特許 5783504 胎生プログラミングに対する影響を評価するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5783504

(24)【登録日】2015年7月31日

(45)【発行日】2015年9月24日

(54)【発明の名称】胎生プログラミングに対する影響を評価するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0793 20100101AFI20150907BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20150907BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20150907BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150907BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/00 202S

   C12Q1/02

   C12Q1/68 A

   !C12N15/00 A

【請求項の数】13

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2009-81497(P2009-81497)

(22)【出願日】2009年3月30日

(65)【公開番号】特開2010-227079(P2010-227079A)

(43)【公開日】2010年10月14日

【審査請求日】2012年3月21日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】501273886

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立環境研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(74)【代理人】

【識別番号】100078662

【弁理士】

【氏名又は名称】津国 肇

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(74)【代理人】

【識別番号】100146031

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 明夫

(74)【代理人】

【識別番号】100141357

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 音哉

(72)【発明者】

【氏名】曽根 秀子

(72)【発明者】

【氏名】永野 麗子

(72)【発明者】

【氏名】大迫 誠一郎

(72)【発明者】

【氏名】宮崎 航

(72)【発明者】

【氏名】今西 哲

(72)【発明者】

【氏名】赤沼 宏美

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５００１０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２４８５０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／００８７５８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２００１−５２６８８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１８９９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／１４２４４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Neurosci. Res.，２００８年 ２月 １日，Vol.86, No.2，p.270-280

【文献】 曽根秀子，外２名，マルチプロファイリング技術による化学物質の胎生プログラミングに及ぼす影響評価手法の開発，国立環境研究所の研究成果（年報），２００８年，平成20年度

【文献】 曽根秀子，外２名，マルチプロファイリング技術による化学物質の胎生プログラミングに及ぼす影響評価手法の開発，国立環境研究所の研究成果（年報），２００７年，平成19年度

【文献】 <http://www.nies.go.jp/media/20081006.html>，２００８年１０月 ６日

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記工程：
ウェルの直径が３００μｍであり、ウェル間の距離（ピッチ）が３３０μｍであり、ウェルの深さが２７０μｍである、１０２０個の均一なウェルを枠内（１０×１０ｍｍ）に有する取り外し可能な枠を有する２４×２４ｍｍ角の枠分離型マイクロスフィアアレイを用いて、マイクロスフィアアレイ当たりＥＳ細胞懸濁液を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／２５０μｌずつ加え、ＥＳ細胞からなるマイクロスフィアを神経誘導因子に暴露させ、ニューロスフィア前駆体を形成させること、
得られたニューロスフィア前駆体を、神経細胞培養用容器を用いて神経誘導培地中で培養することによってニューロスフィアを構成する細胞を成熟神経細胞に分化させること
を含む、神経細胞系モデルの作成方法。

【請求項2】

上記神経細胞培養用容器が、オルニチン・ラミニンコートプレートである、請求項１に記載の神経細胞系モデルの作成方法。

【請求項3】

全工程が、２０日間で終了する、請求項２に記載の神経細胞系モデルの作成方法。

【請求項4】

下記工程：
ウェルの直径が３００μｍであり、ウェル間の距離（ピッチ）が３３０μｍであり、ウェルの深さが２７０μｍである、１０２０個の均一なウェルを枠内（１０×１０ｍｍ）に有する取り外し可能な枠を有する２４×２４ｍｍ角の枠分離型マイクロスフィアアレイを用いて、マイクロスフィアアレイ当たりＥＳ細胞懸濁液を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／２５０μｌずつ加え、ＥＳ細胞からなるマイクロスフィアとサンプルとを接触させること、
上記マイクロスフィアからサンプルを分離すること、
上記マイクロスフィアの一部を神経誘導因子に暴露し、ニューロスフィア前駆体を形成させるとともに、残りの一部からトータルＲＮＡを回収し、遺伝子の発現量を測定すること、
得られたニューロスフィア前駆体を、神経細胞培養用容器を用いて神経誘導培地中で培養することによってニューロスフィアを構成する細胞を成熟神経細胞に分化させる、神経細胞系モデルを作成すること、
得られた神経細胞系モデルの細胞形態を測定すること
を含む、胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。

【請求項5】

上記神経細胞培養用容器が、オルニチン・ラミニンコートプレートである、請求項４に記載の胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。

【請求項6】

上記遺伝子が、下記：
ＥＲα、ＥＲβ、ＡＲ、ＲＡＲα及びＲＡＲβからなる群より選択される１以上の核内レセプター遺伝子と、
ＤＴＮＢＰ１、ＮＲＧ１、ＤＡＯ、ＤＡＯＡ、ＲＧＳ４、ＣＡＰＯＮ、ＰＰＰ３ＣＣ、ＴＲＡＲ４、ＶＣＦＳ、ＣＯＭＴ、ＰＲＯＤＨ、ＤＨＨＣ、ＺＤＨＨＣ８、ＤＩＳＣ１及びＧＲＭ５からなる群より選択される１以上の統合失調症の感受性遺伝子、
Ｔｓｃ１、Ｔｓｃ２、Ｆｍｒ１、Ｕｂｅ３ａ、Ｒｅｌｎ、Ｎｌｇｎ３、Ｆｏｘｐ２、Ｃｎｔｎａｐ２、Ｓｌｃ６ａ４、Ｇａｂｒｂ３、Ｍｅｃｐ２及びＥｎ２からなる群より選択される１以上の自閉症関連遺伝子、
ＥｐｈｒｉｎＢ、ＥｐｈＢ、Ｓｅｍａ３Ａ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｉｔｇｂ１、Ｎｅｔｒｉｎ１、Ｓｌｉｔ１、Ｒｏｂｏ２、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、ＮｅｔｒｉｎＧ、ＮＧＬ１及びＵｎｃ５からなる群より選択される１以上の軸索ガイダンス関連遺伝子、
Ｆｏｘｇ１、Ｅｍｘ１、Ｅｍｘ２、Ｎｋｘ２．１、Ｏｔｘ１、Ｏｔｘ２、Ｅｎ１、Ｇｂｘ２、Ｈｏｘｂ１及びＨｏｘａ２からなる群より選択される１以上の脳セグメンテーション関連遺伝子、
Ｓｎｃａ、Ｕｃｈｌ１、Ａｐｏｅ、Ｐａｒｋ７、Ａｐｂｂ１、Ｂｃｌ２、Ｕｂｅ２ｌ１、Ｕｂｑｌｎ１、Ｂａｘ、Ｃｄｋ５、Ｕｂｂ、Ａｌｓ２、Ｇｔｆ２ａ１、Ｂａｃｅ１、Ａｐｐ、Ｐｓｅｎ１、Ｉｄｅ、Ｃｃｓ、Ｓｏｄ１及びＧｐｘ１からなる群より選択される１以上の神経疾患関連遺伝子、
Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｚｆｐ４２、Ｐｏｕ５ｆ１、Ｆｇｆｒ１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１、Ｍａｐ２、Ｏｌｉｇ２、Ｇｆａｐ、Ｒａｆ１、Ａｔｂｆ１、Ｐｌａ２ｇ６、Ｃｄｙｌ、Ｍａｐｋ３、Ｓｈｃ１、Ｈｒａｓ１、Ｒｐｓ６ｋａ１、Ｍａｐｋ１、Ｓｍａｒｃａｄ１、Ｇｂｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｍａｐ２ｋ１、Ｆｏｓ及びＲｉｆ１からなる群より選択される１以上の神経発達関連遺伝子、
Ｔｈ、Ｓｌｃ６ａ３、Ｓｎｃａ、Ｕｂｅ１、Ｕｂｃｈ７、Ｐａｒｋ２、Ｕｃｈ１、Ｐａｒｋ７、Ｃａｓｐ９、Ｃａｓｐ３及びＣａｓｐ７からなる群より選択される１以上のパーキンソン病関連遺伝子、及び／又は
Ａｐｐ、Ｂａｃｅ、Ｐｓｅｎ、ＡｐｏＥ、Ｉｄｅ、Ｍｍｅ、Ｉｌ１ｒ１、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ、Ｃａｓｐ３及びＣａｓｐ７からなる群より選択される１以上のアルツハイマー病関連遺伝子との組合わせである、請求項５に記載の胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。

【請求項7】

上記細胞形態が、ニューロスフィアの面積、ニューロスフィアの真円率、ニューロスフィアの個数、細胞数、核の面積、ニューロスフィアの円周、神経突起の長さ、神経突起の交差点の個数及び神経突起の分岐点の個数である、請求項５に記載の胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。

【請求項8】

上記細胞形態の測定を、マルチチャンネル細胞画像解析装置によって行う、請求項７に記載の胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。

【請求項9】

下記工程：
ウェルの直径が３００μｍであり、ウェル間の距離（ピッチ）が３３０μｍであり、ウェルの深さが２７０μｍである、１０２０個の均一なウェルを枠内（１０×１０ｍｍ）に有する取り外し可能な枠を有する２４×２４ｍｍ角の枠分離型マイクロスフィアアレイを用いて、マイクロスフィアアレイ当たりＥＳ細胞懸濁液を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／２５０μｌずつ加え、ＥＳ細胞からなるマイクロスフィアとサンプルとを接触させること、
上記マイクロスフィアからサンプルを分離すること、
上記マイクロスフィアの一部を神経誘導因子に暴露し、ニューロスフィア前駆体を形成させるとともに、残りの一部からトータルＲＮＡを回収し、遺伝子の発現量を測定すること、
得られたニューロスフィア前駆体を、神経細胞培養用容器を用いて神経誘導培地中で培養することによってニューロスフィアを構成する細胞を成熟神経細胞に分化させる、神経細胞系モデルを作成すること、
得られた神経細胞系モデルの細胞形態を測定すること
得られた上記遺伝子発現量及び上記細胞形態の測定値を、サンプルで処理しない場合か又は胎生プログラミングに対する影響が知られている物質についての測定値と対比すること、
を含む胎生プログラミングに対する影響を評価するための方法。

【請求項10】

上記胎生プログラミングに対する影響を、ベジアンネットワークシステムを用いて評価する、請求項９に記載の胎生プログラミングに対する影響を評価するための方法。

【請求項11】

下記工程：
ウェルの直径が３００μｍであり、ウェル間の距離（ピッチ）が３３０μｍであり、ウェルの深さが２７０μｍである、１０２０個の均一なウェルを枠内（１０×１０ｍｍ）に有する取り外し可能な枠を有する２４×２４ｍｍ角の枠分離型マイクロスフィアアレイを用いて、マイクロスフィアアレイ当たりＥＳ細胞懸濁液を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／２５０μｌずつ加え、ＥＳ細胞からなるマイクロスフィアとサンプルとを接触させること、
上記マイクロスフィアからサンプルを分離すること、
上記マイクロスフィアの一部を神経誘導因子に暴露し、ニューロスフィア前駆体を形成させるとともに、残りの一部からトータルＲＮＡを回収し、遺伝子の発現量を測定すること、
得られたニューロスフィア前駆体を、神経細胞培養用容器を用いて神経誘導培地中で培養することによってニューロスフィアを構成する細胞を成熟神経細胞に分化させる、神経細胞系モデルを作成すること、
得られた神経細胞系モデルの細胞形態を測定すること
遺伝子発現量及び上記細胞形態の測定値を、胎生プログラミングに対する影響が知られている物質についての測定値と対比すること
を含む、病変リスクを予測するためのデータを提供する方法。

【請求項12】

下記工程：
ウェルの直径が３００μｍであり、ウェル間の距離（ピッチ）が３３０μｍであり、ウェルの深さが２７０μｍである、１０２０個の均一なウェルを枠内（１０×１０ｍｍ）に有する取り外し可能な枠を有する２４×２４ｍｍ角の枠分離型マイクロスフィアアレイを用いて、マイクロスフィアアレイ当たりＥＳ細胞懸濁液を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／２５０μｌずつ加え、ＥＳ細胞からなるマイクロスフィアとサンプルとを接触させること、
上記マイクロスフィアからサンプルを分離すること、
上記マイクロスフィアの一部を神経誘導因子に暴露し、ニューロスフィア前駆体を形成させるとともに、残りの一部からトータルＲＮＡを回収し、遺伝子の発現量を測定すること、
得られたニューロスフィア前駆体を、神経細胞培養用容器を用いて神経誘導培地中で培養することによってニューロスフィアを構成する細胞を成熟神経細胞に分化させる、神経細胞系モデルを作成すること、
得られた神経細胞系モデルの細胞形態を測定すること
を含む、上記遺伝子発現量及び上記細胞形態の測定値を、サンプルで処理しない場合の測定値と対比する、胎生プログラミングに対する影響を有する物質をスクリーニングするための方法。

【請求項13】

上記胎生プログラミングに対する影響を有する物質が、環境化学物質、医薬品又は農薬である、請求項１２に記載のスクリーニングするための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経細胞系モデルの作成方法、それに用いるＥＳ細胞に由来する細胞からなるニューロスフィア前駆体、上記神経細胞系モデルを用いる、胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法、胎生プログラミングに対する影響を評価するための方法、病変リスクを予測するための方法及び胎生プログラミングに対する影響を有する物質をスクリーニングするための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

化学物質の生体影響を取りまく状況には、化学物質の情報不足、アレルギー疾患や神経系障害など旧来のリスク評価では見過ごされてきた健康影響の増加、さらには、これらの影響が胎児期曝露による晩発影響（胎生プログラミング）であるとの指摘などがある。生体リスク（生物の健康リスク）の管理のうえでは、これらの指摘事項をクリアすることが必要である。そのためには、多種多様な化学物質ばかりでなく、多種多様なエンドポイントの評価が可能であり、簡便かつ高速多験体を解析することができる毒性評価システムの構築が求められている。さらに、成体の各臓器の発生・発育段階を模倣するモデル細胞系の確立も所望されている。

【0003】

神経機能障害に及ぼす影響を評価するための方法として、神経芽細胞を用いる方法も報告されているが（特許文献１）、胎生プログラミングを評価する方法は、いまだ開発されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００６−３２５５５１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、簡便かつ高速多験体を解析することができる胎生プログラミングの評価システムを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、神経細胞系モデルの作成方法、それに用いるＥＳ細胞に由来する細胞からなるニューロスフィア前駆体、上記神経細胞系モデルを用いる、胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法、胎生プログラミングに対する影響を評価するための方法、病変リスクを予測するための方法及び胎生プログラミングに対する影響を有する物質をスクリーニングするための方法を開発し、本発明を完成させた。

【0007】

すなわち、本発明は、下記のとおりである。
［１］神経細胞系モデルを作成するための、ＥＳ細胞に由来する細胞からなるニューロスフィア前駆体。
［２］上記ＥＳ細胞が、ヒトＥＳ細胞である、［１］に記載のニューロスフィア前駆体。
［３］下記工程：
ＥＳ細胞からなるマイクロスフィアを神経誘導因子に暴露させ、ニューロスフィア前駆体を形成させること、
得られたニューロスフィア前駆体を、神経細胞培養用容器を用いて神経誘導培地中で培養することによってニューロスフィアを構成する細胞を成熟神経細胞に分化させること
を含む、神経細胞系モデルの作成方法。
［４］上記神経細胞培養用容器が、オルニチン・ラミニンコートプレートである、［３］に記載の神経細胞系モデルの作成方法。
［５］全工程が、２０日間で終了する、［４］に記載の神経細胞系モデルの作成方法。
［６］下記工程：
ＥＳ細胞からなるマイクロスフィアとサンプルとを接触させること、
上記マイクロスフィアからサンプルを分離すること、
上記マイクロスフィアの一部を神経誘導因子に暴露し、ニューロスフィア前駆体を形成させるとともに、残りの一部からトータルＲＮＡを回収し、遺伝子の発現量を測定すること、
得られたニューロスフィア前駆体を、神経細胞培養用容器を用いて神経誘導培地中で培養することによってニューロスフィアを構成する細胞を成熟神経細胞に分化させる、神経細胞系モデルを作成すること、
得られた神経細胞系モデルの細胞形態を測定すること
を含む、胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。
［７］上記神経細胞培養用容器が、オルニチン・ラミニンコートプレートである、［６］に記載の胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。
［８］上記遺伝子が、下記：
ＥＲα、ＥＲβ、ＡＲ、ＲＡＲα及びＲＡＲβからなる群より選択される１以上の核内レセプター遺伝子と、
ＤＴＮＢＰ１、ＮＲＧ１、ＤＡＯ、ＤＡＯＡ、ＲＧＳ４、ＣＡＰＯＮ、ＰＰＰ３ＣＣ、ＴＲＡＲ４、ＶＣＦＳ、ＣＯＭＴ、ＰＲＯＤＨ、ＤＨＨＣ、ＺＤＨＨＣ８、ＤＩＳＣ１及びＧＲＭ５からなる群より選択される１以上の統合失調症の感受性遺伝子、
Ｔｓｃ１、Ｔｓｃ２、Ｆｍｒ１、Ｕｂｅ３ａ、Ｒｅｌｎ、Ｎｌｇｎ３、Ｆｏｘｐ２、Ｃｎｔｎａｐ２、Ｓｌｃ６ａ４、Ｇａｂｒｂ３、Ｍｅｃｐ２及びＥｎ２からなる群より選択される１以上の自閉症関連遺伝子、
ＥｐｈｒｉｎＢ、ＥｐｈＢ、Ｓｅｍａ３Ａ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｉｔｇｂ１、Ｎｅｔｒｉｎ１、Ｓｌｉｔ１、Ｒｏｂｏ２、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、ＮｅｔｒｉｎＧ、ＮＧＬ１、Ｕｎｃ５からなる群より選択される１以上の軸索ガイダンス関連遺伝子、
Ｆｏｘｇ１、Ｅｍｘ１、Ｅｍｘ２、Ｎｋｘ２．１、Ｏｔｘ１、Ｏｔｘ２、Ｅｎ１、Ｇｂｘ２、Ｈｏｘｂ１及びＨｏｘａ２からなる群より選択される１以上の脳セグメンテーション関連遺伝子、
Ｓｎｃａ、Ｕｃｈｌ１、Ａｐｏｅ、Ｐａｒｋ７、Ａｐｂｂ１、Ｂｃｌ２、Ｕｂｅ２ｌ１、Ｕｂｑｌｎ１、Ｂａｘ、Ｃｄｋ５、Ｕｂｂ、Ａｌｓ２、Ｇｔｆ２ａ１、Ｂａｃｅ１、Ａｐｐ、Ｐｓｅｎ１、Ｉｄｅ、Ｃｃｓ、Ｓｏｄ１及びＧｐｘ１からなる群より選択される１以上の神経疾患関連遺伝子、
Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｚｆｐ４２、Ｐｏｕ５ｆ１、Ｆｇｆｒ１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１、Ｍａｐ２、Ｏｌｉｇ２、Ｇｆａｐ、Ｒａｆ１、Ａｔｂｆ１、Ｐｌａ２ｇ６、Ｃｄｙｌ、Ｍａｐｋ３、Ｓｈｃ１、Ｈｒａｓ１、Ｒｐｓ６ｋａ１、Ｍａｐｋ１、Ｓｍａｒｃａｄ１、Ｇｂｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｍａｐ２ｋ１、Ｆｏｓ及びＲｉｆ１からなる群より選択される１以上の神経発達関連遺伝子、
Ｔｈ、Ｓｌｃ６ａ３、Ｓｎｃａ、Ｕｂｅ１、Ｕｂｃｈ７、Ｐａｒｋ２、Ｕｃｈ１、Ｐａｒｋ７、Ｃａｓｐ９、Ｃａｓｐ３及びＣａｓｐ７からなる群より選択される１以上のパーキンソン病関連遺伝子、及び／又は
Ａｐｐ、Ｂａｃｅ、Ｐｓｅｎ、ＡｐｏＥ、Ｉｄｅ、Ｍｍｅ、Ｉｌ１ｒ１、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ、Ｃａｓｐ３及びＣａｓｐ７からなる群より選択される１以上のアルツハイマー病関連遺伝子との組合わせである、［７］に記載の胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。
［９］上記細胞形態が、ニューロスフィアの面積、ニューロスフィアの真円率、ニューロスフィアの個数、細胞数、核の面積、ニューロスフィアの円周、神経突起の長さ、神経突起の交差点の個数及び神経突起の分岐点の個数である、［７］に記載の胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。
［１０］上記細胞形態の測定を、マルチチャンネル細胞画像解析装置によって行う、［９］に記載の胎生プログラミングに対する影響を測定するための方法。
［１１］［６］に記載の方法によって得られた上記遺伝子発現量及び上記細胞形態の測定値を、サンプルで処理しない場合か又は胎生プログラミングに対する影響が知られている物質についての測定値と対比する、胎生プログラミングに対する影響を評価するための方法。
［１２］上記胎生プログラミングに対する影響を、ベジアンネットワークシステムを用いて評価する、［１１］に記載の胎生プログラミングに対する影響を評価するための方法。
［１３］［６］に記載の方法によって得られた上記遺伝子発現量及び上記細胞形態の測定値を、胎生プログラミングに対する影響が知られている物質についての測定値と対比することを含む、病変リスクを予測するための方法。
［１４］［６］に記載の方法によって得られた上記遺伝子発現量及び上記細胞形態の測定値を、サンプルで処理しない場合の測定値と対比する、胎生プログラミングに対する影響を有する物質をスクリーニングするための方法。
［１５］ 上記胎生プログラミングに対する影響を有する物質が、環境化学物質、医薬品又は農薬である、［１４］に記載のスクリーニングするための方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明の方法を用いることによって、胎生プログラミングに対する影響を評価することができる。また、本発明の方法を用いて胎児期曝露による晩発影響のハイスループット解析を実施したならば、多種多様な化学物質についての生体（健康）影響を予見する情報の利用が可能となる。このことによって、生体（健康）影響予測が可能となり、化学物質曝露の被害を未然に防ぐことも可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明の方法の模式図である。

【図2】対照群（０．１％ＤＭＳＯ）のマルチ情報のネットワーク図である。

【図3】ＰＣＢ（１０^−８Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図4】Ｅ２（１０^−８Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図5】ＰＭＴ（１０^−５Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図6】ＤＨＴ（１０^−８Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図7】ＴＭＤ（１０^−５Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図8】ＢＰＡ（１０^−１０Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図9】ＤＥＨＰ（１０^−４Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図10】Ｔ３（１０^−８Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図11】ＭＰＡ（１０^−４Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図12】ＤＥＸ（１０^−８Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図13】ＣＰＭ（１０^−５Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【図14】ＴＣＤＤ（１０^−８Ｍ）処置群のマルチ情報のネットワーク図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明において神経細胞系モデルとは、ニューロン（ＭＡＰ２陽性面積）が占める面積比が総細胞面積の２０〜５０％程度であり、かつ、グリア細胞（ＧＦＡＰ陽性細胞の占める面積）が占める面積比が総細胞面積の５０〜８０％程度のであるものをいう。

【0011】

本発明においてＥＳ細胞とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られ、分化多能性及び無限増殖能を有する細胞をいう。動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、マウス又はヒトであり、最も好ましくは、ヒトである。また、本発明では、ＥＳ細胞の代わりにｉＰＳ細胞を用いることもできる。

【0012】

本発明においてニューロスフィア前駆体とは、神経幹細胞マーカーや神経発生初期マーカーが発現するが、グリア細胞は発生していない細胞凝集体のことをいう。成熟神経細胞の分化のためには、ニューロスフィア前駆体の平均直径が６４０μｍであることが好ましい。

【0013】

本発明においてマイクロスフィアとは、４５〜２００個の細胞、好ましくは、５０〜１５０個の細胞、より好ましくは、９８個の細胞が凝集した球状の塊をいう。成熟神経細胞の分化のためには、ニューロスフィア前駆体の平均直径が２１０μｍ（オルチニンラミニンコートに播く直前の直径が２１０μｍであり、オルチニンラミニンコートで培養後の２０日目はニューロスフィアの平均直径は６４０μｍとなる）であることが好ましい。マイクロスフィアの平均直径は、好ましくは、１００〜３００μｍ、より好ましくは、２００〜２５０μｍ、最も好ましくは、２１０μｍである。

【0014】

本発明において神経誘導因子とは、未分化細胞を神経細胞に誘導する能力を有する物質をいい、例えば、レチノイン酸を挙げることができる。レチノイン酸の処理濃度は、好ましくは、高濃度（１０^−６Ｍ）、中濃度（１０^−７Ｍ）又は極めて低濃度（１０^−９Ｍ）であり、より好ましくは、低濃度（１０^−８Ｍ）である。

【0015】

本発明において神経細胞培養容器とは、神経誘導前のＥＳ細胞を大きさや分化の速度を均一にし、ニューロスフィア前躯体を形成する培養する培養器具をいい、例えば、マイクロデバイス、を挙げることができる。好ましくは、１０〜６０ｍｍディッシュ、より好ましくは、２４ウェルプレート、最も好ましくは、３次元パターニング（あるいは、マイクロスフィアアレイ）である。

【0016】

本発明の神経細胞培養容器は、オルニチン・ラミニンでコートされていることが、好ましい。オルニチン・ラミニンコートプレートは、プレートにオルニチン溶液を加え、３７℃で一昼夜放置し、水洗後、ラミニン溶液を加え、３７℃で４時間以上放置することによって作製することができる。オルニチン・ラミニンコートプレートとして、BD Bio Coat TM poly-L-Ornithine/Laminin cell ware 24-well Plateが市販されている。しかし、このプレートは、ニューロスフィア前躯体の接着性や成熟神経幹細胞への分化誘導や増殖が悪いため、自分でオルニチン・ラミニンでコートを行ったものを使用しなければならない。

【0017】

本発明において成熟神経細胞とは、下記の条件の全てを満たす細胞をいう。
１）ニューロンの一視野面積（３３３５４５４７μｍ^２）当たりの分岐点が１０００個〜３５００個であり、一視野面積当たりの交差点が２００〜６００個であり、かつ、一視野面積当たり（３３３５４５４７μｍ^２）のＭＡＰ２陽性ニューロンの神経突起の伸張の総計（総伸張）が１００００μｍ〜５０００００μｍであり、
２）グリア細胞の一視野面積当たりの分岐点が１５０個〜２７００個であり、一視野面積当たりの交差点が２０個〜５００個であり、かつ、一視野面積当たり（３３３５４５４７μｍ^２）のＧＦＡＰ陽性グリア細胞の細胞質突起の伸張の総計（総伸張）が９００００μｍ〜３０００００μｍであり、
３）ニューロン及びグリア細胞が１００００個〜５００００個の細胞からなるニューロスフィア前駆体に由来し、この細胞が遊走して広がったものであり、
４）ＭＡＰ２陽性総面積は、１００００μｍ^２〜２００００００μｍ^２であり、ＧＦＡＰ陽性面積は６００μｍ^２〜４００００００μｍ^２の範囲である。

【0018】

本発明においてトータルＲＮＡは、従来公知の任意の方法を用いて回収することができる。たとえば、マイクロスフィアアレイ上で化学物質暴露４８時間後のニューロスフィア前駆体からRNeasy Mini Kit (50) (QIAGEN)の手法に従ってTotal RNAを精製することができる。詳細な手法は、マイクロスフィアアレイ上で培養したニューロスフィア前駆体をＰＢＳで洗浄後、ピペッティングして回収し、１０００ｒｐｍで５分間の遠心後、ＰＢＳを取り除き５×１０^６個のＥＳ細胞あたり３５０μｌのＲＬＴ Ｂｕｆｆｅｒを加えて１ｍｌのシリンジ２３Ｇ（直径０．６５ｍｍ）で１０回出し入れして細胞を分散させる。この細胞を試験に供するまで−８０℃に保存する。３５０μｌの７０％エタノールを添加し白濁するまでピペッティングする。さらに、７００μｌのサンプルを２ｍｌのコレクションチューブの上に乗せたRNeasy spin columnに入れる。次に、１２０００ｒｐｍで室温で１分間遠心する。下のカラムの溶液を捨てる。さらに、RNeasy Mini Kit (50) (QIAGEN)キット内にあるＲＷ１バッファーを７００μｌ加え、１２０００ｒｐｍで室温で１分間遠心する。次に、８０μｌのＤＮａｓｅＩ溶液を加えて、室温に１５分間置く。次に、３５０μｌのＲＷ１を加え、１２０００ｒｐｍで室温で１分間、遠心し、５００μｌのＲＰＥバッファーを添加し、１２０００ｒｐｍで室温で１分間遠心する。５００μｌのＲＰＥバッファーを添加し、１２０００ｒｐｍで室温で１分間遠心し、１５０００ｒｐｍで室温で１分間遠心し、spin columnを新しい１．５ｍｌのコレクションチューブに移す。次に、２０μｌのＲＮａｓｅフリー水を加え、１００００ｒｐｍで室温で１分間遠心し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを得る。

【0019】

本発明において遺伝子の発現量は、従来公知の任意の方法を用いて測定することができる。たとえば、イルミナのBead Arrayによって遺伝子発現レベルを解析することができる。抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡの吸光度を測定後、Agilent 2100 bioanalyzerとRNA LabChip Kitにより微量サンプルのＴｏｔａｌ ＲＮＡ用の電気泳動分析を行った。イルミナBead Arrayを行うためには、サンプル量は１アレイに付き５００ｎｇ／１０μｌ以上で、サンプル純度は０．１．２６０／０．１．２８０＝１．７〜２．１であることが必要である。

【0020】

本発明において細胞形態とは、ニューロスフィアの面積、ニューロスフィアの真円率、ニューロスフィアの個数、細胞数、核の面積、ニューロスフィアの円周、神経突起の長さ、神経突起の交差点の個数及び神経突起の分岐点の個数である。この細胞形態は、マルチチャンネル細胞画像解析装置を用いて測定することができる。

【0021】

本発明に用いることができるマルチチャンネル画像解析装置は、たとえば、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）であり、細胞形態計測の方法は、２０日間の培養後、画像解析装置で形態解析を行うために４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）−０．２Ｍスクロース−０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で約１５分間の固定を行った。固定後、０．１ＭＰＢＳで３回洗浄後、透過処理として０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ １００−０．１Ｍ ＰＢＳで３０分間の処理を行った。その後、０．１ＭＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）−０．１ＭＰＢＳで１０分間のブロッキング操作を行った。

【0022】

本発明に使用する一次抗体として神経幹細胞の特異的なマーカーであるマウス抗ネスチンモノクローナル抗体（CHEMICON International）、グリア細胞のマーカーであるマウス抗グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）モノクローナル抗体（CHEMICON International）を選択し、４℃で一昼夜反応させる。翌日、０．１Ｍ ＰＢＳで３回洗浄を行い、２次抗体として標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Alexa Fluor 568, Invitrogen）で１時間室温の反応を行い、０．１Ｍ ＰＢＳにて１０分間で３回ずつ洗浄する。核染色として２μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２溶液（Dojindo）にて１５分間反応後、０．１ＭＰＢＳで５分間で３回ずつ洗浄する。IN Cell Analyzer 1000で解析を行うために各ウェルにＰＢＳを８０％くらいに満たし、乾燥を防ぐためにパラフィルムでカバーをしてディッシュの蓋で密閉し冷蔵庫内で保存する。マルチチャンネル細胞画像解析装置（IN Cell analyzer 1000, GE）によって画像として取得後、ニューロスフィアの面積、ニューロスフィアの真円率、ニューロスフィアの個数、細胞数、核の面積、ニューロスフィアの円周、神経突起の長さ、神経突起の交差点の個数及び神経突起の分岐点の個数をパラメーターとして選定しマルチ解析ソフトウェアの一つであるDeveloper Tool Boxによって自動的に個々の神経細胞の形態を測定し数値情報へ変換、定量的・客観的な表現型データとして化学物質の神経細胞の分化への影響の比較解析を行う。

【0023】

本発明に用いることができる遺伝子は、下記：
Ｒａｆ１（ＧＥＮＢＡＮＫ ＩＤ ＡＫ０３６３１７）、Ａｔｂｆ１（ＮＭ＿００７４９６）、Ｐｌａ２ｇ６（ＮＭ＿０１６９１５）、Ｃｄｙｌ（ＮＭ＿００９８８１）、Ｍａｐｋ３（ＮＭ＿０１１９５２）、Ｓｈｃ１（ＮＭ＿０１１３６８）、Ｈｒａｓ１（ＮＭ＿００８２８４）、Ｒｐｓ６ｋａ１（ＮＭ＿００９０９７）、Ｍａｐｋ１（ＮＭ＿０１１９４９）、Ｓｍａｒｃａｄ１（ＮＭ＿００７９５８）、Ｇｂｘ２（ＮＭ＿０１０２６２）、Ｓａｌｌ１（ＮＭ＿０２１３９０）、Ｍａｐ２ｋ１（ＮＭ＿００８９２７）、Ｆｏｓ（ＮＭ＿０１０２３４）、Ｒｉｆ１（ＮＭ＿１７５２３８）、Ｇｆａｐ（ＮＭ＿０１０２７７）、Ｍａｐ２（ＮＭ＿００８９２７）、ネスチン（ＮＭ＿０１６７０１）、Ｔｕｊ１（ＮＭ＿０２３２７９）からなる群より選択される１以上の神経分化遺伝子と、
Ｅｓｒ１（ＡＫ０５４１８２）、Ｅｓｒ２（ＮＭ＿０１０１５７）、ＡＲ（ＮＭ＿０１３４７６）、ＲＡＲａ（ＮＭ＿０３１５２８）、ＲＡＲｂ（Ｍｍ．２５９３１８）、ＲＡＲｇ（ＮＭ＿０１１２４４）、Ｎａｎｏｇ（ＮＭ＿０２８０１６）、Ｋｌｆ４（ＮＭ＿０１０６３７）、Ｚｆｐ４２（ＮＭ＿００９５５６）、Ｐｏｕ５ｆ１（ＮＭ＿０１３６３３）、Ｆｇｆｒ１（ＮＭ＿０１０２０６）、ネスチン（ＮＭ＿０１６７０１）、Ｔｕｊ１（ＮＭ＿０２３２７９）、Ｍａｐ２（ＮＭ＿００８９２７）、Ｏｌｉｇ２（ＮＭ＿０１６９６７）、Ｇｆａｐ（ＮＭ＿０１０２７７）からなる群より選択される１以上の核内受容体遺伝子を含む分化段階マーカー遺伝子と、
Ｅｓｒ１（ＡＫ０５４１８２）、Ｅｓｒ２（ＮＭ＿０１０１５７）、ＡＲ（ＮＭ＿０１３４７６）、ＲＡＲａ（ＮＭ＿０３１５２８）、ＲＡＲｂ（Ｍｍ．２５９３１８）、ＲＡＲｇ（ＮＭ＿０１１２４４）、ＥｐｈｒｉｎＢ（ＮＷ＿００１０３０８８２）、ＥｐｈＢ（ＮＭ＿１７３４４７）、Ｓｅｍａ３Ａ（ＮＭ＿００９１５２）、ＰｌｅｘｉｎＡ（Ｍｍ．３７８９）、Ｓｅｍａ７Ａ（ＮＭ＿０１１３５２）、Ｉｔｇｂ１（ＮＭ＿０１０５７８）、Ｎｅｔｒｉｎ１（Ｍｍ．３９０９５）、Ｓｌｉｔ１（ＮＭ＿０１５７４８）、Ｒｏｂｏ２（ＮＭ＿１７５５４９）、Ｃｘｃｌ１２（ＮＭ＿０１３６５５）、Ｃｘｃｒ４（ＮＭ＿００９９１１）、ＮｅｔｒｉｎＧ（Ｍｍ．３９２６２）、ＮＧＬ１（Ｍｍ．２４１６８２）、Ｕｎｃ５（ＮＭ＿１５３１３１）からなる群より選択される１以上の核内受容体遺伝子を含む軸索伸長と、
Ｅｓｒ１（ＡＫ０５４１８２）、Ｅｓｒ２（ＮＭ＿０１０１５７）、ＡＲ（ＮＭ＿０１３４７６）、ＲＡＲａ（ＮＭ＿０３１５２８）、ＲＡＲｂ（Ｍｍ．２５９３１８）、ＲＡＲｇ（ＮＭ＿０１１２４４）、Ｔｓｃ１（ＮＭ＿０２２８８７）、Ｔｓｃ２（ＮＭ＿０１１６４７）、Ｆｍｒ１（ＮＭ＿００８０３１）、Ｕｂｅ３ａ（ＮＭ＿０１１６６８）、Ｒｅｌｎ（ＮＭ＿０１１２６１）、Ｎｌｇｎ３（ＮＭ＿１７２９３２）、Ｆｏｘｐ２（ＮＭ＿０５３２４２）、Ｃｎｔｎａｐ２（ＮＭ＿００１００４３５７）、Ｓｌｃ６ａ４（ＮＭ＿０１０４８４）、Ｇａｂｒｂ３（ＮＭ＿００８０７１）、Ｍｅｃｐ２（ＮＭ＿０１０７８８）、Ｅｎ２（ＮＭ＿０１０１３４）からなる群より選択される１以上の核内受容体遺伝子を含む自閉症関連遺伝子と、
Ｅｓｒ１（ＡＫ０５４１８２）、Ｅｓｒ２（ＮＭ＿０１０１５７）、ＡＲ（ＮＭ＿０１３４７６）、ＲＡＲａ（ＮＭ＿０３１５２８）、ＲＡＲｂ（Ｍｍ．２５９３１８）、ＲＡＲｇ（ＮＭ＿０１１２４４）、Ｔｈ（ＮＭ＿００９３７７）、Ｓｌｃ６ａ３（ＮＭ＿０１００２０）、Ｓｎｃａ（ＮＭ＿００９２２１）、Ｕｂａ１（ＮＭ＿００１１３６０８５）、Ｕｂｃｈ７（ＮＭ＿０２０５６９）、Ｐａｒｋ２（ＮＭ＿０１６６９４）、Ｕｃｈｌ１（ＮＭ＿０１１６７０）、Ｐａｒｋ７（ＮＭ＿０２０５６９）、Ｃａｓｐ９（ＮＭ＿０１５７３３）、Ｃａｓｐ３（ＮＭ＿００９８１０）、Ｃａｓｐ７（ＮＭ＿００７６１１）からなる群より選択される１以上の核内受容体遺伝子を含むパーキンソン病関連遺伝子と、
Ｅｓｒ１（ＡＫ０５４１８２）、Ｅｓｒ２（ＮＭ＿０１０１５７）、ＡＲ（ＮＭ＿０１３４７６）、ＲＡＲａ（ＮＭ＿０３１５２８）、ＲＡＲｂ（Ｍｍ．２５９３１８）、ＲＡＲｇ（ＮＭ＿０１１２４４）、Ａｐｐ（ＮＭ＿００７４７１）、Ｂａｃｅ（ＮＭ＿０１１７９２）、Ｐｓｅｎ（ＮＭ＿００８９４３）、ＡｐｏＥ（ＮＭ＿００９６９６）、Ｉｄｅ（ＮＭ＿０３１１５６）、Ｍｍｅ（ＮＭ＿００８６０４）、Ｉｌ１ｒ１（ＮＭ＿００８３６２）、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ（ＮＭ＿０１１６０９）、Ｃａｓｐ３（ＮＭ＿００９８１０）、Ｃａｓｐ７（ＮＭ＿００７６１１）からなる群より選択される１以上の核内受容体遺伝子を含むアルツハイマー病関連遺伝子との組合わせである。

【0024】

【表1】

【0025】

本発明において、遺伝子発現量及び上記細胞形態の測定値を、サンプルで処理しない場合か又は胎生プログラミングに対する影響が知られている物質についての測定値と対比する方法は、たとえば、ベジアンネットワークシステムである。ベイジアンネットワークとは、不確実性を含む事象の予測や合理的な意思決定、障害診断などに利用することのできる確率モデルの一種である。ある確率分布を表現し、その確率分布を計算し、予測や最適な意思決定を行う。この確率分布の計算は、確率推論と呼ばれる。ベイジアンネットワークの特徴は、因果的な構造をネットワークとして表し、その上で確率推論を行うことで不確実な事象の起こりやすさやその可能性を予測するものである。例えば、「変数（パラメーター）Ｘがｘという値を取るならば（親ノード）、変数Ｙはｙとなる（子ノード）」という関係が成立するとすと、Ｙのとる値はＸの値から独立ではない。つまり、ＹはＸの値に依存していて共変関係があるといえる。TAOgenは、Toyoshibaら及びYamanakaらによって開発された非循環ネットワークの関係を線形回帰によってベイジアン理論に基づく計算を行い、遺伝子間のリンケージ（関係性）を明らかにするものである（Yamanaka T, Toyoshiba H, Sone H, Parham FM, Portier CJ.:「大腸菌におけるＳＯＳ修復への適用で遺伝子相互作用・ネットワークを識別するためのTAO-Genアルゴリズム」 Environ Health Perspect. 112巻16号、1614-1621頁（2004）、Toyoshiba H, Yamanaka T, Sone H, Parham FM, Walker NJ, Martinez J, Portier CJ.：「遺伝子相互作用・ネットワークは、ダイオキシンがアリール炭化水素レセプターとレチノイン酸レセプター・ベータの間の重要なつながりを誘導することを示唆する。」Environ Health Perspect. 112巻12号、1217-1224頁（2004）.）。このTAOgenを元に、独自にカスタマイズしたmulti-TAOgenというソフトウエアを用いて解析を行った。

【0026】

本発明において、遺伝子発現量及び上記細胞形態の測定値を、胎生プログラミングに対する影響が知られている物質についての測定値と対比するとは、multi-TAOgenのソフトウェアによって統合化ネットワークを構築することをいう。

【0027】

胎児期曝露後の晩発影響を評価するため、ＥＳ細胞の大きさを均一に培養制御できる微粒子型溝を１００−１０２０個有するアレイ上でＥＳ細胞から均一な胚葉体（ＥＢ、embryonic body）の形成を行い、その後に、神経誘導基底膜上で培養して、成熟神経細胞へ分化誘導する培養法を確立した。

【0028】

たとえば、神経系誘導剤であるレチノイン酸（１０^−８Ｍ）とともに、３次元パターニングアレイ上の培養開始から化学物質に一定時間（たとえば、４８時間）曝露させ、その後、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現を測定する。さらに、神経誘導基底膜上で培養し、成熟神経細胞の形態を計測する。計測した遺伝子発現情報及び細胞形態情報をベイジアンアルゴリズムにより相互関係を確率的に示したネットワーク図で示し、ネットワークの構造の違いにより、影響の違いを示す。これら一連の手法が、本発明の、マルチプロファイリングによる化学物質の胎生プログラミングに及ぼす影響検出法である。

【0029】

以下、本発明について、実施例を示して具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。

【実施例1】

【0030】

１．ＥＳ細胞の調製
ＧＦＰ発現ベクターにＣＡＧプロモーターを繋いで作製したＧｒｅｅｎ ｍｏｕｓｅ ＦＭ１３１マウス由来のマウス胚性幹細胞株（ｍＥＳ細胞）であるＢ６Ｇ−２細胞系（理研）を、増殖不活性化処理済みのマウス繊維芽細胞（ＭＥＦ）上で十分に増殖させた。その後、０．１％ゼラチンをコートした６０ｍｍディッシュ上でＤＭＥＭ（フェノールレッド不含、Invitrogen），１５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Invitrogen）、１００μＭ ＮＥＡＡ（Non-essential amino acids、Invitrogen）、１００μＭ ２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール、Invitrogen）、及び１０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ（白血病抑制因子、ＥＳＧＲＯ、Invitrogen）を含むＥＳ培地で継代を行った。ＭＥＦの影響が最も少なく遺伝子の変異を抑えられる第２継代後、マイクロスフィアアレイ上にＥＳ細胞を播種した。

【0031】

２．ＥＳ細胞マイクロスフィアの調製
細胞を培養する環境を制御することは、細胞の挙動の理解や細胞機能を工学的に応用する際に極めて重要である。本研究では、細胞が付着する基板、その付着面の位置と形状、細胞周囲の流動場を全てマイクロメーターの精度でパターニングを行う微細加工技術である（軟性リソグラフィ）を施したデバイスのマイクロスフィアアレイ上でマウスのＥＳ細胞の大きさや分化速度の均一化を行い、成熟神経細胞を誘導する３次元的培養法を確立した。本研究で使用した枠分離型マイクロスフィアアレイ（チップ３００）の構造は、基板として材質は、アクリル樹脂性であり外形寸法は、２４×２４ｍｍ角、枠樹脂の材質は、ＰＤＭＳ樹脂で出来ており、形状は額縁型の形状で内側に２５０μｌの培地が入る容積として設計されている。この枠はピンセットで容易に取り外しが可能である。更に、枠内（１０×１０ｍｍ）には１０２０個の均一なウェルが形成されており、ウェルの直径は３００μｍであり、ウェル間の距離（ピッチ）は３３０μｍであり、ウェルの深さは２７０μｍである。

【0032】

この枠分離型マイクロスフィアアレイ（チップ３００）を６ウェルプレートへ移し、ピペットマンで、枠内の滅菌水を全て吸引除去する作業後、直ちにＥＢ培地を入れてＰＢＳ（−）と置換した。この作業を３回行った後、２５０μｌずつのＥＢ培地を入れて３７℃のインキュベーターに静置した。第２継代のＥＳ細胞懸濁液を４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整した。調整後、インキュベーター内のマイクロスフィアアレイを取り出しＥＢ培地を吸引除去し、ＥＳ細胞懸濁液を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／２５０μｌずつアレイの枠内に、枠の端から緩やかに注ぎインキュベーター内に４時間程静置した。アレイに播種したＥＳ細胞は１０分以内には全てウェル内に均一に集積することが確認された。培養６時間後に化学物質を添加したＥＢ培地と培地交換を行い、化学物質での４８時間の暴露を行った。

【0033】

３．ニューロスフィア前駆体の調製
化学物質添加４８時間後に、１０^−８Ｍのレチノイン酸を含むＥＢ培地と培地交換を行った。培養４日目に、再び、１０^−８Ｍのレチノイン酸を含むＥＢ培地と培地交換を行った。更に、培養６日目にＥＢ培地のみに交換した。培養８日目にマイクロスフィアアレイをピンセットで取り出し、全てのニューロスフィア前駆体を完全に回収するために非接着性の３５ｍｍディッシュ内で１ｍｌのピペットで軽くピペッティングを行い、ニューロスフィア前駆体を１．５ｍｌのマイクロチューブに回収した。あらかじめ自作した２４ウェルのオルチニン・ラミニンコートプレートに、回収したニューロスフィア前駆体を２００マイクロのチップで均一に８３個／ウェルになるように２００マイクロのチップで播種した。この時のニューロスフィア前駆体の直径の平均は約２１０μｍであった。

【0034】

オルチニン・ラミニンコートの作成方法は、下記のとおりである。Ｐｏｌｙ−ｌ−オルニチン溶液を蒸留水で２．５倍に希釈した。１００μｌのラミニンを、１２ｍｌのＰＢＳで希釈した。２．５倍に希釈したＰｏｌｙ−ｌ−オルニチン溶液を、２４ウェルに５００μｌずつ分注し、３７℃のインキュベーター内で一昼夜静置した。翌日、ＤＷで３回洗浄した。希釈したラミニンを２４ウェルに５００μｌずつ分注し、３７℃のインキュベーター内で４〜６時間静置した。アスピレーターでラミニンを完全に吸い取り、１ｍｌのＥＢ培地を加え、３７℃のインキュベーター内で静置した。

【0035】

４．神経細胞系モデルの調製
ＥＢ培地で２４時間培養後、ニューロスフィア前駆体が完全にウェル内で接着し、短い神経突起の伸長を確認後、神経誘導培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、Ｎ２、１０μｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ）へ培地交換を行った。培地交換は３日おきに行った。オルチニン・ラミニンコート上にニューロスフィア前駆体を播種後、１２日間の培養を行った（培養期間の総計は２０日間となった。）。培養１２日目（培養期間の総計として２０日間）の細胞は、下記の条件の全てを満たした。
（１）ニューロスフィア前駆体の平均真円率は、０．４９、（２）ニューロスフィア前躯体の平均円周は１５５１．７μｍ、（３）ニューロスフィア前躯体の平均総面積は、６６５４０６９．２μｍ^２（４）ニューロスフィア前躯体の平均個数は、８４．７個、（５）ニューロスフィア前躯体の平均直径は、４９２．３μｍ、（５）ニューロスフィア前躯体から遊走する細胞の総数は、１４４６８．４個、（６）MAP2陽性ニューロスフィア前躯体の平均総面積は、６０１９３９．８μｍ^２、（７）ニューロスフィア前躯体から遊走するMAP2陽性ニューロンの神経突起の平均総伸張は、２３７２１４．１μｍ、（８）MAP2陽性ニューロンの交差点の平均総数は、１２８４．６個、（９）MAP2陽性ニューロンの分岐点の平均総数は、４６１５．６個、（１０）GFAP陽性ニューロスフィア前躯体の平均総面積は、７１９５４４．９μｍ^２、（１１）ニューロスフィア前躯体から遊走するGFAP陽性細胞の細胞質突起の平均総伸張は、４３１５１．３μｍ（１２）GFAP陽性細胞の交差点の平均総数は、２２７．４個、（１２）GFAP陽性細胞の分岐点の平均総数は、１０７９．５個であった。

【0036】

５．１２化学物質での実験結果
マルチチャンネル画像解析装置のＩＮ Ｃｅｌｌ アナライザー１０００により、コントロール群と１２種類の選定被験化学物質（それぞれ高用量として、１０ｎＭのトリヨードチロキシン、１０ｎＭのデキサメタゾン、１０ｎＭの１７β−エストラジオール、１０ｎＭの５α−ジハイドロテストステロン、１０ｎＭの２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ジオキシン（テトラクロロジベンゾダイオキシン）、１００μＭのメトプレン酸、１０μＭのシクロパミン、１０μＭのサリドマイド、１０ｎＭの４（ＯＨ）−２’，３，３’，４’，５’−ペンタクロロビフェニル（水酸化ポリクロロビフェニル１０７）、１０μＭのペルメトリン、１００ｐＭのビスフェノール−Ａ、１００μＭのビス（２−エチルヘキシル）フタル酸（フタル酸ジエチルヘキシル）の曝露影響の結果を下記に示す。

【0037】

（１）ニューロスフィア前駆体の真円率は、コントロール群は０．４９、１０ｎＭ Ｄｅｘは０．５４、１０μＭ ＰＭＴは、０．５６、１０ｎＭ Ｅ２は０．５６、１０ｎＭ ＴＣＤＤは、０．５０、１０ｎＭ ＤＨＴは、０．５３、１００μＭ ＤＥＨＰは０．５７、１００ｐＭ ＢＰＡは、０．５８、１０ｎＭ ＰＣＢは、０．５１、１０ｎＭＴ３は、０．５２、１０μＭ ＴＭＤは０．５１、１０μＭ ＣＰＭは、０．５２、１００μＭ ＭＰＡは０．５５であった。

【0038】

（２）ニューロスフィア前躯体の円周は、コントロール群は１５５１．７μｍ、１０ｎＭ Ｄｅｘは１４３６．７μｍ、１０μＭ ＰＭＴは、１１８７．８μｍ、１０ｎＭ Ｅ２は１２５０．５μｍ、１０ｎＭ ＴＣＤＤは、１４２９．９μｍ、１０ｎＭ ＤＨＴは１３９３．０μｍ、１００μＭ ＤＥＨＰは１２０７．８μｍ、１００ｐＭ ＢＰＡは１１８２．６μｍ、１０ｎＭ ＰＣＢは、１５６５．８μｍ、１０ｎＭＴ３は、１３６２．５μｍ、１０μＭ ＴＭＤは１３１７．０μｍ、１０μＭ ＣＰＭは１３５３．６μｍ、１００μＭ ＭＰＡは１２６９．２μｍであった。

【0039】

（３）ニューロスフィア前躯体の面積は、コントロール群は６６５４０６９．２μｍ^２、１０ｎＭ Ｄｅｘは６７４６９０２．５μｍ^２、１０μＭ ＰＭＴは５５４００４４．２μｍ^２、１０ｎＭ Ｅ２は４９０９４２５．８μｍ^２、１０ｎＭ ＴＣＤＤは５４４６５０２．０μｍ^２、１０ｎＭ ＤＨＴは６１０９４９７．７μｍ^２、１００μＭ ＤＥＨＰは５０３１１０２．７μｍ^２、１００ｐＭ ＢＰＡは２７５６３４１．９μｍ^２、１０ｎＭ ＰＣＢは、４４８８２９２．４μｍ^２、１０ｎＭＴ３は、６０８８２７３．９μｍ^２、１０μＭ ＴＭＤは４１４２２７５．１μｍ^２、１０μＭ ＣＰＭは４１６４９２１．６μｍ^２、１００μＭ ＭＰＡは４１９７８２５．１μｍ^２であった。

【0040】

（４）ニューロスフィア前躯体の個数は、コントロール群は８４．７個、１０ｎＭ Ｄｅｘは８３．２個、１０μＭ ＰＭＴは８９．６個、１０ｎＭ Ｅ２は６９．５個、１０ｎＭ ＴＣＤＤは７２．９個、１０ｎＭ ＤＨＴは７６．３個、１００μＭ ＤＥＨＰは７３．６個、１００ｐＭ ＢＰＡは４２．３個、１０ｎＭ ＰＣＢは、５０．１個、１０ｎＭＴ３は、８１．７個、１０μＭ ＴＭＤは５９．２個、１０μＭ ＣＰＭは５４．６個、１００μＭ ＭＰＡは５８．８個であった。

【0041】

（５）ニューロスフィア前躯体の直径は、コントロール群は４９２．３μｍ、１０ｎＭ Ｄｅｘは４５９．４μｍ、１０μＭ ＰＭＴは、３７４．８μｍ、１０ｎＭ Ｅ２は４００．９ｍ、１０ｎＭ ＴＣＤＤは、４５５．８μｍ、１０ｎＭ ＤＨＴは４４７．８μｍ、１００μＭ ＤＥＨＰは３８３．９μｍ、１００ｐＭ ＢＰＡは３６５．０μｍ、１０ｎＭ ＰＣＢは、５０１．３μｍ、１０ｎＭＴ３は、４３１．８μｍ、１０μＭ ＴＭＤは４１８．１μｍ、１０μＭ ＣＰＭは４２９．６μｍ、１００μＭ ＭＰＡは４０２．４μｍであった。

【0042】

（５）ニューロスフィア前躯体から遊走する細胞の個数は、コントロール群は１４４６８．４個、１０ｎＭ Ｄｅｘは３５２８８．１個、１０μＭ ＰＭＴは３３７２０個、１０ｎＭ Ｅ２は２８９１２．１個、１０ｎＭ ＴＣＤＤは１３１５５．１個、１０ｎＭ ＤＨＴは３２５７１．９個、１００μＭ ＤＥＨＰは３３６７４．４個、１００ｐＭ ＢＰＡは１０２７１．４個、１０ｎＭ ＰＣＢは、１０１１９．８個、１０ｎＭＴ３は、３２２６９．９個、１０μＭ ＴＭＤは２２１９０．１個、１０μＭ ＣＰＭは２０４５２．１個、１００μＭ ＭＰＡは２６１７７．６個であった。

【0043】

（６）ＭＡＰ２陽性ニューロスフィア前躯体の面積は、コントロール群は６０１９３９．８μｍ^２、１０ｎＭ Ｄｅｘは１０７７５９４．６μｍ^２、１０μＭ ＰＭＴは１０４９２３９．８μｍ^２、１０ｎＭ Ｅ２は７３２１５８．４μｍ^２、１０ｎＭ ＴＣＤＤは４７１９４０．７μｍ^２、１０ｎＭ ＤＨＴは２５４３３０．６μｍ^２、１００μＭ ＤＥＨＰは５７０４９５．２μｍ^２、１００ｐＭ ＢＰＡは３４４５２５．８μｍ^２、１０ｎＭ ＰＣＢは、３５４８７６．３μｍ^２、１０ｎＭＴ３は、９６０７４．０μｍ^２、１０μＭ ＴＭＤは７６４３０．１μｍ^２、１０μＭ ＣＰＭは１００５５５．５μｍ^２、１００μＭ ＭＰＡは１９８４４５．２μｍ^２であった。

【0044】

（７）ニューロスフィア前躯体から遊走するＭＡＰ２陽性ニューロンの神経突起の総伸張は、コントロール群は２３７２１４．１μｍ、１０ｎＭ Ｄｅｘは３８０２７２．０μｍ、１０μＭ ＰＭＴは、３６２９３３４．０μｍ、１０ｎＭ Ｅ２は２５０９８６．２μｍ、１０ｎＭ ＴＣＤＤは、１８３２３５．９μｍ、１０ｎＭ ＤＨＴは１４１４２６７．０μｍ、１００μＭ ＤＥＨＰは２２４２７８．９μｍ、１００ｐＭ ＢＰＡは１２５２９９．８μｍ、１０ｎＭ ＰＣＢは、１３７２８３．３μｍ、１０ｎＭＴ３は、８０９１６．１μｍ、１０μＭ ＴＭＤは２５１０１．７μｍ、１０μＭ ＣＰＭは２６３１６．２μｍ、１００μＭ ＭＰＡは４２９６９．９μｍであった。

【0045】

（８）ＭＡＰ２陽性ニューロンの交差点の個数は、コントロール群は１２８４．６個、１０ｎＭ Ｄｅｘは１４０４．３個、１０μＭ ＰＭＴは１４８２．５個、１０ｎＭ Ｅ２は９５５．６個、１０ｎＭ ＴＣＤＤは９８７．４個、１０ｎＭ ＤＨＴは５４３．８個、１００μＭ ＤＥＨＰは８６９．２個、１００ｐＭ ＢＰＡは６６４個、１０ｎＭ ＰＣＢは、７２５．８個、１０ｎＭＴ３は、３０３．４個、１０μＭ ＴＭＤは１３０．４個、１０μＭ ＣＰＭは１４１．４個、１００μＭ ＭＰＡは２４５．２個であった。

【0046】

（９）ＭＡＰ２陽性ニューロンの分岐点の個数は、コントロール群は４６１５．６個、１０ｎＭ Ｄｅｘは６５４８．９個、１０μＭ ＰＭＴは６２３０．７個、１０ｎＭ Ｅ２は４３２７２．５個、１０ｎＭ ＴＣＤＤは３５２５．６個、１０ｎＭ ＤＨＴは２１５７．３個、１００μＭ ＤＥＨＰは３６３０．８個、１００ｐＭ ＢＰＡは２３９５．６個、１０ｎＭ ＰＣＢは、２５７３．７個、１０ｎＭＴ３は、１１２７個、１０μＭ ＴＭＤは４４８．１個、１０μＭ ＣＰＭは４８１．４個、１００μＭ ＭＰＡは８０６．６個であった。

【0047】

（１０）ＧＦＡＰ陽性ニューロスフィア前躯体の面積は、コントロール群は７１９５４４．９μｍ^２、１０ｎＭ Ｄｅｘは２０２９２４０μｍ^２、１０μＭ ＰＭＴは９５５１０９．９μｍ^２、１０ｎＭ Ｅ２は８３１３４７．６μｍ^２、１０ｎＭ ＴＣＤＤは５６９２１９．１μｍ^２、１０ｎＭ ＤＨＴは１８０８５３１．８μｍ^２、１００μＭ ＤＥＨＰは１０８６８８８．７μｍ^２、１００ｐＭ ＢＰＡは１１００１６８．１μｍ^２、１０ｎＭ ＰＣＢは、１１２９６６１．４ｍ^２、１０ｎＭＴ３は、２０７４７１．２μｍ^２、１０μＭ ＴＭＤは２１３０９３．５μｍ^２、１０μＭ ＣＰＭは１０９２５１．６μｍ^２、１００μＭ ＭＰＡは２５２３２１．３μｍ^２であった。

【0048】

（１１）ニューロスフィア前躯体から遊走するＧＦＡＰ陽性細胞の細胞質突起の総伸張は、コントロール群は４３１５１．３μｍ、１０ｎＭ Ｄｅｘは１２５３８２．９μｍ、１０μＭ ＰＭＴは、４４３８６．０μｍ、１０ｎＭ Ｅ２は３８７７１．９μｍ、１０ｎＭ ＴＣＤＤは、３４４１９．４μｍ、１０ｎＭ ＤＨＴは１２９０２３．１μｍ、１００μＭ ＤＥＨＰは５７６６４．５μｍ、１００ｐＭ ＢＰＡは６１５１３．８μｍ、１０ｎＭ ＰＣＢは、６５４１０．１μｍ、１０ｎＭＴ３は、４０５３８．４μｍ、１０μＭ ＴＭＤは８２６７．９μｍ、１０μＭ ＣＰＭは５７１９４．８μｍ、１００μＭ ＭＰＡは４９２２９．４μｍであった。

【0049】

（１２）ＧＦＡＰ陽性細胞の交差点の個数は、コントロール群は２２７．４個、１０ｎＭ Ｄｅｘは４０７．９個、１０μＭ ＰＭＴは１３６個、１０ｎＭ Ｅ２は１１６．１個、１０ｎＭ ＴＣＤＤは１８４．３個、１０ｎＭ ＤＨＴは４０４．７個、１００μＭ ＤＥＨＰは１６９．１個、１００ｐＭ ＢＰＡは３０２．７個、１０ｎＭ ＰＣＢは、３２２．６個、１０ｎＭＴ３は、１２３．２個、１０μＭ ＴＭＤは２４．８個、１０μＭ ＣＰＭは２５６．１個、１００μＭ ＭＰＡは２４７．４個であった。

【0050】

（１３）ＧＦＡＰ陽性細胞の分岐点の個数は、コントロール群は１０７９．５個、１０ｎＭ Ｄｅｘは２６１６．５個、１０μＭ ＰＭＴは８８６個、１０ｎＭ Ｅ２は７７４．１個、１０ｎＭ ＴＣＤＤは８６８．２個、１０ｎＭ ＤＨＴは２６００．１個、１００μＭ ＤＥＨＰは１１４９．７個、１００ｐＭ ＢＰＡは１５１４．１個、１０ｎＭ ＰＣＢは、１６０７個、１０ｎＭＴ３は、８１６．４個、１０μＭ ＴＭＤは１６０．３個、１０μＭ ＣＰＭは１３６５．２個、１００μＭ ＭＰＡは１２１１．２個であった。

【0051】

【表2】

【0052】

コントロール群（２３７２１４．０７μｍ）と比較してＭＡＰ２陽性ニューロンの神経突起の長さ（１視野における総伸張の平均値）を促進する化学物質は、１０ｎＭ Ｄｅｘ （３８０２７２μｍ）、１０μＭ ＰＭＴ（３６２９３４μｍ）、１０ｎＭ Ｅ２（２５０９８６．２）、１００μＭ ＤＥＨＰ（２２４２７９μｍ）、１０ｎＭ Ｔ３（８０９１６．１μｍ）、１０μＭ ＴＭＤ（２５１０１．７μｍ）、１０μＭ ＣＰＭ（２６３１６．２μｍ）、１００μＭ ＭＰＡ（４２９６９．９μｍ）であった。

【0053】

一方で、ＧＦＡＰグリア陽性細胞の突起の１視野における総伸長の平均値がＣｏｎｔｒｏｌ群（４３１５１．３μｍ）と比して促進するものは、１０μＭＰＭＴ（４４３８６．１μｍ）、１０ｎＭ ＤＨＴ（１２９０２３．１μｍ）、１００μＭ ＤＥＨＰ（５７６６４．５μｍ）、１００ｐＭ ＢＰＡ（６１５１３．８μｍ）、１０ｎＭ ＰＣＢ（６５４１０．１μｍ）、１００ｎＭ ＣＰＭ（５９７１９４．８μｍ）、１０μＭ ＣＰＭ（５７１９４．８μｍ）、１００μＭ ＭＰＡ（４９２２９．４μｍ）であった。

【0054】

ＭＡＰ２陽性ニューロンの交差点の１視野における総数は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（１２８４．６個）と比して多いものは、１０ｎＭ Ｄｅｘ（１４０４．３個）、１０μＭ ＰＭＴ（１４０４．３個）であった。ＭＡＰ２陽性ニューロンの分岐点の１視野における総数の平均値に関しては、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（４６１５．６個）、１０ｎＭ Ｄｅｘ（６５４８．９個）、１０μＭ ＰＭＴ（６２３０．７個）であった。

【0055】

同様にＧＦＡＰ陽性グリア細胞の細胞質突起の交差点の１視野における総数の平均値はＣｏｎｔｒｏｌ群（２２７．４個）に対して、１０ｎＭ Ｄｅｘ（４０７．９個）、１０ｎＭ ＤＨＴ （４０４．７個）、１００ｐＭ ＢＰＡ（３０２．７個）、１０ｎＭ ＰＣＢ（３２２．６個）、１０μＭ ＣＰＭ（２５６．１個）、１００μＭ ＭＰＡ（２４７．４個）、そして、分岐点の１視野における総数の平均値は、コントロール群（１０７９．５個）に対して１０ｎＭ Ｄｅｘ（２６１６．５個）、１０ｎＭ ＤＨＴ （２６００．１個）、１００μＭ ＤＥＨＰ（１１４９．７）、１００ｐＭ ＢＰＡ（１５１４．１個）、１０ｎＭ ＰＣＢ（１６０７個）、１０μＭ ＣＰＭ（１３６５．２個）、１００μＭ ＭＰＡ（１２１１．２個）であった。

【0056】

さらに、ＭＡＰ２陽性ニューロンの１視野における総面積の平均値を検討したところ、コントロール群（６０１９４０．８μｍ^２）と比較して、１０ｎＭ Ｅ２（７３２１５８．４μｍ^２）であった。ＧＦＡＰ陽性グリア細胞の１視野における総面積の平均値は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（７１９５４４．９μｍ^２）と比較して、１０μＭ ＰＭＴ（９５５１１０μｍ^２）、１０ｎＭ Ｅ２（８３１３４７．６μｍ^２）であった。

【0057】

次に、ニューロスフィアの形態に影響を及ぼす化学物質は、（１）ニューロスフィアの１視野における総面積の平均値がコントロール群（６０１９３９．７６９μｍ^２）と比較して大きい化学物質は、１０ｎＭ Ｅ２（７３２１５８．４３５６μｍ^２）であった。（２）ニューロスフィアの１視野における総数の平均値がコントロール群（８４．６６６６６６７個）と比較して多い化学物資は、１０μＭ ＰＭＴ（８９．５５５５５５５６個）、１００ｎＭ ＴＭＤ（８６．０５５５５５６個）、（３）ニューロスフィアの真円率の平均値は、いずれも化学物質に暴露されるとコントロール群（０．４８６５）と比較して全て真円に近い値を示した（０．５０〜０．５７）。

【0058】

（４）ニューロスフィアから遊走する細胞総数（核の総数）の１視野における平均値をコントロール群（１４４６８．３８８９個）と比較して促進する化学物質は、１０ｎＭ Ｄｅｘ（３５２８８．１１１１１個）、１０μＭ ＰＭＴ（３３７２０個）、１０ｎＭ Ｅ２（２８９１２．１１１１１個）、１０ｎＭ ＤＨＴ（３２５７１．８８８９個）、１００μＭ ＤＥＨＰ（３３６７４．４４４４４個）、１０ｎＭ Ｔ３ （３２２６９．８８８９個）、１０μＭ ＴＭＤ（２２１９０．０５５６個）、１０μＭ ＣＰＭ（２０４５２．１１１１個）、１００μＭ ＭＡＰ（２６１７７．５５５５６個）であった。

【0059】

（５）ニューロスフィアの１視野における円周の平均値がコントロール群（１５５１．６９３３３μｍ）と比較して大きい化学物資は、１０ｎＭ ＰＣＢ（１５６５．８１４１７μｍ）のみであった。

【0060】

（６）ニューロスフィアから遊走する１視野における細胞群の総核面積の平均値がコントロール群（２１２９４７３．９９μｍ^２）と比較して大きい化学物資は、
１０ｎＭ Ｄｅｘ （４１７１３６２．２７６μｍ^２）、１０μＭ ＰＭＴ（５１４６９００．１９６μｍ^２）、１０ｎＭ Ｅ２（３９７３０１５．４６７μｍ^２）、１０ｎＭ ＤＨＴ （４４８５４２３．６４μｍ^２）、１００μＭ ＤＥＨＰ（４５９１４０９．９２μｍ^２）、１０ｎＭ Ｔ３ （４８９５９０６．５６μｍ^２）、１０μＭ ＴＭＤ（３３６０７６１．７４μｍ^２）、１０μＭ ＣＰＭ（３１０４５３６．８９μｍ^２）、１０μＭ ＭＰＡ（３８７２４８７．９６４μｍ^２）であった。

【0061】

このように、マルチチャンネル画像解析装置によって得られた数値情報を元にグラフ化は可能であるため、それぞれの化学物質暴露群における比較は可能であるが、形態情報と化学物質の相関性について簡便に明確に示す事は出来ない。そこで、これらの形態情報と神経分化に関連する上記遺伝子セット（集団）の変動情報を類型化するための指標として、一元配置し、各指標間の依存関係を確率的に推定する手法ＴＡＯ−Ｇｅｎアルゴリズムを用いて、化学物質ごとの指標間ネットワークをマトリックスに表現した。このマトリックスは、化学物質によって、異なる得意な特徴をもつものが得られた（分類ができた）。

【0062】

ＴＡＯ−Ｇｅｎ（Theoretical Algorithm for Optimal Gene interaction networks）は、最適遺伝子相互ネットワークを作成するための数理アルゴリズムである。この手法は、ベイズの定理に基づいたもので既知であるが、形態情報と遺伝子変動情報との融合による多次元化情報を用いた相互関係への応用は、本発明が初めてである。

【0063】

６．実験結果の評価（対比方法、判断基準、分類方法等）
マルチ情報のネットワーク図として得られた個々の化学物質の特徴は、図２−図１４に示すとおり、左端列の各指標が最上行頭の各指標に関係性があるとの関係である。黒セルが正の制御関係、網セルが負の制御関係で示している。例えば、ＤＭＳＯ群の１行目に着目すると、ＡＲ遺伝子がＥｓｒ２と正の制御関係にあることを示し、ＡＲがＮｅｔｒｉｎ１と負の制御関係にあることを示している。このように、２０遺伝子と１０形態パラメーターを統合した３０の指標に基づいて、３０×３０のマトリックスで表現されるネットワーク図に、化学物質の初期曝露から晩発影響を網羅することが可能となった。このネットワーク図をさらに、サブカテゴリー（遺伝子に関する３種のカテゴリーセットと形態で合計４サブ分類）にわけて、そのなかに配置される関係の類似度の基準を９０％においた場合、１２種の化学物質に分けることができた。

【0064】

下記のブロックについて、ブロックごとに、各セルを１とした類似頻度を算出し、０．１％ＤＭＳＯを基準に９０％以下を異なるブロックとして識別した（表３参照）。
（ＡＲ、Ｅｓｒ１、Ｅｓｒ２、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ）×（ＡＲ、Ｅｓｒ１、Ｅｓｒ２、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ）のマトリックスからなるブロック１、
（Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、Ｉｔｇｂ１、ＮＧＬ１、ＮｅｔｒｉｎＧ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｎｅｔｒｉｎ１）×（ＡＲ、Ｅｓｒ１、Ｅｓｒ２、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ）のマトリックスからなるブロック２、
（ＥｐｈＢ、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｒｏｂｏ２、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｌｉｔ１、Ｕｎｃ５）×（ＡＲ、Ｅｓｒ１、Ｅｓｒ２、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ）のマトリックスからなるブロック３、
（ＥＢ＿Ａｒｅａ、ＥＢ＿ＦｏｒｍＦａｃｔｏｒ、ＥＢ＿Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ、ＥＢ＿ｃｏｕｎｔ、Ｎｕｃ＿Ａｒｅａ、Ｎｕｃ＿ｃｏｕｎｔ、Ｐｏｓｉ＿Ａｒｅａ、Ｂｒａｎｃｈ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｃｒｏｓｓｉｎｇ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｎｅｕｒｉｔｅ＿Ｌｅｎｇｔｈ）×（ＡＲ、Ｅｓｒ１、Ｅｓｒ２、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ）のマトリックスからなるブロック４、
（ＡＲ、Ｅｓｒ１、Ｅｓｒ２、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ）×（Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、Ｉｔｇｂ１、ＮＧＬ１、ＮｅｔｒｉｎＧ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｎｅｔｒｉｎ１）のマトリックスからなるブロック５、
（Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、Ｉｔｇｂ１、ＮＧＬ１、ＮｅｔｒｉｎＧ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｎｅｔｒｉｎ１）×（Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、Ｉｔｇｂ１、ＮＧＬ１、ＮｅｔｒｉｎＧ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｎｅｔｒｉｎ１）のマトリックスからなるブロック６、
（ＥｐｈＢ、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｒｏｂｏ２、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｌｉｔ１、Ｕｎｃ５）×（Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、Ｉｔｇｂ１、ＮＧＬ１、ＮｅｔｒｉｎＧ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｎｅｔｒｉｎ１）のマトリックスからなるブロック７、
（ＥＢ＿Ａｒｅａ、ＥＢ＿ＦｏｒｍＦａｃｔｏｒ、ＥＢ＿Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ、ＥＢ＿ｃｏｕｎｔ、Ｎｕｃ＿Ａｒｅａ、Ｎｕｃ＿ｃｏｕｎｔ、Ｐｏｓｉ＿Ａｒｅａ、Ｂｒａｎｃｈ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｃｒｏｓｓｉｎｇ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｎｅｕｒｉｔｅ＿Ｌｅｎｇｔｈ）×（Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、Ｉｔｇｂ１、ＮＧＬ１、ＮｅｔｒｉｎＧ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｎｅｔｒｉｎ１）のマトリックスからなるブロック８、
（ＡＲ、Ｅｓｒ１、Ｅｓｒ２、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ）×（ＥｐｈＢ、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｒｏｂｏ２、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｌｉｔ１、Ｕｎｃ５）のマトリックスからなるブロック９、
（Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、Ｉｔｇｂ１、ＮＧＬ１、ＮｅｔｒｉｎＧ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｎｅｔｒｉｎ１）×（ＥｐｈＢ、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｒｏｂｏ２、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｌｉｔ１、Ｕｎｃ５）のマトリックスからなるブロック１０、
（ＥｐｈＢ、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｒｏｂｏ２、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｌｉｔ１、Ｕｎｃ５）×（ＥｐｈＢ、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｒｏｂｏ２、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｌｉｔ１、Ｕｎｃ５）のマトリックスからなるブロック１１、
（ＥＢ＿Ａｒｅａ、ＥＢ＿ＦｏｒｍＦａｃｔｏｒ、ＥＢ＿Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ、ＥＢ＿ｃｏｕｎｔ、Ｎｕｃ＿Ａｒｅａ、Ｎｕｃ＿ｃｏｕｎｔ、Ｐｏｓｉ＿Ａｒｅａ、Ｂｒａｎｃｈ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｃｒｏｓｓｉｎｇ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｎｅｕｒｉｔｅ＿Ｌｅｎｇｔｈ）×（ＥｐｈＢ、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｒｏｂｏ２、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｌｉｔ１、Ｕｎｃ５）のマトリックスからなるブロック１２、
（ＡＲ、Ｅｓｒ１、Ｅｓｒ２、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＲＡＲｇ）×（ＥＢ＿Ａｒｅａ、ＥＢ＿ＦｏｒｍＦａｃｔｏｒ、ＥＢ＿Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ、ＥＢ＿ｃｏｕｎｔ、Ｎｕｃ＿Ａｒｅａ、Ｎｕｃ＿ｃｏｕｎｔ、Ｐｏｓｉ＿Ａｒｅａ、Ｂｒａｎｃｈ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｃｒｏｓｓｉｎｇ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｎｅｕｒｉｔｅ＿Ｌｅｎｇｔｈ）のマトリックスからなるブロック１３、
（Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、Ｉｔｇｂ１、ＮＧＬ１、ＮｅｔｒｉｎＧ、Ｓｅｍａ７Ａ、Ｎｅｔｒｉｎ１）×（ＥＢ＿Ａｒｅａ、ＥＢ＿ＦｏｒｍＦａｃｔｏｒ、ＥＢ＿Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ、ＥＢ＿ｃｏｕｎｔ、Ｎｕｃ＿Ａｒｅａ、Ｎｕｃ＿ｃｏｕｎｔ、Ｐｏｓｉ＿Ａｒｅａ、Ｂｒａｎｃｈ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｃｒｏｓｓｉｎｇ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｎｅｕｒｉｔｅ＿Ｌｅｎｇｔｈ）のマトリックスからなるブロック１４、
（ＥｐｈＢ、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＰｌｅｘｉｎＡ、Ｒｏｂｏ２、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｌｉｔ１、Ｕｎｃ５）×（ＥＢ＿Ａｒｅａ、ＥＢ＿ＦｏｒｍＦａｃｔｏｒ、ＥＢ＿Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ、ＥＢ＿ｃｏｕｎｔ、Ｎｕｃ＿Ａｒｅａ、Ｎｕｃ＿ｃｏｕｎｔ、Ｐｏｓｉ＿Ａｒｅａ、Ｂｒａｎｃｈ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｃｒｏｓｓｉｎｇ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｎｅｕｒｉｔｅ＿Ｌｅｎｇｔｈ）のマトリックスからなるブロック１５、
（ＥＢ＿Ａｒｅａ、ＥＢ＿ＦｏｒｍＦａｃｔｏｒ、ＥＢ＿Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ、ＥＢ＿ｃｏｕｎｔ、Ｎｕｃ＿Ａｒｅａ、Ｎｕｃ＿ｃｏｕｎｔ、Ｐｏｓｉ＿Ａｒｅａ、Ｂｒａｎｃｈ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｃｒｏｓｓｉｎｇ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｎｅｕｒｉｔｅ＿Ｌｅｎｇｔｈ）×（ＥＢ＿Ａｒｅａ、ＥＢ＿ＦｏｒｍＦａｃｔｏｒ、ＥＢ＿Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ、ＥＢ＿ｃｏｕｎｔ、Ｎｕｃ＿Ａｒｅａ、Ｎｕｃ＿ｃｏｕｎｔ、Ｐｏｓｉ＿Ａｒｅａ、Ｂｒａｎｃｈ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｃｒｏｓｓｉｎｇ＿Ｐｏｉｎｔ、Ｎｅｕｒｉｔｅ＿Ｌｅｎｇｔｈ）のマトリックスからなるブロック１６

【0065】

表３ ネットワーク判別手法におけるＤＭＳＯ群を基準とした場合のネットワークブロックの類似度

【0066】

【表3】

【0067】

１２種類の化学物質（２，３，７，８−四塩素化−パラ−ダイオキシン、４（ＯＨ）−２’，３，３’，４’，５’−ペンタ−クロロビフェニル、トリヨードチロニン、デキサメサゾン、５α−ジハイドロテストステロン、１７β−エストラジオール、サリドマイド、ビス（２−エチルエキシル）、フタル酸、ペルメスリン、シクロパミン、ビスフェノールＡ、メソプレン酸）について、本発明の方法を適用し、１２種の異なるネットワークに分類することができた。このことにより、作用機序が未知の化学物質を試験する場合、未知化学物質について、同様な曝露実験を行い、遺伝子発現データ及び細胞形態データを用いて、今回分類した既存の化学物質のネットワーク鋳型にあてはめて影響を予測することが可能となった。具体的には、未知物質のネットワークマトリックスを作成し、表３に示したネットワークブロックの類似性と同様な判別を行うことによって、未知物質の影響を予測することができる。

【産業上の利用可能性】

【0068】

本発明の方法を用いることによって、胎生プログラミングに対する影響を評価することができる。また、本発明の方法を用いて胎児期曝露による晩発影響のハイスループット解析を実施したならば、多種多様な化学物質についての生体（健康）影響を予見する情報の利用が可能となる。このことによって、生体（健康）影響予測が可能となり、化学物質曝露の被害を未然に防ぐことも可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】