特許 5769701 脂質組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5769701

(24)【登録日】2015年7月3日

(45)【発行日】2015年8月26日

(54)【発明の名称】脂質組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/127 20060101AFI20150806BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 47/34 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20150806BHJP

   C07D 403/12 20060101ALI20150806BHJP

   C07D 233/36 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 47/42 20060101ALI20150806BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/127

   A61K47/24

   A61K47/28

   A61K47/34

   A61K47/22

   A61K47/26

   A61K31/7088

   A61K31/713

   A61K48/00

   C07D403/12CSP

   C07D233/36

   A61K47/42

【請求項の数】37

【全頁数】113

(21)【出願番号】特願2012-509956(P2012-509956)

(86)(22)【出願日】2010年5月5日

(65)【公表番号】特表2012-526135(P2012-526135A)

(43)【公表日】2012年10月25日

(86)【国際出願番号】US2010033777

(87)【国際公開番号】WO2010129709

(87)【国際公開日】20101111

【審査請求日】2012年6月15日

(31)【優先権主張番号】61/175,770

(32)【優先日】2009年5月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/299,291

(32)【優先日】2010年1月28日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】513146871

【氏名又は名称】テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ムティアー・マノハラン

(72)【発明者】

【氏名】カラントッタティル・ジー・ラジーヴ

(72)【発明者】

【氏名】ムトゥサミー・ジャヤラマン

(72)【発明者】

【氏名】デヴィッド・バトラー

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・イー・チョン

【審査官】 天野 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５１１１１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０４２９７３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／１２７

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

Ａ６１Ｋ ４７／２２

Ａ６１Ｋ ４７／２４

Ａ６１Ｋ ４７／２６

Ａ６１Ｋ ４７／２８

Ａ６１Ｋ ４７／３４

Ａ６１Ｋ ４７／４２

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ｃ０７Ｄ ２３３／３６

Ｃ０７Ｄ ４０３／１２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ステロール、中性脂質、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質および式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）

【化1】

の化合物またはこれらの混合物を含み、
式中、各々のＲは独立に、

【化2】

であり、
ここで、Ｒ^１は、Ｈであり、
Ｒ^２は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｙは、Ｏである、組成物。

【請求項2】

Ｒが、少なくとも３つの存在について、

【化3】

である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

Ｒ^２がアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

Ｒ^２がアルキルである、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

Ｒが、少なくとも３つの存在について、

【化4】

である、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

式（Ｖ）

【化5】

の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

式（ＶＩ）

【化6】

の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物が、それらの無機塩または有機塩である、請求項１、６または７に記載の組成物。

【請求項9】

式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物が、有機酸の塩である、請求項１、６または７に記載の組成物。

【請求項10】

式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物が水和物の形態である、請求項１、６または７に記載の組成物。

【請求項11】

前記ステロールがコレステロールである、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記中性脂質がジステアロイルホスファチジルコリンである、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物が、約２５〜７５％の式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）の化合物またはそれらの混合物、約５〜５０％の前記ステロール、約０．５〜２０％の前記ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質および約０．１〜１５％の前記中性脂質を含む、請求項１、６または７に記載の組成物。

【請求項14】

前記組成物が、約３５〜６５％の式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）またはそれらの混合物、約１５〜４５％の前記ステロール、および約０．５〜１０％の前記ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質ならびに約３〜１５％の前記中性脂質を含む、請求項１、６または７に記載の組成物。

【請求項15】

前記組成物が、約４０〜６５％の式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）の化合物またはそれらの混合物、約２５〜４０％の前記ステロール、および約０．５〜５％の前記ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、ならびに約５〜１０％の前記中性脂質を含む、請求項１、６または７に記載の組成物。

【請求項16】

前記組成物が、約５０％の式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）の化合物またはそれらの混合物、約３８．５％の前記ステロール、および約１．５％の前記ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、ならびに約１０％の前記中性脂質を含む、請求項１、６または７に記載の組成物。

【請求項17】

前記組成物が、約５０％の式（Ｖ）の化合物またはその混合物、約３８．５％の前記ステロール、および約１．５％の前記ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、ならびに約１０％の前記中性脂質を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記組成物が、約５０％の式（ＶＩ）の化合物またはその混合物、約３８．５％の前記ステロール、および約１．５％の前記ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、ならびに約１０％の前記中性脂質を含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項19】

Ｎ−アセチルガラクトサミンをターゲッティング部分として含むターゲッティング脂質をさらに含む、請求項１、６または７に記載の組成物。

【請求項20】

前記ターゲッティング脂質が複数のＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記ターゲッティング脂質が、約０．００１％〜約５％のモル量で組成物中に存在する、請求項１９に記載の組成物。

【請求項22】

前記ターゲッティング脂質が、約０．００５％〜約１．５％のモル量で組成物中に存在する、請求項１９に記載の組成物。

【請求項23】

前記ターゲッティング脂質が、式２、式３、式６および式７：

【化7】

【化8】

【化9】

【化10】

からなる群から選択される化合物である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項24】

前記組成物がリポソームである、請求項１に記載の組成物。

【請求項25】

核酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項26】

１つ以上の核酸をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

５つ以上の核酸をさらに含む、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

１０以上の核酸をさらに含む、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

ＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項30】

一本鎖ＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項31】

二本鎖ＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項32】

押出法またはインライン混合法を含む、請求項２４に記載の組成物を産生する方法。

【請求項33】

脂質：核酸の比が約３〜約１５である、請求項１に記載の組成物。

【請求項34】

脂質：核酸の比が約５〜約１３である、請求項１に記載の組成物。

【請求項35】

少なくとも１種のアポリポタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項36】

前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＶおよびＡｐｏＥ、ならびに活性のある多型形態、アイソフォーム、変異体および突然変異体、ならびにそれらの断片または切断形態からなる群から選択される、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＥ、活性のあるその多型形態、アイソフォーム、変異体および突然変異体、ならびにそれらの断片または切断形態である、請求項３５に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２００９年５月５日に出願された米国特許出願第６１／１７５，７７０号および２０１０年１月２８日に出願された米国特許出願第６１／２９９，２９１号に対する優先権を主張し、これらの各内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、脂質粒子を用いた治療剤送達の分野に関する。特に、本発明は、核酸のインビボ送達に有利なカチオン性脂質およびこれらの脂質を含む脂質粒子、ならびにインビボでの治療的使用に好適な核酸−脂質粒子組成物を提供する。さらに、本発明は、これらの組成物を調製する方法、および例えば、様々な病状の治療のために、これらの組成物を用いて、核酸を細胞に導入する方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

治療用核酸には、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、および免疫刺激性核酸が含まれる。これらの核酸は、種々のメカニズムによって作用する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの場合、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡコンストラクトは、ＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体から離れ、結合したｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの配列に対する相補的配列を有するｍＲＮＡを認識し、それに結合することができる鋳型をＲＩＳＣ内部に生じさせる。相補的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ複合体はｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出させる。ＲＮＡｉは、タンパク質合成をコードする対応するｍＲＮＡの特異的破壊を標的とすることによって、特定のタンパク質の下方調節をもたらすことができる。

【0004】

ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡコンストラクトは、標的タンパク質に対する任意のヌクレオチド配列に関して合成することができるので、ＲＮＡｉの治療的用途は極めて幅広い。これまでに、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、インビトロとインビボの両方のモデルで標的タンパク質を特異的に下方調節する能力を示している。さらに、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、現在、臨床研究で評価されているところである。

【0005】

しかしながら、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡコンストラクトが現在直面している２つの問題は、第一に、血漿中でのヌクレアーゼ消化に対して感受性があること、そして第二に、細胞内コンパートメント（遊離のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして全身投与されたときにＲＩＳＣに結合することができる）に近づく能力が限られていることである。これらの二本鎖コンストラクトは、化学修飾ヌクレオチドリンカー（例えば、ホスホチオアート基）を分子内に取り込ませることによって安定化することができる。しかしながら、これらの化学修飾は、ヌクレアーゼ消化からの限られた保護しかもたらさず、かつコンストラクトの活性を減少させ得る。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの細胞内送達は、ポリマー、カチオン性リポソームなどの担体系の使用によるか、または例えば、コレステロール分子の共有結合によるコンストラクトの化学修飾によって、促進することができる。しかしながら、送達系の改善には、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子の効力の増加と、化学修飾の必要性の軽減または除外とが求められる。

【0006】

アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムもまた、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害することができる。アンチセンスコンストラクトの場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に対する相補的配列を有し、ワトソン−クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げ、および／またはｍＲＮＡ転写産物のＲＮアーゼＨ分解を誘発する。結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドには、作用の特異性（すなわち、特定の疾患に関連するタンパク質の下方調節）の途方もない可能性がある。これまでに、これらの化合物は、炎症性疾患、癌、およびＨＩＶのモデルをはじめとする、いくつかのインビトロおよびインビボモデルで有望ぶりを示している（Ａｇｒａｗａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３７６−３８７（１９９６）に概説されている）。アンチセンスは、染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることによって、細胞活性に影響を及ぼすこともできる。いくつかのアンチセンス薬物の先端的なヒト臨床評価が現在進行中である。これらの薬物の標的としては、ｂｃｌ２およびアポリポタンパク質Ｂの遺伝子およびｍＲＮＡ産物が挙げられる。

【0007】

治療用核酸の使用に関してよく知られている問題の１つは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合の安定性と、このリンカーのヌクレアーゼに対する感受性とに関する。血清中にエキソヌクレアーゼやエンドヌクレアーゼが存在するために、ホスホジエステルリンカーを有する核酸の消化が速やかに起こり、それゆえに、治療用核酸は、血清の存在下または細胞内で非常に短い半減期を有する可能性がある（Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：３２３−３３８（１９９３）；およびＴｈｉｅｒｒｙ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐｌ４７−１６１ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，ＲＰ ａｎｄ Ｉｚａｎｔ，ＪＧ編；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２））。これらのおよび他の既知の問題のために、現在開発されている治療用核酸は、天然の核酸に見られる基本的なホスホジエステル化学を利用していない。

【0008】

この問題は、血清または細胞内分解を低下させる化学修飾によって一部克服されている。（例えば、ホスホロチオアート、メチルホスホナートまたはホスホルアミダート結合を用いた）ヌクレオチド間ホスホジエステル架橋において、ヌクレオチド塩基（例えば、５−プロピニル−ピリミジン）において、または糖（例えば、２’−修飾糖）において、修飾が試験されている（Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．Ｘ．，ｐｐ ６４−８１ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９７））。他の者らは、２’−５’糖結合を用いて安定性を改善することを試みている（例えば、米国特許第５，５３２，１３０号を参照されたい）。他の変化も試みられている。しかしながら、これらの解決法はどれも、完全に満足の行くものではないことが分かり、インビボでの遊離の治療用核酸には、依然として限られた効力しかない。
さらに、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関して上で述べたように、治療用核酸が細胞膜を横断する能力が限られていることに関する問題（Ｖｌａｓｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９７：９５−１０８２（１９９４）を参照されたい）や、補体媒介性アナフィラキシー、凝固特性の変化、および血球減少症などの全身毒性に関する問題が残る（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．４：２０１−２０６（１９９４））。

【0009】

最近の進展にもかかわらず、一般的な治療的使用に好適な改善された脂質−治療用核酸組成物が当該技術分野において依然として必要とされている。これらの組成物は、高効率に核酸を封入し、高い薬物：脂質比を有し、封入された核酸を血清中での分解やクリアランスから保護し、全身送達に好適であり、かつ封入された核酸の細胞内送達をもたらすことが好ましい。さらに、これらの脂質−核酸粒子は、核酸の有効用量での患者治療が患者に対する著しい毒性および／またはリスクを伴わない程度に、十分に忍容性でかつ十分な治療指数を提供すべきである。本発明は、このような組成物、この組成物の作製方法、および疾患治療のためを含む、この組成物を用いた細胞への核酸の導入方法を提供する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ａｇｒａｗａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３７６−３８７（１９９６）

【非特許文献2】Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：３２３−３３８（１９９３）

【非特許文献3】Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐｌ４７−１６１ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，ＲＰ ａｎｄ Ｉｚａｎｔ，ＪＧ編；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）

【非特許文献4】Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．Ｘ．，ｐｐ ６４−８１ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９７）

【非特許文献5】Ｖｌａｓｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９７：９５−１０８２（１９９４）

【非特許文献6】Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．４：２０１−２０６（１９９４）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、式（Ｉ）

【化1】

のカチオン性脂質、中性脂質、ステロールおよびＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む脂質組成物を提供し、
式（Ｉ）中、
各々のＸ^ａおよびＸ^ｂは、各存在において、独立に、Ｃ_１−６アルキレンであり、
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、
Ａは、各存在において、ＮＲ_２または１〜３個のＲで任意に置換された環状部分であり、
Ｂは、ＮＲまたは１〜２個のＲで任意に置換された環状部分であり、
各々のＲは独立に、Ｈ、アルキル、

【化2】

但し、少なくとも１つのＲは、

【化3】

であり、
Ｒ^１は、各存在において、独立に、Ｈ、Ｒ^３、

【化4】

であり、
Ｒ^２は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｒ^３は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されており、
Ｙは、各存在において、独立に、Ｏ、ＮＲ^４、またはＳであり、
Ｒ^４は、各存在において、独立に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、

【0012】

本発明は、組成物を製剤化する方法および脂質組成物を用いて疾患を治療する方法をさらに提供する。

【0013】

別の態様では、式（ＩＶ）

【化5】

式中、
各々のＲは独立に、Ｈ、アルキル、

【化6】

であり、但し、少なくとも１つのＲは、

【化7】

であり、ここで、Ｒ^１は、各存在において、独立に、Ｈ、Ｒ^３、

【化8】

であり、ここで、Ｒ^３は、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｒ^２は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｒ^３は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｙは、各存在において、独立に、Ｏ、ＮＲ^４、またはＳであり、
Ｒ^４は、各存在において、独立に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されている
の化合物を作製する方法であって、β−ヒドロキシアルキル基が１つ以上の置換基で任意に置換されている、エナンチオマーが豊富なβ−ヒドロキシアルキル合成等価物を、式（ＶＩＩＩ）

【化9】

式中、Ｒ^５は、各存在において、独立に、Ｈ、アルキル、またはアミン保護基であり、ここで、アルキルは、１つ以上の置換基で任意に置換されており、かつＲ^６は、各存在において、独立に、Ｈ、−（ＣＨ_２）_２Ｎ（Ｒ^５）_２、またはアミン保護基である
の化合物と接触させることを含む、方法。

【0014】

β−ヒドロキシアルキル合成等価物はＲの前駆体であることができる。すなわち、β−ヒドロキシアルキル合成等価物により提供される官能基は、式（ＩＶ）の化合物中に最終的なＲ基を提供するためにさらなる反応を受けることができる。

【0015】

式（ＶＩＩＩ）の化合物は、

【化10】

またはそれらの混合物であることができる。

【0016】

エナンチオマーが豊富なβ−ヒドロキシアルキル合成等価物は、例えば、（Ｒ）−１，２−エポキシドデカンなどの、エナンチオマーが豊富な１，２−エポキシアルカンを含むことができる。エナンチオマーが豊富なβ−ヒドロキシアルキル合成等価物は、例えば、２−（Ｏ−Ｐｇ）−ドデカナールなどの、保護されたα−ヒドロキシアルデヒドを含むことができ、ここで、Ｏ−Ｐｇは保護されたヒドロキシル基を表す。

【0017】

本方法は、１級アルコール捕捉試薬を、エナンチオマーが豊富なβ−ヒドロキシアルキル合成等価物と式（ＶＩＩＩ）の化合物との反応産物と接触させることをさらに含むことができる。

【0018】

別の態様では、化合物を作製する方法は、１−（２−（フタルイミド）エチル）−ピペラジンを１−（２−クロロエチル）イミダゾリジン−２−オンと接触させることを含む。

【0019】

別の態様では、式：

【化11】

を有する化合物およびその塩。

【0020】

別の態様では、式：

【化12】

を有する化合物およびその塩。

【0021】

別の態様では、化合物を作製する方法は、１−シアノメチル−４−（２−（（シアノメチル）アミノ）エチル）ピペラジンを還元剤と接触させることを含む。

【0022】

還元剤はＨ_２以外のものであることができる。還元剤はＮａＢＨ_４を含むことができる。本方法は、シアノメチル−４−（２−（（シアノメチル）アミノ）エチル）ピペラジンを還元剤およびアミノ基保護試薬と同時に接触させることを含むことができる。アミノ基保護試薬は（ＢｏＣ）_２Ｏを含むことができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】様々な脂質比での相対ＦＶＩＩタンパク質を示すグラフである。

【図2】様々な脂質比での体重変化に対する効果を示すグラフである。

【図3】様々な量のカチオン性脂質（Ｉ）および低ＰＥＧ脂質での相対ＦＶＩＩタンパク質を示すグラフである。

【図4】様々な量のカチオン性脂質（Ｉ）および低ＰＥＧ脂質での体重変化に対する効果を示すグラフである。

【図5】１０種の異なるｓｉＲＮＡを含む脂質組成物の１０種の異なる肝臓ｍＲＮＡに対する効果を示すグラフである。

【図6】様々なＡＦ１２を含有するリポソーム組成物におけるＦＶＩＩの用量依存性応答を示すグラフである。

【図7】ＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるＡｐｏＥ含有およびＧａｌＮＡｃ３含有リポソーム組成物の用量応答を示すグラフである。

【図8】ＷＴ（Ｃ５７Ｂｌ／６）およびＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける様々な量のＡＦ１２での相対ＦＶＩＩタンパク質レベルを示すグラフである。

【図9】図９ａは、ＡｐｏＥ ＫＯマウスにおけるＡｐｏＥおよびＧａｌＮＡｃ３含有組成物中の様々な量のＡＦ１２での相対ＦＶＩＩタンパク質レベルを示すグラフである。図９ｂは、野生型マウスにおけるＡｐｏＥおよびＧａｌＮＡｃ３含有組成物中の様々な量のＡＦ１２での相対ＦＶＩＩタンパク質レベルを示す正規化したグラフである。

【図10】ＧＡＰＤＨ（図１０Ａ）、ＶＥＦＧ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）（図１０Ｂ）、およびＶｅ−カドヘリン（図１０Ｃ）発現と比較したときの、心臓におけるＴｉｅ２発現のノックダウン（ＫＤ）を示すグラフである。

【図11】ＡＦ−０１１（図１１Ｂ）とではなく、ＡＦ−０１２（図１１Ａ）とともに製剤化したｓｉＲＮＡによる肝臓におけるＴｉｅ２発現のＫＤを示すグラフである。

【図12】ＡＦ−０１２とともに製剤化したｓｉＲＮＡによる肝臓におけるＴｉｅ２発現のＫＤ（図１２Ａ）、およびＡＦ−０１２とともに製剤化したＴｉｅ２ ｓｉＲＮＡに応答したＶＥＧＦＲ２発現の活性化（図１２Ｂ）を示すグラフである。

【図13】ＡＦ−０１２とともに製剤化したｓｉＲＮＡによる肺におけるＴｉｅ２発現のＫＤ（図１３Ａ）を示すグラフである。Ｔｉｅ２発現をＶＥ−カドヘリン（図１３Ａ）およびＶＥＧＦＲ−２（図１３Ｂ）発現と比較した。

【図14】ｓｉＲＮＡを、ＡＦ−０１１とともに製剤化したときではなく、ＡＦ−０１２とともに製剤化したときの、腎臓（図１４Ａ）および骨格筋（図１４Ｂ）におけるＴｉｅ２発現のＫＤを示すグラフである。

【図15】ｓｉＲＮＡをＡＦ−０１２とともにまたはＡＦ−０１１とともに製剤化したとき、Ｔｉｅ２ ｓｉＲＮＡによって視床下部における遺伝子発現がノックダウンされなかったことを示すグラフである。

【図16】図１６Ａおよび図１６Ｂは、それぞれ、肝臓および骨格筋におけるＴｉｅ２発現の用量依存的ノックダウンを示す。

【図17】図１７Ａおよび図１７Ｂは、それぞれ、脾臓および心臓における用量依存的Ｔｉｅ２ノックダウンを示す。

【図18】図１８Ａおよび図１８Ｂは、それぞれ、異なる用量での腎臓および脂肪組織のＴｉｅ２ノックダウンを示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明は、作用剤、例えば、核酸ベースの作用剤（例えば、ＲＮＡべースのコンストラクト）を細胞または対象に送達する上で、その好適性のために本明細書に開示される脂質組成物を提供する。ＲＮＡべースのコンストラクトを含む脂質組成物を動物に投与し、標的遺伝子の発現を評価する方法。

【0025】

本発明は、式（Ｉ）

【化13】

式中、
各々のＸ^ａおよびＸ^ｂは、各存在において、独立にＣ_１−６アルキレンであり、
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、
Ａは、各存在において、ＮＲ_２または１〜３個のＲで任意に置換された環状部分であり、
Ｂは、ＮＲまたは１〜２個のＲで任意に置換された環状部分であり、
各々のＲは独立に、Ｈ、アルキル、

【化14】

但し、少なくとも１つのＲは、であり、

【化15】

Ｒ^１は、各存在において、独立に、Ｈ、Ｒ^３、

【化16】

であり、
Ｒ^２は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｒ^３は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されており、
Ｙは、各存在において、独立に、Ｏ、ＮＲ^４、またはＳであり、
Ｒ^４は、各存在において、独立に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されている、の化合物と、
ステロールと、
ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質と
を含む組成物を提供する。

【0026】

一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は少なくとも２個の窒素を含む。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は少なくとも３個の窒素を含む。

【0027】

一実施形態では、ｎは、１、２、または３である。

【0028】

一実施形態では、少なくとも１つのＡは環状部分である。一実施形態では、少なくとも１つのＡは窒素を含有する環状部分である。一実施形態では、少なくとも１つのＡはピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）またはピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｉｎｙｌ）部分である。

【0029】

一実施形態では、ｎは２であり、かつ少なくとも１つのＡは環状部分である。

【0030】

一実施形態では、少なくとも１つのＢは環状部分である。一実施形態では、少なくとも１つのＢは窒素を含有する環状部分である。一実施形態では、少なくとも１つのＢはピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）またはピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｉｎｙｌ）部分である。

【0031】

一実施形態では、ｎは２であり、かつ少なくとも１つのＢは環状部分である。

【0032】

一実施形態では、Ｘ^ａはＣ_２またはＣ_３アルキレンである。一実施形態では、Ｘ^ｂはＣ_２またはＣ_３アルキレンである。

【0033】

一実施形態では、Ｘ^ａおよびＸ^ｂは各々、Ｃ_２またはＣ_３アルキレンである。一実施形態では、Ｘ^ａおよびＸ^ｂは各々、Ｃ_２アルキレンである。

【0034】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも３つの存在について、

【化17】

である。一実施形態では、ｎは２または３であり、かつＲは、少なくとも３つの存在について、

【化18】

である。一実施形態では、ｎは３であり、かつＲは、少なくとも５つの存在について、

【化19】

である。

【0035】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも１つの存在（例えば、１つまたは２つの存在）について、Ｈである。一実施形態では、ＹはＯまたはＮＲ^４である。

【0036】

一実施形態では、ＹはＯである。一実施形態では、各存在において、ＹはＯである。

【0037】

一実施形態では、Ｒ^１はＨである。一実施形態では、各存在において、Ｒ^１はＨである。

【0038】

一実施形態では、Ｒ^１は

【化20】

であり、ここで、Ｒ^３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されている。

【0039】

一実施形態では、Ｒ^１は

【化21】

であり、Ｒ^３は、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されたアルキルである。

【0040】

一実施形態では、Ｒ^３は−ＯＨで置換されている。

【0041】

一実施形態では、Ｒ^１は、Ｒ^３、

【化22】

であり、ここで、Ｒ^３アルキルは、１つ以上の置換基で任意に置換されている。

【0042】

一実施形態では、Ｒ^３は親水性置換基で置換されている。一実施形態では、Ｒ^３は−ＯＨで置換されている。

【0043】

一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル（例えば、Ｃ_６−Ｃ_１８アルキル、例えば、Ｃ_８−Ｃ_１２アルキル、例えば、Ｃ_１０アルキル）である。

【0044】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも３つ（例えば、少なくとも４つまたは５つ）の存在については、

【化23】

である。

【0045】

一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル（例えば、Ｃ_６−Ｃ_１８アルキル、例えば、Ｃ_８−Ｃ_１２アルキル、例えば、Ｃ_１０アルキル）である。

【0046】

一実施形態では、組成物は、式（ＩＩ）

【化24】

式中、
各々のＸ^ａおよびＸ^ｂは、各存在において、独立にＣ_１−６アルキレンであり、ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、
各々のＲは独立に、Ｈ、アルキル、

【化25】

であり、但し、少なくとも１つのＲは、

【化26】

であるか、または２つのＲは、それらが結合する窒素とともに、環を形成し、
Ｒ^１は、各存在において、独立に、Ｈ、Ｒ^３、

【化27】

であり、ここで、Ｒ^３は、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｒ^２は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｒ^３は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｙは、各存在において、独立に、Ｏ、ＮＲ^４、またはＳであり、
Ｒ^４は、各存在において、独立に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されている、の化合物と、
ステロールと、
ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質と、を含む。

【0047】

一実施形態では、Ｘ^ａはＣ_２またはＣ_３アルキレンである。一実施形態では、Ｘ^ｂはＣ_２またはＣ_３アルキレンである。

【0048】

一実施形態では、Ｘ^ａおよびＸ^ｂは各々、Ｃ_２またはＣ_３アルキレンである。一実施形態では、Ｘ^ａおよびＸ^ｂは各々、Ｃ_２アルキレンである。

【0049】

一実施形態では、ｎは２または３である。

【0050】

一実施形態では、ｎは３である。

【0051】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも３つの存在について、

【化28】

である。一実施形態では、ｎは２または３であり、かつＲは、少なくとも３つの存在について、

【化29】

である。一実施形態では、ｎは３であり、かつＲは、少なくとも５つの存在について、

【化30】

である。

【0052】

２つのＲが、それらが結合する窒素とともに、環を形成する、請求項ｘの組成物。一実施形態では、それらが結合する窒素とともに、環を形成する２つのＲは、隣接する窒素上に位置する。

【0053】

一実施形態では、ＹはＯまたはＮＲ^４である。一実施形態では、ＹはＯである。一実施形態では、各存在において、ＹはＯである。

【0054】

一実施形態では、Ｒ^１はＨである。一実施形態では、各存在において、Ｒ^１はＨである。

【0055】

一実施形態では、Ｒ^１は

【化31】

であり、ここで、Ｒ^３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されている。一実施形態では、Ｒ^１は

【化32】

であり、Ｒ^３は、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されたアルキルである。

【0056】

一実施形態では、Ｒ^３は−ＯＨで置換されている。

【0057】

一実施形態では、Ｒ^１はＲ^３、

【化33】

であり、ここで、Ｒ^３アルキルは、１つ以上の置換基で任意に置換されている。

【0058】

一実施形態では、Ｒ^３は親水性置換基で置換されている。一実施形態では、Ｒ^３は−ＯＨで置換されている。

【0059】

一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル（例えば、Ｃ_６−Ｃ_１８アルキル、例えば、Ｃ_８−Ｃ_１２アルキル、例えば、Ｃ_１０アルキル）である。

【0060】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも３つ（例えば、少なくとも４つまたは５つ）の存在について、

【化34】

である。

【0061】

一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル（例えば、Ｃ_６−Ｃ_１８アルキル、例えば、Ｃ_８−Ｃ_１２アルキル、例えば、Ｃ_１０アルキル）である。

【0062】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも１つの存在（例えば、１つまたは２つの存在）について、Ｈである。

【0063】

一実施形態では、組成物は、式（ＩＩＩ）、（ＶＩ）

【化35】

の化合物またはそれらの混合物を含む。

【0064】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも３つの存在について、

【化36】

である。一実施形態では、ｎは２または３であり、かつＲは、少なくとも３つの存在について、

【化37】

である。一実施形態では、ｎは３であり、かつＲは、少なくとも５つの存在について、

【化38】

である。

【0065】

一実施形態では、ＹはＯまたはＮＲ^４である。一実施形態では、ＹはＯである。一実施形態では、各存在において、ＹはＯである。

【0066】

一実施形態では、Ｒ^１がＨである。一実施形態では、各存在において、Ｒ^１はＨである。

【0067】

一実施形態では、Ｒ^１は

【化39】

であり、ここで、Ｒ^３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されている。一実施形態では、Ｒ^１は

【化40】

であり、Ｒ^３アルキルは、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されている。

【0068】

一実施形態では、Ｒ^３は−ＯＨで置換されている。

【0069】

一実施形態では、Ｒ^１は、Ｒ^３、

【化41】

であり、ここで、Ｒ^３アルキルは、１つ以上の置換基で任意に置換されている。

【0070】

一実施形態では、Ｒ^３は親水性置換基で置換されている。一実施形態では、Ｒ^３は−ＯＨで置換されている。

【0071】

一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル（例えば、Ｃ_６−Ｃ_１８アルキル、例えば、Ｃ_８−Ｃ_１２アルキル、例えば、Ｃ_１０アルキル）である。

【0072】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも３つ（例えば、少なくとも４つまたは５つ）の存在について、

【化42】

である。

【0073】

一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル（例えば、Ｃ_６−Ｃ_１８アルキル、例えば、Ｃ_８−Ｃ_１２アルキル、例えば、Ｃ_１０アルキル）である。一実施形態では、Ｒ^２は、アルキル（例えば、Ｃ_６−Ｃ_１８アルキル、例えば、Ｃ_８−Ｃ_１２アルキル、例えば、Ｃ_１０アルキル）である。

【0074】

一実施形態では、Ｒは、少なくとも１つの存在（例えば、１つまたは２つの存在）について、Ｈである。

【0075】

一実施形態では、組成物は、式（Ｖ）

【化43】

の化合物を含む。一実施形態では、組成物は、式（ＶＩ）

【化44】

の化合物を含む。

【0076】

一実施形態では、組成物は、式（ＶＩＩ）：

【化45】

の化合物を含む。

【0077】

一実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物は、それらの無機塩または有機塩、例えば、それらのヒドロハライド塩、例えば、それらの塩酸塩である。一実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物は、有機酸の塩、例えば、酢酸塩またはギ酸塩である。一実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物は、水和物の形態である。

【0078】

一実施形態では、ステロールはコレステロールである。一実施形態では、脂質はＰＥＧ修飾脂質である。一実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。

【0079】

一実施形態では、組成物は、中性脂質をさらに含む。一実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。

【0080】

一実施形態では、組成物は、約２５〜７５％の式（Ｉ）の化合物（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物）、約５〜５０％のステロール、および約０．５〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。一実施形態では、組成物は、約０．５〜１５％の中性脂質をさらに含む。

【0081】

一実施形態では、組成物は、約３５〜６５％の式（Ｉ）の化合物（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物）、約１５〜４５％のステロール、および約０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0082】

一実施形態では、組成物は、約３〜１２％の中性脂質をさらに含む。

【0083】

一実施形態では、組成物は、約４５〜６５％の式（Ｉ）の化合物（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物）、約２５〜４０％のステロール、および約０．５〜５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0084】

一実施形態では、組成物は、約５〜１０％の中性脂質をさらに含む。

【0085】

一実施形態では、組成物は、約６０％の式（Ｉ）の化合物（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物）、約３１％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。一実施形態では、組成物は、約７．５％の中性脂質をさらに含む。

【0086】

一実施形態では、本発明の組成物は、約５７．５％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物）、約７．５％の中性脂質、約３１．５％のステロール、および約３．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、式（Ｉ）のカチオン性脂質は式Ｖの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。

【0087】

一実施形態では、本発明の組成物は、約５０％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、約１０％の中性脂質、約３８．５％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、式（Ｉ）のカチオン性脂質は式Ｖの脂質であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。

【0088】

一実施形態では、本発明の組成物は、約５０％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、約１０％の中性脂質、約３８．５％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、式（Ｉ）のカチオン性脂質は式Ｖの脂質であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＳＧである。

【0089】

一実施形態では、本発明の組成物は、約５０％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、約１０％の中性脂質、約３８．５％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、式（Ｉ）のカチオン性脂質は式ＶＩの脂質であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。

【0090】

一実施形態では、本発明の組成物は、約５０％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、約１０％の中性脂質、約３８．５％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、式（Ｉ）のカチオン性脂質は式ＶＩの脂質であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＳＧである。

【0091】

一実施形態では、組成物は会合錯体である。一実施形態では、組成物はリポソームである。

【0092】

一実施形態では、組成物は、核酸剤（例えば、１つ以上の核酸剤）をさらに含む。

【0093】

一実施形態では、組成物は、ＲＮＡ剤をさらに含む。一実施形態では、組成物は、一本鎖ＲＮＡ剤（例えば、１つ以上の一本鎖ＲＮＡ剤）をさらに含む。一実施形態では、組成物は、二本鎖ＲＮＡ剤（例えば、１つ以上の二本鎖ＲＮＡ剤）をさらに含む。

【0094】

一実施形態では、脂質組成物は、２つ以上のｓｉＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、２つ以上の異なるｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、５つ以上の異なるｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、１０以上の異なるｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、２０以上の異なるｓｉＲＮＡを含む。

【0095】

式（ＩＩＩ）もしくは（ＶＩ）

【化46】

式中、
各々のＲは独立に、Ｈ、アルキル、

【化47】

であり、
Ｒ^１は、各存在において、独立に、Ｈ、Ｒ^３、

【化48】

であり、
Ｒ^２は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されており、
Ｒ^３は、各存在において、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換されており、
Ｙは、各存在において、独立に、Ｏ、ＮＲ^４、またはＳであり、
Ｒ^４は、各存在において、独立に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり、これらは各々、１つ以上の置換基で任意に置換されている、の化合物またはそれらの混合物と、
ステロールと、
ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質と、を含む組成物。

【0096】

押出法またはインライン混合法を含む、本明細書に記載の組成物を産生する方法。

【0097】

一実施形態では、本発明の組成物は、２５〜７５％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、０．５〜１５％の中性脂質、５〜５０％のステロール、および０．５〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0098】

一実施形態では、本発明の組成物は、３５〜６５％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0099】

一実施形態では、本発明の組成物は、４５〜６５％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、および０．５〜５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0100】

一実施形態では、本発明の組成物は、約６０％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、約７．５％の中性脂質、約３１％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、式（Ｉ）のカチオン性脂質は式Ｖの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。

【0101】

一実施形態では、本発明の組成物は、約５７．５％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の脂質）、約７．５％の中性脂質、約３１．５％のステロール、および約３．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、式（Ｉ）のカチオン性脂質は式Ｖの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。

【0102】

一実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡの比は、少なくとも約０．５：１、少なくとも約１：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１または少なくとも約１１：１である。一実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡの比は、約１：１〜約２０：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１５：１、約５：１〜約１３：１である。一実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡの比は、約０．５：１〜約１２：１である。

【0103】

一態様では、脂質組成物はターゲッティング脂質も含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、ＧａｌＮＡｃ部分（すなわち、Ｎ−ガラクトサミン部分）を含む。例えば、ＧａｌＮＡｃ部分を含むターゲッティング脂質としては、２００８年４月１２日に出願された米国特許出願第１２／３２８，６６９号に開示されているものを挙げることができ、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ターゲッティング脂質としては、例えば、米国特許出願第１２／３２８，６６９号または国際公開第２００８／０４２９７３号に記載されているような当該技術分野で公知の任意の他の脂質（例えば、ターゲッティング脂質）を挙げることもでき、これらの文献の内容は各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、複数のＧａｌＮＡｃ部分、例えば、２つまたは３つのＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、複数の、例えば、２つまたは３つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質中の脂質は、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリド（すなわち、ＤＳＧ）である。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、ＰＥＧ部分（例えば、少なくとも約５００Ｄａ、例えば、約１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａまたはそれよりも大きい分子量を有するＰＥＧ部分）を含み、例えば、ターゲッティング部分は、ＰＥＧ部分を介して脂質に接続されている。

【0104】

いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、葉酸部分を含む。例えば、葉酸部分を含むターゲッティング脂質としては、２００８年４月１２日に出願された米国特許出願第１２／３２８，６６９号に開示されているものを挙げることができ、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、葉酸部分を含むターゲッティング脂質としては、式５の化合物を挙げることができる。

【0105】

例示的なターゲッティング脂質は、下記の式Ｌ：
（ターゲッティング基）_ｎ−Ｌ−脂質
式Ｌ
式中、
ターゲッティング基は、当業者に公知のおよび／または本明細書に記載の任意のターゲッティング基（例えば、細胞表面受容体）であり、
ｎは１〜５の整数（例えば、３）であり、
Ｌは結合基であり、かつ
脂質は、本明細書に記載の脂質（例えば、ＤＳＧなどの中性脂質）などの脂質である。

【0106】

いくつかの実施形態では、結合基はＰＥＧ部分を含む。別の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１，０００〜約２０，０００ダルトン（例えば、約１，５００〜約５，０００ダルトン、例えば、約１０００ダルトン、約２０００ダルトン、約３４００ダルトン、または約５０００ダルトン）の分子量まで大きさが異なる。

【0107】

いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、下記に示すような式２、３、４、５、６または７

【化49】

【化50】

【化51】

【化52】

【化53】

【化54】

の化合物である。

【0108】

いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、モル基準で約０．００１％〜約５％（例えば、約０．００５％、０．１５％、０．３％、０．５％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、または５％）の量で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、本明細書に記載の組成物に含まれる。

【0109】

いくつかの実施形態では、脂質組成物は、抗酸化剤（例えば、ラジカルスカベンジャー）も含む。抗酸化剤は、例えば、約０．０１％〜約５％の量で組成物中に存在することができる。抗酸化剤は、疎水性または親水性である（例えば、脂質に溶けるか、または水に溶ける）ことができる。いくつかの実施形態では、抗酸化剤は、フェノール化合物、例えば、ブチルヒドロキシトルエン、レスベラトロール、補酵素Ｑ１０、または他のフラボノイド類、あるいはビタミン、例えば、ビタミンＥもしくはビタミンＣである。他の例示的な抗酸化剤としては、リポ酸、尿酸、β−カロテンまたはレチノール（ビタミンＡ）などのカロテン、グルタチオン、メラトニン、セレン、およびユビキノールが挙げられる。

【0110】

いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質（例えば、ＧａｌＮＡｃ含有脂質）の受容体は、アシアロ糖タンパク質受容体（すなわち、ＡＳＧＰＲ）である。

【0111】

一実施形態では、本発明の組成物は、押出法またはインライン混合法によって産生される。

【0112】

押出法（事前形成法またはバッチプロセスとも表す）は、まず空のリポソーム（すなわち、核酸なし）を調製し、次いで、核酸を空のリポソームに添加する方法である。リポソーム組成物を小孔性ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜に通して押し出すことにより、比較的明確な径分布が得られる。通常、所望のリポソーム複合体径分布が達成されるまで膜に通して１回以上懸濁を繰り返す。リポソームを連続的に、より小さくなる膜に通して押し出し、リポソーム径の段階的な減少を達成してもよい。場合によっては、形成される脂質−核酸組成物をサイジングなしで用いることができる。これらの方法は、米国特許第５，００８，０５０号；米国特許第４，９２７，６３７号；米国特許第４，７３７，３２３号；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９７９ Ｏｃｔ １９；５５７（１）：９−２３；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８０ Ｏｃｔ ２；６０１（３）：５５９−７；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８６ Ｊｕｎ １３；８５８（１）：１６１−８；およびＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９８５ ８１２，５５−６５に開示されており、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0113】

インライン混合法は、脂質と核酸の両方を混合チャンバーに同時に添加する方法である。混合チャンバーは、単純なＴ型コネクターまたは当業者に公知の任意の他の混合チャンバーであることができる。

【0114】

これらの方法は、米国特許第６，５３４，０１８号および米国特許第６，８５５，２７７号；米国特許公開第２００７／００４２０３１号ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３，Ｍａｒ．２００５，ｐ．３６２−３７２に開示されており、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0115】

本発明の組成物を当業者に公知の任意の方法によって調製することができることがさらに理解される。

【0116】

さらなる実施形態では、押出法またはインライン混合法によって調製される代表的な組成物が表１に記載されており、ここで、脂質Ｔは、

【化55】

【化56】

またはその組合せである。

【表A】

【表B】

【0117】

一実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも９０％封入されている。

【0118】

一実施形態では、本発明の組成物は、緩衝剤（例えば、クエン酸塩、リン酸塩）をさらに含む。

【0119】

一実施形態では、本発明の組成物は、アポリポタンパク質をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」という用語は、当業者に公知のアポリポタンパク質とその変異体および断片、ならびに下記のアポリポタンパク質アゴニスト、その類似体または断片を指す。

【0120】

好適なアポリポタンパク質としては、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＶおよびＡｐｏＥと、活性のある多型形態、アイソフォーム、変異体および突然変異体ならびにそれらの断片または切断形態が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、アポリポタンパク質はチオール含有アポリポタンパク質である。「チオール含有アポリポタンパク質」は、少なくとも１つのシステイン残基を含むアポリポタンパク質、変異体、断片またはアイソフォームを指す。最も一般的なチオール含有アポリポタンパク質は、１つのシステイン残基を含むＡｐｏＡ−Ｉミラノ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ）およびＡｐｏＡ−Ｉパリ（ＡｐｏＡ−Ｉｐ）である（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２９７：２０６−１３；Ｂｉｅｌｉｃｋｉ ａｎｄ Ｏｄａ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：２０８９−９６）。ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３もチオール含有アポリポタンパク質である。その組換えで産生された形態を含む、単離されたＡｐｏＥおよび／またはその活性断片およびポリペプチド類似体は、米国特許第５，６７２，６８５号；同第５，５２５，４７２号；同第５，４７３，０３９号；同第５，１８２，３６４号；同第５，１７７，１８９号；同第５，１６８，０４５号；同第５，１１６，７３９号に記載されており、これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＡｐｏＥ３は、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ Ｅ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏ−Ｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ”， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１） ２５６：９０７７−９０８３；およびＲａｉｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｈｙｐｅｒｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔｓ”， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２） ７９：４６９６−４７００に開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ００３９６も参照されたい。

【0121】

特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、成熟形態、プレプロアポリポタンパク質形態またはプロアポリポタンパク質形態であることができる。プロＡｐｏＡ−Ｉおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉのホモ二量体およびヘテロ二量体（実現可能な場合）（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１６（１２）：１４２４−２９）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（Ｋｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：（３）１６７９−８７；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１６３２−３５）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（Ｄａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６１４−２２）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１４）：８６３７−４６；Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１５）：９９２９−３５）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（２）：３７３−８３）、およびＡｐｏＥ（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１４）：８９９３−９０００）を本発明の範囲内で利用することもできる。

【0122】

特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の断片、変異体またはアイソフォームであることができる。「断片」という用語は、天然のアポリポタンパク質のアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有し、かつその断片が、脂質結合特性をはじめとする、天然のアポリポタンパク質の活性を保持する任意のアポリポタンパク質を指す。「変異体」とは、アポリポタンパク質のアミノ酸配列の置換または改変を意味し、アミノ酸残基の置換または改変、例えば、付加および欠失は、脂質結合特性をはじめとする、天然のアポリポタンパク質の活性を消失させない。したがって、変異体は、１つ以上のアミノ酸残基が化合的に類似したアミノ酸と保存的に置換されている本明細書で提供される天然のアポリポタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドを含むことができる。保存的置換の例としては、少なくとも１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）の別の疎水性残基への置換が挙げられる。同様に、本発明は、例えば、少なくとも１つの親水性残基の置換、例えば、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、およびグリシンとセリンの間の置換を企図する（米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号および同第６，０４６，１６６号を参照されたい）「アイソフォーム」という用語は、同じか、より大きいかまたは部分的な機能と、同様か、同一かまたは部分的な配列とを有するタンパク質を指し、同じ遺伝子の産物で、かつ通常は組織特異的であってもよいし、そうでなくてもよい（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１；Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５；Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６；Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（ｌ）：４６８−７４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０；Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２；Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４；Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１；Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（１）：８０−８；Ｓａｃｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４０（１−３）：１８１−７；Ｗｅｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００（１−３）：４８１−９２；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３３）：２９９１９−２６；Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（２３）：１４８８８−９３および米国特許第６，３７２，８８６号を参照されたい）。

【0123】

特定の実施形態では、本発明の方法および組成物は、アポリポタンパク質のキメラ構築の使用を含む。例えば、アポリポタンパク質のキメラ構築は、虚血再灌流保護特性を含むアポリポタンパク質ドメインと関連する高い脂質結合能を有するアポリポタンパク質ドメインから構成される可能性がある。アポリポタンパク質のキメラ構築は、アポリポタンパク質（すなわち、相同な構築）内部に別々の領域を含む構築であることができるし、またはキメラ構築は、異なるアポリポタンパク質間の別々の領域を含む構築（すなわち、異種の構築）であることができる。キメラ構築を含む組成物は、アポリポタンパク質変異体である部分または特定の特性（例えば、脂質結合、受容体結合、酵素特性、酵素活性化特性、抗酸化特性または還元酸化特性）を有するように設計された部分を含むこともできる（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１；Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５；Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６；Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（ｌ）：４６８−７４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０；Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２；Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４；Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１；Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（ｌ）：８０−８；Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１９（９）：２２１４−２５；Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ １９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１６（２）：３２８−３８：Ｔｈｕｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１１）：６０６２−７０；Ｄｙｅｒ １９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２３）：１５０００９−１５；Ｈｉｌｌ １９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４７）：３０９７９−８４）。

【0124】

本発明で利用されるアポリポタンパク質には、組換え、合成、半合成または精製アポリポタンパク質も含まれる。本発明で利用されるアポリポタンパク質またはその等価物を得るための方法は当該技術分野で周知である。例えば、アポリポタンパク質は、例えば、密度勾配遠心分離もしくは免疫親和性クロマトグラフィーによって血漿もしくは天然産物から分離することができるし、または合成、半合成で、もしくは当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて産生することができる（例えば、Ｍｕｌｕｇｅｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７９８（１−２）：８３−９０；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２１（３）：２８４−９１；Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２８（８）：９１３−２９；Ｐｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７１１：９７−１０９；米国特許第５，０５９，５２８号、同第５，８３４，５９６号、同第５，８７６，９６８号および同第５，７２１，１１４；ならびに国際公開第８６／０４９２０号および同第８７／０２０６２号を参照されたい）。

【0125】

本発明で利用されるアポリポタンパク質には、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉミラノ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ）、ＡｐｏＡ−Ｉパリ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐ）、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣するアポリポタンパク質アゴニスト（例えば、ペプチドおよびペプチド類似体）もさらに含まれる。例えば、アポリポタンパク質は、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、同第６，０４６，１６６号、および同第５，８４０，６８８号に記載されているもののいずれかであることができ、これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる

【0126】

アポリポタンパク質アゴニストペプチドまたはペプチド類似体は、例えば、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号および同第６，０４６，１６６号に記載の技術をはじめとする、当該技術分野で公知のペプチド合成の任意の技術を用いて合成または製造することができる。例えば、ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）によって最初に記載された固相合成技術を用いて調製し得る。他のペプチド合成技術は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，第２版（１９７６）および当業者に容易に入手可能な他の参考文献に見出し得る。ポリペプチド合成技術の概要は、Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，（１９８４）に見出すことができる。ペプチドは、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，第３版，Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ．ａｌ．，編，ｐ．１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）に記載されているような溶液法でも合成し得る。様々なペプチド合成で使用される適切な保護基は、上述のテキストおよびＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）に記載されている。本発明のペプチドは、例えば、アポリポタンパク質Ａ〜Ｉのより大きい部分からの化学的または酵素的切断によっても調製し得る。

【0127】

特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の混合物であることができる。一実施形態では、アポリポタンパク質は、均質な混合物、すなわち、１種類のアポリポタンパク質であることができる。別の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の不均質な混合物、すなわち、２種以上の異なるアポリポタンパク質の混合物であることができる。アポリポタンパク質不均質な混合物の実施形態としては、例えば、動物源由来のアポリポタンパク質と半合成源由来のアポリポタンパク質の混合物を挙げることができる。特定の実施形態では、不均質な混合物としては、例えば、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−Ｉミラノの混合物を挙げることができる。特定の実施形態では、不均質な混合物としては、例えば、ＡｐｏＡ−ＩミラノとＡｐｏＡ−Ｉパリの混合物を挙げることができる。本発明の方法および組成物において使用される好適な混合物は当業者に明白であろう。

【0128】

アポリポタンパク質を自然源から得る場合、それを植物または動物源から得ることができる。アポリポタンパク質は動物源から得られ、アポリポタンパク質は任意の種由来であることができる。特定の実施形態では、アポリポタンパク質を動物源から得ることができる。特定の実施形態では、アポリポタンパク質をヒト源から得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が投与される個体と同じ種に由来する。

【0129】

一実施形態では、標的遺伝子は、肝臓で発現される遺伝子、例えば、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）遺伝子である。他の実施形態では、標的遺伝子は、内皮（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、視床下部または骨格筋）で発現される。標的遺伝子、例えば、ＦＶＩＩの発現の効果は、血清または組織試料などの、生物学的試料におけるＦＶＩＩレベルの測定によって評価される。例えば、例えば、ＦＶＩＩ活性のアッセイによって測定されるような血液中のＦＶＩＩのレベルを決定することができる。一実施形態では、肝臓または内皮におけるｍＲＮＡのレベルを評価することができる。別の好ましい実施形態では、少なくとも２種類の評価、例えば、（例えば、血液中の）タンパク質レベルの評価と（例えば、肝臓中の）ｍＲＮＡレベルの測定を両方とも行なう。

【0130】

一実施形態では、作用剤は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸である。

【0131】

別の実施形態では、核酸剤は一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。例えば、二本鎖ＤＮＡは、構造遺伝子、制御および終結領域を含む遺伝子、または自己複製系（例えば、ウイルスもしくはプラスミドＤＮＡ）であることができる。二本鎖ＲＮＡは、例えば、ｄｓＲＮＡまたは別のＲＮＡ干渉試薬であることができる。一本鎖核酸は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、または三重鎖形成オリゴヌクレオチドであることができる。

【0132】

さらに別の実施形態では、候補作用剤を投与した後の様々な時点で、流体試料、例えば、血液、血漿、または血清、あるいは組織試料、例えば、肝臓または（例えば、心臓、腎臓、肺、視床下部もしくは骨格筋由来の）内皮試料などの、生物学的試料を試験対象から採取して、標的タンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルに対する作用剤の効果を試験する。特に好ましい一実施形態では、候補作用剤は、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡであり、生物学的試料を第ＶＩＩ因子タンパク質またはｍＲＮＡのレベルに対する効果について試験する。一実施形態では、例えば、免疫組織化学アッセイまたは発色アッセイを用いて、ＦＶＩＩタンパク質の血漿レベルをアッセイする。別の実施形態では、肝臓または内皮（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、視床下部もしくは骨格筋）におけるＦＶＩＩ ｍＲＮＡのレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ、またはノーザンブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲアッセイなどのアッセイで試験する。

【0133】

一実施形態では、作用剤、例えば、脂質組成物を含む組成物を毒性について試験する。さらに別の実施形態では、モデル対象を、例えば、体重または臨床的挙動の変化により、身体的影響についてモニタリングすることができる。

【0134】

一実施形態では、本方法は、作用剤、例えば、脂質組成物を含む組成物をさらなる評価にかけることをさらに含む。さらなる評価としては、例えば、（ｉ）上記の評価の繰返し、（ｉｉ）異なる数の動物もしくは異なる用量を用いた上記の評価の繰返し、または（ｉｉｉ）異なる方法、例えば、別の動物モデル（例えば、非ヒト霊長類）における評価によるものを挙げることができる。

【0135】

別の実施形態では、肝臓タンパク質もしくはｍＲＮＡのレベルまたは内皮に対する候補作用剤の観察された効果に応じて、さらなる研究（例えば、臨床試験）において作用剤と脂質組成物を含めるかどうかに関する決定を行なう。例えば、候補ｄｓＲＮＡがタンパク質またはｍＲＮＡレベルを少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれより大きく減少させることが観察される場合、この作用剤には臨床試験が考慮される。

【0136】

さらに別の実施形態では、肝臓タンパク質、ｍＲＮＡのレベルまたは内皮に対する候補作用剤とアミノ脂質の観察された効果に応じて、薬学的組成物中に作用剤と脂質組成物を含めるかどうかに関する決定を行なう。例えば、候補ｄｓＲＮＡがタンパク質またはｍＲＮＡレベルを少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれより大きく減少させることが観察される場合、この作用剤には臨床試験が考慮される。

【0137】

別の態様では、本発明は、脂質組成物を、ＲＮＡべースのコンストラクト、例えば、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを送達するその好適性について評価する方法を特色とする。本方法は、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡと候補アミノ脂質とを含む組成物を提供すること、この組成物を齧歯類（例えば、マウス）に投与すること、ＦＶＩＩの発現を血液中のＦＶＩＩのレベルまたは肝臓におけるＦＶＩＩ ｍＲＮＡのレベルのうちの少なくとも１つの関数として評価し、それにより候補アミノ脂質を評価することを含む。

【0138】

脂質含有成分（例えば、リポソーム）を含む組成物、かつこれらは以下でさらに詳細に記載されている。例示的な核酸ベースの作用剤としては、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、または三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの作用剤も以下でさらに詳細に記載されている。

【0139】

「ＬＮＰ」組成物（例えば、ＬＮＰ０１、ＬＮＰ０２など）と表される組成物は、「ＡＦ」組成物（例えば、ＡＦ０１、ＡＦ０２など）としても知られている。

【0140】

「アルキル」は、１〜２４個の炭素原子を含む直鎖または分岐、非環状または環状飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられ、一方、飽和分岐アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環状アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ、一方、不飽和環状アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。

【0141】

「アルケニル」は、隣接炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含む、上で定義されたようなアルキルを意味する。アルケニルには、シス異性体とトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分岐アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられる。

【0142】

「アルキニル」は、隣接炭素原子間に少なくとも１つの三重結合をさらに含む、上で定義されたような任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分岐アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどが挙げられる。

【0143】

「アシル」は、結合点の炭素が、以下で定義するようなオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルがアシル基である。

【0144】

「複素環」は、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、かつ窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１または２個のヘテロ原子を含む５〜７員単環式、または７〜１０員二環式の複素環式環を意味し、ここで、この窒素および硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されていてもよく、かつこの窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよく、これには、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に融合している二環式環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合し得る。複素環としては、以下で定義するようなヘテロアリールが挙げられる。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。

【0145】

「任意に置換されたアルキル」、「任意に置換されたアルケニル」、「任意に置換されたアルキニル」、「任意に置換されたアシル」、および「任意に置換された複素環」 という用語は、置換されるときに、少なくとも１つの水素原子が置換基と置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置き換えられる。そういう意味では、置換基は、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ^ｘ、−ＮＲ^ｘＲ^ｙ、−ＮＲ^ｘＣ（＝０）Ｒ^ｙ、−ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、−Ｃ（＝０）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、−ＳＯ_ｎＲ^ｘおよび−ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙを含み、その場合、ｎは０、１または２であり、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは同じものまたは別のもので、かつ独立に水素、アルキルまたは複素環であり、該アルキルおよび複素環置換基は各々、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ^ｘ、複素環、−ＮＲ^ｘＲ^ｙ、−ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ、−ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、−ＳＯ_ｎＲ^ｘおよび−ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙのうちの１つまたは複数でさらに置換されていてもよい。

【0146】

「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。

【0147】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、保護基の使用を必要とする場合がある。保護基に関する方法論は当業者に周知である（例えば、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照されたい）。簡潔に述べると、本発明との関連における保護基は、官能基の望ましくない反応性を低下または消失させる任意の基である。保護基を官能基に付加して、特定の反応の間のその反応性をマスクし、その後、除去して、もとの官能基を暴露することができる。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」を使用する。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を減少または消失させる任意の基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を用いて付加および除去することができる。

【0148】

合成
本発明の化合物を既知の有機合成技術により調製し得る。一般に、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の脂質は、アミン化合物を様々なエポキシドと反応させることによって調製することができる。１つの例では、式（Ｖ）および（ＶＩ）の脂質を以下の反応スキーム１によって作製することができ、その場合、置換基は全て、別途指示しない限り、上で定義されたものである。

【0149】

【化57】

化合物１および２を国際公開第９３１８０１７号に記載の報告手順に従って合成した。

【0150】

高温で１とエポキシド３を反応させると、化合物４が得られた。これを標準的なシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。化合物５はアミン２から同様に得られた。

【0151】

スキーム１によるアミノ脂質の形成に好適な他のエポキシドおよびアミンは、Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ，ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”，ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９１０６０３１０６に記載されており、この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0152】

使用可能ないくつかの例示的なエポキシドとしては、

【化58】

を挙げることができる。使用可能ないくつかの例示的なアミンとしては、

【化59】

を挙げることができる。

【0153】

式（Ｖ）の化合物

【化60】

を２つの前駆体：

【化61】

から調製することができる。例えば、式（Ｖ）の化合物をラセミ化合物３から調製することができる。この場合、最初の産物は、ジアステレオマーの混合物を含むことがあり、これを任意でさらに精製することができる。

【0154】

化合物（Ｒ）−６は、式（Ｖ）による立体的に制御された化合物である。

【化62】

【0155】

化合物（Ｒ）−６は、スキーム１に従って２つの前駆体：

【化63】

から調製することができる。対応する（Ｓ）−６化合物は、１および（Ｓ）−７（すなわち、（Ｒ）−７のエナンチオマー）から調製することができる。

【0156】

１の構造異性体をアミノ脂質の調製において用いることもできる。このような構造異性体としては、

【化64】

が挙げられる。

【0157】

式（ＶＩ）

【化65】

の化合物を、２つの前駆体

【化66】

から調製することができる。

【0158】

式（ＶＩＩ）

【化67】

の化合物を、２つの前駆体

【化68】

から調製することができる。

【0159】

実質的に立体的に純粋なエポキシドを用いて、立体的に制御されたアミノ脂質を提供することができる。

【化69】

【0160】

アミン２および８を反応スキーム２に従って調製することができる。両方とも共通の出発物質である４−（ｔ−ブトキシカルボニル）−１−（２−（フタルイミド）エチル）−ピペラジンから調製し得る。

【0161】

マルチグラム（ｍｕｌｔｉｇｒａｍ）量の２および８をスキーム２に従って調製した。アミン１は、１−（２−アミノエチル）ピペラジンから始めて、スキーム３に従って調製することができる。

【0162】

【化70】

あるいは、スキーム４は、１−（２−（フタルイミド）エチル）ピペラジンからの１の調製を図示している。

【0163】

【化71】

スキーム４の方法の規模を大きくして、マルチグラム規模で１を生成させた。最終工程は、もう１つの方法として、酸（例えば、ＨＣｌ）の代わりに塩基（例えば、ＫＯＨ）を用いて行なうことができる。反応は、塩基性条件下よりも速やかに進行し得る。

【0164】

別のバリエーションでは、１をスキーム３に示した方法と同様であるが、スキーム５に示すように、異なる還元条件を用いた方法で調製することができる。

【0165】

【化72】

有利なことに、スキーム５の方法は、スキーム３またはスキーム４の方法よりも簡単に規模を大きくすることができ、反応条件は非常に穏やかであり、触媒（１０ｍｏｌ％）量の塩化ニッケル（ＩＩ）しか必要とされず、生成物の単離および精製は簡単である。この手順の規模を大きくして、マルチグラム量の１を生成させた。

【0166】

エポキシド３（ｎ＝９）を分割して、高度にエナンチオマー過剰な所望の光学異性体（例えば、（Ｒ）−７）を得ることができる。例えば、３（ｎ＝９）を、スキーム６に図示するようにＪａｃｏｂｓｅｎ触媒を用いて分割することができる。

【0167】

【化73】

この反応をマルチグラム（例えば、３００ｇ）規模で行なった。

【0168】

アミノ脂質（Ｒ）−６を１および（Ｒ）−７からマルチグラム（例えば、＞１６ｇ）規模で調製した。この反応生成物をカラムクロマトグラフィーでさらに精製した。ＴＬＣでアッセイしたとき、得られた物質は明らかに純粋であった。しかしながら、いくつかの微量生成物も存在していた。これらの微量生成物（スキーム７参照）は、エポキシド環の開裂が、より遮蔽された炭素上で起こり、１級アルコールを生じさせる反応から生じた。

【0169】

【化74】

微量生成物は、（上述のように固定化された）１級アルコールと選択的に反応する固体支持体のトリチルクロリド試薬（スキーム８）で処理したときに、主要生成物から実質的に分離された。

【0170】

【化75】

立体的に制御されたアミノ脂質への別のアプローチは、アミン（例えば、１）との反応においてエポキシドの代わりに使用可能な立体的に純粋なα−ヒドロキシアルデヒドを必要とすることがある。α−ヒドロキシアルデヒドを使用する場合、アミン（例えば、１）との反応は還元条件下で起こる。スキーム９は、α−オレフィンから始まる、保護α−ヒドロキシアルデヒド１０の立体的に制御された合成を図示している。

【化76】

【0171】

スキーム１０は、（Ｒ）−グリシドールから始まる、保護α−ヒドロキシアルデヒド１１への代替経路を表している。

【化77】

【0172】

立体的に制御されたアミノ脂質（例えば、（Ｒ）−６）を生成させるために、アミン１を還元剤（例えば、ＡｃＯＨ中のＮａ（ＯＡｃ）_３ＢＨ）の存在下で所望の立体化学を有する保護α−ヒドロキシアルデヒドと反応させておく。

【0173】

本発明のアミノ脂質はカチオン性脂質である。本明細書で使用されるとき、「アミノ脂質」という用語は、１個もしくは２個の脂肪酸または脂肪アルキル鎖とアミノ頭部基（アルキルアミノまたはジアルキルアミノ基を含む）とを有し、プロトン化されて、生理的ｐＨでカチオン性脂質を形成し得る脂質を含むことが意図される。

【0174】

他のアミノ脂質としては、代わりの脂肪酸基や、アルキル置換基が異なるジアルキルアミノ基（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−など）をはじめとする他のジアルキルアミノ基を有するアミノ脂質が挙げられる。Ｒ^１１とＲ^１２が両方とも長鎖アルキルまたはアシル基である実施形態の場合、それらは同じものまたは別のものであることができる。一般に、飽和が少ないアシル鎖を有するアミノ脂質は、特に、複合体を、フィルター滅菌するために、約０．３マイクロメートル未満の大きさにしなければならないときに、より簡単に大きさを整えられる。炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ２２の範囲の不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質が好ましい。他のスキャフォールドを用いて、アミノ脂質のアミノ基と脂肪酸または脂肪アルキル部分を隔てることもできる。好適なスキャフォールドは当業者に公知である。

【0175】

特定の実施形態では、本発明のアミノ脂質またはカチオン性脂質は、脂質が生理的ｐＨまたはそれ未満のｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）で正の電荷を帯び、かつ第２のｐＨで、好ましくは生理的ｐＨまたはそれを上回るｐＨで中性となるように、少なくとも１つのプロトン化可能基または脱プロトン化可能基を有する。当然のことながら、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は平衡過程であること、および帯電脂質または中性脂質に対する言及は主な種の性質を指し、脂質の全てが帯電形態または中性形態で存在することを必要とするわけではないことが理解されるであろう。２つ以上のプロトン化可能基もしくは脱プロトン化可能基を有するか、または両性イオン性である脂質は、本発明における使用から除外されない。

【0176】

特定の実施形態では、本発明によるプロトン化可能な脂質は、約４〜約１１の範囲のプロトン化可能基のｐＫ_ａを有する。これらの脂質は、より低いｐＨ製剤の段階ではカチオン性であるが、これらの粒子はｐＨ７．４付近の生理的ｐＨでは表面が（完全にではないものの）大部分は中和されるので、約４〜約７のｐＫ_ａが最も好ましい。このｐＫ_ａの利点の１つは、粒子の外部表面と関連する少なくともいくつかの核酸が、生理的ｐＨでその静電相互作用を失い、単なる透析で除去されること、したがって、粒子のクリアランスに対する感受性を大いに低下させることである。

【0177】

脂質粒子
本明細書で取り上げられる肝臓または内皮（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、視床下部もしくは骨格筋）スクリーニングモデルで試験するための作用剤および／またはアミノ脂質を脂質粒子中に製剤化することができる。脂質粒子としては、リポソームが挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用されるとき、リポソームは、水性内部を封入する脂質含有膜を有する構造である。リポソームは１つ以上の脂質膜を有し得る。本発明は、単一膜と呼ばれる単層リポソームと、多重膜と呼ばれる多層リポソームの両方を企図している。核酸と複合体を形成する場合、脂質粒子は、例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎに記載されているような、ＤＮＡ層とＤＮＡ層の間に挟まれたカチオン性脂質二重層から構成されるリポプレックスでもあり得る。

【0178】

脂質粒子は、１つ以上の追加の脂質および／または他の成分（例えば、コレステロール）をさらに含み得る。脂質酸化の防止またはリガンドのリポソーム表面への付着などの種々の目的のために、他の脂質をリポソーム組成物中に含め得る。両親媒性脂質、中性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質を含む、いくつかの脂質のうちのどれが存在してもよい。このような脂質を単独でまたは組み合わせて使用することができる。存在し得る追加の脂質成分の特定の例を以下に記載する。

【0179】

脂質粒子中に存在し得る追加の成分としては、ポリアミドオリゴマー（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号を参照されたい）、ペプチド、タンパク質、洗剤、脂質誘導体（例えば、ホスファチジルエタノールアミンと結合したＰＥＧおよびセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ）（米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）などの二重層安定化成分が挙げられる

【0180】

脂質粒子は、第２のアミノ脂質またはカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、および形成時の脂質粒子の凝集を低下させるために選択される脂質のうちの１つまたは複数を含むことができる。この形成は、形成時の電荷誘導性凝集を防ぐ粒子の立体安定性によって生じ得る。

【0181】

肝臓または内皮（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、視床下部もしくは骨格筋）スクリーニングモデルで使用可能な核酸剤との結合に好適な脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、および例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されているようなポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）がある。ＰＥＧ、Ｇｍ１またはＡＴＴＡのような、製剤化の間の凝集を防ぐ、電荷のない、親水性の、立体障害部分を有する他の化合物を用いて、本発明の方法および組成物に示すように使用される脂質に結合させることができる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号および同第５，８８５，６１３号に記載されている。通常、凝集を低下させるために選択される脂質成分の濃度は、（脂質のモルパーセントで）約１〜１５％である。

【0182】

本発明において有用なＰＥＧ修飾脂質（または脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）の具体例は、ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面に固定するための種々の「アンカリング」脂質部分を有することができる。好適なＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、参照により本明細書に組み込まれる同時係属の米国特許出願第０８／４８６，２１４号に記載されているＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。特に好ましいのは、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールである。

【0183】

立体的に大きい部分（例えば、ＰＥＧまたはＡＴＴＡ）が脂質アンカーにコンジュゲートしている実施形態では、脂質アンカーの選択は、コンジュゲートが脂質粒子とどのような種類の関連を有することになるかによって決まる。ｍｅＰＥＧ（分子量：２０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、粒子が循環から除去されるまで、おそらくは数日間、リポソームと関連し続けることがよく知られている。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０などの他のコンジュゲートには同様の滞留能がある。しかしながら、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清に暴露されると、製剤外に速やかに入れ替わり、いくつかのアッセイでは、Ｔ_１／２は６０分未満となる。米国特許出願第０８／４８６，２１４号に示されているように、少なくとも３つの特徴、すなわち、アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和、および立体障害頭部基のサイズが交換速度に影響を与える。これらの特色の好適なバリエーションを有する化合物は本発明に有用であり得る。いくつかの治療用途のために、ＰＥＧ修飾脂質がインビボで核酸−脂質粒子から速やかに失われることが好ましい場合があり、それにより、ＰＥＧ修飾脂質が比較的短い脂質アンカーを保有することになる。他の治療用途では、核酸−脂質粒子がより長い血漿循環寿命を示すことが好ましい場合があり、それにより、ＰＥＧ修飾脂質は比較的長い脂質アンカーを保有することになる。例示的な脂質アンカーとしては、約Ｃ_１４〜約Ｃ_２２、好ましくは約Ｃ_１４〜約Ｃ_１６の長さを有する脂質アンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分（例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ_２）のサイズは、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンである。

【0184】

凝集を防ぐ化合物が、適切に機能するために、必ずしも脂質コンジュゲーションを必要とするわけではないことに留意すべきである。凝集を防ぐのに、溶液中の遊離ＰＥＧまたは遊離ＡＴＴＡで十分な場合がある。製剤化した後に粒子が安定である場合、対象に投与する前にＰＥＧまたはＡＴＴＡを透析して除去することができる。

【0185】

中性脂質は、脂質粒子中に存在する場合、生理的ｐＨで電荷のないまたは中性の両性イオン形態として存在するいくつかの脂質種のいずれかであることができる。このような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが挙げられる。本明細書に記載の粒子中で使用される中性脂質の選択は、通常、例えば、リポソームサイズや血流中のリポソームの安定性を考慮して判断される。好ましくは、中性脂質成分は、２つのアシル基を有する脂質（すなわち、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。様々な鎖長および飽和度の種々のアシル鎖基を有する脂質が利用可能であるかまたは周知の技術により単離もしくは合成可能である。一群の実施形態では、炭素鎖長がＣ_１４〜Ｃ_２２の範囲の飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。別の群の実施形態では、炭素鎖長がＣ_１４〜Ｃ_２２の範囲の単不飽和脂肪酸または二不飽和脂肪酸を有する脂質を用いる。さらに、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を用いることができる。好ましくは、本発明で使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の関連ホスファチジルコリンである。本発明において有用な中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、または他の頭部基（例えば、セリンおよびイノシトール）を有するリン脂質から構成されていてもよい。

【0186】

脂質混合物のステロール成分は、存在する場合、リポソーム、脂質小胞または脂質粒子調製の分野で従来使用されているステロールのうちのいずれかであることができる。好ましいステロールはコレステロールである。

【0187】

上で具体的に記載したものに加えて、生理的ｐＨ付近で正味の正電荷を担持する他のカチオン性脂質もまた本発明の脂質粒子に含まれ得る。このようなカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃ１」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、例えば、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、ならびにリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）などの、カチオン性脂質のいくつかの市販の調製物を用いることができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。

【0188】

本発明の脂質粒子において使用するのに好適なアニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0189】

多くの実施形態では、両親媒性脂質が本発明の脂質粒子に含まれる。「両親媒性脂質」とは、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に向けられている一方で、親水性部分が水性相に向けられている任意の好適な物質を指す。このような化合物としては、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸などの、他のリンを欠く化合物を使用することもできる。さらに、このような両親媒性脂質は、トリグリセリド類やステロール類などの他の脂質と容易に混合することができる。

【0190】

プログラム可能な融合脂質も本発明の脂質粒子中に含めるのに好適である。このような脂質粒子は、細胞膜と融合する傾向がほとんどなく、所与のシグナル事象が起こるまで、その積み荷を送達する。これにより、脂質粒子は、生物または疾患部位に注射された後、より均一に分布し、その後に細胞と融合し始めることが可能になる。このシグナル事象は、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境の変化、または時間であることができる。最後の場合、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ−脂質コンジュゲートなどの、融合遅延成分または「クローキング」成分は、時間とともに脂質粒子膜外に単に入れ替わることができる。例示的な脂質アンカーとしては、約Ｃ_１４〜約Ｃ_２２、好ましくは約Ｃ_１４〜約Ｃ_１６の長さを有する脂質アンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分（例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ_２）のサイズは、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンである。

【0191】

体内に適切に分布するまでに、脂質粒子は、融合するのに十分なクローキング剤を失っている。他のシグナル事象の場合、疾患部位または標的細胞と関連するシグナル（例えば、炎症部位での温度上昇）を選択することが望ましい。

【0192】

核酸剤にコンジュゲートした脂質粒子は、ターゲッティング部分、例えば、細胞型または組織に特異的なターゲッティング部分を含むこともできる。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン類（例えば、リボフラビン）およびモノクローナル抗体などの、種々のターゲッティング部分を用いた脂質粒子のターゲッティングがこれまでに記載されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照されたい）。ターゲッティング部分は、タンパク質全体またはその断片を含むことができる。ターゲッティング機構は、通常、ターゲッティング部分が標的（例えば、細胞表面受容体）との相互作用に利用可能となるような形で、ターゲッティング剤が脂質粒子の表面に位置付けられることを必要とする。例えば、Ｓａｐｒａ，Ｐ．ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，ＴＭ，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２（５）：４３９−６２（２００３）およびＡｂｒａ，ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１−３（２００２）に記載されているものをはじめとする、種々の異なるターゲッティング剤およびターゲッティング方法が当該技術分野で知られており、かつ利用可能である。

【0193】

ターゲッティングのために、親水性ポリマー鎖（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖）の表面コーティングを有する脂質粒子、すなわち、リポソームを使用することが提案されている（Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２３７：９９−１０８（１９９５）；ＤｅＦｒｅｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ １１８：６１０１−６１０４（１９９６）；Ｂｌｕｍｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １１４９：１８０−１８４（１９９３）；Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）；米国特許第５，０１３５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：２９６−２９９（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５３：７１−７４（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ 第９章（Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ編） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌ（１９９５）。１つのアプローチでは、脂質粒子を標的とするリガンド（例えば、抗体）を、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に結合する。別のアプローチでは、ターゲッティングリガンドを、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位末端に結合させる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）；Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８８：１１５−１１８（１９９６））。

【0194】

標的薬剤を結合させるための標準的な方法を用いることができる。例えば、標的薬剤の結合のために活性化することができるホスファチジルエタノールアミン、または誘導体化された親油性化合物（例えば、脂質誘導体化ブレオマイシン）を用いることができる。

【0195】

例えば、プロテインＡを組み込んだリポソームを用いて、抗体をターゲッティングするリポソームを構築することができる（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３３７−１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：２４４８−２４５１（１９９０）を参照されたい）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されており、この文献の教示は参照により本明細書に組み込まれる。ターゲッティング部分の例としては、新生物または腫瘍と関連する抗原を含む、細胞成分に特異的な他のタンパク質を挙げることもできる。ターゲッティング部分として用いられるタンパク質は、共有結合によってリポソームに結合させることができる（Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，１４９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１１−１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照されたい）。他のターゲッティング方法としては、ビオチン−アビジンシステムが挙げられる。

【0196】

治療剤−脂質粒子組成物および製剤化
本発明は、本発明の脂質粒子と活性剤とを含む組成物を含み、その場合、この活性剤は、脂質粒子と関連している。特定の実施形態では、活性剤は治療剤である。特定の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の水性内部に封入されている。他の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の１つ以上の脂質層の内部に存在する。他の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の外部または内部脂質表面に結合している。

【0197】

本明細書で使用される「完全に封入された」とは、粒子中の核酸が、血清への暴露または遊離のＤＮＡを相当に分解するヌクレアーゼアッセイの後にそれほど分解されないことを示す。完全に封入された系では、通常は遊離の核酸の１００％を分解する処理において、好ましくは粒子核酸の２５％未満が分解され、より好ましくは１０％未満、および最も好ましくは粒子核酸の５％未満が分解される。あるいは、完全な封入は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより決定され得る。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸染色剤である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）。

【0198】

完全に封入されたとは、粒子が血清安定である、すなわち、インビボ投与によって、粒子がすぐにはその構成部分に分解されないことも示唆する。

【0199】

本明細書で使用される活性剤としては、細胞、組織、器官、または対象に所望の効果を及ぼすことが可能な任意の分子または化合物が挙げられる。このような効果は、例えば、生物学的、生理学的、または美容的であり得る。活性剤は、例えば、核酸、ペプチドならびにポリペプチド（例えば、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、および霊長類化（Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（商標）抗体、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそのリガンド、ホルモンを含む）ならびに小分子（小さい有機分子または化合物を含む）をはじめとする、任意のタイプの分子または化合物であり得る。

【0200】

一実施形態では、活性剤は、治療剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤誘導体は、それ自体に治療活性があってもよく、またはさらに修飾されたときに活性を持つようになるプロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態では、治療剤誘導体は、未修飾の薬剤と比較したときに、治療活性の一部または全てを保持しているが、別の実施形態では、治療剤誘導体は治療活性を欠いている。

【0201】

様々な実施形態では、治療剤としては、例えば、抗炎症性化合物、抗鬱薬、刺激剤、鎮痛薬、抗生物質、受胎調節剤、解熱薬、血管拡張薬、抗血管新生薬、細胞血管剤（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬（例えば、抗不整脈剤、血管収縮薬）、ホルモンおよびステロイドが挙げられる。

【0202】

特定の実施形態では、治療剤は抗癌薬であり、これは、抗腫瘍剤、抗癌剤、腫瘍薬、抗新生物剤などとも呼ばれる。本発明に従って使用可能な抗癌薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、ブスルファン静注、ブスルファン経口、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ゲムツズマブ−オゾガミシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミゾール、リトレチノイン、メガストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテール、テモゾロミド、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、およびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用可能な抗腫瘍薬の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシン類似体または誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤ならびにカンプトテシンである。

【0203】

核酸−脂質粒子
特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は核酸と関連して、核酸−脂質粒子を生じさせる。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子中に完全に封入されている。本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことが意図されている。最大５０個のヌクレオチドを含む断片を通常オリゴヌクレオチドと呼び、それよりも長い断片をポリヌクレオチドと呼ぶ。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは２０〜５０ヌクレオチド長である。

【0204】

本発明との関連において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、またはその部分を含むポリマーまたはオリゴマーも含む。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取込みの強化やヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの特性のために、天然の形態よりも好ましいことが多い。

【0205】

オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドと分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、この糖の５’炭素と３’炭素においてリン酸と共有結合して、交互の非分岐状ポリマーを形成するデオキシリボースと呼ばれる５炭糖からなる。リボオリゴヌクレオチドは、５炭糖がリボースである同様の反復構造からなる。

【0206】

本発明による脂質−核酸粒子中に存在する核酸には、既知の核酸の任意の形態が含まれる。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、制御領域および終結領域を含む遺伝子、ならびに自己複製系（例えば、ウイルスまたはプラスミドＤＮＡ）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。

【0207】

本発明の核酸は、通常、核酸の特定の形態に依存して様々な長さであり得る。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００〜１００，０００ヌクレオチド残基長であり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０〜１００ヌクレオチド長の範囲であり得る。様々な関連実施形態では、一本鎖、二本鎖、および三本鎖のオリゴヌクレオチドの長さの範囲は、約１０〜約５０ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、約１５〜約３０ヌクレオチド長、約２０〜約３０ヌクレオチド長であり得る。

【0208】

特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイスするかまたは標的ポリヌクレオチドに相補的である。「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドの間で安定かつ特異的な結合が起こる程度の十分な相補度を示すために用いられる用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的に結合することで、標的分子の正常な機能が妨げられて、それからの有用性または発現が失われ、かつ特異的結合が望ましい条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合は、生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合は、アッセイが行なわれる条件下で、オリゴヌクレオチドが非標的配列に結合するのを妨げるほどの十分な相補度があるときに特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、それが標的としているまたはそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比較したとき、１、２、または３つの塩基置換を含む。

【0209】

ＲＮＡ干渉核酸
特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子と関連している。ＲＮＡｉ分子を用いたＲＮＡ干渉法を用いて、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を妨害し得る。この５年の間に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、基本的には、開発中の次世代の標的化オリゴヌクレオチド薬物としてアンチセンスＯＤＮやリボザイムに取って代わった。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる細胞質の多タンパク質複合体と会合することができる通常２１〜３０ヌクレオチド 長のＲＮＡ二重鎖である。ｓｉＲＮＡを搭載したＲＩＳＣは、相同なｍＲＮＡ転写産物の分解を仲介し、それゆえ、高い特異性をもってタンパク質発現をノックダウンするよう、ｓｉＲＮＡを設計することができる。他のアンチセンス技術とは異なり、自然な機構によるｓｉＲＮＡ機能は、非コードＲＮＡを介して遺伝子発現を制御するよう進化した。これは、その活性が、アンチセンスＯＤＮまたはリボザイムよりもインビトロおよびインビボで強力である理由であると一般に考えられている。臨床的に意義のある標的を標的とするｓｉＲＮＡをはじめとする種々のＲＮＡｉ試薬は現在、例えば、ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６：４４３−４５３（２００７）に記載されているように、医薬品として開発されているところである。

【0210】

最初に記載されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンス鎖とＲＮＡアンチセンス鎖の両方を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、現在、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスハイブリッド、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡｉを仲介することができることが証明されている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ａ．Ｔ．，（２００３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１１１−１１９）。したがって、本発明は、これらの異なるタイプの二本鎖分子のいずれかを含むＲＮＡｉ分子の使用を含む。さらに、ＲＮＡｉ分子を種々の形態で用いて、細胞に導入し得ることが理解される。したがって、本明細書で使用されるとき、ＲＮＡｉ分子は、限定するものではないが、２つの別々の鎖、すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、二本鎖領域を形成する相補配列のヘアピンループを含むポリヌクレオチド、例えば、ｓｈＲＮＡｉ分子と、単独でまたは別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる１つ以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターとを含む、細胞内でＲＮＡｉ応答を誘導することができる任意のおよび全ての分子を包含する。

【0211】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、標的ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害し得る。二本鎖ＲＮＡを介する遺伝子および核酸発現の抑制は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを細胞または生物に導入することにより、本発明に従って達成し得る。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方、例えば、１つのＲＮＡ鎖と１つのＤＮＡ鎖を含むハイブリッド分子であり得る。ｓｉＲＮＡを細胞に直接導入することにより、哺乳動物細胞内でＲＮＡｉを誘発することができることが証明されている（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１））。さらに、哺乳動物細胞内での抑制はＲＮＡレベルで起こり、標的とされた遺伝子に特異的で、ＲＮＡとタンパク質抑制の間に強い相関があった（Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４６−９７４７（２００１））。さらに、ＨｅＬａ Ｓ３、ＣＯＳ７、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＣＨＯ−Ｋ１およびＭＣＦ−７細胞をはじめとする、多種多様な細胞株は、ある程度ｓｉＲＮＡサイレンシングに感受性があることが示された（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ ９（１）：１−７、ｗｗｗ．ｄｏｔ．ａｍｂｉｏｎ．ｄｏｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ（９／１／０２）のワールドワイドウェブ上で入手可能）。

【0212】

特定のポリヌクレオチドを標的とするＲＮＡｉ分子は、当該技術分野で公知の手順に従って容易に調製することができる。効果的なｓｉＲＮＡ分子の構造的特徴が同定されている。Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８およびＥｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１），ＥＭＢＯ ２０：６８７７−６８８８。したがって、当業者であれば、多種多様な異なるｓｉＲＮＡ分子を用いて、特異的な遺伝子または転写産物を標的し得ることを理解するであろう。特定の実施形態では、本発明によるｓｉＲＮＡ分子は二本鎖であり、１６〜３０または１８〜２５ヌクレオチド長（その間にある各々の整数を含む）である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長さである。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、０〜７ヌクレオチドの３’突出または０〜４ヌクレオチドの５’突出を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、２ヌクレオチドの３’突出を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長であり、２ヌクレオチドの３’突出を有する（すなわち、ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖の間に１９ヌクレオチドの相補領域を含む）。特定の実施形態では、突出はＵＵまたはｄＴｄＴの３’突出である。

【0213】

１塩基対のミスマッチですらサイレンシングを低下させることが示されているので、通常、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ分子の一方の鎖に完全に相補的である。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、２’−デオキシ−または２’−Ｏ−メチル修飾などの修飾された骨格組成を有し得る。しかしながら、好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡの鎖全体は、２’デオキシまたは２’−Ｏ−修飾塩基のいずれかを含んで作製されない。

【0214】

別の実施形態では、本発明は、細胞内で遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む細胞を提供する。ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡのうちの１つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された調節配列を含む。

【0215】

一実施形態では、ｓｉＲＮＡ標的部位は、標的ｍＲＮＡ転写産物配列をＡＡジヌクレオチド配列の存在についてスキャンすることによって選択される。３’隣接の約１９ヌクレオチドと組み合わされた各々のＡＡジヌクレオチド配列は、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位である。一実施形態では、調節領域に結合するタンパク質がｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得るので、ｓｉＲＮＡ標的部位は、選択的に、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内または開始コドン付近の領域内（約７５塩基以内）には位置しない（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２０：６８７７−６８８８（２００１））。さらに、潜在的標的部位を、適当なゲノムデータベース（例えば、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ）上で入手可能な、ＢＬＡＳＴＮ ２．０．５）、および除外された他のコード配列とかなりの相同性を有する潜在的標的配列と比較し得る。

【0216】

特定の実施形態では、短いヘアピンＲＮＡは、本発明の核酸−脂質粒子の核酸成分を構成している。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、配列特異的に標的遺伝子の発現を低下させることができるヘアピンＲＮＡの形態である。短いヘアピンＲＮＡは、通常、細胞環境においてより安定でかつ分解されにくいので、遺伝子発現を抑制するときにｓｉＲＮＡに優る利点を提供し得る。このような短いヘアピンＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングは、種々の正常細胞株および癌細胞株において、ならびにマウス細胞およびヒト細胞をはじめとする哺乳動物細胞において機能することが立証されている。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８（２００２）。さらに、改変されたｓｈＲＮＡをコードする染色体遺伝子を担持するトランスジェニック細胞株が作製されている。これらの細胞は、ｓｈＲＮＡを構成的に合成し、それにより、子孫細胞に受け継がれ得る長時間持続型のまたは構成的な遺伝子サイレンシングを促進することができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（３）：１４４３−１４４８（２００２）。

【0217】

ｓｈＲＮＡはステムループ構造を含む。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、変えられるステムの長さ、通常、１９〜２９ヌクレオチド、またはその間の任意の数の長さを含み得る。特定の実施形態では、ヘアピンは、１９〜２１ヌクレオチドステムを含むが、他の実施形態では、ヘアピンは、２７〜２９ヌクレオチドステムを含む。特定の実施形態では、ループサイズは４〜２３ヌクレオチドの長さであるが、ループサイズは、サイレンシング活性にそれほど影響を及ぼすことなく、２３ヌクレオチドより大きいことがあり得る。ｓｈＲＮＡ分子は、効力を低下させることなく、ミスマッチ、例えば、ｓｈＲＮＡステムの２つの鎖の間のＧ−Ｕミスマッチを含み得る。実際、特定の実施形態では、例えば、細菌中で増殖させる間、ヘアピンを安定化するために、ヘアピンステム中に１個または数個のＧ−Ｕ対を含むようにｓｈＲＮＡを設計する。しかしながら、通常、標的ｍＲＮＡに結合するステムの部分（アンチセンス鎖）とｍＲＮＡの相補性が必要とされるので、この領域中の１塩基対ミスマッチでさえもサイレンシングを無効にする可能性がある。５’および３’突出は、ｓｈＲＮＡ機能に重要であるようには見えないので、必要とはされないが、これらが存在していてもよい（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８）。

【0218】

マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質には翻訳されない高度に保存された小ＲＮＡ分子群である。プロセッシングされたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれるようになる約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）の一本鎖ＲＮＡ分子であり、発生、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の重要な調節因子として同定されている。これらは、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に結合することによって、遺伝子発現の調節に役割を果たしていると考えられている。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写産物切断、またはその両方によって、遺伝子発現の下方調節を仲介する。ＲＩＳＣは、広範囲にわたる真核生物の核内での転写サイレンシングにも関与する。

【0219】

これまでに同定されたｍｉＲＮＡ配列の数は多く、かつ増加しており、その実例は、例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ” Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；“Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ” Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１に、また、ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｄｏｔ．ｓａｎｇｅｒ．ｄｏｔ．ａｃ．ｄｏｔ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／におけるワールド・ワイド・ウェブ上でも見られる。

【0220】

アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、標的化ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選ばれた配列に相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡの場合、相補的なＲＮＡ鎖に結合することによって、その翻訳を妨げる。アンチセンスＤＮＡは、特異的で、相補的な（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的するために用いることができる。結合が起こる場合、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを酵素のＲＮアーゼＨで分解することができる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチドを含む。この用語は、所望の標的遺伝子と正確には相補的ではない場合があるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、本発明は、非標的特異的活性がアンチセンスで見られる場合に、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途で最も好ましい場合に利用することができる。

【0221】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の効果的でかつ標的を定めた阻害剤であることが示されており、それゆえに、これを用いて、標的とされた遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドがタンパク質合成を阻害する効力は、よく確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼおよびムスカリンおよびムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡ_Ａ受容体およびヒトＥＧＦについて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８ Ｊｕｎ １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｎ １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号および米国特許第号５，６１０，２８８）。さらに、種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害し、かつこれらを治療するために使用可能なアンチセンスコンストラクトもまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７号および米国特許第５，７８３，６８３号）。

【0222】

アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製する方法は、当該技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために容易に適応することができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の解析、ならびに二次構造、Ｔ_ｍ、結合エネルギーおよび相対的な安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ダイマー、ヘアピン、または宿主細胞における標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少させるかもしくは妨げる他の二次構造を相対的に形成することができないことに基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの極めて好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンにおける領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造解析および標的部位の選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）および／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７， ２５（１７）：３３８９−４０２）を用いて行なうことができる。

【0223】

リボザイム
本発明の別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子は、リボザイムと会合する。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ−タンパク質複合体である（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、しばしばオリゴヌクレオチド基質内のいくつかのリン酸エステルのうちの１つだけを切断する高度の特異性によって、リン酸エステル転移反応を加速させる（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８１ Ｄｅｃ；２７（３ Ｐｔ ２）：４８７−９６；Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｄｅｃ ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ ａｎｄ Ｓｈｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｍａｙ １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、基質が化学反応前に特異的な塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部のガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合する必要があることに起因している。

【0224】

天然に存在する酵素的ＲＮＡの少なくとも６つの基本的な種類が現在知られている。各々は、生理的条件下においてトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持されている酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡを認識し、次に、相補的な塩基対形成によってそれに結合し、いったん正確な部位に結合したら、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的な切断は、コードされるタンパク質の合成を指示する能力を破壊する。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的に結合し、それを切断した後、そのＲＮＡから放出されて、別の標的を捜し、そして、新しい標的への結合とその切断を繰り返すことができる。

【0225】

酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、δ肝炎ウイルス、グループＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と会合した状態）またはアカパンカビＶＳ ＲＮＡモチーフとして形成され得る。ハンマーヘッド型モチーフの具体的な例は、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ Ｓｅｐ １１；２０（１７）：４５５９−６５に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第ＥＰ０３６０２５７号）、Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９ Ｊｕｎ １３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｊａｎ ２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。δ肝炎ウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２ Ｄｅｃ １；３１（４７）：１１８４３−５２に記載されており、ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｄｅｃ；３５（３ Ｐｔ ２）：８４９−５７に記載されており、アカパンカビＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｍａｙ １８；６１（４）：６８５−９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１ Ｏｃｔ １；８８（１９）：８８２６−３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３ Ｍａｒ ２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載されており、グループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明に従って使用される酵素的核酸分子の重要な特徴は、それらが、標的遺伝子のＤＮＡ領域またはＲＮＡ領域の１または複数に相補的である特異的な基質結合部位を有すること、およびその分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を基質結合部位内または基質結合部位周辺に有することである。したがって、リボザイムコンストラクトは、本明細書中で述べられる特定のモチーフに限定される必要はない。

【0226】

任意のポリヌクレオチド配列を標的とするリボザイムを作製する方法は、当該技術分野で公知である。リボザイムは、各々参照により本明細書に明確に組み込まれる、国際公開第９３／２３５６９号および同第９４／０２５９５号に記載されているように設計され、かつ合成されて、それらに記載されているようにインビトロおよびインビボで試験され得る。

【0227】

リボザイム活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更すること、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ修飾を有するリボザイムを化学的に合成すること（例えば、国際公開第９２／０７０６５号；国際公開第９３／１５１８７号；国際公開第９１／０３１６２号；欧州特許出願公開９２１１０２９８．４号；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際公開第９４／１３６８８を参照されたい。これらの文献は、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分になされ得る様々な化学修飾を記載している）、細胞内でのそれらの効力を高める修飾、およびＲＮＡ合成時間を短縮し、化学的必要性を低下させるステムＩＩ塩基の除去によって、最適化することができる。

【0228】

本発明の組成物および方法において使用するのに好適なオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の追加の特定の核酸配列は、米国特許出願第６０／３７９，３４３号、米国特許出願第０９／６４９，５２７号、国際公開第０２／０６９３６９号、国際公開第０１／１５７２６号、米国特許第６，４０６，７０５号およびＲａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９８：１１８５−１１９２（２００１）に記載されている。ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法において使用されるＯＤＮは、ＣｐＧモチーフ内にホスホジエステル（「ＰＯ」）骨格もしくはホスホロチオアート（「ＰＳ」）骨格および／または少なくとも１つのメチル化されたシトシン残基を有する。

【0229】

核酸修飾
１９９０年代、ＤＮＡベースのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）およびリボザイム（ＲＮＡ）が、薬物のデザインおよび開発に対して興奮させる新しいパラダイムをもたらしたが、それらのインビボでの適用は、エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼ活性ならびに首尾よい細胞内送達の欠如によって妨げられた。この分解の問題は、オリゴヌクレオチド（オリゴ）薬物がヌクレアーゼ酵素によって認識されるのを妨げるが、それらの作用機構を阻害しない化学修飾に対する大規模な研究の後、効果的に克服された。この研究は非常に成功したので、現在開発過程のアンチセンスＯＤＮ薬物は、未修飾分子の場合の数分間と比較して、インビボで数日間インタクトな状態である（Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．２００３．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：１６２８−４４）。しかしながら、細胞内送達および作用機序の問題は、これまで、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムが臨床的な製品になることを制限している。

【0230】

ＲＮＡ二重鎖は、本質的に、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡよりもヌクレアーゼに対して安定であり、かつアンチセンスＯＤＮとは異なり、未修飾ｓｉＲＮＡは、いったん細胞質に到達すると良好な活性を示す。そうであっても、アンチセンスＯＤＮやリボザイムを安定化させるために開発された化学修飾もまた、どれくらいの化学修飾が許容され得るか、薬物動態学的および薬力学的な活性を高めることができるかどうかを明らかにするために、ｓｉＲＮＡに体系的に適用されている。ｓｉＲＮＡ二重鎖によるＲＮＡ干渉には、異なる機能を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖が必要である。両方とも、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの侵入を可能にするために必要であるが、いったん装填されると、２本の鎖は分離し、センス鎖は分解されるのに対し、アンチセンス鎖は残留して、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡに導く。ＲＩＳＣへの侵入は、標的ｍＲＮＡの認識および切断よりも構造的に厳格性の低いプロセスである。結果として、センス鎖の多くの異なる化学修飾が可能であるが、限られた変化しかアンチセンス鎖によって許容されない（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0231】

当該技術分野で公知の通り、ヌクレオシドは、塩基と糖の組合せである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、その糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合させることができる。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合して、線状のポリマー化合物を形成する。次に、この線状のポリマー構造のそれぞれの末端がさらに結合されて、環状構造を形成することができる。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’−５’ホスホジエステル結合である。

【0232】

本発明による脂質−核酸粒子において使用される核酸は、公知である任意の形態の核酸を含む。したがって、この核酸は、ヌクレアーゼ耐性および血清安定性を高めるために以前に使用されたタイプの修飾された核酸であり得る。しかしながら、驚くべきことに、許容可能な治療的な生成物は、天然の核酸ポリマーのホスホジエステル結合に対する修飾を有さない核酸から脂質−核酸粒子を製剤化する本発明の方法を用いても調製することができ、未修飾のホスホジエステル核酸（すなわち、全ての結合がホスホジエステル結合である核酸）を使用することが、本発明の好ましい実施形態である。

【0233】

骨格修飾
本発明において有用なアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび他のオリゴヌクレオチドとしては、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格内にリン原子を保持するオリゴヌクレオチドと骨格内にリン原子を有さないオリゴヌクレオチドが含まれる。ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと考えることができる。修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ−エステル、メチルホスホナートおよび他のアルキルホスホナート（３’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含む）、ホスフィナート、ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホロセレナート、メチルホスホナートまたはＯ−アルキルホスホトリエステル結合、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスファート、これらの２’−５’結合類似体、および反転した極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接する対では、３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’とが結合する）が挙げられる。本発明による核酸内に存在し得る特定の修飾の特定の非限定的な例を表２に示す。

【0234】

様々な塩、混合塩および遊離酸形態もまた含まれる。上記結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号が挙げられるが、これらに限定されない。

【0235】

特定の実施形態では、その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合の混合、または１つ以上の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、例えば、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２構成部分を有するその他のものが挙げられる。上記のオリゴヌクレオシドを記載している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されない。

【0236】

ホスホロチオアート骨格修飾（表３、＃１）（ホスホジエステル結合内の非架橋酸素が硫黄で置換されている）は、ヌクレアーゼ分解に対して核酸薬物を安定化させるために配置された最も古く最も一般的な手段の１つである。通常、ＰＳ修飾は、活性に対して大きく影響せずに、両方のｓｉＲＮＡ鎖に対して広範になされ得るようである（Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８−４４，２００３）。しかしながら、ＰＳオリゴは、タンパク質と非特異的に貪欲に会合することが知られており、その結果、特にｉ．ｖ．投与の際に毒性が生じる。それゆえに、ＰＳ修飾は、通常、３’および５’末端における１つまたは２つの塩基に制限される。ボラノホスファートリンカー（表３、＃２）は、ＰＳよりも明らかに安定であり、ｓｉＲＮＡ活性を高め、そして低毒性を有する、最近の修飾である（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：５９９１−６０００，２００４）。

【表C】

【表D】

【表E】

【0237】

他の有用な核酸誘導体としては、架橋酸素原子（リン酸エステル結合を形成するもの）が−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＨ_２−などで置換されている核酸分子が挙げられる。特定の実施形態では、使用されるアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸に対する改変は、核酸と会合する負電荷に完全には影響を及ぼさないであろう。したがって、本発明は、結合の部分が、例えば、中性のメチルホスホナートまたはホスホルアミダート結合で置換されている、アンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび他の核酸の使用を企図する。中性の結合が使用されるとき、ある特定の実施形態において、８０％未満の核酸結合が、そのように置換されるか、または５０％未満の結合がそのように置換される。

【0238】

塩基修飾
塩基修飾は、骨格および糖に対する修飾よりも一般的ではない。０．３−６に示す修飾の全てが、ヌクレアーゼに対してｓｉＲＮＡを安定化させ、活性に対してほとんど効果がないようである（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｄｕ，Ｑ．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．２００６．ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６：８９３−９００）。

【0239】

したがって、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオ塩基（当該技術分野では単に「塩基」と表されることが多い）の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用されるとき、「未修飾の」または「天然の」ヌクレオ塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾されたヌクレオ塩基としては、他の合成および天然のヌクレオ塩基（例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃまたはｍ５ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。

【0240】

特定のヌクレオ塩基は、本発明のオリゴマー化合物（５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）を含む）の結合親和性を増加させるのに特に有用である。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，編，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １９９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐａｇｅｓ ２７６−２７８）。これらは、特定の実施形態では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせ得る。これらの修飾されたヌクレオ塩基ならびに他の修飾されたヌクレオ塩基の特定のものの調製を教示する米国特許としては、上で述べた米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１，５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号が挙げられるが、これらに限定されない。

【0241】

糖修飾
糖基におけるほとんどの修飾は、好都合に化学的に反応性の部位を提供する、ＲＮＡ糖環の２’−ＯＨにおいて生じる。（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．２００４．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ８：５７０−９；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｄｕ，Ｑ．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．２００６．ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６：８９３−９００）。２’−Ｆおよび２’−ＯＭＥ（０．７および８）が、一般的であり、その両方が、安定性を高め、２’−ＯＭＥ修飾は、１本の鎖あたり４ヌクレオチド未満に制限される限り、活性を低下させない（Ｈｏｌｅｎ，Ｔ．，Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，Ｍ．，Ｂａｂａｉｅ，Ｅ．，Ｐｒｙｄｚ，Ｈ．２００３．Ｓｉｍｉｌａｒ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｓｉＲＮＡｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈｅｙ ａｃｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｃｏｍｍｏｎ ＲＮＡｉ ｐａｔｈｗａｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２４０１−７）。修飾塩基がその分子の中央領域に限定されるとき、２’−Ｏ−ＭＯＥ（０．９）は、ｓｉＲＮＡにおいて最も有効である（Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ａｌｌｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｄａｎｄｅ，Ｐ．，Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｔ．Ａ．，Ｓｉｏｕｆｉ，Ｎ．，Ｊａｒｒｅｓ，Ｒ．，Ｂａｋｅｒ，Ｂ．Ｆ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．，Ｇｒｉｆｆｅｙ，Ｒ．Ｈ．，Ｂｈａｔ，Ｂ．２００５．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８：４２４７−５３）。活性を失わせることなくｓｉＲＮＡを安定化させることが見出されている他の修飾を、０．１０−１４に示す。

【0242】

修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の置換された糖部分も含み得る。例えば、本発明は、以下のうちの１つを２’位に含むオリゴヌクレオチドを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル、またはＯ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル（ここで、このアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ_１−Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２−Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２（ここで、ｎおよびｍは１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のもののうちの１つを_２’位に含む：Ｃ_１−Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基。１つの修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の修飾としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）が挙げられる。

【0243】

修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合したオリゴヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても行われ得る。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物も有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号：同第５，１１８，８００号：同第５，３１９，０８０号：同第５，３５９，０４４号：同第５，３９３，８７８号：同第５，４４６，１３７号：同第５，４６６，７８６号：同第５，５１４，７８５号：同第５，５１９，１３４号：同第５，５６７，８１１号：同第５，５７６，４２７号：同第５，５９１，７２２号：同第５，５９７，９０９号：同第５，６１０，３００号：同第５，６２７，０５３号：同第５，６３９，８７３号：同第５，６４６，２６５号：同第５，６５８，８７３号：同第５，６７０，６３３号：および同第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されない。

【0244】

他のオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方（すなわち、骨格）は、新規の基で置換されるが、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。ヌクレオ塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の生成を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００）に見られる。

【0245】

本発明の特定の実施形態は、ホスホロチオアート骨格を有するオリゴヌクレオチドならびにヘテロ原子骨格、特に、上で参照された米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格と称される）、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−（ここで、天然のホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−と表現される）および上で参照された米国特許第５，６０２，２４０号アミド骨格を有するオリゴヌクレオシドである。上で参照された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。

【0246】

キメラオリゴヌクレオチド
所与の化合物における全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、上述の修飾のうちの２つ以上が、１つの化合物、またはオリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドにさえ組み込まれ得る。本発明の特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は、本発明との関連において、各々が少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている２つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、通常、１つ以上の有利な特性（例えば、高いヌクレアーゼ耐性、細胞への高い取り込み、ＲＮＡ標的に対する高い結合親和性）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域、およびＲＮａｓｅＨ切断に対する基質である領域を含む。

【0247】

一実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増加させるために修飾された少なくとも１つの領域を含む。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチド／標的対のＴｍ（オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度であり；解離は、分光光度的に検出される）を測定することによって通例の通りに決定される。Ｔｍが高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が高い。一実施形態では、標的ｍＲＮＡ結合親和性を増加させるために修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位において修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドに通例の通りに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。このような高い親和性の効果は、標的遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害を大いに高めることになる。

【0248】

別の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨに対する基質として作用する領域を含む。当然、オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載の様々な修飾の任意の組合せを含み得ることが理解される。

【0249】

本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞取込みを高める、１つ以上の部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。このようなコンジュゲートおよびそれを調製する方法は、当該技術分野で公知である。

【0250】

治療効力などのインビボでの有用性について、合理的な経験則は、チオ化されたバージョンの配列が遊離形態で働く場合、任意の化学成分の、同じ配列の封入された粒子も有効であるということを当業者は理解するだろう。封入された粒子は、アンチセンス治療に別段応答性であることが知られていない状態およびモデルにおいて有効性を示す、より広範囲のインビボ有用性も有し得る。本発明を適用することにより、現在アンチセンス治療に応答する古いモデルを見出し得ることを当業者は知っている。さらに、当業者は、本発明を使用することにより、見捨てられたアンチセンス配列または化学成分を再考し、効力を見出し得る。

【0251】

本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、周知の固相合成技術によって、好都合にかつ通例の通りに、作製され得る。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかのベンダーによって販売されている。このような合成のための任意の他の手段も使用され得る。オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に、業務従事者の能力の範囲内である。ホスホロチオアートおよびアルキル化された誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することも周知である。

【0252】

定義
便宜のため、本明細書、実施例、および付随する特許請求の範囲で使用される特定の用語および語句の意味が、以下に提供される。本明細書の他の部分におけるある用語の用法と本節で示されるその定義との間に明白な矛盾がある場合には、本節の定義が優先されるものとする。

【0253】

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は各々、通常、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳述するような修飾ヌクレオチド、または代用置換部分を指すこともできるということが理解されるであろう。当業者にはよく知られていることであるが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させないで、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを他の部分に置換することが可能である。例えば、限定するものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中で、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドに置換し得る。このような置換部分を含む配列は本発明の実施形態である。

【0254】

本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子」とは、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを意味する。「第ＶＩＩ因子」という用語は、当技術分野で、ＡＩ１３２６２０、Ｃｆ７、凝固因子ＶＩＩ前駆体、凝固因子ＶＩＩ、ＦＶＩＩ、血清プロトロンビン転化促進因子、ＦＶＩＩ凝固タンパク質、およびエプタコグαとしても知られている。

【0255】

本明細書で使用されるとき、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを含む、遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。

【0256】

本明細書で使用されるとき、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて参照される配列によって説明される、ヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

【0257】

本明細書で使用されるとき、および別途示されない限り、ヌクレオチド対との関連で使用される場合の「相補的」という用語は、古典的なワトソン−クリック対、すなわち、ＧＣ、ＡＴ、またはＡＵを意味する。この用語は、ヌクレオチドの一方または両方が、例えば、リボース修飾またはリン酸骨格修飾によって、本明細書に記載されるように修飾されている古典的なワトソン−クリック対形成にまでも及ぶ。この用語は、イノシンまたは塩基対形成特性を実質的に変化させない他の実体との対形成を含むこともできる。

【0258】

本明細書で使用されるとき、および別途示されない限り、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を説明するのに使用される場合の「相補的」という用語は、当業者に理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、特定の条件下で二重鎖構造を形成する能力を指す。相補性は、生理的条件下での、すなわち、生物内で直面し得るような生理的に関連のある条件下でのハイブリダイゼーションを可能にする完全な相補性、実質的な相補性、および十分な相補性を含むことができる。完全な相補性とは、個々の対について上で定義されるような、第１の配列と第２の配列の対の全てにおける相補性を指す。ある配列が、本明細書中の第２の配列に対して「実質的に相補的」である場合、この２つの配列は、完全に相補的であることができるか、またはこれらの配列は、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の、しかし通常は、多くて４つ、３つ、もしくは２つのミスマッチの塩基対を形成しながらも、その最終的な適用に最も関連がある条件下でハイブリダイズする能力を保持し得る。実質的な相補性は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとして定義することもでき、この場合、ストリンジェントな条件は、以下を含み得る：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間の後、洗浄。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従う２つの配列の相補性の試験に最も適当な条件の組を決定することができるであろう。

【0259】

しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の一本鎖突出を形成するように設計される場合、このような突出は、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、一方の２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと、もう一方の２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本発明の目的のために、やはり「完全に相補的」と呼ばれ得る。

【0260】

本明細書で使用される「相補的」配列はまた、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然ヌクレオチドや修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよく、またはこれらの塩基対から完全に形成されてもよい。

【0261】

生理的条件下での、例えば、生物内で直面し得るような生理的に関連のある条件下でのハイブリダイゼーションを可能にする「相補的」、「完全に相補的」、「実質的に相補的」、および十分な相補性という用語は、これらを使用する文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基ミスマッチに関して本明細書で使用され得る。

【0262】

本明細書で使用されるとき、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に相補的な、例えば、実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、目的の（例えば、第ＶＩＩ因子をコードする）ｍＲＮＡの連続した部分に相補的な、例えば、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列が第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。

【0263】

本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、逆平行で、かつ上で定義されたような、実質的に相補的な２つの核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子、またはリボ核酸分子の複合体を指す。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはその２つの鎖は、別々のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が１つのより大きい分子の部分であり、したがって、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間の中断されないヌクレオチド鎖によって接続されている場合、接続ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間の中断されないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合的に接続されている場合、この接続構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチドの数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチド突出を含み得る。本明細書で使用されるｄｓＲＮＡは、「小さい阻害性ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、または「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる。

【0264】

本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端がもう一方の鎖の５’末端を越えて伸びるか、またはその逆である場合に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する不対ヌクレオチド（単数または複数）を指す。「平滑」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチド突出がないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチド突出がないｄｓＲＮＡのことである。

【0265】

「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用されるとき、「相補領域」という用語は、本明細書で定義されるように、配列（例えば、標的配列）に実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、かつ存在する場合は、通常、末端領域（単数または複数）に、例えば、５’末端および／または３’末端から６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。

【0266】

本明細書で使用される「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖のある領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。

【0267】

「同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列を比較することによって決定される、このような配列間の関係性のことである。同一性はまた、一連のポリヌクレオチド配列間の一致によって決定される、このような配列間の配列関連性の程度を意味する。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、この用語は当業者に周知である（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ．，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照されたい）。本明細書で使用される「実質的に同一」とは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的遺伝子の対応する部分との間に非常に高い相同性（好ましくは１００％の配列同一性）があることを意味する。しかしながら、９０％超、または９５％の配列同一性を有するｄｓＲＮＡを本発明で使用してもよく、したがって、遺伝子突然変異、系統多形、または進化的分岐のために見込まれ得る配列のバリエーションも許容することができる。１００％同一性が好ましいが、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡと標的遺伝子の間に単一または多数の塩基対のランダムなミスマッチを含有してもよい。

【0268】

当業者には理解されるように、「細胞に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに関する場合、細胞内への取込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取込みは、人の手を借りない拡散プロセスまたは能動的な細胞プロセスを通じて、または補助的な薬剤もしくは装置によってなされ得る。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されるものではない。ｄｓＲＮＡは、生きた生物の一部である「細胞に導入される」場合もある。このような例では、細胞への導入は、生物への送達を含むことになる。例えば、インビボ送達については、ｄｓＲＮＡを組織部位に注入することができるし、または全身投与することができる。インビトロでの細胞への導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法が含まれる。

【0269】

「サイレンシングする」および「発現を阻害する」という用語は、これらの用語が第ＶＩＩ因子遺伝子を指すものである限り、本明細書では、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を指し、この抑制は、第ＶＩＩ因子遺伝子が転写される第１の細胞または細胞群であって、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現が阻害されるように処理された細胞または細胞群から単離し得る、第ＶＩＩ因子遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群であって、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、第１の細胞または細胞群のように処理されていない細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、低下していることによって明らかにされるようなものである。阻害の程度は、通常

【数1】

で表される。

【0270】

あるいは、阻害の程度は、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写に関数関係があるパラメータ（例えば、細胞によって分泌される、第ＶＩＩ因子遺伝子にコードされたタンパク質の量、または特定の表現型（例えば、アポトーシス）を示す細胞の数）の減少という観点から与えられる場合もある。原則として、第ＶＩＩ因子遺伝子のサイレンシングは、構成的にかまたはゲノム工学によるかのいずれかで、標的を発現している任意の細胞において、任意の適当なアッセイによって測定し得る。しかしながら、所与のｓｉＲＮＡが第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を一定の度合いで阻害するかどうか、したがって、このｓｉＲＮＡが本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要な場合、以下の実施例に提供されるアッセイが、このような参照としての役割を果たすものとする。

【0271】

例えば、ある例では、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約２０％、２５％、３５％、４０％、または５０％抑制される。一実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。より好ましい実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。

【0272】

「治療する」、「治療」などの用語は、疾患または障害の緩和または軽減を指す。本発明との関連において、以下に本明細書で記載される他の状態（例えば、血栓疾患以外の第ＶＩＩ因子が仲介する状態）のいずれかに関する限り、「治療する」、「治療」などの用語は、このような状態に伴う少なくとも１つの症状を緩和もしくは軽減すること、またはこのような状態の進行を遅延もしくは逆行させることを意味する。

【0273】

「治療的に有意義な」組成物は、適切な用量で投与されたときに、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を緩和または軽減することができる。

【0274】

本明細書で使用されるとき、「第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患」という用語ならびに関連用語および関連語句は、不適切な（例えば、正常よりも大きい）第ＶＩＩ因子の活性を特徴とする状態または障害を指す。不適切な第ＶＩＩ因子の機能的活性は、通常は第ＶＩＩ因子を発現しない細胞での第ＶＩＩ因子の発現、または（例えば、ウイルス性出血熱の症状、もしくは血栓を引き起こす）第ＶＩＩ因子発現の増大の結果として生じ得る。第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患は、不適切な第ＶＩＩ因子の機能的活性によって完全にまたは部分的に仲介され得る。しかしながら、第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患は、第ＶＩＩ因子の調節によって、根本的な状態または障害にいくらかの影響を及ぼせるものである（例えば、第ＶＩＩ因子の阻害剤によって、少なくとも一部の患者では健康がいくらか改善される）。

【0275】

「出血熱」には、ウイルス感染によって引き起こされる病気の組合せが含まれる。典型的には、発熱と消化管症状に続いて、毛細血管の出血が起こる。

【0276】

「凝固障害」とは、対象の血液凝固機構の任意の欠陥のことである。

【0277】

本明細書で使用されるとき、「血栓障害」とは、好ましくは望ましくないＦＶＩＩ発現に起因する任意の障害のことであり、望ましくない血液凝固を特徴とする任意の障害を含む。

【0278】

本明細書で使用されるとき、「治療的有効量」および「予防的有効量」という語句は、ウイルス性出血熱、またはこのような障害の明らかな症状（例えば、出血、発熱、衰弱、筋肉痛、頭痛、炎症、もしくは循環性ショック）の治療、予防、もしくは管理において治療効果を提供する量を指す。治療的に有効な具体的な量は、普通の医師により容易に決定可能であり、当技術分野で公知の要因、例えば、血栓障害のタイプ、患者の病歴および年齢、疾患の段階、ならびに他の薬剤の投与などによって変わり得る。

【0279】

本明細書で使用されるとき、「薬学的組成物」には、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡと薬学的に許容される担体とが含まれる。本明細書で使用されるとき、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」、または単に「有効量」とは、意図される薬理学的結果、治療的結果、または予防的結果をもたらすのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害と関連する測定可能なパラメータが少なくとも２５％低下したときに、所与の臨床治療が有効であると考えられる場合、その疾患または障害を治療するための薬物の治療的有効量は、そのパラメータの少なくとも２５％低下をもたらすのに必要な量である。

【0280】

「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤を投与するための担体を指す。このような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。この用語は、細胞培養培地を特に除外する。経口投与される薬物について、薬学的に許容される担体には、薬学的に許容される賦形剤、例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、香料、着色剤、および防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれ、一方、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は、好適な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれ得、一方、潤滑剤は、存在する場合には、一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。所望の場合には、消化管内での吸収を遅らせるために、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングし得る。

【0281】

本明細書で使用されるとき、「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能なベクターが導入された細胞のことである。

【0282】

核酸−脂質粒子の特徴
特定の実施形態では、本発明は、脂質に封入された核酸粒子を生成するための方法および組成物に関し、この粒子中で、核酸は脂質層内に封入される。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み込んでいるこのような核酸−脂質粒子は：（１）薬物対脂質比；（２）封入効率；および（３）粒径をはじめとする種々の生物物理学的パラメータを用いて特徴付けられる。高い薬物対脂質比、高い封入効率、良好なヌクレアーゼ耐性および血清安定性、ならびに調節可能な粒径（通常、直径２００ｎｍ未満）が望ましい。さらに、ヌクレアーゼ耐性を付与するための核酸の修飾が、治療薬のコストに加えられるが、多くの場合、限られた耐性しか提供しないので、核酸ポリマーの性質が重要である。特に記述されない限り、これらの基準は、本明細書中で以下の通りに計算される。

【0283】

薬物対脂質比は、規定容量の調製物中の核酸の量を、同じ容量中の脂質の量で割ったものである。これは、モル当たりのモル基準または重量当たりの重量基準またはモル当たりの重量基準に基づくものであり得る。最終的な投与の準備のできた組成物の場合、透析、クロマトグラフィーおよび／または酵素（例えば、ヌクレアーゼ）消化を用いて、可能な限り多くの外部核酸を除去した後に、核酸：脂質比を計算する。

【0284】

封入効率とは、出発混合物の薬物対脂質比を、最終的な投与に適格な組成物の薬物対脂質比で割ったものを指す。これは、相対的な効率の尺度である。絶対的な効率の尺度については、最終的に投与に適格な組成物になる出発混合物に添加された核酸の総量を計算することもできる。製剤化プロセスの間に失われる脂質の量も計算し得る。効率は、組成物の損失量と費用の尺度である

【0285】

サイズは、形成される粒子のサイズ（直径）を示す。サイズ分布は、Ｎｉｃｏｍｐ Ｍｏｄｅｌ３７０サブマイクロメートル粒子寸法測定器において準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を用いて測定され得る。２００ｎｍ未満の粒子が、新生物や炎症部位などの新生血管形成された（漏出性）組織への分布のために好ましい。

【0286】

脂質粒子の調製方法
本発明の方法および組成物は、特定のカチオン性脂質を利用し、その脂質の合成、調製および特徴づけは、以下および添付の実施例において説明される。さらに、本発明は、治療剤（例えば、核酸）と会合した脂質粒子をはじめとする脂質粒子を調製する方法を提供する。本明細書で記載される方法において、脂質の混合物は、核酸の緩衝水溶液と組み合わされて、脂質粒子内に封入された核酸を含む中間体混合物を生成し、その場合、この封入された核酸は、約３重量％〜約２５重量％、好ましくは５〜１５重量％という核酸／脂質比で存在する。この中間体混合物は、脂質に封入された核酸粒子を得るために、場合によって大きさが揃えられてもよく、その場合、この脂質部分は、好ましくは３０〜１５０ｎｍの直径、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単層小胞である。次に、ｐＨを上げて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それにより、少なくとも部分的に表面が中和された、脂質に封入された核酸組成物が提供される。

【0287】

上記のように、これらのカチオン性脂質のいくつかは、アミノ基のｐＫ_ａ未満のｐＨにおいて帯電しており、ｐＫ_ａより高いｐＨにおいて実質的に中性である、アミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と呼ばれ、２工程プロセスを用いて本発明の組成物において使用することができる。第１に、核酸の存在下において、滴定可能なカチオン性脂質と他の小胞成分を用いて、低ｐＨにおいて脂質小胞を形成することができる。この方法で、小胞が核酸を封入し、捕捉する。第２に、媒体のｐＨを、存在する滴定可能なカチオン性脂質のｐＫ_ａより高いレベルに、すなわち、生理学的ｐＨまたはそれよりも高く上昇させることによって、新しく形成された小胞の表面電荷を中和することができる。このプロセスの特に有利な態様は、表面に吸着された任意の核酸の容易な除去と、中性の表面を有する結果として生じる核酸送達ビヒクルの両方を含む。中性の表面を有するリポソームまたは脂質粒子は、循環からの速やかなクリアランスを回避し、かつカチオン性リポソーム調製物と関連する特定の毒性を回避すると予想される。核酸−脂質粒子の組成物におけるこのような滴定可能なカチオン性脂質のこれらの使用に関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号に提供されている。

【0288】

この方法で形成された小胞は、高含有量の核酸を含む均一な小胞サイズの組成物を提供することにさらに留意する。さらに、これらの小胞は、約３０〜約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０〜約９０ｎｍのサイズ範囲を有する。

【0289】

任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、核酸封入の非常に高い効率は、低ｐＨにおける静電相互作用の結果であると考えられる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）において、小胞表面は帯電しており、静電相互作用を介して核酸の一部に結合する。外部の酸性緩衝液が、より中性の緩衝液（例えば、ｐＨ７．５）に交換されると、脂質粒子またはリポソームの表面は中和され、任意の外部の核酸を除去することが可能になる。製剤化プロセスに関するより詳細な情報は、様々な刊行物（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号）に提供されている。

【0290】

上記のことを考慮して、本発明は、脂質／核酸組成物を調製する方法を提供する。本明細書で記載される方法において、脂質の混合物は、核酸の緩衝水溶液と組み合わされて、脂質粒子内に封入された核酸を含む中間体混合物を生成し、例えば、その場合、この封入された核酸は、約１０重量％〜約２０重量％という核酸／脂質比で存在する。中間体混合物は、脂質に封入された核酸粒子を得るために、場合によって、大きさを揃えてもよく、その場合、この脂質部分は、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単層小胞である。次に、ｐＨを上げて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それにより、少なくとも部分的に表面が中和された脂質で封入された核酸組成物を提供する。

【0291】

特定の実施形態では、脂質の混合物は、少なくとも２つの脂質成分、すなわち、脂質が、ｐＫａよりも低いｐＨにおいてカチオン性であり、ｐＫａより高いｐＨにおいて中性であるようなｐＫａを有する脂質から選択される本発明の第１アミノ脂質成分と、脂質−核酸粒子形成中の粒子凝集を防止する脂質の中から選択される第２脂質成分とを含む。特定の実施形態では、アミノ脂質は、本発明の新規のカチオン性脂質である。

【0292】

本発明の核酸−脂質粒子を調製する際、脂質の混合物は、通常、有機溶媒中の脂質の溶液である。次に、この脂質の混合物を乾燥させて、薄膜を形成させることができるか、または凍結乾燥させて、粉末を形成させ、その後、水性緩衝液で水和して、リポソームを形成させることができる。あるいは、好ましい方法において、脂質混合物をエタノールなどの水混和性アルコール中に可溶化し、このエタノール性溶液を水性緩衝液に添加して、自発的にリポソームを形成させる。ほとんどの実施形態では、アルコールを市販されている形態で使用する。例えば、エタノールを、無水エタノール（１００％）として、または９５％エタノール（残りの部分は水である）として使用することができる。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号でより詳細に記載されている。

【0293】

本発明によって、脂質混合物を、核酸を含み得る緩衝水溶液と組み合わせる。この緩衝水溶液は、通常、緩衝液が脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のｐＫ_ａ未満のｐＨを有する溶液である。好適な緩衝液の例としては、クエン酸、リン酸、酢酸およびＭＥＳが挙げられる。特に好ましい緩衝液はクエン酸緩衝液である。好ましい緩衝液は、封入される核酸の化学成分に応じて１〜１０００ｍＭのアニオンの範囲であり、緩衝液濃度の最適化は、高い充填レベルを達成するために重要であり得る（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号を参照されたい）。あるいは、塩化物、硫酸塩などでｐＨ５〜６に酸性化された純水が有用であり得る。この場合、５％グルコース、または粒子が、エタノールを除去するため、ｐＨを上げるために透析されるか、もしくは通常の食塩水などの薬学的に許容される担体と混合されたときに、粒子膜を超えて浸透ポテンシャルを釣り合わせる別の非イオン性溶質を添加することが好適である場合がある。緩衝液中の核酸の量は、変動し得るが、通常、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬである。

【0294】

脂質の混合物と治療用核酸の緩衝水溶液とを組み合わせて中間体混合物を得る。中間体混合物は、通常、封入された核酸を有する脂質粒子の混合物である。さらに、中間体混合物は、負に帯電した核酸のイオン引力および脂質粒子表面上の正に帯電した脂質（アミノ脂質またはプロトン化可能な第１脂質成分を構成している他の脂質は、その脂質上のプロトン化可能な基のｐＫ_ａ未満のｐＨを有する緩衝液中で正に帯電している）のために、脂質粒子（リポソームまたは脂質小胞）の表面に付着したいくらかの核酸も含み得る。一群の好ましい実施形態では、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、その溶液の各々の容量は、組み合わせたときに、得られるアルコール含有量が約２０容量％〜約４５容量％になるように調整される。混合物を組み合わせる方法は、多くの場合、生成される組成物の規模に応じて、種々のプロセスのいずれかを含むことができる。例えば、総容量が約１０〜２０ｍＬ以下であるとき、溶液を試験管内で組み合わせて、ボルテックスミキサーを用いて一緒に撹拌することができる。大規模プロセスを好適な生産規模のガラス製品中で実施することができる。

【0295】

場合により、脂質混合物と治療剤（核酸）の緩衝水溶液とを組み合わせることによって生成される、脂質に封入された治療剤（例えば、核酸）の複合体は、所望のサイズの範囲および比較的狭い分布の脂質粒径を達成するために、大きさを揃えることができる。好ましくは、本明細書で提供される組成物は、約７０〜約２００ｎｍ、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍの平均直径の大きさに揃えられる。所望のサイズにリポソームの大きさを揃えるために、いくつかの技術が利用可能である。大きさを揃える１つの方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。バスまたはプローブ超音波処理によってリポソーム懸濁液を超音波処理することにより、サイズが約０．０５マイクロメートル未満の小型の単層小胞（ＳＵＶ）まで段階的にサイズが縮小される。均質化は、大きなリポソームをより小さなリポソームに断片化する剪断エネルギーに依存する別の方法である。通常の均質化手順では、選択されたリポソームサイズ（通常、約０．１〜０．５マイクロメートル）が観察されるまで、多層小胞を標準的なエマルジョンホモジナイザーに通して再循環させる。両方の方法において、粒径分布は、従来のレーザービーム粒径測定によってモニタリングすることができる。本明細書中の特定の方法の場合、均一な小胞サイズを得るために、押出しを用いることができる。

【0296】

小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を介するリポソーム組成物の押出しによって、比較的明確に規定されたサイズ分布がもたらされる。通常、所望のリポソーム複合体のサイズ分布が達成されるまで、懸濁液を膜に通して１回以上循環させる。リポソームを連続的により小孔の膜に通して押し出し、リポソームのサイズを徐々に小さくすることを達成し得る。いくつかの例では、形成される脂質−核酸組成物を、サイズを揃えることなく使用してもよい。

【0297】

特定の実施形態では、本発明の方法は、脂質−核酸組成物の脂質部分上の表面電荷の少なくとも一部を中和する工程をさらに含む。表面電荷を少なくとも部分的に中和することにより、封入されていない核酸が脂質粒子表面から解放され、従来の技術を用いて組成物から除去され得る。好ましくは、封入されていない核酸や表面に吸着した核酸は、緩衝溶液を交換することにより、得られる組成物から除去される。例えば、クエン酸緩衝液（ｐＨ約４．０、組成物を形成するために使用される）をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ ｐＨ約７．５）溶液で置換することにより、リポソーム表面の中和と、表面からの核酸の放出とがもたらされる。次に、放出された核酸を、標準的な方法を用いるクロマトグラフィーによって除去した後、使用される脂質のｐＫ_ａよりも高いｐＨを有する緩衝液に切り換えることができる。

【0298】

場合により、脂質小胞（すなわち、脂質粒子）を水性緩衝液中での水和によって形成し、核酸を添加する前に、上記の方法のいずれかを用いて大きさを揃えることができる。上記のように、水性緩衝液は、アミノ脂質のｐＫ_ａよりも低いｐＨであるべきである。次に、核酸の溶液を、これらの大きさが揃えられ、予め形成された小胞に添加することができる。このような「予め形成された」小胞内への核酸の封入を可能するために、混合物は、エタノールなどのアルコールを含むべきである。エタノールの場合、それは、約２０％（ｗ／ｗ）〜約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在するべきである。さらに、脂質小胞の組成および核酸の性質に応じて、水性緩衝液−エタノール混合物中の予め形成された小胞と核酸の混合物を約２５℃〜約５０℃の温度に温める必要があることがある。脂質小胞中の核酸の所望のレベルを達成するための封入プロセスの最適化には、エタノール濃度や温度などの変数の操作が必要であることが当業者に明白であろう。核酸の封入のための好適な条件の例を実施例に提供する。一旦核酸が予め形成された小胞内に封入されたら、外部のｐＨを上げて、少なくとも部分的に表面電荷を中和することができる。次に、封入されていない核酸や表面に吸着した核酸を上記のように除去することができる。

【0299】

使用方法
本発明の脂質粒子は、インビトロまたはインビボで治療剤を細胞に送達するために使用され得る。特定の実施形態では、治療剤は、本発明の核酸−脂質粒子を用いて細胞に送達される核酸である。本発明の脂質粒子および関連する薬学的組成物を使用する様々な方法の以下の説明は、核酸−脂質粒子に関する説明によって例証されるが、これらの方法および組成物が、そのような治療の恩恵を受ける任意の疾患または障害を治療するための任意の治療剤を送達するために容易に適応され得ることが理解される。

【0300】

特定の実施形態では、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法を提供する。細胞に導入するための好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンスおよびリボザイムである。これらの方法は、細胞内送達が生じるのに十分な時間にわたって、本発明の粒子または組成物を細胞と接触させることによって行われ得る。

【0301】

本発明の組成物をほとんどの任意の細胞型に吸着させることができる。核酸−脂質粒子は、一旦吸着すると、細胞の一部によってエンドサイトーシスによって取り込まれるか、脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合することができる。この複合体の核酸部分の移入または取込みは、これらの経路のうちのいずれか１つを介して起こることができる。本発明の範囲に関して限定することを意図するものではないが、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる粒子の場合、この粒子は、次に、エンドソーム膜と相互作用し、おそらく非二重層の相の形成によってエンドソーム膜の不安定化をもたらし、封入された核酸が細胞質に導入されると考えられる。同様に、粒子と細胞の原形質膜との直接的な融合の場合、融合が起こるとき、リポソーム膜は細胞膜に統合され、リポソームの内容物が細胞内の液体と組み合わされる。インビトロで行われるとき、細胞と脂質−核酸組成物との接触は、生物学的に適合性の媒体中で起こる。組成物の濃度は、特定の用途に応じて広く変動し得るが、通常、約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。特定の実施形態では、脂質−核酸組成物による細胞の処置は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、約１〜２４時間、好ましくは、約２〜８時間行われる。インビトロでの適用では、核酸の送達は、起源が植物であるか動物であるか、脊椎動物あるか無脊椎動物であるか、およびどの組織またはタイプであるかに関係なく、培養で増殖している任意の細胞に対するものであることができる。好ましい実施形態では、細胞は、動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。

【0302】

一群の実施形態では、脂質−核酸粒子懸濁液を、約１０^３〜約１０^５細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０^４細胞／ｍＬの細胞密度を有する６０〜８０％コンフルエントでプレーティングされた細胞に添加する。細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬである。

【0303】

通常の適用は、周知の手順を用いて、ｓｉＲＮＡの細胞内送達をもたらし、特定の細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングすることを含む。あるいは、適用は、治療的に有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。この方法で、欠損しているかまたは存在しない遺伝子産物を供給することによって、遺伝性疾患に対する治療が提供される（すなわち、デュシェンヌ型ジストロフィーの場合は、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４５（３）：６３０−６４３（１９８９）を参照されたく、嚢胞性線維症の場合は、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１０２−１０３（１９８９）を参照されたい）。本発明の組成物に対する他の用途は、細胞内へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入を含む（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４１：１０２３−１０３３（１９９２）を参照されたい）。

【0304】

あるいは、本発明の組成物は、当業者に公知の方法を用いて、インビボで核酸を細胞に送達するために使用することもできる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を送達するための本発明の適用に関して、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３）には、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を用いたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達が記載されている。参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｙｄｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５０−２５６（１９９３）には、リポソームを用いた、マウスの気道の上皮および肺の中の肺胞への嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達が記載されている。参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１（１９８９）には、細胞内の酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能性原核生物遺伝子によるマウスの肺のインビボトランスフェクションが記載されている。したがって、本発明の組成物は、感染症の治療で使用することができる。

【0305】

インビボ投与の場合、薬学的組成物は、好ましくは、非経口的に、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内に投与される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内に投与される。１つの例として、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔａｄｌｅｒらの米国特許第５，２８６，６３４号を参照のこと。細胞内核酸送達は、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１０１：５１２−５２７（１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０（１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．６：２３９−２７１（１９８９）、およびＢｅｈｒ，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−２７８（１９９３）にも論じられている。脂質ベースの治療薬を投与するまた他の方法は、例えば、Ｒａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ，米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；およびＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号に記載されている。

【0306】

他の方法では、薬学的調製物は、調製物を組織に直接適用することによって標的組織と接触させ得る。適用は、局所的な「開放系」または「閉鎖系」手順によって行ない得る。「局所的」とは、環境（例えば、皮膚、中咽頭、外耳道など）に露出される組織への薬学的調製物の直接的な適用のことを意味する。「開放系」手順は、患者の皮膚を切開することと、その下にある、薬学的調製物が適用される組織を直接可視化することとを含む手順である。これは、一般に、外科的手順（例えば、肺に到達する開胸術、腹部の内臓に到達する開腹術、または標的組織に対する他の直接的な外科的アプローチ）によって達成される。「閉鎖系」手順は、内部の標的組織を直接可視化しないが、皮膚の小さい創傷から器具を挿入することによって到達する、侵襲的な手順である。例えば、調製物は、洗浄針によって腹膜に投与され得る。同様に、脊髄麻酔または脊髄のメトリザマイドイメージングのために通常行われるような、腰椎穿刺中の注入後に患者を適切な位置にすることによって、薬学的調製物が髄膜または脊髄に投与され得る。あるいは、調製物は、内視鏡デバイスを介して投与され得る。

【0307】

脂質−核酸組成物は、肺に吸入されるエアロゾルとして（Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．２９８（４）：２７８−２８１（１９８９）を参照のこと）または疾患部位における直接的な注射によって（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４））も投与することもできる。

【0308】

本発明の方法は、種々の宿主において実施し得る。好ましい宿主としては、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物種が挙げられる。

【0309】

本発明の脂質−治療剤粒子に対する投薬量は、治療剤と脂質の比と、患者の年齢、体重および状態に基づく投与医師の見解とによって決まる。

【0310】

一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般に、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を調節することができる核酸と会合している本発明の脂質粒子と細胞を接触させることを含む。本明細書で使用されるとき、「調節する」という用語、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を変化させることを指す。様々な実施形態では、調節するとは、増加させることもしくは増強することを意味することができるし、または減少させることもしくは低下させることを意味することができる。標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現のレベルを測定する方法は、当該技術分野において公知であり、利用可能であり、これらの方法としては、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用する方法や免疫組織化学的手法が挙げられる。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現のレベルは、適当な対照値と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％超、増加しているか、または低下している。例えば、ポリペプチドの発現の増加が望ましい場合、核酸は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであり得る。他方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の低下が望ましい場合、核酸は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、それにより標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を妨げるポリヌクレオチド配列を含む、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡであり得る。あるいは、核酸は、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドであり得る。

【0311】

特定の一実施形態では、本発明は、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法であって、式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）もしくは（ＶＩ）の脂質）、中性脂質、ステロール、ＰＥＧもしくはＰＥＧ修飾脂質からなるかもしくはこれらから本質的になる脂質粒子を、例えば、約３５〜６５％の式（Ｉ）のカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質のモル比で、細胞に提供することを含み、ここで、この脂質粒子は、ポリペプチドの発現を調節することができる核酸と会合している、方法を提供する。特定の実施形態では、モル脂質比は、約６０／７．５／３１／１．５または５７．５／７．５／３１．５／３．５（ｍｏｌ％ ＬＩＰＩＤ Ｉ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）である。特定の実施形態では、モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％ ＬＩＰＩＤ Ｖ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）または約５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％ ＬＩＰＩＤ ＶＩ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質を、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換える。別の群の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＤＳＧである。

【0312】

特定の実施形態では、治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、その場合、このｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドの発現を低下させるような、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む。

【0313】

他の実施形態では、核酸は、ポリペプチドまたはその機能的な変異体もしくは断片の発現を増加させるような、ポリペプチドまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードするプラスミドである。

【0314】

関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、対象に本発明の薬学的組成物を提供することを含み、ここで、この治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、かつこのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む、方法を提供する。

【0315】

一実施形態では、薬学的組成物は、脂質Ａ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡからなるかまたはこれらから本質的になる脂質粒子を、例えば、約３５〜６５％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）もしくは（ＶＩ）の脂質）、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧもしくはＰＥＧ修飾脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡのモル比で含み、その場合、この脂質粒子は、治療用核酸と会合している。特定の実施形態では、モル脂質比は、約６０／７．５／３１／１．５または５７．５／７．５／３１．５／３．５（ｍｏｌ％ 脂質Ｉ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）である。特定の実施形態では、モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％ ＬＩＰＩＤ Ｖ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）または約５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％ ＬＩＰＩＤ ＶＩ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質を、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換える。別の群の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＤＳＧである。

【0316】

別の関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、対象に本発明の薬学的組成物を提供することを含み、ここで、この治療剤は、ポリペプチドまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードするプラスミドである、方法を含む。

【0317】

本発明は、対象における免疫応答を誘導する方法であって、対象に本発明の薬学的組成物を提供することを含み、ここで、この治療剤は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、方法をさらに提供する。特定の実施形態では、免疫応答は、例えば、約３５〜６５％の式（Ｉ）のカチオン性脂質（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の脂質）、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧもしくはＰＥＧ修飾脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡのモル比の、脂質Ａ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡからなるかまたはこれらから本質的になる液性免疫応答または粘膜免疫応答であり、その場合、この脂質粒子は、治療用核酸と会合している。特定の実施形態では、モル脂質比は、約６０／７．５／３１／１．５または５７．５／７．５／３１．５／３．５（ｍｏｌ％ ＬＩＰＩＤ Ｉ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）である。特定の実施形態では、モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％ ＬＩＰＩＤ Ｖ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）または約５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％ ＬＩＰＩＤ ＶＩ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧ）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質を、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換える。別の群の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＤＳＧである。

【0318】

さらなる実施形態では、薬学的組成物は、ワクチンまたは抗原と組み合わせて対象に提供される。したがって、本発明自体が、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、かつ免疫応答が望まれる抗原と会合している、本発明の脂質粒子を含むワクチンを提供する。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原であるか、または例えば、ウイルス、細菌もしくは寄生虫などの感染体と関連している。

【0319】

種々の腫瘍抗原、感染体抗原、および他の疾患に関連する抗原が、当該技術分野で周知であり、これらの例は、本明細書に引用される参考文献に記載されている。本発明における使用に好適な抗原の例としては、ポリペプチド抗原およびＤＮＡ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。抗原の特定の例は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、痘瘡、ポリオ、炭疽、インフルエンザ、チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核および風疹の抗原である。一実施形態では、抗原は、Ｂ型肝炎組換え抗原である。別の態様では、抗原はＡ型肝炎組換え抗原である。別の態様では、抗原は腫瘍抗原である。このような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原およびバーキットリンパ腫に関連する抗原である。さらなる態様では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原組換え抗原である。当業者は、本発明における使用に好適な他の抗原を知っているであろう。

【0320】

本発明における使用に好適な腫瘍関連抗原は、単一の腫瘍タイプを示し、いくつかのタイプの腫瘍間で共有され、および／または正常細胞と比較して腫瘍細胞においてもっぱら発現されるかもしくは過剰発現される可能性がある、突然変異した分子と突然変異していない分子の両方を含む。タンパク質および糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質およびムチンの発現の腫瘍特異的パターンも報告されている。本癌ワクチンにおいて使用するための例示的な腫瘍関連抗原としては、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、および腫瘍細胞に特有の突然変異または再配列を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚性遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的な（しかし、腫瘍特異的でない）分化抗原、増殖因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、ならびにいくつかの他の自己タンパク質が挙げられる。

【0321】

腫瘍関連抗原の特定の実施形態としては、例えば、突然変異した抗原（例えば、Ｒａｓ ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３およびＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子のタンパク質産物ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８およびβカテニン）；過剰発現される抗原（例えば、ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２およびＫＳＡ）、癌胎児性抗原（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ））；自己抗原（例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）およびメラノサイト分化抗原（例えば、Ｍａｒｔ１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１およびＴＲＰ２））；前立腺関連抗原（例えば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１およびＰＳＭ−Ｐ２）；再活性化された胚性遺伝子産物（例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥおよび他の癌精巣抗原（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２およびＳＣＰ１））；ムチン（例えば、Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２）；ガングリオシド（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２およびＧＤ３）、中性糖脂質および糖タンパク質（例えば、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）およびグロボ−Ｈ）；ならびに糖タンパク質（例えば、Ｔｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）およびｓＴｎ）が挙げられる。全細胞および腫瘍細胞ライセートならびにその免疫原性部分、ならびにＢ細胞リンパ腫に対して使用されるＢリンパ球のモノクローナル増殖時に発現される免疫グロブリンイディオタイプもまた、本明細書における腫瘍関連抗原として含められる。

【0322】

病原体としては、感染体、例えば、哺乳動物（より特には、ヒト）に感染するウイルスが挙げられるが、これに限定されない。感染性ウイルスの例としては：レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）またはＨＩＶ−ＩＩＩ）；および他の分離株（例えば、ＨＩＶ−ＬＰ）；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロノウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクスウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブニアウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部伝染性；クラス２＝非経口伝染性（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルスならびにアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0323】

また、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌は、脊椎動物において抗原として働く。このようなグラム陽性細菌としては、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種が挙げられるが、これらに限定されない。感染性の細菌の特定の例としては：ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア属の種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ）（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アウィウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属の種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、腸球菌属の種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属の種（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス属の種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、フゾバクテリウム・ヌクレアートゥム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）およびアクチノミセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0324】

病原体のさらなる例としては、哺乳動物（より特には、ヒト）に感染する感染性真菌が挙げられるが、これに限定されない。感染性真菌の例としては、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラートゥム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コッキディオイデス・イムミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミケス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミディア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。感染性寄生虫の例としては、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、例えば、プラスモディウム・ファルキパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモディウム・オウァレ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）およびプラスモディウム・ウィウァクス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）が挙げられる。他の感染性生物（すなわち、原生生物）としては、トキソプラスマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。

【0325】

薬学的組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の肝臓スクリーニングモデルで同定された核酸剤を含む薬学的組成物を提供する。組成物は、作用剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）と薬学的に許容される担体とを含む。薬学的組成物は、遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害を治療するのに有用である。このような薬学的組成物は、送達の様式に基づいて製剤化される。１つの例は、非経口送達を介する全身投与用に製剤化される組成物である。

【0326】

同定された薬剤を含む薬学的組成物を、標的遺伝子（例えば、第ＶＩＩ因子遺伝子）の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与する。通常、ｄｓＲＮＡ剤の好適な用量は、１日にレシピエントの体重１キログラム当たり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲、通常、１日に体重１キログラム当たり１マイクログラム〜１ｍｇの範囲である。薬学的組成物を１日１回投与してもよく、またはｄｓＲＮＡを１日を通して適切な間隔で２回、３回、もしくはよりより多くのサブ用量として、または徐放製剤による連続的な注入もしくは送達すら用いて投与してもよい。その場合、各サブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは、総１日投薬量に到達するために相応により少量でなければならない。投薬単位は、例えば、数日間にわたってｄｓＲＮＡの持続的放出をもたらす従来の持続放出製剤を用いて、数日間かけて送達されるように調合することもできる。持続放出製剤は当該技術分野で周知であり、かつ本発明の薬剤とともに使用し得るような薬剤の膣送達に特に有用である。この実施形態では、投薬単位は、対応する複数の１日用量を含む。

【0327】

当業者であれば、限定するものではないが、対象の疾患もしくは障害の重症度、過去の治療、全般的な健康および／または年齢、ならびに他の存在する疾患をはじめとする、特定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投薬量およびタイミングに影響を与え得ることを理解するであろう。さらに、治療的有効量の組成物による対象の治療は、１回の治療または一連の治療を含むことができる。本発明によって企図される個々のｄｓＲＮＡについての有効投薬量やインビボ半減期を、従来の方法を用いて、または本明細書の別の場所に記載されているような、適当な動物モデルを用いたインビボ試験に基づいて、推定することができる。

【0328】

特定の実施形態では、本発明の脂質−核酸粒子を含む薬学的組成物は標準的な技術に従って調製され、かつこれは薬学的に許容される担体をさらに含む。通常、食塩水が薬学的に許容される担体として利用される。他の好適な担体としては、例えば、安定性を増強するために糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を含む、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられる。食塩水または他の塩含有担体を含む組成物では、担体が、以下の脂質粒子製剤に添加されることが好ましい。したがって、脂質−核酸組成物を生成した後、これらの組成物を薬学的に許容される担体（例えば、食塩水）中に希釈することができる。

【0329】

得られた薬学的調製物を従来的な周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。その後、水性溶液を、無菌条件下で、使用のために包装するかまたは濾過し、凍結乾燥させ、凍結乾燥させた調製物を、投与の前に滅菌水性溶液と組み合わせる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤およびｐＨ緩衝剤、張性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含んでもよい。さらに、脂質懸濁液は、保存時のフリーラジカルおよび脂質過酸化による傷害に対して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。親油性のフリーラジカルクエンチャー（例えば、α−トコフェロール）および水溶性の鉄特異的キレート剤（例えば、フェリオキサミン）が好適である。

【0330】

薬学的製剤中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は、様々に（すなわち、約０．０１重量％未満、通常は、約０．０５〜５重量％または少なくとも約０．０５〜５重量％から１０〜３０重量％までにも）異なる可能性があり、主に、選択される特定の投与様式に従う液量、粘性などによって選択される。例えば、治療に伴う流体負荷を下げるために、この濃度を増加させてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症に関連する鬱血性心不全または重症高血圧を有する患者で特に望ましい可能性がある。あるいは、投与部位での炎症を緩和するために、刺激性の脂質から構成された複合体を低濃度に希釈してもよい。一群の実施形態では、核酸は、標識が付着しており、（相補的核酸の存在を示すことによって）診断に使用される。この例では、投与される複合体の量は、使用される特定の標識、診断されている病状、および臨床医の判断によって決定されるが、通常、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0331】

上記のように、本発明の脂質−治療剤（例えば、核酸）粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、ＰＥＧ−セラミド、もしくはガングリオシドＧ_Ｍ１修飾脂質、または凝集を防ぐかまたは制限するのに有効な他の脂質を含んでもよい。このような成分の添加は、単に複合体凝集を防ぐだけではない。それどころか、これは、循環寿命を増大させ、標的組織への脂質−核酸組成物の送達を増大させる手段も提供する可能性がある。

【0332】

本発明は、キット形態の脂質−治療剤組成物も提供する。キットは、通常、キットの様々な要素を入れるために区画化された容器から構成されている。キットは、好ましくは脱水または濃縮された形態の、本発明の粒子または薬学的組成物を、それらを再水和または希釈および投与するための指示書とともに含む。特定の実施形態では、粒子は活性剤を含むが、他の実施形態では、含まない。

【0333】

肝臓スクリーニングモデルによって同定された薬剤を含む薬学的組成物を、局所的処置が望ましいかまたは全身的処置が望ましいかによって、および治療されるべき面積によって、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所的、肺（例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹入）；気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口的または非経口的であってもよい。投与はまた、局所送達を通じて、例えば、関節への直接的な関節内注射によって、消化管および腸への直接的な送達のための直腸投与によって、子宮頸部および膣への送達のための膣内投与によって、眼への送達のための硝子体内投与によって、特定の組織への優先的な局在化をもたらすように設計されてもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、関節内、皮下、腹腔内または筋肉内への注射もしくは注入；または頭蓋内（例えば、髄腔内もしくは脳室内）投与が挙げられる。

【0334】

局所的投与のための薬学的組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、座薬、スプレー、液剤および粉末剤を挙げることができる。従来の薬学的担体、水性、粉末もしくは油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、グローブなども有用であり得る。好ましい局所製剤としては、本発明のｄｓＲＮＡが、局所的送達成分（例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤または界面活性剤）と混合されているものが挙げられる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明のｄｓＲＮＡはリポソーム内に封入され得るし、またはｄｓＲＮＡは、リポソームへと（特に、カチオン性リポソームへと）複合体を形成し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡを脂質へと（特に、カチオン性脂質へと）複合体化し得る。好ましい脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはＣ_１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられるが、これらに限られない。局所製剤は１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願第０９／３１５，２９８号に詳細に記載されており、この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0335】

経口的投与のための組成物および製剤としては、粉末剤または顆粒剤、マイクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水中もしくは非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ、錠剤またはミニ錠が挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。好ましい経口製剤は、本発明のｄｓＲＮＡが１つ以上の浸透増進剤界面活性剤およびキレート化剤と組み合わせて投与されるものである。好ましい界面活性剤として、脂肪酸および／またはそれらのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。好ましい胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好ましい脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはそれらのモノグリセリド、ジグリセリドもしくは薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。浸透増進剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩も好ましい。特に好ましい組合せは、ラウリン酸のナトリウム塩とカプリン酸とＵＤＣＡである。さらなる浸透増進剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明のｄｓＲＮＡを噴霧乾燥した粒子を含む顆粒形態として経口的に送達するか、またはそれを複合体化させてマイクロ粒子もしくはナノ粒子を形成させてもよい。ｄｓＲＮＡ複合体化剤としては、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリラート；ポリアルキルアクリラート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリラート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリラート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリラート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロースおよびデンプンが含まれる。特に好ましい複合体化剤にはキトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリラート）、ポリ（エチルシアノアクリラート）、ポリ（ブチルシアノアクリレトー）、ポリ（イソブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリラート）、ＤＥＡＥ−メタクリラート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリラート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリラート、ポリヘキシルアクリラート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギナートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤およびそれらの調製は、米国特許出願第０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、同第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、同第０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、同第０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日出願）および同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）に詳細に記載されており、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0336】

非経口、髄腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の好適な添加剤（例えば、限定するものではないが、浸透増進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体もしくは賦形剤）も含有し得る滅菌水溶液を含み得る。

【0337】

薬学的組成物としては、溶液、エマルジョョンおよびリポソーム含有組成物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物を、事前形成された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体が含まれるが、これらに限定されない種々の成分から生成させ得る。

【0338】

好都合に単位投薬形態で提示し得る本発明の薬学的組成物は、薬学的産業において周知の従来の方法に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤と関連させる工程を含む。一般に、組成物は、活性成分を液体担体もしくは微粉砕された固体担体または両方と均一かつ緊密に関連させ、次に、必要ならば、生成物を成形することにより調製される。

【0339】

本発明の組成物を製剤化し、多くの可能な投薬形態、例えば、限定するものではないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、座薬、および浣腸のいずれかにしてもよい。また、本発明の組成物を、水性、非水性または混合媒体中の懸濁剤として製剤化してもよい。水性懸濁剤は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を高める物質をさらに含んでいてもよい。懸濁剤はまた、安定剤を含んでいてもよい。

【0340】

本発明の一実施形態では、薬学的組成物を泡剤として製剤化し、使用してもよい。薬学的泡剤としては、限定するものではないが、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの製剤が挙げられる。これらの製剤は性質において基本的に類似しているが、成分および最終的生成物の稠度の点で異なる。このような組成物および製剤の調製は、一般に、製薬および医薬の技術分野における専門家に知られており、かつ本発明の組成物の製剤に適用され得る。

【0341】

本発明は、その適用が以下の説明に示される成分の構築および配置の詳細には制限されない。本発明は、他の実施形態であり得、様々な方法で実施または実行され得る。また、本明細書で用いられる表現および技術用語は、説明目的のものであって、制限とみなされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、および本明細書におけるそれらのバリエーションの使用は、以後列挙される項目およびその等価物ならびにさらなる項目を包含することが意図される。

【実施例】

【0342】

以下の実施例は、特許請求された発明を例証するために提供されるのであって、これを限定するために提供されるのではない。

【0343】

実施例１：インビボ齧歯類第ＶＩＩ因子サイレンシング実験。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）とＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）に、尾静脈注射によって、０．０１ｍＬ／ｇの容量で、食塩水または製剤化されたｓｉＲＮＡのいずれかを投与した。投与後の様々な時点で、後眼窩採血によって血清試料を採取する。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を用いて試料中で決定する。第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを決定するために、動物を屠殺し、肝臓を摘出し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結した組織から組織ライセートを調製し、第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を用いて定量した。

【0344】

実施例２：核酸−脂質粒子を用いた哺乳動物遺伝子発現の調節。凝固カスケードの著名なタンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、肝臓（肝細胞）で合成され、血漿中に分泌される。血漿中のＦＶＩＩレベルは、簡単なプレートに基づく比色アッセイで決定することができる。したがって、ＦＶＩＩは、ｓｉＲＮＡ媒介性の肝細胞由来タンパク質の下方調節の決定、ならびに核酸脂質粒子およびｓｉＲＮＡの血漿濃度および組織分布のモニタリングのための好都合なモデルである。

【0345】

マウスにおける第ＶＩＩ因子ノックダウン
Ｃ５７ＢＬ／６マウスで静脈内（ボーラス）注射した２４時間後、ＦＶＩＩ活性をＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ処理動物で評価した。マイクロプレートスケールで、製造元の指示に従って、血清または組織中のタンパク質レベルを決定するための市販キットを用いてＦＶＩＩを測定した。ＦＶＩＩの低下を未処理の対照マウスに対して決定し、結果を残存ＦＶＩＩ％として表した。４つの用量レベル（２、５、１２．５、２５ｍｇ／ｋｇ ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ）を各々の新規リポソーム組成物の初期スクリーンで用い、初期スクリーンで得られた結果を基にして、この用量を後の研究で拡大した。

【0346】

認容性の決定
体重変化、臨床観察、臨床化学検査および、場合によって、血液検査をモニタリングすることにより、各々の新規リポソームｓｉＲＮＡ組成物の認容性を評価した。処理前および処理２４時間後に、動物の体重を記録した。データを体重変化％として記録した。体重測定に加えて、肝機能マーカーを含む、完全な臨床化学検査パネルを、ＦＶＩＩ解析用に採取された血清のアリコートを用いて、注射２４時間後に、各用量レベル（２、５、１２．５および２５ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）で得た。解析のために、試料をＣｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ（Ｌａｎｇｌｅｙ，ＢＣ）に送付した。場合によっては、血液検査解析用の全血の採取が行えるように、治療群に追加のマウスを含めた。

【0347】

治療指数の決定
治療指数（ＴＩ）は、毒性と活性の測定値を比較して生成される任意のパラメータである。これらの研究のために、ＴＩを

【数2】

として計算する。

【0348】

これらの研究についてのＭＴＤは、体重の＞７％減少および齧歯類の肝臓の損傷に対する良好な特異性を有する臨床的化学マーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の＞２００倍の増加を引き起こす最低の用量として設定された。ＥＤ_５０は、ＦＶＩＩ用量−活性曲線から求められた。

【0349】

実施例３：押出法の一般的プロトコル
脂質（脂質（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ）を可溶化し、所望のモル比に従ってエタノール中で混合する。混合した脂質をｐＨ５．２の酢酸ナトリウム緩衝液に添加するエタノール注入法によって、リポソームを形成させる。これにより、３５％エタノール中でリポソームが自然に形成される。リポソームを０．０８μｍポリカーボネート膜に少なくとも２回通して押し出す。ストックｓｉＲＮＡ溶液を酢酸ナトリウムおよび３５％エタノール中に調製し、リポソームに添加して、充填（ｌｏａｄ）した。ｓｉＲＮＡ−リポソーム溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、希釈した。エタノールを除去し、透析または接線流濾過でＰＢＳ緩衝液に交換した。

【0350】

実施例４：インライン混合法の一般的プロトコル
一方は脂質を含み、もう一方はｓｉＲＮＡを含む、個々別々のストックを調製する。脂質（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）；ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ脂質を含む脂質ストックを９０％エタノールに可溶化して調製する。残りの１０％は低ｐＨクエン酸緩衝液である。脂質ストックの濃度は４ｍｇ／ｍＬである。このクエン酸緩衝液のｐＨの範囲は、利用される融合原性脂質の種類によって、ｐＨ３〜５であることができる。ｓｉＲＮＡを４ｍｇ／ｍＬの濃度でクエン酸緩衝液にも可溶化する。小規模用に、５ｍＬの各ストック溶液を調製する。

【0351】

ｓｉＲＮＡと組み合わせる前に、ストック溶液は完全に透明であり、かつ脂質は完全に可溶化されなければならない。それゆえに、ストック溶液を加熱して、脂質を完全に可溶化してもよい。このプロセスで使用されるｓｉＲＮＡは、未修飾オリゴヌクレオチドであっても、修飾オリゴヌクレオチドであってもよく、コレステロールなどの親油性部分とコンジュゲートされていてもよい。

【0352】

各溶液をＴ字路に汲み上げて、個々のストックを組み合わせる。デュアルヘッド型のＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプを用いて、２つのストリームの開始と停止を同時に制御する。線流速を増加させるために、１．６ｍｍのポリプロピレンチューブをさらに小さくして、０．８ｍｍのチューブにする。このポリプロピレンライン（ＩＤ＝０．８ｍｍ）をＴ字路のどちらかの側に取り付ける。ポリプロピレンＴは、４．１ｍｍ^３の容積が結果として得られるように、１．６ｍｍの直線状の先端を有する。ポリプロピレンラインの大きい末端（１．６ｍｍ）の各々は、可溶化された脂質ストックかまたは可溶化されたｓｉＲＮＡのいずれかを含む試験管の中に入れられる。Ｔ字路の後ろに、組み合わされたストリームが流れるチューブを１本置く。次に、チューブを伸ばして、２×容量のＰＢＳが入った容器中に入れる。ＰＢＳを素早く撹拌する。ポンプの流速は、３００ｒｐｍまたは１１０ｍＬ／分の設定とする。エタノールを除去し、透析でＰＢＳに交換する。次に、脂質組成物を、遠心分離または透析濾過を用いて、適当な作用濃度まで濃縮する。

【0353】

実施例５：様々な脂質比を有する組成物の効力
様々な脂質比を、下記の表に示すように試験した。脂質Ｔ（「Ｔ」）、コレステロール（「Ｃ」）およびＰＥＧ−脂質（ＰＥＧ−ＤＭＧ）が含まれる。これらの成分の相対モルパーセンテージを以下に記載する。それゆえ、「Ｔ５０−Ｃ４０−Ｐ１０」は、５０ｍｏｌ％の脂質Ｔと、４０ｍｏｌ％のコレステロールと、１０ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＭＧを含む。使用したｓｉＲＮＡ二重鎖は、第ＶＩＩ因子遺伝子（ＦＶＩＩ）を標的とするＡＤ−１６６１であった。

【表F】

【表G】

【表H】

【0354】

実施例６：マウスにおけるインライン混合組成物の効力

【表I】

【表J】

【0355】

実施例７：様々なリポソーム組成物を用いたマウスにおけるインライン混合（ＩＬ）組成物の効力

【表K】

【表L】

【0356】

実施例８：様々なＰＥＧおよび中性脂質を用いたマウスにおけるＩＬ組成物の効力
ＰＥＧ鎖長または中性脂質を修飾する効果を調べた。中性脂質については、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ホスファチジルコリン）またはＤＭＰＣ（ジミリストイル−ホスファチジルコリン）を試験した。Ｃ１０またはＣ１８鎖長のｍＰＥＧ２０００コンジュゲート脂質も１．５ｍｏｌ％で試験した。下に「ＩＬ」で示されている場合は、粒子をインライン混合法を用いて作製した。

【表M】

【表N】

【0357】

実施例９：マウスにおけるＡＦ１２の用量応答
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）およびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）に、尾静脈注射によって、０．０１ｍＬ／ｇの容量で、食塩水または製剤化したｓｉＲＮＡのいずれかを投与した。投与後の様々な時点で、後眼窩採血によって、血清試料を採取した。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を用いて試料中で決定した。第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを決定するために、動物を屠殺し、肝臓を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結した。凍結した組織から組織ライセートを調製し、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を用いて、第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを定量した。

【0358】

リポソーム組成物中に様々な濃度のＡＦ１２を含むリポソーム組成物を用いて、インビボ実験を行なった。標準の第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ｓｉＲＮＡ二重鎖１６６１を用いてＡＦ１２用量応答を０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．３ｍｇ／ｋｇまで試験した。これらの結果を図６に示すようにルシフェラーゼ対照（二重鎖１９５５）と比較した。合計４０匹の動物の実験において遺伝子型１つ当たり８つの群の各々について５匹の動物を用いた。図６に示すように、増加する用量のリポソーム組成物は、通常、ＦＶＩＩのノックダウン量の増加をもたらした。

【表O】

【0359】

実施例１０：ＡｐｏＥ ＫＯマウスにおけるＡＦ１２リポソーム組成物の効力
様々なＡＦ１２リポソーム組成物の効力におけるＡｐｏＥの役割をさらに調べるために、ＡＤ−１６６１ ｓｉＲＮＡ組成物を含むものを、様々な濃度で投与した。

【0360】

ＡｐｏＥまたはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）コンジュゲート脂質を含むリポソーム組成物を用いてインビボ実験を行なった。ＧａｌＮＡｃ受容体が肝臓で高度に発現すると考えられることが分かっているので、ＧａｌＮＡｃが潜在的ターゲッティングリガンドとして選ばれた。それゆえ、本質的に実施例６に記載したようにＣ５７ＢＬ／６およびＡｐｏＥノックアウトマウスを用いて研究を行ない、様々な濃度のＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ脂質をさらに含むＡＦ１２製剤の効力を試験した。全ての実験において、ＰＥＧ−コンジュゲート脂質の総量を一定に保った（例えば、０．５％ｍｏｌのＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧを添加する場合、ＰＥＧ−ＤＭＧの対応量を０．５％ｍｏｌだけ減らし、総ＰＥＧ−脂質を１．５％ｍｏｌに保つ）。

【0361】

図７に示すように、ＡｐｏＥをリポソーム組成物に添加しても、ＡＦ１２含有リポソーム組成物の用量応答に対して皆無かそれに近い効果しかない。ＧａｌＮＡｃ３含有組成物は、ＦＶＩＩのノックダウンにわずかながら効果があるように見える。

【表P】

【0362】

実施例１１：ＷＴマウスおよびＡｐｏＥマウスにおいて、ならびにＷＴマウスおよびＬＤＬＲノックアウトマウスにおいて試験されたＡＦ１２
様々なＡＦ１２リポソーム組成物のＡｐｏＥ依存性を調べるために、ＬＤＬＲ（ＬＤＬ受容体）欠損マウスにおけるこれらのリポソーム組成物の効力を評価した。ＬＤＬＲ欠損マウスにおけるリポソーム組成物の効力の減少により、ＡｐｏＥ依存性が示唆された。以下に示すような様々な濃度で、ＡＤ−１６６１ ｓｉＲＮＡ組成物を含むＡＦ１２リポソーム組成物を野生型マウスおよびＬＤＬＲ ＫＯマウスに投与した。第１の群には陰性対照としてのＰＢＳを投与した。

【表Q】

【0363】

結果を図８に示す。この結果は、ＬＤＬＲ（ＬＤＬ受容体）欠損マウスにおける増加した効力と同様であることが明らかになり、これにより、これらのリポソーム組成物がＡｐｏＥ依存的でないことが示唆される。

【0364】

実施例１２：ＡｐｏＥ欠損マウスにおけるＡＦ１２の効力に対するＡｐｏＥまたはＧａｌＮＡｃ脂質の効果
ＡｐｏＥ欠損マウスに対するＡＦ１２組成物の効果を調べるために、ＡｐｏＥまたは以下に詳述するようなＧａｌＮＡｃターゲッティング脂質の存在下で、様々な濃度のＡＦ１２を投与した。

【表R】

【0365】

図９ａおよび９ｂに示すように、ＡｐｏＥノックアウトマウスと野生型マウスにおけるリポソーム組成物の効力には、皆無かそれに近い差しか観察されなかった。これは、ＡｐｏＥ含有リポソーム組成物とＧａｌＮＡｃ３含有組成物の両方で観察された。図９ａは、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおける用量応答を示し、一方、図９ｂは野生型マウスにおける用量応答を示す。

【0366】

実施例１３：脂質Ｔを含む製剤によるＴｉｅ２シグナリング
本明細書に記載の製剤を用いた核酸の送達を試験するために、内皮特異的マーカーのＴＥＫチロシンキナーゼを選んだ。Ｔｉｅ２またはルシフェラーゼ（「Ｌｕｃ」）を標的とする、以下の配列を有するｓｉＲＮＡ二重鎖ＡＤ−２７４３０をＡＦ−０１２またはＡＦ−０１１とともに製剤化した。

【表S】

【0367】

下記のような「高用量」または「低用量」プロトコルに従って、マウスに製剤を投与した。

【0368】

高用量プロトコルでは、表に記載したように、２用量のＰＢＳ、Ｔｉｅ２を標的とする脂質製剤化ｓｉＲＮＡ、またはルシフェラーゼを標的とする脂質製剤化ｓｉＲＮＡ（１群当たりｎ＝５）をマウスに投与した。

【表T】

【0369】

「低用量」プロトコルでは、下の表に記載したように、単一用量のＴｉｅ２を標的とする脂質製剤化ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝４）またはルシフェラーゼを標的とする脂質製剤化ｓｉＲＮＡ（ｎ＝１、ＡＦ−０１２の場合のみ）の２回の投与をマウスに施した。

【表U】

【0370】

以下の表に示すように、ＡＦ−０１２で製剤化されたｓｉＲＮＡは、肝臓、肺、心臓、および腎臓をはじめとする、様々な血管床の内皮において効果的なサイレンシングを引き起こした。脂質Ｔを含まないＡＦ−０１１製剤では、サイレンシングが観察されなかった。

【表V】

【0371】

結果を図１０Ａ〜１５にまとめる。図１０Ａ〜１０Ｃは、ＧＡＰＤＨ（図１０Ａ）、ＶＥＦＧ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）（図１０Ｂ）、およびＶｅ−カドヘリン（図１０Ｃ）発現と比較したときの、心臓におけるＴｉｅ２発現のノックダウン（ＫＤ）を示す。ｓｉＲＮＡをＡＦ−０１２製剤とともにパッケージングしたときに、Ｔｉｅ２ ｓｉＲＮＡのみがＴｉｅ２をサイレンシングし、ｓｉＲＮＡをＡＦ−０１１製剤とともにパッケージングしたときには、サイレンシングしなかった。

【0372】

図１１Ａ、１１Ｂおよび１２Ａは、ＡＦ−０１１（図１１Ｂ）ではなく、ＡＦ−０１２とともに製剤化されたｓｉＲＮＡによる（図１１Ａおよび１２Ａ）肝臓におけるＴｉｅ２発現のノックダウン（ＫＤ）を示す。高用量は２．０と表す（これらの処理では、０．６および２．０ｍｇ／ｋｇを投与した）；低用量は０．６と表す（０．６ｍｇ／ｋｇを投与した）。

【0373】

肝臓におけるＶＥＧＦＲ２発現の増加も、Ｔｉｅ２ ｓｉＲＮＡの投与に応答して観察された（図１２Ｂ）。

【0374】

図１３Ａおよび１３Ｂは、ＡＦ−０１２とともに製剤化されたｓｉＲＮＡによる肺におけるＴｉｅ２発現のＫＤを示す。Ｔｉｅ２発現をＶＥ−カドヘリン（図１３Ａ）およびＶＥＧＦＲ−２（図１３Ｂ）発現と比較した。図１４Ａおよび１４Ｂは、ｓｉＲＮＡをＡＦ−０１２とともに製剤化したときに、それぞれ、腎臓および骨格筋においてＴｉｅ２発現をノックダウンしたが、ＡＦ−０１１とともに製剤化したときには、ノックダウンしなかった。

【0375】

図１５は、Ｔｉｅ２ ｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡをＡＦ−０１２とともにまたはＡＦ−０１１とともに製剤化したときに、視床下部における遺伝子発現をＫＤしなかったことを示すグラフである。

【0376】

これらの結果は、脂質Ｔ含有リポソームが、内皮組織における遺伝子サイレンシングのために標的化されるべきｓｉＲＮＡに特によく適していることを示している。

【0377】

７組の（ｓｅｐａｔｅ）用量応答実験を行なった。簡潔に述べると、７つの群のＣ５７Ｂｌ６メス（１群当たりマウス５匹）に０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、および０．６ｍｇ／ｋｇ（１日目）＋２．０ｍｇ／ｋｇ（０日目）を投与した。７２時間後に組織および器官を摘出し、これらの組織でＴｉｅ２レベルを測定した。図１６Ａ〜Ｂは、それぞれ、肝臓および骨格筋におけるＴｉｅ２発現の用量依存的ノックダウンを示す。図１７Ａ〜Ｂは、それぞれ、脾臓および心臓におけるＴｉｅ２ノックダウンを示す。図１８Ａ〜Ｂは、それぞれ、様々な用量での腎臓および脂肪組織でのＴｉｅ２のノックダウンを示す。

【0378】

実施例１４：多数の異なるｓｉＲＮＡを取り込んだ脂質組成物
本明細書に記載の製剤によって与えられる比較的広範な治療域の結果として、単回ｉ．ｖ．投与で肝臓における多数の遺伝子をサイレンシングする可能性が試験された。多数の遺伝子を調節する能力は、多数の遺伝子標的が既に同定されている疾患に対して強力な治療的アプローチを提供し得ると想定することができる。このアプローチの実行可能性を調べるために、潜在的な治療的関心のある肝臓の標的である、第ＶＩＩ因子、ＡｐｏＢ、ＰＣＳＫ９、Ｘｂｐ１、ＳＯＲＴ１、ＴＴＲ１、ＴＴＣ３９Ｂ、ＩＴＧｂ１、ＡｐｏＣ３、およびＲａｂ５ｃに対するｓｉＲＮＡ配列をプールし、ＴｅｃｈＧ１脂質を含む粒子とともに製剤化した。

【0379】

多重遺伝子サイレンシング研究では、第ＶＩＩ因子、ＡｐｏＢ、ＰＣＳＫ９、Ｘｂｐ１、ＳＯＲＴ１、ＴＴＲ１、ＴＴＣ３９Ｂ、ＩＴＧｂ１、ＡｐｏＣ３、およびＲａｂ５ｃのｍＲＮＡレベルを、ＴｅｃｈＧ１脂質を含む製剤中に１０種のｓｉＲＮＡのプールまたはルシフェラーゼを標的とする無関係な対照ｓｉＲＮＡを含む製剤を投与したマウスから摘出した肝臓で評価した。脂質粒子（ＡＦ１２）は、以下の成分（単位モル％）を含んでいた：約１：１の脂質：ｓｉＲＮＡ比で製剤化された、ＴｅｃｈＧ１：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−ＤＭＧ（５０ｍｏｌ％：１０ｍｏｌ％：３８．５ｍｏｌ％：１．５ｍｏｌ％）。各ｓｉＲＮＡについて０．１ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの尾静脈に単回注射した４８時間後、これらの標的遺伝子の発現をｍＲＮＡレベルで解析した。簡潔に述べると、凍結肝臓組織をすり潰し、組織ライセートを調製した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対して正規化したこれらの遺伝子のｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いてライセート中で決定した。本明細書に記載の１０種のｓｉＲＮＡのプールで処理したマウスにおける標的／ＧＡＰＤＨレベルを、同じ製剤ではあるが、ルシフェラーゼ対照ｓｉＲＮＡを含む製剤で処理したマウスにおける対応する標的／ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した後、プロットした。０．１ｍｇ／ｋｇから各ｓｉＲＮＡの投薬量ごとにサイレンシング効果を調べた。１０種全ての遺伝子の有意なサイレンシングは、ｓｉＲＮＡ当たり０．１ｍｇ／ｋｇの用量（１ｍｇ／ｋｇトータルｓｉＲＮＡ用量）で観察された（図５）。

【0380】

１０種全ての遺伝子を本明細書に示すように同時にサイレンシングすることにより、同様のまたは異なるシグナル伝達経路に関与する多数の遺伝子を単一の製剤の単回投与で調節し得ることが初めて証明された。例えば、肝臓におけるいくつかの異なる標的の同時サイレンシングは、多数の遺伝子および経路が関与するメタボリックシンドローム、癌、または感染性疾患などの多因子性（ｍｕｌｔｉ−ｆａｃｔｏｒａｌ）疾患を治療するための新規の戦略を可能にし得る。本発明者らの知る限り、これは、１０種の肝臓標的をインビボで同時にｓｉＲＮＡを介してサイレンシングした最初の報告である。本明細書に記載の脂質を用いた送達の効力を考慮すると、プールしたｓｉＲＮＡ産物でさらにより多くの遺伝子を同時にサイレンシングすることができると仮定される。治療的観点から、これは、多数の標的が治療効果の増強を達成する、より複雑な治療的アプローチを可能にし得る。例えば、この戦略は、急速に進化するウイルスゲノムが、ウイルスゲノムの単一の部位を標的とする単一のｓｉＲＮＡにとって見付けにくいものであることが分かっているＣ型肝炎などのウイルス感染の治療において特に有用であり得る。この多重標的アプローチは、低密度リポタンパク質レベルの調節および既に多数の遺伝子が関与するとされている、癌などの疾患の治療において有用であると分かる可能性もある。

【0381】

したがって、２つ以上の核酸組成物（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む脂質組成物が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、２つ以上の異なる核酸組成物を含む。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、５つ以上の異なる核酸組成物を含む。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、１０以上の異なる核酸組成物を含む。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、２０以上の異なる核酸組成物を含む。異なる核酸組成物は、同じ標的遺伝子を標的とすることができる。別の実施形態では、異なる核酸組成物は、個別的な標的遺伝子を標的とすることができる。標的遺伝子は、同じ生物学的経路（例えば、抗ウイルス応答などの免疫応答、アポトーシス、コレステロール代謝）の構成要素であってもよいし、または個別的な生物学的経路の構成要素であってもよい。標的遺伝子は、対象由来のものではない遺伝子（例えば、ウイルス遺伝子）を含むことができる。一実施形態では、脂質組成物は、本明細書に記載の少なくとも１種のカチオン性脂質を含む。脂質組成物は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をさらに含むことができる。別の実施形態では、脂質組成物は、ステロール（例えば、コレステロール）をさらに含むことができる。また別の実施形態では、脂質組成物は、中性脂質をさらに含むことができる。

【0382】

本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様をこのように記載したので、様々な変更、修正、および改良が当業者に容易に思い付くであろうということが理解されるべきである。このような変更、修正、および改良は、本開示の一部であることが意図され、かつ本発明の精神および範囲の範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明は、ほんの一例に過ぎない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】