特許 5769802 液体培地のウイルス不活化のためのデバイス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5769802

(24)【登録日】2015年7月3日

(45)【発行日】2015年8月26日

(54)【発明の名称】液体培地のウイルス不活化のためのデバイス

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/12 20060101AFI20150806BHJP

   C12N 7/04 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150806BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/12

   C12N7/04

   A61K37/02

   A61K37/48

   A61K39/395 H

   A61K39/395 J

【請求項の数】25

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2013-514254(P2013-514254)

(86)(22)【出願日】2011年6月6日

(65)【公表番号】特表2013-534816(P2013-534816A)

(43)【公表日】2013年9月9日

(86)【国際出願番号】US2011039301

(87)【国際公開番号】WO2011156281

(87)【国際公開日】20111215

【審査請求日】2013年3月5日

(31)【優先権主張番号】61/352,276

(32)【優先日】2010年6月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ムスクマール・ダナセカラン

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５１２９０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５１２９１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３３４４１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｎ ７／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）以下を含む少なくとも１つの同軸円筒（１１０）；
ｉ）長さ、内径、及び外径を有する外筒（１２０）；
ｉｉ）外筒（１２０）の長さに実質的に等しい長さを有し、そして内筒（１３０）の外径と外筒（１２０）の内径間にギャップ（１６０）を形成するように適合される外径を有し、ここでギャップ（１６０）は１ｍｍと５ｍｍの間の範囲にある、外筒（１２０）と同軸の内筒（１３０）；
ｂ）ギャップ（１６０）に沿って実質的なサイクロン流路で液体を流すように構成される、入口（１４０）、ここで入口（１４０）は外筒（１２０）に垂直に連結され、そして、入口（１４０）は矩形断面を有する；
ｃ）液体に向かって紫外線Ｃを放射し、そしてそれにより、液体の実質的なサイクロン流との併用によって、液体中のウイルスを不活化し、又は殺す紫外線Ｃの狭い線量分布を生じさせるように、内筒（１２０）の内部に置かれた少なくとも１つの紫外線Ｃのエミッタ（１４５）；及び
ｄ）入口（１４０）の反対側で外筒（１２０）に連結された出口（１５０）:
を含んでなる、高吸光度の液体のウイルス不活化のためのハイスループット装置（１００）。

【請求項2】

少なくとも１つの紫外線Ｃのエミッタ（１４５）は、２４０ｎｍと２６０ｎｍの間の範囲の波長の放射を出し、そして、任意に、紫外線Ｃのエミッタ（１４５）の数は１エミッタと８エミッタの間の範囲にある、請求項１に記載の装置（１００）。

【請求項3】

内筒（１３０）はフッ素重合体及び石英から成る群から選択される材料から作られる、請求項１に記載の装置(１００)。

【請求項4】

ギャップ（１６０）は、ａ）静的ミキサエレメント（１６５）を含み、及び／又は、ｂ）流れ偏向器又は調節板を含む、請求項１に記載の装置（１００）。

【請求項5】

ギャップは約３ｍｍである、請求項１に記載の装置。

【請求項6】

出口（１５０）は、流出時に液体の実質的なサイクロン流を維持するように構成される、請求項１に記載の装置（１００）。

【請求項7】

ａ）入口マニホールド（１１５）及び出口マニホールド（１２５）、並びに少なくとも２つの同軸円筒（１１０）；
ｂ）少なくとも第２の同軸円筒（１１０）に連結された少なくとも１つのコネクタ（１９５）、ここでコネクタ（１９５）は第１の同軸円筒（１１０）の出口（１５０）を第２の同軸円筒（１１０）の入口（１４０）に連結し、コネクタ（１９５）は第２の同軸円筒（１１０）のギャップ（１６０）に沿った液体の実質的なサイクロン流を維持するように構成され、ここでコネクタ（１９５）は静的ミキサエレメント（１６５）を含んでもよい；
ｃ）液体が暴露されている放射線量を示すモニタ（２２０）；
ｄ）液体の流れを止めるための閉止弁（２４０）；
ｅ）放射に暴露過剰又は暴露不足になった液体を洗い流すためのフラッシングシステム（２５０）；及び／又は、
ｆ）ポンプ（２１０）
を更に含む、請求項１に記載の装置（１００）。

【請求項8】

ａ）外筒（１２０）及び内筒（１３０）の長さは２５ｃｍと１００ｃｍの間の範囲にあり；
ｂ）装置（１００）の体積は、１２５立方フィートに等しいか又はそれ未満であり；
ｃ）液体の流量は０.５Ｌ／分と５０Ｌ／分の間の範囲にあり；
ｄ）装置（１００）は５０ｐｓｉ以下の圧力で評価され；及び／又は、
ｅ）装置（１００）の設置スペースは、５フィート×５フィート×５フィートに等しいか又はそれ未満である、
請求項１に記載の装置(１００)。

【請求項9】

さらに、液体が、２０と３０ｍＪ／ｃｍ²の間の範囲で最小放射線量に暴露され、９０％の液体が８０〜１００ｍＪ／ｃｍ²未満の放射線量に暴露されることを伴ない、５０と６０ｍＪ／ｃｍ²の間の範囲にある平均放射線量を有し、３Ｌと５Ｌ／分の間の範囲にある流量についてであり、そして液体が２と５吸光度単位の間の範囲の紫外線吸光度を有するものについてであり、シリンダ当り１ランプを含む１〜２の同軸円筒を備える、請求項１に記載の装置（１００）。

【請求項10】

液体は酵素、組換タンパク質及びモノクローナル抗体からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１に記載の装置（１００）。

【請求項11】

ａ）高吸光度の液体を請求項１に記載の装置に導入する工程；
ｂ）ギャップに沿って実質的なサイクロン流路中のギャップを通して液体を流す工程；
ｃ）少なくとも１つの紫外線Ｃのエミッタにより液体を放射線にさらし、これにより、液体の実質的なサイクロン流との併用によって、液体中のウイルスを不活化し、又は殺す紫外線Ｃの狭い線量分布を生じさせる工程；及び
ｄ）出口を通して液体を流す工程:
を含んでなる、高吸光度の液体中のウイルスを不活化するための方法。

【請求項12】

液体は０．５Ｌ／分と５０Ｌ／分の間の範囲の流量で流れる、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ウイルスはエンベロープウイルス、非エンベロープウイルス、又はその組み合わせであり、そして、任意に、不活化は、非処理対照液体におけるウイルス濃度と比べてウイルス
濃度の少なくとも４の対数減少をもたらす、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

放射線は５ｍＪ／ｃｍ²と１００ｍＪ／ｃｍ²の間の範囲の線量である、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

少なくとも１つの紫外線Ｃのエミッタは、２４０ｎｍと２６０ｎｍの間の範囲の波長の放射を出し、そして、任意に、紫外線Ｃのエミッタの数は１エミッタと８エミッタの間の範囲にある、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

内筒はフッ素重合体及び石英から成る群から選択される材料から作られる、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

ギャップは、ａ）静的ミキサエレメントを含み、及び／又は、ｂ）流れ偏向器又は調節板を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項18】

ギャップは約３ｍｍである、請求項１１に記載の方法。

【請求項19】

出口は、流出時に液体の実質的なサイクロン流を維持するように構成される、請求項１１に記載の方法。

【請求項20】

ａ）入口マニホールド及び出口マニホールド、並びに少なくとも２つの同軸円筒；
ｂ）少なくとも第２の同軸円筒に連結された少なくとも１つのコネクタ、ここでコネクタは第１の同軸円筒の出口を第２の同軸円筒の入口と連結し、そして、コネクタは第２の同軸円筒のギャップに沿った液体の実質的なサイクロン流を維持するように構成され、ここでコネクタは静的ミキサエレメントを含んでもよい；
ｃ）液体が暴露されている放射線量を示すモニタ；
ｄ）液体の流れを止めるための閉止弁；
ｅ）放射に暴露過剰又は暴露不足になった液体を洗い流すためのフラッシングシステム；及び／又は、
ｆ）ポンプ、
を更に含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項21】

ａ）外筒及び内筒の長さは２５ｃｍと１００ｃｍの間の範囲にあり；
ｂ）装置の体積が１２５立方フィート以下であり；
ｃ）液体の流量は０.５Ｌ／分と５０Ｌ／分の間の範囲にあり；
ｄ）装置は５０ｐｓｉ以下の圧力で評価され；及び／又は、
ｅ）装置の設置スペースが５フィート×５フィート×５フィート以下である、
請求項１１に記載の方法。

【請求項22】

さらに、液体が８０〜１００ｍＪ／ｃｍ²未満の放射線量に暴露され、５０と６０ｍＪ／ｃｍ²の間の範囲にある平均放射線量を有し、３Ｌと５Ｌ／分の間の範囲にある流量についてであり、そして液体が２と５吸光度単位の間の範囲の紫外線吸光度を有するものについてであり、シリンダ当り１ランプを含む１〜２の同軸円筒を備えた、請求項１１に記載の方法。

【請求項23】

液体は酵素、組換タンパク質及びモノクローナル抗体から成る群から選択されるタンパク質を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項24】

高吸光度の液体が細胞培養培地である、請求項１に記載の装置（１００）。

【請求項25】

高吸光度の液体が細胞培養培地である、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
本願は、２０１０年６月７日に出願された米国特許仮出願第６１／３５２２７６号の便益を主張するものであり、上記出願の全文が参照することにより本明細書に組み入れられている。

【背景技術】

【0002】

生物医薬品製造工程のすべての段階にわたるウイルス軽減は、治療又は非治療目的のための生物医薬品の適用におけるウイルス汚染を防止するために、国際的又は国内の規制機関によって確立された益々厳しい要求事項である。大型又は小型、エンベロープ又は非エンベロープウイルス粒子を不活化し及び／又は生物医薬品組成物から除去するために、幾つかの方法が用いられている。そのような方法の例は、濾過（例えば、２０ｎｍ濾過、Ｑ膜クロマトグラフィー、デプスフィルター技術）、加熱（例えば、高温短時間（ＨＴＳＴ）低温殺菌）、化学物質（溶媒の添加−界面活性剤又は化学薬品）、又は放射（紫外線又はγ線放射）を含む。これらの方法は、それらの低処理能力及び／又は高コストに因る生物医薬品製造工程において主として下流で使用されている。１日当たり２００００Ｌ又はそれ以上までが処理される生物医薬品製造工程へ投入される細胞培養培地のウイルス不活化は、既存の方法では時間とコストに関して非常に高くなり得る。例えば、水処理などと異なって、培地の過剰暴露(特に血清を含む培地)は有害であり得て、従って放射線量は培地に均一に送達されそして比較的狭い範囲内で調節する必要があることから、紫外線Ｃ（ＵＶＣ）放射などの幾つかの方法は生物医薬品製造工程に適用するのに努力を必要とする。培地、特に血清を含有する培地の紫外線放射の更なる課題は、培地のＵＶＣ範囲でのＵＶ透過率（例えば、２５４ｎｍで）は、例えばこの波長範囲の水のＵＶ透過率より実質的に低い。また、ハイスループット生物医薬品製造に使用されるデバイスは、洗浄及び殺菌（例えば、定置洗浄（ＣＩＰ）及び蒸気洗浄（ＳＩＰ）手順）に敏感に反応する成分を含むことが望ましい。従って、生物医薬品及び他の適用のための低透過率液体培地のハイスループットウイルス不活化を可能にする方法及び装置の必要性が存在する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明は一般的に液体培地のハイスループットウイルス不活化を可能にする方法及び装置を対象にする。

【課題を解決するための手段】

【0004】

１つの実施態様では、高吸光度液体培地のウイルス不活化ができる装置は、外筒（長さ、内径、及び外径の寸法を備えた）及び外筒と同軸の内筒から構成される少なくとも１つの同軸円筒を含む。装置は培地入口、放射の少なくとも１つの紫外線Ｃのエミッタ、及び培地出口を更に含む。内筒は、外筒、及び内筒の外径と外筒の内径間にギャップを形成するように適合される外径の長さに実質的に等しい長さを有する。液体培地はギャップに沿った実質的にサイクロン流に流れる。培地入口は、外筒の端部で、又は近くで外筒に連結される。入口は、ギャップに沿って実質的にサイクロン流に沿って培地を流すように構成される。紫外線Ｃで処理しようとする培地に向かって紫外線Ｃを放射するように、そしてそれにより培地中のウイルスを不活化するように、少なくとも１つの紫外線Ｃのエミッタは内筒の内部に置かれる。出口は、入口の反対側の外筒の端部で、又は近くで外筒に連結される。更なる実施態様では、処理しようとする培地は細胞培養培地である。尚更なる実施態様では、処理しようとする培地は血清を含む。

【0005】

別の実施態様では、高吸光度液体培地中のウイルスを不活化する方法は、液体培地を、内筒の外径と外筒の内径の間のシリンダ長さに沿ってギャップを含む少なくとも１つの同軸円筒に導入することを含む。培地は、ギャップに沿って実質的にサイクロン流に沿って液体培地を流すように構成される入口を通して導入される。方法は更に、液体培地に向かって紫外線Ｃを放射するように、そしてそれにより培地中のウイルスを不活化するように、内筒の内部に置かれる少なくとも１つの紫外線Ｃのエミッタにより培地を放射することを含む。方法は次いで、入口の反対側の外筒の端部に近い外筒に連結される培地出口を通して培地を流すことを含む。更なる実施態様では、処理しようとする培地は細胞培養培地である。まだ更なる実施態様では、処理しようとする培地は血清を含む。

【0006】

本発明は、生物医薬品工程のための液体培地のハイスループットウイルス不活化、及び洗浄手順（例えば、定置洗浄（ＣＩＰ）及び定置蒸気（ＳＩＰ）に対する敏感反応性などの多くの利点を有する。本発明の装置の別の利点は、限定又は特製スペース要件にそれらを合わせることができる、構成中の可撓性である。

【0007】

前記は、類似の参照文字が異なる図にわたって同じ部材を示す添付図面に図示されるように、本発明の例示実施態様の下記のより特定の記載から明らかになるものである。図面は必ずしも縮尺されたものではなく、代わりに本発明の実施態様を説明する際に強調されている。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】１つの同軸円筒を含む本発明による液体培地のウイルス不活化のための装置の透視図の概略説明図である。

【図1B】図１Ａに示される装置の入口及び同軸円筒の断面の概略説明図である。

【図1C】図１Ａに示される装置の入口及び同軸円筒の側面図の概略説明図である。

【図1D】本発明による、接線方向入口及び出口を備えた、両方とも矩形断面及び円形角を備えた液体培地のウイルス不活化のための装置の透視図の概略説明図である。

【図1E】本発明によるサイクロン流の概略説明図である。

【図1F】２つの同軸円筒及び各同軸円筒周りのハウジングを含む本発明による液体培地のウイルス不活化のための装置の具体例の概略説明図である。

【図2】紫外線Ｃの複数のエミッタを備えた同軸円筒の断面の概略説明図である。

【図3】同軸円筒に沿ったギャプ内部の静的ミキサエレメントの概略説明図である。

【図4】２つの垂直積層同軸円筒を備えた、本発明による液体培地のウイルス不活化のための装置の側面図の概略説明図である。

【図5A】本発明による入力マニホールドと出力マニホールドの間の２列の同軸円筒を積層する概略説明図である。

【図5B】本発明による入力マニホールドと出力マニホールドの間の４列の同軸円筒を積層する概略説明図である。

【図6】本発明による入力マニホールドと出力マニホールドの間の２列の同軸円筒を水平積層する概略説明図である。

【図7A】本発明による水平及び垂直に積層された４つの同軸円筒の概略説明図である。

【図7B】図７Ａに示される装置を通した液体培地の流れの概略説明図である。

【図8】本発明による細胞培養培地のウイルス不活化のための装置の平面図の概略説明図である；Ｗ＝水洗／洗浄バルブ、Ｆ＝流量調節弁、Ｄ＝線量計の概略説明図である。

【図9】モデル開発のためのワークフローの概略説明図である。

【図10】水、無血清細胞培養培地、及び血清含有（１０％ｖｏｌ）細胞培養培地用石英スリーブからの半径方向距離関数としての２５４ｎｍでの線強度のグラフである。

【図11】実施例２に記載の装置の概略説明図である。

【図12】実施例２に記載の装置におけるサイクロン流の概略説明図である。

【図13】実施例２（５ｍｍギャップ、３．８ｌｐｍ（１ｇｐｍ））及び実施例３（３ｍｍギャップ、４．７５ｌｐｍ（１．２５ｇｐｍ）及び９．５ｌｐｍ（２．５ｇｐｍ））に記載の装置における無血清細胞培養培地に対するＵＶ線量の関数としての頻度（暴露細胞培養培地の％）のグラフである。

【図14】実施例２（５ｍｍギャップ、３．８ｌｐｍ（１ｇｐｍ））及び実施例３（３ｍｍギャップ、４．７５ｌｐｍ（１．２５ｇｐｍ）及び９．５ｌｐｍ（２．５ｇｐｍ））に記載の装置における無血清細胞培養培地に対するＵＶ線量の関数としての粒子％（累積線量）のグラフである。

【図15】実施例２（５ｍｍギャップ、１．９ｌｐｍ（０.５ｇｐｍ））及び実施例３（３ｍｍギャップ、２．４ｌｐｍ（０．６３１ｇｐｍ）及び３．８ｌｐｍ（１ｇｐｍ））に記載の装置における血清含有細胞培養培地に対するＵＶ線量の関数としての頻度（暴露細胞培養培地の％）のグラフである。

【図16】実施例２（５ｍｍギャップ、１．９ｌｐｍ（０.５ｇｐｍ））及び実施例３（３ｍｍギャップ、２．４ｌｐｍ（０．６３１ｇｐｍ）及び３．８ｌｐｍ（１ｇｐｍ））に記載の装置における血清含有細胞培養培地に対するＵＶ線量の関数としての粒子％（累積線量）のグラフである。

【図17】実施例４に記載のＵＶＣ処理セットアップの概略説明図である。

【図18】Ａ及びＢは、正規化の前（図１８Ａ）及び後（図１８Ｂ）で処理サンプルの蛍光分布のグラフである。

【図19】平行ビーム較正実験から得られた種々の均一線量レベルでの蛍光分布のグラフである。

【図20】Ａ及びＢは、水中での平行ビーム較正実験から種々のＵＶフルエンシーで得られた蛍光分布の平均値のグラフである。

【図21】３つの種々の流速でＵＶＣリアクタにおいてＵＶ光に暴露されたサンプルの蛍光分布のグラフである。

【図22】Ａ〜Ｃは、β_j、Г_ji、及びα_iの定義の絵画概略説明図である。

【図23】表２に与えられた比例での数学的混合較正サンプルにより得られた２つのテスト蛍光分布のグラフである。

【図24】２つのテストケースでの実際の及び予測ＵＶ線量分布の比較のグラフである。

【図25A】図２５Ａ−１流量＝２．７５ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝９１ｍＪ／ｃｍ²；図２５Ａ−２実験平均ＵＶ線量＝８２ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した細胞培養培地におけるＵＶ線量分布のグラフである。

【図25B】図２５Ｂ−１流量＝４．７５ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝５３ｍＪ／ｃｍ²；図２５Ｂ−２実験平均ＵＶ線量＝５２ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した細胞培養培地におけるＵＶ線量分布のグラフである。

【図25C】図２５Ｃ−１流量＝７．６ｌｐｍ予測平均ＵＶ線量＝３５ｍＪ／ｃｍ²；図２５Ｃ−２予測平均ＵＶ線量＝５０ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した細胞培養培地におけるＵＶ線量分布のグラフである。

【図26A】図２６Ａ−１流量＝２．２ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝８９ｍＪ／ｃｍ²；図２６Ａ−２実験平均ＵＶ線量＝４７ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した細胞培養培地における１０％ＤＢＳのＵＶ線量分布のグラフである。

【図26B】図２６Ｂ−１流量＝３．８ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝５３ｍＪ／ｃｍ²；図２６Ｂ−２実験平均ＵＶ線量＝３６ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した細胞培養培地における１０％ＤＢＳのＵＶ線量分布のグラフである。

【図26C】図２６Ｃ−１流量＝６ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝３４ｍＪ／ｃｍ²；図２６Ｃ−２実験平均ＵＶ線量＝２８ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した細胞培養培地における１０％ＤＢＳのＵＶ線量分布のグラフである。

【図27】ビタミンＣ水溶液のＵＶＣ吸光度測定値のグラフである。

【図28A】図２８Ａ−１流量＝２．２ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝１０４ｍＪ／ｃｍ²；図２８Ａ−２実験平均ＵＶ線量＝８１ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した０．１ｇ／Ｌ（４．７吸光度単位の吸光度）ビタミンＣ溶液のＵＶ線量分布のグラフである。

【図28B】図２８Ｂ−１流量＝３．８ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝６１ｍＪ／ｃｍ²；図２８Ｂ−２実験平均ＵＶ線量＝６３ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した０．１ｇ／Ｌ（４．７吸光度単位の吸光度）ビタミンＣ溶液のＵＶ線量分布のグラフである。

【図29A】図２９Ａ−１流量＝２．７５ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝９１ｍＪ／ｃｍ²；図２９Ａ−２実験平均ＵＶ線量＝８１ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した０．０４ｇ／Ｌ（１．９４吸光度単位の吸光度）ビタミンＣ溶液のＵＶ線量分布のグラフである。

【図29B】図２９Ｂ−１流量＝４．７５ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝５３ｍＪ／ｃｍ²；図２９Ｂ−２実験平均ＵＶ線量＝６０ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した０．０４ｇ／Ｌ（１．９４吸光度単位の吸光度）ビタミンＣ溶液のＵＶ線量分布のグラフである。

【図29C】図２９Ｃ−１流量＝７．６ｌｐｍ、予測平均ＵＶ線量＝３５ｍＪ／ｃｍ²；図２９Ｃ−２実験平均ＵＶ線量＝４７ｍＪ／ｃｍ²：で、蛍光分布の関数としてのＵＶＣリアクタを通した０．０４ｇ／Ｌ（１．９４吸光度単位の吸光度）ビタミンＣ溶液のＵＶ線量分布のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明は一般的にリガンドのハイスループット処理を対象にする。特定の態様では、本発明は、液体培地のハイスループットウイルス不活化を可能にする方法及び装置を対象にする。本明細書で使用されるように、液体培地は、限定されるものではないが、緩衝液、摂取可能流体、注射液、生物学的流体、血清、培地、バイオプロセス溶液、動物成分含有溶液、及びヒト又は動物使用のための治療薬を含む、ウイルス汚染を取り除きそして汚染可能性を防止することが望まれる、いずれの流体又は溶液を含む。１つの実施態様では、バイオプロセス溶液は、細胞培養培地、条件培地、クロマトグラフィー溶液（水又は溶出用緩衝液など）、又は製剤溶液である。１つの実施態様では、液体培地は細胞培養培地（例えば、血清含有細胞培養培地又は無血清培地）である。別の実施態様では、液体培地は、モノクローナル抗体、組換タンパク質、又は酵素などの少なくとも１つの治療用タンパク質を含む液体である。

【0010】

本明細書で使用される、液体の「ハイスループット」処理は、約０．５Ｌ／分（ｌｐｍ）と約５０Ｌ／分の間、又は約０．５Ｌ／分と約５Ｌ／分の間、又は約５Ｌ／分と約１０Ｌ／分の間の範囲の流量における処理を意味する。特定の実施態様では、大流量は、約１Ｌ／分、又は約２Ｌ／分、又は約３Ｌ／分、又は約４Ｌ／分、又は約５Ｌ／分、又は約１０Ｌ／分、又は約２０Ｌ／分、又は約３０Ｌ／分、又は約４０Ｌ／分、又は約５０Ｌ／分である。

【0011】

ウイルスは、例えば、ＨＩＶ、ＢＩＶ、ウシ白血病、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｇ型肝炎、ヘルペスウイルス、Ｃａｃｈｅバレーウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、αウイルス、Ｂｏｒｎａウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ｖｏｒｏｎａウイルス、ＰＲＲＳＶ、ＬＤＨＥＶ、ＢＶＤＶ、及びフラビウイルスなどのエンベロープウイルス、及び、例えば、Ａ型肝炎、Ｅ型肝炎、パルボウイルス、カリシウイルス、ベシウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、コブウイルス、テシオウイルス、シルコウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、及びロタウイルス、などの非エンベロープウイルスを含む。本発明の１つの実施態様では、本発明の装置及び方法はエンベロープウイルスの不活化のために使用される。本発明の別の実施態様では、本発明の装置及び方法は非エンベロープウイルスの不活化ができる。ウイルス不活化は、本発明の装置及び方法が、
非処理対照培地におけるウイルス濃度と比べて、ウイルスの濃度が少なくとも２対数減少（log reduction）、好ましくは少なくとも３対数減少、より好ましくは少なくとも４対数減少、最も好ましくは少なくとも５対数減少あるいはそれ以上減少することができることを意味する。当業者には当然のことながら、ウイルス減少の測定は、公知ウイルスの測定量でスパイクされている未処理対照を提供すること、及び本発明の装置又は方法で未処理対照を処理後に得られたレベルと比較することなど、当技術分野における一般的な方法に基づいてよい。Wang, J., Mauser, A., Chao, S.-F., Remington, K., Treckmann, R., Kaiser, K., Pifat, D., and Hotta, J.、新しい紫外線−Ｃリアクタにおけるウイルス不活化及び蛋白質回収、Vox Sanguinis 86: 230-238 (2004); Chevrefils, G., Ing, B., Caron, E., Wright, H., Sakamoto, G., Payment, P., Benoit, B., and Cairns, W.、細菌、原生動物及びウイルスの増分ログ不活化を実現するのに必要なＵＶ線量、IUVA News 8(1): 38-45 (2006)を参照されたい。

【0012】

１つの実施態様では、図１Ａに示されるように、細胞培養培地などの液体のウイルス不活化のための装置１００は、外筒１２０（長さ、内径、及び外形の寸法で）及び外筒と同軸の内筒１３０から構成される１つの同軸円筒１１０を含む。外筒１２０及び内筒１３０の長さは、使用に応じて変化することができる。限定されるものではないが、特定の実施態様では、外筒１２０の長さは、約２５ｃｍと約１００ｃｍの間、又は約３５ｃｍと約９０ｃｍの間、又は約４５ｃｍと約８０ｃｍの間、又は約５５ｃｍと約７０ｃｍの間の範囲であってよい。装置は更に、液体培地入口１４０、内筒１３０内部の放射の少なくとも１つの紫外線Ｃのエミッタ１４５（同軸円筒１１０の断面で図１Ｂに示される）、及び液体培地出口１５０を含む。内筒１３０は、外筒１２０の長さ、及び図１Ｂに示されるように、内筒１３０の外径と外筒１２０の内径間にギャップ１６０を形成するように適合される外径１２０に実質的に等しい長さを有する。ギャップ１６０は約１ｍｍと約５ｍｍの間の範囲にあってよい。特定の態様では、ギャップは、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約３ｍｍ、約４ｍｍ、又は約５ｍｍである。液体培地は、図１Ｅに示されるように、ギャップ１６０のすべて、又は実質的な部分に沿って実質的にサイクロン流に流れる。サイクロン流は、同軸円筒１１０の軸に垂直なギャップ１６０に沿って断面の平面において二次旋回流を含むことができる。

【0013】

ギャップはまた、図３に示されるようにバッフル又は流れ偏向器などの静的ミキサエレメントを選択的に含む。本明細書に記載のように、液体はハイスループットでギャップ１６０を通して流れることができる。限定されるものではないが、特定の実施態様では、ギャップ１６０に沿った液体培地の流量は、約０.５ｌｐｍと約５０ｌｐｍの間、又は約５ｌｐｍｌと約４０ｐｍの間、又は約１０ｌｐｍと約３０ｌｐｍの間の範囲にあってよい。

【0014】

図１Ａに戻って、液体培地入口１４０は、好ましくは外筒１２０の端部で又は近くで外筒１２０に連結される。入口１４０は液体培地をギャップ１６０に沿って実質的にサイクロン流に流入するように構成される。図１Ｂに示されるように、入口１４０は、入口１４０に沿った中心線１７０が、外筒１２０の外径で、又は近くで位置１８５において入口１４０に沿って中心線１７０に垂直に外筒１２０の半径１８０と交差するように位置する。１つの態様では、図１Ｂに示されるように、入口１４０は外筒１２０及び／又は内筒１３０に対して接線方向である。

【0015】

外筒１２０に対して入口１４０の接線方向の連結は、ギャップ１６０に沿ったサイクロン流を作り又は増強する。当業者には当然のことながら、他の手段はギャップに沿ったサイクロン流を増強し又は維持するのに使用することができる。例えば、サイクロン流を増強する別の機能が、図１Ｃに示されるように、入口１４０の連結部と外筒１２０のその端部（即ち、入口が位置する外筒の端部）の間のスペースを最小化している。図１Ｆは、２つの同軸円筒１１０及び各同軸円筒１１０周りのハウジング１０５を含む装置１００の特定の実施例の説明図である。ハウジング１０５は、内筒１２０と外筒１３０間にＯ−リングシール１１５を含む。

【0016】

入口１４０に沿った中心線１７０は、図１Ｂに９０°で示されるように、外筒１２０の半径１８０とラジアル角ｒを形成する。ラジアル角ｒは、約９０°と約１５０°間、又は約１００°と約１４０°間、又は約１１０°と約１３０°の間の範囲にあってよい。

【0017】

図１Ｃに示されるように、入口１４０に沿った中心線１７０に平行な線は、図１Ｃに９０°で示されるように、外筒１２０の軸１９０と軸角ａを形成する。軸角ａは、約３０°と約９０°間、又は約４０°と約８０°間、又は約５０°と約７０°の間の範囲にあってよい。

【0018】

入口１４０は、図１Ｂの入口で示されるように、長方形、正方形、楕円形、又は円形断面など様々な形状を有することができる。長方形断面を備えた入口１４０も図１Ｄに示される。長方形又は正方形断面を備えた入口１４０も、図１Ｄの長方形断面で示されるように丸角を含む。

【0019】

図１Ｂに示されるように、紫外線Ｃの少なくとも１つのエミッタ１４５は、紫外線Ｃで処理しようとする液体培地に向けて紫外線Ｃを放射し、それにより細胞培養培地など液体培地中のウイルスを不活化するように、内筒１３０内部に位置する。少なくとも１つのエミッタ１４５は、約１.６ｃｍと約２．５４ｃｍの間の範囲の直径を有することができる。特定の実施態様では、少なくとも１つのエミッタ１４５は、１．６ｃｍ、１．７ｃｍ、１．８ｃｍ、１．９ｃｍ、２．０ｃｍ、２．１ｃｍ、２．２ｃｍ、２．３ｃｍ、２．４ｃｍ、２．５ｃｍ、及び２．５４ｃｍの直径を有することができる。複数のエミッタ１４５を内筒１３０内部に置くことができる。特定の態様では、例えば、１エミッタから、２エミッタ、３エミッタ、４エミッタ、５エミッタ、６エミッタ、７エミッタなど、８エミッタまで内筒１３０内部に置くことができる。図２に示されるように、７エミッタ１４５は内筒１３０内部に均等に分布することができる。紫外線Ｃ（ＵＶＣ）の少なくとも１つのエミッタ１４５は、例えば、低圧ＵＶＣランプ又は中圧ＵＶＣランプであり得て、そのいずれも市販されている。例えば、Heraeus Noblelight LLC, Duluth, GA.製ＵＶランプ参照。少なくとも１つのエミッタ１４５は、約２００ｎｍと約２８０ｎｍ間（ＵＶＣ範囲又はＣ型）、又は約２１０ｎｍと約２７０ｎｍ間、又は約２２０ｎｍと約２６０ｎｍ間、又は約２２０ｎｍと約２７０ｎｍ間、又は約２４５ｎｍと約２６０ｎｍの間の範囲の波長の放射を出す。１つの態様では、ランプは、約２５４ｎｍの波長を備えた単色性（ＵＶＣ範囲内）である。少なくとも１つのエミッタ１４５は、約８０Ｗと２００Ｗの間の範囲にランプ出力を有することができる。特定の態様では、少なくとも１つのエミッタ１４５は、約８０Ｗ、又は約９０Ｗ、又は約１００Ｗ、又は約１１０Ｗ、又は約１２０Ｗ、又は約１３０Ｗ、又は約１４０Ｗ、又は約１５０Ｗ、又は約１６０Ｗ、又は約１７０Ｗ、又は約１８０Ｗ、又は約１９０Ｗ、又は約２００Ｗのランプ出力を有することができる。

【0020】

当業者には当然のことながら、ＵＶＣ放射の透過はBeer-Lambert則により距離で指数関数的に減少する。図１０に示されるように、無血清細胞培養培地のＵＶＣ透過率は２５４ｎｍで約０．１％（約３吸光度単位のＵＶＣ吸光度）であったが、一方で１０ｖｏｌ％血清含有培地のＵＶＣ透過率は、水の２５４ｎｍで約７０％のＵＶＣ透過率（約０．１５吸光度単位のＵＶＣ吸光度）と比べて、２５４ｎｍで約０．００１％（約５吸光度単位のＵＶＣ吸光度）であった。無血清細胞培養培地の典型的なＵＶＣ吸光度は、約１．５と約２.５吸光度単位の間の範囲であってよい。血清含有細胞培養培地の典型的なＵＶＣ吸光度は、血清濃度により約２.５と約５．５吸光度単位の間の範囲であってよい。明細書に使用されているように、低透過率(即ち、高吸光度)液体は、約１％と約１Ｅ−５％の間の範囲で約２５４ｎｍの透過率（約２と約７吸光度単位の間の範囲のＵＶＣ吸光度）、又は約１％と約１Ｅ−８％の間の範囲で約２５４ｎｍの透過率（約２と約１０吸光度単位の間の範囲のＵＶＣ吸光度）、又は約１％と約１Ｅ−１３％の間の範囲で約２５４ｎｍの透過率（約２と約１５吸光度単位の間の範囲のＵＶＣ吸光度）、又は約１％と約１Ｅ−１８％の間の範囲で約２５４ｎｍの透過率（約２と約２０吸光度単位の間の範囲のＵＶＣ吸光度）、又は約１％と約１Ｅ−２３％の間の範囲で約２５４ｎｍの透過率（約２と約２５吸光度単位の間の範囲のＵＶＣ吸光度）、又は約１％と約１Ｅ−２８％の間の範囲で約２５４ｎｍの透過率（約２と約３０吸光度単位の間の範囲のＵＶＣ吸光度）、又は約１％と約１Ｅ−３３％の間の範囲で約２５４ｎｍの透過率（約２と約３５吸光度単位の間の範囲のＵＶＣ吸光度）、などの約１％と約１Ｅ−３８％の間の範囲で約２５４ｎｍのＵＶＣ透過率（約２と約４０吸光度単位の間の範囲のＵＶＣ吸光度）の液体である。

【0021】

図１Ａに戻って、出口１５０は、好ましくは入口１４０と反対側の外筒１２０の端部で又は近くで外筒に連結される。出口１５０は、入口１４０と類似した構成において、流出時に液体培地（細胞培養培地など）のサイクロン流を作り出し又は維持するように構成することができる。本発明の装置が図４〜７に示されるように複数の同軸円筒１１０を含むとき、そのような構成は特に有用である。

【0022】

外筒１２０及び内筒１３０は様々な材料から作ることができる。１つの態様では、外筒１２０はステンレススチール、通常３１６Ｌグレードなどの生物医薬品プロセスに好適な金属又は材料から作られる。別の態様では、内筒１３０はフッ素重合体及び／又は石英など、ＵＶＣ放射に実質的に透明な材料から作られる。あるいは内筒１３０及び外筒１２０は、液体のサイクロン流を容易にするために様々な形状で成形することができる。例えば内筒１３０(例えば、フッ素重合体製)は液体のサイクロン流を維持又は増強するように形成することができ、一方でギャップ１６０に沿った形状を提供することにより、又はギャップ１６０に沿った静的ミキサエレメント、粗面、又はリッジ（ridges）を提供することにより、二次乱流渦又は渦巻きを通して半径方向混合を増加させる。フッ素重合体で作られる内筒１３０は、装置１００の維持を簡略化するために、使い捨てもあり得る。クラスＶＩ規格を満たし、そしてそれ故医薬用途に好適なフッ素重合体材料の例は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フルオロエチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、及びペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、サンゴバンパフォーマンスプラスチック、アクロン、ＯＨを含むが、これらに限定されるものではない。

【0023】

特定の態様では、装置は２つ又はそれ以上の同軸円筒を含む。これらの実施態様では、装置は同軸円筒のそれぞれ間にコネクタを含む。例えば、図４に戻って、液体(例えば、細胞培養培地)のウイルス不活化のための装置１００は、第１の同軸円筒１１０及び第２の同軸円筒１１０間にコネクタ１９５を含む。コネクタ１９５は、本明細書に記載の入口１４０と類似した構成において、第１の同軸円筒１１０からの流出時に液体培地のサイクロン流を作り出し又は維持するように、構成することができる。

【0024】

当業者には当然のことながら、装置１００は、特別使用（例えば、処理しようとする液体の量及びタイプ等）により複数の同軸円筒を含むことができる。図５Ａ及び５Ｂに示されるように、そのような実施態様は更に１つ又はそれ以上のマニホールドを含むことができる。１つの態様では、装置１００は、複数の同軸円筒１１０を積層することができる少なくとも１つの入力マニホールド１１５を、そして少なくとも１つの出力マニホールド１２５を含む。同軸円筒１１０は、図４に示されるように垂直に、又は図６に示されるように水平に、又は図７Ａに示されるように垂直及び水平積層の混合物として、そして図７Ｂに示される対応の流れ図のように積層することができる。複数の同軸円筒を含んでなる装置の１つの利点は、限定スペース又は特注スパース条件に合う装置の能力である。図５Ａ、５Ｂ、及び６に示される積層配置は、マニホールド上で特定同軸円筒１１０を閉止するために更なるバルブ（示されず）を含むことができる。

【0025】

１つの実施態様では、同軸円筒１１０の積層は、装置の設置スペースが５フィートずつの単位で約５フィート未満又はそれに等しくなり得る。別の実施態様では、同軸円筒１１０の積層は、装置の体積が約１２５立方フィート未満又はそれに等しくなり得る。別の実施態様では、同軸円筒の積層（垂直か、水平、又は混合）は、装置が既存の製造又は他の装置周りに合うことができるようにし、一方で尚処理しようとするハイスループットの液体培地を尚提供する。高流量への縮尺は平行に多くのユニットを連結するのに係わることができる。例えば１つの実施態様では、この例では各ユニットが３ｍｍギャップの２同軸円筒を含み平行に１０ユニットだけ連結すること、及び１０ｌｐｍで作動することは、更なる入口エルボ損失の原因となることなく、平方インチ当り２．５ポンド（ｐｓｉ）の圧力損失で無血清細胞培養培地処理のために流量１００ｌｐｍを提供することができる。１つの実施態様では、装置１００は、濾過(通常約３０ｐｓｉまでを用いて)などで、装置の圧力下流を用いるプロセスの流れにおいて装置を使用することができるように、約５０ｐｓｉ以下の圧力で評価される。別の実施態様では、装置１００は、約２５ｐｓｉと約５０ｐｓｉの間の範囲の圧力で評価される。５ｐｓｉ以下の流れからの圧力損失で、１００ｌｐｍでの血清含有細胞培養培地の処理は、平行して２５同軸円筒によって実現することができ、これは５’ｘ５’ｘ５’設置スペースに十分に合うことができ、そして尚かつ約２５００Ｌ／ｈと約６０００Ｌ／ｈの間の範囲でスループットを有する。特定の実施態様では、スループット範囲は、約２２００Ｌ／ｈ、約２４００Ｌ／ｈ、約２５００Ｌ／ｈ、約２６００Ｌ／ｈ、約２８００Ｌ／ｈ、約３０００Ｌ／ｈ、約３２００Ｌ／ｈ、約３４００Ｌ／ｈ、約３６００Ｌ／ｈ、約３８００Ｌ／ｈ、約４０００Ｌ／ｈ、約４２００Ｌ／ｈ、約４４００Ｌ／ｈ、約４６００Ｌ／ｈ、約４８００Ｌ／ｈ、約５０００Ｌ／ｈ、約５２００Ｌ／ｈ、約５４００Ｌ／ｈ、約５６００Ｌ／ｈ、約５８００Ｌ／ｈ、又は約６０００Ｌ／ｈであってよい。

【0026】

当業者には当然のことながら、装置は更に様々な選択的部材を含んでよい。図８に戻って、別の実施態様では、液体（例えば、細胞培養培地）のウイルス不活化のための装置２００は、装置１００、及び場合により装置１００を通して液体培地（例えば、細胞培養培地）をポンピングするためのポンプ２１０を含む。あるいは、液体貯蔵タンク２１５からのヘッド圧は、装置１００を通して液体培地（例えば、細胞培養培地）を流すために使用することができる。装置２００は更に、液体培地（例えば、細胞培養培地）がそれに暴露されている線量を示すモニタ２２０（図８でＤ印）を選択的に含むことができ、そして更に１つ又はそれ以上の閉止弁２４０を選択的に含む。

【0027】

放射線量は、約５ｍＪ／ｃｍ²と約１００ｍＪ／ｃｍ²の間、又は約１０ｍＪ／ｃｍ²と約９０ｍＪ／ｃｍ²の間、又は約２０ｍＪ／ｃｍ²と約８０ｍＪ／ｃｍ²の間、又は３０ｍＪ／ｃｍ²と約７０ｍＪ／ｃｍ²の間、又は約４０ｍＪ／ｃｍ²と約６０ｍＪ／ｃｍ²の間の範囲であってよい。１つの態様では、非エンベロープウイルス濃度の望ましい少なくとも４対数減少を達成するための最小放射線量は約２０ｍＪ／ｃｍ²である。別の態様では、ウイルス濃度の望ましい少なくとも６対数減少を達成するための最小放射線量は約３０ｍＪ／ｃｍ²である。尚別の態様では、ウイルス濃度の少なくとも１５対数減少(理論的基礎)を達成するための最小放射線量は約５０ｍＪ／ｃｍ²である。装置２００は、下記のように、必要に応じて液体培地流れを調節しそして選択的に止めることができる液体培地流量調節弁２３０（図８でＦ印）を更に選択的に含むことができる。培地流量は約０.５ｌｐｍと約５０ｌｐｍの間の範囲であってよい。装置２００もまた、培地の流れを止めるための装置１００の上流の閉止弁２４０、及び放射に対して暴露過剰又は暴露不足になっている液体培地（例えば、細胞培養培地）を洗い流すためのフラッシングシステム２５０（図８でＷ印）を含む。フラッシングシステム２５０が作動するとき、流量調節弁２３０は閉鎖され、そして培地は装置１００の下流の閉止弁２４０を通して廃棄又は別の貯蔵タンクに送られる。当業者には当然のことながら、装置２００の選択的エレメントは様々な方法で構成することができる。

【0028】

処理しようとする液体によっては、当業者には当然のことながら、ギャップ寸法、同軸円筒の長さ、及び液体の流量は所望のウイルス不活化処理を得るために調整することができる。特定の実施態様では、外筒に対して接線方向に３ｍｍギャップ及び入口及びコネクタ、及び２つの直列同軸円筒で、無血清又は血清含有細胞培養培地は、約２０と約３０ｍＪ／ｃｍ²の間の範囲で最小放射線量に暴露することができ、約９０％の細胞培養培地は約８０〜約１００ｍＪ／ｃｍ²未満の放射線量に暴露され、約５０と約６０ｍＪ／ｃｍ²の間の範囲の平均放射線量で、約３と約５ｌｐｍの間の範囲の流量で、そして細胞培養培地は約２と約５吸光度単位の間の範囲の紫外線吸光度を有し、１〜２同軸円筒はシリンダ当り１ランプを含む。

【0029】

装置は様々な目的、例えばハイスループットでのいずれの液体処理など、例えば水又は食品工業（例えば、飲料の処理）に使用することができる。１つの実施態様では、細胞培養培地は本発明の方法及び装置によって処理することができる。

【0030】

細胞培養培地、並びにそれへ補足（supplement）は、当技術分野で周知である。多種多様な細胞培養培地は、例えば、Life Technologies, Inc. (Carlsbad, CA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA), Becton Dickinson & Co. (Franklin Lakes, NJ)などの様々な供給業者から市販されている。細胞培養培地は、原核細胞、真核細胞、及び始原細胞の培養に使用可能である。例えば、細胞培養培地は、細菌、昆虫細胞、始原細胞、植物細胞、酵母、哺乳類細胞、幹細胞、神経細胞及び他の細胞型に対して使用可能である。細胞培養培地は、各々化学的に確定された成分(合成培地など)を含んでよく、又は植物、動物又は鉱物起源由来のエキスなど、未確定の１つ又はそれ以上の成分を含んでよい。当技術分野で周知のように、細胞培養培地には、砂糖、塩、ビタミン、緩衝剤、エキス、化学薬品などの１つ又はそれ以上の栄養素、又は細胞増殖、培養物の生産又は安定化に資する他の栄養素を補足することができる。また当技術分野で周知のように、細胞培養培地には血清を補足してよい。例えば、動物血清は細胞培養での使用に周知である。例えば、哺乳類細胞培養に通常使用される動物血清は、限定されるものではないが、ドナーウシ血清（ＤＢＳ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、又は子ウシ血清を含む。

【0031】

特定の実施態様では、本発明の方法と装置は、ＵＶＣ線量を、その線量がウイルスを致死させることができる細胞培養培地（補足の有り又は無しで）に送達するように設計される。特定の実施態様では、本発明の方法と装置は、ＵＶＣ線量を、その線量がウイルスなどの感染性因子の存在リスクを軽減することができる、細胞培養培地（補足の有り又は無しで）に送達するように設計される。

【0032】

特定の態様では、細胞培養培地においてウイルスを不活化する方法は、細胞培養培地を、内筒の外径と外筒の内径間においてシリンダの長さに沿ったギャップを含む少なくとも１つの同軸円筒に導入することを含む。別の実施態様では、装置は複数の同軸円筒を含む。尚別の実施態様では、装置は同軸円筒のマニホールドを含む。培地は、ギャップに沿って実質的にサイクロン流に沿って細胞培養培地を流すように構成される入口を通して導入される。方法は更に、細胞培養培地を、それによって細胞培養培地中のウイルスを不活化するために細胞培養培地に向いて紫外線Ｃを放射するように、内筒内部に置かれた紫外線Ｃの少なくとも１つのエミッタで放射することを含む。方法は次いで、細胞培養培地を、入口の反対側の外筒の端部で、又はその近位の外筒に連結された細胞培養培地出口を通して流すことを含む。１つの実施態様では、細胞培養培地は、約２ｖｏｌ％と約１２ｖｏｌ％の間の範囲で血清を含む。特定の態様では、細胞培養培地は、４ｖｏｌ％血清、６ｖｏｌ％血清、８ｖｏｌ％血清、又は１０ｖｏｌ％血清を含む。別の実施態様では、細胞培養培地は無血清である。尚他の実施態様では、細胞培養培地は、無動物由来成分（無ＡＤＣ）、又は化学的に確定されている。別の実施態様では、細胞培養培地は、流加バッチを目的とした細胞培養培地である。

【0033】

別の態様では、ウイルスを不活化する方法は、モノクローナル抗体、酵素、融合タンパク質、又は組換タンパク質などの、少なくとも１つの治療用タンパク質を含む液体培地に対する生物医薬品工程の下流に適用することができる。特定の実施態様では、液体培地は、水、溶離液又は樹脂を含む溶液などのクロマトグラフィー液体である。他の実施態様では、液体培地は、治療用タンパク質の製剤化又は再構成された溶液である。

【0034】

〔実施例１〕−５ｍｍギャップ備えた装置
図４に示される装置１００の設計は、流体力学及び放射モデリングの第１原理に基づくコンピュータシミュレーションを用いる。モデル開発のワークフローは図９に示される。第１に、装置の詳細な３Ｄ形状モデルが構成される。装置１００は、流体側からランプを分離する石英管で囲まれるそのコア中のＵＶランプ（管形ランプ）を含む、２つのＵＶ処理チャンバから構成される。液体培地は、石英管と外筒壁の間のギャップに沿って流れる。

【0035】

計算流体力学（ＣＦＤ）は、液体培地のウイルス不活化のための装置のこのモデルにおける流量分布を解く場合の手段として使用された。Fluent, Inc., (Lebanon, NH)。ＣＦＤは、有限体積法を用いて、各制御体積（リアクタ形状は何百万の制御体積に離散化される）での第１原理ベースの流動方程式の数値解析に関与する。S. V. Patankar, Numerical Heat Transfer and Fluid Flow, Hemisphere, Washington, DC, 1980。

【0036】

流れ解（flow solution）は、予測流れパターンに関する情報を提供し、そして予測速度、圧力損失、及び乱流量の視覚化を可能にした。流れ解に続いて、離散座標法(ＣＤ)モデルと呼ばれる放射モデルを用いて、コンピュータモデル装置中の放射分布を予測した。コンピュータモデル中の各制御体積で、この流体エレメント又は制御体積離脱結果放射を算出するために、ＤＯモデルは入射光を把握し、そして処理しようとするポテンシャル流体の吸光度に基づく吸収、内散乱及び外散乱を勘案した。流れ解と同様に、このコンピュータ解析は、コンピュータモデル化装置にわたって制御体積の各々について実施され、このように装置中の予測ＵＶ放射の分布を提供した。放射モデルの境界条件では、壁面は、全方向における「拡散」、反射放射と考えられた。

【0037】

入射光は、ＵＶランプワット量並びにランプの効率及び表面積に基づいて算出された。典型的なランプ効率は、約３０％と約４０％の間の範囲である。更に、ランプ表面から石英外面まで１０％の放射損失が推定され、そしてこのように入射強度（Ｉｏ）が算出され、そしてすべての以下の計算において石英管の全長にわたって均一に分布していると考えられた。

【0038】

最終ステップとして、仮想トレーサ粒子（ウイルス粒子、タンパク質粒子、流体パケットのシミュレーション）は入口表面から放射された。４０００ほどの数の粒子が、流体によりそれらにかけられた流体力に基づき同軸円筒１１０を通して追跡された。粒子は十分小さく（１μｍの想定サイズ）、それらが流れとともに移動し、混合及び途中のＵＶ線量へ暴露の良好なインジケータを提供した。

【0039】

各粒子で、ＵＶ線量は、それが同軸円筒１１０を通して装置１００の出口１５０まで移動を続ける間累積記録された。ＵＶ線量は、
ＵＶＣ線量（Ｊ／ｍ²）＝入射光（Ｗ／ｍ²）^*暴露時間（ｓｅｃ） （１）
で計算された。
式１の結果は、追跡した粒子数に基づくＵＶＣ線量分布で、それは平均線量を決定するための統計的尺度、分散、並びに設定流量のための最小線量、培地の吸光度、及び同軸円筒１１０の形状設計として使用された。

【0040】

すべてのコンピュータシミュレーションは、Windows^(R) XP x64走行HP xw8600-Intel Xeon x５４５０ワークステーションでの市販のＣＦＤ ソフトウェア−ANSYS FLUENT（登録商標）バージョン６．３．２６を用いて実施された。使用解析は、高分解能有限体積メッシュ(１ｘ１０⁶制御体積より大)、精度増加のための二次数値離散化、及び残余の深部収束（１ｘ１０^-4）実現などの、モデリング化を確立した。

【0041】

実施例２及び３では、実施例１のコンピュータモデリングからの予測結果が記載される。当業者には当然のことながら、Lagrange化学光量測定は、コンピュータモデリングによって予測されたＵＶ線量分布を確認するため蛍光ミクロスフェアを使用する方法である。Anderson, W.A., Zhang, L., Andrews, S.A., Bolton, J.R. ＵＶ直接フルエンス分布の直接測定法、水質技術会議報告；米国水道学会：Philadelphia, PA, 2003。このアプローチでは、蛍光粒子は装置から上流へ放射され、そして粒子はＵＶ光で放射したとき化学反応を受ける。装置の流出では、これらの粒子は、ＵＶ線量暴露分布に対応するそれらの蛍光度がフローサイトメトリーで解析され、それ故明細書に記載の数学モデルへの確証をもたらす。

【0042】

〔実施例２〕−接線方向入口及びコネクタを備えた５ｍｍギャップ
図１１に示される設計繰り返しは、デッドスポットを除きそして混合を強化するために、５ｍｍのギャップ、接線方向入口１４０、及び接線方向コネクタ１９５を使用する。接線方向入口及びコネクタは、より良好な混合をもたらすサイクロン流を作り出し、このようにしてＵＶ線量分布を狭小化可能にする。図１２に示される予測流量分布はサイクロン流を示すが、管の長さを鑑みて、初期の密な旋回流は最終的にはまっすぐになろうとする。「５ｍｍ」とラベルされたこの設計の予測ＵＶ線量分布は図１３に示される。図１４に示される予測累積分布結果は、累積分布の傾きの変化が分散の直接インジケータであることから、分散の直接インジケータを提供する。この設計の分散は凡そ３１.７％である。

【0043】

〔実施例３〕−接線方向入口及びコネクタを備えた３ｍｍギャップ
この設計は、接線方向入口１４０及び接線方向コネクタ１９５に加えて、５ｍｍの代わりに３ｍｍの流体ギャップ１６０を伴う。この設計からの予測結果は「３ｍｍ」とラベルされて図１３及び１４に示される。無血清培地での予測分散は、非常に狭いＵＶ線量分布をもたらす２１．２６％へ予測実質減少を示す。図１４に示される急傾斜の予測累積分布は、設計改善機能の強いインジケータを予測する。例えば、無血清細胞培養培地の２.５ガロン／分（２.５ｇｐｍ又は９.５ｌｐｍ）の流量では、平均線量は、５７．８ｍＪ／ｃｍ²（ミリジュール／平方センチメートル）で３０ｍＪ／ｃｍ²の最小線量である。図１４に示されるように、無血清細胞培養培地の９０％は７５ｍＪ／ｃｍ²の最大線量まで暴露され得て、そして無血清細胞培養培地の１００％は１００ｍＪ／ｃｍ²未満の線量まで暴露され得る。

【0044】

図１５及び１６に示されるように血清含有（１０ｖｏｌ％）細胞培養培地では、予測は狭いＵＶ線量分布と類似している。特に、血清含有細胞培養培地では、分布は長いテイリングを予測するが、一方で最小線量は通常２０ｍＪ／ｃｍ²以下に残る。３ｍｍ流体ギャップ及び接線方向入口の設計では、線量分布は３０ｍＪ／ｃｍ²の最小線量で実質的に狭小化すると予測され、そして図１６に示されるように、血清含有細胞培養培地の９０％は、１ｇｐｍ（３.８ｌｐｍ）の流量で８５ｍＪ／ｃｍ²未満の暴露を受け、５８ｍＪ／ｃｍ²の平均線量である。

【0045】

３ｍｍの流体ギャップ並びに接線方向入口及びコネクタを備えた装置は、無血清細胞培養培地及び血清含有細胞培養培地の両方に対して十分に狭いＵＶＣ線量分布を提供する。並列構成のこのユニット内の圧力損失は、高流量に対してでも５ｐｓｉの限度内で良好と予測される。１００ｌｐｍの高流量での予測圧力損失は２．５ｐｓｉであり、一方で低流量の予測圧力損失は２．５ｐｓｉ未満の予測圧力損失をもたらす。設計はまた好みにより、必要に応じて連続して(例えば、２つから１つに) 同軸円筒の数を減らすことにより、低い圧力損失を実現するようにスケーラブルである。別の態様では、設計はまた、ギャップを１ｍｍ間に減少し、そして０.５Ｌ／分で作動する複数ユニットを用いることにより、非常に低透過率（約４０吸光度単位の吸光度）で濃縮回分流加培地の処理を実現するようにスケーラブルである。

【0046】

〔実施例４〕−３ｍｍギャップ並びに接線方向入口、コネクタ、及び出口を備えたＵＶＣ処理装置
ウイルス不活化を確実にし、一方で培地分解を引き起こす可能性のある高線量を超えない、高流量での細胞培養培地などの高吸光度流体を処理することができるＵＶＣリアクタの実験室スケールプロトタイプが構築され試験された。試験方法は、蛍光ミクロスフェアの使用を通したＵＶリアクタ検証のために、Bohrerova et al．によって開発された方法に基づく。Bohrerova, Z., Bohrer, G., Mohanraj, S.M, Ducoste, J., and Linden, K.G., Experimental measurements of Fluence distribution in a UV reactor using Fluorescent microspheres, Environ. Sci. Technol. 39: 8925-8930 (2005) を参照されたい。本方法では、ＵＶ線量曝露の分布は、ＵＶフルエンス値に対するミクロスフェアの蛍光の相関を通して得られた。

【0047】

材料及び方法
ＵＶＣ曝露（２５４ｎｍ）に感受性の蛍光ミクロスフェアは、PolyMicrospheres, Division of Vasmo, Inc., Indianapolis, INから得られ、これは約４．４４ｘ１０⁹粒子／ｍＬに等しい１ｗｔ％固体である１０ｍＬ溶液になった。それらは約１．６μｍの平均径を有した。これらのミクロスフェアは、ＵＶフルエンスに比例してＵＶＣ放射に暴露したとき光退色を受けた。この依存性はＵＶ線量分布を測定するのにこれらのミクロスフェアの利用を可能にした。

【0048】

培地中の蛍光ミクロスフェアのＵＶＣ処理
培地調製
実験の２日前に、細胞培養培地(約１．９５吸光度単位のＵＶＣ吸光度)及び１０％ドナーウシ血清（ＤＢＳ）含有細胞培養培地(約５．３吸光度単位のＵＶＣ吸光度)が、冷室から取り出され、室温で平衡化された。ミクロスフェアスパイク溶液を調製するために、細胞培養培地の５００ｍＬ溶液を２ｍＬミクロスフェア溶液と混合し、約１．８ｘ１０⁷ミクロスフェア／ｍＬ濃度を得た。スパイク溶液ボトルは実験前暴露を防止するためにアルミフォイルでカバーされた。

【0049】

ＵＶＣプロトタイプ試験
ＵＶＣプロトタイプは、３ｍｍの流体ギャップ、並びに約３０”（７６ｃｍ）の内筒及び外筒長さで図４に示される設計に基づいて構築された。チャンバへのサイクロン流を維持しそして再生成するために、設計は接線方向入口及び出口並びに接線方向コネクタを備えた２つの処理チャンバ（１ランプ／チャンバ）から構成された。ランプは、８５Ｗのワット数定格で２５４ｎｍにおける低圧単色ランプであった。しかしながら、ＵＶＣ効率定格はわずか約３２.９％であった。ランプは約２９”（７３．５ｃｍ）の長さであった。石英表面での放射フラックスは、石英の表面積ベースでそして損失を入れて約４００Ｗ／ｍ²と推算された。

【0050】

ＵＶＣリアクタは図１７に示される概略図のように設定された。システムは、培地バッグが連結される前に脱イオン水でフラッシングされた。

【0051】

４０、５８、及び１００ｍＪ／ｃｍ²の目標の平均ＵＶフルエンスに到達するために、必要な流量は図１に示されるように事前のＣＦＤ予測の外挿に基づいて推算された。ミクロスフェアの希釈液は、約１ｘ１０⁵ミクロスフェア／ｍＬの濃度を得るために、培地がＵＶＣリアクタに入る前に流れにスパイクされた。

【0052】

ＵＶＣリアクタは約６５０ｍＬの容積を有した。ミクロスフェアの一貫した出口濃度を得るために、一度ミクロスフェアのスパイクが始まると９９％のウォッシュアウト（washout）が目標とされた。表１は各流量に対して計算されたウォッシュアウト時間を含む。ウォッシュアウト時間はウェル混合リアクタと仮定して計算された。

【0053】

【表1】

【0054】

すべての細胞培養培地ランでは、適切なウォッシュアウト時間が表１のように達するまで、流れは廃棄物タンクに向けられた。次いで流れは３分間放射線にさらされた培地ボトルに向きが変えられ、ボトルを毎分変更する。システムは各ランの間に脱イオン化水で洗浄される。

【0055】

各培地タイプに対する対照ランは、１００ｍＪ／ｃｍ² の目標フルエンス（fluence）に使用されるものと同じポンプセットを用いて、消えたＵＶランプによって実施された。

【0056】

細胞培養培地処理では、２つのＵＶランプの１つは取り外された。ＤＢＳ含有培地を処理するため、両ランプが目標線量を達成するのに使用された。過熱を防止するためにＵＶＣユニットを通して流れる脱イオン化水による処理前に、ランプが１０分間点灯された。流量は表１のように流れた。

【0057】

サンプリング
各処理ラン後に、１Ｌを各流出ボトルから１Ｌの丸型ボトルに注ぎ込み、残りは廃棄した。丸型ボトルは更なるミクロスフェア暴露を防止するためにアルミフォイルでカバーされ、冷室に貯蔵された。

【0058】

サンプリングの第１日目に、３つの２００μＬサンプルは、フローサイトメトリー（ＦＣ）分析のために各細胞培養培地流出ボトルから９６ウェルプレートへ入れた。各未処理培地の１つのサンプル(ミクロスフェアではなく)も比較目的で含まれた。

【0059】

サンプリングの２日目は１日目の４日後であり、そして２つの９６ウェルが含められた。各スパイク溶液からのサンプルもまた含められ、同様に１日目に試験した各流出ボトルからの単一サンプルも含められた。プレート２は細胞培養培地の各流出ボトルからの単一サンプルを含んだ。

【0060】

ベンチスケールキャリブレーション
ＵＶフルエンスと蛍光の間の関数関係を明らかにするために、ベンチスケールキャリブレーション実験では、擬似平行ビーム装置及び１０〜１２０ｍＪ／ｃｍ²にわたる均一な線量のためにミクロスフェア水溶液を使用した。サンプルはランダム化順位で三重に流れ、そして貯蔵溶液から排出された。

【0061】

貯蔵ミクロスフェア溶液のペトリファクター及びＵＶ透過率はサンプルの放射前に測定された。Bolton, J. R., and Linden, K. G.、ベンチスケールＵＶ実験でのフルエンス（ＵＶ線量）測定方法の標準化、J. Environ. Eng., 129(3), 209 (2003)参照。放射照度測定値はサンプル暴露の前後で直ちに取得された。サンプルは、０．３２ｍＬの全量で６０ｘ１５ｍｍペトリ皿中マイクロマグネティックスターラーを用いて混合された。

【0062】

フローサイトメトリー
ミクロスフェアの蛍光変化は、４つのレーザを備えたBD(登録商標)Biosciences特注フローサイトメーターLSR IIを用いて検出された。BD Biosciences, San Jose, CA。４８８ｎｍ青色レーザ及び３５１ｎｍＵＶレーザがミクロスフェアの励起のために使用された。散乱光は青色レーザで検出され、そしてミクロスフェアの蛍光放射光は帯域通過フィルタ４０７／３０ｎｍを用いてＵＶレーザで集光された。データは、BD(登録商標) Biosciences DiVa(登録商標) ソフトウェア及び／又は FlowJo(登録商標) (Tree Star, Inc., Ashland OR)データ解析ソフトウェアを用いて処理・解析され、そしてまた更なる処理及び解析のためにMATLABへ輸送された。

【0063】

ＵＶＣ線量のＣＦＤ予測
新しい計算は、予測ＵＶＣ線量を得るために。実際の実験流量で上記のようにＣＦＤ手法を用いて、そして約４００Ｗ／ｍ²の石英表面からの入射光フラックスを想定して実施された。約４.７吸光度単位（更に下記のように）の吸光度のビタミンＣモデル溶液に対するＣＦＤ計算も、実験データと比較するために行われた。

【0064】

データ解析
前処理
フローサイトメトリーから得られた生データは、蛍光測定値の日々の変動を説明するために正規化された。それぞれの対照サンプル（０ｍＪ／ｃｍ²ＵＶ線量）に対する蛍光分布の平均が正規化因子として選択された。図１８Ａ及び１８Ｂは、正規化の前（図１８Ａ）及び後（図１８Ｂ）に水及び細胞培養培地での蛍光分布を示す。

【0065】

蛍光分布をＵＶ線量分布に転換
較正実験から得られたサンプルの蛍光測定値は、単一のＵＶ線量で放射されたミクロスフェアの集団の蛍光分布を示した。図１９は種々のＵＶ線量レベルで放射されたサンプルの蛍光分布を示す。いずれの特定の理論によって縛られることを望むものではないが、蛍光レベルのこの変動は、ミクロスフェア集団内の固有の不均質性に、並びにフローサイトメトリー装置の特性に起因しているようである。

【0066】

文献及び科学的予測に基づいて、図２０Ａ及び２０Ｂに示されるように、各ＵＶ線量の水較正データの平均蛍光は線形フィットと相関した。フィットの曲率は主として０〜２０ｍＪ／ｃｍ²の間の低線量においてであった。図２０Ａ及び２０Ｂに示される予測フィットでは、低線量結果は過剰予測になり得て、一方で高線量結果は約１２ｍＪ／ｃｍ²のＲＭＳＥで過少予測となり得る。

【0067】

平行ビーム実験は粒子に対して均等線量を必要とすることから、較正データは水で得られた。検量線を細胞培養培地及びビタミンＣ溶液などのモデル溶液に適用する際に、蛍光データは、水で集められている、しかし細胞培養培地に適用されている較正データを説明するために、水対照（ＵＶ線量＝０）からの対応の蛍光測定値に対して、細胞培養培地対照（ＵＶ線量＝０）中のミクロスフェアの蛍光測定値に基づいて計られた。

【0068】

種々の流量で細胞培養培地に対してＵＶＣリアクタから得られたサンプルの典型的な蛍光測定値が図２１に示される。データ解析方法の目標は、フローサイトメトリー測定値からの蛍光分布を鑑みてＵＶＣリアクタによって送達される線量分布を推定することであった。この推定は、Blatchley et al., ＵＶ線量分布を定量化するための染色ミクロスフェア: Lagrange化学光量測定による光化学リアクタの特性化, J. Env. Eng. 132: 1390-1403. (2006)によって開発された方法を用いて実施された。１３９６ページにおいてこれらの著者は以下の仮説を提案した：

【0069】

線量分布にかけられたミクロスフェアを含むサンプルにおける[蛍光]分布は：
１．ＵＶ線量分布；
２．フローサイトメトリーに付随した測定誤差；及び
３．染色ミクロスフェア内の集団不均質性によって生じた。
その上、これらの誤差原因は独立性で、従ってそれらの影響は付加的であることが想定された。

【0070】

数学的に説明すると、連続フローＵＶリアクタから収集したサンプルで測定された[蛍光]分布は、各々個別の線量及び線量分布に起因する[蛍光]分布の畳み込みとして表すことができるとの仮説が立てられた。

【0071】

Blatchley et al.による数式
以下の定義は、実施例４からのデータ解析中に使用され、そして図２２Ａ、２２Ｂ、及び２２Ｃにおいて絵を用いて説明された。
ｉ＝係数線量指数（Ｄ）増分（瓶幅＝５ｍＪ／ｃｍ²；ｉ＝１，２，．．ｍ）
ｊ＝創設蛍光指数（Ｆｌ）増分（瓶幅＝０．０２；ｊ＝１，２，．．ｎ）
α_i＝線量Ｄ_iを受けるサンプル中の粒子のフラクション
β_j＝蛍光Ｆｌ_jを放射するサンプル中の粒子のフラクション
Γ_j,i＝蛍光Ｆｌ_jを放射する線量Ｄ_iを受けるサンプル中の粒子のフラクション

【0072】

数学的に、仮説は下記の式によって表すことができる−

【数1】

【0073】

本式では、β_j、蛍光Ｆｌ_jを放射する粒子のフラクションは、α₀からα_mまでの範囲の種々のＵＶ線量への暴露に因りＦｌ_jを放射するフラクションの一次線形結合である。種々の値のｊに対して書かれているとき、式２は、以下のようにベクトル形で表すことができるセットの一次方程式を形成する−

【数2】

【0074】

デコンボリューションの目的は、ベクター[α]によって表される線量分布の推定をもたらすことであった。各作動条件で、ベクター[β]はＵＶＣリアクタ由来のサンプルのフローサイトメトリー解析からの蛍光分布(ヒストグラム)であった。

【0075】

Blatchley et al. 方程式の解法
マトリックス[Γ]は、較正実験中に均一なＵＶ線量に暴露されたサンプルのフローサイトメトリーからのデータに対して、Weibull分布を用いて補間アルゴリズムの適用によって計算された。
連立方程式を解くために、ＵＶ線量分布（α_iの値）が、ＵＶＣ線量分布の予想形状に基づいて対数正規分布に従うことも想定された。

【0076】

式４は以下のように繰り返し形式で解かれた：
１）対数正規分布の２つのパラメータ、平均μ及び標準偏差σはＵＶ線量分布、 [α]_gの初期推測を生み出すのに想定された。
２）蛍光分布は、式４を用いて[β]_gは式４を用いて所定の[α]_gで計算された。
３）計算された[β]_g値は実験的に得られた[β]値と比較された。全誤差は、

【数3】

と計算された。
４）[α]_gの平均及び標準偏差は全誤差を最小化するように最適化された。ステップ１〜３は、誤差が許容基準になるまで反復された。
ステップ１〜４は、MATLABコード(MathWorks, Natick, MA)を用いて実行された。

【0077】

データ解析技術の検証
前項に記載されるデータ解析技術は数学的畳み込み実験を用いて検証された。試験ＵＶ分布は較正サンプルの蛍光測定値から数学的に構成された。較正サンプルの蛍光分布測定値は、新しい畳み込み蛍光分布を生成するように事前に定義された割合で数学的に混合された。２つの試験分布は表２に示される割合で較正サンプルを混合することによって生成された。得られた蛍光分布は図２３に示される。

【0078】

【表2】

【0079】

前項に記載される数学的手法は、図２３に示される蛍光分布からのＵＶ線量分布を計算するために適用された。結果は図２４に示される。表２に挙げる混合割合に対応する実際のＵＶ線量分布は、予測ＵＶ線量分布と同じプロットにプロットされた。実際値と予測値間に非常に良好な一致が認められた。図２４では、本検討で使用された数学的手法は、蛍光分布データからＵＶ線量分布を予測することができた。

【0080】

結果
Ｆｌ分布データから推定されたデバイスを通した細胞培養培地のＵＶ線量分布は図２５Ａ、２５Ｂ、及び２５Ｃに示された。各流量のグラフは、３つの異なるジャーに収集されたサンプルから得られた３つの異なる曲線を示し、工程における異なる時点を表した。ジャーからジャーまでの最小変動はＵＶＣリアクタの定常作動を示唆した。ＣＦＤシミュレーションによって予測されたＵＶ線量分布も同じプロット上にプロットされた。正確な実験条件でのＣＦＤ計算を用いて実験結果を比較した。

【0081】

７．６Ｌ／分（ＬＰＭ）の高い流量では、実験中に均一な流れを維持することに関連するポンピングの問題があり、そしてそれ故に第３のサンプルは、図２５Ｃ−１に示されるようにフローサイトメトリー解析で十分なミクロクロスフェアを受け入れなかったと思われる。結果もまた高い流量では過剰予測され、これらは図２０Ａ及び２０Ｂに示される嵌め合い等級と一致した。

【0082】

デバイスを通した細胞培養培地中の１０％ＤＢＳのＵＶ線量分布がＦｌ分布データから推定され、そして図２６Ａ、２６Ｂ、及び２６Ｃに示されるようにモデル（ＣＦＤ）と比較された。血清含有培地による観察は、平均値を含む予想ＵＶ線量分布の予測の下で一致していた。

【0083】

流れ及びＵＶＣ放射の物理学は検討した流量及び吸光度の範囲で変化することが予想されなかったことから、すべての実験的ＵＶ平均線量が予測よりも一貫して低いという観察は、１０％ＤＢＳ培地中の血清成分とミクロクロスフェアとの相互作用に因るもので、遮蔽作用を引き起こしそして結果を交絡する可能性を示唆した。１０％ＤＢＳ細胞培養培地と類似の吸光度を有するモデル溶液が、結果のこの潜在的矛盾を解決するために使用された。ビタミンＣの水溶液がそのようなモデル溶液の潜在的候補として特定された。３つの異なる濃度のビタミンＣ（アスコルビン酸）溶液が、２５４ｎｍで吸光度を測定するためにＵＶ分光光度計（Agilent 8453）を用いて試験された。図２７に示されるように結果は、ビタミンＣ溶液が１０％ＤＢＳ細胞培養培地の吸光度を模倣するモデル流体として使用でき、一方で水様粘度及び密度を維持することを確認した。

【0084】

１０ｇ／ＬのビタミンＣ溶液の貯蔵溶液を使用して、約４.７吸光度単位のＵＶＣ吸光度を有した０．１ｇ／ＬのビタミンＣ溶液を作った。溶液の吸光度がＵＶ暴露によって変化しないことを確認するために、吸光度値がＵＶ放射による実験の前後に測定された。モデル溶液で用いられた実験手順は、細胞培養放射実験を行う手順と同じであった。

【0085】

０．１ｇ／ＬのビタミンＣ溶液の結果を、４.７の吸光度値のＣＦＤ予測と比較して図２８Ａ及び２８Ｂに示した。ビタミンＣモデル溶液では、モデル結果は実験結果と良く一致し、デバイスが血清含有細胞培養培地など高吸光度流体でも正常に機能することを確認した。

【0086】

無血清細胞培養培地（１.９５吸光度単位の吸光度）を模倣するように、ビタミンＣ溶液による実験も繰り返された。０．０４ｇ／ＬのビタミンＣ溶液濃度は、１.９４吸光度単位のＵＶＣ吸光度をもたらし、そしてこれはＵＶ処理前の溶液をサンプリングすることにより確認された。放射溶液のサンプルもＵＶＣ吸光度測定のために採取され、溶液の吸光度が放射に因って変化しないことを確認した。モデル溶液で用いられた実験手順は、細胞培養放射実験を行う手順と同じであった。０．０４ｇ／ＬのビタミンＣ溶液の結果を、ＣＦＤ予測と比較して図２９Ａ、２９Ｂ、及び２９Ｃに示した。

【0087】

ビタミンＣモデル溶液は、図２５Ａ、２５Ｂ、及び２５Ｃを図２９Ａ、２９Ｂ、及び２９Ｃと比較することにより示されるように、無血清細胞培養培地と同様の結果をもたらし、モデル溶液としてビタミンＣで取られたアプローチの確認を提供した。観察された変動性は、実験的変動及び水較正データとの嵌め合い等級、並びに水較正データセットを細胞培養培地などの高い吸光度流体に拡張するのに使用される近似の範囲内であった。

【0088】

結論
図４に示される設計に基づいて構築された実験室スケールプロトタイプが、細胞培養培地でＵＶＣ線量分布を測定するために、蛍光ミクロスフェアを用いて試験された。ユニットは、接線方向入口、出口を備えた３ｍｍ流量ギャップ、及びまた２処理チャンバの接線方向コネクタを有した。結果は、実験的に測定したＵＶ線量分布がＣＦＤ予測とよく合うことを示した。血清含有細胞培養培地の結果は線量を過小予測したが、これは血清成分と結果を交絡する蛍光ミクロスフェアとの相互作用に因ると考えられる。これは同様に高吸光度値をもたらしたことから、血清含有細胞培養培地のモデル流体としてビタミンＣ水溶液による実験が繰り返された。結果はＣＦＤ予測とよく一致し、プロトタイプが高吸光度流体においてウイルス不活化を可能にするＵＶ線量を送達することができることを明らかにした。有効なアプローチとして、ビタミンＣによるモデル流体は、無血清細胞培養培地用のモデルビタミンＣ溶液を作製することによって検証され、そして結果は予測と良い一致を立証した。

【0089】

要約すれば、ＵＶＣプロトタイプユニットによって図示される本発明の装置は、予測したように、血清の有り又は無しでの、細胞培養培地などの高吸光度流体で、狭いＵＶＣ線量分布をもたらすことができることが証明された。従って、本発明の装置は様々なウイルスを殺菌するのに必要なＵＶ線量を送達する。

【0090】

すべての関連する患者への教示、公開出願及び本明細に引用された参考文献は、それらの全文が参照することにより本明細書に組み入れられている。

【0091】

本発明はその例示実施態様を参照して特に示され記載されている一方で、当業者には当然のことながら、形式又は詳細の様々な変更は、添付された特許請求の範囲によって包含された本発明の範囲から逸脱することなく本明細書において行われてよい。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図29C】