特許 5782479 ＰＥＧ化ＡβＦＡＢ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5782479

(24)【登録日】2015年7月24日

(45)【発行日】2015年9月24日

(54)【発明の名称】ＰＥＧ化ＡβＦＡＢ

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20150907BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20150907BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150907BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20150907BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20150907BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20150907BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   A61K47/48

   A61K39/395 N

   A61P25/28

   A61P9/00

   A61P25/00

【請求項の数】8

【外国語出願】

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2013-133551(P2013-133551)

(22)【出願日】2013年6月26日

(62)【分割の表示】特願2009-546461(P2009-546461)の分割

【原出願日】2008年1月9日

(65)【公開番号】特開2013-241420(P2013-241420A)

(43)【公開日】2013年12月5日

【審査請求日】2013年7月23日

(31)【優先権主張番号】60/885,439

(32)【優先日】2007年1月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100068526

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 恭生

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100138900

【弁理士】

【氏名又は名称】新田 昌宏

(72)【発明者】

【氏名】ケリー・レニー・ベイルス

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・フランク・ブモル

(72)【発明者】

【氏名】チ−キン・チョウ

(72)【発明者】

【氏名】ロナルド・ブラッドリー・ディマットス

(72)【発明者】

【氏名】ライアン・ジョン・ハンセン

(72)【発明者】

【氏名】ウマ・クチブボートラ

(72)【発明者】

【氏名】ジロン・ル

(72)【発明者】

【氏名】ピーター・コロン・マクドネル

【審査官】 木原 啓一郎

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０６６１７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０７１４０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Adv Drug Deliv Rev.，２００２年 ６月１７日，Vol.54, No.4，p.531-545

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸位置１３〜２８の間でヒトＡβペプチドに特異的に結合するＦａｂフラグメントを含む分子であって、前記Ｆａｂフラグメントが、配列番号１の軽鎖可変領域および配列番号２の重鎖可変領域を含み、ポリエチレングリコール分子が、マレイミド結合を介して配列番号２の５６位に共有結合される、分子。

【請求項2】

前記ポリエチレングリコール分子が０．５ｋＤ〜１００ｋＤの分子量を有する、請求項１記載の分子。

【請求項3】

前記ポリエチレングリコール分子が１０ｋＤの分子量を有する、請求項２記載の分子。

【請求項4】

前記ポリエチレングリコール分子が２０ｋＤの分子量を有する、請求項２記載の分子。

【請求項5】

前記ポリエチレングリコール分子が３０ｋＤの分子量を有する、請求項２記載の分子。

【請求項6】

前記ポリエチレングリコール分子が１００ｋＤの分子量を有する、請求項２記載の分子。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子を含む、組成物。

【請求項8】

薬理学的に受容可能な担体をさらに含む、請求項７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドに結合し、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合される抗体フラグメントに関する。

【背景技術】

【0002】

循環型のＡβペプチドは、前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の分解により生じた３９〜４３アミノ酸（ほとんどは４０または４２アミノ酸）から構成される。可溶性から高β−シート含有量を有する不溶性へのＡβの変換、および脳における老人斑および脳血管斑としてのその沈着は、アルツハイマー病、ダウン症、および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を含む、多くの状態および疾患に関連するように見える。Ａβ沈着の予防および／または逆転により、Ａβペプチドと関連する状態を処置できる。

【0003】

Ａβ沈着に作用する治療薬としては、Ａβペプチドに対する抗体（例えば、国際公開第２００１／６２８０１号（特許文献１）、国際公開第２００４／０７１４０８号（特許文献２）およびＴａｍｕｒａ，Ｙ．ら，「Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．ｏｆ Ｄｉｓ．」（２００５）２０：５４１−５４５（非特許文献１）に議論されているヒト化抗体およびフラグメント）が挙げられる。

【0004】

多くの抗体およびそれらの誘導体が、診断および治療に有用であり得るが、抗体の理想的な薬物動態は、しばしば、特定の適用については達成されない。Ａβペプチドと関連する種々の状態および疾患を対処することを目的としている治療抗体は、一般に、インタクトなＦｃ領域を有する免疫グロブリンである。Ｆｃ領域は、血漿中の抗体の半減期を長引かせるのに関与する。しかしながら、この延長は、標的ペプチドに結合する抗体が、効率的に除去されるのを妨げ、その結果、抗原抗体複合体が血漿循環中に存在する時間が延長されるため、不都合であり得る。抗体のその後の投与により、血漿中に望まれない複合体のさらなる蓄積が引き起こされる。抗体のＦｃ部分は、特定の不要のエフェクター機能を有する場合があり、かかる機能を除去するため、改変する必要があり得る。さらに、Ｆｃ部分は、総合的な治療が大がかりになり、これが、送達経路、送達装置、およびスケールアップした製造プロセスに関連する問題をしばしば生じる。

【0005】

Ｆａｂを含む、Ｆｃ部分を有さない抗体フラグメントは、かかるフラグメントが、有力な治療法であり得るかどうかを決定するためにインビボで研究されている。しかしながら、研究により、Ｆａｂのようなフラグメントに関与する治療の有効性が、速いクリアランス速度および短い半減期のために、制限されていることが示唆されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２００１／６２８０１号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２００４／０７１４０８号パンフレット

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．ら，「Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．ｏｆ Ｄｉｓ．」（２００５）２０：５４１−５４５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従って、血漿における複合体形成および潜在的エフェクター機能によって引き起こされ得る潜在的副作用を回避すると同時に、改良された投与計画を可能にする薬物動態および薬力学を有する活性のある治療的抗Ａβペプチド抗体分子の必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、Ａβペプチドを標的とし得る治療抗体または抗体フラグメントに関連する多くの問題を克服する。本発明の化合物は、Ａβに結合し、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合する抗体フラグメントを含む。これらの化合物は、哺乳動物細胞株における抗体産生に関連する種々の問題（例えば、コストの問題、精製の問題、および汚染している内因的に産生された抗原の問題）を取り除く細菌細胞系または酵母細胞系において産生できる。さらに、本発明の化合物は皮下投与されてもよく、Ａβへの抗体フラグメントの親和性および選択性を保存すると同時に、理想的な薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）プロファイルを有する。

【0010】

全く予測も予想もできなかった事であるが、出願人らは、抗体フラグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）へのＰＥＧ分子の共有結合は、Ａβへの抗体フラグメントの活性、親和性または選択性を変化させないことも見出した。

【0011】

本発明は、アミノ酸位置１３〜２８の間でヒトＡβペプチドに特異的に結合する抗体フラグメントを含む分子を提供し、その抗体フラグメントはＰＥＧ分子に共有結合される。好ましくは、その抗体フラグメントはＦａｂフラグメントである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

一実施形態において、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体フラグメントを含む分子を提供し、ここで、その軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：ＣＤＲＬ１：ＳＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨ（配列番号６）、ＣＤＲＬ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号７）およびＣＤＲＬ３：ＴＱＳＴＨＳＰＷＴ（配列番号８）を有するＣＤＲ領域を含み、その重鎖可変領域は、アミノ酸配列：ＣＤＲＨ１：ＧＹＴＦＳＲＹＳＭＳ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＱＩＮＩＲＧＣＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧ（配列番号１０）またはＱＩＮＩＲＧＮＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧ（配列番号１１）、およびＣＤＲＨ３：ＧＤＦ（配列番号１２）を有するＣＤＲ領域を含む。好ましくは、かかる分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかに共有結合されるＰＥＧ分子を有する。より好ましくは、かかる分子は、ＣＤＲに共有結合されるＰＥＧ分子を有する。さらにより好ましくは、かかる分子は、ＣＤＲ内のシステイン残基に共有結合されるＰＥＧ分子を有する。最も好ましくは、かかる分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域のＣＤＲＨ２：ＱＩＮＩＲＧＣＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧ（配列番号１０）に共有結合されるＰＥＧ分子を有する。

【0013】

別の実施形態において、本発明は、配列番号１の軽鎖可変領域、および配列番号２の重鎖可変領域を有する抗体フラグメントを含む分子を提供する。好ましくは、かかる分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかに共有結合されるＰＥＧ分子を有する。より好ましくは、かかる分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域のＣＤＲに共有結合されるＰＥＧ分子を有する。さらにより好ましくは、かかる分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域のＣＤＲ内のシステイン残基に共有結合されるＰＥＧ分子を有する。最も好ましくは、かかる分子は、配列番号２の重鎖可変領域のアミノ酸位置５６においてシステインに共有結合されるＰＥＧ分子を有する。

【0014】

別の実施形態において、本発明は、ＦａｂフラグメントまたはＳｃＦｖフラグメントを含む分子を提供し、ここで、そのＦａｂフラグメントまたはＳｃＦｖフラグメントは、ＰＥＧ分子に共有結合されて、配列番号１の軽鎖可変領域、および配列番号２の重鎖可変領域を有する。好ましくは、かかる分子は、配列番号２の重鎖可変領域のアミノ酸位置５６においてシステインに共有結合されるＰＥＧ分子を有する。また、好ましくは、かかる分子において、ＰＥＧの分子量は約０．５ｋＤ〜約３０ｋＤであり、より好ましくは２０ｋＤである。

【0015】

別の実施形態において、本発明は、配列番号１の軽鎖可変領域および配列番号２の重鎖可変領域を有する抗体フラグメントを含む分子を提供し、ここで、前記抗体フラグメントは、配列番号２の重鎖可変領域の５６位において２０ｋＤのＰＥＧ分子に共有結合される。好ましくは、かかる分子において、ＰＥＧ分子は、マレイミド結合を介して共有結合される。

【0016】

別の実施形態において、本発明は、アミノ酸位置１３〜２８の間でヒトＡβペプチドに特異的に結合する抗体フラグメントを含む分子を提供し、ここで、その抗体フラグメントは、ＰＥＧ分子に共有結合され、配列番号１の軽鎖可変領域、および配列番号３の重鎖可変領域を有する。好ましくは、かかる分子は、抗体フラグメントのヒンジ領域に共有結合されるＰＥＧ分子を有する。より好ましくは、ＰＥＧは、マレイミド結合を介してヒンジ領域に共有結合される。

【0017】

本発明はまた、血漿中の複合体形成によって引き起こされ得る潜在的副作用を最小化し、Ａβへの抗体フラグメントの活性、親和性および選択性を保存または向上させると同時に、週一度の投与計画を可能にする薬物動態および薬力学を有する活性のある治療分子を生じる抗体フラグメントにＰＥＧ分子が共有結合される、その抗体フラグメント、好ましくはヒト化抗体フラグメントを有する分子を含む。

【0018】

本発明はまた、前臨床アルツハイマー病および臨床的アルツハイマー病の両方、ダウン症、ならびに前臨床アミロイド血管症（ＣＡＡ）および臨床的アミロイド血管症（ＣＡＡ）、認知障害、脳卒中、脳内出血、および全般的精神衰弱を含む、Ａβペプチドに関連する状態および疾患を処置、予防または逆転する方法を含む。これらの方法は、本明細書に記載され特許請求されている有効量の分子を患者に投与することを含む。

【0019】

本発明は、アミノ酸位置１３〜２８の間でＡβペプチドに特異的に結合する抗体フラグメントを含む分子を提供し、ここで、その抗体フラグメントは、ＰＥＧ分子に共有結合される。本発明者らは、Ａβに結合する抗体フラグメントに対してＰＥＧ分子を共有結合させても、Ａβへの抗体フラグメントの活性、親和性または選択性を負に変化させないことを見出した。より驚いたことには、本発明者らは、Ａβに結合する抗体フラグメントのＣＤＲに対して２０ｋＤまでの分子量を有するＰＥＧ分子を共有結合させても、Ａβへの抗体フラグメントの活性、親和性または選択性を負に変化させないことを見出した。これらの抗体フラグメントは、皮下投与されてもよく、柔軟性のある投与計画を支持する治療上の使用のための改良されたＰＫ／ＰＤプロファイルを有している。さらに、これらの抗体フラグメントは、哺乳動物細胞における全長の抗体産生に関連する種々の問題を取り除く細菌細胞系または酵母細胞系において産生できる。本発明のＰＥＧ化抗体フラグメントは、Ａβペプチドに関連して生じるヒトの症状を予防法および治療法の両面で、予防および処置する機会を与える。

【0020】

天然に存在する全長の抗体は、４つのペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互に連結される２つの重（Ｈ）鎖（全長の場合、約５０〜７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（全長の場合、約２５ｋＤａ）からなる免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。

【0021】

軽鎖はκまたはλに分類され、特定の定常領域によって特徴付けられる。各軽鎖は、Ｎ末端軽鎖可変領域（本明細書中では「ＬＣＶＲ」）および１つのドメインからなる軽鎖定常領域ＣＬからなる。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定し、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２に分けてもよい。各重鎖タイプは、特定の定常領域によって特徴付けられる。各重鎖は、Ｎ末端重鎖可変領域（本明細書中では「ＨＣＶＲ」）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡについては３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなり、ＩｇＭおよびＩｇＥについては４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）からなる。

【0022】

ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、超可変性の領域、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より多くの保存される領域が散在する領域にさらに細かく分けられ得る。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配列される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３」と称され、軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３」と称される。ＣＤＲは、抗原と特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび位置決めは、周知のカバット番号付与法（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）に従う。

【0023】

各軽−重鎖対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」または「抗原結合領域」または「抗原結合ドメイン」または「抗原結合部位」とは、抗原と相互作用し、抗体に抗原への特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含有する抗体分子の部分を、交換可能に指す。この抗体部分は、抗原結合残基の適切な配座を維持するのに必須である「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域は、ヒト起源または実質的にヒト起源（少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％ヒト起源）であり、カバット番号付与に従う。あるいは、抗原結合領域は、ヒト配列に由来してもよい。

【0024】

本明細書で使用される場合、用語「抗体フラグメント」とは、抗原（例えば、Ａβ）に特異的に結合する能力を保有する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の「抗体フラグメント」という用語の範囲内に含まれる分子の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、ならびに（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインである、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらを単一のタンパク鎖として合成できる合成リンカーによる組み換え法を用いて、それらは結合されてもよく、ここで、ＶＬおよびＶＨ領域は対をなして、一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６：およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）を形成する。かかる一本鎖抗体はまた、「抗体フラグメント」という用語の範囲内に含まれることが意図されている。二重特異性抗体などの一本鎖抗体の他の形態もまた、「抗体フラグメント」という用語に含まれる。二重特性抗体は二価の二重特異性結合タンパク質であり、ＶＨおよびＶＬドメインは一本鎖ポリペプチドで発現されるが、同じ鎖で２つのドメイン間の対を形成させるには短すぎるリンカーを用いて、強制的にそのドメインに別の鎖の相補的ドメインと対を形成させ、２つの抗原結合部位を生成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。

【0025】

さらに、抗体またはその抗体フラグメントは、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドと抗体または抗体フラグメントとの共有結合または非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着分子の部分であってもよい。かかる免疫接着分子の例としては、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら、（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３−１０１）ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２などの抗体フラグメントは、それぞれ、全抗体のパパインまたはペプシン消化のような従来技術を用いて、全抗体から調製できる。さらに、抗体、抗体フラグメントおよび免疫接着分子は、当該分野において周知の標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。抗体、抗体フラグメントおよび免疫接着分子は、グリコシル化されてもよいし、されなくてもよく、これも本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである。

【0026】

用語「ヒト化抗体」とは、部分的または完全に、ヒト抗体生殖細胞系または再構成された配列由来のアミノ酸配列、および非ヒトＣＤＲを有する抗体の配列を変更することにより作製されるアミノ酸配列からなる抗体を指す。可変領域のフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域によって置換されてもよい。ヒトフレームワーク領域は、ゲノムフレームワーク領域、および１つ以上のアミノ酸置換を含むものを含む。特に、かかる置換は、ヒトフレームワークにおける特定の位置でのアミノ酸が、非ヒトＣＤＲの天然フレームワークの対応する位置からのアミノ酸と置き換えられる変異を含む。例えば、マウスＣＤＲを有するヒト化抗体は、特定のヒトフレームワークアミノ酸を対応するマウスフレームワークアミノ酸で置き換える１つ以上の置換を含んでいてもよい。使用できるマウス抗体をヒト化することに関する方法をさらに記載している参考文献は、例えば、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８６９，１９９１；米国特許第５，６９３，７６１号；同第４，８１６，３９７号；同第５，２２５，５３９号；Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０，１９８３に記載されるようなコンピュータープログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ；ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６，１９８８）に従って、実質的に実施できる）。好ましくは、本発明の抗体はヒト化抗体フラグメントである。より好ましくは、本発明の抗体はヒト化抗体ｆａｂフラグメントである。

【0027】

本発明はまた、１つ以上のＰＥＧ分子に共有結合される抗体フラグメントを含む。用語「ポリエチレングリコール」および「ＰＥＧ」とは、交換可能に用いられ、ポリエチレングリコールまたは当該分野において周知のその誘導体（例えば、米国特許第５，４４５，０９０号；同第５，９００，４６１号；同第５，９３２，４６２号；同第６，４３６，３８６号；同第６，４４８，３６９号；同第６，４３７，０２５号；同第６，４４８，３６９号；同第６，４９５，６５９号；同第６，５１５，１００号および同第６，５１４，４９１号を参照のこと）を指すことが意図される。好ましくは、ＰＥＧは、抗体フラグメントの１つ以上のリジンまたはシステイン残基に共有結合される。より好ましくは、ＰＥＧは、抗体フラグメントの重鎖可変領域における１つ以上のリジンまたはシステイン残基に共有結合される。さらにより好ましくは、ＰＥＧは、抗体フラグメントのＣＤＲ内の１つ以上のリジンまたはシステイン残基に共有結合される。最も好ましくは、ＰＥＧは、前記配列番号２の重鎖可変領域のアミノ酸位置５６においてシステイン残基に結合される。あるいは、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントのヒンジ領域へのリンカーまたはスペーサー分子を介して抗体フラグメントに結合されてもよい。ヒンジ領域へのリンカーおよびスペーサー分子の付加は、当該分野において周知である。さらに、ＰＥＧは、当該分野において周知の技術によって、抗体フラグメントの改変された非天然アミノ酸に共有結合されてもよい。

【0028】

その典型的な形態において、「ＰＥＧ」は、末端ヒドロキシル基を有するリンカーポリマーであり、式ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨ（式中、ｎは、約８〜約４０００である）を有する。末端水素は、アルキルまたはアルカノール基（Ｍ−ＰＥＧ）などの保護基で置換されてもよい。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基は、活性化されてペプチドと反応することが好ましい。種々の化学修飾が、官能基（例えば、活性カーボネート、活性エステル、アルデヒド、トレシレート）を有する活性ＰＥＧ誘導体を調製するために使用されるか、または所定の標的分子に結合するのに適切なＰＥＧ−プロピオンアルデヒドが使用される。次いで、活性化ＰＥＧ誘導体は、ポリペプチド薬物の反応基に共有結合される。本発明に有用な多くのＰＥＧ形態が存在する。非常に多くのＰＥＧ誘導体が当該分野において存在し、本発明における使用に適切である。本発明の抗体フラグメントに共有結合されるＰＥＧ分子は、特定の型またはサイズに限定されることを意図されていない。ＰＥＧの分子量は、好ましくは約０．５キロダルトン（ｋＤ）〜約１００ｋＤであり、より好ましくは約５ｋＤ〜約３０ｋＤであり、最も好ましくは約１ｋＤ〜約２０ｋＤである。ＰＥＧは直鎖状であってもまたは分枝状であってもよく、本発明の抗Ａβペプチド抗体フラグメントは、そのペプチドに共有結合された１、２、３、４、５または６つのＰＥＧ分子を有してもよい。１つのＰＥＧ分子抗体フラグメントが存在することが最も好ましい；しかしながら、１つのペプチド分子につき、１つより多くのＰＥＧ分子が存在する場合、６つ以下であることが好ましい。ＰＥＧ分子の両端は、２つ以上の抗Ａβペプチド抗体フラグメント分子を一緒に架橋するように適合できることがさらに企図されている。タンパク質、抗体およびそのフラグメントにＰＥＧ分子を結合する方法は、当該分野において周知である。

【0029】

本明細書で使用される場合、用語「Ｋ_Ｄ」とは、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を指すと意図される。それは、式：Ｋ_Ｄ＝ｋ_Ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ（Ｍで測定される）によって計算される。本明細書で使用される場合、用語「ｋ_ｏｎ」とは、単位：Ｍ^−１秒^−１で測定される順反応の複合体形成反応の会合速度定数または特異反応速度を指すと意図される。本明細書で使用される場合、用語「ｋ_ｏｆｆ」とは、単位：秒^−１で測定される抗体／抗原複合体からの抗体の解離について、解離速度定数または特異反応速度を指すと意図される。

【0030】

本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」とは、特異的結合対の１つのメンバーが、その特異的結合パートナー（複数を含む）以外の分子に有意に結合しない状況を指す。その用語はまた、例えば、本発明の抗体の抗原結合ドメインが、多くの抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合に適用可能であり、その場合、抗原結合ドメインを保有する特異的抗体は、そのエピトープを保有する種々の抗原に結合できる。従って、本発明の分子は、Ａβペプチドに特異的に結合するが、ＡＰＰには特異的に結合しない。さらに、本発明の分子は、アミノ酸ＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（１３〜８）（配列番号４）を含む直鎖、非直鎖または立体配座のＡβエピトープの間で特異的に結合する。

【0031】

本発明の分子に関して、用語「活性」とは、エピトープ／抗原親和性および特異性、インビボまたはインビトロにおけるＡβペプチドの活性を無効化または拮抗する能力、ＩＣ_５０、抗体のインビボでの安定性ならびに抗体の免疫特性を含むが、これらに限定されない。当該分野において認識される抗体の他の同定可能な生物学的特性または特徴としては、例えば、交差反応性（すなわち、標的化ペプチドの非ヒト相同体との交差反応性、あるいは一般的に他のタンパク質または組織との交差反応性）、および哺乳動物細胞におけるタンパク質の高発現レベルを保存する能力が挙げられる。上述の特性または特徴は、当該分野において認識されている技術（ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡ表面プラズモン共鳴分析、制限のないインビトロまたはインビボでの中和アッセイ、受容体結合、サイトカインもしくは成長因子産生および／または分泌、シグナル変換、ならびにヒト、霊長類を含む異なる起源、または任意の他の起源由来の組織部分を用いる免疫組織化学が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、観察、測定または評価され得る。

【0032】

用語「個体」、「被験者」および「患者」とは、本明細書で交換可能に使用され、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。特定の実施形態において、その患者はさらに、Ａβペプチドの減少した活性から利点を得る疾患または障害または状態で特徴付けられる。

【0033】

本明細書に使用される場合、「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」との表現は、交換可能に使用され、本発明の任意の単離されたポリヌクレオチドまたは本発明のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲもしくはモノクローナル抗体をコードする配列を含む任意の組み換えベクター（複数も含む）の受容物である個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含む。その子孫は、形態学において、または全ＤＮＡ相補体において、自然、偶発的、または意図的変異および／または変化に起因して、元の親細胞と完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明の抗体フラグメントまたはその軽鎖もしくは重鎖を発現する組み換えベクターまたはポリヌクレオチドで、形質転換、形質導入または感染された細胞を含む。宿主染色体中に安定的に導入されるか、またはそうではないかのいずれかである、本発明の組み換えベクターを含む宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」とも称される。本発明の宿主細胞を生成するための好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０、ＣＲＬ−１６５１）およびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）である。本発明に使用されるさらなる宿主細胞としては、植物細胞、酵母細胞、他の哺乳動物細胞および原核細胞が挙げられる。より好ましくは、本発明に使用するための細胞は、酵母細胞または原核細胞である。

【0034】

用語「Ａβペプチドに関連する状態または疾患」または「Ａβ活性を有する疾患に関連する状態」とは、１）脳におけるβアミロイド斑の進行、２）Ａβの異常型の合成、３）Ａβの特定の毒性型の形成、あるいは４）Ａβの合成、分解またはクリアランスの異常速度、に関連する全ての状態、障害および疾患を含むことを意味する。アルツハイマー病、ダウン症、脳アミロイド血管症、特定の血管性認知症、および軽度認識障害などの状態および疾患は、このようなＡβとの関係を有することが知られているか、またはそうであると考えられている。

【0035】

本発明は、アミノ酸位置１３〜２８の間でＡβペプチドに特異的に結合する抗体フラグメントを含む分子を提供し、その抗体フラグメントは、ＰＥＧ分子に共有結合される。好ましくは、抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントおよび／またはｓｃＦｖフラグメントなどのヒト化抗体フラグメントである。最も好ましくは、その抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである。Ａβペプチドへの本発明の分子の特異的結合により、Ａβペプチドに関連する疾患および障害、すなわち、Ａβペプチドの生物活性の阻害から利益を得る状態、疾患または障害の治療薬として、前記分子を使用することが可能となる。

【0036】

本発明の一実施形態において、抗体フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有し、その軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：ＣＤＲＬ１：ＳＳＳＱＳＬＩＹＳＤＧＮＡＹＬＨ（配列番号６）、ＣＤＲＬ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号７）およびＣＤＲＬ３：ＴＱＳＴＨＳＰＷＴ（配列番号８）を有するＣＤＲ領域を含み、ならびに／あるいはその重鎖可変領域は、アミノ酸配列：ＣＤＲＨ１：ＧＹＴＦＳＲＹＳＭＳ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＱＩＮＩＲＧＣＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧ（配列番号１０）またはＱＩＮＩＲＧＮＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧ（配列番号１１）、およびＣＤＲＨ３：ＧＤＦ（配列番号１２）を有するＣＤＲ領域を含む。好ましくは、本発明の抗体フラグメントの６つのＣＤＲは、一緒に存在する。本発明のＣＤＲを含む組成物は、概して、抗体の重鎖配列または軽鎖配列あるいはその実質的な部分であり、ここで、ＣＤＲは、カバット番号付与と一致する位置に配置される。重鎖および軽鎖の各鎖についての３つのＣＤＲ領域は、式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４によって表される連続配列としてフレームワーク領域に提供される。上記した順でＣＤＲを有する連続配列として構成される場合、重鎖または軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、抗体フラグメントの完全なフレームワーク領域を形成するように組み合わされる。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域は、ヒト起源または実質的にヒト起源（すなわち、約８０、８２、８５、８７、９０、９２、９５、９７％より大きい）である。

【0037】

好ましくは、本発明の抗体フラグメントは、以下の配列のペプチドを含むＬＣＶＲ

【化1】

および以下の配列

【化2】

からなる群より選択される配列を有するペプチドを含むＨＣＶＲを含む。

【0038】

あるいは、抗体フラグメントは、配列番号１からなる配列を有するペプチドを含むＬＣＶＲおよび配列番号２または配列番号３からなる群より選択される配列を有するペプチドを含むＨＣＶＲを含み、ここで、そのＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、抗体フラグメントに一緒に存在する。当業者は、本発明の抗体フラグメントが、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの特定の配列には限定されず、これらの配列が本発明の分子に存在する場合、親抗体の抗原結合能力および少なくとも１つの他の機能的特性、例えば、エピトープ特異性、Ａβペプチドへの結合に関して親抗体と競合する能力、Ａβペプチド結合へのＩＣ_５０および／またはＫ_Ｄもしくはｋ_ｏｆｆ値を保有するか、または向上させるこれらの配列の変異体も含むことは、理解するだろう。

【0039】

本発明の別の実施形態において、可変領域の全てまたは一部は、配列番号１によって示されるような特定のＬＣＶＲ配列、および配列番号２または配列番号３に示されるようなＨＣＶＲによって限定され、そして、インビボまたはインビトロで少なくとも１つのＡβペプチド活性に拮抗またはそれを無効化することによってさらに特徴付けられる。可変領域の全てまたは一部が、本明細書中のＬＣＶＲ配列番号１およびＨＣＶＲ配列番号２または配列番号３によって示されるような特定の配列によって限定される本発明の抗体は、ヒトＡβペプチドには特異的に結合するが、ヒトＡＰＰには結合しないことによってさらに特徴付けられる。

【0040】

本発明の一態様において、ＰＥＧ（またはその誘導体）は、抗体フラグメントの１つ以上のリジン、システインまたは非天然の修飾されたアミノ酸残基に共有結合される。好ましくは、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかに共有結合される。より好ましくは、かかる分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域のＣＤＲに共有結合されるＰＥＧ分子を有する。最も好ましくは、かかる分子は、配列番号２の重鎖可変領域のアミノ酸位置５６においてシステインに共有結合されるＰＥＧ分子を有する。あるいは、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントのヒンジ領域へのリンカーまたはスペーサー分子を介して抗ＡβペプチドＦａｂ抗体に結合されてもよい。

【0041】

本発明の別の態様において、ＰＥＧ分子は、１つ以上の操作された本発明の抗体のリジン、システインまたは非天然の修飾されたアミノ酸残基に共有結合されて、Ａβへの抗体フラグメントの親和性および選択性に有意に影響を与えずに、抗体分子に存在するグリコシル化（ｇｙｃｌｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を置換する。好ましくは、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域または軽鎖可変領域でグリコシル化シグナルを置換する。より好ましくは、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントの重鎖可変領域のＣＤＲでグリコシル化シグナルを置換する。最も好ましくは、ＰＥＧ分子は、配列番号２の重鎖可変領域の５６位でグリコシル化シグナルを置換する。

【0042】

本発明における抗体に共有結合されたＰＥＧ分子は、特定の型またはサイズに限定されることを意図されていない。ＰＥＧの分子量は、好ましくは約０．５ｋＤ〜約１００ｋＤ、より好ましくは約０．５ｋＤ〜約３０ｋＤ、最も好ましくは約１ｋＤ〜約２０ｋＤである。あるいは、ＰＥＧの分子量は、約０．５ｋＤ、約１ｋＤ、約５ｋＤ、約１０ｋＤおよび約２０ｋＤからなる群より選択されてもよい。ＰＥＧは、直鎖状または分枝状であってもよく、本発明のＰＥＧ化抗Ａβペプチド抗体は、ペプチドに結合される１つ以上のＰＥＧ分子を有してもよい。好ましくは、１つのＰＥＧ化抗Ａβペプチド抗体につき、１つのＰＥＧ分子が存在する。

【0043】

最も好ましくは、本発明の抗体分子は、配列番号１の軽鎖可変領域、および配列番号２の重鎖可変領域を有する抗体フラグメントを含み、ここで、前記抗体フラグメントは、配列番号２の重鎖可変領域の５６位において２０ｋＤのＰＥＧ分子に共有結合される。

【0044】

本発明の抗体が結合する抗原性Ａβペプチドエピトープは、アミノ酸ＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号４）を含む直鎖状、非直鎖状または立体配座のエピトープである。前記エピトープに結合する抗体は、それらのＡＰＰ結合と比較してＡβペプチドに特異的および選択的に結合する。本発明のモノクローナル抗体は、それがヒトＡＰＰに結合するより少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍高く（例えば、より高い親和性またはより高い特異性）、より好ましくは、それがＡＰＰに結合するより少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００倍高く、Ａβペプチドに結合し、さらに好ましくは、それは、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるバックグランドレベル、あるいはＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡアッセイにおけるＫ_Ｄ値より高いレベルではＡＰＰに結合しない。

【0045】

本発明の抗体フラグメントは、アミノ酸ＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号５）を含まないエピトープより、少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍高く（例えば、より高い親和性またはより高い特異性）、アミノ酸ＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号５）の間でエピトープに結合する。より好ましくは、アミノ酸ＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号５）を含まないエピトープより少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００倍高く結合し、さらにより好ましくは、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるバックグランドレベル、あるいはＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡアッセイにおけるＫ_Ｄ値より高いレベルではアミノ酸ＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号５）を含まないエピトープに結合しない。

【0046】

好ましい実施形態において、本発明は、ＫｉｎＥｘＡ法によって測定した場合、約２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭまたは３０ｐＭ未満、好ましくは約２０ｐＭ未満のヒトＡβペプチドへの結合親和性（Ｋ_Ｄ）で、配列ＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号５）を含むＡβペプチドへの強力な結合親和性を有する抗体フラグメント、すなわち、Ａβペプチド、またはその一部に結合する［すなわち、抗体がＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫと接触する］抗体フラグメントを提供する。あるいは、ヒトＡβペプチドへの結合親和性（Ｋ_Ｄ）は、０．１ｐＭ〜２００ｐＭである。抗体親和性は、本明細書の以下の実施例に記載する方法で測定してもよいし、または当該分野で利用可能な他の方法で測定してもよい。

【0047】

本発明の抗体の投与経路は、経口、非経口、吸入または局所的であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、非経口的投与にとって適切な医薬組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、用語、非経口とは、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内、または腹腔内投与を含む。静脈内または腹腔内または皮下注射による末梢全身送達が好ましい。より好ましくは、本発明の抗体の投与経路は、皮下注射を介する。かかる注射の適切なビヒクルは、当該分野においては明白である。

【0048】

本発明の抗体フラグメントは、血漿において対応する抗Ａβペプチド全長抗体より短い半減期を有し、対応する抗Ａβ全長抗体より血漿から速く除去される。あるいは、本発明の抗体は、ＰＥＧ分子に共有結合されない対応する抗ＡβペプチドＦａｂフラグメントより長い血漿半減期を有し、ＰＥＧ分子に共有結合されない対応する抗ＡβペプチドＦａｂフラグメントほどには血漿から速く除去されない（実施例１、２および３）。本明細書で使用される場合、抗体に関する用語「対応する」とは、同じＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを有する抗体を指す。例えば、配列番号１のＬＣＶＲおよび配列番号２からなるＨＣＶＲを有する抗体Ｆａｂフラグメントに関する対応する全長抗体は、インタクトなＦｃドメインと同じ配列番号１のＬＣＶＲおよび配列番号２からなるＨＣＶＲを一緒に有する。

【0049】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする組み換えポリヌクレオチドに関し、それは、発現した場合、配列番号１のＬＣＶＲおよび配列番号２からなるＨＣＶＲを含む。コドンの縮重に起因して、他のポリヌクレオチド配列は、これらの配列に容易に置換され得る。本発明の特に好ましいポリヌクレオチドは、発現した場合、配列番号６〜８の軽鎖ＣＤＲ、および配列番号９、１０または１１および１２の重鎖ＣＤＲ、あるいは配列番号１〜配列番号３の可変領域のうちのいずれかを含む抗体をコードする。配列番号１のＬＣＶＲおよび配列番号２のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列の例は、配列番号１３（ＬＣＶＲ）および配列番号１４（ＨＣＶＲ）にそれぞれ表される。

【0050】

ポリヌクレオチドは、典型的に、自然に会合するプロモーター領域または異種プロモーター領域を含む、ヒト化免疫グロブリンをコードする配列に作動可能に連結される発現制御ポリヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核プロモーター系であるが、原核細胞の制御配列が使用されてもよい。ひとたび、ベクターが宿主細胞株に組み込まれると、宿主細胞は、ヌクレオチド配列を発現するのに適切な条件下で増殖させ、所望の場合、軽鎖、重鎖、軽／重鎖二量体またはインタクトな抗体、結合フラグメントあるいは他の免疫グロブリン型の回収および精製がそれに続いてもよい。

【0051】

所望の抗体または抗体フラグメントを最終的に発現できる本発明の核酸配列は、種々の周知技術のうちのいずれかを用いて、種々の異なるポリヌクレオチド（ゲノムまたはｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチドなど）および構成要素（例えば、Ｖ、Ｊ、ＤおよびＣ領域）から形成できる。適切なゲノムおよび合成配列の結合は、一般的な生成方法であるが、ｃＤＮＡ配列を利用してもよい。

【0052】

ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞から、しかし好ましくは、不死化Ｂ細胞から、周知の手順に従って単離され得る。免疫グロブリン発現および分泌のためのポリヌクレオチド配列および宿主細胞にとって適切な細胞は、当該分野において周知の多くの供給源から得ることができる。

【0053】

具体的に本明細書に記載されるヒト化抗体または抗体フラグメントに加えて、他の「実質的に相同の」修飾された抗体が、容易に設計でき、当業者に周知の種々の組み換えＤＮＡ技術を用いて製造できる。例えば、フレームワーク領域は、アミノ酸置換、終端付加、中間体付加、終端欠失および中間欠失などによって、一次構造レベルで天然配列から変化させることができる。さらに、種々の異なるヒトフレームワーク領域は、本発明のヒト化抗体の基礎として、単独で、または組み合わせて使用してもよい。一般に、遺伝子の修飾は、部位特異的突然変異誘発法などの種々の周知技術によって容易に成され得る。

【0054】

上述のように、ポリヌクレオチドは、配列が、発現制御配列に作動可能に連結された（すなわち、発現制御配列の機能を確実にするために配置された）後に、宿主中で発現される。これらの発現ベクターは、典型的に、宿主染色体ＤＮＡのエピソームまたは必須部分として、宿主細胞中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、選択マーカー、例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシンを含むので、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの宿主細胞の検知を可能である。これらの細胞の発現ベクターとしては、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終了配列を含むことができる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。

【0055】

目的のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖をコードする配列ならびに発現制御配列）を含むベクターは、細胞の種類に応じて変わる周知の方法によって、宿主細胞に移すことができる。種々の宿主が、当該分野において周知の技術を用いて本発明の抗体を発現するために使用されてもよい。好ましい細胞株としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０（ＡＴＣＣ、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、マナッサス、バージニア州などの公的な保存場所から利用可能である）が挙げられる。好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子を含む１つ以上のベクターまたは構築物を含む。本発明の宿主細胞は、本発明のベクターが導入される細胞であり、前記ベクターは、本発明のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドおよび／または本発明のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、本発明の２つのベクターが導入されている宿主細胞を提供し、１つは、本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、もう１つは、本発明の抗体に存在するＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、各々は、プロモーター配列に作動可能に連結される。細胞種類としては、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞および酵母細胞が挙げられる。好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、酵母細胞あるいは任意の好ましい細胞種類の誘導体または子孫である。

【0056】

ひとたび発現すると、本発明のインタクトな抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン型は、硫安塩析、イオン交換、親和性、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該分野の標準的手段に従って精製され得る。薬学的用途のために、少なくとも約９０％、９２％、９４％または９６％均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８％〜９９％またはそれより高い均一性が最も好ましい。ひとたび、部分的または所望の場合均一に精製されると、次いで、ペプチドは、本明細書に指示されるように、治療または予防用に使用されてもよい。

【0057】

認知障害、脳卒中、脳出血、および全般的精神衰弱を生じる多くの症状は、Ａβペプチドを含有する脳の老人斑および脳血管斑に関連しているように見える。これらの状態の中には、前臨床アルツハイマー病および臨床的アルツハイマー病、ダウン症、ならびに前臨床アミロイド血管症（ＣＡＡ）および臨床的アミロイド血管症（ＣＡＡ）がある。アミロイド斑は、Ａβペプチドから形成される。これらのペプチドは、血液および脳脊髄液（ＣＳＦ）において、典型的には、リポタンパク質との複合体型として循環する。循環型におけるＡβペプチドは、共通前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（多くの場合、ＡＰＰと指定されている）の分解から得られる３９〜４３アミノ酸（ほとんどは４０または４２アミノ酸）から構成される。可溶性ＡＰの一部の形態は、それら自体が神経毒であり、神経変性および／または認識低下の重症度を決定する場合がある（ＭｃＬｅａｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｔｕｒｏｌ．（１９９９）４６：８６０−８６６；Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ら、（１９９８）９５：６４４８−６４５３；Ｎａｓｌｕｎｄ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（２０００）２８３：１５７１）。

【0058】

従って、本発明の分子を含む医薬組成物は、Ａβペプチドの存在が、望ましくない病理学的作用を引き起こすか、または原因となる症状、あるいは、Ａβ活性の減少が、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて治療的利点を有する症状（Ａβペプチドを含有する脳における老人斑および脳血管斑に関連しているように見える臨床的アルツハイマー病または前臨床アルツハイマー病、ダウン症、臨床的アミロイド血管症（ＣＡＡ）または前臨床アミロイド血管症（ＣＡＡ）、前駆アルツハイマー病、軽度認識障害（ＭＣＩ）および認知障害、脳卒中、脳出血、および全般的精神衰弱が挙げられるが、これらに限定されない）の処置または予防に有用であり得る。Ａβペプチド活性が有害であるか、減少したレベルの生物活性Ａβペプチドから利益を得る、上述の障害の少なくとも１つを処置または予防するため、本発明の分子の使用が本明細書に企図されている。さらに、上述の障害の少なくとも１つの処置用の医薬の製造における本発明の分子の使用も企図されている。

【0059】

本明細書に使用される場合、用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患および／または疾患の進行に起因する悪影響の、部分的または完全な治癒であってもよい。本明細書に使用される場合、「処置」とは、特にヒトへの化合物の投与を含み、そして（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その進行を停止させること；または（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患または障害の退行、あるいはそれらの症状または合併症の軽減を含む。投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療的または予防的反応）を提供するために調整されてもよい。例えば、単回ボーラスが投与されてもよいし、いくつかの分割量が、時間をかけて投与されてもよいし、あるいは、その用量は、治療状況の要求によって比例的に減少または増加されてもよい。

【0060】

本発明の分子は、患者への投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。本発明の分子は、単回投与または複数回投与において、単独で、または製薬的に許容し得る担体、希釈剤および／または賦形剤と組み合わせて投与され得る。投与のための医薬組成物は、選択された投与様式に適合するように設計され、必要に応じて、製薬的に許容し得る希釈剤、担体および／または賦形剤、例えば、分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定剤などが使用される（例えば、本明細書の実施例１４を参照のこと）。上記組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５（これは、一般に医師に公知である製剤技術の概要を提供する）のような従来技術に従って、設計される。

【0061】

本発明の分子を含む医薬組成物は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔、舌下または坐剤投与を含む、標準的な投与技術を用いて、本明細書に記載の病態の危険性があるか、またはかかる病態を示す患者に投与され得る。好ましくは、本発明の分子は、皮下投与によって、本明細書に記載の病態の危険性があるか、またはかかる病態を示す患者に投与され得る。

【0062】

好ましくは、本発明の医薬組成物は、本発明の分子の「治療的有効量」または「予防的有効量」である。「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な用量および期間での有効量を指す。分子の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の反応を引き起こす分子の能力などの要因によって、変わってもよい。治療的有効量はまた、分子のあらゆる毒性または有害な影響を治療的に有益な効果が上回るものである。「予防的有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに必要な用量および期間での有効量を指す。典型的には、予防用量が、疾患の初期段階前または初期段階時に患者に使用されるため、予防的有効量は、治療的有効量より少ない。

【0063】

治療的有効量または予防的有効量は、患者に治療的有用性を与えるのに必要である活性剤の少なくとも最小量であるが、毒性量未満である。つまり、本発明の分子の治療的有効量は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、Ａβペプチド活性、例えば、Ａβペプチドへの結合を減少させる量である。ここで、Ａβペプチドの存在は、望ましくない病理学的作用を引き起こすかそれに寄与する、あるいは、Ａβペプチドの減少が、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて有益な治療的効果を生じる。

【0064】

本発明の分子の投与経路は、経口、非経口、吸入または局所的であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、非経口投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。本明細書に使用される場合、用語、非経口とは、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内、または腹腔内投与を含む。静脈内または腹腔内または皮下注射による末梢全身送達が好ましい。皮下注射が最も好ましい。かかる注射の適切なビヒクルは、当該分野においては明白である。

【0065】

医薬組成物は、典型的には、例えば、密閉されたバイアルまたはシリンジを含む提供された容器内での製造および保存の条件下で、無菌および安定でなければならない。従って、医薬組成物は、製剤の製造後に濾過滅菌してもよいし、または他の方法で微生物学的に受容可能なものにしてもよい。静脈内注射のための典型的な組成物は、以下に列挙した典型的な投薬量を送達するため、２５０〜１０００ｍｌほどの容量の流体（例えば、滅菌リンガー溶液、生理的食塩水、デキストロース溶液およびハンクス液）ならびに治療的有効量（例えば、１〜１００ｍｇ／ｍｌ以上）の治療剤を有する。容量は、疾患の種類および重症度に応じて変わってもよい。医薬分野において周知のように、任意の１人の患者への投薬量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全体的な健康、および同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。例えば、典型的な用量は、０．００１〜１０００μｇの範囲であるが、この例示的な範囲以下または以上の用量が、特に上述の要因を考慮して想定されている。毎日の非経口投与計画は、１日あたり、全体重の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは体重の約０．３μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。進行は定期評価によってモニターされてもよい。症状に応じて数日間または長期間にわたる反復投与のため、処置が、疾患症状の所望の抑制が生じるまで繰り返される。所望の投薬量は、医師が達成することを望む薬物動態減衰のパターン次第であるが、分子の単回ボーラス投与によって、複数回ボーラス投与によって、または持続注入投与によって送達され得る。

【0066】

本発明の分子のかかる提案量は、多くの治療的裁量により変化する。適切な用量および計画を選択する際の主な要因は、得られた結果である。この文脈で考慮すべき要因としては、処置されている特定の疾患、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の特定の型、投与方法、投与計画、および医師に公知の他の要因が挙げられる。

【0067】

本発明の治療剤は、保存用に凍結または凍結乾燥され、使用前に適切な無菌担体において再構成されてもよい。凍結乾燥および再構成は、様々な程度の抗体活性喪失を変化させる原因となり得る。投薬量は、補正のため調整の必要があるかもしれない。

【0068】

以下の実施例は、本発明を限定せず、例示することを意図する。本明細書の以下の実施例は、とりわけ、「２６６」と指定したマウスモノクローナル抗体（ｍ２６６）を使用する。これは、ヒトＡβペプチドの１３〜２８残基および２６６と指定したマウスモノクローナル抗体のＦａｂフラグメント（ｍ２６６−Ｆａｂ）から構成されるペプチドを用いて、免疫化によって最初に調製したものである。この抗体は、このペプチドと免疫反応することが確認されている。ｍ２６６の調製は、以前に記載されている。ｍ２６６−ＦａｂにＰＥＧ分子を共有結合するため、Ｆａｂを変異させ、重鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｎ５６Ｃ）にシステイン残基を導入し、以下に示した方法（実施例４）でＰＥＧ化してもよい。実施例は、マウス系において実施した実験を記載しているので、マウスモノクローナル抗体の使用は、条件を満たす。しかしながら、ヒトの使用を意図する本発明の処置方法においては、本発明の抗体、またはそのフラグメントのヒト化形態が好ましい。以下の実施例で称される１Ａ１−Ｆａｂは、配列番号１のＬＣＶＲおよび配列番号２のＨＣＶＲを含む、ヒト化抗体Ｆａｂフラグメントである。

【実施例】

【0069】

（実施例１）
ＰＤＡＰＰマウスにおけるｍ２６６−Ｆａｂ ＰＥＧ皮下ＰＫ／ＰＤ研究
若い（３ヶ月齢）トランスジェニックＰＤＡＰＰマウスを、抗体および抗体−Ａβ複合体の薬物動態／薬力学血漿反応を調べるために使用する。マウス２６６Ｆａｂ（ｍ２６６−Ｆａｂ）、ｍ２６６−Ｆａｂ＋５ＫＤ ＰＥＧ、ｍ２６６−Ｆａｂ＋１０ＫＤ ＰＥＧ、ｍ２６６−Ｆａｂ＋２０ＫＤ ＰＥＧ、およびインタクトな全長ｍ２６６ ＩｇＧ抗体を含む、いくつかの抗体を調べる。ＰＤＡＰＰ＋／−マウスを１ｍｇ／ｋｇの抗体で皮下注射し、続いて、血漿を投与してから１、４、８、２４、４８、９６、１６８および２４０時間後に単離する。ｍ２６６−Ｆａｂ抗体を与えた動物を、この部分の迅速な代謝回転（ｔｕｒｎ−ｏｖｅｒ）のゆえに、さらに早い時点で分析する。ｍ２６６−Ｆａｂについての時点は、投与してから１、４、８、１２、１６、２４および４８時間後である。全部で５匹の動物を、時点ごとに１つの抗体につき分析する。全血を、前もって０．５Ｍ ＥＤＴＡでリンスした１ＣＣシリンジに接続された２３ゲージニードルを用いて心穿刺を介して得る。血液サンプルを、単離手順の間、氷上でインキュベートし、続いて、４℃で１５分間、冷やした微小遠心管中で１４，０００ＲＰＭで遠心分離する。得られた血漿サンプルをアリコートし、−８０℃で保存する。

【0070】

Ａ．Ｆａｂ ＰＫ分析の方法論
血漿Ｆａｂ濃度を、抗原検出ＥＬＩＳＡを用いて測定する。手短に言えば、プレートを、４℃で一晩、または３７℃で１時間、Ａβ−ＢＳＡ接合体でコーティングし、次いで、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）カゼイン緩衝剤でブロックする。標品、コントロールサンプル、および研究サンプルをプレートに添加し、その後、室温で１時間インキュイベートする。ヤギ抗マウスＨＲＰを検出のために使用し、比色反応をＯＰＤ基質で発現させる。プレートを、Ａ７００の基準を用いてＡ４９３の吸光度で読み取る。血漿サンプルからの免疫反応活性濃度を、４／５パラメーターアルゴリズムを用いて、マウス血漿におけるｍ２６６ Ｆａｂの既知量から作成した標準曲線から測定する。ｍ２６６ Ｆａｂについてのアッセイ範囲は、０．０５〜０．５μｇ／ｍＬである。ＰＥＧ化Ｆａｂの範囲は、０．０７５〜０．８μｇ／ｍＬである。

【0071】

血漿サンプルからの免疫反応活性濃度を、４／５パラメーターアルゴリズムを用いて、マウス血漿におけるｍ２６６ Ｆａｂの既知量から作成した標準曲線から測定する。２６６ Ｆａｂのアッセイ範囲は、０．０５〜０．５μｇ／ｍＬである。ＰＥＧ化Ｆａｂの範囲は、０．０７５〜０．８μｇ／ｍＬである。結果は、ＰＥＧ分子の付加およびＰＥＧ分子のサイズの増加が、非ＰＥＧ化ｍ２６６−Ｆａｂ（８時間後に３５０ｎｇ／ｍｌ）と比べて、血漿におけるＰＥＧ化Ｆａｂの保持率を増加させること（２０Ｋ ＰＥＧ化ｍ２６６−Ｆａｂについて８時間後に２５４５ｎｇ／ｍｌ）を明らかに示している。

【0072】

Ｂ．ｍ２６６ Ａβ ＥＬＩＳＡアッセイ
治療抗体（全長またはＦａｂフラグメント）の非存在下または存在下のいずれかにおいて、血漿Ａβの量を測定するため、ＥＬＩＳＡアッセイを策定し、利用する。これらのアッセイにおいて測定されるＡβペプチドは、全長Ａβ１〜４０またはＡβ１〜４２である。９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を、４℃で一晩、ＰＢＳ（１つのウェルあたり１００μｌ）中１０μｇ／ｍｌでＣ末端捕捉抗体（Ａβ４０プレートについてｍ２Ｇ３またはＡβ４２プレートについてｍ２１Ｆ１２）でコーティングする。試験プレートを密閉して、一晩のインキュベートの間、蒸発を防ぐ。次の日、ウェルの溶液を除去し、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ ９６ウェルプレート洗浄機を用いて、ウェルをＰＢＳ（１つのウェルあたり４００μｌ）で３回洗浄する。ブロック緩衝剤（３６０μｌの１％ミルク−ＰＢＳ）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。サンプルを、そのサンプル希釈剤の中で血漿を希釈することによって調製して、２０％血漿、０．５Ｍグアニジン、５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．５×プロテアーゼ阻害剤カクテル、２５μｇ／ｍｌ ｍ２６６およびＰＢＳを得る。アッセイにおいて使用される血漿の容量は、高レベルのＡβペプチドが存在するために、一定時間減少させる必要があるかもしれず、その場合、残りの血漿容量は、ラットの血漿で調整される（最終容量パーセントは２０％で維持する）。２５０ｐｇ／ｍｌ〜３．９ｐｇ／ｍｌで変化する濃度のＡβ標品を、標準希釈剤（２０％ラット血漿、０．５Ｍグアニジン、５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、および０．５×プロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、２５μｇ／ｍｌ ｍ２６６、およびＰＢＳ）中で生成する。サンプルおよび標準希釈剤の両方における２５μｇ／ｍｌのインタクトなｍ２６６の組み込みが、中央部ドメイン抗体の可変レベルがアッセイに影響を与え得るあらゆる負の干渉を中和するために要求される。ブロックの後、プレートをＰＢＳで４回洗浄する。サンプルおよび標品を３連（１つのウェルあたり１００μｌ）負荷し、プレートを密閉して、４℃で一晩インキュベートする。次の朝、プレートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄し、ウェルを、室温で２時間、ビオチン化二次抗体ｍ３Ｄ６（０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで希釈したウェルあたり１００μｌ）とインキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、それらを、室温で１．５時間、ストレプトアビジン−ポリＨＲＰ（０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中１：５０００）とインキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）基質を添加する。比色進行を１５、３０および６０分で、６５０ｎｍでモニターする。

【0073】

表１．薬力学結果：Ａβ４０についての平均血漿濃度（ｐｇ／ｍｌ）

【表1】

【0074】

ＰＥＧのサイズに基づいて操作できるより柔軟性のある投与計画に加えて、この結果により、ＰＥＧ化Ｆａｂ−抗原複合体が、インタクトな抗体（ｍ２６６インタクト）のようには、延長した時間、血漿循環中に蓄積しないことが示されている。インタクトな抗体は、血漿中の抗体半減期を延長し、延長した時間（２４０時間より長い）、血漿循環中に存在する抗原−抗体複合体を生じる。一方で、天然Ｆａｂ（ｍ２６６ Ｆａｂ）は、速いクリアランス率および短い半減期（２４時間より短い）を有し、治療薬としては制限される。対照的に、表１に示すように、ＰＥＧ化Ｆａｂは、改良された投与計画を可能にする薬物動態および薬力学を有する抗体分子を提供する。

【0075】

（実施例２）
ＰＤＡＰＰマウスにおける１Ａ１−Ｆａｂ ＰＥＧ皮下ＰＫ／ＰＤ研究
抗体および抗体−Ａβ複合体の薬物動態／薬力学血漿反応を調べるために、研究を、若い（３ヶ月齢）トランスジェニックＰＤＡＰＰマウスで実施する。ヒト化１Ａ１−Ｆａｂ、１Ａ１−Ｆａｂ＋５ＫＤ ＰＥＧ、１Ａ１−Ｆａｂ＋１０ＫＤ ＰＥＧ、および１Ａ１−Ｆａｂ＋２０ＫＤ ＰＥＧを含む、いくつかの抗体を調べる。ＰＤＡＰＰ＋／−マウスを１ｍｇ／ｋｇの抗体で皮下注射し、続いて、血漿を、抗体注入群に応じて異なる時点で単離する。以下の時点を種々の抗体について使用する：
１Ａ１−Ｆａｂは、投与してから１、４、８、１２、１８、２４および４８時間後に採血し、
１Ａ１−Ｆａｂ＋５ＫＤ ＰＥＧは、投与してから１、４、８、２４、４８、９６および１６８時間後に採血し、
１Ａ１−Ｆａｂ＋１０ＫＤ ＰＥＧは、投与してから１、４、８、２４、４８、９６および１６８時間後に採血し、
１Ａ１−Ｆａｂ＋２０ＫＤ ＰＥＧは、投与してから１、８、２４、４８、９６、１６８および２４０時間後に採血する。
全部で５匹の動物を、時点ごとに１つの抗体につき分析する。得られた血漿サンプルをアリコートし、−８０℃で保存する。

【0076】

Ａ．Ｆａｂ ＰＫ分析についての方法論
１Ａ１ Ｆａｂの血漿１Ａ１ Ｆａｂ濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定する。プレートを、ヤギ抗ヒトＩｇＧκ標品、コントロールサンプルでコーティングし、研究サンプルをそのプレートに添加し、次いで、室温で１時間インキュベートする。ヤギ抗ヒトＩｇＧを検出のために使用し、続いて、比色反応のためにＯＰＤを使用する。プレートを、Ａ７００の基準を用いてＡ４９３の吸光度で読み取る。

【0077】

血漿サンプルからの濃度を、４／５パラメーターアルゴリズムを用いて、マウス血漿における既知量の１Ａ１ Ｆａｂで作成した標準曲線から測定する。ＦａｂおよびＦａｂ−５Ｋ ＰＥＧアッセイの範囲は０．００３〜０．３μｇ／ｍＬであり、Ｆａｂ−１０Ｋ ＰＥＧアッセイの範囲は０．００６〜０．２および０．０４〜０．４μｇ／ｍＬであり、Ｆａｂ ２０Ｋ ＰＥＧアッセイの範囲は０．０２〜０．４および０．０４〜０．４μｇ／ｍＬである。結果は、ＰＥＧ分子の付加およびＰＥＧ分子のサイズの増加が、非ＰＥＧ化１Ａ１ Ｆａｂ（２４時間後に不検出）と比べて、血漿におけるＰＥＧ化Ｆａｂの保持率を増加させること（２０Ｋ ＰＥＧ化１Ａ１ Ｆａｂについて９６時間後に７７ｎｇ／ｍｌ）が明らかに示されている。

【0078】

Ｂ．１Ａ１ Ａβ ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡは、ｍ２６６について上で記載したものと本質的に同じである。サンプルを、サンプル希釈剤の中で血漿を希釈することによって調製して、２０％血漿、０．５Ｍグアニジン、５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．５×プロテアーゼ阻害剤カクテル、２０μｇ／ｍｌ １Ａ１、およびＰＢＳを得る。これらのアッセイで測定されるＡβペプチドは、全長Ａβ１〜４０またはＡβ１〜４２である。比色進行を１５、３０および６０分で、６５０ｎｍでモニターする。結果を以下の表２に示す。

【0079】

表２．薬力学結果：Ａβ４０の平均血漿濃度（ｐｇ／ｍｌ）

【表2】

【0080】

実施例１のｍ２６６ Ｆａｂと同様の方法で、表２からのデータにより、ＰＥＧ分子に共有結合されるヒト化Ｆａｂもまた、抗体−抗原複合体が、延長した時間、血漿循環中に蓄積することを防止すると同時に、柔軟性のある投与計画を可能にする理想的なＰＫ／ＰＤプロファイルを提供することが示されている。

【0081】

（実施例３）
マウス２６６およびヒト化１Ａ１ Ｆａｂ類似物の精製
マウス２６６Ｆａｂまたはヒト化１Ａ１ Ｆａｂおよび類似物でトランスフェクトした細胞からの培養上清物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、カチオン交換クロマトグラフィー、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーからなる２段階クロマトグラフィーストラテジーを用いて精製する。収集後、培養上清物を、ＴＨＦを用いて濃縮し、４℃で一晩、２０倍過剰容量の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）に対して透析する。沈殿物を遠心分離によって除去し、上清を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で満たしたＳＰセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の充填層上に負荷する。Ｆａｂフラグメントが溶出するまで、約９０〜１１０ｍＭ ＮａＣｌで、連続的に量を増やしたＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）でカラムを洗浄する。活性Ｆａｂを含むカラム分画を同定し、プールする。容量を減らし、遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて緩衝剤を交換（ＰＢＳ）する。最終容量を１３ｍｌに調整し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイジングカラムに負荷する。約５０ｋＤで溶出するＦａｂ含有画分を同定し、さらなる特徴付けおよびＰＥＧ化のためにプールする。

【0082】

（実施例４）
インビトロでのＰＥＧ化および特徴付け
細胞培養物から精製した１Ａ１−Ｆａｂ上のＮ５６Ｃシステインを、ＰＥＧ化のためにブロックする。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）のＲｅｄｕｃｅ−Ｉｍｍ（商標）固定化還元剤ビーズを使用して、Ｎ５６Ｃシステインを選択的に還元する。還元剤ビーズは、製造者によって提供され、バッチモードにおいて使用されるカラムから抽出される。約４ｍｌのビーズを、３０分間、Ｒｅｄｕｃｅ−ＩＭＭ平衡緩衝剤＃１（リン酸ナトリウム＋ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で、８ｍｌの１０ｍＭ ＤＴＴで最初に活性化させる。次いで、ビーズをＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１．７ｍｇ／ｍｌで１８ｍｌの１Ａ１ Ｎ５６Ｃ Ｆａｂをビーズに添加し、１０ｍＭ ＥＤＴＡを混合物に添加する。その混合物を、４〜５時間室温で回転させ、インキュベートする。Ｆａｂを、Ｈａｎｄｅｅ（商標）樹脂分離器を用いてビーズから引き離し、ビーズをＰＢＳで洗浄する。Ｆａｂおよび洗浄物を合わせ、１時間、５倍モル過剰のＰＥＧマレイミド（ＮＯＦ由来２０ｋ ＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ由来１０ｋ ＰＥＧ；Ｎｅｋｔａｒ由来５ｋ ＰＥＧ）と反応させる。反応混合物を、４Ｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ５．０）に対して透析し、それによって、ＦａｂおよびＦａｂ−ＰＥＧを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ５．０）で平衡になるＳＰセファロースカラム上で捕捉することができる。未反応のＦａｂおよびＦａｂ−ＰＥＧを、塩勾配で溶出する。それらを、５０ｍＭ〜７０ｍＭのＮａＣｌで溶出する。タンパク質をさらに、移動相としてＰＢＳを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製する。還元反応は増加および減少させることができる。同様の方法を使用して、ＰＥＧ化マウス２６６Ｆａｂ Ｎ５６Ｃを調製することができる。

【0083】

サンプルをサイズ排除カラムクロマトグラフィーで分析して、ＦａｂへのＰＥＧの付加を確認する。サイズ排除カラムクロマトグラフィーは、ＴＳＫ Ｇ３０００ＰＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを用いて実施する。カラムを、２１４ｎｍで作動するＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００シリーズ分析ＨＰＬＣを用いて、ｐＨ７．４で、ＰＢＳに加えて０．３５Ｍ ＮａＣｌを用いて０．５ｍｌ／分で流す。さらに、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析する。１０μｇの精製した物質を、４〜１２％のＮｕＰａｇｅ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに負荷し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。

【0084】

（実施例５）
Ｂｉａｃｏｒｅを用いる速度定数の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器も使用して、結合反応速度を測定する。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）は、表面プラズモン共鳴の光学特性を利用して、デキストランバイオセンサーマトリクス内で相互作用する分子のタンパク質濃度における変化を検出する。記載したものを除いて、全ての試薬および材料は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。全ての測定を２５℃で実施する。サンプルを、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝剤（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中に溶解する。ヤギ抗ヒトκ抗体を、アミン結合キットを用いて、８０００反応単位（Ｒｕ）のレベルで、ＣＭ５センサーチップのフローセル１〜４に固定する。

【0085】

結合を、複数の分析サイクルを用いて評価する。各サイクルを５０μＬ／分の流量で実施し、これは４００〜５００Ｒｕｓの捕捉を目的とする１０μｇ／ｍＬでの約２０μＬの抗体結合組成物の注入工程、２５０μＬのヒトＡβ（１〜４０）の注入工程（各サイクルについて２００ｎＭで開始し、２倍の連続希釈を使用する）、続いて、２０分の解離工程、および約３０μＬの１０ｍＭ塩酸グリシン（ｐＨ１．５）を用いる再生工程からなる。各サイクルの会合速度および解離速度を、ＢＩＡ評価ソフトウェアにおける「１：１（ラングミュア）結合」モデルを用いて評価する。結果は、Ｎ５６Ｃ部位でのＰＥＧ化は、ヒトＡβに結合する際にＦａｂの親和性にほとんど影響を与えないことを示している。

【0086】

（実施例６）
ＫｉｎＥｘＡを用いる平衡定数の測定
ＫｉｎＥｘＡ分析を直交アプローチとして使用して、抗原Ｆａｂ複合体の遅い速度による平衡結合分析によって結合親和性を測定する。ＫｉｎＥｘＡ ３０００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．）を使用して、結合反応速度を測定する。手短に言えば、抗原をセファロースビーズに共有結合し、ビーズに対するフリーＦａｂ／Ｆａｂ−ＰＥＧの結合を、その機器で検出する。Ｋ_ｄを測定するために、減少方向に連続希釈した抗原ヒト可溶性Ａβ（１〜４０）（０〜１０ｎＭ）を有するＦａｂ／Ｆａｂ−ＰＥＧを含む個々のチューブ（１Ａ１−Ｆａｂ−２０ｋＰＥＧについて２０ｐＭまたは５００ｐＭ、１Ａ１ Ｆａｂについて５ｐＭまたは５０ｐＭ）を、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で、３７℃で３０〜５０時間インキュベートして、平衡達成を確実にする。インキュベート後、各平衡サンプルにおけるフリーＦａｂ／Ｆａｂ−ＰＥＧを、製造者の指示書に従って、ＫｉｎＥｘＡ ３０００で測定する。Ｋ_ｄ値を、ＫｉｎＥｘＡ ３０００ソフトウェアを用いてｎ−曲線分析によって測定する。その結果により、１Ａ１ Ｆａｂ結合が、マウス２６６ Ｆａｂ（２４０ｐＭ）と比べて約１０倍高い親和性で、ヒトＡβ（１９ｐＭ）に強く結合することが示されている。さらに、Ｎ５６Ｃ部位における２０Ｋ ＰＥＧの共有結合は、１Ａ１−Ｆａｂ（１２ｐＭ）の親和性に影響を与えていない。

【0087】

（実施例７）
細胞ベースのＥＬＩＳＡを用いるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）結合分析
Ａβ前駆体ＡＰＰと２６６ Ｆａｂ／ｍＡｂとの交差反応性を評価するために、ＡＰＰ（ａａ１〜７５１）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用している。これらの細胞を、ネオマイシン耐性マーカーを含有するプラスミド中にＡＰＰ（１〜７５１）遺伝子をクローニングすることによって作製する。この組み換えプラスミドを、ＨＥＫ２９３中にトランスフェクトし、細胞を２００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で選択して、過剰発現する安定的な細胞株を生成する。結合アッセイのために、７５，０００個のＡＰＰ７５１細胞を、ＰＤＬでコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルにプレートする。増殖培地（ＤＭＥＭ Ｆ１２、５％ ＦＢＳ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８）における２日間のインキュベート後、液体を除去して、２０μｇ／ｍｌのＦａｂまたはｍＡｂを、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ（Ｃａ／ＭＧを有する）中に添加する。４℃で２時間、結合を進行し、細胞を１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで３回洗浄する。ヒトまたはマウス軽鎖に特異的な二次抗体（抗κ軽鎖に接合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｒｐ））を、ＰＢＳ／ＢＳＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に添加する。ＰＢＳ／ＢＳＡ中１：５０００の希釈を、抗ヒト軽鎖について使用し、１：２０００を抗マウス軽鎖について使用する。４℃で１時間のインキュベート後、細胞をＢＳＡ／ＰＢＳで５回洗浄する。ＡＰＰに結合するＦａｂ／ｍＡｂの関数として、ＨＲＰ活性を、１０分間、ＴＭＢ基質を付加することによって測定する。反応物を、きれいな９６ウェルプレートに移し、６５０ｎｍでの吸光度を測定する。データにより、ＰＥＧ化（５ｋＤ、１０ｋＤ、および２０ｋＤ）１Ａ１−Ｆａｂおよびｍ２６６−Ｆａｂが、ＡＰＰよりＡβペプチドに選択性を与えることが示されている。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]