特許 5786019 化粧品組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5786019

(24)【登録日】2015年7月31日

(45)【発行日】2015年9月30日

(54)【発明の名称】化粧品組成物

(51)【国際特許分類】

   C07H 15/203 20060101AFI20150910BHJP

   A61K 8/60 20060101ALI20150910BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20150910BHJP

   A61K 31/7028 20060101ALI20150910BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20150910BHJP

【ＦＩ】

   C07H15/203CSP

   A61K8/60

   A61Q19/08

   A61K31/7028

   A61P17/00

【請求項の数】9

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2013-503216(P2013-503216)

(86)(22)【出願日】2011年4月14日

(65)【公表番号】特表2013-527146(P2013-527146A)

(43)【公表日】2013年6月27日

(86)【国際出願番号】IB2011051628

(87)【国際公開番号】WO2011125057

(87)【国際公開日】20111013

【審査請求日】2014年3月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】512259178

【氏名又は名称】グェルラン ソシエテ アノニム

(73)【特許権者】

【識別番号】500262120

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＳＴＲＡＳＢＯＵＲＧ

(73)【特許権者】

【識別番号】501089863

【氏名又は名称】サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス）

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジムラー， シャルロット

(72)【発明者】

【氏名】ルプランケ， ヴィルジニー

(72)【発明者】

【氏名】ノブレス， エマニュエル

(72)【発明者】

【氏名】アンドレ， パトリス

(72)【発明者】

【氏名】ロープシュタイン， アンネリーゼ

【審査官】 早乙女 智美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５０４９２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２０９１４３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ

Ａ６１Ｋ８

Ａ６１Ｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

４−（４−β−Ｄ−グルコピラノシロキシベンジル）−（２Ｒ）−２−（ｐ−ヒドロキシベンジル）−マレート（ＶＴ１）、１，４−ビス（４−β−Ｄ−グルコピラノシロキシベンジル）−（２Ｒ）−２−（ｐ−ヒドロキシベンジル）−マレート（ＶＴ２）及び４−ビス（４−β−Ｄ−グルコピラノシロキシベンジル）−（２Ｒ）−２−（２−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−ｔｒａｎｓ−シンナモイルエステル）−２−（ｐ−ヒドロキシベンジル）−マレート（ＶＴ３）からなる群から選択される化合物。

【請求項2】

植物抽出物であって、請求項１に記載の化合物の１つ以上を乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも４０重量％含む抽出物。

【請求項3】

Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ属、Ｖａｎｄａ属又はＥｎｃｙｃｌｉａ属のランの少なくとも一部から得られることを特徴とする、請求項２に記載の抽出物。

【請求項4】

ラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓから得られることを特徴とする、請求項２に記載の抽出物。

【請求項5】

ＶＴ１及び／又はＶＴ２から選択される化合物を１つ以上含み、その合計含有量は４０重量％超であることを特徴とする、請求項２に記載の抽出物。

【請求項6】

ＶＴ３化合物を含み、その含有量は、乾燥抽出物の重量に対して８重量％超であることを特徴とする、請求項２に記載の抽出物。

【請求項7】

乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも８０重量％のＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物で構成されることを特徴とする、請求項２に記載の抽出物。

【請求項8】

化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分として、請求項１に記載の化合物の少なくとも１つ及び／又は請求項２に記載の抽出物の少なくとも１つを含む化粧品組成物又は皮膚科学的組成物。

【請求項9】

請求項１に記載の化合物又は請求項２に記載の抽出物の製造方法であって、
前記化合物を含有するラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの少なくとも一部を、極性溶媒を少なくとも１つ用いて抽出する工程を少なくとも１回、
糖の除去、又は、分画により、請求項１に記載の化合物の１つ以上について、前記抽出工程で得られた抽出物を濃縮する工程を少なくとも１回行う方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規なオイコム酸（２−（４−ヒドロキシベンジル）リンゴ酸）誘導体、これらの化合物を少なくとも１つ含む化粧品組成物又は皮膚科学的組成物、及び、該組成物を用いた処置方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ミトコンドリアは、その呼吸鎖及び酸化的リン酸化によって細胞のエネルギーを生産する場である。皮膚の老化、特に光に起因する皮膚の老化に伴って、ミトコンドリアの機能の低下が見られる。

【0003】

一般的に、ミトコンドリア呼吸鎖に欠陥があると活性酸素（ＲＯＳ）が細胞内で増加し、皮膚の老化の進行が加速する。このようにミトコンドリアが機能不全に陥ると、結果として細胞のエネルギー代謝が低下し、最終的には、細胞のエネルギー生産が損なわれる。化粧品産業において、ミトコンドリア呼吸鎖の機能を刺激し、それによって細胞のエネルギー代謝を活性化できる有効成分は、老化防止機能に値する（ＣｏＱ１０、レスベラトロール）。また、細胞の再生、従って分化を刺激する化粧品有効成分は、若くて健康的な肌を維持するのに役立つ。

【0004】

本発明は、そのような特徴を有するオイコム酸（２−（４−ヒドロキシベンジル）リンゴ酸）の誘導体である新規な化合物、特にラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの抽出物から得られる化合物に関する。

【0005】

オイコム酸は公知である。最初に、Ｅｕｃｏｍｉｓ ｐｕｎｃｔａｔａ（ユリ科）の球根抽出物から単離され（非特許文献１）、続いて、Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（マメ科）、Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ ｓｅｓｓｉｆｌｏｒａ（マメ科）、Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｐｉｎｎａｔｉｆａｄａ（バラ科）又はＥｎｃｙｃｌｉａ ｍｉｃｈｕａｃａｎａ（ラン科）等の他の植物種からも同定された。

【0006】

ラン科（ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｎｓ又はｏｒｃｈｉｄｓ）は、非常に広範な単子葉植物の科である。最も多種多様な植物の科であり、８５０属にわたって分布する２５０００種を超える植物種が含まれている。化粧品分野では、スキンケア用途を目的としていくつかのランが既に研究対象となっている。

【0007】

例えば、特許文献１には、ラン：Ｖａｎｄａ ｔｅｒｅｓ（現在はＰａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓという種名でＰａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ属に分類）の少なくとも一部から得られた抽出物が開示されており、また、化粧品として許容される賦形剤を少なくとも１つ含み、皮膚の老化の影響を減少又は遅延させるために肌に適用することを意図した化粧品組成物における有効成分として上記抽出物を使用することも開示されている。

【0008】

従って、このＰａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓ抽出物は、その活性、特に化粧品としての活性や皮膚科学的活性の面で特に有利である。だが、本発明者らの知る限り、現時点ではこれらの活性をもたらす分子は単離も同定もされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】仏国特許出願公開第２９２４３４８号明細書

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｈｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１９８４，５７（６），１７６６−８４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、皮膚の老化の影響を減少若しくは遅延させること、及び／又は、皮膚の保湿性を維持若しくは改善すること、及び／又は、皮膚治癒を促進することができる化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分として使用できる新規な化合物を提供することを主な目的とする。

【0012】

本発明はまた、化粧品組成物又は皮膚科学的組成物において有効成分として使用できる形態、特に、これらの新規な化合物の少なくとも１つが濃縮された植物抽出物の形態で、これらの新規な化合物を提供することを目的とする。

【0013】

別の態様によれば、本発明は、化粧品として又は皮膚科学的に許容されるビヒクル中に化粧品成分又は皮膚科学的成分としてこれらの化合物を少なくとも１つ又はそのような有効成分を植物抽出物の形態で含み、且つ、肌へ局所的に適用できる化粧品組成物又は皮膚科学的組成物に関する。

【0014】

本発明はまた、ラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの抽出物の活性分子を１つ以上単離及び特性決定するという技術的課題を解決することを目的とする。

【0015】

また、本発明は、産業及び化粧品レベルで使用できるとりわけ簡便で比較的安価な方法により、これらの技術的課題を解決できる手段を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らは、オイコム酸の誘導体である新規な化合物、特にラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓ抽出物から得られた化合物を単離、同定した。これらの新規な化合物は下記式（Ｉ）で表され、本明細書中ではまとめて「バンダテロシド（ｖａｎｄａｔｅｒｏｓｉｄｅ）（ＶＴと略す）」と呼ぶ。

【0017】

本発明者らはまた、本発明のバンダテロシドがヒトケラチノサイト（ＮＨＫ及びＨａＣａＴ）におけるミトコンドリア呼吸鎖の機能に与える影響を、具体的には呼吸鎖複合体Ｉ及びＩＩ並びにシトクロムＣオキシダーゼに着目して、明らかにした。更に、本発明者らは、それらがミトコンドリア呼吸鎖の機能及びヒトケラチノサイトの細胞分化を著しく刺激することを明らかにした。従って、これらの分子は、エネルギー代謝及び細胞の酸化ストレスを制御する中心として作用し、よって、皮膚の老化を防ぐ化粧品組成物又は皮膚科学的組成物の有効成分として、予想されなかったほどに、有利である。細胞の再生及び分化を刺激することにより、上記化合物は細胞の代謝系に関与し、角質の再生を刺激し、若くて健康的な肌を維持するのに役立つ。

【0018】

用いた方法では、まず、ＮＨＫ複合体Ｉ及びＩＩによるＸＴＴ（２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド）から可溶性ホルマザンへの変換率を測定し、続いて、組み換えヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）のミトコンドリアから抽出したシトクロムＣオキシダーゼの酵素活性を実測する必要がある。

【0019】

同様に、本発明者らは、これらのバンダテロシドがＮＨＫ分化発現タンパク質（トランスグルタミナーゼ、インボルクリン、デスモグレインＩ）の産生に及ぼす作用を免疫標識によって評価した。この分化プロセスは、角化膜の細胞再生に関与する。

【0020】

本発明の第一の主題は、式（Ｉ）：

【0021】

【化1】

【0022】

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、同時に水素原子となることはなく；Ｒ_１及びＲ_３は、それぞれ独立に、水素原子であるか、又は、芳香族基、好ましくはフェニル基を有する好ましくは炭素数１〜１２の飽和若しくは不飽和炭化水素系鎖であり、上記芳香族基は、好ましくは、糖、好ましくは単糖若しくは二糖を含む基で置換されているものであり、上記鎖は、ヘテロ原子、好ましくはＯ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子を１つ以上有していてもよいものであり；Ｒ_２は、水素原子又は糖、好ましくは単糖若しくは二糖であり、上記糖は、特に、芳香族基、好ましくはフェニル基を有する好ましくは炭素数１〜１２の飽和又は不飽和炭化水素系鎖を有する残基によって、好ましくはヒドロキシ基１つのエステル化により置換されていてもよいものであり、上記炭化水素系鎖は、ヘテロ原子、好ましくはＯ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子を１つ以上有していてもよいものである）で表される化合物に関する。

【0023】

上記糖は、グルコース、マンノース、フルクトース、キシロース若しくはアラビノース等の単糖類、スクロース若しくはマルトース等の二糖類、又は、それらの誘導体であることが好ましい。

【0024】

なかでも、本発明の化合物は、式（Ｉ）の化合物のうち、Ｒ_１及び／又はＲ_３は、ＯＲ_４基によって好ましくはパラ位が置換されたベンジル基であり、Ｒ_４は、以下：
（ｉ）水素原子、あるいは、
ヘテロ原子、好ましくはＯ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子を１つ以上有していてもよい、直鎖若しくは分枝及び／又は環状の芳香族又は非芳香族の好ましくは炭素数１〜１２の飽和又は不飽和炭化水素系鎖を有するアルキル基であって、上記炭化水素系鎖自体は、好ましくは糖、好ましくは単糖若しくは二糖を含む基によって、置換されていてもいなくてもよい、アルキル基；並びに、
（ｉｉ）糖、好ましくは単糖又は二糖の残基であって、上記糖は、特に、ヘテロ原子、好ましくはＯ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子を１つ以上有していてもよい、直鎖若しくは分枝及び／又は環状の置換又は非置換の芳香族又は非芳香族の好ましくは炭素数１〜１２の飽和又は不飽和炭化水素系鎖を有する残基によって、置換されていてもよい、糖の残基
から選択される基であるものであることが好ましい。

【0025】

Ｒ_１及びＲ_３は、同一又は異なって、水素原子であるか、又は、ベンジル基、好ましくはグルコピラノシロキシ基で置換されたベンジル基、例えば４−β−Ｄ−グルコピラノシロキシベンジル基であり；Ｒ_２は、グルコピラノシル基、例えばβ−Ｄ−グルコピラノシル基、好ましくは、特にヒドロキシル官能基のエステル化によって、芳香族基、好ましくはフェニル基を有する好ましくは炭素数１〜１２の飽和又は不飽和炭化水素系鎖で置換されているグルコピラノシル基、特にβ−Ｄ−グルコピラノシル−３−ｔｒａｎｓ−シンナモイルエステル基であり；Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、同時に水素原子となることはないことが好ましい。

【0026】

特に好ましい化合物において、Ｒ_１及び／又はＲ_３は、同一又は異なって、ＯＲ_４基で置換されたベンジル基であり、Ｒ_４は、置換されていてもよいグルコピラノシル基である。

【0027】

これらの化合物のなかでも、特に、Ｒ_１及びＲ_３は、同一であって、４’−（グルコピラノシロキシ）ベンジル基である式（Ｉ）の化合物が好ましい。

【0028】

式（Ｉ）中のリンゴ酸エステル部位の２位の不斉炭素原子について、エナンチオマーの配座が（Ｒ）で表されることが有利である。

【0029】

本発明を実施するのに特に好ましい化合物は、下記式で表されるものである。

【0030】

【化2】

特に４−（４−β−Ｄ−グルコピラノシロキシベンジル）−（２Ｒ）−２−（ｐ−ヒドロキシベンジル）マレート、

【0031】

【化3】

特に１，４−ビス（４−β−Ｄ−グルコピラノシロキシベンジル）−（２Ｒ）−２−（ｐ−ヒドロキシベンジル）マレート、

【0032】

【化4】

特に１，４−ビス（４−β−Ｄ−グルコピラノシロキシベンジル）−（２Ｒ）−２−（２−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−ｔｒａｎｓ−シンナモイルエステル）−２−（ｐ−ヒドロキシベンジル）マレート。

【0033】

本発明の第二の主題は、上に記載の式（Ｉ）の化合物のうち１つ以上が特異的に濃縮されていることを特徴とする植物抽出物に関する。

【0034】

上記抽出物は、ラン、特にＰａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ属、Ｖａｎｄａ属又はＥｎｃｙｃｌｉａ属のランの少なくとも一部から得られることが有利である。

【0035】

好ましい抽出物は、特に、ラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓ、特にその茎、根又は花から得られ、且つ、式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つ、好ましくはＶＴ１及び／又はＶＴ２及び／又はＶＴ３を含むことを特徴とする。

【0036】

「特異的に濃縮」又は「濃縮」とは、抽出物中の式（Ｉ）の化合物、好ましくはＶＴ１及び／又はＶＴ２及び／又はＶＴ３化合物の含有量を意図的に増加させるための工程によって得られた抽出物を意味するものである。

【0037】

上記濃縮抽出物は、糖の除去工程、又は、分画、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより得られることが特に有利である。

【0038】

典型的な抽出物としては、乾燥抽出物中の式（Ｉ）の化合物、好ましくはＶＴ１及び／又はＶＴ２及び／又はＶＴ３化合物の濃度が、上記化合物の濃度を特異的に増加させるための工程を行わなくても、抽出後に得られる乾燥抽出物のものよりも高いものが挙げられる。

【0039】

上記濃縮抽出物中、乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％の式（Ｉ）の化合物、好ましくはＶＴ１及び／又はＶＴ２及び／又はＶＴ３化合物を含むことが好ましい。

【0040】

ラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓから製造されるのが有利である本発明の具体的な抽出物は、ＶＴ１及び／又はＶＴ２から選択される化合物を１つ以上含み、その合計含有量は、乾燥抽出物の重量に対して４０重量％超、好ましくは６０重量％超、更に好ましくは８０重量％超であることを特徴とする。

【0041】

同様にラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓから製造されるのが有利である本発明の別の抽出物は、ＶＴ３化合物を含み、その含有量は、乾燥抽出物の重量に対して８重量％超、好ましくは１５重量％超、好ましくは２５重量％超、より好ましくは４０重量％超であることを特徴とする。

【0042】

本発明の抽出物は、乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも８０重量％、好ましくは少なくとも９０重量％のＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物で構成されることを特徴とするのが有利である。

【0043】

好ましい濃縮抽出物は、特に、ラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの茎又は根から製造される。

【0044】

本発明の第三の主題は、化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分として、式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つ及び／又は該化合物を含む植物抽出物の少なくとも１つを含む化粧品組成物又は皮膚科学的組成物に関し、該組成物は、上述した変形例及び実施形態のいずれか一つに準ずるものであるのが有利である。

【0045】

少なくとも１つの上記化合物又は抽出物に加えて、上記化粧品組成物は、上記化合物と同様且つ／又は相補的な化粧効果を有する他の化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分の１つ以上を精製分子及び／又は植物抽出物の形態で含んでいてもよい。

【0046】

従って、上記組成物は、特に、植物全体若しくは植物の一部から得られた他の植物抽出物、又は、該植物の抽出物から調製された溶液を１つ以上含んでいてもよい。この抽出物は、当業者が従来用いてきた方法、特に、水、炭素数１〜４のアルコール及びグリコールから選択されるのが有利である極性溶媒又は極性溶媒の混合物を用いて抽出することで得られるのが有利である。

【0047】

上記他の化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分は、老化防止効果を有する物質；肌の脱色効果又は肌を明るくする効果を有する物質；痩身効果を有する物質；保湿効果を有する物質；鎮痛、鎮静又は緩和効果を有する物質；皮膚の微小循環系を刺激して、肌の色つや、特に顔色を改善する物質；油性肌のケアのための皮脂制御効果を有する物質；肌を洗浄又は浄化するための物質；及び、フリーラジカル捕捉効果を有する物質等から選択できる。

【0048】

上記組成物は、Ｂｒａｓｓｏｃａｔｔｌｅｙａ属のラン、例えばラン：Ｂｒａｓｓｏｃａｔｔｌｅｙａ ｍａｒｃｅｌｌａの抽出物、Ｅｎｃｙｃｌｉａ属のラン、例えばラン：Ｅｎｃｙｃｌｉａ ｍｉｃｈｕａｃａｎａの抽出物、Ｃａｔｔｌｅｙａ属のラン、Ｖａｎｄａ属のラン、例えばＶａｎｄａ ｃｏｅｒｕｌｅａ若しくはＶａｎｄａ ｄｅｎｉｓｏｎｉａｎａのラン抽出物、又は、Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ属のラン等のラン抽出物を少なくとも１つ含むことが有利である。

【0049】

上記組成物はまた、特に、顔料、着色剤、ポリマー、界面活性剤、レオロジー剤、香料、電解質、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、保存料及びこれらの混合物から選択される、化粧品として又は皮膚科学的に許容される賦形剤の少なくとも１つを含むことが有利である。

【0050】

上記化粧品組成物又は皮膚化学的組成物は、セラム、ローション、クリーム若しくはヒドロゲル、特にパックの形態、又は、スティック若しくはパッチの形態であることが有利である。

【0051】

本発明の第４の主題は、有利には上述した変形例及び実施形態のいずれか一つに係る、式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つ又は該化合物を含む植物抽出物の少なくとも１つの、化粧品組成物又は皮膚科学的組成物における化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分としての使用に関する。

【0052】

上記化合物又は抽出物は、皮膚の老化を防ぐこと、特に、皮膚の老化の影響を減少若しくは遅延させたり、表皮を再構築したり、肌を引き締めたり、並びに／又は、皺の減少若しくは除去及び表皮の保護性を促進したりすること、並びに／又は、皮膚の保湿性を維持若しくは改善すること、並びに／又は、皮膚治癒を促進することを目的とした有効成分であることが有利である。

【0053】

本発明はまた、有利には上述した変形例及び実施形態のいずれか一つに係る、式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つ又は該化合物を含む植物抽出物の少なくとも１つの、化粧品組成物又は皮膚科学的組成物における有効成分としての使用であって、上記有効成分は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ及び／若しくはシトクロムＣオキシダーゼの発現及び／若しくは活性、並びに／又は、ミトコンドリア呼吸鎖、並びに／又は、細胞のエネルギー代謝、並びに／又は、上皮細胞の分化及び再生を刺激するものである使用に関する。

【0054】

上記有効成分は、表皮、特に上皮細胞、更にとりわけケラチノサイトに作用できることが有利である。

【0055】

本発明はまた、有利には上述した変形例及び実施形態のいずれか一つに係る上記化合物を含むラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓ、特にその茎又は根の抽出物の少なくとも１つの、化粧品組成物又は皮膚科学的組成物における有効成分としての使用であって、上記有効成分は、皮膚の老化を防ぐこと、特に、皮膚の老化の影響を減少若しくは遅延させたり、表皮を再構築したり、肌を引き締めたり、並びに／又は、皺の減少若しくは除去及び表皮の保護性を促進したりすること、並びに／又は、皮膚の保湿性を維持若しくは改善すること、並びに／又は、皮膚治癒を促進することを目的としたものであり、上記有効成分は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ及び／若しくはシトクロムＣオキシダーゼの発現及び／若しくは活性、並びに／又は、ミトコンドリア呼吸鎖、並びに／又は、細胞のエネルギー代謝、並びに／又は、上皮細胞の分化及び再生を刺激するものである使用に関する。

【0056】

本発明の化合物は、ケラチノサイト分化タンパク質の発現を刺激する有効成分であることが有利である。

【0057】

上記本発明の各主題について、化粧品組成物又は皮膚科学的組成物中に化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分として含まれる式（Ｉ）の化合物又は該化合物を含む抽出物の濃度は、上記組成物の重量に対して０．０００１〜１重量％、特に０．００１〜０．１重量％、更に好ましくは０．０１〜０．１重量％である。

【0058】

本発明の組成物によれば、皮膚の老化を防ぐ、特に、皮膚の老化の影響を減少若しくは遅延させたり、表皮を再構築したり、肌を引き締めたり、並びに／又は、皺の減少若しくは除去及び表皮の保護性を促進したりする、並びに／又は、皮膚の保湿性を維持若しくは改善する、並びに／又は、皮膚治癒を促進するという特に望まれる効果を得られる。

【0059】

また、本発明の一つの主題は、皮膚の老化を防ぐこと、特に、皮膚の老化の影響を減少若しくは遅延させたり、表皮を再構築したり、肌を引き締めたり、皺の減少若しくは除去及び表皮の保護性を促進したりすること、並びに／又は、皮膚の保湿性を維持若しくは改善すること、並びに／又は、皮膚治癒を促進することに有効な量で上述の化粧品組成物又は皮膚科学的組成物を関係する肌の部位に適用することを含む化粧処置方法又は皮膚科学的処置方法である。

【0060】

上記方法は、顔、首又は体、特に手において老化の兆候、例えば皺や小皺が見られる肌の部位に上記組成物を適用することを含むのが有利である。

【0061】

本発明はまた、本発明に係る式（Ｉ）の化合物又は本発明に係る濃縮抽出物の製造方法であって、上記化合物を含有する植物、有利にはラン、特にラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの少なくとも一部を抽出する工程と、式（Ｉ）の化合物の１つ以上、好ましくはＶＴ１及び／又はＶＴ２及び／又はＶＴ３化合物について、上記抽出工程で得られた抽出物を濃縮する工程を少なくとも１回行う方法に関する。

【0062】

本方法において、上記抽出工程の前に植物全体又は植物の少なくとも一部、好ましくは茎、葉又は根をすり潰す工程を行った後、その植物又は植物の一部を抽出する工程を行うことが好ましい。

【0063】

上記植物又は植物の一部は、すり潰す前に乾燥又は凍結されていることが有利である。

【0064】

上記抽出は、極性溶媒を少なくとも１つ用いて行われることが好ましい。極性溶媒としては、単一の溶媒を用いても、溶媒混合物を用いてもよい。用いる極性溶媒としては、水；アルコール、好ましくは炭素数１〜４のアルコール、特にメタノール、エタノール若しくはプロパノール；ポリオール、特にグリコール、例えばグリセリン、プロピレングリコール若しくはブチレングリコールが好ましい。

【0065】

溶媒混合物としては、水／アルコール混合物、好ましくはエタノール／水混合物、更にとりわけ体積比が約９０／１０（ｖ／ｖ）であるエタノール／水混合物を用いるのが好ましい。

【0066】

上記抽出は、好ましくは還流下の極性溶媒中で、好ましくはソックスレー装置を用いて行うことができる。複数の溶媒を用いて溶媒の極性を漸増させることで、例えば、アルカン系溶媒（ペンタン、ヘキサン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ヘプタン等）、ハロゲン化アルカン系溶媒（ジクロロメタン等）、次いでアルコール系溶媒（エタノール又はメタノール等）へと連続的に変化させていくことで、ソックスレー抽出を最適に行うことができる。

【0067】

続いて、抽出物を濃縮して溶媒又は溶媒混合物を取り除くことができる。これにより、乾燥化合物を得ることができ、この乾燥化合物は、最終的に本発明の組成物中で使用するために、化粧品として又は皮膚化学的に許容される賦形剤に溶解又は分散させることができる。

【0068】

本発明の方法では、上述の式（Ｉ）の化合物の１つ以上について、上記抽出工程で得られた抽出物を濃縮する工程を行うことが有利である。本方法では、特に、糖の除去、又は、分画、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより濃縮する工程を行う。

【0069】

また、上記抽出物は、特に、極性溶媒の存在下に置いた後に活性炭素の存在下で、部分的又は完全に脱色してもよい。

【0070】

抽出した画分は、当業者に公知の方法、例えばクロマトグラフィー、特にゲルカラムクロマトグラフィー及び／又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製できる。

【0071】

本発明のその他の目的、特徴及び利点は、抽出物の製造例、抽出物の特性を確かめる試験例、及び、該抽出物を用いた化粧品組成物例を参照した以下の例示的記載から明らかであろうが、これらは単なる例示であるため、本発明の範囲を全く限定しない。

【0072】

実施例において、特に記載のない限り、％は全て「重量％」であり、温度は全て「℃」であり、圧力は「大気圧」である。

【図面の簡単な説明】

【0073】

【図1】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物並びにオイコム酸の半構造式を示す。

【図2】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物のマススペクトルを示す。

【図3】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図4】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（ＤＥＰＴ１３５）を示す。

【図5】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物を含む実施例１．２の抽出物（５ｍｇ／ｍＬ ＭｅＯＨに溶解）をＨＰＬＣ及びＵＶ検出して得られたプロファイルを示す。

【図6】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性化作用を示す。処理時間：４８時間、ネガティブコントロール：ＤＭＳＯ（０．１ｖ／ｖ％）、平均値±ＳＤ（標準偏差）：実験を３回行って算出した。

【図7】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物のシトクロムＣオキシダーゼ発現活性を示す。ＨａＣａＴ細胞の処理：３時間、ネガティブコントロール：未処理細胞（ＤＭＳＯ（０．１ｖ／ｖ％））、ポジティブコントロール：レスベラトロール（１１．４１μｇ／ｍｌ）、平均値±ＳＤ（標準偏差）：独立した実験を３回行って得た。

【図8】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物のミトコンドリア生合成活性を示す。ＨａＣａＴ細胞の処理：４８時間、ネガティブコントロール：未処理細胞（ＤＭＳＯ（０．１ｖ／ｖ％））、ポジティブコントロール：レスベラトロール（１１．４１μｇ／ｍｌ）、平均値±ＳＤ（標準偏差）：独立した実験を３回行って得た。

【図9】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物を用いた処理のトランスグルタミナーゼ発現作用を示す。

【図10】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２又はＶＴ３化合物の存在下におけるトランスグルタミナーゼ発現を示す電子顕微鏡写真である。

【図11】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２又はＶＴ３化合物を用いた処理のインボルクリン発現作用を示す。

【図12】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２又はＶＴ３化合物を用いた処理のデスモグレイン１発現作用を示す。

【図13】本発明に係るＶＴ１、ＶＴ２又はＶＴ３化合物の存在下におけるデスモグレイン１発現を示す電子顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0074】

（実施例１：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓ抽出物）
ラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの各部分を分析して、該植物の各部分におけるバンダテロシドの有無を検出し、その含有量を測定する。

【0075】

ラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓ（中国、Ｔｉａｎ Ｚｉ原産）の茎（実施例１．１及び１．２）、根（実施例１．３）又は葉（実施例１．４）からなる乾燥植物原料（ＰＭ）１００ｇを抽出工程の前にすり潰す。

【0076】

（実施例１．１：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの茎の水／アルコール抽出物）
乾燥ＰＭの水／アルコール全抽出物（エタノール（ＥｔＯＨ）／水＝９０／１０（ｖ／ｖ）、ＰＭ／溶媒比＝１／１５）を還流下（３０分、８０℃）で調製する。このようにして得た全抽出物の重量収率（抽出物重量／乾燥ＰＭ重量）は１２．８％である。

【0077】

（実施例１．２：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの茎のメタノール抽出物）
実施例１．１よりも特異的なソックスレー抽出（Ｓｏｘｔｅｃ Ａｖａｎｔｉ ２０５５装置）を用いれば、三種類の溶媒、すなわちシクロヘキサン（４５分、１８０℃）、ジクロロメタン（１回目：４５分、１８０℃、２回目：続いて３０分、１８０℃）及びメタノール（ＭｅＯＨ）（４５分、１８０℃で２回）を極性を漸増させるように連続的に使用して乾燥ＰＭを使い果たすことができる。

【0078】

このようにして得たバンダテロシドを濃縮したメタノール抽出物の重量収率（抽出物重量／乾燥ＰＭ重量）は６．９％である。

【0079】

（実施例１．３：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの根の水／アルコール抽出物）
水／アルコール全抽出物を以下の条件：ＥｔＯＨ／水＝９０／１０、ＰＭ／溶媒比＝１／１５で調製する。抽出物は還流下（３０分、８０℃）で調製する。根抽出物について得られた重量収率は１４．８％である。

【0080】

（実施例１．４：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの葉の水／アルコール抽出物）
水／アルコール全抽出物を以下の条件：ＥｔＯＨ／水＝９０／１０、すり潰した乾燥ＰＭ／溶媒比＝１／１５で調製する。抽出物は還流下（３０分、８０℃）で調製する。葉抽出物について得られた重量収率は１５．０％である。

【0081】

これらの抽出物（実施例１．１〜１．４）を実施例２に記載した条件で分析（分画、単離）して、単離及び構造解析後に式（Ｉ）の化合物３種、すなわちＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３の存在を確認する。各抽出物及び画分の濃度を実施例２．１の方法に従ってＲＰ−ＨＰＬＣで外部校正により測定する。すなわち、単離化合物ＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３それぞれの段階希釈液を調製して検量線を決定する。

【0082】

結果を以下の表１に示す（図５も参照）。

【0083】

【表1】

【0084】

（結論）
これらの分析から、以下のことが分かった。
・バンダテロシドＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３は、Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓ植物の全部位（茎、葉及び根）に存在する。
・Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓの根の抽出物にはＶＴ２が集中し、その含有量は茎又は葉の水−アルコール抽出物中の１．８倍になっている。

【0085】

（実施例２：バンダテロシドが特異的に濃縮された抽出物）
単離及び構造解析後、上記実施例１に従って得られた抽出物を選択し、サイズ分画工程を行って、式（Ｉ）の各化合物、すなわちＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３について、これらの抽出物を特異的に濃縮する。

【0086】

（実施例２．１：ゲルカラムクロマトグラフィーによる分画）
実施例１．２で得られたメタノール抽出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０ゲル（ＬＨ２０−１００、Ｓｉｇｍａ）（２８×１８０ｍｍ）のカラムで極性溶媒の勾配（水１００％→メタノール１００％に変化、流量：１ｍｌ／分）を用いて分画する。

【0087】

このメタノール抽出物１ｇを水／メタノール混合物（ｖ／ｖ＝５０／５０）で希釈し、Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル３０ｇに載せる。サイズ及び溶出溶媒への溶解度に従って極性分子を分離する。

【0088】

１０ｍｌの画分が２０個が得られ、これらを薄層クロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／酢酸／ギ酸／水（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ＝１００／１１／１１／２６）、担体：６０Ｆ_２５４シリカゲル（０．２５ｍｍ、ＭＥＲＣＫ）、発色剤：Ｖａｎｉｌｌｉｎ（Ｍｅｒｃｋ）−Ｈ_２ＳＯ_４（９７％、Ｆｌｕｋａ）５％）にかけ、得られたプロファイルが類似するものをあわせて、最終的に１０画分とする。

【0089】

逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析は、最初の１０画分のうち、全抽出物中に含まれる式（Ｉ）の化合物が集中する画分を同定することを目的とする。

【0090】

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、ポンプ（Ｐｒｏｓｔａｒ ２３０）及びダイオードアレイ検出器（Ｐｒｏｓｔａｒ ３３０）を備えたＮｕｃｌｅｏｄｕｒ Ｃ_１８ｅｃカラム（５μｍ、２５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ）を有するクロマトグラフ（Ｖａｒｉａｎ）を用いて行う。ＭｅＯＨ／（水＋０．１％ギ酸（ＨＣＯ_２Ｈ））混合液を溶出溶媒として使用し、流量１ｍｌ／分で、２０％ＭｅＯＨで開始して４７％まで１３．５分かけて上昇させた後、４７％ＭｅＯＨで１０分間保持し、最終的に４７％ＭｅＯＨから１００％まで１０分かけて上昇させる直線勾配とする。画分は、波長２００〜４００ｎｍで可視化する。

【0091】

１７８ｍｇの画分Ａ及び３９．５ｍｇの画分Ｂを回収する。

【0092】

（実施例２．２：式（Ｉ）の化合物の単離）
実施例２．１で選択した２つの画分Ａ及びＢを用いて本発明の化合物を精製し、実施例２．１の各画分中の該化合物の定量を行う。

【0093】

グラジエントポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ ３２２）、ＵＶ検出器（Ｇｉｌｓｏｎ ＵＶ−ＶＩＳ １５１）及びＮｕｃｌｅｏｄｕｒ Ｃ１８ｅｃカラム（５μｍ、２５０ｍｍ×内径２１ｍｍ）を備えたＧｉｌｓｏｎクロマトグラフを用いたセミ分取ＨＰＬＣによって、選択した２つの画分それぞれから式（Ｉ）の化合物（ＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３）を単離する。各画分をＭｅＯＨ中、３０ｍｇ／ｍｌで調製した後、ろ過する（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＲＣ１５フィルタ、０．４５μｍ）。溶出条件は、ＭｅＯＨ／（水＋０．１％ＨＣＯ_２Ｈ）混合液で以下の条件とする：１３．５分かけて２０→４７％ＭｅＯＨ、４７％ＭｅＯＨで１０分間、更に５分かけて２０％に戻す；流量１４ｍｌ／分。２０５ｎｍで検出する。

【0094】

セミ分取ＨＰＬＣで画分Ａを精製した後、ＶＴ１化合物６４ｍｇ及びＶＴ２化合物１１２ｍｇを回収する。

【0095】

同様の方法で画分Ｂを精製した後、ＶＴ３化合物２０ｍｇを回収する。

【0096】

各画分Ａ及びＢ中並びに画分（Ａ＋Ｂ）中のＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物の各含有量並びに合計含有量（ＶＴ１＋ＶＴ２＋ＶＴ３）を表２に示す。

【0097】

【表2】

【0098】

（結論）
画分Ａ及びＢはそれぞれ、５０重量％を超える式（Ｉ）の化合物で構成されているため、本発明の主題である式（Ｉ）の化合物が特異的に濃縮された抽出物であると言える。

【0099】

また、これら２つの画分を組み合わせて単一の画分（Ａ＋Ｂ）にすることもでき、これも本発明の特異的に濃縮された抽出物の一例である。このように組み合わせることで、同定された３つの化合物（ＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３）をそれぞれ含み、その全含有量が乾燥抽出物中９０重量％である抽出物が得られる。

【0100】

従って、これらの抽出物はそれぞれ化粧品組成物又は皮膚科学的組成物において化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分として使用できる。

【0101】

（実施例３：式（Ｉ）の化合物の構造解析）
ラン：Ｐａｐｉｌｉｏｎａｎｔｈｅ ｔｅｒｅｓ（実施例１．２）のＰＭから抽出した後、サイズ分画及びＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した式（Ｉ）の化合物の構造を解析するには、一連のスペクトル技術が必要である。

【0102】

（機材）
（質量分析（ＭＳ））
ＥＳＩ源を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ ＱＴＯＦ質量分析計に接続され、且つ、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ_１８カラム（２５ｃｍ×内径２．１ｍｍ×５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＲＲＬＣで高速液体クロマトグラフィーを行い、バンダテロシドを分析する。

【0103】

溶出条件は、アセトニトリル（ＡＣＮ）／（水＋０．０１％ＨＣＯ_２Ｈ）混合液を用いて以下の条件とする：２％から５０％ＡＣＮまで３０分かけ、次いで９５％ＡＣＮまで５分かけて変化させ、９５％ＡＣＮで５分間保持し、２％ＡＣＮまで５分かけて戻す；流量０．６ｍｌ／分。

【0104】

更に、ＥＳＩポジティブ源を備えたＢｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦ−Ｑ分光計を用いてＥＳＩ ＭＳ高分解能質量スペクトルを得た。校正は、ギ酸リチウムの１０^−４Ｍイソプロパノール／水（ｖ／ｖ＝５０／５０）混合溶液を用いて行った。

【0105】

（核磁気共鳴（ＮＭＲ））
Ｂｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ分光計でＮＭＲ分析を行った。単離した分子の構造を完全に解析するには、１Ｄ（^１Ｈ及び^１３Ｃ）及び２Ｄ（Ｃｏｓｙ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ）スペクトルを求める必要がある。スペクトルは、ＮＭＲ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析する。

【0106】

最低限の精製した分子１０ｍｇを重水素化ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ Ｄ_６、Ｃ_２Ｄ_６ＯＳ；９９．９％Ｄ、Ｓｉｇｍａ）６００μｌで希釈する。得られた最低濃度は１６ｍｇ／ｍｌ程度である。

【0107】

（紫外線（ＵＶ）分光法）
バンダテロシドのＵＶスペクトル特性は、Ｓｈｉｍａｚｕ ＵＶ−２４０１ＰＣ装置を用いて求める。ＶＴ１分子を５×１０^−５Ｍで、ＶＴ２及びＶＴ３分子を２．５×１０^−５ＭでＭｅＯＨに溶解させる。ランベルト・ベールの法則に従って、モル吸光係数ξ（ｍｏｌ^−１・Ｌ・ｃｍ^−１）を求める。
Ａ＝ξ×ｃ×ｌ
Ａ＝波長λにおける分子の吸光度
Ｃ＝分子の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
ｌ＝光路長（ｃｍ）

【0108】

（偏光分析）
バンダテロシドの不斉炭素による偏光の比旋光度［α］は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３４１偏光計を用いて測定する。分子を１ｍｇ／ｍｌＭｅＯＨ溶液として保持し、偏光計の測定セル内に入れて、５８９ｎｍ、２０℃における偏光の旋光度を測定する。よって、ビオの法則に従って、各分子の［α］^２０°を求める。
α＝［α］^Ｔ°×ｌ×ｃ
ａ＝観測された旋光度（度）
ｌ＝キュベットの長さ（ｄｍ）
ｃ＝溶液の濃度（ｇ／ｍｌ）
［α］^Ｔ°＝温度Ｔ、所定の波長で得られた比旋光度（ｇ^−１・ｍＬ・ｄｍ^−１で表す）

【0109】

（構造解析結果）
ＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物それぞれについて得られたＮＭＲスペクトルデータを下記表３に示す。

【0110】

【表3】

【0111】

各化合物について各種分析方法を用いて得られた結果を以下で詳述する。

【0112】

・ＶＴ１
外観：黄色樹脂
溶解性：ＭｅＯＨ及びＤＭＳＯに可溶、水に難溶
ＮＭＲ：^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲデータ（ＤＭＳＯ Ｄ_６、４００ＭＨｚ及び１００ＭＨｚ）→図３〜４及び表３
ＭＳ：ｍ／ｚ＝５２６．１９２３６のＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳイオン［（Ｍ＋ＮＨ_４）］^＋（Ｃ_２４Ｈ_２８Ｏ_１２として計算された分子式：５０８．１５８０８、Δ：−０．８９ｐｐｍ）→図２及び表４

【0113】

【表4】

【0114】

ＵＶ：２０３（ｌｏｇξ４．２）、２２５（ｌｏｇξ４．０）及び２７８（ｌｏｇξ３．２）ｎｍで吸収極大→図５
［α］_ＭｅＯＨ^２０°＝−５０°ｇ^−１・ｍＬ・ｄｍ^−１

【0115】

酸加水分解：
分子を酸加水分解（２．０Ｍ ＨＣｌの存在下、８０℃で３時間）後、水で飽和させたｎ−ブタノールで水相を３回洗浄し、その後、蒸発乾固する。ピリジンと１−（トリメチルシリル）イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）の混合物（ｖ／ｖ＝１／４）を乾燥残留物に加え、６０℃で１時間加熱して誘導体化する。次に、反応混合物１〜２μｌを５００μｌの分析用ＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈した後、ＴＲ−５ＭＳ ＳＱＣキャピラリーカラム（１５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を備え、且つ、質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＤＳＱＩＩ）に接続されたガスクロマトグラフ（Ｔｒａｃｅ ＧＳ Ｕｌｔｒａ型）で分析する。検出は、７０ｅＶの電子衝撃で行う。用いた条件は以下の通りである：４０℃で１分、続いて１０℃／分の勾配で２５０℃まで上昇させ、２５０℃の静止期に保持（ヘリウム流量：１ｍｌ／分、注入温度：２５０℃、トランスファーライン温度：２８５℃）。検出は分析２分後に行い、質量測定間隔は０〜５００にわたる。

【0116】

酸加水分解の最後に放出される糖は、同様の誘導体化プロセスを行ったＤ−グルコースコントロール（Ｍｅｒｃｋ）（Ｔｒ＝１５．６０分）の保持時間及び質量スペクトルと比較して同定する。３種類のバンダテロシドを解析したところ、加水分解後に同定された糖はＤ−グルコースである。

【0117】

・ＶＴ２
外観：非晶質白色粉末
溶解性：水中では約１０ｍＭでゲルを形成。ＶＴ２はＭｅＯＨ及びＤＭＳＯに可溶、水に難溶。
ＮＭＲ：^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲデータ（ＤＭＳＯ Ｄ_６、４００ＭＨｚ及び１００ＭＨｚ）→図３〜４及び表３
ＭＳ：ｍ／ｚ＝７９４．２８８６７のＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳイオン［（Ｍ＋ＮＨ_４）］^＋（Ｃ_３７Ｈ_４４Ｏ_１８として計算された分子式：７７６．２５２７６、Δ：−０．０１ｐｐｍ）→図２及び表５

【0118】

【表5】

【0119】

ＵＶ：２０３（ｌｏｇξ４．５）、２２５（ｌｏｇξ４．５）及び２７８（ｌｏｇξ３．５）ｎｍで吸収極大→図５
［α］_ＭｅＯＨ^２０°＝−５６°ｇ^−１・ｍＬ・ｄｍ^−１
酸加水分解：ＶＴ１を参照

【0120】

・ＶＴ３
外観：黄色樹脂
溶解性：化合物はＭｅＯＨ及びＤＭＳＯに可溶、水に難溶
ＮＭＲ：^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲデータ（ＤＭＳＯ Ｄ_６、４００ＭＨｚ及び１００ＭＨｚ）→図３〜４及び表３
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１０８６．３８４８４のＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳイオン［（Ｍ＋ＮＨ_４）］^＋（Ｃ_５２Ｈ_６０Ｏ_２４として計算された分子式：１０６８．３４７４５、Δ：−１．８９ｐｐｍ）→図２及び表６

【0121】

【表6】

【0122】

ＵＶ：２２３（ｌｏｇξ４．５）及び２７６（ｌｏｇξ３．５）ｎｍで吸収極大→図５
［α］_ＭｅＯＨ^２０°＝−３７°ｇ^−１・ｍＬ・ｄｍ^−１
酸加水分解：ＶＴ１を参照

【0123】

（実施例４：本発明に係る化合物の生物活性）
（処理）
あらかじめ単離しておいた３つの化合物ＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３それぞれのストック溶液をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を用いて調製する。

【0124】

次に、ストック溶液を培地で直接希釈して細胞（正常なヒトケラチノサイトＮＨＫ又はＨａＣａＴ細胞系）を処理する。

【0125】

（ケラチノサイトに対するミトコンドリアデヒドロゲナーゼの刺激）
３７歳コーカソイド女性のまぶたから単離した正常なヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加ケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３継代培養する。

【0126】

ＮＨＫを１×１０^４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ）に播き、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養する。次いで、これらの細胞にＵＶ_Ｂを照射（６０ｍＪ／ｃｍ^２、Ｖｉｌｂｅｒｔ−Ｌｏｕｒｍａｔ社製照射装置）した後又は照射することなく、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）で希釈したＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３化合物の段階希釈液（６．２５〜０．７８μｇ／ｍｌ）を用いて最終濃度０．１ｖ／ｖ％で処理する。このプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で培養する。ＤＭＳＯを０．１ｖ／ｖ％含む未処理細胞をネガティブコントロールとする。４８時間処理後、上清を除去して各ウェルにＸＴＴ溶液（細胞増殖キットＩＩ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を載せ、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼの全活性を測定する。この活性は、ミトコンドリア呼吸鎖の構成要素である糖分解ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（複合体Ｉ）及びコハク酸デヒドロゲナーゼ（複合体ＩＩ）の酵素活性が必要となる細胞機構を介して、ＸＴＴテトラゾリウム塩を可溶性ホルマザンに変換することにより評価する。着色ホルマザン量（４５０ｎｍでの光学密度を読み取って測定）は、第一に、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼの酵素活性と直接関連づけられ、第二に、代謝活性細胞量と関連づけられる（Ｒｏｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１；１４２：２５７−２６５）。３時間培養後、ＸＴＴを上記デヒドロゲナーゼで可溶性ホルマザンに還元する。９６ウェルプレートを蛍光分光計（ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ、Ｔｅｃａｎ）を用いて４５０ｎｍで読み取る。ＢＣＡ法（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙ（Ｕｐｔｉｍａ Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ ｋｉｔ））により、各ウェル中の総タンパク量を分析する。

【0127】

結果を４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）の平均として表し、総細胞タンパク濃度（μｇ／ｍｌ）に対して標準化する。これにより、上記デヒドロゲナーゼの活性のみを測定し、得られたＯＤの測定値に対する細胞増殖の影響をなくすことができる。

【0128】

各分子濃度（Ｒｍ）について得られた平均結果を、ネガティブコントロール（Ｒｃ）について得られた結果と比較する。Ｒｍ／Ｒｃ＞１であれば、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性の刺激がみられたことを示す。

【0129】

（組み換えヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）に対するシトクロムＣオキシダーゼの刺激）
本試験は、ミトコンドリア呼吸鎖の性能レベルに対する本発明の主題に係る化合物の刺激能を評価することを目的とする。分析は、遺伝子組み換えヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）で行う。

【0130】

６ウェルプレートを用いて、ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の非存在下、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びペニシリン／ストレプトマイシン混合物を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によりＨａＣａＴ細胞をコンフルエンスまで培養した。続いて、グルコース４．５ｇ／Ｌ及び０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＡＭ２６１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、ＤＭＳＯで段階希釈したバンダテロシド（６．２５〜０．７８μｇ／ｍｌ）（最終濃度０．１ｖ／ｖ％）で処理した。レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ）５０μＭ、すなわち１１．４１μｇ／ｍｌをポジティブ対照として用いた。０．１ｖ／ｖ％のＤＭＳＯを含む未処理細胞をネガティブコントロールとした。３時間処理後、細胞を溶解させ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂ６９１６、Ｓｉｇｍａ）で総細胞タンパク量を分析した。続いて、各サンプルの総タンパク濃度を２ｍｇ／ｍｌに調整した。

【0131】

細胞溶解物をアッセイバッファー（Ｓｉｇｍａ）の存在下で培養し、基質を加えないで酵素反応速度を測定し、これをＶｏと表した。また、シトクロムＣ（ウマ心臓由来、Ｃ−７７５２、Ｓｉｇｍａ）をＤＴＴ（ジチオスレイトール、Ｓｉｇｍａ）で還元し、５０μＭで上記アッセイバッファーに加え、酵素反応速度を測定した。分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６４０）を用いて、メーカー（Ｓｉｇｍａ）の指示書に従い、５５０ｎｍで９０秒間、還元型シトクロムＣの消失をモニタリングした。酵素反応速度曲線から算出した結果をシトクロムＣオキシダーゼ活性（タンパク質１μｇ当たりのＵ）として表す。

【0132】

下記式により、酵素活性が算出できる。
・シトクロムＣの酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝Ａ_ＣＯＸ＝（ＤＡ／分）／２１．８４
式中、
・ＤＡ／分＝Ａ／分（ｖ）−Ａ／分（ｖ０）
・２１．８４（ｍＭ）＝５５０ｎｍにおけるフェロシトクロムＣのε（モル吸光係数）
・Ａ＝５５０ｎｍにおける吸光度
・Ａ／分（ｖ）＝基質追加後の測定時間に相当する時間“ｖ”（分）、５５０ｎｍでの吸光度
・Ａ／分（ｖ０）＝“ｖ０”（分）（開始時、すなわち基質追加前）、５５０ｎｍでの吸光度

【0133】

結果は、バンダテロシド（Ａ_ＣＯＸサンプル）存在下で測定した酵素活性を酵素活性コントロール（Ａ_ＣＯＸコントロール）と比較して、すなわち（Ａ_ＣＯＸサンプル）／（Ａ_ＣＯＸコントロール）として表す。

【0134】

算出した（Ａ_ＣＯＸサンプル）／（Ａ_ＣＯＸコントロール）比が１を超えた場合、サンプル存在下でシトクロムＣオキシダーゼ活性の刺激がみられたことを示す。

【0135】

（組み換えヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）におけるミトコンドリア生合成の測定）
シトクロムＣ活性の刺激作用を有するバンダテロシドＶＴ１及びＶＴ２について、ミトコンドリア生合成測定を行う。

【0136】

測定された酵素活性の増加が、当初から存在するミトコンドリアの呼吸鎖の基礎刺激に関連するのか、又は、ミトコンドリア生合成が刺激されたことを意味する細胞内ミトコンドリア数の増加に関連するのかを確認することが、本測定の目的である。

【0137】

ＨａＣａＴ細胞を６ウェルプレートで培養した後、上述の通り処理する。４８時間処理後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び１％ＳＤＳからなるバッファー（１ｍｌ／ウェル）を用いて、５５℃で一晩という培養時間に従い、細胞を溶解する。細胞溶解物に対してフェノール溶液（１／１比）を用いてミトコンドリアＤＮＡを抽出する。４０００ｒｐｍ（５分）での遠心分離を２回行う。その後、ＣＨＣｌ_３／イソアミルアルコール溶液（ｖ／ｖ＝２４／１）を上部の水相に加え、沈殿後に回収する。次いで、混合物を遠心分離する（５分、４０００ｒｐｍ、４℃）。

【0138】

無水エタノール／３Ｍ酢酸ナトリウム混合物（ｖ／ｖ＝２．５／１．１０^ｅ）を上清に加え、全ＤＮＡを析出させる。遠心分離（３０分、１２０００ｒｐｍ、４℃）後、ペレットを７０°ｖ／ｖのＥｔＯＨで洗浄し、乾燥し、脱イオン水に取る。分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＤＮＡを分析する。ＤＮＡ溶液は、濃度１０ｎｇ／μｌに調整する。

【0139】

ｑＰＣＲにより、３つの異なる遺伝子の発現を測定する。この方法によれば、蛍光標識によってＤＮＡ重合量を測定できる。選択したのは２つのミトコンドリア遺伝子１６Ｓ及びＣＯＸ２（それぞれミトコンドリアリボソーム及びシトクロムＣオキシダーゼの発現に関する遺伝子）、並びに、細胞核に位置する遺伝子ＵＣＰ−２（ゲノムＤＮＡ）である。上記遺伝子の発現を測定してコントロールとする。

【0140】

プライマーは以下のものを用いた。
１６Ｓ ＤＮＡ：センス（５’−ＴＧＧ−ＡＣＡ−ＡＣＣ−ＡＧＣ−ＴＡＴ−ＣＡＣ−ＣＡ−３’）；アンチセンス（５’−ＡＣＴ−ＴＴＧ−ＣＡＡ−ＧＧＡ−ＧＡＧ−ＣＣＡ−ＡＡ−３’）
ＣＯＸ−２ ＤＮＡ：センス（５’−ＡＧＧ−ＣＧＡ−ＣＣＴ−ＧＣＧ−ＡＣＴ−ＣＣＴ−ＴＧＡ−３’）；アンチセンス（５’−ＴＴＡ−ＧＣＴ−ＴＴＡ−ＣＡＧ−ＴＧＧ−ＧＣＴ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−ＧＣ−３’）
ＵＣＰ−２ ＤＮＡ：センス（５’−ＣＣＴ−ＡＧＣ−ＧＣＴ−ＧＣＣ−ＴＣＡ−ＴＡＡ−ＡＣ−３’）；アンチセンス（５’−ＣＣＴ−ＡＴＧ−ＧＧＴ−ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＣＴＧ−ＴＴ−３’）

【0141】

ｑＰＣＲ試験は９６ウェルプレートで行う。全サンプルのＤＮＡ混合物に当たる一連のＤＮＡ範囲を段階希釈によって各プライマーにつき調製する。細胞ＤＮＡサンプルは、脱イオン水を加えたＭＩＸ−ＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）混合物と混合する。ＰＣＲは、ハイブリダイゼーション温度６０℃で４５サイクル行う（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。

【0142】

４５サイクル後に蛍光発光を測定し、得られたＤＮＡ量をＤＮＡ範囲に基づいて評価する。

【0143】

結果を１６Ｓ及びＣＯＸ２（Ｑ_ＣＯＸ２）ＤＮＡ量で表し、ＵＣＰ−２ゲノムＤＮＡ（Ｑ_{ＵＣＰ−２}）量に応じて算出し、（Ｑ_ＣＯＸ２）／（Ｑ_{ＵＣＰ−２}）とする。

【0144】

算出した（Ｑ_ＣＯＸ２）／（Ｑ_{ＵＣＰ−２}）比が１を超えている場合、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加したことを示し、細胞内ミトコンドリア数が増加したことを反映している。

【0145】

（結果）
４８時間処理後に行ったＸＴＴ測定から、試験した化合物がケラチノサイトのミトコンドリア呼吸機能を顕著に刺激していることが分かる。だが、顕著な用量効果は見られない。

【0146】

また、ケラチノサイトにＵＶ_Ｂを照射しても、上記デヒドロゲナーゼに顕著な刺激は見られない。

【0147】

ＶＴ１及びＶＴ２化合物は、ケラチノサイトミトコンドリアデヒドロゲナーゼの活性を最も刺激する化合物である。

【0148】

特に、ＶＴ２化合物は、最も低い０．７８μｇ／ｍｌ、すなわち１μＭ（ネガティブコントロールに対して＋３９％）という試験濃度においても、上記デヒドロゲナーゼ活性を顕著に刺激する（図６）。

【0149】

試験した３つの化合物は、レスベラトロール（ポジティブコントロール）よりも低い濃度でシトクロムＣオキシダーゼを活性化し、ＶＴ２化合物は最も良好なシトクロムＣオキシダーゼ活性化剤である。ＶＴ２は、濃度１．５６μｇ／ｍｌ（２μＭ）において、濃度１１．４１μｇ／ｍｌ（５０μＭ）のレスベラトロールに匹敵する活性レベルでシトクロムＣオキシダーゼ活性を刺激する（図７）。

【0150】

ＶＴ１化合物にのみ用量効果が見られる。

【0151】

ＶＴ１及びＶＴ２についてミトコンドリア生合成測定を行い、測定された酵素活性の増加が、当初から存在するミトコンドリアの呼吸鎖の基礎刺激と関連するのか、又は、細胞内ミトコンドリア数の増加と関連するのかを確認する。

【0152】

その結果、６．２５μｇ／ｍｌのＶＴ１を除いた試験濃度において、２つの化合物のいずれもミトコンドリア生合成の活性化、すなわち細胞内ミトコンドリア数の増加を引き起こさないことが分かった。

【0153】

従って、ミトコンドリアシトクロムＣオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼの酵素活性の増加を示す得られた結果は、これらの酵素活性の基礎刺激を反映したものであり、細胞内ミトコンドリア数の増加を反映したものではない。

【0154】

ＶＴ１及びＶＴ２は、複合体Ｉ及びＩＩのデヒドロゲナーゼ酵素活性を刺激することにより、またミトコンドリア呼吸鎖のシトクロムＣオキシダーゼを刺激することにより、最も良好なミトコンドリア活性化能を示す。

【0155】

従って、ＶＴ１、とりわけＶＴ２化合物は、それぞれ、上記鎖の複合体Ｉ及びＩＩの刺激並びにシトクロムＣオキシダーゼ活性の刺激によって、ケラチノサイトのミトコンドリア呼吸鎖に対し顕著な活性を示す。これにより、これらの化合物が肌細胞のエネルギー代謝をそのミトコンドリア呼吸機能によって活性化することが確認できる。

【0156】

上記活性から、本発明の化合物、特にＶＴ１及び／又はＶＴ２を化粧品有効成分又は皮膚科学的有効成分として、特に成熟した肌に対する化粧処置又は皮膚科学的処置、例えば、皮膚の老化を防ぐこと、並びに／又は、皮膚の保湿性及び／若しくは皮膚治癒を維持若しくは改善することに用いることができることが示される。

【0157】

（正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）の分化の刺激）
デスモグレインはカドヘリン（膜貫通タンパク質）であって、デスモソームを形成して上皮細胞（ケラチノサイト等）同士を結合させる。ロリクリンと同様、インボルクリンは、最終分化段階にある角質層の構成要素であるケラチノサイトにより発現されるタンパク質である。このケラチノサイトはコルネオサイトと呼ばれる。トランスグルタミナーゼはＣａ^２＋依存酵素であり、上記タンパク質間に共有結合点を形成する。従って、これら３種類のタンパク質は、ケラチノサイトの早期分化（デスモグレインＩ）及び後期分化（インボルクリン及びトランスグルタミナーゼ）のマーカーとなる。肌が老化していくと、ケラチノサイトの再生、その活性、及び、そのコルネオサイトへの変換に遅れが見られる。表皮の萎縮が見られる。肌は水分を失い、そして表皮の保護及び治癒機能が遅くなる。こうして、肌は生気のない乾燥した外観を呈する。

【0158】

（方法）
Ｔ７５フラスコを用いて、ＫＳＦＭ完全培地にてＮＨＫを３継代培養する。コンフルエンスに達する前にＮＨＫをトリプシン処理し、８ウェルＬａｂ−ＴｅｋＩＩ培養システム（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に１ウェル当たり２００００細胞の割合で播き、各処理条件につき４ウェルを使用する。８０％コンフルエンスとなったら、種々の有効成分組成物（ＶＴ１、ＶＴ２及びＶＴ３、各１２μｇ／ｍｌ）を用いて、コンフルエンスに達するまで５日間細胞を処理する。３％のＶｉｔａｃｔｙｌ（登録商標）ｃｌａｉｒ（Ｍａｌｖａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ抽出物、Ｓｉｌａｂ）をポジティブコントロールとして用いる。

【0159】

（免疫標識）
細胞をＰＢＳ（ＰＢＳタブレット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧＩＢＣＯ）で洗浄した後、ホルマリン（中性緩衝ホルマリン溶液、１０％、Ｓｉｇｍａ）で１０分間固定する。

【0160】

ＰＢＳで洗浄後、培養チャンバを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ溶液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ）で１０分間満たして膜を透過処理し、その後ＰＢＳで２回洗浄する。続いて、周囲温度下で３０分間、細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）溶液で覆う。スライドを吸収紙上で傾けて、ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液をスライドから除去する。

【0161】

次いで、周囲温度下で６０分間、細胞を一次抗体溶液で覆う。
・抗トランスグルタミナーゼ（マウスモノクローナル、Ｈａｒｂｏｒ Ｂｉｏ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）１／２００希釈
・抗デスモグレイン１（マウスモノクローナル、Ｚｙｍｅｄ）１／１００希釈
・抗インボルクリン（マウスモノクローナル、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）１／２００希釈

【0162】

ＰＢＳで洗浄後、１／２００に希釈した二次抗体溶液（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ））で細胞を覆う。暗所にて、周囲温度下で６０分間、スライドを培養する。このスライドをＰＢＳで３回洗浄する。

【0163】

（封入）
スライドの培養チャンバを取り出し、封入剤（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＡＫＯ）を細胞に数滴載せてから、カバーガラス（２４×６０ｍｍ、Ｋｎｉｔｔｅｌ Ｇｌａｅｓｅｒ）を被せる。

【0164】

（共焦点顕微鏡による写真の取得）
Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８フィルタを備えたビデオ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００）で画像を得る。

【0165】

各条件につき、２０倍の対物レンズを用いて緑色蛍光（マーカー発現）の写真を４枚撮影する。取得時のパラメータ（露光時間、ゲイン）は、試験した各マーカーにつき同様である。

【0166】

写真はＬｅｉｃａ ＱＷｉｎ画像分析ソフトで分析する。プログラムを作成して上記分化マーカーの発現量を定量化する。

【0167】

（結果）
その結果、本発明の化合物は、ネガティブコントロールと比較して、ケラチノサイト分化タンパク質の発現を顕著に刺激することが分かった。

【0168】

試験した化合物の中でも、ＶＴ１及びＶＴ２が最も効果的である（図８〜１３）。またＶＴ２は、３％で使用したポジティブコントロールよりも高いレベルでインボルクリン発現を刺激する。

【0169】

このことから、バンダテロシド、とりわけＶＴ１及びＶＴ２は、表皮上層を構成するケラチノサイトの再生を刺激することが分かる。

【0170】

バンダテロシドは角質の再生を促進し、従って肌の外観を若くする。この現象は、表皮の保護及び修復機能を維持するとともに、皮膚の保湿性を維持又は改善するのに役立つ。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】