特許 5772220 サーチュイン発現増強剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5772220

(24)【登録日】2015年7月10日

(45)【発行日】2015年9月2日

(54)【発明の名称】サーチュイン発現増強剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/05 20060101AFI20150813BHJP

   A61K 31/09 20060101ALI20150813BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20150813BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150813BHJP

   C07C 39/23 20060101ALN20150813BHJP

   C07C 39/21 20060101ALN20150813BHJP

   C07C 43/23 20060101ALN20150813BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/05

   A61K31/09

   A61P3/00

   A61P43/00 107

   !C07C39/23

   !C07C39/21

   !C07C43/23 C

【請求項の数】1

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2011-118367(P2011-118367)

(22)【出願日】2011年5月26日

(65)【公開番号】特開2012-246242(P2012-246242A)

(43)【公開日】2012年12月13日

【審査請求日】2014年4月9日

(73)【特許権者】

【識別番号】390020189

【氏名又は名称】ユーハ味覚糖株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100074561

【弁理士】

【氏名又は名称】柳野 隆生

(74)【代理人】

【識別番号】100124925

【弁理士】

【氏名又は名称】森岡 則夫

(74)【代理人】

【識別番号】100141874

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 久由

(72)【発明者】

【氏名】土井 聡

(72)【発明者】

【氏名】來住 明宣

(72)【発明者】

【氏名】松川 泰治

(72)【発明者】

【氏名】野島 正朋

(72)【発明者】

【氏名】松居 雄毅

(72)【発明者】

【氏名】山田 泰正

(72)【発明者】

【氏名】山田 一郎

【審査官】 前田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−２７００１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−０４８５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１９１０４９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／０５

Ａ６１Ｋ ３１／０９

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（１）：

【化1】

、式（２）：

【化2】

又は式（３）：

【化3】

で示されるレスベラトロール誘導体、これらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするサーチュイン発現増強剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、レスベラトロール誘導体を含有するサーチュイン発現増強剤に関するものである。

【背景技術】

【0002】

我が国の高齢化は世界でも類をみない速度で進行している。２０１０年では、日本の人口の３０.４７％が６０歳以上の高齢者であることが国連の統計調査によって示されている。高齢化社会の到来は医療費の増大など社会的負担を招き、その影響は多岐にわたる。そのような現状を鑑みて、世界では老化予防「アンチエイジング」の研究が盛んに行われている。

【0003】

アンチエイジング研究において最も進んでいるのが、酵母、線虫、ショウジョウバエのようなモデル生物を用いた研究である。これらの生物において、カロリー制限が寿命延長・老化抑制に有効な処理であることが古くから知られている。この生理現象の要因となる遺伝子の探索が行われ、酵母においてＳｉｒ２遺伝子が関与していることが明らかとなった。

【0004】

Ｓｉｒ２遺伝子はＳＩＲ２（ｓｉｌｅｎｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ２）ファミリーと総称される遺伝子群に属する。酵母での研究において、Ｓｉｒ２はリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の蓄積を抑制する酵素として見出された。ゲノム上から切り出された環状ｒＤＮＡの蓄積は老化現象の１つとして認識されており、過剰な蓄積は細胞死につながる。Ｓｉｒ２はサイレンシングによりこの環状ｒＤＮＡの蓄積を抑制する抑制因子と認識された。さらにＳｉｒ２がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性の脱アセチル化酵素をコードしていることが明らかとなり、細胞内のエネルギー代謝状態のセンサーとして機能していることが示唆された。以上のことから、Ｓｉｒ２遺伝子は老化抑制・寿命延長にかかわる老化抑制遺伝子として認識された。

【0005】

一方、哺乳類ではＳｉｒ２ファミリーに属する遺伝子としてＳＩＲＴ（ｓｉｒｔｕｉｎ）１〜７が見出されており、サーチュインと呼ばれる。このうちＳＩＲＴ１は酵母のＳｉｒ２に最も相同性の高い遺伝子であり、Ｓｉｒ２と同様にカロリー制限によって発現が増強されることが見出されている。また、全身でＳＩＲＴ１を強制発現させたトランスジェニックマウスでの解析では、老化や高脂肪食がもたらす悪影響に有意な抵抗性を示すことが明らかになっている。さらに大腸においてＳＩＲＴ１を強制発現させた大腸癌モデルマウスにおいては、腫瘍の大きさ、成長率や発生率が１／４まで低下することが示されている。また、ＳＩＲＴ１の標的タンパク質が数多く同定されており、その中にはＮＦ−κＢ、ｐ５３、ＦＯＸＯ、ＰＧＣ−１α、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＵＣＰ２などの肥満、体内のエネルギー消費に関連する主要な受容体・制御因子が含まれており、ヒトにおいては、ＳＩＲＴ１遺伝子の一塩基多型と肥満、エネルギー消費、インスリン感受性の間に有意な相関が示されていることから、ＳＩＲＴ１が基本的な代謝応答を制御することが示されている。

【0006】

このようにサーチュインが老化・寿命・代謝に大きな影響を及ぼすことから、低分子の活性化剤の探索も行われている。その結果、植物性ポリフェノール化合物であるレスベラトロールが見出されている。例えば、酵母での研究において、レスベラトロールがカロリー制限に伴うシグナル伝達経路を活性化し、顕著な延命効果をもたらすことが明らかとなっている（非特許文献１）。哺乳類においては、レスベラトロールを摂取させたマウスの遺伝子発現プロファイルが、カロリー制限をしたマウスの遺伝子発現プロファイルに類似することが明らかとなり、カロリー制限を模倣した効果が期待された（非特許文献２）。また、高脂肪食を与えたマウスにレスベラトロールを摂取させることで、脂肪肝、糖尿病、心筋の炎症など肥満によるリスクを低減すること（非特許文献３）、また体重増加を有意に抑制することが示されている（非特許文献４）。さらに、糖尿病モデルマウスでは、レスベラトロールを摂取させることでインスリン感受性が改善することも見出されている（非特許文献５）。

【0007】

このような現状から、サーチュインの活性を促進する、または発現を増強する物質の探索が行われており、レスベラトロール以外にも先行技術が報告されている。例えば、フラボノイド類を有効成分とするサーチュイン活性化剤（特許文献１）、乳酸菌由来成分を有効成分とするサーチュイン発現増強剤（特許文献２）、スダチより抽出される化合物を有効成分とするＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性化剤（特許文献３）、カッコンエキスを有効成分とするサーチュイン１活性化剤（特許文献４）、ε―ビニフェリンを有効成分とするサーチュイン活性促進剤（特許文献５）が知られている。

【0008】

このようにサーチュイン発現増強剤、サーチュイン活性促進剤の有用性から、このような活性を有する化合物や素材が多数提案されているが、更なる新規素材の開発が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２００７−３２６８７２号公報

【特許文献2】特開２００８−１９５６７３号公報

【特許文献3】特開２００９−１２６７９９号公報

【特許文献4】特開２０１０−２７００１２号公報

【特許文献5】特開２０１１−５７５８０号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２５（６９５４）：１９１−１９６

【非特許文献2】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１０，５：２５３−２９５

【非特許文献3】Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４４（７１１７）：３３７−３４２

【非特許文献4】Ｃｅｌｌ，２００６，１２７（６）：１１０９−１１２２

【非特許文献5】Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂ．，２００７，６（４）：３０７−３１９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明者らは、サーチュイン発現増強剤およびサーチュイン活性促進剤に関する前記の状況を鑑みて、新規なサーチュイン発現増強剤およびサーチュイン活性促進剤の探索をした。その結果、新たに作製したレスベラトロール誘導体類が優れたサーチュイン発現増強剤およびサーチュイン活性促進剤を有する化合物であることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

したがって、本発明は、優れたサーチュイン発現増強剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の要旨は、
〔１〕下記式（１）：

【0014】

【化1】

【0015】

、式（２）：

【0016】

【化2】

【0017】

又は式（３）：

【0018】

【化3】

【0019】

で示されるレスベラトロール誘導体、これらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするサーチュイン発現増強剤に関する。

【発明の効果】

【0020】

本発明のサーチュイン発現増強剤は、公知の増強剤であるレスベラトロールと比べ優れたサーチュイン発現増強作用を有していることから、新規のサーチュイン発現増強剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は実施例５で行ったリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。左から（１）ＤＭＳＯ、（２）レスベラトロール、（３）ＵＨＡ４００２、（４）ＵＨＡ９０２１、（５）ＵＨＡ１０２８で処理した細胞より抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡ中のサーチュイン発現量を相対値で表している。

【図2】図２は実施例６で行ったウェスタンブロット解析の結果を示す。左から、（１）ＤＭＳＯ、（２）レスベラトロール、（３）ＵＨＡ４００２で処理した細胞より抽出したタンパク質中のサーチュインを検出した結果を示している。

【図3】図３は実施例６で行ったウェスタンブロット解析の結果を示す。左から、（１）ＤＭＳＯ、（２）レスベラトロール、（３）ＵＨＡ９０２１、（４）ＵＨＡ１０２８で処理した細胞より抽出したタンパク質中のサーチュインを検出した結果を示している。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のサーチュイン発現増強剤およびサーチュイン活性促進剤は、下記式（１）：

【0023】

【化4】

【0024】

、式（２）：

【0025】

【化5】

【0026】

又は式（３）：

【0027】

【化6】

【0028】

で示されるレスベラトロール誘導体、これらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする。

【0029】

本発明において、「サーチュイン発現増強剤」とは、代謝経路を包括的に制御する酵素であるサーチュインの細胞内の発現を増強することができる薬剤をいう。
また、「サーチュイン活性促進剤」とは、代謝経路を包括的に制御する酵素であるサーチュインの酵素活性を促進することができる薬剤をいう。
サーチュイン発現増強作用およびサーチュイン活性促進作用は、具体的には、後述の実施例に記載の方法により、それぞれを測定し、公知の化合物であるレスベラトロールの作用と対比することで確認することができる。

【0030】

前記レスベラトロール誘導体類において、炭素−炭素２重結合は、トランスまたはシスであってよく、シス体とトランス体との混合物を含む。

【0031】

前記レスベラトロール誘導体類の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩； アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩； アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩； α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

【0033】

前記のレスベラトロール誘導体類はいずれも、レスベラトロールや公知のレスベラトロール誘導体に比べて、優れたサーチュイン発現増強作用を有し、レスベラトロールに比べて同程度以上のサーチュイン活性促進作用を有する。
したがって、本発明は、前記レスベラトロール誘導体類を有効成分として含有するサーチュイン発現増強剤およびサーチュイン活性促進剤を提供することができる。

【0034】

次に本発明を実施例に基いて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。

【実施例】

【0035】

（実施例１：ＵＨＡ１０２８の生成および単離・精製）
トランス−レスベラトロール（東京化成工業（株）社製）１ｇ、ｐ−クマル酸（和光純薬（株）社製）１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、ミネラルウォーター（商品名「ゲロルシュタイナー」サッポロ飲料（株）製）２０ｍＬを加えて、レスベラトロール、ｐ−クマル酸含有溶液（ｐＨ＝４．６）を得た。このレスベラトロール、ｐ−クマル酸含有溶液をオートクレーブにて１３０℃、９０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうち１０μＬをＨＰＬＣにより分析し、ＵＨＡ１０２８の生成を確認した。

【0036】

ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ₂Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）

【0037】

得られた反応物からＵＨＡ１０２８を分取ＨＰＬＣにより精製し、常法により乾燥したところ、褐色粉末状の物質であった。

【0038】

なお、ＵＨＡ１０２８の分子量を高分解能電子イオン化質量分析法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は４０８．４４３６であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２４Ｈ２４Ｏ６（Ｍ⁺）：４０８．４４３８
分子式Ｃ₂₄Ｈ₂₄Ｏ₆

【0039】

次に、前記ＵＨＡ１０２８を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ１０２８が前記式（３）で表される構造を有することを確認した。

【0040】

（実施例２：ＵＨＡ４００２の生成および単離・精製）
トランス−レスベラトロール７００ｍｇをエタノール１４ｍｌに溶解し、２．５％ＮａＨＣＯ₃水溶液を１４ｍｌ加えて、レスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ（ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ）にて１３０℃、２０分間加熱した。次いで、１回目のオートクレーブ処理にて得られた反応溶液に、エタノール１４ｍｌと５．０％ＮａＨＣＯ₃水溶液を１４ｍｌ加え、再度、オートクレーブ（ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ）にて１３０℃、２０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍｌにメスアップし、このうちの１０μｌをＨＰＬＣにより分析し、ＵＨＡ４００２の生成を確認した。ＨＰＬＣ分析は、実施例１と同様の条件で行った。

【0041】

得られた反応物からＵＨＡ４００２を分取ＨＰＬＣにより精製し、常法により乾燥したところ、褐色粉末状の物質であった。

【0042】

なお、実施例１と同様に高分解能電子イオン化質量分析法にてＵＨＡ４００２の分子量を測定したところ、測定値は４３９．４８０３であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２８Ｈ２３Ｏ５（Ｍ⁺）：４３９．４７９２
分子式Ｃ₂₈Ｈ₂₃Ｏ₅

【0043】

次に、前記ＵＨＡ４００２を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ４００２が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。

【0044】

（実施例３：ＵＨＡ９０２１の生成および単離・精製）
トランス−レスベラトロール１ｇ、シナピン酸（和光純薬（株）社製）１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、ミネラルウォーター２０ｍＬを加えて、レスベラトロール、シナピン酸含有溶液（ｐＨ＝４．９）を得た。このレスベラトロール、シナピン酸含有溶液をオートクレーブにて１３０℃、９０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうち１０μＬをＨＰＬＣにより分析し、ＵＨＡ９０２１の生成を確認した。ＨＰＬＣ分析は、実施例１と同様の条件で行った。

【0045】

得られた反応物からＵＨＡ９０２１を分取ＨＰＬＣにより精製し、常法により乾燥したところ、褐色粉末状の物質であった。

【0046】

なお、実施例１と同様に高分解能電子イオン化質量分析法にてＵＨＡ９０２１の分子量を測定したところ、測定値は３４８．３９１５であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２２Ｈ２０Ｏ４（Ｍ⁺）：３４８．３９１８
分子式Ｃ₂₂Ｈ₂₀Ｏ₄

【0047】

次に、前記ＵＨＡ９０２１を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ９０２１が前記式（２）で表される構造を有することを確認した。

【0048】

（実施例４：ヒトサーチュイン活性の比較）
ヒトサーチュインＳＩＲＴ１に対するレスベラトロール誘導体の活性促進作用を評価するために、ＳＩＲＴ１活性測定用キット「ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＳＩＲＴ１ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」（ＡＮＡＳＰＥＣ社製）を用いて測定を行った。

【0049】

試料にはレスベラトロール、活性促進作用が報告されているε−ビニフェリン（和光純薬（株）社製）、本発明品であるＵＨＡ４００２の３種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬（株）社製）に１００μＭの濃度で溶解させて試験に使用した。

【0050】

測定は前記測定用キットに付属の取り扱い説明書の方法に準じて行った。まず、コンポーネントＡ（サーチュイン基質）５０μＬとコンポーネントＥ（ＮＡＤ⁺）５０μＬをコンポーネントＤ（アッセイバッファー）４．９ｍＬに混合し、サーチュイン基質溶液とした。次にコンポーネントＣ（リコンビナントサーチュイン）をコンポーネントＤで２０倍希釈し、これをサーチュイン酵素溶液とした。次にコンポーネントＧ（デベロッパー）５００μＬとコンポーネントＦ（ニコチンアミド）５００μＬにコンポーネントＤ ４ｍＬに混合し、これを１×デベロッパー溶液とした。

【0051】

酵素反応は９６ウェルアッセイブラックプレート（コーニングジャパン（株）社製）を用いて行った。ウェルにサーチュイン酵素溶液 ４０μＬと試料１０μＬを添加した。なお、コンポーネントＤ ４０μＬと試料１０μＬを添加したものを化合物コントロールとした。
３７℃ １０分プレインキュベートし、これにサーチュイン基質溶液を５０μＬ添加した（試料終濃度１０μＭ）。化合物コントロールにはコンポーネントＤ ５０μＬを添加した。穏やかに３０秒程度撹拌し、３７℃で６０分インキュベートした。
１×デベロッパー溶液を各ウェルに５０μＬずつ加えた。撹拌・混合後に３７℃ １０分インキュベートし、これを蛍光検出器「Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）にて励起波長４８５ｎｍ、測定波長５３８ｎｍで測定した。得られたデータをもとに、レスベラトロールを添加した条件の活性を１００％とし、各試料を添加した条件の活性を算出した。これらの結果を表１に示した。

【0052】

【表1】

【0053】

表１の結果より、ＵＨＡ４００２にレスベラトロール、ε―ビニフェリンよりも優れたサーチュイン活性促進作用が見られた。
また、ＵＨＡ１０２８、ＵＨＡ９０２１についても、同様にして調べたところ、レスベラトロールと同程度のサーチュイン活性促進作用が確認された。

【0054】

（実施例５：サーチュイン遺伝子発現量の比較）
次にヒト細胞におけるサーチュイン遺伝子ＳＩＲＴ１の発現増強作用を評価するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｖｅｃ）（ＬＯＮＺＡ（株）社製）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。

【0055】

試料にはレスベラトロール、本発明品であるＵＨＡ１０２８、ＵＨＡ４００２、ＵＨＡ９０２１の4種類を用いた。各試料をＤＭＳＯに２ｍＭの濃度で溶解させたものを試験に使用した。

【0056】

Ｈｕｖｅｃの培養には、内皮細胞添加因子セット−２（「ＥＧＭ（登録商標）−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ」、タカラバイオ（株）社製）の内皮細胞添加因子（ｈＥＧＦ、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、ＦＢＳ、ｈＦＧＦ−Ｂ、アスコルビン酸、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ、ＧＡ−１０００）を全量添加した内皮細胞基本培地−２（「ＥＢＭ（登録商標）−２」、タカラバイオ（株）社製）を使用した。培養用ディッシュには、細胞培養用コラーゲンＩコート１０ｃｍディッシュ（日本ＢＤ（株）社製）を使用した。細胞は、５×１０⁴ｃｅｌｌ／ｍＬに調製した培養液を１０ｍＬ播種し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で６２時間培養し、８０％コンフルエント以上の状態で試験に使用した。継代回数は５回の細胞を使用した。

【0057】

試験は定法に従って実施した。８０％コンフルエント以上の状態の細胞に各試料を終濃度１０μＭとなるように添加した（ＤＭＳＯ持込量０．５％）。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをネガティブコントロールとした。

【0058】

試料添加後、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養し、細胞よりＲＮＡ抽出キット「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ II」（タカラバイオ（株）社製）を用いて全量ＲＮＡを抽出・精製した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用逆転写試薬「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（タカラバイオ（株）社製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。つまり５×Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ４μＬ、全量ＲＮＡ １μｇを混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ₂Ｏで２０μＬに調製した。ＰＣＲ用サーマルサイクラー「ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（株）社製）を使用して｛３７℃ １５分 → ８５℃ ５秒｝×１サイクルのプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用希釈試薬「ＥＡＳＹ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ」（タカラバイオ（株）社製）にて１０倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。

【0059】

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には「ＥＣＯ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ―ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ」（イルミナ（株）製）を使用した。プライマーには、サーチュインフォワードプライマー；（プライマーＩＤ：ＨＡ１３２６４８−Ｆ）、サーチュインリバースプライマー；（プライマーＩＤ：ＨＡ１３２６４８−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー；（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｆ）、ＡＣＴＢリバースプライマー；（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｒ）（いずれもタカラバイオ（株）社製）を使用した。反応にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ II」（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ（株）社製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に２×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ II（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、逆転写反応液 ２μＬ、ｄＨ₂Ｏ ２．８４μＬ（総量１０μＬ）を混合して[９５℃ ３０秒 → ｛９５℃ １５秒 → ６０℃ １分｝×４０サイクル → ９５℃ １５秒 → ５５℃ １５秒 → ９５℃ １５秒]のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。

【0060】

得られた各細胞中のβ−アクチンとサーチュイン（ＳＩＲＴ１）のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からサーチュイン発現量の相対値を算出した。結果を図１に示した。

【0061】

図１の結果より、ＵＨＡ１０２８、ＵＨＡ４００２、ＵＨＡ９０２１いずれにおいても、レスベラトロールよりもメッセンジャーＲＮＡレベルにおいて強いサーチュイン発現増強作用が確認された。

【0062】

（実施例６：サーチュインタンパク質発現量の比較）
次にヒト細胞におけるサーチュインタンパク質発現増強作用を評価するために、Ｈｕｖｅｃを用いたウェスタンブロット解析を行った。

【0063】

試料にはレスベラトロール、本発明品であるＵＨＡ１０２８、ＵＨＡ４００２、ＵＨＡ９０２１の4種類を用いた。各試料をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭの濃度で溶解させたものを試験に使用した。

【0064】

Ｈｕｖｅｃの培養は、実施例３と同様の方法で行った。また、継代回数は４回の細胞を使用した。

【0065】

試験は定法に従って実施した。つまり、８０％コンフルエント以上の状態の細胞に各試料を終濃度５０μＭとなるように添加した（ＤＭＳＯ持込量０．５％）。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをネガティブコントロールとした。
ＵＨＡ４００２の場合、試料添加後に３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２時間培養して細胞を回収した。ＵＨＡ１０２８、ＵＨＡ９０２１の場合には、試料添加後に３７℃、５％ＣＯ₂条件下で８時間培養して細胞を回収した。
プロテアーゼインヒビターカクテル錠「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ」（ロシュ・ダイアグノスティックス（株）製）１錠をリン酸緩衝液ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）１．５ｍＬに溶解させ、これをプロテアーゼインヒビター溶液とした。ＰＢＳ８５０μＬにプロテアーゼインヒビター溶液１５０μＬを混合して細胞破砕液を調整した。

【0066】

回収した細胞に細胞破砕液１００μＬを添加し、超音波処理と遠心分離により粗タンパク質溶液を調製した。得られたタンパク質溶液は、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ」(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製)ブラットフォード法によりタンパク質濃度の定量を行った。

【0067】

タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供するタンパク質サンプルは、タンパク質４μｇ相当に１／５量のＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１００ｍＭジチオトレイトール、３０％グリセロール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）を添加して９６℃で５分間加熱変性させたものを使用した。ゲルには「ミニプロティアンＴＧＸ７．５％Ｇｅｌ」（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）を使用した。
変性させたタンパク質サンプルを全量ゲルに供し、２００Ｖ、３０分間電気泳動した。
電気泳動後、セミドライ式ブロッティング装置「ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ Ｓ−Ｄ ＳＥＭＩ−ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ」（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）でＰＶＤＦ膜（ミリポア（株）社製）にブロッティングした。ここから、「Ａｎｔｉ−ＳＩＲＴ１ Ｒａｂｂｉｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」（一次抗体、ａｂｃａｍ社製）、「Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」（二次抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた抗体反応によってサーチュインの検出を行った。これらの結果を図２、図３に示した。

【0068】

図２、図３の結果より、ＵＨＡ１０２８、ＵＨＡ４００２、ＵＨＡ９０２１いずれにおいてもレスベラトロールよりもサーチュインタンパク質発現量が増強されたことがわかる。

【図1】

【図2】

【図3】