特許 5789192 ヒト化抗ＩＬ−６抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5789192

(24)【登録日】2015年8月7日

(45)【発行日】2015年10月7日

(54)【発明の名称】ヒト化抗ＩＬ−６抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/24 20060101AFI20150917BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 47/08 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 27/14 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 9/08 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150917BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20150917BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20150917BHJP

   A01H 5/00 20060101ALI20150917BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150917BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/24ZNA

   A61K39/395 U

   A61K45/00

   A61K47/02

   A61K47/08

   A61K47/10

   A61K47/12

   A61K47/18

   A61K9/08

   A61K9/19

   A61K47/24

   A61P19/02

   A61P29/00 101

   A61P1/04

   A61P37/02

   A61P27/02

   A61P15/08

   A61P37/08

   A61P11/06

   A61P11/02

   A61P17/00

   A61P27/14

   A61P11/00

   A61P37/06

   A61P31/04

   A61P31/10

   A61P13/02

   A61P7/00

   A61P17/02

   A61P1/18

   A61P1/16

   A61P29/00

   A61P7/06

   A61P3/10

   A61P17/04

   A61P7/04

   A61P9/08

   A61P21/04

   A61P19/10

   A61P17/06

   A61P17/14

   A61P13/12

   A61P43/00 111

   A61P43/00 121

   C12P21/08

   A01K67/027

   A01H5/00 A

   !C12N15/00 A

【請求項の数】36

【全頁数】79

(21)【出願番号】特願2011-536496(P2011-536496)

(86)(22)【出願日】2009年11月13日

(65)【公表番号】特表2012-508762(P2012-508762A)

(43)【公表日】2012年4月12日

(86)【国際出願番号】US2009064321

(87)【国際公開番号】WO2010056948

(87)【国際公開日】20100520

【審査請求日】2012年11月12日

(31)【優先権主張番号】61/114,295

(32)【優先日】2008年11月13日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511116247

【氏名又は名称】フェムタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＦＥＭＴＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(72)【発明者】

【氏名】フライ、ゲルハルト

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ホワイ ウェン

(72)【発明者】

【氏名】ショート、ジェイ

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０１９０６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０６６０８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／１１９１１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０３９８２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０２０６３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９４／０２８１５９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ０７Ｋ １６／２４

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＩＬ−６に結合する単離抗体または抗体フラグメントであって、
１またはそれ以上のヒト抗体に由来する定常領域と、
配列番号１５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号１３４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号１４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号１４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号１４４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号１５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号８８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号１４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号８０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号１４０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
配列番号１５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または、
配列番号１５６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号７５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
を有する、抗体またはフラグメント。

【請求項2】

前記抗体またはフラグメントが、インビボでの抗ＩＬ−６マウス抗体のヒトＩＬ−６への結合を競合的に阻害する、請求項１に記載の抗体またはフラグメント。

【請求項3】

少なくとも１０^−９Ｍの親和性（Ｋ_ｄ）でＩＬ−６に結合する、請求項１に記載の抗ＩＬ−６抗体またはフラグメント。

【請求項4】

少なくとも１０^−１１Ｍの親和性（Ｋ_ｄ）でＩＬ−６に結合する、請求項１に記載の抗ＩＬ−６抗体またはフラグメント。

【請求項5】

少なくとも１０^−１２Ｍの親和性（Ｋ_ｄ）でＩＬ−６に結合する、請求項１に記載の抗ＩＬ−６抗体またはフラグメント。

【請求項6】

少なくとも１つのＩＬ−６の少なくとも１つの活性を実質的に中和する、請求項１に記載の抗ＩＬ−６抗体またはフラグメント。

【請求項7】

前記活性が、ＩＬ−６媒介性ＭＣＰ−１産生の阻害、ＴＨＰ−１ヒト単球性白血病細胞におけるＩＬ−６シグナル伝達の阻害、ＨｅｐＧ２細胞からのＩＬ−６誘導性血清アミロイドＡ産生の阻害、およびｒｈＩＬ−６誘導性細胞増殖の阻害から成る群より選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の抗ＩＬ−６抗体またはフラグメント。

【請求項8】

請求項１に記載の単離抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントと、担体または希釈剤とを含有する医薬組成物。

【請求項9】

ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、麻酔薬（ｎａｒｃｏｔｉｃ）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬（ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃ）、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、糖尿病関連薬、無機物、栄養素、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、下痢止め薬、鎮咳薬、鎮吐薬、抗潰瘍薬、緩下薬、抗凝固薬、エリスロポエチン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節剤、散瞳薬、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経様作用薬、興奮薬、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼα、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、および抗ＴＮＦαまたはＩＬ−１２／ＩＬ−２３モノクローナル抗体の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの化合物またはタンパク質をさらに含有する、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

細胞、組織、器官または動物における免疫障害または疾患の治療用の医薬組成物であって、選択免疫調節に有効量の請求項１に記載の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントの少なくとも１つを含み、該医薬組成物は、前記細胞、組織、器官または動物に接触させられるまたは投与される、医薬組成物。

【請求項11】

前記免疫障害または疾患が、関節リウマチ／血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性脈管炎／ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎、アレルギー性疾患、アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、熱傷、電離放射線への暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病変、サルコイドーシス、クローン病、鎌状赤血球貧血
、ネフローゼ、過敏症反応、枯草熱（花粉症）、通年性鼻炎、結膜炎、蕁麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、何らかの器官または組織の移植片拒絶反応、腎移植拒絶反応、心移植拒絶反応、肝移植拒絶反応、膵移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植片拒絶反応、軟骨移植拒絶反応、骨移植拒絶反応、小腸移植拒絶反応、胎児胸腺移植片拒絶反応、副甲状腺移植拒絶反応、何らかの器官または組織の異種移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、抗受容体過敏症反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、重症筋無力症、抗体媒介性細胞傷害、ＩＩＩ型過敏症反応、全身性エリテマトーデス、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、脈管炎、心筋梗塞（ＭＩ）後心臓切開術症候群、ＩＶ型過敏症、接触皮膚炎、過敏性肺炎、細胞内生物体に起因する肉芽腫、薬物感受性、代謝性／特発性ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、α１−アンチトリプシン欠損症、糖尿病、橋本甲状腺炎、骨粗しょう症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、家族性血球貪食性リンパ組織球症、皮膚疾患、乾癬、脱毛、ネフローゼ症候群、腎炎、尿毒症、慢性サリチル酸中毒から選択される少なくとも１つである、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記有効量が、前記細胞、組織、器官または動物の１キログラム当たり０．０００１〜５０ｍｇである、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記有効量が、前記細胞、組織、器官または動物の１キログラム当たり０．００１〜５０ｍｇである、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

細胞、組織、器官または動物において癌障害または疾患を調節するために使用するための医薬組成物であって、医薬として有効量の請求項１に記載の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントを含み、
該医薬組成物は、前記細胞、組織、臓器もしくは動物に接触させられるまたは投与される、医薬組成物。

【請求項15】

前記癌障害または疾患が、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵癌、腎細胞癌、前立腺細胞癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴症候群／悪性高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、および悪性黒色腫から選択される少なくとも１つである、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記有効量が、前記細胞、組織、器官または動物の１キログラム当たり０．０１〜１００ｍｇである、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記接触または前記投与が、静脈内、筋肉内、ボーラス、皮下、呼吸器、吸入、経膣、経直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、または経皮から選択される少なくとも１つの様式による、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記接触もしくは投与の前に、接触もしくは投与と同時に、または接触もしくは投与の後に、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、糖尿病関連薬、無機物、栄養素、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、下痢止め薬、鎮咳薬、鎮吐薬、抗潰
瘍薬、緩下薬、抗凝固薬、エリスロポエチン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節剤、散瞳薬、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経様作用薬、興奮薬、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼα、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、および抗ＴＮＦαまたはＩＬ−１２／ＩＬ−２３モノクローナル抗体の少なくとも１つから選択される治療に有効な量の少なくとも１つの化合物またはタンパク質を含有する少なくとも１つの組成物を投与することをさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項19】

請求項１に記載の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントを含む医療装置であって、前記少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントを、静脈内、筋肉内、ボーラス、皮下、呼吸器、吸入、経膣、経直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、または経皮から選択される少なくとも１つの様式によって接触させるまたは投与するのに適する医療装置。

【請求項20】

請求項１に記載の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントと、
滅菌水、滅菌緩衝水から選択される少なくとも１つの担体、または
フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、もしくはそれらの混合物から成る群より選択される少なくとも１つの防腐剤
を溶解させた水性希釈剤と、
を含有する医薬組成物。

【請求項21】

抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントの濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

等張剤をさらに含有する、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項23】

生理的に許容される緩衝液をさらに含有する、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項24】

凍結乾燥形態の請求項１に記載の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントを入れた第１容器と、
滅菌水、滅菌緩衝水、または、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、もしくはそれらの混合物から成る群より選択される少なくとも１つの防腐剤を溶解させた水性希釈剤を含有する任意の第２容器を含むキット。

【請求項25】

抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントの濃度が、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成される、請求項２４に記載のキット。

【請求項26】

等張剤をさらに含む、請求項２４に記載のキット。

【請求項27】

生理的に許容される緩衝液をさらに含む、請求項２４に記載のキット。

【請求項28】

少なくとも１つの抗ＩＬ−６媒介性疾患の治療に使用されるキットであって、
請求項２４に記載の第１容器と第２容器とを含み、前記第１容器の内容物は前記第２容器の内容物で再構成され、該再構成された前記第１容器の内容物はその必要のある患者に投与される、キット。

【請求項29】

包装材料と、請求項１に記載の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントの溶液または凍結乾燥形態を含有する容器とを含む、ヒト医薬用途のための製品。

【請求項30】

前記容器が、複数回使用での投与のための栓を有するガラスまたはプラスチック容器である、請求項２９に記載の製品。

【請求項31】

請求項１に記載の抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントを作製するための方法であって、
前記抗体もしくはフラグメントをコードするヌクレオチド配列で形質転換した、宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞から、前記抗体またはフラグメントを発現させること、および
前記宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞から、前記抗体またはフラグメントを回収すること、
を含み、
ただし、前記トランスジェニック動物は、トランスジェニックヒトを除く、方法。

【請求項32】

前記宿主細胞が哺乳動物細胞、植物細胞または酵母細胞である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記トランスジェニック動物が哺乳動物である、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記トランスジェニック哺乳動物が、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、および非ヒト霊長動物から選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

請求項１に記載の少なくとも１つの抗体を発現することができるトランスジェニック動物（ただし、ヒトを除く）または植物。

【請求項36】

請求項３１に記載の方法によって作製される少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメント。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願情報
本出願は、米国以外のすべての国を指定国とする場合の出願人を米国企業Ｆｅｍｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．とし、米国のみを指定国とする場合の出願人をドイツ国国民フライ、ゲルハルト（Ｇｅｒｈａｒｄ Ｆｒｅｙ）、アメリカ合衆国国民チャン、ホワイ ウェン（Ｈｗａｉ Ｗｅｎ Ｃｈａｎｇ）、およびアメリカ合衆国ショート、ジェイ（Ｊａｙ Ｓｈｏｒｔ）としたＰＣＴ国際特許出願として２００９年１１月１３日に出願されたものであり、２００８年１１月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／１１４，２９５号の優先権を主張する。

【0002】

本発明は、少なくとも１つのインターロイキン６（インターフェロンβ２としても知られるＩＬ−６）タンパク質またはそのフラグメントに特異的な抗体（特定部分または変異体を包含する）、ならびにそのような抗ＩＬ−６抗体をコードする核酸、相補的核酸、ベクター、宿主細胞、ならびに治療用製剤、投与および装置を包含するその製造および使用の方法に関する。

【背景技術】

【0003】

インターロイキン６（ＩＬ−６）は多くの異なる細胞型によって産生されるプロ炎症性サイトカインである。インビボでは、刺激された単球、線維芽細胞および内皮細胞がＩＬ−６の主要な供給源である。マクロファージ、ＴおよびＢリンパ球、顆粒球、ケラチノサイト、マスト細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、グリア細胞ならびに平滑筋細胞のような他の細胞もまた、刺激後にＩＬ−６を産生する。いくつかの腫瘍細胞もＩＬ−６を生産し、ＩＬ−６は前立腺癌進行についての予後因子として関係づけられてきた。ＩＬ−６産生はＩＬ−６自体によって調節され、また細胞型に依存して、ＩＬ−６はそれ自体の合成を刺激するまたは阻害することができる。

【0004】

ＩＬ−６は、マイトジェン活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、末梢血単球および特定の腫瘍上で発現されるＩＬ−６受容体に結合することができる。ＩＬ−６受容体は少なくとも２つの異なる成分を有し、ＩＬ−６結合に関与するｇｐ８０と呼ばれるα鎖、およびシグナル伝達のために必要なｇｐ１３０と称されるβ鎖から成る。ＩＬ−６、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＩＬ−１１、ＣＮＴＦおよびＣＴ−１を含むサイトカインファミリーはすべて、それらのコグネイト受容体への結合後にｇｐ１３０を介してシグナル伝達する。加えて、ＩＬ−６サイトカインファミリーのすべての成員は、急性期タンパク質の肝臓発現を誘導することができる。

【0005】

ＩＬ−６の少なくとも２つの主要な生物学的機能がある：急性期タンパク質の媒介ならびに分化および活性化因子として作用すること。急性期タンパク質は、免疫応答を調節し、炎症を媒介し、そして組織リモデリングにおいて役割を果たすことが知られている。分化および活性化因子として、ＩＬ−６は、Ｂ細胞を分化して抗体を分泌するように誘導し、Ｔ細胞を細胞傷害性Ｔ細胞に分化するように誘導し、細胞シグナル伝達因子を活性化し、そして造血を促進する。ＩＬ−６は、多くの決定的に重要な身体機能およびプロセスに深く関与する。結果として、骨代謝、腫瘍性形質転換ならびに免疫および炎症応答を含む生理的プロセスは、抗体を用いたインビボでのＩＬ−６の生物活性の操作によって増強、抑制または防止され得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＩＬ−６に関連する疾患を予防する、治療する、改善するまたは診断するために使用される、ＩＬ−６またはそのフラグメントに対する高親和性の中和キメラまたはヒト抗体を提供することが求められている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、当技術分野で公知のものと組み合わせて、本明細書で説明し、本明細書で可能にする、高親和性のＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９抗ＩＬ−６抗体に由来する少なくとも１つの抗原結合領域を有する単離されたヒト化抗ＩＬ−６抗体、ならびに抗ＩＬ−６抗体組成物、それに関連するコード核酸または相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、装置、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、ならびにその作製および使用の方法を提供する。本発明の抗体は、ヒトＩＬ−６を高い親和性で特異的に中和する。

【0008】

本発明は、本明細書で述べる少なくとも１つの単離されたヒト化抗ＩＬ−６抗体を提供する。本発明による抗体は、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９の任意の１つ、または本発明の抗体に組み込むことができる、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域またはその任意の部分と組み合わせた、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０もしくはＢＡ９３９抗体の１つに由来する、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分を含む任意のタンパク質またはペプチド分子を包含する。１つの実施形態では、本発明は、各々の鎖がヒト定常領域の少なくとも一部、およびその各々がヒトＩＬ−６に特異性を有するＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９の１またはそれ以上に由来する可変領域（ｖ）の少なくとも一部を含有する、軽鎖および重鎖を含む抗ＩＬ−６抗体であって、ヒトＩＬ−６の阻害および／または中和エピトープに高い親和性で結合する抗体を対象とする。本発明はまた、そのような抗体のフラグメントまたは誘導体、たとえば、重鎖定常領域、連結領域、多様性領域もしくは可変領域、または軽鎖定常領域、連結領域もしくは可変領域などの、抗体鎖の１またはそれ以上の部分を包含する。

【0009】

抗体は、抗ＩＬ−６抗体に由来する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（たとえば重鎖または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）（これらの用語は本明細書で定義される）の少なくとも１つの特定部分、および／または少なくとも１つの定常もしくは可変フレームワーク領域またはその任意の部分を含み得る。抗体アミノ酸配列は、場合により、本明細書で述べるまたは当技術分野で公知の少なくとも１つの特定の置換、挿入または欠失をさらに含み得る。

【0010】

本発明の好ましい抗体は、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０、ＢＡ９３９、ＢＡ３９９−０１、ＢＡ３９９−０２、ＢＡ３９９−０３、ＢＡ３９９−０４、ＢＡ３９９−０５、ＢＡ３９９−０６、ＢＡ３９９−０７、ＢＡ３９９−０８、ＢＡ３９９−０９およびＢＡ３９９−１０、ならびにそのフラグメントおよび領域を包含する。

【0011】

１つの実施形態では、本開示は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、１３４、１４０、１４１、１４４、１４７、１４９、１５２、１５３または１５６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、６８、７１、７２、７５、７６、８０または８８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；および１またはそれ以上のヒト抗体に由来する定常領域を含む、ヒトＩＬ−６に結合する単離抗体または抗体フラグメントを提供する。１つの態様では、本開示は、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０および
ＢＡ９３９の１またはそれ以上の可変領域に由来する重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、１またはそれ以上のヒト抗体に由来する定常領域とを有する、ヒトＩＬ−６に結合する単離抗体または抗体フラグメントを提供する。もう１つの態様では、本開示は、前記抗体またはフラグメントが、インビボで抗ＩＬ−６マウス抗体のヒトＩＬ−６への結合を競合的に阻害する、請求項１に記載の抗体またはフラグメントを提供する。

【0012】

本発明の好ましい抗体は、Ｂｒａｃｋｅｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（前出）によって記述されたエピトープを包含する、ヒトＩＬ−６に結合して、受容体結合をブロックするものである。競合的阻害によってモノクローナル抗体の特異性および親和性を決定するための好ましい方法は、参照により本出願に組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗ， ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．， １９８８）に見出すことができる。本発明の少なくとも１つの抗体は、たとえばＢｒａｃｋｅｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（前出）によって記述されているように、ヒトＩＬ−６タンパク質、サブユニット、フラグメント、それらの部分または任意の組合せに特異的な少なくとも１つの特定エピトープに結合する。エピトープは、少なくとも１つの抗体結合領域を含むことができ、前記エピトープは、好ましくは、ヒトＩＬ−６タンパク質の少なくとも１つの機能性、細胞外、可溶性、親水性、外部もしくは細胞質ドメイン、またはその任意の部分などの、しかしこれらに限定されない、その少なくとも１つの部分の少なくとも１〜５アミノ酸から成る。

【0013】

１つの態様では、本発明は、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０、ＢＡ９３９、ＢＡ３９９−０１、ＢＡ３９９−０２、ＢＡ３９９−０３、ＢＡ３９９−０４、ＢＡ３９９−０５、ＢＡ３９９−０６、ＢＡ３９９−０７、ＢＡ３９９−０８、ＢＡ３９９−０９およびＢＡ３９９−１０の１つからの少なくとも１つの可変領域、ならびにそれらをコードする核酸配列を含む、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＩＬ−６抗体を提供する。

【0014】

もう１つの態様では、本発明は、（ｉ）ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０、ＢＡ９３９、ＢＡ３９９−０１、ＢＡ３９９−０２、ＢＡ３９９−０３、ＢＡ３９９−０４、ＢＡ３９９−０５、ＢＡ３９９−０６、ＢＡ３９９−０７、ＢＡ３９９−０８、ＢＡ３９９−０９およびＢＡ３９９−１０に由来する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列、ならびにそれらをコードする核酸配列の全部；または（ｉｉ）ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０、ＢＡ９３９、ＢＡ３９９−０１、ＢＡ３９９−０２、ＢＡ３９９−０３、ＢＡ３９９−０４、ＢＡ３９９−０５、ＢＡ３９９−０６、ＢＡ３９９−０７、ＢＡ３９９−０８、ＢＡ３９９−０９およびＢＡ３９９−１０の１つからの軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列、ならびにそれらをコードする核酸配列の全部のいずれかを含む、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＩＬ−６抗体を提供する。

【0015】

もう１つの態様では、本発明は、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０、ＢＡ９３９、ＢＡ３９９−０１、ＢＡ３９９−０２、ＢＡ３９９−０３、ＢＡ３９９−０４、ＢＡ３９９−０５、ＢＡ３９９−０６、ＢＡ３９９−０７、ＢＡ３９９−０８、ＢＡ３９９−０９およびＢＡ３９９−１０に由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲ、ならびにそれらをコードする核酸配列を含む、少なくとも１つの単離された哺乳動物抗ＩＬ−６抗体を提供する。

【0016】

本発明の他の態様では、少なくとも１つのヒトＣＤＲを含む、少なくとも１つの単離された哺乳動物キメラ、ヒト化またはＣＤＲ移植抗ＩＬ−６抗体を提供し、前記抗体は、ヒトＩＬ−６のエピトープの少なくとも１〜３アミノ酸を含む少なくとも１つのエピトープ
に特異的に結合する。

【0017】

少なくとも１つの抗体はさらに、場合により、少なくとも１０^-9Ｍ、好ましくは少なくとも１０^-10Ｍの親和性（Ｋｄ）でＩＬ−６に結合し、および／または少なくとも１つの
ＩＬ−６タンパク質の少なくとも１つの活性を実質的に中和する。好ましい実施形態では、抗体は、少なくとも５×１０^-10Ｍ、好ましくは５×１０^-11Ｍ、より好ましくは５×１０^-12Ｍの親和性（Ｋ_d）Ｌ−６に結合し、ヒトＩＬ−６を中和する。

【0018】

本発明は、１つの態様では、その少なくとも１つの特定配列、ドメイン、部分または変異体を包含する、前記特異的抗ＩＬ−６抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、前記ポリヌクレオチドに相補的な、または前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離核酸分子を提供する。本発明はさらに、前記抗ＩＬ−６抗体核酸分子を含む組換えベクター、そのような核酸および／または組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのような抗体核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を作製するおよび／または使用する方法を提供する。従って、本発明は、少なくとも１つの単離哺乳動物抗ＩＬ−６抗体をコードする単離核酸、前記単離核酸を含む単離核酸ベクター、および／または前記単離核酸を含む原核生物または真核生物宿主細胞を包含する。宿主細胞は、場合により、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその任意の誘導体、固定化もしくは形質転換細胞から選択される少なくとも１つであり得る。また、ＩＬ−６抗体が検出可能なまたは回収可能な量で発現される、インビトロ、インビボまたはインサイチュー条件下で核酸をコードする核酸を翻訳することを含む、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を作製する方法も提供される。

【0019】

本発明はまた、本明細書で述べる宿主細胞を、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体が検出可能なおよび／または回収可能な量で発現される条件下で培養することを含む、宿主細胞において少なくとも１つの前記抗ＩＬ−６抗体を発現するための少なくとも１つの方法を提供する。

【0020】

本発明はまた、（ａ）単離抗ＩＬ−６抗体をコードする核酸および／または本明細書で述べる抗体と、（ｂ）適切な担体または希釈剤とを含有する少なくとも１つの組成物を提供する。前記担体または希釈剤は、場合により、公知の担体または希釈剤に従って、医薬的に許容され得る。組成物は、場合により、少なくとも１つのさらなる化合物、タンパク質または組成物をさらに含有し得る。

【0021】

本発明はさらに、当技術分野で公知のようにおよび／または本明細書で述べるように、関連する疾患の前に、後にまたはその間に、細胞、組織、器官、動物または患者において少なくとも１つのＩＬ−６関連疾患を調節するまたは治療するために治療有効量を投与するための、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体法または組成物を提供する。従って、本発明は、本発明の少なくとも１つの単離抗ＩＬ−６抗体の有効量を含有する組成物を、細胞、組織、器官または動物に接触させるまたは投与することを含む、細胞、組織、器官または動物においてＩＬ−６関連疾患を診断するまたは治療するための方法を提供する。その方法は、場合により、細胞、組織、器官または動物に対して本発明の抗ＩＬ−６抗体の０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇの有効量を使用することをさらに含み得る。前記方法は、場合により、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内または経皮経路から選択される少なくとも１つの方法によって接触させるまたは投与することをさらに含み得る。前記方法は、場合により、抗体の接触もしくは投与の前に、接触もしくは投与と同時に、また
は接触もしくは投与の後に、検出可能な標識またはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗うつ薬、抗精神病薬、興奮薬、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたはその類似体、細胞傷害性または他の抗癌薬、メトトレキサートなどの代謝拮抗薬、抗増殖薬、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、および抗ＴＮＦαまたはＩＬ−１２／ＩＬ−２３モノクローナル抗体の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの化合物またはタンパク質の有効量を含有する少なくとも１つの組成物を投与することをさらに含み得る。

【0022】

本発明はさらに、当技術分野で公知のようにおよび／または本明細書で述べるように、関連する疾患の前に、後にまたはその間に、細胞、組織、器官、動物または患者において少なくとも１つのＩＬ−６関連疾患を診断するための少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体法を提供する。

【0023】

本発明はまた、本発明に従って、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を診断するための少なくとも１つの組成物、装置および／または送達方法を提供する。
また、少なくとも１つの単離ヒト化抗ＩＬ−６抗体および少なくとも１つの医薬的に許容される担体または希釈剤を含有する組成物も提供される。組成物は、場合により、検出可能な標識またはレポーター、細胞傷害性または他の抗癌薬、メトトレキサートなどの代謝拮抗薬、抗増殖薬、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＴＨＥ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗うつ薬、抗精神病薬、興奮薬、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは類似体の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの化合物またはタンパク質の有効量をさらに含有し得る。

【0024】

また、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内または経皮経路から選択される少なくとも１つの方法によって少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を接触させるまたは投与するのに適する、本発明の少なくとも１つの単離哺乳動物抗ＩＬ−６抗体を含む医療装置が提供される。

【0025】

さらなる態様では、本開示は、凍結乾燥形態の本開示の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントを入れた第１容器と、滅菌水、滅菌緩衝水、または、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、もしくはそれらの混合物から成る群より選択される少なくとも１つの防腐剤を溶解させた水性希釈剤とを含有する任意の第２容器を含むキットを提供する。１つの態様では、キットにおいて、第１容器中の抗ＩＬ−６抗体または特定部分もしくは変異体の濃度は、第２容器の内容物で約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成される。もう１つの態様では、第２容器は等張剤をさらに含む。もう１つの態様では、第２容器は、生理的に許容される緩衝液をさらに含む。１つの態様では、本開示は、キット中で提供され、投与の前に再構成される製剤をその必要のある患者に投与することを含む、少なくとも１つの抗ＩＬ−６媒介性疾患を治療する方
法を提供する。

【0026】

また、包装材料よ、本発明の少なくとも１つの単離哺乳動物抗ＩＬ−６抗体の溶液または凍結乾燥形態を含有する容器とを含む、ヒト医薬または診断用途のための製品が提供される。製品は、場合により、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内または経皮送達装置またはシステムの成分として容器を有することを含み得る。

【0027】

本発明はさらに、本明細書で述べる任意の発明を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９の軽鎖（配列番号１、２）および重鎖（配列番号３、４）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図2】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ４３６の軽鎖（配列番号５、６）および重鎖（配列番号７、８）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図3】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ８０２の軽鎖（配列番号９、１０）および重鎖（配列番号１１、１２）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図4】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ８０８の軽鎖（配列番号１３、１４）および重鎖（配列番号１５、１６）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図5】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ８４０の軽鎖（配列番号１７、１８）および重鎖（配列番号１９、２０）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図6】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ８４８の軽鎖（配列番号２１、２２）および重鎖（配列番号２３、２４）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図7】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ８９０の軽鎖（配列番号２５、２６）および重鎖（配列番号２７、２８）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図8】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ９３９の軽鎖（配列番号２９、３０）および重鎖（配列番号３１、３２）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図9】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ００１の軽鎖（配列番号３３、３４）および重鎖（配列番号３５、３６）可変領域について、それぞれアミノ酸配列および核酸配列を示す。

【図10】ＢＡ００１と本発明の抗ＩＬ−６抗体の競合ＥＬＩＳＡ分析を示す。

【図11】ＢＡ００１と本発明の抗ＩＬ−６抗体のＢｉａＣｏｒｅおよびＥＬＩＳＡ分析を示す。

【図12】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ０１ ＤＮＡ〜ＬＣ０６ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ軽鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号２、３７、３８、３９、４０および４１）を示す。

【図13】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ０７ ＤＮＡ〜ＬＣ１２ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ軽鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号４２、４３、４４、４５、４６および４７）を示す。

【図14】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ１３ ＤＮＡ〜ＬＣ１８ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ軽鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号４８、４９、５０、５１、５２および５３）を示す。

【図15】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ１９ ＤＮＡ〜ＬＣ２４ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ軽鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８および５９）を示す。

【図16】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ２５ ＤＮＡ〜ＬＣ３０ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ軽鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４および６５）を示す。

【図17】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ３１ ＤＮＡおよびＬＣ３２ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ軽鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号６６および６７）；ならびに抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ０１ ＰＲＯ〜ＬＣ０８ ＰＲＯの軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１、６８、６９、７０、７１、７２、７３および７４）を示す。

【図18】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ０９ ＰＲＯ〜ＬＣ２０ ＰＲＯのＢＡ３９９ ＣＰＳ軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６）を示す。

【図19】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＬＣ２１ ＰＲＯ〜ＬＣ３２ ＰＲＯのＢＡ３９９ ＣＰＳ軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７および９８）を示す。

【図20】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ０１ ＤＮＡ〜ＨＣ０６ ＤＮＡのＢＡ ＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号４、９９、１００、１０１、１０２および１０３）を示す。

【図21】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ０７ ＤＮＡ〜ＨＣ１２ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号１０４、１０５、１０６、１０７、１０８および１０９）を示す。

【図22】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ１３ ＤＮＡ〜ＨＣ１８ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４および１１５）を示す。

【図23】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ１９ ＤＮＡ〜ＨＣ２４ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号１１６、１１７、１１８、１１９、１２０および１２１）を示す。

【図24】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ２５ ＤＮＡ〜ＨＣ３０ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７）を示す。

【図25】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ３１ ＤＮＡおよびＨＣ３２ ＤＮＡのＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についての核酸配列（それぞれ配列番号１２２８および１２９）；ならびに抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ０１ ＰＲＯ〜ＨＣ０６ ＰＲＯの重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号３、１３０、１３１、１３２、１３３および１３４）を示す。

【図26】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ０７ ＰＲＯ〜ＨＣ１５ ＰＲＯのＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２および１４３）を示す。

【図27】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ１６ ＰＲＯ〜ＨＣ２５ ＰＲＯのＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）を示す。

【図28】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９ ＨＣ２６ ＰＲＯ〜ＨＣ３２ ＰＲＯのＢＡ３９９ ＣＰＳ重鎖可変領域についてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９および１６０）を示す。

【図29】包括的ポジショナルエボルーション（ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＰＥ））によるＢＡ３９９親和性成熟からの上位１０のヒットの相対比活性を示す。各々のクローンについての相対比活性を、黒い水平な線で示す、抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９の比活性に基準化している。

【図30】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９の軽鎖可変領域のコンビナトリアルタンパク質合成（ＣＰＳ）による親和性成熟からの３９９ＣＰＳ ＬＣ０１〜３９９ＣＰＳ ＬＣ３２（それぞれ配列番号１、６８、６９、７０、・・・９８）のアミノ酸配列の比較を示す。完全長配列および対応する配列番号を図１７〜１９に示す。

【図31】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９の重鎖可変領域のコンビナトリアルタンパク質合成（ＣＰＳ）による親和性成熟からの３９９ＣＰＳ ＨＣ０１〜３９９ＣＰＳ ＨＣ３２（それぞれ配列番号３、１３０、１３１、１３２、・・・１６０）のアミノ酸配列の比較を示す。完全長配列および対応する配列番号を図２５〜２８に示す。

【図32】コンビナトリアルタンパク質合成（ＣＰＳ）によるＢＡ３９９親和性成熟からの上位１０のヒットの基準化した比活性を示す。各々のクローンについての相対比活性を、水平な黒い線で示すように、抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９の比活性に基準化している。

【図33】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９の親和性成熟によって生成された抗ＩＬ−６ Ｍａｂクローン、ＢＡ００３（ＣＮＴＯ１３６）、およびＢＡＰ００１クローン１〜ＢＡＰ００１クローン１０のＳａｐｉｄｙｎｅ ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）反応速度排除分析からの解離定数（Ｋｄ）を含む表を示す。

【図34】抗ＩＬ−６ Ａｂ ＢＡ３９９の親和性成熟によって生成された抗ＩＬ−６ ａｂクローン、ＢＡ３９９−２、ＢＡ３９９−５、ＢＡ３９９−９およびＢＡ３９９−１０のＢｉａＣｏｒｅ分析からの結合データを含む表を示す。

【図35】抗ＩＬ−６ Ｍａｂ濃度を上昇させることによるＴＨＰ−１細胞でのＩＬ−６／ｓＩＬ６Ｒ誘導性Ｓｔａｔ３リン酸化の阻害を示す。データは、総Ｓｔａｔ３についてのウエスタンブロットに基づいて基準化している。

【図36】１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６を使用して、００３、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−９を含む様々な抗ＩＬ−６ Ｍａｂによる、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒで刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＳｔａｔ３リン酸化の阻害を示す（Ａ）。各々の状態についての総Ｓｔａｔ３のウエスタンブロットを（Ｂ）に示す。

【図37】１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６を使用して、００３、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−５を含む様々な抗ＩＬ−６ Ｍａｂによる、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒで刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＳｔａｔ３リン酸化の阻害を示す（Ａ）。各々の状態についての総Ｓｔａｔ３のウエスタンブロットを（Ｂ）に示す。

【図38】１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６を使用して、ＢＡ００３、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−９を含む様々な抗ＩＬ−６ Ｍａｂによる、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒで刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＳｔａｔ３リン酸化の阻害を示す（Ａ）。各々の状態についての総Ｓｔａｔ３のウエスタンブロットを（Ｂ）に示す。

【図39】２４時間目の、抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＣＮＴＯ１３６、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２、ＢＡ３９９−９の連続希釈による、ヒトＩＬ−６、ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−１ｂで刺激したＨｅｐＧ２細胞による血清アミロイドＡタンパク質産生の阻害を示す。

【図40】４８時間目の、抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＣＮＴＯ１３６、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２、ＢＡ３９９−９の連続希釈による、ヒトＩＬ−６、ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−１ｂで刺激したＨｅｐＧ２細胞による血清アミロイドＡタンパク質産生の阻害を示す。

【図41】ビオチニル化抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ００１のサルＩＬ−６に対する交差反応性、およびビオチニル化していないヒト化抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ００１、ＢＡ００３、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−９の、ビオチニル化ＢＡ００１のサルＩＬ−６への結合をブロックする能力を示す。ヒトＩｇＧを非特異的抗体として使用する。

【図42】抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ００１、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８およびＢＡ８９０による４８時間目のＩＬ−６誘導性ＤＳ−１細胞増殖の阻害を示す。

【図43】抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ００１、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８およびＢＡ８９０による９６時間目のＩＬ−６誘導性ＤＳ−１細胞増殖の阻害を示す。

【図44】ＢＡ３９９抗ＩＬ−６ ＭａｂのＣＰＳ親和性成熟からの上位１０クローンにおいて使用した軽鎖と重鎖の組合せを示す。軽鎖と重鎖についての対応するアミノ酸配列および配列番号はそれぞれ図１７〜１９および図２５〜２８に示されている。

【発明を実施するための形態】

【0029】

引用
本明細書中で引用するすべての公表文献または特許は、それらが本発明の時点での技術水準を示すので、および／または本発明の記載および実施可能性を提供するために、全体が参照により本明細書に組み込まれる。公表文献は、任意の学術公表文献もしくは特許公開公報、またはすべての記録、電子または印刷形式を含む、任意のメディア形式で利用可能な任意の他の情報を指す。以下の参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， Ｎ．Ｙ． （１９８７−２００１）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ， ２．ｓｕｐ．ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）； Ｃｏｌｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．，
ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ （１９９４−２００１）；
Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， Ｎ． Ｙ．， （１９９７−２００１）。

【0030】

アミノ酸コード
本発明の抗ＩＬ−６抗体を構成するアミノ酸はしばしば略記される。アミノ酸の特定は、当技術分野で広く理解されているように、その１文字コード、３文字コード、名称または３つのヌクレオチドコドンによってアミノ酸を特定することにより指示され得る（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，
Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４参照）。

【0031】

定義
本明細書で使用される、「抗インターロイキン６抗体」、「抗ＩＬ−６抗体」、「抗ＩＬ−６抗体部分」、または「抗ＩＬ−６抗体フラグメント」および／または「抗ＩＬ−６抗体変異体」等は、本発明の抗体に組み込むことができる、非マウス起源、好ましくはヒト起源の重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域またはその任意の部分と組み合わせた、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９ヒト化モノクローナル抗体の少なくとも１つに由来する重鎖もしくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分を含む、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を包含する。あるいは、「抗ＩＬ−６抗体」という用語は、ヒト化モノクローナル抗体ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０およびＢＡ９３９を集合的にまたは個別に指す。そのような抗体は、インビトロ、インサイチューおよび／またはインビボで、少なくとも１つのＩＬ−６活性もしくは結合、またはＩＬ−６受容体活性もしくは結合を調節する、低下させる、拮抗する、軽減する、緩和する、ブロックする、阻害する、排除するおよび／または妨げることができる。非限定的な例として、本発明の適切な抗ＩＬ−６抗体、特定部分または変異体は、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９モノクローナル抗体の少なくとも１つによって認識されるヒトＩＬ−６の阻害および／または中和エピトープに高い親和性で結合することができる。適切な抗ＩＬ−６抗体、特定部分または変異体はまた、場合により、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質合成、ＩＬ−６放出、ＩＬ−６受容体シグナル伝達、膜ＩＬ−６切断、ＩＬ−６活性、ＩＬ−６産生および／または合成などの、しかしこれらに限定されない
ＩＬ−６の活性または機能の少なくとも１つに影響を及ぼし得る。

【0032】

「抗体」という用語はさらに、抗体ミメティックを包含する、または、各々が抗ＩＬ−６に由来する少なくとも１つのＣＤＲを含有する、一本鎖抗体およびそのフラグメントを包含する、抗体またはその特定フラグメントもしくは部分の構造および／または機能を模倣する抗体の部分を含有する、抗体、その消化フラグメント、特定部分および変異体を包含することが意図されている。機能的フラグメントは、哺乳動物ＩＬ−６に結合する抗原結合フラグメントを含む。たとえば、Ｆａｂ（たとえばパパイン消化による）、Ｆａｂ’（たとえばペプシン消化と部分的還元による）およびＦ（ａｂ’）２（たとえばペプシン消化による）、ｆａｃｂ（たとえばプラスミン消化による）、ｐＦｃ’（たとえばペプシンまたはプラスミン消化による）、Ｆｄ（たとえばペプシン消化、部分的還元および再集合による）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（たとえば分子生物学技術による）フラグメントを含むがこれらに限定されない、ＩＬ−６またはその部分に結合することができる抗体フラグメントは、本発明に包含される（たとえばＣｏｌｌｉｇａｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出参照）。

【0033】

抗体フラグメントは、当技術分野で公知のようにおよび／または本明細書で述べるように、酵素切断、合成または組換え技術によって作製できる。抗体はまた、１またはそれ以上の終止コドンが天然の終止位置の上流に導入された抗体遺伝子を使用して様々なトランケート形態で作製することもできる。たとえば、重鎖のＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組合せ遺伝子を設計することができる。抗体の様々な部分を、従来の技術によって化学的に共に連結するか、または遺伝子操作技術を用いて隣接タンパク質として調製することができる。

【0034】

本明細書で使用される「キメラ」抗体または「ヒト化」抗体または「ＣＤＲ移植」は、非マウス、好ましくはヒト抗体に由来する１またはそれ以上のタンパク質またはペプチドと組み合わせた本明細書で述べる抗ＩＬ−６ ＡＢまたはそれに由来する任意のＣＤＲの任意の組合せを包含する。本発明に従って、キメラまたはヒト化抗体は、ＣＤＲが本明細書で述べる抗ＩＬ−６ Ａｂの１もしくはそれ以上および少なくともその一部に由来するか、または抗体の残りの部分が１もしくはそれ以上のヒト抗体に由来するものを包含する。従って、抗体のヒト部分は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（たとえばＣＨ１、ＣＨ₂、ＣＨ₃）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ）領域を含み得る。ヒト抗体に由来する抗体の領域は、ヒト抗体と１００％の同一性を有する必要はない。好ましい実施形態では、免疫原性が無視し得る程度であるためにできるだけ多くのヒトアミノ酸残基が保持されるが、ヒト残基は、同時に抗体のヒト化を最大化しつつ、ＣＤＲによって形成される抗原結合部位を支持するために必要に応じて修飾され得る。そのような変化または変異は、場合によりおよび好ましくは、非修飾抗体と比較してヒトまたは他の種における免疫原性を保持するまたは低減する。ヒト化抗体は、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン（たとえば重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核もしくは真核細胞によって産生され得ることが注目される。さらに、抗体が一本鎖抗体である場合、それは、天然ヒト抗体では認められないリンカーペプチドを含み得る。たとえば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域を連結する、２〜約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基のようなリンカーペプチドを含み得る。そのようなリンカーペプチドはヒト起源であるとみなされる。

【0035】

抗体のヒト化は、たとえば、個々のヒトフレームワークのプールにフレーム内で融合された非ヒト標的モノクローナル抗体の６つのＣＤＲを含むコンビナトリアルライブラリーを合成することによって実施できる。すべての公知の重鎖および軽鎖ヒト生殖細胞遺伝子を代表する遺伝子を含むヒトフレームワークライブラリーが利用できる。生じたコンビナ
トリアルライブラリーを、次に、対象とする抗原への結合に関してスクリーニングすることができる。このアプローチは、親抗体への結合活性を維持するという観点から完全なヒトフレームワークの最も好ましい組合せの選択を可能にし得る。その後、ヒト化抗体を様々な技術によってさらに最適化することができる。

【0036】

抗体のヒト化は、マウスまたは他の非ヒト抗体を「完全ヒト」抗体へと進化させるために使用できる。生じる抗体は、出発抗体と類似の結合親和性および特異性を維持しつつ、ヒト配列だけを含み、マウスまたは非ヒト抗体配列を含まない。

【0037】

「包括的ポジショナルエボルーション」（ＣＰＥ（商標））という用語は、単一または複数の抗体特性と結合特性を増強するように包括的な突然変異誘発、シャフリングおよび合成技術を組み合わせるために使用できる抗体進化技術プラットフォームを表すのに使用される。ＣＰＥプラットフォームは、タンパク質内の各々の位置における６３の潜在的コドン変化すべてについてタンパク質内のあらゆる個別コドン変化のインビボ作用を包括的にマッピングすることを可能にする。この包括的突然変異誘発技術は、抗体可変ドメインの配列に沿ってあらゆる位置でアミノ酸変化を試験することにより、抗体変異体を迅速に作製する。

【0038】

「コンビナトリアルタンパク質合成」（ＣＰＳ（商標））という用語は、抗体の最良特性を新たな高性能抗体へと組み合わせることによって抗体の所望特性を最適化するために使用できるコンビナトリアルタンパク質合成技術を表すのに使用される。ＣＰＳ（商標）はＣＰＥ（商標）後に使用でき、タンパク質または抗体内のコドン変化の最適の組合せまたはセットの同定のために、改善された個別コドンのすべての置換のその後の作製とインビボ選択を可能にし得る。これらの技術の組合せは、スクリーニングするのに利用できる抗体変異体のプールを大きく拡大することができ、それは、結合親和性、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化および溶解度などの単一または複数の増強された特性を有する抗体を発見する確率を有意に上昇させる。

【0039】

完全長抗体分子のために、ハイブリドーマ細胞株のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから免疫グロブリン遺伝子を得ることができる。抗体重鎖および軽鎖を哺乳動物ベクター系でクローニングする。二本鎖配列分析で構築を実証する。抗体構築物を他のヒトまたは哺乳動物宿主細胞株において発現させることができる。構築物を、次に、対象とする発現された抗体の一過性トランスフェクションアッセイおよびウエスタンブロット分析によって確認できる。最も高い生産性を有する安定な細胞株を単離し、迅速検定法を用いてスクリーニングすることができる。

【0040】

「親和性成熟」という用語は、抗原に対する免疫応答の平均的な親和性の上昇を指す。本来は、抗原への反復暴露後に起こり得る。特に好ましいタイプの置換変異体は、親抗体（たとえばヒト抗体）の１またはそれ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択される、生じた変異体は、それらが生成された親抗体に比べて改善された生物学的特性を有する。そのような置換変異体を生成するための好都合な方法は、本明細書で述べる技術または当業者に公知の他の技術、たとえばファージディスプレイ（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６３：５５１−６７， １９９６）を用いた親和性成熟を含む。変異体を、次に、本明細書で述べるように、たとえばＢｉａｃｏｒｅアッセイによって、それらの生物活性（たとえば結合親和性）に関してスクリーニングする。修飾のための良好な候補である超可変領域残基を同定するために、アラニン置換突然変異誘発を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。１またはそれ以上の適切なアッセイにおいて卓越した特性を有する抗体をさらなる開発に供することができる。

【0041】

「有効量」は、ある程度の期間にわたってそれを投与される生物において疾患を治療するまたは予防するのに有効である、たとえば所望投与間隔の間治療効果を提供する、抗ＩＬ−６抗体またはフラグメントの量である。

【0042】

「治療する」という用語は、（１）状態、障害または疾患に罹患する可能性があるかまたは素因があるが、まだその状態、障害または疾患の臨床もしくは準臨床症状を経験していないまたは示していない動物において発現する状態、障害または疾患の臨床症状の出現を防止または遅延させること；（２）状態、障害または疾患を抑制すること（すなわち疾患、その少なくとも１つの臨床もしくは準臨床症状の発現、または維持治療の場合はその再発を停止、低減または遅延させること；および／または（３）疾患を緩和すること（すなわち状態、障害または疾患またはその臨床もしくは準臨床症状の少なくとも１つの後退を生じさせること）を包含する。治療される患者にとっての利益は、統計的に有意であるか、または少なくとも患者もしくは医師に認知できる。

【0043】

測定量に関して本明細書で使用される場合、「約」という用語は、測定の目的および使用される測定装置の精度に応じた、一定の注意を払って測定を実施する当業者によって予想される測定量の通常の変動を指す。特に指示されない限り、「約」は、与えられる数値の±１０％の変動を指す。

【0044】

本発明の抗体
本発明に従って、抗ＩＬ−６抗体は、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０もしくはＢＡ９３９抗体の任意の１つ、または可変領域もしくはＣＤＲがＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０もしくはＢＡ９３９抗体の任意の１つに由来し、且つ抗体のフレームワークおよび定常領域が１もしくはそれ以上のヒト抗体に由来する抗体を含む。抗体に由来する可変領域またはＣＤＲは、好ましくはＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９抗体の任意の１つの可変領域またはＣＤＲと約９０％〜約１００％の同一性を有するが、キメラ抗体が、ＩＬ−６に結合してＩＬ−６を阻害する能力を維持する限り、置換、挿入および欠失を含むありとあらゆる修飾が企図される。ヒト抗体に由来するキメラ、ヒト化またはＣＤＲ移植抗体の領域は、ヒト抗体と１００％の同一性を有する必要はない。好ましい実施形態では、免疫原性が無視し得る程度であるためにできるだけ多くのヒトアミノ酸残基が保持されるが、ヒト残基、特にフレームワーク領域の残基は、必要に応じておよび本発明に従って本明細書中以下で教示するように置換される。本明細書で開示するそのような修飾は、同時に抗体のヒト化を最大化しつつ、ＣＤＲによって形成される抗原結合部位を支持するために必要である。

【0045】

本発明に従って、抗ＩＬ−６ Ａｂの可変領域（軽鎖および重鎖）の核酸配列および推定アミノ酸配列を図１〜８に示す。ＢＡ００１軽鎖および重鎖可変領域の配列を図９に示す。ＢＡ３９９の親和性成熟からの軽鎖および重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を図１２〜２８に示す。軽鎖および重鎖可変領域の配列をそれぞれ図３０および３１で比較する。重鎖および軽鎖可変領域の各々は、集合して抗原結合部位を形成する３つのＣＤＲを含む。３つのＣＤＲは、主としてＣＤＲを支持するように機能する４つのＦＲ領域によって取り囲まれている。重鎖および軽鎖の可変領域の配列内のＣＤＲの配列は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｕ．Ｓ． Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．によるコンピュータ援用アラインメントによって、または可変領域の分子モデリングによって、たとえばＬｅｖｉｔｔ （１９８３
） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６８：５９５によって述べられたようなＥＮＣＡＤプログラムを利用して同定できる。

【0046】

好ましい実施形態では、ＣＤＲはＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９の任意の１つに由来する。重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの決定は、十分に当業者の技術範囲内である。たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／参照。

【0047】

抗ＩＬ−６抗体のＣＤＲの配列は、ＣＤＲ移植抗体がヒトＩＬ−６に結合して、ヒトＩＬ−６を阻害する能力を維持する範囲で挿入、置換および欠失によって修飾され得る。当業者は、本明細書中以下で述べる機能的アッセイを実施することによってこの活性の維持を確認することができる。

【0048】

あるいは、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９の任意の１つの重鎖可変領域および軽鎖可変領域全体をヒト定常領域およびフレームワーク領域と組み合わせて、本発明のキメラ抗体を形成し得る。１つの態様では、親和性成熟からの抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ３９９の上位１０クローンのために利用した可変軽鎖および重鎖アミノ酸配列を図４４に開示する。クローンＢＡ３９９−０１は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ０６（配列番号７２）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ−０６（配列番号１３４）を含む。クローンＢＡ３９９−０２は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ０２（配列番号６８）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−２５（配列番号１５３）を含む。クローンＢＡ３９９−０３は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ０５（配列番号７１）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ２１（配列番号１４９）を含む。クローンＢＡ３９９−０４は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ０６（配列番号７２）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ１３（配列番号１４１）を含む。クローンＢＡ３９９−０５は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ１０（配列番号７６）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ１６（配列番号１４４）を含む。クローンＢＡ３９９−０６は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ２２（配列番号８８）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ２４（配列番号１５２）を含む。クローンＢＡ３９９−０７は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ１４（配列番号８０）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ１９（配列番号１４７）を含む。クローンＢＡ３９９−０８は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ１０（配列番号７６）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ１２（配列番号１４０）を含む。クローンＢＡ３９９−０９は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ０９（配列番号７５）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ２４（配列番号１５２）を含む。クローンＢＡ３９９−１０は、軽鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＬＣ０９（配列番号７５）と重鎖ＢＡ３９９ＣＰＳ−ＨＣ２８（配列番号１５６）を含む。

【0049】

本発明のヒト化抗体、フラグメントおよび領域の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、公知の方法によって、ヒト胎児肝ライブラリーから誘導できる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現し、産生するものを含む、任意のヒト細胞に由来し得る。ヒトＣＨ領域は、γ、μ、α、δ、εを含むヒトＨ鎖の公知のクラスまたはアイソタイプ、およびＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４などのそれらのサブタイプのいずれかに由来し得る。Ｈ鎖アイソタイプは抗体の様々なエフェクター機能に関与するので、ＣＨ領域の選択は、補体固定、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における活性などの、所望エフェクター機能によって導かれる。好ましくは、ＣＨ領域はγ１（ＩｇＧ１）に由来する。

【0050】

ヒトＣＬ領域は、ヒトＬ鎖アイソタイプκまたはλのいずれか、好ましくはκに由来し得る。
ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的なクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９） ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８７−１９９３））によってヒト細胞から得られる。ヒトＣ領域遺伝子は、Ｌ鎖の２つのクラス、Ｈ鎖の５つのクラスおよびそれらのサブクラスを代表する遺伝子を含む公知のクローンから容易に入手可能である。Ｆ（ａｂ^１）２およびＦａｂなどのキメラ抗体フラグメントは、適切にトランケートされたキメラＨ鎖遺伝子を設計することによって調製できる。たとえば、Ｆ（ａｂ^１）２フラグメントのＨ鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、続いてトランケート分子を生成するための翻訳終止コドンを含む。

【0051】

一般に、一例では、本発明のヒト化抗体、フラグメントおよび領域は、抗ＩＬ−６特異的抗体のＨ鎖およびＬ鎖抗原結合領域をコードするＤＮＡセグメントをクローニングし、これらのＤＮＡセグメントを、それぞれＣＨおよびＣＬ領域を含むＤＮＡセグメントに連結して、完全長キメラ免疫グロブリンコード遺伝子を生成することによって作製される。

【0052】

抗体の可変領域の配列は、キメラ抗体が、ヒトＩＬ−６に結合して、ヒトＩＬ−６を阻害する能力を維持する範囲で挿入、置換および欠失によって修飾され得る。当業者は、本明細書中以下で述べる機能的アッセイを実施することによってこの活性の維持を確認することができる。可変領域は、たとえば、配列番号１〜３２の可変領域に約５０％〜約１００％の相同性を有し得る。好ましい実施形態では、抗体の可変領域は、配列番号１〜３２および３７〜１６０の可変領域に約８０％〜約１００％の相同性を有する。より好ましい実施形態では、可変領域は、配列番号１〜３２および３７〜１６０の可変領域に約９０％〜約１００％の相同性を有する。

【0053】

１つの特定態様では、本開示の好ましい抗ＩＬ−６ Ｍａｂは、配列番号１に９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列相同性を有する可変軽鎖領域を含み、配列番号３に９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列相同性を有する可変重鎖領域をさらに含む。

【0054】

１つの特定態様では、本開示の好ましい抗ＩＬ−６ Ｍａｂは、配列番号６８〜９８の１つから選択される可変軽鎖領域を含む。さらなる特定態様では、本開示の好ましい抗ＩＬ−６ Ｍａｂは、配列番号６８、７１、７２、７５、７６、８０および８８の１つから選択される可変軽鎖領域を含む。

【0055】

もう１つの特定態様では、本開示の好ましい抗ＩＬ−６ Ｍａｂは、配列番号１３０〜１６０の１つから選択される可変重鎖領域を含む。さらなる特定態様では、本開示の好ましい抗ＩＬ−６ Ｍａｂは、配列番号１３４、１４０、１４１、１４４、１４７、１４９、１５２、１５３および１５６の１つから選択される可変重鎖領域を含む。

【0056】

非ヒトまたはヒト抗体を遺伝子操作するまたはヒト化するための方法も使用でき、当技術分野において周知である。一般に、ヒト化または遺伝子操作された抗体は、非ヒト、たとえば、限定されることなく、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物または他の哺乳動物であるソースからの１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、「インポート」残基は、典型的には公知のヒト配列の「インポート」可変、定常または他のドメインから取られる。公知のヒトＩｇ配列は、たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、：
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；
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Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）
に開示されている。

【0057】

そのようなインポート配列は、当技術分野で公知のように、免疫原性を低減する、または結合、親和性、オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、アビディティー、特異性、半減期もしくは任意の他の適切な特性を低減する、増強するもしくは修飾するために使用できる。一般に、可変領域と定常領域の非ヒト配列をヒトまたは他のアミノ酸で置き換える一方で、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部または全部が維持される。抗体はまた、場合により、抗原に対する高い親和性および他の有益な生物学的特性を保持しつつヒト化することができる。この目標を達成するために、ヒト化抗体を、場合により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列および様々な概念上のヒト化産物の分析工程によって作製することができる。三次元免疫グロブリンモデルが一般に使用可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、その残基が候補免疫グロブリン配列の機能において果たす可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性上昇などの所望抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基を選択し、コンセンサス配列およびインポート配列から組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接且つ最も実質的に関与する。本発明の抗体のヒト化または遺伝子操作は、各々全体が、その中で引用される参考文献を含めて、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｔｅｒ （Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３ （１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ （１９８８））， Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１： ２２９６ （１９９３）； Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１ （１９８７）， Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：４２８５ （１９９２）； Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１ ：２６２３ （１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号、同第４，８１６，５６７号、ＰＣＴ／：第ＵＳ９８／１６２８０号、同第ＵＳ９６／１８９７８号、同第ＵＳ９１／０９６３０号、同第ＵＳ９１／０５９３９号、同第ＵＳ９４／０１２３４号、英国特許第ＧＢ８９／０１３３４号、同第ＧＢ９１／０１１３４号、同第ＧＢ９２／０１７５５号；国際公開公報第ＷＯ９０／１４４４３号、同第ＷＯ９０／１４４２４号、同第ＷＯ９０／１４４３０号、欧州特許第ＥＰ ２２９２４６号に述べられているものなどの、しかしこれらに限定されない、任意の公知の方法を用いて実施できる。

【0058】

本発明のヒト化抗体のヒト定常領域は、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等）またはアイソタイプであり得、κまたはλ軽鎖を含み得る。１つの実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ重鎖または規定フラグメント、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの少なくとも１つを含む。もう１つの実施形態では、抗ヒトＩＬ−６ヒト抗体は、ＩｇＧ１重鎖およびＩｇＧ１Ｋ軽鎖を含む。本発明の単離抗ＩＬ−６抗体は、任意の適切なポリヌクレオチドによってコードされる、本明細書で開示する抗体アミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体または抗原結合フラグメントはヒトＩＬ−６に結合し、それによってタンパク質の少なくとも１つの生物活性を部分的にまたは実質的に中和する。抗体またはその特定部分もしくは変異体は、少なくとも１つの
ＩＬ−６タンパク質またはフラグメントの少なくとも１つの生物活性を部分的にまたは好ましくは実質的に中和し、それによりＩＬ−６のＩＬ−６受容体への結合を介してまたは他のＩＬ−６依存性または媒介性機構を介して媒介される活性を阻害する。本明細書で使用される、「中和抗体」という用語は、ＩＬ−６依存性活性を、アッセイに依存して約２０〜１２０％、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはそれ以上阻害することができる抗体を指す。ＩＬ−６依存性活性を阻害する抗ＩＬ−６抗体の能力は、本明細書で述べるようにおよび／または当技術分野で公知のように、好ましくは少なくとも１つの適切なＩＬ−６タンパク質または受容体アッセイによって評価される。

【0059】

本発明の少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つのＩＬ−６タンパク質、サブユニット、フラグメント、部分またはそれらの任意の組合せに特異的な少なくとも１つの特定エピトープに結合する。少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の少なくとも１つの部分を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含むことができ、前記エピトープは、好ましくはタンパク質の少なくとも１つの細胞外、可溶性、親水性、外部または細胞質部分から成る。一般に、本発明のヒト抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書で述べる抗ＩＬ−６ Ａｂに由来する、少なくとも１つの重鎖可変領域の少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）または変異体ならびに少なくとも１つの軽鎖可変領域の少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６）または変異体を含む抗原結合領域を含有する。特定実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、対応するＣＤＲ１、２および／または３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）の少なくとも一部を含む抗原結合領域を有し得る。もう１つの特定実施形態では、抗体または抗原結合部分もしくは変異体は、対応するＣＤＲ４、５および／または６のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ４、ＣＤＲ５および／またはＣＤＲ６）の少なくとも一部を含む抗原結合領域を有し得る。好ましい実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲは、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８、ＢＡ８４０、ＢＡ８４８、ＢＡ８９０またはＢＡ９３９の少なくとも１つの対応するＣＤＲのアミノ酸配列を有する。そのような抗体は、従来技術を用いて抗体の様々な部分（たとえばＣＤＲ、フレームワーク）を化学的に共に連結することによって、組換えＤＮＡテクノロジーの従来技術を用いて抗体をコードする（１またはそれ以上の）核酸分子を調製し、発現することによって、または任意の他の適切な方法を用いて、本発明のポリペプチドの発現を生じさせる可能な縮重コドンのいずれかを使用することによって作製できる。

【0060】

軽鎖および重鎖についてのコンビナトリアル可変ドメインヒト化ライブラリーの液相合成が使用できる。ヒト化軽鎖（ＬＣ）可変ドメインライブラリーの構築は、たとえば、ヒト軽鎖フレームワーク（ＦＷ）および非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ライブラリーは、たとえば、ＦＷとＣＤＲ ＤＮＡフラグメントの段階的液相連結を使用することによって構築される。ライブラリーは、当業者に公知の技術によってＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＣＤＲ２−ＦＷ３−ＣＤＲ３の順でＦＷとＣＤＲ ＤＮＡフラグメントの段階的液相連結を使用することによって構築される。たとえば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、以下の参考文献の１またはそれ以上の技術による。Ｌｏ， Ｂ． Ｋ．， ２００３， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｅｄｉｔ ｂｙ Ｂｅｎｎｙ Ｋ． Ｃ． Ｌｏ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２４８， １３５−１５９； Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ＳＤ
Ｒ ｇｒａｆｔｉｎｇ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｅｄｉｔ ｂｙ Ｂｅｎｎｙ Ｋ． Ｃ． Ｌｏ，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２４８， ３６１−３７６； Ｂａｓｓｅｔｔｅ， Ｐ． Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｄｉｒｅｃｔｅｄ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｒｅａｔｉｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｅｄｉｔ． Ａｒｎｏｌｄ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２３１， ２９−３７；
Ｃｈａｍｅｓ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｎ
Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｅｄｉｔ ｂｙ Ｒ． Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ． Ｄｕｂｅｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， １４９−１６６； Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｓ．， ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ｔ．， ２００１， Ｈｕｍａｎｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｅｄｉｔ ｂｙ Ｒ． Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ． Ｄｕｂｅｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， ５６７−５９０。

【0061】

上記に定義された重鎖または軽鎖可変領域またはＣＤＲ領域を含むヒトＩＬ−６に結合する抗体は、当技術分野で公知のようにおよび／または本明細書で述べるように、ファージディスプレイ（Ｋａｔｓｕｂｅ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ． ＭｏＩ．
Ｍｅｄ， ｌ（５）：８６３−８６８ （１９９８））またはトランスジェニック動物を用いる方法などの、適切な方法を用いて作製できる。たとえば、抗体、特定部分または変異体は、コード核酸またはその部分を使用して適切な宿主細胞において発現させることができる。

【0062】

前述したように、本発明はまた、配列が本明細書で述べるアミノ酸配列と実質的に同じである配列のアミノ酸を含む抗体、抗原結合フラグメント、免疫グロブリン鎖およびＣＤＲに関する。そのような抗ＩＬ−６抗体は、本明細書で特定するように、自然の突然変異またはヒト操作のいずれかからの、１またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。好ましくは、そのような抗体または抗原結合フラグメントおよびそのような鎖またはＣＤＲを含む抗体は、高い親和性（たとえば約１０^-9Ｍまたはそれ以下のＫＤ）でヒトＩＬ−６に結合することができる。本明細書で述べる配列と実質的に同じであるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換、ならびにアミノ酸欠失および／または挿入を含有する配列を包含する。保存的アミノ酸置換は、第一アミノ酸のものに類似する化学的および／または物理的特性（たとえば電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第二アミノ酸による第一アミノ酸の置換を指す。保存的置換は、以下の群内の１つのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を含む：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤおよびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）およびグリシン（Ｇ）；Ｆ、ＷおよびＹ； Ｃ、ＳおよびＴ。

【0063】

言うまでもなく、当業者が行うアミノ酸置換の数は、上述したものを含む多くの因子に依存する。一般的に言えば、任意の所与の抗ＩＬ−６抗体、フラグメントまたは変異体についてのアミノ酸置換、挿入または欠失の数は、本明細書で特定するように、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１以下、たとえば１〜３０またはその中の任意の範囲または値である。

【0064】

機能に必須である本発明の抗ＩＬ−６抗体中のアミノ酸は、部位指定突然変異誘発またはアラニン置換突然変異誘発などの、当技術分野で公知の方法によって同定できる（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｓｕｐｒａ， Ｃｈａｐｔｅｒｓ ８， １５； Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９））。後者の手順は、分子内のあらゆる残基で１個のアラニン突然変異を導入する。次に、生じた突然変異体分子を、少なくとも１つのＩＬ−６中和活性などの、しかしこれに限定されない生物活性に関して試験する。抗体結合のために重要な部位も、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識などの構造解析によって同定できる（Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９− ９０４ （１９９２）
ａｎｄ ｄｅ Ｖｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２
（１９９２））。

【0065】

本発明の抗ＩＬ−６抗体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０に由来するＣＤＲの少なくとも１つの連続するアミノ酸の５から全部より選択される少なくとも一部、一連、または組合せを含み得るが、これらに限定されない。

【0066】

抗ＩＬ−６抗体は、場合により、配列番号１、３、５、・・・３１の少なくとも１つに由来するＣＤＲの連続するアミノ酸の７０〜１００％の少なくとも１つのポリペプチドをさらに含み得る。１つの特定態様では、抗ＩＬ−６抗体は、配列番号１に９５〜９９％の配列相同性を有するポリペプチド、好ましくは配列番号６８〜９８の１つを含むＣＤＲを含有する。もう１つの特定態様では、抗ＩＬ−６抗体は、配列番号３に９５〜９９％の配列相同性を有するポリペプチド、好ましくは配列番号１３０〜１６０の１つを含むＣＤＲを含有する。

【0067】

１つの実施形態では、免疫グロブリン鎖またはその部分（たとえば可変領域、ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号１、３、５、・・・３１の少なくとも１つのアミノ酸配列に約７０〜１００％の同一性（たとえば７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその中の任意の範囲もしくは値）を有する。たとえば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９の配列と比較できる。好ましくは、７０〜１００％のアミノ酸同一性（すなわち９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその中の任意の範囲もしくは値）は、当技術分野で公知のように、適切なコンピュータアルゴリズムを用いて決定される。１つの特定態様では、抗ＩＬ−６抗体は、配列番号１に９５〜９９％の配列相同性を有するポリペプチド、好ましくは配列番号６８〜９８の１つを含む可変領域を含有する。もう１つの特定態様では、抗ＩＬ−６抗体は、配列番号３に９５〜９９％の配列相同性を有するポリペプチド、好ましくは配列番号１３０〜１６０の１つを含む可変領域を含有する。

【0068】

例示的な重鎖および軽鎖可変領域配列は、配列番号１、３、５、・・・３１、６８〜９８または１３０〜１６０において提供される。本発明の抗体またはその特定変異体は、本発明の抗体からの任意の数の連続するアミノ酸残基を含むことができ、その数は、抗ＩＬ−６抗体中の連続残基数の１０〜１００％から成る整数の群より選択される。場合により
、この連続するアミノ酸のサブ配列は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０もしくはそれ以上のアミノ酸長、またはその中の任意の範囲もしくは値である。さらに、そのようなサブ配列の数は、１〜２０から成る群から選択される任意の整数、たとえば少なくとも２、３、４または５であり得る。

【0069】

当業者が認識するように、本発明は、本発明の少なくとも１つの生物学的に活性な抗体を包含する。生物学的に活性な抗体は、天然（非合成）、内因性または関連および公知抗体の比活性の少なくとも２０％、３０％または４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、９０％または９５％〜１００％の比活性を有する。酵素活性および基質特異性の程度を検定し、数量化する方法は当業者に周知である。

【0070】

もう１つの態様では、本発明は、有機部分の共有結合によって修飾された、本明細書で述べるようなヒト抗体および抗原結合フラグメントに関する。そのような修飾は、改善された薬物動態特性（たとえば高いインビボ血清半減期）を有する抗体または抗原結合フラグメントを生成し得る。有機部分は、直鎖状または分枝鎖親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であり得る。特定実施形態では、親水性ポリマー基は約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマーまたはポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸基または脂肪酸エステル基は約８〜約４０個の炭素原子を含み得る。

【0071】

本発明の修飾抗体および抗原結合フラグメントは、直接または間接的に抗体に共有結合された１またはそれ以上の有機部分を含み得る。本発明の抗体または抗原結合フラグメントに結合される各々の有機部分は、独立して親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用される、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、この用語が本明細書で使用される場合、オクタンよりも水により可溶性である有機ポリマーを指す。たとえば、ポリリシンはオクタンよりも水により可溶性である。従って、ポリリシンの共有結合によって修飾された抗体は本発明に包含される。本発明の抗体を修飾するのに適する親水性ポリマーは、直鎖状または分枝鎖であり得、たとえばポリアルカングリコール（たとえば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧ等）、炭水化物（たとえばデキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖類等）、親水性アミノ酸のポリマー類（たとえばポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸等）、ポリアルカンオキシド類（たとえばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等）およびポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、本発明の抗体を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子的実体として約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。たとえばＰＥＧ５０００およびＰＥＧ２０，０００が使用でき、前記下付き文字はダルトンで表したポリマーの平均分子量である。親水性ポリマー基は、１〜約６個のアルキル基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、適切な方法を使用することによって調製できる。たとえば、アミン基を含むポリマーは、脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボキシレートとカップリングさせることができ、脂肪酸または脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（たとえばＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化された）は、ポリマー上のヒドロキシル基とカップリングさせることができる。

【0072】

本発明の抗体を修飾するのに適した脂肪酸および脂肪酸エステルは、飽和であり得るかまたは１もしくは以上の不飽和単位を含有し得る。本発明の抗体を修飾するのに適した脂
肪酸は、たとえばｎ−ドデカノエート（Ｃ₁₂、ラウレート）、ｎ−テトラデノエート（Ｃ₁₄、ミリステート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ₁₈、ステアレート）、ｎ−エイコサノエート（Ｃ₂₀、アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ₂₂、ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ₃₀）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ₄₀）、シス−δ９−オクタデカノエート（Ｃ₁₈、オレエート）、すべてのシス−δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート（Ｃ₂₀、アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸等を含む。適切な脂肪酸エステルは、直鎖または分枝鎖低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルを包含する。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含み得る。

【0073】

修飾ヒト抗体および抗原結合フラグメントは、１またはそれ以上の変性剤との反応などの、適切な方法を用いて調製できる。「変性剤」は、この用語が本明細書で使用される場合、活性化基を含有する適切な有機基（たとえば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で、２番目の化学基と反応し、それによって変性剤と２番目の化学基の間で共有結合を形成することができる化学的部分または官能基である。たとえば、アミン反応性活性化基は、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＭＨＳ）等のような求電子基を含む。チオール類と反応することができる活性化基は、たとえばマレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）等を含む。アルデヒド官能基は、アミンまたはヒドラジド含有分子に結合することができ、アジド基は三価リン基と反応してホスホルアミデートまたはホスホルイミド結合を形成することができる。分子中に活性化基を導入する適切な方法は当技術分野において公知である（たとえばＨｅｒｎａｎｓｏｎ， Ｇ． Ｔ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９６）参照）。活性化基は、有機基（たとえば親水性ポリマー、脂肪酸または脂肪酸エステル）に直接、またはリンカー部分、たとえば１もしくはそれ以上の炭素原子が酸素、窒素または硫黄などのヘテロ原子によって置換されていてもよい二価Ｃ₁−Ｃ₁₂基を介して結合され得る。適切なリンカー
部分は、たとえばテトラエチレングリコール、−（ＣＨ₂）₃−、−ＮＨ−（ＣＨ₂）₆−ＮＨ−、−（ＣＨ₂）₂−ＮＨ−および−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ
−ＣＨ−ＮＨ−を含む。リンカー部分を含む変性剤は、たとえばモノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（たとえばモノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させて遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間でアミド結合を形成することによって生成できる。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理して、前述したように別のカルボキシレートにカップリングさせ得る第一級アミンを露出させることによって生成物から除去できるか、またはマレイン酸無水物と反応させ、生じた生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる。（たとえば、その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．，
国際公開公報第ＷＯ９２／１６２２１号参照）。

【0074】

本発明の修飾抗体は、ヒト抗体または抗原結合フラグメントを変性剤と反応させることによって生成できる。たとえば、アミン反応性変性剤、たとえばＰＥＧのＮＨＳエステルを使用することにより、有機部分を非部位特異的に抗体に結合することができる。修飾ヒト抗体または抗原結合フラグメントはまた、抗体または抗原結合フラグメントのジスルフィド結合（たとえば鎖内ジスルフィド結合）を還元することによっても調製できる。還元された抗体または抗原結合フラグメントを、次に、チオール反応性変性剤と反応させて本発明の修飾抗体を生成することができる。本発明の抗体の特定部位に結合された有機部分を含む修飾ヒト抗体および抗原結合フラグメントは、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ３：１４７−１５３ （１９
９２）； Ｗｅｒｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ５：４１１−４１７ （１９９４）； Ｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ６（１０）：２２３３− ２２４１ （１９９７）； Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ２４（１）： ５９−６８ （１９９６）；
Ｃａｐｅｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ５６（４）：４５６−４６３ （１９９７））、およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ． Ｔ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９６）に記載されている方法などの、適切な方法を用いて調製できる。

【0075】

本発明の抗体は、広い範囲の親和性（Ｋ_D）でヒトＩＬ−６に結合することができる。
好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのヒトｍＡｂは、場合により、高い親和性でヒトＩＬ−６に結合し得る。たとえば、ｍＡｂは、０．１〜９．９（またはその中の任意の範囲もしくは値）×１０^-7、１０^-8、１０^-9、１０^-10、１０^-11、１０^-12、１０^-13またはその中の任意の範囲もしくは値のような、しかしこれらに限定されない、約１０^-7Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＩＬ−６に結合することができる。

【0076】

抗原に対する抗体の親和性またはアビディティーは、任意の適切な方法を用いて実験的に決定することができる。（たとえば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ， ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉｂｏｄｙ− Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，煤@Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍ
ｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ． （１９８４）； Ｋｕｂｙ， Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９９２）；および本明細書で述べる方法参照。）特定の抗体−抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（たとえば塩濃度、ｐＨ）下で測定した場合異なり得る。従って、親和性および他の抗原結合パラメータ（たとえば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは抗体および抗原の標準化溶液、ならびに本明細書で述べる緩衝液などの標準化緩衝液で行われる。

【0077】

本発明の方法および組成物において有用な抗ＩＬ−６抗体は、ＩＬ−６に高い親和性で結合することならびに、場合によりおよび好ましくは、低い毒性を有することを特徴とする。特に、可変領域、定常領域およびフレームワークなどの個々の成分が、個別におよび／または集合的に、場合によりおよび好ましくは、低い免疫原性を有する、本発明の抗体、特定フラグメントまたは変異体は、本発明において有用である。本発明において使用できる抗体は、場合により、症状の測定可能な緩和ならびに低いおよび／または許容される毒性で長期間にわたって患者を治療するそれらの能力を特徴とする。低いまたは許容される免疫原性および／または高い親和性、ならびに他の適切な特性は、達成される治療結果に寄与し得る。「低い免疫原性」は、本明細書では、治療される患者の約７５％未満、または好ましくは約５０％未満において有意のＨＡＨＡ、ＨＡＣＡまたはＨＡＭＡ応答を生じさせること、および／または治療される患者において低い力価をもたらすこと（二重抗原酵素免疫検定法で測定される約３００未満、好ましくは約１００未満）（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４４：１１２５−１１２７（１９９４））と定義される。

【0078】

少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、ヒト化抗体である二重特異性、ヘテロ特異性、ヘテロコンジュゲートまたは同様の抗体もまた使用できる。本発明の場合、結合特異性の一方は少なくとも１つのＩＬ−６タンパク質に対してであり、他方は任意の他の抗原に対してである。二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２本の重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖と軽鎖のランダムな組合せのゆえに、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる、正しい分子の精製はかなり面倒であり、生成物の収率は低い。同様の手順は、たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報第ＷＯ９３／０８８２９号、米国特許第６，２１０，６６８号、同第６，１９３，９６７号、同第６，１３２，９９２号、同第６，１０６，８３３号、同第６，０６０，２８５号、同第６，０３７，４５３号、同第６，０１０，９０２号、同第５，９８９，５３０号、同第５，９５９，０８４号、同第５，９５９，０８３号、同第５，９３２，４４８号、同第５，８３３，９８５号、同第５，８２１，３３３号、同第５，８０７，７０６号、同第５，６４３，７５９号、同第５，６０１，８１９号、同第５，５８２，９９６号、同第５，４９６，５４９号、同第４，６７６，９８０号、国際公開公報第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／００３７３号、欧州特許第ＥＰ０３０８９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ
Ｊ．１０：３６５５（１９９１），Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）に開示されている。

【0079】

核酸分子
配列番号１、３、５、・・・３１、６８〜９８または１３０〜１６０の少なくとも１つの連続するアミノ酸の少なくとも７０〜１００％をコードするヌクレオチド配列、その特定フラグメント、変異体もしくはコンセンサス配列、またはこれらの配列の少なくとも１つを含む寄託されたベクターなどの、本明細書で提供される情報を使用して、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体をコードする本発明の核酸分子が、本明細書で述べるまたは当技術分野で公知の方法を用いて入手できる。

【0080】

本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡまたは任意の他の形態などのＲＮＡの形態、またはクローニングによって得られるもしくは合成によって生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡの形態、またはそれらの任意の組合せであり得る。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖もしくは一本鎖、またはそれらの任意の組合せであり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であり得、またはアンチセンス鎖とも称される非コード鎖であり得る。

【0081】

本発明の単離された核酸分子は、場合により１またはそれ以上のイントロンを伴う、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、たとえば、限定されることなく、少なくとも１つの重鎖（たとえば配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２もしくは９９〜１２９）または軽鎖（たとえば配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０もしくは３７〜６７）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３のような、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定部分を含む核酸分子；抗ＩＬ−６抗体または可変領域についてのコード配列（たとえば配列番号２、４、６、・・・３２、３７〜６７または９９〜１２９）を含む核酸分子；ならびに上述したものと実質的に異なるが、本明細書に述べるようにおよび／または当技術分野において公知のように、遺伝暗号の縮重のために、まだなお少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を包含し得る。言うまでもなく、遺伝暗号は当技術分野において周知である。従って、本発明の特異的抗ＩＬ−６抗体をコードするそのような縮重核酸変異体を作製することは当業者にとって日常的である。たとえばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、前出参照。そしてそのような核酸変異体は本発明に包含される。本発明の単離核酸分子の非限定的な例は、それぞれ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ可変領域およびＬＣ可変領域をコードする核酸の非限定的な例に対応する、配列番号２、４、６、・・・３２、３７〜６７または９９〜１２
９を含む。

【0082】

本明細書で示すように、抗ＩＬ−６抗体をコードする核酸を含む本発明の核酸分子は、単独で、抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードするもの；全長抗体またはその一部のコード配列；抗体、フラグメントまたは部分のコード配列、ならびに付加的な配列、たとえば転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを包含するｍＲＮＡプロセシングにおいて役割を果たす（たとえばリボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）、転写されるが翻訳されない配列のような、非コード５’および３’配列が含むがこれらに限定されない、付加的な非コード配列と共に、少なくとも１つのイントロンのような上記の付加的コード配列を伴うまたは伴わない、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチドのコード配列；付加的な機能を提供するもののような、付加的なアミノ酸をコードする付加的なコード配列を包含するが、これらに限定されない。従って、抗体をコードする配列は、抗体フラグメントまたは部分を含む融合抗体の精製を容易にするペプチドをコードする配列などの、マーカー配列に融合することができる。

【0083】

本明細書で述べるポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本発明は、本明細書で開示するポリヌクレオチドに選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離核酸を提供する。従って、この実施形態のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離する、検出するおよび／または定量するために使用できる。たとえば、本発明のポリヌクレオチドは、寄託されたライブラリー中の部分または完全長クローンを同定する、単離するまたは増幅するのに使用できる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離された、またはさもなければヒトもしくは哺乳動物核酸ライブラリーからのｃＤＮＡに相補的な、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列である。

【0084】

好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％の完全長配列、好ましくは少なくとも８５％または９０％の完全長配列、より好ましくは少なくとも９５％の完全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーは、まれな配列の表示を高めるために基準化され得る。低または中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、典型的には、しかし排他的ではなく、相補的配列に対して低い配列同一性を有する配列に関して使用される。中および高ストリンジェンシー条件は、場合により、より大きな同一性の配列に関して使用できる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソロガスまたはパラロガス配列を同定するために使用できる。

【0085】

場合により、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で述べるポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも一部をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションのために使用できる核酸配列を包含する。たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出；Ｃｏｌｌｉｇａｎ、前出参照。

【0086】

核酸の構築
本発明の単離核酸は、当技術分野において周知のように、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、またはそれらの組合せを用いて作製することができる。

【0087】

核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて配列を好都合に含み得る。たとえば、ポリヌクレオチドの単離に役立つように１またはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入することができる。また、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立つように翻訳可能な配列を挿入することができる。たとえば、ヘキサ−ヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製する好都合な手段を提
供する。コード配列を除く本発明の核酸は、場合により、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、アダプターまたはリンカーである。

【0088】

そのようなクローニングおよび／または発現配列に、クローニングおよび／または発現におけるそれらの機能を最適化する、ポリヌクレオチドの単離に役立つ、または細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善するために付加的な配列を加えることができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプターおよびリンカーの使用は当技術分野において周知である。（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ、；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、前出参照）。

【0089】

核酸を構築するための組換え法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの任意の組合せなどの、本発明の単離核酸組成物は、当業者に公知の様々なクローニング方法を用いて生物学的ソースから入手できる。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件下で、本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中の所望配列を同定するのに使用する。ＲＮＡの単離ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築は当業者に周知である（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ、；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、前出参照）。

【0090】

核酸スクリーニングおよび単離方法
ｃＤＮＡまたゲノムライブラリーは、本明細書で開示するもののような、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用してスクリーニングできる。プローブを使用してゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズし、同じかまたは異なる生物において相同な遺伝子を単離することができる。当業者は、ハイブリダイゼーションの様々な度合のストリンジェンシーがアッセイにおいて使用できること；およびハイブリダイゼーションまたは洗浄媒質のいずれかがストリンジェントであり得ることを認識する。ハイブリダイゼーションの条件がストリンジェントになると共に、二本鎖の形成が起こるためにはプローブと標的との間により大きな度合の相補性が存在しなければならない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、およびホルムアミドなどの部分的に変性する溶媒の存在の１またはそれ以上によって制御され得る。たとえば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、たとえば０％〜５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作を介して、反応物溶液の極性を変えることによって好都合に変化する。検出可能な結合のために必要とされる相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質および／または洗浄媒質のストリンジェンシーに従って異なる。相補性の程度は、最適には１００％、または７０〜１００％、またはその中の任意の範囲もしくは値である。しかし、プローブおよびプライマーにおける小さな配列変異は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄媒質のストリンジェンシーを低下させることによって相殺され得ることが理解されるべきである。

【0091】

ＲＮＡまたはＤＮＡの増幅の方法は当技術分野において周知であり、本明細書で提示する教示および指針に基づき、過度の実験を必要とせずに本発明に従って使用できる。
ＤＮＡまたはＲＮＡ増幅の公知の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連増幅工程（たとえば、Ｍｕｌｌｉｓ， ｅｔ ａｌ．への米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号；Ｔａｂｏｒ， ｅｔ ａｌ．への米国特許第４，７９５，６９９号および同第４，９２１，７９４号；Ｉｎｎｉｓへの米国特許第５，１４２，０３３号；Ｗｉｌｓｏｎ， ｅｔ
ａｌ．への米国特許第５，１２２，４６４号；Ｉｎｎｉｓへの米国特許第５，０９１，３１０号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ，ｅｔ ａｌ． への米国特許第５，０６６，５８４号；Ｇｅｌｆａｎｄ， ｅｔ ａｌ． への米国特許第４，８８９，８１８号；Ｓｉｌｖｅｒ， ｅｔ ａｌへの米国特許第４，９９４，３７０号；Ｂｉｓｗａｓへの米国特許第４，７６６，０６７号；Ｒｉｎｇｏｌｄへの米国特許第４，６５６，１３４号参照）ならび
に二本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを用いるＲＮＡ媒介増幅（Ｍａｌｅｋ， ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，１３０，２３８号、商標名ＮＡＳＢＡ）を含むが、これらに限定されず、前記参考文献の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、前出参照）。

【0092】

たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、本発明のポリヌクレオチドおよび関連遺伝子の配列をゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから直接増幅するために使用できる。ＰＣＲおよび他のインビトロ増幅方法はまた、たとえば、発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするため、試料中の所望ｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用する核酸を作製するため、核酸配列決定のため、または他の目的のために有用であり得る。当業者をインビトロ増幅方法へと導くのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、前出、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌ、前出、ならびにＭｕｌｌｉｓ， ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）；およびＩｎｎｉｓ， ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０）に認められる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販のキットは当技術分野において公知である。たとえば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）参照。加えて、たとえばＴ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は、長いＰＣＲ産物の収率を改善するために使用できる。

【0093】

核酸を構築するための合成方法
本発明の単離核酸はまた、公知の方法（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．、前出参照）による直接化学合成によって作製することもできる。化学合成は、一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、それを相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として用いるＤＮＡポリメラーゼでの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換することができる。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基またはそれ以上の配列に限定され得るが、短い配列の連結によってより長い配列が得られることを認識する。

【0094】

組換え発現カセット
本発明はさらに、本発明の核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本発明の核酸配列、たとえば本発明の抗体をコードするｃＤＮＡまたはゲノム配列は、少なくとも１つの所望宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築するために使用できる。組換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を指令する転写開始調節配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む。異種および非異種（すなわち内因性）プロモーターの両方が、本発明の核酸の発現を指令するために使用できる。

【0095】

一部の実施形態では、プロモーター、エンハンサーまたは他のエレメントとして働く単離核酸を、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方調節または下方調節するように本発明のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（上流、下流またはイントロン内）に導入することができる。たとえば、内因性プロモーターを、突然変異、欠失および／または置換によってインビボまたはインビトロで変化させることができる。

【0096】

ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、当技術分野において周知のように、本発明の単離核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の作製に関する。たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込
まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出；Ａｕｓｕｂｅｌ、前出参照。

【0097】

ポリヌクレオチドは、場合により、宿主における増殖についての選択可能なマーカーを含むベクターに連結することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物、または荷電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウイルスである場合、それを、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングし、その後宿主細胞に形質導入することができる。

【0098】

ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。発現構築物は、転写開始部位、終結部位および、転写される領域内に、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される成熟転写産物のコード部分は、好ましくは、最初に翻訳開始コドンおよび翻訳されるｍＲＮＡの末端に適切に位置する終止コドン（たとえばＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含み、哺乳動物または真核細胞発現のためにはＵＡＡおよびＵＡＧが好ましい。

【0099】

発現ベクターは、好ましくは、しかし場合により、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーは、たとえば、真核細胞培養についてはメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターセ（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；同第４，６５６，１３４号；同第４，９５６，２８８号；同第５，１４９，６３６号；同第５，１７９，０１７号）、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸、またはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号）耐性遺伝子、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌または原核生物における培養についてはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない（上記特許は全体が参照により本明細書に組み込まれる）。上述した宿主細胞のための適切な培地および培養条件は当技術分野において公知である。適切なベクターは当業者に容易に明らかである。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染または他の公知の方法によって実施できる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｓｕｐｒａ、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １−４ ａｎｄ
１６−１８； Ａｕｓｕｂｅｌ， ｓｕｐｒａ， Ｃｈａｐｔｅｒｓ １， ９， １３， １５， １６に記載されている。

【0100】

本発明の少なくとも１つの抗体は、融合タンパク質のような修飾形態で発現され、分泌シグナルだけでなく、付加的な異種機能領域も含むことができる。たとえば、付加的なアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、精製の間またはその後の取り扱いおよび保存の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善するために抗体のＮ末端に付加することができる。また、精製を容易にするためにペプチド部分を本発明の抗体に付加することができる。そのような領域は、抗体またはその少なくとも１つのフラグメントの最終的な調製の前に除去できる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｓｕｐｒａ， Ｃｈａｐｔｅｒｓ １７．２９−１７．４２ ａｎｄ １８．１−１８．７４； Ａｕｓｕｂｅｌ，
ｓｕｐｒａ， Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６， １７ ａｎｄ １８などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。

【0101】

当業者は、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現のために利用可能な数多くの発現系に精通している。
あるいは、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞中で作動させることによって（操作によって）宿主細胞において発現させ得る。そのような方法は、たとえば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号および同第５，７３３
，７６１号に記載されているように、当技術分野において周知である。

【0102】

抗体、その特定部分もしくは変異体の生産のために有用な細胞培養物の例は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系はしばしば細胞単層の形態であるが、哺乳動物細胞懸濁液またはバイオリアクターも使用できる。無傷グリコシル化タンパク質を発現することができる多くの適切な宿主細胞株が当技術分野で開発されており、ＣＯＳ−１（たとえばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（たとえばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（たとえばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（たとえばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）およびＢＳＣ−１（たとえばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞等を含み、これらは、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞は、骨髄腫およびリンパ腫細胞などのリンパ球系由来の細胞が包含される。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１８５１）である。特に好ましい態様として、組換え細胞はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３もしくはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。

【0103】

これらの細胞の発現ベクターは、以下の発現制御配列、たとえば、限定されることなく、複製起点；プロモーター（たとえば後期または初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモーター；エンハンサー、および／またはリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（たとえばＳＶ４０ラージＴ抗原ポリＡ付加部位）などのプロセシング情報部位、および転写終結配列などの１またはそれ以上を含むことができる。たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、前出； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．、前出参照。本発明の核酸またはタンパク質の生産に有用な他の細胞は、公知である、および／または、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）もしくは他の公知のまたは商業的ソースから入手可能である。

【0104】

真核生物宿主細胞を用いる場合、典型的にはポリアデニル化配列または転写終結配列がベクターに組み込まれる。終結配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写産物の正確なスプライシングのための配列も含まれ得る。スプライシング配列の一例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１（１９８３））。さらに、当技術分野において公知のように、宿主細胞における複製を制御する遺伝子配列をベクターに組み込むことができる。

【0105】

抗体の作製
本発明の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体は、当技術分野で周知のように、場合により細胞株、混合細胞株、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団によって産生され得る。たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， Ｎ．Ｙ． （１９８７−２００１）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２．ｓｕｐ
．ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．
（１９８９）． Ｃｏｌｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ （１９９４−２００１）； Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， Ｎ．Ｙ．， （１９９７−２００１）参照。

【0106】

１つのアプローチでは、ハイブリドーマを、適切な不死細胞株（たとえばＳｐ２／０、ＳＰ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、ＳＰ２ ＳＳ１、ＳＰ２ ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａなどの、しかしこれらに限定されない骨髄腫細胞株）等、またはヘテロ骨髄腫、それらの融合産物、またはそれらに由来する任意の細胞もしくは融合細胞、または当技術分野で公知の任意の他の適切な細胞株（たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．参照）等を、単離されたまたはクローニングされた脾、末梢血、リンパ、扁桃、または他の免疫細胞もしくはＢ細胞含有細胞、または内因性もしくは異種核酸のいずれかとして、組換えもしくは内因性の、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯動物、ウマ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長動物、真核生物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖、ハイブリダイズしたもの等またはそれらの任意の組合せとして、重鎖もしくは軽鎖定常もしくは可変もしくはフレームワークもしくはＣＤＲ配列を発現する任意の他の細胞などの、しかしこれらに限定されない、抗体産生細胞と融合することによって作製する。たとえば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｓｕｐｒａ， ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｇａｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｓｕｐｒａ， ｃｈａｐｔｅｒ ２参照。

【0107】

任意の他の適切な宿主細胞も、本発明の抗体、その特定フラグメントまたは変異体をコードする異種または内因性核酸を発現するために使用できる。融合細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択的培養条件または他の適切な公知の方法を用いて単離し、限界希釈または細胞選別または他の公知の方法によってクローニングすることができる。所望の特異性を有する抗体を生産する細胞を適切なアッセイ（たとえばＥＬＩＳＡ）によって選択できる。

【0108】

本発明の抗体はまた、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体をコードする核酸を使用して、乳中にそのような抗体を産生する、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ等のようなトランスジェニック動物または哺乳動物を提供するように調製することができる。そのような動物は公知の方法を用いて提供され得る。たとえば、限定されることなく、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号、同第５，５６５，３６２号；同第５，３０４，４８９号等参照。

【0109】

本発明の抗体は、さらに、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体をコードする核酸を使用して、そのような抗体、特定部分または変異体を植物の部分においてまたはそれらから培養された細胞において産生するトランスジェニック植物および培養植物細胞（たとえば、限
定されることなく、タバコおよびトウモロコシ）を提供するように調製することができる。非限定的な例として、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉は、たとえば誘導的プロモーターを用いて、大量の組換えタンパク質を提供するために成功裡に使用されてきた。たとえば、Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４０：９５−１１８ （１９９９） およびその中で引用される参考文献参照。また、トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系において生産されるものまたは天然のソースから精製されたものと同等の生物活性で、哺乳動物タンパク質を商業生産レベルで発現するために使用されている。たとえば、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ４６４：１２７−１４７ （１９９９）およびその中で引用される参考文献参照。抗体はまた、タバコ種子およびジャガイモ塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体フラグメントを含有するトランスジェニック植物種子から大量に生産されてきた。たとえば、Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１−１０９（１９９８）およびその中で引用される参考文献参照。従って、本発明の抗体はまた、公知の方法に従って、トランスジェニック植物を用いて作製することもできる。たとえば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：９９−１０８ （Ｏｃｔｏｂｅｒ， １９９９）， Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３：５２２−７ （１９９５）； Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０９：３４１−６ （１９９５）； Ｗｈｉｔｅｌａｍ
ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ２２：９４０−９４４ （１９９４）；およびその中で引用される参考文献も参照のこと。上記参考文献の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0110】

抗体の精製
抗ＩＬ−６抗体は、プロテインＡ精製、プロテインＧ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、周知の方法によって組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も、精製のために使用できる。たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１），ｅ．ｇ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ １，４，６，８，９，ａｎｄ １０参照。

【0111】

本発明の抗体は、天然精製された産物、化学合成手順の産物、ならびに、たとえば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主から組換え技術によって生産される産物を包含する。組換え生産手順において使用される宿主に依存して、本発明の抗体は、グリコシル化され得るかまたはグリコシル化されなくてもよく、グリコシル化されることが好ましい。そのような方法は、すべて全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｓｕｐｒａ，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ １７．３７−１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｓｕｐｒａ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １０，１２，１３，１６，１８ ａｎｄ ２０，Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｓｕｐｒａ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ
１２−１４などの多くの標準的な実験室マニュアルに記述されている。

【0112】

精製抗体は、たとえばＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリー、免疫細胞学、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析、Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫｉｎＥｘＡ（商標）反応速度排除分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によって、またはＨＰＬＣ分析ならびに本明細書で開示する多くの他の機能的アッセイによって特徴づけることができ
る。

【0113】

哺乳動物細胞におけるＩＬ−６抗体のクローニングおよび発現
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する少なくとも１つのプロモーターエレメント、抗体コード配列、ならびに転写の終結および転写産物のポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。付加的なエレメントは、エンハンサー、コザック配列、ならびにＲＮＡスプライシングのための供与および受容部位に隣接される介在配列を含む。高度に効率的な転写は、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、レトロウイルス、たとえばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成され得る。しかしながら、細胞エレメントも使用できる（たとえばヒトアクチンプロモーター）。本発明を実施する際に使用するための適切な発現ベクターには、たとえば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮまたはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）またはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９））などのベクターを含む。使用できる哺乳動物宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ ２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。

【0114】

あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれた遺伝子を含有する安定な細胞株において発現させることができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシンまたはハイグロマイシンなどの選択可能なマーカーとの同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。

【0115】

トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされる抗体を発現するために増幅することができる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、数百、さらには数千コピーの対象遺伝子を担持する細胞株を開発するために有用である。もう１つ別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））である。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子（１または複数）を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞が、抗体の作製のためにしばしば使用される。

【0116】

ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現
単離された可変および定常領域をコードするＤＮＡと脱リン酸化ベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次に、大腸菌ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、たとえば制限酵素分析を用いて、プラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含有する細菌を同定する。

【0117】

活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチンを用いてのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏと同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、優性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵素をコードするＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含有する。細胞を、１μｇ／ｍｌのＧ４１８
を添加したα−ＭＥＭに接種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、１０、２５または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したα−ＭＥＭにおいてハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接種する。約１０〜１４日後、単一クローンをトリプシン処理し、次に種々の濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して６穴ペトリ皿または１０ｍｌフラスコに接種する。次に、最も高い濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度のメトトレキサート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含有する新しい６穴プレートに移す。１００〜２００ｍＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで同じ手順を反復する。所望遺伝子産物の発現は、たとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。

【0118】

抗ＩＬ−６抗体組成物
本発明はまた、非天然に生じる組成物、混合物または形態で提供される、本明細書で述べるおよび／または当技術分野で公知の、その少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６またはそれ以上の抗ＩＬ−６抗体を含有する少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物を提供する。そのような組成物は、本明細書で述べる抗体のＣＤＲ領域またはその特定フラグメント、ドメインもしくは変異体の連続するアミノ酸の７０〜１００％から成る群より選択される抗ＩＬ−６抗体アミノ酸配列の、少なくとも１つまたは２つの完全長、Ｃ末端および／またはＮ末端欠失変異体、ドメイン、フラグメントまたは特定変異体を含有する非天然に生じる組成物を含む。好ましい抗ＩＬ−６抗体組成物は、本明細書で述べる抗ＩＬ−６抗体配列の少なくとも１つのＣＤＲまたはＬＢＲ含有部分として、少なくとも１つまたは２つの完全長、フラグメント、ドメインまたは変異体を含む。さらなる好ましい組成物は、本明細書で述べる抗ＩＬ−６ ＡｂのＣＤＲ領域の７０〜１００％の少なくとも１つの４０〜９９％を含む。そのような組成物パーセンテージは、当技術分野で公知のようにまたは本明細書で述べるように、液体または乾燥溶液（ｄｒｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、混合物、懸濁液、乳濁液またはコロイドとしての重量、容量、濃度、モル濃度、または重量モル濃度比である。

【0119】

本発明の抗ＩＬ−６抗体組成物は、そのような調節、治療または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物または患者に対する少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含む組成物または医薬組成物の任意の適切で有効な量の少なくとも１つをさらに含有することができ、場合により、少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（たとえば、限定されることなく、ＴＮＦ抗体またはフラグメント、可溶性ＴＮＦ受容体またはフラグメント、それらの融合タンパク質、または低分子ＴＮＦアンタゴニスト）、抗リウマチ薬（たとえばメトトレキサート、オーラノフィン、金チオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬（たとえばアミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗菌薬）、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、糖尿病関連薬、無機物、栄養素、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、下痢止め薬、鎮咳薬、鎮吐薬、抗潰瘍薬、緩下薬、抗凝固薬、エリスロポエチン（たとえばエポエチンα）、フィルグラスチム（たとえばＧ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制薬（たとえばバシリキシマブ、サイクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節剤、散瞳薬、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経様作用薬、興奮薬、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン
、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインまたサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも１つをさらに含有し得る。そのようなサイトカインの非限定的な例は、ＩＬ−１〜ＩＬ−３４のいずれかを含むが、これらに限定されない。適切な投与量は当技術分野において周知である。たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ， Ｓｔａｍｆｏｒｄ， Ｃｏｎｎ． （２０００）； ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ， Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ
Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００， Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ， Ｃａｌｉｆ． （２０００）参照。

【0120】

そのような抗癌剤または抗感染症薬はまた、本発明の少なくとも１つの抗体と会合、結合、同時製剤または同時投与される毒素分子を含有し得る。毒素は、場合により病的細胞または組織を選択的に死滅させるように働くことができる。病的細胞は、癌細胞または他の細胞であり得る。そのような毒素は、たとえばリシン、ジフテリア毒素、毒液毒素または細菌毒素の少なくとも１つから選択される、毒素の少なくとも１つの機能的細胞傷害性ドメインを含む精製または組換え毒素または毒素フラグメントであり得るが、これらに限定されない。毒素という用語はまた、死をもたらし得る、毒素ショックを含む、ヒトおよび他の哺乳動物において何らかの病的状態を引き起こし得る任意の天然に生じる、突然変異型または組換え細菌またはウイルスによって産生される内毒素および外毒素の両方を包含する。そのような毒素は、腸管毒素原性大腸菌耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、耐熱性エンテロトキシン（ＳＴ）、赤痢菌細胞毒素、アエロモナスエンテロトキシン、トキシックショック症候群外毒素１（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）、またはＣ（ＳＥＣ）、連鎖球菌エンテロトキシン等を含み得るが、これらに限定されない。そのような細菌は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管出血性大腸菌の種の株（たとえば血清型Ｏ１５７：Ｈ７の株）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種（たとえば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種（たとえば志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｓｅ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ）およびソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種（たとえば腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（たとえばウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｈｌｏｂａｃｔｅｒ）種（カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｈｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・フィタス（Ｃａｍｐｈｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ））、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種（たとえばヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）種（たとえばアエロモナス・ソブリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｏｂｒｉａ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ））、プレシオモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）、エルジシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏｓ）種（たとえばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏｓ
ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏｓ ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）を含むが、これらに限定されない。たとえば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，３ｒｄ ｅｄ．，ｐｐ １−１３，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９０）；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２ｄ．Ｅｄ．，ｐｐ ２３９−２５４，Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍａｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７６：１２１−１３４（１９９１）；Ｍａｒｒａｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：７０５−７１１（１９９０）参照。

【0121】

本発明の抗ＩＬ−６抗体化合物、組成物または組合せは、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバント等のような、しかしこれらに限定されない任意の適切な助剤の少なくとも１つをさらに含有し得る。医薬的に許容される助剤が好ましい。Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）１９９０などの、しかしこれに限定されない、そのような滅菌溶液の非限定的な例およびそのような滅菌溶液を調製する方法は、当技術分野において周知である。当技術分野で周知のようにまたは本明細書で述べるように、抗ＩＬ−６抗体、フラグメントまたは変異体組成物の投与の方法、溶解度および／または安定性のために適切な、医薬的に許容される担体は、常套的に選択することができる。

【0122】

本発明の組成物において有用な医薬的賦形剤および添加剤は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（たとえば、単糖、二糖、三糖、四糖およびオリゴ糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖等のような誘導体化糖；ならびに多糖または高分子糖を含む、糖類）を含むが、これらに限定されず、それらは単独でまたは組み合わせて存在することができ、単独でまたは組み合わせて１〜９９．９９重量％または容量％を構成する。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）などの血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン等を含む。緩衝能力においても機能を果たすことができる代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等を含む。１つの好ましいアミノ酸は、グリシンである。

【0123】

本発明における使用に適する炭水化物賦形剤は、たとえば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等のような単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等のような二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等のような多糖；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトール等のようなアルジトールを含む。本発明における使用のための好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロースおよびラフィノースである。

【0124】

抗ＩＬ−６抗体組成物はまた、緩衝剤またはｐＨ調整剤を含有してもよく、典型的には、緩衝剤は、有機酸または塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤は、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸の塩などの
有機酸塩；トリス、トロメタミン塩酸塩またはリン酸緩衝液を含む。本発明における使用のための好ましい緩衝剤は、クエン酸塩などの有機酸塩である。

【0125】

加えて、本発明の抗ＩＬ−６抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（高分子糖）、デキストレート（たとえば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（たとえば、「ＴＷＥＥＮ ２０」および「ＴＷＥＥＮ ８０」などのポリソルベート）、脂質（たとえばリン脂質、脂肪酸）、ステロイド（たとえばコレステロール）、ならびにキレート化剤（たとえばＥＤＴＡ）などの高分子賦形剤／添加剤を含み得る。

【0126】

本発明による抗ＩＬ−６抗体、部分または変異体組成物における使用に適するこれらおよび付加的な公知の医薬賦形剤および／または添加剤は、たとえば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”１９．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、および“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”５２ｎｄｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）に列挙されているように、当技術分野において公知である。好ましい担体または賦形剤材料は、炭水化物（たとえば糖類およびアルジトール）ならびに緩衝剤（たとえばクエン酸塩）または高分子剤である。

【0127】

製剤
上記のように、本発明は、医薬的に許容される製剤中に少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含有する、好ましくは食塩水または選択された塩を含むリン酸緩衝液である安定な製剤、ならびに防腐剤を含有する保存溶液および製剤、ならびに医薬または獣医学的用途に適する多回使用保存製剤を提供する。保存製剤は、水性希釈剤中に、少なくとも１つの公知の防腐剤または場合により、少なくとも１つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（たとえば六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、もしくはそれらの混合物から成る群より選択される少なくとも１つの防腐剤を含有する。たとえば０．００１〜５％、またはその中の任意の範囲もしくは値などの、たとえば０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、またはその中の任意の範囲もしくは値などの、しかしこれらに限定されない、任意の適切な濃度または混合物が当技術分野で公知のように使用できる。非限定的な例は、防腐剤なし、０．１〜２％ｍ−クレゾール（たとえば０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、０．１〜３％ベンジルアルコール（たとえば０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１〜０．５％のチメロサール（たとえば０．００５、０．０１）、０．００１〜２．０％フェノール（たとえば０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％アルキルパラベン（１または複数）（たとえば０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）等を含む。

【0128】

上記のように、本発明は、包装材料ならびに、場合により水性希釈剤中に、所定の緩衝剤および／または防腐剤と共に少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の溶液を含有する少なくとも１つのバイアルを含む製品を提供し、前記包装材料は、そのような溶液が１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間またはそれ以上の期間にわたって保持され得ることを示すラベルを含む。本発明はさらに、包装材料、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含有する第一バイアル、および所定の緩衝剤または防腐剤の水性希釈剤を含有する第二のバイアルを含む製品を包含し、前記包装材料は、２４時間またはそれ以上の期間にわたって保持され得る溶液を形成するために少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を水性希釈剤中で再構成することを患者に指示するラベルを含む。

【0129】

本発明に従って使用される少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体は、本明細書で述べるようにまたは当技術分野で公知のように、哺乳動物細胞またはトランスジェニック標本からの方法を含む、組換え手段によって作製することができ、または他の生物学的ソースから精製することができる。

【0130】

本発明の製品における少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の範囲は、湿式／乾式系（ｗｅｔ／ｄｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）における場合、再構成の際に約１．０μｇ／ｍｌ〜約１０００ｍｇ／ｍｌの濃度を生じさせる量を含むが、より低いおよびより高い濃度も実施可能であり、意図される送達ビヒクルに依存し、たとえば溶液製剤は、経皮パッチ、経肺、経粘膜または浸透圧もしくはマイクロポンプ法とは異なる。

【0131】

好ましくは、水性希釈剤は、場合により、医薬的に許容される防腐剤をさらに含む。好ましい防腐剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、またはそれらの混合物から成る群より選択されるものを含む。製剤に使用される防腐剤の濃度は、抗菌作用を生じさせるのに十分な濃度である。そのような濃度は、選択される防腐剤に依存し、当業者によって容易に決定される。

【0132】

他の賦形剤、たとえば等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存性増強剤を、場合によりおよび好ましくは、希釈剤に加えることができる。グリセリンなどの等張剤は、公知の濃度で一般的に使用される。生理的に耐容される緩衝剤を、好ましくは、改善されたｐＨ管理を与えるために添加する。製剤は、約ｐＨ４〜約ｐＨ１０などの、広範囲のｐＨをカバーすることができ、好ましい範囲は約ｐＨ５〜約ｐＨ９、最も好ましい範囲は約６．０〜約８．０にわたり得る。好ましくは、本発明の製剤は約６．８〜約７．８のｐＨを有する。好ましい緩衝剤は、リン酸緩衝剤、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。

【0133】

Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、またはポリソルベート２０もしくは８０またはポロキサマー１８４もしくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、ポリオール、他のブロックコポリマーなどの非イオン性界面活性剤のような医薬的に許容される可溶化剤、ならびにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡなどのキレート化剤のような他の添加剤を、場合により、凝集を低減するために製剤または組成物に添加することができる。これらの添加剤は、ポンプまたはプラスチック容器を使用して製剤を投与する場合、特に有用である。医薬的に許容される界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を軽減する。

【0134】

本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体と、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールまたはそれらの混合物から成る群より選択される防腐剤を水性希釈剤中で混合することを含む工程によって調製され得る。水性希釈剤中で少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体と防腐剤を混合することは、従来の溶解および混合手順を用いて実施される。適切な製剤を調製するために、たとえば、緩衝液中の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の測定量を、所望濃度のタンパク質および防腐剤を提供するのに十分な量の、緩衝液中の所望防腐剤と組み合わせる。この工程の変法は当業者によって認識される。たとえば、成分を添加する順序、付加的な添加剤を使用するかどうか、製剤を調製する温度およびｐＨは、すべて、使用される濃度および投与手段のために最適化することができる因子である。

【0135】

特許請求する製剤は、透明溶液として、または水性希釈剤中に、水、防腐剤および／または賦形剤、好ましくはリン酸緩衝液および／または食塩水および選択された塩を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体のバイアルを含むデュアルバイアルとして患者に提供され得る。単一溶液バイアルまたは再構成を必要とするデュアルバイアルのいずれもが、複数回再使用でき、単回または複数サイクルの患者治療のために十分であり得、従って、現在使用可能なものよりも好都合な治療レジメンを提供することができる。 本特許請求の製品は、即時から２４時間またはそれ以上の期間にわたる投与に有用である。従って、本発明の特許請求する製品は患者に有意の利点を提供する。本発明の製剤は、場合により、約２℃〜約４０℃の温度で安全に保存することができ、また長期間にわたってタンパク質の生物活性を保持することができ、従って、溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、または９６時間またはそれ以上の期間にわたって保持および／または使用できることを示す包装ラベルを許容する。保存希釈剤を使用する場合、そのようなラベルは、１〜１２か月、半年、１年半および／または２年までの使用を含み得る。

【0136】

本発明における少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の溶液は、水性希釈剤中に少なくとも１つの抗体を混合することを含む工程によって調製され得る。混合は、従来の溶解および混合手順を用いて実施される。適切な希釈液を調製するために、たとえば、水または緩衝液中の少なくとも１つの抗体の測定量を、所望濃度のタンパク質および、場合により、防腐剤または緩衝剤を提供するのに十分な量で組み合わせる。この工程の変法は当業者によって認識される。たとえば、成分を添加する順序、付加的な添加剤を使用するかどうか、製剤を調製する温度およびｐＨは、すべて、使用される濃度および投与手段のために最適化することができる因子である。

【0137】

特許請求する製品は、透明溶液として、または水性希釈剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体のバイアルを含むデュアルバイアルとして患者に提供され得る。単一溶液バイアルまたは再構成を必要とするデュアルバイアルのいずれもが、複数回再使用でき、単回または複数サイクルの患者治療のために十分であり得、従って、現在使用可能なものよりも好都合な治療レジメンを提供する。

【0138】

特許請求する製品は、透明溶液または水性希釈剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された少なくとも１つの抗体のバイアルを含むデュアルバイアルを、薬局、診療所、または他のそのような機関および施設に提供することによって患者に間接的に提供され得る。この場合の透明溶液は、１リットルまでまたはさらに大きいサイズであり得、そこから少なくとも１つの抗体溶液の一部をより小さなバイアルに移すために１回または複数回取り出し、薬局または診療所によってそれらの顧客および／または患者に提供さ
れ得る、大きな容器を提供することができる。

【0139】

これらの単一バイアル系を含む広く認められている装置は、溶液の送達用のペンインジェクター装置、たとえばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．，ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇ．（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．，ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）によって製造または開発された、たとえばＢＤ Ｐｅｎｓ、ＢＤ Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ−Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）およびＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊ−ｔｉｐ Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（登録商標）などを含む。デュアルバイアル系を含む広く認められている装置は、ＨｕｍａｔｒｏｎＰｅｎ（登録商標）などの、再構成した溶液の送達用のカートリッジ中で凍結乾燥薬剤を再構成するためのペンインジェクター系が包含される。

【0140】

本特許請求の製品は包装材料を含む。包装材料は、規制当局によって要求される情報に加えて、製品が使用できる条件を提供する。本発明の包装材料は、２つのバイアルの湿潤／乾燥製品のための溶液を形成し、２〜２４時間またはそれ以上の期間にわたって溶液を使用するために少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を水性希釈剤中に再構成するための患者への指示書を提供する。単一バイアルの溶液製品に関しては、ラベルは、そのような溶液が２〜２４時間またはそれ以上にわたって使用できることを指示する。本特許請求の製品は、ヒト医薬品用途のために有用である。

【0141】

本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体と選択された緩衝液、好ましくは食塩水または選択された塩を含有するリン酸緩衝液とを混合することを含む工程により調製され得る。少なくとも１つの抗体と水性希釈剤中の緩衝剤を混合することは、従来の溶解および混合手順を用いて実施される。適当な製剤を調製するために、たとえば、水または緩衝液中の少なくとも１つの抗体の測定量を、所望濃度のタンパク質および緩衝液を提供するのに十分な量で水中の所望緩衝剤と組み合わせる。この工程の変法は当業者によって認識される。たとえば、成分を添加する順序、付加的な添加剤を使用するかどうか、製剤を調製する温度およびｐＨは、すべて、使用される濃度および投与手段のために最適化することができる因子である。

【0142】

特許請求する安定なまたは保存された製剤は、透明溶液として、または水性希釈剤中に防腐剤もしくは緩衝剤および賦形剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体のバイアルを含むデュアルバイアルとして患者に提供され得る。単一溶液バイアルまたは再構成を必要とするデュアルバイアルのいずれもが、
複数回再使用でき、単回または複数サイクルの患者治療のために十分であり得、従って、現在使用可能なものよりも好都合な治療レジメンを提供する。

【0143】

本明細書中で述べる安定なまたは保存された製剤または溶液のいずれか中の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体は、当技術分野で周知のように、ＳＣまたはＩＭ注入、経皮、経肺
、経粘膜、移植、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、または当業者によって認識される他の手段を含む様々な送達方法を介して、本発明に従って患者に投与することができる。

【0144】

治療への応用
本発明の１つの実施形態では、本開示の抗ＩＬ−６抗体を含有する医薬組成物は、生物、好ましくは動物、好ましくは哺乳動物へのヒト化抗体の投与を容易にする。特定の哺乳動物は、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジおよびブタ動物、非ヒト霊長動物、ならびにヒトを含む。ヒトが特に好ましい。

【0145】

ＩＬ−６は、その多面的活性のために、様々な疾患の病理に関与する。それゆえ、ＩＬ−６に対する高親和性の中和キメラまたはヒト抗体は、癌、悪液質、ＳＬＥ、関節リウマチ、骨粗しょう症、脳外傷、脳浮腫、うつ病およびＣＨＦなどのＩＬ−６関連疾患において使用されることが望ましい。１つの好ましい態様では、本開示の抗ＩＬ−６抗体は関節リウマチを治療するために使用できる。抗ＩＬ−６抗体またはキメラもしくはヒト化を含むこれらのｍＡｂの任意の誘導体、またはフラグメントは、骨痛を緩和するうえで、黒色腫、腎癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌および多発性骨髄腫などの腫瘍の増殖を抑制するうえで、リンパ増殖性障害およびＩＬ−６が関係づけられてきた他の疾患において使用できる。これらの抗体は、単一作用物質としてまたは他の治療薬と組み合わせて使用できる。加えて、これらのＭａｂは、細胞傷害性薬剤の治療効果を高めることができる化学療法増感剤として使用できる。これらの抗体は、放射線の効果を改善し得る放射線増感剤として使用できる。それらはまた、ＩＬ−２、ＩＬ−１２および／またはＩＦＮαなどの他の腫瘍免疫調節剤と組み合わせて使用することもできる。加えて、抗ＩＬ−６抗体は、抗ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＬ−２、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、ＣＤ５２、ＣＤ２０、ＲＳＶタンパク質、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体等のようなタンパク質のモノクローナル抗体；ならびにＲｉｔｕｘａｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｍｙｌｏｔａｒｇ、Ｃａｍｐａｔｈ、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｂｅｘｘａｒ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＡｖａｓｔｉｎおよびＶｅｃｔｉｂｉｘを含む市販の承認された抗体と組み合わせて使用できる。

【0146】

従って、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を使用して、当技術分野で公知のようにまたは本明細書で述べるように、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つのＩＬ−６関連疾患を調節するまたは治療する方法を提供する。

【0147】

ＩＬ−６は、悪性細胞のアポトーシスの阻害を含む自己分泌またはパラ分泌機構を介して多発性骨髄腫（ＭＭ）における悪性形質細胞の増殖、分化および生存を増強することが公知である。ＭＭは治療不能の悪性形質細胞障害であるが、ＩＬ−６をブロックすることが有効な治療であると主張されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ：Ｎｅｗ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：１４７−１６５，２０００）。ＩＬ−６はまた、基底細胞癌における腫瘍形成作用も有するが、ＩＬ−６でトランスフェクトした細胞は、アポトーシスを抑制することおよび活発に促進することの両方によって高い腫瘍増殖速度を示した（Ｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｃｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２ ｐｐ．１９８−２０８，２００１）。ＩＬ−６はまた、ｍｄｒ１遺伝子発現（ｍｄｒ１およびメタロチオネイン経路）を誘導することによって化学療法に対する乳癌細胞の耐性も促進し得る（Ｃｏｎｚｅ ｅｔ ａｌ，Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ Ｃａｕｓｅｓ Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：８８５１−８８５８，２００１）。（Ｃｏｎｚｅ ｅｔ ａｌ，Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ Ｃａｕｓｅｓ Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｅｒ Ｒｅｓ ６１：８８５１−８８５８，２００１）。

【0148】

腫瘍細胞の生存および疾患進行を媒介するＩＬ−６の能力は、インビトロおよびインビボの両方で腫瘍増殖への抗ＩＬ−６ ｍＡｂの阻害作用によって確認された。ＩＬ−６の遮断は、インビトロでヒト脳腫瘍（グリア芽細胞腫）の増殖を抑制できることが報告された（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ− ６−ｍｅｄｉａｔｅｄ
ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｕ８７ＭＧ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ７１：１８３７−１８４５，１９９８）。同じアプローチを使用して、マウスＣＬＢ８抗ＩＬ−６抗体の注入はヒト腫瘍を担持するマウスの生存を延長させることが示された（Ｍａｕｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ＩＬ−６．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；３０（７）：２０６５−７３， ２０００）。また、ｍＣＬＢ８抗ＩＬ−６抗体は、ヌードマウスにおいてヒト腎癌腫瘍の増殖を後退させ、血清カルシウム濃度を低下させることも報告された（Ｗｅｉｓｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ
ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８（５）：１８７９−８．，１９９５）。ＣＬＢ−８抗体はまた、マウスにおける樹立したヒトホルモン不応性前立腺腫瘍異種移植片も退縮させた （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２００１）。抗インターロイキン−６モノクローナル抗体は、ヌードマウスにおけるヒト前立腺癌異種移植片の退縮を誘導する（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ；４８（ｌ）：４７−５３）。

【0149】

ＩＬ−６はまた、悪性疾患の予後因子およびマーカーでもあり得る。腎細胞癌（ＲＣＣ）において、高レベルのＩＬ−６は腫瘍転移、そして最終的には予後不良および短い生存期間と相関することが報告された（Ｊｅａｎ−Ｙｖｅｓ Ｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．１９９２）。さらに、ＲＣＣでは、高い血清ＩＬ−６は、ＩＬ−２治療に対する応答不良に関連し（Ｆｕｍａｇａｌｌｉ ｅｔ ａｌ． １９９９）Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８０（３−４）：４０７−ｌ １）、ＩＬ−２関連毒性の程度と相関する （Ｃａｐｕｒｏｎ ｅｔ ａｌ．２００１）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；２６（８）：７９７−８０８）。

【0150】

ＩＬ−６の高いレベルはまた、乳癌における予後不良および転移性疾患の存在とも相関する（Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ ２０００ ａｎｄ Ｂｅｎｏｙ ２００２） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ；７（２）：１２４−９．Ｓｅｒｕｍ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６， ｐｌａｓｍａ ＶＥＧＦ，ｓｅｒｕｍ ＶＥＧＦ，ａｎｄ ＶＥＧＦ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｏａｄ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ；２（４）：３１１−５。

【0151】

ＩＬ−６は、無力症／悪液質および骨吸収などの癌に関連する病的状態における原因因子であると仮定される。ＩＬ−６ノックアウトマウスでは、腫瘍誘発性悪液質（Ｃａｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２０００）および骨吸収（その後の高カルシウム血症）（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．１９９９）が減少することが認められた。癌関連うつ病および脳腫瘍に続発する脳浮腫も、高レベルのＩＬ−６に関連してきた（Ｍｕｓｓｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． ２００１）。本発明の抗ＩＬ−６抗体はまた、ヌードマウスにおけるヒト黒色腫およびヒト前立腺癌誘発性悪液質を抑制した。

【0152】

本発明は、多発性骨髄腫、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、腎細胞癌、膵癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴症候群／悪性高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨痛の少なくとも１つを含むが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物または患者において少なくとも１つの悪性疾患を調節するまたは治療すること；癌転移の抑制；癌悪液質の改善；およびメサンギウム増殖性糸球体腎炎等のような炎症性疾患の治療のための方法を含む。そのような方法は、場合により、そのようなＩＬ−６抗体の投与の前に、同時にまたは後に投与することにより、放射線療法、抗血管新生薬、化学療法剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤等と組み合わせて使用することができる。

【0153】

本発明はまた、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性脈管炎／ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管復元術、アレルギー性／アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、熱傷、電離放射線への暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病変、サルコイドーシス、クローン病、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏症反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱（花粉症）、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、何らかの器官または組織の移植片拒絶反応、腎移植拒絶反応、心移植拒絶反応、肝移植拒絶反応、膵移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植片拒絶反応、軟骨移植拒絶反応、骨移植拒絶反応、小腸移植拒絶反応、胎児胸腺移植片拒絶反応、副甲状腺移植拒絶反応、何らかの器官または組織の異種移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、抗受容体過敏症反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介性細胞傷害、ＩＩＩ型過敏症反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器巨大症、内分泌障害、単クローン性高ガンマグロブリン血症および皮膚変化症候群）、多発性神経障害、臓器巨大症、内分泌障害、単クローン性高ガンマグロブリン血症、皮膚変化症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、脈管炎、心筋梗塞（ＭＩ）後心臓切開術症候群、ＩＶ型過敏症、接触皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植拒絶反応、細胞内生物体に起因する肉芽腫、薬物感受性、代謝性／特発性ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、α１−アンチトリプシン欠損症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗しょう症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎
、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性血球貪食性リンパ組織球症、皮膚疾患、乾癬、脱毛、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ｏｋｔ３療法、抗ｃｄ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（たとえば無力症、貧血、悪液質等を含むが、これらに限定されない）、慢性サリチル酸中毒、睡眠時無呼吸、肥満症、心不全、副鼻腔炎、炎症性腸疾患等の少なくとも１つを含むが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つのＩＬ−６媒介性免疫関連疾患を調節するまたは治療するための方法も提供する。たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ−１７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ．（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９），Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ
ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）参照。

【0154】

本発明はまた、急性または慢性細菌感染、細菌、ウイルスおよび真菌感染を含む急性および慢性の寄生または感染過程、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ型、Ｂ型またはＣ型等）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌Ｏ１５７：ｈ７、溶血性尿毒症症候群／血栓溶解性血小板減少性紫斑症、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、トキシックショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌、トリ型結核菌群、ニューモシスティス・カリニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）肺炎、骨盤内炎症性疾患、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ菌、ライム病、インフルエンザＡ型、エプスタイン‐バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎等の少なくとも１つを含むが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの感染症を調節するまたは／治療するための方法を提供する。

【0155】

そのような方法のいずれもが、場合により、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含有する少なくとも１つの組成物または医薬組成物の有効量を、そのような調節、治療または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物または患者に投与することを含み得る。抗ＩＬ−６療法による治療のための適応症は、参照により本出願に組み込まれる、以下の参考文献：Ｖａｎ Ｓｎｉｃｋ，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：２５３−２７８ （１９９０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ．Ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ＮＯＤ／Ｗｅｈｉ Ｍｉｃｅ，”． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ， ８７：７３９−７４２ （１９９１）；Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａ Ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｐｌａｓｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ，”Ｂｌｏｏｄ，７８（５）：１１９８−１２０４（１９９１）；Ｓｔａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉ−ＩＬ−６ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ａｇａｉｎｓｔ Ｌｅｔｈａｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｅｔｈａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎ Ｍｉｃｅ，”．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５（１２）：４１８５−４１９１ （１９９０）； Ｓｔｒａｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｃｈｅｘｉａ，”．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，８９：１６８１−１６８４ （１９９２）において開示されている。

【0156】

本発明の任意の方法は、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含有する組成物または医薬
組成物の有効量を、そのような調節、治療または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物または患者に投与することを含み得る。そのような方法は、場合により、そのような免疫疾患もしくは悪性疾患を治療するための同時投与または併用療法をさらに含むことができ、前記の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体、その特定部分または変異体の投与は、前、同時および／または後に、少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（たとえば、限定されることなく、ＴＮＦ抗体またはフラグメント、可溶性ＴＮＦ受容体またはフラグメント、それらの融合タンパク質、または低分子ＴＮＦアンタゴニスト）、ＩＬ−１８抗体またはフラグメント、低分子ＩＬ−１８アンタゴニストまたはＩＬ−１８受容体結合タンパク質、ＩＬ−１抗体（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方を含む）またはフラグメント、可溶性ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗リウマチ薬（たとえばメトトレキサート、オーラノフィン、金チオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン、放射線療法、抗血管新生薬、化学療法剤、サリドマイド、筋弛緩薬、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬（たとえばアミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗菌薬）、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、糖尿病関連薬、無機物、栄養素、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、エリスロポエチン（たとえばエポエチンα）、フィルグラスチム（たとえばＧ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制薬（たとえばバシリキシマブ、サイクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節剤、散瞳薬、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経様作用薬、興奮薬、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインまたサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも１つを投与することをさらに含む。適切な投与量は当技術分野において周知である。たとえば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ， Ｃｏｎｎ．（２０００）；ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ
Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．（２０００）参照。

【0157】

本発明の組成物、併用療法、同時投与、装置および／または方法（本発明の少なくとも１つの抗体、その特定部分および変異体をさらに含む）に適するＴＮＦアンタゴニストは、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合フラグメント、およびＴＮＦに特異的に結合する受容体分子；サリドマイド、テニダップ、ホスホジエステラーゼ阻害剤（たとえばペントキシフィリンおよびロリプラム）、Ａ２ｂアデノシン受容体アゴニストおよびＡ２ｂアデノシン受容体エンハンサーなどの、ＴＮＦ合成、ＴＮＦ放出または標的細胞へのその作用を阻止および／または阻害する化合物；マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤などの、ＴＮＦ受容体シグナル伝達を阻止および／または阻害する化合物；メタロプロテイナーゼ阻害剤などの、膜ＴＮＦ切断をブロックおよび／または阻害する化合物；アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（たとえばカプトプリル）などの、ＴＮＦ活性をブロックおよび／または阻害する化合物；ならびにＭＡＰキナーゼ阻害剤などの、ＴＮＦ産生および／または合成をブロックおよび／または阻害する化合物を含むが、これらに限定されない。

【0158】

治療処置
本発明の任意の方法は、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含有する組成物または医薬組成物の有効量を、そのような調節、治療または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物または患者に投与することを含む、ＩＬ−６媒介性疾患を治療するための方法を含み得る。そのような方法は、場合により、そのような免疫疾患を治療するための同時投与または併用療法をさらに含むことができ、前記の少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体、その特定部分または変異体の投与は、上述した少なくとも１つの作用物質を前に、同時におよび／または後に投与することをさらに含む。

【0159】

典型的には、病的状態の治療は、組成物中に含まれるものの比活性に依存して、平均で、各投与につき患者の１キログラム当たり少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体が少なくとも約０．０１〜５００ミリグラムの範囲、好ましくは単回または多回投与につき患者の１キログラム当たり抗体が少なくとも約０．１〜１００ミリグラムの範囲に合計でなる、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物の有効量または投与量を投与することによって実施される。あるいは、有効血清濃度は、単回または多回投与につき０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含み得る。適当な投与量は医師に公知であり、言うまでもなく、特定の疾患状態、投与される組成物の比活性、および治療を受けている特定の患者に依存し、一部の場合には、所望治療量を達成するために、反復投与、すなわち特定の観測用量または測定用量の反復個別投与を与える必要があり得、前記個別投与は、所望１日用量または作用が達成されるまで反復される。

【0160】

好ましい用量は、場合により、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および／または１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／投与、またはその任意の範囲、値もしくは割合、または単回もしくは多回投与当たり０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、１２、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、１４．９、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００および／または５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、またはその任意の範囲、値もしくは割合を達成する用量を含み得る。

【0161】

あるいは、投与される用量は、特定作用物質の薬力学的特性、ならびにその投与方法および経路；受容者の年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度、併用処置の種類、治療頻度、ならびに所望効果などの公知の因子に依存して異なり得る。通常、有効成分の投与量は、体重の１キログラム当たり約０．１〜１００ミリグラムであり得る。通常は、各投与につきまたは持続放出形態でキログラム当たり０．１〜５０、好ましくは０．１〜１０ミリグラムが所望結果を得るために有効である。

【0162】

非限定的な例として、ヒトまたは動物の治療は、１日当たり、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇなどの、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの本発明の少なくとも１つの抗体の単回または定期的投与量として、単回注射または反復用量を使用して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０日間の少なくとも１つ、あるいはまたは加えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１または５２週間の少なくとも１つ、あるいはまたは加えて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０年間の少なくとも１つ、またはそれらの任意の組合せで提供され得る。

【0163】

体内投与に適する剤形（組成物）は、一般に、単位当たりまたは容器当たり約０．１ミリグラム〜約５００ミリグラムの有効成分を含有する。これらの医薬組成物において、有効成分は、通常、組成物の総重量に基づき約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在する。

【0164】

非経口製剤および投与
非経口投与のために、抗体は、医薬的に許容される非経口ビヒクルと結合してまたは別途に提供される、溶液、懸濁液、乳剤または凍結乾燥粉末として製剤され得る。そのようなビヒクルの例は、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および１〜１０％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび不揮発性油などの非水性ビヒクルも使用できる。ビヒクルまたは凍結乾燥粉末は、等張性（たとえば塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（たとえば緩衝剤および防腐剤）を維持する添加剤を含有し得る。製剤は、公知のまたは適切な技術によって滅菌される。

【0165】

適切な医薬担体は、当技術分野における標準的な参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記載されている。

【0166】

非経口投与用の製剤は、一般的な賦形剤として滅菌水または食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレン等を含有し得る。注射用の水性または油性懸濁液は、公知の方法に従って、適切な乳化剤または増湿剤および懸濁化剤を使用することによって調製できる。注射剤は、水溶液または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液などの非毒性で非経口的に投与可能な希釈剤であり得る。使用可能なビヒクルまたは溶媒として、水、リンガー液、等張食塩水等が許容される；通常の溶媒または懸濁溶媒としては、滅菌不揮発性油が使用できる。これらの目的のために、天然または合成または半合成の脂肪油または脂肪酸；天然または合成または半合成のモノグリセリドまたはジグリセリドまたはトリグリセリドを含む、任意の種類の不揮発性油および脂肪酸が使用できる。非経口投与は当技術分野において公知であり、従来の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているガス加圧無針注射装置、および全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８３９，４４６号に記載されているレーザー穿孔装置を含むが、これらに限定されない。

【0167】

選択的送達
本発明はさらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内または経皮手段による少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の投与に関する。少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物は、特に液体溶液または懸濁液の形態で非経口（皮下、筋肉内もしくは静脈内）または任意の他の投与に使用するため；クリームおよび坐薬などの、しかしこれらに限定されない、特に半固体形態で膣または直腸投与において使用するため；錠剤またはカプセル剤の形態などの、しかしこれらに限定されない口腔内または舌下投与のため；または粉末、点鼻薬またはエアロゾルまたは特定作用物質の形態などの、しかしこれらに限定されない鼻腔内投与のため；または皮膚構造を改変するためもしくは経皮パッチにおける薬剤濃度を高めるためのジメチルスルホキシド（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ“Ｄｒｕｇ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ煤GＨｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．５９−９０，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９４）などの化学増強剤を含む、またはタンパク質およびペプチドを含有する製剤の皮膚への適用（国際公開公報第ＷＯ９８／５３８４７号）、または電気穿孔などの一時的輸送経路を作り出すためもしくはイオン導入などの皮膚を通しての荷電薬剤の移動性を高めるための電場の適用、または超音波導入（米国特許第４，３０９，９８９号および同第４，７６７，４０２号）などの超音波の適用を可能にする酸化剤を含む、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液またはパッチ送達システムなどの、しかしこれらに限定されない経皮的投与のために調製され得る（上記の特許公開および特許は全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0168】

経肺／経鼻投与
経肺投与は、好ましくは、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物が肺または洞の下気道に達するために有効な粒径で送達される。本発明によれば、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体は、吸入による治療薬の投与のための当技術分野において公知の様々な吸入または点鼻装置のいずれかによって送達され得る。エアロゾル化された製剤を患者の洞腔（ｓｉｎｕｓ ｃａｖｉｔｙ）または肺胞に沈着させることができるこれらの装置は、定量吸入器、ネブライザー、ドライパウダー発生器、噴霧器等を含む。抗体の経肺または経鼻投与を導くのに適する他の装置も当技術分野において公知である。すべてのそのような装置は、抗体をエアロゾルで配薬する投与に適した製剤を使用することができる。そのようなエアロゾルは、溶液（水性および非水性の両方）または固体粒子のいずれかで構成され得る。Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）定量吸入器のような定量吸入器は、典型的には推進剤ガスを使用し、吸気時の作動を必要とする（たとえば国際公開公報第ＷＯ９４／１６９７０号、同第ＷＯ９８／３５８８８号参照）。Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（商標）（Ａｓｔｒａ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｓｐｉｒｏｓ（商標）吸入器（Ｄｕｒａ）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって市販されている装置、およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）パウダー吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）のようなドライパウダー吸入器は、混合パウダーの呼吸作動を用いる（全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６６８，２１８号、Ａｓｔｒａ、欧州特許第ＥＰ ２３７５０７号、Ａｓｔｒａ、国際公開公報第ＷＯ９７／２５０８６号、Ｇｌａｘｏ、国際公開公報第ＷＯ９４／０８５５２号、Ｄｕｒａ、米国特許第５，４５８，１３５号、Ｉｎｈａｌｅ、国際公開公報第ＷＯ９４／０６４９８号、Ｆｉｓｏｎｓ）。ＡＥＲｘ（商標）（Ａｒａｄｉｇｍ）、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、およびＡｃｏｒｎ ＩＩ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（米国特許第５，４０４，８７１号、Ａｒａｄｉｇｍ、国際公開公報第ＷＯ９７／２２３７６号）（上記の参考文献は全体が参照により本明細書に組み込まれる）のようなネブライザーは溶液からエアロゾルを生成し、一方定量吸入器、ドライパウダー吸入器等は小さな粒子エアロゾルを生成
する。市販の吸入装置のこれらの特定例は、本発明の実施に適する特定装置を代表することが意図されており、本発明の範囲を限定するものではない。好ましくは、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含有する組成物は、ドライパウダー吸入器または噴霧器によって送達される。本発明の少なくとも１つの抗体を投与するための吸入装置のいくつかの望ましい特徴がある。たとえば、吸入装置による送達は、好都合には信頼性があり、再現可能且つ正確である。吸入装置は、場合により、良好な呼吸適用性のために、小さな乾燥粒子、たとえば約１０μｍ未満、好ましくは約１〜５μｍの乾燥粒子を送達することができる。

【0169】

スプレーとしてのＩＬ−６抗体組成物の投与
ＩＬ−６抗体組成物タンパク質を含むスプレーは、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の懸濁液または溶液を加圧下でノズルを通して押し出すことによって生成され得る。ノズルの大きさおよび形状、適用圧、ならびに液体供給速度は、所望出力および粒径を達成するように選択され得る。エレクトロスプレーは、たとえば毛管またはノズル供給口と接続した電場によって生成され得る。好都合には、噴霧器によって送達される少なくとも１つのＩＬ−６抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの範囲、最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの粒径を有する。

【0170】

噴霧器での使用に適する少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物タンパク質の製剤は、典型的には、溶液ｍｌ当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇまたはｍｇ／ｇｍの少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物タンパク質、またはその中の任意の範囲もしくは値、たとえば、限定されることなく、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｍｌまたはｍｇ／ｇｍの濃度で水溶液中に抗体組成物タンパク質を含有する。製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、防腐剤、界面活性剤および、好ましくは亜鉛などの作用物質を含有し得る。製剤はまた、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質または炭水化物などの、抗体組成物タンパク質の安定化のための賦形剤または作用物質も含有し得る。抗体組成物タンパク質を製剤するのに有用なバルクタンパク質は、アルブミン、プロタミン等を含む。抗体組成物タンパク質を製剤するのに有用な典型的な炭水化物は、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等を含む。抗体組成物タンパク質製剤はまた、エアロゾルを形成する際に溶液の噴霧化によって引き起こされる抗体組成物タンパク質の表面誘導凝集を低減するまたは防止することができる界面活性剤も含有し得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの、様々な従来の界面活性剤が使用できる。量は、一般に、製剤の０．００１〜１４重量％の範囲である。本発明のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０等である。ＩＬ−６抗体または特定部分または変異体などのタンパク質の製剤のための当技術分野で公知の付加的な作用物質も、製剤に含めることができる。

【0171】

ネブライザーによるＩＬ−６抗体組成物の投与
抗体組成物タンパク質は、ジェットネブライザーまたは超音波ネブライザーなどのネブライザーによって投与することができる。典型的には、ジェットネブライザーでは、開口部を通して高速空気ジェットを作り出すために圧縮空気源を使用する。気体がノズルを越えて広がると共に、低圧領域が作られ、それが液体レザーバに接続された毛管を通して抗体組成物タンパク質の溶液を引き込む。毛管からの液体流は、管から出て行くときに不安定なフィラメントおよび小滴へと剪断され、エアロゾルを作り出す。所与のジェットネブライザーから所望性能特性を達成するために一連の形状、流速、およびバッフル型が使用できる。超音波ネブライザーでは、高周波電気エネルギーを使用して振動機械エネルギーを作り出し、典型的には圧電変換器を用いる。このエネルギーは、直接またはカップリン
グ流体を介して抗体組成物タンパク質の製剤に伝達され、抗体組成物タンパク質を含むエアロゾルを作り出す。好都合には、ネブライザーによって送達される抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの範囲、最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの粒径を有する。

【0172】

ジェットまたは超音波のいずれかのネブライザーでの使用に適する少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の製剤は、典型的には、溶液ｍｌ当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇの少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体タンパク質の濃度を含む。製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、防腐剤、界面活性剤および、好ましくは亜鉛などの作用物質を含有し得る。製剤はまた、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質または炭水化物などの、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物タンパク質の安定化のための賦形剤または作用物質も含有し得る。少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物タンパク質を製剤するのに有用なバルクタンパク質は、アルブミン、プロタミン等を含む。少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を製剤するのに有用な典型的な炭水化物は、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等を含む。少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体製剤はまた、エアロゾルを形成する際に溶液の噴霧化によって引き起こされる少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の表面誘導凝集を低減するまたは防止することができる界面活性剤も含有し得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの、様々な従来の界面活性剤が使用できる。量は、一般に、製剤の０．００１〜４重量％の範囲である。本発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０等である。抗体タンパク質などのタンパク質の製剤のための当技術分野で公知の付加的な作用物質も、製剤に含めることができる。

【0173】

定量吸入器によるＩＬ−６抗体組成物の投与
定量吸入器（ＭＤＩ）では、噴射剤、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体、および任意の賦形剤または他の添加剤を、液化圧縮ガスを含む混合物として容器中に含む。定量バルブが作動すると、好ましくは、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍのサイズ範囲の粒子を含有する、エアロゾルとしてダイ混合物（ｄｉｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）を放出する。所望エアロゾル粒径は、ジェットミル処理、噴霧乾燥、臨界点凝縮などを含む、当業者に公知の様々な方法によって生成される抗体組成物タンパク質の製剤を使用することによって得られる。好ましい定量吸入器は、３ＭまたはＧｌａｘｏによって製造される、ハイドロフルオロカーボン噴射剤を用いるものを含む。

【0174】

定量吸入器装置で使用するための少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体の製剤は、一般に、非水性媒質中の懸濁液として、たとえば界面活性剤を用いて噴射剤に懸濁した少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を含有する微細粉末を含む。噴射剤は、このために使用される任意の従来の物質、たとえば、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタン、ＨＦＡ−１３４ａ（ハイドロフルオロアルカン−１３４ａ）、ＨＦＡ−２２７（ハイドロフルオロアルカン−２２７）等を含む、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、または炭化水素であり得る。好ましくは、噴射剤はハイドロフルオロカーボンである。界面活性剤は、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を噴射剤中の懸濁液として安定化する、有効成分を化学分解から保護する、等のために選択され得る。適切な界面活性剤は、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、オレイン酸等を含む。一部の場合には、エタノールなどの溶媒を用いる溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の製剤のために当技術分野において公知の付加的な作用物質も、製剤に含めることができる。

【0175】

当業者は、本発明の方法が、本明細書に記載していない装置による少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体組成物の経肺投与によって達成され得ることを認識する。
経口製剤および投与
経口投与用の製剤は、腸壁の透過性を人工的に高めるためのアジュバント（たとえばレゾルシノールならびにポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン性界面活性剤）の同時投与、ならびに酵素分解を阻害するための酵素阻害剤（膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＦ）およびトラジロール）の同時投与に基づく。経口投与用の固体型剤形の有効成分化合物は、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成または半合成のポリマー、およびグリセリドを含む少なくとも１つの添加剤と混合することができる。これらの剤形はまた、他のタイプ（１または複数）の添加剤、たとえば不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウム、パラベンなどの潤滑剤、ソルビン酸、アスコルビン酸、α−トコフェロールなどの防腐剤、システインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、着香料、香料等を含有し得る。

【0176】

錠剤および丸剤は、腸溶性製剤へとさらに加工され得る。経口投与用の液体製剤は、医療用途のために許容される乳剤、シロップ、エリキシル、懸濁液および溶液製剤を含む。これらの製剤は、前記分野において通常使用される不活性希釈剤、たとえば水を含有し得る。リポソームもまた、インスリンおよびヘパリンの薬剤送達システムとして記述されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。最近になって、混合アミノ酸（プロテイノイド）の人工ポリマーのミクロスフェアが医薬品を送達するために用いられている（米国特許第４，９２５，６７３号）。さらに、米国特許第５，８７９，６８１号および同第５，８７１，７５３号に記載されている担体化合物は、当技術分野で公知の生物学的に活性な作用物質を経口的に送達するために使用される。

【0177】

経粘膜製剤および投与
粘膜面を通しての吸収に関して、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体を投与する組成物および方法は、乳剤粒子の粘膜接着を達成することによって粘膜表面を通しての吸収を促進する、複数のサブミクロン粒子、粘膜接着性高分子、生物活性ペプチド、および水性連続相を含有する乳剤を含む（米国特許第５，５１４，６７０号）。本発明の乳剤の適用に適する粘膜表面は、角膜、結膜、口腔、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸、および直腸投与経路を含み得る。膣または直腸投与のための製剤、たとえば坐薬は、賦形剤として、たとえばポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバター等を含有し得る。鼻腔内投与用の製剤は、固体であって、たとえばラクトースを賦形剤として含有し得るか、または点鼻薬の水溶液または油性溶液であり得る。口腔内投与については、賦形剤は、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプン等を含む（米国特許第５，８４９，６９５号）。

【0178】

経皮製剤および投与
経皮投与のために、少なくとも１つの抗ＩＬ−６抗体は、リポソームまたはポリマーナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、またはミクロスフェア（特に明記しない限り集合的に微粒子と称する）などの送達装置に封入される。多くの適切な装置が公知であり、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそのコポリマーなどのポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリホスファゼンのような合成ポリマー、ならびにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミンおよび他のタンパク質、アルギネートおよび他の多糖のような天然ポリマー、ならびにそれらの組合せで作られる微粒子を含む（米国特許第５，８１４，５９９号）。

【0179】

長期投与および製剤
時として、本発明の化合物を長期間にわたって、たとえば単回投与から１週間〜１年間の期間にわたって被験者に送達することが望ましいことがあり得る。様々な徐放性剤形、デポー剤または埋め込み剤形が利用できる。たとえば、剤形は、体液に低い溶解度を有する化合物の医薬的に許容される非毒性の塩、たとえば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノスルホン酸もしくはジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような多塩基酸との酸付加塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等のような多価金属陽イオン、または、たとえばＮ，Ｎ’−ジベンジル−エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンとの塩；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ、たとえばタンニン酸亜鉛塩を含有し得る。加えて、本発明の化合物または、好ましくは上述したような比較的不溶性の塩は、注射に適する、ゲル、たとえばゴマ油を含むモノステアリン酸アルミニウムゲルに製剤することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩等である。注射用徐放性デポー剤のもう１つのタイプは、たとえば米国特許第３，７７３，９１９号に記載されているポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーのような、緩やかに分解する非毒性の非抗原性ポリマーに封入するために分散された化合物または塩を含む。化合物または、好ましくは上述したような比較的不溶性の塩はまた、特に動物における使用のために、コレステロールマトリックスシラスティックペレットに製剤することもできる。さらなる除放性製剤、デポー剤または埋め込み製剤、たとえばガスまたは液体リポソームは、文献において公知である（米国特許第５，７７０，２２２号および“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９７８）。

【0180】

略語：
ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン
ＥＩＡ−酵素免疫検定法
ＦＢＳ−ウシ胎仔血清
Ｈ₂Ｏ₂−過酸化水素
ＨＲＰ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ
Ｉｇ−免疫グロブリン
ＩＬ−６−インターロイキン６
ＩＰ−腹腔内
ＩＶ−静脈内
Ｍａｂ−モノクローナル抗体
ＯＤ−光学密度
ＯＰＤ−ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩
ＰＥＧ−ポリエチレングリコール
ＰＳＡ−ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン
ＲＴ−室温
ＳＱ−皮下
ｖ／ｖ−容量／容量
ｗ／ｖ−重量／容量

【実施例1】

【0181】

アフィニティーおよび定量的ＥＬＩＳＡ
ＩＬ−６によるアフィニティーＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６穴プレートを、コーティング溶液中２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌまたは０．００２μｇ／ｍｌの１
００μｌのＩＬ−６でコーティングし、プレートシーラーで覆って、４℃で一晩インキュベートした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加し、２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）２００μｌを添加し、２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ＥＬＩＳＡ用の希釈試料１００μｌを使用した。試料を２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした；プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加し、２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした；プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。この工程を３回反復した。００１試料については、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）で希釈したＨＲＰと結合した抗ヒトＩｇＧの１：２５００希釈液１００μｌを添加した。対照抗体については、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）で希釈したＨＲＰと結合した抗ウサギＩｇＧの１：２５００希釈液１００μｌを添加した。内容物を２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうし、プレートを空にして、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加し、２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした；プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。この工程を３回反復した。ＴＭＢ基質溶液１００μｌを添加し、室温でインキュベートした。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取った。

【0182】

ビオチニル化ＩＬ−６によるアフィニティーＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６穴プレートを、コーティング溶液中１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製した１００μｌのＦｃ特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧでコーティングした。プレートをプレートシーラーで覆い、４℃で一晩インキュベートした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）２００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ＥＬＩＳＡ用の希釈試料１００μｌを使用した。２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて留液をペーパータオル上に取り出した。３回反復した。ＰＢＳで希釈した、２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌまたは０．００２μｇ／ｍｌの１００μｌのビオチニル化ＩＬ−６を添加した。２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて留液をペーパータオル上に取り出した。３回反復した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）で希釈したＨＲＰと結合した抗ビオチン抗体の１：２０００希釈液１００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ＴＭＢ基質溶液１００μｌを添加した。室温でインキュベートした。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。

【0183】

定量的ＥＬＩＳＡ
このＥＬＩＳＡは、細胞培養上清中の抗体の発現レベルを測定するために使用した。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６穴プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）を
、コーティング溶液中１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製したＦｃ特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ １００μｌでコーティングした。プレートシーラーで覆い、４℃で一晩インキュベートした。プレートを空にし、残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）２００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ＥＬＩＳＡ用の希釈試料１００μｌを使用した。２０ｎｇ／ｍｌのヒトＩｇＧおよびその後１：２希釈液を標準品として使用した。トランスフェクションからの上清（５０ｎｇ〜２００ｎｇ／ｍｌ）を、アッセイ用に未希釈から１：１０まで希釈した。２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて留液をペーパータオル上に取り出した。３回反復した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）で希釈したＨＲＰと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧの１：２５００または１：５０００希釈液１００μｌを添加した。２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加した。室温でインキュベートした。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。

【0184】

比活性
各々の抗ＩＬ−６ ＭａｂについてのＥＬＩＳＡ比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＥＬＩＳＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を、定量的ＥＬＩＳＡの値で除したアフィニティーＥＬＩＳＡの値として計算する。図２９は、親和性成熟からの上位１０のＣＰＥヒットについての基準化した比活性を示す。図３２は、上位１０のＣＰＳヒットについての基準化した比活性を示す。クローンのＥＬＩＳＡ比活性をクローンＢＡ３９９の比活性で除する。ＢＡ３９９の基準化した比活性は、１（水平な黒い線）である。

【0185】

００１の機能的ＥＬＩＳＡ
このＥＬＩＳＡは、細胞培養上清中の抗体の親和性を比較するために使用した。Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ−ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６穴プレートを２μｇ／ｍｌの００１ ＩＬ−６抗原１００μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをデカンテーション（傾斜させて上澄みを移す）し、洗浄して（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）、ＰＢＳ中２％カーネーション脱脂乳で室温にて１時間ブロックした。２０ｎｇ／ｍｌの抗００１対照抗体およびその後１：２希釈液を標準品として使用した。２組のトランスフェクションからの上清１００μｌを、アッセイ用に未希釈から１：５０まで希釈し（５０ｎｇ〜２００ｎｇ／ｍｌ）、室温で１時間プレートに添加した。プレートをデカンテーションし、３回洗浄した。各々のウエルに、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）で希釈したＨＲＰと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧの１：５０００希釈液１００μｌを添加し、それを２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートをデカンテーションし、洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加し、２〜５分ごとに検査しながら、室温でインキュベートした。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。

【実施例2】

【0186】

ＢＡ００１と本発明の抗ＩＬ−６抗体との間のエピトープ重複を確認するための競合的ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ−ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６穴プレートを、コーティング溶液中０．２μｇ／ｍｌの１００μｌのＩＬ−６でコーティングした（実験のために十分なウエルを調製した）。プレートシーラーで覆って、４℃で一晩インキュベートした。プレート
を空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加した。プレートを２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）２００μｌを添加した。プレートを２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。０μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌの精製００１抗体（各々の精製００１抗体量について２つの反応物を調製した）と共にＰＢＳで希釈した０．０５μｇ／ｍｌのビオチニル化００１ １００μｌを添加した。また、０μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌの非抗ＩＬ−６抗体（任意の抗マウスＩｇＧまたは他の陰性対照対照抗体）（各々の精製００１抗体量について２つの反応物を調製した）と共にＰＢＳで希釈した０．０５μｇ／ｍｌの１００μｌのビオチニル化００１を添加した。プレートを２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。洗浄液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μｌを添加した。プレートを２００ＲＰＭにて室温で５分間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。３回反復した。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中２％カーネーションミルク）で希釈したＨＲＰと結合した抗ビオチン抗体の１：２０００希釈液１００μｌを添加した。プレートを２００ＲＰＭにて室温で１時間振とうした。プレートを空にし、軽くたたいて残留液をペーパータオル上に取り出した。ＴＭＢ基質溶液１００μｌを添加した。室温でインキュベートした。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。結果を図１０に示す。図に示すように、本発明の抗ＩＬ−６ Ａｂのすべてが、ヒトＩＬ−６へのＢＡ００１の結合を低減する。これは、新規ヒト化抗体がＢＡ００１と同じ領域に結合することを示す。

【実施例3】

【0187】

ＣＨＯ−Ｓ細胞トランスフェクション
トランスフェクションの１週間前に、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の単層培養に移した。トランスフェクションの１日前に、細胞を、９６穴形式でトランスフェクション試料当たり１００μＬの血清添加Ｄ−ＭＥＭ中０．４×１０⁵細胞で塗布する
。各トランスフェクション試料についてＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を調製した。０．２５μｇのＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ血清使用量低減培地２５μＬで希釈し、静かに混合して、室温で５分間インキュベートした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ血清使用量低減培地２５μＬで希釈した。静かに混合し、室温で５分間インキュベートした。希釈したＤＮＡを希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと一緒にした。静かに混合し、室温で２０分間インキュベートした。ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体５０μＬを、細胞と培地を含む各々のウエルに添加した。プレートを揺り動かすことによって静かに混合した。細胞を５％ＣＯ₂インキュベーターにおいて３７℃で一晩インキュベートした。各ウエル中の培
地を吸引した。１００μＬの血清添加Ｄ−ＭＥＭを各ウエルに添加した。ＥＬＩＳＡアッセイ用に上清を収集し、β−ガラクトシダーゼアッセイ用に細胞溶解産物を収集した。

【実施例4】

【0188】

細胞培養上清からの抗体精製
以下の緩衝液を標準的な方法で調製した。結合緩衝液：１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．０。溶出緩衝液：１２．５ｍＭクエン酸、ｐＨ２．７（Ｎａ_３−クエン酸塩を使用する）。中和緩衝液：０．５Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０。２０％エタノールおよび水。すべての緩衝液を使用前にろ過した（０．４５μｍ）。ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧセファロースＨＰ（容量１ｍＬ）カラムに取り付けたＡ
ＫＴＡ（商標）ＦＰＬＣ（商標）システムを使用して上清を精製した。試料を負荷するために、負荷チューブをエタノール（２０ｍＬ、５ｍＬ／分）、次に結合緩衝液（２０ｍＬ、５ｍＬ／分）で洗浄する。プロテインＧカラムをシステムに取り付け、結合緩衝液（１０ｍＬ、１ｍＬ／分）で洗浄する。試料を１ｍＬ／分またはより遅い速度で（一晩負荷のため）負荷する。負荷後、カラムを取り外し、負荷チューブを水（２０ｍＬ、５ｍＬ／分）、次に２０％エタノール（２０ｍＬ、５ｍＬ／分）で洗浄する。抗体精製のために、ＡＫＴＡシステムを結合緩衝液で洗浄した（ポンプＡおよびすべてのチューブ類）。中和緩衝液５０μｌを各チューブに添加することによって画分収集用に収集チューブを調製した。プロテインＧカラムをシステムに取り付けた。流速を１ｍＬ／分に設定し、基線が安定するまで作動させた。カラムの弁をポジション３に切り替えた。カラムを、基線に達するまで結合緩衝液（最小限１０ｍＬ）で洗浄した。ポンプを停止させ、水、次に溶出緩衝液で洗浄した。流速を１ｍＬ／分に設定し、基線が安定するまで作動させた。カラムの弁をポジション３に切り替え、画分収集器を始動させた（画分０．５ｍＬ）。基線が、システムが停止する点に達するまで画分を収集した。溶出プロフィールをクリップボードにコピーし、ＷＯＲＤドキュメントへとコピーした。ポンプを水、次に結合緩衝液で洗浄した。プロテインＧカラムを結合緩衝液（１０ｍＬ）で洗浄した。ポンプを２０％エタノールで洗浄した。カラムを２０％エタノール（２０ｍＬ）で洗浄し、冷蔵室で保存した。

【実施例5】

【0189】

Ｓａｐｉｄｙｎｅ分析
Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫｉｎＥｘＡ（商標）反応速度排除アッセイ自動免疫検定システム（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）を使用して、製造者のプロトコールに従って様々な抗体の平衡および速度定数を測定した。反応速度排除アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）（ＫｉｎＥｘＡ）は、非修飾分子に関して、溶液相中で真の平衡結合親和性および反応速度を測定する方法である。たとえば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，ＡＳＳＡＹ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２（６）：２００４参照。簡単に述べると、ＫｉｎＥｘＡ（商標）システムは、ミクロ細孔性スクリーンを取り付けた毛管フロー／観察セル（内径＝１．６ｍｍ）から成り、前記ミクロ細孔性スクリーンを通して様々な溶液が陰圧下で引き込まれる。スクリーンの平均細孔径（５３ｍｍ）より大きい均一な粒子が抗原で前コーティングされ、充填床においてスクリーンの上に沈着した。平衡であるかまたは平衡に近い抗原と抗体の個々の溶液混合物を、次に、粒子の充填床を通して引き込んだ。占有されていない結合部位を有する各々の混合物中の抗体だけが、固相上にコーティングされた抗原に結合するために利用可能であった。このようにした捕捉された一次抗体の定量を、粒子を蛍光標識抗種二次抗体に短時間暴露し、続いて過剰の非結合試薬を除去した後、生じた粒子からの蛍光を測定することによって実施した。

【0190】

抗体を、滅菌１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％アジ化ナトリウム、１０ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ中で再構成した。抗原は、０．５ｍｇ、１ｍｇ、０．５ｍｇおよび０．５ｍｇの４つの別々のバイアルに入ったＩＬ−６（２１，０００ｋＤａ）であり、これを滅菌１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％アジ化ナトリウムで３７５μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬに希釈した。標識、Ｃｙ５−結合ＡｆｆｍｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｃｙ５、１．５μｇ／ｍＬは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）より購入した。標識を滅菌１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％アジ化ナトリウム中で再構成し、０．５００ｍｇ／ｍＬに希釈した。ランニング緩衝液は、１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％アジ化ナトリウムであった。試料緩衝液は、１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％アジ化ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。ＰＭＭＡビーズ（Ｐａｒｔ番
号４４０１９７／Ｌｏｔ３２５７）は、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．（Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）によって提供され、以下のようにして捕捉試薬でコーティングした。ビーズを乾燥して２００ｍｇずつのアリコートに分け、コーティング溶液（ランニング緩衝液中３０μｇ／ｍＬ ＢＡＰ００１）１ｍＬ中で２時間揺動した。次にビーズをブロッキング溶液（ランニング緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中で１時間揺動し、４℃で保存した。

【0191】

平衡分析のために、ＩＬ−６でコーティングしたＰＭＭＡビーズを使用して、受容体（抗ＩＬ−６抗体）とリガンド（抗原；ＩＬ−６）の平衡試料から遊離受容体の一部を捕捉した。各データ点について、リガンドコーティングビーズの新鮮カラムをフローセルに導入した。固定化リガンドとの接触時間を最小限に抑えるためにカラムを通して平衡試料を迅速に引き込んだ、これにより、固定化リガンドとの接触時間が試料の平衡を破壊しないことが確保された。固定化リガンドは、このようにして溶液中の遊離受容体を捕捉するためのプローブとして働いた。捕捉された抗体を、蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。非結合試薬を洗い流し、平衡試料中の遊離受容体に比例するシグナルを残した。蛍光を、平衡試料中の遊離受容体（抗体）の量に直接比例する電圧に変換した。実験を受容体の高濃度と低濃度の両方で実施し、その後、最適結果についてのｎ曲線解析において一緒に利用した。反応速度分析の直接法（Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ）のために、平衡実験用と同じ固定化リガンド（ＩＬ−６コーティングＰＭＭＡ）を反応速度実験のための捕捉試薬として使用した。試料中の遊離受容体（抗体）の量を平衡前に測定し、試料が平衡に近づくのに伴う経時的な遊離受容体（抗体）の減少を観測するデータ点を生成した。図３３は、ＢＡ００３（ＣＮＴＯ１３６）と比較した抗ＩＬ−６抗体ＢＡＰ００１−クローン１〜ＢＡＰ００１−クローン１０についての上位１０のヒットのＳａｐｉｄｙｎｅ分析からのデータの表を示す。

【実施例6】

【0192】

ＢＡ００１およびヒト化誘導体のＢｉａｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴）親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを使用して、結合曲線および反応速度パラメータを決定した。抗ヒトＦｃ（１．８ｍｇ／ｍｌ）をＮａＯＡｃ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．８）で５０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＢＩＡｃｏｒｅシステムマニュアルに記載されているように製造者のアミンカップリング化学を用いてＣＭ−５センサーチップのカルボキシメチル化デキストランマトリックスにカップリングした。１００００ＲＵを目標とする表面処理ウィザードを使用して、センサー表面上のカルボキシル基を最初にＮＨＳ／ＥＤＣで活性化し、続いて抗ヒトＦｃを添加した。残存する活性化基を１Ｍエタノールアミンの注入によってブロックした。フローセルの各々を個別に連結した。これらの条件を用いて、７５５４−９５７１ＲＵの抗ヒトＦｃを含有する４つのフローセル表面を調製した。予備実験において、１００ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄／０．０５％ＣＨＡＰＳの３回の注入（３０μｌ／分で１５μｌ）が結合免疫グロブリンを効率的に除去し、固定化抗ヒトＦｃの結合能力を保存することが測定された。

【0193】

２５℃、３０μｌ／分の流速にてＢＩＡｃｏｒｅ ３０００で実験を実施した。抗体候補物を５μｇ／ｍｌでＨＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％界面活性剤Ｐ２０を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４）に溶解した。分析物であるＩＬ−６を０．２５、０．１２５、０．０６２、０．０３１および０．０１５μｇ／ｍｌでＨＢＳに溶解した。５μｇ／ｍｌの３×３０μｌの抗体ＢＡ００１をそのそれぞれのフローセルに流し、続いて各々のＩＬ−６濃度２４０μｌを３０μｌ／分で注入して（結合相）、緩衝液を連続１２００秒間流した（解離相）。１００ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄／０．０５％ＣＨＡＰＳを各々１５μｌずつ３回連続的に注入してチップの表面を再生させた。ＨＢＳの注入は、分析のためにバルク屈折率を差し引く参照（ブランクセンソグラム）として役立つ。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１における１：１モデルを使用して、ロ
ーカルフィットおよびグローバルフィットを解離（ｋｄ、［ｓ−１］および結合（ｋａ、［Ｍ^−１ｓ^−１］）の両方について実施し、解離定数（ＫＤ、［Ｍ］）を計算した（ｋｄ／ｋａ）。

【0194】

分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．０を用いて行った。反応速度定数は、相互作用機構のモデルから得られる速度式に実験の曲線を適合させることによってセンソグラムデータから導いた。ローカルＲＵｍａｘフィットで１：１結合モデルを用いた大域解析によってｋａ、ｋｄおよびＫＤを決定した。

【0195】

以下の式を利用した：

【0196】

【数1】

親和性成熟前のヒト化抗ＩＬ−６ ＭａｂについてのＢｉａｃｏｒｅデータを図１１に示す。ＢＡ３９９親和性成熟を抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ３９９に関して実施した後、選択したクローンをＢｉａｃｏｒｅ分析によって試験した。図３４は、それぞれクローンＢＡ３９９−２、ＢＡ３９９−５、ＢＡ−３９９−９およびＢＡ３９９−１０についてのＢｉａｃｏｒｅデータを示す。

【実施例7】

【0197】

ＴＨＰ−１細胞におけるＳｔａｔ３リン酸化の阻害
Ｓｔａｔ３転写因子は、多くのサイトカインおよび増殖因子受容体のための重要な細胞シグナル伝達分子である（Ｈｅｉｍ． Ｔｈｅ Ｊａｋ−ＳＴＡＴ ｐａｔｈｗａｙ：ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９９９．１９（ｌ−４）：７５−１２０）。 Ｓｔａｔ３は多くのヒト腫瘍において構成的に活性化され、発癌能 （Ｂｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｔ３ ａｓ ａｎ ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ １９９９ ９８（３）：２９５−３０３）および抗アポトーシス活性を有する。Ｓｔａｔ３はＴｙｒ７０５のリン酸化によって活性化され、二量体形成、核転座およびＤＮＡ結合を誘導する（ＩｈＩｅ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ １９９５，３７７（６５５０）：５９１−４）。転写活性化は、ＭＡＰＫまたはｍＴＯＲ経路を介したＳｅｒ７２７のリン酸化によって調節されると考えられる（Ｙｏｋｏｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｘｉｍａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｓｔａｔ３ ｄｕｒｉｎｇ ＣＮＴＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｂｙ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｍＴＯＲ． ２０００ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．１０（ｌ）：４７−５０）。

【0198】

Ｓｔａｔ３リン酸化の阻害をＴＨＰ−１細胞において測定した。ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ）細胞を標準的なプロトコールに従って使用した。各試験条件のために、２×１０^６細胞を血清飢餓させた。陽性対照は、ヒトＩＬ−６（１００、５０、１０ｎｇ／ｍｌ）とｓＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激したＴＨＰ−１細胞から成った。陰性対照は培地だけから成った。試験試料は、各々ヒトＩＬ−６（１００、５０、１０ｎｇ／ｍｌ）およびｓＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）を含む、１０ｍｇ／ｍｌのＣＮＴＯ １３６、Ｎｏ．３９９、ＢＡ３９９クローンＮｏ．２、またはＢＡ３９９クローンＮｏ．９のいずれかを
含有した。ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒおよび抗体を３７℃で１５分間インキュベートした。次に反応混合物をＴＨＰ−１細胞に添加した。３７℃で１５分間のインキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、直ちに検定した。Ｓｔａｔ３のリン酸化レベルを、製造者のプロトコールに従って使用した細胞シグナル伝達ホスホ−Ｓｔａｔ３サンドイッチＥＬＩＳＡキット（たとえばＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）ホスホ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）サンドイッチＥＬＩＳＡキットＮｏ．７３００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）によって測定した。総Ｓｔａｔ３の発現レベルは、ヒトＳｔａｔ ３（アミノ酸５０〜２４０）に対するＳａｎｔａ Ｃｒｕｚウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）によって測定した。ＴＨＰ−１リン酸化データを図３５〜３８に示す。各々図において、データを総Ｓｔａｔ３についてのウエスタンブロットに基づいて基準化している。

【0199】

図３５に示すように、抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ００３（ＣＮＴＯ １３６）、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−９の各々は、陽性対照と比較してＩＬ６／ｓＩＬＲで刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＳｔａｔ３のリン酸化の濃度依存的低下を生じさせた。

【0200】

図３６は、ＴＨＰ−１細胞を様々な条件下で１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒで刺激した場合のリン酸化の相対レベルを示す（Ａ）。ウエスタンブロットによる総Ｓｔａｔ３レベルを（Ｂ）に示す。抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ００３（ＣＮＴＯ １３６）、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−９の各々は、陽性対照と比較してＩＬ６／ｓＩＬＲで刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＳｔａｔ３のリン酸化の有意の低下を生じさせた。

【0201】

図３７は、ＴＨＰ−１細胞を様々な条件下で１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒで刺激した場合のリン酸化の相対レベルを示す（Ａ）。ウエスタンブロットによる総Ｓｔａｔ３レベルを（Ｂ）に示す。抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ００３（ＣＮＴＯ １３６）、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−９の各々は、陽性対照と比較してＩＬ６／ｓＩＬＲで刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＳｔａｔ３のリン酸化の有意の低下を生じさせた。

【0202】

図３８は、ＴＨＰ−１細胞を様々な条件下で１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒで刺激した場合のリン酸化の相対レベルを示す（Ａ）。ウエスタンブロットによる総Ｓｔａｔ３レベルを（Ｂ）に示す。抗ＩＬ−６ Ｍａｂ ＢＡ００３（ＣＮＴＯ １３６）、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−９の各々は、陽性対照と比較してＩＬ６／ｓＩＬＲで刺激したＴＨＰ−１細胞におけるＳｔａｔ３のリン酸化の有意の低下を生じさせた。

【実施例8】

【0203】

ＨｅｐＧ２細胞による血清アミロイドＡタンパク質産生の阻害
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）は、その産生がＩＬ−６によって誘導される急性期タンパク質である。ＩＬ−６、ＩＬ−１およびＴＮＦなどのサイトカインはＳＡＡタンパク質合成のメディエイターとみなされる。それらは、肝細胞を刺激してＳＡＡを産生させ、血流中に放出させる。急性および慢性炎症を有する患者において高いレベルのＳＡＡが認められる。続発性アミロイドーシスは、ＳＡＡが高いままである長期または反復炎症状態の結果として発症し得る。この進行性の致死的疾患は器官機能の喪失を特徴とする。関節リウマチ、若年性関節炎、強直性脊椎炎、家族性地中海熱、進行性硬化症、ならびに結核および骨髄炎のような慢性感染症などの炎症性疾患は、アミロイドーシスを発症する素因となる（Ｒｅｉｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ．１９９０ ＭｏＩ．Ｂｉｏ
．Ｍｅｄ．７：２８７−２９８）。

【0204】

ＩＬ−６／ｓＩＬ−６ＲとＩＬ−１ｂによって刺激したＨｅｐＧ２細胞において血清アミロイドＡタンパク質産生をブロックする抗ＩＬ−６ Ｍａｂの能力を以下のように試験した。ＨｅｐＧ２細胞を２４穴形式にて２．２５×１０^５細胞／ウエルで接種した。各条件につき２組のウエルを使用した。陽性対照は、ヒトＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ｓＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１ｂ（２５ｎｇ／ｍｌ）から成った。１つの陰性対照は培地だけから成った。もう１つの陰性対照は、ヒトＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ｓＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）から成った。抗ＩＬ６ Ｍａｂ ＣＮＴＯ １３６、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２、ＢＡ３９９−９（１０^−５、１０^−４、１０^−３、１０^−２、１０^−１、１ｍｇ／ｍｌ）の各々とヒトＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）およびｓＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１ｂ（２５ｎｇ／ｍｌ）から連続希釈を作製した。ＩＬ−６、ｓＩＬ−６ＲおよびＭａｂを室温で３０分間インキュベートした。ＩＬ−１ｂをＩＬ−６／抗体混合物に添加した。反応混合物全体をＨｅｐＧ２細胞に添加した。血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の発現レベルを、反応混合物の添加後２４時間目と４８時間目に製造者のプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎヒトＳＡＡ免疫検定法キットによって測定した。データを図３９および４０に示す。

【0205】

図３９は、ヒトＩＬ−６／ｓＩＬ−６およびＩＬ−１ｂで刺激したＨｅｐＧ２細胞による２４時間目の血清アミロイドＡタンパク質産生の、抗ＩＬ−６ Ｍａｂによる阻害を示す。抗ＩＬ６ Ｍａｂ ００３（ＣＮＴＯ １３６）、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−５の各々は、ＳＡＡ産生を用量依存的に阻害した。ヒトＩｇＧは陰性対照である。

【0206】

図４０は、ヒトＩＬ−６／ｓＩＬ−６およびＩＬ−１ｂで刺激したＨｅｐＧ２細胞による４８時間目の血清アミロイドＡタンパク質産生の、抗ＩＬ−６ Ｍａｂによる阻害を示す。抗ＩＬ６ Ｍａｂ ００３（ＣＮＴＯ １３６）、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−５の各々は、ＳＡＡ産生を用量依存的に阻害した。ヒトＩｇＧは陰性対照である。

【実施例9】

【0207】

サルＩＬ−６との交差反応性
ＥＬＩＳＡプレートを抗サルＩＬ−６抗体でコーティングした。３００ｐｇ／ｍＬのサルＩＬ−６を添加した。陽性対照はビオチニル化抗サルＩＬ−６から成った。陰性対照は緩衝液だけから成った。０．１ｍｇ／ｍＬのビオチニル化００１と５ｍｇ／ｍｌの００１、００３、ＢＡ３９９、ＢＡ３９９−２およびＢＡ３９９−９の各々との試験試料を、非特異的ヒトＩｇＧと共に使用した。ストレプトアビジン−ＨＲＰでＥＬＩＳＡを実施した。データを図４１に示す。ビオチニル化抗ＩＬ−６ Ｍａｂは、サルＩＬ−６とある程度の交差反応性を示し、これは抗ＩＬ−６ヒト化Ｍａｂの各々によって部分的にブロックされたが、非特異的ヒトＩｇＧによってはブロックされなかった。

【実施例10】

【0208】

ＩＬ−６誘導性ＤＳ−１細胞増殖の阻害
ＤＳ−１は、腸リンパ管拡張症およびリンパ腫を有する免疫不全患者に由来するＢ細胞株である。ヒトＩＬ−６に応答して細胞増殖が増大するが、マウスＩＬ−６では増殖は増大しない。構成的ＩＬ−６産生にもかかわらず、ＤＳ−１のインビトロ増殖は外因性ＩＬ−６に依存する。（Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ａ ｎｅｗ ＩＬ−６ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｕｍａｎ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｉｎ ａ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
５（５）：４８０−４８９ （１９９３）。

【0209】

簡単に述べると、各試験条件について９６穴形式で８００細胞を接種した。１０Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−６ならびに０、０．００５、０．０５および０．５μｇ／ｍＬ ＣＮＴＯ１３６、ＢＡ３９９および様々な抗ＩＬ−６ Ｍａｂを使用した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、抗体の添加の０、２および４日後に細胞増殖を測定した。４８時間目と９６時間目のＩＬ−６誘導性ＤＳ−１細胞増殖の阻害をそれぞれ図４２および４３に示す。ＢＡ００１、ＢＡ３９９、ＢＡ４３６、ＢＡ８０２、ＢＡ８０８およびＢＡ８４０を含むいくつかの抗ＩＬ−６ Ｍａｂは、４８時間目と９６時間目の両方でＤＳ−１細胞増殖を用量依存的に低下させた。

【0210】

本発明が、前記の説明および実施例において特に記述されている以外の方法でも実施できることは明らかである。
本発明の数多くの修正および変形が上記の教示に照らして可能であり、それ故、添付の特許請求の範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図36】

【図37】

【図38】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]