２℃で１分間で、最後の３つの工程について３５サイクルであった。分化したヒト
脂肪細胞によって、そしてより低い程度でヒト前脂肪細胞によって、ＲＵＰ４３が内因性
に発現されていたことを見出した（図２Ａ）。

【0526】

（ｂ．）
ヒト皮下脂肪（「ＳｕｂＱ」）および内臓脂肪によるＲＵＰ４３の発現を、上記（ａ
．）のようにＲＴ−ＰＣＲで調べた。１９〜３５の範囲のＢＭＩを有する１０人の個体か
ら、皮下脂肪サンプルを得た。１９〜４５の範囲のＢＭＩを有する８人の個体から、内臓
脂肪サンプルを得た。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）
のＲＴ−ＰＣＲを使用して、サンプルローディングが同等であることを示した。ヒトＲＵ
Ｐ４３が、皮下脂肪および内臓脂肪の両方において内因性に発現されていることを見出し
た（図２Ｂ）。

【0527】

（ｃ．）
マウス３Ｔ３Ｌ１細胞を、未分化のままにしたか、分化に供した。未分化３Ｔ３Ｌ１細
胞、分化した３Ｔ３Ｌ１細胞、またはマウス骨格筋細胞からＲＮＡを調製した。ＲＮＡか
らｃＤＮＡへの変換を、逆転写酵素の存在下（「＋」）もしくは非存在下（「−」；ネガ
ティブコントロール）のいずれかで行った。次いで、ＲＴ−ＰＣＲを行い、以下の特異的
プライマーを用いてＲＵＰ４３の発現を調べた：
５’−ＴＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴ−３’（センスプライマー；配列
番号１３）、および
５’−ＧＡＴＴＧＴＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣ−３’（アンチセンスプライマー
；配列番号１４）
使用したサイクル条件は、９４℃で２分間、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、お
よび７２℃で１分間で、最後の３つの工程について３５サイクルであった。分化したマウ
ス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞によって、そしてより低い程度でマウス未分化３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞
によって、ＲＵＰ４３が発現されていたことを見出した。ＲＵＰ４３がマウス骨格筋細胞
によって内因性に発現されていたことをまた見出した（図２Ｃ）。

【0528】

（ｄ．）
ヒト骨格筋細胞を、Ｃａｍｂｒｅｘから得た。ＲＮＡを骨格筋細胞から調製し、ｃＤＮ
Ａに変換した。ポジティブコントロールとして、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒから得たヒト
脂肪細胞から上記（ａ．）のように調製したｃＤＮＡを使用した。（ａ．）に記載するよ
うに、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＵＰ４３が、骨格筋細胞によって、そして既に（ａ．）
で示したように脂肪細胞によって、内因性に発現されていたことを見出した（図２Ｄ）。

【0529】

（実施例１２）
（脂肪細胞分化）
（マウス３Ｔ３Ｌ１細胞の分化）
３Ｔ３Ｌ１増殖培地１０００ｍｌ
ＤＭＥＭ１０００ｍｌ
１０％ＢＣＳ１００ｍｌ
Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ１０ｍｌ
Ｐ／Ｓ１０ｍｌ

３Ｔ３Ｌ１通常培地１０００ｍｌ
ＤＭＥＭ１０００ｍｌ
１０％ＦＢＳ１００ｍｌ
Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ１０ｍｌ
Ｐ／Ｓ１０ｍｌ

３Ｔ３Ｌ１誘導培地１０００ｍｌ
ＤＭＥＭ１０００ｍｌ
１０％ＦＢＳ１００ｍｌ
Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ１０ｍｌ
Ｐ／Ｓ１０ｍｌ
インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ
ＩＢＭａｘ（１０ｍｇ／ｍｌ）１１．１ｍｌ
デキサメタゾン（１０ｍｇ／ｍｌ）３２８μｌ

３Ｔ３Ｌ１インスリンのみの培地１０００ｍｌ
ＤＭＥＭ１０００ｍｌ
１０％ＦＢＳ１００ｍｌ
Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ１０ｍｌ
Ｐ／Ｓ１０ｍｌ
インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ

ＤＭＥＭ：ＨＹＱＤＥＭ／高グルコース，ＳＨ３００８１．０１，５００ｍｌ、ＳＨ
３００８１．０２、１０００ｍｌ
ＢＣＳ：仔ウシ血清、ＨｙｃｌｏｎｅＳＨ３００７３．０３
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清、ＨｙｃｌｏｎｅＳＨ３００７１．０３
Ｌ−グルタミン、２００ｍｍ、１００×、ＨｙｃｌｏｎｅＳＨ４０００３−１１
ペニシリン−ストレプトマイシン、１００ｍＭＨｙｃｌｏｎｅＳＶ３００１０
トリプシン、ＨＹＱ、０．０５％１×、ＳＨ３０２３６．０１１００ｍｌ
ＨＹＱＤＰＢＳ／改変、１×、ＳＨ３００２８．０２５０ｍｌ

３Ｔ３Ｌ１細胞を、５０％コンフルエントで播種し、その結果、培養物は翌日に完全に
コンフルエントになった。２日後、細胞は１００％コンフルエントに達し、誘導培地を添
加した。２〜５日後、細胞をインスリンのみの培地へと交換した。誘導の２〜５日後、細
胞を通常培地に２日間戻し、３Ｔ３Ｌ１の脂肪細胞への分化のプロセスを完了した。

【0530】

（ｂ．ヒト前脂肪細胞の分化）
Ｃａｍｂｒｅｘから購入したヒト前脂肪細胞を、２４ウェルプレートに、１×１０^６細
胞／ウェルで播種した。２日後、細胞が１００％コンフルエントに達した場合、Ｃａｍｂ
ｒｅｘから購入した誘導培地を添加した。細胞を誘導培地中で１０日間培養し、それによ
って、初代ヒト前脂肪細胞の脂肪細胞への分化のプロセスを完了した。

【0531】

（実施例１３）
（ヒト骨格筋細胞の分化）
ヒト初代未分化骨格筋細胞を、Ｃａｍｂｒｅｘから購入したＳＫＧＭ−２培地で培養し
た。骨格筋筋芽細胞培養物が５０〜７０％コンフルエントに達した場合、ＳＫＧＭ−２培
地を除去し、融合培地（２％ウマ血清を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２）を添加した。

【0532】

融合培地中での細胞の培養を、（隔日で融合培地を交換しながら）４〜７日間または筋
管芽培養物全体にわたって観察されるまで継続した。

【0533】

得られた分化した培養物が多核（３より多くの核）化した筋管を含むことを観察した。

【0534】

筋管を長期の培養期間を必要とするアッセイにおいて使用すべき場合、融合培地を除去
し、ＳＫＧＭ−２培地と交換した。最高の性能のため、ＳＫＧＭ−２培地を隔日で交換し
、培養物を２〜３週間維持した。筋管培養物を、分化後２週間までに最も良好に使用した
。

【0535】

（実施例１４）
（内因性ＲＵＰ４３はＧｓに結合する）
ＲＵＰ４３によるＧｓ結合を、内因性のヒト、マウスもしくはラットのＲＵＰ４３でト
ランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰの細胞内レベルと、偽トランス
フェクトされたＨＥＫ２９３細胞（「ｐＣＭＶ」）とを比較することによって調べた。細
胞内ｃＡＭＰレベルの決定を、トレーサーとしての^１２５Ｉ（ＮＥＸ１３０）とともにＰ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＦｌａｓｈｐｌａｔｅＫｉｔ（ＳＭＰ００４Ｂ）を使用した
シクラーゼアッセイによって、実質的に製造者の使用説明書のとおりに行った。

【0536】

ＨＥＫ２９３細胞を１．２×１０^７の密度でプレートし、そして一晩接着させた。次い
で、ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＣＭＶ単独もしくは内因性のヒト、マウスもしくはラットの
ＲＵＰ４３をコードするポリヌクレオチドを含むｐＣＭＶで、リポフェクタミン（１２０
ｇ／１５ｃｍディッシュ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞
を、一晩回復させた。アッセイのために、トランスフェクトした細胞を回収し、ｆｌａｓ
ｈｐｌａｔｅのウェルに、１ｘ１０^６細胞の最終細胞数で添加した。これらを接着させ、
次いで２時間トレーサーに供した。次に全てのウェルを吸引し、プレートをマイクロプレ
ートリーダー（Ｗａｌｌａｃ１４５０ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンター）で読み取った
。ＲＵＰ４３でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞内レベルは、偽トランスフ
ェクト細胞よりも有意に高かった。このことは、ＲＵＰ４３が検出可能なレベルの構成的
Ｇｓ結合を表すことを示す（図３）。

【0537】

（実施例１５）
（ＲＵＰ４３のアゴニストとしての化合物１の同定）
（材料）
ＡＴＣＣから得たＨＥＫ２９３細胞を全てのアッセイにおいて使用した。培養培地は、
１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を補充した９０ｍｌのＤＭＥＭから構成され
た。アデニリルシクラーゼ活性化Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ（登録商標）アッセイを使用して
、直接ｃＡＭＰ［^１２５Ｉ］検出システムによりサイクリックＡＭＰ測定値を決定した。

【0538】

（一過性トランスフェクションおよび全細胞シクラーゼＦｌａｓｈｐｌａｔｅアッセイ
）
ＨＥＫ２９３細胞（５×１０^５細胞／ｍｌ）を１５ｃｍディッシュにプレートした。翌
日、ＦｕＧＥＮＥ６試薬（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ）を製造者が
示唆するように使用して、細胞をトランスフェクトした。簡単にいうと、ＯｐｔｉＭＥＭ
（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）およびＦｕＧＥＮＥ６試薬から構成されるトランスフェクショ
ン混合物を、一緒に混合して、室温で５分間インキュベートさせた。２μｇの内因性ヒト
ＲＵＰ４３レセプタープラスミド（トランスフェクト）、もしくは２μｇの空（ｅｍｐｔ
ｙ）ｐＣＭＶベクター（偽）を含む別々のチューブに、トランスフェクション試薬を滴下
し、そして１５分間室温でインキュベートさせた。ＤＮＡ／トランスフェクション混合物
を、各それぞれのプレートに滴下し、３７℃、９５／５％Ｏ_２／ＣＯ_２で維持された加湿
インキュベーターにおいて一晩インキュベートした。翌日、培地を通常の増殖培地と交換
し、細胞を一晩インキュベートした。

【0539】

３日目、細胞をＰＢＳで一回リンスし、非酵素性細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ
）を使用してプレートから剥離させ、そしてｃＡＭＰの測定のため、２×１０^６細胞／ｍ
ｌでアッセイ刺激緩衝液中（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で再懸濁した。化
合物１もしくはビヒクルを刺激緩衝液で２×所望の最終濃度で連続希釈した。化合物１お
よびビヒクル（５０μＬ／ウェル）を、９６ウェルＦｌａｓｈｐｌａｔｅ（登録商標）（
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）のそれぞれのウェルに添加した。トランスフェクト細胞また
は偽細胞を各ウェルに分注し（５０μＬ／ウェル）、室温で、プレート形の振盪機上で１
時間インキュベートさせた。検出緩衝液（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，１０
０μＬ）を各ウェルに添加し、穏やかに攪拌しながら２時間室温でインキュベートした。
２時間のインキュベーションの最後に、プレートを吸引し、Ｗａｌｌａｃ１４５０ｍ
ｉｃｒｏｂｅｔａカウンターを使用してｃＡＭＰレベルを決定した。

【0540】

化合物１が、容量依存的な様式で、内因性ヒトＲＵＰ４３でトランスフェクトされたＨ
ＥＫ２９３細胞において特異的に細胞内ｃＡＭＰを増加させたが、偽トランスフェクト細
胞においては増加させなかったことを見出した。このことは、化合物１を、ＲＵＰ４３の
アゴニストであると同定する（図４）。

【0541】

（実施例１６）
（ＲＵＰ４３のアゴニストとしての化合物２の同定）
メラニン保有細胞技術（実施例１０、上記）を使用して、化合物２が内因性ヒトＲＵＰ
４３のアゴニストであることを見出した（図５）。簡単にいうと、コンフルエントなフラ
スコ（Ｔ−１８５ｃｍ^２フラスコ）から、トリプシン（０．７×）を使用してメラニン保
有細胞を回収し、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。内因性ヒトＲ
ＵＰ４３をコードするポリヌクレオチド（３０μｇ）を、メラニン保有細胞のトランスフ
ェクションのために使用した。エレクトロポレーションの後、非生存細胞および細片を除
去するために、細胞をフラスコ中で約３〜４時間予めプレートした。完了後、次にフラス
コをトリプシン処理し、アッセイのため、３つ組で３８４ポリ−Ｄ−リジンウェルコーテ
ィングしたプレートにプレートした。トランスフェクションの４８時間後、アッセイプレ
ートを分光光度計で読んだ（吸光度Ｔ_０）。次いで、連続希釈した化合物＃２とともに細
胞を１時間インキュベートし（１００μＭ−５１．２ｐＭ、５倍希釈、０．５％ＤＭＳ
Ｏ最終）、再度読んだ（吸光度Ｔ_６０）。３つ組の吸光度データを分析し、％コントロー
ル反応として示し、ポジティブコントロールウェル（２００）およびネガティブコントロ
ールウェル（１００）と比較した。曲線の高さは、コントロールのおよそ９２％であり、
ＥＣ５０＝０．２１２μＭであった。

【0542】

（実施例１７）
（インビトログルコース取り込みアッセイ）
インビトログルコース取り込みアッセイをここに記載されるように行った。

【0543】

（緩衝液および試薬）
飢餓培地：ＤＭＥＭ／０．５％ＢＳＡを含む高グルコース
ＫＲＰＨ緩衝液：
５ｍＭＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．４（ＫＲＰＨ緩衝液は各回に新たに作製）
２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４
１ｍＭＭｇＳＯ_４
１ｍＭＣａＣｌ_２
１３６ｍＭＮａＣｌ
４．７ｍＭＫＣｌ
１％ＢＳＡ
２−デオキシグルコース（ＤＯＧ）：ストック１００ｍＭ：水中１６．４ｍｇ／ｍｌ（
４℃で１〜２週間保存）
各ウェルに、１μＣｉ［^３Ｈ］−２−ＤＯＧを含む１μｌおよび１μｌ冷ストック２−
ＤＯＧおよび２ｍｌのＫＲＰＨを添加
サイトカラシンＢ（ＣｙｔｏＢ）：ストック（９５％エタノール中１０ｍＭ）：−２０
℃に保つ
ＣｙｔｏＢを１０μＭ最終で使用し、キャリア媒介性取り込みをブロックする。最後に
またこの濃度を使用して反応を停止させる。停止緩衝液は、ＰＢＳ＋１０μＭＣｙｔｏ
Ｂ（「ＰＢＳ」）である
１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ：これは可溶化緩衝液である
細胞を２４ウェルプレートにプレートする
（手順）
１．少なくとも２時間、細胞を飢餓状態にする
２．細胞をＫＲＰＨ緩衝液で２回洗浄し、２ｍｌのＫＲＰＨをウェルに添加する
３．細胞を、２０分間、インスリンおよび／もしくは試験化合物で処理するか、または
ビヒクルで処理する（コントロール）
４．２０分後、緩衝液をウェルから吸引し、直ちに１ｍｌのＫＲＰＨ緩衝液＋２−ＤＯ
Ｇを添加する。ＣｙｔｏＢ処理細胞については、ＣｙｔｏＢを取り込みアッセイ前に５分
間添加する
５．４分後、ウェルから緩衝液を吸引し、そして３ｍｌの冷ＰＢＳを添加する。アッセ
イを完了した後、各ウェルにおいて細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄する。停止ＰＢＳを完全に
吸引し、次いで７００μｌの１％ＴｒｉｔｏｎＸを添加する。３７℃のインキュベー
ターに３０分おく
６．全溶解液のＣＰＭを計数する。ＣＰＭ／ウェルを計算する
ＣｙｔｏＢ値をインスリンおよび／もしくは試験化合物で処理された細胞、ならびにビ
ヒクルで処理された細胞（コントロール）の各々について得られた価から引き算する。

【0544】

（実施例１８）
（化合物２は、マウス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激する）
分化したマウス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を、種々の時間、５０μＭの化合物２で処理した。
その後、実施例１７に従ってグルコース取り込みを決定した。図６より、化合物２が３Ｔ
３Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激したことは明らかである。この結果は
、ＲＵＰ４３アゴニストが、高グルコース血症におけるインスリンで制御できないグルコ
ースレベルを調節するための魅力的な候補であることを示す。刺激されたグルコース取り
込みの迅速な時間経過は、血中グルコース濃度を低下させるために、ＲＵＰ４３アゴニス
トは現在利用可能な薬物よりも、より迅速な治療効果を提供し得ることを示唆する。

【0545】

（実施例１９）
（化合物２は、マウス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込
みを増強する）
分化したマウス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を、化合物２あり（「化合物２」）、またはなし（
「コントロール」）で、無血清培地において３時間処理した。次いで、３Ｔ３Ｌ１細胞を
新鮮なＫＲＰＨ緩衝液で２回洗浄し、そして種々の濃度のインスリンで２０分間処理した
。インスリンによる処理後、実施例１７に従ってグルコース取り込みを決定した。図７よ
り、化合物２が３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強
したことは明らかである。この結果は、ＲＵＰ４３アゴニストがインスリン効力を増加し
、それによって最大のグルコース取り込みを達成するのに必要とされるインスリン濃度を
低下させ得ることを示す。

【0546】

（実施例２０）
（化合物２は、ヒト初代ヒト脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激する）
ヒト前脂肪細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ）を脂肪細胞へと分化させた。この分化させた初代ヒ
ト脂肪細胞を、５０μＭの化合物２ありもしくはなしで、３時間無血清培地中で処理した
。次いで、ヒト脂肪細胞を新鮮なＫＲＰＨ緩衝液で２回洗浄し、１００ｎＭインスリンあ
りまたはなしで、２０分間処理した。インスリンありまたはなしでの処理の後、グルコー
ス取り込みを実施例１７に従って決定した。図８より、化合物２が初代ヒト脂肪細胞にお
けるグルコース取り込みを刺激したことは明らかである。図８より、化合物２が初代ヒト
脂肪細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強したことがまた明らかであ
る。顕著なことに、マウス３Ｔ３Ｌ１細胞に関して観察されたように、ＲＵＰ４３アゴニ
ストは、インスリンの非存在下で初代ヒト脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激し
得、そしてＲＵＰ４３刺激性グルコース取り込みのレベルは、インスリン刺激性グルコー
ス取り込みのレベルに匹敵する。

【0547】

（実施例２１）
（化合物２はラットＬ６筋芽細胞におけるグルコース取り込みを刺激する）
ラット骨格筋Ｌ６筋芽細胞をＡＴＣＣから得て、２４ウェルプレートでコンフルエント
まで増殖させた。

【0548】

（ａ．）
コンフルエントなＬ６細胞を、種々の濃度の化合物２ありまたはなしで、無血清倍地中
で３時間処理した。次いで、Ｌ６細胞をＫＲＰＨ緩衝液で２回洗浄した。化合物２で処理
したＬ６細胞を、ＫＲＰＨ緩衝液とともに２０分間インキュベートし；化合物２で処理し
なかったＬ６細胞を、１０ｎＭもしくは１００ｎＭのインスリンとともに２０分間インキ
ュベートした。インスリンありもしくはなしでの処理の後、グルコース取り込みを実施例
１７に従って決定した。図９Ａより、化合物２がラットＬ６筋芽細胞におけるグルコース
取り込みを増強したことは明らかである。ＲＵＰ４３アゴニストは、ラットＬ６筋芽細胞
において、インスリンより多くのグルコース取り込みを刺激した。骨格筋細胞は、インビ
ボにおけるグルコース処理の８０％に関与し、得られた結果は、ＲＵＰ４３アゴニストが
、インビボにおいてインスリンより良好なグルコース処理を提供するための、魅力的な候
補であることを示す。

【0549】

（ｂ．）
コンフルエントなＬ６筋芽細胞を、５０μＭの化合物２で、種々の時間処理した。各処
理期間の終わりに、グルコース取り込みを実施例１７に従って決定した。結果は、ＲＵＰ
４３アゴニストが２０分（インスリンの時間枠と同様の時間枠）以内に骨格筋細胞におけ
るグルコース取り込みを刺激し得ることを示す（図９Ｂ）。この結果は、ＲＵＰ４３アゴ
ニストが、インスリンに匹敵する短い時間内でインビボにおけるグルコースレベルを調節
するための、魅力的な候補であることを示す。

【0550】

（実施例２２）
（化合物２は、ラットＬ６筋芽細胞におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増
強する）
コンフルエントなラットＬ６筋芽細胞を、５０μＭの化合物２ありまたはなしで、３時
間無血清倍地中で処理した。次いで、Ｌ６細胞を新鮮なＫＲＰＨ緩衝液で２回洗浄した。
次に、Ｌ６細胞を、１００ｎＭインスリンありまたはなしで、２０分間処理した。インス
リンありまたはなしでの処理の後、グルコース取り込みを実施例１７に従って決定した。
図１０より、脂肪細胞について観察された結果と同様に、化合物２がラットＬ６筋芽細胞
におけるインスリン刺激性グルコース取り込みを増強したことは明らかである。この結果
は、ＲＵＰ４３アゴニストがインスリン効力を増加し、それによって最大のグルコース取
り込みを達成するのに必要とされるインスリン濃度を低下させ得ることをさらに示す。し
たがって、ＲＵＰ４３は、高インスリン血症を原因とする、インスリン抵抗性に関する問
題を被る個体にとっての魅力的な治療選択肢であることを示している。

【0551】

（実施例２３）
（化合物２は、初代ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを刺激する）
Ｃａｍｂｒｅｘから得られた初代ヒト骨格筋細胞を５０％コンフルエントまで増殖させ
、次に誘導培地での５〜７日間の培養により分化させた。分化した初代ヒト骨格筋細胞を
次に増殖倍値に７〜１０日間移した。

【0552】

（ａ．）
分化したヒト骨格筋細胞を、種々の濃度の化合物２ありまたはなしで、無血清倍地中で
３時間処理した。化合物２ありもしくはなしでの処理の後、細胞を新鮮なＫＲＰＨ緩衝液
で２回洗浄した。次いで、化合物２で処理したＬ６細胞を、ＫＲＰＨ緩衝液とともに２０
分間インキュベートし；化合物２で処理しなかったＬ６細胞を、１０ｎＭもしくは１００
ｎＭのインスリンとともに２０分間インキュベートした。インスリンありもしくはなしで
の処理の後、グルコース取り込みを実施例１７に従って決定した。図１１Ａより、ＲＵＰ
４３アゴニストが、インスリンの非存在下で、かつインスリンよりも効率的に、ヒト骨格
筋細胞におけるグルコース取り込みを調節し得ることは明らかである。得られた結果は、
ＲＵＰ４３アゴニストが、グルコース処理の８０％が起こるヒト骨格筋細胞におけるグル
コース取り込みの刺激に有効であることを示す。この結果は、ＲＵＰ４３アゴニストが、
インスリン作用に対して無反応性の高グルコース血症におけるグルコースレベルを制御す
るための、魅力的な候補であることを示す。

【0553】

（ｂ．）
分化したヒト骨格筋細胞を、５０μＭの化合物２で、種々の時間処理した。各処理期間
の終わりに、グルコース取り込みを実施例１７に従って決定した。得られた結果を図１１
Ｂに提示する。ＲＵＰ４３アゴニストに対して観察されたヒト骨格筋細胞におけるグル
コース取り込みの迅速な刺激は、ＲＵＰ４３アゴニストが、インビボにおいてグルコ−ス
レベルを直接的に、かつ短い時間内に調節するための、魅力的な候補であることを示す。

【0554】

（実施例２４）
（経口バイオアベイラビリティ）
経口バイオアベイラビリティを直接的に評価するための物理化学分析アプローチが、当
業者に周知であり、使用され得る［例えば、限定ではなく以下を参照のこと：Ｗｏｎｇ
ＰＣら，ＣａｒｄｉｏｖａｓｃＤｒｕｇＲｅｖ（２００２）２０：１３７−５２；お
よびＢｕｃｈａｎＰら，Ｈｅａｄａｃｈｅ（２００２）補遺２：Ｓ５４−６２；これら
の各々の開示は、その全体が本明細書において参考として援用される］。さらなる例示の
ためであって限定のためではなく、上記代替的アプローチは、液体クロマトグラフィータ
ンデム質量分析計［Ｃｈａｖｅｚ−ＥｎｇＣＭら，ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢＡｎ
ａｌｙｔＴｅｃｈｎｏｌＢｉｏｍｅｄＬｉｆｅＳｃｉ（２００２）７６７：１１
７−２９；ＪｅｔｔｅｒＡら，ＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ（２００２）
７１：２１−９；ＺｉｍｍｅｒｍａｎＪＪら，ＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ（１
９９９）３９：１１５５−６１；およびＢａｒｒｉｓｈＡら，ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕ
ｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ（１９９６）１０：１０３３−７；これらの各々の開示
は、その全体が本明細書において参考として援用される］。近年、陽電子断層撮影法（Ｐ
ＥＴ）が、薬物の経口投与後の哺乳動物の体における薬物分布の直接測定値（経口バイオ
アベイラビリティを含む）を得るために、うまく使用されている［Ｇｕｌｙａｓら，Ｅｕ
ｒＪＮｕｃｌＭｅｄＭｏｌＩｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３１−８；
この開示は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。

【0555】

あるいは、例として、例示のためであって限定のためではなく、実施例２６のマウスモ
デルを介して、開発されたインビボデータに基づく。モジュレーターは、０．１ｍｇｋｇ
^−１〜１００ｍｇｋｇ^−１の範囲の用量での経口（ｏｒａｌｇａｖａｇｅ）で投与され
る。モジュレーターの効果は、用量依存性であり、腹腔内投与後の効果に匹敵することが
示されている。ここで、この効果は、血中グルコース濃度を低下させる（実施例２６）。
経口投与を介する有益な効果である減少の、最大の半分を達成するために必要とされるモ
ジュレーターの用量は、腹腔内投与を介する有益な効果である減少の、最大の半分を達成
するために必要とされるモジュレーターの用量に匹敵する。例示のため、上記経口用量が
、上記腹腔内用量の２倍である場合、モジュレーターの経口バイオアベイラビリティは、
５０％である。より一般的には、上記経口用量がθｍｇｋｇ^−１であり、そして上記腹腔
内用量がρｍｇｋｇ^−１である場合、パーセンテージとしてのこのモジュレーターの経口
バイオアベイラビリティは、［（ρ／θ）×１００］である。

【0556】

（実施例２５）
（血液脳関門モデル）
本発明の化合物の血液脳関門を横切る能力を、脳由来の細胞を使用して決定し得る。想
定される１つの方法は、例示のためであって限定のためではなく、脳毛細管内皮細胞およ
び星状細胞の共培養物を使用する。Ｄｅｈｏｕｃｋら［ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９
０）５４：１７９８−８０１；本明細書によって、その全体が参考として援用される］の
血液／脳関門モデルを使用することである。

【0557】

ウシ毛細管内皮（ＢＢＣＥ）細胞を単離し、Ｍｅｒｅｓｓｅら［ＪＮｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ（１９８９）５３：１３６３−１３７１；本明細書によって、その全体が参考として援
用される］に記載されるように特徴付ける。簡単にいうと、ウシ脳の半球からの単離後、
機械的ホモジネーションにより、微小血管を、ウシ角膜内皮によって分泌された細胞外マ
トリックスでコーティングされたディッシュに播種する。播種の５日後、第１の内皮細胞
は毛細管から移動し、微小コロニーを形成し始める。このコロニーが十分に大きくなった
場合、５つの最も大きな島をトリプシン処理し、３５ｍｍ径のゼラチンコーティングされ
たディッシュ上に、１５％仔ウシ血清（Ｓｅｒｏｍｅｄ）、３ｍＭグルタミン、５０μｇ
／ｍｌのゲンタマイシン、２．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）
、およびウシ線維芽細胞成長因子（１ｎｇ／ｍｌ、隔日で添加）を補充したダルベッコ改
変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の存在下で播種する（１クローン／ディッシュ）。１つの３
５ｍｍ径ディッシュ由来の内皮細胞を、コンフルエントな状態で回収し、６０ｍｍ径のゼ
ラチンコーティングされたディッシュに播種する。６〜８日後、コンフルエントな細胞を
１：２０の分割比で継代培養する。継代第３代の細胞（約１００ディッシュ）を液体窒素
中に保存する。

【0558】

星状細胞の初代培養を新生仔ラットの大脳から作製する。髄膜を除去した後、脳組織を
、ＢｏｏｈｅｒおよびＳｅｎｓｅｎｂｒｅｎｎｅｒ［Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７
２）２：９７−１０５；本明細書によって、その全体が参考として援用される］によって
記載されるように、穏やかにナイロンシーブに通す。１０％ウシ胎仔血清（Ｓｅｒｏｍｅ
ｄ）、２ｍＭグルタミン、および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充されたＤＭＥＭ
を、大脳組織の解離および星状細胞の発達のために使用する。

【0559】

培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ；孔サイズ０．４μＭ；直径、３
０ｍｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ［ＬａｂＩｎｖｅｓｔ（１９５
８）７：１３４−１３９；本明細書によって、その全体が参考として援用される］の方法
の改変によって調製されるラット尾部コラーゲンで、両側からコーティングする。

【0560】

星状細胞を、フィルターを裏返しに用いて底部側に、２．５×１０^５細胞／ｍｌの濃度
でプレートする。８日後、フィルターを適切に配置し、週に２回培地を交換する。播種の
３週後、星状細胞の培養物は安定化する。次いで、継代第３代で凍結されたＢＢＣＥ細胞
を、６０ｍｍ径のゼラチンコーティングされたディッシュ上で再培養する。コンフルエン
トな細胞をトリプシン処理し、フィルターの上側に４×１０^５細胞の濃度でプレートする
。共培養のために使用される培地は、１５％ウシ血清、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍ
ｌのゲンタマイシンおよび１ｎｇ／ｍｌの、隔日で添加されるウシ線維芽細胞成長因子を
補充されたＤＭＥＭである。これらの条件下で、ＢＢＣＥ細胞は、８日以内にコンフルエ
ントな単層を形成する。

【0561】

培養プレートを６ウェルプレートに設定し、上部チャンバーに２ｍｌの緩衝液を添加し
、そして２ｍｌをインサートを含有するプレートに添加する。この６ウェルプレートを、
３７℃の浸透する水浴に配置する。上部チャンバーに本発明の化合物を添加し、１００μ
ｌを下部チャンバーから種々の時点で除去する。特定の実施形態においては、試験化合物
を放射性標識する。特定の実施形態においては、この放射性標識は、^３Ｈもしくは^１４Ｃ
である。いくつかの実施形態において、最終時点は約２０分、約３０分、約４０分、約５
０分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分。下部チャンバーに存在する全試験化合
物のパーセンテージを、種々の時点で決定する。ロイシンは、透過性のポジティブコント
ロールとして使用される。イヌリンは、透過性のネガティブコントロールとして使用され
る。

【0562】

特定の実施形態において、最終時点での下部チャンバーにおける本発明の化合物の、少
なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少
なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、ま
たは少なくとも約９０％の測定は、本発明の化合物が血液脳関門を横切ることができると
いう指標である。

【0563】

（実施例２６）
（ラットにおけるグルコースホメオスタシスに対するＲＵＰ４３アゴニストのインビボ
効果）
（Ａ．ラットにおける経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ））
１０週齢の雄性Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病脂肪性（ＺＤＦ）ラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖ
ｅｒ）を、１８時間絶食させ、無作為に群に分け（ｎ＝１１）、ＲＵＰ４３アゴニストを
種々の用量で受容させるか、またはコントロールの、インスリン感受性を増加させること
が公知であるロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（ＲＳＧ、１０ｍｇ／ｋｇ
）で処理する。ＲＵＰ４３アゴニストを腹腔内に送達する。ＲＳＧを腹腔内に送達する。
好ましいＲＵＰ４３アゴニストの用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好まし
い用量は、以下からなる群より選択される：０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．
０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／
ｋｇ。プラシーボ群にはビヒクルを投与する。

【0564】

試験化合物およびコントロールＲＳＧの投与の３０分後、２ｇ／ｋｇ用量で、ラットに
デキストロースを経口投与する。ＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒＥｌｉｔｅＸＬ（Ｂａｙｅｒ
）を使用して、種々の時点で血中グルコースレベルを決定する。デキストロース投与の時
点を「０分」として取ると、例示的な時点は−３０分、０分、３０分、６０分、９０分、
および１２０分である。平均グルコース濃度を、各処置群の１１匹の動物から平均する。
これらの結果は、ラットにおいて、グルコース負荷の後、ＲＵＰ４３アゴニストが用量依
存的な様式で血中グルコースレベルを低下させることを実証し得る。

【0565】

あるいは、本明細書において記載される経口ブドウ糖負荷試験は、ＲＵＰ４３アゴニス
ト、ＲＳＧまたはビヒクルの７回の毎日投与の直後にラットにおいて実施される。

【0566】

本明細書において記載される経口ブドウ糖負荷試験が種々の動物（例えば、マウス、ウ
サギ）においてもまた実施され得ることが、明確に企図される。

【0567】

（Ｂ．ＺＤＦラットのＲＵＰ４３アゴニスト対する急性応答）
１０週齢の雄性Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病脂肪性（ＺＤＦ）ラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖ
ｅｒ）を、無作為に群に分け（ｎ＝６）、ビヒクル（腹腔内）、ＲＵＰ４３アゴニスト（
腹腔内）、またはロシジタゾン（ＲＳＧ、１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を受容させた。ＲＵ
Ｐ４３アゴニストの好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用
量は、以下からなる群より選択される：０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍ
ｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ
。化合物投与の後、食物を除去し、そして種々の時点で血中グルコースレベルを決定する
。グルコースレベル決定の例示的時間は、０時間、１時間、２時間、３時間および４時間
であり、そして毎日１週間までである。各時点での血中グルコースレベルの低下は、元の
グルコースレベルのパーセンテージとして表現され、各群について６動物から平均する。
これらの動物は、３００〜４００ｍｇ／ｄｌの血中グルコースレベル（給餌状態）を有す
る。これは、非糖尿病の野生型動物よりも有意に高い。ＲＵＰ４３アゴニストもしくはＲ
ＳＧによる処理は、ビヒクルコントロールに対してグルコースレベルの有意な低下を示し
得る。これらのデータは、ＲＵＰ４３アゴニストが糖尿病動物におけるグルコースホメオ
スタシスを改善するという効力を有することを実証し得る。

【0568】

あるいは、ラットは、血中グルコースレベルが７日間毎日決定される直後に、ＲＵＰ４
３アゴニスト、ＲＳＧまたはビヒクルを用いて、７日間毎日注射される。

【0569】

本明細書において記載される急性応答試験が種々の動物（例えば、マウス、ウサギ）に
おいてもまた実施され得ることが、明確に企図される。

【0570】

（実施例２７）
（本発明の化合物の合成）
（実施例２７Ａ：２−｛１−［２−（２−クロロ−フェニル）−アセチル］−ピペリジン
−４−イル｝−チアゾール−４−カルボン酸メチル２−メチル−４，５，６，７−テト
ラヒドロ−２Ｈ−インダゾール−３−イル）−アミド）
（２−ピペリジン−４−イル−チアゾール−４−カルボン酸エチルエステル二臭化水素
酸塩）
３０ｍＬのＥｔＯＨ中のｔｅｒｔ−ブチル−４−（アミノカルボチオイル）テトラヒド
ロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシレート（２．０ｇ、８．２ｍｍｏｌ）およびエチル
ブロモピルベート（１．６ｇ、８．２ｍｍｏｌ）の溶液を、８０℃で４時間攪拌した。そ
の後、この混合物を室温に冷却し、そして４８％のＨＢｒ（１．０ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）
を充填した。この反応混合物をさらに１時間攪拌し、次いで濃縮して油状の固体とした。
ジエチルエーテルで粉砕して３．０ｇ（９１％）の褐色個体を得た。^１ＨＮＭＲ（４０
０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ９．０２（ｂｒｓ，１Ｈ），８．７７（ｂｒｓ，１Ｈ
），８．４６（ｓ，１Ｈ），７．０１（ｂｒｓ，１Ｈ），４．２９（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈ
ｚ，２Ｈ），３．４４−３．３３（ｍ，３Ｈ），３．０２（ｑ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２Ｈ
），２．１９（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９７−１．８８（ｍ，２Ｈ），１．
２９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。Ｃ_１１Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_２Ｓ＋ＨについてのＭＳ：計算
値２４１、観察値２４１。

【0571】

（２−｛１−［２−（２−クロロ−フェニル）−アセチル］−ピペリジン−４−イル｝
−チアゾール−４−カルボン酸エチルエステル）
３０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中の２−ピペリジン−４−イル−チアゾール−４−カルボン酸
エチルエステル二臭化水素酸塩（１．０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、２−クロロフェニル酢酸
（０．５５ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ
，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．４ｇ、３
．５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｏｓｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌ
ａｍｉｎｅ）（３．０ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）の溶液を、４０℃で８時間攪拌した。その後
、３０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で粗混合物を希釈し、１Ｍクエン酸（３×５０ｍＬ）で洗浄し
、ＮａＨＣＯ_３水溶液（１×３０ｍＬ）で飽和させ、ＮａＣｌ水溶液（１×３０ｍＬ）で
飽和させた。得られた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して褐色の油状物と
した。ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（３：１）によるシリカゲル上での精製により、０．９４ｇ
（７５％）の淡褐色の油状物を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．
０８（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ
，Ｊ＝７．２，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２５−７．１９（ｍ，２Ｈ），４．７６（ａｐ
ｐａｒｄ，１Ｈ），４．４２（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．９９−３．９５（ｍ
，１Ｈ），３．８８（ｄ，ＡＢパターン，Ｊ_ＡＢ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８３（ｄ
，ＡＢパターン，Ｊ_ＡＢ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｔｔ，Ｊ＝１１．７，３．
７Ｈｚ，１Ｈ），３．２１−３．１４（ｍ，１Ｈ），２．８３−２．７６（ｍ，１Ｈ），
２．２０−２．１６（ｍ，２Ｈ），１．７４（ｑｄ，Ｊ＝１２．３，４．１Ｈｚ，１Ｈ）
，１．６３（ｑｄ，Ｊ＝１２．３，４．０Ｈｚ，１Ｈ），１．４０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ
，３Ｈ）。Ｃ_１９Ｈ_２１ＣｌＮ_２Ｏ_３Ｓ＋ＨについてのＭＳ：計算値３９３、観察値３９
３。

【0572】

（２−｛１−［２−（２−クロロ−フェニル｝−アセチル］−ピペリジン−４−イル｝
−チアゾール−４−カルボン酸）
２０ｍＬのＭｅＯＨ中の２−｛１−［２−（２−クロロ−フェニル）−アセチル］−ピ
ペリジン−４−イル｝−チアゾール−４−カルボン酸エチルエステル（０．９４ｇ，２．
４ｍｍｏｌを、１ＭＮａＯＨ（２０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）で希釈し、６０℃で４時間攪
拌した。その後、粗混合物を濃縮し、ＭｅＯＨ溶媒を除去した。次いで、この水性の塩基
性溶液をＣＨ_２Ｃｌ_２（２×２５ｍＬ）で洗浄し、５ＭのＨＣｌでｐＨ＝１に酸性化した
。得られた酸性の水溶液を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ
、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、０．５１ｇ（５８％）の白色の泡沫状の固
体を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１２．９６（ｂｒｓ，１
Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），７．４５−７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．２５（
ｍ，３Ｈ），４．４３（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈ
ｚ，１Ｈ），３．８７（ｄ，ＡＢパターン，Ｊ_ＡＢ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（
ｄ，ＡＢパターン，Ｊ_ＡＢ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３８−３．３１（ｍ，１Ｈ），
３．２５（ａｐｐａｒｔ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．７９（ａｐｐａｒｔ，Ｊ
＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），２．０８（ｔ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６７（ｑｄ，
Ｊ＝１２．１，３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．５３（ｑｄ，Ｊ＝１２．２，４．０Ｈｚ，１Ｈ
）。Ｃ_１７Ｈ_１７ＣｌＮ_２Ｏ_３Ｓ＋ＨについてのＭＳ：計算値３６５、観察値３６５。

【0573】

（２−｛１−［２−（２−クロロ−フェニル）−アセチル］−ピペリジン−４−イル｝
−チアゾール−４−カルボン酸メチル−（２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−
２Ｈ−インダゾール−３−イル）−アミドジヒドロ二塩酸塩）
１０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中のＮ，１−ジメチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ
−インダゾール−３−アミン（２３ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ），Ｏ−（７−アザベンゾト
リアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ
ホスフェート（７５ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）および２−｛１−［２−（２−クロロ−フ
ェニル）−アセチル］−ピペリジン−４−イル｝−チアゾール−４−カルボン酸（５０ｍ
ｇ，０．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、４０℃ｐで８時間攪拌した。その後、粗混合物を２０
ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、１Ｍのクエン酸（３×３０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＨＣＯ_３
水溶液（１×３０ｍＬ）で飽和させ、ＮａＣｌ溶液（１×３０ｍＬ）で飽和させた。得ら
れた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮して、黄色の油状物を得た。勾配ＨＰＬＣ（ア
セトニトリル−水、０．１％ＴＦＡによる）により精製し、二塩酸塩に変換して５６ｍ
ｇ（７０％）の白色固体を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ８．２８
（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４３−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２６
（ｍ，３Ｈ），４．５０（ｔ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０９−４．０３（ｍ，１
Ｈ），３．９８−３．９１（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，３Ｈ），３
．３７（ｓ，３Ｈ），３．２４−３．２０（ｍ，１Ｈ），２．８９−２．８２（ｍ，１Ｈ
），２．８３−２．６６（ｍ，２Ｈ），２．４７−２．４１（ｍ１Ｈ），２．０３−１
．８８（ｍ，４Ｈ），１．７２−１．６０（ｍ，３Ｈ），１．４６−１．２６（ｍ，３Ｈ
）。Ｃ_２６Ｈ_３０ＣｌＮ_５Ｏ_２Ｓ＋ＨについてのＭＳ：計算値５１２、観察値５１２。

【0574】

（実施例２７Ｂ：２−（２−クロロ−フェニル）−１−｛４−［４−（３，４−ジヒド
ロ−２Ｈ−キノリン−１−カルボニル）−チアゾール−２−イル］−ピペリジン−１−イ
ル｝−エタノン）
実施例２９Ａと同様の一般的手順によって、１，２，３，４−テトラヒドロキノリンか
ら２−（２−クロロ−フェニル）−１−｛４−［４−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリ
ン−１−カルボニル）−チアゾール−２−イル］−ピペリジン−１−イル｝−エタノンを
黄色の油状物として得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ７．７８（ｓ，
１Ｈ），７．４２−７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２４（ｍ，３Ｈ），７．１８
（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｔ
，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｂｒｓ，１Ｈ），４．２８（ｄ，Ｊ＝１２．８
Ｈｚ，１Ｈ），３．９４−３．８１（ｍ，５Ｈ），３．３０−３．２０（ｍ，２Ｈ），２
．９８−２．９１（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０４（四
重項，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．９９−１．９３（ｂｒｍ，２Ｈ），１．６０−１
．５１（ｍ，２Ｈ）。Ｃ_２６Ｈ_２６ＣｌＮ_３Ｏ_２Ｓ＋ＨについてのＭＳ：計算値４８０、
観察値４８０。

【0575】

（実施例２７Ｃ：２−｛１−［２−（２−フルオロ−フェニル）−アセチル］−ピペリ
ジン−４−イル｝−チアゾール−４−カルボン酸メチル−（２−メチル−４，５，６，７
−テトラヒドロ−２Ｈ−インダゾール−３−イル）−アミド）
実施例２９Ａと同様の一般的手順によって、２−｛１−［２−（２−フルオロ−フェ
ニル）−アセチル］−ピペリジン−４−イル｝−チアゾール−４−カルボン酸から２−｛
１−［２−（２−フルオロ−フェニル）−アセチル］−ピペリジン−４−イル｝−チアゾ
ール−４−カルボン酸メチル−（２−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−イ
ンダゾール−３−イル）−アミドを白色固体として得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ_３）δ７．７１（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈ
ｚ，１Ｈ），７．２６−７．２２（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）
，７．０５（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ａｐｐａｒｔ，Ｊ＝１３．６Ｈ
ｚ，１Ｈ），３．９０−３．７９（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，２Ｈ），３．６３（ｄ，
Ｊ＝４．４Ｈｚ，３Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），３．１７−３．１１（ｍ，１Ｈ），３
．０４−２．９５（ｍ，１Ｈ），２．９１−２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６１−２．４３
（ｍ，２Ｈ），２．２７（ｄｔ，Ｊ＝１５．３，５．７Ｈｚ，１Ｈ），１．９９−１．８
８（ｍ，３Ｈ），１．７９−１．７２（ｍ，１Ｈ），１．６４−１．３８（ｍ，５Ｈ）。
Ｃ_２６Ｈ_３０ＦＮ_５Ｏ_２Ｓ＋ＨについてのＭＳ：計算値４９６、観察値４９６。

【図面の簡単な説明】

【0576】

【図1】例示のためであって限定のためではなく、図１は、ＲＵＰ４３に関連のない、内因性の構成的に活性なＧｓ共役ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質構築物である「標的レセプター」に対する候補化合物の一次スクリーニングの結果を示す。「化合物Ａ」についての結果をウェルＡ２に提供する。「化合物Ｂ」についての結果をウェルＧ９に提供する。（実施例７を参照のこと。）

【図2A】脂肪細胞および骨格筋細胞によるＲＵＰ４３発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ヒト脂肪細胞およびマウス脂肪細胞は、ＲＵＰ４３を発現する。ヒト骨格筋細胞およびマウス骨格筋細胞は、ＲＵＰ４３を発現する。（実施例１１を参照のこと。）

【図2B】脂肪細胞および骨格筋細胞によるＲＵＰ４３発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ヒト脂肪細胞およびマウス脂肪細胞は、ＲＵＰ４３を発現する。ヒト骨格筋細胞およびマウス骨格筋細胞は、ＲＵＰ４３を発現する。（実施例１１を参照のこと。）

【図2C】脂肪細胞および骨格筋細胞によるＲＵＰ４３発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ヒト脂肪細胞およびマウス脂肪細胞は、ＲＵＰ４３を発現する。ヒト骨格筋細胞およびマウス骨格筋細胞は、ＲＵＰ４３を発現する。（実施例１１を参照のこと。）

【図2D】脂肪細胞および骨格筋細胞によるＲＵＰ４３発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ヒト脂肪細胞およびマウス脂肪細胞は、ＲＵＰ４３を発現する。ヒト骨格筋細胞およびマウス骨格筋細胞は、ＲＵＰ４３を発現する。（実施例１１を参照のこと。）

【図3】内因性ＲＵＰ４３は、Ｇｓに共役する。（実施例１４を参照のこと。）

【図4】ＲＵＰ４３のアゴニストとしての化合物１の同定。（実施例１５を参照のこと。）

【図5】ＲＵＰ４３のアゴニストとしての化合物２の同定。（実施例１６を参照のこと。）

【図6】化合物２は、化合物２によるマウス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激する。（実施例１８を参照のこと。）

【図7】化合物２は、マウス３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞におけるインスリンによって刺激されたグルコース取り込みを増強する。（実施例１９を参照のこと。）

【図8】化合物２は、初代ヒト脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激する。（実施例２０を参照のこと。）

【図9A】化合物２は、ラットＬ６筋芽細胞におけるグルコース取り込みを刺激する。（実施例２１を参照のこと。）

【図9B】化合物２は、ラットＬ６筋芽細胞におけるグルコース取り込みを刺激する。（実施例２１を参照のこと。）