特許 5778039 流行関連株のためのインフルエンザワクチンレジメン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5778039

(24)【登録日】2015年7月17日

(45)【発行日】2015年9月16日

(54)【発明の名称】流行関連株のためのインフルエンザワクチンレジメン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/145 20060101AFI20150827BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20150827BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20150827BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/145ZMD

   A61K39/39

   A61P31/16

【請求項の数】11

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2011-548804(P2011-548804)

(86)(22)【出願日】2010年2月10日

(65)【公表番号】特表2012-517415(P2012-517415A)

(43)【公表日】2012年8月2日

(86)【国際出願番号】IB2010000302

(87)【国際公開番号】WO2010092476

(87)【国際公開日】20100819

【審査請求日】2012年12月4日

(31)【優先権主張番号】61/207,371

(32)【優先日】2009年2月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504389991

【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】グロス， ニコラ

(72)【発明者】

【氏名】フラガパーネ， エレナ

【審査官】 吉田 佳代子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０３２２１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 NURSING COLLEGE，２００７年，VOL.2，P.41-43

【文献】 日本医事新報，１９８４年１１月 ３日，NO.3158，P.43-48

【文献】 日本臨床内科医会会誌，１９９９年，VOL.14, NO.5，P.229-232

【文献】 VACCINE，２００７年，VOL.25，P.4345-4349

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトを免疫化するための組み合わせ物であって、前記組み合わせ物は、
（ａ）流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含み、かつスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む水中油型エマルジョンアジュバントによってアジュバント添加された第一の不活化ウイルスワクチンであって、前記第一のワクチンは、筋肉内注射によって投与されることを特徴とする、第一のワクチン；および
（ｂ）前記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含み、かつスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む水中油型エマルジョンアジュバントによってアジュバント添加された第二の不活化ウイルスインフルエンザワクチンであって、前記第二のワクチンは、前記第一のワクチンが投与されてから２週間後に投与され、かつ前記第二のワクチンは、筋肉内注射によって投与されることを特徴とする、第二のワクチン
を含み、ここで、前記流行関連インフルエンザウイルス株からの前記抗原は、前記ワクチン中の唯一の抗原であり、そして、前記流行関連インフルエンザウイルス株がＨ５血球凝集素サブタイプを有し、前記第一および第二のワクチンの水中油型エマルジョンアジュバントはサブミクロンの油滴を有する、組み合わせ物。

【請求項2】

ヒトを免疫化するのに使用される医薬の製造における、第一の不活化ウイルスワクチンおよび第二の不活化ウイルスワクチンの使用であって、各々、同じ流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含み、かつスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む水中油型エマルジョンアジュバントによってアジュバント添加されており、前記第一のワクチンおよび前記第二のワクチンは同じヒトに筋肉内注射によって２週間隔で投与され、ここで、前記流行関連インフルエンザウイルス株からの前記抗原は、前記ワクチン中の唯一の抗原であり、そして、前記流行関連インフルエンザウイルス株がＨ５血球凝集素サブタイプを有し、前記水中油型エマルジョンアジュバントはサブミクロンの油滴を有する、使用。

【請求項3】

予備免疫化するための第一の不活化ウイルスワクチンであって、前記第一のワクチンは、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含み、かつスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む水中油型エマルジョンアジュバントによってアジュバント添加されており、前記第一のワクチンは、前記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含み、かつスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む水中油型エマルジョンアジュバントによってアジュバント添加された第二の不活化ウイルスワクチンを受容するヒトに筋肉内注射によって投与されることを特徴とし、ここで、前記第二のワクチンは、２週間後に筋肉内注射によって投与されることを特徴とし、そして前記流行関連インフルエンザウイルス株からの前記抗原は、前記ワクチン中の唯一の抗原であり、そして、前記流行関連インフルエンザウイルス株がＨ５血球凝集素サブタイプを有し、前記第一および第二のワクチンの水中油型エマルジョンアジュバントはサブミクロンの油滴を有する、第一の不活化ウイルスワクチン。

【請求項4】

流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む、免疫化するための第二の不活化ウイルスワクチンであって、前記第二のワクチンは、スクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む水中油型エマルジョンアジュバントによってアジュバント添加されており、前記第二のワクチンは、前記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含み、かつスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む水中油型エマルジョンアジュバントによってアジュバント添加された第一の不活化ウイルスワクチンを受容したヒトに筋肉内注射によって投与されることを特徴とし、ここで、前記第一のワクチンは、前記第二のワクチンを受容する２週間前に筋肉内注射によって投与されることを特徴とし、そして前記流行関連インフルエンザウイルス株からの前記抗原は、前記ワクチン中の唯一の抗原であり、そして、前記流行関連インフルエンザウイルス株がＨ５血球凝集素サブタイプを有し、前記第一および第二のワクチンの水中油型エマルジョンアジュバントはサブミクロンの油滴を有する、第二の不活化ウイルスワクチン。

【請求項5】

第一の不活化ウイルスワクチンおよび第二の不活化ウイルスワクチンを含むキットであって、各々、同じ流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含み、かつスクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む水中油型エマルジョンアジュバントによってアジュバント添加されており、前記第一のワクチンおよび前記第二のワクチンは２週間隔でのヒトへの筋肉内注射による投与のためのものであり、そして前記流行関連インフルエンザウイルス株からの前記抗原は、前記ワクチン中の唯一の抗原であり、そして、前記流行関連インフルエンザウイルス株がＨ５血球凝集素サブタイプを有し、前記水中油型エマルジョンアジュバントはサブミクロンの油滴を有する、キット。

【請求項6】

前記第一のワクチンおよび前記第二のワクチンが両方ともスプリットビリオンワクチンであるか、または両方とも精製された表面抗原ワクチンである、請求項１または３〜５のいずれか一項に記載の組み合わせ物、ワクチンまたはキット。

【請求項7】

前記第一の不活化ウイルスワクチンおよび前記第二の不活化ウイルスワクチンが両方ともチオメルサールを含まない、請求項１または３〜５のいずれか一項に記載の組み合わせ物、ワクチンまたはキット。

【請求項8】

前記第一の不活化ウイルスワクチンおよび前記第二の不活化ウイルスワクチンが約０．５ｍｌの投薬容量で投与される、請求項１または３〜５のいずれか一項に記載の組み合わせ物、ワクチンまたはキット。

【請求項9】

前記第一のワクチンおよび前記第二のワクチンが両方ともスプリットビリオンワクチンであるか、または両方とも精製された表面抗原ワクチンである、請求項２に記載の使用。

【請求項10】

前記第一の不活化ウイルスワクチンおよび前記第二の不活化ウイルスワクチンが両方ともチオメルサールを含まない、請求項２に記載の使用。

【請求項11】

前記第一の不活化ウイルスワクチンおよび前記第二の不活化ウイルスワクチンが約０．５ｍｌの投薬容量で投与される、請求項２に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この特許出願は、２００９年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／２０７，３７１号（この完全な内容は、参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。

【0002】

技術分野
この発明は、インフルエンザウイルス感染から保護するためのワクチン、特に、流行関連株からの抗原を含むワクチンを投与するためのレジメンの分野にある。

【背景技術】

【0003】

流行しているインフルエンザＡウイルスはサブタイプＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２であるが、Ｈ５サブタイプが近い将来流行するかもしれないと予想されている。ヒト集団は新しい血球凝集素サブタイプに免疫学的にナイーブであるので、この抗原シフトはインフルエンザ流行の大発生を引き起こす。

【0004】

インフルエンザ流行に備えて、流行前ワクチン接種戦略を用いることが提案されている。そのうちに起こるかもしれないいかなる抗原連続変異にもかかわらず、もたらされる免疫が流行発生時に有益であることを期待して、患者は現在のＨ５株（鳥由来）で免疫化される。２００８年に、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品が、ヒト流行前使用のために欧州で承認された。

【0005】

ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品は、２つの用量レジメンによって投与される。臨床試験では２１日間隔で（すなわち０日目および２１日目に）用量を投与したが、このレジメンは参考文献１でも報告されている。Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒの流行前ワクチンも、０日目および２１日目に投与されたことを参考文献２（非特許文献１）および参考文献３（非特許文献２）は報告している。Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＶａｃｃｉｎｅｓのＡＦＬＵＮＯＶ（商標）製品も、このレジメンによって投与されている［４］。同様に、参考文献５は、豪州のＣＳＬのワクチンの２１日２用量レジメンを報告し、同じレジメンは参考文献６で用いられた。参考文献７は２１日２用量レジメンを用いる様々な試験を指摘しているが、２８日レジメンも指摘している（参考文献８も参照）。マカクでの試験［９］では、０日目および２７日目に２用量を投与した。一前臨床試験では、ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）は０日目および２４日目にウサギに投与された。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｂｒｅｓｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ（２００６）３６７：１６５７〜６４

【非特許文献2】Ｌｅｖｉｅら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（２００８）１９８：６４２〜９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、例えば流行前免疫化のために、流行関連インフルエンザワクチンの投与のためのさらなる改善されたレジメンを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

用量が３〜４週間隔で与えられる先行技術のレジメンと対照的に、本発明によれば、２用量の流行関連インフルエンザ抗原が１週間隔、２週間隔または６週間隔でヒト被験体に投与される。

【0009】

したがって、本発明は、ヒトを免疫化するための方法であって、（ａ）流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第一のワクチンを前記ヒトに投与するステップと、次いでｗ週間後に、（ｂ）前記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第二のインフルエンザワクチンを前記ヒトに投与するステップとを含む方法を提供する。

【0010】

本発明は、この方法によってヒトを免疫化することにおいて使用するための、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第一のインフルエンザワクチンおよび第二のインフルエンザワクチンも提供する。

【0011】

本発明は、ヒトを免疫化することにおいて使用するための医薬の製造における、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原をそれぞれが含む第一のワクチンおよび第二のワクチンの使用であって、第一のワクチンおよび第二のワクチンは同じヒトにｗ週間隔で投与される使用も提供する。

【0012】

本発明は、ヒトを予備免疫化するための医薬の製造における、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第一のワクチンの使用も提供し、ここで、前記ヒトに、前記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第二のワクチンがｗ週間後に投与される。

【0013】

本発明は、ヒトを免疫化するための医薬の製造における、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第二のワクチンの使用も提供し、ここで、前記ヒトに、前記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第一のワクチンが前記第二のワクチンの投与のｗ週間前に投与されている。

【0014】

本発明は、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原をそれぞれが含む第一のワクチンおよび第二のワクチンを含むキットも提供し、ここで、前記第一のワクチンおよび前記第二のワクチンはｗ週間隔でヒトに投与される。

【0015】

ｗの値は、１、２または６である。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ヒトを免疫化するための方法であって、（ａ）流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第一のワクチンを上記ヒトに投与するステップと、次いでｗ週間後に、（ｂ）上記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第二のインフルエンザワクチンを同じヒトに投与するステップとを含み、ｗが１、２または６である、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法によってヒトを免疫化するのに使用される、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む、第一のインフルエンザワクチンおよび第二のインフルエンザワクチン。
（項目３）
ヒトを免疫化するのに使用される医薬の製造における、同じ流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原をそれぞれが含む第一のワクチンおよび第二のワクチンの使用であって、上記第一のワクチンおよび上記第二のワクチンは同じヒトにｗ週間隔で投与され、ここで、ｗは１、２または６である、使用。
（項目４）
ヒトを予備免疫化するための医薬の製造における、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第一のワクチンの使用であって、上記ヒトは、上記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第二のワクチンをｗ週間後に受容し、ここでｗは１、２または６である、使用。
（項目５）
ヒトを免疫化することにおいて使用するための医薬の製造における、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第二のワクチンの使用であって、上記ヒトは、上記流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む第一のワクチンを、上記第二のワクチンを受容するｗ週間前に受容しており、ｗは１、２または６である、使用。
（項目６）
同じ流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原をそれぞれが含む第一のワクチンおよび第二のワクチンを含むキットであって、上記第一のワクチンおよび上記第二のワクチンはｗ週間隔でのヒトへの投与のためのものであり、ｗは１、２または６である、キット。
（項目７）
上記第一のワクチンおよび上記第二のワクチンが両方とも不活化ウイルスワクチンである、前述の項目のいずれかに記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目８）
上記第一のワクチンおよび上記第二のワクチンが両方ともスプリットビリオンワクチンであるか、または両方とも精製された表面抗原ワクチンである、項目７に記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目９）
上記流行関連インフルエンザウイルス株がＨ５血球凝集素サブタイプを有する、前述の項目のいずれかに記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目１０）
上記第一のワクチンおよび上記第二のワクチンに、スクアレンを含む水中油型エマルジョンアジュバントがアジュバント添加されている、前述の項目のいずれかに記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目１１）
上記エマルジョンがサブミクロンの油滴を有し、スクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートを含む、項目１０に記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目１２）
上記エマルジョンがサブミクロンの油滴を有し、スクアレン、ＤＬ−α−トコフェロールおよびポリソルベート８０を含む、項目１０に記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目１３）
上記エマルジョンがサブミクロンの油滴を有し、スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤および疎水性非イオン性界面活性剤を含む、項目１０に記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目１４）
上記第一のワクチンおよび上記第二のワクチンが両方ともチオメルサールを含まない、前述の項目のいずれかに記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目１５）
上記第一のワクチンおよび上記第二のワクチンが約０．５ｍｌの投薬容量で投与される、前述の項目のいずれかに記載の方法、ワクチン、使用またはキット。
（項目１６）
上記第一のワクチンおよび上記第二のワクチンが筋肉内注射によって投与される、前述の項目のいずれかに記載の方法、ワクチン、使用またはキット。

【発明を実施するための形態】

【0016】

ワクチン
様々な形のインフルエンザウイルスワクチンが今日利用でき、ワクチンは、生ウイルスまたは不活化ウイルスに一般に基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、または精製された表面抗原に基づいてもよい。インフルエンザ抗原は、ビロゾームの形で提示されてもよい。本発明は、これらの種類のワクチンのいずれかと共に用いることができるが、一般的に不活化ワクチンと共に用いられる。

【0017】

不活化ウイルスが用いられる場合、ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオンまたは精製された表面抗原（血球凝集素を含み、ノイラミニダーゼも通常含む）を含むことができる。ウイルスを不活化するための化学的手段には、以下の作用物質、すなわち界面活性剤、ホルムアルデヒド、βプロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミンまたはそれらの組合せの１つまたは複数の有効量による処理が含まれる。ウイルス不活化の非化学的方法は、例えば紫外線またはガンマ照射など、当技術分野で公知である。

【0018】

ビリオンは、ウイルスを含有する流体から様々な方法によって収集することができる。例えば、精製方法は、ビリオンを破壊するための界面活性剤を含む線形ショ糖勾配溶液を用いる、ゾーン遠心法を含むことができる。次に任意選択の希釈の後、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製することができる。

【0019】

スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割工程を含めて、精製されたビリオンを界面活性剤（例えばエチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、トリトンＸ−１００、トリトンＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）で処理してサブビリオン調製物を生成することによって得られる。インフルエンザウイルスを分割する方法は当技術分野で周知であり、例えば参考文献１０〜１５などを参照されたい。ウイルスの分割は、感染性または非感染性の全ウイルスを、分割剤の破壊濃度で破壊または断片化することによって一般的に実施される。破壊はウイルスタンパク質の完全または部分的可溶化を生じさせ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性（例えば陽イオン性）の界面活性剤、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、ヘカメグ（Ｈｅｃａｍｅｇ）、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチル臭化アンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミンおよびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばトリトン界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００またはトリトンＮ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分割手順はデオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続作用を用い、分割は初期のビリオン精製中に（例えばショ糖密度勾配溶液で）起こることができる。したがって、分割工程は、ビリオン含有物質の浄化（非ビリオン物質を除去するため）、収集されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ_４吸着などの吸着法を用いる）、非ビリオン物質からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心工程（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分割剤を含むショ糖勾配を用いる）での分割剤を用いるビリオンの分割、次に望ましくない物質を除去するためのろ過（例えば限外ろ過）を含むことができる。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張性生理食塩水に有効に再懸濁することができる。ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品は、スプリットワクチンである。

【0020】

精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原血球凝集素および、一般的にノイラミニダーゼも含む。精製された形のこれらのタンパク質を調製する方法は周知である。ＡＦＬＵＮＯＶ（商標）、ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品が例である。

【0021】

不活化インフルエンザ抗原の別の形は、ビロゾーム［１６］（無核酸ウイルス様リポソーム粒子）である。ビロゾームは、界面活性剤によるインフルエンザウイルスの可溶化と、続くヌクレオカプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって調製することができる。ビロゾームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、それらの膜にウイルスタンパク質を有するリポソームを与えることを含む。本発明は、ＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ（商標）およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）製品の場合のように、バルクのビロゾームを保存するために用いることができる。ビロゾームＨ５Ｎ１ワクチンが公知である［１７］。

【0022】

本発明のレジメンによって投与される第一のワクチンおよび第二のワクチンは、好ましくは同じ種類であり、すなわち両方とも不活性化されるかまたは両方とも生である。両方とも不活性化される場合、不活性化の型は好ましくは同じであり、すなわち両方とも完全ビリオンであるか、両方ともスプリットビリオンであるか、両方ともビロゾームであるか、または両方とも精製された表面抗原である。スプリットビリオンおよび表面抗原が好ましい。

【0023】

ＨＡは現在の不活性化インフルエンザワクチンでの主な免疫原であり、ワクチンの用量は、一般的にＳＲＩＤで測定されるＨＡレベルを参考にして標準化される。既存の季節性ワクチンは一般的に１株につき約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば小児のために、または汎流行の状態において、またはアジュバントを用いる場合、より低い用量を用いることができる。より高い用量（例えば３×または９×用量［１８、１９］）が用いられていることと同様に、１／２（すなわち１株につき７．５μｇのＨＡ）、１／４（すなわち、ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）のように３．７５μｇのＨＡ）および１／８などの分割用量が用いられている。特記されている場合を除き、ワクチンは、流行関連インフルエンザ株由来の０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどを含むことができる。特定の用量には、例えば約４５μｇ、約３０μｇ、約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．７５μｇ、約１．９μｇ、約１．５μｇなどが含まれる。

【0024】

生ワクチンについては、投与はＨＡ含有量ではなくメジアン組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）によって測定され、１株につき１０^６〜１０^８（好ましくは１０^６．５〜１０^７．５）のＴＣＩＤ_５０が一般的である。

【0025】

本発明のワクチンは、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む。インフルエンザＡウイルスは、１６個のＨＡサブタイプ、すなわちＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６を現在提示する。流行関連インフルエンザ株の特性は、以下の通りである：（ａ）現在循環しているヒト株の血球凝集素と比較して新しい血球凝集素、すなわち１０年を超える間ヒト集団で明らかでなかったもの（例えばＨ２）、またはヒト集団でそれ以前に全く見られていないもの（例えば、鳥集団だけで一般に見出されているＨ５、Ｈ６もしくはＨ９）を含み、したがってワクチンのレシピエントおよび一般ヒト集団はその株の血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである、（ｂ）ヒト集団で水平感染することができる、ならびに（ｃ）ヒトに病原性である。

【0026】

本発明で使用するための流行関連インフルエンザウイルス株は、一般的にＨ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のサブタイプ、例えばＨ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１またはＨ７Ｎ７を有する。Ｈ５Ｎ１株が好ましい。Ｈ５サブタイプ内では、株はクレード０、１、２、３、４、５、６、７、８または９であってよい。流行株は、Ｈ１サブタイプ（例えばＨ１Ｎ１）を有することができ、例えば、ＨＡはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９株と免疫学的に交差反応を起こしてもよい。

【0027】

上に述べたように、本発明のワクチンは、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原を含む。これはワクチンで唯一の抗原であってよく、または、流行関連インフルエンザウイルス株からの抗原に加えて、ワクチンは少なくとも１つの抗原を含むことができる。さらなる抗原（複数可）は、インフルエンザウイルスからのものであってよく、例えばインフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスからのものであってよい。例えば、ワクチンは、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ３Ｎ２株および／またはインフルエンザＢウイルス株からの抗原を含むことができる。この型の４価ワクチンは、参考文献２０に開示されている。２つのインフルエンザＡウイルス株からの抗原が含まれる場合、これらは共通のノイラミニダーゼサブタイプ、例えばＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１を共有することができる。この共通のＮサブタイプは、交差防御を増強することができる［２１］。

【0028】

本発明で用いられる株は、野生型ウイルスで見出される天然のＨＡまたは改変ＨＡを有することができる。例えば、ウイルスを鳥類の種で高病原性にする決定因子（例えばＨＡ１／ＨＡ２切断部位のあたりの超塩基性領域）を除去するために、ＨＡを改変することが公知である。

【0029】

本発明で用いられるインフルエンザウイルスは、リアソータント株であってもよく、逆方向遺伝学技法によって得られたものでもよい。逆方向遺伝学技法［例えば２２〜２６］は、プラスミドまたは他の人工ベクターを用いて、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することを可能にする。一般的に、それは、（ａ）例えばｐｏｌＩプロモーターまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター由来の所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子、および（ｂ）例えばｐｏｌＩＩプロモーター由来のウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現させることを含み、この結果、細胞内の両種のＤＮＡの発現が完全な無傷の感染性ビリオンの組立てをもたらす。ＤＮＡは好ましくはウイルスのＲＮＡおよびタンパク質のすべてを提供するが、ＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを用いることも可能である。各ウイルスＲＮＡを生成するために別々のプラスミドを用いる、プラスミドに基づく方法を用いることができ［２７〜２９］、これらの方法は、ウイルスタンパク質のすべてまたは一部（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰタンパク質だけ）を発現させるためのプラスミドの使用も含み、一部の方法では最高１２個のプラスミドが用いられる。必要なプラスミドの数を減少させるために、最近の手法［３０］は、同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成のために）（例えば、１、２、３、４、５、６、７または全８個のインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）を、および別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域と組み合わせる（例えば、１、２、３、４、５、６、７または全８個のインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写産物をコードする配列）。参考文献３０の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡのｍＲＮＡコード領域、ならびに（ｂ）単一のプラスミド上の全８個のｖＲＮＡコードセグメントを含む。１つのプラスミドの上にＮＡおよびＨＡセグメントを含み、別のプラスミドの上に他の６つのセグメントを含むことも、事を促進することができる。

【0030】

ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを用いることの代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを用いることが可能である［３１］。例えば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターを、都合よく用いることができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のために、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）により便利であることができるが、細胞は、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってもトランスフェクトされなければならない。

【0031】

他の技術では、ウイルスＲＮＡおよび単一の鋳型からの発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために、二重のｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを用いることが可能である［３２、３３］。

【0032】

したがって、インフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含むことができる（一般的に、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来する６個のセグメント、ＨＡおよびＮセグメントはワクチン株に由来する、すなわち６：２のリアソータント）。それは、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス、またはワクチン製剤のためにリアソータントウイルスを生成するために有用な任意の他のウイルス株からの、１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含むこともできる。インフルエンザＡウイルスは、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０）からの６個未満（すなわち、０、１、２、３、４または５個）のウイルスセグメントを含むことができる。インフルエンザＢウイルスは、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）からの６個未満（すなわち、０、１、２、３、４または５個）のウイルスセグメントを含むことができる。一般的に、本発明は、ヒトからヒトへの感染が可能な株から保護し、したがってその株のゲノムは、哺乳動物（例えばヒト）のインフルエンザウイルスに由来した少なくとも１つのＲＮＡセグメントを通常含む。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来したＮＳセグメントを含むことができる。

【0033】

その抗原が組成物に含まれてもよい株は、抵抗性流行株を含め、抗ウイルス療法に抵抗性であってよい（例えば、オセルタミビル［３４］および／またはザナミビルに抵抗性）［３５］。

【0034】

インフルエンザウイルスは弱毒化されてもよい。インフルエンザウイルスは温度感受性であってもよい。インフルエンザウイルスは低温順応化されてもよい。これらの３つの特徴は、生きているウイルスを抗原として用いる場合に特に有用である。

【0035】

特に有用な株は、患者からの単離から細胞培養系での複製までの間のいかなる段階においても卵で継代されていないものである。ＭＤＣＫ細胞は、単離からウイルス複製までのすべての工程で排他的に用いることができる。

【0036】

一部の実施形態では、本発明で用いる株は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合優先性を有する血球凝集素を有する。ヒトインフルエンザウイルスはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖（ガラクトースに対するα−２，６連結シアル酸）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵およびＶｅｒｏ細胞はＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有する受容体オリゴ糖を有する。ＭＤＣＫなどの細胞でのヒトインフルエンザウイルスの増殖は、卵での継代と異なって、本来のＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合を維持するように血球凝集素に選択圧を加える。

【0037】

ウイルスが、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合優先性を有するかどうかを決定するために、様々なアッセイを用いることができる。例えば、参考文献３６は、親和定数の高感度な定量測定値を与えるインフルエンザウイルス受容体結合活性のための、固相酵素結合アッセイを記載している。参考文献３７は、２つの異なるシアリル糖タンパク質へのウイルスの結合が評価された（Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ決定因子を有するオボムコイド、およびＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ決定因子を有するブタα_２−マクログロブリン）固相アッセイを用い、さらに、２つの受容体類似体である遊離のシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）および３’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）に対してウイルスの結合が評価されたアッセイを記載する。参考文献３８は、α２，３またはα２，６結合への受容体優先性を明らかに区別することができたグリカンアレイを用いるアッセイを報告する。参考文献３９は、Ｓｉａ（α２，６）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，３）Ｇａｌを含むように酵素で改変されたヒト赤血球の凝集に基づくアッセイを報告する。アッセイの種類によって、ウイルス自体で直接に実施すること、またはウイルスから精製された血球凝集素で間接に実施することができる。

【0038】

一部の実施形態では、本発明で用いるインフルエンザ株は、卵由来のウイルスと異なるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質（血球凝集素を含む）を有する。したがって、糖タンパク質は、鶏卵で見られないグリコフォームを含む。

【0039】

細胞系
本発明で使用するためのワクチンの製造では、ウイルス増殖のための基質としてＳＰＦ卵を用いることができ、その場合、ウイルスは鶏卵の感染尿膜腔液から収集される。しかし代わりに、インフルエンザウイルスの複製を補助する細胞系を用いてもよい。細胞系は、一般的に哺乳動物起源である。適する哺乳動物細胞起源には、それらに限定されないが、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）ならびにイヌの細胞が含まれるが、霊長類細胞の使用は好ましくない。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などの、様々な細胞型を用いることができる。適するハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称の細胞系である。適するサル細胞は、Ｖｅｒｏ細胞系の場合のように、例えば腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である［４０〜４２］。適するイヌ細胞は、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞系の場合のように、例えば腎臓細胞である。

【0040】

したがって、適する細胞系には、それらに限定されないが、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＣＬＤＫ、ＨＫＣＣ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、ＰＥＲ．Ｃ６［４３］、ＦＲｈＬ２、ＷＩ−３８などが含まれる。適する細胞系は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［４４］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［４５］から、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、目録番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で様々な異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、目録番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を提供している。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。

【0041】

最も好ましい細胞系は、哺乳動物型のグリコシル化を有するものである。哺乳動物細胞系に対するあまり好ましくない代替形態として、カモ（例えばカモ網膜）または雌鶏に由来する細胞系を含む鳥類の細胞系でウイルスを増殖させることができる［例えば、参考文献４６〜４８］。鳥類の細胞系の例には、鳥類の胚性幹細胞［４６、４９］およびカモ網膜細胞［４７］が含まれる。適する鳥類の胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞系、ＥＢ４５、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４が含まれる［５０］。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を用いてもよい。しかし鳥類の細胞を用いずに、哺乳動物の細胞を用いることは、ワクチンが鳥類のＤＮＡおよび卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）を含まないようにすることができ、それによってアレルゲン性を低減させることを意味する。

【0042】

インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞系は、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌの腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞系である［５１〜５４］。元のＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞系の派生株および他のＭＤＣＫ細胞系を用いることもできる。例えば、参考文献５１は、懸濁培養での増殖に順応させたＭＤＣＫ細胞系を開示する（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託されている「ＭＤＣＫ３３０１６」）。同様に、参考文献５５は、無血清培養での懸濁で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞系を開示する（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託されている「Ｂ−７０２」）。参考文献５６は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献５７は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞系を開示する。これらのＭＤＣＫ細胞系のいずれかを用いることができる。

【0043】

ウイルスは、接着培養または懸濁の細胞上で増殖させることができる。微粒子担体培養を用いることもできる。一部の実施形態では、細胞をこのように懸濁での増殖のために順応させることができる。

【0044】

細胞系は、好ましくは無血清培地および／またはタンパク質非含有培地で増殖させる。ヒトまたは動物起源の血清からの添加物がない本発明の状況において、培地は無血清培地と呼ばれる。そのような培養で増殖する細胞は当然タンパク質自体を含むが、タンパク質非含有培地は、細胞の増殖（例えば感染前の）が、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して起こるものを意味すると理解されているが、ウイルス増殖のために必要かもしれないトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を任意選択で含むことができる。

【0045】

インフルエンザウイルスの複製を補助する細胞系は、ウイルス複製の間、好ましくは３７℃未満で増殖させる［５８］（例えば３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）。

【0046】

培養細胞でインフルエンザウイルスを増殖させるための方法は、細胞培養物に増殖させる株の接種材料を接種するステップ、ウイルス増殖のために所望の時間、例えばウイルス力価または抗原発現の決定のように（例えば接種後の２４〜１６８時間）感染細胞を培養するステップ、および増殖させたウイルスを収集するステップを一般に含む。培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０のウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ_５０によって測定）対細胞比で接種される。ウイルスは細胞懸濁液に加えられるかまたは細胞の単層に加えられ、ウイルスは、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で少なくとも６０分間、しかし通常３００分間未満、好ましくは９０〜２４０分間、細胞の上で吸収される。収集された培養上清のウイルス含有量を増加させるために、感染した細胞培養物（例えば単層）を凍結融解または酵素作用によって取り出すことができる。収集された流体は、次に不活化または凍結保存される。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させることができる。さらにより好ましくは、細胞を約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞は、感染後３０〜６０時間で収集することができる。好ましくは、細胞は、感染後３４〜４８時間で収集される。さらにより好ましくは、細胞は、感染後３８〜４０時間で収集される。ウイルス放出を可能にするために細胞培養の間、プロテアーゼ（一般的にトリプシン）が一般に加えられ、プロテアーゼは、培養中の任意の適する段階で、例えば接種前、接種と同時、または接種後に加えることができる［５８］。

【0047】

有用な実施形態では、特にＭＤＣＫ細胞では、細胞系は元の作業用細胞バンクから４０回の個体数倍加レベルを越えて継代培養されない。

【0048】

ウイルス接種材料およびウイルス培養物は、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルスおよび／またはパルボウイルスが好ましくは含まれない（すなわち、それによる汚染について検査され、陰性である）［５９］。単純ヘルペスウイルスの非存在が、特に好ましい。

【0049】

宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスを細胞系で増殖させた場合、ＤＮＡのあらゆる発癌活性を最小にするために、最終ワクチンに残留する細胞系ＤＮＡの量を最小にすることが標準的な実施である。

【0050】

したがって、好ましくは本発明によって調製されるワクチン組成物は、１用量につき１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留性宿主細胞ＤＮＡを含むが、極微量の宿主細胞ＤＮＡが存在してもよい。

【0051】

０．２５ｍｌ容量につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンのように、１５μｇの血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが好ましい。０．５ｍｌ容量につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンのように、５０μｇの血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンがより好ましい。

【0052】

任意の残留性宿主細胞ＤＮＡの平均長が、５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。

【0053】

混入ＤＮＡは、標準の精製手順、例えばクロマトグラフィーなどを用いて、ワクチン調製の間に除去することができる。残留性宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼによる処理、例えばＤＮアーゼを用いることによって増強することができる。先ずウイルス増殖の間用いることができるＤＮアーゼ（例えばベンゾナーゼ）を用い、次にビリオン破壊の間用いることができる陽イオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）を用いる二段階処理を含む、宿主細胞ＤＮＡの混入を減らすための便利な方法が、参考文献６０および６１に開示されている。βプロピオラクトン処理による除去を用いることもできる。

【0054】

残留性宿主細胞ＤＮＡの測定は、今では生物学的製剤にとってはルーチンな規制要件で、当業技術者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡの測定に用いられるアッセイは、一般的には検証済みのアッセイである［６２、６３］。検証済みのアッセイの性能特性は、数学的および定量化可能な用語で記載することができ、その可能な間違いの原因は特定されていることになる。そのアッセイは、正確度、精度、特異性などの特性について、一般に検査されていることになる。アッセイが較正され（例えば宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）、検査されると、定量的なＤＮＡ測定を常法により実施することができる。ＤＮＡ定量化のための３つの主な技術を用いることができる：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション方法［６４］、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）系などのイムノアッセイ方法［６５］、および定量的ＰＣＲ［６６］。これらの方法のすべては当業技術者によく知られているが、各方法の正確な特性は、問題の宿主細胞、例えばハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択などによって決まるかもしれない。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓからのＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）系は、総ＤＮＡのピコグラムレベルの定量アッセイであり、生物薬剤中の混入ＤＮＡレベルを監視するために用いられている［６５］。一般的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体およびＤＮＡの間での、反応複合体の非配列特異的形成を含む。すべてのアッセイ構成要素は、製造業者から入手可能な完全なＴｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに含まれる。様々な商業的な製造者は、例えばＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど、残留性宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ混入の測定についての、化学発光ハイブリダイゼーションアッセイおよび総ＤＮＡ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）系の比較を、参考文献６７に見ることができる。

【0055】

医薬組成物
本発明で使用するためのワクチンは、インフルエンザ抗原に加えて成分を通常含み、例えばそれらは１つまたは複数の薬学的担体および／または賦形剤を一般的に含む。そのような成分の詳細な議論は、参考文献６８で入手可能である。多くの実施形態では、アジュバントが含まれてもよい。

【0056】

組成物は、投与時には一般に水性の形である。

【0057】

組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含むことができる。ワクチンは、水銀物質を実質的に含まないこと（例えば＜１０μｇ／ｍｌ）、例えばチオメルサールを含まないことが好ましい［１４、６９］。水銀を含有していないワクチンがより好ましく、水銀化合物に代わるものとしてα−トコフェロールスクシネートが含まれてもよい［１４］。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。

【0058】

張度を調節するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むのが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在することができる。存在することができる他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウムおよび／または塩化マグネシウムなどが含まれる。アジュバントが抗原とは別の容器にある場合、塩化ナトリウムは両方の容器に存在することができる。

【0059】

組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、おそらく２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を有することができる。

【0060】

組成物は、１つまたは複数の緩衝液を含むことができる。一般的な緩衝液には、以下が含まれる：リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントと一緒に）、またはクエン酸緩衝液。緩衝液は、一般的に５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。

【0061】

組成物のｐＨは、一般に５．０〜８．１であり、より一般的には６．０〜８．０、例えば６．５および７．５、または７．０〜７．８である。

【0062】

組成物は、好ましくは無菌である。組成物は好ましくは非発熱性であり、例えば１用量につき＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準の尺度）、好ましくは１用量につき＜０．１ＥＵしか含まない。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。

【0063】

本発明の組成物は、界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知である）、オクトキシノール（例えばオクトキシノール−９（トリトンＸ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、または、特にスプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために、デオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。界面活性剤は、極微量だけ存在してもよい。したがって、ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々の１ｍｇ／ｍｌ未満を含むことができる。極微量の他の残留性成分は、抗生物質（例えばネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）でよかった。アジュバントが抗原とは別の容器にある場合、この界面活性剤は抗原を含有する容器に通常存在する（例えば、抗原とポリソルベート８０およびオクトキシノール１０）。

【0064】

組成物は１回の免疫化のための材料を含むことができ、または複数回の免疫化のための材料を含むことができる（すなわち、「多用量」キット）。多用量の配列では、保存剤の含有が好ましい。多用量組成物に保存剤を含むことの代わりに（またはそれに加えて）、組成物は、材料の取り出しのための無菌アダプターを有する容器に含まれてもよい。

【0065】

インフルエンザワクチンは、一般的に約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、特に小児には、半用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を投与することもできる。

【0066】

ワクチンは、好ましくは２℃〜８℃で保存される。それらは、冷凍されるべきでない。それらは、理想的には直射光から保護されるべきである。

【0067】

ワクチンは、即時投与のために、または投与前即席混合のための部品キットとして、例えば別々の抗原およびアジュバント成分として（ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品の場合のように）製剤化して、任意の適する容器で供給することができる。適する容器には、バイアル、注射器（例えば使い捨て注射器）、鼻内噴霧などが含まれる。これらの容器は無菌であるべきである。組成物／成分がバイアル内に置かれる場合、バイアルは、好ましくはガラスまたはプラスチック製の材料で作製される。バイアルは、好ましくは組成物がそれに加えられる前に滅菌される。ラテックス感受性患者の問題を回避するために、バイアルは好ましくはラテックスを含まないストッパーで密封され、すべての包装材料にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、ワクチンの単回用量を含むことができ、またはそれは１回より多い用量（「多回用量」バイアル）、例えば１０回用量を含むことができる。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。バイアルは、注射器をそのキャップに挿入することができるように適合されたキャップ（例えばルアーロック）を有することができる。バイアルは、特に多回用量バイアルの場合、その内容物の無菌取り出しを可能にするキャップを有することができる。成分が注射器に収容される場合、注射器はそれに装着される針を有することができる。針が装着されない場合、組立ておよび使用のために別の針を注射器と一緒に供給してもよい。そのような針は、ケースに入れてもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージ針が一般的である。記録の保守を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期および内容物の有効期限を印刷することができる引き剥がしラベルを注射器とともに提供してもよい。吸引の間、プランジャーが偶発的に抜けることを予防するために、注射器のプランジャーは、好ましくはストッパーを有する。注射器は、ラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを有することができる。使い捨て注射器は、１回用量のワクチンを含む。注射器は針の装着前にチップを密封するためのチップキャップを一般に有し、チップキャップは好ましくはブチルゴム製である。

【0068】

例えば小児への送達を容易にするために、半用量の容量を示す印を容器に付けてもよい。例えば、０．５ｍｌの量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示すマークを有することができる。

【0069】

ガラス容器（例えば注射器またはバイアル）を用いる場合、ソーダ石灰ガラス製よりもホウ珪酸ガラス製の容器を用いるのが好ましい。

【0070】

容器は、ワクチンの詳細、例えば投与の説明、ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットと同梱（例えば同じボックスに）してもよい。説明書は、例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応などの場合に容易に利用できるアドレナリン溶液を常備するための警告を含むこともできる。

【0071】

アジュバント
使用時に、有利には、本発明のワクチンは、組成物を投与される患者で誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強する働きをすることができるアジュバントを含むことができる。水中油型エマルジョンアジュバント（特にスクアレンを含むもの）の存在は、季節性［７０］および流行性［７１、７２］インフルエンザワクチンの免疫応答の株交差反応性を増強することがわかっている。

【0072】

本発明で使用するための水中油型エマルジョンは、一般的に少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、（１つまたは複数の）油および界面活性剤は、生物分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に直径５μｍ未満であり、サブミクロンの直径でさえも有することができ、これらの小さいサイズは、安定したエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーで達成される。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴はろ過滅菌にかけることができるので、それらが好ましい。

【0073】

本発明は、動物（例えば、魚）または植物源からのものなどの油と一緒に用いることができる。植物油の原料には、堅果、種子および穀類が含まれる。最も一般的に入手可能である落花生油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、堅果油の例である。ホホバ油を用いることができ、例えばホホバ豆から得ることができる。種子油には、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが含まれる。穀類群では、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦などの他の穀物粒の油を用いることもできる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油には天然に存在しないが、堅果油および種子油から始まる適当な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪と油は代謝可能であり、したがって、この発明の実施で用いることができる。動物源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化の手順および他の手段は、当技術分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に回収することができる代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、鮫肝油および鯨蝋などの鯨油は、本明細書で用いることができる魚油のいくつかの例である。５炭素イソプレン単位でいくつかの分枝鎖油が生化学的に合成され、テルペノイドと一般に呼ばれている。鮫肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知である、分枝状不飽和テルペノイドを含む。スクアレンの飽和類似体スクアランを用いることもできる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的な供給源から容易に入手できるか、または当技術分野で公知である方法によって得ることができる。スクアレンが好ましい。

【0074】

他の有用な油はトコフェロールであり、ビタミンＥは高齢患者（例えば、６０歳以上）で免疫応答に対して正の影響を有することが報告されているので、それらは、有利にはこの患者群で使用するためのワクチンに含まれる［７３］。それらは、エマルジョンの安定化を助けることができる抗酸化特性も有する［７４］。様々なトコフェロールが存在する（α、β、γ、δ、εまたはξ）が、αが通常用いられる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンに適合し、水銀化合物に代わる有用な保存剤であることが公知である［１４］。

【0075】

油の混合物、例えばスクアレンおよびα−トコフェロールを用いることができる。２〜２０％（容積で）の範囲の含油率が一般的である。

【0076】

界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性比）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それらに限定されないが以下を含む界面活性剤と用いることができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸ（商標）で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が異なることができるオクトキシノールであって、オクトキシノール−９（トリトンＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなどの、ノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびに、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（通常、ＳＰＡＮとして公知である）。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンに含めるのに最も好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ８０）である。

【0077】

界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびオクトキシノールの組合せも適する。別の有用な組合せは、ラウレス９に加えてポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。

【0078】

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０など）０．０１〜１％、より詳細には約０．１％；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばトリトンＸ−１００、またはトリトンシリーズの他の界面活性剤）０．００１〜０．１％、より詳細には０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、より詳細には０．１〜１％、または約０．５％である。

【0079】

スクアレンを含有する水中油型エマルジョン、特にポリソルベート８０を含むものが好ましい。本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントには、それらに限定されないが以下のものが含まれる。

【0080】

・スクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの組成は、容量で約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ８５であってよい。重量では、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ８５になる。参考文献７８の第１０章および参考文献７９の第１２章でさらに詳細に記載されるように、このアジュバントは「ＭＦ５９」［７５〜７７］として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、有利にはクエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。

【0081】

・スクアレン、トコフェロールおよびポリソルベート８０のサブミクロンのエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のポリソルベート８０を有することができ、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１（例えば０．９０）であり、この比が、より安定したエマルジョンを提供することができる。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容量比、または約１１：５の重量比で存在することができる。そのようなエマルジョンの１つは、ＰＢＳにＴｗｅｅｎ８０を溶解させて２％溶液を与え、次にこの溶液の９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次にこの混合物を微流動化することによって作製することができる。生じるエマルジョンは、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロンの油滴を有する。エマルジョンは、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）を含むこともできる。この型の別の有用なエマルジョンは、ヒトの１用量につき０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロールおよび０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含むことができる［８０］。

【0082】

・スクアレン、トコフェロールおよびトリトン界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）のエマルジョン。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬを含むこともできる（下記参照）。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含むことができる。

【0083】

・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、トリトン界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）およびトコフェロール（例えばα−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３つの成分を約７５：１１：１０の質量比（例えば７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌトリトンＸ−１００および１００μｇ／ｍｌα−トコフェロールスクシネート）で含むことができ、これらの濃度は、これらの成分の抗原からのあらゆる寄与を含むべきである。エマルジョンは、スクアレンを含むこともできる。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬを含むこともできる。水相は、リン酸緩衝液を含むことができる。

【0084】

・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４で製剤化することができる。このエマルジョンはムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルで、「ＳＡＦ−１」アジュバントで、スレオニル−ＭＤＰと用いられている［８１］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバント［８２］（５％スクアラン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）の場合のように、それはＴｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる。微流動化が好ましい。

【0085】

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性の非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えばソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」）を含むエマルジョン。エマルジョンは好ましくは温度可逆的であり、および／または少なくとも９０％（容量で）の、２００ｎｍ未満のサイズの油滴を有する［８３］。エマルジョンは、以下の１つまたは複数を含むこともできる：アルジトール；凍結保護剤（例えば糖、例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；ならびに／またはアルキルポリグリコシド。エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含むことができる［８４］。そのようなエマルジョンは、凍結乾燥してもよい。

【0086】

・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［８５］。アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチン中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。

【0087】

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献８６に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。

【0088】

・非代謝性油（軽鉱油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）など）および少なくとも１つの界面活性剤（例えばレシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）のサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（グルクロン酸のカルボキシル基を通してのデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの添加によって生成される、参考文献８７に記載のＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤が含まれてもよい。

【0089】

・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）がらせんミセルとして会合するエマルジョン［８８］。

【0090】

・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［８９］。

【0091】

・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン性親油性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［８９］。

【0092】

エマルジョンは、ワクチンの製造の間に（１つまたは複数の）抗原と組み合わせること、または送達の時に（ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品の場合のように）、別の抗原含有成分と即席的に混合するための別々の成分として供給することができる。これらの２つの成分が液体である場合、混合するための２つの液体の容量比は異なることができる（例えば５：１〜１：５の間で）が、一般的に約１：１である。

【0093】

抗原およびアジュバントを混合した後、血球凝集素抗原は水溶液に一般に残るが、油／水界面の周辺に分布することがある。一般に、あるとしても少量しかない血球凝集素は、エマルジョンの油相に入る。

【0094】

一部の実施形態では、第一のワクチンおよび第二のワクチンの１つだけにアジュバントが添加されている（好ましくは第一）。しかし好ましくは、一般的に同じアジュバントを用いて両方のワクチンにアジュバントが添加されている。

【0095】

ワクチン投与
ワクチンは、本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者の免疫応答を惹起する方法において用いられる。

【0096】

本発明の方法、キットおよび使用は、一般に抗体応答、好ましくは防御抗体応答を起こさせるために用いられる。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当技術分野で周知である。ヒト試験は、ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清試料血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染からの約５０％の防御を与える）［９０］。抗体応答は、血球凝集阻止、微量中和、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血（ＳＲＨ）によって一般的に測定される。偽型アッセイを用いることができる。これらのアッセイ技術はすべて、当技術分野において周知である。

【0097】

本発明の組成物は、様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫化経路は筋肉内注射（例えば腕や脚）によるものであるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻腔内［９１〜９３］、経口［９４］、口内、舌下、皮内［９５、９６］、経皮、経真皮［９７］などが含まれる。

【0098】

本発明によって調製されるワクチンは、小児および成人の両者を治療するために用いることができる。インフルエンザワクチンは、６カ月の年齢以上の、小児および成人の免疫化で使用することが現在推奨されている。したがって、患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。ワクチン投与に好ましい患者は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳および好ましくは≧６５歳）、年少者（例えば≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍部および軍隊の人員、妊娠女性、慢性病患者、免疫不全患者、ワクチン投与の前７日間に抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルまたはザナミビル化合物、下記参照）を投与された患者、卵アレルギーのある者および海外旅行者である。しかしワクチンは、これらの群のためだけに適するのではなく、集団でより一般に用いることができる。

【0099】

ワクチンは、流行前の状況下で（すなわち流行が起こる前に）、または流行の状況下で（すなわち流行の大発生が開始した後に）投与することができる。

【0100】

本発明の好ましい組成物は、効力のＣＰＭＰ基準の１つ、２つまたは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）では、これらの基準は以下の通りである：（１）≧７０％血清防御、（２）≧４０％セロコンバージョン、および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加。高齢者（＞６０歳）では、これらの基準は以下の通りである：（１）≧６０％血清防御、（２）≧３０％セロコンバージョン、および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加。これらの基準は、少なくとも５０人の患者の非盲検試験に基づく。

【0101】

本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同じ時間に（例えば医療専門家またはワクチン接種施設への同じ診察または診療の間に）、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、複合Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌複合ワクチン（四価のＡ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌複合ワクチンなどと実質的に同じ時間に、患者に投与されてもよい。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同じ時間の投与は、高齢患者で特に有益である。

【0102】

同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに有効な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同じ時間に（例えば医療専門家への同じ診察または診療の間に）患者に投与されてもよい。これらの抗ウイルス薬には、そのエステル（例えばエチルエステル）およびその塩（例えばリン酸塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などのノイラミニダーゼ阻害剤が含まれる。好ましい抗ウイルス薬は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）であり、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））としても公知である。

【0103】

レジメン
本発明のレジメンは２用量の流行関連抗原の投与を含み、２用量は、１週間隔、２週間隔または６週間隔で投与される。いかなる流行関連抗原もこれらの２用量の間に投与されないが、さらなる流行関連抗原が第二の用量の後に投与されてもよい。

【0104】

２用量が１週間隔で与えられる場合、これらは正確に７日間隔（例えば２つの連続する月曜日）でよいが、標準的な実施によれば、多少の許容差がある。同様に、２週または６週間隔で与えられる用量にも、許容差がある。したがって、２用量は、ｘ〜ｙ日間隔で与えることができる。

【0105】

第一の実施形態では、ｘの値は５であり、ｙの値は９である。第二の実施形態では、ｘの値は６であり、ｙの値は８である。

【0106】

第三の実施形態では、ｘの値は１２であり、ｙの値は１６である。第四の実施形態では、ｘの値は１３であり、ｙの値は１５である。

【0107】

第五の実施形態では、ｘの値は３５であり、ｙの値は４９である。第六の実施形態では、ｘの値は３８であり、ｙの値は４６である。第七の実施形態では、ｘの値は４０であり、ｙの値は４４である。第八の実施形態では、ｘの値は４１であり、ｙの値は４３である。

【0108】

一部の実施形態では、ｘおよびｙの値は同一であり、その場合には、句「ｘ〜ｙ」は単に「ｘ」になり、そこで、ｘは７、１４または４２である。

【0109】

一般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから排他的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｏｆ）こと、または別のものを含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）こと、例えばＸ＋Ｙであることができる。

【0110】

単語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明の定義から省略されてもよい。

【0111】

数値ｘに関しての用語「約」は、任意選択で用いられ、例えばｘ±１０％を意味する。

【0112】

特記されていない場合、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、混合のいかなる特定の順序も要求しない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。３つの成分がある場合、２つの成分を互いと組み合わせ、次にその組合せを第三の成分と組み合わせること、などができる。

【0113】

動物（特にウシ）の材料を細胞の培養で用いる場合、それらは、伝染性の海綿状脳症（ＴＳＥ）が存在せず、特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）が存在しない原料から得るべきである。全体として、動物由来の物質が完全に存在しない中で細胞を培養することが好ましい。

【0114】

リアソートメントまたは逆方向遺伝学手順のために、またはウイルス増殖のために細胞基質を用いる場合、好ましくはそれは、例えばＰｈ Ｅｕｒ ｇｅｎｅｒａｌ第５．２．３章の場合のように、ヒトワクチンの製造での使用が承認されているものである。

【実施例】

【0115】

前向き無作為化非盲検第ＩＩＩ相試験が、１８〜６０歳の約２４０名の被験体で実施される。被験体は１：１：１：１の比で無作為化され、４つの異なるワクチン接種スケジュールの１つを受ける。ワクチンは、三角筋（好ましくは非利き腕の）の筋肉内に１、２、３または６週間隔で投与される。血球凝集阻止（ＨＩ）、微量中和（ＭＮ）および一元放射溶血（ＳＲＨ）による免疫原性の評価のために、各ワクチン接種の前（１回目および２回目の診察）、ならびに第二のワクチン接種の３週間後（３回目の診察）に、血液試料をすべての被験体からとる。２週群および３週群からの血液試料は、異種Ｈ５Ｎ１（Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５）抗原に対する免疫応答についてさらに試験される。

【0116】

同じワクチン、すなわちＡ／Ｈ５Ｎ１株からの７．５μｇの血球凝集素を含む０．５ｍＬの一価表面抗原ワクチンが、すべての患者に投与される。ワクチンは、ＭＦ５９（商標）水中スクアレンエマルジョンでアジュバント添加され、０．２５ｍＬの２×アジュバントを０．２５ｍＬの２×抗原と混合することによって作製される。ワクチンは、最大０．０５ｍＬまで過剰に充填された充填済み注射器で提供される。

【0117】

同種ワクチン抗原（ＮＩＢＲＧ１４；クレード１）によるＭＮ、ＨＩおよびＳＲＨアッセイに基づき、第二のワクチンを第一のワクチンの２、３または６週間後に投与される群では、すべてのＣＨＭＰ基準が満たされる。第二の投与の後、２週および６週群でのセロコンバージョン率（それぞれ７６％および７９％）は、３週群（７２％）と比較して高い。同様に、ＭＮアッセイで４倍の増加を示した患者のパーセンテージは、３週群（７３％）と比較して、２週および６週群（それぞれ７５％および９０％）でより高かった。ＳＲＨが示すように、ワクチンは、異種Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５に対して異種免疫防御も誘導する。

【0118】

１週、２週および６週群の患者は、ワクチンに対して疼痛、発赤および腫脹のような、局所有害事象がより少ないことも示す（表１を参照）。

【0119】

本発明は、ほんの一例として説明されたすぎず、本発明の範囲および精神の範囲に留まりながら修正を加えることができることが理解されよう。

【0120】

【表1】

【0121】

【化1】

【0122】

【化2】

【0123】

【化3】