特許 5780680 神経学的障害の動物モデル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5780680

(24)【登録日】2015年7月24日

(45)【発行日】2015年9月16日

(54)【発明の名称】神経学的障害の動物モデル

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/027 20060101AFI20150827BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20150827BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20150827BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20150827BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150827BHJP

【ＦＩ】

   A01K67/027ZNA

   C12Q1/68 A

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   !C12N15/00 A

【請求項の数】15

【全頁数】73

(21)【出願番号】特願2012-520831(P2012-520831)

(86)(22)【出願日】2010年7月17日

(65)【公表番号】特表2012-533309(P2012-533309A)

(43)【公表日】2012年12月27日

(86)【国際出願番号】US2010042373

(87)【国際公開番号】WO2011009107

(87)【国際公開日】20110120

【審査請求日】2013年7月4日

(31)【優先権主張番号】61/226,394

(32)【優先日】2009年7月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511315253

【氏名又は名称】アン アンド ロバート エイチ． ルーリー チルドレンズ ホスピタル オブ シカゴ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】コーツ， ジャムク

【審査官】 上條 肇

(56)【参考文献】

【文献】 Developmental Dynamics，２００４年，Vol.231，p.614-620

【文献】 Gene Expression Patterns，２００４年，Vol.4，p.407-412

【文献】 Development，２００８年，Vol.135，p.2905-2916

【文献】 Genes and Development，２００６年，Vol.20，p.1470-1484

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

Ｃ１２Ｎ １５／８５ − １５／９０

Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１および／またはＥｖｆ２の発現減少を有することにより特徴づけられる、非ヒトトランスジェニック動物であって、ここで、該発現減少は、Ｅｖｆ配列であって、該Ｅｖｆ配列中へ挿入された転写停止配列を有するＥｖｆ配列を含む組換え核酸コンストラクトの導入によって達成される、非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項2】

前記動物がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの異常発達を呈する、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項3】

前記動物がヒトの自閉症または気分障害に類似する少なくとも１つの兆候を呈する、請求項１または２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項4】

前記動物が機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項5】

前記組換え核酸コンストラクトは、Ｅｖｆ配列であって、該Ｅｖｆ配列のエクソン１中に挿入された前記転写停止配列を有するＥｖｆ配列を含む、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項6】

前記動物が脳皮質において変化したドーパミン反応を呈する、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項7】

前記動物が、依存症、統合失調症、学習障害、気分障害および行動障害からなる群より選択されるヒト症状に類似する少なくとも１種の兆候を呈する、請求項６に記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項8】

前記動物が、非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現減少を有する、請求項６または７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項9】

前記組換え核酸コンストラクトは、Ｅｖｆ配列であって、該Ｅｖｆ配列のエクソン３中に挿入された前記転写停止配列を有するＥｖｆ配列を含む、請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項10】

前記非ヒト動物が、マウス、ラットおよびサルからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。

【請求項11】

脳障害を処置するための治療剤の同定方法であって、
請求項１〜１０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程、
該試験薬剤に対する該非ヒトトランスジェニック動物の反応を解析する工程であって、少なくとも１種の脳障害の兆候の緩和が治療効果の指標となる工程、を含む、方法。

【請求項12】

前記動物が、機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１種の脳障害の兆候が、自閉症または気分障害の兆候である、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記動物が、機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現減少を有する、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項15】

前記少なくとも１種の脳障害の兆候が、統合失調症または薬物依存症の兆候である、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経障害分野、より具体的には、精神神経障害分野に関する。本発明は、統合失調症、薬物依存症、自閉症、学習障害、気分障害、行動障害等の神経障害のための非ヒトトランスジェニック動物を提供する。また、該動物は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの発達に関する障害の分野、およびＧＡＢＡ依存性神経伝達が役割を果たす他の障害において適用される。

【背景技術】

【0002】

脳において、興奮および抑制の間のバランスは適切な機能にとって重要であり、２つの主要なクラスのニューロンによって維持される。すなわち、興奮性投射ニューロンおよび抑制性局所回路介在ニューロンである。興奮が、主に神経伝達物質であるグルタミン酸によって媒介される一方、ＧＡＢＡは主として抑制を媒介する。最近、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数多くの調節的役割が同定された（Ｄｉ Ｃｒｉｓｔｏ，２００７）。ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、発達の間、ニューロンの増殖、遊走および分化を調節し、ならびに、局所皮質回路の興奮性、一時的な同調および緻密化を調節する。ＧＡＢＡ調節回路の機能障害は統合失調症、自閉症およびトゥーレット症候群、ならびにてんかん等の異なる精神障害に結び付けられる。（Ｂｌａｔｔら２００１；Ｃａｓａｎｏｖａら２００２；Ｃｏｓｓｅｔｔｅら２００２；ＤｉＣｉｃｃｏ−Ｂｌｏｏｍら２００６；Ｍａら２００５；Ｎｏｅｂｅｌｓ，２００３）。ヒト自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）Ｒｅｔｔ症候群のモデルであるメチルＣｐＧ結合タンパク質（Ｍｅｃｐ２）突然変異体マウス（ＢｉｅｎｖｅｎｕおよびＣｈｅｌｌｙ，２００６；ＣｈａｈｒｏｕｒおよびＺｏｇｈｂｉ，２００７；ＭｏｒｅｔｔｉおよびＺｏｇｈｂｉ，２００６）において、ＧＡＢＡ依存性の抑制性の皮質活性化が減少する（Ｄａｎｉら２００５）。統合性失調症患者の背外則前頭前皮質において、最も一貫した知見の１つは、ＧＡＢＡ合成の原因酵素であるＧＡＤ６７の減少である（Ｌｅｗｉｓら２００５）。したがって、多数の一連の証拠は、様々な神経疾患におけるＧＡＢＡ作動性機能の異常を意味する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

しかしながら、この脳機能に関する知識にもかかわらず、そのような神経疾患の予防または処置において使用される治療剤の発見のための動物モデルの開発が依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0004】

１つの実施態様において、本発明は、機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１および／またはＥｖｆ２の発現減少を有することにより特徴づけられる、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。

【0005】

別の実施態様において、本発明は、自閉症の動物モデルの製造方法であって、該動物において機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現を減少または排除することが可能な組換え核酸コンストラクトにより動物細胞を形質転換する工程、および脳組織における機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する変異動物を再生する工程を含む方法を提供する。

【0006】

また、本発明は、薬物依存症または統合失調症の動物モデルの製造方法であって、該動物における機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現を減少または排除することが可能な組換え核酸コンストラクトにより動物細胞を形質転換する工程、および脳組織における機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現減少を有する変異動物を再生する工程を含む方法を提供する。

【0007】

さらに別の実施態様において、本発明は、脳障害の動物モデルの製造方法であって、機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１および／またはＥｖｆ２の発現減少を有する第１トランスジェニック非ヒト動物と第２非ヒト動物とを交差する工程、およびＥｖｆ配列のエクソン中に転写停止配列を導入するための配列を含む少なくとも１種の組換え核酸を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を、第１世代子孫から選択する工程を含む方法を提供する。

【0008】

また、本発明は、脳障害を処置するための治療剤の同定方法であって、機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１および／またはＥｖｆ２の発現減少を有する非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程、少なくとも１種の脳障害の兆候の緩和を治療効果の指標として、試験薬剤に対する非ヒトトランスジェニック動物の反応を解析する工程を含む方法を提供する。

【0009】

また、本発明は、試験薬剤の治療効果を決定する方法であって、試験薬剤を機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１および／またはＥｖｆ２の発現減少を有する第１非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程、脳障害の兆候のレベルを計測する工程、および該兆候レベルと試験薬剤が投与されなかった同型の第２非ヒトトランスジェニック動物のレベルとを、第１非ヒト動物における兆候の改善を試験薬剤の効果の指標として比較する工程を含む方法を提供する。

【0010】

別の実施態様において、本発明は、薬物依存症の予防または処置のための薬剤をスクリーニングする方法であって、機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現減少を有する第１非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程、精神刺激薬物に対する第１動物の反応を計測する工程、および、該反応と試験薬剤が投与されなかった同型の第２非ヒトトランスジェニック動物の反応とを、第１非ヒト動物における精神刺激薬物に対する反応の改善を薬物依存の処置または予防効果の指標として比較する工程を含む方法を提供する。

【0011】

さらなる実施態様において、本発明は、気分障害の処置のための薬剤をスクリーニングする方法であって、機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する第１非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程、気分障害の少なくとも１つの兆候を計測する工程、および該少なくとも１つの兆候の計測と、試験薬剤が投与されなかった同型の第２非ヒトトランスジェニック動物の少なくとも１つの兆候の計測とを、第１非ヒト動物における少なくとも１つの兆候計測の改善を気分障害処置のための試験薬剤の効果の指標として比較する工程を含む方法を提供する。

【0012】

さらなる実施態様において、本発明は、自閉症スペクトラム障害の処置のための薬剤をスクリーニングする方法であって、機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する第１非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程、自閉症スペクトラム障害の少なくとも１つの兆候を計測する工程、および該少なくとも１つの兆候の計測と、試験薬剤が投与されなかった同型の第２非ヒトトランスジェニック動物の少なくとも１つの兆候の計測とを、第１非ヒト動物における少なくとも１つの兆候の計測の改善を自閉症スペクトラム障害処置のための試験薬剤の効果の指標として比較する工程を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１および／またはＥｖｆ２の発現減少を有することにより特徴づけられる、非ヒトトランスジェニック動物。
（項目２）
前記動物がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの異常発達を呈する、項目１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目３）
前記動物がヒトの自閉症または気分障害に類似する少なくとも１つの兆候を呈する、項目１または２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目４）
前記動物が機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する、項目１〜３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目５）
前記発現減少が、組換え核酸コンストラクトの遺伝子移入によって達成され、該組換え核酸コンストラクトは、Ｅｖｆ配列であって、該Ｅｖｆ配列のエクソン１中に挿入された転写停止配列を有するＥｖｆ配列を含む、項目４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６）
前記動物が脳皮質において変化したドーパミン反応を呈する、項目１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目７）
前記動物が、依存症、統合失調症、学習障害、気分障害および行動障害からなる群より選択されるヒト症状に類似する少なくとも１種の兆候を呈する、項目６に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目８）
前記動物が、非コードＲＮＡＥｖｆ１の発現減少を有する、項目６または７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目９）
前記発現減少が、組換え核酸コンストラクトの遺伝子移入によって達成され、該組換え核酸コンストラクトは、Ｅｖｆ配列であって、該Ｅｖｆ配列のエクソン３中に挿入された転写停止配列を有するＥｖｆ配列を含む、項目８に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目１０）
前記非ヒト動物が、マウス、ラットおよびサルからなる群より選択される、項目１〜９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目１１）
自閉症の動物モデルの製造方法であって、
該動物において機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現を減少または排除することが可能な組換え核酸コンストラクトで該細胞を形質転換する工程、および
脳組織における機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する変異動物を再生する工程を含む、方法。
（項目１２）
前記発現の減少または排除が、Ｅｖｆ配列のエクソン１中に転写停止配列を含む安定に導入された組換えコンストラクトの使用により達成される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記再生された動物が、海馬において機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
薬物依存症または統合失調症の動物モデルの製造方法であって、
該動物における機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現を減少または排除することが可能な組換え核酸コンストラクトで動物細胞を形質転換する工程、および
脳組織における機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現減少を有する変異動物を再生する工程を含む、方法。
（項目１５）
前記発現の減少または排除が、Ｅｖｆ配列のエクソン３中に転写停止配列を含む安定に導入された組換えコンストラクトの使用により達成される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記再生された動物が、前頭前皮質における機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現減少を有する、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
脳障害の動物モデルの製造方法であって、
項目１に記載の第１トランスジェニック非ヒト動物と第２非ヒト動物とを交差する工程、および
少なくとも１つの第１組換え核酸を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を、第１世代子孫から選択する工程であって、該第１組換え核酸は、Ｅｖｆ配列のエクソン中に転写停止配列を導入するための配列を含む、工程を含む、方法。
（項目１８）
前記組換え核酸が、エクソン１およびエクソン２からなる群より選択されるＥｖｆ配列のエクソン中に転写停止配列を導入するための配列を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
脳障害を処置するための治療剤の同定方法であって、
項目１〜１０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程、
該試験薬剤に対する該非ヒトトランスジェニック動物の反応を解析する工程であって、少なくとも１種の脳障害の兆候の緩和が治療効果の指標となる工程、を含む、方法。
（項目２０）
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記動物が、機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記少なくとも１種の脳障害の兆候が、自閉症または気分障害の兆候である、項目１９〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記動物が、機能性非コードＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現減少を有する、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２４）
前記少なくとも１種の脳障害の兆候が、統合失調症または薬物依存症の兆候である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
試験薬剤の治療効果を決定するための方法であって、
試験薬剤を項目１に記載の第１非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程、
脳障害の兆候のレベルを計測する工程、および
該兆候レベルと該試験薬剤が投与されなかった同型の第２非ヒトトランスジェニック動物のレベルとを比較する工程であって、該第１非ヒト動物における兆候の改善が試験薬剤の効果の指標となる工程を含む、方法。
（項目２６）
薬物依存症の予防または処置のための薬剤をスクリーニングするための方法であって、
機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ１の発現減少を有する第１非ヒトトランスジェニック動物に
試験薬剤を投与する工程、
精神刺激薬物に対する該第１動物の反応を計測する工程、および、
該反応と該試験薬剤が投与されなかった同型の第２非ヒトトランスジェニック動物の反応とを比較する工程であって、該第１非ヒト動物における精神刺激薬物に対する反応の改善が、薬物依存症を処置または予防するための該試験薬剤の効果の指標となる工程を含む、方法。
（項目２７）
自閉症スペクトラム障害の処置のための薬剤をスクリーニングするための方法であって、
機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する第１非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程、
自閉症スペクトラムの少なくとも１つの兆候を計測する工程、および
該少なくとも１つの兆候の計測と、該試験薬剤が投与されなかった同型の第２非ヒトトランスジェニック動物の少なくとも１つの兆候の計測とを比較する工程であって、第１非ヒト動物における少なくとも１つの兆候の計測の改善が、自閉症スペクトラム障害処置のための該試験薬剤の効果の指標となる工程を含む、方法。
（項目２８）
気分障害の処置のための薬剤をスクリーニングするための方法であって、
機能性ｎｃＲＮＡ Ｅｖｆ２の発現減少を有する第１非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程、
気分障害の少なくとも１つの兆候を計測する工程、および
該少なくとも１つの兆候の計測と、試験薬剤が投与されなかった同型の第２非ヒトトランスジェニック動物の少なくとも１つの兆候の計測とを比較する工程であって、該第１非ヒト動物における少なくとも１つの兆候計測の改善が、該気分障害の処置のための該試験薬剤の効果の指標となる工程を含む、方法。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1-1】図１（ａ）は、エクソン３から開始して転写される３．７ｋｂ〜１０１ｂｐ（Ｅｖｆ２ＴＳ）にＥｖｆ２（Ｅｖｆ１ではない）転写物を切断する、Ｅｖｆエクソン１中への３倍ポリアデニル化転写停止部位のターゲッティングの例の概略図を提供する。切断型Ｅｖｆ２ＴＳ転写物（１０１ｂｐ）は、超保存されたｅｉ領域を完全に欠損している。３倍ポリアデニル化シグナル挿入からＤｌｘ５（Ｂ１０．２ｋｂ）およびＥｖｆ１（Ｂ１０．４ｋｂ）転写開始部位までの距離のみがスケールに示される。図１（ｂ）は、サザン解析により確認された、Ｅｖｆエクソン１に正確にターゲッティングされた転写停止を含有するＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスの作製に使用された、ＥＳ細胞の１つの実施態様を提供する。図１（ｃ〜ｈ）は、アンチセンスＥｖｆ２（ｃ、ｄ）、アンチセンスＥｖｆ１（ｅ、ｆ）またはアンチセンスＤｌｘ５（ｇ、ｈ）でプローブされた、野生型（ＷＴ）およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体の終脳のＥ１３．５冠状切片のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションの結果を提供する。図１（ｉ）は、Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ Ｅ１３．５ＭＧＥにおける遺伝子発現の変化を示す、本発明の１つの実施態様の代表例を提供する。３倍ポリＡ挿入は、Ｅｖｆ２の発現をノックダウンする。Ｄｌｘ５および６が発現増加される一方、Ｅｖｆ１およびニューロピリン２は変化しない。ｗｔ（野生型同腹仔コントロール、ｎ＝４）およびＥｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ（ｎ＝３のＥｖｆ２解析による全てについてｎ＝６）胚からプールされたＥ１３．５ＭＧＥ組織の定量的のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析。スチューデントのｔ−検定解析、^＊ｐ＜０．０５。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。統計解析：Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、Ｐ＜０．０５：Ｅｖｆ２＝０．００５５、Ｄｌｘ５＝０．０４４、Ｄｌｘ６＝０．００５５；野生型ｎ＝４、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝６。図１（ｊ）は２ｍｇ ｐｃＮＤＡ（コントロール）、ｌμｇ ｐｃＤＮＡ−Ｅｖｆ２およびｌμｇ ｐｃＤＮＡ）、ならびに２μｇ ｐｃＤＮＡ−Ｅｖｆ２を用いてエレクトロポレーション処理されたＥ１２．５Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体ＭＧＥの定量的Ｑ２１リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。統計解析、ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ両側検定、Ｐ＜０．０５値：Ｄｌｘ５、（０μｇ，１μｇ Ｅｖｆ２＝０．０５，０μｇ，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．００１）、ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ検定、Ｐ＜０．０５値、Ｄｌｘ６（０μｇ，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．０４１，１μｇ Ｅｖｆ２，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．０３３）；ｎ＝４．^＊Ｐ＜０．０５；ｔ検定、Ｍａｎｎ ＷｈｉｔｎｅｙまたはＡＮＯＶＡ。

【図1-2】図１（ａ）は、エクソン３から開始して転写される３．７ｋｂ〜１０１ｂｐ（Ｅｖｆ２ＴＳ）にＥｖｆ２（Ｅｖｆ１ではない）転写物を切断する、Ｅｖｆエクソン１中への３倍ポリアデニル化転写停止部位のターゲッティングの例の概略図を提供する。切断型Ｅｖｆ２ＴＳ転写物（１０１ｂｐ）は、超保存されたｅｉ領域を完全に欠損している。３倍ポリアデニル化シグナル挿入からＤｌｘ５（Ｂ１０．２ｋｂ）およびＥｖｆ１（Ｂ１０．４ｋｂ）転写開始部位までの距離のみがスケールに示される。図１（ｂ）は、サザン解析により確認された、Ｅｖｆエクソン１に正確にターゲッティングされた転写停止を含有するＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスの作製に使用された、ＥＳ細胞の１つの実施態様を提供する。図１（ｃ〜ｈ）は、アンチセンスＥｖｆ２（ｃ、ｄ）、アンチセンスＥｖｆ１（ｅ、ｆ）またはアンチセンスＤｌｘ５（ｇ、ｈ）でプローブされた、野生型（ＷＴ）およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体の終脳のＥ１３．５冠状切片のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションの結果を提供する。図１（ｉ）は、Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ Ｅ１３．５ＭＧＥにおける遺伝子発現の変化を示す、本発明の１つの実施態様の代表例を提供する。３倍ポリＡ挿入は、Ｅｖｆ２の発現をノックダウンする。Ｄｌｘ５および６が発現増加される一方、Ｅｖｆ１およびニューロピリン２は変化しない。ｗｔ（野生型同腹仔コントロール、ｎ＝４）およびＥｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ（ｎ＝３のＥｖｆ２解析による全てについてｎ＝６）胚からプールされたＥ１３．５ＭＧＥ組織の定量的のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析。スチューデントのｔ−検定解析、^＊ｐ＜０．０５。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。統計解析：Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、Ｐ＜０．０５：Ｅｖｆ２＝０．００５５、Ｄｌｘ５＝０．０４４、Ｄｌｘ６＝０．００５５；野生型ｎ＝４、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝６。図１（ｊ）は２ｍｇ ｐｃＮＤＡ（コントロール）、ｌμｇ ｐｃＤＮＡ−Ｅｖｆ２およびｌμｇ ｐｃＤＮＡ）、ならびに２μｇ ｐｃＤＮＡ−Ｅｖｆ２を用いてエレクトロポレーション処理されたＥ１２．５Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体ＭＧＥの定量的Ｑ２１リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。統計解析、ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ両側検定、Ｐ＜０．０５値：Ｄｌｘ５、（０μｇ，１μｇ Ｅｖｆ２＝０．０５，０μｇ，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．００１）、ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ検定、Ｐ＜０．０５値、Ｄｌｘ６（０μｇ，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．０４１，１μｇ Ｅｖｆ２，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．０３３）；ｎ＝４．^＊Ｐ＜０．０５；ｔ検定、Ｍａｎｎ ＷｈｉｔｎｅｙまたはＡＮＯＶＡ。

【図1-3】図１（ａ）は、エクソン３から開始して転写される３．７ｋｂ〜１０１ｂｐ（Ｅｖｆ２ＴＳ）にＥｖｆ２（Ｅｖｆ１ではない）転写物を切断する、Ｅｖｆエクソン１中への３倍ポリアデニル化転写停止部位のターゲッティングの例の概略図を提供する。切断型Ｅｖｆ２ＴＳ転写物（１０１ｂｐ）は、超保存されたｅｉ領域を完全に欠損している。３倍ポリアデニル化シグナル挿入からＤｌｘ５（Ｂ１０．２ｋｂ）およびＥｖｆ１（Ｂ１０．４ｋｂ）転写開始部位までの距離のみがスケールに示される。図１（ｂ）は、サザン解析により確認された、Ｅｖｆエクソン１に正確にターゲッティングされた転写停止を含有するＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスの作製に使用された、ＥＳ細胞の１つの実施態様を提供する。図１（ｃ〜ｈ）は、アンチセンスＥｖｆ２（ｃ、ｄ）、アンチセンスＥｖｆ１（ｅ、ｆ）またはアンチセンスＤｌｘ５（ｇ、ｈ）でプローブされた、野生型（ＷＴ）およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体の終脳のＥ１３．５冠状切片のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションの結果を提供する。図１（ｉ）は、Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ Ｅ１３．５ＭＧＥにおける遺伝子発現の変化を示す、本発明の１つの実施態様の代表例を提供する。３倍ポリＡ挿入は、Ｅｖｆ２の発現をノックダウンする。Ｄｌｘ５および６が発現増加される一方、Ｅｖｆ１およびニューロピリン２は変化しない。ｗｔ（野生型同腹仔コントロール、ｎ＝４）およびＥｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ（ｎ＝３のＥｖｆ２解析による全てについてｎ＝６）胚からプールされたＥ１３．５ＭＧＥ組織の定量的のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析。スチューデントのｔ−検定解析、^＊ｐ＜０．０５。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。統計解析：Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、Ｐ＜０．０５：Ｅｖｆ２＝０．００５５、Ｄｌｘ５＝０．０４４、Ｄｌｘ６＝０．００５５；野生型ｎ＝４、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝６。図１（ｊ）は２ｍｇ ｐｃＮＤＡ（コントロール）、ｌμｇ ｐｃＤＮＡ−Ｅｖｆ２およびｌμｇ ｐｃＤＮＡ）、ならびに２μｇ ｐｃＤＮＡ−Ｅｖｆ２を用いてエレクトロポレーション処理されたＥ１２．５Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体ＭＧＥの定量的Ｑ２１リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。統計解析、ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ両側検定、Ｐ＜０．０５値：Ｄｌｘ５、（０μｇ，１μｇ Ｅｖｆ２＝０．０５，０μｇ，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．００１）、ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ検定、Ｐ＜０．０５値、Ｄｌｘ６（０μｇ，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．０４１，１μｇ Ｅｖｆ２，２μｇ Ｅｖｆ２＝０．０３３）；ｎ＝４．^＊Ｐ＜０．０５；ｔ検定、Ｍａｎｎ ＷｈｉｔｎｅｙまたはＡＮＯＶＡ。

【図2】図２は、Ｅ１３．５ ＭＧＥにおいてＤｌｘ５／６の遺伝子間のエンハンサーに結合するＤＬＸおよびＭＥＣＰ２に影響する、Ｅｖｆ２喪失のグラフの代表例を提供する。図２（ａ）は、Ｄｌｘ５／６およびＥｖｆ１／２を囲むマウス染色体６ｑＡ１における領域を示す概略図の代表例を提供する。図２（ｂ〜ｄ）は、Ｄｌｘ５／６領域に亘る（ａｃｒｏｓｅｅ）プライマー１〜６およびＤＬＸに対する全抗体（ｐａｎａｎｔｉｂｏｄｙ）（ｐ＜０．０５値：３＝０．０２５、５＝０．０２５；ｂ）、ＭＥＣＰ２に対する抗体（ｐ＜０．０５値：２＝０．０２５、３＝０．０２５、５＝０．０２５；ｃ）またはＨＤＡＣ１に対する抗体（Ｐ＜０．０５値：５＝０．０２５、６＝０．０２５；ｄ）を用いた、野生型（黒色バー）およびＥｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ突然変異体（灰色バー）からのＥ１３．５ ＭＧＥの定量的ＣｈＩＰの結果を提供する。ｑＣｈＩＰ−ＰＣＲを、先に定義したプライマーセット（１＝１５、２＝２４、４＝２７）および新たに定義されるセットをｅｉ（３、赤色）、ｅｉｉ（５、赤色）および外部プライマー（６）に使用して、最適化されたプライマーセットに対して行った。プライマー２（緑色）は、成人脳皮質中における転写抑制のためのＭＥＣＰ２／ＨＤＡＣ結合部位と同定された。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。^＊Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定。（ａ）における概略図は、以前に公開されたプライマーにより整列させるためにＥｖｆ２転写停止挿入（図１）について示されたものから逆向きにされている。

【図3】図３は、Ｅｖｆ２はＤＬＸまたはＭＥＣＰ２の核局在化に影響しないことを示す結果の例を提供する。図３（ａ）は、Ｄｌｘ２ ｃＤＮＡおよび／またはＥｖｆ２ ｃＤＮＡを含有するコンストラクトのトランスフェクション後のＤＬＸ２タンパク質のウェスタンブロット解析を提供する。トランスフェクションは、等しいレベルのＤＬＸ２タンパク質を示す、Ｅｖｆ２ ＲＮＡの存在または非存在下で、Ｃ１７マウス神経幹細胞中において行われた。Ｅｖｆ２ ＲＮＡがトランスフェクションの後に安定していたことがＲＴ−ＰＣＲによって決定された（データ非表示）。図３（ｂ）は、Ｅｖｆ２の欠損がＤＬＸ２タンパク質レベルに影響を与えなかったことを示す、ＤＬＸ２（Ｄ．Ｅｉｓｅｎｔｓｔａｔからの贈与）に対する抗体でプローブされたＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳおよび野生型のＥ１３．５神経節隆起抽出物のウェスタン解析を提供する。図３（ｃ〜ｈ）野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ Ｅ１３．５ ＭＧＥ ＳＶＺ（脳室下帯）の両方において、ＤＡＰＩ（青色）により対比染色されたＤＬＸ（緑色）染色核に対する全抗体；ＶＺ、脳室帯域。スケールバーは、２００μｍ（ｃ、ｆ）、２０μｍ（ｄ、ｇ）および１０μｍ（ｅ、ｈ）を表す。図３（ｉ、ｊ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ＭＧＥ細胞の両方にて同様の核の局在化を示す、ＭＥＣＰ２（緑色）およびＤＡＰＩ（青色の核）に対する抗体を用いた免疫組織化学を提供する。スケールバーは２０ｍｍを表す。

【図4-1】図４は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体マウスのＰ２海馬および歯状回においてＧＡＢＡ作動性介在ニューロン欠損を支持するデータの例を提供する。図４（ａ）は、脳室下帯および側脳室を縁取る細胞が海馬と歯状回に遊走するにつれて発現するＥｖｆ２のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション解析を提供する。スケールバーは１３０μｍを表す。ＤＧ、歯状回；ＤＧＣ、歯状回顆粒細胞層；ＬＭｏｌ、網状層分子；ＬＶ、側脳室；Ｍｏｌ、歯状回の分子層；Ｏｒ、多形細胞層（ｏｒｉｅｎｓ）；Ｐｙ、錐体；Ｒａｄ、放線状層（ｒａｄｉａｔｕｍ）。図４（ｂ）は、歯状回および海馬ＣＡ１およびＣＡ３領域におけるＧＡＤ６７発現ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数の定量化を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。歯状回、ＣＡ３およびＣＡｌについてＰ＝０．０２５ Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（野生型ｎ＝３、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝３）。図４（ｃ、ｄ）は、海馬におけるＧａｄ１発現介在ニューロンのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを提供する。スケールバーは１３５μｍを表す。図４（ｅ、ｆ）は、ＧＡＢＡ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色核）に対する抗体による免疫組織化学の結果を提供する。スケールバーは２００μｍを表す。図４（ｇ、ｈ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳにおいて同様の発現を示す、海馬ＣＡ３領域におけるｖＧｌｕｔｌ発現ニューロンのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを提供する。スケールバーは８０μｍを表す。図４（ｉ、ｊ）は、海馬ＣＡ３領域におけるアポトーシスＴＵＮＥＬアッセイ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色核）を使用した、免疫組織化学を提供する。スケールバーは１０μｍを表す。図４（ｋ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体間の細胞死において差を示さない、歯状回および海馬ＣＡ１およびＣＡ３領域におけるＴＵＮＥＬポジティブ細胞数の定量化を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。歯状回、ＣＡ３およびＣＡｌについてＰ＜０．０５、スチューデントのｔ検定（野生型ｎ＝３，Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝３）。^＊Ｐ＜０．０５（ｔ検定または Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。

【図4-2】図４は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体マウスのＰ２海馬および歯状回においてＧＡＢＡ作動性介在ニューロン欠損を支持するデータの例を提供する。図４（ａ）は、脳室下帯および側脳室を縁取る細胞が海馬と歯状回に遊走するにつれて発現するＥｖｆ２のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション解析を提供する。スケールバーは１３０μｍを表す。ＤＧ、歯状回；ＤＧＣ、歯状回顆粒細胞層；ＬＭｏｌ、網状層分子；ＬＶ、側脳室；Ｍｏｌ、歯状回の分子層；Ｏｒ、多形細胞層（ｏｒｉｅｎｓ）；Ｐｙ、錐体；Ｒａｄ、放線状層（ｒａｄｉａｔｕｍ）。図４（ｂ）は、歯状回および海馬ＣＡ１およびＣＡ３領域におけるＧＡＤ６７発現ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数の定量化を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。歯状回、ＣＡ３およびＣＡｌについてＰ＝０．０２５ Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（野生型ｎ＝３、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝３）。図４（ｃ、ｄ）は、海馬におけるＧａｄ１発現介在ニューロンのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを提供する。スケールバーは１３５μｍを表す。図４（ｅ、ｆ）は、ＧＡＢＡ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色核）に対する抗体による免疫組織化学の結果を提供する。スケールバーは２００μｍを表す。図４（ｇ、ｈ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳにおいて同様の発現を示す、海馬ＣＡ３領域におけるｖＧｌｕｔｌ発現ニューロンのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを提供する。スケールバーは８０μｍを表す。図４（ｉ、ｊ）は、海馬ＣＡ３領域におけるアポトーシスＴＵＮＥＬアッセイ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色核）を使用した、免疫組織化学を提供する。スケールバーは１０μｍを表す。図４（ｋ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体間の細胞死において差を示さない、歯状回および海馬ＣＡ１およびＣＡ３領域におけるＴＵＮＥＬポジティブ細胞数の定量化を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。歯状回、ＣＡ３およびＣＡｌについてＰ＜０．０５、スチューデントのｔ検定（野生型ｎ＝３，Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝３）。^＊Ｐ＜０．０５（ｔ検定または Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。

【図5】図５は、Ｅ１３．５ ＭＧＥにおいてはＥｖｆ２がトランスポジティブにＧａｄｌ発現を調節するが、成体の海馬では調節しないデータの例を提供する。図５（ａ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体からのＥ１３．５ ＭＧＥにおけるＧａｄ１の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。Ｐ＝０．０３１、スチューデントのｔ検定（野生型ｎ＝３、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝５）。図５（ｂ）は、コントロール（ｐｃＤＮＡ、２ｍｇ）および２ｍｇ ｐｃＤＮＡ−Ｅｖｆ２でエレクトロポレーション処理されたＥ１２．５ Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体ＭＧＥにおけるＧａｄ１の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。Ｐ＝０．０３７５、スチューデントのｔ検定（ｎ＝４）。図５（ｃ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体からのＰ６０海馬におけるＧａｄｌの定量的のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。Ｐ＝０．０３１、スチューデントのｔ検定（野生型ｎ＝２、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝２）。図５（ｄ）は、８か月齢の歯状回ならびに海馬ＣＡ３およびＣＡｌ領域おける、ＧＡＤ６７発現ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数の定量化を提供する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。歯状回、ＣＡ３およびＣＡｌについてＰ＞０．０５、スチューデントのｔ検定（野生型ｎ＝３、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ ｎ＝３）。^＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定。

【図6-1】図６は、ＧＡＢＡ作動性シナプス抑制は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体マウス成体の海馬ＣＡ１層で減少されることを示すデータの例を提供する。図６（ａ、ｂ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳのマウスのＣＡｌ錐体細胞からのｓＩＰＳＣ（１）およびｍＩＰＳＣ（２）の代表的なトレースを提供する。ピクロトキシン（０．２５ｍＭ）は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳおよび野生型のマウス（３）においてすべてのＩＰＳＣ活性を阻害した。図６（ｃ、ｄ）は、ＣＡ１錐体細胞からのｓＩＰＳＣおよびｍＩＰＳＣインターイベント（ｉｎｔｅｒ−ｅｖｅｎｔ）間隔の平均化された累積確率プロットを提供する（Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ、赤色；野生型、黒色；Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｍｏｖ検定、Ｐ＜０．００１）。挿入、ｓＩＰＳＣおよびｍＩＰＳＣイベント頻度は、成体および老齢Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスにおいて（ｓＩＰＳＣ成体、１１．７５±１．７３Ｈｚ；ｓＩＰＳＣ老齢、９．１７±０．７１；ｍＩＰＳＣ成体、１０．６５±１．０５Ｈｚ；ｍＩＰＳＣ老齢、６．５±０．８３Ｈｚ）、コントロール野生型マウス（ｓＩＰＳＣ成体、１６．６６±１．２６Ｈｚ；ｓＩＰＳＣ老齢、１２．６２±０．９２Ｈｚ；ｍＩＰＳＣ成体、１４．１６±１．６７Ｈｚ；ｍＩＰＳＣ老齢、９．０６±０．７７Ｈｚ）よりも少なかった。図６（ｅ、ｆ）は、ｓＩＰＳＣおよびｍＩＰＳＣ振幅の平均化累積確率プロットを提供する（Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ、赤色；野生型、黒色；ｓＩＰＳＣ成体、３３．６±２．７ｐＡ；ｓＩＰＳＣ老齢、４８．５０±３．０６；ｍＩＰＳＣ成体、３５．２６±１．４１ｐＡ；ｍＩＰＳＣ老齢、３４．８７±３．７６）および野生型マウス（ｓＩＰＳＣ成体、３７．４±３．２ｐＡ；ｓＩＰＳＣ老齢、５３．７８±３．９８；ｍＩＰＳＣ成体、３４．５４±１．６４ｐＡ；ｍＩＰＳＣ老齢、３７．０３±４．６３）。図６（ｇ）は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスにおけるＧＡＢＡ作動性抑制の誘発されたＩＰＳＣのＩ−Ｖプロットを提供する（Ｐ＜０．０１、対応ｔ検定）。ＩＰＳＣ電流は、興奮性シナプス活動を抑えるための薬物を含有しないＡＣＳＦにおいて、誘発されたＥＰＳＣの振幅に対して標準化された。トレース１は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ（赤色）および野生型（黒色）マウス（平均ｎ＝５）において＋２０ｍＶでの代表的なＩＰＳＣ記録を示す。ピクロトキシン（０．２５ｍＭ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウス（トレース２）の両方からＣＡｌニューロンにおいて誘発されたＩＰＳＣを阻害した。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。^＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定。

【図6-2】図６は、ＧＡＢＡ作動性シナプス抑制は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体マウス成体の海馬ＣＡ１層で減少されることを示すデータの例を提供する。図６（ａ、ｂ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳのマウスのＣＡｌ錐体細胞からのｓＩＰＳＣ（１）およびｍＩＰＳＣ（２）の代表的なトレースを提供する。ピクロトキシン（０．２５ｍＭ）は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳおよび野生型のマウス（３）においてすべてのＩＰＳＣ活性を阻害した。図６（ｃ、ｄ）は、ＣＡ１錐体細胞からのｓＩＰＳＣおよびｍＩＰＳＣインターイベント（ｉｎｔｅｒ−ｅｖｅｎｔ）間隔の平均化された累積確率プロットを提供する（Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ、赤色；野生型、黒色；Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｍｏｖ検定、Ｐ＜０．００１）。挿入、ｓＩＰＳＣおよびｍＩＰＳＣイベント頻度は、成体および老齢Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスにおいて（ｓＩＰＳＣ成体、１１．７５±１．７３Ｈｚ；ｓＩＰＳＣ老齢、９．１７±０．７１；ｍＩＰＳＣ成体、１０．６５±１．０５Ｈｚ；ｍＩＰＳＣ老齢、６．５±０．８３Ｈｚ）、コントロール野生型マウス（ｓＩＰＳＣ成体、１６．６６±１．２６Ｈｚ；ｓＩＰＳＣ老齢、１２．６２±０．９２Ｈｚ；ｍＩＰＳＣ成体、１４．１６±１．６７Ｈｚ；ｍＩＰＳＣ老齢、９．０６±０．７７Ｈｚ）よりも少なかった。図６（ｅ、ｆ）は、ｓＩＰＳＣおよびｍＩＰＳＣ振幅の平均化累積確率プロットを提供する（Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ、赤色；野生型、黒色；ｓＩＰＳＣ成体、３３．６±２．７ｐＡ；ｓＩＰＳＣ老齢、４８．５０±３．０６；ｍＩＰＳＣ成体、３５．２６±１．４１ｐＡ；ｍＩＰＳＣ老齢、３４．８７±３．７６）および野生型マウス（ｓＩＰＳＣ成体、３７．４±３．２ｐＡ；ｓＩＰＳＣ老齢、５３．７８±３．９８；ｍＩＰＳＣ成体、３４．５４±１．６４ｐＡ；ｍＩＰＳＣ老齢、３７．０３±４．６３）。図６（ｇ）は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスにおけるＧＡＢＡ作動性抑制の誘発されたＩＰＳＣのＩ−Ｖプロットを提供する（Ｐ＜０．０１、対応ｔ検定）。ＩＰＳＣ電流は、興奮性シナプス活動を抑えるための薬物を含有しないＡＣＳＦにおいて、誘発されたＥＰＳＣの振幅に対して標準化された。トレース１は、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ（赤色）および野生型（黒色）マウス（平均ｎ＝５）において＋２０ｍＶでの代表的なＩＰＳＣ記録を示す。ピクロトキシン（０．２５ｍＭ）は、野生型およびＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウス（トレース２）の両方からＣＡｌニューロンにおいて誘発されたＩＰＳＣを阻害した。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。^＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定。

【図7】図７は、Ｅｖｆ−１およびＥｖｆ−２がＤｌｘファミリーメンバーと協同して、標的特異的、ホメオドメイン特異的、および細胞型特異的にＤｌｘ５／６エンハンサー活性を活性化することを示す、いくつかのデータの例を提供する。示されるように、ＣＩ７およびＭＮ９Ｄの神経細胞株、またはＣ２Ｃ１２筋細胞株を、（ｉ）に示されるように異なるレポーターと共に、ｐｃＤＮＡ含有コンストラクトでトランスフェクトした。実験はすべて、最低３回を３連で行った。（ｉ）１−７に列挙された異なるレポーターを標的として使用して、Ｅｖｆ−１、Ｅｖｆ−２およびＤｌｘ−２による協同的活性化に対して使用された特異性を決定した。トランスフェクション効率は、ウミウシルシフェラーゼ内部コントロールプラスミドを含めることにより標準化された。図７ａは、マウスＤｌｘ５／６およびゼブラフィッシュＤｌｘ４／６エンハンサーコンストラクトのＥｖｆ−１およびＥｖｆ−２誘導用量依存性の協同的活性化の例を提供する。異なるレポーターコンストラクトと共に、１．７５μｇ、０．８８μｇ、０．４４μｇまたは（ｏｆ）１ｇのＥｖｆ−２をｐｃＤＮＡ−Ｄｌｘ−２で共トランスフェクトし、ホタルおよびウミウシのルシフェラーゼ活性はＹ軸の上に決定され、標準化され、プロットされた。図７ｂは、Ｅｖｆ転写増強活性の標的としてｅｉおよびｅｉｉの両方の例を提供する。図７ｃは、ＥｖｆがＤｌｘ−２と、Ｗｎｔエンハンサーおよびｄの活性化を増加させるようには協同しないことを示す。ＥｖｆはＧｌｉ−Ｉと、フロアプレート（ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ）エンハンサーの活性化を増加させるようには協同しない。図７ｅは、ＥｖｆがＣ１７神経細胞におけるＤｌｘ５／６エンハンサー活性を活性化するため、Ｐａｘ３またはＧｌｉ−１と協同しないことを示す。図７ｆは、ＥｖｆがＭＮ９Ｄ神経細胞におけるＤｌｘ５／６エンハンサー活性の活性化するため、Ｐａｘ−３またはＧｌｉ−１とではなく、Ｄｌｘ−２と協同することを示す。図７ｇは、Ｅｖｆが筋細胞株Ｃ２Ｃ１２においてｍｙｏＤエンハンサーを抑えるため、Ｍｓｘ−１およびＭｓｘ−２と協同しないことを示す。図７ｈは、Ｄｌｘファミリーメンバー１、２、４および６が異なるレベル（Ｄｌｘ２＞Ｄｌｘ４＞Ｄｌｘ６＞Ｄｌｘ１）へとＥｖｆとの協同的活性を呈することを示す。全抗ｄｌｌ抗体でプローブされた、トランスフェクトされた細胞抽出液のウェスタン解析を以下に示す。図７ｉは、Ｅｖｆ−２がＭｓｘ−１およびＭｓｘ−２による抑制を防止しないことを示す。図７ｊは、図７ａ〜ｈで使用されるレポーターの概要を示す。

【図8】図８は、Ｅｖｆ−１およびＥｖｆ−２がＤｌｘファミリーメンバーと協同して、標的特異的、ホメオドメイン特異的、および細胞型特異的にＤｌｘ５／６エンハンサー活性を活性化することを示す、いくつかのデータの追加例を提供する。図８Ａ〜Ｌは、Ｄｌｘ５／６エンハンサーのＤｌｘ−２依存性協同の活性化に必要且つ十分な、Ｅｖｆ−１およびＥｖｆ−２の５つのプライムユニーク（ｐｒｉｍｅ ｕｎｉｑｕｅ）領域を提供する。異なるＥｖｆ−２欠失変異体によるＣ１７神経細胞株におけるＤｌｘ５／６エンハンサー活性化の比較。図８Ａ、Ｇは、５つのプライムＥｖｆ欠失の図を提供する。図８Ｂ、８Ｈは、異なる５つのプライムＥｖｆ欠失の活性を提供する、図８Ｃ、８Ｉは、Ｅｖｆ欠失の定量的ＲＴ−ＰＣＲを提供する。図８Ｄ、Ｊは、３’Ｅｖｆ欠失の図を提供する。図８Ｅ、８Ｋは、異なる３つのプライムＥｖｆ欠失の活性を提供する。図８Ｆ、８Ｌは、３’Ｅｖｆ欠失の定量的ＲＴ−ＰＣＲを提供する。定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、５−および３−プライム欠損が比較的同量においてなされたことを示す。したがって、機能の喪失は、Ｅｖｆ ＲＮＡ分解または不安定化の結果ではない。

【図9】図９は、Ｅｖｆ−１およびＥｖｆ−２転写調節ドメイン間での第２の構造比較の概略図の代表例を提供する。Ｅｖｆ−１およびＥｖｆ−２は、それらの機能性ドイインにおける同様のステムループ構造、ならびにフォールディングされた全長ＲＮＡを含む。これらの構造（赤色および緑色の四角によって強調される）は以下を含む：赤色四角の構造：６ヌクレオチド（ｎｔ）ループ−４塩基対（ｂｐ）ステムＩ−｛２ｎｔ（Ｅｖｆ−１）または４ｎｔ（Ｅｖｆ−２）バルジ｝−４ｂｐステムＩＩ（緑色四角の構造）：４ｎｔループ−３／５ｂｐステムＩＶ−４／２ｂｐバルジ−４／５ｂｐステムＩＩＩ。したがって、配列類似性の欠損にもかかわらず、共有される第２の構造は、それらの同様の転写活性を説明し得る。

【図10-1】図１０は、マウスＥＳ細胞における相同組換えによるＥｖｆ−１およびＥｖｆ−２、５’領域への転写停止部位挿入の１つの実施態様の概略例を提供する。Ｎ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ（ＢＡＣ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＬｅｅおよびＣｏｐｅｌａｎｄ，２０００）から得られた試薬およびプロトコルを使用して、３倍ポリＡを、エクソン１（Ｅｖｆ−２ＴＳ）またはエクソン３（Ｅｖｆ−１ＴＳ）に挿入した。これは、時期尚早に、エンハンサー調節配列を破壊せずに、Ｅｖｆ−２およびＥｖｆ−１ＲＮＡの内因性転写を停止する。コンストラクトを、ＥＳ細胞中でエレクトロポレーション処理した。サザンハイブリダイゼーションは、ＥＳ細胞が正確に標的化された対立遺伝子を含むことを示す。Ｅｖｆ−２ ＴＳおよびＥｖｆ−１ ＴＳ ＥＳ細胞を用いた胚盤胞注射は、いくつかのキメラマウスを作出した。両方のための生殖細胞系伝達は、サザン解析（示されない）によって確認された。ＥＩＩＡｃｒｅマウスとの交差によりｆｌｏｘｅｄ ｎｅｏを排除した後、１つのｌｏｘＰおよびＴＳ配列（６３のヌクレオチド）が残る。Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳおよびＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスは繁殖性であり、１歳まで生きる。Ｔ、標的化；ｗ、野生型。

【図10-2】図１０は、マウスＥＳ細胞における相同組換えによるＥｖｆ−１およびＥｖｆ−２、５’領域への転写停止部位挿入の１つの実施態様の概略例を提供する。Ｎ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ（ＢＡＣ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＬｅｅおよびＣｏｐｅｌａｎｄ，２０００）から得られた試薬およびプロトコルを使用して、３倍ポリＡを、エクソン１（Ｅｖｆ−２ＴＳ）またはエクソン３（Ｅｖｆ−１ＴＳ）に挿入した。これは、時期尚早に、エンハンサー調節配列を破壊せずに、Ｅｖｆ−２およびＥｖｆ−１ＲＮＡの内因性転写を停止する。コンストラクトを、ＥＳ細胞中でエレクトロポレーション処理した。サザンハイブリダイゼーションは、ＥＳ細胞が正確に標的化された対立遺伝子を含むことを示す。Ｅｖｆ−２ ＴＳおよびＥｖｆ−１ ＴＳ ＥＳ細胞を用いた胚盤胞注射は、いくつかのキメラマウスを作出した。両方のための生殖細胞系伝達は、サザン解析（示されない）によって確認された。ＥＩＩＡｃｒｅマウスとの交差によりｆｌｏｘｅｄ ｎｅｏを排除した後、１つのｌｏｘＰおよびＴＳ配列（６３のヌクレオチド）が残る。Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳおよびＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスは繁殖性であり、１歳まで生きる。Ｔ、標的化；ｗ、野生型。

【図11】図１１は、Ｅｖｆ−１およびＥｖｆ−２発現が海馬において誕生後に分岐（ｄｉｖｅｒｇｅ）することを示すデータを提供する。ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションは、側脳室に隣接する脳室下帯における発現、および脳梁の方へ背側に遊走する細胞により、Ｐ２でＥｖｆ−１およびＥｖｆ−２発現が類似することを示す。Ｐ１２では、Ｄｌｘ−１およびＤｌｘ−５発現細胞が脳室下帯を出て脳梁への外部カプセルに沿って移動するにつれて、Ｅｖｆ−２発現（濃い青色細胞）と類似する。Ｅｖｆ−１およびＤｌｘ−６発現は、これら遊走する集団において検知されない。しかしながら、Ｐ６０までに、Ｅｖｆ−１およびＤｌｘ−６は明確に異なるパターンで海馬において発現される。Ｅｖｆ−１は、錐体層および放射状層、ならびに歯状回全体でも見出される。Ｅｖｆ−２は脳室下帯のＰ６０海馬において検知されない。ｏｒ、多形細胞層；ｐｙ、錐体；ｒａｄ；放射状；ＬＭｏｌ、網状分子；Ｍｏｌ；ＤＯＣ、歯状回顆粒細胞層；ＬＶ、側脳室；Ｄ、背側；Ｖ、腹側；Ｐ＝出生後日数。

【図12】図１２は、マウスＰ２嗅球においてＥｖｆ１が発現されるが、Ｅｖｆ２は発現されないことを示すデータを提供する。Ｐ２嗅球におけるＤｌｘ遺伝子１、２、５および６とオーバーラップして、ＳＶＺにおいてＥｖｆ１が発現されるが、Ｅｖｆ２は発現されない。脳室下帯、ＳＶＺ；顆粒細胞層、ＧＣ；僧帽細胞層、ＭＣ；傍糸球体層、ＰＯ；外顆粒層（ｏｕｔｅｒ ｎｅｒｖｅｒ ｌａｙｅｒ）、ＯＮＬ。

【図13】図１３は、Ｅｖｆ１および２が出生後の脳室下帯において発現されるが、Ｅｖｆ１発現だけがＰ１２および成体の内側嗅結節において持続することを示すデータの例を提供する。標識化されたアンチセンスＲＮＡを用いた出生２日目（Ｐ２、線条体ＳＶＺ））、１２日目（Ｐ１２）または成体のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション。上部右パネルはＰａｘｉｎｏｓ（マウスアトラス）からである。Ｌ、側面；Ｍ、内側；Ｄ、背側；Ｖ、腹側；ＳＶＺ、脳室下帯；ｍＯｌｆＴｕｂ、内側嗅結節；ＧＡＤ６７、グルタミン酸デカルボキシラーゼアイソフォーム６７。

【図14-1】図１４は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの減少、ｐＤｙｎ発現細胞数の減少、およびＥｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ突然変異体の成体前前頭皮質におけるＤ２受容体発現細胞数の増加を示すデータの例を提供する。図１４ａ〜ｈは、Ｅｖｆｌ、ＧＡＤ６７、ｐＤｙｎおよびＤ２受容体プローブを使用した、野生型同腹仔コントロール（ｗｔ）と比較されるＥｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ突然変異体からの出生６０日後の冠状切片に対するＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを提供する。図１８ｉは、出生６０日後の前前頭皮質におけるＧＡＤ６７発現介在ニューロン、ｐＤｙｎおよびＤ２受容体発現細胞の数の定量化を提供する。ｗｔ（黄色）Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ（青色）。

【図14-2】図１４は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの減少、ｐＤｙｎ発現細胞数の減少、およびＥｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ突然変異体の成体前前頭皮質におけるＤ２受容体発現細胞数の増加を示すデータの例を提供する。図１４ａ〜ｈは、Ｅｖｆｌ、ＧＡＤ６７、ｐＤｙｎおよびＤ２受容体プローブを使用した、野生型同腹仔コントロール（ｗｔ）と比較されるＥｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ突然変異体からの出生６０日後の冠状切片に対するＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを提供する。図１８ｉは、出生６０日後の前前頭皮質におけるＧＡＤ６７発現介在ニューロン、ｐＤｙｎおよびＤ２受容体発現細胞の数の定量化を提供する。ｗｔ（黄色）Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ（青色）。

【図15】図１５は、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ突然変異体がコカイン投与されるチャンバーで野生型同腹仔（Ｅｖｆｌ＋／＋）より多くの時間を費やすことを示すデータの例を提供する。１つのチャンバー中で５ｍｇ／ｋｇのコカインを使用し、別のチャンバー中で食塩水を使用する、公平な条件付け場所嗜好性アッセイは、コカインを求めて費やされた時間を比較する。予備試験状況において、マウスは、遺伝子型にかかわらず、コカイン側に対する嗜好性を示さない。コカインと食塩水を交互に行った４日後、野生型の同腹仔コントロール、Ｅｖｆｌ＋／＋（黄色）と比較して、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ突然変異体（青色）は、試験日にコカインに対する嗜好性を示した。各遺伝子型ｎ＝５、^＊ｐ＝０．０２３。

【図16】図１６は、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ前前頭皮質におけるコカインに対するＧＡＢＡ作動性介在ニューロン反応のモデルを提供する。ＰＦＣ ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、Ｄ２ファミリー受容体を発現することが示されている（Ｍｒｚｌｊａｋら、１９９６）。Ｄ２受容体に結合するドーパミンは、ＧＡＢＡ放出を結果として生じ、錐体ニューロンによる発火の阻害を増加させる（ＢｕｎｎｅｙおよびＡｇｈａｊａｎｉａｎ，１９７６）。ＧＡＢＡはドーパミン放出を減少させることができ（Ｄｅｗｅｙら１９９２）、このようにして自己調節メカニズムを提供する。Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳマウスでは、ＰＦＣ ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数は減少し（図１４）、ＧＡＢＡレベルを低下させる。これは、ドーパミンレベル増加、および介在ニューロンの分集団におけるＤ２Ｒの発現増加を結果として生じる。しかしながら、ＰＦＣ介在ニューロンのこの分集団からの増加したＧＡＢＡ放出が、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ ＰＦＣにおいて観察されたＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの喪失を克服するのに十分であることはありそうもない。したがって、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ ＰＦＣがＧＡＢＡの減少に起因する、より高いレベルの細胞外ドーパミンを含むことが提案されている。ドーパミンの再取込みを防ぐことによって、コカイン処理は、ｗｔコントロールマウスと比較して、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳにおいて細胞外のドーパミン濃度をさらに増加させるであろう。このモデルにより、即時反応に要するコカイン濃度、またはコカイン条件付け嗜好性を誘発するためのコカイン濃度が、ｗｔコントロールよりもＥｖｆｌ ＴＳ／ＴＳマウスにおいてより低いことが予測される。これはＤｅｗｅｙら（１９９７）（コカインの３時間前に投与されたＧＡＢＡアゴニストＧＶＧが自発運動反応を減ずることができると報告した）によるものである。図１７において示される予備データは、ＣＰＰアッセイにおいて、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ突然変異体がコカインチャンバーに対してより高い嗜好性を示すことを支持する。

【図17】図１７は、Ｄｌｘ５／６エンハンサーｅｉに対するＤｌｘおよびＭｅｃｐ２のＥｖｆ２依存性の強まりについて、別モデルを提供する。ＣＨＩＰデータは、野生型Ｅ１３．５ＭＧＥにおいて、ｅｉおよびｅｉｉがＤｌｘタンパク質によって結合されることを示す。簡潔に、ｅｉ部位だけがこのモデルにおいて描かれる。異なるメカニズムが可能である一方、このモデルは他のｅｉコピーがＭｅｃｐ２によって結合されるのに対し、１つの対立遺伝子がＤｌｘによって結合されることを提案する。Ｍｅｃｐ２ヌルマウスは、Ｄｌｘ’５および６の発現増加を示し、ｅｉに結合したＭｅｃｐ２がＤｌｘ５発現を抑制するという考えを支持する（Ｈｏｒｉｋｅら、２００５）。Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ突然変異体において、Ｍｅｃｐ２ヌルアッセイで見出だされたものに類似して、Ｄｌｘ５およびＤｌｘ６は両方とも発現増加される。ＣＨＩＰ実験は、Ｅｖｆ２の喪失がｅｉへのＤｌｘ補充の喪失を結果として生じることを示す。このモデルは、Ｅｖｆ２（ＴＳ）の早期終止（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）が１つの対立遺伝子上のｅｉへのＤｌｘ補充および他のｅｉ対立遺伝子へのＭｅｃｐ２補充を防ぐことを提案する。このモデルは以下を示唆する：１．Ｅｖｆ２ ＲＮＡは、ポジティブおよびネガティブ転写調節因子の補充を介してエンハンサー活性を調節する。２．Ｄｌｘタンパク質は、Ｍｅｃｐ２結合を阻害することによりＤｌｘ５／６ｅｉおよびｅｉｉにより調節される転写を促進する。３．Ｍｅｃｐ２は、Ｄｌｘ転写因子の結合を防ぐことによりＤｌｘ５／６遺伝子発現を抑制する。

【図18】図１８は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達に重要なＥｖｆ依存性相互作用の例を提供する。腹側前脳正中によって分泌されるＳｈｈは、胚の脳室および脳室下帯におけるＤｌｘ１／２の発現を引き起こす。Ｄｌｘ１／２は、Ｎｏｔｃｈおよびニューロピリン２を抑制し、Ｄｌｘ５／６およびＥｖｆを活性化する。Ｅｖｆ２はＤｌｘ１／２および／またはＭｅｃｐ２を補充し、Ｄｌｘ５／６遺伝子間エンハンサーによってＤｌｘ５／６の調節を平衡に保つ。ＤｌｘおよびＥｖｆによる正確な調節制御は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達のいくつかの態様に重要である。

【図19】図１９は、仮定的レスキュー（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｃｕｅ）に関するスキームの概略図の代表例を提供する。Ｅｖｆｌ（Ｅｖｆ遺伝子のエクソン３および４）を含み、Ｄｌｘ５／６エンハンサー調節配列（赤色）によって稼動されるＢＡＣは、タモキシフェン処置が３倍ポリＡ部位の排除を引き起こし、Ｅｖｆｌの発現を可能とするように構築される。Ｄｌｘ６は，ＥＲ−ｃｒｅ（タモキシフェン誘導性ｅｒｅ）ＩＲＥＳ−ＧＦＰにより置換されｔｅトランスジェニック系統のマーキングを可能とする。

【図20】図２０は、インビボでの仮定的なＥｖｆｌ不活性化に関するスキームを提供する。ＬｏｘＰ部位は、エクソン３に導入された５’および３’となる。エクソンの仮定的削除は、転写されるｅｖｆｌの５’機能領域の喪失を結果として生じる。Ｅｖｆｌ ｆｌｏｘｅｄｅｘ３ ＸＲＯＳＡ−ＥＲ−ｃｒｅマウスは、タモキシフェンで異なる時（Ｅ９．５、Ｅ１７．５、Ｐ３０）に処置されエクソン３の排除を引き起こす。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、ＥｖｆｌまたはＥｖｆ２等のＧＡＢＡ作動性機能の調節に関与する、非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の発現減少または排除を結果として生じる変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。そのような変異は、ＧＡＢＡ作動性活性の調節に関与する非機能性ｎｃＲＮＡの発現に対して提供することが可能なトランス遺伝子の使用を通じて導入されてもよい。本明細書において例証されたトランスジェニック非ヒト動物は、機能性Ｅｖｆ１および／またはＥｖｆ２の発現を防ぐＥｖｆ１またはＥｖｆ２のエクソン中の３倍ポリアデニル化転写停止部位を有する組換えコンストラクトを含む。また、開示される動物に用いられる方法および組成物が提供される。

【0015】

本発明についてさらに詳細に記述する前に、以下の用語が最初に定義される。

【0016】

重要な略語および用語：
本明細書において使用される略語のリストは以下の通りである：Ｓｈｈ、ソニックヘッジホッグ；Ｅｖｆ、胚性腹側前脳；ｎｃＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ；ｔｒｕｃＲＮＡ、転写調節超保存ＲＮＡ；Ｄｌｘ、脊椎動物ホメオドメインタンパク質メンバーのファミリー、ハエｄｌｌホメオドメインタンパク質のオーソログ；エンハンサー、方向と無関係に、遺伝子発現を離れたところから稼動するＤＮＡの領域；Ｅ１１．５〜Ｅ１２．５、受胎からの胚性段階における日数；Ｐ、出生後日数；ＭＧＥ、ＬＧＥ、ＣＧＥ、それぞれ、内側神経節隆起、外側神経節隆起、尾側神経節隆起；ＧＡＤ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ；ＳＶＺ、脳室下帯；ＶＺ、脳室帯域；ｑＲＴ−ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；ＧＡＢＡ、ガンマアミノ酪酸、脳において主要な抑制性伝達物質；Ｄ２、ドーパミン受容体２；ｐＤｙｎ、プロダイノルフィン（麻薬ペプチド）；ｍＯＴｕ、内側嗅結節；ＰＦＣ、前前頭皮質；ＧＷＡ、ゲノムワイド関連。

【0017】

本明細書において使用されるように、「非コードのＲＮＡ」（ｎｃＲＮＡｓ）は遺伝子調節、用量補正およびインプリンティングにおいて機能するあらゆるＲＮＡを指す。核における様々な機能に加えて、ｎｃＲＮＡは、ｍＲＮＡ安定性、翻訳効率およびタンパク質輸送を調節するために、細胞質において機能し得る。ｎｃＲＮＡのクラスは周知のグループを包含する：リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ翻訳調節遺伝子ＩＳファミリー）、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、小型干渉ＲＮＡ）、および核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡ修飾に関与する）。

【0018】

ＥＶＦ１およびＥＶＦ２
Ｅｖｆ−１およびＥｖｆ−２は、発達中の終脳においてＳｈｈによってＤｌｘ遺伝子で共調節され、選択的スプライシングおよび選択的転写開始から生成された長く（それぞれ２．７ｋｂおよび３．７ｋｂ）、ポリアデニル化された、非コーディングＲＮＡである（Ｋｏｈｔｚら、１９９８，ＫｏｈｔｚおよびＦｉｓｈｅｌｌ，２００４，Ｆｅｎｇら２００６）。Ｅｖｆ−２非コーディングＲＮＡ転写物は、超保存されたＤｌｘ５／６遺伝子間エンハンサー（ｅｉ）とオーバーラップし、またＤｌｘ２と複合体を形成してＤｌｘ５／６エンハンサーからの転写を活性化する。単鎖センスＥｖｆ２ＲＮＡが転写的に活性であり、５’ユニークな超保存領域が、Ｄｌｘホメオドメインタンパク質と共にＤｌｘ５／６エンハンサーの転写共活性化に必要且つ十分である。

【0019】

Ｅｖｆ２とＤｌｘ２との間の直接的な相互作用はいまだに同定されていないが、細胞株におけるＥｖｆ２ＲＮＡおよびＤｌｘ２タンパク質の複合体、組織抽出物、単離された胚細胞からの核における蛍光インサイチュ／免疫共局在が検出された（Ｆｅｎｇら、２００６，図６ａ〜ｃ）。理論によって拘束されることを意図するものではないが、そのような結果は、Ｅｖｆ２非コーディングＲＮＡが、発達の間にポジティブにＤｌｘ１／２活性を調節し得ることを示す。

【0020】

Ｅｖｆ−２（選択的スプライシングと同様、選択的転写開始に起因するＥｖｆ−１の形態）はｅｉから転写され、２つのＤｌｘ５／６のうち１つは以前にＺｅｒｕｃｈａらによって同定された遺伝子間領域を保存した（２０００）（Ｆｅｎｇら）。Ｄｌｘ５／６ｅｉは、他の重要な発達調節因子およびＤＮＡ結合タンパク質の近くに位置する、数百の超保存された配列のうちの１つである（Ｓａｎｔｉｎｉら２００３，Ｓｐｉｔｚら２００３，Ｂｅｊｅｒａｎｏら２００４，Ｂｏｆｆｅｌｌｉら２００４，Ｓａｂａｒｉｎａｄｈら２００４，Ｓａｎｄｅｌｉｎら２００４，Ｗｏｏｌｆｅら２００５）。これら超保存された領域の機能は現在知られていない。Ｄｌｘ５／６ｅｉの転写は、脊椎動物に保存されることが示されており、Ｅｖｆ−２の超保存領域が、ホメオドメインタンパク質Ｄｌｘ−２と共に協同して、標的およびホメオドメイン特異的方法でＤｌｘ５／６エンハンサーの活性を増加させることが示されている（Ｆｅｎｇら、２００６）。本明細書において開示されるように、Ｅｖｆ−１は類似の転写調節活性を呈する。本発明は、少なくとも一部分において、発達的に調節されるｎｃＲＮＡは、ホメオドメインタンパク質の転写活性を調節するためにトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）機能し得ることを提供する。

【0021】

Ｅｖｆ−１（Ｋｏｈｔｚら、１９９８）は、パターン化するタンパク質であるソニックヘッジホッグの下流標的である。Ｅｖｆｌは、発達的に調節される、２．７ｋｂのポリアデニル化ｎｃＲＮＡであり、マウスＤｌｘ−６遺伝子の転写された上流である（ＫｏｈｔｚおよびＦｉｓｈｅｌｌ，２００４）。Ｅｖｆ−１の非コーディングＲＮＡは、大きな３７．５ｋｂのイントロンによって分離された２つのエクソンによってコードされる。Ｅｖｆｌエクソン１は、Ｄｌｘ６遺伝子の４ｋｂ上流であり、保存されたエンハンサーｉｉ（ｅｉｉ）から８ｋｂ離れている（ＫｏｈｔｚおよびＦｉｓｈｅｌｌ，２００４）。Ｅｖｆｌエクソン１はＥｖｆ２エクソン３配列（図ｌ０Ａを参照）とオーバーラップし、Ｅｖｆ１発現は、脊椎動物前脳および鰓弓におけるＤｌｘ−６センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ（Ｌｕｉら、１９９７）発現に似る（ＫｏｈｔｚおよびＦｉｓｈｅｌｌ，２００４）。脊椎動物Ｄｌｘ遺伝子は、ショウジョウバエＤｉｓｔａｌｌｅｓｓ遺伝子（ｄｌｌ）（ＰａｎｇａｎｉｂａｎおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、２００２による総説）と関係するホメオドメインタンパク質ファミリーの一部である。マウスにおけるＤｌｘ遺伝子の遺伝的欠失は、発達の間のニューロン分化および遊走、ならびに頭蓋顔面および手足のパターニングにおけるその重要な役割を実証する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７ａ，１９９７ｂ，Ｄｅｐｅｗら、１９９９，Ａｃａｍｐｏｒａら、１９９９，Ｒｏｂｅｌｄｏら２００３）。Ｄｌｘ−１の喪失は、特異的なニューロン喪失およびてんかんに関係している（Ｃｏｂｏｓら２００５）。Ｄｌｘ遺伝子は両遺伝子群において発現し、保存された遺伝間エンハンサーは、Ｄｌｘ５／６およびＤｌｘ１／２ｌｏｃｉについて同定されている（Ｚｅｒｕｃｈａら２０００，Ｇｈａｎｅｍら２０００）。ゲルシフトおよびＣＨＩＰ解析によって示されるように、Ｄｌｘ−２は保存されたＤｌｘ５／６遺伝子間領域の配列に結合する（Ｚｅｒｕｃｈａら２０００，Ｚｈｏｕら２００４）。セマフォリン受容体、ニューロピリン２もまた、直接Ｄｌｘ１／２によって抑制されることが示されている（Ｌｅら２００７）。Ｅｖｆ−１発現は、Ｄｌｘ−６センスＲＮＡおよび以前に同定された腹側前脳および鰓弓において発現するアンチセンスＲＮＡ（Ｌｕｉら、１９９７）に非常によく似ている（ＫｏｈｔｚおよびＦｉｓｈｅｌｌ，２００４）。

【0022】

ＥｖｆｌおよびＥｖｆ２は、他の非コーディングＲＮＡとのいくつかの類似点を示す。例えば、Ｅｖｆ−２と以前に特徴づけられたｎｃＲＮＡ Ｈ１９（Ａｒｎｅｙ、２００３による総説）、Ａｉｒ（Ｓｌｅｕｔｅｌｓら、２００２）、ｒｏＸ（ＡｍｒｅｉｎおよびＡｘｅｌ，１９９７，Ｍｅｌｌｅｒら、１９９７）、ＳＲＡ（Ｌａｎｚら、１９９９）およびＮＲＳＥ（Ｋｕｗａｂｕｒａら、２００４）との類似性が明らかである。Ｈ１９およびＥｖｆ−２は、発現差異スクリーニングにおいて単離され、発達的に調節され、ポリアデニル化されスプライシングされる。それらのサイズは類似している（Ｈ１９＝２．３ｋｂ、Ｅｖｆ−２＝３．８ｋｂ）。Ｈ１９およびＥｖｆ−２の転写調節領域の両方は、異種間配列保存解析およびインビトロにおける翻訳による試験で２００ｂｐより大きなオープン・リーディング・フレームを含まない。Ｈ１９ｎｃＲＮＡはＩｇｆ２遺伝子座のインプリンティングにおいて役割を果たさないことが示されている一方、Ｈ１９プロモーター（Ｈ１９−ＤＨＲ）の近くに位置するＤＮＡエレメントは、Ｉｇｆ２遺伝子座のインプリンティングに影響を及ぼすことが見出された（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９９，Ｈａｒｋら２０００）。Ｈ１９ｎｃＲＮＡのトランス作用性効果は、腫瘍抑制に連結されているが、メカニズムは同定されていない。１０８ｋｂのポリアデニル化非スプライシングｎｃＲＮＡであるＡｉｒ、インプリンティング制御因子（ＩＣＥ）を介する転写およびＩｇｆ２ｒプロモーターへのアンチセンス転写の関係（Ｗｕｔｚら２００１，Ｚｗａｒｔら２００１）は、Ｅｖｆ−２、Ｄｌｘ５／６エンハンサーおよびＤｌｘ−６プロモーター間の関係に類似し得る。ＡｉｒのプロモーターはＩＣＥ因子とオーバーラップし、Ａｉｒの早期の転写終結は、領域における３つの遺伝子（それらのうち２つはＡｉｒとオーバーラップしていない）のサイレンシングを結果として生じる（Ｓｌｅｕｔｅｌｓら２００２）。ｒｏＸ ＲＮＡのショウジョウバエにおけるＸ染色体の転写を活性化する能力と、ｒｏＸ ＤＮＡの活性化のための染色体エントリーポイント（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｐｏｉｎｔ）としてはたらく能力は、Ｅｖｆ−２とメカニズム的に類似し得る。トランス作用性ｒｏＸ ｎｃＲＮＡのＤＮＡ標的特異性はいまだに見出されていないが、短い２１７ｂｐ ｒｏＸＩ ＤＮＡ断片は異所性のクロマチンのエントリー部位を産生するには十分である（Ｋａｇｅｙａｍａら２００１）。ｒｏＸ１ ＤＮＡによる補充はｒｏＸ１ ｎｃＲＮＡに非依存的であった（Ｋａｇｅｙａｍａら２０００）。本明細書の実施例においてより詳細に示されるように、Ｅｖｆ２転写は、Ｄｌｘ５／６エンハンサー配列にＤｌｘタンパク質を補充するために重要である。したがって、Ｄｌｘ５／６エンハンサー上でのＥｖｆ−２／Ｄｌｘ−２複合体は、特異的染色体エントリーポイントとして同様に機能し得る。Ｅｖｆ−２の特異性および共活性因子機能は、ＳＲＡ（ステロイドホルモン受容体活性を特異的に共活性化するｎｃＲＮＡ）に類似する（Ｌａｎｚら、１９９９）。さらに最近では、ＳＲＡ ｎｃＲＮＡ−ＳＬＩＲＰタンパク質相互作用が染色体上の核受容体結合部位へと因子を補充することが示された（Ｈａｔｃｈｅｌｌら、２００６）。最後に、ＮＲＳＥは、ニューロン細胞の運命選択に関係し、直接的に転写因子複合体ＮＲＥＳＴと相互作用する低分子二重鎖ＲＮＡであり（Ｋｕｗａｂｕｒａら、２００４）、Ｅｖｆ２と機能的な類似性を呈する。この提案の実験は、Ｅｖｆ−１が、Ｅｖｆ２のように、Ｄｌｘ５／６領域のＤｌｘ補充にとって重要かどうか検討するであろう。

【0023】

生物学的プロセスでのＲＮＡに関する新たな役割の承認を得ることに類似しているのは、二重の機能が単一の分子に帰し得るという考えである。この考えは、遺伝子配列がＤＮＡおよびＲＮＡの両方のレベルで機能し得る、Ｈ１９、Ａｉｒ、ｒｏＸおよびＥｖｆ２の例を見る場合だけでなく、転写因子の作用においても妥当である。ＤＮＡおよびＲＮＡに明確に異なる役割を結び付ける転写因子のレポートが報告された（ＣａｓｓｉｄａｙおよびＭａｈｅｒによる総説，２００２）。実証された（さらに仮定された）この３つの例は以下を包含する：５Ｓ ｒＤＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡの両方に結合する、ジンクフィンガー含有転写因子、ＴＦＩＩＩＡ（Ｅｎｇｅｌｋｅら、１９８０，Ｃｌｅｍｅｎｓら、１９９３）、発達遺伝子を調節し、ｔｒａ−２ ｍＲＮＡ３’ＵＴＲに結合する別のジンクフィンガー転写因子、ｔｒａ−１（Ｇｒａｖｅｓら、１９９９）、および発達遺伝子を調節し、ｃａｄ ｍＲＮＡ３’ＵＴＲに結合することによってｃａｄ ｍＲＮＡ翻訳を抑制する、ホメオドメイン含有転写因子、バイコイド（ＤｕｂｎａｕおよびＳｔｒｕｈｌ １９９６）。我々の研究において、我々は、Ｄｌｘ５／６エンハンサーに結合し、活性化すると知られているＤｌｘ−２、ホメオドメイン含有転写因子が、Ｅｖｆ−１またはＥｖｆ−２ ｎｃＲＮＡと協同し、結果としてＤｌｘ５／６エンハンサー活性を増加することを示す。しかしながら、Ｅｖｆ−２ ＲＮＡおよびＤｌｘ−２タンパク質間の直接の相互作用は見つかっていない。核内の２つの濃縮スポットにおけるＥｖｆ−２／Ｄｌｘ−２複合体の存在は、Ｄｌｘ−２転写活性に対するＥｖｆ−２ ｎｃＲＮＡの直接の役割を支持する。本明細書において提供されるクロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）データは、Ｅｖｆ２欠損マウスにおいては、Ｄｌｘタンパク質がｅｉとｅｉｉにインビボで補充されないことを示す。しかしながら、Ｅｖｆｌ ＲＮＡ／タンパク質複合体、および転写因子補充に対するＥｖｆｌ喪失の影響は、いまだ行われていない。

【0024】

したがって、標的特異的転写調節はホメオドメインの転写調節に共通のメカニズムを提供し得る。７ＳＫ ｓｎＲＮＡ（Ｙａｎｇら２００１，Ｎｇｕｙｅｎら２００１）および６Ｓ ＲＮＡ（Ｍｏｎｔｚｋａら２０００）が、ＲＮＡポリメラーゼ活性ならびにショウジョウバエ生殖細胞において極細胞顆粒（ｐｇｃ）ｎｃＲＮＡによるＲＮＡｐｏｌＩＩＩ依存的転写の抑制を調整することによって転写に影響するという報告は、ＲＮＡが一般的なメカニズムを通して転写に影響し得ることを示す。７ＳＫ ｓｎＲＮＡ、６Ｓ ＲＮＡおよびｐｇｃ ｎｃＲＮＡと異なり、Ｅｖｆｓは、ＲＮＡポリメラーゼとの相互作用によって一般的な転写メカニズムに影響することによるのではなく、発達的に調節されたホメオドメインタンパク質との協同および複合体形成によって転写活性に影響する、発達的に調節されたｎｃＲＮＡである。したがって、他の保存された非タンパクコーディング領域およびエンハンサー配列は転写されて、自己活性化および転写因子複合体形成が可能なポリアデニル化ｎｃＲＮＡを生成し得る。理論によって限定されることを意図するものではないが、エンハンサー活性に対するＥｖｆ−２のトランス作用性効果は、進化的且つ機能的に保存されたＤｌｘ５／６エンハンサーｅｉ配列を備えたＥｖｆ−２の５つのプライム領域の同一性に基づいたものであり得る。保存された遺伝子間領域が他のＤｌｘ遺伝子座について同定されたのであれば（Ｇｈａｎｅｍら２００３）、ヒトゲノムの９７％は多数の推定上および実証された非コーディング転写物とコーディングせず、ヒトおよびフグのゲノム間の比較は、複数の保存された非コーディング配列を明らかにし（Ｇｉｌｌｉｇａｎら２００２）、本明細書において提供される結果は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方のレベルで、転写調節におけるエンハンサーおよび保存された非タンパク質コーディング配列の役割を考慮することが重要であろうということを示唆する。

【0025】

薬物依存中の異常なＧＡＢＡ作動性シグナリング
下記実施例においてより詳細に開示されるように、Ｅｖｆｌとして指定された単一の非コーディングＲＮＡは、コカインの影響に対する感受性増強に結びつくＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの発達を制御する。異常なドーパミンシグナリングが多くのコカイン研究の焦点であった一方で、ＧＡＢＡもコカイン乱用および／または依存の媒介に関与し得る。したがって、Ｅｖｆｌ発現の変化は、ドーパミンシグナリングおよびＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達の両方に作用し得る。異常なＧＡＢＡ伝達は、成体の脳において発達の間に決定された遺伝的、後天的、または環境要因に起因し得る。

【0026】

本明細書において提供されるように、非コーディングＲＮＡの乱れは、発達の間にＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの制御を調節し、成体の脳皮質におけるＧＡＢＡ伝達の低下を引き起こし得、コカインの影響に対する感受性増強を結果として生じる。

【0027】

下記実施例においてより詳細に開示されるように、Ｅｖｆ２として指定される単一の非コーディングＲＮＡは、前脳組織の発達においてホメオドメイン転写因子ＤＬＸ５およびＤＬＸ６の転写を調節し、成体の脳においてＧＡＢＡ依存性ニューロン回路の適切な形成に重要であり、様々な神経学的障害に関係し得る。したがって、Ｅｖｆ２の発現の変化は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達に影響し得る。

【0028】

突然変異体動物
したがって、１つの実施態様において、本発明は、非コーディングＲＮＡ ＥｖｆｌもしくはＥｖｆ２の発現減少、または機能性非コーディングＲＮＡ ＥｖｆｌもしくはＥｖｆ２の発現減少を結果として生じる変異を有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。これらの動物もＥｖｆｌ ＴＳ／ＴＳおよびＥｖｆ２ ＴＳ／ＴＳとそれぞれ呼ばれる。

【0029】

トランスジェニック動物は、対応する同じ種の野生型非ヒト動物に対して、機能性非コーディングＲＮＡ Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の発現減少を呈する。トランスジェニック非ヒト動物は、同じ種の野生型非ヒト動物によって呈されたものと比較して、例えば、少なくとも８０％の機能性Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の発現減少を呈する。他の実施態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、同じ種の野生型非ヒト動物によって呈されたものと比較して、少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の機能性Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の発現減少を呈する。他の実施態様において、同じ種の野生型の動物によって呈されたものと比較して、トランスジェニック動物は、機能性Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の検知可能な発現を呈さない。

【0030】

非コーディングＲＮＡの減少または排除された発現を結果として生じる変異は、Ｅｖｆ１および／もしくはＥｖｆ２の発現の減少または排除を結果として生じるか、または非機能性Ｅｖｆｌおよび／もしくはＥｖｆ２ ＲＮＡの発現を結果として生じるあらゆる変異であってもよい。変異は、ＥｖｆｌまたはＥｖｆ２のいずれかに関して減少されたかもしくは排除された発現、または非機能ＲＮＡの発現を結果として生じてもよいが、別のＲＮＡに関して機能性ＲＮＡの発現を可能としてもよい。例えば、非機能性Ｅｖｆ２ ＲＮＡの発現を結果として生じるが、しかしさらに機能性Ｅｖｆ１ ＲＮＡの発現を結果として生じる変異が導入されてもよい。

【0031】

Ｅｖｆｌ変異に関して、Ｅｖｆｌの発現を減少するかまたは排除するあらゆる変異が導入されてもよい。そのような変異は、Ｅｖｆｌの転写の減少かまたは排除を結果として生じるＥｖｆ配列の任意の部分へ導入されてもよい。Ｅｖｆｌ変異に関するある特定の実施態様において、変異はＥｖｆ配列の３番目のエクソンに挿入されてもよい。したがって、例えば、そのような変異は、Ｅｖｆ配列の最初の２００のヌクレオチド、またはＥｖｆｌ配列の最初の１７５、１５０、１２５、１００、もしくは５０ヌクレオチド内のゲノムの位置に挿入されてもよい。他の実施態様において、機能性Ｅｖｆ２ ＲＮＡ配列の発現を備える一方、Ｅｖｆｌの発現を減少するかまたは排除する変異が導入される。

【0032】

Ｅｖｆ２変異に関し、Ｅｖｆ２の発現を減少するかまたは排除するあらゆる変異が導入されてもよい。そのような変異は、Ｅｖｆ２転写の減少または排除を結果として生じるＥｖｆ配列の任意の部分へ導入されてもよい。１つの実施態様において、変異は、超保存されたＤｌｘ５／６ｅｉ領域の少なくとも１つの部分を欠損する、切断型ＲＮＡが転写されるようにＥｖｆ配列の領域へ導入されてもよい。他の実施態様において、Ｄｌｘ５／Ｄｌｘ６遺伝子間領域の超保存されたｅｉ領域を完全に欠損するＲＮＡ配列の転写を結果として生じる変異が導入されてもよい。そのような変異は、Ｅｖｆ２配列の発現を減少するか排除するために導入されてもよく、さらにＥｖｆｌの継続的な発現を可能としてもよい。例えば、そのような変異はＥｖｆ配列のエクソン１へ導入されてもよく、これはＥｖｆｌがＥｖｆ配列のエクソン３から開始して発現されることから、Ｅｖｆｌの継続的な発現を可能とするであろう。他の実施態様において、変異は、Ｅｖｆ２コーディング配列の最初の２００、１７５、１５０、１２５、または１００ヌクレオチドに導入されてもよい。

【0033】

本明細書において例証されるように、Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ突然変異体動物の特徴は、成体の脳においてＧＡＢＡ作動性になるニューロンにおいて、ＤＬＸおよびＭＥＣＰ２転写因子がＤＮＡ制御要素への結合を減少させたか、結合できなかったことを示す。加えて、低下したＧＡＤ６７ ＲＮＡおよび低減したシナプス抑制もまた、成体の海馬（高次脳機能にとって重要な領域）中のＥｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ成体において呈され得る。いくつかの実施態様において、Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ突然変異体は、成体段階のＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数の回復を実証し、ＧＡＢＡ作動性回復が可能であることを示す。また、本明細書において提供されるデータは、ＭＥＣＰ２、神経伝達されたＧＡＢＡ、自閉症障害、および非コーディングＲＮＡ制御の間のリンクを提供する。また、本明細書において提供されるデータは、ＭＥＣＰ２、神経伝達されたＧＡＢＡ、気分障害、および非コーディングＲＮＡ制御の間のリンクを提供する。

【0034】

したがって、１つの実施態様において、本発明は、不完全なＧＡＢＡ神経伝達を有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。不完全なＧＡＢＡ神経伝達は、ＧＡＢＡ神経伝達に影響する任意の変異の結果であり得るが、例証される動物は、組換え核酸コンストラクトの使用を通じて改変された。

【0035】

１つの実施態様において、本発明は、転写活性を有するポリアデニル化非コーディングＲＮＡを提供する。そのようなポリアデニル化非コードディングＲＮＡは、Ｅｖｆｌおよびその選択的スプライシングされた形態のＥｖｆ２を含む。

【0036】

別の実施態様において、ＥｖｆｌおよびＥｖｆ２の突然変異体マウスにより本明細書中に開示される研究は、ポリアデニル化非コーディングＲＮＡが、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達および成体脳回路を制御する能力を実証する。

【0037】

したがって、突然変異体マウスモデルは、薬物感受性に対するＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆体の胚性調節の関連を支持する。いくつかの実施態様において、このマウスモデルは、Ｅｖｆｌの発現を減少または排除する変異を含む。そのような突然変異体は、ニコチンまたはコカインへの依存等の薬物依存障害の処置において使用される薬剤の治療的発見のためのモデルを提供し得る。本発明は、発達の間のポリアデニル化非コーディングＲＮＡにおける単一の変化が遺伝子発現を制御し、脳回路のＧＡＢＡ依存性制御に影響し、最終的には薬物乱用および依存に影響するメカニズムを提供する。そのようなメカニズムは、発達の間の薬物使用に対する素因がどのように決定され得るかを理解するためのモデル動物を提供するが、単独またはゲノムワイド関連研究と組み合わせて使用して、ヒトにおける薬物乱用および依存に対する素因遺伝子座を同定してもよい。

【0038】

したがって、別の実施態様において、本発明は、動物の脳の同定された領域におけるＥｖｆｌ非コーディングＲＮＡの発現を減少または排除したトランスジェニック非ヒト動物を提供する。Ｅｖｆｌ発現は、モデル動物における内側嗅結節（ｍＯＴｕ）、側坐核および／または前前頭皮質（ＰＦＣ）等の任意の脳組織において減少または排除され得る。いくつかの実施態様において、Ｅｖｆｌ発現は、少なくともｍＯＴｕおよびＰＦＣ組織で減少または排除され、これは、精神刺激薬物反応および依存の調節に関与する成体能領域に一致する。

【0039】

上述のように、Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２配列の発現は、内因性配列の発現の変化が可能なあらゆる方法を用いて減少または排除され得る。１つの実施態様において、転写停止配列は、切断型ＲＮＡの発現を結果として生じるＥｖｆ配列中に導入されてもよい。いかなる転写停止配列も、本明細書中の動物モデルの製造において使用し得る。例えば、下記に例証されるように、トランスジェニック非ヒト動物は、Ｅｖｆｌ転写を防ぐＥｖｆｌ配列へと挿入された３倍ポリアデニル化停止配列を有する。例証されたマウスは、Ｅｖｆｌ突然変異体ＰＦＣがより少数のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを含んでおり、異常なドーパミンシグナリングを示す遺伝子を発現することを示す。ＰＦＣは、キュー（ｃｕｅｓ）の間、ヒトにおいて活性化され得、結果として薬物渇望を生じ、依存が薬物を得るために正常な前頭皮質機能を支配する可能性へと導く（Ｈｙｍａｎら２００６，Ｈｙｍａｎ ２００５）。ＰＦＣにおいてわずかに不均衡なＧＡＢＡ作動性機能を伴うヒト集団内の個体について、この転換（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）がより容易に起こり得、固体を薬物の依存特性に対してより感受性にし得る。

【0040】

したがって、ＰＦＣ（Ｅｖｆｌの場合のように）または海馬（Ｅｖｆ２の場合のように）においてＧＡＢＡ作動性シグナリングのバランスを調節することができる、非コーディングＲＮＡ配列は、依存および精神障害に対する遺伝的素因の同定に関するこれらのＲＮＡの潜在的な標的をコードする遺伝子を作製する。例えば、Ｅｖｆｌの成体発現、および可能性として他の同様の非コーディングＲＮＡは、薬物反応に重要な脳の領域におけるニューロン機能の調節に関する新規な、高度に特異的な標的を提供し得る。そのような標的は、多数のニューロン機能を干渉する神経伝達のアゴニスト／アンタゴニストよりもむしろ特異的ＲＮＡ標的を調節する薬物の開発のためのモデルを提供する。別の実施態様において、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数の非コーディングＲＮＡ制御は、胚のイベント等の特定の発達段階に制限され得る。Ｅｖｆｌ突然変異体動物は、薬物依存、統合失調症、学習または記憶障害の新規な処置および／または予防を同定するために、Ｅｖｆｌ非コーディングＲＮＡが、どのように脳においてＧＡＢＡ作動性シグナリングを制御するのかについての理解を提供する。

【0041】

したがって、１つの実施態様では、本明細書中に開示されるモデルが、薬物依存の予防または処置のための治療剤のスクリーニングおよび同定のために有用であり得る。覚醒剤は、異なる脳領域における神経伝達の正常な均衡を乱すとされている。コカインおよびアンフェタミン等の覚醒剤の作用の主要な機序は、ドーパミン取込みまたは流出によるものであるが、複数の神経伝達のシステムは、それらの反応および依存に関与する。例えば、内側嗅結節（ｍＯＴｕ）、側坐核およびＰＦＣにおけるＧＡＢＡ作動性およびドーパミン受容性（ｄｏｐａｍｉｎｏｃｅｐｔｉｖｅ）シグナリングは、精神刺激薬物に対する反応に重要な役割を果たす。

【0042】

加えて、複数の相関性が、ヒト集団における薬物依存に対する遺伝が存在することをさらに支持する。ゲノムワイド関連（ＧＷＡ）スクリーニングは、薬物依存に対する遺伝的素因を与え得る具体的な遺伝子座の同定をし始めている。例えば、ＧＡＢＡ経路に関与する遺伝子の乱れは、ニコチン中毒用のＧＷＡスクリーニングを通じて同定された。（Ｂｉｅｒｕｔら２００６，Ｓａｃｃｏｎｅら２００６，Ｌｉら２００７）。これらの結果は、わずかに不均衡なＧＡＢＡ作動性シグナリングを有する個体が、薬物の報酬効果、および継続し得る依存の異なる側面により感受性であり得ることを示唆する。不均衡なＧＡＢＡがシナプス伝達にとって重要な受容体またはトランスポーターにおける変異に由来し得る一方、発達の間の細胞および分子イベントは、原因となり得るＧＡＢＡ作動性介在ニューロン（ｉｎｔｅｍｅｕｒｏｎｓ）の分集団の適切な発達を変化させ得る。

【0043】

改変された動物の製造方法
別の実施態様において、本発明は、機能性非コーディングＲＮＡ Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の発現減少または阻害を有する改変された非ヒト動物の調製のためのコンストラクトおよび方法を提供する。

【0044】

内因性非コーディングＲＮＡの発現を減少または排除するのに利用することができる任意の方法によって、非ヒト動物を改変することができる。そのような方法としては、ＧＡＢＡ作動性活性の調節に関与する機能性非コーディングＲＮＡ発現の減少または排除を結果として生じる突然変異誘発および形質転換方法を包含するが、これらに限定されない。１つの実施態様において、改変された非ヒト動物は、Ｅｖｆ配列中に、機能性非コーディングＲＮＡ、Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の発現を減少することが可能な変異を導入するためのＥｖｆｌまたはＥｖｆ２ターゲッティングＤＮＡコンストラクトを導入する形質転換方法を使用して製造される。

【0045】

本発明のトランスジェニック非ヒト動物、または野生型に対して、Ｅｖｆ１またはＥｖｆ２の発現減少を呈する任意のトランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物を遺伝子的に操作する様々な技術によって製造され得る。例えば、同じ種の対応する野生型の動物に対してＥｖｆ１および／またはＥｖｆ２発現減少を呈するトランスジェニック非ヒト動物を作製するため、Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２のターゲッティングベクターが最初に作出される。

【0046】

「Ｅｖｆｌターゲッティングベクター」および／または「Ｅｖｆ２ターゲッティングベクター」は、Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の一部、またはすべてを含む、オリゴヌクレオチド配列を指し、受容細胞内に内因性のＥｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２配列の少なくとも１つの対立遺伝子中へのターゲッティングベクターの相同組換えを可能とするのに十分である。ターゲッティングベクターは、ポジティブまたはネガティブな異種性の選択可能なマーカー遺伝子（例えばポジティブ選択遺伝子、ｎｅｏ）をさらに含んでもよい。ターゲッティングベクターは、一般に、Ｌｉｕ，ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３，４７６−４８４（２００３）に記載されるように、ラムダファージに基づいた組換え技術の（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）ベクターであってもよい。

【0047】

ランダム統合用のＤＮＡコンストラクトは、組換えを介在するための相同領域を包含する必要はない。相同組換えが望まれる場合、ＤＮＡコンストラクトは、所望の遺伝子改変を伴う少なくとも一部分の標的遺伝子を含み、標的遺伝子座に対する相同領域を包含するであろう。簡便には、ポジティブおよびネガティブ選択のためのマーカーが包含されてもよい。相同組換えによって標的とされた遺伝子改変を有する細胞を作出する方法は、当該技術において公知である。哺乳類細胞をトランスフェクトするための様々な技術については、Ｋｅｏｗｎら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５２７−５３７を参照。

【0048】

ＤＮＡコンストラクト調製において、Ｅｖｆ ＲＮＡ配列の発現の変化を可能とする任意の方法が使用され得る。いくつかの実施態様において、この方法は、Ｅｖｆ配列中への転写停止配列の挿入を含み、結果として切断型Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２配列の発現を生じる。そのような方法は、全長ＥｖｆｌまたはＥｖｆ２のいくつかの発現を可能とし得るが、この方法は、一般に、切断型ＥｖｆｌまたはＥｖｆ２配列等の切断型Ｅｖｆ配列である、トランスジェニック細胞において発現されたＥｖｆ配列の大半を結果として生じる。

【0049】

転写停止配列の挿入の使用を含む方法において、あらゆる転写停止配列がコンストラクトの調製において使用され得る。例えば、３倍ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）停止配列（ＴＳ）が、本明細書において開示される方法において使用され得る。加えて、そのような転写停止配列は、Ｅｖｆ配列のいかなる場所に挿入されて切断型Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２配列の発現を結果として生じ得る。

【0050】

本発明のいくつかの方法において、Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２ターゲッティングベクターは作出され、その後、非ヒト動物の受容細胞（野生型Ｅｖｆ１またはＥｖｆ２配列を含む）中へと導入されて処置された受容細胞を産生し得る。この導入は、受容細胞のゲノム中の少なくとも１つの野生型Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２配列へのベクターの相同組換えに好適な条件の下で行われてもよい。非ヒト動物は、上述したように、あらゆる好適な動物（例えばネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ、げっ歯動物およびヒツジ）であってもよいが、げっ歯動物が好ましい。より好ましくは、非ヒト動物はネズミまたはマウスである。受容細胞は、例えば胚幹細胞または卵母細胞もしくは接合子の細胞であってもよい。

【0051】

本発明のＥｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２ターゲッティングベクターは、遺伝子導入に好適な任意のインビボまたはエクスビボの手段によって受容細胞へ導入されてもよく、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、モノカチオニックリポソーム融合、ポリカチオニックリポソーム融合、原形質融合、インビボにおける電場の作製、ＤＮＡコーティング微粒子銃、組換え複製欠損ウイルスの注入、相同組換え、ウイルスベクターおよびネイキッドＤＮＡトランスファー、またはこれらのあらゆる組み合わせを包含するが、これらに限定されない。遺伝子導入に好適な組換えウイルスベクターは、レトロウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、サイトメガロウイルスおよびワクシニアウイルス等のウイルスのゲノムに由来するベクターを包含するが、これらに限定されない
そのような方法に従って、処置された受容細胞は、その後（例えば、胚盤胞腔への注入またはマイクロ注入によって）同じ種の非ヒト動物の胚盤胞へ導入されて、処理された胚盤胞を産生し得る。その後、処理された胚盤胞は、発現および後の子孫への生殖細胞系伝達のために、同じ種の偽妊娠非ヒト動物へ（例えば、移植によって）導入され得る。例えば、予定日まで処理された胚盤胞を発達させてもよく、それにより、偽妊娠の動物が相同組換えされたベクターを含む子孫を出産することを可能とし、ここで、子孫は、同じ種の対応する野生型の動物に対してＥｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の発現減少を呈し得る。そのようにすれば、ゲノムが内因性Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２配列における乱れを含むトランスジェニック非ヒト動物を同定することが可能であろう。同定されたトランスジェニック動物を、その後、他の創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）トランスジェニック動物と異種交差して、同じ種の対応する野生型の動物に対してＥｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２の発現減少を呈するヘテロ接合または同型接合の非ヒト動物を製造し得る。

【0052】

遺伝子導入用の受容細胞の１種としては、胚性未分化細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビトロ培養された着床前の胚から得られてもよい。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション等の標準的な技術によってか、またはレトロウイルスを介した形質導入によって効率的にＥＳ細胞へ導入し得る。結果として生じた形質転換されたＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物からの胚盤胞と結合し得る。その後、導入されたＥＳ細胞は、胚をコロニー化し、結果として生じるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。

【0053】

発明の中で使用される遺伝子コンストラクトを作成するため、当業者に周知である、組換えＤＮＡおよびクローニングの方法を利用してもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照）。この点に関して、Ｅｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２配列内の関連位置に簡便に位置する制限酵素部位を使用し、適切なＥｖｆｌおよび／またはＥｖｆ２配列を、ゲノムクローンから作出してもよい。あるいは、上記方法と組み合わせて、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の合成オリゴヌクレオチドおよび特異的系統（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ら、１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２）とを組み合わせて、単鎖環状ＤＮＡ分子を産生することができる、Ｍ１３もしくはファージミド等のベクターを使用するか、または、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）（Ｈｏら、１９８９，Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９；Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．ら、１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５４０４）の使用のいずれかを含む部位定方向突然変異技術を利用して、必要なヌクレオチド配列を作出してもよい。その後、適切なＥｖｆ配列は、直接単離され、クローニングされ、使用されてトランスジェニック動物を製造し得る。また、配列を用いて、再び本明細書に記載される技術を使用して、Ｅｖｆプロモーター以外の調節配列を利用するキメラ遺伝子コンストラクトを操作してもよい。その後、これらのキメラ遺伝子コンストラクトも、トランスジェニック動物の製造において使用することができる。

【0054】

薬物候補を同定する方法
別の実施態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、脳障害の予防または処置のための化合物の試験、より具体的には気分障害の処置のための化合物の試験に使用することができる。本明細書において用いられる気分障害は、人の気分の錯乱が、主要な根本的特徴であると仮定される、精神障害の診断および統計マニュアル（ＤＳＭ ＩＶ ＴＲ）分類体系における診断の１つのグループのうちのいずれか１つである。気分障害の２つのグループが広く認識され、区分はその人がかつて躁病または軽躁病のエピソードを持っていたかどうかに基づく。したがって、抑鬱障害のうち、最もよく知られ、最も研究されているものとして、以前は「躁鬱病」として知られ、躁病および鬱状態のエピソードの断続的な期間により説明されていた、一般に臨床的鬱病または大鬱病と呼ばれる大鬱病性障害（ＭＤＤ）、および双極性障害（ＢＤ）が存在する。

【0055】

別の実施態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、脳障害の予防または処置のための化合物の試験、より具体的には、自閉症スペクトル障害、依存性障害、ならびに統合失調症、てんかんおよびトゥーレット症候群等の他の精神障害の処置のための化合物の試験に使用することができる。

【0056】

一般に、トランスジェニック動物の使用に好適な薬物スクリーニングアッセイが公知である。例えば、米国特許番号第６，０２８，２４５および６，４５５，７５７を参照のこと。したがって、トランスジェニック動物は、ヒト脳障害のモデルシステムとして使用されてもよく、および／またはこれらの障害に関する細胞培養モデルとして使用され得るニューロン細胞株の作出に使用されてもよい。脳障害のためのトランスジェニック動物モデルシステムを試験基質として使用して、そのような障害の予防、進行の遅延、または処置において有効であり得る薬物、医薬品、治療剤および介入を同定し得る。治療剤は、全身または局所投与され得る。好適な経路としては、数種を例示するとすれば、経口、直腸、または腸管投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、脳内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射を含む非経口投与を包含し得る。処置に対する動物の反応は、所定の脳障害と関連する１つ以上の徴候の好転を評価することによりモニターされ得る。介入に関しては、障害のどんな側面も好転させるあらゆる処置が、治療的介入に対する候補と見なされるべきである。しかしながら、これらの障害のうちのどれにも関連した一連の病状を好転させる処置または管理体制が好ましいであろう。検査薬剤の用量は、用量反応曲線を得ることにより決定され得る。脳障害のためのトランスジェニック動物モデルシステムを、トランスジェニック動物が呈する障害の進行を悪化させ得る環境要因、薬物、医薬品および化学物質の同定における試験基質として使用してもよい。代替の実施態様において、本発明のトランスジェニック動物を使用して、培養内で試験基質として使用され得る細胞株を得、障害を低減する薬物および増強する薬物の両方を同定し得る。本発明のトランスジェニック動物に由来する初代培養物（例えば、海馬のニューロン）を利用してもよいが、継代細胞系を得ることもできる。トランスジェニック動物からの継代細胞系を得るために使用され得る技術の例は、Ｓｍａｌｌら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：６４２−６４８を参照。

【0057】

また、別の特定の実施態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、（１）候補薬剤の特異性を解析する；（２）薬物の副作用をモニタリングする；および、（３）そのような薬剤の長期的な影響（例えば補足効果、合併症等）を追跡するために候補治療剤のスクリーニングに有用であろう。

【0058】

さらなる別の実施態様において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、特にＧＡＢＡ合成に影響する薬剤の試験に使用することができる。さらなる別の実施態様において、非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞株は、検査薬の試験に使用して、特に成体脳組織においてＧＡＢＡ依存性のニューロン回路の形成に影響する薬剤を同定し得る。本明細書において使用される「検査薬」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する）、抗体（モノクローナルおよびポリクローナル、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片）、分子、化合物、抗生物質、薬物、またこれらの任意の組み合わせを包含する。Ｆａｂ断片は、抗体の１価の抗原結合性断片であり、パパイン消化によって産生される。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、抗体の二価の抗原結合性断片であり、ペプシン消化によって産生される。本発明の抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、当業者に周知の技術によって産生され得る。

【0059】

同定された薬剤は、薬物依存、統合失調症、自閉症スペクトル障害、気分障害（例えば鬱）、学習障害、行動障害等の神経障害の予防または処置用医薬の製造に使用することができる。

【0060】

実施態様は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、単なる例示であることが理解されるべきである。上記の検討およびこれらの実施例から、当業者は本質的な特質を理解することができ、その精神および範囲から外れることなく、本発明の実施態様に様々な変更および修正を加え、様々な使用および条件に適応させることができる。したがって、本発明の実施態様の様々な変更は、本明細書において示され、且つ記載されたものに加え、先の記載から当業者には明らかであろう。そのような変更も、添付の特許請求の範囲にあるように意図される。

【実施例】

【0061】

実施例１：Ｅｖｆ２突然変異体マウスの調製および特徴づけ
機能性非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をコードするゲノムの可能性が解明され始めたところである（Ｐｒａｓａｎｔｈら（２００７）およびＭａｔｔｉｃｋら（２００６）。多くのｎｃＲＮＡは低分子調節ＲＮＡのクラスに属するが、１つのサブセットの長いポリアデニル化ｎｃＲＮＡ（ｌｐｎｃＲＮＡ）はタンパク質パートナーと協同的に作用する（Ｓｈａｍｏｖｓｋｙら（２００６））。以前に、発達途中の終脳におけるソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナリングのｌｐｎｃＲＮＡ標的であるＥｖｆ２が、ＤＬＸホメオドメインタンパク質とトランス作用性の転写協同作用を呈し、神経幹細胞株においてＤｌｘ５／６エンハンサー活性を増加させることが見出された（Ｆｅｎｇら（２００６））。超保存されたＤｌｘ５／６の相互遺伝子ＤＮＡの調節要素の同定（Ｚｅｒｕｃｈａら（２０００）は、重要な発達調節因子または転写因子の近くの１，０００を超える超保存されたＤＮＡ配列の発見を導いた（Ｇｉｌｌｉｇａｎら（２００２），Ｓａｎｔｉｎｉら（２００３），およびＢｅｊｅｒａｎｏら（２００４））。転写の調節活性に必要且つ十分なＥｖｆ２のドメインは、Ｅｖｆ２ ＲＮＡの５’末端におけるこの超保存された配列中に存在する（Ｆｅｎｇら（２００６））。Ｅｖｆ２が、転写調節活性を有するという発見は（Ｆｅｎｇら（２００６））は、超保存されたＤＮＡ配列のサブセットが転写され機能的である可能性を高めた。最近、超保存されたｎｃＲＮＡが転写調節超保存ｎｃＲＮＡ（ｔｒｕｃＲＮＡ）の新たなクラスを構成する可能性を支持する、さらなる超保存脳ｌｐｎｃＲＮＡが同定された（Ｍｅｒｃｅｒら（２００８））。この研究において、我々は、Ｅｖｆ２ ｔｒｕｃＲＮＡが脳において主要な抑制性神経伝達物質であるＧＡＢＡを産生する、遺伝子調節および介在ニューロンの発達にとって重要であることを、我々の知る限り初めて見出した。

【0062】

脳における興奮および抑制間のバランスは、適切な機能にとって重要であり、２つの主要なクラスのニューロンによって保持される：刺激性投射ニューロンおよび抑制性局所回路介在ニューロンである。興奮は、神経伝達物質グルタミン酸によって主として媒介されるが、ＧＡＢＡは主として抑制を媒介する。最近、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの多くの調節的役割が同定された（Ｄｉ Ｃｒｉｓｔｏ（２００７））。ＧＡＢＡ調節回路の機能障害は、統合失調症、自閉症およびトゥーレット症候群ならびにてんかん等の、異なる精神障害に関係してきた。ヒト自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）Ｒｅｔｔ症候群のモデルである、メチルＣｐＧ結合タンパク質（Ｍｅｃｐ２）突然変異体マウス（Ｂｉｅｎｖｅｎｕら（２００６）、Ｍｏｒｅｔｔｉら（２００６）、およびＣｈａｈｒｏｕｒら（２００７））において、ＧＡＢＡ依存性の抑制性皮質活性が減少する（Ｄａｎｉら（２００５））。統合失調症患者の背外側前前頭皮質において、最も一貫した知見の１つは、ＧＡＢＡ合成の原因となる酵素であるＧＡＤ６７の減少である（Ｌｅｗｉｓら（２００５））。したがって、多数の一連の証拠は、様々な神経学的疾患におけるＧＡＢＡ作動性機能の異常を結び付ける。本明細書において、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンおよび成体脳回路の発達を制御し、このメカニズムを発達および疾患両方の研究の標的とする非コーディングＲＮＡが例証される。

【0063】

方法：
Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}マウスの作出
３倍ポリＡ配列（ＴＳ）を使用して、強い転写停止シグナルを提供するそれらの能力に関し、Ｅｖｆ２発現を変化させた。Ｅｖｆ２突然変異体の調製のため、ＴＳをＥｖｆエクソンｌ、Ｅｖｆエクソンｌの開始からの８４ヌクレオチドに挿入した。使用された隣接配列は以下の通りであった：

【0064】

【化1】

このＴＳの挿入位置を使用して、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスにおいて最も大きな可能性のあるＥｖｆ２転写物は、Ｆｅｎｇら２００６に定義されるように、転写調節ドメインを欠損する、８４ヌクレオチド長である。

【0065】

Ｅｖｆ２ターゲッティングコンストラクトを、以前に記載されるように大腸菌中でラムダファージ系組換え技術を使用して作出した（Ｌｉｕ，らＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３，４７６−４８４（２００３））。ハイフィデリティＴａｑ（ロッシュ）を使用して、ＢＡＣ ＤＮＡからおよそ５００ｂｐの相同性アームが（追加された制限部位により）ＰＣＲ増幅された。３つの断片ライゲーションを使用して、相同性アームはＰＬ２５３のＣｌａＩおよびＮｈｅＩ部位へと、それらの間に操作されたＨｉｎｄＩＩＩ部位によりクローニングされた。１６．Ｉ−ｋｂ領域（マウス染色体６上の６、８０９、６５１〜６、８２５、７４２位に対応する、ＮＣＢＩ集合体）は、組換え誘導性ＥＬ２５０細胞を使用して、回復プラスミドへのｐＢＡＣｅ３．６Ｍ８（Ｍ．Ｅｋｋｅｒ）から回復された（Ｌｉｕ，ら）。さらなるターゲッティングは、回復プラスミド上で行われた。ポリアデニル化ターゲッティングベクターは、ｆｌｏｘｅｄ−Ｎｅｏ−含有プラスミドであるＰＬ４５２において構築された。３倍ポリアデニル化シグナルは、ＰＬ４５２のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位へとクローニングされた。およそ５００ｂｐのターゲッティング相同性アームが、ｐｏｌｙＡ−ｆｌｏｘｅｄ−Ｎｅｏ挿入物のいずれか片方上に連続してクローニングされた。簡潔には、断片は上述のようにＰＣＲ増幅され、ＣｌａＩおよびＫｐｎＩ部位、またはＮｏｔＩおよびＳａｃＩＩ部位中へとクローニングされた。この３倍ｐｏｌｙＡ−ｆｌｏｘｅｄ−Ｎｅｏカセットは組換え誘発性ＥＬ２５０細胞を用いて、回復された１６．Ｉ−ｋｂ領域中へとターゲットティングされた。ターゲッティングの成功は、完成したコンストラクトの内部プローブを用いたサザンブロット解析により確認された（ＮＥＢｌｏｔ ｋｉｔ，ＮＥＢ）。

【0066】

マウスＥＳ細胞は、標準的手法を使用して、相同組換えによってターゲッティングされた。ＥＳ細胞におけるターゲッティングの成功は、サザンブロットにより確認され、５’および３’末端の両方における適切な相同組換えが立証された。プローブは、１６．Ｉ−ｋｂ相同性領域の外で作出された。５’プローブは、４９９ｂｐ（染色体６塩基６，８０８，４３０〜６，８０８，９２８）であり、３’プローブは、９９１ｂｐ（染色体６塩基６，８２５，８２１〜６，８２６，８１１）であった。野生型ＡｐａＬＩ部位は、染色体６塩基６，８２８，７６５および６，８１７，９１３に存在し、３’プローブとハイブリダイズする１０．８−ｋｂの断片を生じる。ＥＬ２５０細胞および組換えプラスミドＰＬ２５３およびＰＬ４５２はＮ．Ｃｏｐｅｌａｎｄによって提供された（ウェブサイトでワールドワイドウェブ上にも記載される：ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／Ｐｌａｓｍｉｄ．ａｓｐ）。

【0067】

Ｅｖｆ２ＴＳ（ｆｌｅｘｅｄ−Ｎｅｏ）ヘテロ接合体はサザンブロットによって立証され、２世代間ＥＩＩＡｃｒｅマウス（Ｊａｃｓｏｎ Ｌａｂｓ）と交差された。Ｎｅｏ排除は、ＰＣＲ（データ非表示）によって立証された。マウスを、混合された１２９／ＦＶＢ／Ｃ５７Ｂ１６バックグラウンド上で保持し、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って収容した。

【0068】

Ｅｖｆ２変異体の調製および立証に使用されたプライマー配列は以下の通りであった。遺伝子ターゲッティングについては、回復相同性アームに対する以下のプライマーを使用した：ＣＬａＩ（５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＡＡＴ ＣＧＡ ＴＣＧ ＧＣＴ ＴＡＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＴＴ Ｃ−３’；配列番号２）、Ｈｉｎｄｌｌｌ（５’−ＡＡＡ ＣＣＣ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＣＴＡ ＧＣＧ ＴＧＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＧＧＴ−３’；配列番号３）、Ｈｉｎｄｌｌｌ^＊（５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＴＣ ＡＧＴ ＧＣＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＡ ＧＧＡ ＣＡＴ−３’；配列番号４）、ＮｈｅＩ（５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＡＧＣ ＴＡＧ ＣＧＧ ＧＧＴ ＴＧＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＧ−３’；配列番号５）。ターゲッティングアームについて、我々は以下を使用した。ＳａｃＩＩ（５’−ＴＴＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＣＴ ＧＧＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＴＣ ＴＣＡ ＡＧＴ Ｃ−３’；配列番号６）、Ｎｏｔ１（５’−ＡＴＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＴＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＴＡＴ ＴＣＡ ＣＣＧ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＴＴ ＴＴＴ ＡＴＴ−３’；配列番号７）、ＣｌａＩ（５’−ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＴＣ ＧＡＴ ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＴ ＣＴＡ ＴＡＣ ＴＧＡ Ｇ−３’；配列番号８）、Ｋｐｎ（５’−ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＧＧ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＴＴ ＧＡＴ ＣＧＣ ＴＡＣ ＴＧ−３’；配列番号９）、５’ＥＳサザンプローブｍＥｖｆ５’．１（５’−ＴＧＧ ＴＧＡ ＡＧＣ ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＡＣ−３’；配列番号１０）およびｍＥｖｆ５’．２（５’−ＣＡＣ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＣＡ ＣＣＣ ＣＴＧ−３’；配列番号１１）、および３’サザンプローブｍＥｖＤ’．１（５’−ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＧＣ−３’；配列番号１２）およびｍＥｖｆ３’．１（５’−ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＴＴＧ ＧＴ−３’；配列番号１３）。

【0069】

定量的逆転写ＰＣＲについては、我々はＳＹＢＲグリーンと共に以下のプライマーを使用した。Ｅｖｆ２−Ｆ（０．２μＭ，５’−ＣＴＣ ＣＣＴ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＧＴ ＡＴＡ ＧＡＴ ＴＴＣ−３’；配列番号１４）、Ｅｖｆ２−Ｒ（０．２μＭ，５’−ＣＣＴ ＣＣＣ ＣＧＧ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＣＴ ＣＴＴ−３’；配列番号１５）、Ｄｌｘ２−Ｆ（０．１５μＭ，５’−ＣＣＣ ＴＡＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＴＣＧ Ｔ−３’；配列番号１６）、Ｄｌｘ２−Ｒ（０．１５μＭ，５’−ＴＣＧ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＴ−３’；配列番号１７）、Ｎｒｐ２−Ｆ（０．５ｐＭ，５’−ＡＣＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＡＧ ＴＧＡ ＧＡＡ−３’；配列番号１８）、Ｎｒｐ２−Ｒ（０．５μＭ，５’−ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＡＧ−３’；配列番号１９）、Ｇａｄ６７−Ｆ（０．４μＭ，５’−ＡＣＴ ＣＣＴ ＴＣＧ ＣＣＴ ＧＣＡ ＡＣＣ Ｔ−３’；配列番号２０）、Ｇａｄ６７−Ｒ（０．４μＭ，５’−ＣＧＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＴＡＴ ＣＡＴ ＡＣＧ Ｔ−３’；配列番号２１）、β−アクチン−Ｆ（０．３μＭ，５’−ＧＣＧ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＴＧ Ｃ−３’；配列番号２２）およびβ−アクチン−Ｒ（０．３μＭ，５’−ＴＣＧ ＴＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＡＡＣ Ｔ−３’；配列番号２３）。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲについて、我々は、以下のプライマーを使用した：Ｄｌｘ５プローブ（０．１μＭ，５’−ＣＡＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＣＴ ＴＣ−３’；配列番号２４）、Ｄｌｘ５−Ｆ（０．１μＭ，５’−ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＧＴ ＧＴＴ ＴＧＡ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＴ−３’；配列番号２５）、Ｄｌｘ５−Ｒ（０．１μＭ，５’−ＡＣＧ ＴＣＧ ＧＧＡ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＴＴ−３’；配列番号２６）、Ｄｌｘ６プローブ（０．１μＭ，５’−ＡＡＣ ＧＣＣ Ｔ ＡＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＡＣ Ａ−３’；配列番号２７）、Ｄｌｘ６−Ｆ（０．１μＭ，５’−ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＴ−３’；配列番号２８）、Ｄｌｘ６−Ｒ（０．１ｐＭ，５’−ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＧＣ ＡＧＡ ＴＴＣ Ｔ−３’；配列番号２９）、Ｅｖｆｌプローブ（０．１μＭ，５’−ＡＧＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＣＧＡ ＣＴＧ ＴＡＧ ＧＣＡ ＡＧＣ ＣＡＴ−３’；配列番号３０）、Ｅｖｆｌ−Ｆ（０．１μＭ，５’−ＧＣＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＧＴ−３’；配列番号：３１）、Ｅｖｆｌ−Ｒ（０．１μＭ，５’−ＧＣＣ ＴＴＴ ＣＡＧ ＡＡＣ ＴＡＧ ＡＡＧ ＧＧＡ ＴＴＴ ＡＡＡ−３’；配列番号３２）、β−アクチンプローブ（０．１μＭ，５’−ＣＡＡ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＴＴ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＣ Ｔ−３’；配列番号：３３）、β−アクチン−Ｆ（０．１μＭ，５’−ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＴＣＡ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＴＧ−３’；配列番号３４）およびβ−アクチン−Ｒ（０．１μＭ，５’−ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＡＧ Ａ−３’；配列番号３５）。定量的ＰＣＲについて、我々は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔと共に以下のプライマーを使用した：Ｉ−Ｆ（０．２５μＭ，５’−ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＡＴＴ ＧＣ−３’；配列番号３６）、Ｉ−Ｒ（０．２５μＭ，５’−ＴＧＴ ＣＣＣＡＧＣＴＴＣ ＣＴＡ ＴＣＡ ＣＣ−３’；配列番号３７）、２−Ｆ（０．２５μＭ，５’−ＴＧＧ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’；配列番号３８）、２−Ｒ（０．２５μＭ，５’−ＡＧＡ ＧＣＧ ＣＴＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＣＡ−３’；配列番号３９），３−Ｆ（０．１２μＭ，５’−ＣＣＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＧ−３’；配列番号４０）、３−Ｒ（０．５０μＭ，５’−ＴＣＣ ＣＣＡ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＡＡＴ−３’；配列番号４１），４−Ｆ（０．１０μＭ，５’−ＴＧＧ ＡＴＴ ＣＣＣＴＧＡ ＡＣＴ ＣＣＡ ＡＧ−３’；配列番号４２）。４−Ｒ（０．１０μＭ，５’−ＡＧＧ ＧＣＴ ＴＧＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＡＡ ＣＴ−３’；配列番号４３）、５−Ｆ（０．２４μＭ，５’−ＧＧＣ ＧＣＡ ＴＣＴ ＴＴＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＣＡ−３’；配列番号４４）、５−Ｒ（０．５０μＭ，５’−ＧＣＡ ＧＧＣ ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＧＧ ＡＴＧ ＣＴＡ−３’；配列番号４５）、６−Ｆ（１．０μＭ，５’−ＴＣＧ ＡＡＡ ＧＴＡ ＴＴＧ ＣＧＴ ＧＧＡ ＴＧ−３’；配列番号４６）、６−Ｒ（１．０μＭ，５’−ＧＴＧ ＴＧＴ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＣ−３’；配列番号４７）、７−Ｆ（０．２５μＭ，５’−ＧＧＣ ＧＴＧ ＴＣＡ ＧＣＡ ＣＣＴ ＧＡＴ ＴＴ−３’；配列番号４８）および７−Ｒ（０．２５μＭ，５’−ＧＣＣ ＡＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＣ− ３’；配列番号４９）。

【0070】

ＣｈＩＰ法
ＭＧＥ組織は、Ｅ１３５マウスＥｖｆ２^＋／＋またはＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}胚（１グループ当たり１０〜１５の胚）から採取した。組織を、ピペッティングにより単一細胞へと破壊し、７０μｍフィルターを通して回転（ｓｐｕｎ）した。ＤＮＡを、ローテーター上で１％のパラホルムアルデヒドで９０分間架橋し、その後、ＳＤＳ溶解緩衝溶液（１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．１）および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）およびプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（１７０μｇｍｌ^−１）、ペプスタチン（０．７μｇｍｌ^−１）、ロイペプチン（１０μｇｍｌ^−１）およびアプロチニン（１０μｇｍｌ^−１’）中に再懸濁した。架橋ＤＮＡを、Ｍｉｃｒｏｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ上で、パワー６で１０秒間ごとに６パルス超音波処理した。超音波で処理された混合物を遠心沈殿させ、上澄み液をＣｈＩＰに使用した。

【0071】

各免疫沈降条件について、全量１，０００μｌのＴＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．１）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ）およびプロテアーゼ阻害剤に対し、２０μｇのクロマチンを使用した。クロマチンを４℃でローテーター上であらかじめ純化した（ｐｒｅｃｌｅａｒｅｄ）。我々は、洗浄された７５μｌのプロテインＧ−アガロースビーズを１時間添加し、上澄み液を１０μｌのウサギ前免疫血清で１時間インキュベートした。その後、７５μｌのプロテインＧ−アガロースを１時間添加し、上澄み液を抗体条件およびウサギ前免疫条件について半分に分けた。クロマチンを４℃で免疫沈降させた。抗体（５μｇ）またはウサギ前免疫血清（２μｌ）を４時間添加し、その後１００μｌのプロテインＧ−アガロースを一晩添加した。プロテインＧ−アガロースビーズを、低塩緩衝溶液（０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ９．１）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回、５００ｍＭ ＮａＣｌで１回、ＬｉＣｌ緩衝溶液（０．２５Ｍ ＬｉＣｌ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．１）および１％ＩＧＥＰＡＬ）で２回、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．１）およびＩｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄した。その後、クロマチンを１００μｌの溶出緩衝溶液（１％ＳＤＳ、および０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３）で２回インキュベートすることにより、プロテインＧ−アガロースビーズから溶出した。０．５Ｍ ＮａＣｌ中６５℃で５時間インキュベートすることにより、ＤＮＡ架橋を逆転した。その後、１５ｍＭ ＥＤＴＡ／３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．１）および７５０μｇｍｌ^−１プロテイナーゼＫの半量を６５℃で１時間添加することにより、ＤＮＡをプロテイナーゼＫ処理した。非架橋ＤＮＡを、フェノール抽出し、グリコーゲンを用いてエタノール沈殿させた。Ｄｌｌに対するウサギ全抗体を実験室において産生した。元々記載されるように（Ｐａｎｇａｎｉｂａｎら、１９９５）、Ｄｌｘに対する全抗体を我々の実験室において作製し、広範囲にわたって特徴づけた（Ｆｅｎｇ，ら（２００６））。６２アミノ酸の蝶Ｄｌｌホメオドメイン含有断片に対し、ウサギにおいてＤｌｘに対する全抗体が産生され、親和性精製され、そしてウェスタンブロット（Ｄｌｌ断片およびゼブラフィッシュＤｌｘｌ、２、４および６、ならびにマウスＤｌｘ２）および免疫組織化学（神経外植片、胚前脳切片）により試験された。Ｄｌｘに対する全抗体は、Ｄｌｘ１、２、４および６を含むゼブラフィッシュＤｌｘファミリーメンバーを認識する（Ｆｅｎｇら（２００６））。

【0072】

モノクローナル抗Ｍｅｃｐ２抗体を、商業的に入手し（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）、前もって特徴づけた（Ｋｉｓｈｉら（２００４））。我々は、Ｍｅｃｐ２に対するこれらの抗体が、ウェスタン解析により成体嗅球抽出物中の２つのバンドのみに結合することを立証した（データは示されていない）。ＨＤＡＣ１に対する抗体はＳｉｇｍａから入手した。プライマーを、約−３．３２の標準曲線勾配を有する１００％有効である濃度まで最適化した。

【0073】

下記式を使用して、免疫沈降条件のＣｔ値とインプットクロマチンのＣｔ値とを比較することによって抗体の富化およびウサギ前免疫血清を決定した：２^{−（Ｃｔ（ＩＰ）−Ｃｔ（ｌｎｐｕｔ））}。一旦富化を計算すると、各抗体の相対的な富化を、Ｅｖｆ２^＋／＋およびＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ} ＥＩ３．５ ＭＧＥ組織について前免疫富化により抗体富化を除することによって計算した。

【0074】

免疫組織化学
脳組織を、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、１５％スクロースのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、その後３０％スクロースのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に継続的に一晩浸漬した。組織を、１８μｍにクライオスタットで切片を作製し、風乾して染色した。以前に公開されているように、インサイチュハイブリダイゼーションを行った（Ｆｅｎｇら（２００６））。免疫組織化学を、チラミド増幅を用いて行った（ＴＳＡ Ｋｉｔ＃１２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。組織を６５℃で２時間５０％ホルムアミド／５０％ ２×ＳＳＣにより処理し、その後２×ＳＳＣで洗浄した。細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のＰＢＳで透過処理し、この組織を１％過酸化水素のＰＢＳにおいて３０分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させた。組織を、１％ブロッキング溶液（成分Ｄ）でブロッキングし、ブロッキング溶液中の一次抗体、すなわちＧＡＢＡに対するウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ，１：５００）またはＤｌｌに対する全抗体（０．０１ｍｇ ｍｌ^−１，実験室において精製された）で一晩標識化した。組織をＰＢＳ中で洗浄し、その後、ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体に対するヤギ抗体である二次抗体（成分Ｃ，１：１００）中で１時間インキュベートした。組織をＰＢＳ中で洗浄し、実用性のあるチラミド溶液を１５分間適用した：０．００１５％過酸化水素（成分Ｆ）を有するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８染料（成分Ａ，１：１００）の増幅緩衝溶液（成分Ｅ）。最後に、核局在化についてＤＡＰＩ染色を適用した。

【0075】

ウェスタンブロット
Ｅｖｆ２^＋／＋およびＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ} Ｅ１３．５ ＭＯＥ組織をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝溶液中でホモジナイズし、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロースに転写し、そしてＤ．ＥｉｓｅｎｓｔａｔからのＤｌｘ２に対する一次ウサギ抗体（１：２，０００）でプローブし、その後ウサギペルオキシダーゼに対する二次抗体（１：５，０００，Ｓｉｇｍａ）でプローブした。ブロットを、β−アクチンに対するマウス抗体（１：２０，０００，ＡＣ−１５，Ｓｉｇｍａ）で再プローブした。バンドを、ケミルミネッセンスキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて可視化した。

【0076】

エレクトロポレーション
ＤＮＡを、０．０４％トリパンブルーを注入の間可視化用に用いて水中０．１μｇ μｌ^−１の濃度に溶解した。Ｅ１２．５ Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}胚は、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}雄および雌を交差して得、冷Ｌ−１５培地中で解剖した。頭を冷ＰＢＳ中に配置し、解剖顕微鏡の下で１．５μｌのＤＮＡを前脳の側脳室に注入した。方形波プロトコル（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸＣｅｌｌ）を用いたエレクトロポレーションは、１秒間の間隔を開けて、３０Ｖの５×５０ｍｓパルスを伝達した。各側の外側に配置され、その後、脳の左右の両側をエレクトロポレーションするために逆転されたエレクトロポレーションパドル（Ｐｒｏ ｔｅｃｈ）を用いて、各胚を２回エレクトロポレーションした。ＭＧＥを解剖し、神経細胞培養用培地（０．０２μｍフィルター（Ｎｕｎｃ）上のＢ−２７（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、２００μＭ Ｌ−グルタミン、０．１μｇ ｍｌ^−１ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１μｇ／ｍｌマイトマイシンＣを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養された。培養２４時間後、ＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のための４つのＭＧＥ外植片のプールから分離した。

【0077】

ＲＮＡ単離および逆転写
一対のＥ１３．５ ＭＧＥ組織からのトータルＲＮＡを単離し（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら（１９８７））、ＲＮＡＳＥを含有していないＤＮＡＳＥ Ｉ（ＮＥＢ）で処理し、ランダムヘキサマー（ＮＥＢ）およびＭＭｏＬ Ｖ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて（ｉｓｉｎｇ）逆転写した。

【0078】

定量的ＰＣＲ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３０４８８６）を、７５００Ｆａｓｔ ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上での全ての定量的ＣｈＩＰ ＰＣＲで使用した。以下のＰＣＲプログラムを使用した：ＡＭＰＥｒａｓｅ ＵＮＧ処理を５０℃で２分間、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ活性化を９５℃で１０分間、９５℃で１０秒間の変性を４０サイクル、アニーリングを５８℃で５秒間、および伸長を７２℃で３２秒間。各２５μｌの反応液には、５μｌの１：５０免疫沈降希釈液、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．０μｌのｄＮＴＰブレンド、０．２５μｌのＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧおよび０．２５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼが含まれていた。プライマーは、１００％有効であるか、または約−３．３２の標準曲線勾配を有する濃度まで最適化された。

【0079】

ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎ８０８０２２８）を、７５００ Ｆａｓｔ ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上の残りの定量的ＲＴ−ＰＣＲプライマーで使用した。以下のＰＣＲプログラムを使用した：ＡＭＰＥｒａｓｅ ＵＮＧ処理を５０℃で２分間、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ活性化を９５℃で１５分間、９５℃で３０秒間の変性を４０サイクルおよびアニーリング／伸長を５９℃で１分間。各２５μｌの反応液には、５０ｎｇのｃＤＮＡ、２．５μ１のｌ０ｘＰＣＲ緩衝溶液、５．０μ１の２５ｍＭ ＭｇＣ１_２、０．７５μ１のｄＡＴＰ、０．７５μ１のｄＧＴＰ、０．７５μ１のｄＣＴＰ、０．７５μ１のｄＵＴＰ、０．２５μ１のＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧおよび０．２５μ１のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼが含まれていた。

【0080】

Ｅｖｆ２^＋／＋およびＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ} Ｅ１３．５ ＭＧＥ組織の倍遺伝子発現は、以下の式を使用し、標的遺伝子のＣｔ値をコントロール遺伝子（β−アクチン）のＣｔ値と比較することにより決定した：２^{−（Ｃｔ（ＩＰ）−Ｃｔ（Ｉｎｐｕｔ））}。

【0081】

電気生理学
海馬横断スライス（３００μｍ）を３〜５か月齢のＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}マウスから調製した。スライスを、氷冷（約４℃）した酸素を含ませたＡＣＳＦ中で切断し、その後、１〜２時間回復させた後、３２〜３４℃に加熱し、９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２で飽和した溶液で継続的に灌流した、記録チャンバーに移動させた。標準的な細胞外溶液は、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣ１、１．２５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．３ｍＭ ＭｇＣ１_２、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ_３および１０ｍＭグルコースを含有した。スライシング溶液中のＭｇＣｌ_２の濃度は、２．０ｍＭまで高められ、ＣａＣｌ_２の濃度は１．４ｍＭまで低下した。ＧＡＢＡ作動性電流を単離するため、２０μＭ ＣＮＱＸおよび５０μＭ Ｄ−ＡＰ５を標準的ＡＣＳＦへ添加した。テトロドトキシン（２μＭ）を薬物溶液に添加し、最少ＩＰＳＣを単離した。

【0082】

全体細胞記録を、赤外線微分干渉顕微鏡を用いて、目視ガイダンスの下、ＣＡ１錐体ニューロンから得た。パッチピペットを、ホウケイ酸ガラスキャピラリーチュービング（Ａ−Ｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から引いた。パッチピペット用内部溶液は、１２０ｍＭメタンスルホン酸セシウム、１０ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＴＥＡ−Ｃｌ、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、０．３ｍＭ ＧＴＰおよび５ｍＭ ＱＸ−３１４（ｐＨ７．３〜７．４）を含有し、ＣｓＯＨによりモル浸透圧濃度２９０±１０ｍＯｓｍに調整した。

【0083】

ボルテージクランプ記録を、Ａｘｏｐａｔｃｈ−２００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。我々のすべての記録において、シリーズ抵抗は２２ＭΩ未満であり、８０％で補足された。記録されたシグナルを、５ｋＨｚで低域フィルターし、ＰＣＩ−ＭＩＯ−１６Ｅ−４ボード（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により１０ｋＨｚでデジタル化した。全てのデータを、Ｃ＋＋Ｂｕｉｌｄｅｒ５．０（Ｂｏｒｌａｎｄ）およびＮＩ ＤＡＱ６．５ドライバー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて特注ソフトウェアによりＰＣコンピューター上に保存した。

【0084】

誘発されたＩＰＳＣを、記録される細胞の１５０μｍ内（シャッファー側枝交連線維位置部位）の放射状層上に位置された双極Ｐｔ／Ｉｒ電極（２ｘ２５μｍ）により０．１〜０．０７Ｈｚで引き出した。各実験の開始時に、刺激強度を調整して、０．４〜０．２ｎＡの振幅によりＥＰＳＣを誘発した。誘発されたＩＰＳＣを、ＣＮＱＸおよびＤ−ＡＰ５を含有する溶液でＥＰＳＣをブロッキングした後、１０ｍＶの電圧ステップで−７０ｍＶ〜＋２０ｍＶの保持電位で記録した。

【0085】

自発的なＩＰＳＣをＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ ６．０．３ソフトウェア（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ）を用いて解析した。全てのイベントを、それらの動態に基づいて手作業で選択した。２５０〜４５０の個別のイベントを、各細胞について解析した。誘発されたＩＰＳＰの記録後の解析を、Ｃｌａｍｐｆｉｔ １０（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。全ての統計学的値を、Ｏｒｉｇｉｎ ８（ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により評価した。値を、平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示した。統計学的相違を、特に指示がない限りスチューデントｔ検定を用いてＰ＜０．０５で確立した。

【0086】

動物使用
マウスを、研究所のガイドラインに沿ってＩＡＣＵＣ承認のもとで飼育した。

【0087】

統計学的解析
統計学的な有意性を、各図面の凡例に^＊Ｐ＜〜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、および^＊＊＊Ｐ＜０．００１により示されるように、種々の異なる検定を用いて決定した。グラフ上のエラーバーはｓ．ｅ．ｍに対応する。

【0088】

結果：
インビボにおけるＥｖｆ２によるトランスおよびシス遺伝子調節
Ｅｖｆ２機能喪失マウスを開発して、インビボにおけるＥｖｆ２の役割を決定した。鍵となるＤｌｘ５／６ＤＮＡ調節要素とのＥｖｆ２のオーバーラップのために、転写終了部位は、ＤＮＡ断片の排除ではなく、挿入された（図１ａ）。マウスＢＡＣからのＤｌｘ５、Ｄｌｘ６およびＥｖｆ遺伝子に及ぶ１９．４ｋｂの断片を、サブクローニングした。その後、３倍ポリアデニル化シグナル（Ｓｏｒｉａｎｏ，（１９９９））をエクソン１へ導入した（Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}；図１ａ）。サザン解析は、胚性幹（ＥＳ）細胞株（図１ｂ）およびマウス（データ非表示）において正確にターゲッティングすることを立証した。Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体マウスは繁殖可能であり、少なくとも１年生存し、野生型同腹仔コントロールと形態学的に識別不可能であった（データ非表示）。インサイチュハイブリダイゼーション解析は、Ｅｖｆエクソン１への転写停止挿入が、胚性１３．５日（Ｅ１３．５）腹側終脳におけるＥｖｆ２発現を排除したが、Ｅｖｆ１またはＤｌｘ５発現を排除しなかったことを示した（図１ｅ〜ｈ）。Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}マウスからのＥ１３．５内側神経節隆起（ＭＧＥ）組織のリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲは、Ｄｌｘ６および５転写物が、それぞれ、８および２倍増加したことを示した（図１ｉ）。ＥｖｆｌおよびＤｌｘ５転写開始部位は、３倍ポリアデニル化シグナル挿入部位からほぼ等距離である（図１ａ）という事実にもかかわらず、Ｅｖｆ１転写ではなく、Ｄｌｘ５がＥｖｆ２突然変異体において影響を受けた（図１ｉ）。選択的転写効果は、３倍ポリアデニル化シグナル配列の挿入ではなく、Ｅｖｆ２喪失が原因であるという考えを支持した。３倍ポリアデニル化シグナル挿入が、観察された転写効果を引き起こす場合、Ｅｖｆｌを含む全てのＤｌｘ５／６エンハンサー活性が変化することが期待されるであろう。

【0089】

トランスおよびシス依存性Ｅｖｆ２ ＲＮＡ調節効果を識別するため、我々は２つの異なる濃度でＥ１２．Ｓ Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}脳へのＥｖｆ２エレクトロポレーションを行った（図１ｊ）。より低いＥｖｆ２濃度（１μｇ）において、Ｄｌｘ５発現は減少したが、Ｄｌｘ６およびＥｖｆｌ濃度は依然として変化しなかった。より高いＥｖｆ２濃度（２μｇ）において、Ｄｌｘ５とＤｌｘ６の両方の濃度が増加したが、Ｅｖｆｌの濃度は変わらなかった。Ｅｖｆ２が部分的にＤｌｘ５増加をレスキューする能力は、Ｅｖｆ２トランス調節メカニズムがＤｌｘ５転写制御に関与していることを示唆した。異所的に発現されたＥｖｆ２がＥｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体のＤｌｘ６増加をレスキューし得ないことは、Ｅｖｆ２が、トランスよりもむしろ、シスメカニズムにおいてアンチセンス競合を介してＤｌｘ６発現を低下させるという考えを支持した。より高いＥｖｆ２濃度（２μｇ）において、Ｄｌｘ５およびＤｌｘ６の両方の濃度が増加し、異所的に発現された場合、Ｅｖｆ２ ＲＮＡは、Ｄｌｘ５およびＤｌｘ６ｅｉおよびｅｉｉの転写活性化因子として機能し得るという、先に公開された結果を支持した（Ｆｅｎｇ，ら（２００６））。また、Ｅ１２．５脳へのＥｖｆ２ｓｉＲＮＡコンストラクトのエレクトロポレーションは、Ｄｌｘ５転写物のレベルを増加させ（データ非表示）、Ｅｖｆ２トランス作用性メカニズムがＤｌｘ５発現を調節するという考えをさらに支持した。併せて、これらのデータは、インビボにおいてトランスおよびシス調節メカニズムの両方を使用して、Ｅｖｆ２媒介性転写制御が濃度依存性であることを示唆した。

【0090】

遺伝子間エンハンサーへのＤＬＸおよびＭＥＣＰ２のＥｖｆ２補充
Ｅｖｆ２がインビボにおいてＤＬＸタンパク質と複合体を形成し、Ｃ１７細胞において標的およびホメオドメイン特異性の両方によりＤＬＸ活性の転写活性化補助因子として作用することが示されてきた（Ｆｅｎｇら（２００６））。加えて、Ｅｖｆ２がＤｌｘ５／６遺伝子間エンハンサーへＤＬＸタンパク質を補充するというモデルが提案されてきた。しかしながら、ここで、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、Ｅｖｆ２欠損マウス（図１ｉ）がＤｌｘ５およびＤｌｘ６転写物のレベルの増加を示したことを示しており、Ｅｖｆ２がインビボにおいて、ポジティブというよりもむしろネガティブな転写調節の役割を有することを示唆した。レスキュー実験（図１ｊ）は、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体におけるＤｌｘ６レベルの増加は、シスにおけるアンチセンス干渉の喪失に起因するが、トランスにおいては、Ｄｌｘ５転写に対してよりわずかな抑制効果が生じたことを示唆した。Ｅｖｆ２依存性転写制御のメカニズムをさらに調査するため、我々は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を使用し、続いて野生型およびＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体Ｅ１３．５ ＭＧＥクロマチンに関する定量的ＰＣＲ（ＣｈｉＰ−ＰＣＲ）を行って、Ｅｖｆ２がＤｌｘ５およびＤｌｘ６ｅｉおよび／またはｅｉｉへのＤＬＸの結合に影響を及ぼすかどうかを決定した。ＤＬＸ１および２に対する抗体を用いた定量的ＣｈＩＰアッセイは、以前に、Ｄｌｘ５／６ｅｉおよびｅｉｉを特異的結合部位として同定した（Ｚｈｏｕら（２００４））。野生型Ｅ１３．５ ＭＧＥにおいて、ＤＬＸタンパク質に対する全抗体（Ｆｅｎｇら（２００６）、Ｐａｎｇａｎｉｂａｎら（１９９５）、Ｋｏｈｔｚら（１９９８）、Ｋｏｈｔｚら（２００１）およびＦｅｎｇら（２００４））は、ＤＬＸタンパク質−Ｄｌｘ５／６エンハンサー（ｅｉおよびｅｉｉ）複合体を認識した（図２ｂ）。Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体クロマチンにおいて、ＤＬＸはｅｉおよびｅｉｉに結合せず（図２ｂ）、Ｅｖｆ２がＤｌｘ調節エンハンサーｅｉおよびｅｉｉへのＤＬＸタンパク質の補充に重要であることを示した。

【0091】

Ｄｌｘｌおよび２の両方を欠損するマウスが、Ｄｌｘ５およびＤｌｘ６の発現減少を示した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９７）という以前の報告を前提とすると、Ｄｌｘ５／６ｅｉおよびｅｉｉにＤＬＸタンパク質を補充することができないことが、Ｄｌｘ５／６転写を減少させることは予想されるであろう。しかしながら、Ｄｌｘ５／６転写物の数は増加し、Ｄｌｘ２発現は変わらなかった（図１ｉ）。転写抑制因子Ｍｅｃｐ２の喪失がＤｌｘ５の２倍の増加を成体前前頭皮質に生じ得るという報告（Ｈｏｒｉｋｅ，ら（２００５））によって、我々は、胚の脳におけるＥｖｆ２喪失がＤｌｘ５／６領域においてＭＥＣＰ２結合に影響し得るかどうか調査した。Ｅｖｆ２の欠如において、抑制されたクロマチンと関連するＤＮＡメチル結合タンパク質であるＭＥＣＰ２（Ｂｉｅｎｖｅｎｕら（２００６））は、ｅｉまたはｅｉｉに結合しなかった（図２ｃ）。ＭＥＣＰ２媒介性転写抑制について提案された１つのメカニズムは、クロマチン不活性化の原因であるＨＤＡＣ、ヒストンデアセチラーゼを補充するその能力である（Ｎａｎら（１９９７））。しかしながら、Ｅｖｆ２突然変異体におけるｅｉへのＭＥＣＰ２結合の喪失は、ｅｉへのＨＤＡＣ結合を変化させず（図２ｄ）、ＭＥＣＰ２結合は、この部位および発達段階での代替メカニズムを通して機能することを示唆した。ｅｉｉにおけるＭＥＣＰ２結合の喪失は、実際にＨＤＡＣ結合を減少させ、ｅｉおよびｅｉｉが、ＭＥＣＰ２機能がこれらの部位による転写調節活性にどのように作用するのかにおいて異なることを示唆した。部位２は、先に成体前前頭皮質におけるＭＥＣＰ２およびＨＤＡＣ結合部位として定義されていたが（Ｈｏｒｉｋｅら（２００５））、今回ＭＥＣＰ２は、発達の間部位２にわずかに結合した。加えて、ＨＤＡＣは、野生型の胚性ＭＧＥにおける部位２に結合したが、Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳ突然変異体における減少は、統計学的に有意ではなかった（図２ｄ）。したがって、Ｅｖｆ２突然変異体におけるＤｌｘ５発現増加は、ｅｉおよびｅｉｉへのＭＥＣＰ２結合の喪失、およびその後のｅｉｉからのＨＤＡＣ喪失に起因し得る。

【0092】

Ｅｖｆ２は、ｅｉとｅｉｉへＤＬＸおよびＭＥＣＰ２を補充し、Ｅｖｆ１ではなくＤｌｘ５等の特異的な近傍の遺伝子に対してトランスでＤｌｘ５／６エンハンサー活性に影響を及ぼし、シスにおいてアンチセンス阻害を通してＤｌｘ６転写を調節する（図１および２）。Ｄｌｘ５、Ｄｌｘ６およびＥｖｆ１が、どのようにｅｉとｅｉｉへのＤＬＸ結合の非存在下で転写されるのかという、いくつかの可能性が説明され得る。第１に、ＤＬＸ１Ｉ２は、単にＥｖｆ２非依存的にＤｌｘ５／６発現の初期の活性化にとって重要であり得る；その後のＤＬＸおよびＭＥＣＰ２によるＤｌｘ５／６レベルの調節は、その後、Ｅｖｆ２と関与し得る。第２に、他のＤＬＸ結合部位は、ＤＬＸ ｅｉ／ｅｉｉ相互作用の非存在下で補足し得る。第３に、ＤＬＸ１および２の主要な役割は、ＭＥＣＰ２がｅｉ／ｅｉｉに結合するのを防ぐことであり、直接の活性化因子としてではなく阻害を通して作用し得る。

【0093】

Ｅｖｆ２はＤＬＸまたはＭＥＣＰ２の核局在化を制御しなかった
Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳマウスにおけるｅｉおよびｅｉｉに結合するＤＬＸおよびＭＥＣＰ２タンパク質の欠如が、Ｅｖｆ２がタンパク質の安定性および／または核局在化に影響を及ぼす可能性を高めた。ＣＩ７神経細胞におけるＤＬＸ２タンパク質安定性に対するＥｖｆ２の影響に関する直接検定で、Ｅｖｆ２の存在下または非存在下において、共トランスフェクションに起因するＤＬＸ２タンパク質レベルは変化しなかった（図３ａ）。加えて、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異胚の神経節隆起におけるＤＬＸ２タンパク質レベルは、野生型のそれと比較して変化しなかった（図３ｂ）。Ｅｖｆ２突然変異核におけるＤＬＸタンパク質分布（図３ｆ〜ｈ）は、免疫蛍光可視化により、野生型におけるそれと区別できなかった（図３ｃ〜ｅ）。加えて、ＤＬＸ１／２の直接的な標的である、ニューロピリン２（Ｎｒｐ２）の転写物（Ｌｅ，ら（２００７））は、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体において変化しなかった（図１ｉ）。Ｅｖｆ２がＤＬＸタンパク質の安定性を制御している場合、Ｎｒｐ２を含む全てのＤＬＸ１／２活性が影響を受けるであろうが、そうではない。これらのデータは、Ｅｖｆ２が、ＤＬＸタンパク質を安定化するか、またはＤＬＸ核局在化に方向付けるというよりも、ｅｉおよびｅｉｉへのＤＬＸを補充するというメカニズムを支持する。

【0094】

次に、Ｅｖｆ２突然変異体におけるｅｉ／ｅｉｉへのＭＥＣＰ２結合の喪失が、核局在化に対するその効果に起因するかどうかを決定した。発達途中の脳におけるＭＥＣＰ２局在化の解析は、未熟なニューロンでは発現がほとんどみられず、それらが成熟するにつれてニューロンにおける発現増加の勾配を示す（Ｋｉｓｈｉら（２００４））。しかしながら、Ｅ１３．５ ＭＧＥにおける発現は報告されていない。Ｅｖｆ２およびＤＬＸが正常に発現するＥ１３．５ ＭＧＥ核におけるＭＥＣＰ２の解析は、不均一な、斑点状のＭＥＣＰ２局在化を示した（図３ｉ）。Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体において、ＭＥＣＰ２分布は野生型のそれと区別不可能であり（図３ｉ、ｊ）、Ｅｖｆ２突然変異体においてｅｉおよびｅｉｉへＭＥＣＰ２を補充できないことが、変更された細胞内局在に起因するものではないことを示した。

【0095】

Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}海馬介在ニューロン数の減少
ＤＬＸホメオドメインタンパク質ファミリーは、ショウジョウバエＤｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ遺伝子（ＤＵ）２７と関連がある。Ｄｌｘｌおよび２欠損マウスは、胚性ＭＧＥからの不完全な遊走の結果、皮質（約７５％）および海馬（約９０％）においてＧＡＢＡ作動性介在ニューロン（ｉｎｔｅｍｅｕｒｏｎｓ）の本質的な喪失を有する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）、Ｐｌｅａｓｕｒｅら（２０００）、およびＭａｒｉｎら（２００３））。Ｅｖｆ２の喪失は、海馬および歯状回へと遊走するであろうＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆体の大半の起源であるＥ１３．５ ＭＧＥにおけるＤｌｘ５／６発現およびＤＬＸ機能（図１および２）に影響を及ぼした（Ｐｌｅａｓｕｒｅら（２０００）およびＷｉｃｈｔｅｒｌｅら（２００１））。その後、Ｐ２海馬または歯状回におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達がＥｖｆ２欠損マウスに影響を及ぼすかどうかを調査した。

【0096】

腹側終脳／脳室下帯の発達におけるＥｖｆ２の発現は、Ｐ２脳室下帯および海馬へと遊走すると思われる細胞において、誕生まで持続した（図４ａ）。しかしながら、Ｅｖｆ２は、野生型の出生後２日目（Ｐ２）の海馬および歯状回、ならびに成体の脳室下帯または海馬において検出不可能であった（データ非表示）。グルタミン酸をＧＡＢＡに転換するために必要な酵素であるＧＡＤ６７に対するプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅｖｆ２突然変異体の歯状回ならびに海馬ＣＡ１およびＣＡ３層におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数が４０〜６５％減少したことを示した（図４ｂ〜ｄ）。ＧＡＢＡ免疫化学により示されるように、Ｅｖｆ２突然変異体におけるＧａｄ１（ＧＡＤ６７をコードするマウス遺伝子）の発現減少は、ＧＡＢＡにおける減少を伴った（図４ｅ、ｆ）。グルタミン酸作動性ニューロンに特異的に発現する遺伝子である、小胞性グルタミン酸トランスポーター１（ｖＧｌｕｔ１、Ｓｌｃ１７ａ７としても知られる）に対するインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}および野生型海馬におけるｖＧｌｕｔ１発現が類似することを示した（図４ｇ、ｈ）。加えて、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}ならびに野生型海馬および歯状回のＴＵＮＥＬ染色は、類似の細胞死のレベルを示した（図４ｉ〜ｋ）。併せて、これらのデータは、Ｅｖｆ２が適切なＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの発達に重要であり、運命形質転換（ｆａｔｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）または細胞死増加はこの減少が原因でないことを示した。

【0097】

Ｅｖｆ２は、成体脳ではなく胚においてＧａｄ１を調節した
ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの発達におけるＥｖｆ２の役割をさらに理解するため、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆物質が最初に生成されるＥ１３．５ ＭＧＥにおけるＧａｄ１ ＲＮＡレベルを解析した。野生型Ｅ１３．５ ＭＧＥと比較し、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}においてＧａｄ１転写レベルは−３０％に減少した（図５ａ）。Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ} Ｅ１２．５ ＭＧＥへのＥｖｆ２のエレクトロポレーションは、ｐｃＤＮＡコントロールと比較して、−３０％までＧａｄ１レベルを回復した（図５ｂ）。Ｅｖｆ２がＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体におけるＧａｄ１レベルの減少をレスキューする能力は、Ｅｖｆ２がトランス作用性メカニズムによってＧＡＤ６７転写を活性化することを示唆する。

【0098】

前脳において、Ｅｖｆ２発現は、胚および出生後初期の発達に限定され（図１ｃおよび４ａ）、成体脳室下帯や海馬では検出できなかった（データ非表示）。次に、我々は、出生後初期の海馬におけるＧａｌｌの胚性発現の減少およびＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの減少が成年期まで持続するかどうかという質問に達した。Ｐ６０において、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ} Ｇａｄ１転写レベルは、野生型におけるものに匹敵した（図５ｃ）。加えて、８か月齢のＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}ならびに野生型の海馬および歯状回におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数は、類似した（図５ｄ）。これは、Ｅｖｆ２突然変異体におけるＧａｄ１発現およびＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数が、Ｅｖｆ２下方制御のタイミングと一時的に関連する、出生後初期から２か月間の海馬の発達において、正常なレベルに時々回復したことを示唆する。

【0099】

Ｅｖｆ２ＴＳ／ＴＳのＳ錐体ニューロンにおけるシナプス抑制の減少
Ｄｌｘｌ^−／−マウスは、後のシナプス抑制の減少を結果として生じる、海馬ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの特定集団における喪失を示した（Ｃｏｂｏｓら（２００５））。Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}海馬の解析は、Ｄｌｘｌ^−／−マウスよりも出生後初期の海馬において合計ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの大きなパーセント喪失を示すのみならず（図４ｂ）（Ｃｏｂｏｓら（２００５））、ＧＡＢＡ作動性欠損はそれ以前に出現したことを示した。加えて、Ｄｌｘ１^−／−マウスと異なり、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}マウスは、老齢動物においてＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの回復を示した（図５ｃ、ｄ）。これにより我々は、明白な転写の回復にもかかわらず、より低いレベルの胚および周産期のＧａｄ１が、成人のシナプスの活性に対する長期的な影響を引き起こす場合があるかどうか、という質問に達した。

【0100】

この質問に答えるため、抑制シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}および野生型の同腹仔からのＣＡｌ錐体細胞において、Ｇａｄ１ ｍＲＮＡレベルが正常レベルに回復した場合、Ｐ６０より高齢で比較した。最初に、我々は自発的な抑制シナプス後電位（ｓＩＰＳＣ）および最小抑制シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）を解析した。グルタミン酸塩受容体アンタゴニスト（２０μＭ ６−シアノ−７−ジニトロキノキサリン−２，３ジオン（ＣＮＱＸ）および５０μＭ Ｄ（−）−２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（Ｄ−ＡＰ５））を含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中の外部抑制電流を最大限にするため、＋２０ｍＶで記録した。我々は、テトロドトキシン（２μＭ）を添加してｍＩＰＳＣを単離した（図６ａ、ｂ）。全てのマウスを２つの年齢グループに分けた：成体（３〜５か月）および１２か月齢未満のマウス。この２つの年齢グループによって、我々は、特異的な発達段階に起因し得るものから、突然変異体マウスおよび野生型マウスの間の任意の持続的な差を区別することができた。

【0101】

両方のＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}年齢グループが、ＣＡｌ錐体細胞中のｓＩＰＳＣイベント周波数の顕著な減少を示した。成体グループにおけるｓＩＰＳＣの平均周波数は、野生型のマウスにおけるものと比較し、突然変異体マウスにおいて４２％低かった。老齢マウスにおいて、突然変異体マウスにおけるｓＩＰＳＣイベント周波数は、野生型よりも３８％低かった。我々は、ｍＩＰＳＣイベント周波数の同様の顕著な減少を、野生型と比較した成体および老齢Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}グループにおいて観察した。累積確率プロットおよび対応するＫｏｉｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ統計学的解析は、さらに、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}マウスにおけるＩＰＳＣ周波数の減少を確認した（図６ｃ，ｄ）。これに対し、我々は、野生型および突然変異体マウス間でのｓＩＰＳＰ振幅またはｍＩＰＳＰ振幅の顕著な相違を見出さなかった。これは、Ｅｖｆ２がシナプス接触の特性または正常に分化した介在ニューロンにより形成されたＧＡＢＡ受容体を制御しなかったが、その代わり、ＣＡ１錐体ニューロン上に形成されたＧＡＢＡ作動性シナプスの数を減少させたことを示唆した。

【0102】

特に、ｓＩＰＳＣおよびｍＩＰＳＣの周波数は、成体マウスよりも老齢マウスにおいて低かったが、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}および野生型マウスの両方において同等の年齢依存性変化が生じた。したがって、突然変異体マウスおよび野生型マウス間での相違は持続した。同様に、ｓＩＰＳＣの振幅は、老齢マウスにおいて増加した。これらの年齢差は、以前に報告されたものと一致する（Ｐｏｔｉｅｒら（２００６）およびＸｕら（２００９））。

【0103】

ＣＡ１錐体ニューロンにおける抑制インプットが突然変異体において変化するかどうかをさらに決定するため、我々は、放線状層の刺激について、成体マウスグループからのＣＡ１錐体ニューロンにおいて誘発されたＩＰＳＣを計測した。最初に、我々は、必要に応じて刺激強度を調整しながら、−７０ｍＶにおいて振幅０．４〜０．２ｎＡで誘発された興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）を記録した。グルタミン酸アンタゴニストは、ＥＰＳＣをブロックし（上記参照）、一連の誘発されたＩＰＳＣは異なる保持電位において（−７０ｍＶ〜＋２０ｍＶ）記録された。これらの記録から構築されたＩ−Ｖプロットは、−７０ｍＶで誘発されたＥＰＳＣの振幅を正常化した（図６ｇ）。我々は、解析において類似の生理学的特徴を有する細胞のみを含めた（野生型ｎ＝５；突然変異体ｎ＝４）。誘発されたＩＰＳＣは、突然変異体マウスにおいて有意に小さく（Ｐ＜０．０１，ペアｔ検定）、さらに、ＣＡ１錐体ニューロンがより小さなＧＡＢＡ作動性神経支配を受けることを示唆した。

【0104】

最後に、我々は、自発的および誘発されたＩＰＳＣについて立ち上がりまたは減衰時間において顕著な変化を認めなかった。ＡＣＳＦの記録において追加される場合、０．２５ｍＭのピクロトキシンは、すべての我々の記録における自発的および誘発されたＩＰＳＣの両方を消滅させ、ＧＡＢＡ_Ａ受容体の進化を確認した。従って、老齢マウスにおけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの回復は、海馬における正常なシナプス抑制の回復を結果として生じなかった。

【0105】

考察：
これらの結果は、Ｅｖｆ２非コーディングＲＮＡが腹側前脳の発達における均衡のとれた遺伝子調節に重要であることを示す。Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体において、Ｄｌｘ６転写物は、８倍に増加した。Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体において増加したＤｌｘ６をレスキューし得ないということは、Ｄｌｘ６のＥｖｆ２アンチセンス転写阻害が、アンチセンスアニーリングよりもむしろ逆鎖転写を通じてシスに生じるという考えを支持する。より高いＥｖｆ２レベルがＤｌｘ６の減少ではなく増加を引き起こしたことを示しているデータ（図１ｊ）は、アンチセンスアニーリングメカニズムにより期待されるように、逆鎖転写阻害を支持する。３倍ポリアデニル化シグナル挿入がＥｖｆ２アンチセンス干渉の喪失よりもむしろ、Ｄｌｘ６転写の増加を結果として生じることを除外することはできないが、Ｅｖｆ１転写がＥｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体において影響されないままだったとすれば、３倍ポリアデニル化シグナル挿入はＤｌｘ５／６ｅｉまたはｅｉｉを乱すことはあり得ない。さらに、Ａｉｒ非コーディングＲＮＡの５’末端への３倍ポリアデニル化シグナル挿入（Ｓｌｅｕｔｅｌｓら（２００２））は、隣接の転写に影響を与えない。併せて、これらのデータは、Ｅｖｆ２ ＲＮＡよりもむしろインビボ Ｅｖｆ２転写において、シスにおける競合的アンチセンス阻害を通してネガティブにＤｌｘ６転写を調節することを示唆する。

【0106】

Ｄｌｘ６の効果に反し、Ｄｌｘ５の増加およびＧａｄ１の減少をレスキューするＥｖｆ２の能力は、Ｅｖｆ２ ＲＮＡが、トランスにおいてネガティブにＤｌｘ５を調節し、ポジティブにＧａｄ１を調節したことを示した。したがって、Ｅｖｆ２媒介性のトランス作用性転写調節効果は、標的および濃度依存性であり、低レベルのＥｖｆ２がＤｌｘ５を抑制し、高レベルではＤｌｘ５、Ｄｌｘ６およびＧａｄ１を活性化した。また、これらの結果は、Ｅｖｆ２によってＤｌｘ５／６ｅｉおよびｅｉｉのトランス作用性転写活性化を同定した以前のデータを支持する（Ｆｅｎｇら（２００６））。Ｅｖｆ２がトランスでＤｌｘ５を抑制するように作用するという考えのさらなる支持は、我々のノックダウン研究から端を発する（データ非表示）。

【0107】

研究は、ＳＨＨがＤｌｘおよびＥｖｆ遺伝子および、胚前脳におけるＧａｄ１の胚形態を活性化することを示している（Ｆｅｎｇら（２００６）およびＫｏｈｔｚら（１９９８））。加えて、Ｄｌｘ２およびＤｌｘ５の異所的発現は、胚前脳スライスにおけるＧａｄ１を活性化する（Ｓｔｕｈｍｅｒら（２００２）。併せて、これらのデータは、ＧＡＤ６７を活性化するシグナリングカスケードの構成成分としてＥｖｆ２およびＤＬＸを同定し、Ｅｖｆ２^{ＴＳ／ＴＳ}突然変異体中のＧａｄ１レベル低下が、ＧＡＤ６７のＥｖｆ２／ＤＬＸ調節干渉に起因し得るという考えを支持している。しかしながら、我々の結果および先の結果の両方ともが、Ｅｖｆ２の損失は、Ｇａｄ１転写に直接的に影響しているのか、間接的に影響しているのかどうかを区別しない。ＤＬＸ１／２シグナリングの２つの既知の直接標的のうち、Ｅｖｆ２の喪失は、Ｎｒｐ２ではなく（Ｌｅら（２００７））、Ｄｌｘ５／６に影響し（Ｚｅｒｕｃｈａら（２０００））（図１ｉ）、Ｅｖｆ２が全てのＤｌｘ１／２活性に影響しなかったことを示した。したがって、Ｅｖｆ２の未確認の標的がＧＡＤ６７調節の原因であり得る可能性がある。これらの実験によって提起された重要な問題は、Ｅｖｆ２／ＤＬＸが、直接または間接的にＧＡＤ６７発現を調節するかどうかである。

【0108】

非コーディングＲＮＡによる転写因子補充
我々の結果は、Ｅｖｆ２ ｔｒｕｃＲＮＡが、腹側前脳の発達における超保存ＤＮＡ調節要素Ｄｌｘ５／６ｅｉおよびＤｌｘ５／６ｅｉｉ（図２）へのポジティブ（ＤＬＸ）およびネガティブ（ＭＥＣＰ２）転写因子の補充に重要であることを示す。Ｅｖｆ２の喪失は、Ｄｌｘ５転写において、減少よりむしろ予想外の増加を伴って、ポジティブに作用するＤＮＡ調節要素への公知の転写活性化因子（ＤＬＸ）の補充を防止する（Ｄｌｘ５／６ｅｉおよびｅｉｉ）。公知の転写抑制因子である、ＭＥＣＰ２のＥｖｆ２媒介性の補充は、ｅｉおよびｅｉｉの両方から喪失され、ＭＥＣＰ２喪失がＤｌｘ５の調節解除を説明し得ることを提案する。Ｄｌｘ５／６領域における胚性および成体ＭＥＣＰ２結合部位間の相違にもかかわらず、成体脳におけるＤｌｘ５の２倍の増加がＭＥＣＰ２の喪失に対して生じ（Ｈｏｒｉｋｅら（２００５））、Ｄｌｘ５／６ｅｉ活性に対するＭＥＣＰ２の抑制性の役割を支持する。ｅｉｉにおいて、ＭＥＣＰ２喪失は、ＨＤＡＣＩの喪失を伴い、Ｅｖｆ２突然変異体においてｅｉｉにおけるクロマチンがより活性であることを示唆し、これは次にＤｌｘ５転写を増加し得た。しかしながら、ｅｉへのＨＤＡＣＩ結合は変化せず、代わりの調節メカニズムがこの部位に採用されたことを示唆した。最近の証拠は、ＭＥＣＰ２は、時に、活性化された標的においてＣＲＥＢＩと関連して転写活性化因子として作用し得ることを示唆する（Ｃｈａｈｒｏｕｒら（２００８））。我々のデータは、ＭＥＣＰ２補充はＥｖｆ２依存性であり、トランス作用性ＲＮＡが、追加の因子の共補充を通して、または未知のメカニズムによるいずれかで、活性化因子または抑制因子活性間の選択に影響し得るという可能性を支持する。

【0109】

ＭＥＣＰ２およびＤＬＸタンパク質のＥｖｆ２媒介性補充のメカニズムを解析して、補充が競合的に、同等に両方の対立遺伝子について生じるのか、または互いに排他的な方法で生じるのかを決定した（データ非表示）。対立遺伝子不均衡は、遺伝子調節におけるわずかな（１．５倍）および目立った（９倍）変化の両方を生じ、試験された遺伝子の２０〜５０％に生じる（Ｃｏｗｌｅｓら（２００２）、Ｖａｎら（２００２）、およびＤｏｓｓら（２００５））。同様に、特定の対立遺伝子に局在するＥｖｆ２のレベルが、補充された因子の程度または同一性を決定し得ることが可能である。先の蛍光ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションデータは、Ｅ１３．５ ＭＧＥ核が対立遺伝子間でＥｖｆ２の不均一な分布を有するという考えを支持する；Ｅ１３．５ ＭＧＥ切片において、Ｅｖｆ２転写物は、単独の均等ダブル（ｅｑｕａｌ ｄｏｕｂｌｅ）および不均等ダブル（ｕｎｅｑｕａｌ ｄｏｕｂｌｅ）対立遺伝子上に分布し得る（Ｆｅｎｇら（２００６））。また、我々は、ＤＬＸおよびＭＥＣＰ２が異なる細胞間およびＭＧＥ核において非均質に分布されていることを見出した（図３ｃ〜ｊ）。これらのデータは、Ｅｖｆ２、ＤＬＸおよびＭＥＣＰ２の不均等な分布が、ニューロン前駆体の異なる集団において対立遺伝子不均衡を調節する役割を有し得、ニューロンの多様性または表現型のバリエーションを導くことを示唆する。

【0110】

ヒトにおいて、１５〜２５％の遺伝子が、アンチセンス転写に関与する（Ｙｅｉｉｎら（２００３））。しかしながら、特異的なアンチセンス転写調節を採用するインビボメカニズムの報告はごくわずかしか存在しない（Ｐｒａｓａｎｔｈら（２００７））。これらのうち、アンチセンス転写物のインビボでの役割は、インプリンティング制御におけるＡｉｒ（Ｓｌｅｕｔｅｌｓら２００２）およびＫｃｎｑｌｏｔｌ（Ｍａｎｃｉｎｉ−ＤｉＮａｒｄｏら（２００６））について記載されている。我々のＥｖｆ２突然変異体解析からのデータは、我々のレスキュー実験からのデータと組み合わせて、Ｄｌｘ６のアンチセンス転写物であるＥｖｆ２が逆鎖転写競合を通して、シスにおけるＤｌｘ６転写をネガティブに調節することを示唆する。しかしながら、トランスにおけるＤｌｘ５およびＧａｄ１を調節するＥｖｆ２の能力は、アンチセンス転写物がシス作用性メカニズムまたは局所性調節さえにも限定され得ないという可能性を高める。非インプリント領域における公知のアンチセンス転写物の数があるとすれば、どのくらいの頻度でアンチセンス転写物がトランス調節性効果を有するか、また様々な生物学的プロセスにおけるこの調節の役割を決定することが重要であろう。

【0111】

非コーディングＲＮＡ依存性ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達
胚性ＭＧＥは、Ｄｌｘ依存性メカニズムによって調節され、その後海馬に集合するＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆体を産生する（Ｐｌｅａｓｕｒｅら（２０００））。Ｅｖｆ２の喪失は、胚性ＭＧＥにおける不均衡な遺伝子発現を結果として生じ、出生後初期（Ｐ２）の海馬および歯状回におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの減少をもたらす。さらに、Ｐ２ Ｅｖｆ２突然変異体におけるこのＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの減少は、海馬における増大する細胞死または細胞運命形質転換に起因するものではなかった（図４ｇ〜ｋ）。

【0112】

ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンがＰ２ Ｅｖｆ２突然変異体海馬において減少し得るいくつかの可能性のある理由が存在する。１つの可能性は、Ｅ１３．５ Ｅｖｆ２突然変異体ＭＧＥにおけるＧａｄ１の減少が、介在ニューロン前駆体におけるＧＡＢＡレベルを低下させ、その接線腹側を背側遊走へ変更し、そして、海馬中の目的地に到達するＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数を減少させることである。これは、ＧＡＢＡは、ＭＧＥから皮質への接線方向の遊走を包含する（Ｃｏｗｌｅｓら（２００２）、Ｃｕｚｏｎら（２００６）、およびＬｏｐｅｚ−Ｂｅｎｄｉｔｏ（２００３））多数のコンテキストにおけるニューロン遊走に影響する（Ｈｅｎｇら（２００７））という報告により支持される。加えて、Ｅｖｆ２突然変異体で見られるＤＬＸ１／２活性の干渉は、Ｅ１３．５ ＭＧＥからのＧＡＢＡ作動性介在ニューロン遊走を害すると予想されるであろう（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）およびＰｌｅａｓｕｒｅら（２０００））。大多数のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンが、Ｅｖｆ２突然変異体において欠損する胚および出生初期の腹側起源に由来する場合、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数が成体のＥｖｆ２突然変異体海馬においてどのように回復するか、さらにいくつかの可能性がある。１つの可能性は、Ｅｖｆ２突然変異成体が、海馬の脳室下帯または吻側脳室下帯のいずれかにおけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの神経新生により補足することである。そうであれば、これらのニューロンは、その胎性に生成された相当物に対して、シナプスレベルでは機能的に等価ではなかったことが、我々の電気生理学の実験から明らかである。代替の可能性は、Ｅｖｆ２突然変異体におけるＧＡＢＡ作動性前駆体が適切な時期に、適切な目的地へ遊走したが、Ｅｖｆ２の非存在下でより低いレベルのＧａｄ１を産生したということである。遊走の欠陥が見出された場合、なぜＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数がＰ２で減少するか、それは最終的にどのように回復するか、そのシナプスの欠陥の根拠が何であるかを調査するためにさらなる実験が必要であり得る。

【0113】

胚の腹側前脳におけるＳＨＨシグナリングは、適切なＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達のため、ＤＬＸタンパク質、Ｅｖｆ２、ＭＥＣＰ２およびＧＡＤ６７に関与する転写カスケードを開始する（データ非表示）。ＭＥＣＰ２の出生後の影響はＲｅｔｔ症候群には致命的であろうと文献の主要部分が示唆するものの（Ｇｕｙら（２００７）およびＧｉａｃｏｍｅｔｔｉ（２００７））、我々の結果は、Ｅｖｆ２喪失およびＭＥＣＰ２喪失が、胚性ＭＧＥにおける転写効果が、シナプスレベルで成体のＧＡＢＡ作動性欠損を引き起こす共通のメカニズムを共有するという可能性を高める。Ｒｅｔｔ症候群の病因におけるＭＥＣＰ２の単一または複数の標的を同定する努力は、決定的でなかった。論争の的になっている証拠は、成体Ｍｅｃｐ２^−／−脳におけるＤｌｘ５の調節解除が、ＧＡＢＡ作動性欠陥の原因であり得るいう可能性を高めた（Ｈｏｒｉｋｅら（２００５）およびＳｃｈｕｌｅら（２００７））。しかしながら、Ｅｖｆ２突然変異体の解析は、ＭＥＣＰ２喪失、増加したＤｌｘ５およびＧＡＢＡ作動性欠陥の間の相関が間接的であり得ることを明らかにする。

【0114】

ＤＬＸ５がＧＡＤ６７の活性化因子であるとすれば（Ｓｔｕｈｍｅｒら（２００２））、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失は、Ｅｖｆ２突然変異体における予測されたＤｌｘ５の２倍の増加の影響ではないであろう。実際、Ｅｖｆ２レスキュー実験は、Ｅｖｆ２突然変異体のＧＡＢＡ作動性欠損の原因としてのＤｌｘ５上方制御に反して示唆し、Ｄｌｘ遺伝子のＥｖｆ２調節に関与するメカニズムがＧＡＤ６７のＥｖｆ２調節とは別であることを示唆した。我々のレスキュー実験は、Ｅｖｆ２が明確に異なるトランスおよびシスメカニズムを通してＧａｄ１、Ｄｌｘ５およびＤｌｘ６を制御することを示唆した。加えて、２μｇのＥｖｆ２レスキュー濃度で、Ｄｌｘ５は増加したが、ＧＡＤ６７はレスキューされた。Ｄｌｘ５の２倍の増加がＧＡＢＡ作動性欠損の原因である場合、ＧＡＤ６７は増加するとは予想されないであろう。これらの実験は、Ｄｌｘ５の増加ではなくむしろ、Ｇａｄ１減少がＧＡＢＡ作動性介在ニューロン欠損を生じる可能性が高いことを示唆する。

【0115】

我々の知る限り、これらの知見は、ｎｃＲＮＡ依存性メカニズムが、成体の脳においてＧＡＢＡ依存性の結合性を決定し得る初期のＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達にとって重要であるという最初の論証を説明する。適切な結合性を回復し得ないということは、成体脳において回復されたＧａｄ１およびＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数にかかわらず、発達途中の胚において重要な因子が、成体においてＧＡＢＡ作動性介在ニューロン機能に影響するという考えを強いものとする。これは、精神障害が明白な成体の身体的欠陥がない状態において、異常な胚発達に起因し得るかどうかという、特に重要な長年与えられた質問である。

【0116】

これらのデータは、Ｅｖｆ２ ＴＳ／ＴＳマウスが単にＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの正常な発達を研究するのに有用であるのみならず、自閉症および学習行動の病因を明確にするために有用であろうことを示している。そのようなマウスモデルを使用して、自閉症スペクトル障害、学習障害、記憶障害および社会的混乱を包含する自閉症等の広範囲の脳障害を予防または処置するために有効な可能性のある治療薬を試験し得る。

【0117】

実施例２：Ｅｖｆ１突然変異体マウスの調製および特徴付け
Ｅｖｆ２突然変異体の調製と同様の技術を用いて、Ｅｖｆ配列へ転写停止配列を挿入することによりＥｖｆ１突然変異体を調製した。Ｅｖｆ１突然変異体の調製のため、ＴＳ配列をＥｖｆ配列のエクソン３、Ｅｖｆエクソン３の開始から１つのヌクレオチドへと挿入した。使用された隣接配列は以下の通りである：

【0118】

【化2】

したがって、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳマウス中の最も大きい可能性のあるＥｖｆｌ転写物は、１ｎｔ長になるであろう。

【0119】

Ｄｌｘ５／６領域（図１９に図式化される）の上流にＥｖｆｌエクソンを含むＢＡＣを構築し、ＥＳ細胞中へエレクトロポレーションし、そして細胞をＰＣＲおよびサザンブロットによりシングルコピーした非相同組換えについてスクリーニングした。タモキシフェン誘導性ｅｒｅの細胞質形態を送達するため、そしてＧＦＰを有するレスキューコンストラクトを含む細胞をマーキングするため、Ｄｌｘ６をＥＲ−ｃｒｅ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰで置換した。３倍ポリＡ部位を、上記配列を用いてｌｏｘＰ部位に隣接するエクソン３の５つのプライム末端に挿入した。Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳＸ Ｅｖｆｌレスキューにより交差し、タモキシフェン処理をＥ９．５、Ｅ１７．５またはＰ３０で行った。その後、Ｐ６０の成体の脳を、上記されるようにＤ２受容体、ｐＤｙｎおよびＧＡＤ６７のＰＦＣ発現について解析した。

【0120】

マウスにおけるＤｌｘ１／２喪失の最も劇的な効果のうちの１つは、胚の神経節隆起（ＭＧＥおよびＣＧＥ）から海馬へと遊走するＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの約９０％の減少である（Ｐｌｅａｓｕｒｅら２０００）。インサイチュハイブリダイゼーション解析は、Ｅｖｆ−１およびＥｖｆ−２が出生後の海馬におけるＤｌｘ遺伝子と共に発現され、Ｅｖｆ１発現は成体において持続することを示す（図１１）。Ｐ２でＥｖｆ−１およびＥｖｆ−２発現は、ＳＶＺおよび背側で遊走するする細胞においてオーバーラップする。Ｄｌｘ−１および５に類似して、Ｅｖｆ−２は脳室下帯の細胞において、それが外部カプセルに沿って背側で出て遊走するにつれ、Ｐ１２で発現される。Ｅｖｆ−１およびＤｌｘ−６はこの段階でこの細胞において検出されない。しかしながら、Ｅｖｆ−１およびＤｌｘ−６はＰ６０の海馬内に発現される；放線状層（ｒａｄｉａｔｕｍ）（Ｒａｄ）はＥｖｆ−１発現において富化される。Ｄｌｘ−２発現は、海馬においてこれらのどの年齢でも検出されなかった。興味深いことに、胚性海馬（Ｅ１５．５）における最も初期のＤｌｘ−２発現は、放線状層において濃縮され、この層の細胞密度はＤｌｘ１／２−／−マウスにおいて減少するという報告が以前になされている（Ｐｌｅａｓｕｒｅら２０００）。放線状層におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、Ｄｌｘ１／２−／−マウスにおいて最も影響を受ける（Ｐｌｅａｓｕｒｅら２０００）。

【0121】

また、ＧＡＢＡにおけるＤｌｘ遺伝子および嗅球ニューロンに発現するチロシン加水分解酵素の重要な役割が実証された（Ｑｕｉら、１９９５，Ｂｕｌｆｏｎｅら１９９８，Ｌｏｎｇら２００３）。図１２は、出生後の嗅球において、Ｄｌｘ遺伝子が、Ｅｖｆ２ではなくＥｖｆ１とオーバーラップすることを示す。

【0122】

発達中の神経節隆起におけるＥｖｆ１およびＥｖｆ２の解析は、脳室下帯においてオーバーラップする発現パターンを示す（ＫｏｈｔｚおよびＦｉｓｈｅｌｌ ２００４，Ｆｅｎｇら２００６）。しかしながら、Ｅｖｆ１のみが、出生後の海馬および嗅球において発現される。嗅球に加え、側神経節隆起からの前駆細胞は、側坐核よりもコカインに対して大きな反応を示す領域（Ｉｋｅｍｏｔｏ）である嗅結節へと遊走する（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら２００１）。図１３は、Ｅｖｆｌ発現は出生後１２日および成体嗅結節において持続するが、Ｅｖｆ２発現は検出されないことを示す。Ｃａｌｌｅｊａ島およびドーパミン受容体３発現が集中していると以前に示されたところに類似する大きな核において、Ｅｖｆｌ発現とＧＡＤ６７発現ニューロンがオーバーラップする。

【0123】

海馬に加え、胚の内側神経節隆起から遊走するＧＡＢＡ作動性前駆細胞により集合される別の領域は、脳皮質である。成体の背内側前頭皮質（ＰＦＣとしても知られる）の試験は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの合計数がＥｖｆｌ ＴＳ／ＴＳにおいて、野生型コントロールに比べて減少することを示す（図１４）。これは、両方が異常なドーパミンシグナリングの指標である、Ｄ２受容体を発現するニューロンの数の劇的な増加、ならびにプロダイルノルフィン（ｐＤｙｎ）を発現するニューロンの数の減少を伴う。Ｄ２受容体活性化およびＧＡＢＡが同一経路上に収束することから、Ｄ２受容体の発現増加は、この領域におけるＧＡＢＡの減少によるものであり得る。ＧＡＢＡ作動性シグナリングの減少に対する補足メカニズムの結果として、Ｄ２受容体活性化が残りのＧＡＢＡ作動性介在ニューロン集団において生じるかどうかも決定され得る。

【0124】

また、突然変異体マウスも異常なコカイン反応について解析される。Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ脳が薬物反応および報酬を調節すると知られている領域における異常なＧＡＢＡ作動性／ドーパミン受容性シグナリングを呈するとして、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳ突然変異体を異常なコカイン反応について試験した。バイアスされていない条件付け場所嗜好性（ＣＰＰ）アッセイを、通常野生型動物における弱い反応を引き出すための閾値用量である、５．０ｍｇ／ｋｇのコカインを用いて行った。この５．０ｍｇ／ｋｇのコカイン用量において、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳマウス（青色）は、コカイン側の嗜好を呈したが、Ｅｖｆｌ＋／＋野生型同腹仔（黄色）は、コカイン側の嗜好を呈さなかった（図１５）。ＣＰＰにおいて試験される動物の数を１５に増やすこと、ならびに異なる薬物（コカイン）用量を用いて、追加の試験を行ってもよい。より高いコカイン用量（７ｍｇ／ｋｇ）がＥｖｆｌ ＴＳ／ＴＳと野生型マウスとの相違をマスクし得る一方で、それらはより顕著な相違を生じるであろう可能性もある。低用量でのＣＰＰ反応の増加は、Ｅｖｆ１喪失がコカインの作用強度を増加することをさらに支持する。図１６において、Ｅｖｆｌ ＴＳ／ＴＳマウスにおける増加したコカインの作用強度に関するメカニズムモデルが提案される。このデータは、特定のニューロン分集団のＥｖｆ１依存性制御とコカイン反応とのリンクをさらに支持する。

【0125】

実施例３：結果の概要
２つの発達的および空間的に制限された、Ｄｌｘ５および６ホメオボックス遺伝子とオーバーラップした発現パターンを有する非コーディングＲＮＡ（Ｅｖｆ）が同定されている。Ｄｌｘ遺伝子のように、Ｅｖｆは、主要なシグナリングタンパク質であるソニックヘッジホッグの標的である。Ｄｌｘ２と協同して、Ｅｖｆ１または２は、マウスおよびゼブラフィッシュＤｌｘ５／６および４／６エンハンサーを転写的に活性化することができる。Ｄｌｘ５／６エンハンサーに対するこの協同効果は、両者とも標的特異的であると同時に、Ｄｌｘホメオドメイン含有タンパク質に限定される。ＥｖｆおよびＤｌｘ５／６の発現は腹側前脳の発達、および出生後の脳室下帯においてオーバーラップするが、それらは、誕生後、海馬、嗅球および嗅結節において分岐する。発達の間のＥｖｆとＤｌｘとの間の密接な機能的および発達的関連は、ＥｖｆがインビボにおいてＤｌｘ５／６調節の役割を果たすこと、またこの調節の乱れが、Ｄｌｘ突然変異体解析において乱れることが知られている発達プロセスにおける異常を結果として生じ得ることを示唆する。

【0126】

Ｅｖｆ２の機能喪失突然変異体の表現型解析は、Ｄｌｘ１／２シグナリングの減少と一致する。Ｅｖｆ２機能喪失突然変異体は、野生型同腹仔コントロールと形態学的に区別し得ないが、出生後２日目の海馬および歯状回におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数の減少が観察される。Ｅｖｆ２突然変異体は、胚間における変動性を伴って、出生後の嗅球でのＧＡＤ６７発現介在ニューロンにおける減少を呈する（非表示）。出生後２日目のＥｖｆ２突然変異体において、腹側Ｅｖｆ１ ＳＶＺドメインが拡大される（非表示）。

【0127】

しかしながら、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲおよびｑＣＨＩＰ−ＰＣＲは、Ｅｖｆ２の喪失は、ｅｉおよびｅｉｉエンハンサーへのＤｌｘタンパク質の補充の失敗にもかかわらず、Ｄｌｘ５およびＤｌｘ６を上方制御することを示す。図１７は、Ｄｌｘ５／６遺伝子間エンハンサーに対するポジティブおよびネガティブ転写因子の両方の補充が、Ｅｖｆ２喪失に対するＤｌｘ５／６増加をどのように説明し得るかを説明するモデルを提案する。上記データは、（１）Ｅｖｆ２ ＲＮＡは、ポジティブ（Ｄｌｘ）およびネガティブ（Ｍｅｃｐ２）転写調節因子の補充を通してエンハンサー活性を調節する；（２）Ｄｌｘタンパク質は、Ｄｌｘ５／６ｅｉおよびｅｉｉ調節性転写を、Ｍｅｃｐ２結合を防ぐことにより促進する；および（３）Ｍｅｃｐ２は、Ｄｌｘ５／６遺伝子発現を、Ｄｌｘ転写因子結合を防ぐことにより抑制する、ことを支持する。

【0128】

図１８は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達におけるＥｖｆの役割を説明するための１つのモデルを提供する。腹側正中線からのＳｈｈは胚の神経節隆起においてＤｌｘ遺伝子およびＥｖｆを誘導することがきちんと確立されている。Ｄｌｘ遺伝子の喪失は、神経節隆起において起こるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの顕著な喪失を結果として生じることを示した。本発明は、部分的に、Ｅｖｆ２の喪失が、海馬および嗅球からのＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの分集団の喪失を結果として生じることを示す。併せて、これらのデータは、Ｅｖｆ２が、発現および活性の両方を調節することによりＤｌｘ遺伝子を制御し、ＤｌｘおよびＥｖｆの適切な均衡がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの分集団の発達に重要であることを示唆する。

【0129】

Ｅｖｆ１ＴＳ／ＴＳマウスは、コカイン反応に関与する、介在ニューロンの胚性および成体それぞれのＥｖｆ１非コーディングＲＮＡ制御の役割の開示を伴って、異なる領域（成体ＰＦＣ）においてＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの喪失を呈する。

【0130】

実施例４：Ｅｖｆ１突然変異体の追加解析
発達している脳におけるＥｖｆ１が、成体の脳における不均衡なシグナリングを産生し、コカイン等の覚醒剤に対する感受性を高めることをさらに支持するため、追加の解析を実施する。そのような追加の解析は、Ｅｖｆ１が前頭皮質においてＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのサブセットの適切な形成に重要な因子であることをさらに支持するために実施される。加えて、Ｅｖｆ１突然変異体の前頭皮質におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの喪失は、発達途中での前駆体の不完全な遊走に起因することをさらに支持し得る。さらに、Ｅｖｆ１の胚性発現は、成体前頭皮質におけるＧＡＢＡ作動性およびドーパミン均衡において重要な役割を果たすこと、およびＥｖｆ１の胚性発現がコカイン等の覚醒剤に対して成体の高められた感受性を制御することを支持し得る。

【0131】

したがって、一組の追加の調査を使用して、コカイン反応に関与する脳領域における特定のニューロン集団に対するＥｖｆ１喪失の効果を決定し得る。成体Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ ＰＦＣの解析は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンおよびプロダイノルフィン発現ニューロンの数が減少する一方で、Ｄ２受容体発現細胞の数が増加することを示す。これは、Ｅｖｆ１がＰＦＣにおいて均衡なＧＡＢＡ作動性およびドーパミンシグナリングの維持に関与するという考えを支持する。

【0132】

以下の実験を行って、Ｅｖｆ１突然変異体ＰＦＣにおいて異常なＧＡＢＡ作動性およびドーパミン受容性シグナリングを生じる細胞の変化をさらに特徴付けてもよいし、支持してもよい：
１：Ｅｖｆ１ＴＳ／ＴＳ成体前頭皮質における異なるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンおよびＤ２受容体発現集団の特徴づけ。

【0133】

発達途中の脳において、Ｄｌｘ１／２二重突然変異体マウスの解析は、皮質におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの約７５％の減少を明らかにし、歯状回微粒細胞層を除く、海馬からのほぼ完全な喪失（約９０％）を明らかにした（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７、およびＰｌｅａｓｕｒｅら、２０００）。海馬は、Ｄｌｘ１／２二重およびＤｌｘ１一重突然変異体解析の両方において、皮質よりもより強い影響を受けた（Ｃｏｂｏｓら２００５）。加えて、Ｄｌｘ１一重突然変異体は、海馬におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのサブタイプ特異的喪失を呈する。Ｄｌｘ５−／−マウスは、嗅球におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンおよびドーパミン作動性ニューロンの減少を示す（Ｌｏｎｇら２００３）。ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの皮質および海馬への遊走の解析は、Ｄｌｘ５／６−／−マウスについて報告されておらず、おそらく、これらのマウスが重篤な脳奇形を呈するからであろう。以下の一連の証拠は、ＰＦＣでのＧＡＢＡ作動性介在ニューロン発達におけるＥｖｆ１の役割を支持する：（１）Ｅｖｆ１は、ＰＦＣに集合するＧＡＢＡ作動性介在ニューロン前駆体が生成される、Ｅ１３．５ ＭＧＥにおいて発現される。（２）Ｅ１３．５ ＭＧＥに移植されたＥ１３．５ ＭＧＥからの標識された前駆体を用いたホモタイプの移植実験は、ＭＧＥが皮質のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンをもたらすことを示す（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら２００１）。ならびに（３）Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ成体ＰＦＣはＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数の減少を含む（本明細書において開示される）。

【0134】

手法：グルタミン酸からＧＡＢＡへの変換に必要な酵素であるＧＡＤ６７に対するＲＮＡ インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＩＳＨ）は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを同定する。図１８において、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ成体ＰＦＣのＧＡＤ６７ ＲＩＳＨは、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数の減少を示す。しかしながら、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの大半が残存していることから、すべてのＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのサブタイプがわずかに減少するのか、または、Ｄｌｘ−／−海馬について報告されたように（Ｃｏｂｏｓら２００５）、特定のサブタイプが優先的に喪失されるのかという疑問が残る。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳおよび野生型同腹仔コントロールＰＦＣ切片は、先に特徴づけた抗体を用いて、パルブアルブミン（ＰＶ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、およびソマトスタチン（ＳＯＭ）のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンサブタイプ特異的発現について試験されるであろう。３つの異なる脳における４切片からの少なくとも２箇所を、各遺伝子型について計算した。計算は、Ｂｒｅｇｍａ座標および形態学的基準によって判断されるように同じ相対的な吻側／尾側配置で判断され、マウス脳アトラス（Ｐａｘｉｎｏｓ）によって定義されるように背内側前頭皮質のレベルで判断されるであろう。加えて、ＰＦＣにおけるＤ２受容体は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにより発現されることが示されている（Ｍｒｚｌｊａｋら１９９６）。したがって、Ｄ２Ｒに関する免疫組織化学と組み合わせたＧＡＤ６７に関するＲＩＳＨを使用して、残されたＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに対して、Ｄ２受容体の異所的活性化が生じるかどうか判断される。

【0135】

Ｅｖｆ１は、同様にＥｖｆ２作用して、胚の神経節隆起におけるＤｌｘ１／２依存性転写イベントのサブセットに影響を及ぼし得、これらの実験は、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ成体ＰＦＣにおけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの喪失が特定のサブタイプに限定されるかどうかを決定し得る。

【0136】

Ｅｖｆ１喪失により、Ｄｌｘ１−／−海馬（ＮＰＹ＋，ＳＯＭ＋，ＰＶ−）において喪失すると報告される、サブタイプ特異的ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数が減少するという１つの可能性がある。また、Ｅｖｆ１がＤｌｘ１／２およびその標的以外の転写因子に影響する可能性もある。後者の場合、複数のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのサブタイプが影響されるであろう。加えて、成体Ｅｖｆ１発現の喪失は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン機能および／または維持において未知の役割を果たしそうである。成体Ｅｖｆ１発現は、特定のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの生存に必要であり得る。正確なＧＡＢＡ作動性喪失のサブタイプの定義は、成体Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ脳のＰＦＣに現われる不均衡なシグナリング欠損を理解する一助となるであろう。

【0137】

概説された調査も、Ｄ２受容体活性化がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに生じるかどうかの判断の一助となり得る。

【0138】

抗ＮＰＹ、ＳＯＭおよびＰＶに関するプロトコルは既に確立されている。しかしながら、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのサブタイプまたは全喪失を特徴づけたとしても、なぜそのような喪失が生じるかが明らかにされ得ないことがある。したがって、サブタイプを特徴づけることに加えて、さらに、Ｄｌｘ１−／−突然変異体におけるＴｕｎｅｌ染色によって先に示されたように（Ｃｏｂｏｓら２００５）、細胞死におけるＧＡＢＡ作動性特異的変化またはニューロン特異的変化が、成体のＰＦＣに生じるかどうかが決定され得る。ＤＮＡ断片化を検出する細胞死の指標であるＴｕｎｅｌ染色は、ｗｔコントロールと比較した場合Ｅｖｆ２突然変異体の海馬においては違いを検出しない（図１４ｉ〜ｋ）。

【0139】

Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ突然変異体のＰＦＣにおけるＧＡＢＡ作動性喪失、ｐＤｙｎの減少、およびＤ２受容体発現の活性化の発達時期の判断
ＧＡＢＡ作動性／ドーパミン受容性な不均衡がどのように生じるかをさらに調査するため、これらの変化が最初に検出されるときに判断してもよい。Ｅｖｆ１は、終脳の脳室下帯においてＥ１１．５で最初に発現され（ＫｏｈｔｚおよびＦｉｓｈｅｌｌ，２００４）、そして、それらが皮質に最初に遊走するにつれ、Ｅ１３．５ ＭＧＥ ＧＡＢＡ作動性前駆体において発現される。Ｅ１７．５では、ＧＡＤ６７発現介在ニューロンは、異なる皮質層において検出され得る。腹側から背側への遊走が停止する正確な時期は決定されていないが、Ｐ１２までに大多数の遊走が生じたと考えられる。

【0140】

ＧＡＤ６７、Ｄ２受容体およびｐＤｙｎ ＲＩＳＨを、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳおよび野生型コントロールからのＥ１３．５およびＥ１７．５終脳、ならびに出生後Ｐ２、Ｐ１２およびＰ３０のＰＦＣについて行った。等価な吻側／尾側位で、３つの異なる脳からの最低４つの切片を比較して、確立された比較の立体解析方法を利用する。胚の脳において、これは形態学的基準によって判断される。出生後および成体の脳においては、これは単に形態学的基準による判断のみならず、マウスアトラス（Ｐａｘｉｎｏｓ）によって定義されるＢｒｅｇｍａからの距離によって判断される。個々のニューロンは、これらの各プローブによってＲＩＳＨを使用して同定され得る。したがって、得られた数がＯＰＥＮＬＡＢソフトウェアを用いて計算され、成体ＰＦＣについて図１８に示されるように比較される。

【0141】

海馬におけるＥｖｆ２ ＴＳ／ＴＳ ＧＡＢＡ作動性喪失の解析は、海馬におけるＧＡＤ６７発現介在ニューロンの減少が、誕生直後まで検出されないことを示す（図１４、出生２日後、Ｅ１７．５解析非表示）。Ｄｌｘ１−／−突然変異体において、ＧＡＤ６７数の減少は２か月齢まで観察されない（Ｃｏｂｏｓら２００５）。したがって、Ｅｖｆ１突然変異体において、ＧＡＢＡ作動性喪失が出生後（Ｐ１２）に検出され、それ以前には検出されないことが期待されるであろう。さらに、ＧＡＢＡ作動性喪失が成年期まで検知されないであろうこともあり得る。Ｅｖｆ１が成体ＳＶＺおよび成体皮質において発現されることから、成体の脳において、新たな前駆体が産生され、遊走し続けるという可能性がある。あるいは、Ｅｖｆ１は成体において特異的ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの生存にとって重要であり得る。ドーパミンは、ＧＡＢＡ作動性前駆体の腹側から背側への遊走において役割を果たす（Ｃｒａｎｄａｌｌら２００７）。したがって、発達の間または出生後のいつでも、異所的なＤ２受容体活性化が生じる可能性がある。ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失の前にＤ２受容体増加／ｐＤｙｎ減少が生じる場合、これは、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失と無関係に異常なドーパミンシグナリングが生じることを示唆するであろう。Ｄ２受容体増加／ｐＤｙｎ減少が、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失と同時に起こるか、この後に続く場合、異常なドーパミンシグナリングはＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失の結果となり得る。これは、Ｄ２受容体の増加が、ＧＡＢＡレベルの低下およびドーパミンの上昇に応じて生じ得る、図１７に提案されたモデルに基づくものであろう。

【0142】

概説されるように、この実験はさらに、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスにおけるＧＡＢＡ作動性シグナリングの減少と関連して、いつＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失がＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ皮質において最初に検出されるか、ならびにいつ異常なドーパミンシグナリングが生じるのかを支持する。

【0143】

これらのプローブおよび異なる発達段階を使用するＲＩＳＨが、以前に行われた。ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失が成体皮質においてのみ検出できることが見出された場合、これは必ずしも胚の攪乱が表現型に寄与しないことを意味するものではない。胚における遊走および／または分化のわずかな相違が、表現型の原因となり得ることは可能である。この問題を対処するために、以下に開示されるような条件付けレスキュー実験が行われてもよい。しかしながら、実験はＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失と増加したＤ２Ｒ発現の関係の判断においての一助となり得る。

【0144】

皮質中の異常なドーパミンシグナリングが胚形成期に検出されない場合、皮質のＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失と無関係に生じる可能性がある。Ｅｖｆ１が出生後の嗅球中で発現されるとすれば、嗅結節を神経支配する嗅球ドーパミン作動性ニューロンの数の変化が間接的に皮質ドーパミンシグナリングに影響し得る。この可能性を試験するため、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ突然変異体におけるＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ嗅球のドーパミンニューロンの数を、野生型のコントロールと比較してもよい。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳおよび野生型同腹仔コントロールマウスの成体嗅球を、ドーパミンの生成にとって重要な酵素であり、ドーパミン作動性ニューロンに特異的なチロシン加水分解酵素（ＴＨ）について染色する。抗ＴＨおよびＴＨ ＲＩＳＨの両方を、細胞体がｍＲＮＡレベルでＴＨを発現することを確認するために行う。嗅球ニューロンからのドーパミン作動性喪失または獲得が可能である一方、この喪失の影響は、ＰＦＣにおけるドーパミンシグナリングに間接的に影響するであろう。

【0145】

内側神経節隆起から皮質への遊走に対するＥｖｆ１喪失の影響の判断。

【0146】

ＭＧＥにおけるニューロンの運命特異化（ｆａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、分化および／または遊走における乱れは、皮質中の異常なＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数を結果として生じる。この腹側から背側への遊走というイベントから皮質の介在ニューロンが生成される最初の論証は、Ｄｌｘ１／２ダブルノックアウトマウスの特徴づけに由来する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら１９９７）。続いて、Ｅ１３．５ ＭＧＥから皮質への遊走は、ホモタイプの移植実験によってインビボにおいて示された（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら２００１）。本明細書に開示されるように、Ｅｖｆ１喪失はＰＦＣにおけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの減少を結果として生じる。この点に関して、実験を設計して、この喪失がＭＧＥ由来ＧＡＢＡ作動性前駆体が皮質へと遊走する能力の低下に起因するかどうかを試験してもよい。

【0147】

先に記載されるように（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら２００１）、Ｅ１３．５ Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳまたは野生型ＭＧＥに由来するａｃｔＧＦＰ標識化前駆体の、超音波ガイド（超音波生体顕微鏡、ＵＢＭ）でのホモタイプの移植注入が行われ、野生型のＥ１３．５レシピエントへ移植されるであろう。皮質は、抗ＯＦＰおよび抗ＴＵＪ１（全ニューロン）、抗ＧＦＰおよび抗ＧＡＢＡ（ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン）により共染色され、Ｅｖｆ１がＭＧＥからのニューロン遊走に役割を果たすかどうかを判断し得る。

【0148】

野生型のＭＧＥ、または、野生型のＥ１３．５ ＭＧＥおよび解析された皮質中のＧＦＰ標識されたニューロンをＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳへ移植する、逆実験（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を行うことによって、Ｅｖｆ１喪失の細胞非自律効果が判断されるであろう。

【0149】

概説された実験は、ＭＧＥから皮質までのニューロン遊走のＥｖｆ１制御をさらに支持する。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ ＭＧＥドナー組織が使用される場合、皮質中のＧＦＰにより共標識化されるニューロンが少なくなるという証明は、胚においてＥｖｆ１がニューロン前駆体の遊走に影響を及ぼすことを示唆するであろう。加えて、突然変異体ＭＧＥへ移植された野生型ＬＧＥドナー組織の皮質への遊走が失敗に終わる場合、これは、Ｅｖｆ１喪失が遊走に対する細胞非自律効果を引き起こすことを示唆するであろう。

【0150】

インビボにおけるＥ１３．５でのＭＧＥへのＥ１３．５ ＭＧＥ前駆体のＵＢＭ注入と同様に、マウスＥ９．５脳へのレトロウイルスの超音波ガイド（ＵＢＭ）注入（Ｆｅｎｇら２００６，図２ｂ）が行われるであろう（非表示）。結果は、ＬＧＥ前駆体ではなく、移植されたＭＧＥ由来前駆体（染料ＰＫＨにより蛍光標識化されている）が皮質に遊走するという、Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら（２００１）の結果を再現する。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスをＡｃｔＧＦＰと交差してＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ−ＡｃｔＧＦＰドナー組織を得てもよい。したがって、これらのマウスはこれらの実験を行うために使用することができる。加えて、（ＧＦＰ標識化されている）突然変異体ドナー組織は、ポジティブな内部制御を提供するために、ｍＣｈｅｒｒｙマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）からの野生型ドナー組織と共に共注入されてもよい。

【0151】

ＭＧＥ／皮質遊走の欠損は、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ胚において検出されない可能性がある。ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失は、発達の間または成体における、増殖の減少、脳室下帯での細胞死または異常な細胞運命特異化の増加等の他のメカニズムによる可能性がある。このタイプのさらなる調査が、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ成体ＰＦＣにおける異なるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンおよびＤ２受容体発現集団の特徴づけからの結果によって導かれ、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ表現型が最初に現われる時を定義するであろう。

【0152】

覚醒剤コカインへの反応に対するＥｖｆ−１喪失の影響の判断。

【0153】

ｍＯＴｕがコカイン報酬効果に重要な役割を果たす一方、ＰＦＣは、コカイン依存症の欲求側面（ｃｒａｖｉｎｇ ａｓｐｅｃｔｓ）において役割を果たすと提案された。Ｅｖｆ１はＰＦＣにおいてＧＡＢＡ作動性およびドーパミン受容性シグナリングの平衡を保つことに関与し得るという知見と併せて、これは、Ｅｖｆ１突然変異体が異常なコカイン反応を示し得る可能性を高める。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウス中の異常なコカイン反応についてさらに支持するため以下の実験が行われる：
Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳおよびコントロールマウスにおけるコカイン誘導性遺伝子発現の変化の比較。

【0154】

胚脳において、Ｅｖｆ１およびＥｖｆ２発現はＳｈｈシグナリングに応じて活性化される（Ｋｏｈｔｚら１９９８，Ｆｅｎｇら２００６）。成体におけるＥｖｆ１発現を活性化するシグナリング因子は知られていない。しかしながら、ｍＯＴｕおよび皮質におけるＥｖｆ１の成体発現は、Ｅｖｆ１が、遺伝子調節に役割を果たすこれらの領域において外部シグナルに反応する可能性を高める。Ｅｖｆ１は、コカイン投与に応じて調節され得るか、または、反応に関与する調節遺伝子に関与し得る。しかしながら、これらのイベントの相対的時期の決定は、コカイン反応におけるＥｖｆ１の役割に関して追加情報を提供し得る。

【0155】

薬物投与に対する最初の反応の１つは、即時型遺伝子であるｃ−ｆｏｓである。したがって、抗ｆｏｓ免疫組織化学は、コカイン暴露に対する即時反応（１時間後）の読み出し（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）を提供する。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ成体マウスのＰＦＣおよびｍＯＴｕへの格別な注目を伴って、異なる濃度（５、１０および１５ｍｇ／ｋｇ）のコカイン注入後の野生型のコントロールと比較した異なる脳領域でのｃ−ｆｏｓ発現細胞の数または空間的分布に相違があるかどうかを同定してもよい。注入のストレスも効果を有し得ることから、食塩水注入をコントロールとして使用してストレスと薬依存効果とを識別する。次にＲＩＳＨを使用して、１時間、６時間、および２４時間の時間経過解析を用いてＥｖｆ１発現がコカイン注入後に変化するかどうか判断されるであろう。ＰＦＣおよびｍＯＴｕに特に焦点をおいて、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳおよび野生型コントロールの脳におけるＤ１受容体／エンケファリン、Ｄ２受容体／ｐＤｙｎ発現を解析して、コカイン誘導性ドーパミンシグナリングの増加に反応差があるかどうかを判断する。

【0156】

これらの実験は、コカインに対する即時反応におけるＥｖｆ１の役割を支持する。ｃ−ｆｏｓは薬物反応の即時指標である。コカインの異なる用量に応じて野生型と比較したＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳのｍＯＴｕおよびＰＦＣにおけるｃ−ｆｏｓ発現の比較により、Ｅｖｆ１喪失が即時初期段階で脳の初期反応を変化させるかどうかを決定する。ＧＡＢＡレベルの低下およびドーパミン取込みの低下によりドーパミンレベルがＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ ＰＦＣにおいて増加する場合、より低用量コカインは、ｗｔコントロールと比較したＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳにおいて同様の反応を引き出すために十分であり得る。

【0157】

また、これらの実験は、コカインによる異常なＥｖｆ１発現を支持し得る。発達中の脳におけるＥｖｆ１喪失は、コカインに対する感度の増大をもたらし得る、成体の脳における不均衡なシグナリングを産生する。実験に基づいて、不均衡なシグナリングは、素因の場合のように、コカイン暴露に先立って予測される。Ｅｖｆ１ ＲＮＡがコカイン暴露に応じて調整される場合、これは、素因または用量感受性のシグナリングを越えて、ＲＮＡが薬物反応に役割を果たし得る、追加のレベルを示唆するであろう。この実験に記載されるように、Ｅｖｆ１ ＲＮＡ発現が用量依存性または時間依存性に変化するかどうかを判断することにより、この可能性は取り扱われるであろう。

【0158】

また、これらの実験は、ドーパミンシグナリングにてコカイン誘導性の異常におけるＥｖｆ１の役割を支持し得る。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスにおいて、増加したＤ２受容体および減少したｐＤｙｎ発現は、異常なドーパミンシグナリングの指標である（図１６を参照）。ドーパミン増加がＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ ＰＦＣの異所性発現またはＤ２受容体の増加を引き起こす場合、コカイン注入はドーパミンレベルをさらに増加して非常に敏感な状態を生じ得る。しかしながら、Ｄ２受容体発現の減少が、コントロールより１００倍多い細胞外のドーパミンを呈するドーパミントランスポーター−／−マウスの線条体に生じるように（Ｇｉｒｏｓら、１９９６）、Ｄ２受容体発現とドーパミンとの関係は皮質に明白に依存する。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳおよびコントロールの脳は、コカインに対する反応において異なり、恐らく同様に、ｍＯＴｕとＰＦＣ反応間の相違がありそうであるが、これらの正確な性質は、Ｅｖｆ１喪失によって引き起こされたＧＡＢＡおよびドーパミンの不均衡の性質に依存するであろう。

【0159】

コカインへの細胞応答に対するＥｖｆ１喪失の影響を検討するため、免疫組織化学とインサイチュハイブリダイゼーションを使用して、Ｅｖｆｌ、Ｄ１受容体およびＤ２受容体、ｐＤｙｎおよびエンケファリンを検討する。これは観察された変化に空間分解能を与えるが、ＲＩＳＨはＲＮＡレベルでの変化の定量的計測ではない。リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、比較として野生型同腹仔を用いて、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳの成体のｍＯＴｕおよびＰＦＣにて遺伝子発現におけるコカイン誘導性の変化を測定する。

【0160】

Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳおよびコントロールマウスにおけるコカイン誘導性歩行運動感作の比較。

【0161】

コカインおよびアンフェタミン等の覚醒剤は、常同および歩行運動行動を増加するドーパミン取込みまたは放出を妨害する（Ｒｉｔｚら１９８７，Ｊａｂｅｒら１９９５）。ｍＯＴｕへのコカインの注入は、強健な歩行運動および立ち上がり行動を引き起こす（Ｉｋｅｍｏｔｏ，２００２）。ｍＯＴｕにおいて高レベルのＥｖｆ１発現があれば、Ｅｖｆ１突然変異体は、野生型のコントロール動物からの異常な歩行運動感作プロフィールを示し得る。

【0162】

コカインアッセイに対する歩行運動感作も行われる。動物を繁殖し、遺伝子型を同定し、その後、行動解析について検討した。コカインに対する歩行運動感作試験（Ｂｉｒｎｂａｕｍら）を以下の通り行う：歩行運動感作実験の最初の３日間、マウスに生理食塩水を注入（ｉ．ｐ．）し、その後、ホームケージに類似するが、少量の寝床を含む暗いプレキシガラスの箱内に配置される、プラスチックのマウスケージ（１８ｃｍ×２８ｃｍ）に個別におく。歩行運動感作の最後の５日間、マウスにコカイン（５，１０，または１５ｍｇ／ｋｇ）を注入し、直ちに試験装置中に入れる。コカイン注入の最初の日は、コカイン注入によって即時活性が引き起こされる。行動を、一次元の５光束（Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により、ビームが遮られた回数を５分ごとに記録して２時間モニタリングする。行動は、３種の方法により特徴づけられる：単一ビームの反復性ビーム遮断を常同行動と分類し、２以上のビームの連続的ビーム遮断を歩行行動と分類し、そして、各５分間隔における合計ビーム遮断。１５匹のＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ突然変異体マウスおよび１５匹の野生型コントロールマウスが、各用量で使用する。得られた変動に依存し、統計的有意性のため、マウスを各遺伝子型について２０まで増加してもよい。

【0163】

Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスおよびコントロールマウスおける条件付け場所嗜好性の比較。

【0164】

ラットにおける自己投与および条件付け場所嗜好性（ＣＰＰ）行動アッセイの両方の使用により、側座核を包含する試験された異なる脳領域のうち、ｍＯＴｕは最も強固なコカインの報酬効果を媒介することが示される（Ｉｋｅｍｏｔｏ，２００３）。ｍＯＴｕにおいてＥｖｆｌの集中発現があるとすれば、ＣＰＰアッセイにおいて、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ突然変異体マウスはコントロールマウスとは異なった行動をし得る。

【0165】

Ｅｖｆ１突然変異体同腹仔および野生型同腹仔に対する初期のＣＰＰアッセイ（図１５）を以下の通り行う：場所嗜好性装置は、第３の小さな別のチャンバーにより接続された、２つの別の条件付けチャンバー（異なる壁の色／模様、ならびに異なる床の手触り）からなる。動物の位置は、Ｍｅｄ ＰＣ ＩＶソフトウェア（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ，ＶＴ）を実行するコンピューターに接続された１６の光線によって決定される。第１日目（予備試験）に、マウスを、チャンバーの中央におき、２０分間３つ全てのチャンバーを自由に探索できるようにする。動物が１つの部屋に強い予備試験バイアスを示す場合、それらを研究対象外とする。後日、動物にコカイン（２、５、または７ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を注入し、直ちに、３０分間１つのチャンバーに閉じ込める。翌日、動物に食塩水（ｉ．ｐ．）を注入し、３０分間反対のチャンバーに閉じ込める。薬物処置は連続４日間（２日の食塩水と代替する２日のコカイン）継続する。試験の日、マウスを、薬物を投与しない状態で装置内へ戻し、２０分間３つ全てのチャンバーを自由に探索させることで、それらがどちらの側を気に入るかを決定する。データ解析のため、食塩水ペアチャンバーにおける時間経過を、コカインペアチャンバーにおける時間経過から引き、コカインペアチャンバーに対する嗜好性スコア（秒）を得る。１５匹のＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ突然変異体マウスおよびＩＳ野生型コントロールマウスを、各用量で使用する。あるいは、この数を２０〜２５まで上げて、異なる用量において得られる変動に依存する統計学的有意性（Ｐ＜０．０５）を得てもよい。しかしながら、各グループ中の５ｍｇ／ｋｇおよび５匹のマウスの予備ＣＰＰ試験は、ｐ＝０．０２５有意性を生じた。したがって、各遺伝子型のｎ＝１５が統計的有意なデータ（ｐ＜０．０５）を得るのに十分となることが期待される。

【0166】

Ｅｖｆ１は、ｍＯＴｕに集合するであろう中型有棘ニューロン（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅら２００１）および成体皮質に集合するであろうＧＡＢＡ作動性介在ニューロン（Ａｎｄｅｒｓｏｎら１９９７）の起源である胚の神経節隆起において発現される（Ｋｏｈｔｚら１９９８，ＫｏｈｔｚおよびＦｉｓｈｅｌｌ，２００４）。ＲＩＳＨ解析は、ｍＯＴｕでのＤ２、ｐＤｙｎおよびＧＡＤ６７を発現する多くのニューロンにおける著しい変化を同定しないが、Ｎｉｓｓｌ染色は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンとオーバーラップするニューロンの顕著で異常な形態を示す。これに対し、Ｅｖｆ１突然変異体ＰＦＣの特徴づけは、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数の減少、ならびにドーパミンシグナリングを明らかにする。ＰＦＣ ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、Ｄ２ファミリー受容体を発現すると示された（Ｍｒｚｌｊａｋら１９９６）。Ｄ２受容体へのドーパミン結合は、ＧＡＢＡ放出を結果として生じ、錐体ニューロンによる発火の抑制を増加させる（ＢｕｎｎｅｙおよびＡｇｈａｊａｎｉａｎ，１９７６）。ＧＡＢＡはドーパミン放出を減少させることができ（Ｄｅｗｅｙら１９９２）、そのようにして自己調節メカニズムを提供する。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスにおいて、ＰＦＣ ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数は減少し（図１４）、ＧＡＢＡレベルを低下させる。これは、ドーパミンレベルの増加、およびニューロンの分集団におけるＤ２Ｒの発現増加を結果として生じる。しかしながら、ＰＦＣ介在ニューロンのこの分集団からのＧＡＢＡ放出の増加が、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ ＰＦＣにおいて観察されたＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの喪失を克服するのに十分であることはまずない。Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ ＰＦＣは、減少したＧＡＢＡに起因する、より高いレベルの細胞外ドーパミンを含み得る。ドーパミンの再取込みを防ぐことによって、コカイン処置は、ｗｔコントロールマウスと比較してＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳにおいてさらに細胞外ドーパミン濃度を増加させるであろう。このモデルは、歩行運動感作アッセイにおけるように、またはコカイン条件付け嗜好性を引き出すため、即時反応に十分なコカインの濃度が、ｗｔコントロールよりＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスにおいてより低くなることを予測する。これは、コカインの３時間前に投与されたＧＡＢＡアゴニストＧＶＧが、歩行運動反応を低減することができると報告した、Ｄｅｗｅｙら（１９９７）に一致する。図１５に示されるデータは、ＣＰＰアッセイにおいて、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ突然変異体がコカインチャンバーに対する嗜好性の増加を示すことを支持する。これらの効果は、中脳辺縁系および中脳皮質経路の両方の欠陥の性質および程度に依存する。

【0167】

Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスは、動作スキルに対する試験において野生型のコントロールと相違ない。したがって、動作スキルの欠陥は、歩行運動またはＣＰＰアッセイを混同させないであろう。ＣＰＰアッセイが学習要素を有することから、学習および記憶における相違は、結果の一因となり得る。具体的には、動物は、薬物を受け取って戻るためにチャンバーを思い出さなければならない。変異が、この能力を増加させるか、または減少させるように記憶に影響する場合、ＣＰＰ結果が影響する可能性がある。Ｅｖｆ１突然変異体は、ＣＰＰアッセイにおけるコカインの影響に対する感受性の増加を示すことが見出された。したがって、それらは、野生型同腹仔と同様に、薬物チャンバーがどこであるかを思い出すことができる。しかしながら、Ｅｖｆ１突然変異体における学習能力および記憶能力の増加または減少の可能性のある寄与を直接的に試験するためのコントロール実験も実施する。２つの試験を行う：恐怖条件付けおよびモリス水迷路である。恐怖条件付けは、穏やかな電気ショックと関連する、状況または聴覚シグナルを記憶するための動物の能力を試験することにより、学習および記憶を計測する。試験は２つの段階で行う：１）状況試験：トレーニングの２４〜４８時間後、動物を試験するチャンバーに返し、その行動を、呼吸は別として、完全に不動と定義されるすくみ行動について５〜１０分モニタリングする。２）キュー試験：トレーニングの２４〜４８時間後、動物を異なる発光源を有する変更済の試験チャンバー部屋に返し、プラスチック挿入物を使用してアリーナの手触りおよびサイズを変更し、少量のバニラを試験チャンバー下の寝床に添加して匂いを変更する。マウスを３〜５分間、「新しい」チャンバーを探索できるようにし、その後、聴覚刺激をさらに３〜５分間行う。動物のすくみ行動を、全セッションの間モニタリングする。モリス水迷路試験において、動物を訓練して１０日間に亘ってスイミングプールにて隠されたプラットフォームを位置づける。プラットフォーム排除の後、動物を、特異的空間のキューを使用して、プラットフォームの位置を同定する能力に関してテストする。Ｅｖｆ１突然変異体が、学習および記憶を減少させたが、増加したＣＰＰを示し続けることが分かれば、これはチャンバーの位置を思い出すその能力に、記憶障害が干渉しないことを示唆するであろう。Ｅｖｆ１突然変異体が、学習および記憶能力を増加させ、これが野生型よりも良好に薬物を受け取ったチャンバーを覚え得る可能性がある。この場合、歩行運動アッセイの結果は、ＣＰＰアッセイにおける薬物反応および増強された記憶の相対的な役割の区別の一助となるであろう。また、Ｅｖｆ１突然変異体は増加した歩行運動感度を示さないが、ＣＰＰの増加を示し続け、即時動作反応ではなく、より複雑な報酬を求める経路が影響されたことを示唆し得る。これらの肯定的な結果は、より複雑なコカイン補強パラダイムも使用して、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ突然変異体が他の報酬を求めるアッセイにおいて変化を呈するかどうか判断し得ることを示唆するであろう。具体的には、固定比率（３週）、その後の累進比率（６日）コカイン自己投与スケジュールは、コカインを得るために動物がどれくらい熱心に行動するかを明らかにするであろう。

【0168】

皮質ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数および覚醒剤コカインに対しての反応に関する胚および成人のＥｖｆ１の役割の識別。

【0169】

Ｅｖｆ１は、成体皮質の大半の介在ニューロンの生成の原因となる、胚性領域の遺伝子発現を制御する。加えて、Ｅｖｆ１発現は成人の皮質において持続する。以下の実験を行って、胚および成人のＥｖｆｌの相対的な役割を決定する：
胚または成人のＥｖｆｌが、ＰＦＣにおいてＧＡＢＡ作動性介在ニューロン数を制御するかどうかの判断。

【0170】

Ｅｖｆ１は発達の間に発現され、成体において持続する。上記の特徴が、その胚および成体の役割を描写する一方、直接の試験によって、発達の異なる時期に、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ突然変異体へＥｖｆ１を再導入し、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ表現型に対する影響を試験する。

【0171】

Ｅ９．５は、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳＸ Ｅｖｆ１レスキューのタモキシフェン処置（ＴＥ９．５）に使用された最初の日であり、これが、内因性Ｅｖｆ１が腹側終脳に最初に検出される２日前である。部分的または全体的なレスキューが、１．ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの増加、２．ｐＤｙｎの増加、３．Ｄ２受容体の減少、と定義される。ＴＥ９．５処置脳が部分的または全Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ表現型をレスキューするであろうことが期待される。同様のレスキューがＴＰ３０処置で観察される場合、Ｅｖｆ１の成体発現が、ＰＦＣでのＧＡＢＡ作動性および／またはドーパミン受容性シグナリングの維持における役割を果たすことを示唆するであろう。実験は、均衡のとれたＧＡＢＡ作動性および／またはドーパミン受容性シグナリングの維持における役割を果たす、成体ＰＦＣでのＥｖｆ１発現を支持する。加えて、データは、Ｅｖｆ１の成体発現が、Ｅｖｆ１喪失で観察された表現型をレスキューするかどうかを判断するための支持を提供する。

【0172】

Ｅｖｆｌ１レスキューコンストラクトは、投与のタイミングにかかわらず、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳホモ接合体において観察されるＰＦＣ表現型のいかなる側面もレスキューし得ない。インビボにおける非コーディングＲＮＡのトランス作用性効果よりもむしろ、シス作用性効果に由来するＥｖｆ１喪失の表現型の結果である場合にこのようになるであろう。我々が、トランスフェクションアッセイにおいてＲＮＡのトランス作用性転写活性を検出するとすれば、これはあり得そうもない（図８）。しかしながら、直接これに取り組むため、我々は、先にＧｈａｎｅｍら（２００７）によって定義されるように、既にＤｌｘ１／２ ｌａ調節配列下にＥｖｆ１を発現する、Ｅｖｆ１レスキュートランスジェニック株を作製している。この株が、成功裏にＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの表現型をレスキューすれば、上記のＢＡＣコンストラクトを使用した時間を設定した条件的レスキューが可能であろう。しかしながら、トランスジェニック株を使用したレスキューが可能でない場合、条件付けＥｖｆ１欠失コンストラクトが作製されるであろう（図２０）。このコンストラクトはＥＳ細胞中へエレクトロポレーションされ、ＰＣＲおよびサザンブロットによって相同組換えについてスクリーニングされ、そして、転写アッセイに定義されるようなＥｖｆ１の臨界領域を排除して、条件的に排除されたエクソン３を含む、遺伝子系（ｇｅｎｎｌｉｎｅ）マウスを作出するために使用される。一旦ヘテロ接合体が得られれば、それらをＥｖｆ１ ＴＳ／＋／ＲＯＳＡ−ＥＲｃｒｅマウスと交差して、タモキシフェン処置（Ｅ９．５、Ｅ１７．５およびＰ３０）を用いてＥｖｆ１転写が異なる時に停止した動物を作出する。結果はレスキューから得られたものに類似するかもしれないが、それらはわずかに異なる意味合いを有する。両者とも、Ｅｖｆ１の成体対胚の役割の重要性の疑問に取り組むが、レスキュー実験は、Ｅｖｆ１の再発現が胚性喪失を補足し得るどうかに取り組む。非コーディングＲＮＡを薬物治療の標的と見なす場合、これは特に重要である。

【0173】

胚または成体のＥｖｆ１が、コカイン条件付け場所嗜好性を制御するかどうかの判断。

【0174】

一組の実験を行って、胚または成体のＥｖｆ１が、皮質におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロン喪失を制御するかどうかを決定する。結果により、これは、Ｅｖｆ１再導入による胚または成人のＧＡＢＡ作動性レスキューもＣＰＰアッセイにおけるＥｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスによって呈された増加したコカイン影響を逆にするかどうかという問題を提起する。

【0175】

Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ（胚または成体レスキュー）は、上記により詳細に記載されるように、ＣＰＰアッセイにおいて、Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳ同腹仔と比較されるであろう。

【0176】

Ｅｖｆ１ ＴＳ／ＴＳマウスへのＥｖｆ１の再導入が、レスキューされたＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを結果として生じる一方、これが、ＣＰＰアッセイにおいて観察された、増強されたコカイン効果を逆にするであろうことが期待される。そのようなレスキューが成体において可能な場合、成体におけるＥｖｆ１の直接的な操作は、ＧＡＢＡ依存性のコカイン反応を変更し得ることを示唆するであろう。レスキューが唯一発達の間に可能な場合、成体におけるＥｖｆ１の操作は、恐らく有効な治療ツールではないことを意味するであろう。代わりに、これらの研究は、発達の間に非コーディングＲＮＡの発現およびＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに影響を与える環境因子、母性因子および／または遺伝因子が、薬物感受性に対する素因をどのように制御または防止し得るかを理解するための将来の研究のトピックであるべきであると示唆するであろう。

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参考文献

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【数1-10A】

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【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3】

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【図5】

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【図10-2】

【図11】

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【図15】

【図16】

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【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]