特許 5778138 ＨＥＰＧ２細胞のコレステロール恒常性に関与するダイズ７Ｓグロブリンα’サブユニットの伸長領域のクローニング、酵母発現、精製および生物活性

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5778138

(24)【登録日】2015年7月17日

(45)【発行日】2015年9月16日

(54)【発明の名称】ＨＥＰＧ２細胞のコレステロール恒常性に関与するダイズ７Ｓグロブリンα’サブユニットの伸長領域のクローニング、酵母発現、精製および生物活性

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/415 20060101AFI20150827BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20150827BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20150827BHJP

   A61P 3/06 20060101ALN20150827BHJP

   A61P 9/10 20060101ALN20150827BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150827BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/415

   C12P21/02 C

   A61K37/04

   !A61P3/06

   !A61P9/10

   !C12N15/00 AZNA

【請求項の数】4

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2012-515392(P2012-515392)

(86)(22)【出願日】2010年6月16日

(65)【公表番号】特表2012-530090(P2012-530090A)

(43)【公表日】2012年11月29日

(86)【国際出願番号】EP2010003627

(87)【国際公開番号】WO2010145820

(87)【国際公開日】20101223

【審査請求日】2013年4月26日

(31)【優先権主張番号】09162939.4

(32)【優先日】2009年6月17日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591092198

【氏名又は名称】インデナ エッセ ピ ア

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】モラッツォーニ、 パオロ

(72)【発明者】

【氏名】リヴァ、 アントネッラ

(72)【発明者】

【氏名】ポンツォーネ、 チェザレ

(72)【発明者】

【氏名】ベルランダ、 ダヴィデ

(72)【発明者】

【氏名】デュランティ、 マルチェッロ

(72)【発明者】

【氏名】コンソーニ、 アレッサンドロ

【審査官】 吉門 沙央里

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５１６０４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 M Lovati, et al，Atherosclerosis Supplement，２００９年 ６月１６日，Vol.10, Issue 2，Abstract:600

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ末端側から１４２のアミノ酸残基からなるダイズ７Ｓグロブリンα’サブユニットのＮ末端親水性フラグメント。

【請求項2】

配列番号１からなる請求項１に記載のＮ末端親水性フラグメント。

【請求項3】

組換えポリペプチドのクローニング、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現および精製を含む、請求項１または２に記載のダイズ７ＳグロブリンのＮ末端親水性フラグメントの調製方法。

【請求項4】

好適な担体との混合剤中に活性成分として請求項１または２に記載のダイズ７ＳグロブリンのＮ末端親水性フラグメントを含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ダイズ７Ｓグロブリンの天然のα’サブユニットのＮ末端親水性フラグメントに対応する組換えα’フラグメント、ならびにその調製方法ならびにコレステロールおよびトリグリセリドの恒常性を制御するのに有用な活性成分としてそれを含有する組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

（発明の背景）
高コレステロール血症患者の血中脂質レベル(lipidemic level)の制御における食事性のダイズタンパク質の役割は、広く受け入れられている論点である[１]。以前の研究[２〜４]においては、ＬＤＬ受容体のアップレギュレーションにおけるダイズ７Ｓグロブリンの１つのサブユニットであるα’サブユニットの直接的な関与がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ系において証明され、コレステロール恒常性を調節することができる生物活性（ポリ）ペプチドが、細胞酵素処理により産生される可能性が高いことが示唆されている。

【0003】

天然の７Ｓグロブリンは、異なる遺伝子によりコードされた、３つのランダムに分類されたポリペプチド鎖、α’、αおよびβサブユニット[５]からなる。成熟α’（受入番号Ｐ１１８２７ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース）およびα鎖（受入番号Ｐ１３９１６ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース）は、βサブユニット（受入番号Ｐ２５９７４ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース）には存在していない約１４５のアミノ酸残基の伸長Ｎ末端領域を共有している。α’伸長領域の特有のアミノ酸配列に基づいて、このサブユニットは金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製され、高コレステロール血症ラットに経口投与され、それにより、その血漿脂質低下特性および肝臓β−ＶＬＤＬ受容体のアップレギュレーションの両方を示すことが可能となった[４]。一方、α’サブユニットの分子量はおよそ７１ｋＤａである[６]ため、修飾されない限りｉｎ ｖｉｖｏで腸の障壁を越えるとは考えられない。

【0004】

このため、本発明者らの研究は、薬理学的効果に関与するα’サブユニットのアミノ酸配列(複数可)を探求することに向けられてきた。３つのサブユニットのコア領域は非常に類似のアミノ酸配列を有するため、生物活性は該伸長領域の１つまたは複数の（ポリ）ペプチドにあるはずであると考えられる。原理上、限定的ではあるが有意なα’およびα鎖の伸長領域間のアミノ酸の差異により、生物活性に関与するペプチドの数が制限されるであろう。

【0005】

これらの以前の記述から、最初に探求した戦略は、Ｃｒｏｋｓｏｙ(登録商標)７０(高コレステロール血症患者の食事療法において通常利用されるイソフラボンを含まないダイズ濃縮物[７〜８])のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化(ペプシン／トリプシン)から得られたポリペプチド、および７Ｓダイズグロブリンサブユニット間で異なっていた特定のアミノ酸配列に対応する合成ペプチドの両方の、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ受容体(ＬＤＬ−Ｒ)調節に対する効果を試験することであった。これらの研究において得られた結果は、３０００〜２００００Ｄａの範囲のＭＷを有するＣｒｏｋｓｏｙ(登録商標)７０の酵素消化産物、ならびに７Ｓダイズグロブリン由来の小さい合成ペプチド(２２７１Ｄａ)(１０^−４Ｍの濃度で細胞に添加した)に曝されたＨｅｐＧ２細胞において顕著なＬＤＬ−Ｒアップレギュレーションを誘発できたことを指摘していた[９]。小さいペプチドを用いて得られた研究結果は、現在、依然として調査中であり、今までのところ結論が出ていない[１０]。

【0006】

ダイズタンパク質のコレステロールおよびトリグリセリドを低下させる能力は確固たる論点である。ダイズタンパク質の食事は、高コレステロール血症患者を治療するための現在最も有力な食事性のツールであり、したがって、成人および非常に若い被験者の管理のユニークな機会を提供している。さらに、血漿コレステロールの低減が、コレステロール血症のベースラインの程度が高い患者においてより大きいことは明確に確立されている[１４]。

【0007】

タンパク質自体が血中コレステロールを低減するという仮定は、食事における動物タンパク質から植物タンパク質への転換により、実験動物の肝臓[１５]、ならびに高コレステロール血症患者の循環リンパ単球[１６]においてＬＤＬ受容体系が活性化されることを示している実験的研究に起因していた。コレステロール低下効果に関与するダイズタンパク質成分を同定するために、ＬＤＬ受容体の発現およびコレステロールの生合成／分解を調節する因子に対して非常に感受性であるヒト肝細胞癌細胞系を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を実施した。７Ｓダイズグロブリン由来の精製α’サブユニットがＨｅｐＧ２細胞においてＬＤＬ受容体をアップレギュレーションする[３]ことが分かり、この発見は、コレステロール給餌ラットにおいて確認された[４]。これらのデータは、観察された生物学的効果に該タンパク質部分が関与しているという仮定を支持するものであるが、ペプチドおよびアミノ酸は通常胃および／または腸のタンパク質分解酵素の作用により産生されるため、α’鎖のｉｎ ｖｉｖｏの生体内動態(biological fate)に対する議論が生じる可能性がある。しかし、抗酸化、抗増殖および抗炎症効果に起因する場合が多い関連する調節機能を果たすと主張されている動物および植物（ポリ）ペプチドの数が増大している[１７]。ダイズに関する限り、ペプチドおよびＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害物質などのさらに小さい小型のタンパク質を吸着することができ[１８]、したがって、抗癌、抗炎症性、放射線防護効果を含めた多数の効果を引き出す[１９]可能性が、実験的証拠により明確に示されている。遺伝子組換えダイズ（ポリ）ペプチドも、降圧効果などの生物学的応答を誘発することが示されてきた[２０]。最近になって、７Ｓグロブリンβ鎖に由来するＬＤＬ−Ｒ転写を刺激するペプチド（ＦＶＶＮＡＴＳＮ）が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のプロテアーゼにより、次いで、化学的合成により調製されたダイズ加水分解物から同定された[２１]。この場合、１００μＭの濃度の該ペプチドに曝されたＨｅｐＧ２細胞においてＬＤＬ−Ｒ転写の増大(＋１４８％)が検出された。１１Ｓグロブリンから生じる他のペプチドは、類似の活性を発揮するがその活性はより低いことが示されてきた[２１]。

【0008】

完全長タンパク質の生物学的特性を維持または改善さえする、より短いポリペプチドを入手可能にすることが望ましいであろう。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｓｉｒｔｏｒｉ ＣＲ． ｅｔ ａｌ.，Ｃｕｒｒ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｒｅｐ．２００１；３：４７−５３

【非特許文献2】Ｌｏｖａｔｉ ＭＲ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｔｒ．１９９２；１２２：１９７１−８

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

（発明の説明）
今般、ダイズ７ＳグロブリンのＮ末端側に対応するそのいわゆるα’伸長領域が有益な生物活性を有することが分かり、ＬＤＬの取込みおよび分解に対してフルサイズのα’鎖より効果的でさえあることが証明された。

【0011】

本発明は、したがって、以下ｅα’と呼ぶ前記α’伸長領域、ならびにダイズα’サブユニットのＮ末端伸長領域を含有する組換えポリペプチドのクローニング、酵母発現および精製によるその調製方法を提供する。

【0012】

この目的のために、α’鎖のＮ末端フラグメントの異種発現を試みた。酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの分泌能力のある酵母細胞(secretion-competent yeast cell)においてこの目標を達成した。組換えポリペプチドを精製し、ＨｅｐＧ２細胞においてその生物活性を評価した。この生物工学的手法の使用により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、さらにはｉｎ ｖｉｖｏ実験において試験するのに十分な量の組換えポリペプチドを得ることができた。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ｐＰＩＣＺαＢ−ｅα’コンストラクトの概要である。ｅα’の発現は、ＡＯＸ(アルコールオキシダーゼ)メタノール誘導性プロモーター(５'ＡＯＸ１)により駆動され、α接合因子(α−ＭＦ)は組換えタンパク質の培地への分泌を促進し、ＡＯＸ１ ＴＴはＡＯＸ転写終結領域である。Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子はゼオシンに対する耐性を付与し、ｐＵＣ ＯｒｉはＥ.ｃｏｌｉにおける多数のプラスミドコピーの複製開始点である。他の略語は制限酵素の開裂位置を指し、ｂｐは塩基対である。

【図2】図２は、組換えポリペプチド(ｅα’)および野生型のダイズα’サブユニットの配列アラインメントである。星印は、２つの配列における同一のアミノ酸残基を示す。

【図2A】図２Ａは組換えポリペプチド（ｅα）’の配列（配列番号１）である。

【図2B】図２Ｂは野生型のダイズα’サブユニットの配列（配列番号２）である。

【図3】図３−パネルＡは組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養物の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーンＭ：分子量マーカー。レーン１：メタノールによる誘導の前のＴＣＡ沈殿培養上清(TCA-Precipitated culture supernatant）（無細胞）。レーン２：メタノールによる誘導の１ｈ後のＴＣＡ沈殿培養上清（無細胞）。レーン３：メタノールによる誘導の８ｈ後のＴＣＡ沈殿培養上清（無細胞）。レーン４：メタノールによる誘導の１９ｈ後のＴＣＡ沈殿培養上清（無細胞）。レーン５：メタノールによる誘導の２５ｈ後のＴＣＡ沈殿培養上清（無細胞）。図３−パネルＢはｅα’精製ステップの還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーンＭ：分子量マーカー。レーン１：発酵ブロスの凍結乾燥粉末。レーン２：ＤＥＡＥ−セルロース １５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分。レーン３：ＤＥＡＥ−セルロース ２５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分。

【発明を実施するための形態】

【0014】

発明の詳細な説明
本発明は、次に、以下の実験の項において詳細に説明する。

【0015】

材料および方法
酵母、細菌株および化学物質。酵母発現にＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３(ＷＴ)株(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)を使用した。遺伝子操作に利用した細菌株はＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)であった。制限酵素Ｐｓｔ ＩおよびＸｂａ ＩをＲｏｃｈｅ(Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ)から、Ｓａｃ ＩをＦｅｒｍｅｎｔａｓ(Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ)から購入した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ(Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)から購入した。ゼオシンはＩｎｖｉｖｏｇｅｎ(Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)から購入した。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドはＰｒｉｍｍ(Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ)から得た。ペプトン、トリプトン、酵母エキスおよび寒天はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ(Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ)から購入した。グルコースおよびソルビトールはＳｉｇｍａ(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ)から購入した。透析膜はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ(Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ)から購入した。ＤＥＡＥ樹脂はＷｈａｔｍａｎ(Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ)から購入した。ＮｉＮＴＡ樹脂はＱｉａｇｅｎ(Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ)から購入した。Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ４ ＨＰＬＣカラムはＷａｔｅｒｓ(Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ)から購入した。

【0016】

他の化学物質はＳｉｇｍａ(Ｓｔ.Ｌｕｉｓ、ＭＯ)からまたはＭｅｒｃｋ(Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ)からの試薬グレードであった。

【0017】

培地および増殖条件。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３株をＹＰＤ(酵母ペプトンデキストロース)完全培地(２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース)において培養した。ＹＰＤ、寒天１．５％、１００ｍｇ／ｍＬゼオシンを含有するプレートにおいて、Ｍｕｔ^＋形質転換体を選択した。全ての酵母培養物を３０℃で維持した。異種タンパク質検出のために、ＹＰＳ(酵母ペプトンソルビトール)培地(２％ペプトン、１％酵母エキス、２％ソルビトール)において、Ｚｅｏ^ｒ−Ｍｕｔ^＋形質転換体を６００ｎｍで光学濃度５まで培養した。次いで、メタノールを１％の最終濃度まで添加した。ゼオシンを含有する低塩ＬＢ(Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ)培地のプレート(１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、２５ｍｇ／ｍＬゼオシン)において全ての細菌形質転換体を選択した。全ての細菌培養物を３７℃で維持した。

【0018】

ｅα’遺伝子発現ベクターの構築。関心対象(ｅα’)の配列を含む挿入物(ｔα’)を含有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現プラスミドＤＮＡ鋳型(expression Pichia pastoris plasmid DNA template）（ｐＰＩＣＺαＢ）に対するＰＣＲによりｅα’遺伝子を増幅した。ｅα’遺伝子の５'末端でＰｓｔＩ制限部位を生成するようにオリゴヌクレオチド５'−ＧＡＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＴＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧ−３'を設計した。この変異により、ｅα'のＮ末端位置においてアラニン残基挿入が生じた。ｅα’遺伝子の３'末端でＸｂａＩ制限部位を生成するように第２のオリゴヌクレオチド５'−ＣＣＣＴＴＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣ−３'を設計した。いずれのオリゴヌクレオチドもｍＱ滅菌水に溶解した。ＰＣＲ反応混合物は、０．５ｍＭプライマー、０．８ｍＭ ｄＮＴＰｓ(Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ)、３０ｎｇ鋳型（ｐＰＩＣＺαＢ／ｔα’）、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液(最終組成：５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．４および最終容量が２５ｍＬとなるｍＱ滅菌水)からなっていた。以下の条件を使用して、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００サーモサイクラー(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ)でＰＣＲ増幅を実施した。９４℃で１０ｍｉｎで開始；９４℃で４０ｓｅｃ、６０℃で４０ｓｅｃ、７２℃で２０ｓｅｃで３０サイクル；最終伸長７２℃で１０ｍｉｎおよび４℃で維持。４６５ｂｐのＰＣＲ産物を酵素で消化して４２３ｂｐのフルサイズのコンストラクトとし、それをｐＰＩＣＺαＢベクターにクローニングし、それにより、ｐＰＩＣＺαＢ−ｅα’コンストラクトが生じ、それをＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において形質転換した。テトラサイクリンおよびゼオシンを含有する半流動ＬＢ培地上で陽性クローン(positives clones)を選択した。Ｐｒｉｍｍ(Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ)によりこれらのクローンの１つを配列決定して、ｐＰＩＣＺαＢ−ｅα’コンストラクト配列において変異が発生しないようにした。制限酵素ＳａｃＩを用いた消化により２０μｇのｐＰＩＣＺａＢ−ｅα’コンストラクトおよび３０μｇの発現ベクターｐＰＩＣＺαＢ(負の対照)を線状化し、次いで、精製した。

【0019】

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムにおけるｐＰＩＣＺａＢ−ｅα’の形質転換。１．５ｋＶに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ(Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ)ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ ２５１０装置で２０μｇの線状化ｐＰＩＣＺαＢ−ｅα’コンストラクトおよび３０μｇの線状化ｐＰＩＣＺαＢを用いた電気穿孔法により、野生型(ｗｔ)の酵母細胞を形質転換した。１００ｍｇ／ｍＬのゼオシンを含有するＹＰＤプレートでのプレーティングにより形質転換体を最初に選択した。本発明者らのコンストラクトの形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへの組込みを確認するために、Ｄｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ[ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ]を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。５'ＡＯＸ１(５'−ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ−３')および３'ＡＯＸ１プライマー（５'−ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣ−３'）を使用したＰＣＲによりアルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸ１）部位でのコンストラクトの挿入を確認するための鋳型としてゲノムＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応混合物は、０．５ｍＭプライマー、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１００ｎｇのゲノム鋳型、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液(最終組成は上記の通り)からなっていた。以下の条件を使用してＰＣＲ反応を実施した。９４℃で１０ｍｉｎで開始；９４℃で４０ｓ、６０℃で４０ｓ、７２℃で２０ｓで３０サイクル；最終伸長７２℃で１０ｍｉｎおよび４℃で維持。

【0020】

形質転換体クローンの選択。振盪(１８０ｒｐｍ)培養器中の３０℃の５０ｍＬのＹＰＳ培地において、１８のＺｅｏ^＋形質転換体およびｐＰＩＣＺαＢ発現ベクター(負の対照)を含有する１つの形質転換体をＯＤ_６００＝５まで増殖させた。１％の最終濃度までメタノールを添加することにより誘導期を誘発し、２４時間延長した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりｅα’の発現について上清のアリコートを検査した。発酵槽規模(fermenter scale)での組換えタンパク質の生産のために、最高のｅα’発現を有するクローン形質転換体を選択した。

【0021】

ｅα’の発現：発酵槽規模。大量生産のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの「Ｐｉｃｈｉａ発酵プロセスガイドライン（Ｐｉｃｈｉａ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）」（バージョンＢ、０５３００２）に従って、１４Ｌの発酵槽（Ｃｈｅｍａｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において選択したクローンを増殖させた。バッフルなし振盪フラスコ(unbaffled shake flask)中のＹＮＢ培地（ＫＨ_２ＰＯ_４ ２．０ｇ；(ＮＨ_４)_２ＳＯ_４ １０．０ｇ；ＭｇＳＯ_４ ７Ｈ_２Ｏ １．０ｇ；ＮａＣｌ ０．２ｇ；ＣａＣｌ_２ ０．２ｇ；グリセロール１００％ １０．０ｇ；ｐＨ５．２までのＫＯＨ；１．０Ｌまでの蒸留水）で種菌培養物を調製する。２５０ｒｐｍ、３０℃で約２４時間の培養後、１．０Ｌの種培養物を使用して、８．５Ｌの基礎塩培地(basal salt medium)（Ｈ_３ＰＯ_４ ８５％ ２２７ｍＬ；ＣａＳＯ_４ ２Ｈ_２Ｏ ７．９ｇ；Ｋ_２ＳＯ_４ １５５ｇ；ＭｇＳＯ_４ ７Ｈ_２Ｏ １２７ｇ；ＫＯＨ ３５ｇ；グリセロール１００％ ３４０ｇ；８．５Ｌまでの蒸留水；滅菌後にＮＨ_４ＯＨを用いてｐＨを５．０に調節した）を用いて用意した発酵槽に接種する。前述の培養基のいずれにもビオチンおよびイノシトール(各１ｍｇ／Ｌ)を補充する。基礎塩培地にも修飾されたＰＴＭ_１微量塩溶液(trace salt solution)（Ｈ_２ＳＯ_４ ９６％ ２．５ｍＬ；ＣｏＣ_２Ｏ_４°２Ｈ_２Ｏ ２４３ｍｇ；ＣｕＳＯ_４°５Ｈ_２Ｏ ３．０ｇ；ＫＩ ４４．５ｍｇ；ＭｎＳＯ_４°Ｈ_２Ｏ １．５ｇ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４°２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ；Ｈ_３ＢＯ_３ １０ｍｇ；ＦｅＳＯ_４°７Ｈ_２Ｏ ３２．５ｇ；ＺｎＣｌ_２ １０ｇ；５００ｍＬまでの蒸留水）を補充する。

【0022】

微生物の増殖および異種タンパク質の発現は、３ステッププロセスを介して得られる。約２４時間の最初の回分増殖期(炭素源としてグリセロール)の後に、約４時間の流加回分(fed-batch)期（制限炭素源(limiting C-source)としてグリセロール）が続く。これらの最初の２つの期の間、ＮＨ_４ＯＨ ２０％を添加することによりｐＨを５．０で維持する。一旦全てのグリセロールが消費されると、メタノールの供給を開始してｅα’タンパク質発現を誘発し、ＮＨ_４ＯＨ ２０％を添加することによりｐＨを６．０にシフトする。メタノール流加回分期は約２４時間にわたる。これらの２つの流加回分期の間、通気速度(ｖｖｍ)は手動で徐々に増大させながら撹拌機速度(ｒｐｍ)は電気的に微調節することにより、溶存酸素(ＤＯ％)を３０％で一定に維持する(in maintained stable)。数時間毎に、ＤＯ％レベル(その値はメタノール供給の突然の停止後に急増を示すはずであり、逆に、その再開後に急速な減少を示すはずである)を追跡することにより炭素源制限条件をチェックする。数時間毎に、以下の分析のために無菌条件において発酵槽から試料を採取する。光学濃度(λ６００ｎｍ)、細胞バイオマス％(湿量)、無菌性、顕微鏡観察、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。

【0023】

ｅα’の精製：発酵ブロスの下流処理。約９．２Ｌの培養物を発酵槽から溢流させ、氷で冷却する。その後の操作は全て＋４℃で実施する。３０００ｘｇで３０ｍｉｎの遠心分離(Ｃｅｎｔｒｉｋｏｎ Ｔ−１２４、Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)により培養物全体を分離し、バイオマス(ペレット)を廃棄し、約７．５Ｌの上清をＺｅｔａｐｌｕｓ ３０ＳＰ(Ｃｕｎｏ)での深層濾過(depth filtration)により清澄化し、引き続いて０．２２μｍフィルター(Ｍｉｌｌｉｐａｋ １００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)で精密濾過する。ポリエーテルスルホン膜、ＭＷＣＯ １０ｋＤａ(Ｏｍｅｇａフィルター、Ｐａｌｌ)での限外濾過を介して透明な濾液を濃縮する。約３００ｍＬの濃縮物を、３．０ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ７．２に対してダイアフィルトレーションし、最終的に凍結乾燥する。この手順により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでかなり低い夾雑タンパク質の程度を示し、約２５％ｐ／ｐの総タンパク質含量(Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ、較正標準としてウシ血清アルブミン)を有する３４．５ｇの凍結乾燥粉末を得た。

【0024】

ｅα’の精製：クロマトグラフィーによる精製
より高性能のゲル電気泳動のために、供給業者の手順に従ってＮｕＰＡＧＥ(登録商標)プレキャストゲルシステム(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を使用した。２グラムの凍結乾燥粉末を１５０ｍＬ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５０に溶解し、同じ緩衝液を用いて平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム(６×１０ｃｍ、Ｗｈａｔｍａｎ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、ＵＫ)に装填した。それぞれ１５０および２５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液を用いて、保持されたタンパク質の溶出を実施した。０．２５Ｍ ＮａＣｌ(３００ｍＬ)を用いて溶出した画分が、最も多いｅα’の含量を示した。凍結乾燥により該溶液を１００ｍＬまで濃縮し、次いで、６０００〜８０００Ｄａの膜を用いてｍｉｌｌｉＱ限外濾過水により４℃で２４時間透析し、次いで、凍結乾燥した。約３７０ｍｇのタンパク質を得た。

【0025】

タンパク質の均一性を確認するために、約１ｍｇのタンパク質をＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ４(４．６×２５０ｍｍ)逆相カラムに装填した。緩衝液Ａ(限外濾過水およびトリフルオロ酢酸０．１％)および緩衝液Ｂ(アセトニトリル１００％＋トリフルオロ酢酸０．１％)を使用した。

【0026】

電気泳動技術。参考文献１１に従って、ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ細胞(Ｂｉｏ−Ｒａｄ)を使用して、１２％ポリアクリルアミドゲルで還元条件(２％β−メルカプトエタノール)下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。クーマシーブルーを用いて該ゲルを染色した。

【0027】

細胞培養物。株化ヒト肝細胞癌細胞系(ＨｅｐＧ２)を米国培養細胞系統保存機関(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ)(Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ)から得た。Ｅａｇｌｅの最小必須培地(ＭＥＭ)、ウシ胎仔血清、トリプシン−ＥＤＴＡ(１倍)、ペニシリン(１０^５Ｕ／Ｌ)、ストレプトマイシン(１００ｇ／Ｌ)、トリシン緩衝液(１ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４)および非必須アミノ酸溶液(１００倍)は、ＧＩＢＣＯ(Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ)から得た。ペトリ皿は、ＣＯＳＴＡＲ(Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ)から得た。フィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ(Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ)から得た。タンパク質クーマシープラスタンパク質アッセイキット(Protein Coomassie Plus Protein Assay kit)はＰｉｅｒｃｅ(Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ)から購入した。１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ中の無担体の^１２５ヨウ素はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ)から得た。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム(ＰＤ１０)はＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ(Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ)から得た。ＬＤＨおよびＭＴＴキットは、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ(Ｍｉｌａｎｏ−Ｉｔａｌｙ)から得た。全ての他の化学物質は、Ｍｅｒｃｋ(Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ)からの分析用のものであった。直径９０ｍｍのペトリ皿において単層で細胞を増殖させ、９５％空気、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中で、１０％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)、非必須アミノ酸溶液(１％、ｖ／ｖ)、ペニシリン(１０^５Ｕ／Ｌ)、ストレプトマイシン(０．１ｇ／Ｌ)、トリシン緩衝液(２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４)、ＮａＨＣＯ_３(２４ｍｍｏｌ／Ｌ)およびピルビン酸ナトリウム(０．１１ｇ／Ｌ)を補充したＭＥＭにおいて３７℃で維持した。ＬＤＬ受容体の調節を評価するように設計した実験のために、３５ｍｍのプラスチック皿に細胞を播種し(３〜５×１０^５細胞)、コンフルエンスに達する直前に使用した。全ての細胞培養実験において、２〜３日毎に培地を交換した。細胞生存度を評価するために、基本的に参考文献９に記載されているように、メチルテトラゾリウム塩(ＭＴＴ)アッセイにより、様々な濃度のｅα’に曝された細胞由来の培養基を試験した。動態(ＬＤＨ／ＬＤ)診断キット(Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ)を使用して乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)活性を測定することにより細胞酵素の漏出を判定した。連続調製用超遠心分離(sequential preparative ultracentrifugation)[１２]により、臨床的に健康な正常リポタンパク質のボランティアの血漿からＬＤＬ(１．０１９≦ｄ≦１．０６３ｇ／Ｌ)を単離した。Ｂｉｌｈｅｉｍｅｒらにより改善され[１３]、以前に記載した[３]ＭｃＦａｒｌａｎｅの方法に従ってリポタンパク質を標識した。濾過(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター、孔径０．４５μｍ)により^１２５Ｉ−ＬＤＬを滅菌し、使用するまで４℃で貯蔵した。以前に記載した[９]ようにヒトリポタンパク質欠乏血清(ＬＰＤＳ)を調製した。

【0028】

^１２５Ｉ−ＬＤＬの取込みおよび分解。５ｇ／１００ｇ ＬＰＤＳを補充したＭＥＭにおいて細胞の単層を３７℃で２４ｈ前培養して、表に列挙した様々な濃度のｅα’または３．５μｍｏｌ／Ｌのα’精製サブユニットまたは１．０μｍｏｌ／Ｌのシンバスタチンの存在／不存在下でＬＤＬ受容体をアップレギュレーションした[２]。次いで、一定の濃度(７．５ｍｇ／Ｌ)の^１２５Ｉ−ＬＤＬを該培地に添加し、培養を３７℃でさらに５ｈ継続した。以前に報告された[２]ように^１２５Ｉ−ＬＤＬの特異的な取込み(結合＋内部移行)および分解を評価した。

【0029】

統計的分析。様々な濃度のｅα’を用いた細胞培養後のＬＤＬにおける細胞の取込みおよび分解の差異を、ＡＮＯＶＡおよびその後のＤｕｎｎｅｔｔの検定により求めた。各値は平均値±ＳＤとして表し、Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であると見なした。

【0030】

結果
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるｅα’の発現。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を形質転換するのに使用したプラスミドの構造を図１に示している。挿入物の配列およびα’サブユニットを有するそのアラインメントを図２に示している。材料および方法の項において述べたように、組換えポリペプチドと野生型のポリペプチドの間の唯一の差異はＮ末端第１アミノ酸残基にあり、それは、技術的な理由から、組換え鎖においてはアラニンであった。培養基のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により判断したところ、最大の組換えポリペプチドの生産を示している(図示せず)クローンを大量生産のために選択した。図３−Ａは、メタノールによる誘導の前(レーンｎ.１)および１〜８〜１９および２５時間後(レーンｎ.２、ｎ.３、ｎ.４、ｎ.５)の酵母培養物の上清の電気泳動分析を示している。図３−Ａが示しているように、約２０ｋＤａの明らかな分子量での明白なバンドが誘導の結果として生じている。

【0031】

ｅα’の精製。クロマトグラフィー法によりｅα’の精製を達成した。各ステップから試料を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。同定したポリペプチドの均一性に対する精製ステップの効果を図３−Ｂに示している。培養基において酵母タンパク質による非常に低い程度の混入が既に達成されていたが、さらなるクロマトグラフィーによるステップにより主要な夾雑タンパク質を除去し、ほとんど均一な形態の組換えポリペプチドの回収を可能にした。このバンドのＮ末端配列分析により、この２０ｋＤａポリペプチドがｅα’鎖に対応することが確認された。この試料の純度が細胞アッセイに適していると判断した。

【0032】

ｅα’の生物活性。正の対照としての精製α’サブユニット、およびその切断α’形態のＨｅｐＧ２細胞への添加により、以下の表において報告しているように、未処理の細胞と比較してＬＤＬ受容体媒介性の取込みおよび分解の有意な上昇がもたらされた。

【0033】

【表1】

【0034】

この結果は、ＬＤＬ調節がｅα’に用量依存的であり、最高濃度が正の対照、シンバスタチンの濃度と同様であったことを示していた。ＭＴＴおよびＬＤＨアッセイにより測定したところ、いずれのｅα’の濃度でも細胞毒性の証拠は見られなかった（図示せず）。

【0035】

したがって、本発明において、生物学的応答を誘導することができるアミノ酸配列がα’鎖のＮ末端伸長ドメインに存在することが分かった。さらに、本発明者らは、Ｎ末端親水性フラグメントが、強力な抗高脂血症薬であるシンバスタチンと同程度の濃度でその効果を発揮することを見出した。この効果は、少なくとも部分的に、本発明者らにより報告されている[３]ような、上記のフラグメントとチオレドキシン(保存活性部位配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓに酸化還元活性なジスルフィド−ジチオールを有する小さい多機能性タンパク質)の間のｉｎ ｖｉｔｒｏ相互作用に起因し得る。この発見により、ダイズタンパク質を含有するコレステロールが豊富な食事を給餌したウサギにおいて観察された酸化第二銅により誘発されたＬＤＬ酸化の遅滞期が、同じ食事だがカゼインをタンパク質源として含有する食事を給餌したウサギにおいて見られたもの[２２]より長い理由を説明し得る。

【0036】

得られたデータは、ダイズ７Ｓグロブリンα’鎖のＮ末端親水性フラグメントが、シンバスタチンについて報告されているのと同様に１０μＭ未満の濃度でのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて活性であることを初めて示しているため、特に興味深い。さらに、組換えタンパク質の使用により、明確な利益の欠如および潜在的な毒性が報告されてきた[２３]イソフラボンを含めた他のタンパク質および非タンパク質のダイズ成分の関与が一切排除される。

【0037】

本発明は、脂質低下療法において単独でまたは薬物、すなわち、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチンなどのスタチンと組み合わせて使用される、高脂血症および心血管疾患を含めた様々な疾患に対する有益な効果を有する機能性食品および組成物を提供する。

【0038】

本発明の組成物は、従来の賦形剤および方法を使用して調製する。本発明の組換えポリペプチドの投薬量は、患者の体重、年齢および性別などの複数の因子に依存し、該ポリペプチドの薬理学、薬物動態学および毒物学的特性に基づいて実務者により容易に決定される。しかし、一般に、前記投薬量は、約５０〜約５００ｍｇ、１日１〜３回の範囲である。

【0039】

参考文献

【0040】

【表2】

【図2】

【図2A】

【図2B】

【図1】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]