特許 5769744 抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体とその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5769744

(24)【登録日】2015年7月3日

(45)【発行日】2015年8月26日

(54)【発明の名称】抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体とその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20150806BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150806BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 N

   A61P11/06

   A61P19/02

   A61P25/00

   A61P29/00 101

【請求項の数】2

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2013-44573(P2013-44573)

(22)【出願日】2013年3月6日

(62)【分割の表示】特願2008-511635(P2008-511635)の分割

【原出願日】2006年5月17日

(65)【公開番号】特開2013-116912(P2013-116912A)

(43)【公開日】2013年6月13日

【審査請求日】2013年4月5日

(31)【優先権主張番号】60/682,009

(32)【優先日】2005年5月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594029230

【氏名又は名称】モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト

【氏名又は名称原語表記】ＭＯＲＰＨＯＳＹＳ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(72)【発明者】

【氏名】シュタイドル，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】トーマッセン−ヴォルフ，エリーザベト

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００３／０６８９２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 医学のあゆみ，２００４年，第２１１巻，第７号，ｐ．７２９−７３２

【文献】 Journal of Immunological Methods，２００１年，Vol.254，p.67-84

【文献】 Current Opinion in Biotechnology，２００２年，Vol.13, No.6，p.598-602

【文献】 Arthritis Res., 2001, Vol.3, No.5, pp.293-298

【文献】 Cell. Immunol., 2002, Vol.219, No.2, pp.92-97

【文献】 実験医学別冊 バイオマニュアルＵＰシリーズ タンパク質の分子間相互作用実験法，株式会社 羊土社，１９９６年，ｐ．２１１−２３０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＧＭ−ＣＳＦに対して特異的な単離したヒトもしくはヒト化抗体またはその抗原結合領域より成るフラグメントの、関節リウマチ、多発性硬化症または喘息を治療するために使用される医薬の製造における使用であって、前記単離したヒトもしくはヒト化抗体または前記フラグメントは、（ｉ）０．５μｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦの、２×１０^５ＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現する前記ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体のアルファ鎖との相互作用を、（ａ）前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現する前記ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖の前記濃度は、２×１０^５ＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞に発現するヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖の前記濃度と類似している、および（ｂ）前記単離したヒトもしくはヒト化抗体または前記フラグメントの前記濃度は５μｇ／ｍｌである、という条件下で少なくとも５０％ブロックでき、（ｉｉ）ＴＦ−１増殖アッセイで０．２５ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦを、対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１またはＭＡＢ２１５より少なくとも５倍低いＩＣ_５０値で中和することができる、前記使用。

【請求項2】

前記抗体または前記フラグメントは、ラットＧＭ−ＣＳＦおよび／またはアカゲザルＧＭ−ＣＳＦと交差反応する、請求項１記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の背景】

【0001】

顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は当初は造血成長因子として特定された。これは、リンパ球、単球、内皮細胞、線維芽細胞、および一部の悪性細胞を含む多数の細胞種から産生される（Ｍｅｔｃａｌｆら：１９８６；ＣｌａｒｋとＫａｍｅｎ，１９８７；Ｈａｒｔら、１９８８、Ｍｅｔｃａｌｆら、１９８６）。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞に対して成長促進と分化の機能を持つのに加え、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現する免疫系の細胞に対する各種作用を持つことが発見された（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，２００２；ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、１９９８を参照）。これらの機能のうち最も重要なのは、いくつかの免疫プロセスおよび炎症プロセスにおける単球、マクロファージ、および顆粒球の活性化である（Ｇａｓｓｏｎら，１９９０ｂ；Ｇａｓｓｏｎら、１９９０ａ；Ｈａｒｔら、１９８８；Ｒａｐｏｐｏｒｔら、１９９２）。

【0002】

成熟ＧＭ−ＣＳＦは２つの糖鎖付加部位を持つ１２７個のアミノ酸からなるモノマータンパク質である。可変する程度の糖鎖付加は１４ｋＤａから３５ｋＤａの間の分子量範囲をもたらす。非糖鎖付加型および糖鎖付加型ＧＭ−ＣＳＦは試験管内で同様の活性を示す（Ｃｅｂｏｎら、１９９０）。ＧＭ−ＣＳＦの結晶学的解析が四つの短いαヘリックスからなる樽型の構造を明らかにした（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓら、１９９１）。総合的な所見は、成長ホルモン、インターロイキン‐２、インターロイキン‐４などの他の成長因子と同様である。

【0003】

ＧＭ−ＣＳＦはその受容体に結合することによりその生物学的活性を発揮する（ＫａｓｔｅｌｅｉｎとＳｈａｎａｆｅｌｔ，１９９３；ＳｉｓｓｏｎとＤｉｎａｒｅｌｌｏ，１９８８）。ＧＭ−ＣＳＦ受容体（ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ）の最も重要な部位が骨髄性細胞と内皮細胞の細胞表面である一方、リンパ球はＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ陰性である。天然の受容体はαとβの少なくとも二つのサブユニットから構成される。αサブユニットはリガンド特異性を示し、ナノモル単位の親和性でＧＭ−ＣＳＦを結合する（Ｇｅａｒｉｎｇら、１９８９； Ｇａｓｓｏｎら、１９８６）。βサブユニットもインターロイキン−３とインターロイキン−５受容体複合体の一部であり、ＧＭ−ＣＳＦ受容体αサブユニットとＧＭ−ＣＳＦと連携して、ピコモル単位の結合親和性で複合体の形成をもたらす（Ｈａｙａｓｈｉｄａら、１９９０）。受容体に対するＧＭ−ＣＳＦ上の結合領域はマッピングされており、ＧＭ−ＣＳＦはその受容体のβサブユニットと、ＧＭ−ＣＳＦの第一のαへリックス内にある極めて限定された領域を介して反応する（Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、１９９１ｂ；Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、１９９１ａ；Ｌｏｐｅｚら、１９９１）。αサブユニットへの結合は、第三のαへリックスであるへリックスＣ、へリックスＣおよびＤを結合するループの初めにある残基、ＧＭ−ＣＳＦのカルボキシ末端側へとマッピングされた（Ｂｒｏｗｎら、１９９４）。

【0004】

ＧＭ−ＣＳＦ三量体受容体複合体の形成は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴファミリー、Ｓｈｃ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＡＰキナーゼ、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ、およびＮＦｋＢなどの分子が関与する複雑なシグナル伝達系の活性化をもたらし、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、およびｃ−ｊｕｎの転写へ最終的に導く。活性化は主に受容体のβサブユニットによって誘起される（Ｈａｙａｓｈｉｄａら、１９９０；Ｋｉｔａｍｕｒａら、１９９１； Ｓａｔｏら、１９９３）。共有βサブユニットもＩＬ−３、ＩＬ−５、およびＧＭ−ＣＳＦによって発揮される重複する機能に関与する（ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、１９９８を参照）。

【0005】

ＧＭ−ＣＳＦは、その造血増殖と分化刺激活性だけでなく、特に炎症性サイトカインとして機能する。マクロファージと単球ならびに好中球と好酸球は、ＧＭ−ＣＳＦによって活性化され、他のサイトカインやケモカイン、マトリクス分解プロテアーゼの放出、ＨＬＡ発現の増加、および細胞接着分子またはＣＣケモカインに対する受容体の発現の増加をもたらす。後者は、次に炎症組織への炎症細胞の走化性の増加をもたらす（Ｃｈａｎｔｒｙら、１９９０；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，２００２；ＳｉｓｓｏｎとＤｉｎａｒｅｌｌｏ，１９８８；Ｚｈａｎｇら、１９９８；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９９３；Ｌｏｐｅｚら、１９８６；Ｃｈｅｎｇら、２００１；Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｍｂｒｏｎｅｒｏら、２００３）。しばしば、ＧＭ−ＣＳＦは他のサイトカインまたはＬＰＳのような炎症刺激因子との相乗作用でその活性を発揮し、例えばＬＰＳなどとの組み合わせでＧＭ−ＣＳＦで処理された好中球などは酸化的破壊の増加を示す（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８９； Ｒａｐｏｐｏｒｔら、１９９２）。

【0006】

抗炎症療法の標的としてのＧＭ−ＣＳＦ：
免疫系におけるその多様な活性化機能のために、ＧＭ−ＣＳＦを抗炎症療法の標的として検討できる。関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、乾癬、喘息、アトピー性皮膚炎、またはショックなどの、慢性および急性炎症性疾患に対して、ＧＭ−ＣＳＦ活性の阻害と、続くＧＭ−ＣＳＦ応答細胞の有害な活性化の減少が有効かもしれない（Ｈａｍｉｔｏｎ，１９９３；Ｚｈａｎｇら、１９９８；Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ２００２）。

【0007】

関節炎：
いくつかのグループがＧＭ−ＣＳＦならびにその受容体が関節炎患者の滑膜関節内に存在することを示した（Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａら、１９９１；Ｘｕら、１９８９；Ｈａｗｏｒｔｈｅｔら、１９９１）。さらに、フェルティ症候群における好中球減少症のためにＧＭ−ＣＳＦを用いて治療された患者（Ｈａｚｅｎｂｅｒｇら、１９８９）、または化学療法後の患者（ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、１９９１）において、ＧＭ−ＣＳＦが関節リウマチの発赤の原因となることが示された。

【0008】

ＧＭ−ＣＳＦを阻害する抗体の関節炎の治療に対する有用性に関する最初のヒントは、マウスの生体内試験に由来する（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９７；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９８；Ｃｏｏｋら、２００１）。特に、ＣｏｏｋらはＧＭ−ＣＳＦに対する中和抗体がコラーゲン誘導関節炎モデルにおいて有効性を示したことを示した。ＧＭ−ＣＳＦの阻害は、炎症、軟骨破壊、および最初に罹患した四肢における疾患の進行または他の四肢への進行について、疾患の重篤性の低減につながった。

【0009】

関節リウマチまたは他の炎症性疾患を持つ患者が利益を得られる抗ＧＭ−ＣＳＦ療法のいくつかの作用が存在する。

【0010】

ＧＭ−ＣＳＦの阻害は、
ａ） 成熟単球、マクロファージ、および好中球の活性と数を阻害または減少させることが予想される。特に好中球とマクロファージは滑液と滑膜に豊富である。滑膜中のマクロファージ数が関節リウマチの関節のびらんの程度と相関することが示されてきた（Ｍｕｌｈｅｒｉｎら、１９９６；Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒら、１９９７）。マクロファージは様々な他の炎症性サイトカインマトリクス分解プロテアーゼの源である。好中球によるＨ２０２の産生は、関節炎の関節内で起こる破壊過程の一部である（Ｂａｂｉｏｒ，２０００）。ＧＭ−ＣＳＦの阻害はまた、ｂ）骨髄樹状細胞（ＤＣ）の分化と滑膜のＤＣ（＝滑膜細胞）の活性化を阻害または減少させることが予想される。ＧＭ−ＣＳＦはＤＣとＲＡ滑膜細胞上のＨＬＡクラスＩＩ発現を上方調節し維持する（Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａ ＪＭら、１９９１）。ＤＣは関節内で、炎症性Ｔ細胞の選択的活性化に関連する機能を獲得す
るように指示される。特異的ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子はＲＡの罹患性と関連付けられ、ＤＣの抗体提示を介したＴ細胞の活性化はこの種の免疫性疾患において重要な役割を果たすかもしれない（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｓｃｈｗａｒｚら、２００１）。

【0011】

多発性硬化症：
多発性硬化症においては、ＧＭ−ＣＳＦレベルの上昇は、ＭＳの活動期と相関し（Ｃａｒｒｉｅｒｉら、１９９８； ＭｃＱｕａｌｔｅｒら、２００１）ＧＭ−ＣＳＦ−／− マウスはＭＳ、実験的脳脊髄炎、ＥＡＥのためのモデル系において疾患を発症できない（ＭｃＱｕａｌｔｅｒら、２００１）。

【0012】

喘息：
喘息では、肺におけるＧＭ−ＣＳＦ量の増加が報告されている（Ｂｒｏｉｄｅ ａｎｄ
Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，１９９１）。好酸球が上昇すると同時に、ＧＭ−ＣＳＦはインターロイキン−５と相乗して ｉ）前駆細胞から好酸球への分化を刺激する、ｉｉ）それらの機能性活性化を刺激する、ならびにｉｉｉ）肺における好酸球の寿命を延長するという三つの方式で機能する（Ｂｒｏｉｄｅら、１９９２；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、２００２）。故に、ＧＭ−ＣＳＦの阻害による喘息の気道における好酸球の寿命の減少は、疾患を改善する可能性がある。抗ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体の有用性が、そのような抗体の投与が気道過敏性と気道炎症の著しい減少をもたらした、マウス喘息モデルにおいてさらに示された（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、２００２）。
異なるマウスモデルにおいて、マウスでの抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体２２Ｅ９の使用によって、肺のＬＰＳ依存性炎症を軽減できた（Ｂｏｚｉｎｏｖｓｋｉら、２００３）。

【0013】

有毒作用：
顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子をホモの状態でノックアウトしたマウスは正常に発育し、１２週齢まで造血に大きな異常は見られない。大部分のＧＭ−ＣＳＦ欠乏マウスが一見健康で繁殖能を持つが、全てがコラーゲン線維束の破壊と減少を伴う乱れた血管細胞外基質と、肺界面活性物質クリアランスの障害と、肺での微生物病原体への抵抗の低下を伴う肺の異常を発現する。後者の病理の特徴は、ヒトの疾患である、肺胞タンパク症（ＰＡＰ）に類似する。ＧＭ−ＣＳＦが正常レベルの主要な種類の成熟造血細胞と、血液、骨髄、および脾臓内にあるそれらの前駆物質を維持するのに必要不可欠とは思われない。しかし、それらはＧＭ−ＣＳＦが正常な血管の発達、呼吸生理学、局所感染に対する抵抗に不可欠であるように示唆している（Ｓｔａｎｌｅｙら、１９９４；Ｄｒａｎｏｆｆら、１９９４；Ｐｌｅｎｚら、２００３；Ｓｈｉｂａｔａら、２００１）。近年では、ＧＭ−ＣＳＦに対する自己抗体とＰＡＰの強い関連性が、ヒトにおけるＰＡＰの発生機序におけるＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達異常をさらに示唆している。合わせて、これらの観察はＧＭ−ＣＳＦが肺における肺胞マクロファージ固有の免疫機能と界面活性物質の恒常性の調節において重要な役割を担うことを示している（Ｂｏｎｆｉｅｌｄ ら、２００２；ＴｒａｐｎｅｌｌとＷｈｉｔｓｅｔｔ，２００２；Ｕｃｈｉｄａら、２００４；Ｋｉｔａｍｕｒａら、１９９９）。

【0014】

ＧＭ−ＣＳＦへの阻害活性を持つ高力価の自己抗体が重症筋無力症の患者において説明されてきた。これらの患者は自己免疫現象または造血欠乏症または「他の明らかな臨床的相関」は何も示さなかった（Ｍｅａｇｅｒら，１９９９）。

【0015】

ＧＭ−ＣＳＦの機能を中和するＧＭ−ＣＳＦの修飾形態である、化合物Ｅ２１Ｒが第Ｉ相安全性試験で評価されており、癌患者において良好な安全性プロフィールを持つことが見出されている（Ｏｌｖｅｒら、２００２）。

【0016】

故に、抗ＧＭ−ＣＳＦ療法を適用する際に、詳しく監視されるべき肺機能は別として、
その他の副作用は予想されていない。

【0017】

これまでのところ、ＧＭ−ＣＳＦ中和機能を持つ非ヒト由来の抗体のみが作製されてきた。例えば、ＥＰ０４９９１６１Ａｌは、その配列がＧＭ−ＣＳＦ由来であるオリゴペプチドによってマウスに免疫することによって作製された抗体を記載している。さらに、該出願は、それを必要とする哺乳類における望ましくないＧＭ−ＣＳＦの作用の軽減の方法を開示し、これは前述の哺乳類にＧＭ−ＣＳＦを阻害する量の免疫グロブリンの投与を含む。しかし、その抗体はマウス抗体で、ヒトへの投与には適さない。

【0018】

さらに、ＷＯ ０３／０６８９２０はマウス／ヒトキメラ型のＩｇＧ１阻害抗体を開示する。非ヒト配列を含む抗体は免疫応答を導き出す可能性があり、治療のための投与に適切ではない。例えば、長期の治療が必要となる疾患では、（例えば、関節リウマチ、喘息、および多発性硬化症などの慢性炎症性疾患）、非ヒト治療薬の継続投与は重篤な炎症性反応の可能性と、治療薬を中和するかもしれないヒト抗体の産生を高める。
対応するように、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体療法に対する大きな潜在性の観点から、ＧＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ受容体相互作用を効果的に阻害する、高親和性を持つヒト抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体に対する高いニーズがある。さらに、一つ以上の非ヒト種のＧＭ−ＣＳＦと交差反応できる一つ以上の抗体を持つことは、動物ベースの生体内モデルにおいてそれらの有効性を試験するために有利である。

【0019】

本発明は、以下に記述する十分に高い有効性を持つ抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を提供することによりこれらのニーズと他のニーズを満足する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0020】

【特許文献1】ＥＰ０４９９１６１Ａｌ

【特許文献2】ＷＯ ０３／０６８９２０

【非特許文献】

【0021】

【非特許文献1】Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａ ＪＭ，Ｚｖａｉｆｌｅｒ ＮＪ，Ｂｒｏｗｎ ＣＢ，Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ Ｋ，およびＦｉｒｅｓｔｅｉｎ ＧＳ．（１９９１）．慢性炎症性関節炎におけるサイトカイン．ＶＩ．ＩＬ−１および腫瘍壊死因子アルファによって間接リウマチおよびその調節における顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の生成および遺伝子発現に関与する滑膜細胞の分析．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１４６，３３６５−３３７１．

【非特許文献2】Ｂａｂｉｏｒ，Ｂ．（２０００）．食細胞および酸化的ストレス．ＡｍＪＭｅｄ１０９，３３−４４．

【非特許文献3】Ｂｏｎｆｉｅｌｄ，Ｔ．Ｌ．，Ｋａｖｕｒｕ，Ｍ．Ｓ．，およびＴｈｏｍａｓｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．（２００２）．抗Ａｎｔｉ−ＧＭ−ＣＳＦタイターは肺胞タンパク症におけるＧＭ−ＣＳＦ療法への反応を予測する．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ１０５，３４２−３５０．

【非特許文献4】Ｂｏｚｉｎｏｖｓｋｉ，Ｓ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．，Ｂｅａｖｉｔｔ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｏｏｋ，Ａ．Ｄ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ．，およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｐ．（２００３）．マウス肺におけるリポ多糖体への先天性免疫応答は、ＴＬＲ−４の抑制を介してＧＭ−ＣＳＦの中和により抑制および逆転する。Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．

【非特許文献5】Ｂｒｏｉｄｅ，Ｄ．Ｈ．，Ｐａｉｎｅ，Ｍ．Ｍ．，およびＦｉｒｅｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９２）。好酸球は、ぜんそく患者におけるアレルギー性炎の部位でのインターロイキン５および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ｍＲＮＡを発現する。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ９０，１４１４−１４２４．

【非特許文献6】Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｐｉｈｌ，Ｃ．Ｅ．，およびＫａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｋ．（１９９４）。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットと相互作用するヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子領域のマッピング．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ２２５，８７３−８８０．

【非特許文献7】Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒ，Ｇ．Ｒ．，Ｓｔｕｈｌｍｕｌｌｅｒ，Ｂ．，Ｋｅｙｓｚｅｒ，Ｇ．，ａｎｄＫｉｎｎｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９７）．単核の食細胞およびリウマチ性滑膜炎。関節炎における首謀者または馬車馬？関節炎Ｒｈｅｕｍ４０，５−１８．

【非特許文献8】Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｋ．，Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ａ．，およびＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ．（１９９７）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、マウスにおいてコラーゲン誘導関節炎を悪化させる。Ａｎｎ ＲｈｅｕｍＤｉｓ５６，３６４−３６８．

【非特許文献9】Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｋ．，Ｒｉｃｈ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｉｓｃｈｏｆ，Ｒ．Ｊ．，Ｄｕｎｎ，Ａ．Ｒ．，Ｇｒａｉｌ，Ｄ．，およびＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ．（１９９８）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子欠乏マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎からの予防。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６１，３６３９−３６４４．

【非特許文献10】Ｃａｒｒｉｅｒｉ，Ｐ．Ｂ．，Ｐｒｏｖｉｔｅｒａ，Ｖ．，ＤｅＲｏｓａ，Ｔ．，Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｇｏｒｇａ，Ｆ．，およびＰｅｒｅｌｌａ，Ｏ．（１９９８）再発寛解型多発性硬化症の患者における脳脊髄液および血清サイトカインのプロフィール：臨床活性との相関。Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．２０，３７３−３８２．

【非特許文献11】Ｃｅｂｏｎ，Ｊ．，Ｎｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．，Ｗａｒｄ，Ｍ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｌ，Ｄｅｍｐｓｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｌａｙｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｄｕｈｒｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｕｒ−ｇｅｓｓ，Ａ．，Ｎｉｃｅ，Ｅ．Ｃ．，およびＭｏｒｓｔｙｎ，Ｇ．（１９９０）．ヒトリンパ球からの顆粒球マクロファージ刺激因子。Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ２６５，４４８３−４４９１．

【非特許文献12】Ｃｈａｎｔｒｙ，Ｄ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｆ．，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ａ．，およびＦｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ．（１９９０）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、ヒト単球によってＨＬＡ−ＤＲ表現およびサイトカイン産生の両方を誘発する。Ｃｙｔｏｋｉｎｅ２，６０−６７．

【非特許文献13】ＣｈｅｎＹ．，ＷｉｅｓｍａｎｎＣ．，ＦｕｈＧ．，ＬｉＢ．，ＣｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒＨ．Ｗ．，ＭｃＫａｙ．Ｐ，ｄｅＶｏｓＡ．Ｍ．，ＬｏｗｍａｎＨ．Ｂ．（１９９９）最適化抗ＶＥＧＦ抗体の選択および分析：抗原と複合したアフィニティー成熟ＦａｂフラグメントのＪ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９３，８６５−８１．

【非特許文献14】Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｌａｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｕｋａｃｓ，Ｎ．Ｗ．，およびＫｕｎｋｅｌ，Ｓ．Ｌ．（２００１）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、ヒト好中球においてＣＣＲＩを上方調節する。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６６，１１７８−１１８４．

【非特許文献15】Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．およびＫａｍｅｎ，Ｒ．（１９８７）．ヒト造血コロニー刺激因子。Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６，１２２９−１２３７．

【非特許文献16】Ｃｏｏｋ，Ａ．Ｄ．，Ｂｒａｉｎｅ，Ｅ．Ｌ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＬＫ．，Ｒｉｃｈ，Ｍ．Ｊ．，およびＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ．（２００１）．抗体による顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）へのコラーゲン誘導関節炎開始後の閉塞：病気のエフェクター相におけるＧＭ−ＣＳＦのための必要条件．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ３，２９３−２９８．

【非特許文献17】ｄｅＧｒｏｏｔ，Ｒ．Ｐ．，Ｃｏｆｆｅｒ，Ｐ．Ｊ．，およびＫｏｅｎｄｅｒｍａｎ，Ｌ．（１９９８）．ＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦ受容体ファミリーによる増殖、分化および生存の調節。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．１０，６１９−６２８．

【非特許文献18】ｄｅＶｒｉｅｓ，Ｅ．Ｇ．，Ｗｉｌｌｅｍｓｅ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｉｅｓｍａ，Ｂ．，Ｓｔｅｒｎ，Ａ．Ｃ．，Ｌｉｍｂｕｒｇ，Ｐ．Ｃ．，およびＶｅｌｌｅｎｇａ，Ｅ．（１９９１）．化学療法後のＧＭ−ＣＳＦ治療の間の関節リウマチの再燃。Ｌａｎｃｅｔ３３８，５１７−５１８．

【非特許文献19】Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ，Ｋ．，Ｂｏｏｎｅ，Ｔ．，およびＫａｒｐｌｕｓ，Ｐ．Ａ．（１９９１）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の新規層および推定受容体結合部位。Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４，１７７９−１７８２．

【非特許文献20】ＤｒａｋｅＡ．Ｗ．，ＭｙｓｚｋａＤ．Ｇ．，ＫｌａｋａｍｐＳ．Ｌ．（２００４）動力および平衡ベースの方法による高親和性抗原／抗体複合体の特徴付け。Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２８，３５−４３．

【非特許文献21】Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ａ．Ｄ．，Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｒｅａｍ，Ｂ．，Ｒａｓｈｉｄ，Ａ．，Ｂｒｏｎｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．，Ｄｉｃｋｅｒｓｉｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｂａｃｈｕｒｓｋｉ，Ｃ．Ｊ．，Ｍａｒｋ，Ｅ．Ｌ．，Ｗｈｉｔｓｅｔｔ，Ｊ．Ａ．，および（１９９４）．肺疾患の恒常性における顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の関与。Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４，７１３−７１６．

【非特許文献22】ＦｒｉｇｕｅｔＢ．，ＣｈａｆｆｏｔｔｅＡ．．Ｆ，Ｄｊａｖａｄｉ−ＯｈａｎｉａｎｃｅＬ．，ＧｏｌｄｂｅｒｇＭ．Ｅ．（１９８５），酵素結合の免疫吸着法による抗原抗体複合体の溶体に恒常的な真の親和性の測定。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７７，３０５−１９．

【非特許文献23】Ｇａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄＤｉＰｅｒｓｉｏ，Ｊ．Ｆ．（１９９０ａ）．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆｈｕｍａｎ

【非特許文献24】顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）．Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ３５２，３７５−３８４．

【非特許文献25】Ｇａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｊ．Ｋ．，およびＮｉｍｅｒ，Ｓ．Ｄ．（１９９０ｂ）．ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）：発現の調節．Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ３３８，２７−４１．

【非特許文献26】Ｇａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｗｅｉｓｂａｒｔ，Ｒ．Ｈ．，Ｔｏｍｏｎａｇａ，Ｍ．，およびＧｏｌｄｅ，Ｄ．Ｗ．（１９８６）．正常および白血病性ヒト骨髄性細胞に対する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の高

【非特許文献27】親和性結合。Ｐｒｏｃ Ｎａｉｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８３，６６９−６７３．

【非特許文献28】Ｇｅａｒｉｎｇ，Ｄ．Ｐ．，Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ａ．，Ｇｏｕｇｈ，Ｎ．Ｍ．，およびＮｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．（１９８９）．ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のための受容体の発現クローニング。ＥＭＢＯＪ．１２，３６６７−３６７６．

【非特許文献29】Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｍｂｒｏｎｅｒｏ，Ｊ．，Ｈｏｍ，Ｊ．，Ｐａｕｌ，Ｃ．Ｃ．，およびＢａｕｍａｎｎ，Ｍ．Ａ．（２００３）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、ヒト好中球のための化学誘引物質サイトカインである：リボソームｐ７０Ｓ６キナーゼシグナル経路の関与。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１７１，６８４６−６８５５．

【非特許文献30】Ｈａｅｎｅｌ，Ｃ．，Ｓａｔｚｇｅｒ，Ｍ．，ＤｅｌｌａＤｕｃａｔａ，Ｄ．，Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐ，Ｒ．およびＢｒｏｃｋｓ，Ｂ．（２００５）．電気化学発光ベースの平衡滴定による高親和性抗体の特徴付け。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３９，１，１８２−１８４．

【非特許文献31】Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ．（１９９３）．関節リウマチ：造血増殖因子の反対作用および遅効性の抗リウマチ薬。Ｌａｎｃｅｔ ３４２，５３６−５３９．

【非特許文献32】Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ． （２００２）． 炎症および自己免疫におけるＧＭ−ＣＳＦ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３， ４０３−４０８．

【非特許文献33】Ｈａｒｔ，Ｐ．Ｈ．， Ｗｈｉｔｔｙ，Ｇ．Ａ．， Ｐｉｃｃｏｌｉ，Ｄ．Ｓ．， および Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ． （１９８８）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 ａｎｄ ＩＦＮ−ガンマによるヒト単球の相乗的活性化。ＴＮＦ−アルファを増大させるがＩＬ−Ｉ活性は増大させない。 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１， １５１６−１５２１．

【非特許文献34】Ｈａｗｏｒｔｈ，Ｃ．， Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｆ．Ｍ．， Ｃｈａｎｔｒｙ，Ｄ．， Ｔｕｒｎｅｒ，Ｍ．， Ｍａｉｎｉ，Ｒ．Ｎ．， および Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ． （１９９１）．関節リウマチにおける顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の発現：腫瘍壊死因子アルファによる調節。 Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１， ２５７５−２５７９．

【非特許文献35】Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ｋ．， Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．， Ｇｏｒｍａｎ，Ｄ．Ｍ．， Ａｒａｉ，Ｋ．， Ｙｏｋｏｔａ，Ｋ．， および Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ａ． （１９９０）．ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ための受容体の第二サブユニットの分子クローニング：高親和性 ＧＭ−ＣＳＦ 受容体の再構成。 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７，９６５５−９６５９．

【非特許文献36】Ｈａｚｅｎｂｅｒｇ ＢＰ， Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ＭＡ， Ｖａｎ Ｒｉｊｓｗｉｊｋ ＭＨ， Ｓｔｅｍ ＡＣ， および Ｖｅｌｌｅｎｇａ Ｅ （１９８９）．

【非特許文献37】顆粒球マクロファージコロニー刺激因子よるフェルティ症候群における顆粒球減少症の回復。インターロイキン−６放出の同時誘導および関節炎の再燃。 Ｂｌｏｏｄ ７４， ２７６９−２７８０．

【非特許文献38】Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，Ｒ．Ａ． およびＳｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ． （１９９３）． ＧＭ−ＣＳＦ 受容体：相互作用および活性化。 Ｏｎ−ｃｏｇｅｎｅ ８， ２３１−２３６．

【非特許文献39】Ｋａｕｆｒｎａｎ，Ｓ．Ｅ．， ＤｉＰｅｒｓｉｏ，Ｊ．Ｆ．， および Ｇａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｃ． （１９８９）．

【非特許文献40】ビトロにおける好中球の脱顆粒でのヒトＧＭ−ＣＳＦの効果。 Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １７， ８００−８０４．

【非特許文献41】Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．， Ｓａｔｏ，Ｎ．， Ａｒａｉ，Ｋ．， ａｎｄ Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ａ． （１９９１）．ヒト ＩＬ−３ 受容体 ｅＤＮＡの発現クローニング は，ヒト ＩＬ−３ および ＧＭ−ＣＳＦ 受容体のための共有ベータサブユニットを露呈する。 Ｃｅｌｌ ６６，１１６５−１１７４．

【非特許文献42】Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．， Ｔａｎａｋａ，Ｎ．， Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｊ．， Ｕｃｈｉｄａ， Ｋａｎｅｇａｓａｋｉ，Ｓ．， Ｙａｍａｄａ，Ｙ．， および Ｎａｋａｔａ，Ｋ．（１９９９）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に対する中和抗体を有する自己免疫疾患としての特発性肺胞タンパク症。 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９０， ８７５−８８０．

【非特許文献43】Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ．， Ｔａｎｇｅ Ｔ．， Ｔｅｒａｓａｗａ Ｔ．， Ｃｈｉｂａ Ｓ．， Ｋｕｗａｋｉ Ｔ．， Ｍｉｙａｇａｗａ Ｋ．， Ｐｉａｏ Ｙ．Ｆ．， Ｍｉｙａｚｏｎｏ Ｋ．， Ｕｒａｂｅ Ａ．， Ｔａｋａｋｕ Ｆ． （１９８９）． ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−３， またはエリスロポエチンで依存して増殖する一意的ヒト細胞株の確立および特徴付けＪ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４０， ３２３−３４．

【非特許文献44】Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．， Ｇｅ，Ｌ．， Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．， Ｐａｃｋ，Ｐ．， Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．， Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ，Ｇ．， Ｈｏｅｓｓ，Ａ．， Ｗｏｌｌｅ，Ｊ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．， および Ｖｉｒｎｅｋａｓ，Ｂ． （２０００）．モジュールコンセンサス骨格およびトリヌクレオチドによるＣＤＲランダム化に基づく合成完全ヒトモノクローナル抗体作製技術（ＨｕＣＡＬ）。 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６， ５７−８６．

【非特許文献45】Ｋｒｅｂｓ，Ｂ．， Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．， Ｒｅｉｆｆｅｒｔ，Ｓ．， Ｒｏｔｈｅ，Ｃ．， Ｔｅｓａｒ，Ｍ．， Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ，Ｅ．， Ｃａｏ，Ｍ．， Ｄｒｅｉｅｒ，Ｔ．， Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．， Ｈｏｓｓ，Ａ．， Ｉｎｇｅ，Ｌ．， Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．， Ｍａｒｇｅｔ，Ｍ．， Ｐａｃｋ，Ｐ．， Ｍｅｎｇ，Ｘ．Ｑ．， Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．， Ｓｏｈｌｅｍａｎｎ，Ｐ．， Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．， Ｗｏｌｌｅ，Ｊ．， およびＫｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｔ． （２００１）．組換え型ヒト抗体の高スループット生成およびエンジニアリング。 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４， ６７−８４．

【非特許文献46】Ｌｏｐｅｚ，Ａ．Ｆ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．， Ｇａｍｂｌｅ，Ｊ．Ｒ．， Ｂｅｇｌｅｙ，Ｃ．Ｇ．， Ｈａｒｌａｎ，Ｊ．Ｎ．， Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．， Ｗａｌ−ｔｅｒｓｄｏｒｐｈ，Ａ．， Ｗｏｎｇ，Ｇ．， Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．， および Ｖａｄａｓ，Ｍ．Ａ． （１９８６）． 組換え型ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、ビトロ成熟ヒト好中球および好酸球機能、表面受容体発現、ならびに生存物において刺激する。 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７８， １２２０−１２２８．

【非特許文献47】ＭｃＱｕａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｌ．， Ｄａｒｗｉｃｈｅ，Ｒ．， Ｅｗｉｎｇ，Ｃ．， Ｏｎｕｋｉ，Ｍ．， Ｋａｙ，Ｔ．Ｗ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ．， Ｒｅｉｄ，Ｈ．Ｈ．， および Ｂｅｍａｒｄ，Ｃ．Ｃ． （２００１）． 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子：多発性硬化症における新推定治療標的。 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９４， ８７３−８８２．

【非特許文献48】Ｍｅａｇｅｒ，Ａ．， Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．， Ｂｉｒｄ，Ｃ．， Ｄｉｌｇｅｒ，Ｐ．， Ｔｈｏｒｐｅ，Ｒ．， Ｎｅｗｓｏｍ−Ｄａｖｉｓ，Ｊ．， ａｎｄ Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｎ． （１９９９）．自己免疫疾患を有する患者における顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に対する自然発生的中和抗体。 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９７， ５２６−５３２．

【非特許文献49】Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．， Ｂｅｇｌｅｙ，Ｃ．Ｇ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．， Ｎｉｃｏｌａ，Ｎ．Ａ．， Ｖａｄａｓ，Ｍ．Ａ．， Ｌｏｐｅｚ，Ａ．Ｆ．， Ｗｉｌｌｉａｍ−ｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．， Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．， Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．， および Ｗａｎｇ，Ｅ．Ａ． （１９８６）． 組換え型ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のビトロにおける生物学的特性。 Ｂｌｏｏｄ ６７， ３７−４５．

【非特許文献50】Ｍｕｌｈｅｒｉｎ，Ｄ．， Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｏ．， および Ｂｒｅｓｎｉｈａｎ，Ｂ． （１９９６）． 関節リウマチにおける滑膜組織マクロファージ個体群および関節損傷。 Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ３９， １１５−１２４．

【非特許文献51】Ｎａｇｙ Ｚ．Ａ．， Ｈｕｂｎｅｒ Ｂ．， Ｌｏｈｎｉｎｇ Ｃ．， Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｒ．， Ｒｅｉｆｆｅｒｔ Ｓ．， Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ−Ｗｏｌｆ Ｅ．， Ｚａｈｎ Ｓ．， Ｌｅｙｅｒ Ｓ．， Ｓｃｈｉｅｒ Ｅ．Ｍ．， Ｚａｈｒａｄｎｉｋ Ａ．， Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｃ．， Ｌｏｂｅｎｗｅｉｎ Ｋ．， Ｒａｔｔｅｌ Ｂ．， Ｓｔａｎｇｌｍａｉｅｒ Ｍ．， Ｈａｌｌｅｋ Ｍ．， Ｗｉｎｇ Ｍ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ．， Ｄｕｎｎ Ｍ．， Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ Ｔ．， Ｔｅｓａｒ Ｍ． （２００２） 完全ヒト， ＨＬＡ−ＤＲ特異的な単クローン性抗体は、悪性リンパ腫細胞のプログラム死を効率良く誘導する。 Ｎａｔ Ｍｅｄ． ８， ８０１−７

【非特許文献52】Ｏｌｖｅｒ，Ｉ．Ｎ．， Ｈｅｒｃｕｓ，Ｔ．， Ｌｏｐｅｚ，Ａ．， Ｖａｄａｓ，Ｍ．， Ｓｏｍｏｇｙｉ，Ａ．Ａ．， Ｄｏｙｌｅ，Ｉ．， Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．， Ｋｅｅｆｅ，Ｄ．， Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．， Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．， Ｔｏ，Ｌ．Ｂ．， Ｃｏｌｅ，Ｊ．， Ｒａｗｌｉｎｇ，Ｔ．， Ｃａｍｂａｒｅｒｉ，Ｂ．， Ｍｙｅｒｓ，Ｍ．， Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ，Ｎ．， Ｂａｓｔｉｒａｓ，Ｓ．， Ｓｅｎｎ，Ｃ．， Ｈｅｙ，Ａ．， Ｖｅｒｍａ，Ｍ．， ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｙ，Ｐ． （２００２）． ＧＭ−ＣＳＦ抑制因子 Ｅ２１Ｒの第１相試験。 Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５０， １７１−１７８．

【非特許文献53】Ｐｌｅｎｚ，Ｇ．， Ｅｓｃｈｅｒｔ，Ｈ．， Ｂｅｉｓｓｅｒｔ，Ｓ．， Ａｒｐｓ，Ｖ．， Ｓｉｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｒ．， Ｒｏｂｅｎｅｋ，Ｈ．， ａｎｄ Ｖｄｌｋｅｒ，Ｗ． （２００３）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）−欠損マウスの血管細胞外マトリックスにおける変化。 ＦＡＳＥＢ Ｊ． １７，１４５１−１４５７．

【非特許文献54】Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ａ．Ｐ．， Ａｂｂｏｕｄ，Ｃ．Ｎ．， ａｎｄ ＤｉＰｅｒｓｉｏ，Ｊ．Ｆ． （１９９２）． 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ） および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）：受容体生物学、情報伝達、および好中球活性化。 Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ ６， ４３−５７．

【非特許文献55】Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．， Ｂｏｒｇｅｓ，Ｅ．， Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ−Ｗｏｌｆ，Ｅ．， Ｒｏｍ，Ｅ．， Ａｄａｒ，Ｒ．， Ｙａｎｉｖ，Ｙ．， Ｍａｌｋａ，Ｍ．， Ｃｈｕｍａｋｏｖ，Ｉ．， Ｋｏｔｚｅｒ，Ｓ．， Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙ，Ｄ．， Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．， Ｒｅｉｆｆｅｒｔ，Ｓ．， Ｐｒａｓｓｌｅｒ，Ｊ．， Ｊｕｒｙ，Ｋ．， Ｗａｌｄ−ｈｅｒｒ，Ｄ．， Ｂａｕｅｒ，Ｓ．， Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｔ．， Ｙａｙｏｎ，Ａ．， および Ｒｏｔｈｅ，Ｃ． （２００３）．ヒト線維芽細胞増殖因子受容体 ３に対する特異的で機能的な抗体を産出するヒト組み合わせＦａｂフラグメントライブラリー Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．

【非特許文献56】Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｓｃｈｗａｒｚ Ｆ， Ａｎａｎｄ Ｐ，Ｌ．Ｓ．， ａｎｄ Ｃａｒｓｏｎｓ ＳＥ （２００１）． 関節リウマチ（ＲＡ）における樹枝状細胞（ＤＣ）： Ｔｈｌ 炎症性型反応を選択的に活性化する脊髄のＤＣのサブセットを産出するＲＡ滑液に含まれる前駆細胞および可溶性因子。 Ｊ Ｉｍｍｕ−ｎｏｌ １６７，１７５８−１７６８，

【非特許文献57】Ｓａｔｏ，Ｎ．， Ｓａｋａｍａｋｉ，Ｋ．， Ｔｅｒａｄａ，Ｎ．， Ａｒａｉ，Ｋ．， および Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ａ． （１９９３）．高親和性 ＧＭ−ＣＳＦ 受容体による情報伝達：異なるシグナル伝達に関与する共有ベータサブユニットの２つの特異的な細胞質領域。 ＥＭＢＯ Ｊ １２，４１８１−４１８９．

【非特許文献58】Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．， ＭｃＣａｌｌ Ａ．， Ａｄａｍｓ Ｇ．．Ｐ， Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｋ．Ｗ．， Ｍｅｒｒｉｔｔ Ｈ．， Ｙｉｍ Ｍ．， Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｒ．Ｓ．， Ｗｅｉｎｅｒ Ｌ．Ｍ．， Ｍａｒｋｓ Ｃ．， Ｍａｒｋｓ Ｊ．Ｄ． （１９９６）抗体結合部位の中央での領域を決定する相補性の分子進化によるピコモル親和性抗ｃ−ｅｒｂＢ−２単一鎖Ｆｖ。 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ８， ２６３：５５１−６７．

【非特許文献59】Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｅ．， および Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，Ｒ．Ａ． （１９９１ａ）．，ヒトおよびマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ならびに種特異性での関与における必須アミノ酸残渣の識別。 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６， １３８０４−１３８１０．

【非特許文献60】Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．， Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ａ．， Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．， および Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，Ｒ．Ａ． （１９９１６）． ＧＭ−ＣＳＦ および ＩＬ−５のアミノ末端基ヘリックスは、それらの受容体への高親和性 結合を抑制する。 ＥＭＢＯ Ｊ １０，４１０５−４１１２．

【非特許文献61】Ｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．， Ｂｅｒｃｌａｚ，Ｐ．−Ｙ．， Ｃｈｒｏｎｅｏｓ，Ｚ．， Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．， および Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｂ．Ｃ． （２００１）． ＧＭ−ＣＳＦ は、ＰＵを通して肺での肺マクロファージ分化および先天性免疫を調節する。 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５５７−５６７．

【非特許文献62】Ｓｉｓｓｏｎ，Ｓ．Ｄ． および Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ． （１９８８）．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子により刺激されるヒト単核球によるインターロイキン−１ アルファ、インターロイキン−１ ベータおよび腫瘍壊死因子の生成。 Ｂｌｏｏｄ ７２， １３６８−１３７４．

【非特許文献63】Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．， Ｌｉｅｓｃｈｋｅ，Ｇ．Ｊ．， Ｇｒａｉｌ，Ｄ．， Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．， Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｇ．， Ｇａｌｌ，Ｊ．Ａ．， Ｍａｈｅｒ，Ｄ．Ｗ．， Ｃｅ−ｂｏｎ，Ｊ．， Ｓｉｎｉｃｋａｓ，Ｖ．， および Ｄｕｎｎ，Ａ．Ｒ． （１９９４）． 顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子欠損マウスは、造血の主要な摂動を示さないが、特性肺病理学を発現する。 Ｐｒｏｃ Ｎａｉｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９１， ５５９２−５５９６．

【非特許文献64】Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｂ．Ｃ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｓｅｔｔ，Ｊ．Ａ． （２００２）． ＧＭ−ＣＳＦは、肺界面活性剤恒常性および肺マクロファージ介在先天性宿主防衛を調節する。 Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ６４， ７７５−８０２．

【非特許文献65】Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．， Ｎａｋａｔａ，Ｋ．， Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｂ．Ｃ．， Ｔｅｒａｋａｗａ，Ｔ．， Ｈａｍａｎｏ，Ｅ．， Ｍｉｋａｍｉ，Ａ．， Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｉ．， Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｊ．Ｆ．， Ｏｈ−Ｅｄａ，Ｍ．， Ｉｓｈｉｇｅ，Ｉ．， Ｅｉｓｈｉ，Ｙ．， Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．， Ｙａｍａｄａ，Ｙ．， Ｈａｎａｏｋａ，Ｋ．， および Ｋｅｉｃｈｏ，Ｎ． （２００４）． 高親和性自己抗体は特に、特発性肺胞タンパク症を有する患者の肺での顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の活性を除去する。 Ｂｌｏｏｄ １０３， １０８９−１０９８．

【非特許文献66】Ｖｉｒｎｅｋａｓ， Ｂ．， Ｇｅ， Ｌ．， ＰｌＵｃｋｔｈｕｎ， Ａ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｋ．Ｃ．， Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ， Ｇ． ＆ Ｍｏｒｏｎｅｙ， Ｓ．Ｅ．， （１９９４）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２， ５６００−５６０７．

【非特許文献67】Ｘｕ，Ｗ．Ｄ．， Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．， Ｔａｅｔｌｅ，Ｒ．， Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｋ．， および Ｚｖａｉｆｌｅｒ，Ｎ．Ｊ． （１９８９）．慢性炎症性関節炎におけるサイトカイン。 ＩＩ． リウマチ性滑膜浸出における顆粒球マクロファージコロニー刺激因子。 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８３， ８７６−８８２．

【非特許文献68】Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｎ．， Ｔａｓｈｉｍｏ，Ｈ．， Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．， Ｋａｎｅｋｏ，Ｆ．， Ｎａｋａｎｏ，Ｊ．， Ｋａｔｏ，Ｈ．， Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｔ．， およびＯｈｔａ，Ｋ． （２００２）． ＧＭ−ＣＳＦの中和によるマウスぜんそくモデルにおける気道過敏性の減衰。 Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１９， ９２−９７．

【非特許文献69】Ｙａｎｇ Ｗ．Ｐ．， Ｇｒｅｅｎ Ｋ．， Ｐｉｎｚ−Ｓｗｅｅｎｅｙ Ｓ．， Ｂｒｉｏｎｅｓ Ａ．Ｔ．， Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．， Ｂａｒｂａｓ Ｃ．Ｆ． ３ｒｄ． （１９９５）． 強力なヒト抗ＨＩＶ−１ 抗体 の親和性成熟のためのＣＤＲ歩行突然変異生成をピコモル範囲にする。 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２５４， ３９２−４０３

【非特許文献70】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．， ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｋ．， Ｆｕｊｉｉ，Ｋ．， ａｎｄ Ｗａｈｌ，Ｌ．Ｍ． （１９９８）．単球マトリクスメタロプロテイナーゼ，およびＴＮＦアルファ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ならびにプロスタグランジン依存性およびプロスタグランジン非依存性機構によるＩＬ−Ｉ ベータによるＴＩＭＰ−１ 生成 の分別調節。 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１， ３０７１−３０７６．

【発明の概要】

【0022】

ＧＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ受容体の相互作用を効果的に阻害できるヒトおよびヒト化抗体を提供することは本発明の目的である。

【0023】

ヒトへの投与に安全な抗体を提供することが、本発明の別の目的である。

【0024】

ＧＭ−ＣＳＦの存在に関連する病気および／または状態を、一つ以上の本発明の抗体を用いることによって治療するための方法を提供することも本発明の目的である。これらの目的と本発明の他の目的は本明細書でより詳しく説明する。

【0025】

一つの態様では、本発明はヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗原結合領域を提供し、単離されたヒトまたはヒト化抗体またはそれらの機能性フラグメントが（ｉ）０．５μｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦと、約２×１０^５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体のアルファ鎖との結合を、少なくとも５０％の程度で、（ａ）ＣＨＯ−Ｋｌ細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖の濃度が、約２×１０^５個のＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖の濃度と同様である条件下と、（ｂ）単離したヒト抗体またはヒト化抗体またはそれらの機能性フラグメントの濃度が約５μｇ／ｍｌである条件下で抑制でき、ならびに（ｉｉ）対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／または対照抗体ＭＡＢ２１５より少なくとも５倍低いＩＣ_５０値を用いるＴＦ−１増殖分析における０．２５ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦを中和できる。本明細書での使用については、「ＴＦ−１増殖アッセイ」は特に５Ｂにて説明されるような実施例アッセイとして定義される。当業者は本明細書で提供される指示に従うことで、約２×１０^５のＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞上に発現しているそれと同様の濃度にてヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を得ることができる。

【0026】

本発明は、本明細書に開示されるような抗原結合領域を含む単離されたヒトまたはヒト
抗体または機能性抗体をさらに提供する。そのような抗体またはその機能性フラグメントは、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４９、５０、５１、または５２に表されるＨＣＤＲ３領域を含む抗原結合領域を含んでもよく、この抗原結合領域は配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４９、５０、５１、または５２に表されるＨＣＤＲ２領域をさらに含んでもよく、この抗原結合領域は配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４９、５０、５１、または５２に表されるＨＣＤＲ１領域をさらにまた含んでもよい。そのような抗体またはその機能性フラグメントは配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４９、５０、５１、または５２に表される重鎖可変領域を含む抗原結合領域を含んでもよい。本発明のそのようなＧＭ−ＣＳＦ特異性抗体は配列番号：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５８、５９、６０、または６１に表されるＬＣＤＲ３領域を含む抗原結合領域を含んでもよく、この抗原結合領域はさらに配列番号：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５８、５９、６０、または６１に表されるＬＣＤＲ２領域を含んでもよく、この抗原結合領域は配列番号：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５８、５９、６０、または６１に表されるＬＣＤＲ１をさらにまた含んでもよい。そのような抗体またはその機能性フラグメントは 配列番号：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５８、５９、６０、または６１に表される軽鎖可変領域を含む抗原結合領域を含んでもよい。

【0027】

本明細書で開示される配列のペプチド変異体もまた本発明に包括される。それに応じて、本発明は配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４９、５０、５１、または５２に表されるＣＤＲ領域と少なくとも６０％の配列同一性を持つ、あるいは配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４９、５０、５１、または５２に表されるＣＤＲ領域と少なくとも８０％の配列相同性をＣＤＲ領域に持つ重鎖アミノ酸配列を持つ抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を含む。さらに含まれるのは、配列番号：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５８、５９、６０、または６１に表されるＣＤＲ領域と少なくとも６０％配列同一性をＣＤＲ領域に持つ、あるいは、配列番号：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５８、５９、６０、または６１に表されるＣＤＲ領域と少なくとも８０％の配列相同性をＣＤＲ領域に持つ軽鎖アミノ酸配列を持つ抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体である。

【0028】

抗体フラグメントが例えばＦａｂまたはｓｃＦｖであってもよい一方、本発明の一つの抗体は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ_１）であってもよい。それに応じて、発明の抗体フラグメントは本明細書で開示されるような一つ以上の様式で機能する抗原結合領域であってもよい、あるいはそれを含んでもよい。

【0029】

本発明はまた、ＧＭ−ＣＳＦに特異的なヒトまたはヒト抗体または機能性抗体フラグメントの抗原結合領域をコードできる、それぞれが単離した核酸配列に関する。そのような核酸配列は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、４４、４５、４６、４７、または４８を含む、単離されたヒトまたはヒト抗体またはそれらの機能性フラグメントの重鎖可変領域、または高ストリンジェントな条件下で配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、４４、４５、４６、４７、または４８の相補鎖と交雑する核酸配列をコードしてもよい。核酸は、配列番号：２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５３、５４、５５、５６、または５７を含む単離されたヒトまたはヒト抗体またはそれらの機能性フラグメントの軽鎖可変領域、または高ストリンジェントな条件下で配列番号：２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５３、５４、５５、５６、または５７の相補鎖と交雑する核酸配列をコードしてもよい。

【0030】

この核酸配列は、ヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的なヒトおよびヒト化抗体または機能性抗体フラグメントの抗原結合領域をコードするかもしれず、抗体またはその機能性フラグメントは（ｉ）０．５μｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦと、２×１０^５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体のアルファ鎖との結合を、少なくとも５０％の程度で、（ａ）前述のＣＨＯ−Ｋｌ細胞に発現させた前述のヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖の濃度が、２×１０^５個のＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖の濃度と同様である条件下と、（ｂ）前述の単離したヒト抗体またはヒト化抗体またはそれらの機能性フラグメントの濃度が約５μｇ／ｍｌである条件下で抑制でき、ならびに（ｉｉ）対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／または対照抗体ＭＡＢ２１５より少なくとも５分の１低いＩＣ_５０値を用いるＴＦ−１増殖分析における０．２５ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦを中和できる。

【0031】

本発明の核酸は組換え産生に適している。故に、本発明はまた本発明の核酸配列を含むベクターや宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、細菌細胞または真核細胞かもしれない。

【0032】

本発明の化合物は治療的応用または予防的応用に使用されてもよい。従って本発明は、発明的な抗体（または機能性抗体フラグメント）を含む医薬的組成物および医薬的に許容できる担体、またはその賦形剤を含む。関連する態様では、本発明はＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ発現細胞の望ましくない存在に関連する疾患または状態を治療するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書で記述するまたは意図するような発明的な抗体を含む効果的な量の医薬化合物を、それらを必要とする被験者に投与するステップを含む。そのような疾患または状態は、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、乾癬、喘息、アトピー性皮膚炎、およびショックなどの炎症性疾患かもしれない。
本発明のヒトまたはヒト化抗体（およびそれらの機能性フラグメント）は、溶液平衡滴定（ＳＥＴ）、および／またはＴＦ１増殖アッセイによって検討されるように、ラットおよび／またはアカゲザル（マカク属）ＧＭ−ＣＳＦと交差反応性であってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1a-1】図１ａ−１は各種の新しい抗体の重鎖可変領域領域の核酸配列を提供する。

【図1a-2】図１ａ−２は各種の新しい抗体の重鎖可変領域領域の核酸配列を提供する。

【図1a-3】図１ａ−３は各種の新しい抗体の重鎖可変領域領域の核酸配列を提供する。

【図1a-4】図１ａ−４は各種の新しい抗体の重鎖可変領域領域の核酸配列を提供する。

【図1a-5】図１ａ−５は各種の新しい抗体の重鎖可変領域領域の核酸配列を提供する。

【図1b-1】図１ｂ−１は各種の新しい抗体の重鎖可変領域領域のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲ領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３はＮ末端からＣ末端の方向に定義され、太字で示す。

【図1b-2】図１ｂ−２は各種の新しい抗体の重鎖可変領域領域のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲ領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３はＮ末端からＣ末端の方向に定義され、太字で示す。

【図1b-3】図１ｂ−３は各種の新しい抗体の重鎖可変領域領域のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲ領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３はＮ末端からＣ末端の方向に定義され、太字で示す。

【図2a-1】図２ａ−１は各種の新しい抗体の軽鎖可変領域領域の核酸配列を提供する提供する。

【図2a-2】図２ａ−２は各種の新しい抗体の軽鎖可変領域領域の核酸配列を提供する提供する。

【図2a-3】図２ａ−３は各種の新しい抗体の軽鎖可変領域領域の核酸配列を提供する提供する。

【図2a-4】図２ａ−４は各種の新しい抗体の軽鎖可変領域領域の核酸配列を提供する提供する。

【図2a-5】図２ａ−５は各種の新しい抗体の軽鎖可変領域領域の核酸配列を提供する提供する。

【図2b-1】図２ｂ−１は各種の新しい抗体の軽鎖可変領域領域のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲ領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はＮ末端からＣ末端の方向に定義され、太字で示す。

【図2b-2】図２ｂ−２は各種の新しい抗体の軽鎖可変領域領域のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲ領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はＮ末端からＣ末端の方向に定義され、太字で示す。

【図2b-3】図２ｂ−３は各種の新しい抗体の軽鎖可変領域領域のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲ領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はＮ末端からＣ末端の方向に定義され、太字で示す。

【図3】図３はコンセンサスに基づくＨｕＣＡＬ^(R)抗体マスター遺伝子配列の重鎖可変領域のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲ領域である、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３はＮ末端からＣ末端の方向に定義され、太字で示す（配列番号：４１）。

【図4】図４はコンセンサスに基づくＨｕＣＡＬ^(R)抗体マスター遺伝子配列の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲ領域である、ＬＣＤＲ１，ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３はＮ末端からＣ末端の方向に定義され、太字で示す（配列番号：４２）。

【図5】図５はｐＭＯＲＰＨ^(R)Ｘ９＿ＭＯＲ０３９２９＿ＦＨ発現ベクター（配列番号：４３）のＤＮＡ配列の例を提供する。

【図6】図６はＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ特異抗体ＭＡＢ１００６を用いるＦＡＣＳ解析によって決定される、ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファの発現レベルを提供する。ＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１（実線）がＣＨＯ−Ｋ１（点線）との比較して示される。ｘ軸はＦＬ２チャネルで測定された相対蛍光値（ＲＦＬ）を示し、ｙ軸は細胞数を表す。

【0034】

発明の詳細な説明
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な、または高い親和性を持ち、一つ以上のほかの新しい特性を持つ新しい抗体の発見に基づく。好ましくは、本発明の一つの抗体は被験者に治療上の利益をもたらすことができる。ヒトのまたはヒト化してよい本発明の抗体を、本明細書でより十分に説明する多くの状況で使用できる。

【0035】

「ヒト」抗体または機能性ヒト抗体フラグメントを本明細書では、キメラ（例えば「ヒト化」ではない）ではなく、非ヒト種から（全体または一部分のいずれも）ではないものとして定義する。ヒト抗体または機能性抗体フラグメントはヒトから得られるか、あるいは合成ヒト抗体であってもよい。「合成ヒト抗体」は本明細書では全体または一部において、既知のヒト抗体配列の解析に基づく合成配列からコンピュータ内で得られた配列を持つ抗体として定義する。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのコンピュータ内設計は、例えばヒト抗体または抗体フラグメント配列のデータベースを解析することによって、またそこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することにより達成できる。ヒト抗体または機能性抗体フラグメントの別の例は、ヒト由来の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされたものである（すなわち、ヒトの天然ソースから採取された抗体に基づくライブラリー）。

【0036】

「ヒト化抗体」または機能性ヒト化抗体フラグメントは本明細書では、（ｉ）抗体がヒト生殖細胞配列に基づく、非ヒトソース由来（例えば、異種免疫系を持つトランスジェニックマウス）のもの、（ｉｉ）可変領域が非ヒト由来から得られ、定常領域がヒト由来か
ら得られる、キメラのもの、または（ｉｉｉ）一つ以上の可変領域の骨格がヒト由来で一方、可変領域のＣＤＲが非ヒト由来であり、定常領域（もしあれば）がヒト由来である、ＣＤＲグラフトとして定義される。

【0037】

結合特異性は絶対的なものではなく、相対的な特性であるため、本明細書では、抗体が「特異的に結合する」は、抗体（ここではＧＭ−ＣＳＦ）「に特異的である／に対して特異的な」または抗体を「特異的に認識する」ことになるのは、もしそのような抗体がそのような抗原と一つ以上の対照抗体を識別できる場合である。その最も一般的な形態において（そして定義された文献に言及されていない場合）、「特異的結合」は、例えば、以下の方法のうちの一つに従って決定されるような、目的の抗原と関係のない抗原を識別できるような抗体の能力を指す。そのような方法には、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ＥＣＬ法、ＩＲＭＡ法、およびペプチドスキャン法が含まれるがこれに限定されない。例えば、スタンダードＥＬＩＳＡアッセイを用いてもよい。スコアリングは標準の発色法によって行われてもよい（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体と、過酸化水素を加えたテトラメチルベンジジン）。特定のウェル内での反応を、例えば４５０ｎｍなどの光学的濃度によってスコアリングする。標準的なバックグラウンド（＝陰性反応）は０．１ＯＤであってもよく、標準的な陽性反応は１ＯＤであってもよい。これは陽性と陰性の差が１０倍以上でありうることを意味する。一般的に、単一の対照抗原ではなく、粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリン、または同様のものなど、約３〜５つの関連しない抗原結合特異性の測定を行う。

【0038】

しかし、「特異的結合」はまた、標的抗原と一つ以上の密接に関連する抗原を識別するような抗体の能力を指してもよく、例えばＧＭ−ＣＳＦとＩＬ３、ＩＬ５、ＩＬ−４、ＩＬ１３、またはＭ−ＣＳＦの間の対照点として使用される。さらに、「特異的結合」はその標的抗原の異なる部位、例えばＧＭ−ＣＳＦの異なる領域または部位を、または一つ以上の鍵となるアミノ酸残基またはＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸残基のヒト配列を識別するような抗体の能力に関連してよい。

【0039】

また、本明細書で用いるように、ここでの「免疫グロブリン」（Ｉｇ）はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤのクラス（またはそれらのサブクラス）に属するタンパク質として定義され、従来より知られる全ての抗体とそれらの機能性フラグメントを含む。ここでの抗体／免疫グロブリンの「機能性フラグメント」は、抗原結合領域を持つ抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えばＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は一般的に抗体の一つ以上の超可変領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域内に認められるが、可変領域の「フレームワーク」領域もまた、ＣＤＲ領域に骨格を与えることなどによって抗原結合において重要な働きをする。好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくともアミノ酸残基４番目から１０３番目の軽鎖可変領域（ＶＬ）と５番目から１０９番目の重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、より好ましくは アミノ酸残基３番目から１０７番目のＶＬと４番目から１１１番目のＶＨ、特に好ましいのは完全なＶＬとＶＨである（アミノ酸位置が１番目から１０９番目のＶＬと１番目から１１３番目のＶＨであり、ＷＯ ９７／０８３２０に従って番号を付けている）。本発明での使用のために好ましいクラスの免疫グロブリンはＩｇＧである。本発明の「機能性フラグメント」は、一つの重鎖可変領域または一つの軽鎖可変領域などの、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、または単一の免疫グロブリン可変領域または単一のドメイン抗体ポリペプチドを含む構造物のドメインを含む。Ｆ（ａｂ’）_２またはＦａｂは、Ｃ_ＨＩとＣ_Ｌドメインの間に起こる分子間ジスルフィド結合を最小化する、または完全に除去するために作製されてよい。

【0040】

本発明の抗体は、コンピュータ内で設計され、合成的に作製された核酸によってコードされたアミノ酸配列に基づく組換え抗体ライブラリーから得てもよい。抗体配列のコンピ
ュータ内設計は、例えばヒトの配列のデータベースを解析することにより、またそこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することにより達成される。コンピュータ内で作成された配列を設計し得るための方法は、例えばＫｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：５７； Ｋｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００１）２５４：６７；および米国特許番号第６，３００，０６４号 Ｋｎａｐｐｉｋらにおいて記述され、これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0041】

本発明の抗体
本明細書を通して、以下の本発明の代表的な抗体に対して言及される。「ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｏｓ．」または「ＭＯＲ」０３６８４、０４２５１、０３９２９、０４２５２、０４２８７、０４２９０、０４３０２、０４３５０、０４３５４、０４３５７、０３６８２、０４２８３、０４２９７、および０４３４２。ＭＯＲ０３６８４は、配列番号：１（ＤＮＡ）／配列番号：１１（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２１（ＤＮＡ）／配列番号：３１（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４２５１は、配列番号：２（ＤＮＡ）／配列番号：１２（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２２（ＤＮＡ）／配列番号：３２（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０３９２９は、配列番号：３（ＤＮＡ）／配列番号：１３（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２３（ＤＮＡ）／配列番号：３３（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４２５２は、配列番号：４（ＤＮＡ）／配列番号：１４（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２４（ＤＮＡ）／配列番号：３４（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。

【0042】

ＭＯＲ０４２８７は、配列番号：５（ＤＮＡ）／配列番号：１５（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２５（ＤＮＡ）／配列番号：３５（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４２９０は、配列番号：６（ＤＮＡ）／配列番号：１６（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２６（ＤＮＡ）／配列番号：３６（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４３０２は、配列番号：７（ＤＮＡ）／配列番号：１７（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２７（ＤＮＡ）／配列番号：３７（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４３５０は、配列番号：８（ＤＮＡ）／配列番号：１８（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２８（ＤＮＡ）／配列番号：３８（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４３５４は、配列番号：９（ＤＮＡ）／配列番号：１９（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：２９（ＤＮＡ）／配列番号：３９（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４３５７は、配列番号：１０または４８（ＤＮＡ）／配列番号：２０（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：３０または５７（ＤＮＡ）／配列番号：４０（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０３６８２は、配列番号：４４（ＤＮＡ）／配列番号：４９（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：５３（ＤＮＡ）／配列番号：５８（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４２８３は、配列番号：４５（ＤＮＡ）／配列番号：５０（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：５４（ＤＮＡ）／配列番号：５９（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４２９７は、配列番号：４６（ＤＮＡ）／配列番号：５１（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：５５（ＤＮＡ）／配列番号：６０（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。ＭＯＲ０４３４２は、配列番号：４７（ＤＮＡ）／配列番号：５２（タンパク質）に対応する重鎖可変領域領域と、配列番号：５６（ＤＮＡ）／配列番号：６１（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域を持つ抗体を表す。

【0043】

一つの態様では、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合できる、またはＧＭ−ＣＳＦに高い親和性を持つ抗原結合領域を持つ抗体を提供する。もし親和性測定が少なくとも１００ｎＭ（Ｆａｂフラグメントの一価結合）の場合、抗体は抗原に対して「高親和性」を持つと言われている。発明の抗体または抗原結合領域は、好ましくはＧＭ−ＣＳＦと約１００ｎＭ未満、より好ましくは約６０ｎＭ未満、さらにより好ましくは約３０ｎＭ未満の親和性で結合できる。さらに好ましいのは、約１０ｎＭ未満、より好ましくは約３ｎＭ未満でＧＭ−ＣＳＦに結合する抗体である。例えば、ＧＭ−ＣＳＦに対する本発明の抗体の親和性は約１０．０ｎＭまたは１ｐＭ（Ｆａｂフラグメントの一価結合）であってもよい。

【0044】

表１は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）と溶液平衡滴定（ＳＥＴ）解析によって測定されるような、本発明の代表的な抗体の親和性の概要を提供する。

【0045】

【表1】

表１を参照すると、ＭＯＲ０３６８４、０４２５１、０３９２９、０４２５２、０４３５７、０４２９０、０４３０２、０４３５０、および０４３５４の親和性は、固定化した組換えＧＭ−ＣＳＦにおける表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって測定された。ＭＯＲ０３６８４、０４２５１、０３９２９、０４２５２、０４３５７、０４２９０、０４３０２、０４３５０、および０４３５４のＦａｂ型は、約６４２０から７ｐＭの一価性結合の範囲を示す。

【0046】

Ｆａｂ型はまた液平衡滴定（ＳＥＴ）による親和性の測定にも使用された。表１の右側の欄は、この方法における約１６０００から０．４ｐＭの間のＭＯＲの結合活性を示す。本発明の抗体は、好ましくはヒトおよび少なくとも一つのほかの種と交差反応する種であり、これは齧歯動物または非ヒト霊長類であってもよい。非ヒト霊長類はアカゲザルであってもよい。齧歯動物はラットであってもよい。少なくとも１種の齧歯動物と交差反応性を示す抗体は、同じ抗体を用いた複数の動物種における生体内試験を実施する目的のために、例えば既知の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を超えるより優れた柔軟性や利点を提供できる。
好ましくは、本発明の抗体はＧＭ−ＣＳＦと結合できるだけでなく、ヒトＧＭ−ＣＳＦとＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体のアルファ鎖との結合を、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも１００％の程度で阻害できる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、０．５μｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦと２×１０^５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体のアルファ鎖との結合を、少なくとも５０％の程度で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖の濃度が、約２×１０^５個のＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞に発現させたヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖の濃度と同様である条件下と、発明的な抗体の濃度が約５μｇ／ｍｌである条件下で阻害できる。

【0047】

この点において、当業者は、規定レベルのＧＭ−ＣＳＦ受容体αを発現する様々な安定した細胞株を生成する目的で、ＧＭ−ＣＳＦ受容体αをコードしている適切な発現ベクターにＣＨＯ−Ｋ１細胞の集団をトランスフェクションすることにより、約２×１０^５個のＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞に発現させたものと同様の濃度にて、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体αを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を得られ、その後、安定した細胞株は実施例３Ｃにおいて本質的に記述されるようなプロトコールに従ってＧＭ−ＣＳＦ受容体α発現レベルを測定するために、ＦＡＣＳ解析にて解析され、約２×１０^５個のＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞に発現させたものと同様の濃度にてヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体αを発現する細胞株は、そのようなトランスフェクト細胞の中央蛍光値（ＭＦＬ）を実施例３Ｃにおいて説明されるＭＦＬ値と比較することによって特定される。本明細書で使用されているように、実施例３Ｃにおいて説明されるように、もしトランスフェクト細胞株のＭＦＬ値が２倍の係数より大きい程度で、ＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞に対するＭＦＬ値から偏位しない場合、細胞株は約２×１０^５個のＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞に発現させたものと「同様」の濃度にてＧＭ−ＣＳＦ受容体αを発現しているものと定義される。

【0048】

さらに、本発明の抗体は、対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／またはＭＡＢ２１５より低いＩＣ_５０値を持ち、好ましくは少なくとも５倍低いＩＣ_５０値、より好ましくは対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／またはＭＡＢ２１５より少なくとも１０倍低いＩＣ_５０値、より好ましくは対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／またはＭＡＢ２１５より少なくとも１５倍低いＩＣ_５０値、より好ましくは対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／またはＭＡＢ２１５の２０倍低いＩＣ_５０値、より好ましくは対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／またはＭＡＢ２１５より３０倍低いＩＣ_５０値、より好ましくは対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／またはＭＡＢ２１５より５０倍低いＩＣ_５０値、より好ましくは対照抗体ＢＶＤ２−２１Ｃ１１および／またはＭＡＢ２１５より１００倍低いＩＣ_５０値、および最も好ましくは対照抗体ＢＶＤ２−２１ ＣＩ １および／またはＭＡＢ２１５より１２０倍低いＩＣ_５０値を持つＴＦ−１増殖アッセイにおいてヒトＧＭ−ＣＳＦを中和できる。

【0049】

ペプチド変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）
本発明の抗体はここで開示された特定のペプチド配列に限らない。むしろ、ポリペプチドの変異体も含む。当該開示内容、従来技術および参考文献を参照して、熟練労働者はここで開示された機能的な抗体の変異体を準備、テストおよび活用できると同時に、前記変異体も本発明の範囲内であることを理解する。この文脈において、「ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦ受容体のアルファ鎖との相互作用をブロックする能力」は、本発明の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体で説明された機能的特性を意味する。

【0050】

変異体は、例えば、少なくとも１つの変更相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変性）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変性）、およびここに開示されたペプチド配列に対する領域／位置を有する抗体を含む。この概念をより良く示す為に、抗体構造の簡単な記述を続ける。

【0051】

抗体は、２種のペプチド鎖からなり、それぞれ１つ（軽鎖）または３つ（重鎖）の連続領域および可変領域（ＶＬ、ＶＨ）を含み、後者はそれぞれの場合において４つのＦＲ領域と３つの空間ＣＤＲからなる。抗原結合部位は１つ以上のＣＤＲから形成され、前記ＦＲ領域は前記ＣＤＲの構造的フレームワークを提供するとともに、抗原結合部位において重要な役割を持つ。ＣＤＲまたはＦＲ領域における１つ以上のアミノ酸残基を変更することで、前記熟練労働者は日常的に、抗原に対してスクリーニング可能な変異性または多様性の抗体配列を新規かまたは改良された特性に関して、生成することが可能となる。

【0052】

表２ａ（ＶＨ）および２ｂ（ＶＬ）は本発明の特定の抗体に対するＣＤＲおよびＦＲ領域を描写し、それぞれの所定位置でのアミノ酸と対応コンセンサスまたは「マスター遺伝子」配列とを比較している（米国特許番号第６，３００，０６４号に開示）

【0053】

【表2】

【0054】

【表3】

【0055】

【表4】

【0056】

【表5】

もともとのＨｕＣＡＬ^(R) （完全ヒトモノクローナル抗体作製技術）マスター遺伝子は真正のＮ末端アミノ酸配列で構成されており、例えば、ＶＬラムダ３は１および２の位置でアミノさん「ＳＹ」を、ＶＨ３は１の位置でアミノ酸「Ｅ」を含む。ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R)ライブラリーを含むＨｕＣＡＬ^(R)抗原結合フラグメントライブラリーの構成中、最初の２種のアミノ酸はＶＬラムダ鎖で「ＤＩ」に変化し、その２種のアミノ酸はＶＨ３鎖で「Ｑ」に変化する。

【0057】

熟練労働者は表２ａおよび２ｂのデータを利用し、本発明の範囲内でペプチド変異体を設計できる。変異体は、１つ以上のＣＤＲ領域内にあるアミノ酸を変えることで構成されることが好ましく、変異体は１つ以上の変更フレームワーク領域も有する。新規抗体を互いに比較したものを参照して、変更可能な候補残基には、ＭＯＲ０４２５１の例えば可変性軽鎖の残基２７または５１および例えば可変性重鎖の残基３２または５６を含むが、これらが互いに向かい合う変化の位置だからである。変更（alteration）もフレームワーク領域内で発生する。例えば、ペプチドＦＲ領域は、生殖細胞系配列と比較して、残基内に異常が見られる場所で変更されるかもしれない。

【0058】

新規抗体と対応コンセンサスまたは「マスター遺伝子」配列とを比較したものを参照して、変化可能な候補残基は、例えば、ＶＬＸ３と比較したＭＯＲ０４２５１の可変性軽鎖の残基２７、５０または９０、およびＶＨ３と比較したＭＯＲ０４２５１の可変性重鎖の３３、５２または９６を含む。代わりになるべきものとして、熟練労働者は本明細書で開示された前記アミノ酸配列とそのような抗体の同クラスの公知配列を比較し、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋらによって開示された手順（２０００）とＫｎａｐｐｉｋらに付与された米国特許番号第６，３００，０６４号を利用することで、同じ分析ができる。

【0059】

さらに、ＭＯＲ内の１つ以上のアミノ酸残基、好ましくは１つ以上のＣＤＲ内にあるアミノ酸残基を多様化させることで最適化する為の原点として１つのＭＯＲを利用し、そして改良特性を有する変異体に関して抗体変異体の結果として生じるコレクションをスクリーニングして、変異体を得てよい。特に、ＶＬのＣＤＲ−３、ＶＨのＣＤＲ−３、ＶＬのＣＤＲ−１および／またはＶＨのＣＤＲ−２で１つ以上のアミノ酸残基の多様化が好ましい。トリヌクレオチド突然変異誘発法（ＴＲＩＭ）技術（Ｖｉｍｅｋａｓら、１９９４）を利用したＤＮＡ分子コレクションを合成することで、多様化が可能となる。

【0060】

保存アミノ酸変異体
ポリペプチド変異体は、本明細書で開示される全ての抗体ペプチド配列の分子構造を保存するよう構成される。各アミノ酸の特性を考慮にいれると、いくつかの合理的な代用は前記熟練労働者に認識される。アミノ酸の代用、すなわち「保存代用」が、例えば、極性、電荷、溶解度、疎水性、および／または関係する前記残基の両親媒性の特性における類似性を基本にして、製造される。

【0061】

例えば、（ａ）無極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み、（ｂ）中性極性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み、（ｃ）正荷電（基本）アミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジンを含み、（ｄ）負荷電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。一般に、グループ（ａ）−（ｄ）内で置換してよい。さらに、グリシンおよびプロリンは、α−ヘリックスを分裂させる能力に基づいて別のものと置換してよい。 同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリシンなどの特定のアミノ酸は、α−ヘリックス内でより一般的に見られ、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンはより一般的にβ−プリーテッドシート（pleated sheet）で、より一般的に見られる。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびプロリンは一般的に間欠的に（in turns）見られる。いくつかの好ましい置換は、以下のグループ内で構成される：（ｉ）ＳとＴ、（ｉｉ）ＰとＧおよび（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。周知の遺伝子コード、組換えＤＮＡおよび合成ＤＮＡ技術を考慮すると、熟練科学者は容易にＤＮＡコードおよび保存アミノ酸変異体を構成できる。

【0062】

本明細書で使用される、２種のポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間で同一のアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列相同性」は、同一であるかまたは保存アミノ酸置換を表すアミノ酸パーセンテージを示す。本発明の好ましいポリペプチド配列は、ＣＤＲ領域で少なくとも６０％の配列同一性を有するが、さらに好ましいのは７０％または８０％であればさらに好ましく、９０％であればそれよりさらに好ましく、９５％であれば最良である。抗体もＣＤＲ領域で少なくとも８０％の配列相同性を有することが好ましく、９０％であればさらに好ましく、９５％であれば最良である。

【0063】

本発明のＤＮＡ分子
本発明は本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子にも関する。該配列は、図１ａおよび２ａに示されるＤＮＡ分子を含むがこれに限らない。

【0064】

本発明のＤＮＡ分子は、本明細書で開示された前記配列に限らないが、変異体を含み、本発明におけるＤＮＡ変異体はハイブリダイゼーションの物理的特性を参照にして開示される。熟練労働者は、ＤＮＡを用いてその相補体を同定することができ、そしてＤＮＡが二本鎖であるから、均等物または相同物を、核酸ハイブリダイゼーション技術を利用して識別するためにＤＮＡが用いられることを認識する。ハイブリダイゼーションは、１００％以下の相補性で起こり得ることも認識される。しかし、条件の適切な選択を考慮すれば、ハイブリタイゼーション技術は構造的関連性に基づくＤＮＡ配列と特定のＤＮＡプローブを区別するために利用される。前記条件に関しての手引きとして、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）分子クローン：実験室マニュアル，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＵＳＡ）およびＡｕｓｕｂｅｒｌら、１９９５年 （Ａｕｓｕｂｅｒｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．およびＳｔｒｕｈｌ，Ｋ．編集（１９９５）．分子生物学における現代のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙと息子達）を参照されたい。

【0065】

２種のポリヌクレオチド配列間の構造的類似性は、２種の配列を互いに交雑させる条件の「ストリンジェンシー」の機能性として発現される。ここで使用される用語「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーションを嫌う条件までの範囲を言及する。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションを強く嫌い、最も構造的に相関する分子だけが当該する条件で互いに交雑する。逆に言えば、非ストリンジェントな条件は構造的相関性が低い分子のハイブリダイゼーションを好む。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、よって、２種の核酸配列の構造的関係と直接相互に関係がある。以下の関係は、ハイブリダイゼーションと相関性の相互関係を示すのに有効である（Ｔ_ｍは二重核酸の融点である）：
ａ．Ｔ_ｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％
ｂ．二重ＤＮＡのＴ_ｍは、不適当な塩基対の数が１％増加する度に１℃減少する。
ｃ．（Ｔ_ｍ）_μ２−（Ｔ_ｍ）_μ１＝１８．５ ｌｏｇ_１０μ２／μｌ
μｌおよびμ２は、２つの溶液のイオン強度である。

【0066】

ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、多くの要因の１つの機能で、全体的なＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブの大きさ、および水素結合を妨害する薬剤を含む。ハイブリダイゼーションを促進する要因には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低い温度、長いプローブおよび水素結合を妨害する薬剤の不使用が含まれる。ハイブリダイゼーションは２段階にわたって行われる：「結合」過程と「洗浄」過程である。

【0067】

まず、結合過程において、プローブはハイブリダイゼーションを好む条件において的となるものに結合する。ストリンジェンシーは通常、温度調節によって、この段階で制御さ
れる。高ストリンジェンシーの場合、短い（＜２０ ｎｔ）オリゴヌクレオチドプローブが用いられない限り、温度は通常６５℃から７０℃の間である。典型的なハイブリダイゼーション溶液は、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および非特異的担体ＤＮＡ１００μｇを含む。Ａｕｓｕｂｅｌら、２．９節、別冊２７（１９９４）参照。当然ながら、異なるところも多いが、機能性では同等であり、緩衝条件は周知である。相関性の程度が低い場所では、低温で設定される。低ストリンジェンシー結合温度は約２５℃から４０℃である。中ストリンジェンシーは少なくとも約４０℃から６５℃より低い。高ストリンジェンシーは少なくとも約６５℃である。

【0068】

第二に、超過のプローブは洗浄により除去される。よりストリンジェントな条件が通用適用されるのは、この段階である。それゆえに、ハイブリダイゼーションを通して相関性を定めるのに最も重要なのはこの「洗浄」過程である。洗浄溶液は一般的に低い塩濃度を有する。１つの実験的中ストリンジェンシー溶液は２Ｘ ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含む。高ストリンジェンシー溶液は、約０．２Ｘ ＳＳＣ以下と等量（イオン強度において）を含み、好ましいストリンジェント溶液は約０．１Ｘ ＳＳＣを含む。異なるストリンジェンシーと関連する温度は、「結合」過程で説明した温度と同等である。洗浄溶液は一般的に洗浄過程中に何度も取り替え可能である。例えば、一般的な高ストリンジェンシー洗浄条件は、５５℃で３０分の洗浄を２回、および６０℃で１５分の洗浄を３回が含まれる。

【0069】

よって、本発明は、高ストリンジェンシー結合および洗浄の条件下で図１ａおよび２ａで示された分子を交雑する核酸分子を含み、但し、該核酸は、本明細書で開示された特性を有する抗体または機能性フラグメントをコードする。好ましい分子（ｍＲＮＡパースペクティブから）は、本明細書に明記されるＤＮＡ分子の１つと、少なくとも７５％または８０％（好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、９５％が最良）の配列相同性または同一性を持つ。

【0070】

機能性同一変異体
本明細書に記載されるＤＮＡ分子の変異体はいくつかの異なる方法で構成されることが認識される。例えば、完全合成ＤＮＡとして構成されてよい。効果的に２０から約１５０までのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを合成する方法は、多様にある。Ａｕｓｕｂｅｌら、２．１１節、別冊２１参照（１９９３）。部分的に一致するオリゴヌクレオチドは、Ｋｈｏｒａｎａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７２：２０９−２１７（１９７１）の報告によれば、一応合成され、組み立てられる。Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｕｐｒａ、８．２節も参照。合成ＤＮＡは、適切なベクターにクローンを促進するために遺伝子の５’および３’末端で作り変えられた適切な制限領域を伴って設計されることが望ましい。

【0071】

示されている通り、変異体を生成する方法は本明細書に開示されるＤＮＡの１つから始まり、部位特異的突然変異誘発法を実施する。Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｕｐｒａ、第８章、別冊３７参照。典型的な方法には、対象となるＤＮＡを一重鎖ＤＮＡバクテリフォージ媒体にクローン化する。一重鎖ＤＮＡは、単離し、望ましいヌクレオチド変更物（alterations）を含むオリゴヌクレオチドと交雑する。相補鎖は交雑し、二重鎖ファージは宿主に
結合する。結果生じた子孫はＤＮＡ配列を利用して確認できる望ましい突然変異体（mutant）を有する。さらに、子孫ファージが望ましい変異体（mutant）になる可能性を高める多様な方法がある。これらの方法は当該分野に従事する者にとって周知であり、このような変異体（mutants）を生成するキットは商業的に入手可能である。

【0072】

組換えＤＮＡ構築物と発現
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列を１つ以上含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明の組換えＤＮＡ構築物は、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウィ
ルスベクターなどのベクターとの関連で使用され、そこに本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子を挿入する。

【0073】

コードされた遺伝子はＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９年に開示された技術によって生成されてよい。代わりになるべきものとして、ＤＮＡ配列はシンセサイザーなどを利用して科学的に交雑されてよい。オリゴヌクレオチド合成（ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）（１９８４、Ｇａｉｔ，編集、ＩＲＬプレス、オックスフォード）を参照、および開示内容はここで引用され援用される。本発明の組換え構築物は、コードされたＤＮＡのＲＮＡおよび／またはタンパク質生成物を発現することが可能な発現ベクターを含む。前記ベクターはさらに、読み取り枠（ＯＲＦ）に接続されたプロモーターを含む調節配列からなってよい。前記ベクターはさらに、選択可能なマーカー配列からなってよい。特定の開始シグナルおよび細菌分泌シグナルが、挿入された遺伝子コード配列を効果的に翻訳するのに必要となるかもしれない。

【0074】

本発明はさらに、本発明のＤＮＡを少なくとも１つ含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は実質的に発現ベクターが可能であるどの細胞にもなり得る。例えば、哺乳類細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主細胞、または細菌細胞などの原核細胞である。前記組換え構築物の前記宿主細胞への導入は、リン酸カルシウム移入、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介移入、エレクトロポレーションまたはファージ感染によって影響を受けることもある。

【0075】

細菌発現
細菌の使用に有効な発現ベクターは、望ましいタンパク質をコードした構造的ＤＮＡ配列を適切な翻訳開始シグナルおよびターミネーションシグナルとともに、機能性プロモーターと作動可能なリーディングフェーズにおいて挿入することで構築される。前記ベクターは、１つ以上の表現型選択可能マーカーおよび複製オリジンからなり、前記ベクターを維持し、望ましくは、宿主内での増幅を提供する。形質転換に適した原核性の宿主は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌およびシュードモナス菌、ストレプトミセス菌およびブドウ球菌属内の多様種を含む。

【0076】

細菌のベクターは、例えば、バクテリオファージ、プラスミドであってよく、あるいはファージミドに基づいてよい。これらのベクターは、選択可能なマーカーおよび公知のクローンベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）を有する商業的に入手可能なプラスミド由来の細菌の複製オリジンを含み得る。適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞密度への成長の後、選択可能なプロモーターは適切な手段（例：温度変換または化学的誘発）によって脱抑圧／誘発され、細胞は付加期間培養される。細胞は一般的に遠心分離で培養され、物理的または科学的手段で分裂し、その結果生成された未加工の抽出物はさらなる精製のため保管される。

【0077】

細菌システムにおいて、発現ベクターの多くは、タンパク質を発現する用途をもとに都合よく選択してよい。例えば、抗体の生成またはペプチドライブラリーの選り分けのために大量のタンパク質が生成される場合、容易に精製される融合タンパク質生成物の高いレベルの発現を指示するベクターが望ましいかもしれない。

【0078】

療法
療法は、治療効果のある量の本発明に含まれる抗体を、治療を必要とする対象に投与することを含む。ここでの「治療効果のある」量は、ＧＭ−ＣＳＦと、対象物の治療部位における受容体との間の相互作用を、一用量または複用量摂生に従って、単体でまたは他の製剤との組み合わせで、効果的にブロックするに十分な量と定義され、副作用を緩和しながらも、当該量は毒性学的に許容し得る。対象物は、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、ラットまたはアカゲザル）でよい。

【0079】

本発明の抗体は公知の製剤と併用されるかもしれず、いくつかの場合においては、その抗体自体が修正されるかもしれない。例えば、抗体は効力をさらに高める為に、抗毒素または放射性同意元素に共役される。

【0080】

発明の抗体は、ＧＭ−ＣＳＦは望まれずに発現または発見された多様な状況において、治療または診断ツールとして使用される。本発明の抗体を利用した治療に特に適する疾患および状態は、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、乾癬、喘息、アトピー性皮膚炎またはショックなどの炎症性疾患である。

【0081】

前述の疾患を治療するには、本発明に従った医薬組成物が１つ以上の生理的に許容し得る担体または賦形剤を使用した従来の方法で処方される。本発明の抗体は、治療される疾患の種類によって多岐にわたる適切な手段を用いて投与される。可能性のある投与経路は、非経口的（筋肉の、静脈内の、動脈内の、腹膜内の、または皮下の）、肺内および鼻腔内、そして部位免疫抑制治療を望む場合、病巣内投与が含まれる。さらに、本発明の抗体は抗体の用量を減らし脈に注入して投与してもよい。投薬が急性か慢性かによるが、注射により与えられた投薬が好ましいが、静脈または皮下注射が最も好ましい。投与される量は、臨床的症状、個人の体重、その他薬剤の服用があるかなどの要因に左右される。熟練労働者は、投薬経路が治療される疾患または症状によって異なることを理解する。

【0082】

新規ポリペプチドの治療効果量を本発明に従い決定するには、特に患者の体質、投薬経路および地用される疾患の特質に大きく左右される。一般的な手引きは、例えば調和化に関する国際会議（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ）の出版物またはＲＥＭＩＮＧＳＴＯＮの薬剤学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）２７章および２８
章、４８４〜５２８ページ（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編集、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９９０）に掲載されている。詳細には、治療効果量の決定には、製剤の毒性および効力等の要因にも左右される。毒性は当該技術および前述参照で公知の方法を用いて決定される。効力は、下記の例で解説される方法に関連した同じ手引きを利用して決定される。

【0083】

診断方法
ＧＭ−ＣＳＦは、リンパ球、単球、内皮細胞、繊維芽細胞およびいくつかの悪性細胞を含む多様な細胞によって発現するため、本発明の非ＧＭ−ＣＳＦ抗体は患者の異なる組織内でＧＭ−ＣＳＦの蓄積部位を投影または視覚化するために適用される。これに関し、放射線同位元素、アフィニティーラベル（ビオチン、アビジンなど）、蛍光ラベル、常磁性原子などの使用により、抗体は検知可能となり分類される。分類手順は当該技術においては公知である。画像診断における抗体の臨床的使用は、Ｇｒｏｓｓｍａｎ， Ｈ． Ｂ．，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ．１３：４６５−４７４（１９８６）），
Ｕｎｇｅｒ，Ｅ．Ｃ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２０：６９３−７００（１９８５）），および、Ｋｈａｗ，Ｂ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：２９５−２９７（１９８０）） により見直される。
検知可能で分類された抗体の病巣の検知は、例えば炎症部位から予測可能である。１つの実施態様において、組織または血液のサンプルを採取し、検知可能で分類された抗体内で前記サンプルを培養する実験が行われる。好ましい実施態様は、当該技術が、磁気画像、蛍光関節撮影法など非侵襲性の方法で実施される。そのような診断テストは、ＧＭ−ＣＳＦの存在または欠如が関連指標である疾患治療の結果を監視することで適用される。本発明は、ここで説明されている生体外での診断において、非ＧＭ−ＣＳＦ抗体の使用も考慮に入れる。

【0084】

治療および診断のための組成物
本発明の抗体は、薬剤学的に有効な組成物を準備する公知の方法に従い処方され、本発明の抗体（機能性フラグメントを含む）は薬剤学的に許容し得る担体との組み合わせで結合される。適切な媒体およびそれらの製剤は、例えばＲＥＭＩＮＧＳＴＯＮの薬剤学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編集、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９９０）で解説されている。効果的な投与に最適で薬剤学的に許容し得る組成物を形成するために、当該組成物は、適切な担体と共に、本発明の１つ以上の抗体の効果的な用量を含む。

【0085】

活性化合物を制御放出するために、製剤が適切に処方される。制御放出準備は非ＧＭ−ＣＳＦ抗体を合成または吸収するためにポリマーを使用して実施される。制御放出は、放出を制御するために、適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プロタミン、硫酸塩）、高分子の濃縮および結合方法を選択することで実施される。制御放出製剤による運動期間を制御する別の方法には、非ＧＭ−ＣＳＦ抗体を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリマー（乳酸）、エチレン酢酸ビニル共重合体などの重合体に、結合する。代わりになるべきものとして、これらの製剤を重合体粒子に結合する以外に、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリマーメタクリル酸メチルマイクロカプセルをそれぞれ、またはコロイド状薬物送達システムにおいては例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルまたはマクロエマルジョンによって、製剤を準備されたマイクロカプセルに閉じ込めることも可能である。このような技術はＲｅｍｉｎｇｓｔｏｎの薬剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８０）に開示されている。

【0086】

上記化合物は例えばボーラス注入法または持続注入などの注射によって非経口的投与用に処方される。注入（injection）用の製剤は、アンプル、または複数回の投与のためのコンテナに防腐剤を加えた剤形で提供される。上記組成物は、油性または水生媒体の懸濁剤、液剤または乳濁液の形で構成されてよく、そして、懸濁剤、分解防止剤および／または分散剤などの処方されうる製剤を含んでよい。代わりになるべきものとして、活性成分は、例えば無菌で発熱源のない水などの適切な媒体と構成されるために使用前は、パウダー状になっていてよい。

【0087】

望ましくは、前記組成物はパックまたはディスペンサー装置で提供され、活性成分を有する１つ以上の剤形を含む。パックには、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックのホイルが含まれてもよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与に関する説明とともに使用される。

【0088】

本発明はさらに、本発明に限ることなく説明する以下の実施例を参照して理解される。

【0089】

実施例
実施例１：ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R)ライブラリーからのヒトＧＭ−ＣＳＦ特異性抗体
の生成
Ａ．ファージの増殖および精製
ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R)ライブラリーは、クロラムフェニコールを３４μｇ／ｍｌお
よびブドウ糖１％を含む２ｘＹＴ培地内で増殖させた（２ｘＹＴ−ＣＧ）。０．５のＯＤ_６００における（振動を与えずに３７℃で３０分、２５０ｒｐｍで振動させ３７℃で３０分）補助ファージ感染（ＶＣＳＭ１３）後、細胞を遠沈し（４１２０ｇ、５分、４℃）２
ｘＹＴ／３４μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌ、カナマイシン／０．２５ｍＭ ＩＰＴＧ、そして２２℃で一晩増殖させた。ファージは、上清からＰＥＧ沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセロールに再懸濁し、−８０℃で保管した。パニングラウンド感におけるファージの増殖は、以下のように実施された：対数中期段階の大腸菌ＴＧ１細胞は、溶離したファージを感染させ、ブドウ糖１％とクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを追加したＬＢ寒天で培養した。３０℃で一晩培養した後、コロニーを破片にし、０．５のＯＤ_{６００ｎｍ}になるまで２ｘＹＴ−ＣＧを接種するために使用し、前述のとおり補助ファージが加えられた。

【0090】

Ｂ．ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R)とパニング
ヒトＧＭ−ＣＳＦを認識する抗体の選択には、いくつかのパニング戦略が適用された。概要は、ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R)抗体−ファージを異なるＶＨマスター遺伝子を含む３つのプールに分割した。これらのプールは個々に、ａ）３ラウンドの固相支持体としてニュートラアビジン社のコーティングされた９６ウェルプレートに直接コーティングされたビオチン化ヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質（ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製造）上の固相パニングまたはｂ）３ラウンドのためにＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，ノルウェー オスロー）をコーティングしたストレプトアビジン上に捕獲されたビオチン化ヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質上の溶液パニングに供した。

【0091】

詳細には、不動となったビオチン化ＧＭ−ＣＳＦをパニングするため、ニュートラビジン社のプレートのウエルを３００μｌ ＰＢＳで洗浄した。抗原はＰＢＳで３μｇ／ｍｌ （２００ｎＭ）で薄め、そして各ウェルあたり０．１ｍｌを室温で２時間でコーティングした。３００μｌ ＰＢＳで２回の洗浄ステップの後、ウェルは１対１で薄められた２ｘ Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（ケミコ・インターナショナル社 カリフォルニア州、テメキュア）を含むブロッキングバッファーとインキュベートされた。

【0092】

選択の後、１００μｌのＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R)ファージは、０．４μｌ ２５％
Ｔｗｅｅｎ２０室温で３０分を含むブロッキングブッファー１００μｌに予め吸収させた。ブロックされたファージは、室温で３０分ニュートラビジン社プレートのウェルにｌ００μ１アリコートに移した。このステップは前吸収のために２度繰り返された。
コーティングされ、ブロックされたニュートラアビジン社のマイクロタイタープレートの洗浄（２ｘ ３００μ１ ＰＢＳ）の後、予め吸収された０．１ｍｌのファージをコーティングされたウェルに加え、室温で１．５時間インキュベートして静かに振動させた。このインキュベートに続いて、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０での室温における１０回の洗浄後、が実施された。

【0093】

バウンドファージはウエルあたり１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０中の２０ｍＭ ＤＴＴを１２０μｌ加えることで溶離された。溶離液は取り除かれ、１４ ｍｌの大腸菌ＴＧＩに加えられＯＤ_{６００ｎｍ} ｏｆ ０．６−０．８に増殖させた。ウェルはさらに２００μｌ ＰＢＳで洗浄され、この溶液もＴＧ１細胞に加えられた。大腸菌のファージ感染は振動せずに３７℃で４５分行った。追加で、０．６−０．８のＯＤ_{６００ｎｍ} に成長した２００μｌの細胞を、振動なしで３７℃で４５分間かけて選択ウェルに加えた。このＴＧ−Ｉ細胞は、第一溶離ステップからのファージを含む１４ｍｌの培養液に加えられる。５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後、細菌性のペレットはそれぞれ５００μ１ ２ｘＹＴ培地に再懸濁され、２ｘＹＴ−ＣＧ寒天プレート上で培養され、３０℃で一晩インキュベートされた。コロニーは、その後、プレートから除去され、ファージは前述の通り増殖および精製された。

【0094】

選択の第二および第三ラウンドは選択の第一ラウンドと同じ方法で実施されたが、ファージ結合後の洗浄条件がよりストリンジェントになるのが唯一の違いであった。さらに、選択の第三ラウンドでは、ファージは、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０； Ｄｙｎａｌ）上に追加の前吸着ステップを施される。エッペンドルフ型チューブは、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ溶液で室温で３０分のインキュベーションによりブロックされた。各ファージプール０．３ｍｌは０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む２ｘＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ溶液を１：１になるように混合され、ブロックされたエッペンドルフ型チューブ内で室温１時間インキュベートされ、５０μ１のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０が吸着作用の為３０分加えられた。ビーズは磁気装置（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｅ）を使って取り除かれた。ファージ１５０μｌの一部はニュートラアビジン社のプレートに第一および第二ラウンド同様移動された（上記参照）。

【0095】

ビオチン化ＧＭ−ＣＳを利用した溶液パニングでは、以下のプロトコルが適用された。１．５ｍｌのエッペンドルフ型チューブは、一晩かけて４℃でＰＢＳと１：１で薄められた１．５ｍｌの２ｘＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒでブロックされた。磁性ビーズ（Ｄｙｎａ−ｂｅａｄｓ Ｍ−２８０；Ｄｙｎａｌ）でコーティングされた２００μｌのストレプトアビジンは、２００μｌのＰＢＳで洗浄され２００μｌ ｌｘＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒに再懸濁された（１ｘ ＰＢＳで薄められた）。ビーズのブロッキングは、前ブロックチューブ内において４℃で一晩実施された。各パニング条件において５００μｌのＰＢＳで薄められたファージは、５００μｌ ２ｘＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／０．１％ Ｔｗｅｅｎと１時間室温で混合される（回転装置）。ファージの吸着は２度実施される：５０μｌのブロックされたストレプトアビジン磁性ビーズはブロックされたファージに加えられ、回転装置内室温で３０分間インキュベートされた。磁気装置（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｅ）を通してビーズの分離が終わると、ファージの上清（−１ｍｌ）は新しくブロックされたチューブに移動し、吸着が３０分間５０μｌのブロックされたビーズ上で繰り返された。その後、２００ｎＭのビオチン化ｈＧＭ−ＣＳＦが、新たにブロックされた１．５ｍｌのチューブ内でブロックされたファージに加えられ、回転装置内において室温１時間でインキュベートされた。ブロックされたストレプトアビジン磁性ビーズは各パニングファージプールに加えられ、回転装置内において室温１０分インキュベートされた。ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦに結合し、それによって磁性ビーズに流通停止したファージは、磁性粒子分離器（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｅ）で集められた。ビーズは、回転装置を利用したＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで７ｘ洗浄され、ＰＢＳで３度洗浄された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓからのファージの溶離は、３００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ中２０ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ８を各チューブに１０分間加えることで実施された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは磁性粒子分離器によって分離され、上清は０．６−０．８のＯＤ_{６００ｎｍ}に繁殖する大腸菌ＴＧ−１培養１４ｍ１に加えられた。

【0096】

５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離が終わると、細菌性のペレットは５００μｌ ２ｘＹＴ 培地で再懸濁され、２ｘＹＴ−ＣＧ 寒天プレートの上で培養され、一晩３０℃でインキュベートされた。コロニーはその後プレートから除去され、ファージは上記の通り増殖および精製された。

【0097】

ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦ上の溶液パニングの第一および第二ラウンドは、洗浄過程のストリンジェンシーが高まること以外は、第一ラウンドのプロトコルに従って実施された。Ｃ． 選択されたＦａｂフラグメントのサブクローニングと水溶性Ｆａｂフラグメントの 発現
選択されたＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R)ファージの挿入物をコードするＦａｂは発現ベクターｐＭＯＲＰＨ^(R)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ（図５）にサブクローン化され、水溶性Ｆａｂの急速発現を促進した。選択されたクローンのＤＮＡはＸｂａｌおよびＥｃｏＲＩにより消化し、それによりＦａｂコーディング挿入物（ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ）を切除し、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩにより消化したベクターｐＭＯＲＰＨ^(R)Ｘ９＿Ｆ
ａｂ＿ＦＨにクローン化した。これらのベクター内で発現するＦａｂは、検知および精製のため２つのＣ−末端タグ（それぞれＦＬＡＧ^ＴＭおよび６ｘＨｉｓ）を有した。

【0098】

Ｄ．大腸菌内のＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R) Ｆａｂ抗体のミクロ発現
ｐＭＯＲＰＨ^(R)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにサブクローニングされた後に獲得された単体コロ
ニーは、各ウェル１００μｌ ２ｘＴＹ／Ｃｍ／１％ Ｇｌｕ培地を有するウェルに植え付けるために使用されて３７℃で一晩成育させた。ＴＧ−１大腸菌培養の５μｌは１００μｌ ２ｘＴＹ／Ｃｍ／０．１％ Ｇｌｕ培地／ウェルを有する無菌性の９６−ウェルマイクロタイタープレートに移した。マイクロタイタープレートは、培養物が０．５のＯＤ_{６００ｎｍ}でわずかに混濁（２〜４時間）するまで、マイクロプレートシェイカーでこれらの発現プレートに、各ウェル２０μｌ ２ｘＹＴ／Ｃｍ／３ｍＭ ＩＰＴＧが加えられ（濃縮終了０．５ｍＭ ＩＰＴＧ）、気体透過性テープで密封され、４００ｒｐｍの振動で一晩３０℃に設定されインキュベートされた。

【0099】

全体細胞溶解物の生成（ＢＥＬ抽出物）
発現プレートの個々のウェルに、４０μ１ ＢＥＬ ｂｕｆｆｅｒ（２ｘＢＢＳ／ＥＤＴＡ：２４．７ｇ／ｌ ホウ酸， １８．７ｇ ＮａＣｌ／ｌ，１．４９ｇ ＥＤＴＡ／ｌ， ｐＨ８）が加えられたが、２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームが含まれ、マイクロタイタープレートシェーカで２２℃１時間（４００ ｒｐｍ）に設定されインキュベートされた。ＢＥＬ抽出物は、ＥＬＩＳＡまたはＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｍ−ｓｅｒｉｅｓ^(R) ３８
４ アナライザー（実施例２参照）による結合分析に利用された。

【0100】

Ｅ．大腸菌のＨｕＣＡＬ(R) ＧＯＬＤ Ｆａｂ抗体の発現と精製
ＴＧ−１ 細胞内で、ｐＭＯＲＰＨ(R)Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨによりコードされたＦａｂフ
ラグメントの発現は、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで補完された２ｘＹＴ 培地の１ １と培養するシェーカーフラスコ内で実施した。０．５ｍＭ ＩＰＴＧの導入後、細胞は１．６時間２２℃で増殖させた。細胞ペレットの全体細胞抽出物は、フレンチプレスまたはニッケル／ニトリオトリ酢酸クロマトグラフィーによって単離されたＦａｂフラグメントによって調合された（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）。濃縮は、紫外線光度法によって決定された（Ｋｒｅｂｓら、２００１）。

【0101】

実施例２：ｈＧＭ−ＣＳＦ特異性抗体の識別
ｈＧＭ−ＣＳＦ特異性のＦａｂをコードするクローンを識別するために、上述のパニング法によって選択された個々の大腸菌クローンのＢＥＬ抽出物を、ＥＬＩＳＡまたはＢｉｏ Ｖｅｒｉｓ（Ｂｉｏ Ｖｅｒｉｓ Ｍ−ｓｅｒｉｅｓ^(R)３８４Ａｎａｌｙｚｅｒ）に
よって分析した。

【0102】

Ａ．酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法
ヒト組換えビオチン化ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＰＢＳ中１．５μｇ／ｍｌで、室温で２時間ニュートラアビジン社マイクロタイタープレートにコーティングした。

【0103】

抗原のコーティング後、室温で１時間１％ＢＳＡを有するＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）でウェルをブロックした。ＰＢＳ−ＴＢＥＬ−抽出物でウェルを洗浄した後、精製したＨｕ−ＣＡＬ^(R)Ｆａｂまたは対照ＩｇＧをＰＢＳで希釈し、ウェルに追
加し、また室温で１時間インキュベートした。一次抗体を検出するために、以下の二次抗体、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）−共役アフィニティー精製Ｆ（ａｂ'）_２フラグメ
ント、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を適用した。ＡＰ−共役を検出するために、製造業者による取扱説明書に従って、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ）などの蛍光発生基質を使用した。全てのインキュベーションのステップの間に、マイクロタイタープレートのウェルをＰＢＳ−Ｔで３度、また二次抗体による最終インキュベーションの後で３度洗浄した。ＴＥＣＡＮＳｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーで蛍光を測定した。

【0104】

Ｂ．溶解物でのＧＭ−ＣＳＦ結合Ｆａｂを検出するための電気化学発光（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）ベースの結合分析
大腸菌溶解物（ＢＥＬ抽出物）でのＧＭ−ＣＳＦ結合Ｆａｂ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ実験に代わり、ＢｉｏＶｅｒｉｓＭ−ＳＥＲＩＥＳ(R)３８４ＡｎａｌｙｚｅｒＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｅｕｒｏｐｅ社、ウイットニー、オックスフォードシャー、英国）で結合を分析した。

【0105】

この目的を達成するために、ＢｉｏＶｅｒｉｓスクリーニング用に、アッセイバッファー（ＰＢＳ／０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ）で、少なくとも１：５０および最大で１：１０００にＢＥＬ抽出物を希釈した。０．１μｇ／ｍｌの濃度で、ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ）に結合した。９６のウェルまたは３８４ウェルプレートにつき、Ｄｙｎａｂｅａｄ原液の１：２５希釈の２５または１５μｌを使用した。ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦに加える前に、ビーズを室温で３０分間シェーカーでアッセイバッファーにより３度洗浄した。その後ビーズをアッセイバッファーにより３度洗浄し、未使用のアッセイバッファーで最終的に再懸濁した。ＢＶ−ｔａｇ^ＴＭ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｅｕｒｏｐｅ社、ウイットニー、オックスフォードシャー、英国）を使用して、抗ヒト（Ｆａｂ）'_２（Ｄｉａｎｏｖａ社）をルテニウム標識化した。使用直前に、６μ
ｇ／ｍｌの濃度でこの二次抗体をＧＭ−ＣＳＦ結合ビーズに加えた。Ｆａｂ抗体を含む大腸菌発現培養の希釈ＢＥＬ抽出物（上記参照）の１００μｌまたは６０μｌを９６のウェルまたは３８４ウェルプレートに満たし、各々、ＧＭ−ＣＳＦ結合ビーズとともに抗Ｆａｂ−ＢＶ−ｔａｇ^ＴＭ二次抗体混合の２５または１５μｌをそれぞれのウェルに加え、室温で２時間プレート振動装置でインキュベートした。Ｂｉｏ Ｖｅｒｉｓ Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ^(R)３８４Ａｎａｌｙｚｅｒでプレートを分析した。

【0106】

配列分析の後で、十分強力な結合を示す、七十四（７４）のユニーククローンを同定した（シグナル：ＥＬＩＳＡで１０：１またはＢｉｏ−Ｖｅｒｉｓで５０：１より大きな雑音比）。機能性アッセイで、これらのクローンを発現、精製および検査した。

【0107】

Ｃ．選択した抗ｈＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂの分子特異性および種交差反応性の決定
以下の検体、ラットおよびマウスＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＩＬ−３、ヒトＩＬ−４、ヒトＩＬ−５、ヒトＩＬ−１３、ヒトＭ−ＣＳＦ（全て英国、ロンドン、ペプロテック社から）に対して抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の交差反応性を決定した。

【0108】

表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、ウプサラ、スウエーデン）によって設定された捕獲でこれを実行した。

【0109】

標準ＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学反応を使用して、ＣＭ５ｃｈｉｐｓ（Ｂｉａｃｏｒｅ，スウェーデン）を、５０００−６０００ＲＵ抗Ｆ（ａｂ）_２（Ｄｉａｎｏｖａ社，ＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅＦ（ａｂ）_２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント特異的）、８０μｇ／ｍ１の１０ｍＭ緩衝酢酸溶液、４つ全てのフローセルでｐＨ４によってコーティングした。フローセル２〜４で、特異なＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂ（５μｌ／ｍｌの流速で５００ｎＭ Ｆａｂフラグメントの２０μ１、３００−４００ＲＵ）を捕獲した。特異性Ｆａｂの捕獲後、緩衝剤を注入し、抗Ｆａｂ／Ｆａｂ相互作用の解離を決定した。以下のサイクルでは、特異のシグナルを決定するために、検体の増殖因子を１５から２０００ｎＭまでの濃度範囲で注入した（２０μｌ、流速２０μ１／分）。その後、得た緩衝剤センソグラムを特異性のものから手作業にて差し引いた。それぞれの
サイクルの後で、１００ｍＭ ＨＣＩ（５μｌ）によってフローセルを発生させた。
ＭＯＲ０３６８４およびＭＯＲ０３６８２を含む７つのＨｕＣＡＬ(R)抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体を検査し、ヒトＧＭ−ＣＳＦに対して特異的として、他のサイトカインまたはマウスもしくはラットＧＭ−ＣＳＦのいずれとも結合しなかった。対照的に、Ｆａｂ ＭＯＲ０３９２９は、ラットＧＭ−ＣＳＦに対して著しい交差反応性を示した。

【0110】

実施例３：ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ間の相互作用を抑制する抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂ候補の識別
ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ^(R)ライブラリーから選択された７４の異なるｈＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体の、ｈＧＭ−ＣＳＦとその受容体との間の相互作用を抑制するための効力を検査した。相互作用は、（ｉ）一方はＧＭ−ＣＳＦ依存性ＴＦ−１細胞株（Ｋｉｔａｍｕｒａら、１９８９）を使用した増殖アッセイであり、また（ｉｉ）他方は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のアルファ鎖を発現する組換え型ＣＨＯ細胞株によるＦＡＣＳ分析である、２つの方法で検査した。ＴＦ−１増殖アッセイでは、アルファ鎖およびベータ鎖から成る内因性のＧＭ−ＣＳＦ受容体を有するＧＭ−ＣＳＦの相互作用をブロックするための抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の能力を分析し、細胞増殖の減少をもたらした。ＦＡＣＳアッセイでは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のＧＭ−ＣＳＦとアルファ鎖との間の相互作用の特異的抑制を決定した。

【0111】

Ａ．アカゲザルおよびヒトＧＭ−ＣＳＦのクローニングおよび発現
アカゲザルＧＭ−ＣＳＦ完全長ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ００７３７６）を遺伝子合成（ｇｅｎｅＡＲＴ ＧｍｂＨ、レーゲンスブルク、ドイツ）によって合成し、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−Ａｍｐベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラホーヤ、カルフォルニア州、米国）にクローン化した。次に、ｃＤＮＡを真核性の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ペイズリー、英国）にクローン化してｐｃＤＮＡ−ｍａｃＧＭ−ＣＳＦを得た。Ｑｉａｇｅｎ（ヒルデン、ドイツ）からのＲＮｅａｓｙキットを使用して、ｌ×１０ｅ７ＴＦ−１細胞から単離させたＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ技法によってヒトＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ０００７４９）をクローン化した。ランダムな六量体（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩキットによって逆転写を実行し、続いてＰＣＲによるＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡの増幅を実行した。得たＰＣＲ生成物を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローン化してｐｃＤＮＡ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦを得た。

【0112】

ＨＥＫ２９３細胞は、リポフェクトアミン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラホーヤ、米国）を使用してそれぞれこれらの発現ベクターにより一時的に核酸を入れた。分泌する組換え型マカクまたはヒトＧＭ−ＣＳＦを含む培地をトランスフェクションの４日後に採取した。

【0113】

Ｂ．ヒトまたはサルＧＭ−ＣＳＦを使用して抗体−ｈＧＭ−ＣＳＦ ＦａｂによるＴＦ−１細胞のＧＭ−ＣＳＦ従属増殖の阻害
プロバイダーの手順（ＤＳＭＺ，ブラウシュバイク、ヂオイツ； ＤＳＭＺ Ｎｏ．ＡＣ
Ｃ ３３４）によると、ＴＦ−１（Ｋｉｔａｍｕｒａら、１９８９）細胞は、増殖した。ＴＦ−１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）で二度洗浄され、その後、９６穴平底マルチウェル培養皿のウェルあたり５０μｌに２×１０^５細胞／ｍｌの濃度で播種された。０．５ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＧＭ−ＣＳ（”Ｌｅｕｃｏｍａｘ”、ＥＳＳＥＸ Ｐｈａｒｍａ，ミュンヘン）およびＨｕＣＡＬ(R)Ｆａｂ抗体（ＲＰＭＩ１６４０培
地内で２００ｎｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌに希釈、１０％ＦＣＳ）を３０分混合し、ＧＭ−ＣＳＦの最終濃度が０．２５ｎｇ／ｍｌになるように、混合の５０μｌをＴＦ−１細胞に加えた。最大細胞増殖（０％阻害）は、０．２５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの最終濃度で、抗体の追加なしで、ＴＦ−１細胞をインキュベートしながら測定された。ＴＦ−１増殖の１００％阻害は、そのアッセイからＧＭ−ＣＳＦを除外し、ＲＰＭＩ１６４０培地
（１０％ＦＣＳ）内にのみ、細胞を保持することにより測定された。その後、ＴＦ１細胞は、加湿室内で、５％のＣＯ_２を使用して、３７℃で７２時間、インキュベートされた。製造者の推奨により、細胞活力は、ＭＴＴまたはＸＴＴ試薬（Ｒｏｃｈｅ，マンハイム、ドイツ）を加えることにより、測定された。全体の１９のＦａｂは、ＴＦ−１増殖の有意な阻害を示すことが確認された。結合ＭＯＲ０３６８２、ＭＯＲ０３６８４およびＭＯＲ０３９２９は、２μＭの濃度で、５０％より大きいＴＦ１細胞増殖の一貫した阻害を示した。これらの最適化されていないＦａｂの阻害活性は、最大阻害度を達成できなかったため、ＩＣ_５０の投与量を決定するには十分強力ではなかった。相対的に、単クローン抗体ＢＶＤ２−２１ Ｃ１Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ； Ｃａｔ＃５５４５０３）およびＭＡＢ２１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ； Ｃａｔ＃ＭＡＢ２１５）は、ＴＦ−１増殖を最大阻害できた。

【0114】

さらに、ＭＯＲ０３６８２およびＭＯＲ０３６８４と天然ヒトＧＭ−ＣＳＦの結合は、ＴＦ−１増殖アッセイにおいて、分析された。精製した組換えヒトＧＭ−ＣＳＦをＴＦ−１細胞に追加する代わりに、天然ヒトＧＭ−ＣＳＦを培地に分泌する５６３７細胞の上清（ＤＳＭＺ Ｎｏ．ＡＣＣ ３５）が使用された。５６３７上清の異なる希釈を備える組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの効果を比較する用量反応曲線から、培地が５ｎｇ／ｍｌ以下の天然ヒトＧＭ−ＣＳＦを含むことを決定した。抗体ヒトＧＭ−ＣＳＦのＦａｂ ＭＯＲ０３６８２またはＭＯＲ０３６８４で５６３７上清の前培養により、細胞の生存率が組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを使用する実験と比較して軽減するように、天然ヒトＧＭ−ＣＳＦとＴＦ−１細胞との結合は、ブロックした。従って、ＭＯＲ０３６８４およびＭＯＲ０３６８２は、天然ヒトＧＭ−ＣＳＦに結合する。Ｆａｂ ＭＯＲ０３９２９は、本アッセイにおいて分析されなかった。さらに、サルＧＭ−ＣＳＦへの交叉反応がＴＦ−１増殖アッセイにおいて分析された。精製したヒトＧＭ−ＣＳＦをＴＦ−１細胞に追加する代わりに、組換えサルＧＭ−ＣＳＦを培地に分泌するトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の上清が使用された。

【0115】

ＴＦ−１細胞は、上清を含むサルＧＭ−ＣＳＦの存在において増殖されたが、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の存在において増殖されなかった。ＨＥＫ−２９３培地の異なる希釈を備える組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの効果を比較する用量反応曲線から、トランスフェクト細胞の培地が２μｇ／ｍｌ以下のサルＧＭ−ＣＳＦを含むことを決定した。抗体ヒトＧＭ−ＣＳＦのＦａｂ ＭＯＲ０３６８２またはＭＯＲ０３６８４でサルＧＭ−ＣＳＦ上清の前培養により、細胞の生存率が有意に軽減するように、サルＧＭ−ＣＳＦとＴＦ−１細胞との結合は、ブロックした。

【0116】

従って、ＭＯＲ０３６８２およびＭＯＲ０３６８４は、サルＧＭ−ＣＳＦで交差反応する。Ｆａｂ ＭＯＲ０３９２９は、本アッセイにおいて分析されなかった。
Ｃ．抗体−ｈＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂによる、ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファへのＧＭ−ＣＳＦ結合のブロック
ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖を発現した細胞面へのＧＭ−ＣＳＦ結合を分析するために、ｃＤＮＡが発現ベクターにクローン化され、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ １１０）に安定に導入された。

【0117】

ＧＭ−ＣＳＦ受容体のアルファ鎖に発現する安定したＣＨＯ−Ｋ１細胞株のクローン化ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６４４４５）は、Ｑｉａｇｅｎ（ヒルデン、ドイツ）からのＲＮｅａｓｙキットを使用して、ｌｘ１０ｅ７ ＴＦ−１細胞から単離したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ技術によりクローン化された。逆転写は、ランダムヘキサマープライマー（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩキットとともに、実施された。その後、ＧＭ−ＣＳＦ−受容体アルファ鎖ｃＤＮＡは、以下のプライマーを使用して増幅された。

【0118】

５’：Ｎ−ＧＣＲａ−ｐｌｕｓＳＳ：ＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣ
および
３’：Ｃ−ｆｌＧＣＲａ：ＡＣＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧＴＣである。

【0119】

ＰＣＲ反応は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化された１２５０ｂｐ以下の製品を生じた。発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン、ペイズリー、ＵＫ）は、同一の酵素で消化された。消化ベクターおよびＰＣＲ製品の精製後、フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１ＯＢ細胞へのエレクトロポレーションにより、結紮および形質転換された。適切なクローンは、プラスミドＤＮＡおよびシークエンシングの前処理後、識別された。適切なクローン（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＭ−ＣＳＦＲアルファ）は、完全ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファｃＤＮＡを含んだ。

【0120】

プロバイダーの手順（ＤＳＺＭ、ブラウンシュバイク、ドイツ；ＤＳＭＺ Ｎｏ．ＡＣＣ １１０）によると、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、増殖した。

【0121】

トランスフェクション細胞は、６ウェル培養皿内で８０％の密集度に増殖し、１０μｌのリポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン）と混合した５μｇ ＤＮＡのｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＧＭ−ＣＳＦＲアルファでインキュベートした。４８時間後、細胞に１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を与え、さらに２４時間後、培地は、当該の含有する２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で置換された。２週間後、単一細胞は、９６穴平底マルチウェル培養皿のウェルに播種された。単一クローンは、成長し、それぞれのクローンの５×１０^５細胞は、１μｇ／ｍｌの濃度で一次抗体としてマウスＩｇＧ ＭＡＢ １００６（ケミコン・インターナショナル社、テメキュラ、ＣＡ）、および１：２００の希釈で二次抗体として（Ｒ−ＰＥ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（Ｆａｂ’）_２ヤギ−抗−マウス−ＩｇＧ （Ｄｉａｎｏｖａ社）を使用するＦＡＣＳ分析によりＧＭ−ＣＳＦＲ−アルファ発現のために分析された。これらの工程の間、細胞はＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ）内で洗浄される一方、一次および二次抗体は、１時間連続的に細胞を使用してインキュベートされた。染色した細胞の蛍光は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用し、ＦＬ２チャネル内で定量化された。
クローンの間で、解析されたクローンＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１が、蛍光強度の最高の中央値を示した。１５７の蛍光中央値（ＭＦＬ値）が、ＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１（図６）に対して測定された。

【0122】

ＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１上に発現したＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファへのＧＭ−ＣＳＦ結合のＦＡＣＳ分析：
細胞に加える前に、室温で３０分間、ＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ／３％ＦＢＳ／ＮａＮ_３ ０．０５％）内で、増加する濃度（０．１から１００μｇ／ｍｌ）で抗体をビオチン化されたＧＭ−ＣＳＦ（０．５μｇ／ｍｌ）とともにコインキュベートした。
すべての染色は、ウェルあたり１−５×１０^５細胞で９６穴丸底マルチウェル培養皿（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）内に実施された。２×１０Ｅ５ ＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞は、ＦＡＣＳバッファを含有する５０μｌの抗体／ＧＭ−ＣＳＦ内に取り、１時間４℃でインキュベートされた。その後、細胞は、１５０μｌのＦＡＣＳバッファ／ウェルで１度洗浄され、ＦＡＣＳバッファ内で１：４００に希釈したｌ００μ１のフィコエリトリンのラベル化されたストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）内に取った。４℃で１時間インキュベートした後、細胞は、ＦＡＣＳバッファで２度洗浄され、１００μｌのＦＡＣＳバッファ内で再懸濁され、ビオチン結合ＧＭ−ＣＳＦは、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内で、細胞のＦＬ２蛍光強度を介して測定された。ＩＣ_５０値は、非線形回帰曲線に適用するＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ３．０３ソフトウェアを使用して、取得した用量反応曲線から測定された。Ｆａｂ 抗体ＭＯＲ０３６８２、ＭＯＲ０３６８４およびＭＯＲ０３９２９は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファを発現した細胞面へのＧＭ−ＣＳＦ結合の有意な抑制を示した。

【0123】

実施例４：ＣＤＲカセットの段階的交換による選択されたＦａｂの親和性成熟
Ａ．Ｆａｂライブラリーおよびパニングの親和性成熟の発生
抗−ＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂフラグメントの親和性および阻害活性を増加するために、クローンＭＯＲ０３６８２、ＭＯＲ０３６８４およびＭＯＲ０３９２９は、親和性成熟を受けた。この点について、ＣＤＲ領域は、トリヌクレオチド定方向突然変異誘発（Ｖｉｒｎｅｋａｓら、１９９４；Ｎａｇｙら、２００２）を使用して、カセット式変異誘発により最適化された。配列分析は、分析された３つの親クローンのＣＤＲの間で配列相同性を示さなかった。表２ａおよび２ｂは、親クローンＭＯＲ０３６８２、ＭＯＲ０３６８４およびＭＯＲ０３９２９に対して、６つのＣＤＲペプチド配列を提供する。
Ｆａｂ最適化として使用されたプロトコルを以下に簡潔に説明する。発現ベクターｐＭＯＲＰＨ(R)Ｘ９Ｆａｂ＿ＦＨからのＦａｂフラグメントは、ファージミドベクターにクローンされた（ＵＳ ６，７５３，１３６）。その後、２つの異なる方法は、親Ｆａｂの親和性および有効性を最適化するために適用された。

【0124】

まずは、１つのファージ抗体Ｆａｂライブラリーが各親のＬ−ＣＤＲ３が単一のラムダ軽鎖ＣＤＲ３配列のレパートリーにより置換され、生成される。二次ライブラリーにおいて、Ｈ−ＣＤＲ２領域は、単一の重鎖ＣＤＲ２配列のレパートリーにより置換される。親和性成熟ライブラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン）へ多様性クローンを形質転換することにより生成された。ファージは、実施例１Ａに記載されたように前処理された。ＭＯＲ０３９２９由来のＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２ライブラリーが選択手順の間別々に保持されたが、ＭＯＲ０３６８４およびＭＯＲ０３６８２の双方のＬ−ＣＤＲ３ライブラリーは、プールされ、ＭＯＲ０３６８４およびＭＯＲ０３６８２由来の双方のＨ−ＣＤＲ２ライブラリーは、プールされた。

【0125】

パニングは、実施例１Ｂに記載されているように、元来、３期間のためのソリューションにビオチンＧＭ−ＣＳＦを実施し、さらに厳しい選択状況に適用した。

【0126】

Ｂ．溶解物において改良したＧＭ−ＣＳＦ結合Ｆａｂを検出するための電気化学発光（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）ベースの結合分析
大腸菌溶解物（ＢＥＬ抽出物）におけるＧＭ−ＣＳＦ結合Ｆａｂ抗体を検出するために、基本的に実施例２Ｂに説明したＢｉｏ ＶｅｒｉｓＭ−３８４ＳＥＲＩＥＳ(R)Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｉｏ Ｖｅｒｉｓ Ｅｕｒｏｐｅ社、ウィットニー、オックスフォードシャー、英国）で結合を分析した。最も高いＥＣＬ値を有するＦａｂを精製して、溶解平衡滴定による親和性測定（ＳＥＴ；Ｈａｅｎｅｌら、２００５）および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を行った（実施例４Ｄ参照）。

【0127】

Ｃ．改良したＶＨ（Ｈ−ＣＤＲ２）による改良したＶＬ（Ｌ−ＣＤＲ３）のＸ−クローニング
さらなる親和性の改良のために、同じ親クローンに由来した成熟Ｆａｂからの単独で最適化されたＨ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を、この組み合わせがさらなる親和性を得る結果となる確率が高いので、組み合わせた（Ｙａｎｇら、１９９５；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６；Ｃｈｅｎら、１９９９）。改良した親和性を有するＦａｂが、Ｈ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３ライブラリーの両方から識別されるので、Ｘ−クローニングと呼ばれるこの手順を、親クローンＭＯＲ０３９２９に由来した結合剤に適用した。軽鎖全体（ＸｂａＩ／ＳｐｈＩフラグメント）をＬ−ＣＤＲ３−最適化ドナークローンからＨ−ＣＤＲ２−最適化受容体クローンに移転することによりこれを達成した。

【0128】

【表6】

得られた４つのＦａｂについて、それぞれのＨ−ＣＤＲ２改良したベクター骨格への正しいＶＬの移転を固めるようＶＬおよびＶＨの配列を決定した。表２ａおよび表２ｂは、表３に記載したＭＯＲ０３９２９および３６８２の全ての誘導体のＶＨおよびＶＬタンパク質配列を示す。

【0129】

Ｄ．溶解平衡滴定（ＳＥＴ）および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用したピコモル親和性の決定
Ｋ_Ｄの決定のために、Ｆａｂの単量体比（分析的ＳＥＣによって分析された少なくとも９０％の単量体含有量；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。

【0130】

溶液およびデータ評価における電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの親和性の決定は、基本的にＨａｅｎｅｌら、２００５が説明しているように実行した。溶液中ヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕ−ｃｏｍａｘ）の異なる濃度（段階的な５^ｎ希釈）によってＦａｂの一定量を平衡化した。するｅｄｔｏ磁性ビーズ（Ｍ−２８０ストレプトアビジン，Ｄｙｎａｌ）およびＢＶ−ｔａｇ^ＴＭ（Ｂｉｏ Ｖｅｒｉｓ Ｅｕｒｏｐｅ社、ウィットニー、オックスフォードシャー、英国）標識抗ヒト（Ｆａｂ）’_２（Ｄｉａｎｏｖａ社）に結合したビオチン化ヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を加え、１５〜３０分インキュベートした。続いて、結合していないＦａｂの濃度を、Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ(R)３８４ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏ Ｖｅｒｉｓ Ｅｕｒｏｐｅ社）を使用して、ＥＣＬ検出を経て定量化したＦｒｉｇｕｅｔら、１９８５に従い、検出の間、固相への著しい平衡移動を回避するために用心した。

【0131】

上述のアッセイ条件を使用して、Ｆａｂの親和性を決定し、表４に示した。
標準ＥＤＣ−ＮＨＳアミン結合反応を利用して、１０ｍＭ Ｎａ−酢酸塩ｐＨ４．５で、〜１００ＲＵ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の密度でコーティングされたＦ１チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、スウェーデン）上で動力ＳＰＲ分析をさらに実行した。基準のフローセルでそれぞれの量のＨＡＳを固定した。ＰＢＳ（１３６ｍＭ ＮａＣＩ，２．７ｍＭ ＫＣＩ，１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１．７６ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ７．４）＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を泳動用緩衝剤として使用した。６．３〜２００ｎＭの濃度シリーズにおいて２０μｌ／分の流速でＦａｂを適用した。会合相を６０ｓに、
解離相を１２０ｓ（親）または最大６００ｓ（親和性最適化）に設定した。長期にわたって解離相を監視するために、基本的にＤｒａｋｅら、（２００４）に従って以下の条件を使用した。２００ｎＭの単一濃度でＦａｂを適用し、流速を１００ｐｌ／分に、解離相を６０００〜１８．０００ｓに設定した。これらのアッセイ条件下で決定した基準から外れた率に基づき、Ｆａｂの親和性を決定し、表４に示した。

【0132】

【表7】

Ｅ．溶解平衡滴定（ＳＥＴ）を使用してラットＧＭ−ＣＳＦに対する親和性の決定
ヒトＧＭ−ＣＳＦの代わりに溶液中の検体としてラットＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を使用して、基本的に実施例４Ｄに説明したようにラットＧＭ−ＣＳＦに対する親和性の決定を行った。Ｈａｅｎｅｌら（２００５）に従って親和性を計算した。このアッセイでは、ラットＧＭ−ＣＳＦに対するＦａｂ ＭＯＲ０４３５７の親和性はＫ_Ｄ＝１．０ｎＭであると決定した。

【0133】

実施例５：ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖との間の相互作用を抑制する最適化抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂの特性決定
Ａ．ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ結合アッセイ
０．５μｇ／ｍｌ（３５ｎＭ）のビオチン化ＧＭ−ＣＳＦを使用して、ＧＭ−ＣＳＦ受容体結合アッセイを上述のように実行した（実施例３Ｃ）。ＣＨＯ−ＧＭＲａ＃１１細胞（０％抑制）に対するＧＭ−ＣＳＦの最大結合を、抗体を加えることなく、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化ＧＭ−ＣＳＦの最終ＧＭ−ＣＳＦ濃度で細胞をインキュベートすることにより測定した。ＧＭ−ＣＳＦ結合の１００％抑制を、アッセイからＧＭ−ＣＳＦを除外することにより測定した。非線形回帰曲線適合を適用したＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ３．０３ソフトウェアを使用して得た用量反応曲線からＩＣ_５０値を決定した。
改良した親和性を有するＦａｂ、親Ｆａｂおよび単クローン性対照ＩｇＧを分析した。表５は、これらのアッセイから得たＩＣ_５０値を要約している。５μｇ／ｍｌの抗体濃度で得た％抑制もまた、表５に示している。

【0134】

【表8】

このアッセイは、親和性成熟およびＸ−クローニングから得たＦａｂは、ＧＭ−ＣＳＦがＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファ鎖へ結合するのを防止し、それによりそれらの親Ｆａｂのブロック機構を保持することを定性的に示している。アッセイは、ＦＡＣＳにおける重要なシグナルを得るために、３５ｎＭ（０．５μｇ／ｍｌ）ビオチン化ＧＭ−ＣＳＦの濃度で実行することが必要である。したがって、１７．５ｎＭ Ｆａｂ（または８．７５ｎＭ ＩｇＧ）は、理論上５０％のＧＭ−ＣＳＦをブロックする必要があり、したがって、ＩＣ_５０値を決定するための制限を設定している。

【0135】

Ｂ．ヒトＧＭ−ＣＳＦを使用した抗ｈＧＭ−ＣＳＦ ＦａｂによるＴＦ−１ＧＭ−ＣＳＦ依存増殖の抑制
実施例３Ｂに説明したようにＴＦ−１増殖アッセイを実行した。単クローン性対照ＩｇＧと同様に、改良した親和性を有するＦａｂおよび親Ｆａｂを分析した。非線形回帰曲線適合を適用したＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ３．０３ソフトウェアを使用して得た用量反応曲線からＩＣ_５０値を決定した。表６は、これらのアッセイから得たＩＣ_５０値を要約している。
表６：ＴＦ−１増殖アッセイにおける抗ｈＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂおよび対照ＩｇＧのＩＣ_５０値

【0136】

【表9】

別のセットの実験では、親Ｆａｂ ＭＯＲ０３６８２、その親和性成熟誘導体ＭＯＲ０４２８３、ＭＯＲ０４２９７およびｘ−クローン化変異ＭＯＲ０４３４２のＴＦ−１増殖アッセイにおけるＩＣ_５０値を決定した。表７は、これらのアッセイで得たＩＣ_５０値を要約している。

【0137】

表７：ＴＦ−１増殖アッセイにおける抗ｈＧＭ−ＣＳＦ ＦａｂのＩＣ_５０値

【0138】

【表10】

これらの実験は、親和性成熟およびＸ−クローニング後、ＩＣ_５０値において得た多くの改良を例証した。例えば、ＭＯＲ０４３５７、ＭＯＲ０４３５０、ＭＯＲ０４３５４は、それらの親ＭＯＲ０３９２９と比較して＞２０００倍改良されたＩＣ_５０値を示し、ＢＶＤ２−２１Ｃ１１およびＭａｂ２１５の効力を越えた。

【0139】

実施例６：ヒトＩｇＧ１型へのＭＯＲ０４３５７の変換
Ａ．哺乳類の発現系における発現のためのＦａｂ ＤＮＡ配列の遺伝子最適化
哺乳類遺伝子発現のためのＭＯＲ０４３５７のＶＨおよびＶＬのＤＮＡを最適化するために（例えば、コドン使用頻度の変更、ＧＣ含有量など）、Ｇｅｎｅａｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）で遺伝子合成をして、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔｖｅｃｔｏｒｓにクローン化し０５５９０６ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔおよび０５５９０７ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐを得る、最適化ＶＨおよびＶＬＤＮＡ配列などを定義するのに、Ｇｅｎｅａｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）によるＧｅｎｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ^ＴＭソフトウェアを利用した。配列番号：４８は、それぞれのＶＨ配列を示すが、配列番号：５７はそれぞれのＶＬ配列を示す。

【0140】

Ｂ．ヒトＩｇＧ１型およびＩｇＧＩ発現に変化するＦａｂ ＭＯＲ０４３５７のクローニング
全長免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現するために、遺伝子最適化重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域フラグメントをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（実施例５ａ）からサブクローン化して、ヒトＩｇＧＩのためにｐＭＯＲＰＨ(R)２ｈＩｇベクターシリーズに変化させた。ＭＯＲ０４３５７のコドン最適化ＶＨを、ＮｈｅＩｌＢＩｐＩ温浸を経て０５５９０６ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔから単離し、同じ制限酵素によりｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿ＩｇＧｌｆマスターベクターカットに挿入した。このベクターはすでにヒトガンマ１定常領域を含んでいた。得られた発現核外遺伝子をｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿ＩｇＧｌｆＭＯＲ０４３５７＿ｃｏと命名した。ＭＯＲ０４３５７のコドン最適化ＶＬを、ＮｈｅｌｌＨｐａＴ温浸を経て０５５９０７ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔから単離し、同じ制限酵素によりｐＭｏｒｐｈ２＿ｈ＿Ｉｇｌａｍｂｄａ２マスターベクターカットに挿入した。このベクターはすでにヒトラムダ定常領域を含んでいた。得られた発現核外遺伝子をｐＭ２＿ｈ＿Ｉｇｌａｍｂｄａ２＿ＭＯＲ０４３５７＿ｃｏと命名した。

【0141】

Ｃ．一時的発現およびヒトＩｇＧの精製
等モル量のＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクターＤＮＡにより、真核性のＨＫＢ１１細胞に核酸を入れた。トランスフェクションの３日から７日後に細胞培養浮遊物を採取した。浮遊物のｐＨを８．０に調節および除菌後、溶液を標準タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ＦＦまたはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。緩衝剤交換を１ｘＤｕｌｂｃｅｃｃｏ'ｓＰＢＳ（ｐＨ７，２，インビトロジェン社）に実行し、試料を除菌した（０，２μｍ）。ＭＯＲ０４３５７ＩｇＧＩを１ｘＤｕｌｂｃｅｃｃｏ'ｓＰＢＳ（ｐＨ６，５，インビトロジェン社）に対して透析した。変性させている間に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの条件を軽減して、またはＡｇｉｌｅｎｔＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して、ＳＥ−ＨＰＬＣによる自然な状態で、ＩｇＧの純度を分析した。

【0142】

Ｄ．溶解平衡滴定（ＳＥＴ）を使用してピコモル親和性を決定
Ｋ_Ｄの決定のために、ＩｇＧＩの単量体比（分析的ＳＥＣによって分析された少なくとも９０％の単量体含有量；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。溶液およびデータ評価における電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの親和性の決定は、基本的にＨａｅｎｅｌら、２００５が説明しているように、また実施例４Ｂに説明しているように実行した。ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦに対するＭＯＲ０４３５７ＩｇＧＩのＫ_Ｄ値は、１．１ｐＭであると決定した。

【0143】

Ｅ．溶解平衡滴定（ＳＥＴ）を使用して、ラットＧＭ−ＣＳＦに対する親和性の決定
ヒトＧＭ−ＣＳＦの代わりに溶液中の検体としてラットＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を使用して、基本的に実施例４Ｄに説明したようにラットＧＭ−ＣＳＦに対する親和性の決定を行った。Ｈａｅｎｅｌら（２００５）に従って親和性を計算した。ラット組換え型ＧＭ−ＣＳＦに対するＭＯＲ０４３５７ＩｇＧＩのＫ_Ｄ値は１３０ｐＭであると決定した。

【0144】

実施例７：最適化抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂから誘導されるＭＯＲ０４３５７ＩｇＧ１の特徴付け
Ａ．ヒトおよびアカゲザルＧＭ−ＣＳＦを使用して、抗ｈＧＭ−ＣＳＦ ＩｇＧによるＴＦ−１のＧＭ−ＣＳＦ依存増殖の抑制
実施例３Ｂに説明しているように、ＴＦ−１増殖アッセイを実行した。ＩｇＧ１型でＭＯＲ０４３５７を分析し、対照として単クローン性対照ＩｇＧを分析した。非線形回帰曲線適合を適用したＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ３．０３ソフトウェアを使用して得た用量反応曲線からＩＣ_５０値を決定した。表８は、これらのアッセイから得たＩＣ_５０値を要約している。まず第一に、０．２５ｎｇ／ｍｌの濃度で組換え型ヒトＧＭ−ＣＳＦを大腸菌に生成し、第二に、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを含み、ｐｃＤＮＡ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦにより一時的に核酸を入れられたＨＥＫ２９３から浮遊物を培養し（実施例３Ａ参照）、第三に、組換え型アカゲザル（アカゲザル）ＧＭ−ＣＳＦを含み、ｐｃＤＮＡ−ｍａｃＧＭ−ＣＳＦにより一時的に核酸を入れられたＨＥＫ２９３細胞から浮遊物を培養する（実施例３Ａ参照）。ＴＦ−１増殖アッセイについては、ＴＦ−１細胞が０．２５ｎｇ／ｍｌの確定濃度の大腸菌で生成した精製された組換えヒトＧＭ−ＣＳＦで得られる増殖と比べて類似した増殖を示すような希釈で、それぞれのＧＭ−ＣＳＦのソースとしてＨＥＫ２９３培養浮遊物を使用した。

【0145】

表８：ＴＦ−１増殖アッセイにおけるＭＯＲ０４３５７ＩｇＧおよび対照ＩｇＧのＩＣ_５０値

【0146】

【表11】

この実験は、ＦａｂからＩｇＧＩ型へ変換した後に保存される場合に、親和性成熟およびＸ−クローニング後、ＩＣ_５０値において得た多くの改良を例証した。ＩｇＧ１ ＭＯＲ０４３５７は、Ｆａｂ ＭＯＲ０３９２９と比較して＞２０００倍改良されたＩＣ_５０値を示し、ＢＶＤ２−２１Ｃ１１およびＭａｂ２１５の効力を越えた。

【図1a-1】

【図1a-2】

【図1a-3】

【図1a-4】

【図1a-5】

【図1b-1】

【図1b-2】

【図1b-3】

【図2a-1】

【図2a-2】

【図2a-3】

【図2a-4】

【図2a-5】

【図2b-1】

【図2b-2】

【図2b-3】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]