特許 5775450 グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニスト

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5775450

(24)【登録日】2015年7月10日

(45)【発行日】2015年9月9日

(54)【発明の名称】グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニスト

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/605 20060101AFI20150820BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/605ZNA

【請求項の数】1

【全頁数】149

(21)【出願番号】特願2011-514734(P2011-514734)

(86)(22)【出願日】2009年6月16日

(65)【公表番号】特表2011-524419(P2011-524419A)

(43)【公表日】2011年9月1日

(86)【国際出願番号】US2009047438

(87)【国際公開番号】WO2009155258

(87)【国際公開日】20091223

【審査請求日】2012年6月15日

(31)【優先権主張番号】61/078,168

(32)【優先日】2008年7月3日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/177,476

(32)【優先日】2009年5月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/073,269

(32)【優先日】2008年6月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/090,412

(32)【優先日】2008年8月20日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】507277642

【氏名又は名称】インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＩＡＮＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ディマルキ，リチャード，ディー．

(72)【発明者】

【氏名】スマイリー，デイヴィッド，エル．

(72)【発明者】

【氏名】ディマルキ，マリア

(72)【発明者】

【氏名】シャベンヌ，ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】デイ，ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】パターソン，ジェイムス

(72)【発明者】

【氏名】ウォード，ブライアン，シー．

【審査官】 長部 喜幸

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５０８６３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５１４３３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０１２４５５０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 The Journal of Biological Chemistry，１９８２年，vol.257, no.18，p.10624-10630

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

９個までのアミノ酸修飾を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸でアシル化またはアルキル化されている位置１０のアミノ酸と、位置１６のアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）とを含み、天然グルカゴンと比べて増強されたＧＬＰ−１受容体に対する活性を有する、グルカゴンペプチド、またはその薬学的に許容される塩。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

プレプログルカゴンは、１５８アミノ酸前駆体ポリペプチドであり、異なる組織においてプロセシングされて、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃排出および腸管成長、並びに食物摂取の調節を含む多種多様な生理学的機能に関わる、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）およびオキシントモジュリン（ＯＸＭ）を含む多数の異なるプログルカゴン誘導ペプチドを形成する。グルカゴンは、プレプログルカゴンのアミノ酸３３から６１に対応する２９アミノ酸ペプチドであり、一方、ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンのアミノ酸７２から１０８に対応する３７アミノ酸ペプチドとして産生される。ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、またはＧＬＰ−１（７−３７）酸は、ＧＬＰ−１の生物学的に活性のある形態であって、これらは、ＧＬＰ−１受容体に対し実質的に等価な活性を示す。

【0002】

低血糖症は、血中グルコースレベルが体の活動にとって十分なエネルギーを提供するには低すぎるほど低下したときに生じる。成人または１０歳を超える小児において、低血糖症は、糖尿病治療の副作用以外ではまれであるが、他の薬物療法または疾患、ホルモン若しくは酵素欠乏または腫瘍によってもたらされる可能性がある。血中グルコースが下降し始めると、膵臓により産生されるホルモンであるグルカゴンは、肝臓にグリコーゲンを分解し、グルコースを放出するようにシグナルを送り、血中グルコースレベルを正常なレベルに上昇させる。したがって、グルコース調節におけるグルカゴンの最も認識されている役割は、インスリンの作用に対抗し、血中グルコースレベルを維持することである。しかし、糖尿病患者では、低血糖に対するグルカゴン反応は損なわれている場合があり、グルコースレベルを正常な範囲に戻すことが難しくなっている。

【0003】

低血糖症は、速やかな医学的配慮を必要とする生命を脅かす事象である。グルカゴンの投与は、急性低血糖症を治療する確立された薬物療法であり、投与の数分内にグルコースの正常レベルを回復することができる。グルカゴンが低血糖症の急性医学治療に使用される場合、結晶形態のグルカゴンは希釈酸緩衝液により溶解化され、溶液が筋肉内に注射される。この治療は効果的であるが、その方法論は煩わしく、意識が完全でなくなった人にとっては危険である。したがって、母体となる分子の生物学的機能を維持するが、生理学的な条件下で十分に溶解性で安定であり、注射用の液剤として予備処方することができるような、グルカゴンの類縁体の必要性が存在する。

【0004】

加えて、糖尿病患者は、微小血管合併症を遅延または予防するために、ほぼ正常な血中グルコースレベルを維持することを勧められている。この目標の達成には、通常、集中的なインスリン治療を必要とする。この目的を達成しようという努力において、医者は糖尿病患者における低血糖症の頻度および重篤度の顕著な増加に遭遇する。したがって、現行のインスリン療法よりも低血糖症を誘発する可能性が低い改善された医薬び方法論が、糖尿病の治療のために必要である。

【0005】

ＧＬＰ−１は、グルカゴンと比較すると異なる生物学的活性を有する。その作用には、インスリン合成および分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害および食物摂取の阻害が含まれる。ＧＬＰ−１は、糖尿病患者において高血糖症（グルコースレベルの上昇）を低減することが示されている。ＧＬＰ−１と５０％のアミノ酸同一性を共有する、トカゲ毒液からのペプチドであるエキセンディン−４（Exendin-4）は、ＧＬＰ−１受容体を活性化し、同様に糖尿病患者において高血糖症を低減することが示されている。

【0006】

ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４が食物摂取を低減し、減量を促進する証拠もあり、これは、糖尿病患者のみならず、肥満に罹患している患者にとっても利益になる効果である。肥満の患者は、糖尿病、高血圧症、高脂血症、心血管疾患および筋骨格系疾患の高い危険性を有する。

【0007】

したがって、糖尿病および肥満を治療する代替的で好ましく改善された方法の必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【0008】

本明細書に記載されるように、グルカゴン受容体に対する増加した活性も示し、更なる実施態様では増強された生物物理学的安定性および／または水溶性を示す、高い効力のグルカゴンアゴニスト類縁体が提供される。加えて、本発明の別の態様によると、ＧＬＰ−１受容体に比べてグルカゴン受容体への天然グルカゴンの選択性を失っており、したがってこれらの２つの受容体に対するコアゴニスト（co-agonist）となる、グルカゴンアゴニスト類縁体が提供される。グルカゴン類縁体内の選択されたアミノ酸修飾は、ＧＬＰ−１受容体対グルカゴン受容体における類縁体の相対的活性を制御することができる。したがって、本発明の更に別の態様は、ＧＬＰ−１受容体に比べてグルカゴン受容体に対してより高い活性を有するグルカゴンコアゴニスト類縁体、両方の受容体に対しておよそ同等の活性を有するグルカゴンコアゴニスト類縁体およびグルカゴン受容体に比べてＧＬＰ−１受容体に対してより高い活性を有するグルカゴンコアゴニスト類縁体が提供される。後者の分類のコアゴニストを操作して、グルカゴン受容体に対してほとんどまたは全く活性を示さないようにすることができ、それでも、天然ＧＬＰ−１と同じまたはそれより良好な効力でＧＬＰ−１受容体を活性化する能力を保持することができる。これらの類縁体のいずれかは、増強された生物物理学的安定性および／または水溶性を付与する修飾を含むこともできる。

【0009】

グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対するコアゴニズム（co-agonism）を示すグルカゴン類縁体は、幾つかの用途において有利である。まず第一に、低血糖症を治療するためのグルカゴンの使用は、低い血中グルコースレベルを過剰補償し、過度の血中グルコースレベルをもたらしうる。グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストを投与した場合、付加的なＧＬＰ−１刺激が、グルカゴンアゴニストの作用を緩衝し、低血糖症の治療によりもたらされる過度な血中グルコースレベルを阻止することが予想される。

【0010】

加えて、本明細書に記載されているように、本発明のグルカゴンコアゴニスト類縁体は、単独で、または、他の抗糖尿病若しくは抗肥満治療と組み合わせて投与されると、高血糖症の制御、または減量の誘導若しくは体重増加の予防に使用することができる。減量を誘導する別の化合物は、オキシントモジュリンであり、これは小腸において見出された天然型の消化ホルモンである（Diabetes 2005; 54: 2390-2395を参照）。オキシントモジュリンは、グルカゴン（すなわち、配列番号１）の２９アミノ酸配列、それに続く、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８アミノ酸カルボキシ末端延長部を含む、３７アミノ酸ペプチドである。本発明は、本明細書に記載されるグルカゴン類縁体が、場合によりこの８アミノ酸カルボキシ末端延長部（配列番号２７）と結合しうることを考慮するが、一方、本発明は、幾つかの実施態様において、配列番号２７の８個の連続カルボキシアミノ酸を欠いている類縁体および類縁体の使用も特に考慮する。

【0011】

化合物をアミノ酸修飾により特別に適合させて、ペプチドのＧＬＰ−１活性を調節することができ、したがって、本発明のグルカゴン類縁体を、特定の状態または疾患を治療するように適合させることができる。さらに具体的には、それぞれの類縁体が対応するグルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対する特徴的な相対レベルの活性を示す、グルカゴン類縁体が提供される。例えば、天然ＧＬＰ−１の活性に比べて、少なくとも約１％（少なくとも約１，５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％を含む）から約２００％のいずれか、またはそれ以上のＧＬＰ−１受容体に対する活性を有し、且つ、天然グルカゴンの活性に比べて、少なくとも約１％（約１，５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％を含む）から約５００％のいずれか、またはそれ以上のグルカゴン受容体に対する活性を有するようなグルカゴンペプチドを産生するように、修飾を各ペプチドに対して実施することができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％以下を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％以下を示す。天然グルカゴンのアミノ酸配列は、配列番号１であり、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドのアミノ酸配列は、配列番号５２であり、ＧＬＰ−１（７−３７）酸のアミノ酸配列は、配列番号５０である。例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも１０％およびＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも５０％の活性を示してもよいし、またはグルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも４０％およびＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも４０％の活性を示してもよいし、またはグルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも６０％およびＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも６０％の活性を示してもよい。

【0012】

グルカゴンペプチドの、ＧＬＰ−１受容体と比べたグルカゴン受容体に対する選択性は、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の相対比（天然グルカゴンと比べたグルカゴン受容体に対するペプチドの活性を、天然ＧＬＰ−１と比べたＧＬＰ−１受容体に対するペプチドの活性で割ったもの）として記載することができる。例えば、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の６０％を示し、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の６０％を示すグルカゴンペプチドは、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の１：１比を有する。グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の例示的な比には、約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１若しくは１０：１、または約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２若しくは１：１．５が含まれる。例としては、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性比の１０：１は、ＧＬＰ−１受容体と比べて１０倍のグルカゴン受容体に対する選択性を示す。同様に、ＧＬＰ−１／グルカゴン活性比の１０：１は、グルカゴン受容体と比べて１０倍のＧＬＰ−１受容体への選択性を示す。

【0013】

一実施態様によれば、効力が増強されており、更に溶解性や安定性も向上していてもよい、グルカゴン類縁体が提供される。別の実施態様によると、天然グルカゴン（配列番号１）の位置１６にアミノ酸修飾を含む、グルカゴン受容体に対する増強された効力を有するグルカゴンペプチドが提供される。非限定例によると、そのような増強された効力は、位置１６の天然型のセリンを、グルタミン酸によりまたは４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸により置換することによって、あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかにより、または少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有し約４（若しくは３〜５）原子の長さを有する側鎖を含有する荷電アミノにより置換することによって、もたらすことができる。一つの実施態様において、効力が増強されたグルカゴンアゴニストは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７のペプチド、または配列番号５のグルカゴンアゴニスト類縁体を含む。一つの実施態様によると、野生型グルカゴンに比べてグルカゴン受容体に対する効力が増強されたグルカゴン類縁体タンパク質が提供されるが、このグルカゴンペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体に対して選択性を保持する。

【0014】

グルカゴン受容体活性は、位置３のアミノ酸の修飾により、例えば位置３の天然型のグルタミンの置換により、低減、維持または増強することができる。一つの実施態様において、位置３のアミノ酸の、酸性、塩基性または疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）による置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減または破壊することが示されている。例えばグルタミン酸、オルニチンまたはノルロイシンで置換されている類縁体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１０％以下の活性、例えば、約1〜１０％または約０．１〜１０％または約０．１％超であるが約１０％未満の活性を有し、一方、ＧＬＰ−１受容体に対しては、ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％の活性を示す。例えば、本明細書に記載されている例示的な類縁体は、天然グルカゴンの活性の約０．５％、約１％または約７％を有し、一方、ＧＬＰ−１受容体に対するは、ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。

【0015】

別の実施態様において、グルカゴンペプチドの位置３の天然型のグルタミンを、グルカゴン受容体に対する活性を実質的に失うことなく、幾つかの場合ではグルカゴン受容体活性の増強を伴って、グルタミン類縁体により置換することができる。例えば、位置３にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン（配列番号１）の活性の約５％、約１０％、約２０％、約５０％、若しくは約８５％またはそれ以上の活性を示すことができる。幾つかの実施態様において、位置３にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する、位置３の修飾アミノ酸（例えば、配列番号６０１または配列番号６０２）以外は、グルタミン類縁体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有するような対応するグルカゴンペプチドの活性の、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、約２００％、若しくは約５００％またはそれ以上の活性示すことができる。幾つかの実施態様において、位置３にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する増強された活性を示すが、増強された活性は、天然グルカゴンのまたは位置３の修飾アミノ酸以外は、グルタミン類縁体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有するような対応するグルカゴンペプチドの活性の、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、または１，０００，０００％以下の活性である。

【0016】

幾つかの実施態様において、グルタミン類縁体は、下記の構造Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ：

【化1】

〔式中、Ｒ^１は、Ｃ_０−３アルキルまたはＣ_０−３ヘテロアルキルであり；Ｒ^２は、ＮＨＲ^４またはＣ_１−３アルキルであり；Ｒ^３は、Ｃ_１−３アルキルであり；Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１−３アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ^４、ＳＲ^３、またはＯＲ^３である〕で示される側鎖を含む、天然型のまたは非天然型のアミノ酸である。幾つかの実施態様において、Ｘは、ＮＨであるか、またはＹは、ＮＨＲ^４である。幾つかの実施態様において、Ｒ^１は、Ｃ_０−２アルキルまたはＣ_１ヘテロアルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ^２は、ＮＨＲ^４またはＣ_１アルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１アルキルである。例示的な実施態様において、構造Ｉの側鎖を含み、以下のいずれかが成り立つアミノ酸が提供される：Ｒ^１はＣＨ_２−Ｓであり、ＸはＮＨであり、そしてＲ^２はＣＨ_３である（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））；Ｒ^１はＣＨ_２であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ^２はＣＨ_３である（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））；Ｒ^１はＣ_０アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ^２はＮＨＲ^４であり、そしてＲ^４はＨである（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（尿素））；または、Ｒ^１はＣＨ_２−ＣＨ_２であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ^２はＣＨ_３である（アセチルオルニチン、Ｏｍ（Ａｃ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ^１はＣＨ_２であり、Ｙは、ＮＨＲ^４であり、そしてＲ^４は、ＣＨ_３である（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ^１はＣＨ_２であり、そしてＲ^４は、Ｈである（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））。特定の実施態様において、位置３のアミノ酸はＤａｂ（Ａｃ）により置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号５９５、配列番号６０１、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、および配列番号６０６のアミノ酸配列を含むことができる。

【0017】

別の実施態様において、天然グルカゴンペプチドと比べて増強または保持されたグルカゴン受容体に対する効力を有するが、著しく増強されたＧＬＰ−１受容体に対する活性も有するグルカゴンの類縁体が提供される。グルカゴンは、通常、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１％を有するが、一方、ＧＬＰ−１は、通常、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約０．０１％未満を有する。ＧＬＰ−１受容体に対する増強された活性は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルのような電荷中性基に代えることによってもたらされる。一つの実施態様において、これらのグルカゴン類縁体は、配列番号２０の配列を含み、ここでカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に見出されるカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。これらのグルカゴン類縁体は、グルカゴンとＧＬＰ−１の両方の受容体に対して強力な活性を有し、したがって、両方の受容体に対するコアゴニストとして作用する。一つの実施態様によると、ペプチドが配列番号２０の配列を含み、位置２８のアミノ酸がＡｓｎまたはＬｙｓであり、位置２９のアミノ酸がＴｈｒ−アミドである、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。

【0018】

ＧＬＰ−１受容体に対する増強された活性はまた、３個の介在アミノ酸により隔てられている２個のアミノ酸、すなわち位置「ｉ」のアミノ酸と位置「ｉ＋４」のアミノ酸（ここで、ｉは１２〜２５の任意の整数である）、２個の介在アミノ酸により隔てられている２個のアミノ酸、すなわち位置「ｊ」のアミノ酸と位置「ｊ＋３」のアミノ酸（ここで、ｊは１２〜２７の任意の整数である）、または、６個の介在アミノ酸により隔てられている２個のアミノ酸、すなわち位置「ｋ」のアミノ酸と位置「ｋ＋７」のアミノ酸（ここで、ｋは１２〜２２の任意の整数である）、の側鎖同士の間に分子内架橋を形成することによって、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）のアルファ−へリックス構造を安定化することによっても提供される。例示的な実施態様において、架橋またはリンカーは、約８（または約７〜９）原子長であり、位置１２と１６、または位置１６と２０、または位置２０と２４、または位置２４と２８のアミノ酸の側鎖同士の間に形成される。これらのアミノ酸の側鎖は、非共有結合、例えば水素結合や、塩架橋の形成のようなイオン相互作用を介して、または共有結合により、互いに結合することができる。

【0019】

一つの実施態様によると、配列番号２０の配列を含むグルカゴンアゴニストであって、位置１２、２０または２８に配置されているリシン残基と、位置１６または２４に配置されているグルタミン酸残基の側鎖同士の間にラクタム環が形成されているグルカゴンアゴニストが提供され、ここで側鎖がラクタム環の形成に参加しているグルカゴンペプチドの２個のアミノ酸は、３個の介在アミノ酸により互いに隔てられている。一つの実施態様によると、グルカゴン類縁体を担持するラクタムは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む。一つの実施態様において、ペプチドを担持するラクタムのカルボキシ末端アミノ酸は、末端カルボン酸の代わりにアミド基またはエステル基を含む。一つの実施態様において、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８のグルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のカルボキシ末端に共有結合している付加アミノ酸を更に含む。更なる実施態様において、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９から成る群から選ばれる配列を含み、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９のカルボキシ末端に共有結合している付加アミノ酸を更に含むグルカゴンペプチドが提供される。一つの実施態様において、位置２８のアミノ酸は、アスパラギンまたはリシンであり、位置２９のアミノ酸はトレオニンである。

【0020】

幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンアゴニストペプチドのＣ末端部分におけるアルファ−へリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の共有分子内架橋の形成によって達成される。例えば、適切な共有結合方法（すなわち、共有分子内架橋を形成する方法）には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋または改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成、および、アルファ−へリックスの安定化のために使用されるその他のペプチド環化の方法、のいずれかの一つ以上が含まれる。

【0021】

ＧＬＰ−１受容体に対する増強された活性はまた、所望の活性を保持する位置への１個以上のα，α−二置換アミノ酸の導入を介して、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）のアルファ−へリックス構造を安定化することによっても達成される。幾つかの態様において、アルファ−へリックスの安定化は、塩架橋または共有結合のような分子内架橋を意図的に導入することなく、この方法により達成される。そのようなペプチドは、本明細書において、分子内架橋を欠いているペプチドとして考慮することができる。特定の態様において、アルファ−へリックスの安定化は、共有分子内架橋、例えばラクタム架橋、ジスルフィド架橋を導入することなく、１個以上のα，α−二置換アミノ酸を導入することにより達成される。そのようなペプチドは、本明細書において、共有分子内架橋を欠いているペプチドであると考慮することができる。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドの位置１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４または２９のうちの１、２、３、４つまたはそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）によるグルカゴンペプチドの位置１６の置換は、塩架橋またはラクタムの不在下で、ＧＬＰ−１活性を増強する。幾つかの実施態様において、位置１６、２０、２１または２４のうちの１、２、３つまたはそれ以上は、ＡＩＢで置換されている。

【0022】

分子内架橋（例えば、共有分子内架橋）を欠いているグルカゴン類縁体ペプチドのＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対する増強された活性は、ペプチドの位置１０のアミノ酸の側鎖へのアシルまたはアルキル基の付加により提供される。幾つかの態様において、アシルまたはアルキル基は、天然型のアミノ酸にはないものである。特定の態様において、アシルまたはアルキル基は、あらゆる天然型のアミノ酸に対して非天然である。幾つかの実施態様において、アシル基は脂肪アシル基、例えばＣ４〜Ｃ３０脂肪アシル基である。例えば、本明細書において提供されるものは、位置１６のＡＩＢを含む共有分子内架橋を欠き、位置１０のＬｙｓ残基に共有結合しているＣ１４、Ｃ１６またはＣ１８脂肪アシル基を欠いているグルカゴン類縁体ペプチドである。また提供されるものは、位置２および１６のＡＩＢを含む分子内架橋（例えば、共有分子内架橋）を欠き、位置１０のＬｙｓ残基に共有結合しているＣ１４、Ｃ１６またはＣ１８脂肪アシル基を欠いているグルカゴン類縁体ペプチドである。そのような、分子内架橋（例えば、共有分子内架橋）を欠いているアシル化グルカゴン類縁体ペプチドを、本明細書に更に記載されているように、ペグ化することができる。

【0023】

分子内架橋（例えば、共有分子内架橋）を欠いているアシル化グルカゴン類縁体ペプチドのＧＬＰ−１活性およびグルカゴン活性における更なる増強は、アシルまたはアルキル基と位置１０のアミノ酸の側鎖との間にスペーサーを組み込むことによって達成することができる。幾つかの実施態様によると、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサーまたは疎水性二官能スペーサー）は、３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）長である。ある特定の実施態様によると、スペーサーおよびアシルまたはアルキル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば、１７〜２８個、１９〜２６個の原子、１９〜２１個の原子である。分子内架橋（例えば、共有分子内架橋）を欠いているアシル化またはアルキル化ペプチドのＧＬＰ−１活性およびグルカゴン活性を増強する目的に適したスペーサーは、本明細書において更に記載される。

【0024】

例えば、本明細書において提供されるものは、アシル基またはアルキル基を含む、１０個以下のアミノ酸修飾により配列番号１と異なる非天然グルカゴンペプチドであり、ここで、アシルまたはアルキル基はスペーサーに結合しており、スペーサーはグルカゴンペプチドの位置１０のアミノ酸の側鎖に結合しており、前記グルカゴンペプチドが親水性部分、例えばＰＥＧを欠いている場合、前記グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、約１００％、約１５０％、約２００％、約４００％、約５００％またはそれ以上）を示す。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドが親水性部分、例えばＰＥＧを欠いている場合、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも０．５％（例えば、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％）を示す。幾つかの実施態様において、上記に記載されたグルカゴンペプチドは、上記に示されている活性のいずれかを示すことができ、且つ、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％以下を示すことができる。幾つかの実施態様において、上記に記載されたグルカゴンペプチドは、上記に示されている活性のいずれかを示すことができ、且つ、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％以下を示すことができる。

【0025】

ＧＬＰ−１受容体に対する増強された活性は、また、位置２０のアミノ酸修飾によってももたらされる。一つの実施態様において、位置２０のグルタミンは、帯電しているか、または水素結合の能力を有し、且つ少なくとも５（また約４〜６）原子長である側鎖を有するような、別の親水性アミノ酸、例えばリシン、シトルリン、アルギニンまたはオルチニン、で置換されている。

【0026】

グルカゴン受容体活性を増加または減少し、且つＧＬＰ−１受容体活性を増加するような、上記に記載された修飾のいずれも、個別に適用することも、組み合わせて適用するこもができる。ＧＬＰ−１受容体活性を増加する修飾の組み合わせは、単独で実施されるそのような修飾のいずれのものよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらすことができる。例えば、本発明は、位置１６、位置２０およびＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴン類縁体であって、更に位置１６と２０のアミノ酸の間に共有結合を有してもよい類縁体；位置１６およびＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴン類縁体；位置１６および２０に修飾を含むグルカゴン類縁体であって、更に位置１６と２０のアミノ酸の間に共有結合を有してもよい類縁体；ならびに位置２０およびＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴン類縁体であって、更に、位置１２のアミノ酸はＡｒｇではないこと、または位置９のアミノ酸はＧｌｕではないこと、を条件としてもよい、グルカゴン類縁体を提供する。

【0027】

本明細書に記載される、位置１または２における他の修飾は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）切断に対する、該ペプチドの耐性を増強することができる。例えば、位置２のアミノ酸は、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、またはアミノイソブチル酸によって置換されてもよい。それとは別に、またはそれに加えてさらに、位置１のアミノ酸は、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、またはアルファ，アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）によって置換されてもよい。

【0028】

位置２における複数の修飾（例えば、位置２におけるＡＩＢ）、および、いくつかの場合、位置１における複数の修飾は、グルカゴン活性を、時には著明に抑えることが観察された。驚くべきことに、グルカゴン活性におけるこの低下は、位置「ｉ」と「ｉ＋４」位のアミノ酸、例えば、位置１２と位置１６、位置１６と位置２０、または位置２０と位置２４のアミノ酸同士の共有結合によって、回復することが可能である。幾つかの実施態様において、この共有結合は、位置１６のグルタミン酸と位置２０のリシンとの間のラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、適切な共有結合方法には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋または改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成、およびペプチド環化の他の方法のいずれか、の一つ以上が含まれる。

【0029】

大型の芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ）による位置１のＨｉｓの非保存的置換を含有する、ＧＬＰ−活性を有するグルカゴンペプチドは、アルファ−へリックスが、分子内架橋を介して、例えば、位置「ｉ」と「ｉ＋４」、例えば１２と１６、１６と２０または２０と２４のアミノ酸の間の共有結合を介して安定化される場合、ＧＬＰ−１活性を保持することができる。幾つかの実施態様において、この共有結合は、位置１６のグルタミン酸と位置２０のリシンとの間のラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、適切な共有結合方法には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋または改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成、およびペプチド環化の他の方法、のいずれかの一つ以上が含まれる。

【0030】

なお更なる例示的な実施態様において、前述の化合物のいずれかについて、安定性を向上させるために、配列番号１の位置１５のアミノ酸を修飾して、特に酸性またはアルカリ性の緩衝液におけるペプチドの経時的な分解を低減する更なる修飾を加えることができる。

【0031】

別の実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドの溶解性は、ペプチドへの親水性部分の共有結合により増強される。一実施態様では、親水性成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり、更に、位置１６、１７、２１、２４、２９、Ｃ末端延長部内、またはＣ末端アミノ酸、の内の一つ以上において該ペプチドに連結されてもよい。ある実施態様では、その位置の天然アミノ酸は、親水性成分と架橋結合を形成するのに好適な側鎖を持つアミノ酸によって置換され、それによって、そのペプチドに対する親水性成分の連結がやり易くされる。別の実施態様では、親水基を含むように修飾されたアミノ酸が、ペプチドのＣ末端に加えられる。一実施態様では、ペプチドコアゴニストは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９から成る群から選ばれる配列を含み、前記グルカゴンペプチドの位置１６、１７、２１、または２４の内の一つにおけるアミノ酸残基の側鎖はさらに、約５００から約４０，０００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する、ポリエチレングリコール鎖を含む。一実施態様では、このポリエチレングリコール鎖は、約５００から約５，０００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する。別の実施態様では、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００から約２０，０００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する。さらに別の実施態様では、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００から約４０，０００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する。

【0032】

別の実施態様において、前記グルカゴン類縁体のいずれかの溶解性を、ペプチドのＣ末端部分に、好ましくは配列番号１のＣ末端から位置２７までに、荷電アミノ酸を導入する、アミノ酸置換および／または付加によって改善することができる。更に場合により、１、２または３個の荷電アミノ酸を、Ｃ末端部分の範囲内、好ましくはＣ末端から位置２７まで、に導入してもよい。一つの実施態様によると、位置２８および／または２９の天然アミノ酸は荷電アミノ酸で置換されている、ならびに／あるいは更なる実施態様において、１〜３個の荷電アミノ酸もペプチドのＣ末端に付加されている。例示的な実施態様において、１、２個または全ての荷電アミノ酸は、負に帯電している。更なる修飾、例えば保存的置換をグルカゴンペプチドに行うことができ、依然としてグルカゴン活性を保持することが可能である。一つの実施態様において、配列番号２０のペプチドの類縁体であって、位置１７〜２６の１〜２個のアミノ酸置換により配列番号２０と異なり、一つの実施態様において、位置２０のアミノ酸置換により配列番号２０のペプチドと異なる、類縁体が提供される。

【0033】

幾つかの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは、１個以上のアミノ酸残基によるＣ末端部の切断によって修飾される。そのような修飾グルカゴンペプチドは、本明細書に示されているように、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体に対して同様の活性および効力を保持する。この点において、グルカゴンペプチドは、場合により、本明細書に記載されている付加的修飾を有して、天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のアミノ酸１−２７または１−２８を含むことができる。

【0034】

一つの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端部への第２ペプチド、例えば配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８、の付加により修飾される。一つの実施態様において、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９から成る群から選ばれるペプチド配列を有するグルカゴンペプチドは、ペプチド結合を介して第２ペプチドに共有結合しており、ここで第２ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８から成る群から選ばれる配列を含む。更なる実施態様において、Ｃ末端延長部を含むグルカゴンペプチドにおいて、天然グルカゴンペプチドの位置２９のトレオニンはグリシンで置換されている。位置２９のトレオニンにグリシン置換を有し、配列番号２６のカルボキシ末端延長部を含むグルカゴン類縁体は、配列番号２６のカルボキシ末端延長部を含むように修飾された天然グルカゴンよりも、４倍大きいＧＬＰ−１受容体に対する効力がある。ＧＬＰ−１受容体に対する効力を、位置１８の天然アルギニンのアラニン置換により更に増強することができる。

【0035】

本明細書に開示されているグルカゴンペプチドのいずれかを、アシル基またはアルキル基、例えばＣ４〜Ｃ３０アシルまたはアルキル基、を含むように修飾することができる。幾つかの態様において、アシル基またはアルキル基は、天然型のアミノ酸に対して非天然である。アシル化またはアルキル化は、循環中のグルカゴンペプチドの半減期を増加することができる。アシル化またはアルキル化は、有利には、グルカゴンおよび／またはＧＬＰ−１受容体に対する作用の開始を遅延する、および／または作用の持続時間を延長する、ならびに／あるいはＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善することができる。本明細書において示されているように、グルカゴンペプチドのグルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体に対する活性は、アシル化の後、実質的に増強されないとしても少なくとも維持される。更に、アシル化グルカゴンペプチドの効力は、非アシル化型のグルカゴンコペプチドと比べ、たとえ実質的に増強されないとしても、少なくともそれに匹敵した。グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合しているのと同じアミノ酸の位置または異なるアミノ酸の位置で、アシル化またはアルキル化することができる。幾つかの実施態様において、本発明は、位置１０のアミノ酸に共有結合しているアシル基またはアルキル基を含むように修飾されている、グルカゴンペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、位置１０のアミノ酸とアシル基またはアルキル基との間にスペーサーを更に含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、脂肪酸若しくは胆汁酸またはこれらの塩であり、例えばＣ４０〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキル、または胆汁酸のステロイド部分を含むアルキルである。スペーサーは、アシルまたはアルキル基を結合するのに適した反応性基を有する、任意の部分である。例示的な実施態様において、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能基、例えばアミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレート、または疎水性二官能スペーサーを含む。幾つかの実施態様において、スペーサーは、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、および、ＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ（ＣＨ_２）ｍＣＯＯＨを含むスペーサーからなる群より選択され、ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である。そのようなアシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含んでもよく、これは場合によりポリエチレングリコールであってもよい。前述のグルカゴンペプチドのいずれも、２つのアシル基若しくは２つのアルキル基、またはそれらの組み合わせを含むことができる。

【0036】

従って、本明細書に開示されるように、溶解性および／または安定性の向上を示す、高活力グルカゴン類縁体またはグルカゴンコアゴニスト類縁体が提供される。例示の高活力グルカゴン類縁体は、グルカゴン受容体に対し、天然グルカゴンの活性の少なくとも約２００％を示し、更に、ｐＨ６と８の間、ｐＨ６と９の間、またはｐＨ７と８の間（例えば、ｐＨ７）において、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解性であってもよく、また、２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持（例えば、元のペプチドの５％以下しか分解または分断されない）してもよい。別の例として、例示的なグルカゴンコアゴニスト類縁体は、グルカゴンとＤＬＰ−１の両方の受容体に対して（約１：３〜３：１または約１：２〜２：１の比で）約４０％を超える、または約６０％を超える活性を示し、場合により、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解性であり、更に、２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。別の例示的なグルカゴンコアゴニスト類縁体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１７５％以上およびＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約２０％以下を示し、更に、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解性であってもよく、、２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。更に別の例示的なグルカゴンコアゴニスト類縁体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１０％以下およびＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも約２０％を示し、更に、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解性であってもよく、２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。更に別の例示的なグルカゴンコアゴニスト類縁体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１０％以下であるが０．１％、０．５％または１％超およびＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％またはそれ以上を示し、更に、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解性であってもよく、２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％以下を示す。幾つかの実施態様において、そのようなグルカゴン類縁体は、天然グルカゴンの対応する位置に少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個の天然型のアミノ酸を保持する（例えば、天然型のグルカゴンに対して１〜７、１〜５または１〜３個の修飾を有する）。

【0037】

以下のペプチドのいずれも本発明の化合物から排除されるが、所望のＧＬＰ−１またはコアゴニスト活性を示す本明細書に記載される一つ以上の更なる修飾を含むような以下のペプチド、並びに、そのような化合物を使用する医薬組成物、キット、および治療方法はいずれも、本発明に含まれうる：〔Ａｒｇ１２〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；〔Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２０〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；〔Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２４〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；〔Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２９〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；〔Ｇｌｕ９〕置換を有する配列番号１のペプチド；〔Ｇｌｕ９、Ｇｌｕ１６、Ｌｙｓ２９〕置換およびＣ末端アミドを有する、Ｈｉｓ１を欠いている配列番号１のペプチド；〔Ｇｌｕ９、Ｇｌｕ１６、Ｌｙｓ２９〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；ラクタム架橋を介して結合している〔Ｌｙｓ１３、Ｇｌｕ１７〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；ラクタム架橋を介して結合している〔Ｌｙｓ１７，Ｇｌｕ２１〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；ラクタム架橋を介して結合している〔Ｇｌｕ２０，Ｌｙｓ２４〕置換を有する、Ｈｉｓ１を欠いている配列番号１のペプチド。

【0038】

一つの実施態様によると、好ましくは滅菌され、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の純度レベルを有する、本明細書に開示されている任意の新規グルカゴンペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。そのような組成物は、少なくともＡの濃度でグルカゴンペプチドを含有することができ、ここでＡは、０．００１mg/ml、０．０１mg/ml、０．１mg/ml、０．５mg/ml、１mg/ml、２mg/ml、３mg/ml、４mg/ml、５mg/ml、６mg/ml、７mg/ml、８mg/ml、９mg/ml、１０mg/ml、１１mg/ml、１２mg/ml、１３mg/ml、１４mg/ml、１５mg/ml、１６mg/ml、１７mg/ml、１８mg/ml、１９mg/ml、２０mg/ml、２１mg/ml、２２mg/ml、２３mg/ml、２４mg/ml、２５mg/ml、またはそれ以上である。他の実施態様において、そのような組成物は、Ｂ以下の濃度でグルカゴンペプチドを含有することができ、ここでＢは、３０mg/ml、２５mg/ml、２４mg/ml、２３mg/ml、２２mg/ml、２１mg/ml、２０mg/ml、１９mg/ml、１８mg/ml、１７mg/ml、１６mg/ml、１５mg/ml、１４mg/ml、１３mg/ml、１２mg/ml、１１mg/ml、１０mg/ml、９mg/ml、８mg/ml、７mg/ml、６mg/ml、５mg/ml、４mg/ml、３mg/ml、２mg/ml、１mg/ml、または０．１mg/mlである。幾つかの実施態様において、組成物は、Ａ〜Ｂmg/mlの濃度範囲、例えば０．００１〜３０．０mg/mlの濃度範囲でグルカゴンペプチドを含有することができる。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌されていて、更に多様な容器に保存されていてもよい、水性液剤を含む。そのような液剤を一つの実施態様に従って使用して、注射用の予備処方液剤を調製することができる。別の実施態様において、医薬組成物は凍結乾燥粉末剤を含む。医薬組成物を、患者に組成物を投与する使い捨て装置を含むキットの一部として更に包装することができる。装置は、シリンジおよび針または充填済シリンジを含むことができる。容器またはキ
ットにラベルを付けて周囲温度または冷蔵温度で保存することができる。

【0039】

一つの実施態様によると、本発明のグルカゴンペプチドの予備処方水性組成物を使用して、グルコースレベルを急速に増加する、または低血糖症を治療する方法が提供される。この方法は、本開示の新規修飾グルカゴンペプチドを含む水性液剤の有効量を投与する工程を含む。一実施態様では、グルカゴンペプチドは、位置２１または２４においてＰＥＧ化され、このＰＥＧ鎖は、約５００から約５，０００ダルトンの分子量を持つ。一実施態様では、このグルカゴン修飾体溶液は、該組成物を、低血糖症に罹っている患者に投与するのに使用されるデバイスの中にあらかじめ包装される。

【0040】

一実施態様によれば、インスリン依存性患者において血中グルコースレベルを調節する改良された方法が提供される。本方法は、糖尿病のコントロールのために治療的に有効な量のインスリンを投与する工程、および、低血糖症の予防のために治療的に有効な量の、本開示の新規グルカゴンペプチド修飾体を投与する工程を含み、これらの投与工程は、互いに１２時間以内に実行される。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドおよびインスリンは、単一組成物として同時投与され、ここでグルカゴンペプチドは、約５，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するＰＥＧ鎖でペグ化されている。

【0041】

別の実施態様において、腸管の一過性麻痺を誘導する方法が提供される。この方法は、本明細書に開示されている一つ以上のグルカゴンペプチドを患者に投与する工程を含む。

【0042】

代謝症候群Ｘ、インスリン抵抗症候群またはＲｅａｖｅｎ症候群としても知られている、メタボリックシンドロームは、５千万人を超えるアメリカ人が罹患している疾患である。メタボリックシンドロームは、典型的には、以下の危険因子の少なくとも３つ以上の集団により特徴付けられる：（１）腹部肥満（腹部およびその周りの過剰脂肪組織）、（２）アテローム性異脂肪血症（動脈の壁にプラークの蓄積を増強する、高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロールおよび高ＬＤＬコレステロールを含む血中脂肪障害）、（３）血圧の上昇、（４）インスリン抵抗性またはグルコース不耐性、（５）血栓形成促進状態（例えば、高濃度の血中フィブリノゲンまたはプラスミノゲン活性化剤阻害剤−１）、ならびに（６）炎症促進性状態（例えば、血中Ｃ反応性タンパク質の上昇）。他の危険因子には、加齢、ホルモンの不均衡および遺伝的素因が含まれうる。

【0043】

メタボリックシンドロームは、冠動脈性心疾患の危険性、ならびに、卒中や、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）と呼ばれる末梢血管疾患のような、血管プラークの蓄積に関連する他の障害の危険性の増加に関連する。メタボリックシンドロームの患者は、インスリン抵抗性状態の初期段階から完全なＩＩ型糖尿病まで進行し、ＡＳＣＶＤの危険性を更に増加する。特定の理論に束縛されることを意図せずに、インスリン抵抗性、メタボリックシンドロームおよび血管疾患の間の関係は、インスリン刺激血管拡張障害、増強された酸化ストレスに起因するＮＯ利用能のインスリン抵抗性関連の低減、およびアジポネクチンのような脂肪細胞誘導ホルモンの異常を含む、一つ以上の同時発病機構を伴いうる（Lteif and Mather,Can.J.Cardiol.20(suppl.B):66B-76B(2004)）。

【0044】

２００１年の全米コレステロール教育プログラムの成人治療パネル（ＡＴＰＩＩＩ）によると、同じ個人において以下のいずれか３つの特徴がメタボリックシンドロームの基準を満たす：（ａ）腹部肥満（男性では１０２ｃｍを超える、女性では８８ｃｍを超える胴回り）；（ｂ）血清トリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄｌ以上）；（ｃ）ＨＤＬコレステロール（男性では４０ｍｇ／ｄｌ以下、女性では５０ｍｇ／ｄｌ以下）；（ｄ）血圧（１３０／８５以上）；ならびに（ｅ）空腹時血糖（１１０ｍｇ／ｄｌ以上）。世界保険機構（ＷＨＯ）によると、以下の少なくともいずれか２つの基準を有する高インスリンレベル（空腹時血糖の上昇または食後血糖のみの上昇）を有する個人は、メタボリックシンドロームの基準を満たす：（ａ）腹部肥満（胴回りと臀部の比が０．９超、肥満指数が少なくとも３０ｋｇ／ｍ^２または胴回りの寸法が３７インチ超）；（ｂ）コレステロールパネルが少なくとも１５０ｍｇ／ｄｌのトリグリセリドレベルまたは３５ｍｇ／ｄｌより低いＨＤＬコレステロールを示す；（ｃ）血圧が１４０／９０以上または高血圧の治療中。（Mathur,Ruchi,"Metabolic Syndrome," ed. Shiel,Jr., William C., MedicineNet.com, May 11, 2009）。

【0045】

本明細書における目的のために、ある個人が、２００１年の全米コレステロール教育プログラムの成人治療パネル（ＡＴＰＩＩＩ）またはＷＨＯにより設定された基準のいずれかまたは両方の基準を満たす場合、その個人は、メタボリックシンドロームに罹患していると考慮される。

【0046】

特定の理論に束縛されることなく、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、メタボリックシンドロームの治療に有効である。したがって、本発明は、被験者において、メタボリックシンドロームを予防若しくは治療する、またはその危険因子のうちの１、２、３つ若しくはそれ以上を低減する方法であって、メタボリックシンドロームまたはその危険因子を予防または治療するのに有効な量の本明細書に記載されるグルカゴンペプチドを、被験者に投与することを含む方法を提供する。

【0047】

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、単純な脂肪肝（脂肪変性）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、硬変（肝臓の不可逆性進行瘢痕化）までの範囲の広範囲の肝疾患を意味する。ＮＡＦＬＤの全ての病期は、共通して、肝臓の細胞（肝細胞）における脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を有する。単純な脂肪肝は、炎症または瘢痕化を有さない肝臓の細胞に特定の種類の脂肪、トリグリセリドが異常蓄積することである。ＮＡＳＨでは、脂肪蓄積は、肝臓の多様な程度の炎症（肝炎）および瘢痕化（線維症）に関連する。炎症性細胞は肝臓細胞を破壊することができる（肝細胞壊死）。用語「脂肪性肝炎」および「脂肪壊死」において、脂肪（steato）は、脂肪浸潤を意味し、肝炎は、肝臓における炎症を意味し、壊死は、破壊された肝臓細胞を意味する。ＮＡＳＨは、最終的に、肝臓の瘢痕化（線維症）、次に不可逆性で進行型の瘢痕化（硬変）をもたらす可能性がある。ＮＡＳＨにより引き起こされる硬変は、ＮＡＦＬＤの範囲において最終的で最も重篤な病期である。（Mendler, Michel, "Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH)," ed. Schoenfield, Leslie J., Medicine Net.com, August 29,2005）。

【0048】

アルコール性肝疾患またはアルコール誘導肝疾患は、アルコールの過剰消費に関連するまたはより引き起こされる、３つの病理的に異なる肝臓疾患：脂肪肝（脂肪変性）、慢性または急性肝炎および硬変、を包含する。アルコール性肝炎は、実験室試験における異常が疾患の唯一の指標である中程度の肝炎から、横断（ビリルビンの保持により引き起こされる黄色皮膚）、肝性脳症（肝不全により引き起こされる神経性機能不全）、腹水症（腹部における流体の蓄積）、出血性食道静脈瘤（食道の静脈瘤）、血液凝固異常および昏睡のような合併症を伴う重篤な肝機能不全までの範囲でありうる。組織学的には、アルコール性肝炎は、肝細胞の気球状変性、好中球による、時にはマロリ小体による炎症（細胞中間体フィラメントタンパク質の異常蓄積）による特徴的な外観を有する。硬変は、線維症と組み合わされた、肝臓に広範囲に分布した小結節により解剖学的に特徴付けられる。（Worman, Howard J., "Alcoholic Liver Disease", Columbia University Medical Center website）。

【0049】

特定の理論に束縛されることなく、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、例えば、脂肪変性、脂肪性肝炎、肝炎、肝臓炎症、ＮＡＳＨ、硬変またはこれらの合併症を含む、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、またはこれらの任意の病期の治療に有用である。したがって、本発明は、被験者においてアルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤまたはこれらの任意の病期を予防または治療する方法であって、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤまたはこれらの任意の病期を予防または治療するのに有効な量の本明細書に記載されるグルカゴンペプチドを被験者に投与することを含む方法を提供する。そのような治療方法には、以下のうちの１、２、３つまたはそれ以上の低減が含まれる：肝臓の脂肪含有量、硬変の発症または進行、肝細胞癌の発症、炎症の兆候、例えば異常な肝酵素レベル（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴおよび／またはアラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴまたはＬＤＨ）、血清フェリチンの上昇、血清ビリルブビンの上昇ならびに／あるいは線維症の兆候、例えばＴＧＦ−ベータレベルの上昇。好ましい実施態様において、グルカゴンペプチドを使用して、単純な脂肪肝（脂肪変性）を超えて進行し、炎症または肝炎の兆候を示す患者を治療する。そのような方法は、例えば、ＡＳＴおよび／またはＡＬＴレベルの低減をもたらす場合がある。

【0050】

更に別の実施態様において、本発明のグルカゴンペプチドを含む水性液剤の有効量を投与することを含む、高血糖症を治療する方法、または体重増加を低減する若しくは減量を誘導する方法が提供される。一つの実施態様において、いずれかの方法は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９から成る群から選ばれるグルカゴンアゴニストを含む組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様において、本方法は、グルカゴンアゴニストを含む組成物の有効量を投与することを含み、ここで、グルカゴンアゴニストは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９から成る群から選ばれるグルカゴンペプチドを含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９は、ペプチド結合を介して第２ペプチドに共有結合しており、前記第２ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の配列を含む。更なる実施態様において、従来の用量または低減された用量のインスリンと本発明のグルカゴンペプチドを同時投与することを伴う糖尿病の治療方法が提供される。インスリンの同時投与を伴うことなく、本発明のグルカゴンペプチドにより糖尿病を治療する方法も提供される。

【0051】

更に別の態様において、本発明は、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体の両方とも活性化するグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子（その薬学的に許容される塩を含む）の投与を伴う、高血糖症を治療する新規方法および食欲を減少するまたは減量を促進する新規方法を提供する。グルカゴンとＤＬＰ−１の両方の受容体のアゴニズム、すなわち活性化は、高血糖症の治療においてＧＬＰ−１アゴニズム単独と比較して予想外の改善をもたらす。したがって、グルカゴンアゴニズムの付加は、予想外の付加的若しくは相乗的効果または他の予想外の臨床的利益（複数または単数）をもたらす。従来用量のインスリンか低減用量のインスリンを伴う投与、またはインスリンなしの投与が、そのような方法に考慮される。グルカゴン受容体のアゴニズムも、減量の促進または体重増加の予防においてＧＬＰ−１単独と比較して予想外の利益を有する。

【0052】

例示的なグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子には、本発明のグルカゴンペプチド、ＧＬＰ−１とグルカゴンの両方の受容体を活性化するＧＬＰ−１類縁体、グルカゴンとＧＬＰ−１の融合体またはグルカゴン類縁体とＧＬＰ−１類縁体の融合体、あるいはこれらの化学的に修飾された誘導体が含まれる。あるいは、グルカゴン受容体を活性化する化合物を、ＧＬＰ−１受容体を活性化する化合物（例えば、ＧＬＰ−１類縁体、エキセンディン−４類縁体またはこれらの誘導体）と同時投与することができる。本発明は、グルカゴンアゴニスト類縁体とＧＬＰ−１アゴニスト類縁体の同時投与も考慮する。

【0053】

そのような、高血糖症を治療する、および／または食欲を減少する若しくは減量を促進する方法は、位置１２（例えば、Ａｒｇ１２）の修飾を有するグルカゴン類縁体であって、更に位置１６および／または２０の修飾と組み合わせてもよい類縁体の投与を含む。本発明の方法は、グルカゴン類縁体であって、アミノ酸１２と２９の領域内の、３個の介在アミノ酸により隔てられている２つのアミノ酸、例えば、位置１２と１６、位置１３と１７（例えばＬｙｓ１３とＧｌｕ１７若しくはＧｌｕ１３とＬｙｓ１７）、位置１６と２０、位置１７と２１（例えば、Ｌｙｓ１７とＧｌｕ２１若しくはＧｌｕ１７とＬｙｓ２１）、位置２０と２４、または位置２４と２８（更に位置９のアミノ酸はＧｌｕではないことを条件としてもよい）、の２つのアミノ酸の側鎖同士の間に分子内架橋を含み、更にＣ末端アミドまたはエステルを含んでもよい、グルカゴン類縁体を投与することも含む。

【0054】

一つの実施態様によると、そのようなグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子から排除されるものは、そのような方法に有用であることが知られている従来技術の任意のグルカゴン類縁体またはＧＬＰ−１類縁体である。別の実施態様において、糖尿病の治療においてＧＬＰ−１アゴニストとグルカゴンアンタゴニストの両方として作用する米国特許第６，８６４，０６９号に記載されるペプチドも、グルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子としては排除される。別の実施態様において、排除されるのは、Unson et al., J.Biol. Chem., 264: 789-794 (1989)、Ahn et al., J.Med.Chem., 44: 3109-3116 (2001)およびSapse et al., Mol. Med., 8(5): 251-262 (2002)に記載されているアゴニストのような、糖尿病を治療するグルカゴンアンタゴニストの使用である。更なる実施態様において、オキシントモジュリン（配列番号２７）の８個のＣ末端アミノ酸を含有するオキシントモジュリンまたはグルカゴン類縁体も、グルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子としては排除される。

【0055】

高血糖症を治療するそのような方法は、インスリン依存性またはインスリン非依存性のいずれかの糖尿病、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病または妊娠糖尿病を含む、多様な種類の高血糖症に有用であること、ならびに腎障害、網膜症および血管疾患を含む、糖尿病の合併症を低減することに有用であること、が予想される。そのような食欲を減退するまたは減量を促進する方法は、体重の低減、体重増加の防止または薬剤誘導肥満を含む多様な原因の肥満の治療、ならびに血管疾患（冠動脈疾患、卒中、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症および筋骨格系疾患を含む、肥満に関連する合併症の低減に有用であることが予想される。

【0056】

本明細書に記載されている全ての治療方法、医薬組成物、キットおよび他の同様の実施態様は、グルカゴン類縁体という用語の使用にはその薬学的に許容される塩またはエステルが全て含まれることを考慮する。

【0057】

（関連出願の相互参照）
本出願は、以下に対する優先権を請求する：米国仮出願第６１／０７３，２６９号（２００８年６月１７日出願）、米国仮出願第６１／０７８，１６８号（２００８年７月３日出願）、米国仮出願第６１／０９０，４１２号（２００８年８月２０日出願）、および米国仮出願第６１／１７７，４７６号（２００９年５月１２日出願）。それぞれの出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】図１は、３７℃でそれぞれ２４、４８、７２、９６、１４４および１６６時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ^２１−マレイミドＰＥＧ_５κの安定性を表す棒グラフである。

【図2】図２は、３７℃でそれぞれ２４、７２または１４４時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ^２１マレイミドＰＥＧ_５κのｐＨ５でのＨＰＬＣ分析から生成したデータを表す。

【図3】図３は、グルカゴン類縁体による受容体媒介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。さらに具体的には、図３Ａは、グルカゴン類縁体のＥ１６，Ｋ２０●、Ｅ１５、Ｅ１６▲、Ｅ１６，Ｋ２０▼、Ｅ１５，Ｅ１６（左向き黒三角）、Ｅ１６（右向き黒三角）、およびＧｌｕｃ−ＮＨ_２■によるグルカゴン受容体の誘導を比較する。

【図4】図４Ａと図４Ｂは、グルカゴン類縁体による受容体媒介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。さらに具体的には、図４Ａは、天然グルカゴン■に対して、グルカゴン類縁体のＧｌｕｃ−ＮＨ_２●、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▲、Ｅ３，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▼、Ｏｒｎ３，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（左向き黒三角）およびＮｌｅ３，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（右向き黒三角）によるグルカゴン受容体の誘導を比較し、一方、図４Ｂは、天然ＧＬＰ−１■に対して、グルカゴン類縁体のＧｌｕｃ−ＮＨ_２●、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▲、Ｅ３，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▼、Ｏｒｎ３，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（左向き黒三角）およびＮｌｅ３，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（右向き黒三角）によるＧＬＰ−１受容体の誘導を比較する。

【図5】図５Ａと図５Ｂは、グルカゴン類縁体による受容体媒介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。さらに具体的には、図５Ａは、グルカゴン−ＮＨ_２（■）に対して、グルカゴン類縁体（Ｅ１６，Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２●（５ｎＭ、保存液）、Ｅ１５，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▲（５ｎＭ、保存液）、Ｅ１６，Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▼（１０ｎＭ、保存液）、Ｅ１５，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（左向き黒三角）（１０ｎＭ、保存液）およびＥ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（右向き黒三角））によるグルカゴン受容体の誘導を比較し、一方、図５Ｂは、グルカゴン−ＮＨ_２（□）に対して、グルカゴン類縁体の（Ｅ１６，Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２●、Ｅ１５，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▲およびＥ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（右向き黒三角））によるＧＬＰ−１受容体活性の誘導を比較する。

【図6】図６Ａと図６Ｂは、グルカゴン類縁体による受容体媒介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。さらに具体的には、図６Ａは、グルカゴン（■）に対して、グルカゴン類縁体（Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２●、Ｋ１２Ｅ１６−ＮＨ_２ラクタム▲、Ｅ１６Ｋ２０−ＮＨ_２ラクタム▼、Ｋ２０Ｅ２４−ＮＨ_２ラクタム（左向き黒三角）およびＥ２４Ｋ２８−ＮＨ_２ラクタム（右向き黒三角））によるグルカゴン受容体の誘導を比較し、一方、図６Ｂは、ＧＬＰ−１（■）に対して、グルカゴン類縁体（Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２●、Ｋ１２Ｅ１６−ＮＨ_２ラクタム▲、Ｅ１６Ｋ２０−ＮＨ_２ラクタム▼、Ｋ２０Ｅ２４−ＮＨ_２ラクタム（左向き黒三角）およびＥ２４Ｋ２８−ＮＨ_２ラクタム（右向き黒三角））によるＧＬＰ−１受容体の誘導を比較する。

【図7】図７Ａと図７Ｂは、グルカゴン類縁体による受容体媒介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。さらに具体的には、図７Ａは、グルカゴン（■）に対して、グルカゴン類縁体（Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２●、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▲、Ｋ１２，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ラクタム▼、Ｅ１６，Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（左向き黒三角）およびＥ１６，Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ラクタム（右向き黒三角））によるグルカゴン受容体の誘導を比較し、一方、図７Ｂは、ＧＬＰ−１（■）に対して、グルカゴン類縁体（Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２●、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２▲、Ｋ１２，Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ラクタム▼、Ｅ１６、Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（左向き黒三角）およびＥ１６，Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ラクタム（右向き黒三角））によるＧＬＰ−１受容体の誘導を比較する。

【図8】図８Ａ〜８Ｆは、グルカゴン受容体（図８Ａ、８Ｃおよび８Ｅ）またはＧＬＰ−１受容体（図８Ｂ、８Ｃおよび８Ｆ）に対するグルカゴン類縁体による受容体媒介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表し、ここで、ｈＥ＝ホモグルタミン酸であり、ｈＣ＝ホモシステイン酸である。

【図9】図９Ａおよび９Ｂは、ＧＬＰ（１７−２６）グルカゴン類縁体による受容体媒介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表し、ここで天然グルカゴン（配列番号１）の位置１７〜２６のアミノ酸は、天然ＧＬＰ−１（配列番号５０）の位置１７〜２６のアミノ酸で置換されている。さらに具体的には、図９Ａは、表示ＧＬＰ（１７−２６）グルカゴン類縁体によるグルカゴン受容体の誘導を比較し、図９Ｂは、表示ＧＬＰ（１７−２６）グルカゴン類縁体によるＧＬＰ−１受容体の誘導を比較する。

【図10】図１０Ａ〜Ｅは、それぞれの化合物の表示量を皮下に注射したマウスに減量を誘導する、本発明のグルカゴンペプチドの能力を示すインビボデータを提供するグラフである。図１０Ａ〜１０Ｅに提示したグルカゴンペプチドの配列識別子は以下である。図１０Ａでは、キメラ２ Ａｉｂ２ Ｃ２４ ４０Ｋ ＰＥＧ（配列番号４８６）、Ａｉｂ２ Ｃ２４ キメラ２ ４０Ｋラクタム（配列番号５０４）およびＡｉｂ２ Ｅ１６ Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ Ｌａｃ ４ＯＫ（配列番号５２８）であり；図１０Ｂでは、Ａｉｂ２ Ｃ２４ Ｃｈｉ２ ラクタム４０Ｋ（配列番号５０４）、ＤＭＩＡｌ Ｃ２４ Ｃｈｉ２ ラクタム４０Ｋ（配列番号５０５）、キメラ２ ＤＭＩＡ１ Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５１９）およびキメラ２ Ａｉｂ２ Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号４８６）（ここで文字列の末端の数字は、使用投与量である７０または３５０ｎｍｏｌ／ｋｇを示す）であり；図１０Ｃでは、ＡＩＢ２ ラクタム有 Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５０４）、ＡＩＢ２ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有 Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５２８）、ＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有 Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５１０）、ＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有 ＣＥＸ ４０Ｋ（配列番号５１３）およびＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム無 ＣＥＸ ４０Ｋ（配列番号５２９）であり；図１０Ｄでは、ＡＩＢ２ ラクタム有 Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５０４）、ＡＩＢ２ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有 Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５２８）、ＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有 Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５１０）およびＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有 Ｃｅｘ Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５１３）（ここで文字列の末端の数字は、使用投与量である１４または７０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週を示す）であり；図１０Ｅでは、 ＡＩＢ２ ラクタム無 Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号４８６）、Ｃｈｉ２ ＡＩＢ２ Ｃ２４ ＣＥＸ ４０Ｋ（配列番号５３３）、ＡＩＢ２ Ｅ１６ Ａ１８ Ｋ２０ Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号４９２）、ＡＩＢ２ ラクタム無 ＣＥＸ Ｇ２９ Ｃ４０ ４０Ｋ（配列番号４８８）、ＡＩＢ２ ラクタム無 ＣＥＸ Ｃ４０ Ｃ４１−２（配列番号５３２）、ＡＩＢ２ ラクタム無 ＣＥＸ Ｃ２４ Ｃ４０−２（配列番号５３１）およびＡＩＢ２ ラクタム無 Ｃ２４ ６０Ｋ（配列番号４９８）であり、ここで表示４０Ｋまたは６０Ｋは、グルカゴンペプチドに結合するポリエチレン鎖の分子量を表す。

【図11】図１１は、アシル化グルカゴンペプチドが、該化合物の表示量を皮下注射したマウスにおいて、減量を誘導する能力を示すインビボデータを提供するグラフである。

【図12】図１２は、アシル化グルカゴンペプチドが、該化合物の表示量を皮下注射したマウスにおいて、食物摂取を低減する能力を示すインビボデータを提供するグラフである。

【図13】図１３は、アシル化グルカゴンペプチドが、該化合物の表示量を皮下注射したマウスにおいて、血中グルコースレベルを低減する能力を示すインビボデータを提供するグラフである。

【図14】図１４Ａおよび１４Ｂは、グルカゴン類縁体によるグルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体媒介ｃＡＭＰ誘導をそれぞれ示すデータを表す。

【図15】図１５は、２ｎｍｏｌ／ｋｇのビヒクルのみ（三角）、キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（中空四角）またはキメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（逆三角）により処置され、該ペプチドの投与の１５分後にグルコース投与を受けたＤＩＯマウスにおける、時間（分）の関数としての血中グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。

【図16】図１６は、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのビヒクルのみ（三角）、キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（中空四角）またはキメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（逆三角）により処置され、該ペプチドの投与の１５分後にグルコース投与を受けたＤＩＯマウスにおける、時間（分）の関数としての血中グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。

【図17】図１７は、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのビヒクルのみ（逆三角）、キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（中空三角）、キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（菱形）またはキメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（中空四角）により処置され、該ペプチドの投与の１５分後にグルコース投与を受けたＤＩＯマウスにおける、時間（分）の関数としての血中グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。

【図18】図１８は、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのビヒクルのみ（逆三角）、キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（中空三角）、キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（菱形）またはキメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（中空四角）により処置され、該ペプチドの投与の２４時間後にグルコース投与を受けたＤＩＯマウスにおける、時間（分）の関数としての血中グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。

【図19】図１９は、１５または７０ｎｍｏｌ／ｋｇのビヒクルのみ（菱形と実線）；キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、中空菱形と点線；７０ｎｍｏｌ／ｋｇ、中空三角と実線）；キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^ｌ０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、中実三角と点線；７０ｎｍｏｌ／ｋｇ、中実三角と実線）；キメラ−２ ＡＩＢ^２，Ｋ^ｌ０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、逆三角と点線；７０ｎｍｏｌ／ｋｇ、逆三角と実線）により処置されたＤＩＯマウスにおける、時間（日）の関数のとしての体重の変化（％）のグラフを表す。

【図20】図２０は、１０、２０、４０若しくは８０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４または２０ｎｍｏｌ／ｋｇのキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤまたはビヒクル対照を週に一度ずつ注射して１４日後のマウスにおける、体重の総変化（％）のグラフを表す。

【図21】図２１は、グルコース注射の２４時間前に１０、２０、４０若しくは８０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４または２０ｎｍｏｌ／ｋｇのキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤまたはビヒクル対照を注射したマウスの、グルコース注射に対する反応した血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。

【図22】図２２は、ビヒクル対照、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドまたはβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを表示された用量で注射されたマウスの、体重の総変化（％）のグラフを表す。

【図23】図２３は、ビヒクル対照、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドまたはβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを表示された用量で注射されたマウスの、研究の７日目に測定した脂肪量（ｇ）のグラフを表す。

【図24】図２４は、ビヒクル対照、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドまたはβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを表示された用量で注射されたマウスの、血中グルコースの変化（ｍｇ／ｄＬ；７日目のレベルから０日目のレベルを引く）のグラフを表す。

【図25】図２５は、１０％ＴＦＥ添加また未添加の１０ｍＭのリン酸（ｐＨ５．９）中のペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＤについて、平均残基楕円率を波長（ｎｍ）の関数として示したグラフを表す。

【図26】図２６は、グルカゴン受容体（左）またはＧＬＰ−１受容体（右）のいずれかに結合しているグルカゴン、ＧＬＰ−１、ペプチドＸ、ペプチドＸ−ＰＥＧ、ペプチドＹまたはペプチドＹ−ＰＥＧに反応して産生されるｃＡＭＰの％を、ペプチド濃度（ｎＭ）の関数として示したグラフを表す。

【図27】図２７は、ビヒクル対照、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧにより１週間処置した食餌誘発肥満マウスにおける、Ａ）体重、Ｂ）脂肪量、Ｃ）食物摂取およびＤ）空腹時血糖レベル、に対するインビボ効果を示すグラフの一群を表す。さらに具体的には、図２７Ａは、時間（日）の関数としての体重（ＢＷ）の変化％のグラフを表し、図２７Ｂは、７日目に測定した脂肪量の変化％（初期脂肪量測定値と比較した）を表し、図２７Ｃは、７日目に測定した、研究の全体にわたる総食物摂取量（ｇ）のグラフを表し、図２７Ｄは、７日目に測定した血中グルコースの変化（ｍｇ／ｄＬ）（初期血中グルコースレベルと比較した）のグラフを表す。

【図28】図２８は、多様な用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ／週）でペプチドＸ−ＰＥＧ（図２８Ａおよび２８Ｂ）またはペプチドＹ−ＰＥＧ（図２８Ｃおよび２８Ｄ）のいずれかにより処置されたマウスにおける、体重（図２８Ａおよび２８Ｃ）ならびに空腹時血糖レベル（図２８Ｂおよび２８Ｄ）に対するインビボ効果を示すグラフの一群を表す。

【図29】図２９は、ビヒクル対照、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧにより１か月処置された食餌誘発肥満マウスにおける、Ａ）体重（ＢＷ）、Ｂ）体脂肪量、Ｃ）総食物摂取量、Ｄ）エネルギー消費量、Ｅ）呼吸商、Ｆ）自発運動活性、Ｇ）空腹時血糖、Ｈ）グルコース耐性、およびＩ）総血漿インスリンレベル、に対するインビボ効果を示すグラフの一群を表す。

【図30】図３０は、ビヒクル対照、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧにより１か月処置された食餌誘発肥満マウスにおける、Ａ）食物摂取量、Ｂ）総エネルギー消費量、Ｃ）総呼吸商、Ｄ）自発運動活性、Ｅ）総自発運動活性、Ｆ）ｉｐＧＴＴ曲線下面積、Ｇ）血漿Ｃペプチドのレベル、Ｈ）ＰＥＰＣＫ／ＨＰＲＴ発現比率レベル、およびＩ）Ｇ６Ｐ／ＨＰＲＴ発現比率レベル、の熱量測定に対する３週間目のインビボ効果を示すグラフの一群を表す。

【図31】図３１は、ビヒクル対照、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧにより１か月処置した食餌誘発肥満マウスにおける、血漿のＡ）コレステロール、Ｂ）コレステロールＦＰＬＣ、Ｃ）トリグリセリド、Ｄ）レプチン、Ｅ）レジスチン、およびＦ）アジポネクチン、に対するインビボ効果を示すグラフの一群を表す。

【図32】図３２は、ビヒクル対照、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧにより処置したマウスにおける、Ａ）ＢＡＴ ＵＣＰ−１発現レベル、およびＢ）ホルモン感受性リパーゼ（ｐＨＳＬ）のリン酸化が反映された白色脂肪組織、に対するインビボ効果を示すグラフの一群を表す。

【図33】図３３は、ＤＩＯラットにおけるＡ）体重、およびＢ）脂肪量、に対するビヒクル対照、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧのインビボ効果を示すグラフの一群を表す。図３３Ｃは、ペプチドＹ−ＰＥＧ、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはビヒクルにより２週間処置したマウスから単離した表皮脂肪組織におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量的に評価した、ＴＦＩＩＢと比較してのＣＤ６８の相対的発現に関するグラフを表す。データは、ＴＦＩＩＢ ｍＲＮＡ発現に対して規準化した相対的ＣＤ６８ ｍＲＮＡ発現として表し、平均±ＳＥＭとして表す。

【図34】図３４Ａ〜３４Ｆは、ビヒクル対照、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧにより処置されたＧＬＰ−１−Ｒノックアウトマウスにおける、体重（ＢＷ；３４Ａおよび３４Ｂ）、脂肪量（３４Ｃ）、食物摂取量（３４Ｄ）ならびに血中グルコースレベル（３４Ｅおよび３４Ｆ）に対するインビボ効果を示すグラフの一群を表す。

【図35】図３５Ａ〜３５Ｃは、ビヒクル対照、ペプチドＶまたはペプチドＵにより処置されたＤＩＯマウスにおける、体重（３５Ａ）、血中グルコース（３５Ｂ）および脂肪量（３５Ｃ）に対するインビボ効果を示す一連のグラフを表す。

【発明を実施するための形態】

【0059】

＜定義＞
本発明を説明し、その特許を主張するに当たり、下記の語法が、下記に記載される定義に従って使用される。

【0060】

本明細書で用いる「薬学的に受容可能な担体」という用語は、標準的な製剤担体、例えば、リン酸バッファー生理的食塩水、水、乳液、例えば、油／水または水／脂乳液、および種々のタイプの湿潤剤の内のいずれかを含む。本用語はさらに、ヒトを含む動物における使用に関して、米国連邦政府の規制当局によって承認されるか、または、米国薬局方に掲載されている、任意の薬剤を包含する。

【0061】

本明細書で用いる「薬学的に受容可能な塩」という用語は、母体化合物の生物活性を保持するが、生物学的にもまたは他の点でも有害でない、化合物の塩を指す。本明細書に開示される化合物の多くは、アミノ基および／またはカルボキシル基、または、それと同様の基があるために、酸性および／または塩基性塩を形成することが可能である。

【0062】

薬学的に受容可能な塩基添加塩は、無機および有機塩から調製することが可能である。無機塩から得られる塩としては、例示としてのみ述べると、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基から得られる塩としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、一級、二級、および三級アミンの塩が挙げられる。

【0063】

薬学的に受容可能な酸添加塩は、無機および有機酸から調製されてもよい。無機酸から得られる塩としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。有機酸から得られる塩としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、シナモン酸、マンデル酸、メタンスルフォン酸、エタンスルフォン酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、サリチル酸などが挙げられる。

【0064】

本明細書で用いる「治療する」という用語は、特定の障害または病態の予防、または、特定の障害または病態に関連する症状の緩和、および／または、前記症状の防止または根絶を含む。例えば、本明細書で用いる「糖尿病を治療する」という用語は、一般に、血中のグルコースレベルを正常レベルに向けて変えることを指し、所定の状況に応じて血中のグルコースレベルを上昇または下降させることを含んでもよい。

【0065】

本明細書で用いる、グルカゴンペプチドの「有効」な量、または「治療的有効量」とは、該ペプチドの、無害であるが、所望の作用を実現するのに十分な量を指す。例えば、所望の作用の一つとしては、例えば、血中グルコースレベルの増加によって測定される、低血糖症の予防または治療が考えられる。本開示のコアゴニスト類縁体の、別の所望の作用としては、例えば、血中グルコースレベルの正常により近づく変化によって測定される、高血糖症の治療、または、例えば、体重の低下によって測定される減量の誘導／体重増加の阻止、または、体重増加の阻止若しくは軽減、または、体脂肪分布の正常化が挙げられよう。「有効な」量は、被検体によってまちまちで、個体の年齢および一般的状態、投与方式などに応じて変動する。従って、正確な「有効量」を特定することは常に可能とは限らない。しかしながら、任意の個別の症例における適切な「有効」量は、当業者であれば、慣用的な実験手法によって定めることが可能である。

【0066】

「非経口的」という用語は、消化管を介さず、何らかの別のルート、例えば、皮下、筋肉内、脊髄内、または静脈内によることを意味する。

【0067】

本明細書で用いる「精製された」および同様の用語は、ある分子または化合物について、それが生まれた環境または天然の環境において通常それに付随するような汚染物を実質的含まない形になるように、該分子または化合物を単離することを指す。本明細書で用いる「精製」という用語は、絶対的純度を必要とせず、むしろ、相対的な定義であることが意図される。「精製ポリペプチド」という用語は、本明細書では、他の化合物、例えば、ただしこれらに限定されないが、核酸分子、脂質、および炭水化物、から分離されたポリペプチドを記載するのに用いられる。

【0068】

「単離された」という用語は、参照される物質が、その元々の環境（例えば、それが天然産であれば、天然環境）から取り出されていることを必要とする。例えば、生きている動物の体内に存在する天然産ポリヌクレオチドは、単離されていないが、同じポリヌクレオチドが天然系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離されていれば、単離されている。

【0069】

本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、３個以上のアミノ酸、典型的には５０個未満のアミノ酸の配列を包含し、ここでアミノ酸は、天然型または非天然型のアミノ酸である。非天然型のアミノ酸とは、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。

【0070】

本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸のポリマーを、ポリマーの長さに関わりなく意味するために、相互交換的に使用される用語である。典型的には、ポリペプチドおよびタンパク質は、「ペプチド」よりも長いポリマー長さを有する。

【0071】

本明細書で用いる「グルカゴンペプチド」は、配列番号１のアミノ酸配列か、または、配列番号１のアミノ酸配列の類縁体であって、アミノ酸置換、付加、欠失、または翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内共有結合、例えば、ラクタム架橋形成、ＰＥＧ化など）を含み、例えば実施例１４に記載するアッセイを用いてｃＡＭＰ生産により測定した場合、グルカゴンまたはＧＬＰ−１受容体活性を刺激するような類縁体を含む、任意のペプチドを含む。

【0072】

「グルカゴンアゴニスト」という用語は、例えば実施例１４に記載するアッセイを用いてｃＡＭＰ生産により測定した場合、グルカゴン受容体活性を刺激するようなグルカゴンペプチドを含む、複合体を指す。

【0073】

「グルカゴンアゴニスト類縁体」とは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から成る群から選ばれる配列か、または、該配列の類縁体であって、位置２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９の一つ以上において、一つ以上の保存的アミノ酸置換を含むように修飾される類縁体を含む、グルカゴンペプチドである。

【0074】

本明細書で用いるアミノ酸「修飾」とは、アミノ酸の置換、付加、または欠失を指し、ヒトのタンパク質中に一般的に見出される２０種のアミノ酸、および、非典型的または非天然産アミノ酸の内の任意のアミノ酸による、置換または付加を含む。本明細書を通じて、数字による、ある特定アミノ酸位置への参照（例えば、位置２８）は、全て、天然グルカゴン（配列番号１）中のその位置におけるアミノ酸、または、天然グルカゴンの任意の類縁体中の、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸を指す。例えば、本明細書における「位置２８」への参照は、配列番号１の最初のアミノ酸が欠失したグルカゴン類縁体では、対応する位置２７を意味する。同様に、本明細書における「位置２８」への参照は、配列番号１のＮ末端の前に１個のアミノ酸を付加されたグルカゴン類縁体では、対応する位置２９を意味する。非典型的アミノ酸の市販の供給源としては、Sigma-Aldrich（Milwaukee, WI）、ChemPep Inc. Miami, FL）、およびGenzyme Pharmaceuticals（Cambridge, MA）が挙げられる。非典型的アミノ酸は、供給業者から購入してもよいし、新たに合成してもよいし、または、他のアミノ酸を化学的に修飾しても、または他のアミノ酸から誘導してもよい。

【0075】

本明細書で使用されるとき、「グルカゴンコアゴニスト」は、天然グルカゴンと比べて少なくとも約１０％から約５００％またはそれ以上までのグルカゴン受容体に対する活性を示し、また、天然ＧＬＰ−１と比べて少なくとも約１０％から約２００％またはそれ以上までのＧＬＰ−１受容体に対する活性を示すような、グルカゴンペプチドである。

【0076】

本明細書で使用されるとき、「グルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子」は、天然グルカゴンと比べて少なくとも約１０％のグルカゴン受容体に対する活性を示し、また、天然ＧＬＰ−１と比べて少なくとも約１０％のＧＬＰ−１受容体に対する活性を示すような分子である。

【0077】

本明細書で使用されるとき、用語「天然グルカゴン」は、配列番号１の配列から構成されるペプチドを意味し、用語「天然ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号５２の配列から構成される）、ＧＬＰ−１（７−３７）酸（配列番号５０の配列から構成される）またはこの２つの化合物の混合物を示す一般的用語である。本明細書で使用されるとき、更なる名称が不在なときの「グルカゴン」または「ＧＬＰ−１」への一般的な参照は、それぞれ天然グルカゴンまたは天然ＧＬＰ−１を意味することが意図される。

【0078】

本明細書で使用されるとき、アミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に代えることを意味する。

【0079】

本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書において、以下の５つの群のうちの１つの群内での交換として定義される：
Ｉ．小型で脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負荷電残基及びそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正荷電残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）；
ＩＶ．大型で脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン；
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。

【0080】

本明細書で使用されるとき、「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」という総称は、一般式：Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ（ｎは９以上）により表される、分岐鎖又は直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を意味する。更なる特定がない限り、この用語は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含むことが意図される。「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」は、およその平均分子量を示す数字の接尾辞と組み合わせて使用される。例えば、ＰＥＧ−５，０００は、平均約５，０００の総分子量を有するポリエチレングリコールを意味する。

【0081】

本明細書で使用するとき、用語「ペグ化」及び同様の用語は、ポリエチレングリコールポリマーを結合することにより、天然の状態から修飾された化合物を意味する。「ペグ化グルカゴンペプチド」は、共有結合しているＰＥＧ鎖を有するグルカゴンペプチドである。

【0082】

本明細書で使用されるとき、ペプチドに対する一般的な参照は、修飾されたアミノ末端及びカルボキシ末端を有するペプチドも包含することが意図される。例えば、末端カルボン酸の代わりにアミド基を含むアミノ酸鎖は、標準的なアミノ酸を示すアミノ酸配列に包含されることが意図される。

【0083】

本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子、又は分子群である。リンカーは、２つの実体の間に最適な間隔をもたらしてもよいし、更に２つの実体が互いに分離することを可能にする不安定な結合を提供してもよい。不安定な結合には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分、及び酵素切断基が含まれる。

【0084】

本明細書で使用されるとき「二量体」は、リンカーを介して互いに共有結合している２つのサブユニットを含む複合体である。二量体という用語は、意味を限定する言葉無しに使用される場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を包含する。ホモ二量体は、２つの同一のサブユニットを含み、一方、ヘテロ二量体は、互いに実質的に類似してはいるものの異なった２つのサブユニットを含む。

【0085】

本明細書で使用されるとき、用語「荷電アミノ酸」は、生理学的ｐＨの水溶液中で負に帯電（すなわち、脱プロトン化）している、又は正に帯電（すなわち、プロトン化）してている側鎖を含むアミノ酸を意味する。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、及びホモグルタミン酸が含まれ、一方、正荷電アミノ酸には、アルギニン、リシン、及びヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸に加え、異形又は非天然型のアミノ酸のうちの荷電アミノ酸も含まれる。

【0086】

本明細書で使用されるとき、用語「酸性アミノ酸」は、例えばカルボン酸又はスルホン酸基のような第２の酸性部分を含むアミノ酸を意味する。

【0087】

用語「アルキル」は、示された数の炭素原子を含有する、直鎖又は分岐鎖の炭化水素を意味する。例示的アルキルには、メチル、エチル及び直鎖プロピル基が含まれる。

【0088】

用語「ヘテロアルキル」は、構造の主鎖に示された数の炭素原子、及び少なくとも１つのヘテロ原子を含有する、直鎖又は分岐鎖の炭化水素を意味する。本明細書の目的に適したヘテロ原子には、Ｎ、Ｓ及びＯが含まれるが、これらに限定されない。

【0089】

〔実施態様〕
本発明は、グルカゴン受容体若しくはＧＬＰ−１受容体、または両方の受容体に対する活性が増加または減少したグルカゴンペプチドを提供する。本発明は、また、ＧＬＰ−１受容体に比べたグルカゴン受容体に対する選択性が変更されているグルカゴンペプチドを提供する。

【0090】

グルカゴン受容体に対する増加された活性は、本明細書に記載されているように、天然グルカゴン（配列番号１）の位置１６のアミノ酸修飾によりもたらされる。

【0091】

グルカゴン受容体に対する維持または増加された活性は、また、グルタミン類縁体（例えば、（Ｄａｂ（Ａｃ））による天然グルカゴンの位置３のアミノ酸修飾によりもたらされる。

【0092】

グルカゴン受容体に対する低減された活性は、例えば、本明細書に記載されている、酸性、塩基性または疎水性アミノ酸による位置３のアミノ酸の置換によりもたらされる。

【0093】

ＧＬＰ−１受容体に対する増加された活性は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルのような電荷中性基に代えることによってもたらされる。

【0094】

ＧＬＰ−１受容体に対する増加された活性は、グルカゴンのＣ末端部分（例えば、残基１２〜２９周辺）のアルファ−へリックスを安定化する修飾によりもたらされる。幾つかの実施態様において、そのような修飾は、本明細書に記載されているように、３個の介在アミノ酸により隔てられている、例えば位置１２と１６または１６と２０または２０と２４の２個のアミノ酸の側鎖同士の間に分子内架橋の形成を可能にする。他の実施態様において、そのような修飾には、１個以上のα，α−二重置換アミノ酸、例えばＡＩＢを位置１６、２０、２１または２４の一つ以上に導入する、挿入または置換修飾が含まれる。

【0095】

分子内架橋、例えば共有結合性分子内架橋を欠いているペプチドの、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対する増加された活性は、ペプチドの位置１０のアミノ酸の側鎖にアシルまたはアルキル基を共有結合することによりもたらされ、ここでアシルまたはアルキル基は、位置１０のアミノ酸に対して非天然である。分子内架橋、例えば、共有分子内架橋を欠いているそのようなペプチドの、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対する更に増強された活性は、アシルまたはアルキル基と位置１０のアミノ酸の側鎖との間にスペーサーを組み込むことによって達成することができる。適切なスペーサーは、本明細書に記載されており、３〜１０原子長のスペーサーが含まれるが、これらに限定されない。

【0096】

ＧＬＰ−１受容体に対する増加された活性は、本明細書に記載されているように、位置２０のアミノ酸修飾によりもたらされる。

【0097】

ＧＬＰ−１受容体に対する増加された活性は、配列番号２６のＣ末端延長部を含むグルカゴン類縁体にもたらされる。配列番号２６を含むそのような類縁体におけるＧＬＰ−１活性を、本明細書に記載されているように、位置１８、２８若しくは２９のアミノ酸または位置１８および２９のアミノ酸を修飾することにより、更に増加することができる。

【0098】

位置１および２のアミノ酸修飾により低減されたグルカゴン活性の回復は、本明細書に記載されているように、３個の介在アミノ酸により隔てられている２個のアミノ酸、例えば位置１２と１６または１６と２０または２０と２４の２個のアミノ酸の側鎖同士の間の共有結合によりもたらされる。

【0099】

ＧＬＰ−１効力の更なる中程度の増加は、位置１０のアミノ酸を修飾してＴｒｐにすることによってもたらされる。

【0100】

グルカゴン受容体活性を増加または減少し、且つＧＬＰ−１受容体活性を増加するような、上記に記載された修飾のいずれかを、個別に適用することも組み合わせて適用することもできる。上記に記載された修飾のいずれかを、溶解性および／または安定性ならびに／または作用持続時間の増加のような他の所望の特性を付与するような、他の修飾と組み合わせることもできる。あるいは、上記に記載された修飾のいずれかを、溶解性または安定性または活性に実質的に影響を与えない他の修飾と組み合わせることができる。例示的な修飾には以下が含まれるが、これらに限定されない：
（Ａ）例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくはＣ末端から位置２７までへの１、２、３個またはそれ以上の荷電アミノ酸の導入により、溶解性を改善すること。そのような荷電アミノ酸は、例えば位置２８または２９の天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換する、あるいは位置２７、２８または２９の後に荷電アミノ酸を付加することによって導入することができる。例示的な実施態様において、１、２、３個または全ての荷電アミノ酸は、負に帯電している。他の実施態様において、１、２、３個または全ての荷電アミノ酸は、正に帯電している。そのような修飾は溶解性を増加し、例えば、２５℃で２４時間後に測定したとき、約５．５〜８の所定のｐＨ、例えばｐＨ７で天然グルカゴンに対して少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍またはそれ以上の溶解性をもたらす。
（Ｂ）例えばペプチドの位置１６、１７、２０、２１、２４若しくは２９またはＣ末端アミノ酸への、本明細書に記載されているポリエチレングルコール鎖のような親水性部分の付加により、溶解性および作用持続時間または循環半減期を増加すること。
（Ｃ）位置１５のアスパラギン酸の修飾により、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸による欠失または置換により、＿を増加すること。そのような修飾は、５．５〜８の範囲内のｐＨにおいて分解または切断を低減することができ、例えば２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を保持することができる。
（Ｄ）位置２７のメチオニンの修飾により、例えばロイシンまたはノルロイシンでの置換により、安定性を増加すること。そのような修飾は酸化分解を低減することができる。安定性は、位置２０または２４のＧｌｎの修飾により、例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡＩＢでの置換により増強することもできる。そのような修飾は、Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減することができる。安定性は、位置２１のＡｓｐの修飾により、例えばＧｌｕでの置換により増強することができる。そのような修飾は、Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することによって生じる分解を低減することができる。
（Ｅ）本明細書に記載されている位置１または２のアミノ酸の修飾により、ジペプチジルペプチターゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対して耐性を増加すること。
（Ｆ）活性に影響を与えない保存的若しくは非保存的な置換、付加または欠失、例えば、位置２、５、７、１０、１1、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８若しくは２９の一つ以上での保存的置換；位置２７、２８若しくは２９の一つ以上での欠失；または、アミノ酸２９の欠失、これは更に、Ｃ末端カルボン酸基のＣ末端アミド若しくはエステルによる置換と組み合わせてもよい。
（Ｇ）本明細書に記載されているＣ末端延長部を付加すること。
（Ｈ）本明細書に記載されているグルカゴンペプチドの例えばアシル化またはアルキル化により、循環半減期を増加するおよび／または作用持続時間を延長するおよび／または作用開始を遅延すること。
（Ｉ）本明細書に記載されているホモ二量体化またはヘテロ二量体化。

【0101】

例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴン配列と比べて、合計１個、２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、または１０個までのアミノ酸修飾を含むことができる。

【0102】

他の修飾には、大型で芳香族のアミノ酸（例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐまたはアミノ−Ｐｈｅ）による位置１のＨｉｓの置換；
Ａｌａによる位置２のＳｅｒ；
ＶａｌまたはＰｈｅによる位置１０のＴｙｒの置換；
Ａｒｇによる位置１２のＬｙｓの置換；
Ｇｌｕによる位置１５のＡｓｐの置換；
ＴｈｒまたはＡＩＢによる位置１６のＳｅｒの置換
が含まれる。

【0103】

一つの実施態様において、本明細書の開示は、グルカゴン受容体に対するプチドの効力を増強するために、野生型ペプチドのＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）と比べて修飾されているグルカゴンアゴニストを対象とする。驚くべきことに、出願者たちは、天然グルカゴン（配列番号１）の位置１６に通常存在するセリンを、選択された酸性アミノ酸で置換することで、検証済インビトロモデルアッセイ（実施例１４を参照）におけるｃＡＭＰ合成を刺激する能力に関して、グルカゴンの効力を増強できることを発見した。さらに具体的には、この置換は、この類縁体のグルカゴン受容体に対する効力を、少なくとも２倍、４倍、５倍および１０倍を超えるまで増強する。この置換は、また、天然グルカゴンと比べて、類縁体のＧＬＰ−１受容体に対する活性を少なくとも５倍、１０倍または１５倍増強するが、選択性は、ＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体に対して維持されている。

【0104】

一つの実施態様によると、天然グルカゴンの位置１６のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニンまたはグリシンから成る群から選ばれるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様によると、天然グルカゴンの位置１６のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸から成るから選ばれるアミノ酸で置換されており、一つの実施態様では、セリン残基はグルタミン酸で置換されている。一つの実施態様において、増強されたグルカゴン受容体への選択性を有するグルカゴンペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のペプチドまたはそのグルカゴンアゴニスト類縁体を含み、ここでカルボキシ末端アミノ酸は、天然カルボン酸基を保持する。一つの実施態様によると、ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（配列番号１０）を含むグルカゴンアゴニストが提供され、ここでペプチドは、実施例１４のインビトロｃＡＭＰアッセイにより測定すると、天然グルカゴンと比べておよそ５倍増強されたグルカゴン受容体に対する効力を示す。

【0105】

＜親水性部分＞
ＰＥＧ基のような親水性部分を、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に使用される任意の適切な条件下でグルカゴンペプチドに結合することができる。アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化、又はその他の、ＰＥＧ部分の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）と標的化合物の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）との化学選択的結合／連結方法を含む、当該技術において既知のあらゆる方法を使用することができる。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、５−ピリジル、及びアルファ−ハロゲン化アシル基（例えば、アルファ−ヨード酢酸、アルファ−ブロモ酢酸、アルファ−クロロ酢酸）が含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化によりペプチドに結合する場合、選択されるポリマーは、重合の程度が制御されるように、単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)及びZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照すること。

【0106】

本発明の特定の態様において、チオールを有するグルカゴンペプチドのアミノ酸残基は、ＰＥＧのような親水性部分で修飾されている。幾つかの実施態様において、チオールはマイケル付加反応においてマレイミド活性化ＰＥＧで修飾され、下記に示されるチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドをもたらす：

【化2】

【0107】

幾つかの実施態様において、チオールは核酸置換反応においてハロアセチル活性化ＰＥＧで修飾され、下記に示されるチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドをもたらす：

【化3】

【0108】

適切な親水性部分としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸又は他の多糖ポリマー、フィコール又はデキストラン、並びにこれらの混合物、が挙げられる。

【0109】

一つの実施態様によると、配列番号９または配列番号１０のペプチドの位置１７、２１および２４への親水性部分の導入は、生理学的ｐＨを有する溶液中での高効力グルカゴン類縁体の溶解性および安定性を改善すると予測される。そのような基の導入も、例えば延長された循環半減期として測定されるように、作用の持続時間を増加する。適切な親水性部分には、ＰＥＧのホモ−若しくはコポリマーおよびＰＥＧのモノメチル置換ポリマー（ｍＰＥＧ）またはポリオキシエチレングリセロール（ＰＯＧ）を含む、当該技術において既知の任意の水溶性ポリマーが含まれる。一つの実施態様によると、親水性基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。さらに具体的には、一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号６または配列番号７の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの位置２１および２４に存在するアミノ酸の側鎖に共有結合し、ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、カルボン酸基を有する。

【0110】

＜結合体＞
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが結合体部分に結合しているような他の結合体も包含し、この結合は、場合により共有結合を介してでもよく、場合によりリンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理的な力、又は疎水性若しくは親水性相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー、又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することができる。

【0111】

ペプチドを、ペプチドの標的アミノ酸残基と、これらの標的アミノ酸の選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤との反応により、直接共有結合を介して結合体部分に結合することができる。ペプチド又は結合体部分の反応性基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸又は当該技術に既知の他の作用物質が含まれる。あるいは、結合体部分を、多糖又はポリペプチド担体のような中間体担体を介してペプチドに間接的に結合することができる。多糖担体の例にはアミノデキストランが挙げられる。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、及び、これらのアミノ酸と、得られる装填担体に望ましい溶解性の特性を付与する他のもの、例えばセリン、との混合ポリマーが挙げられる。

【0112】

システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニルン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても、誘導体化される。

【0113】

ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５．５〜７．０で反応させることによって誘導体化されるが、それはこの作用物質がヒスチジル側鎖に比較的特異性があるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは０．１Mのカコジル酸ナトリウムによりｐＨ６．０で実施される。

【0114】

リシニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用物質による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬には、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル及びグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応、が含まれる。

【0115】

アルギニル残基は、１つ又は幾つかの従来の試薬、なかでもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンによる反応で修飾される。アルギニン残基の誘導体化の反応は、グアニジン官能基のpK_aが高いので、アルカリ条件下で実施される必要がある。更に、これらの試薬は、リシンの基、またアルギニン−イプシロン−アミノ基と反応することができる。

【0116】

チロシル残基の特定の修飾は、スペクトル標識をチロシル残基に導入するのに特に興味深く、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンによる反応によって行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体がそれぞれ形成される。

【0117】

カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、Ｒ及びＲ′が異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド、との反応により選択的に修飾される。更に、アスパルチル又はグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。

【0118】

他の修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、アスパラギン又はグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／又はＣ末端カルボン酸基のアミド化若しくはエステル化、が含まれる。

【0119】

別の種類の共有的修飾には、ペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合が含まれる。糖を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン若しくはヒドロキシプロリンのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）チロシン若しくはトリプトファンのような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。

【0120】

本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのいずれかに結合することができる例示的な結合体部分には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン若しくはその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤、が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン、及びグロブリンからなる群より選択される。一つの実施態様において、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミン又はトランスフェリンである。

【0121】

幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、原子鎖は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の原子鎖は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される。原子鎖及びリンカーは、より溶解度の高い結合体をもたらすために、予想される溶解性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素若しくは他の触媒による切断、又は標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体は全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、代替的には当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することもできる。

【0122】

上記に記述したように、幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、免疫グロブリン又はその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ又はＦｃ領域）に結合、例えば融合している。既知の種類の免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域はＩｇ重鎖のＣ末端領域であり、これは、再循環（延長された半減期をもたらす）、抗体依存性細胞仲介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）のような活性を実施するＦｃ受容体への結合に関与している。

【0123】

例えば、幾つかの定義によると、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からＣ末端まで伸びている。「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びている（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関わるシステインを整列することによりＩｇＧ１配列と整列させることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域には２つの定常部ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３、が含まれる。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸びている。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、アミノ酸３４２から酸４４７まで伸びている。免疫グロブリン又は免疫グロブリンのフラグメント若しくは領域のアミノ酸番号付けに関する参照は、全て、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.に基づいている。関連する実施態様において、Ｆｃ領域は、１つ以上の、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖の天然の又は修飾された定常部領域、例えばＩｇＧ及びＩｇＡのＣＨ２及びＣＨ３領域又はＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４領域、を含むことができる。

【0124】

適切な結合体部分としては、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部が挙げられる。サルベージ受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンを再循環して、血液循環に戻すことに関与する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づいて記載されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃＲｎへのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの接合部に近接している。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触点は、全て単一Ｉｇ重鎖の範囲内である。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、及び３１４、並びにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、及び４３３〜４３６が含まれる。

【0125】

幾つかの結合体部分は、ＦｃγＲ結合部位を含んでもよいし含まなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに関与する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（低ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ′／Ｅループ）及びアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥの低ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関わっている（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関わる残基は、Lewisらにより記載されている（J Immunol. 175:6694-701, 2005）。ＩｇＥ受容体結合に関わるアミノ酸残基は、Sayers らにより記載されている（J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004）。

【0126】

アミノ酸修飾を免疫グロブリンのＦｃ領域において行うことができる。そのようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）に少なくとも１つのアミノ酸修飾、及び／又はＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１〜３４１）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ＦｃＲｎに親和性の増加を付与すると考えられる突然変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａが含まれる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の突然変異は、ＦｃＲｎの親和性を有意に低減することなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ領域の結合を低減することができる。例えば、Ａｌａ又は他のアミノ酸によるＦｃ領域の位置２９７のＡｓｎの置換は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去し、Ｆｃ領域の延長された半減期を伴って免疫原性の低減、また、ＦｃγＲへの結合の低減をもたらすことができる（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲへの結合を低減する、ＩｇＧ１の位置２３３〜２３６でのアミノ酸の修飾が行われた（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。幾つかの例示的なアミノ酸置換は、米国特許第７，３５５，００８号及び同第７，３８１，４０８号に記載されており、それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる。

【0127】

本開示はさらに、第２のペプチドまたはポリペプチドが、グルカゴンペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合されている、グルカゴン融合ペプチドまたはタンパクを包含する。さらに具体的には、この融合グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に連結した、配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸をさらに含む、配列番号５５、配列番号９、または配列番号１０のグルカゴンアゴニストを含んでもよい。一実施態様では、配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介して、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合される。出願者たちは、エキセンディン−４のＣ末端延長ペプチド（例えば、配列番号２６または配列番号２９）を含むグルカゴン融合ペプチドにおいて、グリシンによる位置２９の天然トレオニン残基の置換が、ＧＬＰ−１受容体活性を顕著に増加することを発見した。アミノ酸置換を、本明細書に開示されている他の修飾と一緒に使用して、ＧＬＰ−１受容体へのグルカゴン類縁体の親和性を増強することができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換を、Ｓ１６ＥおよびＮ２０Ｋアミノ酸置換と、場合によりアミノ酸１６と２０の間のラクタム架橋と、場合により本明細書に記載されているＰＥＧ鎖の付加と、組み合わせることができる。一つの実施態様において、配列番号６４の配列を含む、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号５５、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から成る群より選択され、ここでＰＥＧ鎖は、位置１７、２１、位置２４若しくはＣ末端アミノ酸または位置２１および２４の両方に存在する場合、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。さらに具体的には、一つの実施態様において、グルカゴンペプチドセグメントは、配列番号７、配列番号８および配列番号６３から成る群より選択され、ここでＰＥＧ鎖は、５００〜５，０００範囲から選択される。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号５５および配列番号６５の配列を含む融合ペプチドであり、ここで配列番号６５のペプチドは、配列番号５５のカルボキシ末端に結合している。

【0128】

＜電荷中性Ｃ末端＞
一つの実施態様によると、配列番号１０のグルカゴンペプチドの更なる化学修飾は、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体に対する相対的活性が実質的に同等となる点まで、ＧＬＰ−１受容体効力を増加させる。したがって、一つの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチドの末端アミノ酸が、天然アミノ酸に存在するカルボン酸の代わりにアミドを有する、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体のそれぞれに対するグルカゴン類縁体の相対的活性は、グルカゴンペプチドを更に修飾して、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約４０％〜約５００％またはそれ以上の活性、およびＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約２０〜約２００％またはそれ以上、例えばＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンの通常の活性に対して５０倍、１００倍またはそれ以上の活性を示す類縁体を産生することによって、調整することができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％までの活性を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％までの活性を示す。

【0129】

＜アルファ−へリックスの安定化／分子内架橋＞
更なる実施態様において、分子内架橋が２つのアミノ酸側鎖の間に形成されて、ペプチドのカルボキシ末端部分の三次元構造を安定化している、グルカゴン類縁体が提供される。２つのアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば水素結合や、塩架橋の形成のようなイオン相互作用を介して、又は共有結合により、互いに結合することができる。２つのアミノ酸側鎖が１つ以上の共有結合を介して互いに結合している場合、本明細書において、ペプチドは共有分子内架橋を含んでいると考慮することができる。２つのアミノ酸側鎖が非共有結合、例えば水素結合やイオン相互作用を介して互いに結合している場合、本明細書において、ペプチドは非共有分子内架橋を含んでいると考慮することができる。

【0130】

幾つかの実施態様において、分子内架橋は、３個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｉとｉ＋４の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｉは、１２〜２５の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５）である。より詳細には、アミノ酸対の１２と１６、１６と２０、２０と２４、又は、２４と２８（ｉ＝１２、１６、２０、又は２４であるようなアミノ酸対）の側鎖は、互いに結合しており、したがってグルカゴンアルファ−へリックスを安定化する。代替的には、ｉは１７であることができる。

【0131】

幾つかの特定の実施態様において、ｉとｉ＋４の位置のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約８個の原子又は約７〜９個の原子である。

【0132】

他の実施態様において、分子内架橋は、２個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｊとｊ＋３の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｊは、１２〜２６の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６）である。幾つかの特定の実施態様において、ｊは１７である。

【0133】

幾つかの特定の実施態様において、位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約６個の原子又は約５〜７個の原子である。

【0134】

さらに他の実施態様において、分子内架橋は、６個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｋとｋ＋７の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｋは、１２〜２２の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２）である。幾つかの特定の実施態様において、ｋは、１２、１３又は１７である。例示的な実施態様において、ｋは１７である。

【0135】

共有結合して６原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、ＯｒｎとＡｓｐ、Ｇｌｕと式Ｉ（式中、ｎは２である）のアミノ酸、及び、ホモグルタミン酸と式Ｉ（式中、ｎは１である）のアミノ酸、が挙げられ、ここで、式Ｉは下記である：

【化4】

【0136】

共有結合して７原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム環）、Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、又は、ホモＳｅｒ−ホモＧｌｕ（ラクトン）、が挙げられる。８原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、ホモＬｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、Ｏｒｎ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ａｓｐ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）、が挙げられる。９原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、ホモＬｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ｇｌｕ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）、が挙げられる。これらのアミノ酸の側鎖のいずれも、アルファ−へリックスの三次元構造が妨げられない限り、追加的な化学基で更に置換することができる。当業者であれば、同様の大きさ及び所望の効果の構造の安定化を作り出すような、代替的な対形成又は化学的に修飾された誘導体を含む代替的なアミノ酸類縁体を着想することができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は、長さが６個の原子であり、更に修飾して所望の効果をもたらすことができる。共有結合がなくても、上記に記載されたアミノ酸対形成又は当業者が想像できる同様の対形成も、非共有結合を介して、例えば塩架橋の形成又は水素結合相互作用を介して、アルファ−へリックスに追加的な安定性をもたらすことができる。

【0137】

更なる例示的な実施態様は、以下の対形成を含み、更にラクタム架橋を含んでもよい：位置１２のＧｌｕと位置１６のＬｙｓ；位置１２の天然Ｌｙｓと位置１６のＧｌｕ；位置１６のＧｌｕと位置２０のＬｙｓ；位置１６のＬｙｓと位置２０のＧｌｕ；位置２０のＧｌｕと位置２４のＬｙｓ；位置２０のＬｙｓと位置２４のＧｌｕ；位置２４のＧｌｕと位置２８のＬｙｓ；位置２４のＬｙｓと位置２８のＧｌｕ。

【0138】

一つの実施態様によると、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニスト活性を示すグルカゴン類縁体が提供され、ここで類縁体は、配列番号１１、４７、４８および４９から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む。一つの実施態様において、側鎖は互いに共有結合しており、一つの実施態様において、２個のアミノ酸は互いに結合してラクタム環を形成する。ラクタム環の大きさは、アミノ酸の側鎖の長さに応じて変わることができ、一つの実施態様において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸の側鎖に結合することによって形成される。

【0139】

ラクタム環におけるアミド結合の順番を逆転することができる（例えば、ラクタム環を、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６の側鎖同士、あるいはＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖同士の間に形成することができる）。一つの実施態様によると、少なくとも一つのラクタム環が、アミノ酸対１２と１６、１６と２０、２０と２４および２４と２８から成る群から選ばれるアミノ酸対の側鎖同士の間に形成される、配列番号４５のグルカゴン類縁体が提供される。一つの実施態様において、コアゴニストが配列番号２０のグルカゴンペプチド類縁体を含み、ペプチドが位置１２と１６のアミノ酸の間または位置１６と２０のアミノ酸の間に形成された分子内ラクタム架橋を含む、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。一つの実施態様において、配列番号２０の配列を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで、分子内ラクタム架橋は、位置１２と１６のアミノ酸の間、位置１６と２０のアミノ酸の間または位置２０と２４のアミノ酸の間に形成され、位置２９のアミノ酸はグリシンであり、配列番号２９の配列は、配列番号２０のＣ末端アミノ酸と結合している。更なる実施態様において、位置２８のアミノ酸はアスパラギン酸である。

【0140】

ラクタム架橋以外の分子内架橋を使用して、グルカゴン類縁体ペプチドのアルファ−へリックスを安定化することができる。一つの実施態様において、分子内架橋は疎水性架橋である。この場合、分子内架橋は、グルカゴン類縁体ペプチドのアルファ−へリックスの疎水性面の部分である２個のアミノ酸の側鎖の間にあってもよい。例えば、疎水性架橋により結合しているアミノ酸のうちの１個は、位置１０、１４、及び１８のアミノ酸であることができる。

【0141】

一つの特定の態様において、全炭化水素架橋系を使用してグルカゴンペプチドのアルファ−へリックスの１又は２巻きを架橋するために、オレフィンメタセシスが用いられる。この場合、グルカゴンペプチドは、多様な長さのオレフィン性側鎖を有し、Ｒ又はＳ立体化学のいずれかに配置されているα−メチル化アミノ酸を、ｉの位置とｉ＋４又はｉ＋７の位置とに含むことができる。例えば、オレフィン性側鎖は（ＣＨ_２）ｎを含むことができ、ここでｎは、１〜６の任意の整数である。一つの実施態様において、架橋長さが８個の原子では、ｎは３である。そのような分子内架橋を形成する適切な方法は、当該技術において記載されている。例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000)及びWalensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004)を参照すること。あるいは、グルカゴンペプチドは、ヘリックスの隣接する２巻きに配置されている２つのＯ−アリルＳｅｒ残基を含むことができ、これらはルテニウム触媒閉環メタセシスを介して互いに架橋されている。そのような架橋の手順は、例えばBlackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998)に記載されている。

【0142】

別の特定の態様において、システインのペプチド模倣体として広く採用されている、非天然チオ−ジアラニンアミノ酸であるランチオニンを、アルファ−へリックスの１巻きを架橋するために使用する。ランチオニンに基づく環化の適切な方法は、当該技術において知られている。例えば、Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., Ｊ. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996);及びOsapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993)を参照すること。

【0143】

幾つかの実施態様において、位置ｉとｉ＋７の２つのＧｌｕ残基の間のα，ω−ジアミノアルカン鎖（例えば１，４−ジアミノプロパンや１，５−ジアミノペンタン）を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。そのような鎖は、ジアミノアルカン鎖の長さに応じて、９原子又はそれ以上の長さの架橋の形成をもたらす。そのような鎖で架橋されたペプチドを産生する適切な方法は、当該技術において記載されている。例えば、Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997)を参照すること。

【0144】

本発明の更に別の実施態様において、ジスルフィド架橋を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスの１又は２巻きを架橋する。あるいは、一方又は両方の硫黄原子がメチレン基に代えられて等配電子マクロ環化をもたらしている修飾ジスルフィド結合を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。ジスルフィド架橋又は硫黄に基づく環化により修飾する適切な方法は、例えば、Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991)及びRudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)に記載されている。

【0145】

更に別の実施態様において、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、ｉとｉ＋４に位置する２つのＨｉｓ残基又はＨｉｓとＣｙｓの対による、金属原子の結合を介して安定化される。金属原子は、例えば、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、又はＣｄ（ＩＩ）であることができる。そのような金属結合に基づいたアルファ−へリックス安定化の方法は、当該技術において知られている。例えば、Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., Ｊ. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990);及びGhadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997)を参照すること。

【0146】

グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、代替的には他のペプチド環化の方法により安定化することもでき、その方法は、Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)により検討されている。アルファ−へリックスは、アミド架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、尿素架橋、カルバメート架橋、スルホンアミド架橋などの形成を介して、安定化することができる。例えば、チオエステル架橋を、Ｃ末端とＣｙｓ残基の側鎖との間に形成することができる。あるいは、チオエステルを、チオールを有するアミノ酸（Ｃｙｓ）及びカルボン酸を有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の側鎖を介して形成することができる。別の方法において、ジカルボン酸、例えばスベリン酸（オクタン二酸）などのような架橋剤は、遊離アミン、ヒドロキシル、チオール基、及びこれらの組み合わせのような、アミノ酸側鎖の２つの官能基の間に結合を導入することができる。

【0147】

一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、ｉとｉ＋４の位置への疎水性アミノ酸の組み込みを介して安定化される。例えば、ｉはＴｙｒであることができ、そしてｉ＋４はＶａｌ又はＬｅｕであることができる；ｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＣｙｓ又はＭｅｔであることができる；ｉはＣｙｓであることができ、そしてｉ＋４はＭｅｔであることができる；或いはｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＩｌｅであることができる。本明細書の目的のために、上記のアミノ酸対形成を逆転することができ、これにより位置ｉの示されたアミノ酸を代替的にｉ＋４の位置に配置することができ、一方、位置ｉ＋４のアミノ酸をｉに配置することができることが理解されるべきである。

【0148】

本発明の更に別の実施態様によると、増強されたＧＬＰ−１活性を有するグルカゴンペプチドは、（ａ）アミノ酸位置１２〜２９内にα，α−二置換アミノ酸による１個以上の置換、を有し、更に（ｂ）Ｃ末端アミド、を含んでもよい。幾つかの態様において、そのようなグルカゴンペプチドは、特に、グルカゴンのＣ末端部分（位置１２〜２９周辺）のアルファ−へリックスを安定化する分子内架橋、例えば共有分子内架橋を欠いていることが理解されるべきである。幾つかの実施態様において、グルカゴンの位置１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４または２９のうちの１、２、３、４つまたはそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸、例えばアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）により、メチル、エチル、プロピルおよびｎ−ブチルから選択される同一若しくは異なる基で二置換されたアミノ酸により、またはシクロオクタン若しくはシクロヘプタン（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）により、置換されている。例えば、分子内架橋、例えば非共有分子内架橋（例えば、塩架橋）または共有分子内架橋（例えば、ラクタム）の不在下でＡＩＢによる位置位置１６の置換は、ＧＬＰ−１活性を増強する。幾つかの実施態様において、位置１６、２０、２１または２４のうちの１、２、３つまたはそれ以上は、ＡＩＢで置換されている。そのようなグルカゴンペプチドは、以下のものを含むが但しこれらに限定されない、本明細書に記載されている他の修飾の１個以上を更に含むことができる：アシル化、アルキル化、ペグ化、Ｃ末端部の１〜２個のアミノ酸の欠失、Ｃ末端部での荷電アミノ酸による付加および／または置換、Ｃ末端カルボキシレートのアミドへの交換、Ｃ末端延長部の付加、ならびに、以下のような、保存的および／または非保存的アミノ酸置換：ＬｅｕまたはＮｌｅによる位置２７のＭｅｔの置換、Ｇｌｕ（または同様のアミノ酸）による位置１５のＡｓｐの置換、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成するアミノ酸による位置１および／または２での置換、Ａｌａによる位置２のＳｅｒの置換、ＶａｌまたはＰｈｅによる位置１０のＴｙｒの置換、Ａｒｇによる位置１２のＬｙｓの置換、ＴｈｒまたはＡＩＢによる位置１６のＳｅｒの置換、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡＩＢによる位置２０および／または２４のＧｌｎの置換、ＧｌｕまたはＴｈｒによる位置１６のＳｅｒの置換、Ａｌａによる位置１８のＡｒｇの置換、Ｌｙｓによる位置２０のＧｌｎの置換、Ｇｌｕによる位置２１のＡｓｐの置換、およびＡｓｎまたはＣｙｓによる位置２４のＧｌｎの置換。幾つかの実施態様において、前記のグルカゴンペプチドは、位置２９にＧｌｎ若しくはＧｌｙを含むか、またはＣ末端延長部の付加、例えば位置２８のアミノ酸へのＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２６）Ｃ末端の付加を含む。特定の態様において、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端カルボキシレートの代わりに一つ以上のアミド基、アシル基、例えばＣ１６脂肪酸、および親水性部分、例えばポリエチレングルコール（ＰＥＧ）を含む。

【0149】

また、別の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１に対して１０個以下の修飾を含み、位置１６、２０、２１および／または２４にＡＩＢによる１個以上のアミノ置換を含む、配列番号１〜２５、３０〜６４および６６〜５５５のいずれかのアミノ酸配列を含み、ここでペプチドは、ペプチドの２個のアミノ酸の側鎖同士の間の分子内架橋、例えば共有分子内架橋を欠いている。したがって、より特定の態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号５５６〜５６１のいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0150】

幾つかの実施態様によると、分子内架橋を欠いているグルカゴンペプチドは、アミノ酸位置１２〜２９の範囲において、α，α−二置換アミノ酸による１つ以上の置換と、グルカゴンペプチドのアミノ酸、例えばグルカゴンペプチドの位置１０のアミノ酸、の側鎖に共有結合しているアシル又はアルキル基とを含む。特定の実施態様において、アシル又はアルキル基は、天然型のアミノ酸に対して非天然型である。特定の態様において、アシル又はアルキル基は、位置１０のアミノ酸に対して非天然型である。分子内架橋を欠いているそのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、対応する非アシル化ペプチドの活性と比較して、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対して増強された活性を示す。ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性の更なる増強は、分子内架橋を欠いているアシル化グルカゴンペプチドにおいて、スペーサーをアシル又はアルキル基とペプチドの位置１０のアミノ酸の側鎖との間に組み込むことによって達成することができる。アシル化及びアルキル化は、スペーサーの組み込みを伴う場合も伴わない場合も、本明細書において更に記載されている。

【0151】

＜位置１での修飾＞
一つの実施態様によると、増強されたＧＬＰ−１活性を有するグルカゴンペプチドは、（ａ）大型の芳香族アミノ酸による位置１のＨｉｓのアミノ酸置換および（ｂ）分子のＣ末端部分（例えば、位置１２〜２９周辺）のアルファ−へリックスを安定化する分子内架橋を含む。特定の実施態様において、位置１のアミノ酸は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒまたは３−アミノＴｙｒである。特定の態様において、分子内架橋は、３個の介在アミノ酸により隔てられている２個のアミノ酸の側鎖同士の間、すなわち、アミノ酸ｉとｉ＋４の側鎖同士の間にある。幾つかの実施態様において、分子内架橋はラクタム架橋である。本発明のより特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、ペプチドの位置１に大型の芳香族アミノ酸、および位置１６と２０のアミノ酸の間にラクタム架橋を含む。そのようなグルカゴンペプチドは、１個以上（例えば、２、３、４、５個またはそれ以上）の本明細書に記載されている他の修飾を更に含むことができる。例えば、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにアミドを含むことができる。したがって、一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号５５５のアミノ酸配列を含む。

【0152】

＜アシル化＞
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、アシル基、例えば天然型のアミノ酸に対して非天然であるアシル基を含む。アシル基は、ペプチドが、（ｉ）循環半減期の延長、（ｉｉ）作用開始の遅延、（ｉｉｉ）作用の持続時間の延長、（ｉｖ）ＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性の改善、ならびに（ｖ）ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対する効力の増加、のうちの一つ以上を有する原因となる。本明細書に示されているように、アシル化グルカゴンペプチドは、対応する非アシル化グルカゴンペプチドと比較して、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対する減少した活性を示さない。むしろ、幾つかの場合では、アシル化は、実際にはＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性を増加する。したがって、アシル化されたグルカゴンコアゴニスト類縁体の効力は、非アシル化型の類縁体と比べて、たとえ増強されていないとしても、少なくともそれに匹敵する。

【0153】

一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、体循環中での半減期を延長する、並びに／又は作用の開始を遅延する及び／若しくは持続時間を延長する、並びに／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する目的で、エステル、チオエーテル又はアミド結合を介してグルカゴンペプチドに結合しているアシル基を含むように、修飾される。

【0154】

アシル化は、グルカゴン及び／又はＧＬＰ−１活性が増強されないまでも少なくとも保持される限り、位置１〜２９のいずれか、Ｃ末端延長部内の位置、又はＣ末端アミノ酸を含む、グルカゴンペプチド内の任意の位置で、実施することができる。非限定例には、位置５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９が挙げられる。特定の実施態様において、アシル化は、グルカゴンペプチドの位置１０で生じ、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば共有分子内架橋（例えば、ラクタム架橋）を欠いている。分子内架橋を欠いているそのようなアシル化ペプチドは、共有分子内架橋を欠いている対応する非アシル化ペプチドと比較して及び位置１０以外の位置でアシル化されている分子内架橋を欠いている対応するペプチドと比較して増強された、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性を示す。本明細書において示されているように、位置１０のアシル化は、グルカゴン受容体に対してほとんど活性を有さないグルカゴン類縁体を、グルカゴンとＧＬＰ−１の両方の受容体に対して活性を有するグルカゴンに変換することさえできる。したがって、アシル化が生じる位置は、グルカゴン類縁体の全体的な活性プロフィールを変えることができる。

【0155】

グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアシル化することができる。非限定例には、位置１０でのアシル化、及びグルカゴンペプチドのＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば位置２４、２８若しくは２９、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。

【0156】

アシル基を、グルカゴンペプチドのアミノ基に直接的に共有結合させることもできるし、グルカゴンペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合させることもでき、この場合スペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ基とアシル基との間に位置している。

【0157】

本発明の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル、又はチオールの直接的なアシル化により、アシル基を含むように修飾される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して直接アシル化される。幾つかの実施態様において、アシル化は位置１０、２０、２４、又は２９においてである。この点において、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、位置１０、２０、２４、及び２９のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドの直接アシル化は、位置１０のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して生じる。

【0158】

幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉ：

【化5】

で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４であるアミノ酸（Ｌｙｓ）又はｎが３であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。

【0159】

他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩ：

【化6】

で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｓｅｒ）である。

【0160】

さらに他の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩ：

【化7】

で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｃｙｓ）である。

【0161】

さらに他の実施態様において、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合している水素が第２側鎖に代えられていること以外は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩと同じ構造を含む、二置換アミノ酸である。

【0162】

本発明の一つの実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アシル基と共有結合しているスペーサーと共有結合する。

【0163】

スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能とする部分を含むような任意のアミノ酸（例えば、一置換型のα−置換アミノ酸、又はα，α−二置換アミノ酸）であることができる。例えば、側鎖ＮＨ_２、−ＯＨ、又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この点に関して、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、位置１０、２０、２４、及び２９のアミノ酸の少なくとも１個が側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となるように修飾された、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含んでもい。

【0164】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸であるか、又は、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸を含む、ジペプチド若しくはトリペプチドである。

【0165】

アシル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アシル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアシル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、であることができる。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕ、であることができる。

【0166】

スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアシル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーのアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアシル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアシル化される。本発明の実施態様はそのようなジアシル化分子を含む。

【0167】

アシル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。

【0168】

アシル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。

【0169】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点において、スペーサーは、例えばＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨを含むことができ（式中、ｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である）、例えば、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸であってもよい。

【0170】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、疎水性二官能スペーサーである。疎水性二官能スペーサーは当該技術において知られている。例えば、Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）を参照すること。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。カルボキシレートとヒドロキシル基又はチオール基を含む適切な疎水性二官能スペーサーは、当該技術において知られており、例えば８−ヒドロキシオクタン酸及び８−メルカプトオクタン酸が含まれる。

【0171】

幾つかの実施態様において、二官能スペーサーは、カルボキシレート基の間に１〜７個の炭素を持つ非分岐鎖メチレンを含むジカルボンサンではない。幾つかの実施態様において、二官能スペーサーは、カルボキシレート基の間に１〜７個の炭素を持つ非分岐鎖メチレンを含むジカルボンサンである。

【0172】

スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性又は疎水性二官能スペーサー）は、特定の実施態様において、３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子（例えば、６、７、８、９又は１０個の原子））の長さを有する。より特定の実施態様において、スペーサーは、約３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）の長さであり、アシル基はＣ１２〜Ｃ１８脂肪アシル基、例えばＣ１４脂肪アシル基、Ｃ１６脂肪アシル基、であり、これによりスペーサーとアシル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８個の原子の長さとなる。幾つかの実施態様において、スペーサーとアシル基の長さは、１７〜２８個（例えば、１９〜２６個、１９〜２１個）の原子の長さである。

【0173】

特定の前述の実施態様によると、二官能スペーサーは、長さが３〜１０個の原子のアミノ酸主鎖（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び８−アミノオクタン酸）を含む、合成又は天然型のアミノ酸（本明細書に記載されているいずれもが含まれるが、これらに限定されない）であることができる。あるいは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）のペプチド主鎖を有する、ジペプチド又はトリペプチドスペーサーであることができる。ジペプチド又はトリペプチドスペーサーのそれぞれのアミノ酸は、ジペプチド又はトリペプチドの他のアミノ酸と同一でもよいし異なっていてもよく、以下からなる群より独立して選択することができる：天然型のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のＤ若しくはＬ異性体のいずれか、又は、以下からなる群より選択される非天然型のアミノ酸のＤ若しくはＬ異性体のいずれかを含む、天然型の及び／又は非天然型のアミノ酸：β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−tert−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコ酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リシン、ジメチル−ロイシン、トリメチル−リシン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ_２））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン、（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ_２））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｏ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４，−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｏ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ビス−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、チロシンスルフェートテトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、及びアルキル化３−メルカプトプロピオン酸。

【0174】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、全体として負の電荷を含み、例えば１又は２個の負荷電アミノ酸を含む。幾つかの実施態様において、ジペプチドは、一般構造Ａ−Ｂのジペプチドのいずれでもなく、ここで、Ａは、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＰｒｏからなる群より選択され、Ｂは、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐからなる群より選択される。幾つかの実施態様において、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、及びγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群より選択される。

【0175】

幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル、又はチオールのアシル化により、アシル基を含むように修飾され、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドの位置１０、２０、２４、若しくは２９のアミノ酸又はＣ末端アミノ酸の側鎖に結合している。

【0176】

さらに特定の実施態様において、アシル基は、グルカゴンペプチドの位置１０のアミノ酸に結合しており、スペーサーとアシル基の長さは、１４〜２８個の原子である。位置１０のアミノ酸は、幾つかの態様において、式Ｉのアミノ酸、例えばＬｙｓであるか、又は式Ｉに関連する、二置換アミノ酸である。より特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば共有分子内架橋、を欠いている。グルカゴンペプチドは、例えば、ペプチドのアルファ−へリックスの安定化のために、１個以上のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢ、を含むペプチドであることができる。従って、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号５５５〜５６１および６１０〜６１２の配列、並びに表２０および２８に記載のＡＩＢ含有ペプチドのいずれかを含むことができる。本明細書に示されているように、位置１０のアミノ酸の側鎖に共有結合しているアシル化スペーサーを含むそのようなペプチドは、ＧＬＰ−１とグルカゴンの両方の受容体に対して増強した効力を示す。

【0177】

アミン、ヒドロキシル、及びチオールを介したペプチドアシル化に適した方法は、当該技術において知られている。例えば、実施例１９（アミンを介したアシル化の方法）、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, lnt J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982);及びPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介したアシル化の方法）;並びにSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介したアシル化の方法）; Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照すること。

【0178】

アシル化グルカゴンペプチドのアシル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸、又はＣ３０脂肪酸のいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ１４脂肪酸又はＣ１６脂肪酸、である。

【0179】

代替的な実施態様において、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な胆汁酸であることができる。

【0180】

本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、長鎖アルカンをアシル化することによって、アシル基を含むよう修飾される。特定の実施態様において、長鎖アルカンは、グルカゴンペプチドのカルボキシル基又はその活性化形態と反応するような、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール及びヘキサデカンチオール）を含む。グルカゴンペプチドのカルボキシル基又はその活性化形態は、グルカゴンペプチドのアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド主鎖の一部であってもよい。

【0181】

特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、それに結合しているスペーサーで長鎖アルカンをアシル化することによって、アシル基を含むように修飾される。特定の実施態様において、長鎖アルカンは、スペーサーのカルボキシル基又はその活性化形態と反応するような、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む。カルボキシル基又はその活性化形態を含む適切なスペーサーは、本明細書に記載されており、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー、又は疎水性二官能スペーサーが含まれる。

【0182】

本明細書で使用されるとき、用語「カルボキシル基の活性化形態」は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘのカルボキシル基を意味し、ここで、Ｘは離脱基であり、そしてＲはグルカゴンペプチド又はスペーサーである。例えば、カルボキシル基の活性化形態には、塩化アシル、アシル無水物、及びアシルエステルが含まれうるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、活性化カルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）離脱基のエステルである。

【0183】

長鎖アルカンがグルカゴン又はスペーサーでアシル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは、任意の大きさであることができ、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。特定の態様において、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン、又はＣ３０アルカンのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、又はＣ１８アルカン、を含む。

【0184】

また、幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのアミン、ヒドロキシル、又はチオール基は、コレステロール酸によりアシル化されている。特定の実施態様において、グルカゴンペプチドはアルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサー、例えばアルキル化３−メルカプトプロピオン酸スペーサー、を介してコレステロール酸に結合している。アルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサーは、例えばドデカエチレングリコール部分を含むアルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサーであることができる。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは下記の構造を含む：

【化8】

【0185】

本明細書に記載されているアシル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含むように更に修飾されることができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この点において、アシル化グルカゴンペプチドは、本明細書に記載されている修飾のいずれかを含む配列番号１を含むことができ、ここで、位置１０、２０、２４、及び２９の少なくとも１個のアミノ酸はアシル基を含み、位置１６、１７、２１、２４、若しくは２９の少なくとも１個のアミノ酸、Ｃ末端延長部内の位置、又はＣ末端のアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アシル基は、位置１０に結合しており（この結合は場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してであってもよい）、親水性部分は、位置２４のＣｙｓ残基に組み込まれている。

【0186】

あるいは、アシル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アシル化され、且つ、親水性部分を含むように修飾される。適切なスペーサーの非限定例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。

【0187】

本発明の特定の態様において、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号５３４〜５４４及び５４６〜５４９のいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0188】

＜アルキル化＞
幾つかの実施態様によると、グルカゴンペプチドは修飾されて、アルキル基、例えばアミノ酸において天然に生じてはいないアルキル基（例えば、天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアルキル基）を含む。任意の特定の理論にとらわれることなく、グルカゴンペプチドのアルキル化は、グルカゴンペプチドのアシル化と比べて、もしも同一でないとしても少なくとも同様の効果、例えば、循環半減期の延長、作用開始の遅延、作用の持続時間の延長、ＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性の改善、並びにＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する効力の増加、を達成すると考えられる。

【0189】

アルキル化は、グルカゴン活性が保持される限り、位置１〜２９のいずれか若しくはＣ末端延長部内の位置又はＣ末端アミノ酸を含む、グルカゴンペプチド内の任意の位置で実施することができる。非限定例としては、位置５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９が挙げられる。アルキル基を、グルカゴンペプチドのアミノ基に直接的に共有結合することもできるし、グルカゴンペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することもでき、この場合スペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ基とアルキル基との間に位置している。グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合している位置と同じアミノ酸の位置でも、異なるアミノ酸の位置でも、アルキル化することができる。非限定例としては、位置１０でのアルキル化及びグルカゴンペプチドのＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば位置２４、２８若しくは２９、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。

【0190】

本発明の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル、又はチオールの直接的なアルキル化により、アルキル基を含むように修飾される。幾つかの実施態様において、アルキル化は位置１０、２０、２４又は２９においてである。この点において、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、位置１０、２０、２４、及び２９のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドの直接アルキル化は、位置１０のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して生じる。

【0191】

幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４であるアミノ酸（Ｌｙｓ）か又はｎが３であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。

【0192】

他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｓｅｒ）である。

【0193】

さらに他の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｃｙｓ）である。

【0194】

さらに他の実施態様において、側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合している水素が第２側鎖に代えられていること以外は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩと同じ構造を含む、二置換アミノ酸である。

【0195】

本発明の一つの実施態様において、アルキル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アルキル基と共有結合しているスペーサーと共有結合する。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアルキル化により修飾されてアルキル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドの位置１０、２０、２４又は２９のアミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能とする部分を含むような任意のアミノ酸であることができる。例えば、側鎖ＮＨ_２、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕ）が適している。この点に関して、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、位置１０、２０、２４、及び２９のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよい。

【0196】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか、又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。

【0197】

アルキル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アルキル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアルキル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸であることができる。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、アルキル化が酸性残基のアルファアミンで生じる限り、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーのアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアルキル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアルキル化される。本発明の実施態様はそのようなジアルキル化分子を含む。

【0198】

アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。

【0199】

アルキル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。

【0200】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点において、スペーサーは、例えばＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨを含むことができ(式中、ｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である)、例えば、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸であってもよい。

【0201】

幾つかの実施態様において、スペーサーは、疎水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。カルボキシレートとヒドロキシル基又はチオール基を含む適切な疎水性二官能スペーサーは、当該技術において知られており、例えば８−ヒドロキシオクタン酸及び８−メルカプトオクタン酸が含まれる。

【0202】

スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性又は疎水性二官能スペーサー）は、特定の実施態様において、３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子（例えば、６、７、８、９、又は１０個の原子））の長さを有する。より特定の実施態様において、スペーサーは、約３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）の長さであり、アルキルはＣ１２〜Ｃ１８アルキル基、例えばＣ１４アルキル基、Ｃ１６アルキル基であり、これによりスペーサーとアルキル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば約４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個の原子の長さとなる。幾つかの実施態様において、スペーサーとアルキルの長さは、１７〜２８個（例えば、１９〜２６個、１９〜２１個）の原子である。

【0203】

特定の前述の実施態様によると、二官能スペーサーは、長さが３〜１０個の原子のアミノ酸主鎖（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸及び８−アミノオクタン酸）を含む合成又は非天然型のアミノ酸であることができる。あるいは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）のペプチド主鎖を有するジペプチド又はトリペプチドスペーサーであることができる。ジペプチド又はトリペプチドスペーサーは、例えば本明細書に教示されているアミノ酸のいずれかを含む天然型の及び／又は非天然型のアミノ酸から構成されうる。 幾つかの実施態様において、スペーサーは、全体として負の電荷を含み、例えば１又は２個の負荷電アミノ酸を含む。幾つかの実施態様において、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、及びγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群より選択される。

【0204】

アミン、ヒドロキシル、及びチオールを介したペプチドアルキル化に適した方法は、当該技術において知られている。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴンペプチドのヒドロキシル基とアルキル基との間にエーテル結合を形成することができる。また、ハロゲン化アルキルによるペプチドの求核置換反応は、エーテル、チオエーテル又はアミノ結合のいずれかをもたらすことができる。

【0205】

アルキル化グルカゴンペプチドのアルキル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。本発明の幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、又はＣ３０アルキルのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、例えばＣ１４アルキル又はＣ１６アルキルである。

【0206】

幾つかの実施態様において、アルキル基は、胆汁酸のステロイド部分、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、及びコレステロール酸を含む。

【0207】

本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、求核長鎖アルカンとグルカゴンペプチドとを反応させることにより、アルキル基を含むように修飾されており、ここでグルカゴンペプチドは、求核置換に適した離脱基を含む。特定の態様において、長鎖アルカンの求核基は、アミン、ヒドロキシル基、又はチオール基を含む（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、及びヘキサデカンチオールである）。グルカゴンペプチドの離脱基は、アミノ酸の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド主鎖の一部であってもよい。適切な離脱基には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、及びスルホネートエステルが含まれる。

【0208】

特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、求核長鎖アルカンと、グルカゴンペプチドに結合しているスペーサーとを反応させることにより、アルキル基を含むように修飾されており、ここでスペーサーは離脱基を含む。特定の態様において、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む。特定の実施態様において、離脱基を含むスペーサーは、本明細書において考察された任意のスペーサー、例えば、適切な離脱基を更に含む、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー又は疎水性二官能スペーサー、であることができる。

【0209】

長鎖アルカンがグルカゴン又はスペーサーでアルキル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは、任意の大きさであることができ、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖であってもよいし、分岐鎖であってもよい。特定の態様において、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン又はＣ３０アルカンのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、又はＣ１８アルカン、を含む。

【0210】

また、幾つかの実施態様において、アルキル化は、グルカゴンペプチドとコレステロール部分の間で生じることができる。例えば、コレステロール酸のヒドロキシル基が長鎖アルカンの離脱基を置換して、コレステロール−グルカゴンペプチド産物を形成することができる。

【0211】

本明細書に記載されているアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含むように更に修飾されてもよい。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この点において、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１を含んでもよいし、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含む配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよく、この場合、位置１０、２０、２４、及び２９の少なくとも１個のアミノ酸はアルキル基を含み、位置１６、１７、２１、２４、若しくは２９、若しくはＣ末端延長部内の位置の少なくとも１個のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アルキル基は位置１０に結合しており（この結合は、場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してであってもよい）、親水性部分は、位置２４のＣｙｓ残基に組み込まれている。

【0212】

あるいは、アルキル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アルキル化され、且つ、親水性部分を含むように修飾もされる。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。

【0213】

＜Ｃ末端切断＞
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対する活性および／または効力に影響を与えることなく、グルカゴンペプチドのＣ末端部の１または２個のアミノ酸（すなわち、位置２９および／また２８）の切断または欠失により、更に修飾される。この点において、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のアミノ酸１〜２７または１〜２８を含むことができ、更に、本明細書に記載されている１個以上の修飾を有してもよい。

【0214】

一つの実施態様において、切断グルカゴンアゴニストペプチドは、配列番号５５０または配列番号５５１を含む。別の実施態様において、切断グルカゴンアゴニストペプチドは、配列番号５５２または配列番号５５３を含む。

【0215】

＜荷電Ｃ末端残基＞
配列番号２０のグルカゴンペプチドの溶解性を、例えば、配列番号２０のグルカゴンペプチドのＣ末端部分、好ましくはＣ末端から位置２７までへ、１、２、３個またはそれ以上の荷電アミノ酸を導入することにより、更に改善することができる。そのような荷電アミノ酸は、例えば位置２８または２９の天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換する、あるいは位置２７、２８または２９の後に荷電アミノ酸を付加することによって導入することができる。例示的な実施態様において、１、２、３個または全ての荷電アミノ酸は、負に帯電している。あるいは、溶解性は、ポリエチレングリコールのような親水性部分をペプチドに共有結合することによっても増強することができる。

【0216】

＜例示的な実施態様＞
一つの実施態様において、配列番号５５の配列を含むグルカゴン類縁体が提供され、前記類縁体は、位置１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２４、２７、２８および２９から選択される１〜３個のアミノ酸によって配列番号５５と異なっており、前記グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％の活性を示す。

【0217】

一つの実施態様によると、下記の配列：
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３３）を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで、位置１５のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸から成るアミノ酸の群より選択され、位置１６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ，ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸から成るアミノ酸の群より選択され、位置２０のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、位置２４のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、位置２８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、位置２９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙまたは酸性アミノ酸であり、そしてＲはＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ_２であるが、但し、位置１６がセリンである場合、位置２０はＬｙｓであるか、あるいは位置１６がセリンであり、位置２４がＧｌｕである場合、位置２０または位置２８のいずれかはＬｙｓであることを条件とする。一つの実施態様において、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号３３の配列を含み、ここで、位置２８のアミノ酸はアスパラギン酸であり、位置２９のアミノ酸はグルタミン酸である。別の実施態様において、位置２８のアミノ酸は天然のアスパラギンであり、位置２９のアミノ酸はグリシンであり、配列番号２９または配列番号６５のアミノ酸配列は、配列番号３３のカルボキシ末端に共有結合している。

【0218】

一つの実施態様において、配列番号３３の配列を含むコアゴニストが提供され、ここで追加の酸性アミノ酸が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されている。更なる実施態様において、グルカゴン類縁体のカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。一つの実施態様において、グルカゴン類縁体は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４から成る群から選ばれる配列を含む。

【0219】

一つの実施態様によると、配列番号３３のグルカゴンペプチド類縁体が提供され、ここで、前記類縁体は、位置１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１および２７から選択される１〜３個のアミノ酸により配列番号３３と異なるが、但し、位置１６アミノ酸がセリンである場合、位置２０はリシンであるか、またはラクタム架橋は、位置２４のアミノ酸と、位置２０若しくは位置２８のアミノ酸との間に形成されることを条件とする。一つの実施態様によると、類縁体は、位置１、２、３、２１および２７から選択される１〜３個のアミノ酸により配列番号３３と異なっている。一つの実施態様において、配列番号３３のグルカゴンペプチドは、１若しくは２個のアミノ酸による配列、または一つの実施態様では、位置１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１および２７から選択される単一のアミノ酸による配列で異なっているが、但し、位置１６のアミノ酸がセリンである場合、位置２０はリシンであるか、またはラクタム架橋は、位置２４のアミノ酸と、位置２０若しくは位置２８のアミノ酸との間に形成されることを条件とする。

【0220】

別の実施態様によると、ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５３）の配列を含む相対的に選択性のＧＬＰ−１受容体アゴニストが提供され、ここで、位置３のＸａａは、Ｇｌｕ、ＯｒｎまたはＮｌｅから成るアミノ酸の群より選択され、位置１５のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸から成るアミノ酸の群より選択され、位置１６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸から成るアミノ酸の群より選択され、位置２０のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、位置２４のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、位置２８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、位置２９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙまたは酸性アミノ酸であり、そしてＲは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ_２、配列番号２６または配列番号２９であるが、但し、位置１６がセリンである場合、位置２０はＬｙｓであるか、あるいは位置１６がセリンである場合、位置２４はＧｌｕであり、位置２０または位置２８のいずれかはＬｙｓであることを条件とする。一つの実施態様において、位置３のアミノ酸はグルタミン酸である。一つの実施態様において、位置２８および／または位置２９で置換されている酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。一つの実施態様において、コアゴニストペプチドを含むグルカゴンペプチドは、配列番号３３の配列を含み、ペプチドのカルボキシ末端に付加されている付加酸性アミノ酸を更に含む。更なる実施態様において、グルカゴン類縁体のカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。

【0221】

一つの実施態様によると、下記：
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３４）から成る群から選ばれる修飾グルカゴンペプチドを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで、位置１５のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸から成るアミノ酸の群より選択され、位置１６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ，ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸から成るアミノ酸の群より選択され、位置２０のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、位置２４のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、位置２８のＸａａは、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ_２であり、位置２９のＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、そしてＲはＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ_２、配列番号２６または配列番号２９であるが、但し、位置１６がセリンである場合、位置２０はＬｙｓであるか、あるいは位置１６がセリンである場合、位置２４はＧｌｕであり、位置２０または位置２８のいずれかはＬｙｓであることを条件とする。一つの実施態様において、ＲはＣＯＮＨ_２であり、位置１５のＸａａはＡｓｐであり、位置１６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸から成るアミノ酸の群より選択され、位置２０および２４のＸａａは、それぞれＧｌｎであり、位置２８のＸａａは、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、そして位置２９のＸａａは、Ｔｈｒである。一つの実施態様において、位置１５および１６のＸａａは、それぞれＧｌｕであり、位置２０および２４のＸａａは、それぞれＧｌｎであり、位置２８のＸａａは、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、位置２９のＸａａはＴｈｒであり、そしてＲはＣＯＮＨ_２である。

【0222】

天然グルカゴンペプチドの特定の位置は、母体となるペプチドの活性の少なくとも一部分を保持しつつ、修飾できることが報告されている。したがって、出願者たちは、配列番号１１のペプチドの位置２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９に配置された１個以上のアミノ酸を、天然グルカゴンペプチドに存在するものと異なるアミノ酸で置換することができ、依然としてグルカゴン受容体に対する活性を保持することができると予測する。一つの実施態様において、天然ペプチドの位置２７に存在するメチオニン残基は、ペプチドの酸化分解を防止するために、ロイシン又はノルロイシンに変えられる。別の実施態様において、位置２０のアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、若しくはシトルリンで置換されている、及び／又は、位置２１は、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、若しくはホモシステイン酸で置換されている。

【0223】

一実施態様では、配列番号２０のグルカゴン類縁体であって、位置１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２７、２８、または２９から選ばれる１乃至６個のアミノ酸は配列番号１の対応アミノ酸とは異なるグルカゴン類縁体が提供されるが、ただし、位置１６のアミノ酸がセリンである場合、位置２０はＬｙｓであること、あるいはまた、位置１６がセリンである場合、位置２４はＧｌｕであり、且つ位置２０または位置２８のいずれかがＬｙｓであることを条件とする。別の実施態様によれば、配列番号２０のグルカゴン類縁体であって、位置１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、または２９から選ばれる１乃至３個のアミノ酸が配列番号１の対応アミノ酸とは異なる、グルカゴン類縁体が提供される。別の実施態様では、配列番号８、配列番号９、または配列番号１１のグルカゴン類縁体であって、位置１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０、または２１から選ばれる１乃至２個のアミノ酸が配列番号１の対応アミノ酸とは異なるグルカゴン類縁体が提供され、さらに別の実施態様では、前記１乃至２個の異なるアミノ酸は、天然のグルカゴン配列（配列番号１）に存在するアミノ酸に対し、保存的アミノ酸置換を表す。一実施態様では、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のグルカゴンペプチドであって、位置２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２７、または２９の位置から選ばれる位置に、一つ、二つ、または三つのアミノ酸置換をさらに含む、グルカゴンペプチドが提供される。一実施態様では、位置２、５、７、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、または２９における置換は、保存的アミノ酸置換である。

【0224】

一つの実施態様によると、配列番号３３の配列の変種を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで変種の位置１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７、２８および２９のそれぞれから選択される１〜１０個のアミノ酸は、配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている。一つの実施態様によると、配列番号３３の配列の変種が提供され、ここで変種は、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２４、Ｖａｌ２７およびＧｌｙ２９から成る群から選ばれる１個以上のアミノ酸置換により配列番号３３と異なっている。一つの実施態様によると、配列番号３３の配列の変種を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで変種の位置１７〜２６から選択される１〜２個のアミノ酸は、配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている。一つの実施態様によると、配列番号３３の配列の変種が提供され、ここで変種は、Ｇｌｎ１７、Ａｌａｌ８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３およびＡｌａ２４から成る群から選ばれるアミノ酸置換により配列番号３３と異なっている。一つの実施態様によると、配列番号３３の配列の変種が提供され、ここで変種は、位置１８のアミノ酸置換により配列番号３３と異なっており、置換アミノ酸は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｙから成る群から選ばれる。一つの実施態様によると、配列番号３３の配列の変種が提供され、ここで変種は、位置１８のＡｌａのアミノ酸置換により配列番号３３と異なっている。そのような変種は、配列番号５５に包含される。別の実施態様において、配列番号３３の配列の変種を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで変種の位置１７〜２２から選択される１〜２個のアミノ酸は、配列番号１の対応するアミノ酸と異なっており、更なる実施態様において、配列番号３３の変種が提供され、ここで変種は、位置２０および２０の１または２個のアミノ酸置換により配列番号３３と異なっている。一つの実施態様によると、下記の配列：
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５１）を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで、位置１５のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、位置１６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、位置２０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンであり、位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、位置２４のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、位置２８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、位置２９のＸａａは、Ｔｈｒまたは酸性アミノ酸であり、そしてＲは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ_２である。一つの実施態様において、ＲはＣＯＮＨ_２である。一つの実施態様において、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４７、配列番号４８または配列番号４９の変種を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで変種は、位置２０でのアミノ酸置換により前記配列と異なっている。一つの実施態様において、位置２０へのアミノ酸置換は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンから成る群から選ばれる。

【0225】

一つの実施態様において、配列番号３４の類縁体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストが提供され、ここで類縁体は、位置２にセリン以外のアミノ酸を有することにより配列番号３４と異なっている。一つの実施態様において、セリン残基は、アミノイソ酪酸、Ｄ−アラニンで置換されており、一つの実施態様において、セリン残基は、アミノイソ酪酸で置換されている。そのような修飾は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断を抑制し、同時に親化合物の固有の効力（例えば、親化合物の効力の少なくとも７５、８０、８５、９５％またはそれ以上）を保持する。一つの実施態様において、類縁体の溶解性は、例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくはＣ末端から位置２７まで、への１、２、３個またはそれ以上の荷電アミノ酸の導入により増加される。例示的な実施態様において、１、２、３個または全ての荷電アミノ酸は、負に帯電している。別の実施態様において、類縁体は、位置２８若しくは２９の天然アミノ酸の酸性アミノ酸による置換、または配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を更に含む。

【0226】

一つの実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴン類縁体は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、位置１または２において更に修飾されている。一つの実施態様において、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のグルカゴン類縁体が提供され、ここで類縁体は、位置２での置換により母体分子と異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して低減された感受性（すなわち、耐性）を示す。さらに具体的には、一つの実施態様において、類縁体ペプチドの位置２は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、アミノＮ−酪酸、グリシン、Ｎ−メチルセリンおよびアミノイソ酪酸から成る群から選ばれるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、類縁体ペプチドの位置２は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリンおよびアミノイソ酪酸から成る群から選ばれるアミノ酸で置換されている。別の実施態様において、類縁体ペプチドの位置２は、Ｄ−セリン、グリシンおよびアミノイソ酪酸から成る群から選ばれるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号２１または配列番号２２の配列を含む。

【0227】

一つの実施態様において、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のグルカゴン類縁体が提供され、ここで類縁体は、位置１での置換により母体分子と異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して低減された感受性（すなわち、耐性）を示す。さらに具体的には、類縁体ペプチドの位置１は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジンおよびホモ−ヒスチジンから成る群から選ばれるアミノ酸で置換されている。別の実施態様において、配列番号３４の類縁体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストが提供され、ここで類縁体は、位置１にヒスチジン以外のアミノ酸を有することにより配列番号３４と異なっている。一つの実施態様において、類縁体の溶解性は、例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくはＣ末端の位置から位置２７まで、への１、２、３個またはそれ以上の荷電アミノ酸の導入により増加される。例示的な実施態様において、１、２、３個または全ての荷電アミノ酸は、負に帯電している。別の実施態様において、類縁体は、位置２８若しくは２９の天然アミノ酸の酸性アミノ酸による置換、または配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を更に含む。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。

【0228】

一つの実施態様において、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号２０の配列を含み、１個のアミノ酸の付加カルボキシ末端延長部または配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８から成る群から選ばれるペプチドを更に含む。単一のアミノ酸が配列番号２０のカルボキシ末端に付加される実施態様において、アミノ酸は典型的には２０個の一般的なアミノ酸のうちの１個から選択され、一つの実施態様において、付加的カルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。一つの実施態様において、付加アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸およびグリシンから成る群から選ばれる。

【0229】

代替的な実施態様において、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、ここで、ペプチドは、グルタミン酸残基とリシン残基の側鎖同士の間に形成された少なくとも一つのラクタム環を含み、グルタミン酸残基とリシン残基は、３個のアミノ酸により隔てられている。一実施態様では、ラクタム含有グルカゴンペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。さらに具体的には、一つの実施態様では、下記から成る群から選ばれる修飾グルカゴンペプチドを含むグルカゴンおよびＧＬＰ−１コアゴニストが提供される：
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６６）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６７）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６８）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６９）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１６）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１７）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１８）
上記配列において、位置２８のＸａａ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、位置２９のＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８から成る群から選ばれ、ラクタム架橋は、配列６６の場合は、位置１２のＬｙｓおよび位置１６のＧｌｕの間に形成され、配列６７の場合は、位置１６のＧｌｕおよび位置２０のＬｙｓの間に形成され、配列６８の場合は、位置２０のＬｙｓおよび位置２４のＧｌｕの間に形成され、配列６９の場合は、位置２４のＧｌｕおよび位置２８のＬｙｓの間に形成され、配列１６の場合は、位置１２のＬｙｓおよび位置１６のＧｌｕの間、および、位置２０のＬｙｓおよび位置２４のＧｌｕの間に形成され、配列１７の場合は、位置１２のＬｙｓおよび位置１６のＧｌｕの間、および、位置２４のＧｌｕおよび位置２８のＬｙｓの間に形成され、配列１８の場合は、位置１６のＧｌｕおよび位置２０のＬｙｓの間、および、位置２４のＧｌｕおよび位置２８のＬｙｓの間に形成される。一つの実施態様において、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ_２、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンから成る群より選択され、位置２８のアミノ酸はＡｓｎであり、位置２９のアミノ酸はトレオニンである。一つの実施態様において、ＲはＣＯＮＨ_２であり、位置２８のアミノ酸はＡｓｎであり、位置２９のアミノ酸はトレオニンである。別の実施態様において、Ｒは、配列番号２６、配列番号２９および配列番号６５から成る群より選択され、位置２９のアミノ酸はグリシンである。

【0230】

更なる実施態様において、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８から成る群より選択され、ここでペプチドは、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８から成る群から選ばれる１個アミノ酸またはペプチドの付加的カルボキシ末端延長部を更に含む。一つの実施態様において、末端延長部は、配列番号２６、配列番号２９または配列番号６５の配列を含み、グルカゴンペプチドは、配列番号５５の配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号３３の配列を含み、ここで、位置１６のアミノ酸はグルタミン酸であり、位置２０のアミノ酸はリシンであり、位置２８のアミノ酸はアスパラギンであり、配列番号２６または配列番号２９のアミノ酸配列は、配列番号３３のカルボキシ末端に結合している。

【0231】

単一のアミノ酸が配列番号２０のカルボキシ末端に付加される実施態様において、アミノ酸は典型的には２０個の一般的なアミノ酸のうちの１個から選択され、一つの実施態様において、アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。一つの実施態様において、付加アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸およびグリシンから成る群から選ばれる。グルカゴンアゴニスト類縁体がカルボキシ末端延長部を更に含む実施態様において、延長部のカルボキシ末端アミノ酸は、一つの実施態様において、カルボン酸ではなくアミド基またはエステル基で終わる。

【0232】

別の実施態様において、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＣＯＮＨ_２（配列番号１９）の配列を含み、ここで位置３０のＸａａは、任意のアミノ酸を表す。一つの実施態様において、Ｘａａは、２０個の一般的なアミノ酸のうちの１個から選択され、一つの実施態様において、アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはグリシンである。このペプチドの溶解性は、配列番号１９の位置１７、２１、２４または３０のアミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖を共有結合することによって、更に改善することができる。更なる実施態様において、ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８から成る群から選ばれるペプチドの付加的なカルボキシ末端延長部を含む。一つの実施態様によると、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２の配列を含む。

【0233】

配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号６４のグルカゴン配列への付加的な部位特異的内部修飾を行って、多様な程度のＧＬＰ−１アゴニズムを有する一連のグルカゴンアゴニストを生じることができる。したがって、それぞれの受容体において実質的に同一のインビトロ効力を有するペプチドが調製され、特徴決定される。同様に、２つの受容体それぞれにおいて選択的に１０倍増強された効力を有するペプチドが同定され、特徴決定されている。上記に示したように、グルタミン酸による位置１６のセリン残基の置換は、グルカゴンとＧＬＰ−１の両方の受容体に対する天然グルカゴンの効力を増強するが、グルカゴン受容体に対しておよそ１０倍の選択性を維持する。加えて、グルタミン酸で位置３の天然グルタミンを置換することによって（配列番号２２）、ＧＬＰ−１受容体に対しておよそ１０倍の選択性を示すグルカゴン類縁体を生成する。

【0234】

グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストペプチドの位置１６、１７、２１および２４に親水性基を導入することにより、またはグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストペプチドのカルボキシ末端へ単一修飾アミノ酸（すなわち、親水性基を含むように修飾されたアミノ酸）を付加することにより、天然グルカゴンに対する高い生物学的活性を保持しながら、生理学的ｐＨの水溶液における溶解性を更に増強することができる。一つの実施態様によると、親水性基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。さらに具体的には、一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７また配列番号１８の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの位置１６、１７、２１、２４のアミノ酸またはＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合しているが、但し、ペプチドが配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、位置１７、２１または２４のアミノ酸残基に共有結合しており、ペプチドが配列番号１４または配列番号１５を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、位置１６、１７または２１のアミノ酸残基に共有結合しており、ペプチドが配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、位置１７または２１のアミノ酸残基に共有結合していることを条件とする。

【0235】

一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖が、グルカゴンペプチドの位置１７、２１、２４のアミノ酸またはＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合しており、ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。一つの実施態様において、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９から成る群から選ばれる配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の位置１７、２１若しくは２４、または配列番号１４および配列番号１５の位置１６、１７若しくは２１、または配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８の位置１７若しくは２１のアミノ酸の側鎖に共有結合している。別の実施態様において、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号１１または配列番号１９の配列を含み、ここでＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの位置１７、２１若しくは２４のアミノ酸、またはＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合している。

【0236】

一つの実施態様によると、先行段落において但し書きで限定されているように、グルカゴンコアゴニストペプチドは修飾されて、位置１６、１７、２１、２４若しくは２９またはＣ末端アミノ酸に１個以上のアミノ酸置換を含有し、ここで天然アミノ酸は、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋に適している側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然ペプチドを、天然型のアミノ酸または合成（非天然型の）アミノ酸で置換することができる。合成または非天然型アミノ酸は、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。あるいは、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋に適している側鎖を有するアミノ酸を、本明細書に開示されているグルカゴン類縁体のいずれかのカルボキシ末端に付加することができる。一つの実施態様によると、１６、１７、２１、２４または２９から成る群から選ばれる位置で、天然アミノ酸を、リシン、システイン、オルチニン、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンから成る群から選ばれるアミノ酸に代えるアミノ酸置換を、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストにおいて行い、ここで置換アミノ酸は、アミノ酸の側鎖に共有結合しているＰＥＧ鎖を更に含む。一つの実施態様において、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９から成る群から選ばれるグルカゴンペプチドは、更に修飾されて、グルカゴンペプチドの位置１７または２１のアミノ酸の側鎖に共有結合しているＰＥＧ鎖を含む。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２９の配列を更に含む。

【0237】

別の実施態様において、グルカゴンペプチドは配列番号５５または配列番号５６の配列を含み、配列番号５５または配列番号５６のＣ末端アミノ酸に結合している配列番号２６、配列番号２９または配列番号６５のＣ末端延長部を更に含み、場合により、ペプチドの位置１７、１８、２１、２４若しくは２９のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸に共有結合しているＰＥＧ鎖を更に含んでもよい。別の実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号５５または配列番号５６を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの位置２１または２４のアミノ酸の側鎖に共有結合しており、ペプチドは、配列番号２６または配列番号２９のＣ末端延長部を更に含む。

【0238】

別の実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号５５または配列番号３３または配列番号３４の配列を含み、ここで、付加アミノ酸は、配列番号３３または配列番号３４のカルボキシ末端に付加され、ＰＥＧ鎖は、付加アミノ酸の側鎖に共有結合している。更なる実施態様において、ペグ化グルカゴンペプチドは、配列番号３３または配列番号３４のＣ末端アミノ酸に結合している配列番号２６または配列番号２９のＣ末端延長部を更に含む。別の実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１９の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの位置３０のアミノ酸の側鎖に共有結合しており、ペプチドは、配列番号１９のＣ末端アミノ酸に結合している配列番号２６または配列番号２９のＣ末端延長部を更に含む。

【0239】

ポリエチレングルコール鎖は、直鎖の形態であってもよいし、分岐鎖であってもよい。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。代替的な実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様によると、ペグ化グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号５から構成されるペプチドまたは配列番号５のグルカゴンアゴニスト類縁体を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は位置２１および位置２４のアミノ酸残基に共有結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。

【0240】

特定の例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、１０個までのアミノ酸修飾を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、アシル化またはアルキル化されている位置１０のアミノ酸を含む。幾つかの実施態様において、位置１０のアミノ酸は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸でアシル化またはアルキル化されている。特定の態様において、位置１０のアミノ酸は、天然型のアミノ酸に対して非天然であるアシル基またはアルキル基を含む。

【0241】

特定の実施態様において、アシル化またはアルキル化されている位置１０のアミノ酸を含むグルカゴンペプチドは、安定化されたアルファ−へリックスを含む。したがって、特定の態様において、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載されているアシルまたはアルキル基、および分子内架橋、例えば位置ｉのアミノ酸と位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖同士の間の共有分子内架橋（例えば、ラクタム架橋）を含み、ここでｉは、１２、１６、２０または２４である。代替的にまたは追加的に、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載されているアシルまたはアルキル基を含み、グルカゴンペプチドの位置１６、２０、２１および／または２４のうちの１、２、３つまたはそれ以上の位置は、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢにより置換されている。幾つかの場合において、非天然グルカゴンペプチドは、位置１６のＧｌｕおよび位置２０のＬｙｓを含み、ここで、場合によりラクタム架橋がＧｌｕとＬｙｓを結合してもよく、場合によりグルカゴンペプチドは、位置１７のＧｌｎ、位置１８のＡｌａ、位置２１のＧｌｕ、位置２３のＩｌｅおよび位置２４のＡｌａから成る群から選ばれる一つ以上の修飾を更に含んでもよい。

【0242】

また、グルカゴンペプチドが、アシル化またはアルキル化されている位置１０のアミノ酸を含む実施態様のいずれかにおいて、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端アルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを更に含むことができる。

【0243】

幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているアシルまたはアルキル基を含むグルカゴンペプチドは、位置１、位置２または位置１および２のアミノ酸置換を更に含み、ここでアミノ酸置換（単数または複数）は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。例えば、位置１のＨｉｓを、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジンおよびホモ−ヒスチジンから成る群から選ばれるアミノ酸で置換することができる。代替的にまたは追加的に、位置２のＳｅｒを、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニンおよびアミノイソ酪酸から成る群から選ばれるアミノ酸で置換することができる。

【0244】

本明細書に記載されているようにアシル化またはアルキル化されている位置１０のアミノ酸を含むグルカゴンペプチドは、配列番号１に実質的に関連する任意のアミノ酸配列を含むことができる。例えば、グルカゴンペプチドは、１０個までのアミノ酸修飾（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の修飾）を有する配列番号１を含む。特定の実施態様において、アシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と２５％を超える相同性（例えば、配列番号１と例えば３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはほぼ１００％の相同性）がある。特定の特別な実施態様において、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載されているようにアシル化またはアルキル化されている位置１０のアミノ酸を有する配列番号５５を含むものである。グルカゴンペプチドは、配列番号５５、１または２個のアミノ酸修飾を有する５５、２〜４、９〜１８、２０、２３〜２５、３３、４０〜４４、５３、５６、６１、６２、６４、６６〜５１４および５３４のいずれかであることができる。

【0245】

これらの実施態様のアシルまたはアルキル基は、本明細書に記載されている任意のアシルまたはアルキル基であることができる。例えば、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０（例えば、Ｃ８〜Ｃ２４）脂肪アシル基であることができ、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０（例えば、Ｃ８〜Ｃ２４）アルキル基であることができる。

【0246】

アシルまたはアルキル基が結合しているアミノ酸は、本明細書に記載されている任意のアミノ酸、例えば、式Ｉ（例えば、Ｌｙｓ）、式ＩＩおよび式ＩＩＩのいずれかのアミノ酸であることができる。

【0247】

幾つかの実施態様において、アシル基またはアルキル基は、位置１０のアミノ酸に直接結合している。幾つかの実施態様において、アシルまたはアルキル基は、例えば３〜１０原子長のスペーサー、例えばアミノ酸またはジペプチドのようなスペーサーを介して、位置１０のアミノ酸に結合している。アシルまたはアルキル基を結合する目的に適したスペーサーは、本明細書に記載されている。

【0248】

＜使用＞
実施例に詳細に記載されているように、本発明のグルカゴンアゴニストは、増強された生物物理学的安定性および水溶性を有し、同時に天然ペプチドと比べて増強された生体活性を示す。したがって、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然グルカゴンペプチドについて既に記載されてきたあらゆる使用に適していると考えられる。したがって、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然グルカゴンペプチドについて既に記載されてきたあらゆる使用に適していると考えられる。したがって、本明細書に記載されている修飾グルカゴンペプチドを、低血糖症を治療すること、血中グルコースレベルを増加すること、放射線用途において腸管に一過性麻痺を誘導すること、体重を低減及び維持すること、インスリンの補助療法として、又は、グルカゴンの低血中レベルによりもたらされる他の代謝疾患を治療すること、に使用できる。本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、体重を低減若しくは維持すること、高血糖症を治療すること、血中グルコースレベルを低減すること、又は、血中グルコースレベルを正常化すること、に使用できることも予測される。

【0249】

本発明のグルカゴンペプチドを、単独で、又は他の抗糖尿病又は抗肥満剤と組み合わせて投与することができる。当該技術において既知であるか又は調査中の抗糖尿病剤としては、以下のものが挙げられる：インスリン；トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta, Micronase, Glynase）、グリメピリド（Amaryl）又はグリクラジド（Diamicron）のようなスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）又はナテグリニド（Starlix）のようなメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）又はフェンホルミンのようなビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）若しくはトログリタゾン（Rezulin）又は他のＰＰＡＲγインヒビターのようなチアゾリジンジオン；ミグリトール（Glyset）、アルカボース（Precose/Glucobay）のような炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター；エクセナチド（Byetta）又はプラムリンチド；ビルダグリプチン又はシタグリプチンのようなジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）インヒビター；グルコキナーゼアクチベーター（ＧＫＡ）；グルカゴン受容体アンタゴニスト（ＧＲＡ）；又はＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビター。

【0250】

当該技術において既知であるか又は調査中の抗肥満剤としては、以下のものが挙げられる：フェネチルアミン型刺激薬、フェンテルミン、（場合により、フェンフルラミン又はデクスフェンフルラミンを伴う）、ジエチルプロピオン（Tenuate（登録商標））、フェンジメトラジン（Prelu-2（登録商標）、Bontril（登録商標））、ベンズフェタミン（Didrex（登録商標））、シブトラミン（Meridia（登録商標）、Reductil（登録商標））を含む食欲抑制薬；リモナバン（Acomplia（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Prozac）；Qnexa（トピラメート及びフェンテルミン）、Excalia（ブプロピオン及びゾニサミド）又はContrave（ブプロピオン及びナルトレキソン）；或いは、ゼニカル（Orlistat）若しくはCetilistat （ATL-962としても知られている）又はGT 389-255と類似しているリパーゼインヒビター類。

【0251】

本開示の一つの態様は、低血糖症の治療に使用される本開示のグルカゴンアゴニストの予備処方水性液剤を対象とする。本明細書に記載されているアゴニスト組成物の向上した安定性及び／又は溶解性は、迅速な投与及び低血糖症の治療のためのグルカゴンの予備処方水性液剤の調製を可能にする。したがって、一つの実施態様において、本明細書に記載されているペグ化グルカゴンアゴニストを含む液剤が、低血糖症に罹患している患者に投与するために提供され、ここでペグ化グルカゴンアゴニストに結合しているＰＧＥ鎖の総分子量は、約５００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５、並びに、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５のグルカゴンアゴニスト類縁体、又は、配列番号２０の配列を含むグルカゴンのペグ化ラクタム類縁体、からなる群より選択されるペプチドを含み、ここで前記グルカゴンペプチドのアミノ酸残基の側鎖は、ポリエチレングリコール鎖に共有結合している。

【0252】

本発明による治療方法（低血糖症の治療を含むが、これに限定されない）は、静脈内、腹腔内、皮下若しくは筋肉内のような非経口、鞘内、経皮、直腸内、経口、鼻腔内又は吸入を含む、任意の標準的投与経路を使用して、本開示のグルカゴンアゴニストを患者に投与する工程を含むことができる。一つの実施態様において、組成物は皮下又は筋肉内投与される。一つの実施態様において、組成物は非経口投与され、グルカゴン組成物はシリンジの中に包装される。別の実施態様において、組成物は、吸入器又は他のエアゾール化薬剤送達装置に予め包装されている。

【0253】

驚くべきことに、母体ペプチドの生物活性と特異性を保持するような、ペグ化されたグルカゴンペプチドを調製できることを、出願者らは見出していた。しかし、ＰＥＧ鎖の長さを伸ばすか、ペプチドに複数のＰＥＧ鎖を結合して、結合したＰＥＧの総分子量を5,000ダルトンより大きくすると、修飾グルカゴンの作用の時間が遅れ始める。一実施態様によれば、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５のグルカゴンペプチド、若しくはそのグルカゴンアゴニスト類縁体、又は、配列番号２０の配列を含むグルカゴンのペグ化ラクタム類縁体、が提供され、ここで、ペプチドは１つ以上のポリエチレングリコール鎖を含み、結合したＰＥＧの総分子量は5,000ダルトンより大きく、一実施態様においては10,000ダルトンより大きいが40,000ダルトン未満である。そのような修飾グルカゴンペプチドは、生物活性を失うことなく、活性の時間が遅延又は延長している。従って、そのような組成物を予防的に投与して、投与したグルカゴンペプチドの効果を延長することができる。

【0254】

10,000ダルトンより大きい分子量を有するＰＥＧ鎖を共有結合させて修飾したグルカゴンペプチドは、インシュリンと共に投与して、インシュリンの作用を緩衝し、糖尿病患者における血中グルコースレベルを安定に維持する助けとすることができる。本開示の修飾グルカゴンペプチドは、インシュリンと共に、単一の組成物として、あるいは別々の溶液として、同時に投与することができ、あるいは、インシュリンと修飾グルカゴンペプチドとは互いに異なる時期に投与することもできる。一実施態様においては、インシュリンを含む組成物と修飾グルカゴンペプチドを含む組成物は互いに12時間以内の間隔で投与される。投与したインシュリンに対する修飾グルカゴンペプチドの正確な比率は、患者のグルカゴンレベルを決定することに部分的に依存し、日常的な実験手法を通じて決定することができる。

【0255】

一実施態様によれば、インシュリンと、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５およびそれらのグルカゴンアゴニスト類縁体から成るグループから選ばれる修飾グルカゴンペプチドとを含む組成物が提供されるが、ここで、修飾グルカゴンペプチドはさらに位置１７、２１、若しくは２４、又は位置２１と２４のアミノ酸側鎖に共有結合したポリエチレングリコール鎖を含む。一実施態様において、組成物はインシュリンとグルカゴン類縁体とを含む水溶液である。グルカゴンペプチドが配列番号２４または配列番号２５の配列を含むような実施態様においては、ポリエチレングリコール鎖は、グルカゴンペプチドの位置２１または２４に共有結合している。一実施態様においては、ポリエチレングリコール鎖は約10,000〜約40,000の分子量を有する。

【0256】

一つの実施態様によると、本明細書に開示されている修飾グルカゴンペプチドは、腸管の一過性麻痺の誘導に使用される。この方法は、放射線学の目的において有用性を有し、ペグ化グルカゴンペプチド、Ｃ末端延長部を含むグルカゴンペプチド、又はそのようなペプチドの二量体を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、更に、位置２１又は２４に共有結合している、約１，０００〜４０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される。一つの実施態様において、ＰＥＧ鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。

【0257】

更なる実施態様において、腸管の一過性麻痺を誘導するのに使用される組成物は、第１の修飾グルカゴンペプチドと第２の修飾グルカゴンペプチドとを含む。第１修飾ペプチドは、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群より選択される配列を含み、更に、約５００〜約５，０００ダルトンのＰＥＧ鎖に結合していてもよく、第２ペプチドは、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖と共有結合した、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群より選択される配列を含む。この実施態様において、それぞれのペプチドのＰＥＧ鎖は、それぞれのペプチドの位置２１、２４若しくは２９のいずれかに、互いに独立して、共有結合している。

【0258】

小腸において見出された天然型の消化ホルモンであるオキシントモジュリンは、ラット又はヒトに投与されたときに減量を引き起こすことが報告されている（Diabetes 2005; 54:2390-2395を参照すること）。オキシントモジュリンは、グルカゴン（すなわち、配列番号１）の２９アミノ酸配列と、その後に続く配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８アミノ酸カルボキシ末端延長部とを有する、３７アミノ酸ペプチドである。したがって、出願者たちは、オキシントモジュリンのグルカゴンペプチド部分を本明細書に開示されている修飾グルカゴンペプチドで置換することによって、オキシントモジュリンの生体活性（すなわち、食欲抑制及び減量／体重維持の誘導）を保持しつつ、化合物の溶解性及び安定性を改善し、薬物動態を改善することができると考える。加えて、出願者たちは、本発明のグルカゴンペプチドを含み、オキシントモジュリンの４個の末端アミノ酸が除去されている、切断型オキシントモジュリン分子もまた、食欲の抑制及び減量／体重維持の誘導に有効であると考える。

【0259】

したがって、本発明は、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８のカルボキシ末端延長部を有する本発明の修飾グルカゴンペプチドも包含する。これらの化合物は、減量の誘発誘導、または体重増加の阻止のために、個体に対し投与することが可能である。一つの実施態様によると、アミノ酸２９に結合している配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む、配列番号３３又は配列番号２０のグルカゴンアゴニスト類縁体が、減量を誘導する又は体重増加を予防するために、個人に投与される。さらに具体的には、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５から成る群から選ばれる配列を含み、アミノ酸２９に、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号２８のアミノ酸配列が更に結合している。

【0260】

エキセンディン−４は、３９アミノ酸から構成されるペプチドである。これは、ＧＬＰ−１という名の受容体に対する強力な刺激因子である。このペプチドも、食欲を抑え、減量を誘導することが報告されている。本出願人らは、エキセンディン−４の末端配列は、グルカゴンのカルボキシ末端に付加されると、グルカゴンの生体活性を損なうことなくグルカゴンの可溶性および安定性を強化することを見出した。一実施態様では、エキセンディン−４の末端の１０アミノ酸（すなわち、配列番号２６の配列（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ））が、本開示のグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に結合される。これらの融合タンパクは、食欲の抑制および減量／体重維持の誘導をもたらす薬理学的活性を有することが期待される。一実施態様によれば、配列番号３３または配列番号２０のグルカゴンアゴニスト類縁体であって、アミノ酸２９に配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）または配列番号２９のアミノ酸配列が更に結合したグルカゴンペプチドが、個体に対し、減量の誘導、または体重増加の阻止のために投与される。さらに具体的には、該グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号５５、および配列番号５６から成る群から選ばれる配列を含み、さらに、アミノ酸２９に連結した、配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）または配列番号２９のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、投与されるグルカゴンペプチド類縁体は、配列番号６４の配列を含む。

【0261】

＜多量体＞
本開示はまた、本明細書に記載の修飾グルカゴンペプチドの多量体も包含する。２つ以上の修飾グルカゴンペプチドを、標準的な架橋剤と当業者に周知の手順を用いて互いに結合できる。例えば、２つの修飾グルカゴンペプチドの間で、特にシステイン、リジン、オルニチン、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニン残基で置換されたグルカゴンペプチド（例えば配列番号３や配列番号４）の場合、二官能性チオールクロスリンカーや二官能性アミンクロスリンカーを用いることにより、二量体を形成することができる。二量体はホモ二量体であってもよく、あるいはまたヘテロ二量体であってもよい。特定の実施態様において、２つ（またはそれ以上）のグルカゴンペプチドを連結するリンカーは、ＰＥＧ、例えば５ｋＤａのＰＥＧ、２０ｋＤａのＰＥＧである。幾つかの実施態様において、リンカーはジスルフィド結合である。例えば、二量体のそれぞれのモノマーは、Ｃｙｓ残基（例えば、末端または内部に位置したＣｙｓ）を含むことができ、それぞれのＣｙｓ残基の硫黄原子はジスルフィド結合の形成に参加する。本発明の幾つかの態様において、モノマーは、末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端）を介して、または内部アミノ酸を介して、または少なくとも一方のモノマーの末端アミノ酸および少なくとももう一方のモノマーの内部アミノ酸を介して連結している。特定の態様において、モノマーはＮ末端アミノ酸を介して連結してはいない。幾つかの態様において、多量体のモノマーは、各モノマーのＣ末端アミノ酸が共に結合している「尾−尾」配向で共に結合している。

【0262】

一実施態様では、二量体は、グルカゴン融合ペプチドのホモ二量体であり、そのグルカゴンペプチド部分は、配列番号１１または配列番号２０と、アミノ酸２９に連結する、配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列とを含む。別の実施態様では、二量体は、配列番号１１のグルカゴンアゴニスト類縁体のホモ二量体を含み、該グルカゴンペプチドはさらに、位置２１または２４に共有結合するポリエチレングリコール鎖を含む。

【0263】

一実施態様によれば、リンカーを介して第２グルカゴンペプチドに結合する、第１グルカゴンペプチドを含む二量体が提供され、ここで、第１グルカゴンペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１から成る群から選ばれるペプチドを含み、第２グルカゴンペプチドは、配列番号２０を含む。別の実施態様によれば、リンカーを介して第２グルカゴンペプチドに結合する、第１グルカゴンペプチドを含む二量体、および、その薬学的に受容可能な塩が提供され、ここで、前記第１グルカゴンペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１から成る群から選ばれる配列を含み、第２グルカゴンペプチドは、配列番号１１を含む。別の実施態様によれば、リンカーを介して第２グルカゴンペプチドに結合する第１グルカゴンペプチドを含む二量体、および、その薬学的に受容可能な塩が提供され、ここで、前記第１グルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８から成る群から選ばれ、第２グルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８から成る群から独立に選ばれる。一実施態様では、第１グルカゴンペプチドは、配列番号２０から成る群から選ばれ、第２グルカゴンペプチドは、配列番号８、配列番号９、および配列番号１１から成る群から独立に選ばれる。一実施態様では、二量体は、それぞれが配列番号１１のアミノ酸配列を含む二つのペプチドの間に形成される。

【0264】

＜キット＞
本発明の修飾グルカゴンペプチドを、一つの実施態様に従って、キットの一部として提供することができる。一つの実施態様において、グルカゴンアゴニストを、それを必要とする患者に投与するキットが提供され、ここでキットは、１）配列番号２０、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１の配列を含むグルカゴンペプチド；２）配列番号１１、配列番号２０または配列番号５５のグルカゴンアゴニスト類縁体と、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列とを含むグルカゴン融合ペプチド；ならびに３）配列番号１１または配列番号５１のペグ化グルカゴンペプチド、から成る群から選ばれる修飾グルカゴンペプチドを含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含み、ここで位置１７、２１または２４に共有結合しているＰＥＧ鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。一つの実施態様において、キットは、グルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストを含み、ここでペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８から成る群から選ばれる配列を含む。

【0265】

一つの実施態様において、キットは、患者にグルカゴン組成物を投与する装置、例えば、シリンジニードル、ペン型装置、ジェット式注射器または他の無針注射器を備える。キットは、代替的また追加的に、場合によりグルカゴンペプチドを凍結乾燥形態または水性液剤形態で含有してもよい一つ以上の容器、例えば、バイアル、チューブ、ボトル、単室または複室充填済シリンジ、カートリッジ、注入ポンプ（体外型または埋め込み型）、ジェット式注射器、充填済ペン型装置などを含むことができる。好ましくは、キットは使用説明書も含む。一つの実施態様によると、キットの装置は、エアゾール・ディスペンサーであり、ここで組成物はエアゾール・ディスペンサー内に予め包装されている。別の実施態様において、キットは、シリンジおよび針を含み、一つの実施態様において、滅菌グルカゴン組成物は、シリンジの中に予め包装されている。

【0266】

＜医薬製剤＞
一つの実施態様によると、医薬組成物が提供され、組成物は本開示のグルカゴンペプチドまたはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含む。医薬組成物は、例えば以下の様な、任意の薬学的に許容される成分を含むことができる：酸化剤、添加剤、吸着剤、エアゾール噴射剤、排気剤、アルキル化剤、凝結防止剤、抗凝固剤、抗菌性保存剤、酸化防止剤、消毒剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、被覆剤、着色剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、殺菌剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、色素、緩和剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、皮膜形成剤、風味強化剤、風味剤、流動性向上剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、芳香基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定剤、坐薬基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、粘度増加剤、吸水剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、又は、湿潤剤。

【0267】

幾つかの実施態様において、医薬組成物は、以下の構成成分のうちの任意の１つ又は組み合わせを含む：アカシア、アセスルファムカリウム、アセチルトリブチルシトレート、アセチルトリエチルシトレート、寒天、アルブミン、アルコール、無水アルコール、変性アルコール、希アルコール、アロイリチン酸、アルギニン酸、脂肪族ポリエステル、アルミナ、水酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、アミロペクチン、α−アミロース、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスパルテーム、注射用静菌性水、ベントナイト、ベントナイトマグマ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルパラベン、ブチルパラベンナトリウム、アルギン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、シクラミン酸カルシウム、無水第二リン酸カルシウム、脱水第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム半水和物、カノーラ油、カルボマー、二酸化炭素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β−カロテン、カラギーナン、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、カチオン性乳化ロウ、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、微晶質セルロース、粉末セルロース、ケイ化微晶質セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、セトステアリルアルコール、セトリミド、セチルアルコール、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、コレステロール、酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、クロロジフルオロエタン（ＨＣＦＣ）、クロロジフルオロメタン、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、クロロフェノキシエタノール、クロロキシレノール、コーンシロップ固形物、無水クエン酸、クエン酸一水和物、カカオ脂、着色剤、トウモロコシ油、綿実油、クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロスカメロースナトリウム、クロスポビドン、シクラミン酸、シクロデキストリン、デキストラン、デキストリン、デキストロース、デキストロース無水物、ジアゾリジニル尿素、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ジエタノールアミン、フタル酸ジエチル、ジフルオロエタン（ＨＦＣ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、Captisol（登録商標）のようなシクロデキストリン型化合物、ジメチルエーテル、フタル酸ジメチル、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、ドキュセートカルシウム、ドキュセートカリウム、ドキュセートナトリウム、没食子酸ドデシル、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸、エグルミン、エチルアルコール、エチルセルロース、没食子酸エチル、ラウリン酸エチル、エチルマルトール、オレイン酸エチル、エチルパラビン、エチルパラベンカリウム、エチルパラベンナトリウム、エチルバニリン、フルクトース、フルクトース液、粉砕フルクトース、発熱物質無含有フルクトース、粉末フルクトース、フマル酸、ゼラチン、グリコール、液状グルコース、飽和植物性脂肪酸のグリセリド混合物、グリセリン、ベヘン酸グリセリル、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、自己乳化グリセリルモノステアレート、グリセリルパルミトステアレート、グリシン、グリコール、グリコフロール、グアーガム、ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、高級フルクトースシロップ、ヒト血清アルブミン、炭化水素（ＨＣ）、希塩酸、ＩＩ型硬化植物油、ヒドロキシエチルセルロース、２−ヒドロキエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、イミド尿素、インジゴカルミン、イオン交換体、酸化鉄、イソプロピルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、等張食塩水、カオリン、乳酸、ラクチトール、ラクトース、ラノリン、ラノリンアルコール、脱水ラノリン、レクチン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、炭酸マグネシウム、規定炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム無水物、炭酸マグネシウム水酸化物、水酸化マグネシウム、ラウリル硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム無水物、リンゴ酸、モルト、マルチトール、マルチトール溶液、マルトデキストリン、マルトール、マルトース、マンニトール、中鎖トリグリセリド、メグルミン、メントール、メチルセルロース、メタクリル酸メチル、オレイン酸メチル、メチルパラベン、メチルパラベンカリウム、メチルパラベンナトリウム、微晶質セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、鉱油、軽鉱油、鉱油及びラノリンアルコール、油、オリーブ油、モノエタノールアミン、モンモリロナイト、没食子酸オクチル、オレイン酸、パルミチン酸、パラフィン、ヤシ油、ペトロラクタム、ペトロラクタム及びラノリンアルコール、製剤釉薬、フェール、液状フェノール、フェノキシエタノール、フェノキシプロパノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、ポラクリリン、ポラクリリンカリウム、ポロキサマー、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリレート、ポリエチレン−ポリプロピレンブロックポリマー、ポリメタクリレート、ポリエチレンアルキルエーテル、ポリエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリエチレンステアレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸カリウム、安息香酸カリウム、重炭酸カリウム、重亜硫酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カリウム無水物、リン酸水素カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、プロピオン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ポビドン、プロパノール、プロピオン酸、プロピレンカーボネート、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、没食子酸プロピル、プロピルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、硫酸プロタミン、ナタネ油、リンゲル液、サッカリン、サッカリンアンモニウム、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ベニバナ油、サポナイト、血清タンパク質、ゴマ油、コロイドシリカ、コロイド二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、無水クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム脱水物、塩化ナトリウム、シクラミン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、硫酸ドデシルナトリウム、硫酸ラウリルナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、無水第三リン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンエステル（ソルビタン脂肪エステル）、ソルビトール、７０％ソルビトール溶液、ダイズ油、クジラロウ、デンプン、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルファ化デンプン、滅菌トウモロコシデンプン、ステアリン酸、精製ステアリン酸、ステアリルアルコール、スクロース、糖、圧縮性糖、粉糖、糖球体、転化糖、Sugartab、スーパーイエローＦＣＦ、合成パラフィン、タルク、酒石酸、タルトラジン、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ）、カカオ脂、チメロサール、二酸化チタン、アルファトコフェロール、酢酸トコフェリル、アルファトコフェリル酸スクシネート、ベータ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、トラガカント、トリアセチン、クエン酸トリブチル、トリエタノールアミン、クエン酸トリエチル、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド、トリス緩衝液、エデト酸三ナトリウム、バニリン、Ｉ型硬化植物油、水、軟水、硬水、二酸化炭素無含有水、発熱物質無含有水、注射用水、吸入用滅菌水、注射用滅菌水、潅注用滅菌水、ロウ、アニオン性乳化ロウ、カルナウバロウ、カチオン性乳化ロウ、セチルエステルロウ、微晶質ロウ、非イオン性乳化ロウ、坐剤用ロウ、白ロウ、黄ロウ、白色ペトロラクタム、羊毛脂、キサンタンガム、キシリトール、ゼイン、プロピオン酸亜鉛、亜鉛塩、ステアリン酸亜鉛、又は、Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000）（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）における任意の賦形剤。Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980）（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）は、薬学的に許容される組成物の配合に使用される多様な構成成分及びそれらを調製する既知の技術を開示する。従来の作用物質のいずれについても、医薬組成物と不適合である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が考慮される。補助活性成分を組成物に組み込むこともできる。

【0268】

本明細書に開示されている医薬製剤は、下記に記載されているように、短期作用、迅速放出、長期作用、又は持続的放出であるように設計することができる。医薬製剤を即時放出、制御放出、又は徐放性放出用として配合することもできる。本組成物は、更に、保存性及び／又は送達効果の延長をもたらすために、例えばミセル若しくはリポソーム、又は他の封入形態を含んでもよいし、或いは延長放出形態で投与してもよい。開示されている医薬製剤を、任意のレジメンに従って、例えば毎日（１日あたり１回、１日あたり２回、１日あたり３回、１日あたり４回、１日あたり５回、１日あたり６回）、２日毎に１回、３日毎に１回、４日毎に１回、５日毎に１回、６日毎に１回、毎週、隔週、３週間毎に１回、毎月、又は隔月に、投与することができる。

【0269】

幾つかの実施態様において、前述の構成成分は、任意の濃度、例えば少なくともＡの濃度、で医薬組成物に含まれてもよく、ここでＡは、０．０００１％w/v、０．００１％w/v、０．０１％w/v、０．１％w/v、１％w/v、２％w/v、５％w/v、１０％w/v、２０％w/v、３０％w/v、４０％w/v、５０％w/v、６０％w/v、７０％w/v、８０％w/v、又は９０％w/vである。幾つかの実施態様において、前述の構成成分は、任意の濃度、例えば最大でＢの濃度、で医薬組成物に含まれてもよく、ここでＢは、９０％w/v、８０％w/v、７０％w/v、６０％w/v、５０％w/v、４０％w/v、３０％w/v、２０％w/v、１０％w/v、５％w/v、２％w/v、１％w/v、０．１％w/v、０．０１％w/v、０．００１％w/v、又は０．０００１％である。他の実施態様において、前述の構成成分は、例えば約Ａから約Ｂのような、任意の濃度範囲で医薬組成物に含まれることができる。幾つかの実施態様において、Ａは０．０００１％であり、Ｂは９０％である。

【0270】

医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するように配合することができる。幾つかの実施態様において、医薬組成物のｐＨは、製剤又は投与経路に応じて、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも６、少なくとも６．５、少なくとも７、少なくとも７．５、少なくとも８、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０、又は少なくとも１０．５からｐＨ１１以下であることができる。特定の実施態様において、医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するために、１つ以上の緩衝剤を含むことができる。緩衝剤には、所望のｐＨで緩衝することができる任意の化合物、例えば、リン酸緩衝液（例えばＰＢＳ）、トリエタノール、トリス、ビシン、ＴＡＰＳ、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、ＭＥＳ、及びその他、が含まれていてもよい。特定の実施態様において、緩衝液の強度は、少なくとも０．５mM、少なくとも１mM、少なくとも５mM、少なくとも１０mM、少なくとも２０mM、少なくとも３０mM、少なくとも４０mM、少なくとも５０mM、少なくとも６０mM、少なくとも７０mM、少なくとも８０mM、少なくとも９０mM、少なくとも１００mM、少なくとも１２０mM、少なくとも１５０mM、又は少なくとも２００mMである。幾つかの実施態様において、緩衝液の強度は、３００mM以下（例えば、最大で２００mM、最大で１００mM、最大で９０mM、最大で８０mM、最大７０mM、最大で６０mM、最大で５０mM、最大で４０mM、最大で３０mM、最大で２０mM、最大で１０mM、最大で５mM、最大で１mM）である。

【0271】

＜位置３の修飾＞
本明細書に記載されているグルカゴン類縁体、グルカゴンアゴニスト類縁体、グルカゴンコアゴニストおよびグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子を含むグルカゴンペプチドのいずれかを、位置３に修飾を含有する、例えばＧｌｕで置換されたＧｌｎを含有するように修飾して、グルカゴン受容体に対する選択性と比較して、ＧＬＰ−１受容体に対して高い選択性、例えば１０倍の選択性を有するペプチドを産生することができる。

【0272】

明細書に記載されているグルカゴン類縁体、グルカゴンアゴニスト類縁体、グルカゴンコアゴニストおよびグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子を含むグルカゴンペプチドのいずれかを、グルカゴン受容体に対する活性を実質的に失うことなく、幾つかの場合にでは、グルカゴン受容体活性の増強を伴って、位置３に修飾を含有する、例えばグルタミン類縁体（例えば、Ｄａｂ（Ａｃ））で置換されたＧｌｎを含有するように修飾することができる。

【0273】

＜調製方法＞
本発明の化合物は、標準的な合成法、組み換えＤＮＡ技術、または、他の、任意のペプチドおよび融合タンパク調製法によって調製してよい。ある種の非天然アミノ酸は、標準的組み換えＤＮＡ技術では発現させることはできないものの、その調製のための技術は当該技術分野において公知である。非ペプチド部分を包含するような本発明の化合物は、適用可能な場合は、標準的ペプチド化学反応に加えて、標準的有機化学反応を用いて合成してもよい。

【0274】

〔実施例〕
一般的合成プロトコール：
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430 Aペプチド合成機により、０．２mmolのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から出発し、ＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ Ｂｏｃ」単一カップリングを使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸及びＨＢＴＵは、Midwest Biotech（Fishers, IN）から得た。使用した側鎖保護基は、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）及びＴｒｐ（ＣＨＯ）であった。Ｎ末端Ｈｉｓの側鎖保護基はＢｏｃであった。

【0275】

合成の完了したそれぞれのペプチジル樹脂を、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンの溶液で処理して、トリプトファンからホルミル基を除去した。液体フッ化水素切断を、ｐ−クレゾール及びジメチルスルフィドの存在下で実施した。切断は、ＨＦ装置（Penninsula Labs）を使用して氷浴で１時間実施した。ＨＦを蒸発させた後、残渣をジエチルエーテルに懸濁し、固体物質を濾過した。ペプチドをそれぞれ３０〜７０mlの酢酸水溶液に抽出し、希釈したアリコートをＨＰＬＣ〔Beckman System Gold、０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル、１０分間かけて１０％から８０％Ｂの勾配〕により分析した。

【0276】

精製を２．２×２５cmのKromasil C18カラムのＦＰＬＣにより実施し、その間、２１４nmのＵＶでモニタリングし、５分毎の画分を収集した。均質画分をまとめ、凍結乾燥して、生成物純度＞９５％を得た。正確な分子量及び純度は、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を使用して確認した。

【0277】

一般的ペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、グルカゴンＣｙｓ類縁体をリン酸緩衝食塩水（５〜１０mg/ml）に溶解し、０．０１Mエチレンジアミン四酢酸を加える（総容量の１０〜１５％）。過剰（２倍）マレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Nektar）を加え、反応を室温で撹拌し、その間、ＨＰＬＣで反応進行をモニタリングする。８〜２４時間後、反応混合物を酸性化し、精製のために、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化類縁体を得た。

【0278】

＜実施例１＞
グルカゴンＣｙｓ^１７（１−２９）及び同様のモノＣｙｓ類縁体の合成
６０mlの反応容器中の０．２mmolのBoc Thr(OBzl) Pam樹脂（SynChem Inc）及び以下の配列を改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＣＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号３５）
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mlの液体フッ化水素を圧入した。反応を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を少量の切断抽出物試料により実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia ＦＰＬＣシステムを使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。

【0279】

最高純度の生成物を含有する画分（４８−５２）をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、３０．１mgを得た。生成物のＨＰＬＣ分析は、＞９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の質量の３４２９．７を示した。グルカゴンＣｙｓ^２１、グルカゴンＣｙｓ^２４及びグルカゴンＣｙｓ^２９を同様に調製した。

【0280】

＜実施例２＞
グルカゴン−Ｃｅｘ及び他のＣ末端延長部類縁体の合成
２８５mg（０．２mmol）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を６０mlの反応容器に入れ、以下の配列を改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mlの液体フッ化水素を圧入した。反応物を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を切断抽出物のアリコートにより実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia ＦＰＬＣシステムを溶出に使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。画分５８〜６５をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、１９８．１mgを得た。

【0281】

生成物のＨＰＬＣ分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＤＩ質量スペクトル分析は、Ｃ末端アミドとして、所望の理論質量の４３１６．７を有する生成物の存在を示した。オキシントモジュリン及びオキシントモジュリン−ＫＲＮＲを、適切な装填ＰＡＭ樹脂から出発して、Ｃ末端カルボン酸として同様に調製した。

【0282】

＜実施例３＞
グルカゴンＣｙｓ^１７Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
１５．１mgのグルカゴンＣｙｓ^１７（１−２９）及び２７．３mgの平均分子量５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド（ｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００、Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応物を室温で撹拌し、反応の進行をＨＰＬＣ分析〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によりモニターした。

【0283】

５時間後、反応混合物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆送カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia ＦＰＬＣにより実施し、その間、２１４nmのＵＶ波長でモニタリングし、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、２５．９mgを得た。

【0284】

この生成物をＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕により分析し、およそ９０％の純度を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９５００の（ＰＥＧ誘導体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４２９）へのおよそ５，０００amuの追加を示す。

【0285】

＜実施例４＞
グルカゴンＣｙｓ^２１Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２１．６mgのグルカゴンＣｙｓ^２１（１−２９）及び２４mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応物を室温で撹拌した。２時間後、更なる１２．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。８時間後、反応混合物を２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を４ml／分のPharmacia ＦＰＬＣにより実施し、その間、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。勾配＝４５０分間かけて２０％から８０％Ｂ。

【0286】

生成物の出現に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、３４mgを得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によるこの生成物の分析は、出発グルカゴンペプチドと異なる均質な生成物を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９７００の（ＰＥＧ類縁体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４７０）へのおよそ５，０００amuの追加を示す。

【0287】

＜実施例５＞
グルカゴンＣｙｓ^２４Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．１mgのグルカゴンＣ^２４（１−２９）及び３９．５mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。反応物を室温で７時間撹拌し、次に更なる４０mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。およそ１５時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia ＦＰＬＣを使用して実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、４５．８mgを得た。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、最大値が９１７５．２のＰＥＧに典型的な幅広いシグナルを示し、これはグルカゴンＣ^２４（３４５７．８）よりもおよそ５，０００amu多い。

【0288】

＜実施例６＞
グルカゴンＣｙｓ^２４Ｍａｌ−ＰＥＧ−２０Ｋ
２５．７mgのグルカゴンＣ^２４（１−２９）及び４０．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋ（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら室温で溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。６時間後、出発物質と生成物の比率は、ＨＰＬＣにより決定すると、およそ６０：４０であった。更なる２５．１mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋを加え、反応物を更に１６時間撹拌した。生成物比率が有意に改善されなかったので、反応混合物を、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、４５０分かけて３０％Ｂから１００％Ｂへの勾配を使用するPharmacia ＦＰＬＣにより精製した。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、流量＝４ml／分、５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。均質な生成物を含有する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、２５．７mgを得た。分析ＨＰＬＣにより決定された純度は約９０％であった。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、２３，０００〜２７，０００の幅広のピークを示し、これは出発グルカゴンＣ^２４（３４５７．８）よりもおよそ２０，０００amu多い。

【0289】

＜実施例７＞
グルカゴンＣｙｓ^２９Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．０mgのグルカゴンＣｙｓ^２９（１−２９）及び２４．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら室温で溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。４時間後、更なる１５．６mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えて、反応の完了を促進した。８時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia ＦＰＬＣシステムにより実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７５−９７を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、ＨＰＬＣにより回収された出発物質（画分５８−６３）と異なる、４０．０mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によるこの生成物の分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、８，０００〜１０，０００（最大９０２５．３）の範囲の質量を有するＰＥＧ成分の存在を示し、これは出発物質（３４８４．８）よりも５，５４０amu多い。

【0290】

＜実施例８＞
グルカゴンＣｙｓ^２４（２−ブチロラクトン）
２４．７mgのグルカゴンＣｙｓ^２４（１−２９）に、４mlの０．０５M重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリル及び５．５ulの２−ブロモ−４−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトンの溶液（アセトニトリル９００ul中１００ul）を加えた。室温で３時間撹拌した後、更なる１０５ulのラクトン溶液を反応混合物に加え、更に１５時間撹拌した。反応混合物を、１０％酢酸水溶液で１０mlに希釈し、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配（４５０分かけて２０％Ｂから８０％Ｂ）をPharmacia ＦＰＬＣにより実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝４ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７４−７７を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、７．５mgを得た。ＨＰＬＣ分析は、９５％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、３５４０．７の質量又は出発物質よりも８４質量単位多い質量を示した。この結果は、単一ブチロラクトン部分の付加と一致している。

【0291】

＜実施例９＞
グルカゴンＣｙｓ^２４（Ｓ−カルボキシメチル）
１８．１mgのグルカゴンＣｙｓ^２４（１−２９）を、９．４mlの０．１Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．２）に溶解し、０．６mlのブロモ酢酸溶液（アセトニトリル中１．３mg/ml）を加えた。反応を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣにより追跡した。１時間後、更なる０．１mlのブロモ酢酸溶液を加えた。反応を更に６０分間撹拌し、酢酸水溶液で酸性化し、精製のために２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia ＦＰＬＣ（流量＝４ml／分）により実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分２６−２９を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、数mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の生成物の質量３５１５を確認した。

【化9】

【0292】

＜実施例１０＞
グルカゴンＣｙｓ^２４マレイミド，ＰＥＧ−３．４Ｋ−二量体
１６mgのグルカゴンＣｙｓ^２４及び１．０２mgのＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−３４００、平均分子量３４００のポリ（エチレングリコール）−ビス−マレイミド（Nektar Therpeutics）を、３．５ のリン酸緩衝食塩水及び０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡに溶解し、反応を室温で撹拌した。１６時間後、更なる１６mgのグルカゴンＣｙｓ^２４を加え、撹拌を続けた。およそ４０時間後、反応混合物をPharmcia PepRPC 16/10カラムに装填し、アセトニトリル勾配をPharmacia ＦＰＬＣにより実施し、その間、２分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝２ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分６９−７４を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、１０．４mgを得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、９５００〜１１，０００の範囲の成分を示し、これは所望の二量体と一致する。

【化10】

【0293】

＜実施例１１＞
グルカゴンラムタムの合成
２８５ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を６０ｍＬの反応容器に入れ、以下の配列を、Ｂｏｃ ＤＥＰＢＴ活性化単一結合を使用する改良Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成機により構築した。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−ＮＨ２（１２−１６ラクタム；配列番号１２）

【0294】

以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯＦｍ）、Ｈｉｓ（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。ラクタムが１６−２０、２０−２４または２４−２８から構成された場合、Ｌｙｘ（Ｃｌ−Ｚ）を位置１２で使用した。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドにより回転させながら１時間処理して、Ｔｒｐホルミル基を、ならびにＬｙｓ１２およびＧｌｕ１６からＦｍｏｃおよびＯＦｍ保護を除去した。陽性ニンヒドリン試験により除去を確認してから、樹脂をジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタン、次に再びジメチルホルムアミドで洗浄した。樹脂を、ジメチルホルムアミドおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）の５２０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）で処理した。反応は８〜１０時間進行し、環化は、陰性ニンヒドリン試験により確認した。樹脂を、ジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタンで洗浄し、その後トリフルオロ酢酸で１０分間処理した。Ｂｏｃ基の除去は、陽性ニンヒドリン反応より確認した。樹脂を、ジメチルホルムアミドおよびジクロロメタンで洗浄し、フッ化水素酸（ＨＦ）反応容器に移す前に乾燥した。５００μＬのｐ−クレゾールを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０ｍＬの液体フッ化水素を容器の中に圧入した。反応を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを真空下で除去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを１５０ｍＬの２０％アセトニトリル／１％酢酸に溶解した。

【0295】

粗溶解ペプチドの分析ＨＰＬＣによる分析を次の条件〔０．４６×３０ｍｍのＸｔｅｒｒａ Ｃ８、１．５０ｍＬ／分、２２０ｎｍ、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１００％ＡＣＮ、１５分間かけて５〜９５％Ｂの勾配〕で実施した。抽出物を水で２倍に希釈し、２．２×２５ｃｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ４分取逆相カラムに装填し、ＷａｔｅｒｓＨＰＬＣ系（Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮおよび流量１５．００ｍｌ／分で１２０分間かけて０〜１００％Ｂの勾配）によりアセトニトリル勾配を使用して溶出した。精製ペプチドのＨＰＬＣ分析は、９５％を超える純度を示し、エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析は、１２−１６ラクタムで３５０６Ｄａの質量を確認した。１６−２０、２０−２４および２４−２８のラクタムを同様に調製した。

【0296】

＜実施例１２＞
グルカゴン溶解性アッセイ：
グルカゴン（又は類縁体）の溶液（１mg/ml又は３mg/ml）を０．０１NのＨＣｌで調製する。１００ulの原液を、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度（２７６nm）を決定する。残りの原液のｐＨを、２００〜２５０ulの０．１M Ｎａ_２ＨＯＰ_４（ｐＨ９．２）を使用して、ｐＨ７に調整する。溶液を４℃で一晩放置し、次に遠心分離する。次に１００ulの上澄みを、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度を決定する（２回繰り返す）。

【0297】

初期吸光度の読み取りを容量の増加で補正し、以下の計算を使用して、溶解百分率を確立する。
最終吸光度／初期吸光度×１００＝％溶解
結果を表１に示し、表中、グルカゴン−Ｃｅｘは、野生型グルカゴン（配列番号１）に配列番号２６のカルボキシ末端を付加したものを表し、グルカゴン−Ｃｅｘ Ｒ^１２は、配列番号３９を表す。

【0298】

【表1】

【0299】

＜実施例１３＞
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体へのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競争結合アッセイにより測定した。シンチレーション近接アッセイ緩衝液（０．０５Mのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５MのＮａＣｌ、０．１％w/vのウシ血清アルブミン）により作製したペプチドの一連の３倍希釈を、９６ウエル白色／透明底プレート（Corning Inc., Acton, MA）において、０．０５nMの（３−〔^１２５Ｉ〕−ヨードチロシル）Ｔｙｒ１０グルカゴン（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）、１ウエルあたり１〜６マイクログラムの、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現している細胞から調製した原形質膜画分及び１mg／ウエルのポリエチレンイミン処理ムギ胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）と混合した。ロータリー振とう器により８００rpmで５分間振とうしてから、プレートを室温で１２時間インキュベートし、次にMicroBeta1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で読み取った。非特異的結合（ＮＳＢ）放射能を試験試料の最高濃度よりも４倍高い濃度の「非放射性」天然リガンドを有するウエルで測定し、総結合放射能を、競合物質を有さないウエルで検出した。特異的結合の率を以下のように計算した：％特異的結合率＝（（結合−ＮＳＢ）／（総結合−ＮＳＢ））×１００。ＩＣ_５０値は、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して決定した。

【0300】

＜実施例１４＞
機能アッセイ−ｃＡＭＰ合成
ｃＡＭＰを誘導するグルカゴン類縁体の能力を、ホタルルシフェラーゼに基づいたレポーターアッセイにより測定した。グルカゴン受容体又はＧＬＰ−１受容体のいずれかと、ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞から、０．２５％ウシ増殖血清（HyClone, Logan, UT）が補充されたＤＭＥＭ（Invitrogen, Carlsbad, CA）における１６時間の培養により血清を取り除き、次にグルカゴン、ＧＬＰ−１又は新規グルカゴン類縁体のいずれかによる一連の希釈と共に、９６ウエルポリ−Ｄ−リシン被覆「バイオコート」プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）において３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、１００マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）を各ウエルに加えた。プレートを短時間振とうし、暗黒で１０分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。有効５０％濃度を、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して計算した。結果を、図３〜９及び表２〜１０に示す。

【0301】

【表2】

【0302】

【表3】

【0303】

【表4】

【0304】

【表5】

【0305】

【表6】

【0306】

【表7】

【0307】

【表8】

Ｅ１６ＧｌｕｃＮＨ_２は、Ｇ１６−ＣＯＯＨ及びＴ１６ＧｌｕｃＮＨ_２と比べて、平行して試験した場合には４倍のグルカゴン受容体に対する効力を有していた。

【0308】

【表9】

【0309】

【表10】

【0310】

＜実施例１５＞
グルカゴンＣｙｓ−マレイミドＰＥＧ類縁体の安定性アッセイ
各グルカゴン類縁体を水又はＰＢＳに溶解し、初期ＨＰＬＣ分析を実施した。ｐＨを調整した後（４、５、６、７）、試料を３７℃で特定の時間インキュベートし、ＨＰＬＣにより再び分析して、ペプチドの完全性を決定した。特定の目的のペプチドの濃度を決定し、無傷のまま残っている率を初期分析と比較して計算した。グルカゴンＣｙｓ^２１−マレイミドＰＥＧ_５Ｋの結果を図１及び２に示す。

【0311】

＜実施例１６＞
以下のグルカゴンペプチドを、全体として前述の実施例１〜１１に記載されている通りに構築した：
以下の配列の全てにおいて、「ａ」はＣ末端アミドを意味する。
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号７０）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号７１）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号７２）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号７３）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号７４）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号７５）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号７６）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号７７）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号７８）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号７９）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号８０）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号８１）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号８２）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号８３）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号８４）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号８５）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号８６）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号８７）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号８８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号８９）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号９０）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号９１）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号９２）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号９３）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号９４）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号９５）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号９６）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号９７）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号９８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号９９）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１００）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号１０１）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１０２）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１０３）
上記配列において、Ｘ１＝（Ｄｅｓ−アミノ）Ｈｉｓ。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１０４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１０５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１０６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１０７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１０８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１０９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１１０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１１１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１１２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１１３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１１４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１１５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１１６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１１７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号１１８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１１９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１２０）
上記配列において、Ｘ２＝アミノイソブチル酸。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１２１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１２２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１２３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１２４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１２５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１２６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１２７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１２８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１２９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１３０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１３１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１３２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１３３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１３４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号１３５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１３６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１３７）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）。
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１３８）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１３９）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１４０）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１４１）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１４２）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１４３）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１４４）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１４５）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１４６）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１４７）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１４８）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１４９）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１５０）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１５１）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号１５２）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１５３）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１５４）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１５５）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬｌＶＩＮＴａ（配列番号１５６）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１５７）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１５８）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１５９）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１６０）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１６１）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１６２）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１６３）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１６４）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１６５）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１６６）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１６７）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１６８）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号１６９）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１７０）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１７１）
上記配列において、Ｘ１＝（Ｄｅｓ−アミノ）Ｈｉｓ。
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１７２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１７３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１７４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１７５）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１７６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１７７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号 １７８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１７９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１８０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１８１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１８２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１８３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１８４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１８５）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号１８６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１８７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１８８）
上記配列において、Ｘ２＝アミノイソブチル酸。
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１８９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１９０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１９１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１９２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１９３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１９４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号１９５）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１９６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１９７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号１９８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号１９９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号２００）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２０１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２０２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号２０３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２０４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２０５）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）。
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２０６）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２０７）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２０８）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２０９）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２１０）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２１１）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２１２）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２１３）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２１４）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２１５）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２１６）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２１７）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２１８）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２１９）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（配列番号２２０）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２２１）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２２２）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２２３）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２２４）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２２５）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２２６）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２２７）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２２８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２２９）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２３０）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２３１）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２３２）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２３３）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２３４）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２３５）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＴＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２３６）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（配列番号２３７）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２３８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２３９）
上記配列において、Ｘ１＝（Ｄｅｓ−アミノ）Ｈｉｓであり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２４０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２４１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２４２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２４３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２４４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２４５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２４６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２４７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２４８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２４９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２５０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２５１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２５２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２５３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（配列番号２５４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２５５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２５６）
上記配列において、Ｘ２＝アミノイソブチル酸であり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２５７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２５８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２５９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２６０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２６１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２６２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２６３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２６４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２６５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２６６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２６７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２６８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２６９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２７０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（配列番号２７１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２７２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２７３）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２７４）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２７５）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２７６）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２７７）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２７８）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２７９）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２８０）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２８１）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２８２）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２８３）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２８４）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２８５）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２８６）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２８７）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（配列番号２８８）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２８９）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２９０）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２９１）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２９２）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２９３）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２９４）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２９５）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２９６）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号２９７）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号２９８）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号２９９）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３００）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３０１）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３０２）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３０３）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＴＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３０４）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（配列番号３０５）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３０６）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＴＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３０７）
上記配列において、Ｘ１＝（Ｄｅｓ−アミノ）Ｈｉｓであり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３０８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３０９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３１０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３１１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３１２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３１３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３１４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３１５）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３１６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３１７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３１８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３１９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３２０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３２１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（配列番号３２２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３２３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３２４）
上記配列において、Ｘ２＝アミノイソブチル酸であり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３２５）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３２６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３２７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３２８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３２９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３３０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３３１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３３２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３３３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３３４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３３５）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号３３６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３３７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３３８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（配列番号３３９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３４０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＴＣ＊Ｗ ＬＶＫＧａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号 ３４１）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３４２）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３４３）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３４４）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号３４５）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３４６）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３４７）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３４８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号３４９）
上記配列において、Ｘ１＝（Ｄｅｓ−アミノ）Ｈｉｓであり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３５０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３５１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３５２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号３５３）
上記配列において、Ｘ２＝アミノイソブチル酸であり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３５４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３５５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３５６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号３５７）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３５８）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３５９）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３６０）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号３６１）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３６２）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３６３）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３６４）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号３６５）
上記配列において、Ｘ１＝（Ｄｅｓ−アミノ）Ｈｉｓであり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３６６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３６７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３６８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号３６９）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３７０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３７１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＴａ（配列番号３７２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ Ｃ＊ＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＶＫＧａ（配列番号３７３）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり；Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号３７４）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号３７５）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３７６）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３７７）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３７８）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３７９）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号３８０）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３８１）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３８２）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３８３）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３８４）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（配列番号 ３８５）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３８６）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３８７）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号３８８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号３８９）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３９０）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３９１）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３９２）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３９３）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号３９４）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３９５）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３９６）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号３９７）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号３９８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（配列番号３９９）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４００）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４０１）
上記配列において、Ｘ１＝（Ｄｅｓ−アミノ）Ｈｉｓ。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４０２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４０３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４０４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４０５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４０６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４０７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４０８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４０９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４１０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４１１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４１２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４１３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４１４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４１５）
上記配列において、Ｘ２＝アミノイソブチル酸。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４１６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４１７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４１８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４１９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４２０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４２１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４２２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４２３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４２４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４２５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４２６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４２７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４２８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４２９）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）。
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４３０）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４３１）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４３２）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４３３）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４３４）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４３５）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４３６）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４３７）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４３８）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４３９）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４４０）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４４１）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＨＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４４２）
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４４３）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４４４）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４４５）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４４６）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４４７）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４４８）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４４９）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４５０）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４５１）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４５２）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４５３）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４５４）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４５５）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４５６）
Ｘ１ＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号 ４５７）
上記配列において、Ｘ１＝（Ｄｅｓ−アミノ）Ｈｉｓ。
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４５８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４５９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４６０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４６１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号 ４６２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号 ４６３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号 ４６４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４６５）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号 ４６６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４６７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４６８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４６９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４７０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４７１）
上記配列において、Ｘ２＝アミノイソブチル酸。
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４７２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４７３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４７４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４７５）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４７６）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＲＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４７７）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４７８）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４７９）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４８０）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４８１）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＫＲＡＡＥ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４８２）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（配列番号４８３）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１２−１６；配列番号４８４）
ＨＸ２ＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＤＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４８５）
上記配列において、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）。

【0312】

さらに、ＧＬＰ−１／グルカゴン活性比が約５またはそれ以上を持つ、下記のグルカゴンペプチドも、全体として前述の実施例１〜１１に記載の通りに構築した。一般に、これらのペプチドでは、位置２のＡＩＢは、ＤＰＰ ＩＶ耐性を与えるばかりでなく、グルカゴン活性も著明に下げる。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＴＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号４８６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＣ＊ａ（配列番号４８７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（配列番号 ４８８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４８９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（配列番号４９０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４９１）
上記配列において、Ｘ２＝ＡＩＢであり、Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号４９２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＣ＊ａ（配列番号４９３）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（配列番号４９４）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号 ４９５）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（配列番号４９６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＡＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号４９７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号４９８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＣ＊ａ（配列番号４９９）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（配列番号５００）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５０１）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（配列番号５０２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５０３）
上記配列において、Ｘ２＝ＡＩＢであり、Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。

【0313】

さらに、ＧＬＰ−１／グルカゴンコアゴニストである、下記のグルカゴンペプチドを、全体として前述の実施例１〜１１に記載の通りに構築した。アミノ酸１６および２０の間のラクタム架橋形成は、位置２の置換によってもたらされるグルカゴン活性の低下を回復する。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５０４）
上記配列において、Ｘ２＝ＡＩＢであり、Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５０５）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＣ＊ａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５０６）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５０７）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５０８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５０９）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５１０）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５１１）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＣ＊ａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５１２）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５１３）
上記配列において、Ｘ１＝ＤＭＩＡ（アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸）であり、Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（必要に応じてラクタム＠１６−２０；配列番号５１４）
上記配列において、Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５１７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（ラクタム＠１６−２０；配列番号５２８）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＥＦＩＣ^＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊ａ（配列番号５３１ ）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＣ＊Ｃ＊ａ（配列番号５３２）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（配列番号５３３）
上記配列において、Ｘ２＝ＡＩＢであり、Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号５１８）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号５１９）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＭＮＣ＊ａ（配列番号５２０）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳａ（配列番号５２９）
Ｘ１ＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＣ＊Ｗ ＬＭＮＴａ（配列番号５３０）
上記配列において、Ｘ１＝ＤＭＩＡ（アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸）であり、Ｃ＊はＣｙｓであるか、または親水ポリマーに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約２０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓであるか、またはそれとは別に、Ｃ＊は、約４０ｋＤの平均重量を持つポリエチレングリコールに付着するＣｙｓである。
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＳＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳａ（配列番号５２１）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＳＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳａ（配列番号５２２）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＳＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳａ（配列番号５２３）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＳＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳａ（配列番号５２４）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＳＲＲＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳａ（配列番号５２５）
ＨＳＱＧＴ ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ ＥＲＲＡＫ ＤＦＶＱＷ ＬＭＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳａ（配列番号５２６）
ＨＡＥＧＴ ＦＴＳＤＶ ＳＳＹＬＥ ＧＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＶＫＧＧａ（配列番号５２７）
Ｘ１Ｘ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＲＸ５ＡＫ ＤＦＶＸ３Ｗ ＬＭＮＸ４（配列番号６１）
上記配列において、
Ｘ１＝Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、またはアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、または、イミダゾール酢酸、
Ｘ２＝Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリン、またはアミノイソブチル酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニン、Ｄ−アラニン、
Ｘ３＝Ａｌａ、Ｇｌｎ、またはＣｙｓ−ＰＥＧ、
Ｘ４＝Ｔｈｒ−ＣＯＮＨ２、またはＣｙｓ−ＰＥＧ、またはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５１５）、またはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）、
ただし、Ｘ３がＣｙｓ−ＰＥＧである場合、Ｘ４は、Ｃｙｓ−ＰＥＧ、またはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）ではなく、Ｘ２＝Ｓｅｒである場合、Ｘ１はＨｉｓではなく、
Ｘ５＝ＡｌａまたはＡｒｇ。
Ｘ１Ｘ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱ Ｘ５ＡＫ ＥＨ Ｘ３Ｗ ＬＭＮＸ４（配列番号６２）
上記配列において、
Ｘ１＝Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、またはアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸、
Ｘ２＝Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリン、またはアミノイソブチル酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニン、Ｄ−アラニン、
Ｘ３＝Ａｌａ、Ｇｌｎ、またはＣｙｓ−ＰＥＧ、
Ｘ４＝Ｔｈｒ−ＣＯＮＨ２、またはＣｙｓ−ＰＥＧ、またはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５１５）、またはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）、
ただし、Ｘ３がＣｙｓ−ＰＥＧである場合、Ｘ４は、Ｃｙｓ−ＰＥＧ、またはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）ではなく、Ｘ２＝Ｓｅｒである場合、Ｘ１はＨｉｓではなく、
Ｘ５＝ＡｌａまたはＡｒｇ。

【0314】

上記配列はいずれも、さらに他に修飾を含んでもよく、例えば、活性を破壊しない、１、２、３、４、または５個の修飾、例えば、ただしこれらに限定されないが、効力を強化するために使用することが可能なＷ１０、またはＲ２０置換を含んでもよい。さらに、上記配列はいずれも、ＤＰＰ ＩＶ耐性を付与する修飾無しで、すなわち、天然Ｈｉｓが位置１にあり、天然Ｓｅｒが位置２にある状態で生産することも可能である。さらに、上記の化合物はいずれも、例えば、異種ポリペプチド、免疫グロブリンまたはその一部（例えば、Ｆｃ領域）、標的剤、診断標識、または診断または治療剤に、必要に応じて連結させた、結合体としてもよい。

【0315】

＜実施例１７＞
グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に結合している配列番号２６のＣ末端延長部を含むように修飾された以下のグルカゴンペプチドを、全体として上記の実施例１〜１１に記載された通りに構築し、実施例１４に記載されたインビトロアッセイを使用して、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対する活性をアッセイした。

【0316】

表１１は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対する多様なグルカゴン類縁体の活性を表す。データは、配列番号２６のＣ末端延長部を含むグルカゴン類縁体では、位置１６、２０、２８および２９のアミノ酸置換がＧＬＰ−１受容体に対する類縁体の活性に影響を与える可能性を示す。

【0317】

【表11】

【0318】

＜実施例１８＞
表１２は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対する相対的活性を比較する、多様なグルカゴンペプチドについて蓄積されたインビトロのデータを表す。

【0319】

【表12】

【0320】

＜実施例１９＞
アシル化および／またはペグ化ペプチドを以下のように調製した。ペプチドは、ＣＳ Ｂｉｏ ４８８６ペプチド合成機またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成機のいずれかを使用して、固体支持樹脂上に合成した。Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)に記載されている現場中和化学を使用した。アシル化ペプチドでは、アシル化される標的アミノ酸残基（例えば、位置１０）をＮε−ＦＭＯＣリシン残基で置換した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンによる、合成の完了したＮ末端ＢＯＣ保護ペプチドの３０分間の処理によって、ＦＭＯＣ／ホルミル基を除去した。遊離ε−アミノＬｙｓ残基へのカップリングは、ＦＭＯＣ保護スペーサーアミノ基（例えば、ＦＭＯＣ−（Ｎ−ＢＯＣ）−トリプトファン−ＯＨ）またはアシル鎖（例えば、Ｃ１７−ＣＯＯＨ）のいずれかの１０倍モル過剰との、およびＤＭＦ／ＤＩＥＡ中のＰｙＢＯＰまたはＤＥＰＢＴカップリング試薬とのカップリングにより達成した。その後のスペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基の除去に続いて、アシル鎖とのカップリングを繰り返した。１００％ＴＦＡによる最終処理は、あらゆる側鎖保護基およびＮ末端ＢＯＣ基の除去をもたらした。ペプチド樹脂を、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和し、乾燥し、次にＨＦ／ｐ−クレゾールの９５：５を０℃で１時間使用して支持体から切断した。エーテル抽出の後、５％ＨＯＡｃ溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和した。次に溶液の試料を、正確な分子量のペプチドを含有しているかについてＥＳＩ−ＭＳにより確認した。正確なペプチドを、１００％ＣＨ３ＣＮ中の１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡから０．１％ＴＦＡの直線勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。Ｖｙｄａｃ Ｃ１８の２２ｍｍ×２５０ｍｍタンパク質カラムを精製に使用した。アシル化ペプチド類縁体は、一般に、緩衝液比の２０：８０で完全に溶出した。一部を一緒にプールし、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより純度を調べた。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得た。収量は、合成に応じて１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であった。

【0321】

ペプチドがアシル化されるラクタム架橋および標的残基を含む場合、アシル化は、ペプチド主鎖へのアミノ酸の付加の直後に、上記に記載されたとおりに実施される。

【0322】

ペプチドのペグ化では、４０ｋＤａのメトキシポリ（エチレングルコール）マレイミド−プロピオンアミド（Chirotech Technology Ltd.）を、ペプチドとＰＥＧの両方を溶解して透明な溶液にするのに必要な最小量の溶媒（一般に、２〜３ｍｇのペプチドを使用する反応において２ｍＬ未満）を使用して、７Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中のモル当量のペプチドと反応させた。室温での激しい撹拌を開始して４〜６時間行い、反応を分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ペグ化生成物は、出発物質とは別に、より短い保持時間で出現した。精製は、初期ペプチド精製に使用した条件と同じ条件のＶｙｄａｃ Ｃ４カラムにより実施した。溶出は、緩衝剤比が５０：５０のあたりで生じた。純粋なペグ化ペプチドの画分が見出され、凍結乾燥した。収率は、反応毎に異なるが、５０％超であった。

【0323】

ペプチドは、グルカゴン受容体（ＧＬＵＲ）またはＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）のいずれかと、ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とをＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入することにより、生物学的活性についてアッセイした。形質移入細胞から、０．２５％ウシ増殖血清が補充されたＤＭＥＭにおける１６時間の培養により血清を取り除き、次に、選択された類縁体および基準としてグルカゴンまたはＧＬＰ−１のいずれかのそれぞれによる一連の希釈と共に５時間インキュベートした。ペプチドの吸光度読み取りは、Ｇｅｎｅｓｙｓ ６ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Thermo Electron Corporation）により２８０ｎｍでＵＶ吸光度測定から得た。ベールの法則を使用して、それぞれの類縁体におけるトリプトファンおよびチロシン残基の数に基づいて溶液の濃度を計算した。インキュベーションの終了時に、１００μＬのＬｕｃＬｉｔｅルミネセンス基質試薬を各ウエルに加え、プレートを封止および振とうし、ｃＡＭＰ検出のために Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘルミネセンスカウンター内に挿入した。有効５０％濃度（ＥＣ５０）は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して計算した。

【0324】

アシル化グルカゴンに基づいたコアゴニストペプチドを調製した。これらのペプチドの選択についてのインビトロの結果を表１３に示す。非アシル化ペプチドは、天然グルカゴンと同様に、１ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝食塩溶液において不溶性であるが、アシル化は、中性ｐＨにおいてペプチドの溶解性を増強したことが観察された。

【0325】

【表13】

【0326】

４つのアシル化ペプチドは、全て、ＧＬＰ−１受容体に対して増加した効力を示した。トリプトファンスペーサーを含めることは、グルカゴン受容体に対してより良好な効力をもたらした。アシル鎖長さがＣ１８であることは、いくらか好ましい。

【0327】

アシル化は、ペプチドの半減期を１時間以上延長することができるが、数十のｋＤａ範囲の繰り返しを有するペグ化は、さらに延長することができる。両方の種類の修飾を含むペプチドを調製した。これらのペプチドは、延長された循環半減期、ならびにＤＰＰ−ＩＶおよび他のプロテアーゼに対する耐性を示すと予測される。これらのペプチドの選択についてのインビトロの結果を表１４に示す。

【0328】

【表14】

【0329】

３つのペプチドのうち２つは、ＧＬＰ−１とグルカゴンの両方の受容体に対して、高い効力を保持し、ＥＣ５０は１ｎＭ未満であった。Ｋ^１０−Ｗ−Ｃ_１８アシル化およびペグ化ペプチドは、両方の受容体に対して約１０倍の効力損失を示した。この一連のペプチドは、位置１０のアシル化が、グルカゴンペプチドのＣ末端部分、例えば位置２４、２８若しくは２９、Ｃ末端延長内、またはＣ末端における（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）ペグ化に匹敵することを示す。

【0330】

＜実施例２０＞
多様なアシル化グルカゴンコアゴニストペプチドを、実施例１９に実質的に記載された通りに作製し、インビボ活性について試験した。具体的には、ペプチドＡ（位置２にＡＩＢ、位置１６にＧｌｕ、位置１７にＧｌｎ、位置１８にＡｌａ、位置２０にＬｙｓ、位置２１にＧｌｕ、位置２３にＩｌｅ、位置２４にＣｙｓ（Ｃｙｓは４０Ｋ ＰＥＧに結合している）およびＣ末端アミドを含むように修飾された配列番号１）を、位置１０にＬｙｓを含むよう更に修飾した。Ｌｙｓ１０を、Ｃ８脂肪酸鎖、Ｃ１４脂肪酸鎖、Ｃ１６脂肪酸鎖またはＣ１８脂肪酸鎖でアシル化した。

【0331】

それぞれのアシル化ペプチドのＧＬＰ−１受容体に対する活性を実施例１４に記載された通りにアッセイし、対照のＧＬＰ−１（７−３７）酸（配列番号５０）の活性と比較した。表１５に示されているＧＬＰ−１受容体に対するそれぞれのアシル化ペプチドのＥＣ５０は、ＧＬＰ−１ペプチドのＥＣ５０と同様である。

【0332】

【表15】

【0333】

次にペプチドを、多様なアシル化および非アシル化ペプチドまたはビヒクルのみを食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスに週に一度（７０ｎｍｌ／ｋｇ／週）皮下注射することにより、インビボで試験した。初期体重４４ｇを有する、一群当たり６匹のマウスを試験した。体重、身体組成、食物摂取および血中グルコースレベルを周期的に決定した。

【0334】

図１１に示されているように、アシル化ペプチドは、非アシル化ペプチドと同等の程度に減量を引き起こすことができる。図１１に示されているように、約７〜１２％の減量が、アシル化ペプチドによる処置の最初の３日以内に達成される。図１２に示されているように、アシル化ペプチドは食物摂取の減少を引き起こした。更に、図１３に示されているように、アシル化ペプチドの適宜の血中グルコースレベルは、処置の１日後に低減した。

【0335】

＜実施例２１＞
以下のアシル化グルカゴンコアゴニストペプチドを、実施例１９に実質的に記載された通りに作製した。
（Ａ）「キメラ−２ Ａｉｂ２ Ｌｙｓ１０−Ｃ１８ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：以下の修飾：位置１６のＧｌｕ、位置１７のＧｌｎ、位置１８のＡｌａ、位置２０のＬｙｓ、位置２１のＧｌｕ、位置２３のＩｌｅおよび位置２４のＡｌａ、ならびにＣ末端アミド（「キメラ２」）、を含み、位置２のＡＩＢ、Ｃ１８脂肪酸でアシル化されているＬｙｓ１０および４０Ｋ ＰＥＧ基でペグ化されている位置２４のＣｙｓにより更に修飾されている、天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号１）；
（Ｂ）「キメラ−２ Ａｉｂ２ Ｌｙｓ１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：位置２のＡＩＢ、Ｃ１６脂肪酸でアシル化されているＬｙｓ１０および４０Ｋ ＰＥＧ基でペグ化されているＣｙｓ２４により更に修飾されているキメラ２；
（Ｃ）「グルカゴンＬｙｓ１０−Ｃ１８ Ｅ１６ Ｋ２０ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：以下の修飾：位置１６のＧｌｕ、位置２０のＬｙｓおよびＣ末端アミド、を含む天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号１）は（「Ｅ１６ Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２」）、Ｃ１８脂肪酸でアシル化されているＬｙｓ１０および４０Ｋ ＰＥＧ基でペグ化されているＣｙｓ２４により更に修飾された；
（Ｄ）「グルカゴンＬｙｓ１０−ＴｒｐＣ１６ Ｅ１６ Ｋ２０ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：Ｅ１６ Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２は、Ｃ１６脂肪酸でアシル化されているＴｒｐスペーサーに結合しているＬｙｓ１０により更に修飾された；
（Ｅ）「グルカゴンＬｙｓ１０−ＴｒｐＣ１８ Ｅ１６ Ｋ２０ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：Ｅ１６ Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２は、Ｃ１８脂肪酸でアシル化されているＴｒｐスペーサーに結合しているＬｙｓ１０により更に修飾された。

【0336】

アシル化グルカゴンコアゴニストペプチドを、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対する活性について、実施例１４に一般的に記載された通りに試験した。対照（ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（ＧＬＰ−１のアミノ酸７−３７）、グルカゴン（１−２９）ＯＨ（配列番号１）およびキメラ２ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）（Ｃｙｓ２４に４０Ｋ ＰＥＧを有するキメラ２））と比較した、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体それぞれに対するＥＣ５０を表１６に示す

【0337】

【表16】

【0338】

＜実施例２２＞
以下のアシル化グルカゴンコアゴニストペプチドを、実施例１９に実質的に記載された通りに作製した。
（Ａ）ペプチドＡ：以下の修飾：位置１６のＧｌｕ、位置２０のＬｙｓおよびＣ末端アミドを含む天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号１）（「Ｅ１６ Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２」）；
（Ｂ）ペプチドＢ：Ｃ１６脂肪酸でアシル化されているＬｙｓ１０を更に含むＥ１６ Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２：
（Ｃ）ペプチドＣ：Ｃ１８脂肪酸でアシル化されているＬｙｓ１０を更に含むＥ１６ Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２：
（Ｄ）ペプチドＤ：Ｃ１６脂肪酸でアシル化されているＧｌｕ（スペーサー残基）に結合しているＬｙｓ１０を更に含むＥ１６ Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２：
（Ｅ）ペプチドＥ：Ｃ１８脂肪酸でアシル化されているＴｒｐ（スペーサー残基）に結合しているＬｙｓ１０を更に含むＥ１６ Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２。

【0339】

ペプチドの活性を実施例１４に一般的に従ってアッセイし、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体それぞれに対するＥＣ５０を表１７に示す。

【0340】

【表17】

【0341】

＜実施例２３＞
以下の修飾：位置１６のＧｌｕ、位置１７のＧｌｎ、位置１８のＡｌａ、位置２０のＬｙｓ、位置２１のＧｌｕ、位置２３のＩｌｅ、位置２４のＡｌａ、位置２７のＶａｌ、位置２８のＬｙｓおよびＣ末端アミド、を有する配列番号１のアミノ酸（「キメラ１」）を含むグルカゴンコアゴニストペプチドを作製した。Ｃ末端切断型のキメラ１を、キメラ１の位置２９のアミノ酸の欠失により（「Ｃｈｉ１（１−２８）」）またはキメラ１の位置２８および２９の両方のアミノ酸の欠失により（「Ｃｈｉ１（１−２７）」）作製した。

【0342】

以下の修飾：位置１６のＧｌｕ、Ｃ末端アミド、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むグルカゴンペプチド（「Ｅ１６ Ｇｌｕ−ＮＨ２」）も、位置２９のアミノ酸の欠失により（「Ｅ１６ Ｇｌｕｃ ＮＨ２（１−２８）」）または位置２８および２９の両方のアミノ酸の欠失により（「Ｅ１６ Ｇｌｕｃ ＮＨ２（１−２７）」）Ｃ末端切断した。

【0343】

切断ペプチド、ならびに非切断ペプチドのグルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体に対する活性を、実施例１４に一般的に従って機能活性についてアッセイした。Ｅ１６ Ｇｌｕ ＮＨ２ペプチドまたはキメラ１ペプチドの位置２８および２９のアミノ酸の欠失は、グルカゴン受容体に対するペプチドの活性に有意に影響を与えなかった。Ｅ１６ Ｇｌｕ ＮＨ２ペプチドの位置２８および２９のアミノ酸の欠失は、ＧＬＰ−１受容体に対するペプチドの効力を感知できるほど変化しなかった。キメラ１の位置２８および２９のアミノ酸の欠失は、ＧＬＰ−１受容体に対する活性に影響を与えなかった。

【0344】

キメラ１ペプチドまたはＥ１６ Ｇｌｕｃ ＮＨ２ペプチドのいずれかにおける位置２９のアミノ酸の欠失は、グルカゴン受容体またはＧＬＰ−１受容体のいずれかに対する活性に有意に影響を与えなかった。

【0345】

＜実施例２４＞
食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスに、−１５分の時点で、下記のうちの一つの０．２、２、２０または７０ｎｍｏｌ／ｋｇを腹腔内に注射した：
（Ａ）ビヒクルのみ、
（Ｂ）以下の修飾：位置１６のＧｌｕ、位置１７のＧｌｎ、位置１８のＡｌａ、位置２０のＬｙｓ、位置２１のＧｌｕ、位置２３のＩｌｅおよび位置２４のＡｌａ、ならびにＣ末端アミドを含み（「キメラ２」）、位置２のＡＩＢおよび４０Ｋ ＰＥＧ基でペグ化されている位置２４のＣｙｓを含むように更に修飾されている天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号１）（「キメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）；
（Ｃ）位置２のＡＩＢ、位置１０のＬｙｓ（ＬｙｓはＣ８脂肪酸でアシル化されている）および位置２４のＣｙｓ（Ｃｙｓは４０Ｋ ＰＥＧでペグ化されている）を含むように更に修飾されているキメラ２（「キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）、または
（Ｄ）位置２のＡＩＢ、位置１０のＬｙｓ（ＬｙｓはＣ１６脂肪酸でアシル化されている）および位置２４のＣｙｓ（Ｃｙｓは４０Ｋ ＰＥＧでペグ化されている）を含むように更に修飾されているキメラ２（「キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）。

【0346】

２５％（ｖ／ｖ）グルコースを含む食塩水を、０分の時点で１．５ｇ／ｋｇ体重の用量で注射した。血中グルコースレベルを−１５、０、１５、３０、６０および１２０分の時点で測定した。

【0347】

図１５〜１７は、２、２０および７０ｎｍｏｌ／ｋｇをそれぞれ表示された時点で注射したマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示す。試験した全ての用量において、キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤは、マウスにおいて血中グルコースを低下する最大の能力を示した。図１７に示されているように、このペプチドは、キメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤと同様の活性を有した。

【0348】

＜実施例２５＞
ＤＩＯマウスに、−２４時間の時点で、下記のうちの一つの７０ｎｍｏｌ／ｋｇを腹腔内に注射した：
（Ａ）ビヒクルのみ、
（Ｂ）実施例２４に記載されたキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ、
（Ｃ）実施例２４に記載されたキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ、または
（Ｄ）実施例２４に記載されたキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ。

【0349】

２５％（ｖ／ｖ）グルコースを含む食塩水を、０分の時点で１．５ｇ／ｋｇ体重の用量で注射した。血中グルコースレベルを０、１５、３０、６０および１２０分の時点で測定した。

【0350】

図１８は、表示された時点でのマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示す。３つのペプチドは、全て、マウスにおいて血中グルコースを低下する有意な活性を示す。

【0351】

＜実施例２６＞
ＤＩＯマウスに、ビヒクルのみ、または下記のうちの一つの１５若しくは７０ｎｍｏｌ／ｋｇを腹腔内に注射した：
（Ａ）実施例２４に記載されたキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ、
（Ｂ）実施例２４に記載されたキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ、または
（Ｃ）実施例２４に記載されたキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ。

【0352】

体重を、注射の前および注射の１、３、５および７日後に測定した。

【0353】

図１９は、各群のマウスの体重の変化％を示す。試験した両方の用量において、キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤおよびキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤは、体重を低下する同等の能力を示す。より高用量で試験すると、キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^ｌ０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤは、体重を低下する有意な能力を示す。

【0354】

＜実施例２７＞
位置１にチロシンおよびＥ１６とＫ２０の間にラクタム架橋（ならびにＣ末端カルボキシレートの代わりにアミド）を含む配列番号５５５のペプチドを、上記に実質的に記載された通りに合成し、実施例１４により、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対するインビトロ活性について試験した。それぞれの受容体に対するペプチドのＥＣ５０を表１８に示す。

【0355】

【表18】

【0356】

これらのデータに基づいて、配列番号５５５のペプチドは、例示的なグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストペプチドであることが示された。

【0357】

＜実施例２８＞
配列番号１のペプチド（グルカゴン（１−２９））、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにアミドを有する配列番号１のペプチド（グルカゴン（１−２９ａ））ならびに位置２および１６のそれぞれにＡＩＢを有し、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにアミドを有する配列番号１のペプチド（グルカゴン（１−２９ａ）Ａｉｂ^２ Ａｉｂ^１６）を、実質的に上記に記載された通りに合成した。次にこれらのペプチドを、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対するインビトロ活性について、実施例１４に記載された方法により試験した。それぞれのペプチドのＥＣ５０を表１９に示す。

【0358】

【表19】

【0359】

＜実施例２９＞
以下のペプチドを実質的に上記に記載された通りに合成した：
（１）実施例２８に記載されたグルカゴン（１−２９）、
（２）位置２４にＣｙｓおよびＣ１６脂肪酸を含むＴｒｐに共有結合している位置１０のＬｙｓを有するグルカゴン（１−２９ａ）Ａｉｂ^２ Ａｉｂ^１６（実施例２８に記載）（「グルカゴン（１−２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^ｌｏ−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ｃｙｓ^２４」）、
（３）Ｃｙｓが４０ｋＤ ＰＥＧ基を有するグルカゴン（１−２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^ｌｏ−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ｃｙｓ^２４（「グルカゴン（１−２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）、
（４）位置２０にＡｉｂを含むグルカゴン（１−２９ａ） Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ｃｙｓ^２４（「グルカゴン（１−２９ａ） Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^ｌ０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ａｉｂ^２０ Ｃｙｓ^２４」）および
（５）Ｃｙｓが４０ｋＤ ＰＥＧ基を有するグルカゴン（１−２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ａｉｂ^２０ Ｃｙｓ^２４（「グルカゴン（１−２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ａｉｂ^２０ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）。
次にこれらのペプチドを、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対するインビトロ活性について、実施例１４の方法により試験した。それぞれのペプチドのＥＣ５０を表２０に示す。

【0360】

【表20】

【0361】

＜実施例３０＞
アシル化およびペグ化されたグルカゴンペプチドのインビボ効果をＤＩＯマウスにおいて試験した。具体的には、各群が平均初期体重の５８ｇを有するＤＩＯマウスの６群（一群当たり８匹のマウス）に、アシル化およびペグ化グルカゴンペプチドまたはビヒクル対照の１０、２０、４０または８０ｎｍｏｌ／ｋｇを、１週間に１回で２週間腹腔内注射した。研究に使用したアシル化およびペグ化グルカゴンペプチドは、キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ（実施例２６に記載）およびペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４ （実施例２０に記載）であった。

【0362】

マウスの体重変化およびマウスによる食物摂取を、注射の０、１、３、５、７、８、１０、１２および１４日後に測定した。マウスの血中グルコースレベルを、１４日間にわたってモニターした。グルコース負荷試験を、アシル化またはペグ化ペプチド投与の１時間または２４時間後に、食塩水中２５％グルコースを注射し、グルコース注射の−６０、０、１５、３０、６０または１２０分後に血中グルコースレベルを測定することによって実施した。

【0363】

図２０に示されているように、４０または８０ｎｍｏｌ／ｋｇのアシル化およびペグ化ペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４を注射したマウスの総体重は、ビヒクル対照を注射したマウスと比較して低減した。

【0364】

図２１に示されているように、グルコース注射に反応した、２０、４０若しくは８０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４または２０ｎｍｏｌ／ｋｇのキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤを注射したマウスの血中グルコースレベルは、ビヒクル対照と比較して低下した。

【0365】

＜実施例３１＞
共有分子内架橋を有する又は有さないアシル化グルカゴン類縁体を、固相合成により作成し、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対するインビトロ活性について試験した。各ペプチドについて、各受容体に対するＥＣ５０（ｎＭ）及び％活性を、対応する受容体の天然ペプチドと比較したものを表２１に示す。

【0366】

【表21】

【0367】

共有分子内架橋を有さず、位置２のＡＩＢ、位置１６のＡＩＢ、及び位置１０のＬｙｓ残基にスペーサーを介して結合している脂肪アシル基を含む、幾つかのグルカゴン類縁体を、本明細書に実質的に記載されているように作製した。これらのアシル化グルカゴン類縁体は、スペーサーの種類、ペグ化の存在若しくは不在、及び／又はアシル基の大きさによって異なった。アシル化グルカゴン類縁体を、実施例１４に実質的に記載されているように、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対するインビトロ活性について試験した。それぞれのペプチドの構造、並びにグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するインビトロ活性の概要を、表２２及び２３に示す。

【0368】

【表22】

【表23】

【0369】

表２２及び２３に示されているように、スペーサーを介して結合している脂肪アシル基を含むペプチドは、ペプチド主鎖に直接結合している脂肪アシル基を含むペプチドと比較して、効力を有意に増加した。

【0370】

＜実施例３２＞
それぞれ平均体重４８．７ｇのＤＩＯマウス（１群あたり８匹）に、ビヒクルのみ、３０nmol/kg若しくは１００nmol/kgのアシル化グルカゴン類縁体ペプチド、又は長期作用ＧＬＰ−１類縁体であるリラグルチド(Novo Nordisk, Denmark）を７日間毎日皮下注射した。アシル化グルカゴン類縁体は以下であった：
野生型グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列のうち、位置１０のＴｙｒが修飾されてアシル化Ｌｙｓ残基となり、アシル化Ｌｙｓが、Ｃ１６脂肪アシルを含み、Ｃ末端カルボキシレートがアミド基に置換されたアミノ酸配列を含む「（Ｃ１６）グルカゴンアミド」；
Ｃ１６脂肪アシル基がガンマ−Ｇｌｕ−ガンマ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介して位置１０のＬｙｓに結合している以外はＣ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド」（アシル化Ｌｙｓの構造については下記を参照すること）；

【化11】

Ｃ１６脂肪アシル基がＡｌａ−Ａｌａジペプチドスペーサーを介して位置１０のＬｙｓに結合している以外はＣ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド」；及び
Ｃ１６脂肪アシル基がβ−Ａｌａ−β−Ａｌａジペプチドスペーサーを介して位置１０のＬｙｓに結合している以外はＣ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「βＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド」。

【0371】

マウスの体重を毎日モニターし、体重の総変化（％）を図２２に示す。図２２に示されているように、大部分のアシル化グルカゴンペプチドは、それぞれの用量で体重の減少を引き起こした。リラグルチドは体重においておよそ１２％の減少を示したが、グルカゴン類縁体ペプチドのγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドは、対応する用量でマウスにおいて減量を引き起こす最大の能力を示した。低い用量のγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドでさえ、体重に実質的な減少を引き起こした。

【0372】

マウスの脂肪量を分析の７日目に測定した。図２３に示されているように、１００nmol/kgのγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドを投与されたマウスは、最低の脂肪量を示した。

【0373】

マウスの血中グルコースレベルも、アッセイの期間中にモニターした。図２４に示されているように、高用量のグルカゴン類縁体ペプチドのγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドは、リラグルチドと同様に、マウスの血中グルコースレベルを減少するように作用した。

【0374】

＜実施例３３＞
ＧＬＰ−１活性を有するグルカゴン類縁体ペプチドのアシル化を以下のように評価した。位置２にＡＩＢおよび位置２４にＣｙｓを有する（４０ｋＤａ ＰＥＧ分子を含む）キメラ２の構造を含む非アシル化グルカゴン類縁体ペプチドを、位置１０にアシル化Ｌｙｓ残基を含むように修飾した。非アシル化グルカゴン類縁体ペプチドは、配列番号５８０のアミノ酸配列を含んだ。位置１０のＬｙｓを、Ｃ８、Ｃ１４、Ｃ１６またはＣ１８脂肪アシル基でアシル化し、アシル化ペプチドは、配列番号５３４〜５３７の構造をそれぞれ含んだ。非アシル化ペプチドおよびアシル化型ペプチドのＧＬＰ−１受容体に対するインビトロ活性を、本明細書に実質的に記載されているように試験した。ＧＬＰ−１受容体に対するそれぞれのペプチドのＥＣ５０を表２４に示す。

【表24】

【0375】

＜実施例３４＞
グルカゴン類縁体ペプチドを、本明細書に記載されているように固相ペプチド合成により作製し、ペプチドの位置１０又は３０のいずれかをアシル化した。ペプチド及びそれらの構造は以下である：
位置２のＸがｄ−Ｓｅｒであり、位置３０のＬｙｓがＣ１４脂肪アシル基でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号５８１）を含む「ペプチドｄＳ２Ｅ１６Ｋ２０Ｋ３０−Ｃ１４グルカゴンアミド」；
位置２のＸがｄ−Ｓｅｒであり、位置１０のＬｙｓがＣ１４脂肪アシル基でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号５８２）を含む「ペプチドｄＳ２Ｋ１０（Ｃ１４）Ｅ１６Ｋ２０−グルカゴンアミド」；
位置２のＸがｄ−Ｓｅｒであり、位置３０のＬｙｓがＣ１６脂肪アシル基でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号５８３）を含む「ペプチドｄＳ２Ｅ１６Ｋ２０Ｋ３０−Ｃ１６グルカゴンアミド」；
位置２のＸがｄ−Ｓｅｒであり、位置１０のＬｙｓがＣ１６脂肪アシル基でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号５８４）を含む「ペプチドｄＳ２Ｋ１０（Ｃ１６）Ｅ１６Ｋ２０−グルカゴンアミド」；
位置２のＸがＡＩＢであり、位置１０のＫがＣ１８脂肪アシル基でアシル化され、位置２４のＣｙｓが４０kDaのＰＥＧ分子を含み、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号５８５）を含む「ペプチドキメラ２−ＡＩＢ２−Ｋ１０−アシル化」；及び
位置２のＸがＡＩＢであり、位置３０のＫがＣ１８脂肪アシル基でアシル化され、位置２４のＣｙｓが４０kDaのＰＥＧ分子を含み、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号５８６）を含む「ペプチドキメラ２−ＡＩＢ２−Ｋ３０−アシル化」。

【0376】

それぞれのペプチドのＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対するインビトロ活性を、実施例１４に実質的に記載されたように試験した。結果を表２５に示す。

【0377】

【表25】

【0378】

＜実施例３５＞
固相ペプチド合成を、ＸＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＣＷＬＭＮＴ−ＮＨ_２（ここでＸ＝ＤＭＩＡである）（配列番号５８７）の配列の構築に用いた。位置１６のＧｌｕおよび位置２０のＬｙｓの選択的脱保護の後、ペプチドを樹脂のラクタム架橋を介して環化した。次に、切断後の粗ペプチドを分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳにより特徴決定した（〔Ｍ＋Ｈ〕の計算値：３４７９．９；実測値：３４８０．９）。ペプチド前駆体およびヨードアセチル官能化４０ｋＤａ ＰＥＧ（ＮＯＦ（１：１）を、７Ｍの尿素／５０ｍＭのトリス緩衝液中、ｐＨ８．５、室温で４５分間混合して、下記に示されている、ＰＥＧとペプチドのＣｙｓとの間に共有チオエーテル結合を形成することによって、ペグ化を実施した。

【0379】

【化12】

【0380】

ペグ化ペプチドを分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の画分を収集し、凍結乾燥して、オフホワイトの粉末を得た。生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（４４０００〜４６０００、幅広のピーク）により確認した。

【0381】

ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対するインビトロ活性を実施例１４に実質的に記載された通りに試験した。ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対するＥＣ５０は、それぞれ０．３２７ｎＭおよび０．０４２ｎＭであった。

【0382】

＜実施例３６＞
固相ペプチド合成を、ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＭＮＴ−ＮＨ_２（ここでＸ＝ＡＩＢである）（配列番号５８９）の前駆体の調製に用いた。次に粗ペプチドを分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳにより特徴決定した（〔Ｍ＋Ｈ〕の計算値：３４１２．８；実測値：３４１３．９）。ペプチド前駆体およびヨードアセチル官能化４０ｋＤａ ＰＥＧ（ＮＯＦ（１：１）を、７Ｍの尿素／５０ｍＭのトリス緩衝液中、ｐＨ８．５、室温で４５分間混合して、下記に示されているように、ＰＥＧとペプチドのＣｙｓとの間に共有チオエーテル結合を形成することによって、ペグ化を実施した。

【化13】

【0383】

ペグ化されたペプチドを分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の画分を収集し、凍結乾燥して、オフホワイトの粉末を得た。生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（４４０００〜４６０００、幅広のピーク）により確認した。

【0384】

ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対するインビトロ活性を実施例１４に実質的に記載された通りに試験した。ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対するＥＣ５０は、それぞれ０．０２７ｎＭおよび３３ｎＭであった。

【0385】

＜実施例３７＞
ペプチドＪ：
ＨＳ−Ｘ−ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＴＲＲＡＡＥＦＶＡＷＬ（ＮＩｅ）ＤＥ（配列番号５９１）
の主鎖を含むか、又は、
ペプチドＫ：
ＨＳ−Ｘ−ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＡＤＦＶＡＷＬＭＤＥ（配列番号５９２）
の主鎖を含み、更に位置３に追加の修飾を有するグルカゴン類縁体ペプチドを、実質的に本明細書に記載されている通りに作成した。ペプチドのグルカゴン受容体に対するインビトロ活性を、実施例１４に実質的に記載された通りに試験した。各ペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）を表２６に示す。

【0386】

【表26】

【0387】

表２６に示されているように、グルカゴン受容体に対する活性を実質的に損失することなく、複数のアミノ酸を位置３に配置することができ、いくつかの場合、例えばペプチドＫの主鎖上にＤａｂ（Ａｃ）やＱ（Ｍｅ）を有する場合は、実際には活性は修飾により増大した。

【0388】

＜実施例３８＞
様々なグルカゴン類縁体主鎖上の位置３にＤａｂ（Ａｃ）を含むグルカゴン類縁体ペプチドを、実質的に本明細書に記載されている通りに作成し、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性を試験した。各ペプチドの構造と活性を表２７に示す。

【0389】

【表27】

【0390】

＜実施例３９＞
位置２と１６にＡＩＢおよび位置１０にＬｙｓを有し（ここで位置１０のＬｙｓはＣ１６脂肪アシル基に共有結合している）、ならびにＣ末端カルボキシレートの代わりにアミドを有する配列番号１を含む、第１グルカゴン類縁体ペプチド（ＡＩＢ２，ＡＩＢ１６，Ｋ１０（Ｃ１６）Ｇｌｕｃアミド）を、本明細書に実質的に記載されているように作製した。ＬｙｓがＣ末端に付加されている以外は第１グルカゴン類縁体ペプチドと同じ構造を有する第２グルカゴン類縁体ペプチド（ＡＩＢ２，ＡＩＢ１６，Ｋ１０（Ｃ１６），Ｋ３０ Ｇｌｕｃアミド）。ペプチドのインビトロ活性を実施例１４に実質的に記載されているように試験し、２０％のヒト血漿を含む溶液中で追加的に試験した。ペプチドのそれぞれの受容体に対するＥＣ５０（ｎＭ）を表２８に示す。

【0391】

【表28】

【0392】

＜実施例４０＞
レプチンの発見は、エネルギーバランスと体脂肪を調節する内分泌系の存在を立証した。レプチンはまた、疾患の世界的な蔓延を管理するため、環境および薬理学的手法を確認する方法として、肥満研究に興味および投資を呼び込んだ。十分に効能があり安全な肥満の薬理学的治療は、依然として出現しておらず、外科手術が減量を維持する唯一の証明されている選択肢を構成している。効力飽満誘導を達成する２つの内分泌ホルモン受容体に対する受容体アゴニズムと、単一のペプチドの作用時間の持続における脂質分解効果とを組み合わせた効能が、本明細書において報告される。ＧＬＰ１−Ｒに対する活性が天然ＧＬＰ−１に匹敵するが、グルカゴン受容体アゴニズムのレベルが互いに異なるような、２つの特定のグルカゴン類縁体を、齧歯類肥満モデルにより薬理学的に研究した。異なるグルカゴンおよびＧＬＰ−１活性を有する一連の高効力類縁体から選ばれたこれらのペグ化ペプチドの１週間に１回の投与は、食餌誘導肥満マウス（平均体重約５０ｇ）において１か月以内に脂肪およびグルコース耐性レベルを正常化した。減量は、食物摂取の減少およびエネルギー消費量の増加によりもたらされた体脂肪の減少の結果であり、それはグルカゴン受容体アゴニズムのレベルを増加した。これらのコアゴニスト化合物は、脂肪肝を含むグルコースおよび脂質代謝も正常化した。効果は用量依存性であり、食餌誘導肥満ラットにおいて成功裏に再現された。これらの前臨床研究は、完全ＧＬＰ−１アゴニズムが適切な程度のグルカゴン受容体活性化により増強される場合、体脂肪の低減を実質的および安全に促進できることを示す。本明細書に示される知見は、臨床試験の基本を確立し、メタボリックシンドロームに対する魅力的な新規治療選択肢を示唆している。

【0393】

＜実施例４１＞
以下の材料および方法は、実施例４２〜５１に記載される実験に関わる。

【0394】

［Ｂｏｃペプチド合成および切断］
ペプチド合成は、改良Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成機により、０．２ｍｍｏｌの４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂（Midwest Biotech, Fishers,Indiana）を使用して実施した。固相ペプチド合成は、Ｂｏｃ化学の現場中和を利用した（Schnolzer,M.et al.,International Journal of Peptide Research and Therapeutics,13:31-44(2007)）。合成の完了したペプチド樹脂をＨＦ／ｐ−クレゾール（１０：０．５ｖ／ｖ）により０℃で１時間処理した。ＨＦを真空下で除去し、脱保護ペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで洗浄した。ペプチドを２０％アセトニトリル／１％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。大部分のペプチドは、Ｂｏｃ化学により調製した。以下の側鎖保護基をＢｏｃ−アミノ酸（Midwest Biotech）のために使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。ペプチドの分子量は、エレクトロスプレーイオン化またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析により確認し、他に記載されているように精製した。

【0395】

［ラクタム合成］
ｉからｉ＋４のラクタム形成を有する環化ペプチドを樹脂上に合成した。Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−ＯＨガンマエステル（Peptides International, Louisville, Kentucky）およびＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Peptides International）を、ラクタム形成に関与する位置でＧｌｕ（ＯｃＨｅｘ）およびＬｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）に置換した。合成の完了した保護ペプチジル樹脂を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで４５分間処理して、ＦｍｏｃおよびＯＦｍ保護基を除去した。樹脂において、ラクタム形成を、ＤＭＦ／ＤＩＥＡ中のベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（Ｆｌｕｋａ）の５当量で処理した後に達成した。ラクタムの形成は、ニンヒドリン分析、および開環状のペプチドと比べて質量が１８だけ低減することにより確認した。

【0396】

［ペプチド精製］
樹脂からの切断に続いて、粗ペプチド抽出物を分析用逆相ＨＰＬＣにより分析した。分析用の分離は、Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム（０．４５×５ｃｍ）によりアセトニトリル勾配を用いる０．１％ＴＦＡで実施した。分析的な解析の後、粗抽出物を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４またはＣ１８カラム（２．２×２５ｃｍ）により、アセトニトリル勾配を用いる０．１％ＴＦＡで半分取用クロマトグラフィーによって精製した。ペグ化ペプチドを、同じ条件を使用して精製した。分析用分離に提示された条件を利用した分析用逆相ＨＰＬＣにより、分取画分の純度について分析した（＞９５％）。ペプチド質量および純度を、エレクトロスプレーイオン交換質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）またはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析により確認した。ペグ化ペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、４３４００の広い質量範囲を示した。精製ペプチドを凍結乾燥し、４℃で保存した。

【0397】

［ペプチドのペグ化］
精製ペプチドを、７Ｍの尿素／５０ｍＭのトリス中、ｐＨ８．０でメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド−プロピオンアミド−４０Ｋ（Chirotech Technology Ltd, Cambridge）と１：１のモル比で混合した。反応の進行を分析用逆相ＨＰＬＣによりモニターし、遊離ペプチドは３０分以内に消化された。反応を、０．１％ＴＦＡで停止させ、精製し、他に記載されているように特徴決定した。

【0398】

［グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体媒介ｃＡＭＰ合成］
ペプチド類縁体を、それぞれ、グルカゴン（Ｇｃｇ）およびＧＬＰ−１受容体を介してｃＡＭＰ産生を刺激する能力について試験した。ＨＥＫ２９３細胞に、ＧｃｇＲまたはＧＬＰ−１Ｒ ｃＤＮＡと、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）に結合したルシフェラーゼレポーター遺伝子とを同時形質移入した。細胞から、０．２５％ウシ増殖血清（HyClone, Logan, UT）が補充されたＤＭＥＭ（Invitrogen, Carlsbad, CA）における培養により１６時間かけて血清を取り除いた。グルカゴンおよびＧＬＰ−１類縁体の一連の希釈を、同時形質移入ＨＥＫ２９３細胞を含有する９６ウエルポリ−Ｄ−リシン被覆プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）に加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、当量（１００μＬ）のＬｕｃＬｉｔｅルミネセンス基質試薬（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）を各ウエルに加え、プレートを８００ｒｐｍで３分間振とうした。プレートを暗黒で１０分間インキュベートし、発光をＭｉｃｒｏＢｅｔａ−１４５０液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）により定量化した。有効５０％濃度（ＥＣ５０）は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（OriginLab, N orthampton, MA）により計算した。

【0399】

［円偏光二色性測定］
ペプチドを、ＴＦＥ濃度の増加を伴う１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５．９に溶解し、ペプチドの濃度を定量化した。それぞれのサンプルをＣＤ測定のために１０μＭに希釈した。ＣＤデータを、一定の窒素流および２５℃に設定した１ｍｍのパス長セルの温度制御を有するＪＡＳＣＯ Ｊ−７１５円偏光二色性分光偏光計により収集した。スペクトルデータを、走査速度１００ｍｍ／ｍｍおよび１ｎｍ波長ステップの２７０〜１９０ｎｍで５回の走査により蓄積した。ＪＡＳＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｎａｇｅｒソフトウエアにより溶媒シグナルを差し引き、データを平滑化した（Savitzky and Golay, Anal. Chem. 36: 1627(1964)）。得られたミリ度値を、ｄｅｇｃｍ^２ｄｍｏｒ^−１の単位で平均残基楕円率に変換した。計算した平均残基楕円率値をＤＩＣＨＲＯＷＥＢ（Whitmore and Wallace, Biopolymers 89:392-400(2008); Whitmore and Wallace,Nucleic Acids Research 32: W668~W673 (2004)）に入力して、平均ヘリシティ値を得た。

【0400】

［動物］
Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、Jackson Laboratoriesから得て、５８％ｋｃａｌの脂肪を有する高スクロース食餌である、Research Dietsからの糖尿病誘発性食餌を与えた。マウスを、食物および水を自由に入手することができる、１２：１２時間の明暗サイクルにより２２℃で単独または集団収容した。全ての研究は、University of CincinnatiのInstitutional Animal Care and Use Committeeの指針により承認され、それに従って実施した。

【0401】

［身体組成測定］
全身の組成（脂肪および除脂肪質量）を、ＮＭＲ技術（EchoMRI, Houston, TX）を使用して測定した。

【0402】

［エネルギーバランスの生理学的測定］
エネルギー摂取および消費、ならびにホームケージ（home-cage）活性を、組み合わせた間接的熱量測定系（TSE Systems, Bad Homburg, Germany）を使用して評価した。酸素消費およびＣＯ_２産生を、４５分毎に合計１２０時間測定して（順化の１２時間を含む）呼吸商およびエネルギー消費を決定した。食物および水摂取、ならびに食事パターンを、秤を密閉ケージ環境に当てはめることにより、間接的熱量測定評価と同時に、１２０時間連続して決定した。食事は、食物摂取事象の最小持続時間が６０秒および食物摂取事象間の休憩が３００秒として定義した。ホームケージ自発的運動活性を、ケージの底部および最上部レベルを走査する光線を有する多次元赤外光線系を使用して決定し、活性は光線の遮断として表した。静止運動活性（もじもじする）は、ケージ底レベルの単一光線の連続的遮断として、歩行運動は、ケージ底レベルの任意の２本の異なる光線の遮断として、そして立ち上がりは、ケージ底および最上レベルの両方における光線の同時遮断として定義した。

【0403】

［血液パラメーター］
血液を、６時間の絶食後に、ＥＤＴＡ被覆Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ管（Sarstedt, Nuremberg, Germany）を使用して尾静脈から収集し、直後に氷で冷やした。３，０００ｇおよび４℃で１５分間遠心分離した後、血漿を−８０℃で保存した。血漿インスリンを、Ｌｉｎｃｏ（Sensitive Rat Insulin RlA; Linco Research, St.Charles, MO）のラジオイムノアッセイにより定量化した。血漿ＴＧおよびコレステロールレベルを酵素アッセイキット（Thermo Electron, Waltham, MA）により測定した。５匹の動物／群からプールしたサンプル（０．２５ｍｌ）を、２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムをリポタンパク質分離のために直列に連結した高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ゲル濾過に付した以外は、サンプルを個別に分析した。すべてのアッセイは、製造会社の説明書に従って実施した。

【0404】

［グルコース負荷試験］
グルコース耐性を決定するために、マウスを６時間の絶食に付し、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）のために、２ｇのグルコース／ｋｇ体重（０．９％食塩水中５０％Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ））を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。尾血液グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）を、注射の前（０分）ならびに１５、３０、９０および１２０分後に、携帯用グルコメーター（TheraSense Freestyle）を使用して測定した。

【0405】

［ＷＡＴ ＨＳｌのウエスタンブロット］
脂肪組織を、１．５ｍｌの微量遠心管に入れ、組織溶解機（Retsch, Inc Newtown, PA Cat.#85210）を３０ｈｚで３分間使用して、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（１×ＰＢＳ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．５％ナトリウムドキシコレート、５０ｍＭのＮａＦを有する０．１％ＳＤＳ、０．５Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．１ｍＭのＮａバナデート、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン）中で溶解した。サンプルを１２，０００ｒｐｍで１５分間（４℃）回転し、その時点で中間層を新たな管に取り出し、氷上で１５秒間超音波処理した。サンプルを１４，０００ｒｐｍで１０分間（４℃）回転し、中間層を新たな管に収集した。サンプルを１９，０００ｒｐｍで１０分間（４℃）再度回転し、中間層を新たな管に収集した。次にサンプルのアリコートをタンパク質アッセイのために取り出した。次にサンプルを４×ＳＤＳ／ＤＴＴ緩衝液中で２分間沸騰させた。細胞溶解産物からの５０μｇのタンパク質を、９％（ｗ／ｖ）アクリルアミド分離ゲルのＳＤＳ／ＰＡＧＥに付し、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬニトロセルロール膜に移した。膜をブロッキングし、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからの目的の一次抗体（ＨＳＬ（４１０７））（Ｃｅｌｌ ＳｉｇｎａｌｉｎｇからのＰｈｏｓｐｈｏ−ＨＳＬ（ｓｅｒ６６０）（４１２６））でプローブした。洗浄した後、一次抗体検出を、ＨＲＰ結合抗（ウサギＩｇＧ）または抗（マウスＩｇＧ）（ＨＲＰ結合抗ウサギおよび抗マウス二次抗体はＢｉｏ−Ｒａｄから購入した（１７０−６５１５および１７０−６５１６））のいずれかを使用して実施し、増強化学発光（Amersham Biosciences）を使用して検出し、ＣＬ−Ｘｐｏｓｕｒｅフィルム（Pierce）に暴露した。

【0406】

［免疫組織化学］
白色卵巣上皮脂肪組織のパラフィン包埋切片（５μｍ）を、記載された通りに（Ogden, C. L. et al. JAMA 295: 1549-1555 (2006)）、ヘマトキシリン／エオシンで染色した。個別のマウス組織ブロックのそれぞれにおいて、３つの異なる強拡大視野のそれぞれからの１００個の細胞の脂肪細胞の大きさを、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ５．１ソフトウエア（Media Cybernetics,Bethesda, MD, USA）を使用して、面積測定として定量化した。

【0407】

［オイルレッド染色］
肝臓組織における脂質蓄積を可視化するために、殺処分して採取した肝臓の４〜８ｍｍの断面片を、オイルレッドＯ色素で染色した。２０×および４０×倍率の画像を〔複合レンズ〕顕微鏡を使用して得た。

【0408】

［定量的ＲＴ−ＰＣＲ手順］
動物を給餌状態（朝の食餌を与えた１〜４時間後）で断頭により殺処分し、多様な組織を試料採取し、凍結固定し、続くリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｉｃｙｃｌｅｒ，ＢｉｏＲａｄ）によるＰＥＰＣＫ、Ｇ６ＰおよびＨＰＲＴ（ハウスキーピング）のｍＲＮＡ発現の測定のために、−８０℃で保存した。

【0409】

総ＲＮＡを、標準的プロトコールを使用し、ＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Qiagen,Ca#74804）を使用して凍結組織サンプルから抽出した。ＲＮＡ濃度および純度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用する分光測定法により決定した。ＲＴ−ＰＣＲのｃＤＮＡテンプレートは、２μｇの総ＲＮＡを使用して得た。逆転写反応を、１０×ＤＮａｓｅ Ｉ反応緩衝液、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ａｍｐ Ｇｒａｄｅ、１Ｕ／μｌ、ｄｅｐｃ−Ｈ_２０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、オリゴ（ｄＴ）２０（５０μＭ）、５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ緩衝液、０．１Ｍ ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Invitrogen）により実施した。

【0410】

合成したｃＤＮＡを、順方向および逆方向プライマーの最終濃度０．５μＭを含有する蛍光色素ＳＹＢＲグリーン（ＢｉｏＲａｄ，Ｃａ＃１７０８８８２）を使用して、ＰＣＲにより更に増幅した。産物の純度は解離曲線により確認した。テンプレート無し対照を全てのアッセイに含めたが、これは一定の増幅を生じなかった。標準曲線を使用して、ＰＥＰＣＫまたはＧ６Ｐの相対濃度を得て、結果を、ハウスキーピング遺伝子として使用するＨＰＲＴの濃度に従って補正した。結果は、ビヒクル群の平均を１００％に設定し、次に研究した動物の３群のそれぞれ個別の値を計算した、ビヒクルのパーセントとして表す。

【0411】

［プライマー配列］
ＰＥＰＣＫ、Ｇ６ＰおよびＨＰＲＴのプライマー配列をＮＩＨウエブサイトから取得し、プライマーをＩＤＴ ＤＮＡにより生成した。

【0412】

［逆転写および定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ］
ＣＤ６８のｍＲＮＡ発現を、記載された通りに（Nomiyama, T. et al. Journal of Clinical Investigation 117: 2877-2888 (2007)、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。簡潔には、殺処分の直後に、１００ｍｇの卵巣上皮脂肪組織をＴＲＩＺＯＬ中でホモジナイズし、総ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ反応を、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実施した。それぞれのサンプルを、三重に分析し、ＴＦＩＩＢのｍＲＮＡ発現の値に対して規準化した。使用したマウスのプライマー配列は以下である：
ＣＤ６８、５５’−ＣＡＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＴＴＧＴＧ−３’（フォワード）（配列番号６３８）、
５’−ＣＣＡＡＡＧＧＴＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＧＡ−３’（リバース）（配列番号６３９）；及び
ＴＦＩＩＢ、５’−ＣＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＧＴＣＡＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号６４０）、
５’−ＣＡＡＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣ−３’（リバース）（配列番号６４１）。

【0413】

［統計分析］
特に示されていない限り、全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ一元配置ＡＮＯＶＡおよびカラム統計を使用して実施した。記述されるＰ値は、一元配置分散分析法のためである。全ての結果は、平均±ＳＥとして表す。（受容体活性化データは±ＳＤである）。

【0414】

＜実施例４２＞
アミノ酸修飾を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む２つのグルカゴンペプチド、ペプチドＸおよびＹを、本明細書に記載された通りに作製した。両方のペプチドは、位置２にＡＩＢ、位置１６にＧｌｕ、位置１７にＧｌｎ、位置１８にＡｌａ、位置２０にＬｙｓ、位置２１にＧｌｕ、位置２３にＩｌｅおよび位置２４にＣｙｓを含んだ。部位特異的４０ｋＤペグ化は、位置２４のＣｙｓにおけるマレイミド官能化直鎖ＰＥＧによる反応を介して達成され、ペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧを生じた。ペプチドＹおよびＹ−ＰＥＧは、単一側鎖ラクタム架橋をペプチドＹまたはＹ−ＰＥＧの中央に導入して二次構造を安定化し、グルカゴンアゴニズムを増強する点において、ペプチドＸおよびＸ−ＰＥＧとそれぞれ異なっていた。位置１６のＧｌｕおよび位置２０Ｌｙｓの２つの側鎖を、側鎖アミドとしてペプチド構築の際に共有結合した。このペプチドのマクロ環化は、２１原子ラクタムを表す。ペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧを溶解性について試験し、２５ｍｇ／ｍｌを超える濃度で生理学的緩衝液中で溶解性であることが見出され、ペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧは、１週間にわたって、血漿とのエキソビボインキュベーションに対して完全に耐性があることを証明した。

【0415】

＜実施例４３＞
多様な濃度のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）水溶液において可溶化されるときのペプチドの二次立体配座を、円偏光二色性により分析した（図２５）。グルカゴンは試験されたうちでヘリシティーが最小のペプチドであり、０、１０および２０％のＴＦＥ溶液においてそれぞれ１０、１５および３３％の計算上のヘリシティを有した（表２９）。同じ実験条件下において、ＧＬＰ−１は、増強されたヘリシティの１４、２９および５５％を有し、これらの２つのペプチドが一次構造と共に二次構造も異なることを示した。ペグ化部分が分子の質量の９０％超を占める事実にもかかわらず、ペプチドＸおよびＹはペグ化されたときにヘリシティに有意な変化がなかった（表２９）。対照的に、ＴＦＥの不在下でリン酸緩衝液においてペプチドＹの見かけ上のヘリシティは、ペプチドＸのおよそ２倍、１７％に対して３６％であった。したがって、これらの２つのキメラペプチドのペグ化形態（ペプチドＸ−ＰＥＧおよびペプチドＹ−ＰＥＧ）は、二次構造において明らかに異なっており（図２５）、生物学的特性における差は、これらの二次構造の差と関わりがある可能性がある。

【0416】

【表29】

【0417】

＜実施例４４＞
２つのペプチド（ペプチドＸおよびＹ）ならびにこれらの４０ｋＤペグ化誘導体（ペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧ）を、細胞に基づいたＣＲＥルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるｃＡＭＰ合成を刺激する能力について評価した（図２６）。表３０に示されているように、天然グルカゴンは、０．０５５±０．０１４ｎＭの有効濃度（ＥＣ５０）でグルカゴン受容体を最大半量的に活性化し、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）をさらに高い濃度の３．２９±０．３９ｎＭのＥＣ５０で活性化した。対照的に、ＧＬＰ−１は、その受容体を０．０２８±０．００９ｎＭのＥＣ５０で活性化し、グルカゴン受容体（ＧｃｇＲ）との相互作用を、１μＭを超えるＥＣ５０で生じる点において、極めて特異的であることを証明した。天然リガンドがそれらの受容体に対して示した特異性におけるダイナミックレンジは、百万を超える。ＧＬＰ−１Ｒに対するペプチドＸ−ＰＥＧの効力は、天然ＧＬＰ−１の２倍であり、相対的な意味において、ＧｃｇＲに対してさらに増強された。しかし、ＧｃｇＲ活性は、天然グルカゴンのおよそ１０％だけであった。ラクタムの導入は、ＧＬＰ−１Ｒに対して変わることなく完全グルカゴンアゴニズムを保持した。したがって、ペプチドＹ−ＰＥＧは、天然リガンドと比べて、２つのそれぞれの受容体に対して完全に効力のあるほぼバランスのとれたコアゴニストである。それぞれのペプチドのペグ化は、ＧｃｇＲに対して１０倍、ＧＬＰ−１Ｒに対して５倍、効力を低減した。ＧｃｇＲに対する活性の僅かに増強された損失は、グルカゴン受容体相互作用にとって、Ｃ末端配列のより大きな相対的重要性と関わりがあるのかもしれない。ペグ化ペプチド（ペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧ）は、ＧＬＰ−１よりもＧＬＰ−１Ｒに対して僅かに効力が低いが、依然としてナノモル以下のＥＣ５０を有した。ペプチドＸ−ＰＥＧは、このペプチドのラクタム型、すなわちるペプチドＹ−ＰＥＧよりもＧＬＰ−１Ｒに対して７倍選択性がある。したがって、これらの２つのＤＰＰ−４耐性ペプチドは、持続性インビボ時間作用実験に適しており、ＧＬＰ−１Ｒアゴニズムはよく一致しているが、グルカゴンアゴニズムについては異なっている。

【0418】

【表30】

【0419】

＜実施例４５＞
４０ｋＤペグ化ペプチドのペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧを、食餌誘導肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７Ｂ６マウスに週一度の単回皮下（ｓ．ｃ．）注射として使用した。ペプチドのＹ−ＰＥＧの３２５ｎｍｏｌ／ｋｇの単回注射は、１週間にわたって、体重を５０．９±１．４ｇから３７．８±０．８ｇまで２５．８％減少した（ｐ＜０．０００１、ｎ＝８匹／群）。ペプチドＸ−ＰＥＧの比較投与は、有効であったが著しく効力が低く、体重の減少は９％（４９．１±１．５１ｇから４４．６８±１．３８ｇ）であった。食塩水注射対照マウスは、体重を変えなかった（前：５０．６１±１．３２ｇ、後；５０．８７±１．４６ｇ；図２７Ａ）。体重変化は、脂肪量の減少（ラクタムペプチドでは４１．９％、開型では２２．２％、対照では２．３％、ｐ＜０．００１；図２７Ｂ）の結果であり、平均毎日食物摂取量の有意な減少に匹敵した（ペプチドＹ−ＰＥＧ：０．４０±０．２９ｇ／日、ペプチドＸ−ＰＥＧ：１．８３±０．８１ｇ／日、食塩水：２．７０±０．７８ｇ／日、ｐ＜０．０００１、図２７Ｃ）。血中グルコースは、対照と比較したとき、両方のペプチドでは有意に減少し、ペプチドＹ−ＰＥＧが僅かに多かった（ペプチドＹ−ＰＥＧ：−９０．１ｍｇ／ｄＬ、ペプチドＸ−ＰＥＧ：−７９．６ｍｇ／ｄＬ、対照：−２３．９ｍｇ／ｄＬ、ｐ＝０．０４３３；図２７Ｄ）。２つのペプチド（ペプチドＸ−ＰＥＧおよびペプチドＹ−ＰＥＧ）の相対的な差は統計的に有意ではなかった。

【0420】

＜実施例４６＞
別の実験において、ペプチドＹ−ＰＥＧおよびペプチドＸ−ＰＥＧの６つの異なる用量（０、７、１４、３５、７０、１４０および３５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単回ｓ．ｃ．注射は、体重および血中グルコースの線形用量依存的減少を示した（図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄ）。このことは、観察された効果が、体重の急速な過剰減少の間接的効果以外は、明白な毒性のない、薬理学的な関連性を示唆している。効果の大きさは、ペプチドＹ−ＰＥＧにおいてより顕著であり、グルカゴンアゴニズムの追加的な要素がペプチドの効力を改善することを示している。

【0421】

＜実施例４７＞
別の実験において、ペプチドＹ−ＰＥＧまたはペプチドＸ−ＰＥＧの７０ｎｍｏｌ／ｋｇの週に一度のｓ．ｃ．注射は、ＤＩＯマウスの体重をそれぞれ２８．１％および２０．１％減少した（ｐ＜０．０００１、ｎ＝７〜８匹／群；図２９Ａ）。体重変化は、脂肪量の減少と関連していた（ペプチドＹ−ＰＥＧでは−６２．９％、ペプチドＸ−ＰＥＧでは−５２．２％、対照では５．１％、ｐ＜０．０００１；図２９Ｂ）。食物摂取量に及ぼす、これらの低用量の長期効果（ｐ＝０．９５；図２９Ｃ）は、高用量による短期効果（図２７Ｃ）ほど顕著ではなかった。エネルギー消費量は、ビヒクル（１２．７１±０．４５ｋｃａｌ／〔ｋｇ^＊ｈ〕）と比較して、ペプチドＹ−ＰＥＧ（１４．６０±０．６９ｋｃａｌ／〔ｋｇ^＊ｈ〕）およびペプチドＸ−ＰＥＧ（１７．１９±１．４９ｋｃａｌ／〔ｋｇ^＊ｈ〕）により増加し、一方、呼吸商は減少する傾向があり（図２９Ｄおよび２９Ｅ；ペプチドＹ−ＰＥＧでは０．７１９±０．０１、ペプチドＸ−ＰＥＧでは０．７２５±０．０１、対照では０．７５５±０．０１、ｐ＝０．１０２８）、熱産生の増加および栄養素分配の変化が全体的な負のエネルギーバランスを説明しうることを示した。エネルギー消費量の増加は、自発的運動活性が処置群と対照では異なっていないので（ｐ＝０．４２８１；図２９Ｆ）、自発的身体活動誘導熱産生（ＮＥＡＴ）の変化と関連しなかった。急性給餌の自動オンラインモニタリングも、食物摂取の長期的モニタリングも、カロリー摂取の変化を示さなかった（自動 ｐ＝０．６６７、長期的 ｐ＝０．９４８４；図３０Ａ）。

【0422】

血中グルコースレベルは、最初の注射の３日後から始まり処置期間にわたって著しく減少した（平均減少：ペプチドＹ−ＰＥＧ −３２％、ペプチドＸ−ＰＥＧ −２４．５％、対照 −２．７％、ｐ＜０．０００１；図２９Ｇ）。３日目の腹腔内（ｉ．ｐ．）グルコース投与に反応して、血中グルコースピーク（図２９Ｈ）およびプロフィール（ＡＵＣ）（図３０Ｆ）は、ビヒクル処置対照（３４１２５±３１４２、ｐ＜０．０００１）と比較して２つの処置群（ペプチドＹ−ＰＥＧ １４１８３±１０７２、ペプチドＸ−ＰＥＧ １３７９４±８２４．１）において著しく低くかった。ペプチドＹ−ＰＥＧまたはペプチドＸ−ＰＥＧによる処置の１か月後、血漿インスリンは、対照群（２６７５ｐｇ／ｍｌ）と比較して処置群（１１９４ｐｇ／ｍｌ、１０３４ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０２４４）において低く、改善されたインスリン感受性を示唆した（図２９Ｉ）血漿Ｃペプチドレベルは、ビヒクル（１０７７ｐｇ／ｍｌ）と比べて、Ｙ−ＰＥＧまたはペプチドＸ−ＰＥＧ（７３８．８ｐｇ／ｍｌ、６２４．７ｐｇ／ｍｌ）による処置の１か月後に減少する傾向があった（ｐ＝０．１０８）（図３０Ｇ）。

【0423】

前臨床現象が種を超えて一般化されるかを決定するために、両方の化合物を、食餌誘導肥満ラットに投与した（平均体重７７７．４±２．１ｇ、用量 ７０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週、週に一度の注射、３週間の処置）。ペプチドＹ−ＰＥＧおよびペプチドＸ−ＰＥＧは、それぞれ、ＤＩＯラットの体重（ペプチドＸ−ＰＥＧ：−１１．１５±０．８８％；ペプチドＹ−ＰＥＧ：−２０．５８±２．２６％、ビヒクル：１．０９±０．５６％）（ｐ＜０．０００１）および脂肪量（ペプチドＸ−ＰＥＧ：−１９．１７±２．０３％；ペプチドＹ−ＰＥＧ：−３３．７６±４．７６％；ビヒクル：０．６５±１．２０％；ｐ＜０．０００１）を減少し、この抗肥満処置手法の種非依存的な適用可能性が確認された。

【0424】

＜実施例４８＞
ペプチドＸ−ＰＥＧおよびペプチドＹ−ＰＥＧによる２７日間にわたる長期的ｓ．ｃ．処置は、ビヒクル（２５４．０ ２５．３３ｍｇ／ｄＬ、ｐ＝０．０４４１；図３１Ａ）と比較して、ＤＩＯマウスにおいて総コレステロールを減少した（それぞれ、１０６．９±６．３ｍｇ／ｄＬおよび２００．８±２９．５８ｍｇ／ｄＬ）。別の実験において、ＤＩＯマウスは、ペプチドＸ−ＰＥＧ、ペプチドＹ−ＰＥＧまたはビヒクルの７０ｎｍｏｌ／ｋｇのｓ．ｃ．を０日目および７日目に摂取し、９日目に評価された。ペプチドＹ−ＰＥＧは、血漿トリグリセリド、ＬＤＬコレステロールおよび総コレステロールを減少したが（ビヒクルの１７７．７±１１．８ｍｇ／ｄＬと比較して総コレステロールは６３．０ ２．４９ｍｇ／ｄＬ）（ｐ＜０．０００１）、一方、ＬＤＬからＨＤＬコレステロールへの変更を引き起こす潜在性があった（図３１Ｂ）。ペプチドＸ−ＰＥＧは、ＬＤＬおよびＨＤＬコレステロールを両方とも減少したが、トリグリセリドには有意な効果がなかった（図３１Ｃ）。レプチンにおける有意な減少があった（ペプチドＹ−ＰＥＧでは３３４３±７２３．３ｐｇ／ｍｌ；ペプチドＸ−ＰＥＧでは７３０８±２９２７、ビヒクルでは１８，６４２±６１２４；ｐ＝０．０４２６；図３１Ｄ、３１Ｅ、３１Ｆ）。２７日間の長期的処置も、肝脂肪含有量を正常化したが、一方、対照ＤＩＯマウスは、顕著な脂肪肝を維持した（データ示されず）。

【0425】

＜実施例４９＞
ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧによる１か月の処置は、ＤＩＯマウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）におけるホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）のリン酸化の増加をもたらし（ペプチドＸ−ＰＥＧ：１．１３５±０．３１５；ペプチドＹ−ＰＥＧ：１．６２５±０．１４９；ビヒクル：０．５９７±０．２０４；ｐ＝０．０３６９；図３２Ｂ）、ＷＡＴ脂肪分解に対するグルカゴン特異的な直接効果を示唆した。ペプチドＹ−ＰＥＧおよびペプチドＸ−ＰＥＧの３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週の用量により２週間処置されたマウスにおいて、脂肪量の減少と同時に、対照マウスと比較して、卵巣上皮脂肪組織の脂肪細胞の大きさに有意な低減があった（データ示されず）。しかし、脂肪量の減少および脂肪細胞の小型化にもかかわらず、ペプチドＹ−ＰＥＧおよびペプチドＸ−ＰＥＧによる２週間の短期処置は、ＣＤ６８のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量化された、脂肪組織マクロファージの有意な低減と関連しなかった。（図３３Ｃ）。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）中の脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）は、ペプチドＸ−ＰＥＧにより増加したが、ペプチドＹ−ＰＥＧ処置では増加せず（ペプチドＸ−ＰＥＧ ２．１６７±０．４２９、ペプチドＹ−ＰＥＧ １．２８７±０．１５５８、ビヒクル １．０±０．１１８；ｐ＝０．０２６４；図３２Ａ）、これはＢＡＴの安静時熱産生に対するＧＬＰ−１の特異的作用と一致した。肝臓糖新生を反映する肝臓遺伝子発現は、ペプチドＸ−ＰＥＧまたはペプチドＹ−ＰＥＧのいずれによっても影響を受けなかった（図３０Ｈおよび３０Ｉ）。組織学は、膵臓島がペプチドＸ−ＰＥＧ処置の後で小さくなる傾向を示した（データ示されず）。

【0426】

＜実施例５０＞
ペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧのＧＬＰ−１ＲおよびＧｃｇＲアゴニスト構成要素の寄与を分析するために、それぞれ、高脂肪食餌に維持したＧＬＰ−１受容体ノックアウト（ＧＬＰ−１Ｒ−／−）マウスに１か月投与した。ペプチドＸ−ＰＥＧは、食塩水と比較して、体重（ｐ＞０．０５；図３４Ａおよび３４Ｂ）および脂肪量（ｐ＞０．０５；図３４Ｃ）の低減を引き起こした。ペプチドＹ−ＰＥＧは、ＧＬＰ−１Ｒ−／−マウスにおいて体重（ｐ＝０．００２５）および脂肪量（（ｐ−０．００２５）に有意な減少を引き起こした（図３４Ａ〜３４Ｃ）。ペプチドＸ−ＰＥＧは、ＧＬＰ−１Ｒ−／−マウスにおいて食物摂取に対して効果がなかったが、一方、ペプチドＹ−ＰＥＧは、食物摂取を有意に抑制した（ｐ＝０．０１７）（図３４Ｄ）．ペプチドＹ−ＰＥＧは、機能性ＧＬＰ−１Ｒの不在下でのグルコース負荷試験において血中グルコースを増加する傾向を有し（ペプチドＸ−ＰＥＧは有さず）（ｐ＝０．０３）（図３４Ｅおよび３４Ｆ）、コアゴニストのＧＬＰ−１の構成要素が、グルカゴン誘導高血糖に対して保護するために必要であることを示唆した。

【0427】

＜実施例５１＞
グルカゴンアゴニズムに起因すると考えられるペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧの効果についての独立した評価として、同等のＧＬＰ−１Ｒ効力を有するがＧｃｇＲ活性の著しく異なる、２つの追加的なペプチドアゴニストを試験した。２つのペプチド（ペプチドＵおよびＶ）は、ペプチドＸ−ＰＥＧおよびＹ−ＰＥＧと関連する。ペプチドＵおよびＶは、以下の修飾：位置１６にＧｌｕ、位置１７にＧｌｎ、位置１８にＡｌａ、位置２０にＬｙｓ、位置２１にＧｌｕ、位置２３にＩｌｅおよび位置２４にＣｙｓ、を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むが、位置２４のＣｙｓに２０ｋＤペグ化を含み、位置２にＡＩＢを含まなかった。ペプチドＶは、追加的に、ＧｌｕにＧｌｎ３の置換を含み、これはグルカゴンアゴニズムを選択的に１０倍を超えて低減した。ペプチドＵもペプチドＶもラクタム架橋を含まなかった。ペプチドＶの５０ｎｍｏｌ／ｋｇのｓ．ｃ．によりＤＩＯマウスを毎日、１週間処置すると、ペプチドＵと比べて低減された、体重低下に対する効果を明らかにした（それぞれ、−９．０９±０．８０対−１３．７１±０．９２ｇ）（ｐ＜０．０００１；図３５Ａ）。

【0428】

＜実施例５２＞
γ−Ｇｌｕスペーサーまたはγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介してＬｙｓ残基に結合しているＣ１６脂肪アシル基を含み、該Ｌｙｓ残基が位置１０またはＣ末端（位置２９）に位置しているグルカゴンペプチドを、本明細書に実質的に記載された通りに作製した。ペプチドを、本明細書に記載されているように、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対するインビトロ活性について試験した。結果を表３１に示す。

【0429】

【表31】

【0430】

＜実施例５３＞
表５３に示されているペプチドは、本明細書に実質的に記載された通りに作製した。

【0431】

【表32】

【0432】

表３２のペプチドは、配列番号６２４、６３１および６３２のペプチドを除いて、全て、グルカゴンとＧＬＰ−１の両方の受容体に対して強力なインビトロ活性を示した。

【0433】

表３３に概説されている変化以外は天然グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸を含む、Ａセットのペプチドは、本明細書に実質的に記載された通りに作製する。

【0434】

【表33】

【0435】

位置２７のＭｅｔがノルロイシンに代わっている以外はＡセットのペプチドと同じ構造を有するペプチドは、本明細書に実質的に記載された通りに作製する。これらの修飾ペプチドはＢセットのペプチドである。

【0436】

位置２４のＧｌｎが、４０ｋＤａ ＰＥＧに共有結合しているＣｙｓに代わっている以外はＡおよびＢセットのペプチドと同じ構造を有するペプチドは、本明細書に実質的に記載された通りに作製する。これらペグ化ペプチドはＣセットのペプチドを形成する。

【0437】

位置１０のＴｙｒが、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１６またはＣ１８脂肪アシル基に共有結合しているＬｙｓに代わっている以外はＡ、ＢまたはＣセットのペプチドと同じ構造を有するペプチドは、本明細書に実質的に記載された通りに作製する。Ｃ８脂肪アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｄセットのペプチドを形成する。Ｃ１２脂肪アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｅセットのペプチドを形成する。Ｃ１４脂肪アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｆセットのペプチドを形成する。Ｃ１６脂肪アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｇセットのペプチドを形成する。Ｃ１８脂肪アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｈセットのペプチドを形成する。

【0438】

脂肪アシル基が、スペーサーを介して位置１０のＬｙｓに結合している以外は、ＤからＨのセットのペプチドと同じ構造を有するペプチドは、本明細書に実質的に記載された通りに作製する。γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕスペーサーを含むペプチドは、Ｉセットのペプチドを形成する。γ−Ｇｌｕスペーサーを含むペプチドは、Ｊセットのペプチドを形成する。Ａｌａ−Ａｌａスペーサーを含むペプチドは、Ｋセットのペプチドを形成する。β−Ａｌａ−β−Ａｌａスペーサーを含むペプチドは、Ｌセットのペプチドを形成する。

【0439】

本明細書に引用されている、出版物、特許出願、及び特許を含む、全ての参考文献は、まるでそれぞれの参考文献が個別にかつ明確に参照として組み込まれているように示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度で、参照として本明細書に組み込まれる。

【0440】

本発明を記載する文脈における（特に、後に続く請求項の文脈における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに類似の参照の使用は、本明細書において特に指定がない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、単数及び複数の両方を網羅することが考慮されるべきである。用語「含む」、「有する」、「含まれる」、及び「含有する」は、特に示されない限り、非限定的用語である（すなわち、「含まれるが、これらに限定されない」を意味する）と考慮されるべきである。

【0441】

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特に指定のない限り、単に、範囲内にあるそれぞれ別個の値及びそれぞれの終点を個別に参照するための省略的な方法として機能することが意図され、それぞれの別個の値及び終点は、まるで本明細書において個別に引用されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0442】

本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において特に指定のない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書において提供されている任意の又は全ての例又は例示的な言葉（例えば「のような」）は、単に本明細書をより良好に説明することだけが意図され、特に請求項に記載されていない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書におけるどの言葉も、請求項に記載されていない何らかの要素が本発明の実施に必須であることを示している、と考慮されるべきではない。

【0443】

本発明を実施するために、発明者たちが知っている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施態様が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施態様の変更は、前述の記載を読むことにより当業者に明らかとなりうる。発明者たちは、当業者がそのような変更を適切な場合に用いることを予想し、発明者たちは、発明が本明細書に特定的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法令が許す限り、添付の請求項に引用されている主題の全ての修正及び等価物を含む。更に、全ての可能な変更における上記記載の要素の任意の組み合わせは、本明細書において特に指定のない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、本明細書に包含される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]