特許 5771005 グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を示す化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5771005

(24)【登録日】2015年7月3日

(45)【発行日】2015年8月26日

(54)【発明の名称】グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を示す化合物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/605 20060101AFI20150806BHJP

   A61K 38/26 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20150806BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/605ZNA

   A61K37/28

   A61K47/48

   A61P43/00 111

   A61P3/10

   A61P3/04

   A61P13/12

   A61P3/06

【請求項の数】17

【全頁数】103

(21)【出願番号】特願2010-532174(P2010-532174)

(86)(22)【出願日】2008年10月27日

(65)【公表番号】特表2011-502159(P2011-502159A)

(43)【公表日】2011年1月20日

(86)【国際出願番号】US2008081333

(87)【国際公開番号】WO2009058734

(87)【国際公開日】20090507

【審査請求日】2011年10月27日

(31)【優先権主張番号】60/983,766

(32)【優先日】2007年10月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/090,441

(32)【優先日】2008年8月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507277642

【氏名又は名称】インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＩＡＮＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ディマルキ，リチャード，ディー．

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ビン

(72)【発明者】

【氏名】オーヤン，チェンガン

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５０８６３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５３１６３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０５６３６２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／１０１１４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Medicinal Chemistry，２００１年，Vol.44, No.9，p.1372-1379

【文献】 Journal of Medicinal Chemistry，２００１年，Vol.44, No.19，p.3109-3116

【文献】 Journal of Medicinal Chemistry，２０００年，Vol.43, No.9，p.1714-1722

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドであって、
Ａが、下記：
（ｉ）ＰＬＡ；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；及び、
（ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド；
からなる群より選択され；
Ｂが、配列番号１のアミノ酸ｐ−２６を表すか、または、
Ｂが、下記（ｉｖ）〜（ｘ）からなる群より選択される、１つ以上のアミノ酸修飾を有する配列番号１のアミノ酸ｐ−２６を表し、
（ここでｐは、３、４、５、６又は７である）：
（ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は、下記構造：

【化1】

〔ここで、Ｘ₅は、Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₄アルケニル若しくはＣ₂〜Ｃ₄アルキニルである〕
を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体、による、９位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による、１０、２０及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換；
（ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による、１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換（ここで前記群のアミノ酸は親水性部分に共有結合している）；
（ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸による１５位（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１６位（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
（ｉｘ）Ｇｌｎによる１７位のＡｒｇの交換、Ａｌａによる１８位のＡｒｇの交換、Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの交換、Ｉｌｅによる２３位のＶａｌの交換、及びＡｌａによる２４位のＧｌｎの交換（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）；
（ｘ）Ｇｌｕによる１６位のＳｅｒの交換、Ｇｌｕによる２０位のＧｌｎの交換、又はＧｌｕによる２４位のＧｌｎの交換（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）；
そして
Ｃが、下記（ｘｉ）〜（ｘｉｖ）からなる群より選択され：
（ｘｉ）Ｘ；
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘｉｖ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号２１，２６，２７，及び５０からなる群より選択される）；
下記（１）及び（２）を含む：
（１）分子内架橋、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸、若しくは１６位（配列番号１の番号付けによる）の酸性アミノ酸、又はそれらの組み合わせ、及び、
（２）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミド又はエステル。

【請求項2】

請求項１のペプチドであって、
ａ）前記１６位の酸性アミノ酸は、側鎖スルホン酸又は側鎖カルボン酸を含むアミノ酸であり、及び／又は
ｂ）前記ＰＬＡのオキシ誘導体は、エステル結合又はエーテル結合を介して、アミノ酸、ペプチド、親水性ポリマー、アシル基、又はアルキル基に結合しているＰＬＡであり、及び／又は
ｃ）前記（ｉｉｉ）のペプチドは、配列番号１のアミノ酸ｑ−６を含み（ここでｑは、１、２、３、４又は５である）、及び／又は
ｄ）Ｂは、配列番号１のアミノ酸７−２６を表し、及び／又は
ｅ）Ｙ又はＺが荷電アミノ酸である場合、該荷電アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群より選択され、及び／又は
ｆ）ＣがＸ−Ｙ−Ｚを含む場合、ＺのＣ末端に荷電アミノ酸１〜２個を更に含む、
ペプチド。

【請求項3】

前記１６位（配列番号１の番号付けによる）の酸性アミノ酸が、側鎖スルホン酸又は側
鎖カルボン酸を含むアミノ酸であって、
該酸性アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、
システイン酸、ホモシステイン酸、Ａｓｐ、又は下記構造：

【化2】

〔ここで、Ｘ₅は、Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₄アルケニル又はＣ₂〜Ｃ₄アルキニルであ
る〕
を有するＣｙｓのアルキル化誘導体からなる群より選択される、請求項１または２に記載のペプチド。

【請求項4】

前記ＰＬＡのオキシ誘導体が、エステル結合を介してアミノ酸又はペプチドに共有結合しているＰＬＡを含むデプシペプチドである、請求項１記載のペプチド。

【請求項5】

Ｂが、前記（ｖ）若しくは（ｖｉ）で示されたアミノ酸修飾、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチド。

【請求項6】

（ｉ）配列番号１のアミノ酸番号付けによる１６、２１又は２４位のアミノ酸残基又はＣ末端残基に共有結合している親水性部分及び／又はと、
（ｉｉ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介して、アシル基又はアルキル基に共有結合したアミノ酸、を含み、
該アミノ酸が、１０、２０若しくは２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）にあるアミノ酸であるか、又はＮ若しくはＣ末端の残基である、
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド。

【請求項7】

前記分子内架橋が、ラクタム架橋である、請求項１〜６のいずれか１項記載のペプチド。

【請求項8】

前記ラクタム架橋は、９位と１２位の２つのアミノ酸、１２位と１６位の２つのアミノ酸、１６位と２０位の２つのアミノ酸、２０位と２４位の２つのアミノ酸、または２４位と２８位の２つのアミノ酸（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の間にある、請求項７記載のペプチド。

【請求項9】

１６、２０、２１、又は２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）にαイソブチル酸（ＡＩＢ）を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載のペプチド。

【請求項10】

配列番号６０〜７０、７３〜７８、８０〜８８，９０〜９６，１０３，１０４，１０６及び１１４〜１１８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は、表１３に記載のペプチド２〜６、表１４に記載のペプチド１〜８、及び表１５に記載のペプチド２〜６，８，及び９のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載のペプチド。

【請求項11】

ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト作用の少なくとも５０％を示し、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも５０％の阻害を示す、請求項１〜１０のいずれか１項記載のペプチド。

【請求項12】

Ａが、ＰＬＡである、請求項１〜１１のいずれか１項記載のペプチド。

【請求項13】

配列番号５１の配列を含む、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストであって、ここで、配列番号５１の４位と７位、７位と１１位、１１位と１５位、１５位と１９位、又は、１９位と２３位の２つのアミノ酸同士が、ラクタム架橋を介して結合している、
グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト。

【請求項14】

ａ）当該グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのアミノ酸２４に結合した配列番号２１又は配列番号５０の配列、及び／又は
ｂ）配列番号５１の１６又は１９位のアミノ酸残基に共有結合している親水性部分と、当該グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの薬学的に許容される塩、及び／又は
ｃ）天然のＣ末端アミノ酸のカルボン酸基の代わりのアミド基と、及び／又は
ｄ）配列番号５〜９，配列番号１２〜１４，及び配列番号２２〜２５からなる群から選択されたアミノ酸配列、または配列番号１６−１９,３２,３３,３５,３６,４５−４８,６０,６２,６４,７４−７９,８９，９１−９３，９５，１１５−１１８からなる群から選択されたアミノ酸配列、または配列番号２,１０,１１,１５,２０,３４,３８,３９，６１，７２，９４，９９，１０５，１１０からなる群から選択されたアミノ酸配列、または配列番号６６，７０，８６，８７，１１２，１１３からなる群から選択されたアミノ酸配列、
を含む請求項１３のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト。

【請求項15】

請求項１〜１２のいずれか１項記載のペプチドを含む、多量体又は二量体、あるいは、
請求項１〜１２のいずれか１項記載のペプチドと、異種ペプチド又はポリペプチドとを含む、結合体。

【請求項16】

請求項１〜１２のいずれか１項記載のペプチド、請求項１５記載の多量体若しくは二量体若しくは結合体、又はこれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、滅菌された医薬組成物。

【請求項17】

患者における、高血糖症若しくは糖尿病の治療、食欲の抑制、体重増加の低減、又は減量の誘導に使用するための組成物であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド、請求項１５に記載の多量体若しくは二量体若しくは結合体、又はそれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

プレプログルカゴンは、１５８アミノ酸の前駆体ポリペプチドであり、異なる組織においてプロセシングされて、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃排出及び腸管成長、並びに食物摂取の調節などの多種多様な生理学的機能に関わる、多数の異なるプログルカゴン由来ペプチド、例えば、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ）などを形成する。グルカゴンは、プレプログルカゴンのアミノ酸３３から６１に対応する２９アミノ酸のペプチドであり、一方、ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンのアミノ酸７２から１０８に対応する３７アミノ酸のペプチドとして産生される。ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド又はＧＬＰ−１（７〜３７）酸は、ＧＬＰ−１受容体に対して実質的に同等の活性を示す、生物学的に活性のある形態のＧＬＰ−１である。

【0002】

グルカゴンは、一般に、インスリンの作用に対抗する対抗制御ホルモンとして機能して、特に低血糖の場合に血中グルコースレベルを維持する。したがって、グルコース調節におけるグルカゴンの一般的な役割は、インスリンの作用に対抗すること、並びに肝臓におけるグルコースの合成及び代謝の増強を介して血中グルコースレベルを維持することである。しかし、一部の１型又は２型糖尿病の患者では、絶対的又は相対的に上昇したグルカゴンレベルが低血糖状態に寄与することが示されている。健康な対照動物と１型及び２型糖尿病の動物モデルの両方において、選択的及び特異的抗体による循環グルカゴンの除去は、血糖レベルの低下をもたらした（Brand et al., Diabetologia 37, 985 (1994); Diabetes 43, [suppl 1], 172A (1994); Am. J. Physiol. 269, E469-E477 (1995); Diabetes 44 [suppl 1], 134A (1995); Diabetes 45, 1076 (1996)）。これらの研究は、グルカゴンアンタゴニスト作用が糖尿病の血糖制御に有用でありうることを示唆している。

【0003】

グルカゴンは、７膜貫通Ｇタンパク質共役受容体ファミリーのグルカゴン−セクレチンブランチの一部である受容体に結合し、それを活性化することによって、作用を発揮する。受容体は、アデニリルシクラーゼを活性化するように機能して、ｃＡＭＰレベルの増加をもたらす。以前の報告は、ペプチドに基づいた（Unson, C. G. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 789-94, Ahn, J. et al. (2001) J. Peptide Research 58, 151-8 and Ahn J. et al. (2001) J. Med. Chem. 44, 1372-9を参照すること）、並びにヌクレオチドに基づいた（Sloop K. et al. (2004) J. Clinical Invest. 113, 1571-81）グルカゴンアンタゴニストを同定している。ペプチドに基づいた阻害は、受容体結合のレベルで作用し、一方、後者は、グルカゴン受容体に特異的な細胞内ｍＲＮＡを抑制するように機能する。

【0004】

グルカゴン受容体のインヒビターが記載されており、一般にグルカゴンのアミノ酸配列に基づいている。１個以上のアミノ酸が欠失して又は置換されてグルカゴン受容体の強力なアンタゴニストを産生する幾つかの類縁体が記載されており、例えば〔ｄｅｓ Ｈｉｓ^１〕〔Ｇｌｕ^９〕−グルカゴンアミド（Unson et al., (1989) Peptides 10, 1171; Post et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1662）、ｄｅｓ Ｈｉｓ^１，Ｐｈｅ^６〔Ｇｌｕ^９〕−グルカゴンアミド（Azizh et al., (1995) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 16, 1849）及びＮｌｅ^９，Ａｌａ^{１１，１６}−グルカゴンアミド（Unson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(17), 12548）である。他の類縁体には、グルカゴン配列の４位（Ahn J M et al. (2001) J. Pept. Res. 58(2): 151-8）、１位（Dharanipragada, R. et al. (1993) Int. J. Pept. Res. 42(1): 6877）、並びに４、５、１２、１７及び１８位（Gysin B et al. 1986. Biochemistry. 25(25):8278-84）に置換のあるものが含まれる。

【0005】

ＧＬＰ−１は、グルカゴンとは異なる生物学的活性を有する。その作用には、インスリン合成及び分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害及び食物摂取の阻害が含まれる。ＧＬＰ−１は、糖尿病患者において高血糖症（グルコースレベルの上昇）を低減させることが示されている。ＧＬＰ−１と５０％のアミノ酸同一性を共有する、トカゲ毒由来のペプチドであるエキセンディン−４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）は、ＧＬＰ−１受容体を活性化し、同様に糖尿病患者において高血糖症を低減させることが示されている。

【0006】

ＧＬＰ−１及びエキセンディン−４が食物摂取を低減し、減量を促進する証拠もあり、これは、糖尿病患者のみならず、肥満に罹患している患者にとっても利益になる効果である。肥満の患者は、糖尿病、高血圧症、高脂血症、心血管疾患及び筋骨格系疾患の高い危険性を有する。

【0007】

本明細書に記載されるように、グルカゴンアンタゴニストとしても、ＧＬＰ−１アゴニストとしても高い効力の活性を示す、グルカゴン類縁体が提供される。より詳細には、新規グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、天然グルカゴン配列のＮ末端の新規な化学修飾、及び本化合物のＣ末端部分のアルファ−へリックス構造の安定化を可能にする天然グルカゴン配列の置換を表す。新規グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト化合物を、ＧＬＰ−１アゴニスト作用を同時に伴うグルカゴンアンタゴニスト作用が望ましいあらゆる状況に使用することができる。一つの実施態様によると、この化合物を糖尿病又は肥満の治療に使用することができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

一つの実施態様によると、強力な選択的グルカゴンアンタゴニスト作用及び選択的グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）アゴニスト作用を示す、グルカゴンの類縁体（グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト）が提供される。これらの２つの活性はそれぞれ、代謝症候群、特に糖尿病及び肥満の治療に極めて望ましい特性を示してきた。グルカゴンアンタゴニスト活性は、グルカゴンアゴニスト作用の抑制が望ましいあらゆる状況に有用である。ＧＬＰ−１アゴニスト作用の存在は、更に、膵臓からのグルカゴンの内因性分泌を抑制する一方で、インスリン合成及び分泌を刺激する。２つの薬理学的作用は、相乗的な様式で働いて代謝異常を正常化する。これらのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを更に修飾して、母体化合物のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト活性を維持しながら、本化合物の可溶性及び安定性を改善することができる。

【0009】

一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドを含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供され、ここで、グルカゴンペプチドは、Ｎ末端からの最初の１〜５個のアミノ酸残基（例えば、最初のアミノ酸、最初の２個のアミノ酸、最初の３個のアミノ酸、最初の４個のアミノ酸、最初の５個のアミノ酸）の欠失と、例えば、水素結合、塩架橋の形成のようなイオン相互作用、又は共有結合を介した、１２位と１６位、１６位と２０位、２０位と２４位及び２４位と２８位（天然グルカゴンペプチド配列による）から選択されるアミノ酸対の側鎖同士の相互の結合、などによる、化合物のＣ末端部分（野生型グルカゴン、配列番号１のアミノ酸番号付けにより１２〜２９位のアミノ酸の前後）のアルファ−へリックス構造の安定化とによって、修飾されている。あるいは、残基１２〜１９前後のアルファ−へリックス構造の安定化は、所望の活性を保持する位置での１個以上のα，α−二置換アミノ酸の導入によって達成される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチド又はその類縁体の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３、４つ又はそれ以上の位置は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）によるグルカゴンペプチド又はその類縁体の１６位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）での置換は、塩架橋又はラクタム架橋の不在下で安定化したアルファ−へリックスをもたらす。幾つかの実施態様において、１６、２０、２１又は２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３つ又はそれ以上の位置がＡＩＢで置換されている。

【0010】

一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、グルカゴンペプチドの更なる修飾を表し、ここでは、Ｎ末端欠失に加えて、天然グルカゴンペプチドの６位のフェニルアラニンが修飾されて、例えば、Ｎ末端アミノ基の代わりにヒドロキシル基を含む。更なる実施態様において、Ｃ末端アミノ酸の天然カルボン酸は、アミド又はエステルのような電荷中性基で置換されている。別の実施態様において、４位（天然グルカゴンペプチドの９位）のアスパラギン酸残基は、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、又は下記構造：

【化1】

〔ここで、Ｘ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_４アルケニル若しくはＣ_２〜Ｃ_４アルキニルである〕
を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。

【0011】

一つの実施態様において、システインのスルホン酸誘導体は、システイン酸又はホモシステイン酸である。

【0012】

一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１５又は配列番号５１の配列、より詳細には、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択される配列を含む。

【0013】

また、本明細書において更に提供されるものは、（１）分子内架橋、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸、若しくは１６位（配列番号１の番号付けによる）の酸性アミノ酸、又はそれらの組み合わせ、（２）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミド又はエステル、及び（３）一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ、を含むペプチド又はその結合体であり、
ここでＡは、下記：
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
（ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド
からなる群より選択され；
Ｂは、配列番号１のアミノ酸ｉ−２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６又は７である）、更に、例えば、グルカゴンペプチド若しくはグルカゴン類縁体又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストについて記載された修飾のいずれかを含む、本明細書において更に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含んでもよく、、そして
Ｃは、
（ｘ）Ｘ；
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号２１、２６、２７及び５０からなる群より選択される）
からなる群より選択される。

【0014】

一つの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのカルボキシ末端アミノ酸は、配列番号２１、２６、２７及び５０からなる群より選択される配列を含む第２のペプチドに共有結合している。例えば、一つの実施態様において、配列番号１５、配列番号５１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び２５のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２６（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、配列番号２７（ＫＲＮＲ）及び配列番号５０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ）からなる群より選択される配列を含む第２ペプチドに共有結合している。

【0015】

なお更なる例示的な実施態様において、前述の任意の化合物を、天然グルカゴンの１５又は１６位に対応するアミノ酸を修飾して特に酸性又はアルカリ性の緩衝液におけるペプチドの経時的な分解を低減することによって、更に修飾して安定性を改善することができる。

【0016】

グルカゴンペプチドが結合体部分に結合している、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの結合体も提供され、この結合は、共有結合を介してであっても、リンカーを介してであってもよい。

【0017】

別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの可溶性は、ペプチドへの親水性部分の共有結合により増強される。一つの実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。一つの実施態様によると、親水性部分が天然グルカゴンの１６、２１又は２４位に対応するアミノ酸残基に共有結合している、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、ポリエチレングリコール鎖が配列番号１３の１６位、配列番号１４の１９位又は配列番号１２の１６位と１９位のアミノ酸に共有結合している、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４の配列を含む。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様では、ポリエチレングリコール鎖は、少なくとも約２０，０００ダルトンの分子量を有する。あるいは、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１２の配列を含み、配列番号１２の１６及び１９位の両方アミノ酸に共有結合しているポリエチレングリコール鎖を有し、ここで２つのポリエチレン鎖の合計分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンであるか又は２０，０００ダルトンを超える。

【0018】

別の実施態様において、前記の任意のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの可溶性は、ペプチドのＣ末端部分、好ましくは、天然グルカゴンの２７位に対応するアミノ酸のＣ末端位置（すなわち、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの２２位のＣ末端）に荷電アミノ酸を導入するような置換及び／又は付加により修飾して、改善することができる。更に、１、２又は３個の荷電アミノ酸を、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのＣ末端部分の範囲内、好ましくは２２位のＣ末端に導入してもよい。一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの２３及び／又は２４位の天然アミノ酸が荷電アミノ酸で置換されている、並びに／或いは、更なる実施態様において、１〜３個の荷電アミノ酸もペプチドのＣ末端に付加されている。例示的な実施態様において、１、２個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。

【0019】

さらに別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、グルカゴンペプチドのＣ末端の１又は２個のアミノ酸（すなわち、天然グルカゴンペプチドの２９位又は２８及び２９位）の切断又は欠失により更に修飾されている。

【0020】

一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、対応するアミノ酸位置での天然グルカゴン残基の置換により修飾された、天然ＧＬＰ−１のうちの１つ以上のアミノ酸を含む。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、２、３，１７、１８、２１、２３及び２４位（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のいずれかの位置に１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１ペプチドは、以下のアミノ酸置換の１つ以上により修飾される：Ｓｅｒ２をＡｌａで置換、Ｇｌｎ３をＧｌｕで置換、Ａｒｇ１７をＧｌｎで置換、１８位のＡｒｇをＡｌａで置換、２１位のＡｓｐをＧｌｕで置換、２３位のＶａｌをＩｌｅで置換、そして２４位のＧｌｎをＡｌａで置換（アミノ酸の位置は、天然グルカゴン配列による）。

【0021】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストに対して、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するその活性を保持するような更なる修飾、例えば保存的置換を行うことが可能である。したがって、本発明は、本明細書に開示されているいずれかのグルカゴン類縁体が更に修飾されて、２、３、４、５、６、７、８又は９つまでの更なるアミノ酸修飾を含むことができ、依然としてグルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニストの所望の活性レベルをグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対して保持できることを考慮する。

【0022】

上記に記載された修飾のいずれかを個別に又は組み合わせて適用することができる。

【0023】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの薬学的に許容される塩も、本開示に包含される。

【0024】

本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの二量体も本開示に包含される。一つの実施態様において、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より独立して選択される２つの配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの二量体が提供され、ここで２つのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、それぞれのペプチド鎖の１６、１９、２４及び３５位（配列番号５０の延長ペプチドがグルカゴン類縁体のカルボキシ末端に付加される場合）に独立して結合しているリンカーを介して、互いに結合している。

【0025】

一つの実施態様によると、本明細書に開示されている新規グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを含む医薬組成物が提供される。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌され多様な包装内に含有されている液剤を含む。医薬組成物を、患者に組成物を投与する使い捨て装置を含むキットの一部として更に包装することができる。

【0026】

一つの実施態様によると、予備処方された水性組成物を使用して高血糖症を素早く治療する方法が提供される。この方法は、本開示の新規修飾グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを含む水性液剤の有効量を投与する工程を含む。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストはペグ化されており、ＰＥＧ鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。一つの実施態様において、修飾グルカゴン液剤は、高血糖症に罹患している患者に組成物を投与するのに使用される装置に予め包装されている。

【0027】

一つの実施態様によると、インスリン依存性患者において血中グルコースレベルを調節する改善された方法が提供される。この方法は、糖尿病を制御するのに治療上有効な量のインスリンを投与する工程及び本開示の新規修飾グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを投与する工程を含み、これらの投与工程は、互いに１２時間以内に実施される。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト及びインスリンは、単一組成物として同時投与され、ここでグルカゴン類縁体は、約５，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するＰＥＧ鎖でペグ化されている。高血糖症を治療するそのような方法は、インスリン依存性又はインスリン非依存性のいずれかの糖尿病、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病又は妊娠糖尿病を含む多様な種類の高血糖症に有用であること及び腎障害、網膜症及び血管疾患を含む糖尿病の合併症を低減することに有用であることが予想される。

【0028】

加えて、ＧＬＰ−１の刺激は、減量を誘導するか又は体重増加を防止することが報告されている。したがって、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、減量の誘導又は体重増加の防止に効果的であると考えられる。更に、減量を誘導する別の化合物として、オキシントモジュリンがあるが、これは小腸において見出された天然に生じる消化ホルモンである（Diabetes 2005; 54:2390-2395を参照すること）。オキシントモジュリンは、グルカゴン（すなわち、配列番号１）の２９アミノ酸の配列を含み、その後に配列番号２６（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８アミノ酸のカルボキシ末端延長が続く、３７アミノ酸のペプチドである。本明細書に開示されているペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、更に、この８アミノ酸のカルボキシ末端延長（配列番号２６）と結合してもよいことが考慮されるが、本発明は、配列番号２６の８個の隣接アミノ酸を欠いている類縁体を特に考慮する。そのような食欲を減退する又は体重の減少を促進する方法は、体重の低減、体重増加の防止、又は、薬剤誘導肥満などの多様な原因による肥満の治療、並びに血管疾患（冠動脈疾患、発作、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症及び筋骨格系疾患などの肥満に関連する合併症の低減に有用であることが予想される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】３７℃でそれぞれ２４、４８、７２、９６、１４４及び１６６時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ^２１−マレイミドＰＥＧ_５κの安定性を表す棒グラフである。

【図2】３７℃でそれぞれ２４、７２又は１４４時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ^２１−マレイミドＰＥＧ_５κのｐＨ５でのＨＰＬＣ分析から生成したデータを表す。

【図3A-3B】ｃＡＭＰ産生により測定した、列挙したグルカゴン類縁体のグルカゴン受容体アンタゴニスト作用の測定により生成したデータを表す。試験した類縁体は、グルカゴンペプチドのアミノ末端からの１、３、４又は５個のアミノ酸の除去及び４位でのグルタミン酸置換を有する。より詳細には、図３Ａは、グルカゴン類縁体〔Ｅ９〕Ｇ（２−２９）●、〔Ｅ９〕Ｇ（４−２９））▲、〔Ｅ９〕Ｇ（５−２９）▼、〔Ｅ９〕Ｇ（６−２９）（左向き三角）、によるグルカゴン受容体の誘導を、天然グルカゴン■と比較している。図３Ｂは、０．２nMのグルカゴンによるグルカゴン受容体の誘導に対する同じ類縁体の阻害効果に関するデータを提供する。略語：Ｅ９＝天然グルカゴンの９位に対応するアミノ酸のグルタミン酸置換；Ｇ（Ｘ−２９）＝Ｘ−１アミノ酸によりＮ末端が切断された天然グルカゴン。

【図4】最初の５個の天然アミノ酸の欠失により天然グルカゴンに対して修飾され、Ｎ末端アミノ酸（天然グルカゴンの「残基６」）の修飾に基づいて互いに異なっているグルカゴン類縁体の、結合親和性及びグルカゴン受容体活性を比較したデータを表す。

【図5】ｃＡＭＰ産生により測定した、列挙したグルカゴン類縁体のＧＰＬ−１受容体アゴニスト作用の測定により生成したデータを表す。より詳細には、図５は、グルカゴン類縁体〔Ｅ９〕Ｇ（６−２９）●、〔ＰＬＡ６，Ｅ９〕Ｇ（６−２９）▲、〔Ｅ９〕Ｇ（６−ＣＥＸ）▼、〔Ｅ９，Ｅ１６〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（左向き三角）、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｅ１６〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（右向き三角）、によるＧＬＰ−１受容体の誘導を、天然ＧＬＰ−１■と比較している。略語：ＰＬＡ６＝フェニル乳酸；Ｇ（６−２９）＝５個のアミノ酸によりＮ末端が切断されている天然グルカゴン：Ｅ９＝天然グルカゴンの９位に対応するアミノ酸のグルタミン酸置換；Ｇ（６−ＣＥＸ）＝カルボキシ末端に配列番号２１の追加のアミノ酸が付加されている、５個のアミノ酸によりＮ末端が切断されている天然グルカゴン。

【図6A-6B】グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体における活性を測定して生成したデータを表す。図６Ａは、ｃＡＭＰ産生により測定した、０．８nMの天然グルカゴンの存在下での列挙したグルカゴン類縁体のグルカゴン受容体アンタゴニスト作用の測定により生成したデータを表す。より詳細には、図６Ａは、グルカゴン類縁体〔ＰＬＡ６，Ｅ９〕Ｇ（６−２９）●、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）▲、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）▼による０．８nMのグルカゴン誘導ｃＡＭＰ放出の阻害を、天然グルカゴン■と比較している。図６Ｂは、天然グルカゴン■と比べた、グルカゴン類縁体〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｄ２８］Ｇ（６−２９）●、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）▲、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）▼、によるＧＬＰ−１誘導ｃＡＭＰ放出の測定により生成したデータを表す。このデータは、主鎖ラクタムの、他の点ではグルカゴンアンタゴニストへの導入が、残留アゴニスト作用なしに強力なアンタゴニスト作用を維持することを示す。略語：ＰＬＡ６＝フェニル乳酸；Ｇ（６−２９）＝５個のアミノ酸によりＮ末端が切断されている天然グルカゴン；Ｄ９＝天然グルカゴンの９位に対応する天然Ａｓｐ；Ｅ９＝天然グルカゴンの９位に対応するアミノ酸のグルタミン酸置換；Ｄ２８＝天然グルカゴンの２８位に対応するアミノ酸のアスパラギン酸置換；Ｇ（６−ＣＥＸ）＝カルボキシ末端に配列番号２１の追加のアミノ酸が付加されている、５個のアミノ酸によりＮ末端が切断されている天然グルカゴン；Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ）＝天然グルカゴンペプチドの１２位のリシン及び１６位のグルタミン酸に対応するアミノ酸の側鎖同士の間に形成されたラクタム架橋；Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ）＝天然グルカゴンペプチドの１６位のグルタミン酸及び２０位のリシンに対応するアミノ酸の側鎖同士の間に形成されたラクタム架橋。

【図7A-7B】グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体におけるグルカゴンラクタム誘導体の活性を測定して生成したデータを表す。図７Ａは、ｃＡＭＰ酸性により測定した、０．２nMの天然グルカゴンの存在下での列挙したグルカゴン類縁体のグルカゴン受容体アンタゴニスト作用の測定により生成したデータを表す。より詳細には、図７Ａは、グルカゴン類縁体〔ＰＬＡ６，Ｅ９〕Ｇ（６−２９）●、〔Ｅ９，Ｅ１６〕Ｇ（６−ＣＥＸ）▲、〔Ｅ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）▼、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（左向き三角）、〔Ｅ９，Ｅ１６，Ｋ２０〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（右向き三角）、〔Ｅ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）◆、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ）〕Ｇ（６−２９）（五角形）、による０．２nMのグルカゴン誘導ｃＡＭＰ放出の阻害を、天然グルカゴン■と比較している。図７Ｂは、天然グルカゴン■と比べた、グルカゴン類縁体〔Ｅ９〕Ｇ（６−ＣＥＸ）●、〔Ｅ９，Ｅ１６〕Ｇ（６−ＣＥＸ）▲、〔Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）▼、〔Ｅ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（左向き三角）、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（右向き三角）、〔Ｅ９，Ｅ１６，Ｋ２０〕Ｇ（６−ＣＥＸ）◆、〔Ｅ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（五角形）、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（六角形）、によるＧＬＰ−１誘導ｃＡＭＰ放出の測定により生成したデータを表す。略語は、図６Ａ及び６Ｂに使用したものと一致している。

【図8A-8B】グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体におけるペグ化グルカゴンラクタム誘導体の活性を測定して生成したデータを表す。図８Ａは、ｃＡＭＰ酸性により測定した、０．８nMの天然グルカゴンの存在下での列挙したグルカゴン類縁体のグルカゴン受容体アンタゴニスト作用の測定により生成したデータを表す。より詳細には、図８Ａは、グルカゴン類縁体〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）▲、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｃ２４（２０Ｋ ＰＥＧ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）▼、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ），Ｃ２４（２０Ｋ ＰＥＧ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）（左向き三角）、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８，Ｃ３５（２０Ｋ ＰＥＧ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（右向き三角）、による０．８nMのグルカゴン誘導ｃＡＭＰ放出の阻害を、天然グルカゴン■と比較している。図８Ｂは、天然ＧＬＰ−１■と比べた、グルカゴン類縁体〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）▲、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｃ２４（２０Ｋ ＰＥＧ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）▼、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（Ｌ），Ｃ２４（２０Ｋ ＰＥＧ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）（左向き三角）、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８，Ｃ３５（２０Ｋ ＰＥＧ）〕Ｇ（６−ＣＥＸ）（右向き三角）、によるＧＬＰ−１誘導ｃＡＭＰ放出の測定により生成したデータを表す。略語は、図６Ａ及び６Ｂに使用したもの一致している。

【図9A-9C】グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体におけるグルカゴンラクタム誘導体の活性を測定して生成したデータを表す。図９Ａは、ｃＡＭＰ酸性により測定した、０．８nMの天然グルカゴンの存在下での列挙したグルカゴン類縁体のグルカゴン受容体アンタゴニスト作用の測定により生成したデータを表す。より詳細には、図９Ａは、グルカゴン類縁体〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）●、〔Ｅ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（４−２９）▲、〔Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）▼、〔Ａ２，Ｅ３，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）（左向き三角）、〔Ａ２，Ｅ３，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（１−２９）（右向き三角）、ＡＮＫ２（配列番号３７）◆、による０．８nMのグルカゴン誘導ｃＡＭＰ放出の阻害を、天然グルカゴン■と比較している。図９Ｂは、天然ＧＬＰ−１■と比べた、グルカゴン類縁体〔Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（４−２９）▲、〔Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）▼、〔Ａ２，Ｅ３，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）（左向き三角）、〔Ａ２，Ｅ３，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（１−２９）（右向き三角）、ＡＮＫ２（ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＡＲＹＬＤＡＲＲＡＲＥＦＩＫＷＬＶＲＧＲＧ；配列番号３７、従来技術の化合物）◆、によるグルカゴン誘導ｃＡＭＰ放出の測定により生成したデータを表す。図９Ｃは、天然ＧＬＰ−１■と比べた、グルカゴン類縁体〔Ｅ９，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（４−２９）●、〔Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）▲、〔Ａ２，Ｅ３，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）▼、〔Ａ２，Ｅ３，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（１−２９）（左向き三角）、ＡＮＫ２（配列番号３７）（右向き三角）、〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（Ｌ），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）◆、によるＧＬＰ−１誘導ｃＡＭＰ放出の測定により生成したデータを表す。略語は、図３、６Ａ及び６Ｂに使用したものと一致している。

【発明を実施するための形態】

【0030】

〔定義〕
本発明を記載し、特許請求するに際し、以下の用語を下記に記載した定義に従って使用する。

【0031】

本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される担体」には、リン酸緩衝食塩水、水、油／水又は水／油乳剤のような乳剤、並びに多様な種類の湿潤剤のような標準的な医薬担体のいずれかが含まれる。この用語は、また、ヒトを含む動物における使用が米国連邦政府の規制当局により承認されているか又は米国薬局方に記載されている作用物質のいずれかを包含する。

【0032】

本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される塩」は、母体化合物の生物学的活性を保持し、生物学的にも非生物学的にも有害ではない、化合物の塩を意味する。本明細書に開示されている化合物の多くは、アミノ及び／若しくはカルボキシル基又は同様の基の存在によって酸性及び／又は塩基性塩を形成することができる。

【0033】

薬学的に許容される塩基性付加塩は、無機又は有機塩基から調製することができる。無機塩基から誘導される塩には、単なる例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級及び第三級アミンの塩が含まれるが、これらに限定されない。

【0034】

薬学的に許容される酸性付加塩は、無機又は有機塩基から調製することができる。無機酸から誘導される塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸から誘導される塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。

【0035】

本明細書で使用されるとき、用語「治療する」には、特定の障害若しくは状態を予防すること、又は特定の障害若しくは状態に関連する症状を緩和すること、及び／又は前記症状を防止若しくは排除することが含まれる。例えば、本明細書で使用されるとき、用語「糖尿病を治療する」は、一般に血中グルコースレベルをほぼ正常なレベルに維持することを意味し、所定の状態に応じて血中グルコースレベルを増加又は減少することを含むことができる。

【0036】

本明細書で使用されるとき、グルカゴンアンタゴニストの「有効」量又は「治療有効量」は、所望の効果をもたらすペプチドの非毒性であるが十分な量を意味する。例えば、一つの望ましい効果は、高血糖症の予防又は治療である。「有効」である量は、個人の年齢及び全身状態、投与様式などによって被験者毎に変わる。したがって、正確な「有効量」を規定することがいつも可能というわけではない。しかし、個別の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験を使用して当業者によって決定することができる。

【0037】

用語「非経口的」は、消化管を介するのではなく、皮下、筋肉内、脊髄内又は静脈内のような他の経路によることを意味する。

【0038】

本明細書で使用されるとき、用語「天然グルカゴン」は、配列番号１の配列から構成されるペプチドを意味し、用語「天然ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド（配列番号４の配列から構成される）、ＧＬＰ−１（７〜３７）酸（配列番号３の配列から構成される）、又はこの２つの化合物の混合物を示す総称である。本明細書で使用されるとき、更なる名称が不在なときの「グルカゴン」又は「ＧＬＰ−１」への一般的な参照は、それぞれ天然グルカゴン又は天然ＧＬＰ−１を意味することが意図される。

【0039】

本明細書で使用されるとき、「グルカゴン類縁体」には、配列番号１のアミノ酸配列、又は実施例１３に記載されているアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定されたグルカゴン若しくはＧＬＰ−１受容体活性を刺激する、ペプチドのアミノ酸置換若しくは翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化など）を含む配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸の任意の誘導体のいずれかを含む、任意のペプチドが含まれる。

【0040】

用語「グルカゴンアンタゴニスト」は、実施例１３に記載されるような検証済インビトロモデルアッセイを使用したｃＡＭＰ産生により測定されるグルカゴン活性に対抗するか又はグルカゴン機能を防止する化合物を意味する。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも５０％の阻害（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％の阻害）、好ましくは少なくとも８０％の阻害を示す。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも９０％の阻害を示す。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大反応の１００％の阻害を示す。

【0041】

用語「ＧＬＰ−１アゴニスト」は、実施例１３に記載されているような検証済インビトロモデルアッセイを使用したｃＡＭＰ産生により測定されるＧＬＰ受容体活性を刺激する化合物を意味する。したがってＧＬＰ−１アゴニストは、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を示す。用語「ＧＬＰ−１アゴニスト活性」は、天然ＧＬＰ−１と比べて、ＧＬＰ−１受容体に対する最大活性が、少なくとも１０％〜約２００％又はそれ以上（少なくとも、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％又は１７５％）であることを意味する。

【0042】

本明細書で使用されるとき、「グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト」は、天然グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列と６５％を超えるアミノ酸配列同一性を共有するが、グルカゴンアンタゴニスト活性とＧＬＰ−１アゴニスト活性の両方を示すように修飾されたペプチドである。

【0043】

幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０と比べて約１００倍高い又は約１００倍低い範囲内で、グルカゴン受容体に対するＩＣ５０を示す。例えば、配列番号１のペプチドを、ペプチドがＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト作用の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約１００％）を示し、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約１００％）の阻害を示すように修飾することができる。

【0044】

一つの例において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号２の１１位にグルタミン酸置換を有するか、又は配列番号２の７位と１１位、１１位と１５位、１５位と１９位及び１９位と２３位からなる群より選択されるアミノ酸残基対同士の間に形成される分子内架橋、例えばラクタム架橋を有するように修飾された、配列番号２のグルカゴン類縁体を含む。

【0045】

本出願の全体にわたって、特定のアミノ酸の位置に対する数字による全ての参照は、特定の配列番号に対する更なる名称又は参照が不在なとき、天然グルカゴン（配列番号１）中のアミノ酸の位置であって、配列番号１の最初のアミノ酸を１番として始めて連続的に番号付けした位置、又は任意の類縁体における対応するアミノ酸の位置を指す。しかし、特定の配列番号を参照しながら特定のアミノ酸位置が数字により示される場合、示されたアミノ酸位置は、参照された配列番号の最初のアミノ酸から始める連続した番号付けに基づく。例えば、配列番号２の４位のアミノ酸はアスパラギン酸である。

【0046】

本明細書で使用されるとき、アミノ酸「修飾」は、アミノ酸の置換、付加又は欠失を意味し、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸に加え、異形又は非天然のアミノ酸のいずれかによる、置換又は付加が含まれる。異形アミノ酸の商業供給源には、Sigma-Aldrich（Milwaukee, WI）、ChemPep Inc.（Miami, FL）及びGenzyme Pharmaceuticals（Cambridge, MA）が含まれる。異形アミノ酸は、商業供給者から購入する、新規に合成する、又は天然に生じるアミノ酸を化学的に修飾する若しくは誘導体化して得ることができる。

【0047】

本明細書で使用されるとき、アミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することを意味する。

【0048】

本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群の１つの範囲内の交換として定義される：
Ｉ．小型で脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負荷電残基及びそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性の正荷電残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）；
ＩＶ．大型で脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン；
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。

【0049】

本明細書で使用されるとき、総称「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」は、一般式：Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ（ｎは９以上）により表される、分岐鎖又は直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を意味する。更なる特定がない限り、この用語は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含むことが意図される。「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」を数字の接尾辞と組み合わせて使用して、およその平均分子量を示す。例えば、ＰＥＧ−５，０００は、平均約５，０００の総分子量を有するポリエチレングリコール鎖を意味する。

【0050】

本明細書で使用されるとき、用語「ペグ化」及び同様の用語は、ポリエチレングリコール鎖を化合物に結合することにより天然の状態が修飾された化合物を意味する。「ペグ化グルカゴン類縁体」は、ＰＥＧ鎖を有する共有結合しているグルカゴン類縁体である。

【0051】

本明細書で使用されるとき、ペプチドに対する一般的な参照は、修飾されたアミノ及びカルボキシ末端を有するペプチドも包含することが意図される。例えば、末端カルボン酸の代わりにアミノ基を含むアミノ酸鎖は、標準的なアミノ酸を示すアミノ酸配列に包含されることが意図される。

【0052】

本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子、又は分子群である。リンカーは、２つの実体に最適な間隔をもたらしてもよいし、更に２つの実体が互いに分離することを可能にする不安定な結合を提供してもよい。不安定な結合には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分及び酵素切断基が含まれる。

【0053】

本明細書で使用される「二量体」は、リンカーを介して互いに共有結合している２つのサブユニットを含む複合体である。二量体という用語は、意味を限定する言葉無しに使用される場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を包含する。ホモ二量体は、２つの同一のサブユニットを含み、一方、ヘテロ二量体は、異なる２つのサブユニットを含むが、２つのサブユニットは、実質的に互いに類似している。

【0054】

本明細書で使用されるとき、「システインのスルホン酸誘導体」は、一般構造：

【化2】

〔ここで、Ｘ_６は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_４アルケン又はＣ_２〜Ｃ_４アルキニルである〕で示される化合物を意味する。

【0055】

本明細書で使用されるとき、用語「Ｃ_１〜Ｃ_ｎアルキル」（ここでｎは１〜６であることができる）は、１個から特定の個数までの炭素原子を有する、分岐鎖又は直鎖のアルキル基を表す。典型的なＣ_１〜Ｃ_６アルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0056】

本明細書で使用されるとき、用語「Ｃ_２〜Ｃ_ｎアルケニル」（ここでｎは２〜６であることができる）は、２個から特定の個数までの炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する、オレフィン性不飽和の分岐鎖又は直鎖基を表す。そのような基の例には、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、１，３−ブタジエニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ_２）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_３）、ヘキセニル、ペンテニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0057】

用語「Ｃ_２〜Ｃ_ｎアルキニル」（ここでｎは２〜６であることができる）は、２からｎ個までの炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する不飽和の分岐鎖又は直鎖基を意味する。そのような例には、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0058】

本明細書で使用されるとき、用語「荷電アミノ酸」は、生理学的ｐＨの水溶液中に負に荷電（すなわち、脱プロトン化）している、又は正に荷電（すなわち、プロトン化）している側鎖を含むアミノ酸を意味する。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸及びホモグルタミン酸が含まれ、一方、正荷電アミノ酸には、アルギニン、リシン及びヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸、また異形又は非天然アミノ酸のうちの荷電アミノ酸が含まれる。

【0059】

本明細書で使用されるとき、用語「酸性アミノ酸」は、例えばカルボン酸又はスルホン酸基のような、第２の酸性部分を含むアミノ酸を意味する。

【0060】

本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、更なる指定のない限り、任意の家畜化された温血脊椎動物（例えば、家畜類、ウマ、ネコ、イヌ及び他のペット類が含まれるが、これらに限定されない）並びにヒトを包含することが意図される。

【0061】

本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記述されている値又は値の範囲よりも１０パーセント多い又は少ないことを意味するが、任意の値又は値の範囲をこの広義の定義にのみ指定することを意図しない。用語「約」に続くそれぞれの値又は値の範囲は、記述された絶対値又は値の範囲の実施態様も包含することが意図される。

【0062】

〔実施態様〕
本明細書に開示されているものは、グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニストとして機能するグルカゴン類縁体である。そのようなグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、グルカゴンアゴニスト作用の抑制が望まれ、同時にＧＰ−１活性の刺激も望まれるあらゆる状況に利用される。例えば、ＧＬＰ−１刺激と一緒になったグルカゴンアンタゴニスト活性を、グルカゴンアンタゴニスト作用が高血糖症の前臨床モデルで血中グルコースの低下をもたらすことが実証され、且つＧＬＰ−１活性がインスリン産生と関連している、糖尿病の治療に使用することができる。ＧＬＰ−１活性を示す化合物は、肥満の治療及び体重増加の防止にも有用であることが知られている。

【0063】

出願者たちは、Ｎ末端からの最初の１〜５個のアミノ酸残基（例えば、最初の１個のアミノ酸、最初の２個のアミノ酸、最初の３個のアミノ酸、最初の４個のアミノ酸、最初の５個のアミノ酸）の除去と、例えば２個のアミノ酸（ここでアミノ酸対は１２位と１６位、１６位と２０位、２０位と２４位及び２４位と２８位から選択される）の側鎖同士のペプチド内結合の形成などによる、ペプチドのＣ末端部分におけるアルファ−へリックス構造の安定化とによって修飾されたグルカゴン類縁体が、グルカゴンアンタゴニストとＧＬＰ−１アゴニストの両方の活性を示すことを発見した。

【0064】

一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドが提供されるが、このペプチドは、インビトロアッセイにおけるｃＡＭＰ産生により測定して、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト作用の少なくとも８０％を示し、グルカゴン受容体における最大グルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約５０％低減するグルカゴンアンタゴニスト活性を示す。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドは、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも９０％を示し、グルカゴン受容体における最大グルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％低減するグルカゴンアンタゴニスト活性を示す。

【0065】

一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号２のペプチドの誘導体を含み、このグルカゴンペプチドは、配列番号２の１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２及び２４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置において更なるアミノ酸置換を含み、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも９０％を示し、グルカゴン受容体における最大グルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％低減するグルカゴンアンタゴニスト活性を示す。

【0066】

幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９の前後）のアルファ−へリックス構造は、例えば、共有若しくは非共有分子内架橋の形成により、又はアルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での１２〜２９位前後のアミノ酸の置換及び／若しくは挿入により、安定化される。一つの実施態様において、ラクタム環は、配列番号２のアミノ酸７及び１１又はアミノ酸１１及び１５の側鎖同士の間に形成される。他の実施態様において、１６、２０、２１又は２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３つ又は全ての位置が、α，α−二置換アミノ酸、例えばアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）で置換されている。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１５又は配列番号５１のペプチド誘導体を含み、ここでグルカゴンペプチドは、配列番号１５又は配列番号５１の１、２、５、６、８、９、１２、１３及び１４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置において更なるアミノ酸置換を含む。一つの実施態様において、１、２、５、６、８、９、１２、１３及び１４位での置換は、保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、配列番号５又は配列番号６の２４位のトレオニンは、グリシンで置換されている。

【0067】

一つの実施態様によると、特定のグルカゴン類縁体が調製されるが、ここで、天然グルカゴンの最初の３〜５個のアミノ酸を欠失させ、天然グルカゴンペプチドに対して９位のアミノ酸を、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸、又は下記構造：

【化3】

〔ここで、Ｘ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_４アルケニル若しくはＣ_２〜Ｃ_４アルキニルである〕
を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体からなる群より選択されるアミノ酸で置換し、グルカゴンのＣ末端部分（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９の前後）のアルファ−へリックス構造を、例えば、ラクタム架橋を、天然グルカゴンペプチドに対して、アミノ酸１２と１６又はアミノ酸１６と２０の側鎖同士の間に形成することによって、安定化する。

【0068】

一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号４７又は配列番号４８のペプチドを含み、更なる実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号４７又は配列番号４８のペプチドを含むが、ここでは、これらの配列の４位のアミノ酸がグルタミン酸であり、天然アミノ酸に存在するＣ末端カルボン酸基がアミド基で置換されている。更なる実施態様において、配列番号４７又は配列番号４８のペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端への配列番号２１の配列の付加により更に修飾される。

【0069】

更なる実施態様において、グルカゴン類縁体が開発され、ここでは、天然グルカゴンの最初の５個のアミノ酸を欠失させ、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基（フェニルアラニン）をヒドロキシル基で置換し（すなわち、最初のアミノ酸はフェニル乳酸である）、１２位と１６位、１６位と２０位、２０位と２４位及び２４位と２８位から選択される１つ以上のアミノ酸対の側鎖同士を互いに結合させて、それによりグルカゴン類縁体のアルファ−へリックスを安定化する。

【0070】

一つの実施態様において、配列番号２の配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供されるが、この配列番号２は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン又はグリシンからなる群より選択されるアミノ酸による１１位（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる１６位）のセリン残基の置換によって修飾されている。一つの実施態様によると、配列番号２の１１位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されており、一つの実施態様では、セリン残基はグルタミン酸で置換されている。一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号３８の配列を含む。

【0071】

一つの実施態様において、分子内架橋を２つのアミノ酸の側鎖同士の間に形成して配列番号２のペプチドのカルボキシ末端の三次元構造を安定化した、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。より詳細には、配列番号２のアミノ酸対７と１１、１１と１５、１５と１９又は１９と２３から選択される１つ以上のアミノ酸の側鎖同士を互いに結合して、グルカゴン類縁体のアルファ−へリックスを安定化する。２つの側鎖は、水素結合、イオン相互作用（例えば、塩架橋の形成）又は共有結合を介して互いに結合することができる。一つの実施態様によると、リンカーの大きさは、７〜９個の原子であり、一つの実施態様において、リンカーの大きさは、８個の原子である。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される。一つの実施態様において、アンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換したアミド基を有する。

【0072】

共有結合して７原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）又はホモＳｅｒ−ホモＧｌｕ（ラクトン）が挙げられる。８原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、ホモＬｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、Ｏｒｎ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ａｓｐ（ラクタム）又はＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）が挙げられる。９原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、ホモＬｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ｇｌｕ（ラクタム）又はＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）が挙げられる。これらのアミノ酸の側鎖のいずれかを、アルファ−へリックスの三次元構造が妨げられない限り、追加的な化学基で置換することができる。当業者は、同様の大きさ及び所望の効果の構造の安定化を作り出す代替的な対形成又は代替的なアミノ酸類縁体若しくは誘導体を想像することができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は、長さが６個の原子であり、更に修飾して所望の効果をもたらすことができる。上記に記載されたアミノ酸対形成又は当業者が想像できる同様の対形成は、共有結合無しであっても、非共有結合を介して、例えば塩架橋又は水素結合相互作用の形成を介して、アルファ−へリックスに追加的な安定性をもたらすことができる。

【0073】

一つの実施態様によると、配列番号９のアミノ酸配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト類縁体が提供される。一つの実施態様において、配列番号９のペプチドのカルボキシ末端の三次元構造は、ペプチドの側鎖同士の間の共有結合の形成により安定化される。一つの実施態様において、２つのアミノ酸側酸は、互いに結合してラクタム環を形成する。ラクタム環の大きさは、アミノ酸の側鎖の長さに応じて変わることができ、一つの実施態様において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖とグルタミン酸の側鎖に結合することによって形成される。一つの実施態様において、アンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換したアミド基を有する。

【0074】

ラクタム環におけるアミド結合の順番を逆転することができる（例えば、ラクタム環を、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６の側鎖、あるいはＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖同士の間に形成することができる）。一つの実施態様によると、少なくとも１つのラクタム環が、配列番号９のアミノ酸対７と１１、１１と１５、１５と１９及び１９と２３からなる群より選択されるアミノ酸対の側鎖同士の間に形成されている、配列番号９のグルカゴン類縁体が提供される。一つの実施態様において、配列番号１０の配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドが提供されるが、前記配列は、配列番号１０の７及び１１位のアミノ酸の間又は１１及び１５位のアミノ酸の間又は１５及び１９位のアミノ酸の間に形成される分子内ラクタム架橋を更に含む。一つの実施態様において、配列番号１１の配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドが提供されるが、前記配列は、配列番号１１の７及び１１位のアミノ酸の間又は１１及び１５位のアミノ酸の間に形成される分子内ラクタム架橋を更に含む。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１７の配列を含む。

【0075】

配列番号５の誘導体を含むさらなるグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供されるが、ここで配列番号５の１０位（天然グルカゴンの１５位）のアスパラギン酸は、一般構造：

【化4】

〔ここで、Ｘ_６は、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_３アルケン又はＣ_２〜Ｃ_３アルキニルである〕で示されるアミノ酸である、グルタミン酸で置換されており、一つの実施態様では、Ｘ_６はＣ_１〜Ｃ_３アルキルであり、別の実施態様では、Ｘ_６はＣ_２アルキルである。一つの実施態様において、配列番号９のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト誘導体が提供されるが、配列番号９の１０位（天然グルカゴンの１５位）は、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸及びホモグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。更なる実施態様において、配列番号９の１０位は、システイン酸又はホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト誘導体が提供されるが、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の１０位は、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸及びホモグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、アンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換したアミド基を有する。

【0076】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを更に修飾して、グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持しながら、生理学的ｐＨの水溶液におけるペプチドの可溶性を改善することができる。配列番号５のペプチドの１２、１５、１６、１９及び２４位又は配列番号６のペプチドの１２、１６、１９若しくは２４位に対応する位置への親水性基の導入は、母体化合物のグルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰアゴニスト活性を保持しながら、得られたペプチドの生理学的ｐＨを有する溶液における可溶性を改善することができる。したがって、一つの実施態様において、本開示のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは更に修飾されて、配列番号５又は配列番号６のペプチドの１２、１５、１６、１９及び２４位のアミノ酸に対応するアミノ酸の側鎖に１つ以上の親水性基が共有結合している。更なる実施態様において、配列番号５又は配列番号６の１６及び１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の側鎖は、親水性基に共有結合しており、一つの実施態様において、親水性基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

【0077】

一つの実施態様において、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供されるが、ここで前記ペプチドは、配列番号５の場合はアミノ酸７及び１１の側鎖同士の間、配列番号６の場合は１１位と１５位の側鎖同士の間、配列番号７の場合は１５位と１９位の側鎖同士の間、配列番号８の場合は１９位と２４位の側鎖同士の間に形成される、ラクタム環を含み、前記配列は、それぞれ更に修飾されて、ペプチドに共有結合している親水性部分を含む。より詳細には、一つの実施態様において、ラクタムを有するグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、それぞれ、ポリエチレングルコール鎖の共有結合により修飾されている。例えば、配列番号５を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストでは、ペプチドは、１２、１５、１６、１９及び２４からなる群より選択される位置でペグ化されており、配列番号６を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストでは、ペプチドは、１２、１６、１９及び２４からなる群より選択される位置でペグ化されており、配列番号７のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストでは、ペプチドは、１１、１２，１６及び２４からなる群より選択される位置でペグ化されており、配列番号８を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストでは、ペプチドは、１１、１２、１５及び１６らなる群より選択される位置でペグ化されている。一つの実施態様によると、配列番号４７又は配列番号４８の配列を含み、１２、１６、１９及び２４からなる群より選択される位置でペグ化されている、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドが提供される。

【0078】

一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのアミノ酸は少なくとも１つのシステイン残基で置換されており、ここでシステイン残基の側鎖は、例えばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル及びハロアシルのような、チオール反応性試薬により更に修飾される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシ及び他のエーテル基、また、ポリエチレングリコール単位のような、他の親水性部分を含有することができる。別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのアミノ酸は、リシンで置換されており、置換リシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エスエル（スクシンイミド、無水物など）、又はポリエチレングリコールなどの親水性部分のアルデヒドのような、アミン反応性試薬を使用して、更に修飾される。一つの実施態様によると、配列番号５のペプチドの７位に対応するリシン残基は、アルギニンで置換されており、単一のリシン置換が、配列番号５の１２、１５、１６、１９及び２４位に対応する１個以上のアミノ酸に挿入されている。

【0079】

別の実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの２２位に対応するメチオニン残基をロイシン又はノルロイシンに変えて、ペプチドの酸化分解を防止する。

【0080】

本開示のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、グルカゴン類縁体の機能にとって重要ではないことが知られている位置におけるアミノ酸置換も包含する。一つの実施態様において、置換は、２、５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２、２３又は２４からなる群より選択される１、２又は３つの位置での保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、天然ペグルカゴンプチドの１６、１７、２０、２１、２４又は２９位に対応するアミノ酸、とりわけ天然グルカゴンの２１及び／又は２４位に対応するアミノ酸は、システイン又はリシンで置換されており、ここでＰＥＧ鎖は、置換システイン又はリシン残基と共有結合している。

【0081】

一つの実施態様によると、ペプチドの１１、１２、１５、１６、１９及び／又は２４位に対応する位置での１つ以上の追加的なアミノ酸置換（例えばシステインによる置換を含む）により更に修飾されている、配列番号９から構成される配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供され、ここでアミノ酸置換は、ＰＥＧのような親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸を含む。天然グルカゴンを、天然に生じるアミノ酸又は合成（非天然）アミノ酸で置換することができる。合成又は非天然アミノ酸は、インビボで天然には存在しないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。一つの実施態様において、ペプチドが配列番号９を含み、ペプチドの１６又は１９位にポリエチレン鎖が更に結合しているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。更なる実施態様において、グルカゴン類縁体のＣ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。

【0082】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストがポリエチレングリコール鎖を含むこれらの実施態様において、ポリエチレン鎖は、直鎖の形態であってもよく、分岐鎖であってもよい。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約２，０００ダルトンから選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００ダルトンの平均分子量を有する。

【0083】

一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１５又は配列番号５１の配列から構成されるペプチドを含み、ここでポリエチレングルコール鎖は、配列番号１５又は配列番号５１の１１、１２、１５、１６、１９及び２４位からなる群より選択される選択されるアミノ酸に結合しており、ＰＥＧ鎖の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１５又は配列番号５１の配列から構成されるペプチドを含み、ここでポリエチレングルコール鎖は、配列番号１５又は配列番号５１の１６又は１９位のアミノ酸に結合しており、ＰＥＧ鎖の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。更なる実施態様において、修飾グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、ペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１５又は配列番号５１の配列を含み、ここでポリエチレングルコール鎖は、配列番号１５又は配列番号５１の１６及び１９位のアミノ酸に結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合計分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。

【0084】

一つの実施態様によると、下記：
Ｒ_１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ_２（配列番号３９）、
Ｒ_１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ_２（配列番号１３）、
Ｒ_１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ_２（配列番号１４）、及び
Ｒ_１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ_２（配列番号１２）
からなる群より選択されるグルカゴン類縁体を含む、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供され、
ここで、４位のＸａａは、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸であり、１０位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸であり、１６位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニンであり、１９位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン及びアセチルフェニルアラニンであり、２２位のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり、Ｒ_１はＯＨ又はＮＨ_２であり、そしてＲ_２は、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ（配列番号２１）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｘａａ（配列番号５０；ここでＸａａは、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニンである）、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、ペプチドは更に、配列番号１３の場合は１６位、配列番号１４の場合は１９位、及び配列番号１２の場合は１６と１９位でペグ化されていてもよい。一つの実施態様において、配列番号１２〜１４及び３９の２４位のＴｈｒは、Ｇｌｙで置換されている。一つの実施態様によると、ペプチドは、Ｒ_１がＯＨである配列番号１３又は配列番号１４の配列を含む。一つの実施態様によると、ペプチドは、Ｒ_１がＯＨであり、Ｒ_２がＣＯＮＨ_２である、配列番号１３又は配列番号１４の配列を含む。一つの実施態様によると、ペプチドは、Ｒ_１がＯＨであり、Ｒ_２がＣＯＮＨ_２であり、２４位のトレオニンがグリシンで置換されている、配列番号１３又は配列番号１４の配列を含む。

【0085】

一つの実施態様において、血漿タンパク質がペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合してグルカゴン類縁体の可溶性、安定性及び／又は薬物動態を改善しているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。例えば、血清アルブミンを本明細書に提示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストに共有結合することができる。一つの実施態様において、血漿タンパク質は、配列番号１５、配列番号５１又は配列番号５の１２、１５、１６、１９又は２４位に対応するアミノ酸に共有結合している。より詳細には、一つの実施態様において、血漿タンパク質は、グルカゴン類縁体の１６又は１９位に対応するアミノ酸に結合しており、ここで誘導体は、配列番号５又は配列番号６の配列を含むか、又は血漿タンパク質は、配列番号１３の場合は１６位、配列番号１４の場合は１９位、及び配列番号１２の場合は１６と１９位に結合している。

【0086】

一つの実施態様によると、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表す直鎖アミノ酸配列が、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのアミノ酸側鎖に共有結合して、グルカゴン類縁体の可溶性、安定性及び／又は薬物動態を改善している、グルカゴンアンタゴニストが提供される。例えば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表すアミノ酸配列は、配列番号１５、配列番号５１又は配列番号５のペプチドの１２、１５、１６、１９、２１又は２４位に共有結合することができる。より詳細には、一つの実施態様において、血漿タンパク質は、グルカゴン類縁体の１６又は１９位に対応するアミノ酸に結合しており、ここで誘導体は、配列番号５及び配列番号６の配列を含むか又はＦｃ部分は、配列番号１３を含む誘導体の１６位、配列番号１４を含む誘導体の１９位及び配列番号１２を含む誘導体の１６と１９位に結合している。Ｆｃ部分は、典型的には、ＩｇＧから単離されるものであが、任意の免疫グロブリンからのＦｃペプチドフラグメントも同等に機能するはずである。

【0087】

本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが結合する、他の結合体も包含し、この結合は、共有結合を介してでも、リンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理的な力又は疎水的若しくは親水的相互作用により達成することができる。多様な非共有結合系を使用することもでき、その例として、ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントが挙げられる。

【0088】

例示的な結合体には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン又はその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本明細書に開示されるグルカゴンペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン及びグロブリンからなる群より選択される。一つの実施態様において、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミン又はトランスフェリンである。幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、鎖原子は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される。鎖原子及びリンカーは、より可溶性のある結合体をもたらすと予想される可溶性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素や他の触媒による切断、又は標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体は、ポリペプチドである場合、全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することもできる。

【0089】

天然グルカゴンの１５〜１６位のＡｓｐ−Ｓｅｒ配列は、水性緩衝液において天然ホルモンの早期化学切断をもたらす特有の不安定ジペプチドとして同定されている。例えば、０．０１NのＨＣｌに３７℃で２週間維持されたとき、５０％を超える天然グルカゴンがフラグメントに切断されうる。２つの遊離切断ペプチド１−１５及び１６−２９は、グルカゴン様生物学的活性を欠いており、したがって、グルカゴン及び関連する類縁体の水性予備処方に対して制限となる。Ｇｌｕによる天然グルカゴンの１５位のＡｓｐの選択的化学置換は、１５−１６ペプチド結合の化学切断を実質的に排除することが観察されている。

【0090】

したがって、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを同様に修飾して、水性緩衝液における早期化学切断に対する感受性を減少できることが予想される。一つの実施態様によると、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを更に修飾して、天然グルカゴンの１５位に対応する位置に配置されている天然アスパラギン酸アミノ酸を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換することによって、水溶液中の安定性を増強することができる。一つの実施態様によると、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの１０位のアスパラギン酸残基を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換することができ、一つの実施態様において、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の１０位の天然アスパラギン酸はグルタミン酸で置換される。一つの実施態様において、アンタゴニストが配列番号９の修飾配列を含み、修飾がＧｌｕによる配列番号９の１０位のＡｓｐの置換を含む、水溶液中で改善された安定性を有するグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。一つの実施態様において、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択される配列を含む、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、アミド化されている。

【0091】

一つの実施態様によると、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの分解を低減することによる安定性の増加は、グルタミン酸、システイン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸による１６位（天然グルカゴンの番号付けによる）のセリンの置換によって達成することもできる。特定の実施態様において、１６位（天然グルカゴンの配列番号付けによる）のセリンは、グルタミン酸で置換されている。

【0092】

出願者たちは、電荷をカルボキシ末端に導入することによって、ペプチドのアゴニスト特性を保持しながらペプチドの可溶性を増強するように、天然グルカゴンを修飾できることも発見した。増強された可溶性は、ほぼ中性のｐＨでのグルカゴン溶液の調製及び保存を可能にする。比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）でグルカゴン溶液を配合することは、グルカゴン類縁体の長期安定性を改善する。

【0093】

出願者たちは、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを同様に修飾して、母体タンパク質のグルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１活性を保持しながら、比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）の水溶液における可溶性を増強できることを予測する。したがって、一つの実施態様は、野生型グルカゴン（配列番号１）の６〜２９位に存在する天然アミノ酸に対して、荷電アミノ酸による天然非荷電アミノ酸の置換により又はカルボキシ末端への荷電アミノ酸の付加によりペプチドに電荷を付加して更に修飾されている、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１を対象とする。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのうちの１〜３個の天然非荷電アミノ酸は、荷電アミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、荷電アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択される。より詳細には、出願者たちは、荷電アミノ酸による（天然グルカゴンの）２８及び／若しくは２９位に対応する位置で通常生じるアミノ酸の置換、並びに／又はペプチドのカルボキシ末端への１〜２個の荷電アミノ酸の付加が、生理学的に関連するｐＨ（すなわち、約６．５〜約７．５のｐＨ）の水溶液におけるグルカゴン類縁体の可溶性及び安定性を増強することを発見した。したがって、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのそのような修飾は、母体ペプチドの生物学的活性を保持しながら、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨの水溶液における可溶性に同様の効果を有することが予測される。

【0094】

一つの実施態様によると、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）によるこれらの配列の２３位及び／又は２４位の天然アミノ酸の置換によって修飾されており、更に、ペプチドのカルボキシ末端への負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）の付加によって修飾されてもよい。別の実施態様において、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）による配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の２４位の天然アミノ酸の置換によって修飾されており、更に、ペプチドのカルボキシ末端への１又は２つの正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）の付加によって修飾されてもよい。一つの実施態様によると、改善された可溶性及び安定性を有するグルカゴン類縁体が提供され、類縁体は、配列番号１５又は配列番号５１のアミノ酸配列を含むが、但し、配列番号１５又は配列番号５１の２３又は２４位の少なくとも１個のアミノ酸が、酸性アミノ酸で置換されている、及び／又は、配列番号１５若しくは配列番号５１のカルボキシ末端に、追加の酸性アミノ酸が付加されている。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より独立して選択される。

【0095】

一つの実施態様によると、アンタゴニストが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９のアミノ酸配列を含む、改善された可溶性及び安定性を有するグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。一つの実施態様によると、配列番号１６又は配列番号１７の配列を含むグルカゴンアゴニストが提供される。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号２０の配列を含むが、但し、配列番号２０の２３位のアミノ酸がアスパラギンであって配列番号２０の２４位のアミノ酸がトレオニンである場合は、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのカルボキシ末端には、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群より独立して選択される１〜２個のアミノ酸が更に付加される。

【0096】

一つの実施態様によると、配列番号１５又は配列番号５１の配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。一つの実施態様において、配列番号１５又は配列番号５１の４位は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸であり、一つの実施態様において、４位は、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸であり、更なる実施態様において、配列番号１５又は配列番号５１の４位は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、一つの実施態様において、配列番号１５又は配列番号５１の４位は、アルパラギン酸である。一つの実施態様において、配列番号１５又は配列番号５１の配列を含み、配列番号１５の４位がアスパラギン酸であり、配列番号１５の１０位がグルタミン酸である、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供される。更なる実施態様において、配列番号１５又は配列番号５１のＣ末端アミノ酸は修飾されて、天然カルボン酸基が、アミド又はエステルのような電荷中性基で置換されている。

【0097】

本開示は、第２のペプチドがグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのＣ末端に融合している、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト融合ペプチドも包含する。より詳細には、融合ペプチドは、配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号５０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ）、配列番号２６（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）及び配列番号２７（ＫＲＮＲ）からなる群より選択されるアミノ酸配列がアミノ酸２４に結合している、配列番号１５又は配列番号５１のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドを含むことができる。一つの実施態様において、配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介して配列番号１５又は配列番号５１のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのアミノ酸２４に結合している。別の実施態様において、融合ペプチドは、カルボキシ末端アミノ酸に配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列が更に結合している、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドを含む。更なる実施態様において、Ｃ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。一つの実施態様において、カルボキシ末端アミノ酸に配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列が結合している、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より独立して選択される配列を２つ含む、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト二量体が提供される。

【0098】

更なる実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト融合ペプチドは更に、ペグ化されていてもよい。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト融合ペプチドが提供されるが、融合ペプチドのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト部分は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択され、配列番号２１の配列がグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト部分のカルボキシ末端に融合しており、ＰＧＥ鎖が存在する場合は、ＰＧＥ鎖は５００〜４，０００ダルトンの範囲から選択される。より詳細には、一つの実施態様において、前記融合ペプチドのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストセグメントは、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群より選択され、ＰＧＥ鎖は、５００〜５，０００ダルトンの範囲から選択され、とりわけ、一つの実施態様において、ＰＥＧ鎖は約１，０００ダルトンである。別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト融合ペプチドは、配列番号４５又は配列番号４６の配列を含み、ＰＥＧ鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択され、とりわけ、一つの実施態様において、ＰＥＧ鎖は約１，０００ダルトンである。更なる実施態様において、Ｃ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。

【0099】

幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対する活性又は効力に影響を与えることなく、グルカゴンペプチドのＣ末端の１又は２個のアミノ酸の切断又は欠失（すなわち、天然グルカゴンの２９位又は２８及び２９位のアミノ酸の切断）により更に修飾される。この場合、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストは、天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のうちのアミノ酸１〜２７、１〜２８、２〜２７、２〜２８、３〜２７、３〜２８、４〜２７、４〜２８、５〜２７、５〜２８、６〜２７又は６〜２８であって、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニスト活性をもたらす１つ以上の修飾を有するアミノ酸から実質的に構成されるか又は構成されることができる。

【0100】

一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、対応するアミノ酸位置での天然グルカゴン残基の置換により更に修飾された、天然ＧＬＰ−１のうちの１つ以上のアミノ酸を含む。例えば、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、２、３、１７、１８、２１、２３及び２４位（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のいずれかの位置に１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、以下のアミノ酸置換の１つ以上により修飾される：Ｓｅｒ２をＡｌａで置換、Ｇｌｎ３をＧｌｕで置換、Ａｒｇ１７をＧｌｎで置換、１８位のＡｒｇをＡｌａで置換、２１位のＡｓｐをＧｌｕで置換、２３位のＶａｌをＩｌｅで置換、そして２４位のＧｌｎをＡｌａで置換（アミノ酸の位置は、天然グルカゴン配列による）。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、Ｓｅｒ２をＡｌａで置換すること及びＧｌｎ３をＧｌｕで置換すること（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）により修飾される。別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、以下のアミノ酸置換の１つ以上により修飾される：Ａｒｇ１７をＧｌｎで置換、１８位のＡｒｇをＡｌａで置換、２１位のＡｓｐをＧｌｕで置換、２３位のＶａｌをＩｌｅで置換、そして２４位のＧｌｎをＡｌａで置換（天然グルカゴンによるアミノ酸番号付け）。さらに別の特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは修飾されて、２１位（配列番号１の番号付けによる）のＧｌｕのみを含む。したがって、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号６０〜７０、７３〜７８、８０〜８８、９０〜９６、１０３、１０４、１０６及び１１４〜１１８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができるし、表１３に記載のペプチド２〜６、表１４に記載のペプチド１〜８及び表１５に記載のペプチド２〜６、８及び９のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。

【0101】

特定の実施態様において、ＰＬＡを含む上記に記載されたグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは修飾されて、例えばＰＬＡのエステル又はＰＬＡのエーテルのようなＰＬＡのオキシ誘導体を含む。例えば、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号２、５〜２０、２２〜２５、３２〜３６、３８、３９、４５、４６及び５１のいずれかのアミノ酸配列を含むことができるが、ここでＰＬＡは、エステル又はエーテル結合を介して、アミノ酸、ペプチド、ポリマー、アシル基又はアルキル基に結合している。アミノ酸、ペプチド、ポリマー、アシル基又はアルキル基は、本明細書に記載されている任意のものであることができる。ＰＬＡがエステル結合を介してアミノ酸又はペプチドに結合している場合、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、デプシペプチドであると考慮することができる。

【0102】

また、別の特定の実施態様において、ＰＬＡを欠いている上記記載のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは修飾されて、７位（天然グルカゴンの番号付けによる）からＮ末端までの連続した２個のアミノ酸の間に少なくとも１つのエステル結合又はエーテル結合を含む。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、連続した２個のアミノ酸の間に少なくとも１つのエステル又はエーテル結合を含む。さらに特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１のＮ末端の６個のアミノ酸を含み、Ｎ末端の６個のアミノ酸のうちの連続した２個のアミノ酸は、エステル又はエーテル結合を介して結合している。

【0103】

また、本明細書において更に提供されるものは、（１）本明細書に記載された方法により（例えば、分子内架橋又は１個以上のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸又若しくは１６位（配列番号１の番号付けによる）の酸性アミノ酸の組み込み又はそれらの組み合わせにより）安定化されたアルファ−へリックス、（２）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミド又はエステル及び（３）一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ、を含むペプチド又はその結合体であり、
ここでＡは、下記：
（ｉ）ＰＬＡ；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；及び
（ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド
からなる群より選択され；
Ｂは、配列番号１のアミノ酸ｐ−２６を表し（ここでｐは、３、４、５、６又は７である）、更に、下記からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含んでもよく：
（ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：

【化5】

〔ここで、Ｘ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_４アルケニル若しくはＣ_２〜Ｃ_４アルキニルである〕
を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による、９位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド、又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による、１０、２０及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換；
（ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン、及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による、１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換（ここで前記群のアミノ酸は親水性部分に共有結合している）；
（ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸による１５位（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸による１６位（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
（ｉｘ）Ｇｌｎによる１７位のＡｒｇの交換、Ａｌａによる１８位のＡｒｇの交換、Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの交換、Ｉｌｅによる２３位のＶａｌの交換、及びＡｌａによる２４位のＧｌｎの交換（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）；
（ｘ）Ｇｌｕによる１６位のＳｅｒの交換、Ｇｌｕによる２０位のＧｌｎの交換、又はＧｌｕによる２４位のＧｌｎの交換（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）；
そして
Ｃは、
（ｖｉｉ）Ｘ；
（ｖｉｉｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｉｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号２１、２６、２７及び５０からなる群より選択される）、
からなる群より選択される。

【0104】

特定の態様において、ペプチドは、ＰＬＡのオキシ誘導体を含む。本明細書で使用されるとき、「ＰＬＡのオキシ誘導体」は、ヒドロキシ基がＯ−Ｒ_１１（ここでＲ_１１は化学的部分である）で置換されているＰＬＡの修飾構造を含む化合物を意味する。この場合、ＰＬＡのオキシ誘導体は、例えばＰＬＡのエステル又はＰＬＡのエーテルであることができる。

【0105】

ＰＬＡのオキシ誘導体を作製する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、エステルを、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成することができる。求核剤は、アミン又はヒドロキシルが含まれるが、これらに限定されない任意の適切な求核剤であることができる。したがって、ＰＬＡのエステルは、式ＩＶ：

【化6】

〔式中、Ｒ_７は、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成されるエステルである〕
を含むことができる。

【0106】

求核剤を有するカルボニル（ＰＬＡのヒドロキシルと反応してエステルを形成する）は、例えば、カルボン酸、カルボン酸誘導体又はカルボン酸の活性化エステルであることができる。カルボン酸誘導体は、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステル又はニトリルでありうるが、これらに限定されない。カルボン酸の活性化エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミド又はヘキサフルオロホスフェートであることができる。幾つかの実施態様において、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又は１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＣＩＣＤ）である。幾つかの実施態様において、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェート ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノンホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及びｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群より選択される。

【0107】

ヒドロキシル基（例えば、ＰＬＡのヒドロキシル）を用いる反応によりエーテルを作製する方法も当該技術分野において既知である。例えば、ＰＬＡのヒドロキシル基を、ハロゲン化アルキル又はトシル化アルキルアルコールと反応させて、エーテル結合を形成することができる。

【0108】

一般に、化学的部分であるＲ_１１は、ペプチドの活性を減少させないものである。幾つかの実施態様において、化学的部分は、ペプチドの活性、安定性及び／又は可溶性を増強する。

【0109】

特定の実施態様において、酸素含有結合を介して（例えば、エステル又はエーテル結合を介して）ＰＬＡに結合している化学的部分は、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール）、炭水化物、アミノ酸、ペプチド又は脂質、例えば脂肪酸又はステロイドである。

【0110】

特定の実施態様において、化学的部分は、アミノ酸であり、更に、式ＩＶがデプシペプチドとなるように、ペプチドの一部であってもよい。この場合、ＰＬＡは、ペプチドがＰＬＡ残基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６個又はそれ以上）のアミノ酸Ｎ末端を含むように、ペプチドのＮ末端アミノ酸残基以外の位置にあることができる。例えば、ペプチドは、ペプチドのｎ位にＰＬＡを含むことができ、ここでｎは２、３、４、５又は６である。

【0111】

ＰＬＡ残基のアミノ酸Ｎ末端のアミノ酸は、合成アミノ酸であってもよいし、天然に存在するアミノ酸であってもよい。特定の実施態様において、Ｎ末端ＰＬＡであるアミノ酸は、天然アミノ酸である。一つの実施態様において、ＰＬＡのＮ末端であるアミノ酸は、天然グルカゴンのＮ末端アミノ酸である。例えば、ペプチドは、Ｎ末端に、配列番号５２〜５６のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、ここでＰＬＡは、エステル結合を介してトレオニンに結合している：
配列番号５２ Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５３ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５４ Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５５ Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５６ Ｔｈｒ−ＰＬＡ

【0112】

別の実施態様において、１個以上のＮ末端アミノ酸を天然グルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換することができる。例えば、ペプチドが５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減するアミノ酸であることができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸である。より詳細には、幾つかの実施態様において、アンタゴニスト／アゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、ペプチドが４、５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、ペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。本発明の例示的な実施態様において、ペプチドは、Ｎ末端に、配列番号５７〜５９のいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0113】

式ＩＶの化合物を含むペプチドに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシル基と反応することができる限り、任意のポリマーであることができる。ポリマーは、天然では又は通常は求核剤を有するカルボニルを含むものであることができる。あるいは、ポリマーは、カルボニルを有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。ポリマーは、以下のいずれかを誘導体化したポリマーであってもよい：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン及びポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含むその誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、 ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリ（酢酸ビニル）及びポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、三酢酸セルロース及びセルロース硫酸ナトリウム塩を含むセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレン、並びにポリスチレン。

【0114】

ポリマーは、生分解性ポリマーであることができ、例えば、合成の生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸ポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）及びポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン））及び天然の生分解性ポリマー（例えば、アルギン酸塩及びデキストランを含む他の多糖類、セルロース、コラーゲン、その化学誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者により日常的に行われる他の修飾）、アルブミン及び他の親水性タンパク質（例えば、ゼイン、他のプロラミン及び疎水性タンパク質））、並びにこれらの任意のコポリマー又は混合物であることができる。一般に、これらの物質は、インビボにおける酵素的加水分解又は水への暴露によって、表面又はバルク侵食により分解される。

【0115】

ポリマーは、生体付着性ポリマーであることができ、例えば、H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587により記載される生体侵食性ヒドロゲル（この教示は本明細書に組み込まれる）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）であることができる。

【0116】

一つの実施態様において、ポリマーは水溶性ポリマーである。適切な水溶性ポリマーは、当該技術分野において既知であり、例として、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Methocel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、多様なアルキルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース、多様なセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム及びカルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、並びにこれらの誘導体、塩及び組み合わせが挙げられる。

【0117】

特定の実施態様において、ポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もような、ポリアルキレングリコールである。

【0118】

炭水化物は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含む又は含むように構成される限り、任意の炭水化物であることができる。炭水化物は、例えば、アルファ離脱基を有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。この場合、炭水化物を、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ多糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン）から誘導体化することができる。

【0119】

脂質は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含む任意の脂質であることができる。脂質は、例えば、カルボニルを含むように誘導体化されたものであることができる。この場合、脂質は、以下のものの誘導体であることができる：脂肪酸（例えば、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、サッカロ脂質又はポリケチド、油、ロウ、コレステロール、ステロール、脂溶性のビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質。

【0120】

一つの実施態様において、Ｒ７は、約１００kDa以下の分子量、例えば９０kDa以下、約８０kDa以下、約７０kDa以下、約６０kDa以下、約５０kDa以下、約４０kDa以下の分子量を有する。したがって、Ｒ７は、約３５kDa以下、３０kDa以下、約２５kDa以下、約２０kDa以下、約１５kDa以下、約１０kDa以下、約５kDa以下、又は約１kDaの分子量を有することができる。

【0121】

別の実施態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、Ａとして、連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチドを含む。エステル又はエーテル結合は、例えば、アミノ酸２と３、３と４、４と５、又は５と６の間にあることができる。更に、Ａのペプチドを、ポリマー（例えば、親水性ポリマー）への結合を含む他の化学的部分への共有結合、アルキル化、又はアシル化により、更に修飾してもよい。

【0122】

Ａのペプチドは、連続した少なくとも２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合している限り、合成又は天然の任意のアミノ酸を含むことができる。特定の実施態様において、Ａのペプチドは天然グルカゴンのアミノ酸を含む。例えば、Ａのペプチドは天然グルカゴン（配列番号１）のｊから６を含むことができ、ここでｊは１、２、３、４又は５である。あるいは、Ａのペプチドは、１つ以上のアミノ酸修飾を有する、配列番号１のＮ末端に基づいたアミノ酸配列を含むことができる。１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減させるアミノ酸であることができる。例えば、Ａのペプチドは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸を１位に含むことができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、Ａのペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、Ａのペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。したがって、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃのペプチドは、下記：
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１０７）；
Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１０８）；又は
Ｘａａ_３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１０９）
のアミノ酸配列を含むことができ、
ここで、Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択され；Ｘａａ_２は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択され；そしてＸａａ_３は、Ｇｌｎ又はＧｌｕである。

【0123】

一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドに関して、Ｂは、天然グルカゴンのアミノ酸、例えば配列番号１のアミノ酸ｉ−２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６又は７である）、更に１つ以上のアミノ酸修飾を含んでもよい。特定の実施態様において、Ｂは、配列番号１のアミノ酸７−２６を表し、更に修飾されていてもよい。

【0124】

一つの実施態様において、Ｂは、３つまでのアミノ酸修飾により修飾されている。例えば、配列番号１の天然アミノ酸配列を表すＢは、１つ以上の保存的アミノ酸修飾で修飾されている。

【0125】

別の実施態様において、Ｂは、本明細書に記載された（ｉｖ）〜（ｘ）からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施態様において、Ｂは、アミノ酸修飾（ｖ）及び（ｖｉ）のうちの１つ又は両方を含む。更なる特定の実施態様において、Ｂは、（ｖ）及び（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）及び（ｘ）からなる群より選択されるアミノ酸修飾の１つ又は組み合わせを含む。

【0126】

本明細書に記載されているように、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、Ｃ末端に１個以上の荷電アミノ酸、例えば本明細書に記載されているＹ及び／又はＺを含むことができる。代替的に又は追加的に、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、ＣがＸ−Ｙ−Ｚを含む場合、ＺのＣ末端に１〜２個の荷電アミノ酸を更に含むことができる。荷電アミノ酸は、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕのうちの１つであることができる。特定の実施態様において、ＹはＡｓｐである。

【0127】

一つの実施態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、１、１６、２０、２１若しくは２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸残基に、又はＮ若しくはＣ末端残基に、親水性部分が共有結合している。特定の実施態様において、親水性部分は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＣｙｓ残基に結合している。この場合、天然グルカゴン（配列番号１）の１６、２１、２４又は２９位のアミノ酸はＣｙｓ残基で置換されていることができる。あるいは、親水性部分を含むＣｙｓ残基を、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＣ末端に、３０位として、又は、例えば、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドがＣ末端延長を含む場合、４０位として、付加することができる（位置は配列番号１のアミノ酸番号付けによる）。あるいは、親水性部分は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＰＬＡに、ＰＬＡのヒドロキシル部分を介して結合することができる。親水性部分は、例えばポリエチレングルコールを含む、本明細書に記載されている任意のものでありうる。

【0128】

特定の態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、分子内架橋が組み込まれたために安定化したアルファ−へリックスを含む。一つの実施態様において、分子内架橋はラクタム架橋である。ラクタム架橋は、９位と１２位のアミノ酸、１２位と１６位のアミノ酸、１６位と２０位のアミノ酸、２０位と２４位のアミノ酸又は２４位と２８位のアミノ酸（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の間にあることができる。特定の実施態様において、１２位と１６位のアミノ酸又は１６位と２０位のアミノ酸（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）は、ラクタム架橋を介して結合している。ラクタム架橋の他の位置も考慮される。

【0129】

追加的に又は代替的に、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、例えば１６、２０、２１又は２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の任意の位置にアルファ，アルファ−二置換アミノ酸を含むことができる。一つの実施態様において、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸はＡＩＢである。特定の実施態様において、ＡＩＢは、１６位（配列番号１の番号付けによる）に配置されている。代替的に又は追加的に、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは修飾されて、１６位（配列番号１の番号付けによる）に酸性アミノ酸を含むことができ、この修飾はアルファ−へリックスの安定性を増強する。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、側鎖スルホン酸又は側鎖カルボン酸を含むアミノ酸である。より特定の実施態様において、酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、システイン酸、ホモシステイン酸、Ａｓｐ、及び下記構造：

【化7】

〔ここで、Ｘ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_４アルケニル又はＣ_２〜Ｃ_４アルキニルである〕
を有するＣｙｓのアルキル化誘導体からなる群より選択される。

【0130】

特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号６０〜７０、７３〜７８、８０〜８８、９０〜９６、１０３、１０４、１０６及び１１４〜１１８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができるか、又は、表１３に記載のペプチド２〜６、表１４に記載のペプチド１〜８及び表１５に記載のペプチド２〜６、８及び９のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。

【0131】

一つの実施態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストである。特定の実施態様において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト作用の少なくとも約５０％を示し、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも約５０％の阻害を示す。別の特定の実施態様において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト作用の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％を示す。代替的に又は追加的に、ペプチドは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％の阻害を示す。

【0132】

幾つかの実施態様において、下記（１）〜（３）を含み、更に下記（４），（５）も含んでもよい、グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を有するペプチド（例えば、グルカゴンアンタゴニスト、ＧＬＰ−１アゴニスト）又はその結合体が提供される：
（１）下記を含むが、これらに限定されない、グルカゴンアンタゴニスト活性を付与する修飾：
（ａ）ＰＬＡによる６位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のＰｈｅの置換（更に、野生型グルカゴンのＮ末端から１〜５個のアミノ酸を欠失を伴ってもよい）、又は
（ｂ）野生型グルカゴンのＮ末端からの２〜５個のアミノ酸の欠失（更に、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、又はシステインのスルホン酸誘導体による、野生型グルカゴンの９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換を伴ってもよい）、
並びに
（２）下記を含むが、これらに限定されない、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を付与する修飾：
（ａ）野生型グルカゴンのアミノ酸１２〜２９の範囲内、例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３、４若しくはそれ以上の位置でのα，α−二置換アミノ酸の挿入若しくは置換、又は
（ｂ）野生型グルカゴンのアミノ酸１２〜２９の範囲内の分子内架橋、例えば、塩架橋若しくはラクタム架橋若しくは別の種類の共有結合の導入、又は
（ｃ）例えば、Ｓｅｒ２がＡｌａで置換されている、Ｇｌｎ３がＧｌｕで置換されている、Ａｒｇ１７がＧｌｎで置換されている、１８位のＡｒｇがＡｌａで置換されている、２１位のＡｓｐがＧｌｕで置換されている、２３位のＶａｌがＩｌｅで置換されている、及び／若しくは２４位のＧｌｎがＡｌａで置換されている、ＧＬＰ−１の対応するアミノ酸による２、３、１７、１８、２１、２３若しくは２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１つ以上の位置でのアミノ酸の置換、又は
（ｄ）野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９位の前後のアルファ−へリックス構造を安定化する他の修飾、

並びに
（３）ＧＬＰ−１アゴニスト活性を強化する他の修飾、例えば、
（ａ）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミド又はエステル；
そして、更に、
（４）以下の修飾のうちの１つ以上：
（ａ）例えばＮ末端、若しくは６、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、若しくはＣ末端アミノ酸への、ポリエチレングルコールのような親水性部分の共有結合、及び／又は
（ｂ）アシル化若しくはアルキル化；そして、更に、
（５）以下の追加的な修飾のうちの１つ以上：
（ａ）Ｎ末端へのアミノ酸の共有結合、例えばＮ末端への１〜５個のアミノ酸の共有結合（この結合は６位（野生型グルカゴンの番号付けによる）のＰＬＡへのエステル結合を介してであってもよく、更に、本明細書に記載されているようなＤＰＰ−ＩＶ切断への耐性を改善する１又は２位での修飾を一緒に伴ってもよい）；
（ｂ）２９位及び／又は２８位（野生型グルカゴンの番号付けによる）（更に２７位を含んでもよい）でのアミノ酸の欠失；
（ｃ）Ｃ末端へのアミノ酸の共有結合；
（ｄ）所望の活性を保持しながらの非保存的置換、保存的置換、付加、又は欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位の１つ以上の位置での保存的置換、Ｖａｌ又はＰｈｅによる１０位のＴｙｒの置換、Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換、Ａｌａによるこれらの位置の１つ以上での置換；
（ｅ）分解を低減しうる、１５位のアスパラギン酸の修飾、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸若しくはホモシステイン酸での置換による修飾；又は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６結合の切断による分解を同様に低減しうる、１６位のセリンの修飾、例えばトレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸での置換、若しくは４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸での置換、代替的にはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかでの置換による修飾；
（ｆ）酸化分解を低減するための、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換による、２７位のメチオニンの修飾；
（ｇ）Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減するための、例えばＡｌａ又はＡＩＢでの置換による、２０又は２４位のＧｌｎの修飾；
（ｈ）Ａｓｐが脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続いて異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じる分解を低減するための、２１位のＡｓｐの修飾、例えば、Ｇｌｕでの置換による修飾；
（ｊ）本明細書に記載されているホモ二量体化又はヘテロ二量体化；及び
（ｋ）上記の組み合わせ。

【0133】

同じ部類内の修飾のいずれかを一緒に組み合わせてもよいこと及び／又は異なる部類の修飾が組み合わされることが理解される。例えば、修飾の（１）（ａ）を（２）（ａ）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ａ）を、（２）（ｂ）（例えば、ラクタム架橋又は塩架橋）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ａ）を（２）（ｃ）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）を（２）（ａ）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）を（２）（ｂ）（例えば、ラクタム架橋又は塩架橋）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）を（２）（ｃ）及び（３）と組み合わせることができ；前述のいずれかを（４）（ａ）及び／又は（４）（ｂ）と組み合わせることができ；そして前述のいずれかを（５）（ａ）〜（５）（ｋ）のいずれかと組み合わせることができる。

【0134】

例示的な実施態様において、α，α−二置換アミノ酸ＡＩＢは、１６、２０、２１又は２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３つ又は全ての位置で置換される。

【0135】

例示的な実施態様において、分子内架橋は塩架橋である。

【0136】

別の例示的な実施態様において、分子内架橋は、共有結合、例えばラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、ラクタム架橋は、９位と１２位のアミノ酸、１２位と１６位のアミノ酸、１６位と２０位のアミノ酸、２０位と２４位のアミノ酸又は２４位と２８位のアミノ酸（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の間にある。

【0137】

例示的な実施態様において、アシル化又はアルキル化は、６、１０、２０又は２４位（野生型グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸番号付けによる）、又は、Ｎ末端若しくはＣ末端にある。

【0138】

例示的な実施態様において、修飾には下記が含まれる：
（ｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による、１５位（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による、１６位（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
（ｉｉｉ）荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
（ｉｖ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による、２８位のＡｓｎの置換；
（ｖ）Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；
（ｖｉ）Ａｓｐによる２８位での置換；
（ｖｉｉ）Ｇｌｕによる２８位での置換；
（ｖｉｉｉ）荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
（ｉｘ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による、２９位のＴｈｒの置換；
（ｘ）Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＬｙｓによる２９位での置換；
（ｘｉｉ）Ｇｌｕによる２９位での置換；
（ｘｉｉ）２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
（ｘｉｉｉ）２９位の後ろへのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；
（ｘｉｖ）２９位の後ろへのＧｌｕ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；或いは
これらの組み合わせ。

【0139】

ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性、ペプチド可溶性及び／又はペプチド安定性を増加する上記に記載された修飾のいずれかを個別に又は組み合わせて適用することができる。

【0140】

開示されているペプチド及びグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、他のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストについて以前に記載されているあらゆる使用に適していると考えられる。したがって、本明細書に記載されているグルカゴン類縁体を、高血糖症の治療、又はグルカゴンの高血中レベル若しくは高血中グルコースレベルをもたらす他の代謝疾患の治療に使用することができる。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを使用して治療される患者は、家畜化された動物であり、別の実施態様では、治療される患者はヒトである。研究は、糖尿病患者におけるグルカゴン抑制の欠如が、部分的にはグリコーゲン分解の促進を介した食後高血糖に寄与することを示唆している。経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の際の血中グルコースの分析から、ソマトスタチン誘導グルカゴン抑制の存在又は不在にかかわらず、高グルカゴンレベルの被験者においてグルコースの有意な増加が示された。したがって、本明細書に記載されているペプチド及びグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、高血糖症の治療に使用可能であり、また、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病又は妊娠糖尿病（インスリン依存性とインスリン非依存性のいずれも）を含む多様な種類の糖尿病を治療すること、及び、腎障害、網膜症及び血管疾患を含む糖尿病の合併症を低減することに有用であることが予想される。

【0141】

低血糖症を治療する方法は、静脈内、腹腔内、皮下若しくは筋肉内のような非経口、鞘内、経皮、直腸内、経口、鼻腔内又は吸入を含む、任意の標準的な投与経路を使用して、本開示のペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを患者に投与する工程を含む。一つの実施態様において、組成物は皮下又は筋肉内投与される。一つの実施態様において、組成物は非経口投与され、グルカゴン組成物はシリンジの中に包装される。

【0142】

エキセンディン−４は、３９個までのアミノ酸で作製されるペプチドである。ＧＬＰ−１として知られている受容体の強力な刺激物質である。このペプチドは、食欲を抑制し、減量を誘導することも報告されている。出願者たちは、エキセンディン−４の末端配列は、グルカゴンのカルボキシ末端へ付加されると、グルカゴンの生体活性を損なうことなく、グルカゴンの可溶性及び安定性を改善することを見出した。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを、食欲を減退させるため、又は体重の減少を促進するための方法として、患者に投与する。一つの実施態様によると、患者は家畜化された動物であり、別の実施態様では、治療される患者はヒトである。一つの実施態様において、エキセンディン−４の末端アミノ酸１０個（すなわち配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）の配列）は、本明細書に開示されているペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのカルボキシ末端に結合している。これらの融合タンパク質は、食欲を抑制し、減量／体重維持を誘導する薬理学的活性を有すると予測される。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを更に修飾して、ペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのカルボキシ末端アミノ酸（２４位）に、配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ））又は配列番号５０のアミノ酸配列を結合させて、個人に投与して、減量を誘導するか又は体重維持を支援することができる。より詳細には、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択される配列を含み、カルボキシ末端アミノ酸（２４位）に配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号５０のアミノ酸配列が更に結合しており、食欲の抑制及び減量／体重維持の誘導に使用される。一つの実施態様において、投与されるペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９からなる群より選択される配列を含み、カルボキシ末端アミノ酸（２４位）に配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列が更に結合している。一つの実施態様において、本方法は、配列番号４５又は配列番号４６の配列を含むペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの投与を含む。

【0143】

そのような食欲を減退する又は体重の減少を促進する方法は、体重の低減、体重増加の防止、又は薬剤誘導肥満を含む多様な原因による肥満の治療、並びに血管疾患（冠動脈疾患、発作、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症及び筋骨格系疾患などの肥満に関連する合併症の低減に有用であることが予想される。

【0144】

本発明のグルカゴンペプチドを、単独で又は他の抗糖尿病又は抗肥満剤と組み合わせて投与することができる。当該技術分野において既知であるか又は調査中の抗糖尿病剤には、インスリン；トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta, Micronase, Glynase）、グリメピリド（Amaryl）又はグリクラジド（Diamicron）のようなスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）又はナテグリニド（Starlix）のようなメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）又はフェンホルミンのようなビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）若しくはトログリタゾン（Rezulin）又は他のＰＰＡＲγインヒビターのようなチアゾリジンジオン；ミグリトール（Glyset）、アルカボース（Precose/Glucobay）のような炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター；エクセナチド（Byetta）又はプラムリンチド；ビルダグリプチン又はシタグリプチンのようなジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）インヒビター；又はＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビターが含まれる。

【0145】

当該技術分野において既知であるか又は調査中の抗肥満剤には、フェネチルアミン型刺激薬、フェンテルミン、（更にフェンフルラミン又はデクスフェンフルラミンも）、ジエチルプロピオン（Tenuate（登録商標））、フェンジメトラジン（Prelu-2（登録商標）、Bontril（登録商標））、ベンズフェタミン（Didrex（登録商標））、シブトラミン（Meridia（登録商標）、Reductil（登録商標））を含む食欲抑制薬；リモナバン（Acomplia（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Prozac）；Qnexa（トピラメート及びフェンテルミン）、Excalia（ブプロピオン及びゾニサミド）又はContrave（ブプロピオン及びナルトレキソン）；或いはゼニカル（Orlistat）若しくはCetilistat （ATL-962としても知られている）又はGT 389-255と類似しているリパーゼインヒビターが含まれる。

【0146】

本明細書に開示されているペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを、代謝性るいそうを罹患している患者に投与することもできる。癌患者の過半数が、意図されない進行性の減量、衰弱、並びに低体脂肪及び筋肉により特徴付けられる代謝性るいそうを経験していると推定される。この症状は、ＡＩＤＳ患者において同様に一般的であり、細菌及び寄生虫疾患、リウマチ様関節炎、並びに腸、肝臓、肺及び心臓の慢性疾患においても存在しうる。通常、食欲不振に関連し、加齢の状態又は物理的外傷の結果として表れる可能性がある。代謝性るいそうは、生活の質を減少し、基礎状態を悪化させる症状であり、死亡の主な原因である。出願者たちは、本明細書に開示されているペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを患者に投与して、代謝性るいそうを治療できると予測する。

【0147】

本明細書に開示されているペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを含む医薬組成物を、標準的な薬学的に許容される担体及び当業者に既知の投与経路を使用して、配合及び投与することができる。したがって、本開示は、本明細書に開示されている１つ以上のペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も包含する。医薬組成物は、ペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを唯一の薬学的活性成分として含んでもよいし、或いはペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを１つ以上の追加的な活性剤と組み合わせてもよい。一つの実施態様によると、ペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストと、インスリン又はインスリン類縁体とを含む組成物が提供される。あるいは、配列番号１５又は配列番号５１の配列を含み、配列番号１５又は配列番号５１のアミノ酸２４に配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号５０のアミノ酸配列が更に結合しているペプチドと、抗肥満ペプチドとを含む、減量の誘導又は体重増加の防止のための組成物を提供することができる。適切な抗肥満ペプチドには、米国特許第５，６９１，３０９号、同第６，４３６，４３５号又は米国特許出願第２００５／０１７６６４３号に開示されているものが含まれる。

【0148】

一つの実施態様によると、好ましくは滅菌され、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の純度レベルの、本明細書に開示されている任意の新規ペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストと、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。そのような組成物は、ペプチドグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを、少なくとも０．５mg/ml、１mg/ml、２mg/ml、３mg/ml、４mg/ml、５mg/ml、６mg/ml、７mg/ml、８mg/ml、９mg/ml、１０mg/ml、１１mg/ml、１２mg/ml、１３mg/ml、１４mg/ml、１５mg/ml、１６mg/ml、１７mg/ml、１８mg/ml、１９mg/ml、２０mg/ml、２１mg/ml、２２mg/ml、２３mg/ml、２４mg/ml、２５mg/ml、又はそれ以上の濃度で、含有することができる。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌された、更に多様な容器に保存されてもよい、水性液剤を含む。本明細書に開示されている化合物を一つの実施態様に従って使用して、注射可能な予備処方された液剤を調製することができる。別の実施態様において、医薬組成物は凍結乾燥粉末剤を含む。医薬組成物を、患者に組成物を投与する使い捨て装置を含むキットの一部として更に包装することができる。容器又はキットにラベルを付けて常温又は冷蔵温度で保存することができる。

【0149】

本明細書に記載されている全ての治療方法、医薬組成物、キット及び他の同様の実施態様は、ペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストという用語の使用にはその薬学的に許容される塩が全て含まれることを考慮する。

【0150】

ペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストをペグ化することで、アンタゴニストの水溶性を改善することができる。しかし、ＰＥＧ鎖の長さを増大して又は複数のＰＥＧ鎖をペプチドに結合して、結合ＰＥＧの総分子量が５，０００ダルトンを超えると、修飾グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト又はペプチドの作用時間を遅延し始める。一つの実施態様によると、１つ以上のポリエチレングリコール鎖を含むペプチド又はグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが提供され、ここで結合ＰＥＧの総分子量は、５，０００ダルトンを超え、一つの実施態様では、１０，０００ダルトンを超える。そのような修飾グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト又はペプチドは、活性の時間が遅くなるが、生体活性を失うことはない。したがって、そのような化合物を予防的に投与して、投与グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト又はペプチドの効果を延ばすことができる。

【0151】

一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択されるペプチドを含み、ここでペプチドの１６又は１９位の１個以上のアミノ酸残基の側鎖は、ポリエチレングリコール鎖に共有結合しており、ＰＥＧ鎖の総分子量は、約１０，０００ダルトンを超える。一つの実施態様において、ＰＥＧ鎖の分子量は、１０，０００超から４０，０００ダルトン以下である。

【0152】

１０，０００ダルトンを超える分子量を有するＰＥＧ鎖に共有結合するように修飾されたグルカゴンペプチドを、インスリンと一緒に投与して、糖尿病患者においてインスリン作用を緩衝すること及び安定した血中グルコースレベルの維持を助けることができる。本開示の修飾グルカゴンペプチドを単一組成物でインスリンと同時投与することもできるし、別々の液剤として同時に投与するか、あるいは、インスリンと修飾グルカゴンペプチドを互いに異なる時間で投与することもできる。一つの実施態様において、インスリンを含む組成物及び修飾グルカゴンペプチドを含む組成物を、互いに１２時間以内に投与する。修飾グルカゴンペプチドと投与されたインスリンの正確な比率は、部分的には患者のグルカゴンレベルを決定することによって決まり、慣用的な実験により決定することができる。

【0153】

一つの実施態様によると、インスリンと、配列番号１３のペプチドを含むペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストとを含む組成物が提供され、ここで配列番号１３の１６位のアミノ酸残基は、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖に共有結合している。別の実施態様において、インスリンと、配列番号１４のペプチドを含むペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト又はペプチドとを含む組成物が提供され、ここで配列番号１４の１９位のアミノ酸残基は、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖に共有結合している。一つ実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１２のペプチドを含み、ここで配列番号１２の１６及び１９位のアミノ酸残基は、ポリエチレングリコール鎖に共有結合しており、２つのポリエチレングリコール鎖の合計分子量は、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される。別の実施態様において、ペグ化ルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１３又は配列番号１４のペプチドを含み、ここで共有結合しているＰＥＧ鎖は、少なくとも約１０，０００ダルトンの分子量を有し、一つの実施態様において、ＰＥＧの分子量は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される。

【0154】

一つの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、腸管の一過性麻痺の誘導に使用される。この方法は、放射線学の目的に有用であり、ペグ化されたグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト、Ｃ末端延長を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト、又はそのようなグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの二量体を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む。

【0155】

本開示は、本明細書に開示されているペプチド又は修飾グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの多量体も包含する。２つ以上のグルカゴン類縁体を、標準的な結合剤及び当業者に既知の手順を使用して一緒に結合することができる。例えば、二量体は、２つのペプチド又は修飾グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト、特にシステイン、リシン、オルチニン、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニン残基（例えば、配列番号１３及び配列番号１４）により（例えば、１６又は１９位で）置換されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストから、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤の使用を介して形成することができる。二量体は、ホモ二量体であってもよいし、ヘテロ二量体であってもよい。一つの実施態様において、二量体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８からなる群より独立して選択される２つのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストにより形成され、ここで２つのペプチドは、それぞれのペプチドの１１位、それぞれのペプチドの１６位、若しくはそれぞれのペプチドの１９位、又はこれらの任意の組み合わせに結合しているリンカーを介して、互いに結合している。一つの実施態様において、結合は、それぞれのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドのＣｙｓ１６とＣｙｓ１６又はＣｙｓ１９とＣｙｓ１９又はＣｙｓ１６とＣｙｓ１９又はＣｙｓ２４とＣｙｓ２４又はＣｙｓ３５とＣｙｓ３５残基（配列番号４５又は配列番号４６における）の間のジスルフィド結合である。

【0156】

同様に、二量体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号５１からなる群より独立して選択される、２つのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドにより形成されることができ、ここで結合は、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト配列の１１、１６、１９及び３５位から独立して選択されるアミノ酸位置の間に形成される。一つの実施態様によると、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９からなる群より選択される２つのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを含む、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト二量体が提供され、ここで２つのアンタゴニストは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９の１６又は１９位のアミノ酸を介してジスルフィド結合により互いに結合している。一つの実施態様において、二量体は、２つのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのホモ二量体を含む。別の実施態様において、二量体の第１及び第２グルカゴン類縁体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より独立して選択される。

【0157】

本明細書に開示されているグルカゴン類縁体又はペプチドを、一つの実施態様に従って、キットの一部として提供することができる。一つの実施態様において、グルカゴンアゴニストを、それを必要とする患者に投与するキットが提供され、ここでキットは、下記からなる群より選択される修飾グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを含む：
１）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号５１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト；
２）本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの１１、１２、１５、１６、１９又は２４位（類縁体のアミノ酸配列による）にポリエチレン鎖が共有結合し、ＰＥＧ鎖が約５００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト；
３）本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの末端アミノ酸に配列番号２１のペプチドが更に融合している、融合ペプチド；並びに
４）配列番号２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号５１のアミノ酸配列がカルボキシ末端に更に結合しており、ポリエチレン鎖がグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの１１、１２、１５、１６、１９、２４又は３５位に共有結合し、更に、ポリエチレン鎖が約５００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト。

【0158】

一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト又はペプチド組成物を患者に投与する装置を有するキットが提供される。キットは、多様な容器、例えばバイアル、チューブ、ボトルなどを更に含むことができる。好ましくは、キットは使用説明書も含む。一つの実施態様によると、キットの装置は、エアゾール・ディスペンサー装置であり、ここで組成物はエアゾール装置内に予め包装されている。別の実施態様において、キットは、シリンジ及び針を含み、一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト組成物は、シリンジの中に予め包装されている。

【0159】

以下が、本明細書に開示されているペプチド及びグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストに適用される。

【0160】

＜アルファ−へリックス構造の安定化＞
グルカゴンペプチドのＣ末端部分（野生型グルカゴン、配列番号１のアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９の前後）のアルファ−へリックス構造の安定化は、例えば、共有若しくは非共有分子内架橋の形成により又はアルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での１２〜２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）前後のアミノ酸の置換及び／若しくは挿入により実施することができる。

【0161】

幾つかの実施態様において、分子内架橋が２つのアミノ酸側鎖同士の間に形成されて、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端部分（例えば、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９）の三次元構造を安定化する。２つのアミノ酸側鎖は、水素結合、塩架橋の形成のようなイオン相互作用又は共有結合を介して互いに結合することができる。

【0162】

幾つかの実施態様において、分子内架橋は、３個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｉとｉ＋４の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｉは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる１２〜２５の間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５）の任意の整数である。より詳細には、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸対１２と１６、１６と２０、２０と２４、又は２４と２８（ｉ＝１２、１６、２０又は２４であるアミノ酸対）の側鎖同士が、互いに結合し、それによりグルカゴンアルファ−へリックスを安定化する。代替的には、ｉは１７であることができる。

【0163】

幾つかの特定の実施態様において、ｉとｉ＋４位のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約８原子又は約７〜９原子である。

【0164】

別の実施態様において、分子内架橋は、２個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｊとｊ＋３の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｊは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる１２〜２６の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５及び２６）である。幾つかの特定の実施態様において、ｊは１７である。

【0165】

幾つかの特定の実施態様において、ｊとｊ＋３位のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約６原子又は約５〜７原子である。

【0166】

さらに別の実施態様において、分子内架橋は、６個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｋとｋ＋７の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｉは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる１２〜２２の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１及び２２）である。幾つかの特定の実施態様において、ｋは、１２、１３又は１７である。例示的な実施態様において、ｋは１７である。

【0167】

共有結合して６原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、ＯｒｎとＡｓｐ、Ｇｌｕと式Ｉ（式中、ｎは２である）のアミノ酸、及び、ホモグルタミン酸と式Ｉ（式中、ｎは１である）のアミノ酸、が挙げられ、ここで式Ｉは、下記の通りである：

【化8】

【0168】

共有結合して７原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム環）、Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、又は、ホモＳｅｒ−ホモＧｌｕ（ラクトン）、が挙げられる。８原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、ホモＬｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、Ｏｒｎ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ａｓｐ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）、が挙げられる。９原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、ホモＬｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ｇｌｕ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）、が挙げられる。これらのアミノ酸の側鎖のいずれも、アルファ−へリックスの三次元構造が妨げられない限り、別の化学基でさらに置換することができる。当業者であれば、同様の大きさ及び所望の効果の構造の安定化を作り出すと考えられる、代替的な対形成、又は化学的に修飾された誘導体を含む代替的なアミノ酸類縁体を着想することができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は、長さが６個の原子であり、更に修飾して所望の効果をもたらすことができる。共有結合がなくても、上記に記載されたアミノ酸対形成又は当業者が着想できる同様の対形成も、非共有結合を介して、例えば塩架橋又は水素結合相互作用の形成を介して、アルファ−へリックスに追加的な安定性をもたらすことができる。

【0169】

ラクタム環の大きさは、アミノ酸の側鎖の長さに応じて変わることができ、一つの実施態様において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖とグルタミン酸の側鎖に結合することによって形成される。更なる例示的な実施態様（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）は以下の対形成を含み、更に、ラクタム架橋を伴ってもよい：１２位のＧｌｕと１６位のＬｙｓ；１２位の天然Ｌｙｓと１６位のＧｌｕ；１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓ；１６位のＬｙｓと２０位のＧｌｕ；２０位のＧｌｕと２４位のＬｙｓ；２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕ；２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓ；２４位のＬｙｓと２８位のＧｌｕ。あるいは、ラクタム環におけるアミド結合の順番を逆転することができる（例えば、ラクタム環を、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６の側鎖、あるいはＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖同士の間に形成することができる）。

【0170】

ラクタム架橋以外の分子内架橋を使用して、グルカゴン類縁体ペプチドのアルファ−へリックスを安定化することができる。一つの実施態様において、分子内架橋は疎水性架橋である。この場合、分子内架橋は、更に、グルカゴン類縁体ペプチドのアルファ−へリックスの疎水性面の一部分である２個のアミノ酸の側鎖同士の間にあってもよい。例えば、疎水性架橋により結合しているアミノ酸のうちの１個は、１０、１４及び１８位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸であることができる。

【0171】

一つの特定に態様において、オレフィンメタセシスを、全炭化水素架橋系を使用してグルカゴンペプチドのアルファ−へリックスの１又は２ターンを架橋するために使用する。この場合、グルカゴンペプチドは、多様な長さのオレフィン性側鎖を有し、Ｒ又はＳ立体化学のいずれかに配置されている、ｉ位と、ｉ＋４位又はｉ＋７位の２カ所のα−メチル化アミノ酸を含むことができる。例えば、オレフィン性側鎖は（ＣＨ_２）ｎを含むことができ、ここでｎは、１〜６の任意の整数である。一つの実施態様において、架橋長さが８原子では、ｎは３である。そのような分子内架橋を形成する適切な方法は、当該技術分野において記載されている。例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) and Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004)を参照すること。あるいは、グルカゴンペプチドは、ヘリックスの隣接するターンに配置されている２つのＯ−アリルＳｅｒ残基を含むことができ、これらはルテニウム触媒閉環メタセシスを介して一緒に架橋されている。そのような架橋の手順は、例えばBlackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281- 3284 (1998)に記載されている。

【0172】

別の特定の態様において、システインのペプチド模倣体として広く採用されている、非天然チオジアラニンアミノ酸であるランチオニンを、アルファ−へリックスの１ターンを架橋するために使用する。ランチオニンに基づく環化の適切な方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., Ｊ. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996);及びOsapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993)を参照すること。

【0173】

幾つかの実施態様において、ｉ位とｉ＋７位の２つのＧｌｕ残基の間のα，ω−ジアミノアルカン鎖、例えば１，４−ジアミノプロパンと１，５−ジアミノペンタンを使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。そのような鎖は、ジアミノアルカン鎖の長さに応じて、９原子又はそれ以上の長さの架橋の形成をもたらす。そのような鎖で架橋されたペプチドを産生する適切な方法は、当該技術分野において記載されている。例えば、Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997)を参照すること。

【0174】

本発明のさらに別の実施態様において、ジスルフィド架橋を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスの１又は２ターンを架橋する。あるいは、１個又は両方の硫黄原子がメチレン基で置換されて等配電子マクロ環化をもたらす、修飾ジスルフィド結合を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。ジスルフィド架橋又は硫黄に基づく環化により修飾する適切な方法は、例えば、Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991)及びRudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)に記載されている。

【0175】

さらに別の実施態様において、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、ｉ位とｉ＋４位の２つのＨｉｓ残基又はＨｉｓとＣｙｓの対による金属原子の結合を介して安定化される。金属原子は、例えば、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）又はＣｄ（ＩＩ）であることができる。そのような金属結合に基づいたアルファ−へリックス安定化の方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., 7. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); and Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063- 9064 (1997)を参照すること。

【0176】

グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、代替的には他のペプチド環化の方法により安定化することができ、その方法は、Davies, J. Peptide. ScL 9: 471-501 (2003)により検討されている。アルファ−へリックスは、アミド化架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、尿素架橋、カルバメート架橋、スルホンアミド架橋などの形成を介して安定化することができる。例えば、チオエステル架橋を、Ｃ末端とＣｙｓ残基の側鎖との間に形成することができる。あるいは、チオエステルを、チオール（Ｃｙｓ）及びカルボン酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）を有するアミノ酸の側鎖同士を介して形成することができる。別の方法において、ジカルボン酸、例えばスベリン酸（オクタン二酸）などのような架橋剤は、遊離アミン、ヒドロキシル、チオール基及びこれらの組み合わせのような、アミノ酸側鎖の２つの官能基の間に結合を導入することができる。

【0177】

一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、ｉ位とｉ＋４位への疎水性アミノ酸の組み込みを介して安定化される。例えば、ｉはＴｙｒであることができ、そしてｉ＋４はＶａｌ又はＬｅｕであることができる；ｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＣｙｓ又はＭｅｔであることができる；ｉはＣｙｓであることができ、そしてｉ＋４はＭｅｔであることができる；或いはｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＩｌｅであることができる。本明細書の目的のために、上記のアミノ酸対形成を逆転することができるので、これによりｉ位の示されたアミノ酸を代替的にｉ＋４位に配置することができ、一方、ｉ＋４位のアミノ酸をｉ位に配置することができることが理解されるべきである。

【0178】

本発明の他の実施態様によると、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９の前後）に１個以上のアルファ−へリックス安定化アミノ酸を（アミノ酸置換又は挿入のいずれかにより）組み込むことを介して、アルファ−へリックスが安定化される。特定の実施態様において、アルファ−へリックス安定化アミノ酸は、α，α−二置換アミノ酸であり、例えば、メチル、エチル、プロピル及びｎ−ブチルから選択される同一若しくは異なる基により二置換されているアミノ酸、又はシクロオクタン若しくはシクロヘプタン（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）により二置換されているアミノ酸である、任意のアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）が含まれるが、これに限定されない。幾つかの実施態様において、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３、４つ又はそれ以上の位置は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。特定の実施態様において、１６、２０、２１又は２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３つ又は全ての位置は、ＡＩＢで置換されている。

【0179】

＜親水性部分の結合＞
別の実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドの可溶性は、ペプチドへの親水性部分の共有結合により増強される。親水性部分を、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に使用される任意の適切な条件下でグルカゴンペプチドに結合することができる。アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化又はＰＥＧ部分に対する反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）と標的化合物に対する反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）との他の化学選択的結合／連結方法を含む、当該技術分野において既知のあらゆる方法を使用することができる。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、及び５−ピリジルが含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化によりペプチドに結合する場合、選択されるポリマーは、重合の程度が制御されるように単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)及びZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照すること。

【0180】

適切な親水性部分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングルコールプロピオンアルデヒド、エチレングルコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（ベータ−アミノ酸）（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸又は他の多糖ポリマー、フィコール又はデキストラン、並びにこれらの混合物が含まれる。

【0181】

親水性部分、例えばポリエチレングリコール鎖は、幾つかの実施態様によると、約５００〜約４，００００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。一つの実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約５００〜約５，０００ダルトン又は約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。さらに別の例示的な実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。

【0182】

一つの実施態様において、デキストランが親水性部分として使用される。デキストランは、主にα１−６結合により結合しているグルコースサブユニットの多糖ポリマーである。デキストランは、多くの分子量範囲、例えば約１kDから約１００kDまでの範囲、又は、約５、１０、１５若しくは２０kDから約２０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０kDまでの範囲で入手することができる。

【0183】

直鎖又は分岐鎖ポリマーが考慮される。得られる結合体の調製物は、実質的に単分散又は多分散であることができ、ペプチド１つあたり約０．５、０．７、１、１．２、１．５又は２つのポリマー部分を有することができる。

【0184】

一つの実施態様において、親水性部分は、、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり、更に、１、１６、１７、２０、２１、２４、２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１つ以上、Ｃ末端延長内の位置、例えば３０位、又はＮ若しくはＣ末端のアミノ酸において、ペプチドに結合していてもよい。幾つかの実施態様において、その位置の天然アミノ酸は、ペプチドへの親水性部分の結合を促進するために、親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換されている。例示的な実施態様において、その位置の天然アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチル−フェニルアラニン残基で置換されている。他の実施態様において、親水性基を含むように修飾されているアミノ酸が、ペプチドのＮ又はＣ末端に付加される。

【0185】

＜結合体及び融合＞
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが結合体部分に結合している、他の結合体も包含し、結合は共有結合を介してでもリンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理力、又は、疎水性若しくは親水性相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することもできる。

【0186】

ペプチドを、ペプチドの標的アミノ酸残基と、これらの標的アミノ酸の選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤との反応により、直接共有結合を介して結合体部分に結合することができる。ペプチド又はその結合体の反応基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸又は当該技術に既知の他の作用物質が含まれる。あるいは、結合体部分を、多糖又はポリペプチド担体のような中間体担体を介してペプチドに間接的に結合することができる。多糖担体の例にはアミノデキストランが挙げられる。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー及びこれらのアミノ酸の混合ポリマー、並びに得られる装填担体に望ましい可溶性の特性を付与する他のもの、例えばセリンが挙げられる。

【0187】

システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニルン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても誘導体化される。

【0188】

ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５．５〜７．０で反応させることによって誘導体化されるが、それはこの作用物質がヒスチジル側鎖に比較的特異性があるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは０．１Mカコジル酸ナトリウムによりｐＨ６．０で実施される。

【0189】

リシニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用物質による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬には、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル及びグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応が含まれる。

【0190】

アルギニル残基は、１つ又は幾つかの従来の試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンによる反応で修飾される。アルギニン残基の誘導体化のためには、グアニジン官能基のpK_aが高いので、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。更に、これらの試薬は、リシンの基、またアルギニン−イプシロン−アミノ基と反応することができる。

【0191】

チロシル残基の特定の修飾は、スペクトル標識をチロシル残基に導入するのに特に興味深く、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンによる反応によって行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体がそれぞれ形成される。

【0192】

カルボニル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、Ｒ及びＲ′が異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。更に、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。

【0193】

他の修飾として、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、アスパラギン又はグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／又はＣ末端カルボン酸基のアミド化若しくはエステル化が挙げられる。

【0194】

別の種類の共有的修飾としては、ペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合が挙げられる。糖を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン若しくはヒドロキシプロリンのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）チロシン若しくはトリプトファンのような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。

【0195】

本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのいずれかに結合することができる例示的な結合体部分には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン若しくはその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本明細書に開示されるグルカゴンペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン及びグロブリンからなる群より選択される。

【0196】

幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、原子鎖は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の原子鎖は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される。原子鎖及びリンカーは、より可溶性のある結合体をもたらすと予想される可溶性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素や他の触媒による分解、又は標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体はその全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、代替的には当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することもできる。

【0197】

上記に記述したように、幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、免疫グロブリン又はその一部分（例えば、可変部領域、ＣＤＲ又はＦｃ領域）に結合、例えば融合している。既知の種類の免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域はＩｇ重鎖のＣ末端領域であり、これは、再循環（延長された半減期をもたらす）、抗体依存性細胞仲介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）のような活性を実施するＦｃ受容体への結合に関与している。

【0198】

例えば、幾つかの定義によると、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からＣ末端まで伸びている。「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びている（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関わるシステインを整列することによりＩｇＧ１配列と整列させることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域には２つの定常部ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸びている。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、アミノ酸３４２から酸４４７まで伸びている。免疫グロブリン又は免疫グロブリンのフラグメント若しくは領域のアミノ酸番号付けに関する参照は、全て、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.に基づいている。関連する実施態様において、Ｆｃ領域は、１つ以上の、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖の、天然の又は修飾された定常部領域、例えばＩｇＧ及びＩｇＡのＣＨ２及びＣＨ３領域、又はＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４領域を含むことができる。

【0199】

適切な結合体部分は、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部を含む。サルベージ受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンを再循環して、血液循環に戻すことに関与する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づいて記載されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃＲｎへのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの接合部に近接している。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触点は、全て単一Ｉｇ重鎖の範囲内である。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１及び３１４、並びにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８及び４３３〜４３６が含まれる。

【0200】

幾つかの結合体部分は、ＦｃγＲ結合部位（１つ又は複数の）を含んでもよいし含まなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに関与する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（低ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ′／Ｅループ）及びアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥの低ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関わっている（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関わる残基は、Lewisらにより記載されている（J Immunol. 175:6694-701, 2005）。ＩｇＥ受容体結合に関わるアミノ酸残基は、Sayers らにより記載されている（J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004）。

【0201】

アミノ酸修飾を免疫グロブリンのＦｃ領域に行うことができる。そのようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）に少なくとも１つのアミノ酸修飾、及び／又はＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１〜３４１）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ＦｃＲｎに親和性の増加を付与すると考えられる突然変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａが含まれる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の突然変異は、ＦｃＲｎの親和性を有意に低減することなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ領域の結合を低減することができる。例えば、Ａｌａ又は他のアミノ酸によるＦｃ領域の２９７位のＡｓｎの置換は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去し、Ｆｃ領域の延長された半減期を伴って免疫原性の低減、また、ＦｃγＲへの結合の低減をもたらすことができる（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲへの結合を低減する、ＩｇＧ１の２３３〜２３６位でのアミノ酸の修飾が行われた（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。幾つかの例示的なアミノ酸置換は、米国特許第７，３５５，００８号及び同第７，３８１，４０８号に記載されており、それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる。

【0202】

本開示は、第２のペプチド又はポリペプチドがグルカゴンペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合している、グルカゴン融合ペプチド又はタンパク質も包含する。幾つかの実施態様において、グルカゴンアペプチドのカルボキシ末端に付加される第２ペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）に結合しているＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、ＫＲＮＲＮＮＩＡ、又はＫＲＮＲである。他の実施態様において、第２ペプチドはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、ここでＸは、２０個の通常のアミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸又はグリシンのうちの１つから選択される。一つの実施態様において、Ｘは、アミノ酸の側鎖に共有結合している親水性部分を更に含むアミノ酸、例えばＣｙｓを表す。そのようなＣ末端延長は、可溶性を改善し、グルカゴン又はＧＬＰ−１活性も改善することができる。グルカゴンペプチドがカルボキシ末端延長を更に含む幾つかの実施態様において、延長のカルボキシ末端アミノ酸は、カルボン酸ではなくアミド基又はエステル基で終わる。

【0203】

幾つかの実施態様において、例えばＣ末端延長を含むグルカゴンペプチドにおいて、２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のトレオニンはグリシンで置換されている。例えば、２９位のトレオニンにグリシン置換を有し、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳのＣ末端延長を含むグルカゴンペプチドは、同じＣ末端延長を含むように修飾された天然グルカゴンよりも、ＧＬＰ−１受容体に対して、４倍も効力がある。このＴ２９Ｇ置換を、本明細書に開示されている他の修飾と一緒に使用して、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンペプチドの親和性を増強することができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換を、Ｓ１６Ｅ及びＮ２０Ｋアミノ酸置換（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）と組み合わせることができ、更にアミノ酸１６と２０の間にラクタム架橋を伴ってもよいし、更に本明細書に記載されているＰＥＧ鎖を付加してもよい。

【0204】

幾つかの実施態様において、アミノ酸がＣ末端に付加されており、付加されるアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸及びグリシンからなる群より選択される。

【0205】

本開示は、本明細書に開示されている修飾グルカゴンペプチドの多量体も包含する。２つ以上の修飾グルカゴンペプチドを、標準的な結合剤及び当業者に既知の手順を使用して一緒に結合することができる。例えば、二量体は、２つの修飾グルカゴンペプチド、特にシステイン、リシン、オルチニン、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニン残基により置換されているグルカゴンペプチドから、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤の使用を介して形成することができる。

【0206】

＜アシル化及びアルキル化＞
幾つかの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは修飾されて、アシル基又はアルキル基を含む。アシル化又はアルキル化は、循環しているグルカゴンペプチドの半減期を増加させることができる。アシル化又はアルキル化は、有利には、グルカゴン及び／若しくはＧＬＰ−１受容体に対して作用の開始を遅延する及び／若しくは作用の持続時間を延長する、並びに／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する、並びに／又は可溶性を改善することができる。幾つかの実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドの効力は、非アシル化型のグルカゴンペプチドに匹敵する。グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアシル化又はアルキル化することができる。

【0207】

幾つかの実施態様において、本発明は、グルカゴンペプチドの１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸に共有結合しているアシル基又はアルキル基を含むように修飾されているグルカゴンペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸とアシル基又はアルキル基との間にスペーサーを更に含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、脂肪酸若しくは胆汁酸、又はこれらの塩であり、例えばＣ４０〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキル、又は胆汁酸のステロイド部分を含むアルキルである。スペーサーは、アシル又はアルキル基を結合するのに適した反応性基を有する任意の部分である。例示的な実施態様において、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド若しくはトリペプチド、又は親水性二官能スペーサーを含む。幾つかの実施態様において、スペーサーは、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ及びＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ（ＣＨ_２）ｍＣＯＯＨを含むスペーサーからなる群より選択され、ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である。そのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を更に含んでもよく、これはポリエチレングリコールであってもよい。前述のグルカゴンペプチドのいずれも、２つのアシル基若しくは２つのアルキル基又はそれらの組み合わせを含むことができる。

【0208】

アシル化は、グルカゴンアンタゴニスト活性（及び場合によりＧＬＰ−１活性も）が保持される限り、１〜２９位のいずれかの位置、Ｃ末端延長内の位置、又はＣ末端のアミノ酸を含む、グルカゴンペプチド内の任意の位置で実施することができる。非限定例には、５、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）が挙げられる。アシル基を、グルカゴンペプチドのアミノ基に直接的に又はグルカゴンペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することができ、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ基とアシル基との間に位置している。グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合しているのと同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアシル化することができる。非限定例には、グルカゴンペプチドの１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）でのアシル化、及びＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば２４、２８若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）Ｃ末端延長内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。

【0209】

本発明の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールの直接的なアシル化により修飾されて、アシル基を含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して直接アシル化される。幾つかの実施態様において、アシル化は、１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）においてである。この場合、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、又は本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号２の修飾アミノ酸配列であって、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸となっているアミノ酸配列を含むことができる。本発明の幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドの直接アシル化は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して生じる。

【0210】

幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉ：

【化9】

で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）であるか又はｎが３（Ｏｒｎ）であるアミノ酸である。

【0211】

他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩ：

【化10】

で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）であるアミノ酸である。

【0212】

さらに別の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩ：

【化11】

で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）であるアミノ酸である。

【0213】

本発明の一つの実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドはスペーサーと共有結合し、スペーサーはアシル基と共有結合している。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアシル化により修飾されてアシル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドの１０、２０、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖又はＣ末端アミノ酸に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸であることができる。例えば、側鎖ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この場合、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列か、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよく、ここで、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて、側鎖アミン、ヒドロキシル又はカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となっている。

【0214】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。

【0215】

アシル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アシル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアシル化される場合、スペーサーアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであることができる。あるいは、スペーサーアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーアミノ酸の側鎖アミンがアシル化される場合、スペーサーアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアシル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアシル化される。本発明の実施態様はそのようなジアシル化分子を含む。

【0216】

アシル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。

【0217】

アシル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。

【0218】

一つの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この場合、スペーサーは、例えばＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨを含むことができ（ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である）、その例として、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸が挙げられる。

【0219】

アミン、ヒドロキシル及びチオールを介したペプチドアシル化に適した方法は、当該技術分野において知られている。例えば、実施例１９（アミンを介したアシル化の方法）、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, lnt J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982);及びPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介したアシル化の方法）;並びにSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介したアシル化の方法）; Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照すること。

【0220】

アシル化グルカゴンペプチドのアシル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖又は分岐鎖であることができる。本発明の幾つかの特定の実施態様において、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸又はＣ３０脂肪酸のいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ１４脂肪酸又はＣ１６脂肪酸である。

【0221】

別の実施態様において、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な胆汁酸であることができる。

【0222】

特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、アルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサー、すなわちアルキル化３−メルカプトプロピオン酸スペーサーを介してグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのＬｙｓ残基に結合しているコレステロール酸を含む。アルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサーは、例えば、ドデカエチレングルコール部分を含むデス−アミノＣｙｓスペーサーであることができる。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、下記構造を含む：

【化12】

【0223】

本明細書に記載されているアシル化グルカゴンペプチドは、更に修飾されて、親水性部分を含むことができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この場合、アシル化グルカゴンペプチドは、本明細書に記載されている修飾のいずれを含んでもよい配列番号２を含むことができ、ここで、（ａ）１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の少なくとも１個のアミノ酸はアシル基を含み、（ｂ）１６、１７、２１、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）、Ｃ末端延長内の位置、又はＣ末端のうちの少なくとも１つのアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アシル基は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）に結合しており（結合はＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してでもよい）、親水性部分は、２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のＣｙｓ残基に組み込まれている。

【0224】

あるいは、アシル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アシル化も修飾もされて、親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。

【0225】

一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、循環の半減期を延長する、並びに／又は作用の開始を遅延する及び／若しくは持続時間を延長する、並びに／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する目的で、エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してグルカゴンペプチドに結合しているアルキル基を含むように修飾される。

【0226】

アルキル化は、グルカゴンアンタゴニスト活性（及び場合によりＧＬＰ−１活性も）が保持される限り、１〜２９位のいずれかの位置、Ｃ末端延長内の位置、又はＣ末端のアミノ酸を含む、グルカゴンペプチド内の任意の位置で実施することができる。非限定例には、５、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）が挙げられる。アルキル基を、グルカゴンペプチドのアミノ基に直接的に、又はグルカゴンペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することができ、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ基とアルキル基との間に位置している。グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアルキル化することができる。非限定例には、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）でのアルキル化、及びグルカゴンペプチドのＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば２４、２８若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）、Ｃ末端延長内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。

【0227】

本発明の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールの直接的なアルキル化により修飾されて、アルキル基を含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して直接的にアルキル化される。幾つかの実施態様において、アルキル化は、１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）においてである。この場合、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、又は本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号２の修飾アミノ酸配列を含むことができ、ここで、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸となっている。本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドの直接アルキル化は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して生じる。

【0228】

幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）であるか又はｎが３（Ｏｒｎ）であるアミノ酸である。

【0229】

他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）であるアミノ酸である。

【0230】

さらに別の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）であるアミノ酸である。

【0231】

本発明の一つの実施態様において、アルキル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドはスペーサーと共有結合し、スペーサーはアルキル基と共有結合している。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアルキル化により修飾されて、アルキル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドの１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸であることができる。例えば、側鎖ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この場合、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列か、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよく、ここで、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となっている。

【0232】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか、又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。

【0233】

アルキル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アルキル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアルキル化される場合、スペーサーアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであることができる。あるいは、スペーサーアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される場合、スペーサーアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアルキル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアルキル化される。本発明の実施態様はそのようなジアルキル化分子を含む。

【0234】

アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。

【0235】

アルキル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。

【0236】

一つの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この場合、スペーサーは、例えばＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨを含むことができ（ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である）、その例として、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸が挙げられる。

【0237】

アミン、ヒドロキシル及びチオールを介したペプチドアルキル化に適した方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴンペプチドとアルキル基との間にエーテル結合を形成することができる。また、ハロゲン化アルキルによるペプチドの求核置換反応は、エーテル、チオエーテル又はアミノ結合のいずれかをもたらすことができる。

【0238】

アルキル化グルカゴンペプチドのアルキル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖又は分岐鎖であることができる。本発明の幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル又はＣ３０アルキルのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、例えばＣ１４アルキル又はＣ１６アルキルである。

【0239】

幾つかの実施態様において、アルキル基は、胆汁酸のステロイド部分、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸を含む。

【0240】

本明細書に記載されているアルキル化グルカゴンペプチドは更に修飾されて、親水性部分を含むことができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この場合、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号２又は本明細書に記載されているアミノ酸修飾の１つ以上を含む配列番号２のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、（ａ）１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の少なくとも１個のアミノ酸はアルキル基を含み、（ｂ）１６、１７、２１、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）、Ｃ末端延長内の位置、又はＣ末端のうちの少なくとも１個のアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アルキル基は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）に結合しており（結合はＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してでもよい）、親水性部分は、２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のＣｙｓ残基に組み込まれている。

【0241】

あるいは、アルキル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アルキル化され、かつ修飾もされて親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。

【0242】

〔実施例〕
本発明の化合物を、標準的な合成方法、組み換えＤＮＡ技術又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他の任意の方法により調製することができる。特定の非天然アミノ酸は標準的な組み換えＤＮＡ技術により発現することができないが、それらを調製する技術は当該技術分野において知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適用可能であれば、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応により合成することができる。

【0243】

一般的合成プロトコール：
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430 Aペプチド合成機により、０．２mmolのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から出発し、ＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ Ｂｏｃ」単一カップリングを使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸及びＨＢＴＵは、Midwest Biotech（Fishers, IN）から得た。使用した側鎖保護基は、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）及びＴｒｐ（ＣＨＯ）であった。Ｎ末端Ｈｉｓの側鎖保護基はＢｏｃであった。

【0244】

合成の完了したそれぞれのペプチジル樹脂を、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンの溶液で処理して、トリプトファンからホルミル基を除去した。液体フッ化水素切断を、ｐ−クレゾール及びジメチルスルフィドの存在下で実施した。切断は、ＨＦ装置（Penninsula Labs）を使用して氷浴で１時間実施した。ＨＦを蒸発させた後、残渣をジエチルエーテルに懸濁し、固体物質を濾過した。ペプチドをそれぞれ３０〜７０mlの酢酸水溶液に抽出し、希釈アリコートをＨＰＬＣ〔Beckman System Gold、０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル、１０分間かけて１０％から８０％Ｂの勾配〕により分析した。

【0245】

精製を２．２×２５cmのKromasil C18カラムのＦＰＬＣにより実施し、その間、２１４nmのＵＶでモニタリングし、５分毎の画分を収集した。均質画分をまとめ、凍結乾燥して、生成物純度＞９５％を得た。正確な分子量及び純度は、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を使用して確認した。

【0246】

一般的ペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、グルカゴンＣｙｓ類縁体をリン酸緩衝食塩水（５〜１０mg/ml）に溶解し、０．０１Mエチレンジアミン四酢酸を加える（総容量の１０〜１５％）。過剰（２倍）量のマレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Nektar）を加え、反応物を室温で撹拌し、その間、ＨＰＬＣで反応進行をモニタリングする。８〜２４時間後、反応混合物を酸性化し、精製のために０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化誘導体を得た。

【0247】

〔実施例１〕
グルカゴンＣｙｓ^１７（１−２９）及び同様のモノＣｙｓ類縁体の合成
６０mlの反応容器中の０．２mmolのBoc Thr(OBzl) Pam樹脂（SynChem Inc）及び以下の配列を、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用する改良Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizerに入れ、稼働した。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＣＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号４０）
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mlの液体フッ化水素を圧入した。反応物を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を少量の切断抽出物試料を用いて実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLC系を使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。

【0248】

最も純粋な生成物（４８−５２）を含有する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、３０．１mgを得た。生成物のＨＰＬＣ分析は、＞９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の質量の３４２９．７を示した。グルカゴンＣｙｓ^２１、グルカゴンＣｙｓ^２４及びグルカゴンＣｙｓ^２９を同様に調製した。

【0249】

〔実施例２〕
グルカゴン−Ｃｅｘ及び他のＣ末端延長類縁体の合成
２８５mg（０．２mmol）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を６０mlの反応容器に入れ、以下の配列を、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用する改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、稼働した。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４１）
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mlの液体フッ化水素を圧入した。反応物を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を切断抽出物のアリコートで実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLC系を溶出に使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。画分５８−６５をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、１９８．１mgを得た。

【0250】

生成物のＨＰＬＣ分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＤＩ質量スペクトル分析は、Ｃ末端アミドとして、所望の理論質量の４３１６．７を有する生成物の存在を示した。オキシントモジュリン及びオキシントモジュリン−ＫＲＮＲを、適切な装填ＰＡＭ樹脂から出発して、Ｃ末端カルボン酸として同様に調製した。

【0251】

〔実施例３〕
グルカゴンＣｙｓ^１７Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
１５．１mgのグルカゴンＣｙｓ^１７（１−２９）及び２７．３mgの平均分子量５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド（ｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００、Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応物を室温で撹拌し、反応の進行をＨＰＬＣ分析〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によりモニターした。５時間後、反応混合物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆送カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia FPLCにより実施し、その間、２１４nmのＵＶ波長でモニタリングし、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、２５．９mgを得た。

【0252】

この生成物をＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕により分析し、およそ９０％の純度を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９５００の（ＰＥＧ誘導体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４２９）へのおよそ５，０００原子質量単位の追加を示す。

【0253】

〔実施例４〕
グルカゴンＣｙｓ^２１Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２１．６mgのグルカゴンＣｙｓ^２１（１−２９）及び２４mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応物を室温で撹拌した。２時間後、更なる１２．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。８時間後、反応混合物を２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を４ml／分のPharmacia FPLCにより実施し、その間、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。勾配＝４５０分間かけて２０％から８０％Ｂ。

【0254】

表れた生成物に対応する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、３４mgを得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕による生成物の分析は、出発グルカゴンペプチドと異なる均質生成物を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９７００の（ＰＥＧ誘導体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４７０）へのおよそ５，０００原子質量単位の追加を示す。

【0255】

〔実施例５〕
グルカゴンＣｙｓ^２４Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．１mgのグルカゴンＣ^２４（１−２９）及び３９．５mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。反応物を室温で７時間撹拌し、次に更なる４０mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。およそ１５時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLCを使用して実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、４５．８mgを得た。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、最大９１７５．２の典型的なＰＥＧの幅広のシグナルを示し、これはグルカゴンＣ^２４（３４５７．８）よりもおよそ５，０００原子質量単位だけ多い。

【0256】

〔実施例６〕
グルカゴンＣｙｓ^２４Ｍａｌ−ＰＥＧ−２０Ｋ
２５．７mgのグルカゴンＣ^２４（１−２９）及び４０．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋ（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに室温で撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。６時間後、出発物質と生成物の比率は、ＨＰＬＣにより決定すると、およそ６０：４０であった。更なる２５．１mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋを加え、反応物を更に１６時間撹拌した。生成物比率が有意に改善されなかったので、反応混合物を、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、４５０分かけて３０％Ｂから１００％Ｂへの勾配を使用するPharmacia FPLCにより精製した。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、流量＝４ml／分、５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。均質な生成物を含有する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、２５．７mgを得た。分析ＨＰＬＣにより決定された純度は約９０％であった。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、２３，０００〜２７，０００の広域のピークを示し、これは出発グルカゴンＣ^２４（３４５７．８）よりもおよそ２０，０００原子質量単位だけ多い。

【0257】

〔実施例７〕
グルカゴンＣｙｓ^２９Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．０mgのグルカゴンＣｙｓ^２９（１−２９）及び２４．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに室温で撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。４時間後、更なる１５．６mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えて、反応の完了を促進した。８時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLC系により実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７５−９７をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、ＨＰＬＣにより回収された出発物質（画分５８−６３）と異なる、４０．０mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕による生成物の分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、８，０００〜１０，０００（最大９０２５．３）の範囲の質量を有するＰＥＧ成分の存在を示し、これは出発物質（３４８４．８）よりも５，５４０原子質量単位だけ多い。

【0258】

〔実施例８〕
グルカゴンＣｙｓ^２４（２−ブチロラクトン）
２４．７mgのグルカゴンＣｙｓ^２４（１−２９）に、４mlの０．０５M重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリル及び５．５ulの２−ブロモ−４−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトンの溶液（アセトニトリル９００ul中１００ul）を加えた。室温で３時間撹拌した後、更なる１０５ulのラクトン溶液を反応溶液に加え、更に１５時間撹拌した。反応混合物を、１０％酢酸水溶液で１０mlに希釈し、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配（４５０分かけて２０％Ｂから８０％Ｂ）をPharmacia FPLCにより実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝４ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７４−７７をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、７．５mgを得た。ＨＰＬＣ分析は、９５％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、３５４０．７の質量又は出発物質よりも８４質量単位だけ多い質量を示した。この結果は、単一ブチロラクトン部分の付加と一致している。

【0259】

〔実施例９〕
グルカゴンＣｙｓ^２４（Ｓ−カルボキシメチル）
１８．１mgのグルカゴンＣｙｓ^２４（１−２９）を、９．４mlの０．１Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．２）に溶解し、０．６mlのブロモ酢酸溶液（アセトニトリル中１．３mg/ml）を加えた。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣにより追跡した。１時間後、更なる０．１mlのブロモ酢酸溶液を加えた。反応物を更に６０分間撹拌し、酢酸水溶液で酸性化し、精製のために２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia FPLC（流量＝４ml／分）により実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分２６−２９をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、数mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の生成物の質量３５１５を確認した。

【0260】

【化13】

【0261】

〔実施例１０〕
グルカゴンＣｙｓ^２４マレイミド，ＰＥＧ−３．４Ｋ−二量体
１６mgのグルカゴンＣｙｓ^２４及び１．０２mgのＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−３４００、平均分子量３４００のポリ（エチレングルコール）−ビス−マレイミド（Nektar Therpeutics）を、３．５ のリン酸緩衝食塩水及び０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡに溶解し、反応物を室温で撹拌した。１６時間後、更なる１６mgのグルカゴンＣｙｓ^２４を加え、撹拌を続けた。およそ４０時間後、反応混合物をPharmcia PepRPC 16/10カラムに装填し、アセトニトリル勾配をPharmacia FPLCにより実施し、その間、２分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝２ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分６９−７４をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、１０．４mgを得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、９５００〜１１，０００の範囲の成分を示し、これは所望の二量体と一致する。

【0262】

【化14】

【0263】

〔実施例１１〕
グルカゴン可溶性アッセイ：
グルカゴン（又は類縁体）の溶液（１mg/ml又は３mg/ml）を０．０１NのＨＣｌで調製する。１００ulの原液を、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度（２７６nm）を決定する。残りの原液のｐＨを、２００〜２５０ulの０．１M Ｎａ_２ＨＯＰ_４（ｐＨ９．２）を使用して、ｐＨ７に調整する。溶液を４℃で一晩放置し、次に遠心分離する。次に１００ulの上澄みを、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度を決定する（２回繰り返す）。

【0264】

初期吸光度の読み取りを容量の増加で補正し、以下の計算を使用して、溶解率を確立する。
最終吸光度／初期吸光度×１００＝溶解率

【0265】

結果を表１に示し、表中、グルカゴン−Ｃｅｘは、野生型グルカゴン（配列番号１）＋配列番号２１のカルボキシ末端付加を表し、グルカゴン−Ｃｅｘ Ｒ^１２は、配列番号４４を表す。

【0266】

【表1】

【0267】

〔実施例１２〕
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体へのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競争結合アッセイにより測定した。シンチレーション近接アッセイ緩衝液（０．０５Mのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５MのＮａＣｌ、０．１％w/vのウシ血清アルブミン）により作製したペプチドの３倍希釈系列を、０．０５nMの（３−〔^１２５Ｉ〕−ヨードチロシル）Ｔｙｒ１０グルカゴン（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）、１ウエルあたり１〜６マイクログラムの、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現している細胞から調製した原形質膜画分及び１mg／ウエルのポリエチレンイミン処理ムギ胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）と共に、９６穴白色／透明底プレート（Corning Inc., Acton, MA）で混合した。ロータリー振とう器により８００rpmで５分間振とうしてから、プレートを室温で１２時間インキュベートし、次にMicroBetal450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で読み取った。試験試料の最高濃度よりも４倍高い濃度の「コールドの」天然リガンドを入れたウエルで非特異的結合（ＮＳＢ）放射能を測定し、競合物質を入れなかったウェルで総結合放射能を検出した。特異的結合の率を以下のように計算した：特異的結合率＝（（結合−ＮＳＢ）／（総結合−ＮＳＢ））×１００。ＩＣ_５０値は、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して決定した。

【0268】

〔実施例１３〕
機能アッセイ−ｃＡＭＰ合成
ｃＡＭＰを誘導するグルカゴン類縁体の能力を、ホタルルシフェラーゼに基づいたレポーターアッセイにより測定した。グルカゴン受容体又はＧＬＰ受容体のいずれかと、ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を、０．２５％ウシ増殖血清（HyClone, Logan, UT）が補充されたＤＭＥＭ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で１６時間培養することにより血清を取り除き、次にグルカゴン、ＧＬＰ−１又は新規グルカゴン類縁体のいずれかの希釈系列と共に、９６穴ポリ−Ｄ−リシン被覆「バイオコート」プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）中で３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、１００マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）を各ウエルに加えた。プレートを短時間振とうし、暗黒で１０分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。有効５０％濃度は、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して計算した。結果を図３、並びに表２及び３に示す。

【0269】

【表2】

^＊−実験の数

【表3】

^＊−実験の数

【0270】

〔実施例１４〕
グルカゴンＣｙｓ−マレイミドＰＥＧ類縁体の安定性アッセイ
各グルカゴン類縁体を水又はＰＢＳに溶解し、初期ＨＰＬＣ分析を実施した。ｐＨを調整した後（４、５、６、７）、試料を３７℃で特定の時間インキュベートし、ＨＰＬＣにより再び分析して、ペプチドの完全性を決定した。特定の目的とするペプチドの濃度を決定し、無傷のまま残っている率を初期分析と比較して計算した。グルカゴンＣｙｓ^２１−マレイミドＰＥＧ_５κについての結果を図１及び２に示す。

【0271】

〔実施例１５〕
グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト
グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは以下の一般的な戦略を使用して合成した。

【0272】

Ｂｏｃ化学戦略による一般的なペプチド合成プロトコール：
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430Aペプチド合成機により、０．２mmolのＭＢＨＡ樹脂から又はＰａｍ樹脂に結合した第１アミノ酸から出発し、ＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ Ｂｏｃ」単一カップリングを使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸及びＨＢＴＵは、Midwest Biotech（Fishers, IN）から得た。使用した一般的な側鎖保護基は以下の通りであった：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）及びＴｒｐ（ＣＨＯ）。Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−ＯＨ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Chem-Impex, Wood dale, IL）をラクタム架橋形成部位に使用した。自動固相合成の後、Ｎ末端３−フェニル乳酸（ＰＬＡ）（Aldrich, Milwaukee, WI）を、手動で、ＢＥＰＢＴ（３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−３Ｈ−ベンゾ〔ｄ〕〔１，２，３〕トリアジン−４−オン）（Synchem Inc., Aurora, OH）によりカップリングした。

【0273】

ペプチド固相合成の後、合成の完了したそれぞれのペプチジル樹脂を２０％ピペラジン／ＤＭＦで処理して、Ｆｍｏｃ基を除去した。ラクタム架橋形成には、通常、２９９mg（１mmol、５倍）のＢＥＰＢＴを１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中で加え、ニンヒドリン試験が陰性を示すまで２〜４時間反応させた。

【0274】

ペプチドを、ｐ−クレゾール及びジメチルスルフィドの存在下で実施した液体フッ化水素切断により切断した。切断は、ＨＦ装置（Penninsula Labs）を使用して氷浴で１時間実施した。ＨＦを蒸発させた後、残渣をジエチルエーテルに懸濁し、固体物質を濾過し、エーテルで洗浄した。ペプチドをそれぞれ３０〜７０mlの酢酸水溶液に抽出し、水で希釈し、凍結乾燥した。粗ペプチドを分析ＨＰＬＣで分析し、ペプチド分子量をＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により調べた。次にペプチドを一般的なＨＰＬＣ精製手順により精製した。

【0275】

Ｆｍｏｃ化学戦略による一般的なペプチド合成プロトコール：
ペプチドは、カップリング試薬としてＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用し、Rink ＭＢＨＡアミド樹脂を用いて又はWang樹脂（Novabiochem, San Diego, CA）に結合した第１アミノ酸を用いて、標準的Ｆｍｏｃ化学を使用するABI 433A自動ペプチド合成機により合成した。自動ペプチド合成の後、３−フェニル乳酸（ＰＬＡ）を、手動で、ＢＥＰＢＴにカップリングした。Ｎα−Ｆｍｏｃ〔Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル〕アミノ酸の側鎖保護基は以下であった：Ａｒｇ、Ｐｍｃ；Ａｓｐ、ＯｔＢｕ；Ｃｙｓ、Ｔｒｔ；Ｇｌｎ、Ｔｒｔ；Ｈｉｓ、Ｔｒｔ；Ｌｙｓ、Ｂｏｃ；Ｓｅｒ、ｔＢｕ、Ｔｙｒ、ｔＢｕ；及びＴｒｐ、Ｂｏｃ（Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル、ＯｔＢｕ＝tert−ブチルエステル、Ｔｒｔ＝トリチル、Ｂｏｃ＝tert−ブチルオキシカルボニル及びｔＢｕ＝tert−ブチルエステル）。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨ（Novabiochem, San Diego, CA）をラクタム架橋形成部位に組み込んだ。

【0276】

固相合成の後、Ｇｌｕにおける２−フェニルイソプロピル（２−ＰｈｉＰｒ）基及びＬｙｓにおける４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）基を、ペピチジル樹脂を介して１％ＴＦＡ／ＤＣＭをフラッシュすることによって除去した。ラクタム架橋形成には、通常、１５０mg（０．５mmol、５倍）のＢＥＰＢＴを１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中で加え、ニンヒドリン試験が陰性を示すまで２〜４時間反応させた。

【0277】

８５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％水及び５％チオアニソール（ペプチドがシステインを含有する場合は２．５％ＥＤＴが添加された）を含有する切断カクテルを用いて、ペプチドを樹脂から切断した。粗ペプチドをエーテルに沈殿させ、遠心分離し、凍結乾燥した。次にペプチドを分析ＨＰＬＣにより分析し、ＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析法により調べた。ペプチドを一般的なＨＰＬＣ精製手順により精製した。

【0278】

一般的な分析ＨＰＬＣ手順：
分析ＨＰＬＣは、流量１．０mL／分の勾配溶離及び２１４nmでのモニタリングを用いて、ZORBAX SB-C8カラム（０．４６×５cm、５μm、Agilent）を有するBeckman System GoldＨＰＬＣ系により実施した。勾配は、１０分間の１０％Ｂから８０％Ｂ、次に５分間の１０％Ｂに設定した。緩衝液Ａ＝０．１％ＴＦＡ及びＢ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル。

【0279】

一般的な分取ＨＰＬＣ精製手順：
特に示されていない場合、ペプチドは、通常、準分取ＨＰＬＣカラム（ZORBAX SB-C8、２１．２×２５０mm、７μm、Agilent）を有する４８６モニター系に接続したWaters 600Eにより、２１４nm又は２３０nMでモニタリングしながら精製した。緩衝液Ａ＝０．１ＴＦＡ／１０％アセトニトリル及びＢ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル。精製に使用した勾配は、特に示されていない場合、１２ml／分の流量による４０分間の０〜３０％Ｂ、次に３０分間の３０〜５０％Ｂであった。画分を分析ＨＰＬＣで分析し、質量分析法により調べた。９０％を超える純度の画分を収集し、凍結乾燥し、保存した。６０〜９０％の純度の画分をまとめ、凍結乾燥し、再び精製した。

【0280】

一般的ペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、グルカゴンＣｙｓ類縁体をリン酸緩衝食塩水（５〜１０mg/ml）に溶解し、０．０１Mエチレンジアミン四酢酸を加える（総容量の１０〜１５％）。過剰（１．２〜２倍）量のマレイミドメトキシ−ポリエチレングリコール（ＭＡＬ−ｍ−ｄＰＥＧ）試薬を加え、反応物を室温で撹拌し、その間、ＨＰＬＣで反応進行をモニタリングする。２〜１２時間後、反応混合物を酸性化し、精製のため、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化誘導体を得た。

【0281】

ＰＢＳ中の溶解度が低いペプチドについては、それらのペプチドを２５％アセトニトリル水、又は５０〜１００mMトリスを有する４〜６M尿素緩衝液（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解し、ＰＥＧ試薬と反応させた。

【0282】

上記に記載された方法により合成された化合物の特定の実施例を以下に提示する。

【0283】

〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
ペプチド配列ＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＤＴ（配列番号４９）を、最初に、カップリング試薬としてＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用し、０．１mmolのRink ＭＢＨＡアミドを用いる０．１mmolのＦｍｏｃ／ＨＯＢＴ／ＤＣＣ化学プログラムを使用した、ABI 433A自動ペプチド合成機により固相合成した。以下のＦｍｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）、Ｍｅｔ、ＰＬＡ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＶａｌ。自動合成の後、ペプチジル樹脂を、４mlの５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中の３フェニル乳酸（８３mg、０．５mmol）及びＤＥＰＢＴ（１５０mg、０．５mmol）と、約２時間手動でカップリングさせて、以下の配列を有するペプチジル樹脂を得た：ＨＯ−ＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ_２（配列番号６）。

【0284】

ペプチジル樹脂を５０mlの１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより５〜１０分間フラッシュし、ＤＣＭ、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ及びＤＭＦで洗浄した。次にペプチジル樹脂を、１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中のＤＥＰＢＴ １５０mg（０．５mmol、５倍）により、ニンヒドリン試験が陰性を示すまで、２〜４時間処理した。

【0285】

ペプチジル樹脂を、０．５ｇのフェノール、０．５mlの水及び０．５mlのチオアニソールを添加した８．５mlのＴＦＡにより、室温で２時間処理した。ＴＦＡに溶解したペプチドを濾過し、４０mlのエーテルを加えて、ペプチドを沈殿させた。粗ペプチドを遠心分離し、酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥して、１５０〜２５０mgの粗ペプチドを得た。精製した後、２０〜３０mg（総収率１０〜１５％）のペプチドを純度９５％で得た。ペプチドを、一般的な分析ＨＰＬＣで分析したところ、７．６３分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析は、ペプチド分子量２９９７．３に相当する所望質量の２９９７．０を示した。

【0286】

同様の手順を使用して、以下のペプチドを合成した：分析ＨＰＬＣで７．１７分及びＥＳＩ−ＭＳで計算分子量の３８４５．２に相当する３４４４．５を示す〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム）〕グルカゴン（６−３９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．７１分及びＥＳＩ−ＭＳの計算分子量の２９９７．３に相当する２９９７．０を示す〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（ラクタム），Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．２７分及びＥＳＩ−ＭＳの計算分子量の３８４５．２に相当する３８４５．５を示す〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｋ１２Ｅ１６（ラクタム）〕グルカゴン（６−３９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．８５分及びＥＳＩ−ＭＳの計算分子量の２９７２．３に相当する２９７２．０を示す〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム，Ｃ２４，Ｄ２８）〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．８３分及びＥＳＩ−ＭＳの計算分子量２９７２．３に相当する２９７１．５を示す〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．１３分及び計算分子量の３９３５．３に相当するＭＡＬＤＩ−ＭＳの３９３５．７を示す〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８，Ｃ４０〕グルカゴン（６−４０）アミド。

【0287】

〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４（２０Ｋ），Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
１５mg（０．００５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミド及び１２０mg（０．００６mmol）の２０Ｋ ｍ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量約２０Ｋ、Chirotech Technology Ltd., Cambs CB4 OWG, Germany）を、９mlの２５％アセトニトリル水及び約０．５〜１mlの１Mトリス塩基緩衝液（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣによりモニターした。ＨＰＬＣにより初期生成物が何も検出されなかった後（２〜６時間）、反応混合物を分取ＨＰＬＣにより直接精製した。画分を、２１４nmの分析ＨＰＬＣにより調べ、また、２８０nmのＵＶで測定した。９０％のＨＰＬＣ純度を有し、ＵＶ測定による高吸光度（Ａ２８０nm＝１．０〜２．０）も有する画分をまとめ、凍結乾燥した。分析ＨＰＬＣの分析が８．５〜８．６分の保持時間を示し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳが２２Ｋ〜２４Ｋの広域質量分析を示す、約６０〜８０mgの〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４（２０Ｋ），Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミドを得た。

【0288】

同様の手順を使用して、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（ラクタム），Ｃ２４（２０Ｋ），Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミド及び〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８，Ｃ４０（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−４０）アミドを合成した。

【0289】

二量体〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
２０mg（０．００６７３mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミドを６mlのＰＢＳ緩衝液、０．５〜１mlの１Mトリス塩基（ｐＨ８．０〜８．５に調整）及び３mlのＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を開放容器中で撹拌し、分析ＨＰＬＣにより２時間毎にモニターした。初期生成物（ＨＰＬＣ ＲＴにより７．８５分）が無くなった後、そして二量体生成物（ＨＰＬＣ ＲＴにより７．９６分）が生成物において優勢になった後（約２４時間）、混合物を０．１％ＴＦＡ １０％アセトニトリル水で希釈し、分取ＨＰＬＣにより直接精製した。凍結乾燥した後、ＥＳＩ−ＭＳにおいて計算分子量の５９４２．６に相当する５９４２．０を示す、約６〜１０mgの〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミドを得た。

【0290】

〔実施例１６〕
グルカゴン類縁体のアンタゴニスト活性
グルカゴン及び多様なグルカゴン誘導体インヒビターの受容体結合、ｃＡＭＰ誘導及びｃＡＭＰ阻害を比較した。受容体結合、ｃＡＭＰ誘導及びｃＡＭＰ阻害を測定するアッセイは、実質的に実施例１２及び１３にそれぞれ開示されているアッセイ系を使用して実施した。

【0291】

グルカゴンアンタゴニスト活性を示す特定のグルカゴン類縁体を調製した。そのような化合物は、天然のＮ末端残基を有さず、天然グルカゴンでの９位にグルタミン酸置換を有する点において、天然グルカゴンと異なっている。表４、並びに図３Ａ及び３Ｂは、幾つかの特定のグルカゴン類縁体アンタゴニストのグルカゴン受容体親和性及びアンタゴニスト活性を提示する。

【0292】

【表4】

Ｇｌｕ^９は、天然グルカゴンの番号付けによる９位のグルタミン酸である。

【0293】

表５のデータが示すように、一連のｈＣｙｓ９に基づいたアンタゴニストは、以前に報告されたＧｌｕ９に基づいたアンタゴニストと同等な効力又は選択性を発揮しない。化合物５Ｂ及び６Ｂは、いくらかのアンタゴニスト作用レベルを示すが、アゴニストとしての有効容量の３倍高い濃度においてのみ示す。しかし、複数のＮ末端アミノ酸が更に除去されると、ｈＣｙｓ９に基づいたグルカゴンアンタゴニストの抗力は増強される（表８を参照すること）。

【0294】

【表5】

^＊アンタゴニストではない
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。

【0295】

第１アミノ酸の切断及び９位（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の置換により修飾されたグルカゴン及びグルカゴンペプチドのグルカゴン受容体親和性を、実質的に実施例１２に記載されたとおりに分析した。結果を表６に示す。

【0296】

【表6】

^＊ＥＣ５０（nM）
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。

【0297】

Ｇｌｕ、ｈＧｌｕ、ＣＳＡ−１、ＣＳＡ−２及びβ−ｈＧｌｕにより９位で修飾されたペプチドを含む、試験された幾つかの修飾グルカゴンに基づいたペプチドは、強力なグルカゴンアンタゴニスト活性を示した。

【0298】

９位（天然グルカゴンの番号付けによる）に修飾アミノ酸を含み、様々なＮ末端切断を有するグルカゴンペプチドを、グルカゴンアンタゴニスト活性について分析した。試験したペプチドの結果を表７に示す。

【0299】

【表7】

上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。
^ａデータは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＴＤである。
^ｂｐＡ_２、１単位のアゴニストの反応を０．５単位のアゴニストにより得られた反応に低減する、アンタゴニスト濃度の負の対数。データは、少なくとも二重の実験の平均±ＳＴＤである。
^ｃ（Ｉ／Ａ）_５０、阻害指数、添加された一定のグルカゴン（０．１〜０．２nM）に対するインヒビターのＩＣ_５０比。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均であり、ＥＣ_５０により規準化される。
^ｄＮＡ、完全なアンタゴニストではない。
^ｅＮＤ、検出されず。

【0300】

表８は、ホモシステイン酸修飾切断グルカゴンフラグメントを含む、追加のグルカゴン類縁体のグルカゴン受容体親和性及びアンタゴニスト活性を提示する。ｄｅｓＨｉｓ１に基づいたｈＣｙｓ（ＳＯ_３Ｈ）^９に基づいたアンタゴニストは、以前に報告されたＧｌｕ^９に基づいたアンタゴニスト〔ｄｅｓＨｉｓ^１，Ｇｌｕ９〕グルカゴンペプチドと同等の効力を発揮する。３、４又は５個のアミノ酸の除去により更に短縮されたｈＣｙｓ（ＳＯ_３Ｈ）^９に基づいたグルカゴンアンタゴニストを研究した。受容体結合の結果は、第１残基の除去はグルカゴン受容体への化合物の親和性を低減するが、更なる除去は親和性を僅かしか変えず、依然としてナノモル親和性のリガンドを生じることを示している。

【0301】

【表8】

上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。

【0302】

６−２９短縮グルカゴンアミド主鎖において通常６位に生じるフェニルアラニンをフェニル−乳酸（ＰＬＡ）で置換した、グルカゴンの特定の類縁体も開発した。ＰＬＡはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）と等電子であるが、滴定可能な水素を有さない。表９及び１０に表されているデータは、ＰＬＡ６置換によって、天然Ａｓｐ９類縁体が純粋なアンタゴニスト作用を示すが、効力はＧｌｕ９及びｈＣｙｓ（ＳＯ_３Ｈ）^９類縁体よりも低減していることを示している。文献は、以前は、グルカゴン（２−２９）類縁体の高い親和性及び強力なアンタゴニスト作用のためには天然Ａｓｐ９残基がＧｌｕ９又はｈＣｙｓ（ＳＯ_３Ｈ）^９に変わる必要があると指摘していた。したがって、６−２９短縮グルカゴンアミド主鎖におけるＰＬＡによるＰｈｅの置換が、類縁体の相対的アンタゴニスト効力をＧｌｕ９及びｈＣｙｓ（ＳＯ_３Ｈ）^９類縁体と同程度にまで改善するのは、驚くべきことである。より詳細には、ＰＬＡ６類縁体は、天然Ｐｈｅ６類縁体と比べて、グルカゴン受容体への類縁体の親和性を３倍増加させるとともに、アンタゴニスト作用の効力も増加させる。

【0303】

【表9】

上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。

【表10】

上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。

【0304】

グルカゴン類縁体の４及び５位を含む異なる位置でのＰＬＡ置換の効果も調査した。表１１に表されているデータは、ＰＬＡ６類縁体が、僅かに延長されたペプチドよりも明白に強力なアンタゴニストであることを示している。

【0305】

【表11】

ＮＤ：検出されず
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。

【0306】

表１２に表されているデータは、ＰＬＡ６置換が、ペプチドを効力を増加させるばかりでなく、ペグ化においても重要な役割を果たすことを示している。ＰＬＡ６類縁体を、グルカゴンアゴニスト作用を回復することなく選択的にペグ化することができる。天然Ｐｈｅ６類縁体は、驚くべきことに、ペグ化されるとアゴニスト作用の回復を示す。しかし、このアゴニスト作用の回復は、ＰＬＡ６ペプチド類縁体では観察されない。８、１１及び２４位（天然グルカゴンペプチドによる）のアミノ酸を含む幾つかの特定のペグ化部位を検査した。ＰＬＡ６類縁体の２４位でのペグ化は、最も強力で選択的なグルカゴンアンタゴニスト作用を示す。

【0307】

【表12】

上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。

【0308】

〔実施例１７〕
ここに記載されている全てのペプチドは、特に示されていない限り、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ペプチドの名称で指定されているアミノ酸位置は、天然グルカゴンの番号付けに従っている。

【0309】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの活性
グルカゴン及び多様なグルカゴン誘導体インヒビターの受容体結合、ｃＡＭＰ誘導、及びｃＡＭＰ阻害を比較した。受容体結合、ｃＡＭＰ誘導、及びｃＡＭＰ阻害を測定するアッセイは、実質的に実施例１２及び１３にそれぞれ開示されているアッセイ系を使用して実施した。

【0310】

グルカゴンアンタゴニスト作用とＧＬＰ−１アゴニスト作用の両方を示す特定のグルカゴン類縁体を調製した。より詳細には、天然グルカゴンの最初の５個のアミノ酸が除去され、天然グルカゴンの９位のアスパラギン酸残基がグルタミン酸で置換されている、特定の化合物を調製した。これらの化合物の示すＧＬＰ−１受容体活性は、天然グルカゴンの１６位にグルタミン酸置換を加えるようなペプチドの更なる修飾により増強されうる（図５を参照すること）。更に、表１３及び図６〜８に表されているデータに示されているように、天然グルカゴンに対して最初の５個のアミノ酸欠失を有し、アミノ酸対７と１１又は１１と１５の側鎖同士の間にラクタム環の形成を有するグルカゴン類縁体は、グルカゴンアンタゴニストとＧＬＰ−１の両方の活性を示す。

【0311】

【表13】

【表14】

^＊グルカゴン受容体におけるＥＣ５０

【0312】

表１４及び図６〜８に表されているデータにより示されているように、グルカゴンアンタゴニスト作用／ＧＬＰ−１アゴニスト作用を示すグルカゴンの特定の類縁体が開発されており、６−２９短縮グルカゴンアミド主鎖において、６位にある通常のフェニルアラニンがフェニル−乳酸（ＰＬＡ）で置換されており（「ＰＬＡ６類縁体」）、ラクタム架橋が、グルカゴン類縁体の側鎖同士の間に形成されている。図６Ａ及び６Ｂにより示されているように、主鎖ラクタムの、他の点ではグルカゴンアンタゴニストへの導入が、残留アゴニスト作用なしに強力なアンタゴニスト作用を維持する。図７Ａ、７Ｂ、８Ａ及び８Ｂは、主鎖ラクタムの、他の点ではグルカゴンアンタゴニストへの導入が、ペプチドの特定の配列及びラクタムの位置に応じて、多様な抗力の完全なＧＬＰ−１アゴニスト作用を導入することを示すデータを表す。

【0313】

表１５は、完全なＧＬＰ−１アゴニスト作用及び完全なグルカゴンアンタゴニスト作用を示す一連の異なるペプチドを提示する。２つの異なるペプチド主鎖の足場が開発されているが、両者の主な違いは、ＣＥＸノナペプチド（配列番号２１）による６−２９グルカゴンのＣ末端延長である。

【0314】

【表15】

【0315】

高度に相同性の受容体に対してアンタゴニスト作用を維持するペプチドへのアゴニスト作用の系統的導入は、ペプチド化学において前例がない。Bayer Research Labsにより寄稿された文献においてそのような混合グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストが報告されている〔Journal of Endocrinology (2007) 192:371-80 & Journal of Biological Chemistry (2006) 282:12506-15〕。しかし、以前に開示されたペプチド（ＡＮＫ２；配列番号３７）の分析は、ペプチドが意味のあるグルカゴンアンタゴニスト作用を有していないことを明らかにした。より詳細には、図９Ａ〜９Ｃは、本明細書に開示されている新規グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストと比較したBayerのペプチド（ＡＮＫ２；配列番号３７）が、混合グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストではないことを示すデータを表している。ＡＮＫ２ペプチドは、非常に強力なＧＬＰ−１アゴニスト作用を有するが、弱いが完全なグルカゴンアゴニスト作用を示す。本明細書に開示されているペプチドは、天然Ｎ末端残基を有さず、非天然のアミノ酸を短縮Ｎ末端に有し、類縁体の側鎖同士の間に内部架橋（例えば、塩架橋又は主鎖ラクタムの形態で）を有する点において、化学的に異なっている。ペプチドを選択的にペグ化して、混合アゴニスト／アンタゴニスト特性を変えることなく作用の持続時間を延ばすことができる。

【0316】

〔実施例１８〕
ここに記載されている全てのペプチドは、特に示されていない限り、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ペプチドの名称で指定されているアミノ酸位置は、天然グルカゴンの番号付けに従っている。

【0317】

本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストを以下のようにアシル化する。

【0318】

アシル化及び／又はペグ化ペプチドを以下のように調製する。ペプチドは、CS Bio 4886ペプチド合成機又はApplied Biosystems 430Aペプチド合成機のいずれかを使用して、固体支持樹脂上に合成する。Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193（1992）に記載されている現場中和化学を使用する。アシル化ペプチドでは、アシル化される標的アミノ酸残基（例えば、１０位）をＮε−ＦＭＯＣリシン残基で置換する。合成の完了したＮ末端ＢＯＣ保護ペプチドのＤＭＦ中の２０％ピペリジンによる３０分間の処理によって、ＦＭＯＣ／ホルミル基を除去する。遊離ε−アミノＬｙｓ残基へのカップリングは、１０倍モル過剰量のＦＭＯＣ保護スペーサーアミノ基（例えば、ＦＭＯＣ−（Ｎ−ＢＯＣ）−トリプトファン−ＯＨ）又はアシル鎖（例えば、Ｃ１７−ＣＯＯＨ）のいずれかと、ＤＭＦ／ＤＩＥＡ中のＰｙＢＯＰ又はＤＥＰＢＴカップリング試薬とのカップリングにより達成される。その後のスペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基の除去に続いて、アシル鎖とのカップリングが繰り返される。１００％ＴＦＡによる最終処理は、あらゆる側鎖保護基及びＮ末端ＢＯＣ基の除去をもたらす。ペプチド樹脂を、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和し、乾燥し、次にＨＦ／ｐ−クレゾール９５：５を０℃で１時間使用して支持体から切断する。エーテル抽出の後、５％ＨＯＡｃ溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和する。次に溶液の試料を、正しい分子量のペプチドを含有しているかについてＥＳＩ−ＭＳにより確認する。正しいペプチドを、１００％ＣＨ３ＣＮ中の１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡから０．１％ＴＦＡの直線勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。Vydac C18の２２mm×２５０mmタンパク質カラムを精製に使用する。アシル化ペプチド類縁体は、一般に、緩衝液比率の２０：８０で完全に溶離する。一部を一緒にプールし、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより純度を調べる。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得る。

【0319】

ペプチドのペグ化のためには、４０kDaのメトキシポリ（エチレングルコール）マレイミド−プロピオンアミド（Chirotech Technology Ltd.）を、ペプチドとＰＥＧの両方を溶解して透明な溶液にするのに必要な最小量の溶媒（一般に、２〜３mgのペプチドを使用する反応において２mL未満）を使用して、７Mの尿素、５０mMのトリス−ＨＣｌ緩衝液中のモル当量のペプチドと反応させる。室温での激しい撹拌を開始して４〜６時間行い、反応を分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析する。ペグ化生成物は、保持時間が減少しているので出発物質と異なっていると思われる。精製は、初期ペプチド精製に使用した条件と同じ条件のVydac C4カラムにより実施する。溶離は、緩衝液比率が５０：５０の前後で生じる。純粋なペグ化ペプチドの画分が見出され、凍結乾燥する。

【0320】

〔実施例１９〕
ここに記載されている全てのペプチドは、特に示されていない限り、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ペプチドの名称で指定されているアミノ酸位置は、天然グルカゴンの番号付けに従っている。

【0321】

デプシペプチドを、従来の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して組み立てた。ＰＬＡ誘導体化ペプチド鎖を、最初にラクタム架橋を介して環化し、次に事前活性化対称無水物を手動で使用してアミノ酸によりエステル化した。伝統的なＳＰＰＳを続けて、全配列を完成させた。標準的な切断手順及び精製方法を適用して、所望のデプシペプチドを得た。

【0322】

実施例
ラクタム架橋デプシペプチド〔Ａｉｂ２，Ｅ３，Ｔｈｒ５−Ｏ−ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）アミドの合成
配列ＨＯ−ＰＬＡ−ＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＤを有するペプチジル樹脂〔ＰＬＡ６，Ｅ１６，Ｋ２０，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）は、０．２mmolのＭＢＨＡアミド樹脂を用い、カップリング試薬としてＤＥＰＢＴを用いるABI 430A自動ペプチド合成機を使用した固相Ｂｏｃ化学により合成した。以下のＢｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｘ）、Ｇｌｎ（Ｘａｎ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｍｅｔ、ＰＬＡ、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｒｐ（ＨＯＣ）、Ｔｙｒ（２，６−ジ−Ｃｌ−Ｂｚｌ）及びＶａｌ（但し、１６位のグルタミン酸は、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−ＯＨにより組み込まれ、２０位のリシンは、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨにより組み込まれた）。ＤＭＦ中２０％ピペリジンにより１６及び２０のＦｍ及びＦｍｏｃ保護基を除去した後、ペプチジル樹脂を１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦのＤＥＰＢＴ ３００mg（１mmol）で４時間処理して、ラクタム架橋を形成した。このラクタム架橋ペプチジル樹脂に、ＤＣＭ中のＢｏｃ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（２mmol）／ＤＩＣ（１mmol）／ＤＭＡＰ（０．２mmol）から構成される事前活性化対称無水物溶液を加え、反応を１６時間進行させた。残りのアミノ酸のＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｃＨｘ）−ＯＨ及びＢｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨを、ここでも標準的Ｂｏｃ化学によりカップリングして、以下の配列のデシペプチジル樹脂を得た：Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｏ−ＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ^＊−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ^＊−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＮＨ_２（^＊はラクタム架橋されている）。

【0323】

ペプチジル樹脂を液体フッ化水素で処理して、固体支持体から粗ペプチドを切断し、全ての保護基を除去した。デプシペプチドを、分取ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳ及び分析ＨＰＬＣにより分析した。精製されたペプチドは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析により計算分子量の３３６９．０ダルトンに相当する所望の質量の３３６８．５を生じた。

【0324】

同様の手順を使用して、本特許出願に報告されている他のラクタム架橋デプシペプチドを合成した。

【0325】

〔実施例２０〕
ここに記載されている全てのペプチドは、特に示されていない限り、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ペプチドの名称で指定されているアミノ酸位置は、天然グルカゴンの番号付けに従っている。

【0326】

以下のペプチドを上記に一般的に記載されたように合成し、続いて、実施例１３に一般的に記載されているのと同様に、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する細胞からのｃＡＭＰ放出をアッセイすることにより、ＧＬＰ−１受容体を刺激する能力について試験し、また、０．２〜０．８nMのグルカゴンにより刺激したヒトグルカゴン受容体発現細胞からのｃＡＭＰ放出をアッセイすることによって、グルカゴン受容体を刺激する能力について試験した。

【0327】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１ペプチドのラクタム化及びＣ末端延長の効果を探求するために、Ｃ末端延長グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１ペプチドを、１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓ（天然グルカゴンの番号付けによる）の側鎖同士を架橋するラクタム有り又は無しで産生し、試験した。３つの別々のアッセイをまとめた結果を表１６に示す。

【0328】

【表16】

【0329】

表１６に示されているように、ラクタム架橋を含むＣ末端延長ペプチドは、ラクタム架橋を欠いている対応するペプチドと比較すると、増加したＧＬＰ−１活性を示した。

【0330】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのペプチド配列内のラクタム架橋の位置の効果は、アミノ酸１２と１６、１６と２０、２０と２４又は２４と２８（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の側鎖同士を結合しているラクタムを有するペプチドを産生し、試験することによって試験した。３つの別々のアッセイをまとめた結果を表１７に示す。

【0331】

【表17】

【0332】

表１７に示されているように、アミノ酸１６と２０（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の間にラクタム架橋を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドは、最高のＧＬＰ−１活性を示した。残基１２と１６の間のラクタム架橋も、ペプチドが強力なＧＬＰ−１活性示すことを可能にした。

【0333】

修飾されて天然グルカゴンアミノ酸配列が天然ＧＬＰ−１配列で置換されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１ペプチドを合成し、ＧＬＰ−１配列交換を欠いている対応するペプチドと比較した。３つの別々のアッセイをまとめた結果を表１８に示す。

【0334】

【表18】

【0335】

表１８に示されているように、天然グルカゴン配列を１６〜２５位（天然グルカゴン配列による）の前後でＧＬＰ−１配列に置換した効果は、ほとんどの場合、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を増加した。しかし、２及び３位（天然グルカゴン配列による）にＧＬＰ−１配列を追加的に含み、ＰＬＡを欠いているペプチドでは、１６〜２５位の前後のＧＬＰ−１配列の交換は、グルカゴンアンタゴニスト活性を減少した。

【0336】

多様なＮ末端切断を有し、ＰＬＡを欠いているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１ペプチドを作製し、試験した。幾つかのペプチドはＧＬＰ−１のＮ末端配列も有した。２つの別々のアッセイをまとめた結果を表１９に示す。

【0337】

【表19】

^＊Pan et al., JBiol Chem 281(18): 12506-12515 (2006)に記載されているＡＮＫ２。

【0338】

表１９に示されているように、ＰＬＡを含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１ペプチドは、より強力なグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストである。

【0339】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストデプシペプチド（エステル結合を介してｎ−１位でＴｈｒに結合しているｎ位（ｎ＝５又は６）のＰＬＡを含む）を作製し、活性について試験した。これらのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストとしての抗力を、Ｎ末端アミノ酸としてＰＬＡを含むペプチド及びＰＬＡを欠いているペプチドと一緒に比較した。２つの別々のアッセイをまとめた結果を表２０に示す。

【0340】

【表20】

【0341】

表２０に示されているように、ペプチドのデプシペプチドへの修飾は、ＧＬＰ−１アゴニスト活性及びグルカゴンアンタゴニスト活性の両方の増加をもたらした。

【0342】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドをペグ化する効果を探求するために、２４位（天然グルカゴンの番号付けによる）のアミノ酸に結合した、又はＣ末端延長を含むペプチドのＣ末端残基に結合した２０，０００ダルトンのＰＥＧ部分を有する、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドを合成した。ペプチド「〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｋ２４（ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ−２０ｋＤａ）〕Ｇ（６−２９）」では、３−メルカプトプロピオン酸を、ペグ化のために、２４位（天然グルカゴンの番号付けによる）のＬｙｓの側鎖アミンに結合した。ペプチド「〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｋ２４（剛性−Ｓ−２０ｋＤａ）〕Ｇ（６−２９）」では、３−アミノプロパ−１−イニル−安息香酸を、最初に２４位のＬｙｓの側鎖アミンに結合し、次に３−メルカプトプロピオン酸を、ペグ化のために、剛性結合で結合した。得られたリンカーは、以下の構造を有した：

【化15】

【0343】

次にペプチドを、ＧＬＰ−１受容体に対するアゴニスト活性及びグルカゴン受容体に対するアンタゴニスト活性について、本明細書に実質的に記載されているように試験した。結果を表２１に示す。

【0344】

【表21】

【0345】

表２１に示されているように、ペグ化は、一般に、グルカゴン受容体に対してＩＣ５０を増加し、ＧＬＰ−１受容体に対してＥＣ５０を増加した。

【0346】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドの脂肪酸アシル化の効果を探求するために、グルタミン酸残基スペーサーを介してペプチドのＬｙｓ残基に結合しているＣ１６脂肪酸を含み、Ｌｙｓ残基がグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドの配列内でアミノ酸の位置を変えている、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチド〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）を作製し、試験した。結果を表２２に示す。

【0347】

【表22】

【0348】

〔実施例２１〕
ここに記載されている全てのペプチドは、特に示されていない限り、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ペプチドの名称で指定されているアミノ酸位置は、天然グルカゴンの番号付けに従っている。

【0349】

コレステロール修飾ペプチドは、ラクタム化ペプチドをブロモアセチル化コレステロール誘導体と溶液中で結合することによって調製した。ペプチドは、従来の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して組み立てた。ＰＬＡ誘導体化ペプチド鎖はラクタム架橋を介して環化した。標準的な切断手順及び精製方法を適用して、所望のデプシペプチドを得た。

【0350】

実施例
コレステロール結合ラクタム架橋ペプチド〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）アミドの合成
配列ＨＯ−ＰＬＡ−ＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＤＴを有するペプチジル樹脂〔ＰＬＡ６，Ｋ１０，Ｅ１６，Ｋ２０，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）は、０．２mmolのＭＢＨＡアミド樹脂を用い、結合試薬としてＤＥＰＢＴを用いるABI 430A自動ペプチド合成機を使用した固相Ｂｏｃ化学により合成した。以下のＢｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｘ）、Ｇｌｎ（Ｘａｎ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｍｅｔ、ＰＬＡ、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｒｐ（ＨＯＣ）、Ｔｙｒ（２，６−ジ−Ｃｌ−Ｂｚｌ）及びＶａｌ（但し、１６位のグルタミン酸は、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−ＯＨにより組み込まれ、２０位のリシンは、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨにより組み込まれ、１０位のリシンは、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨにより組み込まれた）。ＤＭＦ中２０％ピペリジンにより１６及び２０位のＦｍ及びＦｍｏｃ保護基を除去した後、ペプチジル樹脂を１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中のＤＥＰＢＴ ３００mg（１mmol）で４時間処理して、ラクタム架橋を形成した。このラクタム架橋ペプチジル樹脂を、１０mLのＣＨＣｌ_３中の１００mg（０．４当量）のＰｄ（ＰＰｈ_３）_４、１２０uLのＰｈＳｉＨ_３、０．２５mLのＮ−メチルモルホリン及び０．５mLの酢酸から構成される溶液によりＮ₂雰囲気下で約３時間処理して、Ａｌｌｏｃ基を除去した。次に３−トリチルチオプロピオン酸をＤＥＰＢＴとカップリングして、ＨＯ−ＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ）−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ^＊−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ^＊−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＮＨ_２（^＊はラクタム架橋されている）の配列を有するペプチジル樹脂を得た。

【0351】

ペプチジル樹脂を液体フッ化水素で処理して、固体支持体から粗ペプチドを切断し、全ての保護基を除去した。ペプチドを、分取ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳ及び分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。精製したペプチドは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析により、ペプチド〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）アミドの計算分子量の３０５１．０ダルトンに相当する所望の質量の３０５０．７を生じた。

【0352】

コレステロール結合ペプチド〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）アミドを合成するために、１０mg（３．２８μM）の〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＨ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）アミドを、５０mMのトリス−ＨＣｌを含有する７M尿素緩衝液（ｐＨ８．０）２mLに溶解した。この溶液に、１０mg（９μM)のコレステロール試薬Ｂｒ−Ｏｘａ_１２−Ｃｈｏｌ（下記の構造を参照すること）を、室温で加えた。反応をＨＰＬＣによりモニターした。約４時間後、反応溶液をＨＰＬＣにより直接精製した。精製したコレステロール結合ペプチドは、分析クロマトグラフィーにより単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析により、ペプチド〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）アミドの計算分子量の４０７３．０ダルトンに相当する所望の質量の４９７３．０を生じた。

【0353】

【化16】

【0354】

同様の手順を使用して、本特許出願に報告されている〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８，Ｋ３０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ）〕Ｇ（６−３０）アミド及び〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８，Ｋ４０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ）〕Ｇ（６−４０）アミドのような、その他のコレステロール結合・ラクタム架橋ペプチドを合成した。

【0355】

コレステロール化ペプチドを、ＧＬＰ−１受容体に対するアゴニスト活性及びグルカゴン受容体に対するアンタゴニスト活性について、実施例１３に実質的に記載されているように試験した。ＧＬＰ−１受容体に対するペプチドのＥＣ５０、及び０．４nMグルカゴンで刺激されたグルカゴン受容体に対するＩＣ５０を表２３に示す。

【0356】

【表23】

標準偏差が（）内に示されている。
^＊２つの異なるアッセイの結果が示されている。

【0357】

〔実施例２２〕
ここに記載されている全てのペプチドは、特に示されていない限り、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ペプチドの名称で指定されているアミノ酸位置は、天然グルカゴンの番号付けに従っている。

【0358】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１ペプチドへのアルファ，アルファ−二置換アミン酸の組み込みを介したアルファ−へリックスの安定化の効果を探求した。６位のＰｈｅの代わりにＰＬＡを含み、１６位にＡＩＢを含み（天然グルカゴンの番号付けによる）、Ｃ末端アミドを含むように修飾された、アミノ酸６−２９のグルカゴンを含むペプチド（配列番号９７）を作製し、グルカゴンアンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１アゴニスト活性について試験した。０．２nMのグルカゴンに反応するグルカゴン受容体に対するＩＣ５０は、一つのアッセイでは７．０４（０．６９）であり、別のアッセイでは２２．０（２．８４）であった（ＳＤが括弧内に提示されている）。ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０は、７９５（３１．２）であった。

【0359】

〔実施例２３〕
ここに記載されている全てのペプチドは、特に示されていない限り、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ペプチドの名称で指定されているアミノ酸位置は、天然グルカゴンの番号付けに従っている。

【0360】

グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドを修飾して、ＰＬＡ含有デシペプチドにした、並びに／又はグルカゴンの２位及び３位の天然アミノ酸の代わりにこれらの位置にＧＬＰ−１の天然アミノ酸を含ませた（番号付けは天然ＧＬＰ−１及びグルカゴンに従った）。次にペプチドをグルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１活性について試験した。アッセイの結果を表２４に示す。

【0361】

【表24】

【0362】

〔実施例２４〕
ここに記載されている全てのペプチドは、特に示されていない限り、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ペプチドの名称で指定されているアミノ酸位置は、天然グルカゴンの番号付けに従っている。

【0363】

以下のペプチドを上記に一般的に記載されたように合成し、続いて、実施例１３に一般的に記載されているように、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する細胞からのｃＡＭＰ放出をアッセイすることにより、ＧＬＰ−１受容体を刺激する能力について試験し、また、０．５nMのグルカゴンにより刺激したヒトグルカゴン受容体発現細胞からのｃＡＭＰ放出をアッセイすることによって、グルカゴン受容体を刺激する能力について試験した。アッセイの結果を表２５に示す。

【0364】

【表25】

（Ｏ^＊）はデプシペプチド結合を表す。

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]