特許 5777522 初期段階の関節リウマチ治療用のＩＬ−３阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5777522

(24)【登録日】2015年7月17日

(45)【発行日】2015年9月9日

(54)【発明の名称】初期段階の関節リウマチ治療用のＩＬ−３阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20150820BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150820BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150820BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20150820BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 D

   A61P19/02

   A61P29/00 101

   A61K45/00

【請求項の数】19

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2011-538903(P2011-538903)

(86)(22)【出願日】2009年12月4日

(65)【公表番号】特表2012-510966(P2012-510966A)

(43)【公表日】2012年5月17日

(86)【国際出願番号】EP2009008703

(87)【国際公開番号】WO2010063488

(87)【国際公開日】20100610

【審査請求日】2012年10月1日

(31)【優先権主張番号】08021114.7

(32)【優先日】2008年12月4日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】511136153

【氏名又は名称】クリニクム デル ウニヴェルシュテート レーゲンスブルク

【氏名又は名称原語表記】ＫＬＩＮＩＫＵＭ ＤＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴ ＲＥＧＥＮＳＢＵＲＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100119530

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 和幸

(74)【代理人】

【識別番号】100175606

【弁理士】

【氏名又は名称】上利 美由紀

(72)【発明者】

【氏名】マチアス マック

(72)【発明者】

【氏名】ブルー ヒルキ

【審査官】 光本 美奈子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２２１１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５４１０６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０００／００９５６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０７−１６５６０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PE Rat Anti-Mouse IL-3，ＵＲＬ，http://www.bdbiosciences.com/ds/pm/tds/554383.pdf

【文献】 J Immunol, vol.143, p.3211-3216 (1989)

【文献】 Am J Hum Genet, vol.68, p.674-685 (2001)

【文献】 Arthritis Rheum, vol.60, p.1352-1361 (2009)

【文献】 Blood, vol.87, p.83-92 (1996)

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ １／００〜４３／００

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

関節リウマチの予防処置用、初期のもしくは悪化の初期相の間の関節リウマチの治療用、または被験者の疾患再燃もしくは疾患進行を妨げる維持療法用の、抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項2】

１つまたは複数の関節におけるＩＬ−３量の増加が検出される、被験者の関節リウマチの治療用の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項3】

進行した関節リウマチを罹患しているが、疾患活動性がないかまたは低度から中程度である被験者の関節リウマチの治療に使用される、請求項１または請求項２に記載の維持療法に使用される抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項4】

被験者における疾患活動性スコア２８（ＤＡＳ２８）の値が５．１までである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項5】

被験者における疾患活動性スコア２８（ＤＡＳ２８）の値が３．２までである請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項6】

ＩＬ−６の血漿濃度を低減させるために使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項7】

関節リウマチの進行を阻害する、または低減させるために使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項8】

軟骨破壊を回避する、または低減させるために使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項9】

滑膜組織の細胞浸潤を低減させるために使用される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項10】

好塩基球数を減少させるために使用される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項11】

被験者が、哺乳動物、特にヒトである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項12】

前記抗ＩＬ−３抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、またはこれらの断片もしくは変異体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項13】

前記抗ＩＬ−３抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１２に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項14】

前記抗ＩＬ−３抗体が、ＩＬ−３を遮断する、またはＩＬ−３のその受容体に対する結合を遮断する、またはＩＬ−３の産生を遮断する薬剤である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項15】

抗ＩＬ−３抗体が、ＩＬ−３を特異的に阻害する、または、
ＩＬ−３のその受容体への結合を特異的に遮断する、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項16】

ヒトＩＬ−３の生物活性を中和する濃度の抗ＩＬ−３抗体、および製薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体を含む組成物。

【請求項17】

関節リウマチを治療する薬剤を調製するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体の使用。

【請求項18】

中和用量（ＮＤ_５０）の抗ＩＬ−３抗体が用いられる、請求項１７に記載の使用。

【請求項19】

併用薬として、ＮＳＡＩＤｓおよびＤＭＡＲＤｓ等から選択される関節リウマチの治療に有効な薬剤と組み合わせた、抗ＩＬ−３抗体を含む、関節リウマチの治療のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、関節リウマチの予防処置、関節リウマチの悪化の初期相および関節リウマチの維持療法に用いられるＩＬ−３阻害剤に関する。

【背景技術】

【0002】

関節リウマチ（ＲＡ）は、工業化社会の０．５〜１％の人口に影響を与える、慢性的な炎症性かつ破壊性の関節疾患であり、一般的に、著しい身体障害を引き起こし、結果的にクオリティオブライフを低下させる。男性よりも女性において、罹患率が２〜３倍高く、いかなる年齢層でも発症しうるが、４０歳と６０歳との間に発症率のピークがある。関節リウマチは、高いコストを伴い、また適切な治療がなされなければ、寿命の短縮を伴う。ＲＡは、内膜、滑膜、関節および／または他の器官の慢性的炎症を特徴とする。ＲＡは、手、足および膝のみならず脊椎にも生ずる、多発性関節炎である。関節外での症状を併発することも、ＲＡの別の特徴であり、これは、リウマトイド結節から重篤な血管炎にまで及び得る。炎症細胞は、骨および軟骨に侵入して、損傷を与え得る。発症した関節においては、その形状および配列が緩くなる傾向があり、これにより可動性を失う。ＲＡを伴う患者には、関節に、痛み、こわばり、発赤および腫れがあり、また発熱のような他の全身症状があり得る。疾患は、しばしば、悪化または再燃という形で断続的に進行する、すなわち、高い疾患活動性を伴う時期と、低度または中度の活動性を伴う時期とが交互に生じ；これらの時期の持続時間が一定しない。ＲＡは、自己免疫反応、すなわち不適切な免疫反応の機序により生ずると推測されているものの、その病理は完全にはわかっていない。

【0003】

一般的に、サイトカインは炎症性疾患に関与する。不規則および／または異常な炎症は、広範囲に渡るヒトの疾患の主要な要素であり、その１つが関節リウマチ（ＲＡ）である。

【0004】

炎症性疾患に関与するサイトカインの１つの主要なサブグループが、インターロイキンファミリーである。インターロイキンは、Ｔ−細胞活性化機序、およびそれによる炎症の変化に関与する。それらは、多様な細胞応答の誘発、およびＴ_Ｈ１またはＴ_Ｈ２細胞のいずれかへの分化に関与する。

【0005】

ＩＬ−３は、インターロイキンファミリーのメンバーの１つであり、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦと共に、４つの短いα−ヘリックスバンドルを有する造血性サイトカインのファミリーに属する。これらのサイトカインの各々は、特有のα−受容体サブユニット（例えば、ＩＬ−３に対するＩＬ−３Ｒα）と結合する。シグナル伝達は、サイトカインのいずれに対しても結合することができない共通のβ−受容体サブユニット（β−Ｃ）により仲介される。マウスでは、ＩＬ−３Ｒαサブユニットと排他的に結合する、第２のβ−受容体サブユニット（βＩＬ−３）が同定された（２）。

【0006】

リウマチのプロセスで滑膜に浸潤するＴ細胞は、主として、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γだけでなくＩＬ−３をも産生するＣＤ４^＋メモリーＴ細胞である。しかしながら、Ｔ細胞からのＩＬ−３の分泌の制御についてほとんど知られていない。ＩＬ−３は、ＣＤ３４^＋造血前駆細胞の増殖、分化および生存に寄与する。ＩＬ−３遺伝子の破損は、基礎の造血に影響しないものの、ＩＬ−３は、感染が生じた場合に、好塩基球および組織型マスト細胞の数の増加を補助するために必要である。体外試験(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)で、ＩＬ−３は、骨髄細胞由来の好塩基球およびマスト細胞の分化を促進する（４−７）。ＩＬ−３は、好塩基球によるヒスタミンおよびＩＬ−４の放出を促進し、また誘導することが報告されている（８−１２）。単球／マクロファージでは、ＩＬ−３は、ＭＨＣ−ＩＩ発現を増加させ、かつＬＰＳ（リポ多糖）誘導性ＩＬ−１の分泌を向上させる（１３、１４）。ＩＬ−４またはＩＦＮ−βと共に、ＩＬ−３は、単球の樹状細胞への分化を補助する（１５、１６）。また、ＩＬ−３による破骨細胞様細胞の誘導も記載されている（１７、１８）。

【0007】

今日まで、関節炎または関節リウマチにおけるＩＬ−３の役割についてほとんど知られていなかった。初期の研究では、ＩＬ−３ ｍＲＮＡは、ＲＡ患者の滑膜において検出されず（１９）、線維芽細胞様滑膜細胞に対するＩＬ−３の効果は、観察されなかった（２０）。しかしながら、遺伝子分析により、ＩＬ−３プロモータにおける一塩基多型と関節リウマチとの間の関連性が見いだされた（２１）。

【0008】

多くのサイトカインが、炎症性マーカーまたは抗炎症性メディエーターであることは、主張されまたは既に示されている。炎症性サイトカインとしての、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαに焦点が当てられてきた。国際公開第２００５／０６９９３３号において、抗炎症療法で単一の炎症性サイトカインを標的とするそれらの戦略は、非常に重要な事実をないがしろにしていることが示唆された、すなわち、炎症関連疾患は、サイトカインの高度のネットワークシステムに関わっているということである。免疫系の機能は、炎症促進性および抗炎症性のメディエーターまたはサイトカインの活性により、うまく均衡が保たれていること、ならびにある特定の炎症性サイトカインをブロックするのに、複数のサイトカインの調節が好適であることがそこで述べられている。従って、国際公開第２００５／０６９９３３号は、多数の炎症性サイトカインを阻害する特定の化合物を使用することを提案する。この考えはまた、米国特許出願公開第２００７／０１１０７４６号明細書にも示されており、炎症性障害の治療では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合をブロックすることができる少なくとも二つの物質が、接着分子とその受容体との結合を遮断するために用いられるべきであることを示す。

【0009】

ＲＡが反応を示す薬物は、そのほとんどが高い副作用のリスクをもたらすため、この疾患の治療は困難である。過去に、二つの主要な治療のアプローチがなされた：非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）による対症療法および疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）である。ＮＳＡＩＤｓ、すなわち、主に抗炎症性および鎮痛性の薬が、治療または少なくとも痛みの緩和のために用いられた。それらは、炎症機序のごく一部、すなわち、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸｓ）によるプロスタグランジンの産生を妨害するのみであり、根本的な炎症現象を妨害する、または関節破壊を遅らせることはない。

【0010】

対照的に、ＤＭＡＲＤｓは、疾患プロセスを修正する。近年、ＤＭＡＲＤｓのグループの中で、新しいクラスの生物学的製剤が、サイトカイン、特にＴＮＦαおよびＩＬ−１の、炎症プロセスにおける役割の新たな理解に基づいて開発された。ＤＭＡＲＤｓの例として、メトトレキサート、レフルノミドまたはインフリキシマブ、すなわち抗ＴＮＦα抗体が挙げられる。いくつかの薬は、抗ＴＮＦα抗体と同様に承認されている。しかしながら、ＴＮＦα−またはＩＬ−１受容体アンタゴニストは、炎症プロセスを妨げることが示され、またこのプロセスを制御することができるにもかかわらす、これらの薬の副作用が重過ぎて、その使用が制限されることもまた見出された。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第２００５／０６９９３３号

【特許文献2】米国特許出願公開第２００７／０１１０７４６号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

今日までに提案されたあらゆる治療は、重度の副作用という問題点を有する。従って、ＮＳＡＩＤｓまたはＤＭＡＲＤｓと同じくらい効果的であるが、副作用のより少ないＲＡの治療用の新薬を開発することが、今なお目的とされる。更に、ＲＡの予防処置用の、初期相のＲＡの治療用の、および／または悪化もしくは再燃を予防するための薬物を提供することが目的である。

【課題を解決するための手段】

【0013】

これらの目的は、関節リウマチの治療、特に初期治療および維持療法の新しい分類、すなわちＩＬ−３阻害剤を提供することによって達成された。

【0014】

従って、特に予防処置として、悪化初期、または低度から中程度の疾患活動性の相にあるＲＡの治療のために、関節リウマチに苦しむ患者のＩＬ−３を遮断し、または不活性化することが、本発明の１つの態様である。

【0015】

本願明細書および請求項では、以下の意味を有すると定義される多数の用語を参照する。

【0016】

本願で用いられる「ＩＬ−３を阻害する」という用語は、このサイトカインの活性または機能を阻害すること、特にＩＬ−３のその受容体に対する結合を阻害すること、および／またはその結合により生じるシグナル発生を阻害することを指すものとする。

【0017】

本願で用いられる「ＩＬ−３阻害剤」という用語は、ＩＬ−３のその受容体に対する結合を阻害または遮断する、および／またはシグナル発生機序を妨げるあらゆる物質を指すものとする。ＩＬ−３阻害剤は、また、ＩＬ−３の生物活性を中和するまたはアンタゴナイズするあらゆる物質としてもよく；それは、また、ＩＬ−３放出を妨げる物質としてもよい。好適には、ＩＬ−３阻害剤は、ＩＬ−３を遮断する物質、またはＩＬ−３の放出を選択的に低減する物質である。好適な実施形態では、ＩＬ−３阻害剤は、ＩＬ−３の、ＩＬ−３受容体のα受容体サブユニットに対する結合を特異的に遮断する物質である。

【0018】

好適な実施形態では、ＩＬ−３阻害剤は、ＩＬ−３を特異的に阻害するもしくはＩＬ−３のその受容体への結合を特異的に遮断する抗体、またはその誘導体もしくはその断片、またはＩＬ−３を特異的に阻害する、もしくはＩＬ−３のその受容体に対する結合を特異的に遮断する、もしくはＩＬ−３の産生を特異的に遮断する薬剤、例えば、ＩＬ−３もしくはその受容体に対して結合するリガンド、ＩＬ−３またはその受容体に対して結合するポリペプチドもしくはペプチド模倣薬、ＩＬ−３またはその受容体に対して結合するアプタマーもしくはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）、ＩＬ−３またはその受容体に対する結合活性を有する、もしくはこの結合を調節することができるペプチドまたはポリペプチドをコード化するＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、またはＩＬ−３受容体の部分およびＩｇＧの断片を含む可溶性の構築物から選択される。

【0019】

本願で用いられる「抗体」という用語は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに遺伝子改変された抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、またはヒト化抗体などの修飾抗体を含むものとする。更に、本願で用いられる「抗体」という用語は、断片、変異体、および多量体をも含むものとする。

【0020】

「抗体断片」という用語は、とりわけ、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）_２断片などの、当業者にとって周知であり、かつＩＬ−３またはその受容体に対する結合親和性を有する、あらゆるタイプの断片を含む。断片は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれに由来してもよい。抗体または抗体断片の提供方法は、標準的な方法であり、また当業者に周知である。

【0021】

本願で用いられる「リガンド」という用語は、ＩＬ−３を遮断する、または不活性化するように、特異的に相互作用する能力を有するあらゆる化合物を指す。相互作用は、ＩＬ−３またはＩＬ−３受容体に対する結合であってもよく、その場合、ＩＬ−３はブロックされるか、もしくは不活性化される。または、相互作用は、ＩＬ−３活性化物質に対する結合であってもよい。

【0022】

「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、それぞれ、化学合成により、またはペプチドもしくはポリペプチドまたはその組み合わせをコード化する核酸からの発現により得られるアミノ酸配列を指す。ペプチドまたはポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸、またはこれらの組み合わせを含みうる。更に、ペプチドまたはポリペプチドは、ＩＬ−３またはその受容体に対する結合、ポリペプチドまたはペプチドのＩＬ−３との複合体の固相化、またはＩＬ−３シグナリングの調節に有用な機能を誘導する官能基を有してもよい。

【0023】

「ＩＬ−３を阻害するかまたは遮断するかまたは調整する、ペプチドまたはポリペプチドをコード化する核酸」という用語は、あらゆる生物のまたは合成のソースから選択され得る、または核酸ライブラリーまたはデータベースに包含され得る核酸を指す。それは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、また、修飾されたヌクレオチドを備えた核酸を含む。核酸は、環状の、直鎖状の、および／または単鎖の、二重鎖の、または部分二重鎖の核酸分子といった、あらゆるタイプのものを使用し得る。

【0024】

「アプタマー」という用語は、特定の分子、本願ではＩＬ−３またはその受容体に対する結合能力を有するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。アプタマーは、ＩＬ−３またはＩＬ−３受容体に対する結合能力に基づいて、ランダムプールから標準的な方法により検出できる。アプタマーに関する更なる情報は、（３６）および（３７）に示される。アプタマーは、立体構造に基づいて、特定の標的に対して結合する強い結合性のオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、巨大なコンビナトリアルの核酸ライブラリーから同定することができ、ＰＣＲにより増幅可能である。ライブラリーからのスクリーニングおよび配列の増幅方法は、標準的な方法であり、当業者に周知である。

【0025】

「Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ」または「鏡像ＲＮＡ」は、結合親和性および機能性に関して、アプタマーと類似するが、天然のＤ−オリゴヌクレオチドの代わりにＬ−オリゴヌクレオチドを用いることによって酵素分解を防ぐ構造を有する核酸を指す。Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓのスクリーニングおよび増幅方法は、例えば、（３８）により、当業者に知られている。本願において、ＩＬ−３またはＩＬ−３受容体に結合するＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓが用いられる。

【0026】

本願において用いられる「構築物」という用語は、ＩＬ−３受容体の特異的結合部分が、免疫グロブリンのＦｃ部位と結合する分子を指す。好適な実施形態は、少なくとも１つのα受容体サブユニットおよび／またはβ受容体サブユニット、または、同様な結合能を有するその誘導体を含む、可溶性の構築物である。

【0027】

「予防処置」という用語は、疾患の徴候を進行させていないが、疾患を進行させる素因を有する患者の処置を指す。

【0028】

「関節リウマチの悪化の初期相」という用語は、疾患が進行中であり、疾患活動性がまだ中度または低度である、ならびに／または、関節および／もしくは血漿中のＩＬ−３量が検出可能および／もしくは標準と比較して増大した、疾患段階を指す。ここで標準とは、健常者の関節における平均のＩＬ−３量である。疾患活動性の決定方法、および関節、組織、または他のあらゆる試料中のＩＬ−３量の決定方法は、当業者にとって公知である。

【0029】

「維持療法」という用語は、疾患が活性でない、または疾患活動性が低い相における、関節リウマチの処置を指す。維持療法の目的は、疾患の悪化または疾患の進行を防ぐことである。

【0030】

「増大した」または「低減した」という用語は、標準、すなわち健常者と比較して、増大したかまたは低減したパーセンテージまたは量に従う。

【0031】

「疾患活動性」という用語、または疾患活動性のレベルは、関節リウマチの段階および重症度を指し、異なる疾患スコアを用いて評価されてよい。一般的に用いられる１つの疾患スコアは、「疾患活動性スコア」（ＤＡＳ−２８）である。このスコアは、腫れた関節の数、痛みを伴う関節の数、赤血球沈降速度および他の因子に基づいて算出できる。本願では、疾患活動性スコアを指すときには、ＤＡＳ２８のことを言う。０〜３．２のＤＡＳ２８値は、疾患がないかまたは低度の疾患活動性を示し；３．２〜５．１のＤＡＳ２８値は、中度の疾患活動性に相当し、そして５．１超の値は高度の疾患活動性に相当する。本発明のＩＬ−３阻害剤は、５．１までのＤＡＳ２８スコア、特に、３．２までのＤＡＳ２８スコアを伴う疾患の相に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0032】

本発明はまた、以下の図を参照して説明される。

【図1】コラーゲン関節炎におけるＩＬ−３および好塩基球を示す。パネルＡは、コラーゲンを用いた再刺激後の脾細胞によるＩＬ−３産生を示す。パネルＢは、滑膜組織のサイトカイン量の測定結果を示す。パネルＣは、好塩基球の活性化および生存に対するＩＬ−３の影響を示す。パネルＤは、炎症を生じた足の滑膜組織中の、好塩基球およびマスト細胞の、フローサイトメトリーによる検出を示す。

【図2】関節炎の発症の間の、ＩＬ−３の遮断を示す。パネルＡは、両グループの関節炎スコアおよび発症率を示す。パネルＢは、コラーゲンによる初回免疫後３７日目の前足の分析を示す。パネルＣは、初回免疫後３７日目の、コラーゲン特異的な総Ｉｇの血漿力価（血漿希釈 １：１００，０００）、コラーゲン特異的なＩｇＧ１（血漿希釈 １：５，０００）、および末梢血白血球サブセット（中央および右パネル）の分析を提供する。

【図3】関節炎の発症の間の、ＩＬ−３の遮断を示す。パネルＡは、Ｈ＆Ｅ染色したマウスの足根中足関節の組織部分を示す。パネルＢは、組織学的変化の概要を示す。

【図4】関節炎の発症後の、ＩＬ−３の遮断を示す。

【図5】ＩＬ−３の投与が関節炎を悪化させることを示す。パネルＡは、両グループの関節炎スコアに関するデータおよび発症率を示す。パネルＢは、コラーゲン特異的なＩｇＧ１およびコラーゲン特異的なＩｇＧ２ａ（中央のパネル）の血漿力価およびＩＬ−６（右のパネル）の血漿濃度と同様に、ＩｇＥおよびＣＤ４５に対する抗体を用いた細胞染色により、全白血球のパーセンテージ（左のパネル）として決定される、末梢血中の好塩基球の頻度を示す。

【図6】ＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＬ−３分泌の制御を示す。パネルＡは、様々な細胞についてのＩＬ−３濃度を示す。パネルＢは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞中の細胞内ＩＬ−３のフローサイトメトリーによる検出を示す。パネルＣは、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞に作用することによって、ＬＰＳがＣＤ４^＋Ｔ細胞のＩＬ−３の発現を上方制御することを示す。パネルＤ−Ｆは、ＩＬ−４およびＩＬ−６が、活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＬ−３の放出を抑制することを示す。

【図7】関節炎患者中のＩＬ−３の検出を示す。活性なＲＡを伴う患者８人中６人で、ＩＬ−３が検出可能であり、非活動性ＲＡまたは他のタイプの関節炎を伴う患者では検出できないということがわかる。

【発明を実施するための形態】

【0033】

本発明の発明者らは、驚くべきことに、ＩＬ−３こそが、関節リウマチの発達、特にこの疾患の初期相において関与していることを見出した。ＩＬ−３の有効性が、疾患限定因子であるようである。更に、発明者らは、ＩＬ−３を阻害することによって、関節リウマチのプロセスが停止される可能性があり、悪化または再燃が妨げられるか、少なくとも軽減される可能性があることを見出した。この発見に基づいて、発明者らは、有害な疾患であるＲＡと闘うための新規な戦略を開発した。発明者らは、ＲＡの選択的な治療と、より少ない副作用とを合わせ持つ薬剤を提供することに成功した。

【0034】

１つの機構として、発明者らは、好塩基球がリウマチのプロセスに関わる重要な細胞成分であることを見出した。ＩｇＥに対する抗体による好塩基球の活性化により、コラーゲン関節炎の顕著な悪化が生じることが観察された。しかしながら、好塩基球は、ＩｇＥ表面の架橋だけでなく、他の因子、特に、ＩＬ−３によっても活性化される。ＩＬ−３により活性化された好塩基球は、ＩＬ−４のみならず、同様に有害な作用を有する関節炎促進性サイトカインであるＩＬ−６をも放出する。更に、発明者らは、好塩基球が免疫記憶応答の重要な細胞成分であること、および好塩基球の活性化が関節リウマチの悪化を生ずることを見出した。好塩基球の潜在的な誘導因子および活性化因子としてのＩＬ−３は、重要な役割を演じ、そして、関節炎の発症中に、ＩＬ−３が滑膜組織中に存在することが見出された。驚くべきことに、炎症が進行し、多量のＩＬ−６などの炎症促進性サイトカインが存在すると、ＩＬ−３の量は抑えられる。従って、関節炎の発症の間、関節炎の初期段階または悪化の初期相において、ＩＬ−３が遮断された場合、これにより、末梢血中の好塩基球数の低減、および滑膜白血球浸潤の低減ならびに滑膜のＩＬ−６量の低減を伴う関節炎の臨床学的および組織学的な徴候の顕著な向上が生じるであろう。関節炎の後期相においてＩＬ−３を遮断する薬剤の使用はほとんど効果的でないことが見出された。

【0035】

発明者らは、ＩＬ−３を阻害することによって、更なる進行機序、つまり、関節リウマチを特徴付ける炎症プロセスの進行を停止させることができると結論付けた。更に、発明者らは、培養物において、非常に低い濃度のＩＬ−３であっても、好塩基球からのＩＬ−６の顕著な放出を誘導するだけでなく、好塩基球の生存を長期化させることを見出した。好塩基球が炎症促進性サイトカインを放出するので、好塩基球の活性化を阻害することによって、また、好塩基球のより長期の生存を阻害することによって、ＲＡの進行は停止させることができる。従って、ＩＬ−３放出の選択的な低減またはＩＬ−３の遮断によって効果を奏することができる。ＩＬ−３の遮断は深刻な副作用（例えば、（３））を引き起こさないことが見出されている。つまり、発明者らは、ＩＬ−３が、末梢血中の好塩基球数を増大させて、血漿中のＩＬ−６濃度をより高くし、そして、関節炎の顕著な悪化を誘導することを示した。

【0036】

従って、発明者らは、関節リウマチが、関節リウマチのプロセスの停止を引き起こすＩＬ−３の遮断により治療される可能性があり、好塩基球および他のＩＬ−３応答性細胞がもはや活性化されず、そして炎症が減少すると結論付けた。

【0037】

従って、本発明は、関節リウマチの予防処置用、関節リウマチの初期段階、関節リウマチの悪化の初期相における治療、および関節リウマチの維持治療のＩＬ−３阻害剤を提供する。

【0038】

本発明の１つの実施形態では、ＩＬ−３阻害剤、特に上記で定義したＩＬ−３阻害剤が、疾患の発症を妨げるために、関節リウマチの発達に関する素因を有する患者の予防処置に用いられる。

【0039】

本発明の更なる実施形態では、ＩＬ−３阻害剤が、上記で定義した、初期段階の関節リウマチの治療に用いられる。初期相の関節リウマチの症状が患者に見られた場合、ＩＬ−３阻害剤をできるだけ早期に投薬するべきである。患者の初期相の診断は、疾患活動性スコアを使用するか、または関節リウマチの一般的な決定因子によりなされる。初期相の関節リウマチの存在は、損傷した関節におけるＩＬ−３量の測定により決定されてもよい。ＩＬ−３の測定は、当業者に周知の分析方法を用いてなされ得る。患者が初期段階のＲＡを患っているかどうかを判断するために、上述の疾患活動性スコアを測定することが有用であるＤＡＳ２８の値が５．１以下、好適には３．２以下である場合、これは、低度から中度のＲＡの活性があるという示唆であり、ＩＬ−３阻害剤での治療に適しているといえる。

【0040】

ＲＡの状態を決定するための、およびＩＬ−３阻害剤での治療の効能を追跡するための別のツールは、患者の血清中の抗ＣＣＰ抗体などのバイオマーカーの量の測定である。ＣＣＰ抗体を測定する有用な方法は、当業者に知られており、文献に記載されている。抗ＣＣＰ抗体などのバイオマーカーの測定方法は、例えば、欧州特許出願公開第１９８０８５５号明細書に記載され、かかる方法は本発明についても有用である。

【0041】

更なる実施形態では、本発明のＩＬ−３阻害剤は、ＲＡの進行中の、悪化もしくは再燃の初期相の治療に、またはＩＬ−３量が増大したときに使用する。再燃の間のＲＡの進行段階においても、ＩＬ−３量は上昇し得ることが見出された。これらの場合、再燃は、ＩＬ−３阻害剤の投薬により、防止できるか、または少なくとも軽減できる。患者が、悪化または再燃の初期相にあるかどうかを判断するための有用なツールが、ＤＡＳ２８である。ＤＡＳ２８の値が、痛みのより少ない期間の後に上昇し始める場合、これは、悪化であるため、本発明のＩＬ−３阻害剤による即時の治療が有用であるといえる。。

【0042】

関節リウマチの初期段階または進行／活性段階において、ＩＬ−３は疾患限定因子であること、およびこれらの段階は検出可能なおよび／または増大した関節中のＩＬ−３量と関連することが見出された。この点について、「増大したＩＬ−３量」は、通常のＩＬ−３量と比較して３０％超増大したＩＬ−３量を指す。

【0043】

活動性の関節リウマチを患う患者では、ＩＬ−３量を検出することができるものの、健常者、もしくは活動性の関節リウマチもしくは他のタイプの関節炎を伴っていない患者においては、滑液中もしくは血漿中には、ＩＬ−３は、存在しないか、または検出可能なごく少量のみがあるということが見出された。従って、活動性のＲＡを有しない個体ではＩＬ−３量を検出可能できない、標準的な個体群においては、関節リウマチの悪化の初期相または関節リウマチの活性状態は、血漿中または滑液中のＩＬ−３量が、血漿または滑液中で３ｐｇ／ｍＬ超、好適には５ｐｇ／ｍＬ超、より好適には７．５ｐｇ／ｍＬ超、更により好適には血漿または滑液中で９．５ｐｇ／ｍＬである患者について診断される。

【0044】

ＲＡの治療に有用な、ＩＬ−３を阻害する様々な方法存在する。ＩＬ−３の生物活性が、好塩基球および他の因子の活性化を回避するために中和されることが必要不可欠である。

【0045】

１つのアプローチでは、ＩＬ−３の結合部位またはその受容体が遮断される、例えば、立体的に妨害されるように、ＩＬ−３の阻害は、ＩＬ−３に対して、またはその受容体、または両方に対して結合する抗体により達成されてよい。別のアプローチでは、ＩＬ−３受容体よりもＩＬ−３に対してより高い親和性を有する物質を用いて阻害を起こしてもよく、この場合、ＩＬ−３を遮断するか、ＩＬ−３を受容体から置換することができる。ＩＬ−３の受容体に対する親和性と比較して、ある物質の親和性は、当業者に周知の方法、例えばリガンドバインディングアッセイにより測定することができる。

【0046】

ＩＬ−３阻害剤として抗体を用いる場合、あらゆるタイプの抗体を使用することができ、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、またはその断片またはそれらをコードするＤＮＡを用いることができる。従って、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、広い意味で用いられ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含み、免疫グロブリン分子の、断片、および二重特異性ならびに三重特異性の抗体などの多量体、標準的な分子生物学的技術を用いて生産される抗体もしくは抗体断片を包含する融合タンパク質、一本鎖抗体、およびヒトもしくはヒト化免疫グロブリン分子もしくはその断片をも含む。ＩＬ−３のその受容体に対する結合を遮断するのに十分な程度に、ＩＬ−３もしくはＩＬ−３受容体に対して物理的に結合するあらゆる抗体もしくはその断片を、本発明に用いることができる。

【0047】

抗体は、ＩＬ−３のその受容体に対する結合が妨げられる限り、ＩＬ−３またはＩＬ−３受容体のどの部位に対して結合してもよい。抗体は、β−受容体サブユニットに結合することによって、α−受容体サブユニットに結合するか、またはシグナル伝達を遮断することができる。阻害は可能な限り特異的とし、好適には、抗ＩＬ−３抗体はα受容体サブユニットに対して結合するか、または遮断するべきである。抗ＩＬ−３抗体は、他のサイトカインと結合しないか、または極めて低い程度にのみ結合することが必要不可欠である。「選択的に」ＩＬ−３に結合する抗体は、他のサイトカイン、すなわちＩＬ−５との交差反応性が低い抗体である。結合を遮断する抗ＩＬ−３抗体は、市販されており、文献、例えば、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８８， １４０ （１：１３１−１３７）および下記の３２から３５に記載される。

【0048】

本発明に有用な抗体として、市販のものを購入することができる。それらは、当業者に周知の方法を用いて作製され得る。当業者は、ＩＬ−３またはＩＬ−３受容体または完全ＩＬ−３または完全ＩＬ−３受容体を発現する細胞、またはその一部のどの部分が、本発明において有用な抗体を作成するための抗原として有用かを知っている。本発明について有用な抗体を作製するために用いるポリペプチドは、部分的にまたは全部、天然資源から精製されてよく、または、当業者に周知の組み換えＤＮＡ技術もしくはペプチド合成技術を用いて合成してもよい。例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−３受容体またはその断片をコード化するＤＮＡは、原核細胞もしくは真核細胞中で発現させることができ、その後、組み換えタンパク質を、精製し、そしてモノクローナルまたはポリクローナル抗体を生産する動物中での免疫反応の惹起に用いてもよい。当業者は、動物中で免疫反応を引き起こすための、または抗体断片を包含するファージライブラリをスクリーニングするための、ポリペプチドの最も適した部分を選択する方法を知っている。当業者に周知の通り、必要に応じて、抗体を産生するために、アジュバンドを用いてもよい。一例として、市販のエピトープおよびペプチド抗体パッケージを含む、少なくとも１２以上のアミノ酸からなるペプチドを使用してもよい。更に、２以上のタイプのモノクローナル抗体または２価以上のポリクローナル抗体は、あらゆる組み合わせで作製し、され、また使用してよく、すなわち、異なるタイプのモノクローナル抗体を組み合わせてもよく、また異なる価数のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を、ＩＬ−３の阻害に必要とされる最適な特異性および親和性を有する調製物を得るために組み合わせてもよい。

【0049】

抗体の活性および親和性の試験は、当業者にとって周知である。適用できる方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡおよび免疫細胞化学、リガンドバインディングアッセイ、ＩＬ−３依存的細胞増殖、細胞活性化、およびフローサイトメトリーが挙げられる。指導は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８８ などの教科書中に見つけられ得る。

【0050】

モノクローナル抗体は、実質的に同種の個体群の抗体または抗体断片から取得する。すなわち、個体群内の個体の抗体はその特異性および親和性において同一である。モノクローナル抗体は、それらが所望の阻害活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサプクラスに属する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは同種であるが、残りの鎖は別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサプクラスに属する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは同種であるキメラ抗体、およびかかる抗体の断片を含む。

【0051】

本発明に有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載される、周知のハイブリドーマ技術を用いて調製されてよい。ハイブリドーマを作製するため、マウスまたは他の適当な宿主動物は、完全なＩＬ−３もしくはＩＬ−３の抗原性部位またはＩＬ−３受容体またはそれらの断片により免疫され、ＩＬ−３またはＩＬ−３受容体に対して特異的に結合する抗体を、産生するかまたは産生することができる白血球を誘発する。当業者に周知の方法で、免疫反応を高めるアジュバンドを用いてもよい。適したリンパ球を選別し、ミエローマ細胞との融合させることにより不死化させ、ハイブリドーマを得る。

【0052】

モノクローナル抗体を、当業者に周知の組み換えＤＮＡ技術によっても作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の方法を用いて、単離し、シーケンスする。抗体または活性抗体断片のライブラリーを、当業者に周知のファージディスプレイ技術を用いて作製し、選別することができる。組換え抗体、抗体断片、それらの融合物およびポリマーは、生体外で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、または原核細胞、例えばバクテリア、または真核細胞、例えば酵母、昆虫または哺乳類細胞で発現させてもよく、かつ周知の方法を用いて更に精製してもよい。

【0053】

一価抗体を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で調製する方法を採用してもよい。抗体の断片の作製方法は、当業者に周知である。すなわち、Ｆａｂ断片は、パパインを用いて作製でき、一方、（Ｆａｂ）’_２断片はペプシンを用いて作製できる。

【0054】

特異的に結合する抗ヒトＩＬ−３抗体は、例えば、Ｒ＆Ｄシステム社、クローン４８０６ ａｎｄ ４８１５ （カタログＮｏ． ＭＡＢ２０３ ａｎｄ Ｎｏ． ＭＡＢ６０３）、およびＢＤバイオサイエンス社、クローン ＢＶＤ３−１ Ｆ９ ａｎｄ ＢＶＤ８−３Ｇ１１ （カタログＮｏ． ５５４６７４ ビオチン ラット 抗ヒト ＩＬ−３ ０．５ ｍｇ； Ｎｏ． ５５４６７１ 精製 ＮＡ／ＬＥ マウス 抗ヒト ＩＬ−３ ０．５ ｍｇ）から市販されているか、または発表されている（Ｆ１４−５７０， Ｆ１４−７４６， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９１， １４６：８９３−８９８）。好適な実施形態では、これらの抗体の１つまたはその断片を、ＩＬ−３に対する特異性および親和性についての対照として用い；好適には、少なくともこれらの市販のもののうちの１つと同様の、特異性および親和性を伴ってＩＬ−３に対して結合している抗体を用いる。他の抗ＩＬ−３抗体を用いてもよい。公知の抗体と比較した抗体の親和性は、当業者に周知の方法、例えば競合ＥＬＩＳＡ法により測定してもよい。

【0055】

１つの抗体が、他の抗体と同様の中和活性または同様のエピトープ特異性を有するかどうかを検出する試験は、当業者にとってありふれたものであり、有用なアッセイ法も公知の方法である。更に、モノクローナル抗体が認識するエピトープの、特異的に結合する抗体による同定は、以下のように行われる。まず、モノクローナル抗体が認識する、分子の様々な部分構造を準備する。部分構造は、分子の様々な部分ペプチドが、公知のオリゴペプチド合成技術により合成的に調整されることを特徴とする方法により、また所望のポリペプチド部分をコード化するＤＮＡが、適した発現プラスミド中に導入され、そして適したホスト、例えばＥ．ｃｏｌｉ中で発現されることを特徴とする方法により調整され、そのペプチドを生産する。一般的に、上記目的のために、両方法はよく、組み合わせて用いられる。例えば、適当に低減した長さを有し、抗原タンパク質のＣ−またはＮ−末端から働く一連のポリペプチドは、確立された遺伝子工学的技術により調整されてよい。エピトープ部位についての大まかな考えは、どの断片が抗体と反応するか立証することによって得られる。エピトープは、確立されたオリゴペプチド合成技術を用いて、それに対応する様々な小分子オリゴペプチド、またはそのペプチドの変異体を合成することによってより詳細に同定され、本発明に関して有用な更なる抗体の調製の基盤となる、そのペプチドの抗ＩＬ−３モノクローナル抗体に対する結合特性、および抗原に対するペプチドの結合の、モノクローナル抗体を用いた競合阻害が決定される。市販のキットは、広く様々なオリゴペプチドを得るために便利に用いられ得る。

【0056】

「抗体」という用語は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体をも指すものとしてよい。非ヒト抗体は、ヒトに投与されると、望ましくない免疫反応を生じるため、当技術分野で周知の方法を用いてヒト化されるべきである。

【0057】

好適な実施形態では、本発明にしたがって、ヒト化抗体を使用する。抗体ヒト化技術は、一般的に、抗体分子の１つまたは複数のポリペプチド鎖をコード化するＤＮＡ配列を操作する組換えＤＮＡ技術の使用を含む。従って、非ヒト抗体のヒト化型またはその断片は、キメラ抗体、または抗体鎖、または、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’などの断片、またはヒト抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト抗体由来の抗原結合部位の一部を包含する、抗体の他の抗原結合部分である。好適な実施形態では、クローン４８０６、４８１５、ＢＶＤ３．１Ｆ９、ＢＶＤ８−３Ｇ１１、Ｆ１４−５７０またはＦ１４−７４６のうちの１つのクローンにより産生された抗体をヒト化型として用いた。

【0058】

ヒト化抗体を生成するために、レシピエントの抗体分子の１つまたは複数の相補鎖決定領域（ＣＤＲｓ）由来の残基が、所望のＩＬ−３またはＩＬ−３受容体結合特性を有することが知られている、ドナーの抗体分子、例えば、上記のクローン４８０６、４８１５、ＢＶＤ３．１Ｆ９、ＢＶＤ８−３Ｇ１１、Ｆ１４−５７０、Ｆ１４−７４６のうちの１つにより産生される抗体の、１つまたは複数のＣＤＲｓ由来の残基により置き換えられる。ときに、ヒト抗体のＦｖフレームワークの残基は、相当する非ヒトの残基により置き換えられ得る。また、ヒト化抗体は、所望の特性を誘導するために他の残基を包含してもよい。従って、本発明については、いくつかのＣＤＲの残基および場合によっていくつかのフレームワークの残基が、クローン４８０６、４８１５、ＢＶＤ３．１Ｆ９、ＢＶＤ８−３Ｇ１１、Ｆ１４−５７０、Ｆ１４−７４６のうちの１つにより産生される抗体中の類似した部位に由来する残基により置換される。非ヒト抗体のヒト化方法は、当業者にとって周知である。例えば、ヒト化抗体は、齧歯類のＣＤＲｓまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の相当する配列で置換することによって生成することができる。

【0059】

更に、ヒト抗体は、当技術分野で記載されるヒトモノクローナル抗体作製技術を用いて調製することもできる。例えば、ヒト抗体を、ファージディスプレイライブラリを用いて作製してもよい。

【0060】

ヒト抗体は、トランスジェニック動物から得てもよい。例えば、免疫に応答してあらゆるレパートリーのヒト抗体を産生することができるトランスジェニックおよび変異体のマウスは、当技術分野で既知の技術である。具体的には、これらのキメラおよび生殖系列の変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合型欠失により、内在性の抗体産生が阻害され、かつヒト生殖系列の抗体遺伝子アレイの、かかる生殖系列変異体マウスへの転移がなされることにより、抗原攻撃のときにヒト抗体が産生される。所望の活性を有する抗体は、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーなどの周知の技術を用いて選別することができる。

【0061】

抗体または抗体断片は、特異的性質を達成するために、挿入、削除、置換、または特定の領域もしくは特定のアミノ酸残基の他に選択された修飾を含んでもよい。更に、抗体または抗体断片は、特異的性質を提供するために、他の配列または特定の官能基に結合させてもよい。例えば、ジスルフィド結合することが可能なアミノ酸を除去または付加する修飾を行い、生体内寿命を増大させ、分泌特性等を変化させてもよい。これらのあらゆる変更を、抗原の特異性および親和性を実質的に変えない条件下で行うことができる。抗体または抗体断片の機能および活性領域は、当業者に周知のように、タンパク質の特定領域の変異導入、それに続く発現および発現されたポリペプチドの試験を行うことで同定および／または向上することができる。例えば、抗体または抗体断片のアミノ酸配列改変体を生成してもよく、ＩＬ−３またはＩＬ−３受容体に対する、同等のまたは向上した親和性を示すものについては標準的な技術を用いて同定してもよい。抗体または抗体断片をコード化する核酸の部位特異的変異導入またはランダム変異導入も、適用可能であり、また当業者に周知である。天然のおよび非天然のアミノ酸は、抗体および抗体断片のアミノ酸配列改変体を生成させるために用いることができる。

【0062】

これらの全てのタイプの抗体および抗体断片は、本発明において有用である。

【0063】

本発明において有用な抗体を選択するために、ＩＬ−３の生物学的活性の中和能が用いることができる。天然型と同様に、組換え型のヒトＩＬ−３またはヒトＩＬ−３受容体に結合する抗体は、当業者に周知のように、固相化されたヒトＩＬ−３またはヒトＩＬ−３受容体を用いて捕捉できる。

【0064】

ＩＬ−３の測定用の試験は、市販されており、例えば、ＢＤバイオサイエンス社製のＥＬＩＳＡキットが挙げられる（３２〜３４参照）。

【0065】

被験者のＩＬ−３活性を中和するために必要とされる抗体の濃度は、サイトカイン濃度、細胞型、生育条件および活性のタイプに依存する。ガイドラインを提供するために、抗体の中和用量は、特定の条件設定の下で決定することができる。中和用量（ＮＤ_５０）とは、抗体について、ＩＬ−３が最大応答を引き起こすのに十分に高い濃度で存在するときに、応答性細胞株における、ＩＬ−３活性またはＩＬ−３受容体の最大阻害の半分を得るために必要とされる抗体濃度として定義される。具体的な濃度は、ＴＦ−１細胞株の増殖試験を用いて、０．００１〜１μｇ／ｍＬの範囲内である。この分析は、Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４０ （２）： ３２３−３３４に記載される。この分析では、ヒトＩＬ−３は、用量依存的に、ヒトＴＦ−１細胞による^３Ｈ−チミジンのを促進する。この効果に関するＥＤ_５０は、一般的に０．１〜０．４ｎｇ／ｍＬである。ヒトＴＦ−１細胞に対するＩＬ−３の生物活性を中和するための抗体の能力を測定するために、ＩＬ−３を、様々な濃度の抗体とともに、９６ウェルプレート中で、３７℃で１時間インキュベートする。このプレインキュベートの後、ＴＦ−１細胞が加えられる。０．００１〜１０μｇ／ｍＬの間の様々な濃度の抗体、１．２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、および１×１０^５細胞／ｍＬの細胞を含有する総量１００μＬの分析混合物を、加湿ＣＯ_２培養器中で、３７℃で４８時間インキュベートする。^３Ｈ−チミジンを、インキュベーションの終了４時間前に添加する。細胞を、ガラス繊維フィルター上に回収し、ＤＮＡに導入された^３Ｈ−チミジンを測定する。これらの条件下で、抗体のＮＤ_５０を、測定することができる。

【0066】

このように、抗ヒトＩＬ−３抗体または抗ヒトＩＬ−３受容体抗体を用い、この試験を実施して、ＩＬ−３を中和するために最適な抗体の濃度を測定することができる。

【0067】

抗体の用量は、かかる中和試験を用いて選択することができる。本発明によるＩＬ−３阻害剤を用いると、ＩＤ_５０を、治療開始時および長期治療の間の適切な期間内に測定することができる。

【0068】

更なる実施形態では、ＩＬ−３を特異的に阻害するか、またはＩＬ−３のその受容体に対する結合を特異的に遮断するか、ＩＬ−３の産生を特異的に遮断する薬剤を用いることができる。実施例は、ＩＬ−３またはその受容体に対して結合するリガンド、ＩＬ−３もしくはその受容体に対して結合するポリペプチドもしくはペプチド模倣薬、ＩＬ−３もしくはその受容体に対して結合するアプタマーもしくはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、ＩＬ−３もしくはその受容体に対する結合能を有するもしくはその結合を変性することができるペプチドもしくはポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、またはＩＬ−３受容体およびＩｇＧ断片の部分を含む可溶性構築物である。

【0069】

１つの実施形態では、リガンドは、ＩＬ−３を阻害または遮断または変性する、ペプチドもしくはポリペプチドまたはペプチドもしくはポリペプチドをコード化する核酸である。

【0070】

ＩＬ−３阻害剤の別の有用なグループは、上記のアプタマーおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓを含む。ＩＬ−３阻害剤として特に有用であるアプタマーおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓは、ＩＬ−３またはその受容体に対する結合活性を有するものである。それらのアプタマーおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓは、ＩＬ−３またはＩＬ−３受容体への結合能に基づいて、標準的な方法によりランダムプールから検出することができる。好適には、抗体と同様の１ｐＭ〜１ｎＭの範囲内のＫｄｓ（平衡定数）を有する、ＩＬ−３またはその受容体に対して結合するアプタマーまたはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓが用いられる。

【0071】

本発明の別の好適な実施形態では、免疫グロブリンのＦｃ部位と抱合された、ＩＬ−３受容体の特異的結合部分を含む構築物が用いられる。かかる構築物の好適な実施形態は、可溶性であり、少なくとも１つのα‐受容体サブユニットおよび／またはβ‐受容体サブユニット、または同様の結合能力を有するその誘導体を含む。

【0072】

別のアプローチでは、可溶性のＩＬ−３受容体またはその断片を使用し、ＩＬ−３の結合部位を占有することでＩＬ−３の結合及び活性化を妨害することによって、ＩＬ−３のその受容体に対する結合を妨害する。

【0073】

更なるアプローチでは、ＩＬ−３の産生を阻害するか、または減少させてもよい。従って、本発明において、例えば、単球、励起されたＢ−細胞由来の、ＩＬ−３産生を妨げるいかなる物質も、本発明について用いることができる。

【0074】

更に、ＩＬ−６およびＩＬ−４の組み合わせが、ＩＬ−３放出に対する相乗効果を有し、ＩＬ−３産生を極めて顕著に遮断することが見出された。このことは、図６ｄ、ｅに示される。ＩＬ−６およびＩＬ−４の組み合わせは、また、ＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＬ−３分泌を低減させることもできる。従って、本発明の更なる実施形態では、ＩＬ−３産生の阻害およびそれによるＲＡの治療のための、ＩＬ−４などの因子を提供する。

【0075】

ＩＬ−３が増加する限り、関節リウマチは更に進行すること、そして関節リウマチの進行は、本発明の使用、すなわち関節リウマチの治療用薬剤の調製にＩＬ−３阻害剤を用いることによって阻害されるか、または低減され得ることが見出された。

【0076】

ＩＬ−３阻害剤を、ＩＬ−３量を減少させるか、またはそれを通常に戻すだけの量用いると、ＲＡの進行を、遅延するかまたは停止させることができ、軟骨破壊を回避するか、少なくとも低減することができ、滑膜組織の細胞浸潤を低減することができ、そして好塩基球の産生および好塩基球からのＩＬ−６の放出を低減することができる。

【0077】

別のアプローチでは、ＩＬ−３結合物質、特にＩＬ−３抗体を固相化した形態で用いることによって、ＩＬ−３を除去することができる。その場合、１つまたは複数のタイプのＩＬ−３結合分子を、固相化用の官能基を用いて固相に対して結合させる。固相は、例えば、担体、支持体、マトリックスまたはビーズであってよい。本発明に従って用いることのできる固相上に固相化するための官能基は、当業者に周知であり、化合物を固相化するために通常用いられるものをここで用いてもよい。

【0078】

上述のように、あらゆるＩＬ−３阻害剤、言い換えれば、ＩＬ−３もしくはＩＬ−３のその受容体に対する結合を阻害するか、または遮断するあらゆる物質を、治療に用いることができる。ＩＬ−３阻害剤は、特に、ＩＬ−３量の増加が観察された被験者で、初期段階の関節リウマチの治療を可能とする。更に、ＩＬ−３阻害剤は、ＲＡに罹患しやすい被験者におけるＲＡの進行妨げるための予防処置に用いることができる。別の実施形態では、ＩＬ−３阻害剤は、ＲＡが重篤化することを妨げるために、進行したＲＡを伴うが、疾患活動性がないかまたは低度である被験者に対する維持治療に用いることができる。ＩＬ−３阻害剤は、ＩＬ−３の生物活性を中和して、これにより関節リウマチの進行を妨げるか、または遅延させる。更に、それは、軟骨破壊、滑膜組織での細胞浸潤、および好塩基球数の減少を、妨げるかまたは回避する。

【0079】

治療の有効な用量は、一般的に当業者に公知であるように、主治医により決定することができる。阻害剤の有効な用量は、ＲＡの徴候を緩和するか、または疾患の悪化を妨げる量である。疾患の進行を、ＩＬ−３量および／または疾患スコア（例えば、ＤＡＳ２８）を定期的にモニタリングすることより、追跡することができる。スコアが維持されるか、０．６超減少している場合には、治療は有効であるとされる。治療成功についての別の示唆は、ＩＬ−３量が減少していること、または血漿および／もしくは滑液中にＩＬ−３が検出されないことである。治療に用いられる用量は、通常、最も好ましい治療指数を有する、すなわち、最低の用量および最低の副作用で最高の効果を奏する用量である。この用量は、当業者に周知のように、用量反応曲線を用いて決定することができる。

【0080】

ＩＬ−３抗体が用いられる場合、用量は、活性および抗体の半減期によって決定される。約１〜２週間の半減期を有する抗体については、用量は、好適には投与回あたり１〜１０００ｍｇ、より好適には１０〜１００ｍｇの範囲内である。抗体は、１日１回から１月１回、好適には１週間に１回または隔週に１回投与されるが、その頻度は、被験者中の抗体の半減期に依存する。

【0081】

最適な用量は、好適には、ＤＡＳ２８値または他のパラメータのような、パラメータの定期的な診断を用いることによって、主治医により決定し、また疾患の経過に基づいて適応させる。

【0082】

他の実施形態では、治療用の用量は、ＩＬ−３放出、ＩＬ−３に応じて放出されるサイトカインである、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および／またはインターロイキン４（ＩＬ−４）量の定期的なモニタリングによって、決定することができる。

【0083】

一般的に、ＩＬ−３阻害剤の有用な用量は、被験者の体重ｋｇ当たり、一週間につき、０．０１；０．０２；０．０３；０．０５；０．０７；１．０；１．５；２．０；２．５；または３０ｍｇのＩＬ−３阻害剤から、被験者の体重ｋｇ当たり、一週間につき、１．０；１．５；２．０；２．５；３．０；４．０；５．０；７．０；１０；１２；１４；１７；または２０ｇのＩＬ−３阻害剤までの用量である。

【0084】

本発明は、更に、ＩＬ−３阻害剤および製薬学的に許容可能な担体を含む、ＲＡ、特に初期段階の治療用の製薬学的組成物を提供する。

【0085】

担体は、製薬学的組成物を調製するのに有用なあらゆる添加剤、賦形剤またはビヒクルとしてよい。

【0086】

本発明のＩＬ−３阻害剤は、動物、すなわち恒温脊椎動物、例えば、ヒト、ウマ、ブタ、子ウシ、マウス、イヌまたはネコ科動物などの関節リウマチの治療に用いることができる。特に、本発明のＩＬ−３阻害剤はヒトについて用いられる。

【0087】

ＲＡの治療のために、ＩＬ−３阻害剤を、液体または固形状などの、あらゆる製薬学的に許容可能な形態で用いることができる。好適には、阻害剤は、特に、静脈内、皮下、筋肉内、関節内注射により、非経口的に投与することができる液体として処方される。好適な実施形態では、ＩＬ−３阻害剤は、全身または局所投与向けの使用のために提供される。１つの実施形態では、ＩＬ−３のその受容体に対する結合を阻害する薬剤は、罹患している関節に対して直接的に投与使用するために提供される。

【0088】

投薬計画は、疾患の重症度、治療される被験者の年齢および体重、用いられる阻害剤、特にその生理学的条件下での半減期、および他の周知の因子によって決定する。適切な投薬計画は、少なくとも１月に１度の、より好適には３〜１５日以内に１度の、および必要ならばより頻繁な、静脈内または皮下投与による投薬を行うことである。

【0089】

加えて、更に治療を向上させ、かつ効能を増大させるために、好適な実施形態では、ＩＬ−３抗体の使用と併用して、共刺激細胞を変容させる物質を用いることができる。

【0090】

更に、本発明の阻害剤は、標準的なＲＡ治療に加えて、例えば、ＮＳＡＩＤｓおよび／またはＤＭＡＲＤｓ（生物製剤を含む）と組み合わせて用いることができる。

【0091】

故に、本発明の更なる実施形態は、ＮＳＡＩＤｓおよびＤＭＡＲＤｓ（生物製剤を含む）から選択されるＲＡの治療に対して有効な薬剤と組み合わせた、ＩＬ−３阻害剤を含む組成物である。

【0092】

従って、本発明によれば、診断および有用な治療のための有用なツールが提供される。関節リウマチと診断され、ＩＬ−３量の増大が測定される場合には、本発明によるＩＬ−３阻害剤の使用が大いに勧められる。

【0093】

以下の図面は、本発明の例示に過ぎないが、本発明の特定の実施形態を更に詳細に記載する。しかしながら、これらの図面は本発明の対象を限定することを意図しない。

【0094】

（図１、コラーゲン関節炎におけるＩＬ−３および好塩基球）
Ａ、コラーゲンによる再刺激後の脾細胞によるＩＬ−３産生。コラーゲンによる初回免疫後３１日目に、総脾細胞、またはｘ軸上に示されるように特定の白血球サブセットを除去した脾細胞を、コラーゲンＩＩ型と共に３日間インキュベートした。コラーゲン特異的なＩＬ−３の産生は、コラーゲン不存在下でのＩＬ−３の放出を差し引いて決定した。Ｂ、滑膜組織でのサイトカイン量の測定。関節炎の誘発後３６日目に、マウスの後足を評価し、０−２（ｎ＝１４）の臨床上の関節炎を伴う１つのグループ、および３−４（ｎ＝１２）のスコアを有する他のグループを備える二つのグループに階層化した。各々の足の滑膜組織を、１ｍＬのＰＢＳ中に調製し、サイトカイン量をＥＬＩＳＡで測定した。高い炎症性の足は、有意に、より多量のＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１βを含んでいたが、より少量のＩＬ−３を含んでいた。ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γβの滑膜組織レベルは、炎症の程度と相関しなかった。Ｃ、好塩基球の活性化および生存に対するＩＬ−３の影響。好塩基球は、マウスの骨髄から濃縮され、図示するように、様々な濃度のＩＬ−３の存在下で、３つに分けて、４日目まで培養した。ＩＬ−３の不存在下では、ＩＬ−６およびＩＬ−４の放出は検出できず、好塩基球の急速な細胞死が起こった。サイトカインの放出および好塩基球の生存は、低量のＩＬ−３の添加により顕著に増加した。Ｄ、フローサイトメトリーによる炎症性の足の滑膜組織中の好塩基球およびマスト細胞の検出。単細胞浮遊液を、コラゲナーゼによる消化により、炎症性の足の滑膜組織から調製した。細胞を、ＣＤ４５、ｃ−ｋｉｔおよびＩｇＥの発現について分析し、好塩基球（ＩｇＥ^＋、ｃ−ｋｉｔ⁻）およびマスト細胞（ＩｇＥ^＋、ｃ−ｋｉｔ^＋）の頻度を、ＣＤ４５陽性浸潤白血球の総量のパーセントとして与える。

【0095】

（図２、関節炎の発症の間のＩＬ−３の遮断）
コラーゲンによる初回免疫の後２１−３６日目の、３５μｇのα−ＩＬ−３（ｎ＝１５）またはラットＩｇＧ（ｎ＝１５）の連日注射により、マウスを処置した。Ａ、関節炎スコアおよび発症率を、両方のグループにおいて決定した。Ｂ、コラーゲンによる初回免疫後３７日目の前足の分析。滑膜組織から回収した細胞を、ＩｇＥ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５およびＧＲ−１に対する抗体で染色し、単球（ＣＤ１１ｂ^＋、ＧＲ−１^{−／ｌｏｗ}）、好中球（ＣＤ１１ｂ^＋、ＧＲ−１^＋）および好塩基球（ＩｇＥ^＋、ＧＲ−１⁻）を識別した。前足ごとの回収された細胞の絶対数を、左および中央パネルに示す。滑膜組織に存在するＩＬ−６およびＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡにより定量化した（右パネル）。Ｃ、コラーゲンによる初回免疫後３７日目の、コラーゲン特異的な総Ｉｇ（血漿希釈 １：１００，０００）およびコラーゲン特異的なＩｇＧ１（血漿希釈 １：５，０００）（左パネル）の血漿力価ならびに末梢血白血球サブセット（中央および右パネル）の分析。図２ｂに記載するように、末梢血細胞を染色して識別し、白血球サブセットを総白血球のパーセントとして算出した。

【0096】

（図３、関節炎の発症の間のＩＬ−３の遮断）
マウス（グループにつきｎ＝１５）を、図２に記載するように処置し、下部の足根中足関節の組織学的変化をコラーゲンによる初回免疫後３７日目に決定した。Ａ、マウスの足根中足関節のＨ＆Ｅ−染色した組織部分。抗ＩＬ−３で処置したマウス（左）では、軟骨または骨破壊のない低度の滑膜の過形成が見られた。コントロールマウスでは、顕著な滑膜の過形成を伴う、重度の骨破壊および穏やかな軟骨破壊が見られた。Ｂ、組織学的変化の概要。滑膜の過形成（増殖）、白血球浸潤（浸潤）、軟骨浸食（軟骨）および骨破壊（骨）を、０−２のスケールで評価した。

【0097】

（図４、関節炎の発症後のＩＬ−３の遮断）
関節炎の誘導後、マウスの関節炎出現について毎日評価した。関節炎スコアが、少なくとも２となったとき、各マウスをランダムに、抗ＩＬ−３（ｎ＝１０）またはラットＩｇＧ（ｎ＝１０）による１日ごとの腹腔内処置に供した。抗ＩＬ−３またはラットＩｇＧの初回投与の日を０日目として、処置を６日目まで続けた。ＩＬ−３の遮断は、既に確立された関節炎の進行を低減しなかった。

【0098】

（図５、ＩＬ−３の投与による関節炎の悪化）
マウスを、コラーゲンによる初回免疫後２０日目から日３０日目まで、毎日２回の、１００ｎｇのＩＬ−３（ｎ＝２１）またはＰＢＳ（ｎ＝１８）の腹腔内注射による処置を施した。Ａ、関節炎スコアおよび発症率を、両方のグループで観察、計測した。Ｂ、末梢血中の好塩基球の数は、ＩｇＥおよびＣＤ４５に対する抗体を用いた細胞染色により測定し、総白血球のパーセンテージとして算出した（左パネル）。コラーゲン特異的なＩｇＧ１（血漿希釈 １：１，０００）およびコラーゲン特異的なＩｇＧ２ａ（血漿希釈 １：２，０００）（中央パネル）の血漿力価ならびにＩＬ−６の血漿濃度（右パネル）を、コラーゲンによる初回免疫後３１日目にＥＬＩＳＡにより測定した。

【0099】

（図６、ＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＬ−３分泌の制御）
Ａ、ｘ軸に示すように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＣＤ１１^＋細胞およびα−ＣＤ３と共に、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞およびα−ＣＤ３と共に、またはα−ＣＤ３／２８ビーズと共に、３日間培養した。図中の凡例に示されるように、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍＬ）、ＣｐＧ ＤＮＡ（１μＭ）またはα−ＣＤ３／２８ビーズ（１ウェル当たり５０，０００）も加えた。上澄み中のＩＬ−３の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。Ｂ、ＣＤ１１ｂ^＋細胞、α−ＣＤ３およびＬＰＳと共に（上パネル）、またはＢ細胞、α−ＣＤ３およびＬＰＳ（下パネル）と共に３日間培養された、ＣＤ４^＋Ｔ細胞における細胞内ＩＬ−３のフローサイトメトリー検出。ＩＬ−３は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞内のみで検出可能である。Ｃ、ＬＰＳは、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞に対して作用することによって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＩＬ−３発現を増加させる。ｘ軸に示すように、野生型マウス（ＷＴ）由来、またはＴＬＲ４−欠損Ｃ３Ｈマウス（Ｃ３Ｈ）由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、野生型マウス由来のＢ細胞の存在下、またはＣ３Ｈマウス由来のＢ細胞の存在下、α−ＣＤ３およびＬＰＳで刺激した。ＩＬ−３の濃度を、ＥＬＩＳＡにより上澄み中で測定した。Ｄ−Ｆ、ＩＬ−４およびＩＬ−６は、活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＬ−３の放出を抑制する。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＣＤ１１ｂ^＋細胞およびα−ＣＤ３と共に、またはＣＤ１１ｂ^＋細胞、α−ＣＤ３およびＬＰＳ（パネルＤ）と共に、またはＣＤ１９^＋Ｂ細胞およびα−ＣＤ３と共に、またはＣＤ１９^＋Ｂ細胞、α−ＣＤ３およびＬＰＳ（パネルＥ）と共に、または励起なしで、またはα−ＣＤ３／２８ビーズ（パネルＦ）と共に３日間培養した。ＩＬ−４、ＩＬ−６または両方を、ｘ軸に示されるように、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。ＩＬ−３の濃度を、ＥＬＩＳＡにより上澄み中で測定した。

【0100】

（図７、関節炎を伴う被験者でのＩＬ−３の検出）
ＩＬ−３は、活動性ＲＡを伴う８人の患者中６人で検出可能であったが、非活動性ＲＡまたは他のタイプの関節炎を伴う患者では検出可能でなかったことが分かる。

【0101】

（結果）
ＩＬ−３は、脾臓中のコラーゲン特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞により多量に産生され、関節炎の発症の間滑膜組織に存在するが、重度の炎症を伴う足では少量に抑えられる。関節炎の発症の間のＩＬ−３の遮断は、滑液白血球、滑液サイトカイン、コラーゲンに対する抗体価、および末梢血の好塩基球の減少を伴う、関節炎の顕著な向上を生ずる。関節炎の後期相におけるＩＬ−３の遮断は、有益な効果を有しない。関節炎の発症の間の、組換えＩＬ−３の投与は、末梢血の好塩基球の増加、血漿ＩＬ−６の増加、およびコラーゲンに対する抗体価の増加を伴って、関節炎の顕著な悪化を誘発する。加えて、我々は、ＬＰＳおよびＣｐＧ−ＤＮＡが、活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＬ−３の分泌を、共刺激細胞に対して作用することによって増加させる一方で、どのように、ＩＬ−３の発現が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞中で制御され、ＩＬ−６およびＩＬ−４が、活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞によりＩＬ−３の放出を抑制するのかを調査した。

【0102】

本発明の好適な実施形態は、以下の実施例に説明されるが、これは本発明の範囲と思考を限定しないものと解されたい。

【実施例】

【0103】

（実施例１）
（導入）
関節炎におけるＩＬ−３の役割を分析した。最近、ＩｇＥに対する抗体による好塩基球の活性化によるコラーゲン関節炎の顕著な悪化が観察された。好塩基球は、表層ＩｇＥの架橋構造だけでなく、他の因子、特にＩＬ−３によっても活性化され得る。好塩基球は、ＩＬ−４だけでなく、関節炎促進性のサイトカインＩＬ−６をも放出する（下記参照）。培養物において、ＩＬ−３濃度が極めて低くても、マウスの好塩基球からのＩＬ−６の顕著な放出を誘導し、好塩基球の生存を長期化させる（下記参照）。ＤＢＡ／１マウスでのコラーゲン関節炎モデルにおいて、疾患の様々な段階での足におけるＩＬ−３の発現を分析し、滑膜組織における好塩基球およびマスト細胞の数を定量し、かつ、ＩＬ−３の遮断または投与が疾患の発症率および活動性に与える影響を調査した。加えて、関節炎における疾患段階に特異的なＩＬ−３の放出の理解を深めるために、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＴ細胞からのＩＬ−３の放出の制御を調査した。

【0104】

（材料および方法）
（コラーゲン関節炎の誘発−マウスの処置）
以下の方法でオスＤＢＡ／１マウスに関節炎を発症させた。０日目の検体に、完全フロイントアジュバンド条件下、１００−２００μｇのウシコラーゲンＩＩ型（シグマ社、Ｃ１１８８）を、尾基部に回の皮内／皮下注射、２１日目の検体に、アジュバンドなしでの、１００−２００μｇのコラーゲンＩＩ型の腹腔内注射による再投与。臨床上の関節炎スコアを、盲検方式で以下のように評価した：０、通常；１、１つの関節での腫脹；２、複数の関節での腫脹；３、足全体の腫脹；４、変形および／または強直。図２および３に示す実験のために、検体動物を、３５μｇのブロッキング抗ＩＬ−３抗体（クローン ＭＰ２−８Ｆ８、バイオゾル社、ドイツ）、または精製ラットＩｇＧ（シグマ−アルドリッチ社）を１日ごとに腹腔内注射による処置を施した。検体のマウスは、３７日目に屠殺した。図４に示す実験のために、個々のマウスの関節炎スコアが少なくとも２となったときに、５０μｇの抗ＩＬ−３抗体または精製ラットＩｇＧを用いた毎日の腹腔内処置を開始した。処置は７日間継続した。図５に示す実験のために、２０−３０日目のマウスに、１００ｎｇのＩＬ−３（ペプロテック社）またはＰＢＳの、１日２回の腹腔内注射の処置を施した。臨床上の関節炎スコアを、盲検方式で以下のように評価した：０、通常；１、１つの関節での腫脹；２、複数の関節での腫脹；３、足全体の腫脹；４、変形および／または強直。動物実験は、バイエルン政府の法規（Ａｚ．５５．２−１−５４−２５３１−１０９−０５）に従って行った。

【0105】

（滑膜組織の調製−サイトカインおよび浸潤細胞の定量）
足首関節から足を切断し、炎症を生じた足から皮膚を除去し、残りの組織を、５００μＬ／１０００μＬの量のＰＢＳ中に、外科用メスを用いて注意深く取り出した。遅滞なく、試料を４００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを直ちに凍結させ、サイトカインのＥＬＩＳＡに用いた。滑膜組織を、コラゲナーゼＩ（シグマ社）により３７℃、２０分間で消化し、単細胞浮遊液を得て、ＦＡＣＳ分析に用いた。

【0106】

（組織学的分析）
後足を、３．７％ホルマリンで２４時間固定し、ＲＤＯ高速脱灰器（メディツ ゲーエムベーハー、ドイツ）を用いて脱灰し、パラフィンに包埋した。少なくとも１０個の、足根中足関節の５μｍの厚さの部分をＨＥで染色し、全ての分類：滑膜炎（１、限局的な炎症性浸潤；２、細胞組織学的に支配的な炎症性浸潤）、滑膜の過形成（１、連続的であり、１つの関節に少なくとも三層の厚い滑膜表層；２、連続的であり、複数の関節に少なくとも三層の厚い滑膜表層）、パンヌス形成および軟骨喪失（１、パンヌスにより部分的に覆われた軟骨、軟骨喪失なし；２、軟骨喪失あり）、および骨破壊（１、小範囲の骨破壊；２、広範囲の骨破壊）について、０（通常）から２までのスケールで、盲検方式で評価した。

【0107】

（フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、サイトカイン）
フローサイトメトリーまたは磁気細胞分離のために、以下の抗体を使用した：フルオレセインイソチオシアネート−抗ＣＤ４５（ＬＣＡ；３０−Ｆ１１）、アロフィコシアニン−抗ＣＤ４５（ＬＣＡ；３０−Ｆ１１）、フルオレセインイソチオシアネート−抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、フィコエリトリン−抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｆｃ−ブロック（２．４Ｇ２）、フィコエリトリン−抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、アロフィコシアニン−抗ＧＲ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）、アロフィコシアニン−抗ＣＤ４（ＲＭ４−５）、フィコエリトリン−抗ｃ−ｋｉｔ（２Ｂ８）、フルオレセインイソチオシアネート−抗ＩｇＥ（Ｒ３５−７２）、フィコエリトリン−抗ＩＬ−３（ＭＰ２−８Ｆ８）、フルオレセインイソチオシアネート−およびフィコエリトリン−標識アイソトープコントロール（全てＢＤバイオサイエンス社）、アロフィコシアニン−抗ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５；ミルテニー社）。未固定の細胞を、Ｆｃ−ブロック（５μｇ／ｍＬ）と共に１５分間氷冷し、その後、直接標識化された抗体と組み合わせて４５分間氷冷した。３回洗浄した後、赤血球をＦＡＣＳ−溶解液（ＢＤバイオサイエンス社）で溶解させ、試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）で分析した。細胞内ＩＬ−３の定量化のために、細胞をまずアロフィコシアニン−抗ＣＤ４で、その後、製造業者の指示に従ってＦｉｘ−ＰｅｒｍおよびＰｅｒｍ−洗浄溶液（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて処理し、そしてＩＬ−３に対するＰＥ−標識化抗体で染色した。

【0108】

ＩＬ−３、ＩＬ−４およびＩＬ−６を、ＢＤバイオサイエンス社から市販されているＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１７を、Ｒ＆Ｄ−システムズ社からのＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）を用いて測定した。コラーゲンに対する抗体をＥＬＩＳＡにより定量化した。コラーゲン（２０μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレート上に終夜でコートした。図中の凡例に示すように、血漿試料をＰＢＳ／３％ＢＳＡ中に希釈した。

【0109】

コラーゲンに結合した免疫グロブリンを、ＨＲＰ標識化ポリクローナルウサギ−抗マウス抗体（Ｐ２６０、ダコ社）、またはマウスＩｇＧＩ（クローン ＬＯ−ＭＧ１−２、セロテック）またはマウスＩｇＧ２ａ（クローン Ｒ１９−１５、ＢＤファーミンゲン社）に対して特異的なＨＲＰ−標識化モノクローナル抗体を用いて検出した。

【0110】

マウスのサイトカインＩＬ−３、ＩＬ−４およびＩＬ−６をプロテック社から得た。

【0111】

（細胞の単離および培養）
コラーゲン関節炎に罹患したマウス由来の脾細胞から、Ｂ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＣＤ１９およびＣＤ４を標的とする磁気ビーズ（ミルテニー社）を用いて取り除いた。好塩基球、単球または好中球を、脾細胞のＩｇＥ、ＣＤ１１ｂもしくはＧＲ−１に対するフルオロクロム標識化抗体とのインキュベーション、およびその後のフルオロクロムを標的とする磁気ビーズとのインキュベーションにより、取り除いた。全脾細胞または特定の白血球サブセットを除去した脾細胞を、ウシコラーゲンＩＩ型を用いて、または用いることなく、９６−ウェル平底プレート（２Ｍｉｏ細胞／２００μＬ培地）中で３日間培養した。細胞培養の上清をＥＬＩＳＡに用い、コラーゲン特異的なＩＬ−３の放出を以下の通りに測定した：コラーゲンによるＩＬ−３の放出−コラーゲンによらないＩＬ−３の放出。

【0112】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を、ＣＤ４、ＣＤ１９およびＣＤ１１ｂ（ミルテニー社）を標的とする磁気ビーズを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６またはＴＬＲ−４欠損型Ｃ３Ｈマウス（チャールス・リバー社）の脾細胞から単離した。単離した細胞の純度は、常時９５％超であった。細胞を、９６ウェル丸底プレートで、総量２００μＬ培地／ウェル（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加）で、３日間培養した。ウェル当たりの細胞数は、各々の細胞タイプについて５０，０００とした。ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体でコートされたビーズ（Ｔ細胞エキスパンダ・ビーズ、Ｄｙｎａｌ／インビトロジェン社）を、５０，０００ビーズ／ウェルの濃度で用いた。図示のように、以下の試薬が加えられる：ＣＤ３（０．５μｇ／ｍＬ、クローン２Ｃ１１）、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍＬ、シグマ社）、ＣｐＧ−ＤＮＡ（１μＭ、ＰＧ１６６８＝ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、ＴＩＢＭｏｌＢｉｏｌ社）、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）に対する抗体。ＩＬ−３の濃度は、３日後の培養上清中でＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ−３の細胞内染色のために、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｂ細胞または単球の存在下で、α−ＣＤ３およびＬＰＳにより３日間活性化した。ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を、培養の最後の４時間の間加え、ブレフェルジンＡ（５μｇ／ｍＬ）を、培養の最後の２．５時間の間加えた。

【0113】

好塩基球を、ＤＸ−５を標的とした磁気マイクロビーズおよびＬＳ−カラム（ミルテニー社）を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から濃縮した。好塩基球は、ＣＤ４５の低発現およびＤＸ−５の高発現により同定され、濃縮された細胞の約１０％を構成した。好塩基球（１，１００細胞／ウェル）を、様々な時間、９６ウェル丸底プレート中で、総量２００μＬの培地／ウェル（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン添加）で、様々な濃度の組換えＩＬ−３と共に培養した。ＩＬ−４およびＩＬ−６の濃度を、細胞培養の上清中でＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＤ４５およびＤＸ−５に対する抗体を、ヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍＬ）およびビーズ計数（コールター社）と組み合わせることで、全ての細胞を染色した後、ウェル当たりの生存の好塩基球数を、各時点で、フローサイトメトリーにより定量化した。

【0114】

（統計）
エラーバーは、全図における平均値の標準誤差を示す。細胞培養実験は、三回行った。有意性を示すＰ値を、片側ｔ−検定を用いて算出し、１つの星印（ｐ＜０．０５）または２つの星印（ｐ＜０．０１）を用いて示した。

【0115】

（結果）
（コラーゲン関節炎におけるＩＬ−３および好塩基球）
我々はまず、ＩＬ−３が関節炎マウスの脾臓および滑膜組織中で産生されるかどうかを調査した。コラーゲンによる初回免疫後３１日目に、我々は、全脾細胞または特定の白血球サブセットを除去した脾細胞を、コラーゲンにより再刺激し、コラーゲン不存在下でのＩＬ−３の放出を差し引くことによってコラーゲン特異的なＩＬ−３の放出を測定した。全脾細胞、またはＣＤ１９^＋細胞（Ｂ細胞）、ＩｇＥ^＋細胞（好塩基球）もしくはＧＲ−１^＋細胞（主に好中球）を除去した脾細胞は、コラーゲンによる刺激の後、大量のＩＬ−３を産生した。対照的に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ１１ｂ^＋細胞（主に単球）の除去は、コラーゲン特異的なＩＬ−３の放出を完全に停止させ、ＩＬ−３の産生が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ^＋共刺激細胞（図１ａ）の存在を両方とも必要とすることを示した。Ｂ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３の産生を補助するために必要とされず、単独では十分な効果を奏しない。Ｂ細胞不存在下でのＩＬ−３の放出の増加は、分析に用いた多数のＴ細胞および単球により生じる。Ｔ細胞及び単球の数は、ウェル当たりの総白血球数を一定に保った上で、Ｂ細胞が脾臓中の白血球の５０％超となるようにするために、多くしたものである。後足の滑膜組織中のサイトカインの産生を、コラーゲンによる初回免疫後３６日目に測定した（図１ｂ）。このため、足を足首関節で切断し、皮膚を除去し、そして軟部組織を１ｍＬのＰＢＳ中に全部取り出した。４００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み中のサイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。０−２のスコアを有する１４の足および３−４のスコアを有する１２の足を用いて、臨床上明らかな関節炎の程度に従って、試料とした足を、２つのグループに階層化した。予想したように、顕著な炎症を伴う足は、多量のＩＬ−６およびＩＬ−１β（それぞれ、６８３および６１９ｐｇ／ｍＬ）を有し、炎症を伴わないまたは低度の炎症を伴う足は、数倍低いＩＬ−６およびＩＬ−１β量（それぞれ、１４４および７２ｐｇ／ｍＬ）を有した。ＴＮＦ−αは、極めて少量でのみ検出可能であったが、３−４のスコアを有する足では増加した。対照的に、ＩＬ−３は、０−２のスコアの足では容易に検出可能だったが（６６ｐｇ／ｍＬ）、重度の炎症を伴う足では大いに有意に減少した（１４ｐｇ／ｍＬ）。ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−γの局所レベルは、足の炎症の程度と相関しなかった（図１ｂ）。

【0116】

ＩＬ−３が、好塩基球からのヒスタミンおよびＩＬ−４の放出を誘発し、促進することは公知である。我々は、ＩＬ−３それ自体も、培養中において、マウスの好塩基球からＩＬ−６の高い放出を誘発して、単離した好塩基球の生存を顕著に長期化することを示す（図１ｃ）。ＩＬ−６の放出は、極めて低いＩＬ−３濃度であっても観察される（約０．３ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３で、最大半量の放出）。ＩＬ−３はまた、好塩基球からＩＬ−４の放出を誘発し、ここで、ＩＬ−３の放出はＩＬ−６の放出（データに示さず）より約３倍低かった。ＩＬ−３の不存在下では、培地中で４日間生存したのは、好塩基球の６％だけであったが、その一方で、ＩＬ−３の添加により好塩基球の生存が約６０％に増加した（図１ｃ）。

【0117】

我々は、コラーゲン関節炎マウスの炎症を生じた足に、好塩基球およびマスト細胞が存在するかどうかをフローサイトメトリーにより分析した。炎症を生じた足由来の滑膜組織を、単細胞浮遊液を得るために、コラゲナーゼにより消化した。細胞を、ＩｇＥ、ｃ−ｋｉｔおよびＣＤ４５に対する抗体で染色して、好塩基球（ＩｇＥ^＋、ｃ−ｋｉｔ⁻、ＣＤ４５^ｌｏｗ）およびマスト細胞（ＩｇＥ^＋、ｃ−ｋｉｔ^＋、ＣＤ４５^＋）を同定した。好塩基球は、炎症を生じた全ての足で、全ての浸潤したＣＤ４５^＋白血球の約０．４％の頻度で明確に検出された一方で、マスト細胞は、いくつかの炎症を生じた足で、好塩基球より２０倍低い頻度でわずかにしか見られなかった。大多数の浸潤細胞は、単球および好中球であり、それらはＩＬ−３に対して応答性があることも公知である。

【0118】

（コラーゲン関節炎におけるＩＬ−３の機能分析）
コラーゲン関節炎の初期型におけるＩＬ−３の存在、およびＩＬ−６またはＩＬ−１などの炎症性サイトカインを放出することによってＩＬ−３に対して応答することができる細胞（例えば、好塩基球および単球）の存在は、ＩＬ−３が関節炎の発症に関わっている可能性があることを示唆する。

【0119】

そのため、我々は、モノクローナル抗体によるＩＬ−３の遮断が、２００μｇのコラーゲンＩＩ型を０および２１日目に注射されたマウスにおいて、関節炎の発症率および重症度を向上させるかどうかを調べた。２１−３６日目の１つのグループのマウス（ｎ＝１５）に、抗ＩＬ−３抗体（３５μｇ／日）を腹腔内注射で１日ごとに投与し、その一方で、コントロールグループに、同じ用量および時間間隔でラットＩｇＧを注射した。疾患発症の間のＩＬ−３の遮断は、臨床上明らかな関節炎の重症度を、際立って有意に低減させた。３７日目に、コントロール群の関節炎スコアの平均値は５．３であるが、投与群の関節炎スコアは１．９であった（図２ａ）。また、関節炎の発症率は、３７日目において約５０％と大幅に低減された（図２ａ）。３７日目に、我々は、前足を用いて、滑膜組織に浸潤する細胞の分析、および回収した滑膜組織の上澄み（５００μＬ／足）中のＩＬ−６およびＴＮＦ−αの測定を行った。後足を組織学的評価のために用いた。前足の１試料あたりの、回収される単球の数、好塩基球の数およびＣＤ１１ｂ^＋細胞（単球および好中球を含む）の総数は、抗ＩＬ−３による処置を施したマウスにおいて、有意に低減された。また、回収した滑膜組織において測定したＩＬ−６の量は、抗ＩＬ−３で処置したマウスにおいて有意に低減された（図２ｂ）。後足の組織学的分析は、滑膜増殖および骨破壊の程度が抗ＩＬ−３で処置したマウスにおいて有意に低減したことを示した。浸潤細胞の程度は、有意に低下し、抗ＩＬ−３で処置したマウスにおける軟骨破壊の低減（ｐ＝０．０６）の傾向が見られた（図３）。コラーゲンに対する抗体（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）の血漿力価は、３７日目の抗ＩＬ−３で処置したマウスにおいて低減した（図２ｃ）。３７日目の末梢血のＦＡＣＳ分析において、好中球および単球の頻度（図２ｃ）に有意な変化がみられず、好塩基球の頻度に軽度ではあるが有意な低減が見られた。

【0120】

これらのデータは、ＩＬ−３が、コラーゲン関節炎の誘発および初期増殖について重要な役割を果たすことを示す。

【0121】

我々は、ＩＬ−３の遮断により既に確立された関節炎の進行が低減するかを次に分析した。マウスを、２００μｇのコラーゲンＩＩ型で２回免疫し、関節炎の進行について毎日検査した。個々のマウスの関節炎スコアが少なくとも２になったときに、抗ＩＬ−３抗体（ｎ＝１０、処置前の関節炎スコア２．６）またはコントロールＩｇＧ（ｎ＝１０、処置前の関節炎スコア２．７）のいずれかを用いて、処置（５０μｇの抗体の毎日の腹腔内投与）を開始した。図４に示すように、ＩＬ−３の遮断は、既に確立した関節炎の進行を低減させない。これらのデータは、ＩＬ−３が関節炎の進行後期には関与しないことを示す。これらのデータは、重度の炎症を伴う足における、ＩＬ−３の発現の低下と相関する（図１参照）。

【0122】

我々はまた、疾患発症の間のＩＬ−３の投与が関節炎の発症率および重症度を増大させ得るかどうかも調査した。マウスを、０日目および２１日目に１００μｇのコラーゲンＩＩ型により免疫した。１つの群のマウス（ｎ＝２１）を、２０−３０日目に、１００ｎｇのＩＬ−３を１日２回の腹腔内注射により投与し、一方で、コントロール群（ｎ＝１８）に、同量のＰＢＳを注射した。疾患発症の間のＩＬ−３の注射は、コラーゲン関節炎の発症率および重症度を有意に増大させた（図５）。３１日目（ＩＬ−３の最終接種の１日後）、ＩＬ−３で処置したマウスにおいて、コラーゲンに対する抗体の血漿力価が有意に増加し、末梢血好塩基球の数が２倍に増加し、ＩＬ−６の血漿濃度がほぼ５倍に増加することが示された。ＩＬ−３処置マウス群およびＰＢＳ処置マウス群の有意差は、３７日目（ＩＬ−３の最終接種の７日後）に検出できなかったことから、好塩基球の増加およびＩＬ−６の血漿濃度の増加は一時的であったといえる。これらのデータは、ＩＬ−３の有効性が、コラーゲンＩＩ型で免疫されたＤＢＡ／１マウスにおける疾患の発症および進行を制限することを示唆する。

【0123】

（ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３産生の制御）
活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＩＬ−３の主要な発生源細胞であるとみられる。しかしながら、Ｔ細胞によるＩＬ−３の分泌がどのように制御されるかは、ほとんど知られていない。したがって、我々はどの因子がＩＬ−３産生を増加または減少させるのかを、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で調査した。ＣＤ３に対する可溶性抗体および補助細胞としてのＢ細胞による、精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞のポリクローナルな活性化は、ＩＬ−３の産生をほとんど生じない。ＣＤ１１ｂ^＋単球が補助細胞として用いられた場合、可溶性のα−ＣＤ３により活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３産生が、３倍超増加した（図６ａ）。ＴＬＲのリガンドＬＰＳおよびＣｐＧ−ＤＮＡの添加は、補助細胞であるＢ細胞または単球の存在下における、ポリクローナルに活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３分泌を顕著に増加させた（図６ａ）。α−ＣＤ３の不存在下におけるＬＰＳまたはＣｐＧ ＤＮＡによるＣＤ４^＋Ｔ細胞および補助細胞の刺激は、検出可能なＩＬ−３放出を生じなかった（図示せず）。ビーズに固定されたＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体の組み合わせによるＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化は、補助細胞の存在またはＬＰＳまたはＣｐＧ ＤＮＡによる刺激によらず、非常に多量のＩＬ−３の放出を生じさせた（図６ａ）。ＩＬ−３の産生は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるものでであって、Ｂ細胞または単球によるものでないということを実証するために、我々は、細胞内のＩＬ−３量をフローサイトメトリーにより測定した（図６ｂ）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＬＰＳで刺激したＢ細胞またはＬＰＳで刺激した単球の存在下、α−ＣＤ３と共に３日間培養した。ＩＬ−３の細胞内染色は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞においてのみ検出可能であり、ＣＤ４陰性のＢ細胞または単球においては検出できなかった。ＴＬＲ−４欠損マウス（Ｃ３Ｈマウス）を用いて、我々は、どのようにＬＰＳがＩＬ−３の放出を向上させるかを更に詳細に分析した（図６ｃ）。補助細胞であるＢ細胞がＬＰＳに応答することができない場合、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３の放出の向上は検出できなかった。ＴＬＲ−４欠損のＣＤ４^＋Ｔ細胞が用いられた場合、ＩＬ−３産生は減少するよりむしろ増加した。これらのデータは、ＬＰＳが補助細胞を刺激することによってＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３放出を増大させ、かつ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対して提供される共刺激のレベルがＩＬ−３の発現に決定的に影響することを示す。

【0124】

ＩＬ−３の量が重度の関節炎を伴う足で低く抑えられるという我々の発見に基づいて、我々は、炎症を生じた関節中に高濃度で存在するサイトカインが、活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３発現を低減させることができるかどうか調査した。この目的のために、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、様々なサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−２）の存在下で活性化した。ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αまたはＭＩＰ−２の添加は、ＩＬ−３の放出に、影響を及ぼさなかった（図示せず）。しかしながら、ＩＬ−６またはＩＬ−４の添加は、Ｔ細胞活性化のために用いられる共刺激因子（非刺激の単球、ＬＰＳで刺激したＢ細胞または単球、および抗ＣＤ３／２８被覆ビーズ）によらず、活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３の放出を有意に低減させた（図６ｄ−ｅ）。ＩＬ−６およびＩＬ−４の組み合わせは、相乗的であり、ＩＬ−３産生（図６ｄ、ｅ）を極めて顕著に遮断した。ＩＬ−６およびＩＬ−４はまた、抗ＣＤ３／２８被覆ビーズのみにより活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＬ−３の分泌を低減し、ＩＬ−６およびＩＬ−４が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対して作用し、補助細胞に作用しないことを示唆した。

【0125】

（考察）
この試験において、我々は、ＩＬ−３が後期相ではなく初期相のコラーゲン関節炎の発達に寄与する重要な因子であることを明らかにする。関節炎の発症の間の、モノクローナル抗体によるＩＬ−３の遮断は、臨床上および組織学上の関節炎の徴候および浸潤細胞数を顕著に低減させたが、確立した関節炎を伴うマウスにおけるＩＬ−３の遮断は全く効果がなかった。ＩＬ−３の投与が関節炎の重症度および発症率を顕著に増大させたため、関節炎の初期相では、ＩＬ−３の有効性が疾患限定因子と見られる。ＩＬ−３は、脾臓中のＣＤ４^＋Ｔ細胞により全身的に、かつ滑膜組織中の細胞により局所的に産生され、全身的に、かつ関節内で局所的に作用することによって、初期の関節炎を悪化させ得る。ＩＬ−３の遮断は、α−ＩＬ−３治療の終了時に測定される、末梢血中の好塩基球数の有意な低減、およびコラーゲンに対する抗体の血漿力価の低減を生じた。我々は最近、活性化された好塩基球が、液性記憶免疫応答の発達に大いに寄与することを明らかにした。活性化された好塩基球は、可溶性因子（主にＩＬ−６）を放出し、Ｂ細胞の増殖およびその生体外および生体内における血漿細胞への分化を促進する細胞間接着依存性因子を供給する（２２）。ＩＬ−３は、末梢血中の好塩基球数を増大させること、好塩基球を活性化させること、およびコラーゲンに対する抗体の血漿力価を増大させることによって、初期の関節炎を悪化させると推測される。我々は、ＩＬ−３が非常に強力な好塩基球の活性化因子であり、生体外での好塩基球の生存を顕著に長期化すること、および生体内のＩＬ−３の投与が、コラーゲンに対する抗体の血漿レベルを高め、末梢血中の好塩基球数を２倍に高め、血漿中のＩＬ−６量を５倍に高めることを明らかにする。しかしながら、ＩＬ−３は、関節炎の発達に寄与し得るいくつかの他の標的細胞（例えば、導入で詳述した単球および樹状細胞）も有していることに留意されたい。全身的効果とは別に、ＩＬ−３は関節中の局所的な効果を有し得る。ＩＬ−３は、軽度の炎症が生じた関節（スコア０−２）で容易に検出可能であるが、重度の炎症が生じた関節（スコア３−４）では低量に抑えられる。関節中には、やはり、ＩＬ−３についてのいくつかの潜在的な標的細胞が存在する。ＩＬ−３は、単球からのＩＬ−１の放出を増大させることができ、破骨細胞の発達を誘発させることができる（１４、１７）。我々は、コラーゲン関節炎マウスの関節中の好塩基球およびマスト細胞の存在をより詳細に分析し、関節炎マウスの炎症が生じた滑膜組織中の好塩基球数の増加（約０．４％の総浸潤白血球）を見出したが、一方でマスト細胞をほとんど検出しなかった。様々な関節炎モデル、および異なった種のマスト細胞欠損マウスにおける矛盾した結果のため、関節炎の発達に対するマスト細胞の役割は、現在のところ明らかでない（２３−２５）。我々のデータは、ＩＬ−３の関節炎促進性の効果が、好塩基球の活性化により部分的に仲介され、いずれも好塩基球を活性化することが知られている、抗ＩｇＥまたは抗ＣＣＲ２抗体の投与による関節炎の悪化を示す以前のデータと一致することを示唆する（２６、２７）。

【0126】

滑膜組織中のＩＬ−３の発現が、関節炎の重症度と負に相関する理由、およびＩＬ−３の発現が制御される機序について理解を深めるために、我々は、ＩＬ−３の主要な細胞性の源と考えられているＣＤ４^＋Ｔ細胞を用いた生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の分析を行った。プロモータ解析およびシクロスポリンＡによる抑制は別として、Ｔ細胞によるＩＬ−３産生の制御について入手可能なデータが非常に限られている（２８）。ＩＬ−３の発現は、ＴＨ１およびＴＨ２細胞の両方で見られる（２９）。我々は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３産生が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に提供される共刺激レベルに依存することを示す。新たに単離されたＢ細胞の存在下では、α−ＣＤ３によるＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化は、ＩＬ−３の発現をほとんど生じさせないが、単球またはＢ細胞、およびＴＬＲ−４またはＴＬＲ−９に対するリガンドにより活性化した単球の存在は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３産生を顕著に増加させた。細胞内サイトカイン染色およびＴＬＲ−４欠損Ｃ３Ｈマウス由来の細胞を用いて、我々は、ＬＰＳが、Ｔ細胞に対して直接的にではなくＢ細胞に対して作用することによって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞中のＩＬ−３産生を増加させることを示す。ＬＰＳがコラーゲン関節炎を悪化させるのに対して、ＴＬＲ−４の遮断はコラーゲン関節炎を改善することは公知である（３０、３１）。我々はまた、炎症が生じた関節中に存在する炎症促進性サイトカインが、ポリクローナルに活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３の分泌をどのように変容させるかを分析し、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αまたはＭＩＰ−２ではなく、ＩＬ−６およびＩＬ−４が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３発現を減少させることを見出した。ＩＬ−４およびＩＬ−６の組み合わせにより、単球、またはＬＰＳ刺激したＢ細胞および単球により誘発されるＩＬ−３産生がほぼ完全に妨げられた。好塩基球は、大量のＩＬ−４およびＩＬ−６を産生するため、好塩基球の活性化とＴ細胞によるＩＬ−３産生との間に負のフィードバックの関係を想定できる。全脾細胞および特定の白血球サブセットを除去した脾細胞のコラーゲンＩＩ型による再刺激は、ＩＬ−３がほぼ専らＣＤ４^＋Ｔ細胞により産生され、抗原を提示するＣＤ１１ｂ^＋単球の存在を必要とすることを裏付けた。Ｂ細胞は、単球の不存在下では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＬ−３産生を補助しない。

【0127】

要約すると、我々のデータは、ＩＬ−３がコラーゲン関節炎の発達に関わっており、関節リウマチの初期型について、または維持療法における再燃の防止についての新規な治療標的であることを証明した。

【0128】

（実施例２）
滑液中または血漿中のＩＬ−３の存在は、関節リウマチの活性化型についての指標であることが見いだされた。このことは、以下の試験で示される。ＩＬ−３が関節炎患者の滑液または血漿中で検出可能かどうかを分析するために、関節炎の症状を伴いリウマチ専門家の元を訪れた、２１人の患者を試験した。これらの患者から、標準的な方法により血漿を入手した。更に、関節穿刺により滑液を入手して、遠心分離の後、試験のために用いた。

【0129】

血漿および滑液の両方におけるＩＬ−３の測定のために、ＥＬＩＳＡ試験を用いた。結果を図７に示す。図示のように、活動性関節リウマチと診断された８人の患者中６人において、ＩＬ−３が血漿または滑液中で見られた。非活動性ＲＡと診断された患者においても、他のタイプの関節炎を伴う患者においても、ＩＬ−３を検出することができなかった。

【0130】

患者は、以下の試験により、関節リウマチ、または他のタイプの関節炎、すなわち、シェーグレン症候群、骨関節症、スチル病または脊椎関節炎と診断された。血漿中のＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）量および滑液中の白血球数を、活動性および非活動性関節炎について定めた。活動性ＲＡの指標を、ＣＲＰ＞２０ｍｇ／ｌ、または滑液中の白血球数＞１００００／μＬと定義した。従って、１４人の患者が関節リウマチと診断され、そのうち８人は、活動性関節リウマチを伴うことが見いだされ、かつ７人の患者は、他のタイプの関節炎と診断された。活動性関節リウマチを伴うその患者では、血漿または滑液中のＩＬ−３量は、平均９．５ｐｇ／ｍＬ、標準偏差±３．３であった。

【0131】

これらのデータは、ＩＬ−３が活動型の関節リウマチに苦しむ患者にのみ存在することを示す。これらの場合、患者を、疾患を軽減するかまたは治療する、ＩＬ−３の遮断により治療することができる。検出可能なＩＬ−３量を呈しない患者は、本発明のＩＬ−３阻害剤により治療することができない。

【0132】

（参考文献）
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１０．Ｋｕｒｉｍｏｔｏ Ｙ， ｄｅ Ｗｅｅｋ ＡＬ， Ｄａｈｉｎｄｅｎ ＣＡ． Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ Ｃ５ａ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９８９；１７０（２）： ４６７−７９．
１１．Ｌｅ Ｇｒｏｓ Ｇ， Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ ＳＺ， Ｃｏｎｒａｄ ＤＨ， Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ， Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ ＦＤ， Ｐｌａｕｔ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ＩＬ−３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−４ ｂｙ ｓｐｌｅｎｉｃ ｎｏｎ−Ｂ， ｎｏｎ−Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｇｅ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９０；１４５（８）： ２５００−６．
１２．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ， Ｔｓｕｔｓｕｉ Ｈ， Ｔｏｍｉｎａｇａ Ｋ， Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｋ， Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ， Ａｋｉｒａ Ｓ， ｅｔ ａｌ． ＩＬ−１８， ａｌｔｈｏｕｇｈ ａｎｔｉａｌｌｅｒｇｉｃ ｗｈｅｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ＩＬ−１２， ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ＩＬ−４ ａｎｄ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ． １９９９：９６（２４）： １３９６２−６．
１３．Ｆｒｅｎｄｌ Ｇ， Ｂｅｌｌｅｒ Ｄｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＬ−３． Ｉ． ＩＬ−３ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｉａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−１ ｂｕｔ ｎｏｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９０；１４４（９）： ３３９２−９．
１４．Ｆｒｅｎｄｌ Ｇ， Ｆｅｎｔｏｎ ＭＪ， Ｂｅｌｌｅｒ Ｄｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＬ−３． ＩＩ． ＩＬ−３ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｃｔ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９０；１４４（９）： ３４００−１０．
１５．Ｂｕｅｌｅｎｓ Ｃ， Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅ ＥＪ， Ａｍｒａｏｕｉ Ｚ， Ｂｏｕｔｒｉａｕｘ Ｍ， Ｓａｌｍｏｎ Ｉ， Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ Ｋ， ｅｔ ａｌ． ｌｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｂｅｔａ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ−ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｂｌｏｏｄ． ２００２；９９（３）： ９９３−８．
１６．Ｅｂｎｅｒ Ｓ， Ｈｏｆｅｒ Ｓ， Ｎｇｕｙｅｎ ＶＡ， Ｆｕｒｈａｐｔｅｒ Ｃ， Ｈｅｒｏｌｄ Ｍ， Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＩＬ−３： ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＩＬ−３ ａｎｄ ＩＬ−４ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅ ｌｅｓｓ ＩＬ−１２ ａｎｄ ｓｈｉｆｔ Ｔｈ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏｗａｒｄ ａ Ｔｈ２ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐａｔｔｅｒｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；１６８（１２）： ６１９９−２０７．
１７．Ｂａｒｔｏｎ ＢＥ， Ｍａｙｅｒ Ｒ． ＩＬ−３ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８９；１４３（１０）： ３２１１−６．
１８．Ｔｏｙｏｓａｋｉ−Ｍａｅｄａ Ｔ， Ｔａｋａｎｏ Ｈ， Ｔｏｍｉｔａ Ｔ， Ｔｓｕｒｕｔａ Ｙ， Ｍａｅｄａ−Ｔａｎｉｍｕｒａ Ｍ， Ｓｈｉｍａｏｋａ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｇｉａｎｔ ｂｏｎｅ− ｒｅｓｏｒｂｉｎｇ ｃｅｌｌｓ： ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｒｓｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． ２００１ ；３（５）： ３０６−１０．
１９．Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ＧＳ， Ｘｕ ＷＤ， Ｔｏｗｎｓｅｎｄ Ｋ， Ｂｒｏｉｄｅ Ｄ， Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａ Ｊ， Ｇｌａｓｅｂｒｏｏｋ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｉ． Ｆａｉｌｕｒｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ （ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３） ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ− ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ （ＣＳＦ−１） ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９８８； １６８（５）： １５７３−８６．
２０．Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａ ＪＭ， Ｚｖａｉｆｌｅｒ ＮＪ， Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ＧＳ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｖ． Ｍｕｔｕａｌ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｏｎ ＨＬＡ−ＤＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １９９０；８６（６）： １７９０−８．
２１．Ｙａｍａｄａ Ｒ， Ｔａｎａｋａ Ｔ， Ｕｎｏｋｉ Ｍ， Ｎａｇａｉ Ｔ， Ｓａｗａｄａ Ｔ， Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ， ａｎｄ ｍａｘｉｍｕｍＬｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｔｈａｔ ｔｗｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃｉ ｈａｖｅ ｏｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ２００１ ；６８（３）： ６７４−８５．
２２．Ｄｅｎｚｅｌ Ａ， Ｍａｕｓ ＵＡ， Ｇｏｍｅｚ ＭＲ， Ｍｏｌｌ Ｃ， Ｎｉｅｄｅｒｍｅｉｅｒ Ｍ， Ｗｉｎｔｅｒ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｂａｓｏｐｈｉｌｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００８；９（７）： ７３３−４２．
２３．Ｌｅｅ ＤＭ， Ｆｒｉｅｎｄ ＤＳ， Ｇｕｒｉｓｈ ＭＦ， Ｂｅｎｏｉｓｔ Ｃ， Ｍａｔｈｉｓ Ｄ１ Ｂｒｅｎｎｅｒ ＭＢ． Ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ： ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００２；２９７（５５８７）： １６８９−９２．
２４．Ｎｉｇｒｏｖｉｃ ＰＡ， Ｂｉｎｓｔａｄｔ ＢＡ， Ｍｏｎａｃｈ ＰＡ， Ｊｏｈｎｓｅｎ Ａ， Ｇｕｒｉｓｈ Ｍ， Ｉｗａｋｕｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｖｉａ ＩＬ−１． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ． ２００７；１０４（７）： ２３２５−３０．
２５．Ｚｈｏｕ ＪＳ， Ｘｉｎｇ Ｗ， Ｆｒｉｅｎｄ ＤＳ， Ａｕｓｔｅｎ ＫＦ， Ｋａｔｚ ＨＲ． Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｋｉｔ（Ｗ−ｓｈ） ｍｉｃｅ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｍｐａｉｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００７；２０４（１２）： ２７９７−８０２．
２６．Ｂｒｕｈｌ Ｈ， Ｃｉｈａｋ Ｊ， Ｐｌａｃｈｙ Ｊ， Ｋｕｎｚ−Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ Ｌ， Ｎｉｅｄｅｒｍｅｉｅｒ Ｍ， Ｄｅｎｚｅｌ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｇｒ−１＋，ＣＣＲ２＋ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ２００７；５６（９）： ２９７５−８５．
２７．Ｂｒｕｈｌ Ｈ， Ｃｉｈａｋ Ｊ， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＭＡ， Ｐｌａｃｈｙ Ｊ， Ｒｕｐｐ Ｔ， Ｗｅｎｚｅｌ Ｉ１ ｅｔ ａｌ． Ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＣＲ２ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＣＲ２＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４；１７２（２）： ８９０−８．
２８．Ｈａｗｗａｒｉ Ａ， Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｊ， Ｖａｄａｓ ＭＡ， Ｃｏｃｋｅｒｉｌｌ ＰＮ． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩＬ−３ ｌｏｃｕｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ｔｗｏ ＮＦＡＴ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２； １６９（４）： １８７６−８６．
２９．Ｓｔｅｖｅｎｓ ＴＬ， Ｂｏｓｓｉｅ Ａ， Ｓａｎｄｅｒｓ ＶＭ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ Ｒ， Ｃｏｆｆｍａｎ ＲＬ， Ｍｏｓｍａｎｎ ＴＲ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ− ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ． １９８８；３３４（６１７９）： ２５５−８．
３０．Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｓ， Ｓａｓａｔｏｍｉ Ｅ， Ｍｏｒｉ Ｙ， Ｓａｇａｉ Ｍ． Ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９； １６３（６）： ３４１７−２２．
３１．Ａｂｄｏｌｌａｈｉ−Ｒｏｏｄｓａｚ Ｓ， Ｊｏｏｓｔｅｎ ＬＡ， Ｒｏｅｌｏｆｓ ＭＦ， Ｒａｄｓｔａｋｅ ＴＲ， Ｍａｔｅｒａ Ｇ， Ｐｏｐａ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４ ｂｒｅａｋｓ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｌｏｏｐ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ２００７；５６（９）： ２９５７−６７．
３２．Ｅｍａｎｕｅｌ ＰＤ， Ｐｅｉｐｅｒ ＳＣ， Ｃｈｅｎ Ｚ， Ｓｈｅｎｇ ＤＣ， Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ＫＳ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９０ Ｊｕｎ；８７（１２）： ４４４９−５２．
３３．Ｓｕｎ Ｑ， Ｗｏｏｄｃｏｃｋ ＪＭ， Ｒａｐｏｐｏｒｔ Ａ， Ｓｔｏｍｓｋｉ ＦＣ， Ｋｏｒｐｅｌａｉｎｅｎ Ｅｌ， Ｂａｇｌｅｙ ＣＪ， Ｇｏｏｄａｌｌ ＧＪ， Ｓｍｉｔｈ ＷＢ， Ｇａｍｂｌｅ ＪＲ， Ｖａｄａｓ ＭＡ， Ｌｏｐｅｚ ＡＦ． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ７Ｇ３ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ （ＩＬ−３） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｃｈａｉｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＬ−３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ． Ｂｌｏｏｄ． １９９６ Ｊａｎ １ ；８７（１）： ８３−９２．
３４．Ｗａｔａｎａｂｅ Ｙ， Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ， Ｈａｙａｓｈｉｄａ Ｋ， Ｍｉｙａｊｉｍａ Ａ． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ （ｂｅｔａ ｃ） ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ （ＩＬ−３）， ＩＬ− ５， ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｓｈｏｗｓ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ ｃ ｂｙ ＩＬ−１ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ． Ｂｌｏｏｄ． １９９２ Ｎｏｖ １ ；８０（９）： ２２１５−２０．
３５．Ｍｏｒｅｌ ＰＡ， Ｓｃｈｒｅｕｒｓ Ｊ， Ｔｏｗｎｓｅｎｄ Ｋ１ Ｇｒｏｓｓ Ｍ， Ｃｈｉｌｌｅｒ ＪＭ， Ｔｗｅａｒｄｙ ＤＪ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＩＬ−３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９１ Ａｐｒ １ ；１４６（７）： ２２９５−３０４．
３６．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ， Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ． Ｎａｔｕｒｅ １９９０， ３４６：８１８−８２２．
３７．Ｔｕｅｒｋ Ｃ， Ｇｏｌｄ Ｌ： Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０， ２４９：５０５−５１０．
３８．Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ Ｓ， Ｎｏｌｔｅ Ａ， Ｂａｌｄ Ｒ， Ｅｒｄｍａｎｎ ＶＡ１ Ｆｕｒｓｔｅ ＪＰ： Ｍｉｒｒｏｒ−ｉｍａｇｅ ＲＮＡ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ Ｄ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９６， １４：１１１２−１１１５．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】