特許 5773535 インターフェロンに非応答性のＨＣＶ患者の治療のための医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5773535

(24)【登録日】2015年7月10日

(45)【発行日】2015年9月2日

(54)【発明の名称】インターフェロンに非応答性のＨＣＶ患者の治療のための医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61P 31/14 20060101AFI20150813BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20150813BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150813BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150813BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20150813BHJP

   A61K 31/7056 20060101ALI20150813BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20150813BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20150813BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20150813BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20150813BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20150813BHJP

【ＦＩ】

   A61P31/14

   A61P1/16

   A61P29/00

   A61P43/00 121

   A61K37/66 G

   A61K37/66 F

   A61K31/7056

   A61K31/7088

   A61K31/7105

   A61K31/711

   A61K45/00

   C12N15/00 GZNA

【請求項の数】16

【全頁数】101

(21)【出願番号】特願2012-506632(P2012-506632)

(86)(22)【出願日】2010年4月26日

(65)【公表番号】特表2012-524539(P2012-524539A)

(43)【公表日】2012年10月18日

(86)【国際出願番号】IB2010051822

(87)【国際公開番号】WO2010122538

(87)【国際公開日】20101028

【審査請求日】2013年3月11日

(31)【優先権主張番号】61/172,486

(32)【優先日】2009年4月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504013269

【氏名又は名称】ロシュ・イノベーション・センター・コペンハーゲン・アクティーゼルスカブ

【氏名又は名称原語表記】Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ａ／Ｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】エリーザベト・ヒルデブラント−エリクセン

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス・ペトリ

(72)【発明者】

【氏名】サカリ・カウッピネン

(72)【発明者】

【氏名】ニルス・アブラハムセン

(72)【発明者】

【氏名】ロバート・ランフォード

【審査官】 菅原 洋平

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／１１２７５３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００７／１１２７５４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００８／０９５９０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０６−２７９３０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３６２４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５１７４２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２４７８１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ELMEN JOACIM，LNA-MEDIATED MICRORNA SILENCING IN NON-HUMAN PRIMATES，NATURE，２００８年 ４月，V452 N7189，P896

【文献】 Sarasin-filipowicz M. et al.，nature medicine，２００９年 １月，Vol.15, No.1，pp.31-33

【文献】 Tai A.W. et al.，Journal of hepatology，２００９年 ２月，Vol.50，pp.412-420

【文献】 LANFORD ROBERT E，THERAPEUTIC SILENCING OF MICRORNA-122 IN PRIMATES WITH CHRONIC HEPATITIS C VIRUS INFECTION，SCIENCE，２０１０年 １月 ８日，V327 N5962，P198-201

【文献】 JOPLING CATHERINE L，MODULATION OF HEPATITIS C VIRUS RNA ABUNDANCE BY A LIVER-SPECIFIC MICRORNA，SCIENCE，米国，AMERICAN ASSOCIATION FOR ADVANCEMENT OF SCIENCE，２００５年 ９月 １日，V309 N5740，P1577-1581

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＣＶ感染対象におけるＨＣＶ感染の治療のためのマイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストを含む医薬組成物であって、該ＨＣＶ感染対象がインターフェロン非応答者である組成物。

【請求項2】

ＨＣＶ感染対象がさらに有効量のインターフェロンで治療される、請求項１記載の医薬組成物。

【請求項3】

インターフェロンがペグ化インターフェロン−アルファである、請求項２記載の医薬組成物。

【請求項4】

ＨＣＶ感染対象がさらに有効量のリバビリンで治療される、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項5】

対象が肝臓移植患者である、請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項6】

マイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストがマイクロＲＮＡ−１２２を標的とするアンチセンスオリゴマーであり、該オリゴマーが７〜２５連続ヌクレオチド長を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項7】

マイクロＲＮＡ−１２２を標的とするオリゴマーが２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマー、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択されるアフィニティー増強性ヌクレオチドアナログの混合物を含むミキシマーである、請求項６記載の医薬組成物。

【請求項8】

ヌクレオチドアナログが独立して、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される、請求項７記載の医薬組成物。

【請求項9】

オリゴマーが２’フルオロおよび２’ＭＯＥヌクレオチドを含む、請求項８記載の医薬組成物。

【請求項10】

マイクロＲＮＡ−１２２を標的とするオリゴマーがＲＮＡまたはＤＮＡを含まない、請求項７記載の医薬組成物。

【請求項11】

オリゴマーが本質的にＲＮａｓｅＨを動員できない、請求項６〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項12】

オリゴマーがＬＮＡおよびＤＮＡ単位を含む、請求項６記載の医薬組成物。

【請求項13】

オリゴマーが８〜１７ヌクレオチド長である、請求項１２記載の医薬組成物。

【請求項14】

オリゴマーが５’−ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ−３’であり、ここに、大文字はベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位を示し、小文字はＤＮＡ単位であり、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである、請求項６記載の医薬組成物。

【請求項15】

対象が、対象に対する該組成物の少なくとも２回の連続的な投与を含む投与計画に付され、ここに、該少なくとも２回の連続的な投与間の投与間隔は、少なくとも２週であって、２０週以内であってもよい、請求項１〜１４のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項16】

インターフェロン非応答対象をインターフェロン応答性にするための、マイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストを含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、インターフェロン調節遺伝子をダウンレギュレートする薬物に感受性のある患者の治療のための化合物、組成物および方法を提供する。特に、本発明は、マイクロＲＮＡ−１２２の活性を修飾するオリゴヌクレオチドを含む組成物に関連し、該組成物は、例えば霊長類において、例えば治療を必要とするヒトにおいて、細胞中のインターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）をダウンレギュレートするために製造される。本発明は、さらに、本発明の組成物を霊長類、好ましくはヒトに提供する治療法に関連し、ここに、該組成物は、インターフェロン非応答性と考えられるＨＣＶに罹患している個体に投与する。さらに、肝臓移植したインターフェロン治療患者における臓器拒絶の治療のための組成物が提供される。

【背景技術】

【0002】

関連出願
本願は、米国仮出願番号第、６１／１７２，４８６号（２００９年４月２４日出願）の優先権を主張し、出典明示により全体として本明細書の一部とされる。

【0003】

発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界人口の約３％を冒し、しばしば、硬変および肝細胞癌をもたらす。ペグ化（pegylated）インターフェロンおよびリバビリン（ribavirin）による現行の治療法は、深刻な副作用を導き、患者の５０％未満においてウイルス根絶を提供する。

【0004】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、発達および疾患において重要な役割を果たす小型調節ＲＮＡであり^１−３、かくして、治療的介入の標的の可能性のある新規なクラスを代表する^４。げっ歯類におけるｍｉＲＮＡのサイレンシングにおける近年の進歩にもかかわらず^５，６、イン・ビボでのマイクロＲＮＡの配列特異的なアンタゴニズムのための有効かつ安全なアプローチの開発は、今だ、有意な科学的かつ治療的な挑戦である。さらに、霊長類におけるｍｉＲＮＡ拮抗作用の報告はない。ここに、発明者らは、非コンジュゲート型セーライン処方のロックド（Locked）核酸修飾オリゴヌクレオチド（ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ）の単純な全身性デリバリーが、非ヒト霊長類において、肝臓に発現したマイクロＲＮＡ−１２２を効果的に拮抗することを示す。アフリカミドリザルに３または１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲを静脈内注射により急性投与すると、霊長類肝細胞の細胞質におけるＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの取り込みおよびＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲとｍｉＲ−１２２との間の安定なヘテロ２本鎖の形成がもたらされた。これには、成熟ｍｉＲ−１２２の涸渇および血漿コレステロールの用量依存性低下が不随した。ｍｉＲ−１２２の効率の良いサイレンシングは、霊長類において、１０ｍｇ／ｋｇ ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの３回の投与により、研究動物においてＬＮＡ−関連毒性または組織病理学的変化のいずれの証拠も伴わずに、全血漿コレステロールの長期かつ可逆的な減少を導くことによって達成された。発明者らの知見は、げっ歯類及び霊長類におけるマイクロＲＮＡ機能の研究において、全身的に投与されたＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲｓの有用性を明らかにし、疾患に関連するマイクロＲＮＡのための新規なクラスの治療剤としてかかる化合物の可能性を支持する。ＭｉＲ−１２２は、肝臓特異的マイクロＲＮＡであり、脊椎動物内でよく保存されている。ＭｉＲ−１２２は、コレステロール代謝に関与し（Ｅｓａｕら、２００５）、近年、ｍｉＲ−１２２が培養細胞においてＣ型肝炎（ＨＣＶ）複製に重要であることが示された（Ｊｏｐｌｉｎｇら、２００５）。

【0005】

ｍｉＲ−１２２の配列は、種々の哺乳動物種間でよく保存されている（ｍｉｒｂａｓｅ， Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， ＵＫ）。
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ ＭＩＭＡＴ００００４２１
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ
＞ｍｍｕ−ｍｉＲ−１２２ ＭＩＭＡＴ００００２４６
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ
＞ｒｎｏ−ｍｉＲ−１２２ ＭＩＭＡＴ００００８２７
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ
＞ｄｒｅ−ｍｉＲ−１２２ ＭＩＭＡＴ０００１８１８
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ
＞ｘｔｒ−ｍｉＲ−１２２ ＭＩＭＡＴ０００３５８５
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵ
＞ｇｇａ−ｍｉＲ−１２２ ＭＩＭＡＴ０００１１９０
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵ
＞ｂｔａ−ｍｉＲ−１２２ ＭＩＭＡＴ０００３８４９
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ

【0006】

Ｊｏｐｌｉｎらはまた、オリゴヌクレオチドによるｍｉＲ−１２２の遮断が、イン・ビトロでのＨＣＶゲノム複製を阻害することを示す。ｍｉＲ−１２２は、ウイルスの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲにおいて標的配列と相互作用し、これらの部位における変異がウイルス複製を減少させる。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ ｍｉＲ−１２２標的部位はどちらも、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２、３、４、５、および６において保存されている。このことは、ｍｉＲ−１２２を遮断することによって、全てのＨＣＶ遺伝子型複製を減少させることができることを示唆する。また、近年、遺伝子型２の複製が、ｍｉＲ−１２２を標的とすることによって相補的オリゴヌクレオチドで遮断されることが示されている（Ｒａｎｄａｌｌら、ＰＮＡＳ ２００７）。全感染者の約７０％が慢性感染を確立する。ＨＣＶに対する現行の抗ウイルス治療は、インターフェロンとリバビリンの組み合わせからなり、幾人かの患者には効果的であるが、大多数は、該治療に非応答性であるか、または耐容性がない。したがって、ＨＣＶのための新規な治療法に対する要望が存在する。本発明は、インターフェロンによる治療に応答しないＨＣＶ患者のための新規な治療を提供し、ここに、有効量のｍｉＲ−１２２阻害剤を該患者に提供する。提供される治療は、ＨＣＶの完全な複製に必要な内在性宿主因子ｍｉＲ−１２２の減少を導き、さらに、インターフェロン調節遺伝子転写産物の発現を修正する。

【0007】

大多数のＨＣＶ感染患者は、インターフェロン治療に応答しないので、インターフェロン治療の代わりとなる、またはかかる治療に患者を応答させることのできる新規な治療法が必要である。いくつかのインターフェロン刺激遺伝子転写産物の治療前肝臓レベルと治療に対するウイルス学的応答との間に逆相関が観察された（Ｃｈｅｎら、２００５， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １２８； １４３７−１４４４）。特に、インターフェロンに対する抗ウイルス応答を欠くＨＣＶ感染チンパンジーの肝臓において、該肝臓におけるＩＦＮに対するインターフェロン−ガンマ誘導性プロテイン−１０（ＩＰ−１０またはＣＸＣＬ１０）転写応答の欠失を観察することができる（Ｌａｎｆｏｒｄら、２００７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ４６， ９９９−１００８）。さらに、Ｌａｎｆｏｒｄは、ＨＣＶ感染チンパンジーにおける基底レベルのＩＰ−１０転写産物が、非感染動物における基底レベルよりも有意に高いことを示した。より一般的には、Ｌａｎｆｏｒｄは、いくつかのＩＲＧ（ここでは、ＨＣＶ感染肝臓におけるインターフェロン刺激遺伝子という）の誘導欠損を示す。リバビリンは、Ｆｅｌｄら^２６ ２０１０によって、ＩＲＧの誘導増加により、ＰＥＧ−インターフェロンに対する応答を増加することが示された。しかしながら、リバビリンをインターフェロンと組み合わせた場合に見られた応答増加のサイズは、単独投与時のインターフェロンに対する初期応答のサイズと相関し（ＨＣＶ ＲＮＡの減少に関して）、その結果、インターフェロンに対する良好な応答の場合よりもあまり効果的でない乏しい応答が増強された。故に、患者におけるインターフェロン治療に対する乏しい初期応答は、リバビリンを該治療に加えた場合、該応答の比較的乏しい増強をもたらすであろう。したがって、インターフェロン非応答者（低い応答を示すか、または全く応答を示さない）は、正常な応答者によって経験される利益と比べてわずかしかリバビリンが有効ではないので、リバビリンは、インターフェロン非応答者を応答性になるように変化させる化合物または化合物群を提供するという問題の解決策ではない。インターフェロンアルファはＨＣＶ感染患者において選択される主要な治療であるが、肝臓移植レシピエントにおける再発性Ｃ型肝炎の治療にも重要である。しかしながら、インターフェロンでのかかる治療の可能性のある深刻な副作用の一つは、急性及び慢性の拒絶であり、次いで、移植片が喪失される（Ｗａｌｔｅｒら、２００７， Ａｍｅｒｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ７， １７７−１８４）。移植後のＨＣＶ再発は万国共通であり、ＨＣＶ感染は、患者および移植片生着を損なう。ＨＣＶ移植片疾患の進行は、免疫コンピーテント患者と比べて、移植レシピエントにおいて加速する（Ｓａｍｕｅｌ， Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ １０， Ｎｏ ７ （ Ｊｕｌｙ）， ２００４： ｐｐ ８６８-８７参照）。インターフェロン調節ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）の高発現は、腎臓移植拒絶の前兆となることが示された（Ｍａｔｚら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （２００６） ６９， １６８３-１６９０）。Ｋｒｕｋｅｍｅｙｅｒら（２００４， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ｖｏｌ ７８， ６５−７０）は、拒絶された肝臓移植片におけるＩＰ−１０の発現上昇を明らかにした。したがって、インターフェロン応答性遺伝子転写産物発現、例えばＩＰ−１０の発現を細胞中、例えば、移植器官、すなわち移植肝臓中、すなわちＨＣＶ患者の移植肝臓中において、正常化に向けて調節する治療が必要である。さらに、本発明の知見は、本発明の抗マイクロＲＮＡ−１２２オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を製造することができ、該組成物が細胞、例えば、霊長類細胞に投与するために製造され、該投与がインターフェロン応答性遺伝子、例えばＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）の発現レベルを正常レベルに改変して、ＨＣＶ感染個体におけるインターフェロンに対する非応答を予防し、または臓器移植拒絶を予防することを示す。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

発明の概要
本発明は、ＨＣＶ感染対象におけるＨＣＶ感染の治療のためのマイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストを提供し、ここに、該ＨＣＶ感染対象はインターフェロン非応答性である。本発明は、ＨＣＶ感染対象におけるＨＣＶ感染の治療のための医薬の調製または製造におけるマイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストの使用を提供し、ここに、該ＨＣＶ感染対象はインターフェロン非応答性である。本発明は、インターフェロン非応答者におけるＨＣＶ感染の治療方法を提供し、該方法は、有効量のマイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストを該インターフェロン非応答者に投与することを含む。

【0009】

本発明は、インターフェロン調節遺伝子、例えば、限定するものではないが、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４をダウンレギュレートする薬物に感受性の患者の治療方法およびかかる治療のための組成物を提供する。特に、本発明は、マイクロＲＮＡ−１２２の活性を修飾するオリゴヌクレオチドの有効投与量を含む組成物であって、細胞中、例えば霊長類において、例えば治療を必要とするヒトにおいて、インターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）のダウンレギュレーションを容易にするために製造される組成物に関する。ＩＲＧのダウンレギュレーションは、臓器移植拒絶を予防するために、およびインターフェロン非応答性ＨＣＶ患者をインターフェロン応答性にするために、有益である。本発明は、さらに、本発明の組成物を細胞に、例えば霊長類、好ましくはヒトにおいて提供する治療方法に関し、ここに、該組成物は、インターフェロン非応答者と考えられるＨＣＶに罹患している個体への投与のために製造される。さらに、肝臓移植したインターフェロン治療患者において臓器拒絶の治療のための組成物が提供される。特に、本発明は、かかる方法および組成物であって、マイクロＲＮＡ、短い非コーディングＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはウイルス性ゲノムの活性のモジュレーターが霊長類、例えば、ヒトに投与され、該維持量の投与が各投与間の長期の投与間隔で起こる方法および組成物に関する。好ましい具体例において、マイクロＲＮＡ、短い非コーディングＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはウイルス性ゲノムの活性のモジュレーターは、オリゴヌクレオチドを含む。好ましい具体例において、該化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈによって切断されないアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明は、マイクロＲＮＡ−１２２の活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる霊長類における研究に基づき、ここに、非常に長期の効果が血中コレステロールレベルおよびＣ型肝炎ウイルス力価の両方に見られる。

【0010】

本発明の組成物は、いくつかの具体例において、ＨＣＶ感染のための既存の治療、例えば、限定するものではないが、インターフェロンアルファ、および／またはリバビリンと組み合わせて使用するために製造される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲによる、正常および高コレステロール血症マウスにおけるｍｉＲ−１２２機能のサイレンシング。ａ，直接的ｍｉＲ−１２２標的アルドラーゼＡの抑制解除（derepression）（ＧＡＰＤＨに対して正規化，平均およびＳＥＭ，ｎ＝５）。完全ホスホロチオエート骨格（ＰＳ）、混合型ホスホロチオエート／ホスホジエステル骨格（ＰＳ／ＰＯ）または非修飾ホスホジエステル（ＰＯ）骨格を有するＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲで処理したマウス由来の肝臓ＲＮＡのノーザンブロット。ノーザンブロットは、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲについてプローブし、ｍｉＲ−１２２について再プローブした。ｂ，完全ホスホロチオエート骨格（ＰＳ）（（ａ）と同じ試料）、混合型ホスホロチオエート／ホスホジエステル骨格（ＰＳ／ＰＯ）または非修飾ホスホジエステル（ＰＯ）骨格を有するＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲで処理したマウス由来の肝臓ＲＮＡのノーザンブロット。ノーザンブロットは、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲについてプローブし、ｍｉＲ−１２２について再プローブした。直接的ｍｉＲ−１２２標的アルドラーゼＡ（（ａ）におけるものと同じ試料，ＧＡＰＤＨに対して正規化，平均およびＳＥＭ，ｎ＝５）の抑制解除。ｃ，ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの１〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲の単一ｉ．ｐ．投与で処理後のマウスにおける全血漿コレステロール（平均およびＳＥＭ，ｎ＝５，１ｍｇ／ｋｇ ｎ＝４）。ｄ，セーライン、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲまたはＬＮＡミスマッチ対照を各々、６週に渡って週に２回５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐの投与量で処理した高コレステロール血症マウスにおける全コレステロールレベル（平均およびＳＥＭ，ｎ＝１０，セーライン ｎ＝９）。ｅ，ｍｉＲ−１２２ノーザンブロット（（ｄ）におけるのと同じ試料）。ｆ，アルドラーゼＡ ｍＲＮＡの定量化（（ｅ）と同じ試料，平均およびＳＥＭ，ｎ＝１０，セーライン ｎ＝９）。ｇ，肝臓ｍＲＮＡ発現プロフィールの管理されていないクラスタリング（（ｄ）におけるのと同じ試料）。ｈ，対照と比べた、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処理マウスにおける肝臓ｍＲＮＡの発現変化。ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲにおける種々の型の規範的ｍｉＲ−１２２シードマッチの存在／非存在によってグループ化される。シードマッチを伴わないｍＲＮＡからの分離を示し（挿入）、全型の部位について有意であった（各々、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ−１Ａ、７ｍｅｒ−ｍ８および８ｍｅｒ部位について、ｐ−値１．４ １０^−６， ２．２^＊１０^−１３、＜１０^＊−１５、および２．４^＊１０^−１４（ＫＳ−テスト）。

【図2】ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲによる、非ヒト霊長類におけるｍｉＲ−１２２のサイレンシング。ａ，ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲまたはセーラインで３回、ｉ．ｖ注射により５日に渡って処理されたアフリカミドリザルにおける全血漿コレステロールレベル（矢印）（１群あたりｎ＝５）。ｂ，Ｌｏｗｅｓｓ−平滑化およびｌｏｇ２−変換したセーライン対照群に対して正規化された（ａ）におけるコレステロールデータの傾向プロット。ｃ，６日目および９６日目に実施した肝臓生検由来のサル肝臓ＲＮＡ試料のノーザンブロット分析。ｄ，６日目肝臓生検（（ｃ）におけるのと同じ動物）におけるＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲのイン・サイチュ検出。ｅ，肝細胞におけるＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの細胞質局在化（６日目、１０ｍｇ／ｋｇ）。

【図3】非ヒト霊長類において、ＬＮＡ−媒介性ｍｉＲ−１２２サイレンシングは安全である。ａ，セーラインまたは３ｘ１０ｍｇ／ｋｇ ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲでの処理後にアフリカミドリザルで評価されたプロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、全ビリルビンおよびクレアチニンレベル。ｂ，６日目の肝臓生検由来のヘマトキシリンおよびエオシン染色された切片の顕微鏡写真。

【図4】ＨＣＶ感染チンパンジーにおけるウイルス力価のＡｎｔｉｍｉＲ−１２２媒介性ダウンレギュレーション。チンパンジー４ｘ０３５８、低用量動物は、ウイルス血症のレベルが下がり始めた７０日目までウイルス力価の有意な減少を示さず、１７５日目、最後の投与後１２週までベースライン以下のままであった。ウイルス力価における最大減少は、ｄ１０５で起こり、３４倍の減少であった。ウイルス血症は、研究期間の最後、２１０日目までに、ベースライン値より１．８倍低い値に戻った。 チンパンジー４ｘ０５１３、高用量動物は、２８日目以降にウイルス力価が減少し始めた。該動物は、一貫したウイルス血症の減少を示し、ウイルス血症における３９５倍の減少を伴って９８日目に最大減少が起こった。ウイルス血症は、ベースライン以下のままであり、研究の最後までにベースラインの７．７倍以内の範囲にゆっくりと増加していた。 チンパンジー４ｘ０５１４、高用量動物は、４ｘ０５１３と類似のプロフィールを示した。ウイルス血症の一貫した減少は２８日目に開始し、持続し、ウイルス血症における３１７倍の減少を伴って９２日目に最大減少が起こった。４ｘ０５１３と同様に、次いで、ウイルス血症は低いままであり、研究の最後までにベースライン値までゆっくりと増加した。

【図5】ＨＣＶ感染チンパンジーの肝臓におけるｍｉＲ−１２２阻害は、インターフェロン調節遺伝子の発現における改変を導く。図４におけるようなチンパンジー研究由来のデータ。Ａ．４匹のＨＣＶ感染チンパンジーにおけるインターフェロン応答遺伝子の管理した分析は、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ−１２２化合物での処理に応答して、ウイルス力価およびインターフェロン応答遺伝子転写産物レベルの両方が影響を受けたことを示した。 Ｂ．ＬＮＡ ａｎｔｉｍｉＲ−１２２化合物での処理の時間経過の測定値としての、４匹のＨＣＶ感染チンパンジーの肝臓におけるＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）のレベル。 Ｃ．ＬＮＡ ａｎｔｉｍｉＲ−１２２化合物での処理の時間経過の関数としての、２匹のＨＣＶ感染チンパンジーにおけるＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）の血漿レベル。

【発明を実施するための形態】

【0012】

発明の詳細な説明
本発明は、細胞または生物（対象、例えば、霊長類、例えば、ヒト）、例えば、ＨＣＶに感染した細胞、または例えば、肝臓移植した対象における細胞の治療のための、有効投与量のｍｉＲ−１２２を標的とするアンチセンスオリゴマーを含む組成物およびかかる組成物を用いる治療方法に関する。

【0013】

いくつかの具体例において、ＨＣＶ感染対象は、さらに、有効量のインターフェロンで治療される。いくつかの具体例において、インターフェロンは、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）インターフェロン−アルファである。いくつかの具体例において、ＨＣＶ感染対象は、さらに、有効量のリバビリンで治療される。いくつかの具体例において、対象は、肝臓移植患者である。いくつかの具体例において、マイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストは、マイクロＲＮＡ−１２２を標的とするアンチセンスオリゴマーであり、ここに、該オリゴマーは、７〜２５連続ヌクレオチド長を有する。いくつかの具体例において、マイクロＲＮＡ−１２２を標的とするオリゴマーは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマー、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択されるアフィニティー増強性ヌクレオチドアナログの混合物を含むミキシマー（mixmer）である。いくつかの具体例において、該ヌクレオチドアナログは、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの具体例において、該オリゴマーは、２’フルオロおよび２’ＭＯＥヌクレオチドを含む。いくつかの具体例において、該マイクロＲＮＡ−１２２を標的とするオリゴマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含まない。請求項６〜１０のいずれか１項に記載のマイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストは、本質的にＲＮａｓｅＨを動員（recruit）できないオリゴマーである。いくつかの具体例において、該オリゴマーは、ＬＮＡおよびＤＮＡ単位を含む。いくつかの具体例において、該オリゴマーは、８〜１７ヌクレオチド長である。いくつかの具体例において、該オリゴマーは、５’−ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ−３’であり、ここに、大文字はＬＮＡ、例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位を示し、小文字はＤＮＡ単位を示し、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであってもよく、いくつかの具体例において、全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。いくつかの具体例において、対象は、該オリゴマーまたは組成物の対象への少なくとも２回の連続的な投与を含む投与計画に付され、ここに、該少なくとも２回の連続的な投与間の投与間隔は、少なくとも２週、所望により、２０週以下である。いくつかの具体例において、該対象は霊長類、例えばヒトである。いくつかの具体例において、該対象は、インターフェロン治療に対して乏しい応答者、例えば、インターフェロン非応答者、緩慢な応答者、部分的応答者、または再発者である。いくつかの具体例において、該対象は、臓器、例えば、肝臓移植インターフェロン治療患者である。いくつかの具体例において、本発明は、臓器移植対象の治療法に関し、ここに、該対象は、高発現レベルのＩＲＧ、例えば、高発現レベルのＩＰ−１０を示す。

【0014】

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を有する患者の多数は、インターフェロンでの標準的な治療にあまり応答しない。例えば、非応答者および再発者が米国におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者の大集団を構成している。本発明の目的のために、「非応答者」なる語は、いくつかの非限定的な具体例において、インターフェロン治療の結果として有意なウイルス学的応答を示さず、治療期間のいずれの時点においても決してウイルス陰性にならないＨＣＶ−感染対象、例えば、ＨＣＶ−感染霊長類、例えば、ＨＣＶ−感染ヒトを意味する。「前治療」は、限定するものではないが、下記のＣ型肝炎抗ウイルス計画、すなわち、標準的なインターフェロン（ＩＦＮ）単独治療、リバビリン（ＲＢＶ）との標準的なＩＦＮ組み合わせ治療、ペグ化ＩＦＮアルファ−２ａ単独治療、ペグ化ＩＦＮアルファ−２ｂ単独治療、ＲＢＶとのペグ化ＩＦＮアルファ−２ａ組み合わせ治療、ＲＢＶとのペグ化ＩＦＮアルファ−２ｂ組み合わせ治療のいずれかを含むことができる。「緩慢な応答者」なる語は、インターフェロン治療での処置開始後約２４週までウイルス学的応答を発現しないＨＣＶ−感染対象、例えば、ＨＣＶ−感染霊長類、例えば、ＨＣＶ−感染ヒトをいう。「部分的応答者」は、インターフェロン治療での処置開始後約２４週までウイルス学的応答を発現しないが、ウイルス学的応答が該処置の最後に維持されないＨＣＶ−感染対象、例えば、ＨＣＶ−感染霊長類、例えば、ＨＣＶ−感染ヒトをいう。「再発者」は、ＨＣＶ ＲＮＡ陰性であって、処置の最後までずっと維持されるウイルス学的応答を有するが、処置後６ヶ月より前に再発が起こるＨＣＶ−感染対象、例えば、ＨＣＶ−感染霊長類、例えば、ＨＣＶ−感染ヒトをいう。「非応答者」、「緩慢な応答者」、「部分的応答者」および「再発者」は、必ずしも相互に両立しないわけではない。

【0015】

いくつかの具体例において、細胞または生物、例えば、霊長類、例えば、ヒトにおける細胞中のインターフェロン応答遺伝子転写産物の発現を調節するための組成物が製造される。いくつかの態様において、インターフェロン応答遺伝子転写産物は、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４のいずれか１つまたはそれ以上である。

【0016】

いくつかの具体例において、インターフェロンでの治療に応答しない、ゆっくりと応答する、部分的に応答する、または該治療後に再発するＨＣＶに感染した細胞、例えば、対象をインターフェロン治療に対して応答性にするために、該細胞または対象の治療のための組成物が製造される。

【0017】

一の具体例において、ＨＣＶに感染した対象の治療のための組成物であって、併用するとａｎｔｉｍｉｒ−１２２化合物がウイルス力価に対して相加効果を有するであろう第２の化合物と共に投与するための組成物が製造される。

【0018】

一の具体例において、上記具体例の第２の化合物は、インターフェロンである。一の具体例において、１以上の他の化合物、例えば、インターフェロンまたはリバビリンと共に使用するための組成物が製造される。

【0019】

一の具体例において、ａｎｔｉｍｉＲ−１２２化合物ならびに第２または第２および第２の化合物は、同じ処方中にある。一の具体例において、ａｎｔｉｍｉＲ−１２２化合物ならびに第２または第２および第３、または他の化合物は、別々の処方中にある。

【0020】

一の具体例において、本発明の組成物は、肝臓中のＩＰ−１０レベルが上昇した対象の治療のために製造される。

【0021】

一の具体例において、本発明の組成物は、対象におけるＨＣＶ感染を治療する方法において使用するために製造される。一の具体例において、本発明の組成物は、肝臓移植患者における移植拒絶を治療する方法において使用するために製造される。一の具体例において、本発明の組成物は、インターフェロンでの治療下にある肝臓移植患者において移植拒絶を治療する方法において使用するために製造される。一の具体例において、本発明の組成物は、臓器移植拒絶を治療する方法において使用するために製造される。一の具体例において、本発明の組成物は、高レベルのＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）発現を有する対象において臓器移植拒絶を治療する方法において使用するために製造される。

【0022】

一の具体例において、対象における臓器移植片拒絶のリスクを評価するための手段として、インターフェロン調節遺伝子産物の分泌を測定するキットが提供される。一の具体例において、該キットは、尿中のかかるＩＲＧ産物の存在を検出するために製造される。一の具体例において、ＩＲＧ産物は、表５に挙げられる遺伝子から生産されるものから選択される。一の具体例において、該キットは、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４の１以上を検出するために製造される。一の具体例において、該キットは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡｅｌｉｓａ）アッセイを提供する。一の具体例において、該キットは、定量的逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲアッセイを提供する。一の具体例において、該キットは、移植片拒絶のリスクの評価を可能とするために、ＩＲＧ転写産物またはタンパク質の定量化手段を提供し、さらに、移植片拒絶の予防のための本発明の医薬組成物を提供する。一の具体例において、該キットは、肝臓移植対象における移植片拒絶のリスクの評価を可能とするために、ＩＲＧ転写産物またはタンパク質の検出のために製造され、さらに、かかる移植片拒絶の予防のための本発明の医薬組成物を提供する。さらに、一の具体例において、対象は、肝臓移植を経験しており、ＨＣＶ感染に罹患しているかまたは罹患したことがある。

【0023】

いくつかの具体例において、該組成物は、投与によって有効投与量のａｎｔｉｍｉＲ−１２２化合物を提供しうる（ここに、治療の維持は、反復投与によって提供され、各維持投与間の間隔が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日である）。

【0024】

いくつかの具体例において、該組成物は、各投与（すなわち、投与量、例えば、有効投与量）間に長時間の間隔をおいた投与によって治療を維持するために製造される。投与計画は、該オリゴマーまたは組成物の対象への少なくとも２回の連続的な投与を含み、ここに、該少なくとも２回の連続的な投与間の投与間隔は、少なくとも２週、所望により２０週以下である。いくつかの具体例において、該組成物は、単位投与形態、例えば、対象への単回投与の全部または一部を形成する各単位投与量である。

【0025】

したがって、いくつかの具体例において、本発明は、対象、例えば、霊長類、例えば、ヒトにおいてイン・ビボでＲＮＡ標的の活性を低下させる方法を提供し、ここに、該方法は、該ＲＮＡ標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも２回の投与量の投与を含み、ここに、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的にＲＮＡｓｅＨを動員できず、少なくとも２回の投与量は、各投与間に少なくとも２週の間隔をおいて該霊長類に投与される。

【0026】

したがって、いくつかの具体例において、本発明は、対象、例えば、霊長類、例えば、ヒトにおいてイン・ビボでＲＮＡ標的の活性を低下させる方法を提供し、ここに、該方法は、該ＲＮＡ標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも２回の投与量の投与を含み、ここに、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、トータルマー（totalmer）またはミキシマーであり、少なくとも２回の投与量は、各投与間に少なくとも２週の間隔をおいて該霊長類に投与される。

【0027】

いくつかの態様において、該少なくとも２回の投与は、アンチセンスオリゴマーの維持投与量、例えば、対象、例えば、霊長類、例えば、ヒト、例えば、標的組織において該オリゴマーの有効濃度を維持するのに十分な投与量である。

【0028】

投与回数は、２より多く、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれ以上の処置であってもよい。本明細書中に記載されるように、実際の投与回数は、例えば、疾患または障害の性質に依存するであろう。治療されうる疾患は、投与計画に対して明確な終点を提供し、一方、疾患または障害は、延長期間にわたって治療されてもよく、いくつかの具体例において、治癒を提供しなくてもよいが、有効に症状を制御する。かかる例において、治療がもはや望まれないと医者によって決定されるまで、ルーチン／規則的な投与を数ヶ月または数年続けてもよい。注目すべきことには、いくつかの具体例において、投与計画は、治療休止、例えば、１２５日を超える期間、またはいくつかの具体例において、２、３、５または６ヶ月以上の期間中断されてもよい。

【0029】

さらに、いくつかの具体例において、本発明は、本質的にＲＮＡｓｅＨを動員できないアンチセンスオリゴマー、例えば、トータルマーまたはミキシマーを含む組成物であって、患者の治療を維持するために製造され、投与量、例えば維持投与量が各投与間に長期の間隔をあけて提供される組成物に関する。

【0030】

本発明は、いくつかの態様において、霊長類における疾患または障害を治療するための医薬の製造における抗マイクロＲＮＡ−１２２オリゴヌクレオチドの使用であって、ここに、該疾患または障害がマイクロＲＮＡ−１２２のダウンレギュレーションに感受性であることによって特徴付けられる使用を提供する。

【0031】

本発明は、いくつかの態様において、霊長類におけるマイクロＲＮＡ−１２２の活性を低下するための、例えば、限定するものではないが、インターフェロンでの治療に応答しないＣ型肝炎感染対象から選択される疾患、および例えば、臓器移植拒絶、例えな、肝臓移植拒絶の予防のための医薬の製造における抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用を提供する。

【0032】

さらに、本発明は、いくつかの具体例において、本明細書中に記載のオリゴマー、例えば、トータルマーまたはミキシマーおよびかかるオリゴマーを含有する組成物を用いる治療法であって、該オリゴマーまたは組成物の少なくとも２回の独立した投与を含み、該オリゴマーまたは組成物の対象への少なくとも２回の連続的な投与間の投与間隔が少なくとも２週、所望により２０週以下である治療法に関する。該組成物および方法は、典型的には、霊長類、例えばヒトにおいて使用するためのものである。したがって、該対象は、霊長類、例えばヒトであってもよく、該治療を必要とする患者であってもよい。

【0033】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）は、標的ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域との塩基対合によって、タンパク質コーディング遺伝子の発現を翻訳後に抑制する〜２２ｎｔ内在性非コーディングＲＮＡである^{１，２，７}。新たな証拠は、動物ｍｉＲＮＡが多くの生物学的プロセスの調節において重要な役割を果たすことを示唆する^{１−３，８}。さらに、ｍｉＲＮＡは、ウイルス感染、心血管疾患、および神経学的および筋肉障害、ならびに癌の発症および進行に関係している^９−１９。マイクロＲＮＡ−１２２は、コレステロールおよび脂質代謝^５，６、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）複製^{１４，２０}に関係する肝臓発現ｍｉＲＮＡであり、高コレステロール血症およびＣ型肝炎感染の治療のための可能性のある治療標的としてｍｉＲ−１２２を強調する。マイクロＲＮＡ−１２２と疾患との間の既知の相関の例を表１に挙げる。しかしながら、いずれかの特定の理論に限定されるべきではないが、インターフェロン治療に非応答性のＨＣＶ患者が上昇レベルのＩＲＧ転写産物を示し、したがって、明らかにウイルス複製に対する効果欠如に関連するので、該転写産物の存在が同様にウイルス複製に対する他の化合物の効果を防ぐと推測してもよい。したがって、さらに、インターフェロン非応答性、緩慢な応答性、部分的応答性または再発性対象においてウイルス複製に対して効果的であるために、化合物は、かかる患者においてＩＲＧを正常化に向けて調節することができるべきであると推測できる。本発明は、ウイルスゲノムに対するｍｉＲ−１２２の直接的作用を介して、およびさらに霊長類におけるＩＲＧの発現を修正するためのいまだ未知のメカニズムを介して、ＨＣＶ複製を阻害することのできるａｎｔｉｍｉＲ−１２２化合物を提供する。特に、ＩＰ−１０の発現は、ＨＣＶ感染チンパンジー（インターフェロン非応答者である）の本発明の組成物での治療によって減少される。さらに、ＨＣＶ感染チンパンジーの本発明の組成物での治療は、表５におけるＩＲＧのほとんどの発現の減少を導き、インターフェロン非応答性、緩慢な応答性、部分的応答性または再発性対象の治療のための、または対象のインターフェロン治療応答能を変化させるための、または臓器移植対象における移植片拒絶の予防のための本発明の組成物および方法の使用の可能性を示す。

【0034】

まとめると、発明者らの結果は、マウスおよび非ヒト霊長類における非コンジュゲート型高アフィニティーＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドの投与によるｍｉｒ−１２２の強力な拮抗作用を実証する。ｍｉＲ−１２２を拮抗する治療的価は、２つの種において推定され、ここに、週２回５ｍｇ／ｋｇ ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲを注射する高コレステロール血症マウスの治療および３または１０ｍｇ／ｋｇ ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲを３回ｉ．ｖ．注射するアフリカミドリザルの治療は、ＬＮＡ−関連毒性のいかなる証拠も伴わずに、血漿コレステロールの有効かつ長期持続性減少をもたらした。さらに、発明者らは、ｍｉＲ−１２２の阻害がチンパンジーにおけるＣ型肝炎ウイルスレベルの長期持続性ダウンレギュレーションを導くことを示すことに成功した。発明者らの結果から、これらの長期持続性効果は、コレステロールレベルおよびＣ型肝炎レベルの両方に対する長期持続性効果を有するｍｉＲ−１２２ケースにおいて見られるように、疾患関連ではなく、むしろ、マイクロＲＮＡ活性の調節に関連することが明らかである。ＬＮＡオリゴマーのよるｍＲＮＡ調節に対する効果の長さは、通常、本実験において見られる場合の約３分の１のみであるので、マイクロＲＮＡを標的とする場合に見られる効果は、ＬＮＡオリゴマーの使用に関連しないようである。さらに、発明者らの結果は、霊長類に投与する場合、ＲＮａｓｅＨによって切断されないアンチセンスオリゴヌクレオチドの長期の効果を実証する。

【0035】

本発明のマイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストは、限定するものではないが、下記するように、ｍｉＲ−１２２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する化合物である。

【0036】

いくつかの具体例において、ａｎｔｉｍｉＲ−１２２化合物は、マイクロＲＮＡ−１２２を標的とするアンチセンスオリゴマーである。

【0037】

いくつかの具体例において、ａｎｔｉｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドは、本質的にＲＮＡｓｅＨを動員できないミキシマーとして設計される。本質的にＲＮＡｓｅＨを動員できないオリゴヌクレオチドは、文献においてよく知られている（例えば、ＷＯ２００７／１１２７５４、ＷＯ２００７／１１２７５３またはＷＯ２００９／０４３３５３参照）。ミキシマーは、アフィニティー増強性ヌクレオチドアナログ、例えば、限定するものではないが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマー、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡの混合物を含むように設計されうる。さらなる具体例において、該オリゴヌクレオチドは、いずれのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドも包含せず、アフィニティー増強性ヌクレオチドアナログのみからなり、かかる分子は、トータルマーとも呼ばれる。いくつかの具体例において、該ミキシマーは、単に、１つの型のアフィニティー増強性ヌクレオチドアナログをＤＮＡおよび／またはＲＮＡと共に含むだけである。いくつかの具体例において、該オリゴヌクレオチドは、１以上の型のヌクレオチドアナログ、例えば、限定するものではないが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマー、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡのみからなる。

【0038】

長さ
いくつかの具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７〜２５（連続）ヌクレオチド、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４（連続）ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７〜１０（連続）ヌクレオチド長を有し、またはいくつかの例において、７〜１６ヌクレオチド長である。いくつかの具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも８（連続）ヌクレオチド長、１０−１７または１０〜１６または１０〜１５（連続）ヌクレオチド長、例えば、１２〜１５（連続）ヌクレオチド長である。

【0039】

本質的にＲＮＡｓｅＨを動員できないオリゴマー
ＥＰ １ ２２２ ３０９は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのイン・ビトロ方法を提供し、それは、ＲＮａｓｅＨ動員能を決定するために使用されうる。オリゴマーは、相補性ＲＮＡ標的と共に提供される場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、ＥＰ １ ２２２ ３０９の実施例９１〜９５に提供される方法を用いて、等価のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチド（２’置換を有さず、該オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する）の少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％未満の初速度を有すれば、ＲＮａｓｅＨを動員できると考えられる。

【0040】

いくつかの具体例において、オリゴマーは、相補性ＲＮＡ標的およびＲＮａｓｅＨと共に提供される場合、ＲＮａｓｅＨ初速度が、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、ＥＰ １ ２２２ ３０９の実施例９１〜９５に提供される方法を用いて、等価のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチド（２’置換を有さず、該オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する）を用いて決定された初速度の１％未満、例えば５％未満、例えば１０％未満または２０％未満であれば、本質的にＲＮａｓｅＨを動員できないと考えられる。

【0041】

ミキシマーまたはトータルマーであるオリゴヌクレオチドは、通常、本質的にＲＮＡｓｅＨを動員できないと考えられるべきであり、ここに、発明者らは、本質的にＲＮａｓｅＨを動員できないという用語を用い、いくつかの具体例において、かかる用語は、いくつかの例において、例えば、ＤＮＡミキシマーをアルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡと共に用いた場合、かかるオリゴマーが実際には、ＲＮａｓｅＨを動員する有意な能力を有したとしても、本明細書中で定義されるミキシマーまたはトータルマーなる用語で置き換えてもよい。

【0042】

いくつかの具体例において、該オリゴマーまたはその連続したヌクレオチド配列は、ヌクレオチドアナログ、例えば、アフィニティー増強性ヌクレオチドアナログの連続した配列からなる（本明細書中において、「トータルマー」と称する）。

【0043】

トータルマー
トータルマーは、非天然ヌクレオチドのみを含む１本鎖オリゴマーである。

【0044】

該オリゴマーは、トータルマーであってもよい。実際に、種々のトータルマー設計は、特にマイクロＲＮＡを標的とする場合（ａｎｔｉｍｉＲ）、治療的オリゴマーとして、またはスプライススイッチオリゴマー（splice switching oligomer）（ＳＳＯ）として、大いに効果的である。

【0045】

いくつかの具体例において、トータルマーは、少なくとも１つのＸＹＸまたはＹＸＹ配列モチーフ、例えば、反復配列ＸＹＸまたはＹＸＹを含むか、または該モチーフからなり、ここに、ＸはＬＮＡであり、Ｙは別の（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチドアナログ、例えば、２’−ＯＭｅＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位である。上記の配列モチーフは、いくつかの具体例において、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹまたはＹＹＸであってもよい。

【0046】

いくつかの具体例において、トータルマーは、８〜１６個のヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のヌクレオチド、例えば、８〜１２個のヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含むか、または該配列からなっていてもよい。

【0047】

いくつかの具体例において、トータルマーの連続したヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％ＬＮＡ単位を含む。残りの単位は、本明細書中で言及される非−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択されてもよく、例えば、２’−Ｏ＿アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、および２’ＭＯＥ ＲＮＡ単位からなる群、または２’−ＯＭｅ ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位からなる群から選択されうる。

【0048】

いくつかの具体例において、トータルマーは、ＬＮＡ単位のみからなる連続したヌクレオチド配列からなるか、または該ヌクレオチド配列を含む。

【0049】

いくつかの具体例において、トータルマーは、マイクロＲＮＡに対して標的化されていてもよい（すなわち、ａｎｔｉｍｉＲである）−米国仮出願第６０／９７９２１７号および第６１／０２８０６２号、およびＰＣＴ／ＤＫ２００８／０００３４４（全て、出典明示により、全体として、本明細書の一部とする）において言及される。

【0050】

ミキシマー
「ミキシマー」なる語は、天然および非天然のヌクレオチドを含むオリゴマーをいい、ここに、ギャップマー（gapmer）、テールマー（tailmer）、ヘッドマー（headmer）およびブロックマー（blockmer）とは対照的に、５個以上の天然ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ単位からなる連続した配列は存在しない。

【0051】

本発明のオリゴマーは、ミキシマーであってもよい。実際に、種々のミキシマー設計は、特にマイクロＲＮＡを標的とする場合（ａｎｔｉｍｉＲ）、治療的オリゴマーとして、またはスプライススイッチオリゴマー（splice switching oligomer）（ＳＳＯ）として、大いに効果的である。

【0052】

いくつかの具体例において、該オリゴマーは、ミキシマーであってもよく、実際に、ミキシマーが有効かつ特異的にその標的に結合する能力のために、治療的オリゴマーとしてのミキシマーの使用は、標的ＲＮＡを減少させるのに特に有効であると考えられる。

【0053】

いくつかの具体例において、ミキシマーは、ヌクレオチドアナログおよび天然ヌクレオチド、または１つの型のヌクレオチドアナログおよび第２の型のヌクレオチドアナログからなる反復パターンの連続したヌクレオチド配列を含むか、または該ヌクレオチド配列からなる。反復パターンは、例えば、２番目または３番目のヌクレオチド毎に、ヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡであり、残りのヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡであるか、または２’置換ヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書中に記載の２’ＭＯＥまたは２’フルオロアナログであるか、またはいくつかの具体例において、本明細書中に記載のヌクレオチドアナログの群から選択される。ヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡ単位の反復パターンは、固定された位置（例えば、５’または３’末端）でヌクレオチドアナログと組み合わされていてもよい。

【0054】

いくつかの具体例において、３’末端から数えてオリゴマーの最初のヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡヌクレオチドである。

【0055】

いくつかの具体例において、同一または異なっていてもよいが、３’末端から数えてオリゴマーの２番目のヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡヌクレオチドである。

【0056】

いくつかの具体例において、同一または異なっていてもよいが、３’末端から数えてオリゴマーの７および／または８番目のヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡヌクレオチドである。

【0057】

いくつかの具体例において、同一または異なっていてもよいが、３’末端から数えてオリゴマーの９および／または１０番目のヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡヌクレオチドである。

【0058】

いくつかの具体例において、同一または異なっていてもよいが、オリゴマーの５’末端は、ヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡヌクレオチドである。

【0059】

上記の設計特徴は、いくつかの具体例において、ミキシマー設計、例えば、ａｎｔｉｍｉＲミキシマー中に組み込まれていてもよい。

【0060】

いくつかの具体例において、ミキシマーは、４より多くの連続的ＤＮＡヌクレオチド単位または３より多くの連続的ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。いくつかの具体例において、ミキシマーは、２より多くの連続的ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。

【0061】

いくつかの具体例において、ミキシマーは、少なくとも２つの連続的なヌクレオチドアナログ単位、例えば、少なくとも２つの連続的ＬＮＡ単位からなる領域を含む。

【0062】

いくつかの具体例において、ミキシマーは、少なくとも３つの連続的なヌクレオチドアナログ単位、例えば、少なくとも３つの連続的ＬＮＡ単位からなる領域を含む。

【0063】

いくつかの具体例において、本発明のミキシマーは、７より多くの連続的なヌクレオチドアナログ単位、例えば、ＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの具体例において、本発明のミキシマーは、６より多くの連続的なヌクレオチドアナログ単位、例えば、ＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの具体例において、本発明のミキシマーは、５より多くの連続的なヌクレオチドアナログ単位、例えば、ＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの具体例において、本発明のミキシマーは、４より多くの連続的なヌクレオチドアナログ単位、例えば、ＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの具体例において、本発明のミキシマーは、３より多くの連続的なヌクレオチドアナログ単位、例えば、ＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの具体例において、本発明のミキシマーは、２より多くの連続的なヌクレオチドアナログ単位、例えば、ＬＮＡ単位の領域を含まない。

【0064】

ミキシマーの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位におけるヌクレオチドの修飾に言及するが、ＬＮＡ単位は、他のヌクレオチドアナログ（例えば、本明細書中に記載するもの）と置き換えてもよい。「Ｘ」は、したがって、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位（２’フルオロ）、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位からなる群から選択されてもよく、「ｘ」は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡであり、最も好ましくはＤＮＡである。

【0065】

いくつかの具体例において、ミキシマー、例えば、ａｎｔｉｍｉＲミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位で修飾される、すなわち、３〜８位に少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。該配列の設計は、非ＬＮＡ単位の存在数によって、またはＬＮＡ単位の存在数によって定義されうる。前者のいくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの少なくとも１つ、例えば１つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの少なくとも２つ、例えば２つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの少なくとも３つ、例えば３つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの少なくとも４つ、例えば４つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの少なくとも５つ、例えば５つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの少なくとも６つ、例えば６つは、非ＬＮＡ単位である。

【0066】

あるいは、いくつかの具体例において、本発明のミキシマー、例えば、ａｎｔｉｍｉＲミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある少なくとも１つのＬＮＡ単位を含む。いくつかの具体例において、ミキシマー、例えば、ａｎｔｉｍｉＲミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある１つのＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、Ｘｘｘｘｘｘ、ｘＸｘｘｘｘ、ｘｘＸｘｘｘ、ｘｘｘＸｘｘ、ｘｘｘｘＸｘおよびｘｘｘｘｘＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。

【0067】

いくつかの具体例において、ミキシマー、例えば、ａｎｔｉｍｉＲミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある少なくとも２つのＬＮＡ単位を含む。そのいくつかの具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある２つのＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ＸＸｘｘｘｘ、ＸｘＸｘｘｘ、ＸｘｘＸｘｘ、ＸｘｘｘＸｘ、ＸｘｘｘｘＸ、ｘＸＸｘｘｘ、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸＸｘｘ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸ、ｘｘｘＸＸｘ、ｘｘｘＸｘＸおよびｘｘｘｘＸＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ＸｘＸｘｘｘ、ＸｘｘＸｘｘ、ＸｘｘｘＸｘ、ＸｘｘｘｘＸ、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸおよびｘｘｘＸｘＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸおよびｘｘｘＸｘＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘおよびｘｘＸｘＸｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、ｘＸｘＸｘｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）である。

【0068】

いくつかの具体例において、ミキシマー、例えば、ａｎｔｉｍｉＲミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある少なくとも３個のＬＮＡ単位を含む。その具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある３個のＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ＸＸＸｘｘｘ、ｘＸＸＸｘｘ、ｘｘＸＸＸｘ、ｘｘｘＸＸＸ、ＸＸｘＸｘｘ、ＸＸｘｘＸｘ、ＸＸｘｘｘＸ、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸｘｘ、ＸｘｘＸＸｘ、ＸｘｘｘＸＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸ、ｘＸｘＸｘＸおよびＸｘＸｘＸｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ＸＸｘＸｘｘ、ＸＸｘｘＸｘ、ＸＸｘｘｘＸ、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸｘｘ、ＸｘｘＸＸｘ、ＸｘｘｘＸＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸ、ｘＸｘＸｘＸおよびＸｘＸｘＸｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸおよびｘＸｘＸｘＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、ｘＸｘＸｘＸまたはＸｘＸｘＸｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）である。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、ｘＸｘＸｘＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）である。

【0069】

いくつかの具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある少なくとも４個のＬＮＡ単位を含む。そのいくつかの具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある４個のＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ｘｘＸＸＸＸ、ｘＸｘＸＸＸ、ｘＸＸｘＸＸ、ｘＸＸＸｘＸ、ｘＸＸＸＸｘ、ＸｘｘＸＸＸ、ＸｘＸｘＸＸ、ＸｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸＸｘ、ＸＸｘｘＸＸ、ＸＸｘＸｘＸ、ＸＸｘＸＸｘ、ＸＸＸｘｘＸ、ＸＸＸｘＸｘおよびＸＸＸＸｘｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。

【0070】

いくつかの具体例において、本発明のミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある少なくとも５個のＬＮＡ単位を含む。そのいくつかの具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、３〜８位にある５個のＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて、３〜８位にあるヌクレオチドの置換パターンは、限定するものではないが、ｘＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸｘＸおよびＸＸＸＸＸｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。

【0071】

いくつかの具体例において、該非−ＬＮＡ単位は、別のヌクレオチドアナログ単位である。

【0072】

いくつかの具体例において、非−ＬＮＡ単位「ｘ」は、別のヌクレオチドアナログ単位である。ある特定の具体例において、別のヌクレオチドアナログ単位は「Ｙ」であることができ、ここに、Ｙは本明細書中に定義されるとおりである。

【0073】

いくつかのミキシマーの具体例において、３’末端から数えて、１１位から５’末端までのヌクレオチドの置換パターンは、ヌクレオチドアナログ単位（例えば、ＬＮＡ）を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。いくつかの具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、１１位から５’末端までに、少なくとも１個のヌクレオチドアナログ単位（例えば、ＬＮＡ）、例えば１個のヌクレオチドアナログ単位を含む。いくつかの具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、１１位から５’末端までに、少なくとも２個のヌクレオチドアナログ単位（例えば、ＬＮＡ）、例えば２個のヌクレオチドアナログ単位を含む。

【0074】

オリゴマーの１１位から５’末端までのヌクレオチドにおけるヌクレオチド修飾に言及するいくつかの具体例において、ＬＮＡ単位は、他のヌクレオチドアナログ（例えば、本明細書中で言及されるもの）と置き換えられていてもよい。したがって、「Ｘ」は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位からなる群から選択されうる。「ｘ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ＤＮＡであってもよい。Ｘは、また、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ単位であってもよい。

【0075】

いくつかの非限定的な具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、１１位のヌクレオチドから５’末端まで繰り返される下記の置換パターンを有する：ｘＸｘＸまたはＸｘＸｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）。他の非限定的な具体例において、ミキシマーは、３’末端から数えて、１１位のヌクレオチドから５’末端まで繰り返される下記の置換パターンを有する：ＸＸｘＸｘｘ、ＸＸｘｘＸｘまたはＸｘＸｘｘＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）。別の具体例において、ミキシマーは、ミキシマーは、３’末端から数えて、１１位のヌクレオチドから５’末端まで繰り返される下記の置換パターンを有する：ＸＸＸｘＸＸＸｘ、ＸＸｘＸｘＸｘＸ、ＸＸＸｘｘｘＸＸまたはＸＸｘＸｘｘＸＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）。

【0076】

３’末端から数えて、１１位から５’末端までのヌクレオチドの特異的な置換パターンは、ミキシマー中のヌクレオチド数に依存する。好ましい具体例において、ミキシマーは、１２個のヌクレオチドを含有し、３’末端から数えて、１１〜１２位の置換パターンは、限定するものではないが、ｘＸおよびＸｘ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）である。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、１１〜１２位の置換パターンは、ｘＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）である。別法では、３’末端から数えて１１〜１２位に、ＬＮＡ単位は存在しない（すなわち、置換パターンはｘｘ）。また他の具体例において、３’末端から数えて、１１〜１２位の置換パターンは、ＸＸであり、ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示す。

【0077】

いくつかの具体例において、ミキシマーは、１２個のヌクレオチドを含有し、３’末端から数えて、１０〜１２位の置換パターンは、限定するものではないが、Ｘｘｘ、ｘＸｘ、ｘｘＸ、ＸＸｘ、ＸｘＸ、ｘＸＸおよびＸＸＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。そのいくつかの具体例において、３’末端から数えて、１０〜１２位の置換パターンは、限定するものではないが、ｘＸｘ、ｘｘＸおよびｘＸＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）を包含する。いくつかの具体例において、３’末端から数えて、１０〜１２位の置換パターンは、ｘｘＸ（ここに、「Ｘ」はＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は非−ＬＮＡ単位を示す）である。別法では、３’末端から数えて、１０〜１２位にＬＮＡ単位は存在せず、すなわち、置換パターンはｘｘｘである。

【0078】

いくつかの具体例において、オリゴマーは、ＭＯＥ−ＲＮＡおよび２’フルオロ−ＤＮＡヌクレオチドのミキシマーである。そのため、ヌクレオチドＸおよびｘのパターンは、また、２’フルオロおよび２’ＭＯＥ化学の組み合わせを示してもよい。したがって、いくつかの具体例において、Ｘは２’ＭＯＥ−ＲＮＡ単位であり、ｘは２’フルオロ−ＤＮＡ単位である。あるいは、いくつかの具体例において、ｘは２’ＭＯＥ−ＲＮＡ単位であり、Ｘは２’フルオロ−ＤＮＡ単位である。いくつかの具体例において、オリゴマーのヌクレオチド単位の全ては、独立して、２’フルオロ−ＤＮＡおよび２’ＭＯＥ−ＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの具体例において、オリゴマーは、２’ＭＯＥ−ＲＮＡおよび２’フルオロ−ＤＮＡ単位の両方を含む。かかるオリゴマーは、Ｄａｖｉｓら、ＮＡＲ ２００９ Ｖｏｌ ３７， Ｎｏ １， ｐｐ ７０−７７（出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されている。さらに、２’ＭＯＥ／２’フルオロ設計は、本明細書中に説明される。

【0079】

いくつかの具体例において、ミキシマーは、５’末端にＬＮＡ単位を含有する。いくつかの具体例において、ミキシマーは、５’末端から数えて、最初の２つの位置にＬＮＡ単位を含有する。ミキシマーは、また、本明細書中でａｎｔｉｍｉＲと関連して（あるいは、ミキシマーが類似のパターンおよび数のヌクレオチド／ヌクレオチドアナログ（例えば、ＸおよびｘまたはＸおよびＹ）を含有するという関係において）特定される１以上の構造的特徴を含有していてもよい。

【0080】

表１．特異的マイクロＲＮＡが示されたいくつかの疾患の例

【表1】

【0081】

いくつかの具体例において、オリゴマーは、ｉ）ＲＮＡ標的中に存在する連続ヌクレオチドのサブ配列に完全に相補的であってもよく、またはｉｉ）該ＲＮＡ標的中に存在する連続ヌクレオチドのサブ配列の相補体とたった１つのミスマッチを含む。したがって、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここに、それは、標的配列の対応する領域に完全に相補的であるか、または標的配列の対応する領域とたった１つのミスマッチを含む。ＲＮＡ標的は、典型的に、医学的状態または疾患と関連し、いくつかの具体例において、例えば、マイクロＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。該オリゴマーは、したがって、例えば、ａｎｔｉｍｉＲ、マイクロＲＮＡ模倣物、マイクロＲＮＡ ｂｌｏｃｋｍｉｒ、またはアンチセンスオリゴマーであってもよい。

【0082】

したがって、該オリゴマーは、マイクロＲＮＡ−１２２を標的とする（すなわち、マイクロＲＮＡ−１２２（の対応する領域）に対して完全に相補的な連続ヌクレオチド配列を含む、または該ヌクレオチド配列からなる、またはそのたった１つのミスマッチを含む）ａｎｔｉｍｉｒであってもよい。かかるオリゴヌクレオチドは、抗−マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドと称することもある。

【0083】

本発明において有用なマイクロＲＮＡ−１２２のモジュレーターの例
本発明において使用するために特に好ましい化合物は、マイクロＲＮＡ−１２２を標的とするものである。ｍｉＲ−１２２の配列は、マイクロＲＮＡデータベース「ｍｉｒｂａｓｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）に見出すことができる。マイクロＲＮＡ−１２２の阻害剤は、多くの特許および文献に記載されており、当業者に周知である。いくつかの具体例において、有用なマイクロＲＮＡ−１２２モジュレーターを記載しているかかる文献の例は、ＷＯ２００７／１１２７５４、ＷＯ２００７／１１２７５３、またはＷＯ２００９／０４３３５３（全て、出典明示により本明細書の一部とされる）である。いくつかの具体例において、かかるマイクロＲＮＡ−１２２モジュレーターは、ＷＯ２００９／２０７７１、ＷＯ２００８／９１７０３、ＷＯ２００８／０４６９１１、ＷＯ２００８／０７４３２８、ＷＯ２００７／９００７３、ＷＯ２００７／２７７７５、ＷＯ２００７／２７８９４、ＷＯ２００７／２１８９６、ＷＯ２００６／９３５２６、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００５／２３９８６、またはＷＯ２００５／１３９０１（全て、出典明示により本明細書の一部とされる）に記載のものである。

【0084】

いくつかの具体例において、マイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニストは、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーまたはその（対応する）連続ヌクレオベース配列である。したがって、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、ヒトｍｉＲ−１２２配列の一部または全長に対して相補的な少なくとも７個の連続ヌクレオチドの配列を含むか、または該配列からなる。これに関連して、一部は、マイクロ−ＲＮＡ１２２配列、例えば、成熟ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列内に見出される配列と１００％相補的な少なくとも６個、例えば少なくとも７個または少なくとも８個の連続ヌクレオチドである。ある特定の具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２シード配列に対して相補的な連続ヌクレオチドの配列を含むか、または該配列からなり、すなわち、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＴＣＣ−３’ （本明細書中において、「シードマッチ領域」という）を含むか、または該配列からなる。

【0085】

いくつかの具体例において、配列５’−ＣＡＣＴＣＣ−３’は、３’末端から数えて、オリゴマーの１−６、２−７または３−８位に位置する。いくつかの具体例において、配列５’−ＣＡＣＴＣＣＡ−３’は、３’末端から数えて、オリゴマーの１−７または２−８位に位置する。連続ヌクレオチド配列からなるオリゴマーは、さらに、非ヌクレオチド成分、例えば、５’または３’非ヌクレオチドコンジュゲーション基を含んでいてもよい。いくつかの具体例において、該オリゴマーは、連続ヌクレオチド配列のみからなる、または該ヌクレオチド配列のみを含み、例えば、コンジュゲーション基を含まない。ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列の一部または全体に対して相補的な７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のヌクレオチドの連続配列を含んでいてもよく、または該配列からなっていてもよい。全ｍｉＲ−１２２に相補的な相補的オリゴマーは、少なくとも２２ヌクレオチド長、すなわち、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列の長さであり、いくつかの例において、さらなる配列−フランキング配列（成熟ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列に隣接するプレ−ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２の領域に相補的であってもよい）を含んでいてもよい。全成熟ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２に相補的な相補的オリゴマーは、したがって、２２ｎヌクレオチド長よりも長くてもよく、例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であってもよい。ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列の一部にのみ相補的なオリゴマーは、２２ヌクレオチド長未満であってもよく、ｍｉＲ−ｈａｓ−ｍｉＲ１２２配列の一部の相補体からなる連続ヌクレオチド配列（すなわち、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２の対応するサブ領域に相補的な連続ヌクレオチド配列）からなってもよく、または該配列を含んでいてもよい。

【0086】

いくつかの具体例において、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列の一部にのみに相補的なオリゴマーは、例えば、成熟ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列に隣接するプレ−ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２の領域に相補的であってもよいフランキング配列を含んでいてもよい。成熟ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２の一部に相補的な相補的オリゴマーは、したがって、２２ヌクレオチド長より長くてもよく、例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長であってもよい。しかしながら、いくつかの具体例において、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２の一部に相補的なオリゴマーは、２２ヌクレオチド長未満である。いくつかの具体例において、該オリゴマーは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２に相補的な連続ヌクレオチド配列からなってもよい。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。

【0087】

いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。

【0088】

いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含む。

【0089】

上記で挙げた具体例において、３’シトシンヌクレオチドは、いくつかの具体例において、３’末端ヌクレオチドであってもよい。いくつかの具体例において、上記配列において、３’シトシンに対して３’にアデノシンヌクレオチドなどの単一のさらなるヌクレオチドが存在していてもよい。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−（Ｃ）（Ａ）（Ａ）（Ａ）（Ｃ）（Ａ）（Ｃ）（Ｃ）（Ａ）（Ｔ）（Ｔ）（Ｇ）（Ｔ）（Ｃ）ＡＣＡＣＴＣＣ−３’からなるか、または該配列を含み、ここに、括弧中のヌクレオチドは任意である。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−（Ｃ）（Ａ）（Ａ）（Ａ）（Ｃ）（Ａ）（Ｃ）（Ｃ）（Ａ）（Ｔ）（Ｔ）（Ｇ）（Ｔ）（Ｃ）ＡＣＡＣＴＣＣＡ−３’ からなるか、または該配列を含み、ここに、括弧中のヌクレオチドは任意である。

【0090】

ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーはシードマッチ領域を含むことが好ましいが、いくつかの具体例において、シードマッチ領域は、３’末端から２個程度のヌクレオチドが切断されていてもよいと考えられる。すなわち、いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−（Ｃ）（Ａ）（Ａ）（Ａ）（Ｃ）（Ａ）（Ｃ）（Ｃ）（Ａ）（Ｔ）（Ｔ）（Ｇ）（Ｔ）ＣＡＣＡＣＴＣ−３’ からなるか、または該配列を含み、ここに、括弧中のヌクレオチドは任意である。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−（Ｃ）（Ａ）（Ａ）（Ａ）（Ｃ）（Ａ）（Ｃ）（Ｃ）（Ａ）（Ｔ）（Ｔ）（Ｇ）ＴＣＡＣＡＣＴ−３’ からなるか、または該配列を含み、ここに、括弧中のヌクレオチドは任意である。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。

【0091】

いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。

【0092】

いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’から成るか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。

【0093】

いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。

【0094】

いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴ−３’からなるか、または該配列を含む。いくつかの具体例において、ｍｉＲ−１２２に相補的なオリゴマーは、連続ヌクレオチド配列５’−ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ−３’からなるか、または該配列を含む。

【0095】

いくつかの具体例において、該オリゴマーは、２’置換ヌクレオシド、例えば、２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅおよび／または２’フルオロを含んでいてもよく、または該２’置換ヌクレオチドからなってもよい。例として、Ｄａｖｉｓら、ＮＡＲ ２００８ Ｖｏｌ ３７， Ｎｏ １は、劇的に改善されたイン・ビボ効力を有する２’−フルオロ／２’−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）［Ｎｉｅｌｓ／Ｍａｒｋ，これがＡＳＯが示すものであることを確認のこと］モチーフを開示する。Ｄａｖｉｓらは、出典明示により本明細書の一部とする。２’ＭＯＥ／２’フルオロミキシマーは、いくつかの具体例において、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長であってもよい。下記の表は、２’ＭＯＥおよび２’フルオロ糖修飾をどのように２２ヌクレオチド長までのオリゴマー、例えば、その配列を上記したオリゴマー中に組み込むことができるかを示す。

【0096】

【化1】

【0097】

上記具体例は、「Ｘ」が２’ＭＯＥであり、「ｘ」が２’フルオロである場合、あるいは、「Ｘ」が２’フルオロであり、「ｘ」が２’ＭＯＥである場合、上記教示と組み合わせてもよい。２’ＭＯＥ／２’フルオロミキシマーは、完全にホスホロチオエートであってもよい。

【0098】

Ｍは、２’−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）を示し、Ｆは、２’フルオロヌクレオシド単位を示す。配列１−２２は、５’−３’に提供される。すなわち、ヌクレオシド間結合は、本明細書中に記載されるとおりであってもよく、例えば、完全なホスホロチオエート骨格を用いてもよい。上記配列は、例えば、成熟ヒトｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列の逆相補体（reverse complement）またはその一部であってもよい（抗−ｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチド配列の上記リスト参照）。該オリゴヌクレオチドは、所望により、例えば、３’コレステロールコンジュゲートによって、コンジュゲートされていてもよい。シトシンは、５−メチルシトシンであってもよい。いくつかの具体例において、１番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、２番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、２番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、３番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、３番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、４番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、４番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、５番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、５番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、６番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、６番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、７番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、７番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、８番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、８番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、９番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、９番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１０番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１０番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１１番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１１番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１２番目のヌクレオチドは、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１２番目のヌクレオチドは、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１３番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１３番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１４番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１４番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１５番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１５番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１６番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１６番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１７番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１７番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１８番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１８番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１９番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、１９番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、２０番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、２０番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、２１番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、２１番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、２２番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’ＭＯＥヌクレオチドである。いくつかの具体例において、２２番目のヌクレオチドは、存在する場合、２’フルオロヌクレオチドである。いくつかの具体例において、オリゴマーは、Ｄａｖｉｓら、２００９に開示されるものに基づく１ ２’ＭＯＥ／２’フルオロ設計、例えば、短縮バージョン、または多かれ少なかれ、２’Ｆコア領域の周囲に２’ＭＯＥフランクを有するバージョン、例えば、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、ＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭ、ＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭ、ＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭ、またはＭＭＭＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＭＭＭからなる。

【0099】

いくつかの具体例において、モジュレーターは、アンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの具体例において、モジュレーターは、７〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのＬＮＡを含む。いくつかの具体例において、マイクロＲＮＡモジュレーターは、７から２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのＬＮＡを含み、さらに、少なくとも１つの他のアフィニティー増強性ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの具体例において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む。１の特に好ましい具体例において、医薬組成物は、配列：５’−ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ−３’（配列番号１１）（ここに、大文字はＬＮＡ単位を示す）、例えば、５’−^ｍＣ_ｓｃ_ｓＡ_ｓｔ_ｓｔ_ｓＧ_ｓＴ_ｓｃ_ｓａ_ｓ^ｍＣ_ｓａ_ｓ^ｍＣ_ｓｔ_ｓ^ｍＣ_ｓ^ｍＣ−３’を有する抗−ｍｉＲ−１２２オリゴマーを含む。

【0100】

本明細書中で使用される場合、配列中の大文字は、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを示し、小文字は、ＤＮＡ単位（２’デオキシリボースヌクレオシド）を示し、「^ｍＣ」は、５−メチルシトシンベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを示し、下付き文字の「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。好ましい具体例において、マイクロＲＮＡ−１２２モジュレーターは、表２および３に挙げられる配列のいずれか１つを含むか、または該配列からなるＬＮＡアンチセンスオリゴマーである。

【0101】

表２ 本発明の方法において使用されうる以下の特定の化合物。該化合物は、好ましくは完全にホスホロチオエートであり、各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、例えば、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡである。ＬＮＡシトシンは、５’メチルシトシンであってもよい。該化合物は、その標的マイクロＲＮＡのシード領域に向けられる（すなわち、シードマー（seedmer）である）。該化合物は、限定するものではないが、ＰＣＴ／ＤＫ２００８／０００３４４（ｍｉＲｂａｓｅにおいて公表されるようなマイクロＲＮＡを標的とするａｎｔｉｍｉＲを開示し、特に、本発明の方法に使用されうるオリゴマーを提供するために、出典明示により本明細書の一部とされる）の表１に開示されるようなオリゴヌクレオチドを包含する。等価のａｎｔｉｍｉＲは、成熟マイクロＲＮＡ−１２２の−２ないし−８／−９または−１０位（７、８または９ｍｅｒの場合）（該マイクロＲＮＡの５’末端ヌクレオチド（すなわち、−１位）から数える）を対合することによって設計することができる。

【0102】

【表2】

【0103】

表３ マイクロＲＮＡ−１２２を標的とするさらなるＬＮＡ化合物。ＰＣＴ／ＤＫ２００８／０００３４４に開示されるような、本発明の方法において使用されうる以下の特定の化合物。

【0104】

【表3】

【0105】

表４ 使用されうるｍｉＲ−１２２を標的とするさらなる特定の化合物（ＷＯ２００７／１１２７５４の表１およびＷＯ２００７／１１２７５３に開示され、出典明示により本明細書の一部とされる）
オリゴヌクレオチドを阻害するｍｉＲ−１２２の具体例は、限定するものではないが、下記の表４に示すものを包含する。

【0106】

【表4】

ここに、小文字は、ＤＮＡ単位の窒素を含む塩基を示し、大文字は、ＬＮＡ単位の窒素を含む塩基を示し、大文字のＣは^ＭｅＣを示す。

【0107】

上記具体例におけるＬＮＡ／ＤＮＡヌクレオベースの設計は、本発明にしたがう他のオリゴヌクレオチドに応用されうることが理解されるであろう。

【0108】

医薬組成物および治療方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートもしくは医薬組成物は、典型的に、有効量（例えば、標的ＲＮＡまたはその活性を、連続的投与間の期間にわたって有意なレベル、例えば、対象に治療的利益があるレベルにダウンレギュレートするのに十分な投与量によって決定されうる）において対象に投与される。いくつかの具体例において、標的ＲＮＡまたはその活性は、連続的投与間の期間中、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％ダウンレギュレートされる。本発明の医薬組成物は、いくつかの具体例において、疾患病状に依存して、疾患の治療において効果的であろう対象、例えば、対象の標的組織における化合物濃度を維持する目的で、維持投与量スキームによって追随されうる初期投与量蓄積期（initial dosage build up phase）を提供するための投与のために製造されうる。投与量の効力は、例えば、病状を示す疾患パラメーターの観察によって測定されうるか、または標的組織に依存して、種々の組織パラメーター、例えば、標的ＲＮＡの活性またはウイルスゲノムの量、あるいは例えば、血漿中の測定可能な病状依存性パラメーターの観察によって測定可能である。しかしながら、いくつかの非限定的な例において、かかる疾患はウイルス性疾患であることができ、増量期後、維持投与量を一定期間与えることができ、ここに、該目的は、標的組織における化合物の比較的高い活性または濃度を維持することであり、一方、例えば、ウイルス力価が減少するか、または他の疾患パラメーターが改善され、その後、各投与間の間隔を増加することができるか、または各投与で与えられる投与量を減少することができ、またはその両方可能であり、それにより、最小限必要とされる有効投与量を用いることで最低レベルで該疾患を維持し、同時に、投与間にぎりぎりの時間間隔（high time interval）をおくことによって、最小限の副作用および患者にとって最低限の不都合しかもたらさないようにする。本明細書に記載の投与最適化は、ルーチンな調整のみを用いて、当業者によって実施されうる。

【0109】

いくつかの具体例において、増量期後、重要な疾患パラメーターに対する所望の効果を得るために、標的組織における有効濃度を維持する目的で、維持投与量が投与され、ここに、患者にとっての投与の不都合を回避するために、各投与間の時間間隔は大きく、副作用を回避するために、投与量は最小限に維持され、一方、選択された疾患パラメーターに対する効果は今だ維持されている。

【0110】

いくつかの具体例において、少なくとも２回の投与、例えば維持投与間の時間間隔は、例えば、少なくとも１日、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または少なくとも１４日のいずれかから選択される。

【0111】

いくつかの具体例において、少なくとも２回の投与、例えば維持投与間の時間間隔は、例えば、少なくとも１４日、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４または少なくとも１２５日のいずれかから選択される。いくつかの具体例において、少なくとも２回の投与、例えば維持投与間の時間間隔は、少なくとも２週、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または少なくとも１８週のいずれかから選択される。いくつかの具体例において、少なくとも２回の投与、例えば維持投与間の時間間隔は、例えば、少なくとも１／２月、例えば、少なくとも１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４または少なくとも４と１／２月のいずれかから選択される。

【0112】

いくつかの具体例において、患者が活性な疾患の症状を有する限り、治療が維持されるであろう。いくつかの具体例において、ある期間、治療を休止してもよく、次いで、高投与または頻繁な投与の初期期間によって再開して、化合物の有効組織濃度を再構築してもよく、次いで、記載にしたがって維持療法を施してもよい。

【0113】

いくつかの具体例において、少なくとも２回の投与、例えば維持投与間の時間間隔は、少なくとも１４日である。いくつかの具体例において、投与間の時間間隔は、少なくとも２１日である。いくつかの具体例において、投与間の時間間隔は、少なくとも４週である。いくつかの具体例において、投与間の時間間隔は、少なくとも５週である。いくつかの具体例において、投与間の時間間隔は、少なくとも６週である。いくつかの具体例において、投与間の時間間隔は、少なくとも７週である。いくつかの具体例において、投与間の時間間隔は、少なくとも８週である。かかる投与量は、維持投与量であってもよい。

【0114】

いくつかの具体例において、患者の循環中、例えば血漿中のオリゴマー濃度は、０．０４〜２５ｎＭ、例えば、０．８〜２０ｎＭのレベルで維持される。

【0115】

いくつかの具体例において、各投与、例えば単位投与量にて投与される化合物の投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの具体例において、各投与、例えば単位投与量にて投与される化合物の投与量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの具体例において、各投与にて投与される化合物の投与量（例えば、単位投与量）は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの具体例において、各投与にて投与される化合物の投与量（例えば、単位投与量）は、１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの具体例において、各投与、例えば単位投与量にて投与される化合物の投与量は、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの具体例において、各投与にて投与される化合物の投与量（例えば、単位投与量）は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５、６．７５、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５、８．７５、９、９．２５、９．５、９．７５、１０、１０．２５、１０．５、１０．７５、１１、１１．２５、１１．５、１１．７５、１２、１２．２５、１２．５、１２．７５、１３、１３．２５、１３．５、１３．７５、１４、１４．２５、１４．５、１４．７５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または例えば約２５ｍｇ／ｋｇ（その各々が個々の具体例である）である。

【0116】

いくつかの具体例において、本発明の組成物（例えば、単位投与量）は、非経口投与方法、例えば、限定するものではないが、静脈内、皮下、腹腔内、脳血管内、鼻腔内投与のために製造される。いくつかの具体例において、投与は経口である。

【0117】

本発明のオリゴマーは、医薬処方および組成物において使用されうる。適当には、かかる組成物は、医薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２は、適当な医薬上許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供する（出典明示により、本明細書の一部とする）。適当な投与量、処方、投与経路、組成物、投与形態、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ処方もまた、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２に提供される（出典明示により、本明細書の一部とする）。いくつかの具体例において、本発明の医薬組成物は、さらに、医薬上許容される担体を含む。

【0118】

本発明の化合物は、いくつかの具体例において、例えば、医薬上許容される担体または希釈剤中、処置した患者に深刻な副作用を引き起こすことなく、治療上有効量を患者にデリバリーするのに十分な量において、単位処方（すなわち、単位投与量）中に含まれうる。しかしながら、処置のいくつかの形態において、深刻な副作用は、治療的処置に対して正の結果を保証する観点から、許容されうる。

【0119】

医薬組成物の投与量は、治療されるべき病態の重篤度および応答性に依存し、数日から数ヶ月または治癒するまで持続する治療コースがもたらされるか、または病状の減少が達成される。最適な投与計画は、患者の体内における薬物蓄積の測定値から算出することができる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化しうる。一般に、イン・ビトロおよびイン・ビボ動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ_５０に基づいて概算することができる。一般に、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１ｇであり、１日に１回以上、週に１回以上、月に１回以上または年に１回以上、または２〜１０年毎に１回、または数時間から数ヶ月までの間の連続的な注入によって、与えられうる。投与の反復率は、体液または組織中の測定された滞留時間および濃度に基づいて概算することができる。成功した処置後、病状の再発を防ぐために、患者は維持療法を受けることが望ましい。

【0120】

処方された薬物は、医薬上許容される結合剤およびアジュバントを含んでいてもよい。カプセル、錠剤および丸薬などは、例えば、下記の化合物を含有していてもよい。結合剤として、微結晶セルロース、ガムまたはゼラチン；賦形剤として、デンプンまたはラクトース；滑沢剤として、ステアリン酸塩；種々の甘味料またはフレーバー剤。カプセルの場合、投与単位は、油脂などの液体担体を含有していてもよい。同様に、糖類または腸溶性剤のコーティングを投与単位の一部としてもよい。オリゴヌクレオチド処方は、また、活性な医薬成分およびミセル性エマルジョンを形成する脂質のエマルジョンであってもよい。

【0121】

本発明の医薬組成物は、局所的または全身的処置が望ましいかどうか、および治療されるべき領域に依存して、いくつかの方法で投与されうる。投与は、（ａ）経口、（ｂ）肺、例えば、ネブライザーによるものを包含する粉末またはエーロゾルの吸入または吹き込みによる、気管内、鼻腔内、（ｃ）表皮、経皮、眼および膣および直腸デリバリーを包含する粘膜を包含する局所的、または（ｄ）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋内注射または注入を包含する非経口、または頭蓋内、例えば、クモ膜下または脳室内投与であってもよい。いくつかの具体例において、活性なオリゴは、ＩＶ、ＩＰ、経口、局所、またはボーラス注射として投与され、または標的器官に直接投与される。具体例において、各投与量は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋内注射または注入を包含する非経口注射または注入；または頭蓋内、例えば、クモ膜下または脳室内投与によって投与される。

【0122】

局所投与のための医薬組成物および処方は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴、スプレー、座剤、液体および粉末を包含しうる。通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などは、必要であるか、または望ましいことがある。いくつかの非限定的な例示的局所処方は、本発明のオリゴヌクレオチドが液体、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所的デリバリー剤と混合されているものを包含する。経口投与のための組成物および処方は、限定するものではないが、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水中または非水性媒体中における懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ、錠剤またはミニ錠剤を包含する。非経口、クモ膜下または脳室内投与のための組成物および処方は、バッファー、希釈剤および他の適当な添加剤、例えば、限定するものではないが、浸透増加剤、担体化合物および他の医薬上許容される担体または賦形剤を含有していてもよい滅菌水性溶液を包含しうる。

【0123】

本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有処方を包含する。これらの組成物は、限定するものではないが、予め形成された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体を包含する種々の成分から生成されうる。腫瘍組織への薬物のデリバリーは、限定するものではないが、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、側鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアを包含する担体媒介性デリバリーによって増強されうる（Ｄａｓｓ ＣＲ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００２； ５４（１）：３−２７）。本発明の医薬処方は、好都合には単位投与形態で提供されうるが、製薬業界においてよく知られた通常の技術にしたがって調製されうる。かかる技術は、活性成分と医薬担体または賦形剤との会合をもたらす工程を包含する。一般に、該処方は、活性成分と液体担体または微粉化固形担体またはその両方との会合を均一かつ密接にもたらし、次いで、所望により成形することによって調製される。

【0124】

本発明の組成物は、多くの可能な投与形態、例えば、限定するものではないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲルおよび座剤のいずれかに処方されうる。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として処方されうる。水性懸濁液は、さらに、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを包含する、該懸濁液の粘性を増加させる物質を含有しうる。懸濁液は、また、安定化剤を含有しうる。

【0125】

非経口、皮下、経皮または局所投与の場合、処方は、滅菌希釈剤、バッファー、等張性調節剤および抗菌剤を含んでいてもよい。活性化合物は、放出制御性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを包含する、分解または体内からの即時排除から保護する担体と共に調製されうる。静脈内投与の場合、担体は、例えば、生理学的セーラインまたはリン酸緩衝化セーラインであってもよい。

【0126】

本発明のオリゴヌクレオチドは、所望の作用を害さないいずれかの物質、または所望の作用を補助する物質と混合してもよい。これらは、他のヌクレオシド化合物を包含する他の薬剤を包含することができる。

【0127】

所望により、本発明の医薬は、治療剤、例えば、さらなるアンチセンス化合物、化学治療化合物、抗炎症性化合物、抗ウイルス性化合物および／または免疫調節化合物を含む。限定するものではないが、非ステロイド性抗炎症薬およびコルチコステロイドを包含する抗炎症薬、抗ウイルス薬、および免疫調節薬もまた、本発明の組成物中に配合されうる。

【0128】

２以上の合わせた化合物を一緒にまたは連続的に用いてもよく、すなわち、本発明の化合物は、本明細書中に言及される１以上の他の治療剤の投与前、投与中または投与後に用いてもよい。

【0129】

本発明のオリゴヌクレオチドは、また、活性な薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質にコンジュゲートされていてもよい。いくつかの具体例において、本発明の医薬組成物は、さらに、少なくとも１つの化学治療剤を含む。該化学治療剤は、例えば、アドレノコルチコステロイド、例えば、プレドニソン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）またはデカドロン（ｄｅｃａｄｒｏｎ）；アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）（ヘキサレン（ｈｅｘａｌｅｎ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ））；アミフォスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）（エチオール（ｅｔｈｙｏｌ））；アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）（シタドレン（ｃｙｔａｄｒｅｎ））；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）（Ｍ−ＡＭＳＡ）；アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）（アリミデックス（ａｒｉｍｉｄｅｘ））；アンドロゲン、例えば、テストステロン；アスパラギナーゼ（エルスパー（ｅｌｓｐａｒ））；バチルス・カルメット−グリン（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｍｅｔｔｅ−ｇｕｒｉｎ）；ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）（カソデックス（ｃａｓｏｄｅｘ））；ブレオマイシン（ブレノキサン（ｂｌｅｎｏｘａｎｅ））；ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）（ミレラン（ｍｙｌｅｒａｎ））；カルボプラチン（パラプラチン（ｐａｒａｐｌａｔｉｎ））；カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）（ＢＣＮＵ，ＢｉＣＮＵ）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）（ロイケラン（ｌｅｕｋｅｒａｎ））；クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ，クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ロイスタチン（ｌｅｕｓｔａｔｉｎ））；シスプラチン（プラチノール（ｐｌａｔｉｎｏｌ））；シトシンアラビノシド（シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ））；デカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）（ＤＴＩＣ）；ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）（アクチノマイシン−Ｄ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ−Ｄ）、コスメゲン（ｃｏｓｍｅｇｅｎ））；ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）（セルビジン（ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ））；ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）（タキソテレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ））；ドクソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）（アドリノマイシン（ａｄｒｉｏｍｙｃｉｎ））；エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）；エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）（エムシト（ｅｍｃｙｔ））；エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）；エトプシド（ｅｔｏｐｓｉｄｅ）（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ、エトポホス（ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ））；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）（フルダラ（ｆｌｕｄａｒａ））；フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）（エウレキシン（ｅｕｌｅｘｉｎ））；５−ＦＵＤＲ（フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ））；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（ゲムザル（ｇｅｍｚａｒ））；ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）（ゾダレックス（ｚｏｄａｌｅｘ））；ヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ））；ヒドロキシウリア（ヒドレア（ｈｙｄｒｅａ））；イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）（イダマイシン（ｉｄａｍｙｃｉｎ））；イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ＩＬ−２（プロレウキン（ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、アルデスレウキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ））；インターフェロンアルファ（イントロンＡ（ｉｎｔｒｏｎ Ａ）、ロフェロンＡ（ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ））；イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（カムプトサル（ｃａｍｐｔｏｓａｒ））；ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）（ルプロン（ｌｕｐｒｏｎ））；レバミソール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）（エルガミソール（ｅｒｇａｍｉｓｏｌｅ））；ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ）；メクロラタミン（ｍｅｃｈｌｏｒａｔｈａｍｉｎｅ）（ムスタルゲン（ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）、ニトロゲンマスタード）；メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）（アルケラン（ａｌｋｅｒａｎ））；メルカプトプリン（プリネトール（ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）、６−ＭＰ）；メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）（メキサート（ｍｅｘａｔｅ））；マイトマイシン−Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ−Ｃ）（ムタムシン（ｍｕｔａｍｕｃｉｎ））；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）（ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ））；オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）（サンドスタチン（ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ））；ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）（２−デオキシコホルミシン（２−ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）、ニペント（ｎｉｐｅｎｔ））；プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）（ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、ミトラシン（ｍｉｔｈｒａｃｉｎ））；プロロカルバジン（ｐｒｏｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）（マツラン（ｍａｔｕｌａｎｅ））；ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）；タモキシフィン（ｔａｍｏｘｉｆｉｎ）（ノルバデックス（ｎｏｌｖａｄｅｘ））；タキソール（ｔａｘｏｌ）（パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ））；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）（ブモン（ｖｕｍｏｎ）、ＶＭ−２６）；チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）；トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）（ヒカムチン（ｈｙｃａｍｔｉｎ））；トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）（ベサノイド（ｖｅｓａｎｏｉｄ）、全トランスレチノイン酸）；ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）（バルバン（ｖａｌｂａｎ））；ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）（オンコビン（ｏｎｃｏｖｉｎ））およびビンオレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）（ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ））からなる群から選択されうる。

【0130】

ある特定の具体例において、本発明は、（ａ）１以上のアンチセンス化合物および（ｂ）非アンチセンスメカニズムによって機能する１以上の他の化学治療剤を含有する医薬組成物を提供する。本発明の化合物と共に使用される場合、かかる化学治療剤は、個々に（例えば、ミトラマイシンおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、一定期間、ミトラマイシンおよびオリゴヌクレオチド、次いで、他の薬剤およびオリゴヌクレオチド）、または１以上の他のかかる化学治療剤と組み合わせて、または放射能療法と組み合わせて用いてもよい。当業者に既知の全ての化学治療剤は、本発明の化合物との組み合わせ治療として本明細書中に組み込まれる。

【0131】

別の具体例において、本発明の組成物は、第１の核酸を標的とした１以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第２の核酸標的を標的とした１以上のさらなるアンチセンス化合物を含有しうる。２以上の組み合わせた化合物を一緒にまたは連続的に用いてもよい。すなわち、本発明の化合物は、本明細書中に言及される１以上の他の治療剤の投与前、投与中または投与後に使用してもよい。

【0132】

本発明の医薬組成物は、プロドラッグを構成していてもよい。したがって、本発明のいくつかの具体例において、本発明の化合物は、プロドラッグの形態であってもよい。オリゴヌクレオチドは、負に荷電されたイオンに基づいていてもよい。細胞膜の脂肪親和性のために、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または脂肪親和性等価物と比べて減少する。該極性「障害」は、プロドラッグアプローチを用いることによって回避することができる（例えば、Ｃｒｏｏｋｅ， Ｒ． Ｍ． （１９９８） ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ， ｖｏｌ． １３１， ｐｐ． １０３−１４０参照）。該アプローチにおいて、オリゴヌクレオチドは、該オリゴが投与時に中性であるように保護された方法で調製される。これらの保護基は、除去でき、その後にオリゴが細胞に取り込まれるように、設計される。かかる保護基の例は、Ｓ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）またはＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）である。これらの保護基は、ヌクレアーゼ耐性であり、選択的に細胞内除去される。

【0133】

本発明の医薬組成物は、いくつかの具体例において、さらに、抗炎症性化合物および／または抗ウイルス性化合物を含む。

【0134】

いくつかの具体例において、本発明で使用されるＬＮＡアンチセンス抗マイクロＲＮＡ化合物は、セーライン中で処方される。

【0135】

ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ
「ヌクレオチド」なる語は、本明細書中で使用される場合、糖部分、塩基部分および共有結合したリン酸基を含むグリコシドを示し、天然ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばＤＮＡ、および修飾された糖および／または塩基部分を含む非天然ヌクレオチド（本明細書中において「ヌクレオチドアナログ」ともいう）の両方を包含する。

【0136】

非天然ヌクレオチドは、修飾された糖部分を有するヌクレオチド、例えば、二環式ヌクレオチドまたは２’修飾ヌクレオチド、例えば、２’置換ヌクレオチドを包含する。

【0137】

「対応する」なる語は、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列（第１の配列）および標的ＲＮＡの逆相補体の全またはサブ配列の等価の連続ヌクレオチド配列間の比較をいう（ＲＮＡ標的に対応するオリゴマー配列またはその連続ヌクレオチド配列は、標的ＲＮＡの全またはサブ配列の逆相補体とアラインした場合に、典型的にミスマッチを含まない、またはたった１個しかミスマッチを含まない）。

【0138】

「対応するヌクレオチドアナログ」および「対応するヌクレオチド」なる語は、ヌクレオチドアナログにおけるヌクレオチドおよび天然ヌクレオチドが同一であることを示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンに結合している場合、「対応するヌクレオチドアナログ」は、アデニンに結合したペントース単位（２−デオキシリボースとは異なる）を含有する。

【0139】

「ヌクレオチドアナログ」は、糖および／または塩基部分における修飾による天然ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの変種である。アナログは、原則として、オリゴマーに関連して、天然ヌクレオチドに対し、単に「サイレント」であるか「等価」であることができ、すなわち、オリゴマーが標的遺伝子発現を阻害するように働く方法に対して機能的な影響を有さない。にもかかわらず、かかる「等価」アナログは、例えば、それらの製造が容易または安価であるか、または貯蔵もしくは製造条件に対してより安定であるか、またはタグもしくはラベルを示す場合、有用でありうる。しかしながら、好ましくは、アナログは、例えば、標的に対する増加した結合アフィニティーおよび／または細胞内ヌクレアーゼに対する増加した耐性および／または細胞中への輸送の増加した容易性を生じることによって、オリゴマーが発現阻害するように働く方法に対して機能的影響を有さないであろう。ヌクレオシドアナログの具体例は、例えば、ＦｒｅｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， ３（２）， ２９３−２１３、およびスキーム１によって記載される。

【0140】

【化2】

スキーム１

【0141】

かくして、オリゴマーは、天然ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書中において、一般に、「ＤＮＡ」という）、おそらくリボヌクレオチド（本明細書中において、一般に「ＲＮＡ」という）、またはかかる天然ヌクレオチドの組み合わせ、および１以上の非天然ヌクレオチド、すなわち、ヌクレオチドアナログの単純な配列を含むか、または該配列からなってもよい。かかるヌクレオチドアナログは、適当には、標的配列のオリゴマーのアフィニティーを増加しうる。

【0142】

適当なヌクレオチドアナログの例は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２によって提供されるか、または該文献中に言及される。

【0143】

オリゴマーにおけるアフィニティー増強性ヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡまたは２’−置換糖類の組み込みは、特異的結合性オリゴマーのサイズを減少させることを可能にし、また、非特異的または異常な結合が起こる前に、その上限を該オリゴマーのサイズに減少させうる。

【0144】

いくつかの具体例において、該オリゴマーは、少なくとも２つのヌクレオチドアナログを含む。いくつかの具体例において、該オリゴマーは、３−８個のヌクレオチドアナログ、例えば、６または７個のヌクレオチドアナログを含む。なによりも好ましい具体例において、第１のオリゴマーにも言及するが、特に第２のオリゴマーに関連して、ヌクレオチドアナログの少なくとも１つは、ロックド（locked）核酸（ＬＮＡ）であり、例えば、ヌクレオチドアナログの少なくとも３または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または８個は、ＬＮＡであってもよい。いくつかの具体例において、ヌクレオチドアナログの全てがＬＮＡであってもよい。

【0145】

ヌクレオチドのかかる修飾の例は、また、２’−置換基を提供するように、または結合アフィニティーを増強し、増加したヌクレアーゼ耐性をも提供しうる架橋（ロックド核酸）構造を提供するように、糖部分を修飾することを包含する。

【0146】

好ましいヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、例えば、オキシ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、およびアルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）、および／またはアミノ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）および／またはチオ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）および／またはＥＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−ＥＮＡおよびアルファ−Ｌ−ＥＮＡ）である。最も好ましくは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。

【0147】

いくつかの具体例において、オリゴマー内に存在するヌクレオチドアナログは、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ（挿入核酸（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， ２００２． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２００２ ３０： ４９１８−４９２５（出典明示により、本明細書の一部とされる））単位、および２’ＭＯＥ単位から独立して選択される。いくつかの具体例において、本発明のオリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチドアナログの上記の型のうちの１つだけが存在する。

【0148】

いくつかの具体例において、ヌクレオチドアナログは、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマーまたはＬＮＡヌクレオチドアナログであり、該オリゴマーとして、これらの３つの型のアナログから独立して選択されるヌクレオチドアナログを含んでいてもよく、または該３つの型から選択されるアナログのうちの１つの型だけを含んでいてもよい。いくつかの具体例において、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１つは、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオチド単位である。いくつかの具体例において、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１つは、２’−フルオロＤＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオチド単位である。

【0149】

いくつかの具体例において、第２のオリゴマーは、ＬＮＡおよび２’−ＭＯＥ−ＲＮＡの両方または２’−フルオロヌクレオチドを含み、いくつかの具体例において、ＬＮＡおよび２’−ＭＯＥ、またはＬＮＡおよび２’−フルオロヌクレオチドからなってもよい。

【0150】

いくつかの具体例において、該オリゴマーは、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）単位、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＬＮＡ単位、例えば、３〜７または４〜８個のＬＮＡ単位、または３、４、５、６または７個のＬＮＡ単位を含む。いくつかの具体例において、全てのヌクレオチドアナログはＬＮＡである。いくつかの具体例において、該オリゴマーは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、および下記ＬＮＡ単位の１以上の両方を含んでいてもよい：ベータ−Ｄまたはアルファ−Ｌ配置のいずれか、またはその組み合わせにおけるチオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、および／またはＥＮＡ。いくつかの具体例において、全ＬＮＡシトシン単位は、５’メチル−シトシンである。本発明のいくつかの具体例において、オリゴマーは、ＬＮＡおよびＤＮＡ単位の両方を含みうる。いくつかの具体例において、ＬＮＡおよびＤＮＡ単位の合わせた数は、１０−２５、または１０−２０、例えば、１２−１６である。いくつかの具体例において、オリゴマー、例えば、連続ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＬＮＡからなり、残りのヌクレオチド単位は、ＤＮＡ単位である。いくつかの具体例において、オリゴマーは、所望により修飾されたヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエートを有する、ＬＮＡヌクレオチドアナログおよび天然ヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡヌクレオチド）のみを含む。

【0151】

「ヌクレオベース」なる語は、ヌクレオチドの塩基部分を示し、天然ならびに非天然変種を包含する。かくして、「ヌクレオベース」は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、その複素環式アナログおよび互変体も包含する。

【0152】

ヌクレオベースの例は、限定するものではないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンを包含する。

【0153】

いくつかの具体例において、オリゴマー中に存在するヌクレオベースの少なくとも１つは、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾されたヌクレオベースである。

【0154】

ＬＮＡ
「ＬＮＡ」なる語は、「ロックド核酸」として知られる二環式ヌクレオチドアナログをいう。それは、ＬＮＡモノマーを示しうるが、「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」の関連で使用される場合、ＬＮＡは、１以上のかかる二環式ヌクレオチドアナログを含有するオリゴヌクレオチドをいう。ＬＮＡヌクレオチドは、例えば、下記のようなビラジカルＲ^４＊−Ｒ^２＊として示されるように、リボース糖環のＣ２’およびＣ４’間のビラジカル「架橋」の存在によって特徴付けられる。

【0155】

本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるＬＮＡは、好ましくは、式Ｉの構造を有する。

【0156】

【化3】

式中、全てのキラル中心に関し、ＲまたはＳ配置のいずれかにおいて、不斉基が見出されてもよく、
ここに、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−、−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−から選択され、例えば、いくつかの具体例において、−Ｏ−であり、
Ｂは、水素、置換されていてもよいＣ_１−４−アルコキシ、置換されていてもよいＣ_１−４−アルキル、置換されていてもよいＣ_１−４−アシルオキシ、天然およびヌクレオベースアナログを包含するヌクレオベース、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、
Ｐは、隣接モノマーに対するヌクレオチド間結合または５’末端基、例えば、置換基Ｒ^５または等しく適用可能な置換基Ｒ^５＊を包含していてもよいヌクレオチド間結合または５’末端基を示し、
Ｐ^＊は、隣接モノマーに対するヌクレオチド間結合、または３’末端基を示し、
Ｒ^４＊およびＲ^２＊は、一緒になって、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−Ｓ−、−ＳＯ_２−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−、および＞Ｃ＝Ｚから選択される１−４個の基／原子からなるビラジカルを示し、ここに、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、および−Ｎ（Ｒ^ａ）−から選択され、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、各々、独立して、水素、置換されていてもよいＣ_１−１２−アルキル、置換されていてもよいＣ_２−１２−アルケニル、置換されていてもよいＣ_２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ_２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここに、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、ここに、２つのジェミナル（geminal）置換基Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、一緒になって、置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ_２）を示していてもよく、ここに、全キラル中心について、不斉基はＲまたはＳ配置のいずれかで見出されてもよく、
存在する置換基Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊、Ｒ^６およびＲ^６＊の各々は、水素、置換されていてもよいＣ_１−１２−アルキル、置換されていてもよいＣ_２−１２−アルケニル、置換されていてもよいＣ_２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ_２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから独立して選択され、ここに、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基は一緒になって、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されていてもよいメチレンを示してもよく、ここに、Ｒ^Ｎは、水素およびＣ_１−４−アルキルから選択され、ここに２つの隣接する（非ジェミナル）置換基は、二重結合を生じる付加的な結合を示してもよく、Ｒ^Ｎ＊は、存在し、かつ、ビラジカルに関与しない場合、水素およびＣ_１−４−アルキルならびに塩基性塩およびその酸付加塩から選択される。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置のいずれで見出されてもよい。

【0157】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−、Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−、Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−ＮＲ^ａ−、Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｓ−、およびＣ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−からなる群から選択される基からなるビラジカルを示し、ここに、各Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、独立して選択されうる。いくつかの具体例において、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、水素およびＣ_１−６アルキル、例えば、メチル、例えば、水素からなる群から独立して選択されてもよい。

【0158】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は、一緒になって、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸−Ｓｅｔｈら、２０１０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ）（Ｒ−またはＳ−配置のいずれかにおける）を示す。

【0159】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）−（２’Ｏ−エチル二環式核酸−Ｓｅｔｈら、２０１０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ）（Ｒ−またはＳ−配置のいずれかにおける）を示す。

【0160】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−（Ｒ−またはＳ−配置のいずれかにおける）を示す。いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２− −（Ｓｅｔｈら、２０１０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ）を示す。

【0161】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、ビラジカル−Ｏ−ＮＲ−ＣＨ_３− −（Ｓｅｔｈら、２０１０， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ）を示す。

【0162】

いくつかの具体例において、ＬＮＡ単位は、下記の群から選択される構造を有する。

【0163】

【化4】

【0164】

いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニルまたは置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アルコキシル、置換されたＣ_１−６−アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは置換されたＣ_１−６−アミノアルキルからなる群から選択される。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されうる。

【0165】

いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊は、水素である。

【0166】

いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニルまたは置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アルコキシル、置換されたＣ_１−６−アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは置換されたＣ_１−６−アミノアルキルからなる群から選択される。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されうる。

【0167】

いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３は、水素である。

【0168】

いくつかの具体例において、Ｒ^５およびＲ^５＊は各々、独立して、Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、および−ＣＨ＝ＣＨ_２からなる群から選択される。適当には、いくつかの具体例において、Ｒ^５またはＲ^５＊のいずれかは水素であり、ここに、他の基（各々、Ｒ^５またはＲ^５＊）は、Ｃ_１−５−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニル、置換されたＣ_１−６−アルキル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルキニルまたは置換されたアシル（−Ｃ（＝Ｏ）−）からなる群から選択され、ここに、各置換された基は、独立して、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニル、置換されたＣ_２−６−アルキニル、ＯＪ_１、ＳＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、Ｎ_３、ＣＯＯＪ_１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_１Ｊ_２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ、Ｒ_２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ）Ｎ（Ｈ）Ｊ_２から選択される置換基でモノまたはポリ置換されており、ここに、ＸはＯまたはＳであり、各Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニル、置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アミノアルキル、置換されたＣ_１−６−アミノアルキルまたは保護基である。いくつかの具体例において、Ｒ^５またはＲ^５＊のいずれかは、置換されたＣ_１−６−アルキルである。いくつかの具体例において、Ｒ^５またはＲ^５＊のいずれかは、置換されたメチレンであり、ここに、好ましい置換基は、Ｆ、ＮＪ_１Ｊ_２、Ｎ_３、ＣＮ、ＯＪ_１、ＳＪ_１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_１Ｊ_２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ、Ｊ_２またはＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｊ_２から独立して選択される１以上の基を包含する。いくつかの具体例において、各Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、ＨまたはＣ_１−６−アルキルである。いくつかの具体例において、Ｒ^５またはＲ^５＊のいずれかは、メチル、エチルまたはメトキシメチルである。いくつかの具体例において、Ｒ^５またはＲ^５＊のいずれかは、メチルである。さらなる具体例において、Ｒ^５またはＲ^５＊のいずれかは、エチレニルである。いくつかの具体例において、Ｒ^５またはＲ^５＊のいずれかは、置換されたアシルである。いくつかの具体例において、Ｒ^５またはＲ^５＊のいずれかは、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_１Ｊ_２である。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されうる。かかる５’修飾二環式ヌクレオチドは、ＷＯ２００７／１３４１８１（出典明示により、その全体として本明細書の一部とされる）に開示される。

【0169】

いくつかの具体例において、Ｂはヌクレオベースであり、ヌクレオベースアナログおよび天然ヌクレオベース、例えば、プリンまたはピリミジン、または置換されたプリンまたは置換されたピリミジン、例えば、本明細書に言及されるヌクレオベース、例えば、アデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル、および／または修飾もしくは置換されたヌクレオベース、例えば、５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２’チオ−チミン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、および２，６−ジアミノプリンからなる群から選択されるヌクレオベースを包含する。

【0170】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｃ（Ｒ^ｅＲ^ｆ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｃ（Ｒ^ｅＲ^ｆ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｎ（Ｒ^ｃ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｎ（Ｒ^ｅ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｎ（Ｒ^ｃ）−Ｏ−、および−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｓ−から選択されるビラジカルを示し、ここに、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは各々、独立して、水素、置換されていてもよいＣ_１−１２−アルキル、置換されていてもよいＣ_２−１２−アルケニル、置換されていてもよいＣ_２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ_２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここに、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基Ｒ^ａおよびＲ^ｂは一緒になって、置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ_２）を示していてもよい。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されうる。

【0171】

さらなる具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｓ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−、および−ＣＨ（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３）−Ｏ−、および／または−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、および−ＣＨ＝ＣＨ−から選択されるビラジカル（二価の基）を示す。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されうる。

【0172】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、ビラジカルＣ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｎ（Ｒ^ｃ）−Ｏ−を示し、ここに、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニルまたは置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アルコキシル、置換されたＣ_１−６−アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは置換されたＣ_１−６−アミノアルキル、例えば、水素からなる群から選択され、ここに、Ｒ^ｃは、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニルまたは置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アルコキシル、置換されたＣ_１−６−アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは置換されたＣ_１−６−アミノアルキル、例えば、水素からなる群から選択される。

【0173】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、ビラジカルＣ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｏ−を示し、ここに、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃおよびＲ^ｄは、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニルまたは置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アルコキシル、置換されたＣ_１−６−アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは置換されたＣ_１−６−アミノアルキル、例えば、水素からなる群から選択される。

【0174】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は、ビラジカル−ＣＨ（Ｚ）−Ｏ−を形成し、ここに、Ｚは、Ｃ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニル、置換されたＣ_１−６−アルキル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルキニル、アシル、置換されたアシル、置換されたアミド、チオールまたは置換されたチオからなる群から選択され、ここに、置換された基の各々は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２、ＮＪ_３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２およびＣＮからなる群から選択される保護されていてもよい置換基で独立して、モノまたはポリ置換され、ここに、各Ｊ_１、Ｊ_２およびＪ_３は、独立して、ＨまたはＣ_１−６−アルキルであり、ＸはＯ、ＳまたはＮＪ_１である。いくつかの具体例において、Ｚは、Ｃ_１−６−アルキルまたは置換されたＣ_１−６−アルキルである。いくつかの具体例において、Ｚはメチルである。いくつかの具体例において、Ｚは置換されたＣ_１−６−アルキルである。いくつかの具体例において、該置換基は、Ｃ_１−６−アルコキシである。いくつかの具体例において、ＺはＣＨ_３ＯＣＨ_２−である。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されうる。かかる二環式ヌクレオチドは、ＵＳ７，３９９，８４５（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊は、水素である。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３＊は水素であり、Ｒ^５、Ｒ^５＊の１つまたは両方は、上記およびＷＯ ２００７／１３４１８１に記載のように、水素以外であってもよい。

【0175】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、架橋において置換されたアミノ基を含む、例えば、ビラジカル−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ^ｃ）−からなるか、または該ビラジカルを含むビラジカルを示し、ここに、Ｒ^ｃはＣ_１−１２−アルキルオキシである。いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は一緒になって、ビラジカル−Ｃｑ_３ｑ_４−ＮＯＲ−を示し、ここに、ｑ_３およびｑ_４は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニルまたは置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アルコキシル、置換されたＣ_１−６−アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは置換されたＣ_１−６−アミノアルキルからなる群から選択され、ここに、各置換された基は、独立して、ハロゲン、ＯＪ_１、ＳＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、ＣＯＯＪ_１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_１Ｊ_２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ_１Ｊ_２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ＝Ｎ（Ｈ）Ｊ_２から独立して選択された置換基でモノまたはポリ置換されており、ここに、ＸはＯまたはＳであり、Ｊ_１およびＪ_２の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは保護基である。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されうる。かかる二環式ヌクレオチドは、ＷＯ２００８／１５０７２９（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニルまたは置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アルコキシル、置換されたＣ_１−６−アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは置換されたＣ_１−６−アミノアルキルからなる群から選択される。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊は、水素である。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３は水素であり、Ｒ^５、Ｒ^５＊の１つまたは両方は、上記およびＷＯ ２００７／１３４１８１に記載のように、水素以外であってもよい。

【0176】

いくつかの具体例において、Ｒ^４＊およびＲ^２＊は、ビラジカル−Ｑ−を形成し、ここに、Ｑは、Ｃ（ｑ_１）（ｑ_２）Ｃ（ｑ_３）（ｑ_４）、Ｃ（ｑ_１）＝Ｃ（ｑ_３）、Ｃ［＝Ｃ（ｑ_１）（ｑ_２）］−Ｃ（ｑ_３）（ｑ_４）またはＣ（ｑ_１）（ｑ_２）−Ｃ［＝Ｃ（ｑ_３）（ｑ_４）］であり、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４は各々、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１−１２アルキル、置換されたＣ_１−１２−アルキル、Ｃ_２−１２−アルケニル、置換されたＣ_１−１２−アルコキシ、ＯＪ_１、ＳＪ_１、ＳＯＪ_１、ＳＯ_２Ｊ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ_１、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪ_１Ｊ_２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ_１、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_１Ｊ_２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ_１Ｊ_２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_１Ｊ_２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ_１Ｊ_２であり、各Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_１−６アミノアルキルまたは保護基であり、ここに、所望により、ＱがＣ（ｑ_１）（ｑ_２）（ｑ_３）（ｑ_４）であり、ｑ_３またはｑ_４の１つがＣＨ_３である場合、ｑ_３またはｑ_４の他方あるいはｑ_１およびｑ_２の１つのうちの少なくとも１つはＨ以外である。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊は水素である。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されうる。かかる二環式ヌクレオチドはＷＯ２００８／１５４４０１（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６−アルキル、置換されたＣ_１−６−アルキル、Ｃ_２−６−アルケニル、置換されたＣ_２−６−アルケニル、Ｃ_２−６−アルキニルまたは置換されたＣ_２−６−アルキニル、Ｃ_１−６−アルコキシル、置換されたＣ_１−６−アルコキシル、アシル、置換されたアシル、Ｃ_１−６−アミノアルキルまたは置換されたＣ_１−６−アミノアルキルからなる群から選択される。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５＊は水素である。いくつかの具体例において、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３は水素であり、Ｒ^５、Ｒ^５＊の１つまたは両方は、上記およびＷＯ ２００７／１３４１８１に記載されるように、水素以外であってもよい。

【0177】

いくつかの具体例において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いられるＬＮＡは、好ましくは、一般式ＩＩ：

【0178】

【化5】

【0179】

［式中、Ｙは、−Ｏ−、−ＣＨ_２Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、Ｎ（Ｒ^ｅ）および／または−ＣＨ_２−からなる群から選択され、ＺおよびＺ^＊は、独立して、ヌクレオチド間結合、Ｒ^Ｈ、末端基または保護基から選択され、Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分（ヌクレオベース）を構成し、Ｒ^Ｈは、水素およびＣ_１−４−アルキルから選択され、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂＲ^ｃ、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、所望により独立して、水素、置換されていてもよいＣ_１−１２−アルキル、置換されていてもよいＣ_２−１２−アルケニル、置換されていてもよいＣ_２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ_２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドからなる群から選択され、ここに、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基Ｒ^ａおよびＲ^ｂは一緒になって、置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ_２）を示していてもよく、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_１−４−アルキルから選択される］
で示される構造を有する。いくつかの具体例において、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂＲ^ｃ、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、所望により独立して、水素およびＣ_１−６−アルキル、例えば、メチルからなる群から選択される。全キラル中心に関し、不斉基は、ＲまたはＳ配置において見出されてもよく、例えば、２つの例示的な立体化学異性体は、下記に示されうるベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌイソ型を包含する。

【0180】

【化6】

【0181】

特定の例示的ＬＮＡ単位は、下記に示される。

【化7】

【0182】

「チオ−ＬＮＡ」なる語は、ロックドヌクレオチドを含み、ここに、上記の式中のＹは、Ｓまたは−ＣＨ_２−Ｓ−から選択される。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−配置の両方にあることができる。

【0183】

「アミノ−ＬＮＡ」なる語は、ロックドヌクレオチドを含み、ここに、上記式中のＹは、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−、および−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−から選択され、ここに、Ｒは、水素およびＣ_１−４−アルキルから選択される。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−配置の両方であることができる。

【0184】

「オキシ−ＬＮＡ」なる語は、ロックドヌクレオチドを含み、ここに、上記式中のＹは−Ｏ−を示す。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−配置の両方であることができる。

【0185】

「ＥＮＡ」なる語は、ロックドヌクレオチドを含み、ここに、上記式中のＹは、−ＣＨ_２−Ｏ−（式中、−ＣＨ_２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’−位置に結合している）である。Ｒ^ｅは、水素またはメチルである。

【0186】

いくつかの具体例において、ＬＮＡは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、特に、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡから選択される。

【0187】

ヌクレオチド間結合
「結合基」または「ヌクレオチド間結合」なる語は、２つのヌクレオチド。２つのヌクレオチドアナログ、およびヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどを一緒に共有結合することができる基を意味することが意図される。特定かつ好ましい例は、ホスフェート基およびホスホロチオエート基を包含する。

【0188】

本発明のオリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドは、結合基を介して一緒に結合されている。適当には、各ヌクレオチドは、結合基を介して３’隣接ヌクレオチドに連結されている。

【0189】

適当なヌクレオチド間結合は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２内に列挙されるもの、例えば、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２（出典明示により、本明細書の一部とされる）の第３４頁の第１段落に列挙されるヌクレオチド間結合を包含する。

【0190】

いくつかの具体例において、ヌクレオチド間結合をその通常のホスホジエステルからヌクレアーゼ攻撃により耐性なもの、例えば、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェート（これら２つは、ＲＮａｓｅ Ｈによって切断可能であり、また、標的遺伝子の発現を減少させることにおいて、アンチセンス阻害の経路を可能にする）に修飾することが好ましい。

【0191】

本明細書中に提供されるようなヌクレオチド間結合を含有する適当な硫黄（Ｓ）が好ましい場合がある。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合もまた、好ましい。

【0192】

オリゴマー中のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであってもよい。ホスホロチオエートは、改善されたヌクレアーゼ耐性、および製造容易などの他の理由で、好ましい。

【0193】

本発明のオリゴマーの一の態様において、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログは、ホスホロチオエート基によって、互いに連結されている。

【0194】

ホスホジエステル結合、例えば、１または２個の結合の、特に、ヌクレオチドアナログ単位中またはヌクレオチドアナログ単位に隣接した、別のホスホロチオエートオリゴマー中への包接は、オリゴマーのバイオアベイラビリティーおよび／または生物分解を修飾することができる（ＷＯ２００８／０５３３１４（出典明示により、本明細書の一部とされる）参照）。

【0195】

適当であるが、特異的に示されないいくつかの具体例において、例えば、上記の具体例において、全ての残りの結合基は、ホスホロジエステルまたはホスホロチオエート、またはその混合物である。

【0196】

いくつかの具体例において、ヌクレオチドアナログ間結合基の全てがホスホロチオエートである。

【0197】

特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書に提供されるものに言及する場合、種々の具体例において、結合がホスホロチオエート結合であるとき、別の結合、例えば、本明細書に開示されるものを用いてもよく、例えば、ホスフェート（ホスホロジエステル）結合を、特に、ヌクレオチドアナログ、例えば、ＬＮＡ単位間の結合に用いてもよい。

【0198】

コンジュゲート
該関連において、「コンジュゲート」なる語は、本明細書中に記載されるようなオリゴマーの、１以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分への共有結合（「コンジュゲーション」）によって形成される異種分子を示すことが意図される。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例は、巨大分子、例えば、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組み合わせを包含する。典型的には、タンパク質は、標的タンパク質の抗体であってもよい。典型的なポリマーは、ポリエチレングリコールであってもよい。

【0199】

したがって、種々の具体例において、本発明のオリゴマーは、典型的にはヌクレオチドの連続配列からなるポリヌクレオチド領域、およびさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含んでいてもよい。連続ヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーに言及する場合、該化合物は、非ヌクレオチド成分、例えば、コンジュゲート成分を含んでいてもよい。

【0200】

本発明の種々の具体例において、オリゴマー化合物は、例えば、オリゴマー化合物の細胞内取り込みを増加させるために使用されうるリガンド／コンジュゲートに結合される。ＷＯ２００７／０３１０９１（出典明示により、本明細書の一部とされる）は、適当なリガンドおよびコンジュゲートを提供する。

【0201】

本発明は、また、本明細書中に記載されるような本発明の化合物、および該化合物に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートを提供する。したがって、本明細書中に開示されるように、本発明の化合物が特定の核酸またはヌクレオチド配列を含むか、または特定の核酸またはヌクレオチド配列からなる種々の具体例において、該化合物は、また、該化合物に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば、１以上のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含まない）を含んでいてもよい。

【0202】

（コンジュゲート部分に対する）コンジュゲーションは、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強しうる。かかる部分は、限定するものではないが、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカジオールまたはウンデシル残基、ホスホリピド、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を包含する。

【0203】

本発明のオリゴマーは、また、活性な薬物物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ薬、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生物質にコンジュゲートされていてもよい。

【0204】

ある特定の具体例において、コンジュゲートされた部分は、ステロール、例えば、コレステロールである。

【0205】

種々の具体例において、コンジュゲートされた部分は、正荷電されたポリマー、例えば、１〜５０個、例えば、２〜２０個、例えば、３〜１０個の長さのアミン酸残基からなる正荷電ペプチド、および／またはポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールを含む、またはそれらからなる（ＷＯ ２００８／０３４１２３（出典明示により、本明細書の一部とされる）参照）。適当には、正荷電ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドは、リンカー、例えば、ＷＯ ２００８／０３４１２３に記載の遊離可能なリンカーを介して、本発明のオリゴマーに結合していてもよい。

【0206】

例示として、下記のコンジュゲート部分を本発明のコンジュゲートにおいて用いてもよい。

【0207】

【化8】

【0208】

活性化されたオリゴマー
「活性化されたオリゴマー」なる語は、本明細書中で使用される場合、１以上のコンジュゲートされた部分、すなわち、それ自体が核酸またはモノマーではない部分に対するオリゴマーの共有結合を可能にして本明細書中に記載のコンジュゲートを形成する、少なくとも１つの機能的部分に共有結合した（すなわち、官能化した）本発明のオリゴマーをいう。典型的には、機能的部分は、例えば、３’−ヒドロキシ基またはアデニン塩基の環外ＮＨ_２基、好ましくは親水性であるスペーサーおよびコンジュゲートされる部分に結合可能な末端基（例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）を介して、オリゴマーに共有結合できる化学基を含むであろう。いくつかの具体例において、該末端基は、保護されておらず、例えば、ＮＨ_２基である。他の具体例において、該末端基は、例えば、いずれか適当な保護基、例えば、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ． ＧｒｅｅｎｅおよびＰｅｔｅｒ Ｇ Ｍ Ｗｕｔｓによる”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、第３版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９９）に記載のものによって、保護される。適当なヒドロキシル保護基の例は、エステル、例えば、酢酸エステル、アラルキル基、例えば、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチル、およびテトラヒドロピラニルを包含する。適当なアミノ保護基の例は、ベンジル、アルファ−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、およびアシル基、例えば、トリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルを包含する。いくつかの具体例において、機能的部分は、自己切断する。他の具体例において、機能的部分は、生物分解性である。例えば、米国特許第７，０８７，２２９号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）参照。

【0209】

いくつかの具体例において、本発明のオリゴマーは、オリゴマーの５’末端にコンジュゲート部分を供給結合可能なように、５’末端で官能化されている。他の具体例において、本発明のオリゴマーは、３’末端で官能化されることができる。また他の具体例において、本発明のオリゴマーは、骨格に沿って、または複素環塩基部分上で官能化されることができる。また他の具体例において、本発明のオリゴマーは、５’末端、３’末端、骨格および塩基から独立して選択される２以上の位置で官能化されることができる。

【0210】

いくつかの具体例において、本発明の活性化されたオリゴマーは、合成の間に、機能的部分に共有結合した１以上のモノマーを組み込むことによって合成される。他の具体例において、本発明の活性化されたオリゴマーは、官能化されていないモノマーを用いて合成され、該オリゴマーは、合成の完了時に官能化される。いくつかの具体例において、オリゴマーは、アミノアルキルリンカーを含有するヒンダード（hindered）エステルで官能化されており、ここに、該アルキル部分は、式（ＣＨ_２）_ｗを有し、式中、ｗは１〜１０の整数、好ましくは約６であり、ここに、該アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分枝鎖であることができ、該官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｗＮＨ）を介してオリゴマーに結合している。

【0211】

他の具体例において、オリゴマーは、（ＣＨ_２）_ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）リンカーを含有するヒンダードエステルを用いて官能化されており、ここに、ｗは１〜１０の整数、好ましくは約６であり、ここに、該アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分枝鎖であることができ、該官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｗＳＨ）を介してオリゴマーに結合している。

【0212】

いくつかの具体例において、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドは、ポリマー部分、例えば、ポリエチレングリコールまたはペプチドとコンジュゲートされている（ジスルフィド結合の形成を介して）。

【0213】

上記のようなヒンダードエステルを含有する活性化オリゴマーは、当該分野で既知のいずれかの方法によって、特に、ＰＣＴ公開ＷＯ ２００８／０３４１２２（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される方法およびその例示によって合成することができる。

【0214】

また他の具体例において、本発明のオリゴマーは、実質的に米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に記載されるような官能化試薬、すなわち、親水性スペーサー鎖を介して一方の末端のホスホラミダイトが保護または非保護スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む反対の末端に結合した実質的に直鎖の試薬によって、スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基をオリゴマー中に導入することによって官能化される。かかる試薬は、主として、オリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの具体例において、かかる活性化されたオリゴマーは、該オリゴマーの５’−ヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。他の具体例において、活性化されたオリゴマーは、３’−ヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。また他の具体例において、本発明の活性化されたオリゴマーは、該オリゴマーの骨格上のヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。またさらなる具体例において、本発明のオリゴマーは、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に記載のような官能化試薬の２以上を用いて官能化される。かかる官能化試薬を合成し、それらをモノマーまたはオリゴマー中に組み込む方法は、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に開示されている。

【0215】

いくつかの具体例において、固相結合オリゴマーの５’末端は、ジエニルホスホラミダイト誘導体を用いて官能化され、次いで、該脱保護されたオリゴマーと、例えば、アミノ酸またはペプチドがＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環付加反応によってコンジュゲーションする。

【0216】

種々の具体例において、２’−糖修飾、例えば、２’−カルバメート置換糖または２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタルイミド）−デオキシリボース糖を含有するモノマーの該オリゴマー中への組み込みは、コンジュゲート部分、該オリゴマーの糖への共有結合を容易にする。他の具体例において、アミノ含有リンカーを１以上のモノマーの２’位置に有するオリゴマーは、試薬、例えば、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｅ−フラルイミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエトキシホスホラミダイトを用いて調製される。例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９１， ３４， ７１７１参照のこと。

【0217】

またさらなる具体例において、本発明のオリゴマーは、アミンを含有する機能的部分を、Ｎ６プリンアミノ基上、グアニンの環外Ｎ２上またはシトシンのＮ４もしくは５位置上を包含するヌクレオベース上に有していてもよい。種々の具体例において、かかる官能化は、オリゴマー合成においてすでに官能化されている市販の試薬を用いることによって達成されうる。

【0218】

いくつかの機能的部分は、商業上入手可能であり、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性結合部分は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）から入手可能である。他の市販の結合基は、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６および３’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ試薬であり、どちらも、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， Ｖａ．）から入手可能である。５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６はまた、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ．）から、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ−２として入手可能であり、３’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒはまた、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ． （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。

【0219】

インターフェロン調節遺伝子
ＨＣＶ感染の間に活性を改変した遺伝子の多くは、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）（インターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）ともいう）である。下記の表５において、インターフェロン処理によって調節されることが知られている遺伝子のリストを示す。Ｅｎｓｅｍｂｌ．Ｇｅｎｅ．ＩＤは、ｗｅｂアドレス： ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ｏｒｇにて、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースにおいて見出されるものを示す。

【0220】

【表5-1】

【0221】

【表5-2】

【0222】

【表5-3】

【0223】

【表5-4】

【0224】

【表5-5】

【0225】

【表5-6】

【0226】

【表5-7】

【0227】

【表5-8】

【0228】

【表5-9】

【0229】

【表5-10】

【0230】

【表5-11】

【0231】

【表5-12】

【0232】

【表5-13】

【0233】

【表5-14】

【0234】

【表5-15】

【0235】

【表5-16】

【0236】

【表5-17】

【0237】

【表5-18】

【0238】

【表5-19】

【0239】

【表5-20】

【0240】

【表5-21】

【0241】

【表5-22】

【0242】

【表5-23】

【0243】

【表5-24】

【0244】

【表5-25】

【0245】

【表5-26】

【0246】

投与間隔に関係する具体例
１．有効投与量の抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡ、非コーディングＲＮＡもしくはウイルスゲノムを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、各投与間の時間間隔が少なくとも１４日、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または少なくとも１２５日で霊長類に投与するために製造された組成物。
２．有効投与量が０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５、６．７５、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５、８．７５、９、９．２５、９．５、９．７５、１０、１０．２５、１０．５、１０．７５、１１、１１．２５、１１．５、１１．７５、１２、１２．２５、１２．５、１２．７５、１３、１３．２５、１３．５、１３．７５、１４、１４．２５、１４．５、１４．７５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または例えば、約２５ｍｇ／ｋｇである、具体例１に記載の医薬組成物。
３．オリゴヌクレオチドがヌクレオチドアナログを含む、具体例１〜２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
４．ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマー、および該アナログの２以上の組み合わせからなる群から選択される、具体例３に記載の医薬組成物。
５．ヌクレオチドアナログが独立して、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される、具体例４に記載の医薬組成物。
６．ヌクレオチドアナログがロックド核酸（ＬＮＡ）である、具体例５に記載の医薬組成物。
７．オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈによって切断されないミキシマーとして設計される、具体例１〜６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
８．化合物が配列番号１６２−１９９として示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つである、具体例１〜７のいずれか１つに記載の医薬組成物。
９．化合物がｍｉＲ−１２２のモジュレーターである、上記具体例のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１０．特定のマイクロＲＮＡの活性低下が利益をもたらす疾患、例えば、限定するものではないが、心不整脈、心臓肥大、癌、高コレステロール血症、代謝障害、乾癬、糖尿病、急性免疫障害、ヘモクロマトーシス、臓器移植拒絶、Ｃ型肝炎感染、または他のウイルス感染から選択される疾患に罹患している個体に投与される、具体例１〜９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１１．一連の組成物投与による有効投与量の初期蓄積（initial build up）があり、次いで、少なくとも１４日、例えな、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または少なくとも１２５日という各投与間の長い時間間隔での維持投与がある投与スケジュールのために製造される、上記具体例のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１２．有効投与量の初期蓄積が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日以内あるいは３、４、５または６週以内で起こる、具体例１〜１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１３．対象、例えば霊長類、例えばヒトに対する投与のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コーディングＲＮＡまたはウイルスゲノムの配列に相補的であり、標的組織において有効濃度の該オリゴヌクレオチドを提供する投与量での投与のために製造され、各投与間の時間間隔が少なくとも１４日、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または少なくとも１２５日で投与されうるオリゴヌクレオチド。
１４．有効投与量が０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５、６．７５、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５、８．７５、９、９．２５、９．５、９．７５、１０、１０．２５、１０．５、１０．７５、１１、１１．２５、１１．５、１１．７５、１２、１２．２５、１２．５、１２．７５、１３、１３．２５、１３．５、１３．７５、１４、１４．２５、１４．５、１４．７５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または例えば、約２５ｍｇ／ｋｇである、具体例１３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１５．ヌクレオチドアナログを含む、具体例１３〜１４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１６．ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマーからなる群から選択される、具体例１５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１７．ヌクレオチドアナログが独立して、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される、具体例１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１８．ヌクレオチドアナログがロックド核酸（ＬＮＡ）である、具体例１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９．ＲＮａｓｅ Ｈによって切断されないミキシマーとして設計される、具体例１３〜１８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０．配列番号１６２−１９９のいずれか１つである、具体例１３〜１９のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２１．ｍｉＲ−１２２のモジュレーターである、上記具体例のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２２．特定のマイクロＲＮＡの活性低下が利益をもたらす疾患、例えば、限定するものではないが、臓器移植拒絶、心不整脈、心臓肥大、癌、高コレステロール血症、代謝障害、乾癬、糖尿病、急性免疫障害、ヘモクロマトーシス、Ｃ型肝炎感染、または他のウイルス感染から選択される疾患に罹患している個体に投与される、具体例１３〜２１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２３．具体例１３〜２２のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの一連の１以上の投与による、標的組織における有効投与量の初期蓄積があり、次いで、少なくとも１４日、例えな、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または少なくとも１２５日という各投与間に長い時間間隔をおいた維持投与があり、該維持投与が標的組織における該オリゴヌクレオチドの有効投与量を維持する投与スケジュールのために製造される、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
２４．有効投与量の初期蓄積が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日以内あるいは３、４、５または６週以内で起こる、具体例１３〜２３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２５．具体例１〜１２のいずれか１つに記載の医薬組成物の投与によって、対象におけるマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ、またはウイルスゲノムの活性を阻害する方法。
２６．対象における疾患または障害を治療する方法であって、該疾患または障害が、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ、またはウイルスゲノムのダウンレギュレーションに対して感受性であることにより特徴付けられ、かつ、該方法が少なくとも２工程を含み、第１工程が、上記マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ、またはウイルスゲノムに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドをの頻回投与（少なくとも１回）が標的組織における該アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効投与量を蓄積する、投与量蓄積工程（dosage building step）であり、第２工程において、霊長類に対する該オリゴヌクレオチドのあまり頻繁ではない投与によって、該有効投与量が標的組織において維持され、ここに、維持工程の各投与間の時間間隔が少なくとも１４日、例えば少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または少なくとも１２５日である、方法。
２７．オリゴヌクレオチドがヌクレオチドアナログを含む、具体例２６に記載の対象において疾患または障害を治療する方法。
２８．ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマーからなる群から選択される、具体例２７に記載の対象において疾患または障害を治療する方法。
２９．ヌクレオチドアナログが独立して、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される、具体例２８に記載の対象において疾患または障害を治療する方法。
３０．ヌクレオチドアナログがロックド核酸（ＬＮＡ）である、具体例２９に記載の対象において疾患または障害を治療する方法。
３１．オリゴヌクレオチドが本質的にＲＮＡｓｅＨを動員できない、具体例２６〜３０のいずれか１つに記載の対象において疾患または障害を治療する方法。
３２．オリゴヌクレオチドが配列番号１６２−１９９のいずれか１つである、具体例２６〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１２２である、具体例２６〜３２のいずれか１つに記載の霊長類において疾患または障害を治療する方法。
３４．具体例１〜１２のいずれか１つの組成物が、特定のマイクロＲＮＡの活性低下が利益をもたらす疾患、例えば、限定するものではないが、臓器移植拒絶、心不整脈、心臓肥大、癌、高コレステロール血症、代謝障害、乾癬、糖尿病、急性免疫障害、ヘモクロマトーシス、Ｃ型肝炎感染、または他のウイルス感染から選択される疾患に罹患している個体に投与される、具体例３３に記載の対象において疾患または障害を治療する方法。
３５．一連の投与による有効投与量の初期蓄積があり、次いで、少なくとも１４日、例えな、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または少なくとも１２５日という各投与間に長い時間間隔をおいた維持投与がある、具体例２６〜３４のいずれか１つに記載の対象において疾患または障害を治療する方法。
３６．有効投与量の初期蓄積が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日以内あるいは３、４、５または６週以内で起こる、具体例２６〜３５のいずれか１つに記載の疾患を治療する方法。
３７．初期投与量蓄積が連続的な注入、または徐放性処方の注射、または吸入によるものである、具体例１〜３６のいずれか１つに記載の疾患を治療する方法。
３８．維持投与量が静脈内注射、皮下、腹腔内、吸入、脳室内、筋内、眼窩内、嚢内、髄腔内、胸骨内（intrasternal）、静脈内または鼻腔内によって投与される、具体例１〜３７のいずれか１つに記載の疾患を治療する方法。

【0247】

いくつかの具体例において、本発明において提供される治療方法および組成物は、上記具体例に記載の方法および投与計画にしたがって使用してもよい。

【0248】

インターフェロン非応答性ＨＣＶ患者の治療、および臓器移植拒絶の治療に関係する具体例
１．抗マイクロＲＮＡ−１２２オリゴヌクレオチドの有効投与量を含む医薬組成物であって、細胞への投与のために製造される組成物。
２．細胞が霊長類、例えばヒトにおけるものである、具体例１に記載の医薬組成物。
３．細胞が肝臓細胞である、具体例１および２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
４．細胞がＨＣＶに感染しており、かつ、ＨＣＶ感染の治療のために製造される、具体例１〜３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
５．ＨＣＶ感染によって引き起こされる肝線維症または肝臓癌の発症を防ぐために、ＨＣＶ感染の治療または予防のために製造される、具体例４に記載の医薬組成物。
６．細胞が、増加したレベルのインターフェロン刺激遺伝子転写産物を発現していることによって特徴付けられる、具体例１〜５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
７．インターフェロン刺激遺伝子転写産物が表５に挙げられたもののいずれか１つである、具体例６に記載の医薬組成物。
８．インターフェロン刺激遺伝子転写産物がＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４のうちのいずれか１つである、具体例７に記載の医薬組成物。
９．細胞が臓器移植した対象におけるものであり、移植拒絶の予防のために製造される、具体例１〜８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１０．臓器が肝臓である、具体例９に記載の医薬組成物。
１１．ｍｉＲ−１２２を標的とする抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号２−１１、１８、６８、１１８、１６６、１６７、または７５−１０２から選択される、具体例１〜１０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１２．抗マイクロＲＮＡ−１２２オリゴヌクレオチドが配列番号２−１１、１８、６８、１１８、１６６、１６７、または７５−１０２のいずれか１つの配列を含むか、または該配列からなる、具体例１１に記載の医薬組成物。
１３．抗マイクロＲＮＡ−１２２オリゴヌクレオチドがヌクレオチドアナログを含む、具体例１〜１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１４．ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマーからなる群から選択される、具体例１３に記載の医薬組成物。
１５．ヌクレオチドアナログが独立して、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される、具体例１４に記載の医薬組成物。
１６．ヌクレオチドアナログがロックド核酸（ＬＮＡ）である、具体例１５に記載の医薬組成物。
１７．霊長類の肝臓におけるマイクロＲＮＡ−１２２の活性を阻害するために製造される、具体例１〜１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１８．臓器移植を受け、移植拒絶の危険性がある患者の診断のために製造されるキットであって、表５における遺伝子転写産物のいずれか１つを検出するために製造されるキット。
１９．ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４を検出するために製造される、具体例１８に記載のキット。
２０．患者由来の尿試料中のＩＰ−１０レベルを検出するために製造される、具体例１９に記載のキット。
２１．具体例１〜１７のいずれか１つに記載の組成物が、インターフェロン非応答者、または緩慢な応答者、部分的応答者、または再発者であるＨＣＶ感染対象の治療に使用される、治療方法。
２２．具体例１〜１７のいずれか１つに記載の組成物が臓器移植拒絶の予防のために使用される、治療方法。
２３．臓器が肝臓である、具体例２２に記載の治療方法。

【0249】

さらなる具体例：
いくつかの態様において、本発明は、本明細書および具体例において記載された本発明の具体例と組み合わせてもよい本発明の下記の具体例によって説明されうる。下記の方法のほかに、本発明は、該マイクロ−ＲＮＡアンタゴニスト、例えば、マイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニスト（例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２）の該方法のための使用、ならびに該方法において使用するためのマイクロ−ＲＮＡアンタゴニストを含むコンジュゲートおよび医薬組成物を包含する。さらに、本発明は、該治療方法のための医薬の製造におけるマイクロ−ＲＮＡアンタゴニストの使用を含む。対象は、典型的に、治療を必要とする霊長類（患者ともいう）、例えばヒトである。対象または細胞は、ＨＣＶに感染していてもよく、インターフェロンおよび／またはリバビリン治療に対して非応答性、または緩慢な応答性、部分的応答性、または再発としての病歴を有していてもよい。対象は、別の治療、例えば、インターフェロンおよび／またはリバビリン治療と組み合わせて、マイクロ−ＲＮＡアンタゴニストで治療されていてもよい。組み合わせ治療は、有効量の各組み合わせ治療剤を含む合わせた、または別々の医薬組成物の対象への投与をいう。組み合わせ剤は、必ずしも同じ時点で対象に提供される必要はないことが理解されるべきである。実際、第２および／または第３の治療剤をマイクロ−ＲＮＡアンタゴニストの投与の前、投与と同時または投与の後に投与してもよい。いくつかの具体例において、マイクロ−ＲＮＡアンタゴニストは、第２または第３の剤（例えば、インターフェロンおよび／またはリバビリン）の前に投与してもよく、第２および／または第３の治療剤は後で適当な時点で、例えば、マイクロ−ＲＮＡ阻害剤の投与の少なくとも１週間後、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも３週間後に投与される。適当には、第２および／または第３の治療剤は、マイクロ−ＲＮＡ阻害剤の投与後、４ヶ月以内（いくつかの態様において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週以内）、例えば、マイクロ−ＲＮＡ阻害剤の投与後、３ヶ月（いくつかの態様において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週）よりも後に投与される。いくつかの態様において、第２および／または第３の治療剤は、マイクロ−ＲＮＡアンタゴニストが患者／細胞中のＨＣＶ力価を減少させたらすぐに、またはインターフェロン刺激遺伝子転写産物の増加レベルに影響を及ぼしたとき（すなわち、インターフェロン刺激遺伝子転写産物のレベルの減少）、投与される。ＨＣＶ力価の減少および／またはインターフェロン刺激遺伝子転写産物のレベルの減少は、いくつかの具体例において、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％であってもよい。

【0250】

１．ＨＣＶ感染対象を治療する方法であって、有効量のマイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニストを該対象に投与することを含み、該対象がインターフェロン非応答者、または緩慢な応答者、部分的応答者、または再発者である、方法。
２．ＨＣＶ感染対象がさらに有効量のインターフェロンで治療される、具体例１に記載の方法。
３．インターフェロンがペグ化されたインターフェロンアルファである、具体例２に記載の方法。
４．ＨＣＶ感染対象が有効量のレバビリンでさらに治療される、具体例１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．有効量のマイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニストを対象に投与することを含む患者において臓器移植拒絶を予防する方法であって、該対象が臓器移植患者である、方法。
６．患者がさらに有効量のインターフェロンで治療される、具体例５に記載の方法。
７．患者がさらにペグ化されたインターフェロンアルファで治療される、具体例５または６に記載の方法。
８．患者がＨＣＶ感染している、具体例５〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．移植された臓器が肝臓である、具体例５〜８のいずれかに記載の方法。
１０．ＨＣＶ感染細胞中のＨＣＶ力価を減少させる方法であって、有効量のマイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニストを該細胞に投与することを含み、該細胞がインターフェロン治療に非応答性である、方法。
１１．細胞が肝臓細胞である、具体例１１に記載の方法。
１２．細胞がインターフェロン刺激遺伝子転写産物の増加レベルを発現することによって特徴付けられる、具体例１１に記載の方法。
１３．インターフェロン刺激遺伝子転写産物が表５に挙げられるもののいずれか１つである、具体例１２に記載の方法。
１４．インターフェロン刺激遺伝子転写産物がＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４のいずれか１つである、具体例１３に記載の方法。
１５．細胞が臓器移植された対象におけるものであり、組成物が移植拒絶の予防のために製造される、具体例１０〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．具体例５〜９の方法を含む、具体例１〜４のいずれか１つに記載の方法。
１７．具体例１０〜１５の方法を含む、具体例１〜４のいずれか１つに記載の方法。
１８．具体例１０〜１５の方法を含む、具体例５〜９のいずれか１つに記載の方法。
１９．対象が霊長類、例えばヒト、例えば治療を必要とするヒトである、具体例１〜１８のいずれか１つに記載の方法。

【0251】

治療方法に関係する本発明のさらなる具体例：
１．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した、インターフェロン療法にあまり応答しない対象を治療する方法であって、有効量のマイクロ−ＲＮＡ−１２２（ｍｉＲ−１２２）アンタゴニストを該対象に投与することを含む方法。
２．ＨＣＶに感染した対象がインターフェロン非応答者、インターフェロンに緩慢な応答者、インターフェロン部分的応答者、または再発者である、具体例１に記載の方法。
３．ＨＣＶに感染した対象がインターフェロン非応答性である、具体例１または具体例２に記載の方法。
４．治療の不在下で、該ＨＣＶに感染した対象が、インターフェロン治療に効果的に応答する非治療ＨＣＶ患者と比べて増加した転写レベルの少なくとも１つのインターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）を示す、具体例１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．該少なくとも１つのＩＲＧが表５に挙げられるＩＲＧである、具体例４に記載の方法。
６．該少なくとも１つのＩＲＧがＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１、ＩＦＩ４４、またはその組み合わせである、具体例４または具体例５に記載の方法。
７．該ｍｉＲ−１２２アンタゴニスト投与が対象におけるＩＲＧ転写レベルを減少させる、具体例１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．さらにインターフェロンを投与することを含む具体例１〜７のいずれか１つに記載の方法であって、対象が該インターフェロン投与に対して改善された応答性を示すところの、方法。
９．効力に必要とされるインターフェロン投与量が、インターフェロン単独でのＨＣＶ感染対象の治療と比べて減少される、具体例８に記載の方法。
１０．インターフェロンがペグ化されたインターフェロンアルファである、具体例８または具体例９に記載の方法。
１１．さらに有効量のリバビリンを投与することを含む、具体例１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．インターフェロン治療にあまり応答しないＨＣＶ感染細胞中のＨＣＶ力価を減少させる方法であって、有効量のマイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニストを該細胞に投与することを含む方法。
１３．細胞が肝臓細胞である、具体例１２に記載の方法。
１４．インターフェロンの不在下で、該ＨＣＶ感染細胞が、インターフェロン治療に応答するＨＣＶ感染細胞と比べて増加した転写レベルの少なくとも１つのＩＲＧを示す、具体例１２または具体例１３に記載の方法。
１５．ｍｉＲ−１２２アンタゴニストが抗−ｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドである、具体例１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．抗−ｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（２）（配列番号１０）
（ｉｉ）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（３）（配列番号１２）
ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（４）（配列番号１０）
（ｉｉｉ）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（５）（配列番号７６）
（ｉｖ）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＣＣＴＣＣ（６）（配列番号７７）
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（７）（配列番号１２）
ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（８）（配列番号１０）
ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（９）（配列番号１０）
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（１０）（配列番号７６）
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（１１−−３６４９））（配列番号１２）
（ｖ）ＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（１８）（配列番号７）
（ｖｉ）ＣＡＣＡＣＴＣＣ（６８）（配列番号６）
（ｖｉｉ）ＡＣＡＣＴＣＣ（１１８）（配列番号５）
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（１６６）（配列番号１２）
ＣＡＣＡＣＴＣＣ（１６７）（配列番号６）
（ｖｉｉｉ）（７５）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡ（配列番号７８）
（ｉｘ）（７６）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号７９）
（ｘ）（７７）ＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号８０）
（ｘｉ）（７８）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号８１）
（７９）ＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号８０）
（８０）ＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号８０）
（８１）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号７９）
（８２）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡ（配列番号７８）
（８３）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号７６）
（ｘｉｉ）（８４）ＣＣＡＴＴＧＴＡＡＣＴＣＴＣＣＡ（配列番号８２）
（８５）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号７６）
（８６）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１２）
（８７）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１０）
（８８）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１２）
（８９）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１０）
（９０）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１０）
（９１）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１０）
（９２）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１２）
（９３）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号７６）
（９４）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号７６）
（ｘｉｉｉ）（９５）ＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ（配列番号８３）
（ｘｉｖ）（９６）ＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡ（配列番号８４）
（ｘｖ）（９７）ＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ（配列番号８５）
（ｘｖｉ）（９８）ＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡ（配列番号８６）
（ｘｖｉｉ）（９９）ＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号８７）
（ｘｖｉｉｉ）（１００）ＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号８８）
（ｘｉｘ）（１０１）ＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号８９）
（ｘｘ）（１０２）ＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号９０）
および該抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせ（括弧内に仮に配列番号が示される）（ここに、Ｃはシトシンまたは^ＭｅＣである）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、具体例１５に記載の方法。
１７． 抗−ｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（２）（配列番号１０）
（ｉｉ）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（３）（配列番号１２）
ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（４）（配列番号１０）
（ｉｉｉ）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（５）（配列番号７６）
（ｉｖ）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＣＣＴＣＣ（６）（配列番号７７）
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（７）（配列番号１２）
ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（８）（配列番号１０）
ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（９）（配列番号１０）
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（１０）（配列番号７６）
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（１１−−３６４９））（配列番号１２）
（ｖ）ＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（１８）（配列番号７）
（ｖｉ）ＣＡＣＡＣＴＣＣ（６８）（配列番号６）
（ｖｉｉ）ＡＣＡＣＴＣＣ（１１８）（配列番号５）
ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（１６６）（配列番号１２）
ＣＡＣＡＣＴＣＣ（１６７）（配列番号６）
（ｖｉｉｉ）（７５）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡ（配列番号７８）
（ｉｘ）（７６）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号７９）
（ｘ）（７７）ＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号８０）
（ｘｉ）（７８）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号８１）
（７９）ＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号８０）
（８０）ＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号８０）
（８１）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ（配列番号７９）
（８２）ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡ（配列番号７８）
（８３）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号７６）
（ｘｉｉ）（８４）ＣＣＡＴＴＧＴＡＡＣＴＣＴＣＣＡ（配列番号８２）
（８５）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号７６）
（８６）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１２）
（８７）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１０）
（８８）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１２）
（８９）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１０）
（９０）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１０）
（９１）ＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１０）
（９２）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（配列番号１２）
（９３）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号７６）
（９４）ＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号７６）
（ｘｉｉｉ）（９５）ＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ（配列番号８３）
（ｘｉｖ）（９６）ＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡ（配列番号８４）
（ｘｖ）（９７）ＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ（配列番号８５）
（ｘｖｉ）（９８）ＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡ（配列番号８６）
（ｘｖｉｉ）（９９）ＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号８７）
（ｘｖｉｉｉ）（１００）ＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号８８）
（ｘｉｘ）（１０１）ＧＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号８９）
（ｘｘ）（１０２）ＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＡＡ（配列番号９０）
および該抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせ（括弧内に仮に配列番号が示される）（ここに、Ｃはシトシンまたは^ＭｅＣである）からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、具体例１５に記載の方法。
１８．抗ｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのアナログを含む、具体例１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．該少なくとも１つのヌクレオチドアナログが、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）モノマー、ｃＥｔモノマー、ｃＭＯＥモノマー、５’−Ｍｅ−ＬＮＡモノマー、２’−（３−ヒドロキシ）プロピル−ＲＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）モノマー、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）モノマー、および該ヌクレオチドアナログの２以上の組み合わせからなる群から選択される、具体例１８に記載の方法。
２０．該少なくとも１つのヌクレオチドアナログがＬＮＡである、具体例１８または具体例１９に記載の方法。
２１．抗−ｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）ＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣ（２）（配列番号６０）
（ｉｉ）ｃｃＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣ（３）（配列番号５９）
（ｉｉｉ）ａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃ（４）（配列番号５８）
（ｉｖ）ｃｃＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣａ（５）（配列番号５６）
（ｖ）ｃＣａＴｔＧｔＣａＣｃＣｔＣｃ（６）（配列番号７５）
（ｖｉ）ｃＣａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃ（７）（配列番号５７）
（ｖｉｉ）ＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（８）（配列番号６２）
（ｖｉｉｉ）ａＴｔＧｔＣａＣａＣｔＣｃ（９）（配列番号６１）
（ｉｘ）ｃＣａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃａ（１０）（配列番号５４）
（ｘ）ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（１１−−３６４９））（配列番号４５）
（ｘｉ）ＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（１８）（配列番号７）
（ｘｉｉ）ＣＡＣＡＣＴＣＣ（６８）（配列番号６）
（ｘｉｉｉ）ＡＣＡＣＴＣＣ（１１８）（配列番号５）
ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（１６６）（配列番号４５）
ＣＡＣＡＣＴＣＣ（１６７）（配列番号６）
（ｘｉｖ）（７５）ｔｇＣａｔＧｇａＴｔｔＧｃａＣａ（配列番号４６）
（ｘｖ）（７６）ｔｇＣａｔＧｇａＴｔｔＧｃａＣ（配列番号４７）
（ｘｖｉ）（７７）ＣａｔＧｇａＴｔｔＧｃａＣ（配列番号４８）
（ｘｖｉｉ）（７８）ｔＧｃＡｔＧｇＡｔＴｔＧｃＡｃ（配列番号４９）
（ｘｖｉｉｉ）（７９）ｃＡｔＧｇＡｔＴｔＧｃＡｃ（配列番号５０）
（ｘｉｘ）（８０）ＣａｔＧＧａｔＴｔＧｃＡＣ（配列番号５１）
（ｘｘ）（８１）ＴｇＣａｔＧＧａｔＴｔＧｃＡＣ（配列番号５２）
（ｘｘｉ）（８２）ＴｇＣａＴｇＧａＴＴｔＧｃＡＣａ（配列番号５３）
（ｘｘｉｉ）（８３）ｃＣａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃａ（配列番号５４）
（ｘｘｉｉｉ）（８４）ｃＣａｔＴｇｔＡａｃＴｃｔＣｃａ（配列番号５５）
（８５）ｃｃＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣａ（配列番号５６）
（８６）ｃＣａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃ（配列番号５７）
（８７）ａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃ（配列番号５８）
（８８）ｃｃＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣ（配列番号５９）
（８９）ＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣ（配列番号６０）
（９０）ａＴｔＧｔＣａＣａＣｔＣｃ（配列番号６１）
（９１）ＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（配列番号６２）
（９２）ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（配列番号４５）
（ｘｘｉｖ）（９３）ＣｃａＴｔｇＴｃａｃＡｃｔｃＣａ（配列番号６３）
（ｘｘｖ）（９４）ＣＣＡｔｔｇｔｃａｃａｃＴＣＣａ（配列番号６４）
（ｘｘｖｉ）（９５）ｔＣａｃＧａｔＴａｇＣａｔＴａａ（配列番号６５）
（ｘｘｖｉｉ）（９６）ａＴｃａＣｇａＴｔａＧｃａＴｔａ（配列番号６６）
（ｘｘｖｉｉｉ）（９７）ＴｃＡｃＧａＴｔＡｇＣａＴｔＡａ（配列番号６７）
（ｘｘｉｘ）（９８）ＡｔｃＡｃＧａＴｔＡｇＣａＴｔａ（配列番号６８）
（ｘｘｘ）（９９）ｇＡｇｃＣｇａＡｃｇＡａｃＡａ（配列番号６９）
（ｘｘｘｉ）（１００）ｇｃＣｇａＡｃｇＡａｃＡａ（配列番号７０）
（ｘｘｘｉｉ）（１０１）ＧａＧｃＣｇＡａＣｇＡａＣａＡ（配列番号７１）
（ｘｘｘｉｉｉ）（１０２）ＧｃＣｇＡａＣｇＡａＣａＡ（配列番号７２）
および該抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせ（括弧内に仮に配列番号が示される）（ここに、小文字はＤＮＡ単位の窒素含有塩基を示し、大文字は、ＬＮＡ単位の窒素含有塩基を示し、Ｃおよびｃは各々、独立して、シトシンまたは^ＭｅＣである）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、具体例１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．抗−ｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）ＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣ（２）（配列番号６０）
（ｉｉ）ｃｃＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣ（３）（配列番号５９）
（ｉｉｉ）ａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃ（４）（配列番号５８）
（ｉｖ）ｃｃＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣａ（５）（配列番号５６）
（ｖ）ｃＣａＴｔＧｔＣａＣｃＣｔＣｃ（６）（配列番号７５）
（ｖｉ）ｃＣａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃ（７）（配列番号５７）
（ｖｉｉ）ＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（８）（配列番号６２）
（ｖｉｉｉ）ａＴｔＧｔＣａＣａＣｔＣｃ（９）（配列番号６１）
（ｉｘ）ｃＣａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃａ（１０）（配列番号５４）
（ｘ）ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（１１−−３６４９））（配列番号４５）
（ｘｉ）ＴＣＡＣＡＣＴＣＣ（１８）（配列番号７）
（ｘｉｉ）ＣＡＣＡＣＴＣＣ（６８）（配列番号６）
（ｘｉｉｉ）ＡＣＡＣＴＣＣ（１１８）（配列番号５）
ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（１６６）（配列番号４５）
ＣＡＣＡＣＴＣＣ（１６７）（配列番号６）
（ｘｉｖ）（７５）ｔｇＣａｔＧｇａＴｔｔＧｃａＣａ（配列番号４６）
（ｘｖ）（７６）ｔｇＣａｔＧｇａＴｔｔＧｃａＣ（配列番号４７）
（ｘｖｉ）（７７）ＣａｔＧｇａＴｔｔＧｃａＣ（配列番号４８）
（ｘｖｉｉ）（７８）ｔＧｃＡｔＧｇＡｔＴｔＧｃＡｃ（配列番号４９）
（ｘｖｉｉｉ）（７９）ｃＡｔＧｇＡｔＴｔＧｃＡｃ（配列番号５０）
（ｘｉｘ）（８０）ＣａｔＧＧａｔＴｔＧｃＡＣ（配列番号５１）
（ｘｘ）（８１）ＴｇＣａｔＧＧａｔＴｔＧｃＡＣ（配列番号５２）
（ｘｘｉ）（８２）ＴｇＣａＴｇＧａＴＴｔＧｃＡＣａ（配列番号５３）
（ｘｘｉｉ）（８３）ｃＣａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃａ（配列番号５４）
（ｘｘｉｉｉ）（８４）ｃＣａｔＴｇｔＡａｃＴｃｔＣｃａ（配列番号５５）
（８５）ｃｃＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣａ（配列番号５６）
（８６）ｃＣａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃ（配列番号５７）
（８７）ａｔＴｇｔＣａｃＡｃｔＣｃ（配列番号５８）
（８８）ｃｃＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣ（配列番号５９）
（８９）ＡｔｔＧｔｃＡｃａＣｔｃＣ（配列番号６０）
（９０）ａＴｔＧｔＣａＣａＣｔＣｃ（配列番号６１）
（９１）ＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（配列番号６２）
（９２）ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ（配列番号４５）
（ｘｘｉｖ）（９３）ＣｃａＴｔｇＴｃａｃＡｃｔｃＣａ（配列番号６３）
（ｘｘｖ）（９４）ＣＣＡｔｔｇｔｃａｃａｃＴＣＣａ（配列番号６４）
（ｘｘｖｉ）（９５）ｔＣａｃＧａｔＴａｇＣａｔＴａａ（配列番号６５）
（ｘｘｖｉｉ）（９６）ａＴｃａＣｇａＴｔａＧｃａＴｔａ（配列番号６６）
（ｘｘｖｉｉｉ）（９７）ＴｃＡｃＧａＴｔＡｇＣａＴｔＡａ（配列番号６７）
（ｘｘｉｘ）（９８）ＡｔｃＡｃＧａＴｔＡｇＣａＴｔａ（配列番号６８）
（ｘｘｘ）（９９）ｇＡｇｃＣｇａＡｃｇＡａｃＡａ（配列番号６９）
（ｘｘｘｉ）（１００）ｇｃＣｇａＡｃｇＡａｃＡａ（配列番号７０）
（ｘｘｘｉｉ）（１０１）ＧａＧｃＣｇＡａＣｇＡａＣａＡ（配列番号７１）
（ｘｘｘｉｉｉ）（１０２）ＧｃＣｇＡａＣｇＡａＣａＡ（配列番号７２）
および該抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせ（括弧内に仮に配列番号が示される）（ここに、小文字はＤＮＡ単位の窒素含有塩基を示し、大文字は、ＬＮＡ単位の窒素含有塩基を示し、Ｃおよびｃは各々、独立して、シトシンまたは^ＭｅＣである）からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、具体例１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２３．大文字のシトシンが^ＭｅＣである、具体例２１または具体例２２に記載の方法。
２４．抗−マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間結合、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、またはその組み合わせを含む、具体例１５〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．抗−マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、具体例２４に記載の方法。
２６．抗−マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の全てがホスホロチオエートヌクレオチド間結合である、具体例２４または具体例２５に記載の方法。
２７．対象が霊長類である、具体例１〜１１または１５〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．ｍｉＲ−１２２アンタゴニストが霊長類の肝臓においてマイクロＲＮＡ−１２２の活性を阻害する、具体例２７に記載の方法。
２９．霊長類がヒトである、具体例２７または具体例２８に記載の方法。
３０．対象が臓器移植患者である、具体例１〜１１または１５〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．移植された臓器が肝臓である、具体例３０に記載の方法。

【0252】

方法の概要
実施例で使用されるＬＮＡ−修飾オリゴヌクレオチドは、完全ホスホロチオエート骨格を有する非コンジュゲートＬＮＡ／ＤＮＡミキシマーとして合成された。ＨＣＶ複製アッセイのための２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチドおよびａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２は、記載のとおりに合成された^１４，６。セーライン処方（formulated）の化合物は、正常および高コレステロール血症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、腹腔内注射によって投与され、コレステロールおよび血清トランスアミナーゼ測定のために、血液試料が収集された。肝臓試料は、ＲＮＡ抽出、ｍｉＲＮＡ定量化および肝臓組織病理学のために調製された。マウス肝臓ＲＮＡのマイクロアレイ発現プロファイリングは、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールにしたがって実施され、データはＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓデータベースに提出された。データ分析のために、標準的なＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ^２４パッケージを用いた。社内のＰｅｒｌスクリプトを用いて、転写産物３’ＵＴＲをｍｉＲ−１２２シードマッチ^２５の存在について検索した。ｍＲＮＡ定量化は、標準的なＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。３０匹の雌の薬物を投与していない若い成体アフリカミドリザルを６群（１群あたりｎ＝５）に割り当て、１日１回、１、３、および５日目に、〜１０分かけて２４ｍｌ／ｋｇ／ｈの速度で静脈内注入した。４つの処理群がリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）または１、３もしくは１０ｍｇ／ｋｇ ＰＢＳ−処方ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲを投与され、その全てが肝臓生検を受け、一方、２つの群が肝臓生検なしにＰＢＳまたは１０ｍｇ／ｋｇ ＰＢＳ−処方ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲを受けた。臨床化学および血液学測定のために、血液試料が収集された。全コレステロールは、マイクロタイタープレートにおいて酵素測定された。リポタンパク質コレステロール分布は、ＦＰＬＣによって決定され、アポリポタンパク質レベルはＥＬＩＳＡによって決定された。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲのイン・サイチュ（in situ）検出は、ＦＡＭ−標識ＬＮＡプローブおよびシアニン３−プラス・チラミド（Cyanine 3-Plus tyramide）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と組み合わせたＨＲＰ−コンジュゲートポリクローナルウサギ抗−ＦＩＴＣ抗体（ＤＡＫＯ）を用いて、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処理したサルおよび対照サルの凍結肝臓切片上で実施された。肝臓ＲＮＡのノーザンブロット分析は、５’ ＦＡＭ−標識したＬＮＡ−修飾ｍｉＲ−１２２プローブおよび検出用ＥＣＬアドバンスドキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と組み合わせた抗フルオレセイン−ＨＲＰ抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， ＮＥＦ７１０）を用いて実施された。

【0253】

具体例
１．有効投与量の抗マイクロＲＮＡ−１２２オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、細胞へ投与するために製造される組成物。
２．細胞が霊長類、例えばヒトにおけるものである、具体例１に記載の医薬組成物。
３．細胞が肝臓細胞である、具体例１および２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
４．細胞がＨＣＶに感染しており、ＨＣＶ感染の治療のために製造される、具体例１〜３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
５．ＨＣＶ感染によって引き起こされる肝線維症または肝臓癌の発症を予防するために、ＨＣＶ感染の治療または予防のために製造される、具体例４に記載の医薬組成物。
６．細胞が、増加したレベルのインターフェロン刺激遺伝子転写産物を発現することによって特徴付けられる、具体例１〜５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
７．インターフェロン刺激遺伝子転写産物が表５に挙げられたもののいずれか１つである、具体例６に記載の医薬組成物。
８．インターフェロン刺激遺伝子転写産物がＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４のいずれか１つである、具体例７に記載の医薬組成物。
９．細胞が臓器移植された対象におけるものであり、組成物が移植拒絶の予防のために製造される、具体例１〜８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１０．臓器が肝臓である、具体例９に記載の医薬組成物。
１１．ｍｉＲ−１２２を標的とする抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号２−１１、１８、６８、１１８、１６６、１６７または７５−１０２から選択される、具体例１〜１０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１２．抗マイクロＲＮＡ−１２２オリゴヌクレオチドが配列番号２−１１、１８、６８、１１８、１６６、１６７、または７５−１０２のいずれか１つの配列を含むか、または該配列からなる、具体例１１に記載の医薬組成物。
１３．抗マイクロＲＮＡ−１２２オリゴヌクレオチドがヌクレオチドアナログを含む、具体例１〜１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１４．ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマーからなる群から選択される、具体例１３に記載の医薬組成物。
１５．ヌクレオチドアナログが独立して、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡ、およびＬＮＡからなる群から選択される、具体例１４に記載の医薬組成物。
１６．ヌクレオチドアナログがロックド核酸（ＬＮＡ）である、具体例１５に記載の医薬組成物。
１７．霊長類の肝臓におけるマイクロＲＮＡ−１２２の活性を阻害するために製造される、具体例１〜１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１８．臓器移植を受けており、移植拒絶の危険性がある患者の診断のために製造されるキットであって、表５における遺伝子転写産物のいずれか１つを検出するために製造されるキット。
１９．ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４を検出するために製造される、具体例８に記載のキット。
２０．患者由来の尿試料中のＩＰ−１０レベルを検出するために製造される、具体例９に記載のキット。
２１．具体例１〜１７のいずれか１つに記載の組成物がインターフェロン非応答性であるＨＣＶ感染対象の治療のために使用される、治療方法。
２２．具体例１〜１７のいずれか１つに記載の組成物が臓器移植拒絶の予防のために使用される、治療方法。
２３．臓器が肝臓である、具体例２２に記載の治療方法。
２４．有効量のマイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニストをＨＣＶ感染対象に投与することを含み、該対象がインターフェロン非応答性である、ＨＣＶ感染対象を治療する方法。
２５．ＨＣＶ感染対象がさらに、有効量のインターフェロンで治療される、具体例２４に記載の方法。
２６．インターフェロンがペグ化されたインターフェロンアルファである、具体例２５に記載の方法。
２７．ＨＣＶ感染対象がさらに、有効量のリバビリンで治療される、具体例２４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．有効量のマイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニストを対象に投与することを含み、該対象が臓器移植患者である、患者において臓器移植拒絶を予防する方法。
２９．患者がさらに、有効量のインターフェロンで治療される、具体例２８に記載の方法。
３０．患者がさらに、ペグ化されたインターフェロンアルファで治療される、具体例２８または２９に記載の方法。
３１．患者がＨＣＶ感染している、具体例２８〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．移植された臓器が肝臓である、具体例２８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．ＨＣＶ感染細胞中のＨＣＶ力価を減少させる方法であって、有効量のマイクロ−ＲＮＡ−１２２アンタゴニストを該細胞に投与することを含み、該細胞がインターフェロン治療に対して非応答性である、方法。

３４．細胞が肝臓細胞である、具体例３３に記載の方法。
３５．細胞が、増加したレベルのインターフェロン刺激遺伝子転写産物を発現することによって特徴付けられる、具体例３３に記載の方法。
３６．インターフェロン刺激遺伝子転写産物が表５に挙げられるもののいずれか１つである、具体例３５に記載の方法。
３７．インターフェロン刺激遺伝子転写産物がＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＯＡＳ１およびＩＦＩ４４のいずれか１つである、具体例３６に記載の方法。
３８．細胞が臓器移植を受けた対象におけるものであり、組成物が移植拒絶の予防のために製造される、具体例３３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．具体例２８〜３２の方法を含む、具体例２４〜２７のいずれか１つに記載の方法。
４０．具体例３３〜３８の方法を含む、具体例２４〜２７のいずれか１つに記載の方法。
４１．具体例３３〜３８の方法を含む、具体例２８〜３２のいずれか１つに記載の方法。
４２．対象が霊長類、例えば、ヒト、例えば、治療を必要とするヒトである、具体例２４〜４１のいずれか１つに記載の方法。

【0254】

参考文献リスト
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【実施例】

【0255】

実施例１
本実施例において使用したオリゴヌクレオチド。非コンジュゲート型ＬＮＡ−改変ａｎｔｉｍｉＲ−１２２ ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、完全なホスホロチオエート骨格を用いて合成したが、ただし、取り込み研究については５０％のホスホロチオエートまたはホスホジエステル骨格を有するさらなるＬＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。高アフィニティーＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ−１２２の配列は：５’−ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ−３’（配列番号１１）であり、マウス研究において用いたＬＮＡミスマッチオリゴヌクレオチドは：５’−ＣｃＡｔｔＣＴｃａＣａＣｔＧＣ−３’（配列番号２００）であり、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）複製アッセイに用いたＬＮＡ対照は：５’−ＣｃＡｔｔＣＴｇａＣｃＣｔＡＣ−３’（配列番号２０１）であった（ＬＮＡは大文字、ＤＮＡは小文字）。ＨＣＶ複製アッセイのための２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチドおよびａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２は記載されているようにして合成した^１４，６。

【0256】

表４

【表6】

表４：相補的成熟ｍｉＲ−１２２ ＲＮＡに対するオリゴのＴｍ、オリゴの配列。すべてのオリゴヌクレオチドは、ｓ１０以外完全にチオール化されており（ｔｈｉｏｌａｔｅｄ）、ｓ１０は部分的にチオール化されている（ａｎｔａｇｏｍｉｒ、Ｋｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ． ２００５参照）。成熟ｍｉＲ−１２２は３’から５’方向にて示されており、切断部位は太字で示されており、シード（ｓｅｅｄ）には下線が付されている。

【0257】

実施例２
インビボ実験。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスに、二日に一回、五日間にわたって、セーラインまたはセーライン処方ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２またはＬＮＡミスマッチ対照を投与し、マウスが１０ｍｌ／ｋｇの注入量を受けることを可能とし、一日腹腔内用量は１から２５ｍｇ／ｋｇの範囲とした。マウスを処置の４８時間後に屠殺した。屠殺に先だって、後眼窩洞血液をＥＤＴＡにより被覆したチューブ中に採取した後、血漿画分を単離し、総コレステロールを、ＡＢＸ Ｐｅｎｔｒａ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＣＰ（Ｈｏｒｉｂａ ＡＢＸ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定した。マウス用量応答研究において、１から２００ｍｇ／ｋｇの範囲のＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの単回腹腔内注射を投与し、血漿コレステロールを処置の６日後に測定した。高脂肪給餌による肥満マウスモデルを、高脂肪食（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を１３週間Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスに給餌することによって作成した。高コレステロール血症マウスを週に２回の５ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲまたはＬＮＡ対照の腹腔内用量により６週間処置した。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを酵素アッセイ（Ｈｏｒｉｂａ ＡＢＸ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。

【0258】

３０頭の薬剤の影響を受けていない（ｄｒｕｇ−ｎａｉｅｖｅ）雌の若い成体アフリカミドリザルを６つの処置群（ｎ＝５／群）に分け、１、３、および５日目に、伏在静脈に挿入したカテーテルを介して２４ｍｌ／ｋｇ／ｈの速度で〜１０分かけて静脈内注入によって１日１回投薬した。すべて肝生検を受けさせた４群を、リン酸緩衝セーライン（ＰＢＳ）または１、３もしくは１０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ−製剤化ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲで処置し、２群には肝生検を受けさせずにＰＢＳまたは１０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ−製剤化ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲを与えた。動物を投薬の前および最中ならびに生検および瀉血時点においてケタミン（７．５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）で鎮静させた。右および左の葉から２つのコア生検を得るために処置後１日目および９０日目に経皮肝生検を行った。それぞれの生検の半分は直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中に浸し、残りの生検は、ヘマトキシリン・エオシン染色のためのパラホルムアルデヒド中での固定およびインサイチュ分析のための冷凍保存に分けた。血液サンプルを表面静脈穿刺を介して処置の前および２４時間後に生検を受けた動物について得、一方さらなる血液サンプルを研究にわたってすべての処置群について採取した。サンプル採取は餌を与えない１２時間の期間の後かつ給餌の前に行うことにより、コレステロール測定に対する食餌効果を最小にした。

【0259】

実施例３
霊長類血液学、臨床化学および血漿脂質測定およびリポタンパク質分析。血液学測定は、光学的および機械的方法および自動細胞計数器によって実施し、一方、臨床化学は、Ａｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる、Ｈｉｔａｃｈｉ ７４７分析システムを用いて測定した。総血漿コレステロールは、マイクロタイタープレート中で酵素的に測定した。リポタンパク質およびコレステロール分布は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により測定し、アポリポタンパク質は、Ｗａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにてＤｒ．Ｍａｒｔｈａ ＷｉｌｓｏｎによってＥＬＩＳＡを用いて測定した。

【0260】

実施例４
インサイチュハイブリダイゼーション。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの検出は、１０μｍの霊長類肝臓低温切開片に対して行った。スライドを解凍し、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間室温で固定し、無水酢酸／トリエタノールアミン中で処理し、次いでＰＢＳですすいだ。スライドを、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５００ｕｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ、１ｘデンハルト溶液中で４８℃で３０分間プレハイブリダイズさせた。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの検出は、肝臓切片に４８℃で３０分間ハイブリダイズさせた相補的ＦＡＭ−標識化ＬＮＡプローブを用いて行い、次いで３ｘ１０分間の０．１ｘＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション後洗浄を５２℃で行った。３％Ｈ_２０_２に１０分間曝した後、スライドをブロッキングバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５ｍＭ ＮａＣｌ）および１％ブロッキング試薬（ＴＮＢ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＴＳＡ ｋｉｔ）とともに１５分間、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたポリクローナルウサギ抗−ＦＩＴＣ抗体（ＤＡＫＯ、ＴＮＢ中１：５００）とともに３０分間プレインキュベートした。スライドを０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＴＮバッファーによりすすぎ、Ｃｙａｎｉｎｅ ３−Ｐｌｕｓ ｔｙｒａｍｉｄｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、増幅バッファー中１：１００）とともにインキュベートした。スライドをすすぎ、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に載せ、ＣＣＤカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＬｅｉｃａ落射蛍光顕微鏡およびＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて分析した。

【0261】

実施例５
マイクロアレイ発現プロファイリングおよびｍｉＲ−１２２標的部位分析。高コレステロール血症マウスからの肝臓ＲＮＡを標識し、製造業者の指示に従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０ ２．０アレイにハイブリダイズさせた。ａｆｆｙ−パッケージからの発現機能（ｅｘｐｒｅｓｓｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を、ｒｍａに基づくバックグラウンド補正、変位値正規化およびＬｉ ａｎｄ Ｗｏｎｇ要約法のＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ’ｓ^２４実行による要約（ｓｕｍｍａｒｉｚｉｎｇ）プローブセットを用いる低レベルデータ分析のために使用した。発現プロファイルを、ユークリッド距離尺度およびＷａｒｄ’ｓアグロメレーション法を用いる階層クラスタリングに供した。アレイデータをＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓデータベースに入れた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットを、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子および転写産物に対してＥｎｓｅｍｂｌ−Ｂｉｏｍａｒｔを用いてマッピングした。転写産物の３’ＵＴＲは、研究室内の（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）Ｐｅｒｌスクリプトを用いてｍｉＲ−１２２シードマッチ^２５についてサーチした。遺伝子が選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）３’ＵＴＲを有していた場合は、最も長い配列のみを用いた。

【0262】

実施例６
ノーザンブロット分析およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。Ｔｒｉｚｏｌで抽出された肝臓ＲＮＡ（１０−１５μｇ／サンプル）を、１５％変性Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ−Ｕｒｅａポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて電気泳動し、Ｚｅｔａ Ｐｒｏｂｅ ｐｌｕｓメンブレン（Ｂｉｏｒａｄ）にトランスファーし、Ｕｌｔｒａｈｙｂ−ｏｌｉｇｏ（Ａｍｂｉｏｎ）中にて４５℃で一晩５’ＦＡＭ−標識化ＬＮＡ−改変ｍｉＲ−１２２プローブとハイブリダイズさせた。メンブレンを低ストリンジェンシー洗浄溶液＃１（Ａｍｂｉｏｎ）中で４５℃で２ｘ３０分間洗浄し、ＰＢＳＴで２回すすぎ、ＥＣＬアドバンスドブロッキング溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１時間室温でブロッキングし、次いでＰＢＳＴで２回すすいだ。抗フルオレセイン−ＨＲＰ抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＮＥＦ７１０）（ブロッキング溶液中１：１０００）をメンブレンとともに室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで２回すすぎ、ＰＢＳＴで２５℃で１５分間、次いで３ｘ５分間洗浄した。ＥＣＬアドバンスドキットを検出のために用い（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏｒａｄ）で可視化した。ｍＲＮＡ定量は、ＴａｑＭａｎアッセイおよび７５００リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。

【0263】

実施例７
ｍｉＲ−１２２のインビボ標的化。インビボでのｍｉＲ−１２２標的化のための効率的なアプローチを開発するために、本発明者らはまず、ｍｉＲ−１２２についてのルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて培養Ｈｕｈ−７細胞における様々なＬＮＡ−改変ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ）の強度を評価した。本発明者らのスクリーニングは、ｍｉＲ−１２２機能の阻害がアフィニティー依存的であることを示し、高アフィニティーＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ（＞５０％ＬＮＡ、Ｔ_ｍ＝８０℃）を同定し、これは、５ｎＭの濃度でルシフェラーゼレポーターの有効な抑制解除を媒介した。このオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶ−ＮレプリコンＮＮｅｏ／Ｃ−５Ｂを有するＨｕｈ−７細胞におけるＨＣＶ複製の阻害においてより低いアフィニティーを示す２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドおよび２つのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲと比較して改善された強度を示した。さらに、ＨｅＬａ細胞における３つのさらなるｍｉＲＮＡのサイレンシングのために適用した場合、本発明者らのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ設計はすべての標的化されたｍｉＲＮＡについて高い強度を示した。

【0264】

次に、本発明者らは、高アフィニティーＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲとホスホロチオエート（ＰＳ）改変とを組み合わせることにより、さらなる接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）化学を用いずにｍｉＲ−１２２のインビボ送達およびサイレンシングが可能となりうるかどうかを調べた。図１ａに示すように、マウス肝臓における非接合型ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの取り込みが、完全なＰＳ骨格を有するセーライン−製剤化ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの３回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により達成された。これはノーザンブロットにおけるシフトしたバンドの検出と一致し（図１ａ）、成熟ｍｉＲ−１２２がＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲとのヘテロ二重鎖中に隔離されていることを示す。

【0265】

ｍｉＲ−１２２機能のＬＮＡ−媒介拮抗作用は、直接のｍｉＲ−１２２標的であるアルドラーゼＡ^６（Ａｌｄｏａ）の３倍の抑制解除を導いた（図１ｂ）。注目すべきことに、１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの単回腹腔内注射の結果、１０ｍｇ／ｋｇの有効用量（ＥＤ_５０）にての総血漿コレステロールの強力な用量依存的かつ持続的な低下が導かれた（図１ｃ）。さらに、１〜２５ｍｇ／ｋｇの３回の注入の範囲の用量の腹腔内送達されたＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲは、同じ投与計画を用いてコレステロール−接合型ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２^６，２１または３０％のみのＬＮＡおよびより低いアフィニティー^２２を有する（Ｔ_ｍ＝７０℃）ホスホロチオール化ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲのいずれかで処置されたマウスと比較して、ｍｉＲ−１２２の拮抗において顕著に改善された効率を示した。これはａｎｔａｇｏｍｉｒ−１２２による効率的なｍｉＲ−１２２のサイレンシングは３ｘ４０ｍｇ／ｋｇ〜３ｘ８０ｍｇ／ｋｇというより高い用量を必要としたというマウスにおける以前の報告^２１と一致しているが、一方、本発明者らの知見は、ＬＮＡが顕著により低用量にてインビボで強力なｍｉＲ−１２２拮抗作用を媒介することができる高度に置換されたＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲオリゴヌクレオチドの設計を可能とすることを示す。

【0266】

実施例８
食事性肥満マウスにおけるｍｉＲ−１２２の拮抗。実施例７における結論を確証するために、本発明者らは、５ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの週に２回の６週間の腹腔内用量を用いて高脂肪給餌による肥満マウスモデルにおいてｍｉＲ−１２２を拮抗させたところ、成熟ｍｉＲ−１２２の効率的な隔離が起こり、血清中の肝毒性マーカーまたは肝臓脂質蓄積の上昇を示さずに、総コレステロールの３０％の持続した低下が起こった（図１ｄおよび１ｅ）。一方、セーラインまたはＬＮＡミスマッチ対照のいずれかによる処置はコレステロールレベルに影響を及ぼさず、両方の群におけるノーザンブロットによる成熟ｍｉＲ−１２２の検出と一致した（図１ｄおよび１ｅ）。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置によって起こったが、ＬＮＡミスマッチ処置マウスにおいては起こらなかったｍｉＲ−１２２標的遺伝子である、Ａｌｄｏａ（図１ｆ）およびＢｃｋｄｋ^２２（データ示さず）の顕著な抑制解除は、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲによるｍｉＲ−１２２のインビボでの拮抗作用が特異的であることを示す。この知見と一致して、肝臓遺伝子発現データのクラスタリングにより、すべてのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ−処置動物（ｎ＝５／群）が、系統樹の同じ主な枝上の均一なクラスターによって示されるように、高度に類似した発現プロファイルを有することが明らかになり、この主な枝はセーラインおよびＬＮＡミスマッチ対照群からは分枝したものであった（図１ｇ）。ｍｉＲＮＡの拮抗作用または異所性発現は、ｍＲＮＡの上昇または低下を導くことが以前に示されており、それはｍｉＲＮＡシードマッチの３’ＵＴＲにおける豊富化を示す^{６，７，２２，２３}。実際、ｍｉＲ−１２２シードマッチの存在と発現変化との相関関係は、ｍｉＲ−１２２に対するシードマッチを有するメッセージは、ＬＮＡ ａｎｔｉｍｉＲ−処置動物において対照マウスにおけるものと比較して抑制解除される傾向にあることを確認した（図１ｈ、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｄ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定、シード＋ｔ１Ａ＋ｍ８についてｐ＝２．４^＊１０^−１４）。これはＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置マウスにおける肝臓ｍＲＮＡ変化が主にｍｉＲ−１２２のサイレンシングに起因することを示す。

【0267】

実施例９
霊長類研究。本発明者らのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲアプローチが、非ヒト霊長類におけるｍｉＲ−１２２拮抗作用のために用いることが可能かを調べるために、本発明者らは、アフリカミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）において有効性研究を行った。薬物による影響を受けていない雌のアフリカミドリザルにおける、１〜１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５／群）の範囲の用量の３回の静脈内注入でのリン酸緩衝セーライン（ＰＢＳ）−製剤化ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの全身投与の結果、霊長類において総血漿コレステロールの用量依存的かつ持続的な低下が起こり（図２ａ）、これは、ｍｉＲ−１２２が拮抗されたマウスにおいて観察されたコレステロール低下と一致する。３ｘ１０ｍｇ／ｋｇの高用量のＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲを投与された霊長類は、処置の２３日後に４０％の最大コレステロール低下を示したが（ｐ＝０．００１）、一方、中程度の用量の群（３ｘ３ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ）は同じ時点において２０％のコレステロール低下を示した（ｐ＝０．０２）（図２ａ）。経時的に観察された総コレステロールレベルにおける変動にもかかわらず、コレステロール低下に対する効果は、対照サルに対して正規化された各処置群のコレステロール傾向プロットにより示されるように明らかに用量依存的であった（図２ｂ）。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲで処置されたサルの最後の投薬の２４時間後に行われた肝生検から抽出されたＲＮＡサンプルのノーザンブロット分析は、シフトしたＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ：ｍｉＲ−１２２ヘテロ二重鎖の用量依存的蓄積および成熟ｍｉＲ−１２２のセーライン−処置対照サルサンプルと比較した枯渇によって示されるように、ｍｉＲ−１２２のサイレンシングを確認した（図２ｃ）。さらに、凍結サル肝生検におけるインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、処置したサルの肝臓切片においてはＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲの蓄積を示したが、セーライン対照のものにおいては示さず（図２ｄ）、一方、高分解能ＩＳＨは、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲは霊長類肝細胞の細胞質に主に局在していることを示した（図２ｅ）。

【0268】

興味深いことに、霊長類におけるｍｉＲ−１２２のＬＮＡ−媒介拮抗作用は、総血漿コレステロールの低下によって測定されるように、高用量ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ群において７週間（ｐ＜０．０５、両側ｔ−検定）、中程度の用量群において５週間（ｐ＜０．０５）（図２ｂ）にわたり、効果的かつ長期持続性であった。コレステロールレベルは、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置後３ヶ月の期間かけてベースラインにむかって徐々に回復し、これは、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置の開始の９６日後に行った第二のセットのサル肝生検においてそれぞれノーザンブロットおよびＩＳＨによって検出される、成熟ｍｉＲ−１２２レベルの正常化およびＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ化合物の肝臓からのクリアランスと一致する（図２ｃおよびデータ示さず）。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）およびその主要なアポリポタンパク質、Ａｐｏ Ａ−Ｉならびに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、およびその主要なアポリポタンパク質、Ａｐｏ Ｂの両方における低下がＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ−処置サルにおいて検出され、これはｍｉＲ−１２２を拮抗されたマウスにおける以前の知見^５と一致する。高用量およびセーライン動物の間のＡｐｏ Ａ−Ｉ／Ａｐｏ Ｂ比の相違は統計的に有意ではなかったが（ｐ＞０．０５、各日において両側ｔ−検定）、その比は高用量群においてわずかに低いようであり、Ａｐｏ Ａ−ＩおよびＨＤＬに対するより顕著な効果を示唆している。

【0269】

実施例１０
霊長類実験における毒性研究。本発明者らは、臨床化学によって示されるように、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置霊長類において急性または亜慢性毒性を観察しなかった。臨床化学では処置群の研究にわたってすべての測定値について正常限界の範囲内であったが、例外としてクレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびビリルビンにおいて一過性の肝臓生検に関連する急上昇がみられた。注目すべきことに、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置と関連した血液凝固プロファイルにおける変化はなかった（図３ａ）。さらに、肝生検の組織病理調査は、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置霊長類において処置に関連する異常はないことを明らかにした（図３ｂ）。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置の安全性評価における肝臓生検に関連する毒性を解離するために、高用量の３ｘ１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲまたはセーラインでそれぞれ処置された２つのさらなる非生検群（ｎ＝５）を霊長類研究に含めた。本発明者らは、セーライン対照と比較しての３ｘ１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置後の血漿トランスアミナーゼであるＡＬＴおよびＡＳＴ、ビリルビン、ＣＰＫおよびクレアチニンにおける上昇の非存在によって示されるように、これらの動物において肝毒性または腎毒性をまったく観察しなかった（図３ａ）。すべての研究動物が、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ化合物およびサンプル収集手順の両方に良好な耐容性を示したこと、および、すべての動物が、ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲ処置後少なくとも１０ヶ月間は良好な健康状態であったことは注目に値する。

【0270】

実施例１１
ａｎｔｉｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドの使用によるＨＣＶ感染チンパンジーにおけるウイルス力価の長期ダウンレギュレーション。原理の証明を示し、抗ウイルス強度を判定するために研究を設計した。各動物をそれ自体の対照として用い、即ち、２プラセボ用量（セーライン）を活性の処置の前のベースラインの間に投与した。チンパンジーを選択した。というのは、チンパンジーはＨＣＶにより感染されることができる（ヒト以外の）唯一の種であり、したがってヒトにおける使用の前の薬物の有効性試験に好適な唯一の動物モデルであるからである。また、チンパンジーにおける薬剤標的の配列（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）相同性はヒトに対しておそらく１００％であるからである。動物に１５分間かけて週に１回、１２週間静脈内注入として１２用量を投与した。低用量動物（４ｘ０３５８）には１ｍｇ／ｋｇ体重を投与し、高用量動物（４ｘ０５１３および４ｘ０５１４）には５ｍｇ／ｋｇ体重を投与した。ウイルス血症を血清ウイルス負荷として週に１回評価し、フォローアップの最後の週には２週間毎に評価した。それは１ｍＬの血清当たりのウイルスＲＮＡのゲノム当量［ＧＥ］にて報告する。チンパンジーにおける処置のために用いたオリゴヌクレオチドは、配列：５’−ＣｃＡｔｔＧＴｃａＣａＣｔＣＣ−３’を有するセーライン製剤化ＬＮＡオリゴヌクレオチドであった。ウイルス力価を、ＴａｑＭａｎプローブを用いる定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。サンプルを（Ｌａｎｆｏｒｄ、Ｒ． Ｅ．、Ｇｕｅｒｒａ、Ｂ．、Ｌｅｅ、Ｈ．、Ａｖｅｒｅｔｔ、Ｄ． Ｒ．、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、Ｂ．、Ｃｈａｖｅｚ、Ｄ．、Ｎｏｔｖａｌｌ、Ｌ．、ａｎｄ Ｂｉｇｇｅｒ、Ｃ．（２００３） アルファインターフェロン、ガンマインターフェロン、ポリ（Ｉ）−ポリ（Ｃ）、腫瘍壊死因子アルファ、およびＣ型肝炎ウイルスサブゲノムレプリコンにおけるリバビリンに応答しての抗ウイルス効果およびウイルス−宿主相互作用，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７、１０９２−１１０４）に記載されているようにＡＢＩ ７５００配列検出器を用いるＴａｑＭａｎアッセイに供した。

【0271】

実験動物における力価測定からのデータを図４に示す。

【0272】

低用量動物であるチンパンジー４ｘ０３５８は、ウイルス血症のレベルが低下し始めた７０日目までウイルス力価の有意な低下を示さず、最後の投薬の１２週間後の１７５日目まではベースラインを下まわって維持された。ウイルス力価の最大の低下は１０５日目に起こり、３４−倍の低下を示した。ウイルス血症は研究期間の最後である２１０日目までにベースライン値を下回る１．８−倍まで戻った。

【0273】

高用量動物であるチンパンジー４ｘ０５１３は、２８日の後にウイルス力価が低下し始めた。この動物はウイルス血症の一貫した低下を示し、最大の低下は９８日目に起こり、ウイルス血症が３９５−倍低下した。ウイルス血症は研究の最後までベースラインを下回って維持され、ベースラインの７．７−倍の範囲まででゆっくりと上昇したのみであった。

【0274】

高用量動物であるチンパンジー４ｘ０５１４は、４ｘ０５１３と類似のプロファイルを示した。ウイルス血症の一貫した低下が２８日目に開始し、９２日目にウイルス血症の３１７−倍の最大低下が起こり、低下は継続した。４ｘ０５１３と同様に、ウイルス血症は次いで低く維持され、研究の最後までにベースライン値にゆっくりと上昇した。

【0275】

結論として、処置動物はすべて活性の処置の結果としてウイルス血症の低下を示した。効果の開始は、用量に依存して研究の２８日目と７０日目の間に明白になった。ウイルス血症は活性の処置の最後まで良好に低下したままであり、効果は最低８週間持続した。

【0276】

実施例１２
遺伝子発現分析によって評価したＨＣＶ感染チンパンジーのａｎｔｉｍｉＲ−１２２処置の有効性
ＨＣＶ遺伝子型１ａ（雌Ｂ、雄Ｃ、雌Ｄ）または１ｂ（雌Ａ）に慢性に（８〜１０年間）感染した４頭の成体チンパンジーを１ｍｇ／ｋｇ（動物ＡおよびＢ）または５ｍｇ／ｋｇ（動物ＣおよびＤ）の静脈内用量により毎週１２週間処置した。動物はそれら自身の対照とし、媒体（セーライン）の２回の注入を活性の処置の期間の前の週に投与した。動物を最後の注入の後少なくとも１２週間追跡した。ウイルス負荷（ウイルス血症）を血清サンプルについて定期的に判定した。ウイルス血症、肝臓ウイルス負荷およびコレステロールおよびＩＰ−１０などのバイオマーカーの低下は用量および時間依存的であった。ウイルス血症は５ｍｇ／ｋｇの用量レベルにて２．６ｌｏｇ低下し、処置の最後の後１０週間まで長期持続効果が経験された。

【0277】

全ＲＮＡを動物（４ｘ０２６７＝Ａ；４ｘ０３５８＝Ｂ；４ｘ０５１３＝Ｃ；４ｘ０５１４＝Ｄ）の肝臓生検組織の画分から抽出し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイで標準的手順にしたがって分析した。低レベル分析を注文作成のＣｈｉｐ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ Ｆｉｌｅを用いて行い、ここで、アレイ上のすべてのプローブは最新のＰａｎ Ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ ＵｎｉＧｅｎｅ Ｂｕｉｌｄおよびゲノム配列に対してＢＬＡＳＴに供され、その結果、プローブは真のチンパンジープローブセットへと再マッピングされた。アレイ上に表されたすべての遺伝子についての３’ＵＴＲ配列情報を分析し、推定ｍｉＲ−１２２標的を見いだした。標的を８−ｍｅｒマッチ（ｍｉＲ−１２２ ８−ｍｅｒシードに対する少なくとも１つの相補的マッチ、および可能性のある付加的な７−ｍｅｒまたは６−ｍｅｒマッチを有する遺伝子）、７−ｍｅｒマッチ（８−ｍｅｒマッチを有さないが、１以上の７ｍｅｒ−Ａ１または７ｍｅｒ−ｍ８、および可能性のある付加的な６−ｍｅｒ部位を有する遺伝子）、６−ｍｅｒマッチ（１以上の６−ｍｅｒシードマッチ部位のみを有する遺伝子）、およびシードマッチ無しに分けた。ｍｉＲ−１２２のＳＰＣ３６４９との拮抗作用の結果、ｍｉＲ−１２２標的の抑制解除が導かれると期待される。各動物について、処置前から処置の最後までの発現のｌｏｇ２倍変化を計算し、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定を用いて、８−ｍｅｒ、７−ｍｅｒまたは６−ｍｅｒシードマッチを有する遺伝子のｌｏｇ２倍比が、シードマッチのない遺伝子からのｌｏｇ２倍比よりも一般的に高いかどうかを分析した。応答者である動物においては一般的により高いｌｏｇ２倍比を有するｍｉＲ−１２２標的の明らかな傾向があったが（各標的タイプの累積画分のプロットにおける右への曲線のシフト）、一方、非応答者／弱い応答者は有意差を示さなかった。さらに、インターフェロン応答性遺伝子（ＩＲＧ）の管理分析（Ｌａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． ２００７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ． ４６、９９９−１００８）は、ａｎｔｉｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドによる処置の開始により、ウイルス力価の低下に、ほとんどのＩＲＧの協調的なダウンレギュレーションが伴ったことを示した（図５ａおよびｂ）。ケモカインＩＰ−１０の血清レベルにより、ＩＲＧ発現プロファイルが確証された（図５ｃ）。興味深いことに、動物Ａは、ｍｉＲ−１２２標的の発現変化ならびに研究の過程にわたっての変化しないＩＲＧ応答に関して非常に弱く応答するようであったが、肝臓ウイルス負荷およびコレステロールは、弱いが一定の応答を示唆した。この個体における全体の異なる応答の原因は不明であるが、この動物は低用量群（１ｍｇ／ｋｇ）に含まれていたことに注目すべきである。

【図1-a】

【図1-b】

【図1-c】

【図1-d】

【図1-e】

【図1-f】

【図1-g】

【図1-h】

【図2-a】

【図2-b】

【図2-c】

【図2-d】

【図2-e】

【図3】

【図4】

【図5-a】

【図5-b】

【図5-c】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]