特許 5779750 血管新生療法用医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5779750

(24)【登録日】2015年7月24日

(45)【発行日】2015年9月16日

(54)【発明の名称】血管新生療法用医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20150827BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20150827BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20150827BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20150827BHJP

   A61K 31/5585 20060101ALI20150827BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20150827BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20150827BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150827BHJP

【ＦＩ】

   A61K48/00

   A61K35/76

   A61K37/24

   A61K37/48

   A61K31/5585

   A61P9/00

   A61P9/10

   A61P43/00 111

   A61P43/00 121

【請求項の数】4

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2011-528658(P2011-528658)

(86)(22)【出願日】2010年8月30日

(86)【国際出願番号】JP2010005321

(87)【国際公開番号】WO2011024480

(87)【国際公開日】20110303

【審査請求日】2013年4月11日

(31)【優先権主張番号】特願2009-200900(P2009-200900)

(32)【優先日】2009年8月31日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】502100149

【氏名又は名称】福田 恵一

(73)【特許権者】

【識別番号】595110128

【氏名又は名称】田邉 忠

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(74)【代理人】

【識別番号】100163038

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 武志

(72)【発明者】

【氏名】福田 恵一

(72)【発明者】

【氏名】川上 崇史

(72)【発明者】

【氏名】田邉 忠

【審査官】 鳥居 福代

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００２／０００２５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 KAWAKAMI, T et al，Adeno-associated Virus-mediated Prostaglandin I2 Synthase (PGIS) Gene Transfer Improves a Limb Ischemia，Circ J，２００９年 ３月 １日，Vol.73, No.Supplement 1，p.592-593

【文献】 HIRAOKA,K. et al，Enhanced therapeutic angiogenesis by cotransfection of prostacyclin synthase gene or optimization of intramuscular injection of naked plasmid DNA，Circulation，２００３年，Vol.108, No.21，p.2689-96

【文献】 KAWAKAMI,T. et al，AAV-PGIS gene transfer improves hypoxia-induced pulmonary hypertension in mice，Biochemical and biophysical research communications，２００７年，Vol.363, No.3，p.656-61

【文献】 YAN,H. et al，Superior neovascularization and muscle regeneration in ischemic skeletal muscles following VEGF gene transfer by rAAV1 pseudotyped vectors，Biochem Biophys Res Commun，２００５年，Vol.336, No.1，p.287-98

【文献】 HAUCK,B. et al，Characterization of tissue tropism determinants of adeno-associated virus type 1，J Virol，２００３年，Vol.77, No.4，p.2768-74

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｋ ３８／２２

Ａ６１Ｋ ３８／４３

Ａ６１Ｋ ３１／５５８５

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生させる作用を有する物質であるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）を合成するｈＰＧＩＳをコードするｈＰＧＩＳ遺伝子と、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子とを導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を有効成分として含有し、
上記ｈＰＧＩＳ遺伝子よりコードされたｈＰＧＩＳより合成されるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生させ、上記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子により血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を誘導し、
上記ｈＰＧＩＳより合成される上記プロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）により産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と、上記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子により誘導されて産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）との併用により末梢動脈の血管新生作用を増強する末梢動脈疾患の治療又は予防に用いられることを特徴とする血管新生療法用医薬組成物。

【請求項2】

少なくとも血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生させる作用を有する物質であるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）を合成するｈＰＧＩＳをコードするｈＰＧＩＳ遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、
を有効成分として含有し、
上記ｈＰＧＩＳ遺伝子よりコードされたｈＰＧＩＳより合成されるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）により血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生させ、上記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子により血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を誘導し、
上記ｈＰＧＩＳより合成される上記プロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）により産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と、上記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子により誘導されて産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）との併用により末梢動脈の血管新生作用を増強する末梢動脈疾患の治療又は予防に用いられることを特徴とする血管新生療法用医薬組成物。

【請求項3】

上記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、タイプ(type)１又はタイプ(type)２であることを特徴とする請求項１又は２記載の血管新生療法用医薬組成物。

【請求項4】

上記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む医薬的に許容される担体を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の血管新生療法用医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血管新生療法に用いて有用な医薬組成物、血管新生作用を増強する増強剤に関する。

【背景技術】

【0002】

西欧化したライフスタイルと高齢化社会を背景に、経年的に、末梢動脈疾患(peripheral arterial disease; ＰＡＤ)の患者の増加が著しい。このＰＡＤは、動脈硬化をベースとした疾患であり、年齢、喫煙、糖尿病、高血圧、脂質代謝異常等が危険因子となる。そして、アメリカ心臓協会の報告によると、ＰＡＤを検出する非侵襲的検査の普及により、ＰＡＤの有病率は５０歳までは約２〜３％、７５歳以上では約２０％との報告がある。また、ＰＡＤの患者の約４０％は、無症状であるといわれている。

【0003】

現在、このＰＡＤの治療法として、抗血小板剤(anti-platelets)、血管拡張剤(vasodiator)、プロスタノイド(prostanoid)を中心とした薬物療法、血管内ステント治療、外科的バイパス術がある。しかし、薬物療法の効果は限定的であり、血管内ステント治療や外科的バイパス術は、重症例に対する第一選択治療であるが、治療適応外のケースも多い。このような従来の治療法に抵抗性を有するＰＡＤとして、重症下肢虚血(critical limb ischemia; ＣＬＩ)がある。ＣＬＩは、慢性虚血性安静時疼痛や虚血性皮膚病変 (潰瘍、壊疽)を伴う状態と定義される。ＣＬＩの予後は悲観的であり、発症１年後に約２５％が下肢を失い、約２５％が死亡するといわれている。

【0004】

近年、臨床研究で、ＰＡＤに対する血管新生療法として、細胞療法(cell therapy)や遺伝子治療(gene therapy)が多く試みられている。細胞療法には、骨髄単核球や末梢血単核球が用いられている。遺伝子治療には、組換え血管新生因子が用いられる。遺伝子治療に用いられる組換え血管新生因子としては、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）が用いられている。これらの血管新生因子は、血管増殖因子を虚血組織に発現させることにより、血管新生を増加させる。そして、この種の血管新生因子を用いることにより、心筋及び下肢虚血症の動物モデルにおける側副血行路の発達を促進及び／又は増進させ得ることが確認されている(Circulation 90，II−228−II−234(1994)。

【0005】

上述したような血管新生因子を用いて血管障害を治療する治療法を「血管新生療法」と称している。特に最近では、上述の如き血管新生因子の遺伝子を用いて、虚血性疾患や動脈疾患に対する血管新生療法の検討が積極的に進められている。

【0006】

そして、血管新生療法に用いられる医薬組成物として、国際公開第２００２／０００２５８号公報（特許文献１）に記載されたものがある。特許文献１に記載される医薬組成物は、ＨＧＦ遺伝子又はＶＥＧＦ遺伝子とプロスタサイクリン合成酵素遺伝子とを有効成分として含有する血管新生療法用医薬組成物である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００２／０００２５８号

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ところで、上述したような血管新生因子を用いた治療法は、ＰＡＤの全症例で有効ではなく、長期的な有効性や有害事象についても不明である。特に、増殖因子を用いた遺伝子治療については、腫瘍発生及び増大のリスクが否定できない。したがって、上述したような問題点を解決できる新規な治療法の開発が要望されている。

【0009】

ＰＡＤの病態では、血管内皮が障害されており、血管拡張因子 (vasodilator) である酸化窒素(nitric oxide)、プロスタグランジン(prostaglandin)、内皮細胞依存性過分極因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor；ＥＤＨＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等が減少し、血管収縮因子 (vasoconstrictor) であるアンギオテンシン(angiotensin)−２、エンドセリン(endothelin)−１等が増加していることがわかっている。これらの血管因子は、ＰＡＤの治療に有用である可能性が高い。実際、プロスタノイド(Prostanoid)は、ＰＡＤや肺高血圧症(Pulmonary arterial hypertension) に対して臨床使用されている。

【0010】

そこで、本願発明者等は、これらの中で、血小板凝集阻害、血管拡張、血管新生作用を有するプロスタグランジン(Prostaglandin)Ｉ２の合成酵素であるプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）に注目した。

【0011】

ＰＧＩＳは、実験的に肺高血圧症や頚動脈内皮傷害モデルで高い有効性が報告されている治療薬を生合成する遺伝子で、代謝産物であるＰＧＩ２は血小板凝集阻害、血管拡張作用、血管新生作用を誘導する作用を有している。遺伝子治療は、病変局所に長期間の遺伝子発現を起こすため、産生物質(products)による有害事象の発生が常に問題になる。臨床研究で用いられた増殖因子では腫瘍発生、進展等のリスクがあるが、これまでにＰＧＩ２治療薬による臨床例において腫瘍発生などの報告はなく、ＰＧＩ２は血管拡張及び血管保護因子であるため、安全性は明らかに高い。同様に、安全に有効な遺伝子発現が比較的長期に得られるベクターとして、アデノ随伴ウイルス (adeno-associated virus；ＡＡＶ）ベクターが最も適していると判断した。

【0012】

上述の重症下肢虚血の臨床研究にはプラスミドやアデノウイルス等が使用されているが、プラスミドでは強力かつ長期間の遺伝子発現を得ることは難しく、頻回の投与を必要とする。また、アデノウイルスは、強力な遺伝子発現が得られるが、効果は短期的で病原性が強く、安全面で懸念が残るベクターである。従来、ウイルスベクターは高い遺伝子導入効率を有するが、ヒトに対する病原性など、ヒトへの使用に際して議論されることが多い。しかし、ＡＡＶベクター、は筋細胞・神経細胞等の非分裂細胞に高い効率で長期間の遺伝子発現が達成でき、ヒトに対して非病原性であることから、注目されているベクターである。

【0013】

そこで、本願発明者等は、ＡＡＶをベクターとして用いて、プロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）を合成するヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子（ＰＧＩＳ遺伝子）をマウスの骨格筋に遺伝子導入することによって、肺高血圧症マウスが改善した例を確認した。この実験の際、遺伝子導入を行ったマウスの局所骨格筋内に強力なＰＧＩＳ遺伝子の発現が確認された。この実験から、ＰＧＩＳ遺伝子の導入は、下肢虚血治療において十分に期待できるとの知見を得た。

【0014】

また、一般的に遺伝子治療には、治療遺伝子の選択だけではなく、遺伝子導入に際して使用するベクターが、遺伝子導入効率、つまり、治療効果に大きく影響する。

【0015】

遺伝子治療で用いるベクターは、可能な限り、病変部での治療遺伝子の発現が高く、長期間持続することが望まれる。しかし、過去の遺伝子治療研究には、プラスミド （plasmid）や非ウイルス性ベクター（non viral vector）が多く使用されており、強力でしかも長期間に亘って治療遺伝子の発現を得るのが難しい。

【0016】

ところで、ウイルス性ベクターであるであるアデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus；ＡＡＶ）であれば、骨格筋細胞に強い親和性(tropism) を持つため、強力で長期間の治療遺伝子発現を達成することができる。このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ)は、ヒトの血友病 (hemophilia)、嚢胞性線維症(cystic fibrosis)、パーキンソン病(Parkinson disease) の遺伝子治療にも使用され、高い安全性と有効性が証明されている。骨格筋に対して強力でしかも長期間の遺伝子発現効率を達成できるアデノ随伴ウイルスを用いることにより、治療遺伝子の長期発現が得られ、ヒトへの臨床応用の可能性が期待できる。

【0017】

本願の発明者等は、上述したような知見に基づいて、本発明を完成するに至ったものである。

【課題を解決するための手段】

【0018】

本発明に先行する血管新生療法用医薬組成物は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生させる作用を有する物質であるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）を合成するヒトプロスタサイクリン合成酵素（ｈＰＧＩＳ）をコードするｈＰＧＩＳ遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を有効成分として含有し、上記ＡＡＶに導入されたｈＰＧＩＳ遺伝子よりコードされたｈＰＧＩＳより合成されたプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）により血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生し、この血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により末梢動脈の血管新生作用を増強する末梢動脈疾患の治療又は予防に用いられる血管新生療法用医薬組成物である。

【0019】

本発明は、少なくとも血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生させる作用を有する物質であるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）を合成するｈＰＧＩＳをコードするｈＰＧＩＳ遺伝子と、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子とを導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を有効成分として含有し、上記ｈＰＧＩＳ遺伝子よりコードされたｈＰＧＩＳより合成されるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生させ、上記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子により血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を誘導し、上記ｈＰＧＩＳより合成される上記プロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）により産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と、上記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子により誘導されて産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）との併用により末梢動脈の血管新生作用を増強する末梢動脈疾患の治療又は予防に用いられることを特徴とする血管新生療法用医薬組成物である。

【0020】

また、本発明は、少なくとも血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生させる作用を有する物質であるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）を合成するｈＰＧＩＳをコードするｈＰＧＩＳ遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、を有効成分として含有し、上記ｈＰＧＩＳ遺伝子よりコードされたｈＰＧＩＳより合成されるプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）により血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を産生させ、上記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子により血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を誘導し、上記ｈＰＧＩＳより合成される上記プロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）により産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と、上記血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子により誘導されて産生される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）との併用により末梢動脈の血管新生作用を増強する末梢動脈疾患の治療又は予防に用いられる血管新生療法用医薬組成物である。

【0021】

ここで、アデノ随伴ウイルスとして、タイプ(type)１又はタイプ(type)２を用いることが有効である。

【0022】

本発明に係る血管新生療法用医薬組成物は、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子、又はヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子と血管新生因子をコードする遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルスを含む医薬的に許容される担体を有する。

【0023】

本発明に係る血管新生療法用医薬組成物に用いられる血管新生因子をコードする遺伝子は、新たな血管の形成を誘導し得るタンパク質、ポリペプチド、これらの一部分をコードする遺伝子のいずれかが用いられる。

【0024】

特に、血管新生因子をコードする遺伝子としては、血管内皮増殖因子遺伝子が望ましい。

【0025】

本発明は、上述したように、末梢動脈疾患の治療又は予防に用いられて有用な血管新生療法用医薬組成物であって、血管拡張作用及び／又は血小板凝集抑制作用を有する物質であるプロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）を生じさせるヒトプロスタサイクリン合成酵素（ｈＰＧＩＳ）遺伝子を含有し、さらには血管新生因子をコードする遺伝子を含有したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を有する血管新生療法用医薬組成物を提供するものである。

【0026】

ここで血管新生療法において用いられる、アデノ随伴ウイル（ＡＡＶ）に含有される「血管新生因子をコードする遺伝子」とは、ｈＰＧＩＳ遺伝子と同様の血小板凝集阻害、血管拡張作用、血管新生作用のいずれかを誘導する作用を有し、新たな血管の形成を誘導し得るタンパク質、ポリペプチド、あるいはこれらの一部分をコードする遺伝子を含む。具体的には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−２、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インシュリン様増殖因子、アンジオポエチン−１などをコードする遺伝子が挙げられる。また、ＶＥＧＦ等の遺伝子の発現を制御するＨＩＦ−１、あるいはｅｔｓ−１を含むｅｔｓファミリー等の転写因子をコードする遺伝子も挙げられる。好ましくはＶＥＧＦ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、公共のデータベースにその遺伝子配列が登録されており、当業者であれば、これらを利用することにより上記の遺伝子を容易にクローニングすることができる。

【0027】

以下、ＶＥＧＦ遺伝子を例に挙げて説明する。本発明において「ＶＥＧＦ遺伝子」とは、ＶＥＧＦタンパクをコードする遺伝子を指す。また、このＶＥＧＦ遺伝子を発現可能なように発現プラスミドに組み込んだものを、単に「ＶＥＧＦ遺伝子」と称する場合もある。具体的には、ＶＥＧＦのｃＤＮＡを、発現ベクターとして後述するウイルスベクターに組み込んだものが例示される。ＶＥＧＦ遺伝子は、ヒトにおいては転写に際しての選択的スプライシングにより、４種類のサブタイプ（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６）の存在が報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３（１９８３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．， ８４，１４７０（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．， １６１，８５１（１９８９））。本発明においては、これらのいずれのＶＥＧＦ遺伝子をも使用することが可能であるが、生物学的に最も活性が強いという観点から、ＶＥＧＦ１６５遺伝子がより好ましい。さらに、これらＶＥＧＦの遺伝子に対して改変等を施した遺伝子であっても、血管新生作用を有するタンパクをコードする遺伝子である限り、本発明のＶＥＧＦ遺伝子の範疇に含まれる。

【0028】

このＶＥＧＦ遺伝子は、文献（例えばＳｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０６（１９８９））記載の配列及びデータベースに登録されている配列情報に基づき、当業者ならば容易にクローニングすることができ、またその改変等も容易に行うことができる。

【0029】

以上のようなＶＥＧＦ遺伝子、あるいはこれらの改変体をコードする遺伝子が血管新生作用を有することは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては国際公開第９７／０７８２４号公報に記載の血管内皮細胞に対する増殖効果を調べることができる。

【0030】

以上のような血管新生因子をコードする遺伝子は、本発明の血管新生療法において単独で用いてもよいし、又は複数を組み合わせて用いてもよい。

【0031】

ここで、ｈＰＧＩＳにより合成されるＰＧＩ２は、上述したように血管拡張作用や血管透過性亢進作用、血小板凝集抑制作用を有するものである。そして、このＰＧＩ２と血管新生因子をコードする遺伝子を併用することにより、一層顕著な併用効果が得られる。

【0032】

ところで、本発明においては、「血管拡張作用を有する物質」として、ＰＧＩ２が用いられ、より好ましくはＰＧＩ２誘導体が用いられる。また「血小板凝集抑制作用を有する物質」としても、ＰＧＩ２が用いられ、より好ましくはＰＧＩ２誘導体が用いられる。

【0033】

本発明において「血管拡張作用及び／又は血小板凝集抑制作用を有する物質を生じさせる物質」とは、血管拡張作用及び／又は血小板凝集抑制作用を有するＰＧＩ２を合成、産生若しくは誘導する物質を意味する。具体的には、プロスタグランジンを上昇させる物質を合成、産生若しくは誘導する物質を指す。当該物質は遺伝子、タンパク質、低分子化合物等の如何なる物質であってもよいが、ＰＧＩ２を合成する合成酵素する物質としては、ＰＧＩＳ遺伝子が用いられる。ＰＧＩＳ遺伝子は、公共のデータベースにその遺伝子配列が登録されており、当業者であればこれらを利用することにより、容易にクローニングすることができる。

【0034】

以下、ｈＰＧＩＳ遺伝子を例にとり説明する。本発明において「ＰＧＩＳ遺伝子」とは、ＰＧＩＳタンパクをコードする遺伝子を指す。なお、ＰＧＩＳ遺伝子を発現可能なように発現プラスミドに組み込んだものを、単に「ＰＧＩＳ遺伝子」と称する場合もある。具体的には、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ，Ｖｏｌ．２００，Ｎｏ．３，ｐ１７２８−１７３４（１９９４）及び国際公開第９５／３００１３号公報に記載のＰＧＩＳのｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだものが例示される。さらに、前記のＶＥＧＦ遺伝子の場合と同様に、これらＰＧＩＳの遺伝子に対して改変等を施した遺伝子であっても、ＰＧＩＳとしての作用を有するタンパクをコードする遺伝子である限り、本発明のＰＧＩＳ遺伝子の範疇に含まれる。

【0035】

当該ＰＧＩＳ遺伝子もＶＥＧＦ遺伝子と同様に、前記文献記載の配列及びデータベースに登録されている配列情報に基づき、当業者ならば容易にクローニングすることができ、またその改変等も容易に行うことができる。当該遺伝子によりコードされるタンパク質が所望のＰＧＩＳ活性を有することは、例えば、６−ｋｅｔｏ Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ１ α ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ社製、カタログ番号＃５１５２１１）を用いたエンザイムイムノアッセイ、又はプロスタサイクリン合成酵素の代謝産物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により検出する方法などにより、測定することができる。

【0036】

以上のような血管拡張作用及び／又は血小板凝集抑制作用を有する物質であるＰＧＩ２、あるいはＰＧＩ２を生じさせる物質は、血管新生因子の遺伝子を用いた血管新生療法において、単独で用いてもよいし、又は複数を組み合わせて用いてもよい。

【0037】

以下、本発明に係る血管新生療法用医薬組成物の導入方法、導入形態及び導入量等について記述する。

【0038】

１）血管拡張作用及び／又は血小板凝集抑制作用を有するＰＧＩ２、及び当該物質を生じさせるＰＧＩＳ遺伝子と、血管新生因子をコードする遺伝子とを用いる場合血管新生因子をコードする遺伝子と、前述のＰＧＩＳ遺伝子を併用する場合、すなわち２種類以上の遺伝子を併用する場合は、共に遺伝子治療剤の形態をとる必要がある。具体的には、ＶＥＧＦ遺伝子とＰＧＩＳ遺伝子の組み合わせが挙げられる。

【0039】

当該遺伝子治療剤を患者に投与する場合、その投与形態としては、ウイルスベクターを用いる例が挙げられ、実験手引書などにその調製法、投与法が詳しく解説されている（別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。以下、具体的に説明する。

【0040】

ところで、本発明においては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に目的とする遺伝子を導入し、この遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベクターとして標的細胞に組換えウイルスを感染させることにより、標的細胞内に遺伝子を導入することが可能である。ここでアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）としては、タイプ(typpe)１、２、５、８のいずれかを用いることができ、望ましくは、タイプ(type)１又はタイプ(type)２が用いられる。

【0041】

本発明において、目的の病変部位等の遺伝子導入部位への遺伝子の導入をするためアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いている。これは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、筋細胞、神経細胞、肝細胞などの非分裂細胞に効率よく遺伝子導入することができるためであり、そのような細胞を標的細胞とする場合には、遺伝子発現を長時間持続させることが可能であるためである。

【0042】

そして、本発明の遺伝子治療剤は、血管新生療法用医薬組成物を構成するものであり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の中でも、筋細胞、神経細胞、肝細胞などの非分裂細胞に効率よく遺伝子導入することができるタイプ(type)１又はタイプ(type)２を用いることが望ましい。

【0043】

そして、本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８，１９９４、実験医学増刊，１２（１５），１９９４、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック，エヌ・ティー・エス，１９９９）。本発明では、ｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましい。ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与することができる。

【0044】

製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態、例えば、液剤等を採り得る。例えば、有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。

【0045】

また、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。

【0046】

なお、製剤中の遺伝子の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、各々の遺伝子として０．０００１−１００ｍｇ、好ましくは０．００１−１０ｍｇであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。

【0047】

２）血管拡張作用及び／又は血小板凝集抑制作用を有するＰＧＩ２、及び当該物質を生じさせるＰＧＩＳ遺伝子と、血管新生因子をコードする遺伝子とを用いる場合

【0048】

血管新生因子をコードする遺伝子と、低分子化合物やタンパク質、ペプチド等とを併用する場合、血管新生因子をコードする遺伝子については前述の遺伝子治療剤の形態とする。一方の低分子化合物等は、一般的な医薬組成物の形態とし、経口または非経口的に投与される。代表的な組み合わせとしては、ＶＥＧＦ遺伝子とＰＧＩ２誘導体の組み合わせなどが挙げられる。

【0049】

以下、前記低分子化合物やタンパク質等を有効成分とする医薬組成物につき説明する。

【0050】

前記低分子化合物やタンパク質のうち、既に血管拡張剤や血小板凝集抑制剤（抗血小板剤）として市販されているものであれば、その能書に従い投与方法や投与量等を設定することができるが、一般的には以下のような投与形態、投与方法が挙げられる。

【0051】

すなわち、経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。非経口的に投与する場合には、局所投与剤（経皮剤等）、直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与することができる。

【0052】

経口剤又は直腸投与剤としては、例えばカプセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、座剤、液剤等が挙げられる。注射剤としては、例えば無菌の溶液又は懸濁液、乳剤等が挙げられ、具体的には水、水−プロピレングリコール溶液、緩衝化液、０．４％の生理食塩水等が挙げられる。局所投与剤としては、例えばクリーム、軟膏、ローション、経皮剤等が挙げられる。

【0053】

以上の剤形は通常当分野で行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤と共に製剤化される。薬学的に許容される賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、ｐＨ調節剤、張度調節剤、浸潤剤等が挙げられる。また、薬学的に許容される担体としては、例えば炭酸マグネシウム、ラクトース、ペクチン、澱粉、メチルセルロース等が挙げられる。

【0054】

このような医薬組成物は、治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接局所投与することができる。また経口投与や坐薬としての投与も可能である。投与量、投与回数は症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、通常は成人に対し１日あたり約０．０００１〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約０．００１〜約１００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。

【0055】

以上のような低分子化合物やタンパク質を有効成分とする医薬組成物は、血管新生因子をコードする遺伝子を含有する遺伝子治療剤と同時に投与することもできれば、時間的間隔をおいて別々に投与することも可能である。

【発明の効果】

【0056】

以上、本発明の血管新生療法用医薬組成物につき述べたが、当該医薬組成物は、血管新生療法が必要とされる末梢動脈疾患の治療又は予防に有効に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】図１は、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の虚血肢の灌流状態をレーザー・ドップラー血流測定法と光学的カメラにより撮影した画像を示す。

【0058】

【図2】図２は、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の虚血肢を発症していない非虚血肢（右脚）と比較した虚血肢（左脚）の血流量灌流速度を定量解析（ｎ＝１２）して示す図である。

【0059】

【図3】図３は、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の壊死の改善状況を比較して示す図である。

【0060】

【図4】図４は、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群において、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法とウエスタンブロット法による分析を用いたｈＰＧＩＳの発現状況を示す図であって、（Ａ）は外部から骨格筋にｈＰＧＩＳを投与してＰＧＩＳの発現状況を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（ｎ＝５）して示し、（Ｂ）はマウス体内の大腿筋肉にｈＰＧＩＳを投与してＰＧＩＳの発現状況を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（ｎ＝）して示す図であり、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）はマウスの大腿筋肉にＶＥＧＦ，ＦＬＫ−１，ＦＬＴをそれぞれ投与したときの発現状況を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（ｎ＝５）して示す図である。

【0061】

【図5】図５は、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群のウエスタンブロット法での分析結果を示す図である。

【0062】

【図6】図６は、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群のそれぞれにＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳベクターを投与したときの左大腿筋肉内のｈＰＧＩＳの発現状態を示す顕微鏡写真であって、Ａは免疫組織科学的染色法により染色した状態を示す顕微鏡写真であり、Ｂは各群の左大腿筋肉内のフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）を染色した状態の代表モデルを示す顕微鏡写真であり、ＣはｖＷＦに関する免疫蛍光染色をした左大腿筋肉内の微笑血管密度の定量分析して示す図である。

【発明を実施するための最良の形態】

【0063】

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

【0064】

プラスミドとアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターの構築

【0065】

ヒトＰＧＩＳ発現ベクターの構築法を簡単に述べると、全長ヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片の平滑化したものを、ｐＵＣ−ＣＡＧＧＳ発現プラスミドのＸｈｏＩで消化し平滑化された部位に連結する。このｐＵＣ／ＰＧＩＳ構築物が生物学的に活性なＰＧＩＳ蛋白質をコードしていることを確認するため、ｐＵＣ／ＰＧＩＳベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、[１４Ｃ]−ＰＧＨ２の６−ｋｅｔｏ−[１４Ｃ]−ＰＧＦ１αへの変換を測定した。挿入のないｐＵＣ−ＣＡＧＧＳベクターを対照ベクターとして用いた。次に、ヒトＰＧＩＳ遺伝子をＡＡＶ−ＣＡＧプラスミドに挿入し、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳベクターを構築した。また、対象実験のため高活性緑色蛍光蛋白質（enhancd green fluorescent protein；ＡＡＶ−ＥＧＦＰ）を調製した。

【0066】

マウス後肢虚血モデル

【0067】

週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス （日本ＣＬＥＡ製）又は雄Ｃ５７／ＢＬ６(８週齢)を用意し、このヌードマウスをヂエチルエーテル麻酔下に置き、左後肢の中心部にある大腿動脈まで皮膚を切開した。大腿動脈を徐々に分離し、動脈の近位部を７−０絹結紮糸で結紮した。用いた動物実験方法及び計画書は、慶應義塾大学医学部の動物愛護と使用に関する委員会により調査承認されており、それらは実験動物の愛護と使用に関するＮＩＨガイドラインに準拠している。

【0068】

実験

【0069】

用意したマウスを、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の３群に分けた。ここで、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群には、左大腿筋にプロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）を生じさせるｈＰＧＩＳ遺伝子をタイプ１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｔｙｐｅ１）に導入したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳ）ベクター（１．０×１０１１(v.g./body)）を投与した。対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群には、左大腿筋に媒介体（０．９％生理食塩水）を投与した。マイナス対照であるＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群には、左大腿筋にＡＡＶｔｙｐｅ１−ＥＧＦＰベクター（１．０×１０１１）を投与した。遺伝子導入１週間後、 マウスの左大腿動脈を結紮し後肢虚血を作成した。結紮２週間後後肢壊死の発生を評価した。マウスの血液灌流率を、レーザー・ドップラー灌流イメージング（ＬＤＰＩ）・システムで測定した。上記マウスの左大腿筋は、摘出され以後の分析に用いられた。

【0070】

そして、ヒトＰＧＩＳ ｍＲＮＡの発現の持続性を調べるため、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の各群当たり４又は５匹のＣ５７／ＢＬ６(８週齢)の左大腿筋へ、ＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳベクター（1.0×1011 (v.g./body)）を投与した。

【0071】

レーザー・ドップラー灌流解析

【0072】

上述のＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の３群の各マウスの後肢の左脚（Ｌ）を虚血させ、右脚（Ｒ）を正常とした上記マウスの後肢のレーザー・ドップラー灌流率を、レーザー・ドップラー灌流イメージング（ＬＤＰＩ）・システム（商品名：ムーアＬＤＰＩ、米国・ムーア・インスツルメンツ社製）で測定した。この測定は、各群のマウスの虚血肢の灌流状態をＬＤＰＩ・システムで撮影し行った。この結果を図１に示す。

【0073】

なお、図１には、各群のマウスの虚血肢の灌流状態を光学カメラで撮影した画像（Ｍａｃｒｏ）をＬＤＰＩ・システムで撮影した画像（ＬＤＰ）に対応して示す。

【0074】

図１において、レーザー・ドップラー血流測定法により撮影した画像は、カラー画像であり、このカラー画像に対応して灌流状態を示す指標がカラーにより示されているを示す。この指標は、左側から右側に向かって濃紺から赤色に着色が変化する。指標の左側の着色（濃紺）で示される区間は、低又は皆無灌流の区間であり、右側の着色（赤から白の部分）で示される区間は、最高の灌流区間を示す。

【0075】

また、図２において、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群における非虚血対照肢である右脚と比較した虚血肢である左脚の血液灌流速度の定量解析（ｎ＝１２）を行った結果を示す。

【0076】

図２において、データは、平均値 ± ＳＤ． ＊Ｐ＜．０５； ｎｓ， 有意差無を意味する。

【0077】

定量ＲＴ−ＰＣＲ

【0078】

ＲＮＡの抽出と定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した。定量ＲＴ−ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ指標物質(Applied Biosystems)として、ｈＰＧＩＳ（Ｈｓ００１６８７６６-ｍｌ），マウスＰＧＩＳ（Ｍｍ００４４７２７１-ｍｌ），マウスＶＥＧＦ（Ｍｍ０１２８１４４９_ｍｌ），ＦＬＫ−１（Ｍｍ０１２２２１９-ｍｌ），ＦＬＴ−１（Ｍｍ００４３８９７１-ｍｌ）)及び齧歯類ＧＡＰＤＨと比較して正規化し、ｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡと比較して正規化した。その結果を図４に示す。図４において、データは、平均値 ± ＳＤ． ＊Ｐ＜．０５； ｎｓ， 有意差無を意味する。

【0079】

ウエスタン・プロット解析

【0080】

骨格筋の膜分画は、氷冷した緩衝液中で大腿筋をホジナイズすることで調製した。免疫学的な検出は、ヒトを用いて膜画分抽出物について行った。その結果を図５に示す。

【0081】

組織学的解析

【0082】

試料は１０％ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋され、４μｍの切片に切断された。切断された切片は、ヘマトリキシリンとエオシンで染色した。また、大腿筋は、抗ｈＰＧＩＳ抗体で染色した。この染色結果を、図６に示す。図６から明らかなように、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳベクターを投与したＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群では、導入筋でｈＰＧＩＳ ｍＲＮＡが顕著に発現し血管新生に寄与した。

【0083】

なお、図６において、（Ａ）はＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群のそれぞれにＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳベクターを投与したときの左大腿筋肉内のｈＰＧＩＳの発現状態を示す顕微鏡写真であって、Ａは免疫組織科学的染色法により染色した状態を示す顕微鏡写真であり、（Ｂ）は各群の左大腿筋肉内のフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）を染色した状態の代表モデルを示す顕微鏡写真であり、（Ｃ）はｖＷＦに関する免疫蛍光染色をした左大腿筋肉内の微笑血管密度の定量分析した結果を示す図である。図６の（Ｃ）のデータにおいて、±ＳＤ．＊Ｐ＜．０５；ｎｓ，有意差無を意味する。

【0084】

微細血管の密度

【0085】

動物は麻酔下に殺され、灌流固定を４％パラホルムアルデヒドで行われた。大腿筋は摘出され、ＯＴＣ混合物に埋包された。凍結切片（７μｍ）が、組織試料から切り出された。血管内皮細胞の免疫蛍光染色は、抗ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）抗体（ＤＡＫＯ）を用いて行われた。核は、ＴＯＴＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色された。微細血管の密度の密度は、ｖＷＦ陽性細胞の数から計算された。全ての共焦点検鏡は、ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ(Carl Zeiss, Jena, Germany)で行われた。毛細血管密度は、イメージ J ソフトウェアによって測定された毛細血管の全面積の骨格筋の全面積に対する割合である。各マウスのデータは、３０連続切片から計算された。

【0086】

統計解析

【0087】

全てのデータは、平均値±標準偏差値で表されている。統計学的有意性は、非対Ｓｔｕｄｅｎｔ t ｔｅｓｔを使って評価された。３群以上の比較は、分散分析により行った。P＜．０５が有意とみなした。

【0088】

［実験結果］

【0089】

ＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳベクター投与後の発現持続

【0090】

本願発明者等は、８週齢のコントロールマウス（Ｃ５７／ＢＬ６）を用いてＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳベクターの効果持続期間を調べた。マウスの左大腿筋へＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳベクターを投与し、解析には、ベクター投与前、投与２週間後、４週間後、８週間後、１２週間後の左大腿筋を使用した。結果、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて、投与２週間後よりヒトＰＧＩＳ ｍＲＮＡの強い発現を認め、１２週間後においても強力な発現が持続していた。その結果を表１に示す。

【0091】

表１に示す結果からも明らかなように、骨格筋へのＡＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳの投与が骨格筋内に強力かつ長期間のｍＲＮＡの発現を示すことがわかった。また、この長期間のｍＲＮＡの発現は単回の筋肉内投与で達成された。

【0092】

【表1】

【0093】

下肢虚血の改善

【0094】

本願の発明者等は、下肢虚血マウスを治療する目的で、患側の左大腿筋へＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳを投与し、下肢虚血処置２週間後に改善の程度を検討した。検討に際して、下肢虚血の重症度を足壊死、指壊死、無壊死の３段階に区分した。その結果、図３に示すように、コントロール群は６３％、ＡＡＶｔｙｐｅ１−ＥＧＦＰを投与したＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群は６９％に足壊死又は指壊死が認められた。しかし、ＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳを投与したＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群の壊死の割合は１９％と有意に低下改善していた。また、最重症である足壊死の頻度も、ＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳ投与群が３群間で最も低かった。これらより、ＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳの筋肉内投与が下肢虚血に対して有効であることが示された。

【0095】

レーザー・ドップラー血液灌流解析

【0096】

レーザー・ドップラー血液灌流(Laser Doppler Blood perfusion；ＬＤＰ）法を用いて、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の３群間の下肢筋組織の血流を経皮的に解析した。ＬＤＰにおいて、コントロール群、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群は、図１に示すように、ＡＡＶｔｙｐｅ１−ＥＧＦＰ投与群と比較して、病側の左下肢筋組織の血流低下が認められた。また、ＬＤＰの定量解析（血液灌流率）では、コントロール群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群は、健側である右下肢組織血流と比較して、それぞれ７３％、５４％、１１８％であった（図２参照）。このＬＤＰの所見より、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与が血流を改善したと見られる。

【0097】

虚血筋肉内のmRNA分析

【0098】

ＱＴ−ＰＣＲを用いて、下肢虚血組織のｍＲＮＡ発現を解析した。コントロール群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群と比較して、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群では著しく有意なヒトＰＧＩＳ遺伝子の発現を認めた（図４のＡ参照）。また、内因性のマウスＰＧＩＳ遺伝子の発現は、３群間で有意差を認めなかった（図４のＢ参照）。また、下肢虚血組織の血管新生について検討するため、３群間のマウスＶＥＧＦ、マウスＦＬＫ−１、マウスＦＬＴ−１のｍＲＮＡ発現について解析した。結果、マウスＶＥＧＦは、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳで他の２群より２倍程度発現し有意であった（図４のＣ参照）。しかし、マウスＦＬＫ−１、マウスＦＬＴ−１のｍＲＮＡ発現は、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群が他の２群と比べて増加傾向であったが、統計学的な有意差を見出せなかった（図４のＤ、Ｅ参照）。以上より、ｍＲＮＡレベルで骨格筋内に強力なｈＰＧＩＳ遺伝子の発現を確認することができた。また、骨格筋内のＶＥＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現も増加していた。

【0099】

虚血筋肉内のウエスタンブロット解析

【0100】

さらに、ウエスタンブロットを用いて、下肢虚血組織内の蛋白質レベルの遺伝子発現を検討した。ウエスタンブロットによりＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群でｈＰＧＩＳ蛋白質が発現していることが確認できた（図５参照）。

【0101】

骨格筋内のｈＰＧＩＳの発現

【0102】

さらにまた、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳの投与部位である骨格筋の組織学的検討を行った。抗ヒトＰＧＩＳ抗体の免疫染色において、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群と比べて、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群の筋細胞に著明なｈＰＧＩＳ遺伝子の発現を認めた（図６参照）。また、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群、対照（ＣＯＮＴＲＯＬ）群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の３群間で炎症細胞浸潤等の明らかな免疫学的変化は認められなかった。

【0103】

骨格筋内の血管新生

【0104】

さらに、筋細胞レベルの改善を検討するために、骨格筋を抗ｖＷＦ抗体で免疫染色した。共焦点顕微鏡では、コントロール群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群と比較して、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群でｖＷＦ陽性細胞の増加が観察された（図６、Ａ及びＢ参照）。そこで、Image Jを用いて、ｖＷＦ陽性範囲を定量的に解析した。結果、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群では、コントロール群、ＡＡＶ−ＥＧＦＰ投与群の約６．５倍であり、統計学的に有意な増加であった（図６のＣ参照）。なお、骨格筋のＥＶＧ染色も行ったが、３群間で有意な変化は見られなかった。

【0105】

以上より、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳを投与した虚血骨格筋には、毛細血管レベルでの血管新生が起こり、これが虚血傷害を軽減していることが分かった。

【0106】

以上より、下肢虚血マウスに対してＡＡＶｔｙｐｅ１をベクターとするヒトＰＧＩＳ遺伝子を虚血骨格筋内へ遺伝子導入することによって、下肢虚血の改善を得ることができた。ＡＡＶには多くの血清型(serotype)が存在するが、ＡＡＶｔｙｐｅ１は骨格筋内で最も強力かつ長期間の遺伝子発現を呈する。本願発明者等は、ＡＡＶｔｙｐｅ１−ヒトＰＧＩＳ（ＡＡＶ−ＰＧＩＳ）がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのコントロール実験で強力かつ長期間の遺伝子導入効率を示すことを報告している。加えてＡＡＶｔｙｐｅ１の遺伝子発現範囲は遺伝子導入された局所のみであり、遠隔臓器には発現しない。この特徴は遠隔臓器への副作用(side effect)を減少させるものであり、他臓器の動脈硬化性疾患を合併することが多い重症下肢虚血患者の治療に有効である。

【0107】

上述の実験から明らかなように、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群は、非投与群と比べて、壊死の頻度が著しく低下し、最重症である足壊死の頻度もこのＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群が最も低かった。また、ＬＤＰによる定量解析において、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群は、非投与群と比べて、統計学的に有意な血流増加を表した。ＬＤＰ ｉｍａｇｅでは、全群において、大腿動脈の結紮による大腿動脈の血流途絶、すなわち、本管の閉塞が確認できたため、側副血行路(collateral vessels)の発達が血流改善に寄与したとみられる。

【0108】

次に、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳの導入部位である骨格筋について検討した。骨格筋内のＰＧＩＳ遺伝子発現についてＱＴ−ＰＣＲで解析したところ、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群の骨格筋では、外因性のＰＧＩＳの著明な遺伝子発現が認められ、コントロール群の１万倍程度であった。また、骨格筋内のＶＥＧＦ発現もＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群ではコントロール群の２倍程度の発現の増強が認められた。この結果は、ｈＰＧＩＳにより、ＶＥＧＦが誘導されたためとみられる。また、ｈＰＧＩＳによる免疫染色では、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ治療群の筋細胞内に著明な発現が認められた。そして、ウィルスベクター投与による筋細胞の炎症性変化や腫瘍形成は、全く認められなかった。これは、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳの安全性を証明する所見であり、特にＡＡＶは、ウィルスベクターの中でも、最も免疫原性が低いことを示している。

【0109】

さらに、本願発明者等は、組織学的に血管新生の有無について、骨格筋をｖＷＦで免疫染色した。ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群では、毛細管(capillary)レベルで顕著な血管新生を確認することができた。なお、骨格筋のＥＶＧ染色も行ったところ、全群で有意な変化は見られなかったため、ＡＡＶ−ｈＰＧＩＳ投与群の骨格筋内には、毛細血管レベルでの血管新生が起こっていると見られる。

【0110】

以上より、ＡＡＶｔｙｐｅ１−ｈＰＧＩＳの骨格筋内への遺伝子導入が、骨格筋細胞内に著明なヒトＰＧＩＳ遺伝子発現を起こさせ、この遺伝子発現を介して筋細胞から産生・分泌されたＰＧＩ２が、血管保護作用、血管新生誘導作用等を起こし、下肢虚血を改善させた。そして、以上の効果が単回投与で達成することができた。従来の臨床及び基礎研究の報告では、プラスミド、非ウィルスベクター等の長期間発現することができないベクターが使用されていたため、強力かつ持続的な遺伝子発現を維持することができなかった。また、複数回の投与を必要とした。実際にヒトに対して使用する際には、動物実験より多くの遺伝子発現が必要になる。ＡＡＶベクターのようなな長期間、強力な遺伝子発現が達成でき、かつ、安全性が高いウィルスベクターはヒトへの臨床応用に理想的なベクターであるといえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】