特許 5787406 物質変換方法、バイオリアクタの製造方法、バイオリアクタ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5787406

(24)【登録日】2015年8月7日

(45)【発行日】2015年9月30日

(54)【発明の名称】物質変換方法、バイオリアクタの製造方法、バイオリアクタ

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/14 20060101AFI20150910BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20150910BHJP

   C12M 1/14 20060101ALI20150910BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/14 B

   C12M1/00 D

   C12M1/14

【請求項の数】13

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2012-38438(P2012-38438)

(22)【出願日】2012年2月24日

(65)【公開番号】特開2013-172662(P2013-172662A)

(43)【公開日】2013年9月5日

【審査請求日】2013年11月15日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 日本生物高分子学会主催の「日本生物高分子学会２０１１年度大会」（平成２３年９月１６日〜１７日）の講演要旨集第４８頁（平成２３年９月１日発行）に発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 平成２３年９月１６日に、日本生物高分子学会主催の「日本生物高分子学会２０１１年度大会」の一般講演において発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 平成２３年９月１６日に、日本生物高分子学会主催の「日本生物高分子学会２０１１年度大会」のシンポジウムにおいて発表

(73)【特許権者】

【識別番号】593165487

【氏名又は名称】学校法人金沢工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100105924

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 賢樹

(72)【発明者】

【氏名】小田 忍

(72)【発明者】

【氏名】堀邊 英夫

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−０２９２５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５８−０３１９８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６４−０３９９８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−１６４６８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−３５４４８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１２９５７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−０４１９８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−２１５３８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Bioscience and Bioengineering，2010, Vol.109, No.3, pp.224-226

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

培養槽に、親水性の基質を含む水溶液と、前記水溶液よりも比重の小さい第１の合成高分子微粒子と、前記第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、前記水溶液から形成される水層の液面に、糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子を含む複合層を形成するステップと、
前記複合層中の糸状菌を生体触媒として、前記親水性の基質を反応させるステップと、を含み、
前記第２の合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂を含み、平均粒径が１０μｍ〜５００μｍ、水の接触角が７５°以上、総イオン交換容量が１．０ｍｅｑ／ｇ以上であることを特徴とする物質変換方法。

【請求項2】

前記第１の合成高分子微粒子は、中空構造を有することを特徴とする請求項１に記載の物質変換方法。

【請求項3】

疎水性の有機溶媒を含む有機層を、前記複合層の液面に重層するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の物質変換方法。

【請求項4】

前記疎水性の有機溶媒が、炭素数６以上１８以下の直鎖状または分岐状パラフィン類、粘度２ｃＰ以下の疎水性シリコンオイル、炭素数１０以上１８以下の脂肪族エーテル類およびエステル類から選択されることを特徴とする請求項３に記載の物質変換方法。

【請求項5】

前記親水性の基質が前記糸状菌により親水性の化合物に変換されて、当該化合物が前記水層に蓄積されることを特徴とする請求項１または２に記載の物質変換方法。

【請求項6】

前記親水性の基質が前記糸状菌により疎水性の化合物に変換されて、当該化合物が前記有機層に蓄積されることを特徴とする請求項３または４に記載の物質変換方法。

【請求項7】

培養槽に、水溶液と、前記水溶液よりも比重の小さい第１の合成高分子微粒子と、前記第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、前記水溶液から形成される水層の液面に、糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合層を形成するステップと、
疎水性の基質および疎水性の有機溶媒を含む有機層を、前記複合層の上面に重層するステップと、
前記複合層中の糸状菌を生体触媒として、前記疎水性の基質を反応させるステップと、を含み、
前記第２の合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂を含み、平均粒径が１０μｍ〜５００μｍ、水の接触角が７５°以上、総イオン交換容量が１．０ｍｅｑ／ｇ以上であることを特徴とする物質変換方法。

【請求項8】

前記疎水性の基質が前記糸状菌により親水性の化合物に変換されて、当該化合物が前記水層に蓄積されることを特徴とする請求項７に記載の物質変換方法。

【請求項9】

前記疎水性の基質が前記糸状菌により疎水性の化合物に変換されて、当該化合物が前記有機層に蓄積されることを特徴とする請求項７に記載の物質変換方法。

【請求項10】

培養槽に、親水性の基質を含む水溶液と、前記水溶液よりも比重の小さい合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、前記水溶液から形成される水層の液面に、糸状菌／合成高分子微粒子の複合層を形成するステップと、
前記複合層中の糸状菌を生体触媒として、前記親水性の基質を反応させるステップと、を含み、
前記合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂を含み、平均粒径が１０μｍ〜５００μｍ、水の接触角が７５°以上、総イオン交換容量が１．０ｍｅｑ／ｇ以上であることを特徴とする物質変換方法。

【請求項11】

培養槽に、水溶液と、前記水溶液よりも比重の小さい合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、前記水溶液から形成される水層の液面に、糸状菌／合成高分子微粒子の複合層を形成するステップと、
疎水性の基質および有機溶媒を含む有機層を、前記複合層の上面に重層するステップと、
前記複合層中の糸状菌を生体触媒として、前記疎水性の基質を反応させるステップと、を含み、
前記合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂を含み、平均粒径が１０μｍ〜５００μｍ、水の接触角が７５°以上、総イオン交換容量が１．０ｍｅｑ／ｇ以上であることを特徴とする物質変換方法。

【請求項12】

培養槽に、水溶液と、糸状菌と、前記水溶液よりも比重の小さい第１の合成高分子微粒子と、前記第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、を添加し、前記水溶液の水面に糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットを形成するステップを含み、
前記第２の合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂を含み、平均粒径が１０μｍ〜５００μｍ、水の接触角が７５°以上、総イオン交換容量が１．０ｍｅｑ／ｇ以上であることを特徴とするバイオリアクタの製造方法。

【請求項13】

培養槽と、
前記培養槽に収容された水溶液と、
前記水溶液の液面に形成された複合マットと、を備え、
前記複合マットは、
糸状菌と、
前記水溶液よりも比重が小さい第１の合成高分子微粒子と、
前記第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、を含み、
前記複合マットは、前記第１の合成高分子微粒子と、前記糸状菌および前記第２の合成高分子微粒子とが複合体となることにより、前記水溶液の液面に形成され、
前記第２の合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂を含み、平均粒径が１０μｍ〜５００μｍ、水の接触角が７５°以上、総イオン交換容量が１．０ｍｅｑ／ｇ以上であることを特徴とするバイオリアクタ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糸状菌を用いて物質変換を行う技術に関する。

【背景技術】

【0002】

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属あるいはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に代表される糸状菌は、古来より醤油や味噌、酒類やチーズ等の食品の製造に欠くことのできない重要な微生物である。また、ゲノムサイズが大きく、属種の多様性が非常に大きい糸状菌は、上記の食品産業以外にも、抗生物質や抗脂血症治療薬原料等の医薬品原料、香料等の化粧品原料、あるいは難分解性の有害物質の分解除去等、多岐にわたる産業分野で利用可能な有用微生物群である。

【0003】

しかしながら、自然界において通常固体の表面に付着した状態で増殖する糸状菌を液体培養法を用いて培養する場合、その形態をうまく制御することが非常に困難となる。糸状菌の菌形態には、ペレット状、フィラメント状、およびアグリゲート状等がある。これらのうち、前二者が物質生産に適した菌形態であるが、どちらがより好適であるかは菌種や標的とする生成物によって異なる。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）によるペクチナーゼの生産や、リゾプス・アーヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）によるフマル酸の生産には、フィラメント状の菌形態が適している。一方、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）によるクエン酸の生産や、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）によるセルラーゼの生産には、ペレット状の菌形態が適している（非特許文献１）。

【0004】

菌形態がフィラメント状に制御された場合には培養液粘度の著しい上昇が生じるため、酸素や生成物の拡散障害や発酵熱の蓄熱が問題となる（非特許文献２）。また、強撹拌によって糸状菌の遊離菌糸が損傷を受けることも深刻な問題である（非特許文献３）。

【0005】

一方、菌形態がペレット状に制御できた場合には、フィラメント状形態の場合に見られる培養液粘度の上昇は生じない。そのため、培養を安定的に推移させることができる（非特許文献４）。しかしながら、ペレットが大きくなり粒径が２μｍを超えると、ペレット内部での酸素や栄養源の欠乏が顕著になるため、ペレット内部の糸状菌細胞が死滅する（非特許文献５）。従って、ペレット状、あるいはフィラメント状に菌形態を制御するという問題以前に、細菌や酵母の液体培養とは異質な、糸状菌の液体培養に特有の問題が存在すると考えられる。

【0006】

上記の液体培養法とは異なる糸状菌の培養法として、固体培養法、液面培養法、膜面液体培養法、固／液界面培養法等のいくつかの手法が提案されている。

【0007】

固体培養法とは、農産（廃棄物）あるいはポリウレタンフォームのような不活性担体を固体基質として用い、その表面に糸状菌を増殖させて物質生産に利用する手法である（非特許文献６）。固体培養法は液体培養法と比較して、標的物質の生産性が高い、生産された標的酵素のプロテアーゼによる分解を受け難い、エネルギー消費が低い、製造設備が安価である、あるいはカタボライト抑制を受け難いなど、いくつかの長所がある（非特許文献７）。しかし固体培養法では、固体基質ベッド内部における低水分活性、低酸素濃度、低物質拡散速度、あるいは蓄熱の問題などが生じる上に、製造設備のスケールアップにも難点がある（非特許文献８）。

【0008】

液面培養法とは、液体培地液面に自然に形成された糸状菌マットを物質生産に利用する方法である。液面培養法を用いると、標的物質の生産性が液体培養を凌ぐ場合がある（非特許文献９）。しかしながら、液面に十分量の糸状菌マットを形成させるためには長期間を要するうえに、形成された糸状菌マットは非常に脆弱である。そのため、液面培養法を大規模な物質生産に適用するのは困難であった。

【0009】

膜面液体培養法とは、液体培地液面に多孔性の高分子膜を設置し、その膜面に糸状菌を増殖させる方法である。膜面液体培養法は、優れた発酵生産能を示すことが報告されている（非特許文献１０）。しかしこの手法にも、糸状菌の栄養菌糸による多孔性高分子膜細孔の閉塞や、スケールアップ困難などの問題点があった。

【0010】

固／液界面培養法とは、栄養寒天平板のような親水性担体とパラフィンのような低毒性の疎水性の有機溶媒との固／液界面に微生物を増殖させる方法である。固／液界面培養法では、疎水性有機層中に添加した脂溶性（疎水性）の基質の毒性を著しく回避することができる（非特許文献１１）。固／液界面培養法を微生物を用いた物質変換に適用した場合、液体培養法と比較して著しく高い基質添加量と産物蓄積量が達成される（非特許文献１２）。しかしながら、この手法にも、担体中に蓄積する副生物（有機酸等）の毒性発現やｐＨの低下（非特許文献１３）、あるいは担体中への栄養源の追加不能といった問題点が認められていた（非特許文献１４）。

【0011】

これら種々の糸状菌の培養や利用法に関する問題点を調和的に克服し得るシステムとして、本発明者らは糸状菌を培養し利用するシステムを提案してきた。これらのシステムでは、ポリアクリロニトリル製で中空構造を有する合成高分子微粒子（以下、中空型合成高分子微粒子ともいう）の速やかな液面への浮上性を利用して、培地中に懸濁させた糸状菌細胞を液面に形成された中空型合成高分子微粒子層中にトラップさせ、所定時間の前培養によって糸状菌と中空型合成高分子微粒子の複合マットを形成させる（特許文献１、２）。この複合マットを利用して、液体培地中の栄養源から水溶性の二次代謝物や酵素を生産し、液体培地中に高濃度で蓄積させるシステムが、液面固定化（ＬＳＩ）システムである（特許文献３、非特許文献１５）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】増田俊明ら、特開２００９?１１３０３７号公報

【特許文献2】野村貫通ら、特開２０１１?２５６２２４号公報

【特許文献3】小田忍、熊谷博行、特開２００８?２９２５１号公報

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｚｎｉｓａｒｓｉｃ，Ｐ．，Ｐａｖｋｏ，Ａ．，Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９：２３７（２００１）

【非特許文献2】Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１４：２３３（１９９８）

【非特許文献3】Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｐ．，Ｍｏｌｉｎ，Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．，１３：８５（２００３）

【非特許文献4】Ｈｏｓｏｂｕｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７６：４７０（１９９３）

【非特許文献5】Ｘｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１６：２２２（２０００）

【非特許文献6】Ｈoｌｋｅｒ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６４：１７５（２００４）

【非特許文献7】Ｍａｈａｄｉｋ，Ｎ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３８：７１５（２００２）

【非特許文献8】Ｇｅｌｍｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５：１２２７（２０００）

【非特許文献9】Ｃｉｅｇｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３９：２８５（１９８０）

【非特許文献10】Ｏｇａｗａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８０：３５（１９９５）

【非特許文献11】Ｏｄａ，Ｓ．，Ｏｈｔａ，Ｈ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｃｏｈｅｍ．，５６：１５１５（１９９２）

【非特許文献12】Ｏｄａ，Ｓ，Ｏｈｔａ，Ｈ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：２０４１（１９９２）

【非特許文献13】Ｏｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１：１７８（２００１）

【非特許文献14】Ｏｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８７：４７３（１９９９）

【非特許文献15】Ｏｄａ，Ｓ．，Ｉｓｓｈｉｋｉ，Ｋ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４２：１５５３（２００７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

上述したＬＳＩシステムを含む糸状菌の培養システムでは、生成物の生産率のさらなる向上が望まれている。筆者らは、これらの糸状菌の培養システムにおいて汎用性および生産率をさらに向上させるために、空気／液体培地の表面や、疎水性の有機溶媒／液体培地の界面の物性、例えば、親水／疎水バランスや荷電状態に改善の余地を見出した。

【0015】

本発明はこうした状況に鑑みてなされており、その目的とするところは、糸状菌を生体触媒として、基質を効率良く物質変換する技術を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0016】

上記課題を解決するために、本発明のある態様の物質変換方法は、培養槽に、親水性の基質を含む水溶液と、水溶液よりも比重の小さい第１の合成高分子微粒子と、第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、水溶液から形成される水層の液面に、糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子を含む複合層を形成するステップと、複合層中の糸状菌を生体触媒として、親水性の基質を反応させるステップと、を含む。なお、本明細書中で物質変換とは、糸状菌を生体触媒として、基質を別の物質に変換することをいう。具体的には、たとえば栄養源でもあるグルコースを基質として用いて、代謝によりクエン酸に変換することをいう。

【0017】

この態様によると、糸状菌を生体触媒として、基質を効率良く物質変換することができる。また、液体培養法とは異なり、カタボライト抑制と標的酵素のプロテアーゼによる分解の両問題を効果的に回避することができる。物質変換に最適な親水／疎水バランスや荷電状態は、使用する糸状菌、発酵および微生物変換反応の種類によって大きく異なることが想定される。しかし、たとえば第２の合成高分子を粉砕および分級することによって、第２の合成高分子微粒子の粒径を任意に設定して任意の割合で混合すれば、液体培地の液面に形成される高分子微粒子層の荷電状態を任意に変動させることができる。そのため、本実施の形態の物質変換方法を用いれば、糸状菌や発酵および微生物変換反応の種類に応じたオーダーメイドな物質変換を容易に行うことができる。

【0018】

物質変換方法において、第１の合成高分子微粒子は、中空構造を有してもよい。この態様によると、より安定して複合層を形成させることができる。

【0019】

物質変換方法において、第２の合成高分子微粒子は、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリスチレン、およびポリ塩化ビニルの少なくとも１つを含んでもよい。この態様によると、物質変換の効率を高めることができる。

【0020】

物質変換方法において、第２の合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂を含んでもよい。この態様によると、物質変換の効率を高めることができる。

【0021】

物質変換方法において、第２の合成高分子微粒子は、平均粒径が１０μｍ〜５００μｍ、真比重が０．０７〜１．３０、水の接触角が７５°以上、総イオン交換容量が１．０ｍｅｑ／ｇ以上であってもよい。この態様によると、物質変換の効率をさらに高めることができる。

【0022】

物質変換方法において、疎水性の有機溶媒を含む有機層を、複合層の液面に重層するステップをさらに含んでもよい。この態様によると、疎水性の基質を物質変換させることができる。

【0023】

物質変換方法において、疎水性の有機溶媒が、炭素数６以上１８以下の直鎖状または分岐状パラフィン類、粘度２ｃＰ以下の疎水性シリコンオイル、炭素数１０以上１８以下の脂肪族エーテル類およびエステル類から選択されてもよい。この態様によると、有機溶媒が糸状菌の成長に及ぼす影響を抑止し、物質変換の効率を高めることができる。

【0024】

物質変換方法において、親水性の基質が糸状菌により親水性の化合物に変換されて、当該化合物が水層に蓄積されてもよい。この態様によると、親水性の基質を用いて物質変換により親水性の生成物を得ることができる。

【0025】

物質変換方法において、親水性の基質が糸状菌により疎水性の化合物に変換されて、当該化合物が有機層に蓄積されてもよい。この態様によると、親水性の基質を用いて物質変換により疎水性の生成物を得ることができる。

【0026】

本発明の別の態様も、物質変換方法である。この物質変換方法は、培養槽に、水溶液と、水溶液よりも比重の小さい第１の合成高分子微粒子と、第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、水溶液から形成される水層の液面に、糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合層を形成するステップと、疎水性の基質および疎水性の有機溶媒を含む有機層を、複合層の上面に重層するステップと、複合層中の糸状菌を生体触媒として、疎水性の基質を反応させるステップと、を含む。

【0027】

本発明の別の態様も、物質変換方法である。この物質変換方法は、培養槽に、親水性の基質を含む水溶液と、水溶液よりも比重の小さい合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、水溶液から形成される水層の液面に、糸状菌／合成高分子微粒子の複合層を形成するステップと、複合層中の糸状菌を生体触媒として、親水性の基質を反応させるステップと、を含む。合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニルの少なくとも１つを含む。

【0028】

本発明の別の態様も、物質変換方法である。この物質変換方法は、培養槽に、水溶液と、水溶液よりも比重の小さい合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、水溶液から形成される水層の液面に、糸状菌／合成高分子微粒子の複合層を形成するステップと、疎水性の基質および有機溶媒を含む有機層を、複合層の上面に重層するステップと、複合層中の糸状菌を生体触媒として、疎水性の基質を反応させるステップと、を含む。合成高分子微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、三級アミノ基を陰イオン交換基として有するアニオン交換樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニルの少なくとも１つを含む。

【0029】

本発明の別の態様は、バイオリアクタの製造方法である。このバイオリアクタの製造方法は、培養槽に、水溶液と、糸状菌と、水溶液よりも比重の小さい第１の合成高分子微粒子と、第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、を添加し、水溶液の水面に糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットを形成するステップを含む。

【0030】

本発明の別の態様は、バイオリアクタである。このバイオリアクタは、培養槽と、培養槽に収容された水溶液と、水溶液の液面に形成された複合マットと、を備える。複合マットは、糸状菌と、水溶液よりも比重が小さい第１の合成高分子微粒子と、第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、を含む。複合マットは、第１の合成高分子微粒子と、糸状菌および第２の合成高分子微粒子とが複合体となることにより、水溶液の液面に形成される。

【0031】

なお、上述した各要素を適宜組み合わせたものも、本件特許出願によって特許による保護を求める発明の範囲に含まれうる。

【発明の効果】

【0032】

本発明によれば、基質を効率良く物質変換することができる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、第１の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。図１（Ｂ）は、第２の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。図１（Ｃ）は、第３の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。図１（Ｄ）は、第４の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。

【図2】物質変換により生成した化合物の量を示すグラフである。図２（Ａ）は、実施例１および比較例１の実験において、物質変換により生成した化合物の量を示すグラフである。図２（Ｂ）は、実施例２および比較例２の実験において、物質変換により生成した化合物の量を示すグラフである。図２（Ｃ）は、実施例３および比較例３の実験において、物質変換により生成した化合物の量を示すグラフである。図２（Ｄ）は、実施例４および比較例４の実験において、物質変換により生成した化合物の量を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、図面を参照しながら、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、図面の説明において重複する説明は適宜省略する。

【0035】

（第１の実施の形態）
本実施の形態の物質変換方法は、培養槽１２に、親水性の基質を含む水溶液と、水溶液よりも比重の小さい第１の合成高分子微粒子と、第１の合成高分子微粒子とは疎水度およびゼータ電位の少なくとも一方が異なる第２の合成高分子微粒子と、糸状菌と、を添加し、水溶液から形成される水層２０の液面に、糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子を含む複合層３０を形成するステップと、複合層３０中の糸状菌を生体触媒として、親水性の基質を反応させるステップと、を含む。

【0036】

図１（Ａ）は、第１の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。

【0037】

本物質変換方法では、バイオリアクタ１０を使用する。バイオリアクタ１０は、培養槽１２と、水層２０と、複合層３０とを含む。培養槽１２は、糸状菌を培養して物質変換を行うための培養反応器である。水層２０は、水と糸状菌に供給される栄養源とを含む水溶液である液体培地から形成される。また、本実施の形態では、水層２０は糸状菌を生体触媒として物質変換される親水性の基質Ｘも含む。親水性の基質Ｘは、栄養源自体であってもよい。複合層３０は、糸状菌と、第１の合成高分子微粒子と、第２の合成高分子微粒子とから形成されたマット状の複合体である。第１の合成高分子微粒子は、水溶液よりも比重が小さく、糸状菌および第２の合成高分子微粒子と複合体を形成することにより、糸状菌を水溶液の液面に浮かせることができる。本明細書中で比重とは、中空構造を有する微粒子の場合にはその内部に含まれる気体も考慮した値をいう。一方、真比重とは、微粒子を粉末にした場合の比重、つまり内部に含まれる気体を考慮しない値をいう。また、第２の合成高分子微粒子は、第１の合成高分子微粒子とは疎水性の程度（以下、疎水度）および荷電状態の少なくとも一方が異なる。本明細書中で荷電状態が異なるとは、具体的にはゼータ電位が異なることをいう。ゼータ電位の測定には、たとえばゼータ電位・粒径測定システム（ＥＬＳＺ−２、大塚電子株式会社）を用いることができる。

【0038】

次に、バイオリアクタ１０の製造方法を説明する。本実施の形態では、まず第１の合成高分子微粒子と第２の合成高分子微粒子とを培養槽１２中にて任意の割合にて混合し、得られた混合物に極少量の水分を添加する。次に培養槽１２を密栓し、高圧蒸気滅菌を行う。任意の組成の液体培地と所定量の糸状菌の菌体懸濁液とを混合し、滅菌後の培養槽１２に注入する。混合液中の糸状菌の菌体と第２の合成高分子微粒子とが第１の合成高分子微粒子の液面浮上に伴って浮上し、液体培地の液面に固定化されることにより、複合層３０が形成される。任意の温度で所定の時間静置培養することにより、複合層３０中の糸状菌は液体培地中の栄養源と水を使って増殖する。これにより、水層２０の液面に物理的に強固な糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合層３０が形成される。以下、物理的に強固な状態となった複合層３０を特に、複合マットと呼ぶ。なお、図１（Ａ）に示したバイオリアクタ１０が製造できるのであれば、各物質を加える順序や滅菌方法はここで示したものに限られない。

【0039】

本実施の形態に使用される第１の合成高分子微粒子として、例えば特開２００８?２９２５１号公報に記載の諸製品などを好適に用いることができる。ただし、複合マットを形成した上で、比較的比重の大きな第２の高分子微粒子を水層２０の液面に浮上させる必要がある。そのため、特に比重の軽い中空構造を有する合成高分子微粒子を用いることが好ましい。具体的には、平均粒径が約２０〜約４０μｍ、真比重が約０．１以下（比重が約０．０６以下）の中空構造を有する合成高分子微粒子が好ましい。これらの性質を満たす第１の合成高分子微粒子として、例えばＭＭＦ−ＤＥ−１（松本油脂製薬株式会社製、平均粒径３０μｍ、真比重０．０６）、ＭＦＬ−８０ＧＣＡ（松本油脂製薬株式会社製、炭酸カルシウムコート型、平均粒径２０μｍ、真比重０．２）が挙げられる。

【0040】

本実施の形態に使用される第２の合成高分子微粒子として、例えばポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリスチレン、およびポリ塩化ビニルから形成される微粒子を好適に用いることができる。このような第２の合成高分子微粒子として、たとえばポリメチルメタクリレートＨＢＳ０００（三菱レーヨン社製）、低密度ポリエチレン４５，２００（プライムポリマー社製）、高密度ポリエチレンＨＪ５６０Ｕ６６４１４（ノバティックＨＤ社）、ポリビニルクロライド２２３−００２５５（和光純薬工業社製）、ポリスチレン４４１１４７−１ＫＧ（アルドリッチ社製）が挙げられる。

【0041】

また、第２の合成高分子微粒子として、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリメチルメタクリレートを基体樹脂とし、表面に三級アミノ基を陰イオン交換基として有するイオン交換樹脂（以下、アニオン交換樹脂ともいう）も好適に用いることができる。アニオン交換樹脂を使用する場合、平均粒径が約１０μｍ〜約５００μｍ、真比重が約０．０５〜約１．３０、水の接触角が約７５°以上、総イオン交換容量が約１．０ｍｅｑ／ｇ以上であることが好ましい。また、平均粒径が約１０μｍ〜約１００μｍ、真比重が約０．０７〜約０．２０のアニオン交換樹脂を使用することがより好ましい。

【0042】

本実施の形態に使用される第２の合成高分子微粒子は、粒子表面の疎水度に基づいて選定される。この場合、併用される第１の合成高分子微粒子の表面の疎水度を基準として第２の合成高分子微粒子を選ぶことができる。第２の合成高分子として、基体樹脂とする第１の合成高分子微粒子とは接触角の値が異なる物質を用いることが好ましい。例えば、第１の合成高分子微粒子としてポリアクリロニトリル（５０〜６０°）を用いる場合、第２の合成高分子としてポリメチルメタクリレート（６０〜７０°）、ポリエチレン（７０〜８０°）、ポリスチレン（８０〜９０°）等を使用する。これにより、各粒子の種類や配合比によって、複合マットの疎水性を任意に設定することが可能となる。

【0043】

また、第２の合成高分子を粉砕および分級することによって、第２の合成高分子微粒子の粒径を任意に設定し、複合層中の疎水性領域（ドメイン）のサイズを任意に設定してもよい。たとえば、上述した第２の合成高分子を、粒径１００μｍ以下または粒径５０μｍ以下に粉砕および分級して使用する。これにより、適用する糸状菌の種類や標的とする発酵あるいは微生物変換の種類に応じて、オーダーメード的な対応を図ることができる。

【0044】

また、第１の合成高分子微粒子と第２の合成高分子微粒子との混合比は、任意に選択することができる。複合マットを水層２０の液面に安定して浮上させるためには、両者の混合比はたとえば約１：１〜約１〜１０であることが好ましい。なお、複合マットの疎水性を変動させるために配合する第２の合成高分子微粒子を、第１の合成高分子微粒子として用いることもできる。この場合、第１の合成高分子微粒子を用いず第２の高分子微粒子のみを用いてもよい。またこの場合、中空構造を有する第２の合成高分子微粒子を使用することが特に好ましい。

【0045】

また、本実施の形態に使用される液体培地の組成は、使用する糸状菌の種類に応じて選定される。液体培地として、真菌類の培養に一般に用いられる培地、例えば、サブロー培地、ＹＭ培地、ＹＰＤ培地、ポテトデキストロース培地等を好適に使用することができる。

【0046】

本実施の形態に使用される糸状菌としては、菌糸の形成能を有し、第１の合成高分子微粒子と第２の合成高分子微粒子とを菌糸により結合するように成長し、物理的に強固な糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットを形成できるものであれば、特に制約はない。標的とする発酵能もしくは微生物変換能を備えているか否かが、採択の基準となる。糸状菌として、例えば様々な酵素や有機酸の生産性に優れるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やリゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、抗生物質等の生物活性二次代謝物の生産性に優れるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の糸状菌を用いることができる。植菌時における糸状菌の形態には特に制限はなく、胞子状であってもよいし菌糸状であってもよい。

【0047】

次に、バイオリアクタ１０を用いた物質変換について説明する。形成された複合マット中の糸状菌の働きにより、親水性の基質Ｘは、糸状菌を生体触媒として、目的物である生成物Ｘ’に物質変換される。

【0048】

糸状菌と親水性の基質Ｘとを適宜組み合わせることにより、様々な生成物Ｘ’が得られる。親水性の基質Ｘとしてたとえば液体培地中の栄養源を用いることにより、抗生物質等の有用二次代謝物、有機酸やアミノ酸等の一次代謝物、さらには、グルコシダーゼやリパーゼ等の有用酵素を効率的に生産し、水層２０中に高濃度で蓄積させることができる（ＬＳＩシステム）。

【0049】

本実施の形態のＬＳＩシステムを用いた物質変換の例としては、たとえば栄養源でもあるグルコースを基質として用いて、クエン酸を生成する反応が挙げられる。

【0050】

以上、本実施の形態の物質変換方法によれば、糸状菌を生体触媒として、基質を効率良く物質変換することができる。また、液体培養法とは異なり、カタボライト抑制と標的酵素のプロテアーゼによる分解の両問題を効果的に回避することができる。物質変換に最適な親水／疎水バランスや荷電状態は、使用する糸状菌、発酵および微生物変換反応の種類によって大きく異なることが想定される。しかし、第２の合成高分子を粉砕および分級することによって、第２の合成高分子微粒子の粒径を任意に設定して任意の割合で混合すれば、液体培地の液面に形成される高分子微粒子層の荷電状態を任意に変動させることができる。そのため、本実施の形態の物質変換方法を用いれば、糸状菌や発酵および微生物変換反応の種類に応じたオーダーメイドな物質変換を容易に行うことができる。

【0051】

（第２の実施の形態）
図１（Ｂ）は、第２の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。

【0052】

本実施の形態では、第１の実施の形態のバイオリアクタ１０において、複合層３０の上面に有機層４０を積層した構造を有する。有機層４０は、微生物に対して実質的に毒性を示さない疎水性の有機溶媒を含む。

【0053】

有機層４０と水層２０との液／液界面に位置する複合層３０中の糸状菌は、水層２０から栄養源と水、有機層４０に接した大気から酸素の供給をそれぞれ受けて活発な代謝活動を続け、標的とする生成物Ｘ’を高濃度で生産および蓄積することができる。本実施の形態では、親水性の基質Ｘから疎水性の二次代謝物である生成物Ｘ’が有機層４０に蓄積される（Ｅｘｔ−ＬＳＩシステム）。

【0054】

本実施の形態のＥｘｔ−ＬＳＩシステムを用いた物質変換の例としては、たとえば基質としてグルコースを用いて６−ペンチル−α−ピロンを生成する発酵が挙げられる。

【0055】

疎水性の有機溶媒としては、糸状菌に対して実質的に毒性を示さず生育を阻害しない溶媒を用いることが好ましい。このような疎水性の有機溶媒としては、３以上、好ましくは４以上のＬｏｇＰ値を有する疎水性の有機溶媒であれば特に制約はない。例えば、ノナン、デカン、ウンデカン等の直鎖状あるいは分岐状パラフィン類やジヘキシルエーテル等の中鎖脂肪族エーテル類、酢酸２−エチルヘキシル等の中鎖脂肪族エステル類、あるいは、ＫＦ−９６Ｌ−１ＣＳ等の低粘性ジメチルシルコンオイルを好適に使用することができる。疎水性の有機溶媒として、炭素数６以上１８以下の直鎖状または分岐状パラフィン類、粘度２ｃＰ以下の疎水性シリコンオイル、炭素数１０以上１８以下の脂肪族エーテル類およびエステル類のいずれかを使用することが、微生物に対しする無毒性、コスト、原料と生成物の溶解性の高さ、室温では揮発しないが減圧蒸留できる程度の適度な沸点、人体に対する無毒性等の観点から特に好ましい。

【0056】

以上、本実施の形態の物質変換方法によっても、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。加えて、有機層４０が疎水性の二次代謝物の抽出溶媒層およびリザーバー層として機能するため、生成物阻害あるいはフィードバック阻害を効果的に回避することができる。

【0057】

（第３の実施の形態）
図１（Ｃ）は、第３の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。

【0058】

本実施の形態では、水層２０ではなく有機層４０に疎水性の基質Ｘを加える点が、第２の実施の形態のバイオリアクタ１０とは異なる。

【0059】

本実施の形態のバイオリアクタ１０によると、疎水性の基質Ｘから疎水性の生成物Ｘ’が生成され、有機層４０に蓄積される（Ｌ−Ｌ ＩＢＲ）。

【0060】

本実施の形態のＬ−Ｌ ＩＢＲを用いた物質変換の例としては、たとえば基質としてノルマルデカンを用いて５−デカノールと５−デカノンを生成する反応、基質としてベンジルを用いてベンゾインを生成する反応、基質としてノルマルノナンを用いて２−ノナノン、３−ノナノン、４−ノナノン、２−ノナノール、３−ノナノール、４−ノナノールを生成する反応が挙げられる。

【0061】

以上、本実施の形態の物質変換方法によっても、第２の実施の形態と同様に、有機層４０は反応溶媒として機能するだけでなく、基質Ｘや生成物Ｘ’のリザーバーとして機能する。つまり、疎水性の基質Ｘは糸状菌に対して毒性を有することが多いが、有機層４０により糸状菌と接する基質Ｘの濃度が希釈される。そのため、糸状菌の生存に影響を与えない基質Ｘとして、様々な物質を選択することができる。また、有機層４０中に添加できる基質Ｘの濃度および有機層４０中に蓄積される生成物Ｘ’の濃度は、従来の液体培養法と比較して飛躍的に向上する。Ｌ−Ｌ ＩＢＲによると、複合層３０と有機層４０の界面に位置する糸状菌は生育を阻害されずに活発に代謝活動を行うことができる。そのため、酸化還元反応のような補酵素要求性の反応や誘導酵素反応等も問題なく触媒することができる。Ｌ−Ｌ ＩＢＲによると、特に糸状菌が得意とする不活性炭素の水酸化反応のような高難易度な微生物変換反応を効率的に進行させることができる。また、Ｌ−Ｌ ＩＢＲによると、生成物の回収も有機層４０からの取り出しのみで済む。そのため、煩雑な溶媒抽出工程を省略することができる。

【0062】

（第４の実施の形態）
図１（Ｄ）は、第４の実施の形態に係る物質変換方法を模式的に示す図である。

【0063】

本実施の形態では、第３の実施の形態と同様に、有機層４０に疎水性の基質Ｘを加える（Ｌ−Ｌ ＩＢＲ）。一方、本実施の形態のバイオリアクタ１０によると、疎水性の基質Ｘから親水性の生成物Ｘ’が水層２０に蓄積される点が、第３の実施の形態とは異なる。

【0064】

本実施の形態のＬ−Ｌ ＩＢＲを用いた物質変換の例としては、たとえば基質としてβ−カリオフィレンを用いて（−）−β−カリオフィレンオキサイドを生成する反応が挙げられる。

【0065】

以上、本実施の形態の物質変換方法によっても、第３の実施の形態と同様の効果が得られる。

【0066】

なお、第１〜４の実施の形態では、水層２０の液面にあらかじめ第１の合成高分子微粒子と第２の合成高分子微粒子の複合粒子層を形成させ、その上に糸状菌を植菌することにより、複合層３０を形成してもよい。この形成方法は、特に、多数の糸状菌を対象とした微生物あるいは酵素のスクリーニング法として有効である。上述した各実施の形態では、液体培養法と比較して高い物質生産性を有している。また、通気や撹拌操作が不要であり、さらには溶媒抽出工程を省略できる。そのため、この形成方法は、多数の微生物を対象とした大規模スクリーニングに威力を発揮する。

【0067】

（用途）
上述した物質変換方法は、例えば、クエン酸やイタコン酸等の有機酸やｇ−デカラクトンや６−ペンチル−ａ−ピロン等の香料原料、あるいはメバスタチンやシクロスポリン等の医薬品原料の生産などに適用することが想定される。糸状菌を適宜選択することにより、これらの生産を容易に効率化することができる。

【0068】

糸状菌は様々な酵素の高生産性微生物として有用である。糸状菌は、たとえばアミラーゼやセルラーゼ等の糖質分解酵素の他、プロテアーゼ、リパーゼ等の高生産に好適である。上述した物質変換方法にこれら糸状菌を用いることにより、液体培養法はもちろん固体培養法をも凌ぐ生成物の高収率が達成可能となる。

【0069】

一方、微生物変換への分野への応用としては、一般的な反応種、例えば、エステルの加水分解、アルコールやアルデヒドの酸化、ケトンやオレフィンの還元等に限定されるものではない。糸状菌が得意する反応種、例えば、不活性炭素の水酸化やエポキシ化反応等、様々な反応種に利用することが可能である。

【実施例】

【0070】

以下、実施例１〜４では、複合マットの形成に第２の合成高分子微粒子を用い、基質としてそれぞれノルマルデカン（ｎ−ｄｅｃａｎｅ）、ベンジル（ｂｅｎｚｉｌ）、ノルマルノナン（ｎ−ｎｏｎａｎｅ）、グルコースを用いて、糸状菌を生体触媒として物質変換を行った実験結果を示す。また、比較例１〜４として、複合マットの形成に第２の合成高分子微粒子を用いずに、基質としてそれぞれ実施例１〜４と同じ物質を用いて物質変換を行った実験結果を示す。実施例１と重複する操作は適宜省略する。

【0071】

（実施例１）
グルコース４０ｇ、ペプトン１０ｇ、硫酸鉄５ｍｇ、硫酸マンガン２０ｍｇ、塩化カルシウム１０ｍｇ、逆浸透水１Ｌよりなる液体培地（ｐＨ６．０）５０ｍｌ、第１の合成高分子微粒子（ＭＭＦ−ＤＥ−１、松本油脂製薬株式会社製、平均粒径３０μｍ、真比重０．０６）１５０ｍｇ、第２の合成高分子微粒子［三菱レーヨン社製ポリメチルメタクリレートＨＢＳ０００の粉砕分級物（粒径１００μｍ以下）、プライムポリマー社製低密度ポリエチレン４５，２００の粉砕分級物（粒径１００μｍ以下）、ノバティックＨＤ社製高密度ポリエチレンＨＪ５６０Ｕ６６４１４の粉砕分級物（粒径１００μｍ以下）、あるいは和光純薬工業社製ポリビニルクロライド２２３−００２５５の粉砕分級物（粒径１００μｍ以下）］各７００ｍｇの混合物に、リゾープス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＮＢＲＣ４７１６の胞子懸濁液（１．２ｘ１０^６ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）１ｍｌを添加して、激しく混合後、直径６８ｍｍ、高さ５５ｍｍの深型ガラスシャーレに全量投入した。２５℃で３日間静置培養して当該糸状菌を発芽、成長させ、糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットを形成させた。その後、当該複合マットの上部に疎水性の基質としてノルマルデカンを２０ｍｌ重層し、２５℃で１週間静置培養した。ここで、培養器間で糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットの厚さを揃えるために、比重並びに粒径から換算して、各培養器中の第２の合成高分子微粒子の添加量は第１の合成高分子微粒子の５倍量とした。

【0072】

１週間の静置培養後、Ｓｕｐｅｌｃｏｗａｘ−１０（０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．ｘ６０ｍ）を装着したガスクロマトグラフィーを用いてノルマルデカンを含む有機層を直接分析することにより、物質変換により生成した化合物の量を測定した。

【0073】

その結果、ポリメチルメタクリレート微粒子配合系で１０．１１ｇ／Ｌの５−デカノール（５−ｄｅｃａｎｏｌ）と５．０９ｇ／Ｌの５−デカノン（５−ｄｅｃａｎｏｎｅ）、低比重ポリエチレン微粒子配合系で１７．４２ｇ／Ｌの５−デカノールと８．４１ｇ／Ｌの５−デカノン、高比重ポリエチレン微粒子配合系で１２．９８ｇ／Ｌの５−デカノールと５．３３ｇ／Ｌの５−デカノン、ポリビニルクロライド微粒子添加系で９．６２ｇ／Ｌの５−デカノールと３．９７ｇ／Ｌの５−デカノンの蓄積が確認された。

【0074】

（比較例１）
実施例１の比較対照として、第２の高分子微粒子を添加していない培養器（第１の合成高分子微粒子２００ｍｇ）と液体培養系（５００ｍｌの三角フラスコを用いて、培地、植菌量、ノルマルデカン量を揃えたもの）を設定した。実施例１と同じく、前培養３日後にノルマルデカンを２０ｍｌ添加して、第１の合成高分子微粒子のみを配合したＬ−Ｌ ＩＢＲは１週間の静置培養、液体培養系は１週間の振盪培養（２００ｒｐｍ）を行った。培養後、実施例１と同じ条件でガスクロマトグラフィーを用いてノルマルデカンを含む有機層を直接分析することにより、物質変換により生成した化合物の量を測定した。

【0075】

その結果、第２の合成高分子微粒子を配合していないＬ−Ｌ ＩＢＲでは、５−デカノールと５−デカノンの蓄積濃度がそれぞれ６．１５ｇ／Ｌと２．２６ｇ／Ｌであった。一方、液体培養系ではそれぞれ１．３６ｇ／Ｌと３．２６ｇ／Ｌであった。

【0076】

図２（Ａ）には、実施例１と比較例１の実験結果のまとめを示す。複合マットの形成に第２の合成高分子微粒子を用いることにより、物質変換の効率が飛躍的に向上することが確認された。

【0077】

（実施例２）
グルコース４０ｇ、トリプトン１０ｇ、硫酸鉄５ｍｇ、硫酸マンガン２０ｍｇ、塩化カルシウム１０ｍｇ、逆浸透水１Ｌよりなる液体培地（ｐＨ６．０）５０ｍｌ、第１の合成高分子微粒子（ＭＭＦ−ＤＥ−１、松本油脂製薬株式会社製、平均粒径３０μｍ、真比重０．０６）１５０ｍｇ、第２の合成高分子微粒子［三菱レーヨン社製ポリメチルメタクリレートＨＢＳ０００の粉砕分級物（粒径５０μｍ以下）、ノバルティックＨＤ社製高密度ポリエチレンＨＪ５６０ Ｕ６６４１４の粉砕分級物（粒径５０μｍ以下）、あるいはアルドリッチ社製ポリスチレン４４１１４７−１ＫＧ微粒子（粒径５０μｍ以下）］各７００ｍｇの混合物に、アスペルギルス・ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）ＮＢＲＣ３２０７４の３日培養液１ｍｌを添加して激しく混合後、直径６８ｍｍ、高さ５５ｍｍの深型ガラスシャーレに全量投入した。２５℃で３日間静置培養して糸状菌を発芽および成長させ、糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットを形成させた。その後、当該複合マットの上部に疎水性の基質として２％ベンジルのジヘキシルエーテル溶液２０ｍｌを重層し、２５℃で５日間静置培養した。実施例１と同様に、培養器間で糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットの厚さを揃えるために、比重並びに粒径から換算して、各培養器中の第２の合成高分子微粒子の添加量は第１の合成高分子微粒子の５倍量とした。

【0078】

５日間の静置培養後、Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−ＳＩＬ（４．６ｍｍ ｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ）カラムを装着した高速液体クロマトグラフィーを用いてジヘキシルエーテルを含む有機層を直接分析することにより、物質変換により生成した化合物の量を測定した。

【0079】

その結果、有機層中のベンゾイン（ｂｅｎｚｏｉｎ）の蓄積濃度は、ポリメチルメタクリレート微粒子配合系では１４．２２ｇ／Ｌ、高密度ポリエチレン微粒子配合系では１６．２１ｇ／Ｌ、ポリスチレン微粒子配合系では１５．７７ｇ／Ｌであった。

【0080】

（比較例２）
第２の高分子微粒子を添加せずに第１の合成高分子微粒子を２００ｍｇ用いた以外は実施例２と同様にして、５日間静置培養した。

【0081】

この場合、有機層中のベンゾインの蓄積濃度は、４．３３ｇ／Ｌであった。

【0082】

図２（Ｂ）には、実施例２と比較例２の実験結果のまとめを示す。複合マットの形成に第２の合成高分子微粒子を用いることにより、物質変換の効率が飛躍的に向上することが確認された。

【0083】

（実施例３）
グルコース４０ｇ、ペプトン１０ｇ、硫酸鉄５ｍｇ、硫酸マンガン２０ｍｇ、塩化カルシウム１０ｍｇ、逆浸透水１Ｌよりなる液体培地（ｐＨ６．０）５０ｍｌ、第１の合成高分子微粒子（ＭＭＦ−ＤＥ−１、松本油脂製薬株式会社製、平均粒径３０μｍ、真比重０．０６）１５０ｍｇ、第２の合成高分子微粒子（オルガノ社製陰イオン交換樹脂の粉砕分級物）［ＩＲＡ９１０ＣＴ ＣＬ（粒径５０μｍ以下）、ＩＲＡ９５８ＣＴ ＣＬ（粒径５０μｍ以下）］各５００ｍｇの混合物に、ボーベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）ＡＴＣＣ７１５９の３日間培養ブロス１ｍｌを添加して、激しく混合後、直径６８ｍｍ、高さ５５ｍｍの深型ガラスシャーレに全量投入した。２８℃で３日間静置培養して当該糸状菌を発芽、成長させて糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットを形成させた。その後、当該複合マットの上部に疎水性の基質としてノルマルノナンを２０ｍｌ重層し、２８℃で１週間、静置培養した。この場合、実施例１と同様に、培養器間で糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットの厚さを揃えるために、比重並びに粒径から換算して、各培養器中の第２の合成高分子微粒子の添加量は第１の合成高分子微粒子の５倍量とした。

【0084】

静止培養後、Ｓｕｐｅｌｃｏｗａｘ−１０（０．２５μｍ ｉ．ｄ．ｘ６０ｍ）を装着したガスクロマトグラフィーを用いて、ノルマルノナンを含む有機層を直接分析した。

【0085】

その結果、ＩＲＡ９１０ＣＴ ＣＬ配合系では、２−ノナノン、３−ノナノン、４−ノナノン、２−ノナノール、３−ノナノール、４−ノナノールの有機層における蓄積濃度は、それぞれ４．０８ｇ／Ｌ、３．２２ｇ／Ｌ、４．８１ｇ／Ｌ、０．９１ｇ／Ｌ、０．８６ｇ／Ｌ、０．９３ｇ／Ｌであった。一方、ＩＲＡ９５８ＣＴ ＣＬを第２の合成高分子微粒子として配合した場合には、２−ノナノン、３−ノナノン、４ノナノン、２−ノナノール、３−ノナノール、４−ノナノールの有機層における蓄積濃度は、それぞれ５．１１ｇ／Ｌ、４．６５ｇ／Ｌ、４．０６ｇ／Ｌ、０．８８ｇ／Ｌ、１．１５ｇ／Ｌ、１．１２ｇ／Ｌであった。

【0086】

（比較例３）
第２の高分子微粒子を添加せずに第１の合成高分子微粒子を２００ｍｇ用いた以外は実施例３と同様にして、５日間静置培養した。

【0087】

この場合、２−ノナノン、３−ノナノン、４−ノナノン、２−ノナノール、３−ノナノール、４−ノナノールの有機層における蓄積濃度は、それぞれ０．９４ｇ／Ｌ、０．６３ｇ／Ｌ、０．４８ｇ／Ｌ、０．２３ｇ／Ｌ、０．１８ｇ／Ｌ、０．３７ｇ／Ｌであった。

【0088】

図２（Ｃ）には、実施例３と比較例３の実験結果のまとめを示す。複合マットの形成に第２の合成高分子微粒子を用いることにより、物質変換の効率が飛躍的に向上することが確認された。

【0089】

（実施例４）
糸状菌の栄養源であると同時に本実施例では基質でもあるグルコース１００ｇ、リン酸二水素カリウム１０ｇ、硝酸ナトリウム２ｇ、塩化アンモニウム２ｇ、硫酸マグネシウム２５０ｍｇ、硫酸鉄５０ｎｇ、硫酸マンガン２００ｎｇ、塩化カルシウム１００ｎｇ、水１Ｌ（ｐＨ６．０）よりなる液体培地５０ｍｌに、第１の合成高分子微粒子（ＭＦＬ−８０ＧＣＡ、松本油脂製薬株式会社製、炭酸カルシウムコート型、平均粒径２０μｍ、真比重０．２）０．５ｇ、充填合成高分子微粒子（オルガノ社製陰イオン交換樹脂粉砕の分級物）［ＩＲＡ９１０ＣＴ ＣＬ（粒径５０μｍ以下）、ＩＲＡ９５８ＣＴ ＣＬ（粒径５０μｍ以下）］各５００ｍｇの混合物に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＮＢＲＣ ６３４１の胞子懸濁液（１．２ｘ１０^６ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）１ｍｌを添加して、激しく混合後、直径６８ｍｍ、高さ５５ｍｍの深型ガラスシャーレに全量投入した。２５℃で３日間静置培養して当該糸状菌を発芽、成長させて糸状菌／第１の合成高分子微粒子／第２の合成高分子微粒子の複合マットを形成させた。静置条件下、２８℃で１週間培養した。

【0090】

培養後、水層中のクエン酸の生産量をＦ−キット・クエン酸（Ｊ．Ｋ．インターナショナル株式会社）で定量することにより、物質変換により生成した化合物の量を測定した。

【0091】

その結果、ＩＲＡ９８ＣＴ ＣＬ配合系では８７．９ｇ／Ｌ、ＩＲＡ９１０ＣＴ ＣＬ配合系では７２．３ｇ／Ｌのクエン酸の蓄積が認められた。

【0092】

（比較例４）
同様の組成の液体培地５０ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに分注し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＮＢＲＣ６３４１の胞子懸濁液（１．２ｘ１０^６ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）１ｍｌを添加して、２８℃、２００ｒｐｍで１週間振盪培養した。その後、遠心分離によって菌体を除去し、得られた上清中のクエン酸をＦ−キット・クエン酸を用いて定量することにより、物質変換により生成した化合物の量を測定した。

【0093】

その結果、水層中に２５．４ｇ／Ｌのクエン酸の蓄積が認められた。

【0094】

図２（Ｄ）には、実施例４と比較例４の実験結果のまとめを示す。複合マットの形成に第２の合成高分子微粒子を用いることにより、物質変換の効率が飛躍的に向上することが確認された。

【0095】

以上、本発明を上述の実施の形態を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態に限定されるものではなく、実施の形態の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態における組合せや工程の順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれうる。

【図1】

【図2】