特許 5786188 試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5786188

(24)【登録日】2015年8月7日

(45)【発行日】2015年9月30日

(54)【発明の名称】試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20150910BHJP

   G01N 33/531 20060101ALI20150910BHJP

   G01N 33/545 20060101ALI20150910BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20150910BHJP

   G01N 21/78 20060101ALN20150910BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 X

   G01N33/531 B

   G01N33/545 B

   G01N33/553

   !G01N21/78 Z

【請求項の数】2

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2010-131417(P2010-131417)

(22)【出願日】2010年6月8日

(65)【公開番号】特開2011-257243(P2011-257243A)

(43)【公開日】2011年12月22日

【審査請求日】2013年5月8日

(73)【特許権者】

【識別番号】000131474

【氏名又は名称】株式会社シノテスト

(72)【発明者】

【氏名】穴田 哲也

(72)【発明者】

【氏名】中村 雄樹

【審査官】 藤田 都志行

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−３４３２１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２２５６０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−２９６２９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６１−００２０７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０６０２９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０７４８６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平１１−２１８５３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第６２８４４７２（ＵＳ，Ｂ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｇ０１Ｎ ３３／５３１

Ｇ０１Ｎ ３３／５４５

Ｇ０１Ｎ ３３／５５３

Ｇ０１Ｎ ２１／７８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣｉＮｉｉ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のＣ反応性蛋白質に対する特異的結合物質を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、該特異的結合物質と試料に含まれていたＣ反応性蛋白質との特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法において、該特異的結合反応の反応時に酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、アクリル酸及びメタクリル酸若しくはその誘導体又はそれらの塩から選択される少なくとも１種を存在させることを特徴とする、Ｃ反応性蛋白質の測定における測定範囲の拡大方法。

【請求項2】

担体粒子が、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子である、請求項１記載の測定範囲の拡大方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中のＣ反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。

【背景技術】

【0002】

抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセプター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用した、試料中に含まれる微量の測定対象物質の測定試薬又は測定方法は種々のものが知られている。

【0003】

これは、試料中に含まれる測定対象物質と、この測定対象物質に対して特異的に結合する特異的結合物質（測定対象物質に対する特異的結合物質）との結合の有無、又は結合の量を測ることにより、試料中に含まれる測定対象物質の有無の測定〔定性測定〕、又はその含有量（濃度）の測定〔定量測定〕を行うものである。

【0004】

例えば、抗原と抗体の間の抗原抗体反応（免疫反応、免疫学的反応）を利用した測定方法としては、酵素免疫測定法、発光免疫測定法、免疫比ろう法、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法、イムノクロマトグラフィー法等の多くの測定方法が知られている。

【0005】

特に、前述した測定方法のうち、免疫比濁法やラテックス免疫比濁法は、操作が簡便であり、測定の自動化が可能なことから広く普及している。

【0006】

また、免疫比濁法やラテックス免疫比濁法の普及に伴って、様々な測定対象物質が測定されるようになってきているが、この測定対象物質は、物質によって測定を必要とする濃度範囲が様々であることから、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度の測定対象物質を正確に測定することが要求されている。

【0007】

例えば、Ｃ反応性蛋白質；Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ＣＲＰと略すこともある）は、肺炎球菌菌体のＣ多糖体と沈降反応を示す蛋白であり、血中ＣＲＰ濃度の上昇は、感染症に罹患していること、又は体内に炎症が生じていること等の証拠となる。
このためＣＲＰは各種炎症のマーカーとして、感染症又は炎症等の疾患の診断のためにその測定が行われてきた。

【0008】

このＣＲＰの測定法としては、Ｃ多糖体との特異的反応をみる方法、及びＣＲＰに結合する抗体（抗ＣＲＰ抗体）を試薬に用い、試料中のＣＲＰと試薬中の抗ＣＲＰ抗体との抗原抗体反応により、抗原抗体複合体を生成させる方法等を挙げることができる。
現在では、抗ＣＲＰ抗体との抗原抗体複合体を生成させる方法である、免疫比ろう法、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法等が日常検査に広く利用されている。

【0009】

健常人の血清中（又は血漿中）のＣＲＰ濃度は一般に０．３ｍｇ／ｄＬ以下であるが、炎症や細菌感染に対して短時間に鋭敏に反応して上昇し２，０００〜４，０００倍にも達する。
ＣＲＰ濃度は、炎症の大きさや程度、又はその改善と相関するため、その測定の臨床的意義は大きい。また、ＣＲＰ濃度が正常域（０．３ｍｇ／ｄＬ以下）であっても、比較的高濃度の場合、冠動脈疾患を発症する可能性が高いことが報告され注目されている。
このため、試料中のＣＲＰの測定においては、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することが要求されてきている。

【0010】

このような背景から、試料中のＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定する方法として、例えば、平均粒径の異なる２種以上のラテックス粒子を混合し用いる方法（例えば、特許文献１参照）、測定試薬に塩酸グアニジンを添加する方法（例えば、特許文献２参照）、測定試薬に界面活性剤を添加する方法（例えば、特許文献３参照）、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を組み合わせて使用する方法（例えば、特許文献４参照）等が提案されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】特開昭６３−６５３６９号公報

【特許文献2】特開平１１−３４４４９３号公報

【特許文献3】特開２００１−３１８０９９号公報

【特許文献4】特開２００６−１７７４５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

従って、本発明の課題は、試料中のＣＲＰと、担体粒子に固定化したＣＲＰに結合する特異的結合物質との、特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、低濃度から高濃度までその測定範囲を拡げ、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる、新たな測定試薬及び測定方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、ＣＲＰと、担体粒子に固定化したＣＲＰに結合する特異的結合物質との、特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩を含有又は存在させることにより、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0014】

すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 試料中のＣ反応性蛋白質に対する特異的結合物質を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、該特異的結合物質と試料に含まれていたＣ反応性蛋白質との特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣ反応性蛋白質を測定する方法において、該特異的結合反応の反応時に酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、アクリル酸及びメタクリル酸若しくはその誘導体又はそれらの塩から選択される少なくとも１種を存在させることを特徴とする、Ｃ反応性蛋白質の測定における測定範囲の拡大方法。
（２） 担体粒子が、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子である、前記（１）記載の測定範囲の拡大方法。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、試料中のＣＲＰと、担体粒子に固定化したＣＲＰに結合する特異的結合物質との、特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩を含有又は存在させることにより、試料中のＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができるものであり、そして、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができるものである。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】酢酸ナトリウムを含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図2】プロピオン酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図3】酪酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図4】乳酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図5】アクリル酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図6】メタクリル酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図7】酢酸ナトリウムを含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図8】プロピオン酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図9】酪酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図10】乳酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図11】アクリル酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【図12】メタクリル酸を含有する測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い得られた吸光度差を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明を詳細に説明する。
〔１〕Ｃ反応性蛋白質に対する特異的結合物質
本発明において、Ｃ反応性蛋白質に対する特異的結合物質とは、ＣＲＰに特異的な親和性を有し結合することができる物質であり、このようにＣＲＰに特異的な親和性を有し結合することができる物質であれば特に限定はない。

【0018】

このＣＲＰに対する特異的結合物質としては、例えば、ＣＲＰに結合することができる抗体（抗ＣＲＰ抗体）、アプタマー（核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー）、アフィボディー、又はレセプター等を挙げることができる。

【0019】

そして、この抗ＣＲＰ抗体としては、例えば、（ＣＲＰに結合することができる）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及びこれらの抗体の断片〔Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖなど〕等を挙げることができる。
また、前記の抗体又は抗体断片に、蛋白質又は低分子化合物を結合させた誘導体を使用することもできる。

【0020】

なお、抗ＣＲＰ抗体の由来については特に限定はなく、抗ＣＲＰ抗体の由来としては、例えば、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはウマなど）、又は鳥類（ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、若しくはアヒルなど）等を挙げることができる。

【0021】

そして、ＣＲＰに対する特異的結合物質としては、ＣＲＰに結合することができる抗体（抗ＣＲＰ抗体）が好ましく、当該抗体がモノクローナル抗体であることがより好ましい。

【0022】

また、本発明においては、２種以上の、ＣＲＰに対する特異的結合物質を用いても良い。この場合、ＣＲＰに対する特異的結合物質としては、例えば、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質や、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質等を挙げることができる。

【0023】

〔２〕担体粒子
本発明において、担体粒子は、前記のＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。

【0024】

すなわち、ＣＲＰと特異的結合物質との特異的な結合反応を利用して試料中のＣＲＰの測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体粒子、又は使用することが可能な担体粒子であればよい。

【0025】

この担体粒子の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ゼラチン、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等を挙げることができる。

【0026】

そして、この担体粒子としては、例えば、ラテックス粒子、金属コロイド粒子、リポソーム、マイクロカプセル、又は赤血球等の粒子等を挙げることができる。
また、本発明における担体粒子としては、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子であることが好ましい。

【0027】

本発明において、ＣＲＰに対する特異的結合物質を担体粒子に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、ＣＲＰに対する特異的結合物質と、担体粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、或いは緩衝液等に溶解したＣＲＰに対する特異的結合物質を、担体粒子に接触させること等により行うことができる。

【0028】

また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、ＣＲＰに対する特異的結合物質と、担体粒子とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、ＣＲＰに対する特異的結合物質と、担体粒子の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。

【0029】

更に、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体粒子のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。

【0030】

また、本発明の担体粒子は、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体粒子と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体粒子との混合物であってもよい。
この場合のカルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体と、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する特異的結合物質を固定化した担体との混合比率は、用いる各々の特異的結合物質や使用する担体の種類などの条件等により異なるため一概に言うことは出来ないが、例えば、両方の担体が同一濃度となるよう混合して用いること等を挙げることができる。

【0031】

なお、本発明における試料中のＣＲＰの測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、ラテックス粒子等の担体粒子の大きさ（粒径）については、特に制限はない。
しかし、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子が、試料中に含まれていたＣＲＰとの複合体凝集物（凝集塊）を生成する程度、及びこの生成した複合体凝集物の測定の容易さ等の理由より、担体粒子の大きさ（粒径）は、その平均径（平均粒径）が、０．０１μｍ〜１０μｍであることが好ましく、０．０４μｍ〜１μｍであることがより好ましい。
また、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法において、担体粒子は、その大きさ（粒径）、材質、又は形状等が異なる２種類以上の担体を使用してもよい。

【0032】

なお、本発明における試料中のＣＲＰの測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子の測定反応時における濃度は、前記の特異的結合物質の担体表面上での分布密度、担体粒子の大きさ（粒径）、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、担体粒子に固定化されたＣＲＰに対する特異的結合物質と、試料に含まれていたＣＲＰとの、特異的結合反応が行われる測定反応時に、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子の濃度が、この測定反応時の反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度のＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子を測定試薬に含有させることが好ましい。

【0033】

本発明の測定試薬及び測定方法においては、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上と共存させてもよい。

【0034】

そして、上記の各物質を共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。

【0035】

〔３〕モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩
本発明の測定試薬及び測定方法においては、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有又は存在させる。ここで、モノカルボン酸とは、分子中にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を１個持つ有機化合物であり、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸（ブタン酸）、乳酸、吉草酸（ペンタン酸）、イソ吉草酸、ピバル酸、２−メチルブタン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、カプロン酸、安息香酸、フェニル酢酸（芳香族）などの飽和モノカルボン酸、アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸、リノール酸などの不飽和モノカルボン酸等を挙げることができる。

【0036】

また、本発明においては、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩が、特に酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、アクリル酸及びメタクリル酸若しくはその誘導体又はそれらの塩であることが好ましい。

【0037】

そして、本発明におけるモノカルボン酸の誘導体とは、モノカルボン酸に小部分の構造上の変化があってできる化合物のことであり、例えば、前記のモノカルボン酸のエステル化物、酸無水物、酸ハロゲン化物、酸過酸化物、酸アジド、酸アミド、酸イミド並びにこれらのハロゲン化誘導体、スルホン化誘導体、ニトロ化誘導体及びニトロソ化誘導体等を挙げることができる。

【0038】

また、本発明におけるモノカルボン酸若しくはその誘導体の塩としては、例えば、リチウム、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどのアンモニウム塩、アルミニウム塩及び亜鉛塩等を挙げることができる。

【0039】

なお、本発明において、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩は、その１種を単独で用いても良いし、２種以上を併用しても良い。

【0040】

本発明において、前記のモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩をＣＲＰの測定試薬に存在させる濃度は、１０ｍＭ以上であることが好ましく、１００ｍＭ以上であることが更に好ましい。

【0041】

なお、前記のモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩をＣＲＰの測定試薬に存在させる方法であるが、このモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を、担体粒子に固定化されたＣＲＰに対する特異的結合物質と、試料に含まれていたＣＲＰとの、特異的結合反応が行われる測定反応時に、前記のＣＲＰの測定試薬に存在させることができればいかなる方法でも良い。

【0042】

例えば、前記のモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を緩衝液に含有させた試薬を調製し、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子を含む試薬と混合することによって、担体粒子に固定化されたＣＲＰに対する特異的結合物質と試料に含まれていたＣＲＰとの、特異的結合反応が行われる測定反応時に、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を存在させるようにすれば良い。

【0043】

〔４〕試料
本発明において、試料とは、ＣＲＰが存在する可能性があり、かつＣＲＰの存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、髄液若しくは腹水などの体液、又は臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、ＣＲＰが含まれる可能性のあるものを挙げることができる。

【0044】

〔５〕測定試薬
本発明の測定試薬は、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子を含むＣＲＰの測定試薬において、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有することを特徴とするものである。

【0045】

これにより、試料中のＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度までその測定範囲を拡げ、そして、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができるものである。

【0046】

本発明の測定試薬は、一つの測定試薬よりなるものであってよい。この場合、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩は、その一つの測定試薬に含有される。

【0047】

また、本発明の測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってもよい。この場合、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。

【0048】

例えば、本発明の測定試薬が、第１試薬及び第２試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩は、第１試薬にのみ含有させてもよく、また、第２試薬にのみ含有させてもよく、更には、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。

【0049】

本発明の測定試薬が二つの測定試薬より構成される場合、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩は、第１試薬にのみ含有させることが好ましい。

【0050】

また、本発明の測定試薬が二つ以上の測定試薬より構成されるものである場合、モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有しない方の試薬は、例えば、ＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子を含む緩衝液等であってよい。

【0051】

なお、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。

【0052】

この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。

【0053】

この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５〜１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。

【0054】

また、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬には、前記のＣＲＰに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子、及び前記のモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などの蛋白質；カルシウムイオンなどの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。

【0055】

なお、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬には、カルシウムイオン又はカルシウム塩を含有させることが好ましい。
そして、これらを本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。

【0056】

なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

【0057】

なお、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のＣＲＰの測定に使用することができる。
また、本発明の試料中のＣＲＰの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中のＣＲＰの測定に使用することもできる。

【0058】

前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する物質の試薬等を挙げることができる。

【0059】

〔６〕測定方法
本発明における試料中のＣＲＰの測定方法は、担体粒子に固定化された「ＣＲＰに対する特異的結合物質」と試料中に含まれていた「ＣＲＰ」との特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することにより、試料中のＣＲＰを測定する方法において、該特異的結合反応の反応時にモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を存在させるものである。

【0060】

本発明の試料中のＣＲＰの測定方法における測定操作は、公知の測定操作に従って行うことができる。

【0061】

この測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

【0062】

また、この測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。

【0063】

以下、ラテックス免疫比濁法を測定原理とする試料中のＣＲＰの測定試薬を用いて、試料中のＣＲＰの測定を行う場合を例にとって、具体的に説明を行う。

【0064】

（１）まず、試料中のＣＲＰの測定試薬として、以下のものを準備する。
第１試薬：モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を含有する緩衝液
第２試薬：ＣＲＰを固定化したラテックス粒子を含有する緩衝液

【0065】

（２）血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１〜３０℃）又は微温（３０〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい（例えば、３７℃等）。

【0066】

（３）一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１〜３０℃）又は微温（３０〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい（例えば、３７℃等）。
そして、前記の静置の時間は、１分以上、１０分以下の一定時間であることが好ましく、３分以上、５分以下の一定時間であることがより好ましい。

【0067】

試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ＣＲＰ抗体と、試料中に含まれていたＣＲＰとの抗原抗体反応（測定反応）を行わせる。

【0068】

そして、この抗原抗体反応（測定反応）により、「…〔抗ＣＲＰ抗体＝ラテックス粒子＝抗ＣＲＰ抗体〕−〔ＣＲＰ〕−〔抗ＣＲＰ抗体＝ラテックス粒子＝抗ＣＲＰ抗体〕…」の架橋が形成され、抗ＣＲＰ抗体を固定化したラテックス粒子同士の複合体凝集物が生成する。

【0069】

（４）そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生ずるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料中に含まれていたＣＲＰの量を求める。

【0070】

（５）そして、「試料の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」と、「標準液、標準血清等の標準物質（既知濃度のＣＲＰを含む試料）の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」とを比較することにより、測定を行った試料中に含まれるＣＲＰの量（濃度）の算出を行う。

【0071】

〔７〕測定範囲の拡大方法
本発明における、Ｃ反応性蛋白質の測定における測定範囲の拡大方法は、試料中のＣＲＰと、担体粒子に固定化したＣＲＰに結合する特異的結合物質との、特異的結合反応により生成した複合体凝集物を測定することによる、試料中のＣＲＰの測定において、該特異的結合反応の反応時にモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を存在させることによるものである。
この試料中のＣＲＰの測定において、該特異的結合反応の反応時にモノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩を存在させることにより、その測定範囲を拡大し、試料中の低濃度から高濃度までのＣＲＰを測定することができる。
また、本発明におけるＣ反応性蛋白質の測定における測定範囲の拡大方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。

【実施例】

【0072】

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0073】

〔実施例１〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−１）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、酢酸ナトリウムを含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0074】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、酢酸ナトリウム〔関東化学社〕を０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１０００ｍＭの濃度となるように添加し、酢酸ナトリウム濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0075】

（２）第２試薬の調製
（ａ）抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１９２μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液０．０９４ｍＬに、抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体を０．０４ｇ／ｄＬの濃度で６．７ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕に混和した液０．５０９８ｍＬを加え、５℃にて一晩静置した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に１．０％ＢＳＡを含む５ｍＭグリシン緩衝液〔ｐＨ９．５（２０℃）〕を加え懸濁し、３７℃で７日間静置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が２５．０ＯＤとなるように懸濁した。
そして、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗ＣＲＰ抗体を固定化したラテックス粒子の０．８００％懸濁液として調製した。
これを抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
なお、抗ＣＲＰモノクローナル抗体としては、市販のマウス抗ＣＲＰモノクローナル抗体（日本バイオテスト研究所社；クローン：ＣＲＢ−０１９）を使用した。

【0076】

（ｂ）第２試薬の調製
前記（ａ）で調製した抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の１ｍＬと、０．０５％アジ化ナトリウム水溶液の９ｍＬとを混合し、０．０８０％の「抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
これを第２試薬とした。

【0077】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
４％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２．７ｍＭ塩化カルシウム・２水和物、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製して、試料希釈液とした。

【0078】

（２）試料の調製
遺伝子組み換え体ＣＲＰ（オリエンタル酵母工業社製）を、前記（１）の試料希釈液で希釈することにより、次のＣＲＰ濃度の試料をそれぞれ調製した。
また、前記（１）で調製した試料希釈液を、ＣＲＰ濃度０ｍｇ/ｄＬの試料とした。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0079】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
（ａ）測定は、日立−７１８０形自動分析装置（日立製作所社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の（２）の試料１〜７の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。

【0080】

（ｂ）前記の第１試薬の添加後４分３４秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（ｂ）の第２試薬の１００μＬを添加し、混合した。

【0081】

（ｃ）前記の第１試薬の添加後５分０９秒目（１８ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗ＣＲＰ抗体と、前記の試料に含まれていたＣＲＰとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。

【0082】

（ｄ）前記の第１試薬の添加後９分５４秒目（３４ポイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。

【0083】

（ｅ）前記（ｄ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ｃ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれるＣＲＰの量（濃度）に比例したものである。

【0084】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図１に示した。
なお、この図１において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0085】

４．考察
図１から明らかなように、第１試薬に酢酸ナトリウムを含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬に酢酸ナトリウムを含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0086】

これに対して、第１試薬に酢酸ナトリウムを含有させた場合（２５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１０００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬に酢酸ナトリウムを含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0087】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、酢酸ナトリウム（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0088】

〔実施例２〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−２）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、プロピオン酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0089】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、プロピオン酸〔和光純薬社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、プロピオン酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0090】

（２）第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0091】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0092】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0093】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例２の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0094】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図２に示した。
なお、この図２において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0095】

４．考察
図２から明らかなように、第１試薬にプロピオン酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬にプロピオン酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0096】

これに対して、第１試薬にプロピオン酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が５０ｍｇ／ｄＬを超えても吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬にプロピオン酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0097】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、プロピオン酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0098】

〔実施例３〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−３）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、酪酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0099】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、酪酸〔ナカライ社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、酪酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0100】

（２）第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0101】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0102】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0103】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例２の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0104】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図３に示した。
なお、この図３において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0105】

４．考察
図３から明らかなように、第１試薬に酪酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬に酪酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0106】

これに対して、第１試薬に酪酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が５０ｍｇ／ｄＬを超えても吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬に酪酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0107】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、酪酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0108】

〔実施例４〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−４）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、乳酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0109】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、乳酸〔和光純薬社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、乳酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0110】

（２）第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0111】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0112】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0113】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例２の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0114】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図４に示した。
なお、この図４において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0115】

４．考察
図４から明らかなように、第１試薬に乳酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬に乳酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0116】

これに対して、第１試薬に乳酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬に乳酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0117】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、乳酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0118】

〔実施例５〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−５）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、アクリル酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0119】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、アクリル酸〔ナカライ社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、アクリル酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0120】

（２）第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0121】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0122】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0123】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例２の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0124】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図５に示した。
なお、この図５において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0125】

４．考察
図５から明らかなように、第１試薬にアクリル酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬にアクリル酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0126】

これに対して、第１試薬にアクリル酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬にアクリル酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0127】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、アクリル酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0128】

〔実施例６〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−６）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、メタクリル酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0129】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、メタクリル酸〔ナカライ社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、メタクリル酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0130】

（２）第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0131】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0132】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0133】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例２の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0134】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図６に示した。
なお、この図６において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0135】

４．考察
図６から明らかなように、第１試薬にメタクリル酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬にメタクリル酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0136】

これに対して、第１試薬にメタクリル酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬にメタクリル酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0137】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、メタクリル酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0138】

〔実施例７〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−７）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、酢酸ナトリウムを含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0139】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、酢酸ナトリウム〔関東化学社〕を０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１０００ｍＭの濃度となるように添加し、酢酸ナトリウム濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0140】

（２）第２試薬の調製
（ａ）抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Ａの調製
平均粒径０．１９２μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液０．０９４ｍＬに、抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体を０．０５ｇ／ｄＬの濃度で６．７ｍＭ
ＭＭＥＳ緩衝液〔ｐＨ５．０（２０℃）〕に混和した液０．５０９８ｍＬを加え、５℃にて一晩静置した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に１．０％ＢＳＡを含む５ｍＭグリシン緩衝液〔ｐＨ９．５（２０℃）〕を加え懸濁し、３７℃で７日間静置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が２５．０ＯＤとなるように懸濁した。
そして、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗ＣＲＰ抗体を固定化したラテックス粒子の０．８０％懸濁液として調製した。
これを抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Ａとした。
なお、抗ＣＲＰモノクローナル抗体としては、カルシウムイオン非依存的にＣＲＰに結合する抗体である、市販のマウス抗ＣＲＰモノクローナル抗体（日本バイオテスト研究所社；クローン：ＣＲＢ−０３０）を使用した。

【0141】

（ｂ）抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Ｂの調製
平均粒径０．１９２μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液０．０９４ｍＬに、抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体を０．０４ｇ／ｄＬの濃度で６．７ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕に混和した液０．５０９８ｍＬを加え、５℃にて一晩静置した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に１．０％ＢＳＡを含む５ｍＭグリシン緩衝液〔ｐＨ９．５（２０℃）〕を加え懸濁し、３７℃で７日間静置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が２５．０ＯＤとなるように懸濁した。
そして、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液により希釈して、抗ＣＲＰ抗体を固定化したラテックス粒子の０．８０％懸濁液として調製した。
これを抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Ｂとした。
なお、抗ＣＲＰモノクローナル抗体としては、カルシウムイオン依存的にＣＲＰに結合する抗体である、市販のマウス抗ＣＲＰモノクローナル抗体（日本バイオテスト研究所社；クローン：ＣＲＢ−０１９）を使用した。

【0142】

（ｃ）第２試薬の調製
前記（ａ）で調製した抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Ａの０．２５ｍＬと、前記（ｂ）で調製した抗ＣＲＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液Ｂの１．０ｍＬとを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液の８．７５ｍＬと混合した。
これを第２試薬とした。

【0143】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0144】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0145】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、第２試薬として前記１の（２）の第２試薬を用い、前記実施例２の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0146】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図７に示した。
なお、この図７において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0147】

４．考察
図７から明らかなように、第１試薬に酢酸ナトリウムを含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬に酢酸ナトリウムを含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0148】

これに対して、第１試薬に酢酸ナトリウムを含有させた場合（２５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１０００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬にメタクリル酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0149】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、酢酸ナトリウム（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0150】

〔実施例８〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−８）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、プロピオン酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0151】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、プロピオン酸〔和光純薬社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、プロピオン酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0152】

（２）第２試薬の調製
前記実施例７の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0153】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0154】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0155】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例７の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0156】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図８に示した。
なお、この図８において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0157】

４．考察
図８から明らかなように、第１試薬にプロピオン酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬にプロピオン酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0158】

これに対して、第１試薬にプロピオン酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬にプロピオン酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0159】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、プロピオン酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0160】

〔実施例９〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−９）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、酪酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0161】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、酪酸〔ナカライ社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、酪酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0162】

（２）第２試薬の調製
前記実施例７の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0163】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0164】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0165】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例７の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0166】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図９に示した。
なお、この図９において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0167】

４．考察
図９から明らかなように、第１試薬に酪酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬に酪酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0168】

これに対して、第１試薬に酪酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬に酪酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0169】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、酪酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0170】

〔実施例１０〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−１０）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、乳酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0171】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、乳酸〔和光純薬社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、乳酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0172】

（２）第２試薬の調製
前記実施例７の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0173】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0174】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0175】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例７の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0176】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図１０に示した。
なお、この図１０において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0177】

４．考察
図１０から明らかなように、第１試薬に乳酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬に乳酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0178】

これに対して、第１試薬に乳酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬に乳酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0179】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、乳酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0180】

〔実施例１１〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−１１）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、アクリル酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0181】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、アクリル酸〔ナカライ社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、アクリル酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0182】

（２）第２試薬の調製
前記実施例７の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0183】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0184】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0185】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例７の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0186】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図１１に示した。
なお、この図１１において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0187】

４．考察
図１１から明らかなように、第１試薬にアクリル酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬にアクリル酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0188】

これに対して、第１試薬にアクリル酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が直線的に上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬にアクリル酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が直線的に上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0189】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、アクリル酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【0190】

〔実施例１２〕
（本願発明の試料中のＣＲＰの測定試薬及び測定方法の効果の確認−１２）
モノカルボン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩として、メタクリル酸を含有する本願発明のＣＲＰの測定試薬を用いて試料中のＣＲＰの測定を行い、その効果を確認した。

【0191】

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕を調製した。ここに、メタクリル酸〔ナカライ社〕を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、メタクリル酸濃度の異なる４種類の第１試薬とした。

【0192】

（２）第２試薬の調製
前記実施例７の１の（２）の記載の通りに、第２試薬を調製した。

【0193】

２．試料
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の２の（１）の記載の通りに、試料希釈液を調製した。

【0194】

（２）試料の調製
前記実施例１の２の（２）の記載の通りに、次の各試料を調製した。
（ａ）試料１： ０ｍｇ/ｄＬ
（ｂ）試料２： ０．０８ｍｇ/ｄＬ
（ｃ）試料３： ０．４ｍｇ/ｄＬ
（ｄ）試料４： ２．０ｍｇ/ｄＬ
（ｅ）試料５： １０．０ｍｇ/ｄＬ
（ｆ）試料６： ５０．０ｍｇ/ｄＬ

【0195】

３．試料中のＣＲＰの測定
（１）測定手順
第１試薬として、前記１の（１）の第１試薬を用い、前記実施例７の３の（１）の記載の通りに試料中のＣＲＰの測定を行い、各試料における測定値（吸光度差）を得た。

【0196】

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた吸光度差を、図１２に示した。
なお、この図１２において、横軸は試料中のＣＲＰ濃度（ｍｇ/ｄＬ）を、縦軸は測定により得られた吸光度差の値〔吸光度差×１０，０００〕（主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍ）を表す。

【0197】

４．考察
図１２から明らかなように、第１試薬にメタクリル酸を含有させない場合（０ｍＭ）には、試料中のＣＲＰ濃度１０ｍｇ／ｄＬまでしか測定できていないことが分かる。つまり、第１試薬にメタクリル酸を含有させない場合には、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となると、それ以上濃度が上昇しても吸光度が直線的に上昇していかないため、検量線等を用いても測定を行うことができないことが分かる。

【0198】

これに対して、第１試薬にメタクリル酸を含有させた場合（５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭ）は、試料中のＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬを超えても更に吸光度が上昇し、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／ｄＬまで測定できていることが分かる。すなわち、第１試薬にメタクリル酸を含有させた場合には、ＣＲＰ濃度が１０ｍｇ／ｄＬ以上となった場合でも、ＣＲＰ濃度の上昇に応じて吸光度が上昇するため、ＣＲＰを測定することが可能であることが分かる。

【0199】

これらのことより、試料中のＣＲＰを測定する測定試薬及び測定方法において、メタクリル酸（モノカルボン酸又はその誘導体あるいはそれらの塩）を含有又は存在させることにより、ＣＲＰの測定において、低濃度から高濃度まで測定範囲を拡げることができることが分かる。
すなわち、本発明は、低濃度から高濃度までの広範囲の濃度のＣＲＰを正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】