特許 5791898 抗原結合性構築物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5791898

(24)【登録日】2015年8月14日

(45)【発行日】2015年10月7日

(54)【発明の名称】抗原結合性構築物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150917BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20150917BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20150917BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20150917BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20150917BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150917BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150917BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150917BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K16/24

   C07K16/46

   C12P21/08

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   A61K39/395 N

   A61P11/06

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P29/00

【請求項の数】19

【全頁数】273

(21)【出願番号】特願2010-535396(P2010-535396)

(86)(22)【出願日】2008年11月28日

(65)【公表番号】特表2011-504742(P2011-504742A)

(43)【公表日】2011年2月17日

(86)【国際出願番号】EP2008066438

(87)【国際公開番号】WO2009068649

(87)【国際公開日】20090604

【審査請求日】2011年7月6日

(31)【優先権主張番号】60/991,449

(32)【優先日】2007年11月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/027,858

(32)【優先日】2008年2月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/046,572

(32)【優先日】2008年4月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/081,191

(32)【優先日】2008年7月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/084,431

(32)【優先日】2008年7月29日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】397009934

【氏名又は名称】グラクソ グループ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(72)【発明者】

【氏名】アシュマン，クレア

(72)【発明者】

【氏名】バトゥワンガラ，ティル

(72)【発明者】

【氏名】バーデン，マイケル，ニール

(72)【発明者】

【氏名】クレッグ，ステファニー，ジェーン

(72)【発明者】

【氏名】デ ヴィルト，ルドルフ，マリア

(72)【発明者】

【氏名】エリス，ジョナサン，ヘンリー

(72)【発明者】

【氏名】ハンブリン，ポール，アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】フセイン，ファルハナ

(72)【発明者】

【氏名】イェスペルス，ローラン

(72)【発明者】

【氏名】ルイス，アラン

(72)【発明者】

【氏名】オレッキア，マルティン，アニバル

(72)【発明者】

【氏名】シャー，ラダ

(72)【発明者】

【氏名】スチュワード，マイケル

【審査官】 一宮 里枝

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０８５８１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０８２８１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０６６１０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Immunological Methods，２００７年 １月，Vol.318，p.65-74

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも２つの重鎖と少なくとも２つの軽鎖を含む抗体免疫グロブリン足場であり、該足場が1以上のエピトープ結合性ドメインに連結されたものである、タンパク質足場を含む抗原結合性構築物であって、該抗原結合性構築物は４つの抗原結合部位を有し、そのうちの２つが免疫グロブリン単鎖可変ドメインであるエピトープ結合ドメイン由来であり、そのうちの２つが対になったVH/VLドメインに由来し、該抗原結合性構築物はIL-13に結合することが可能であり、該免疫グロブリン単鎖可変ドメインのうち少なくとも1つが、1〜50アミノ酸を含むリンカーを用いて免疫グロブリン足場に直接的に連結されており、該免疫グロブリン単鎖可変ドメインが重鎖のC末端で免疫グロブリン足場と連結している、上記抗原結合性構築物。

【請求項2】

2以上の抗原に対する特異性を有する、請求項１に記載の抗原結合性構築物。

【請求項3】

IL-4およびIL-5から選択される1以上の抗原にも結合することが可能である、請求項１または２に記載の抗原結合性構築物。

【請求項4】

免疫グロブリン足場がIgG足場である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項5】

IgG足場が抗体のすべてのドメインを含む、請求項４に記載の抗原結合性構築物。

【請求項6】

該免疫グロブリン単鎖可変ドメインのうち少なくとも1つが、配列番号６〜１１のいずれか1つのリンカーもしくは「GS」、またはそれらのいずれかの組み合わせより選択されるリンカーを用いて免疫グロブリン足場に直接的に連結されている、請求項１に記載の抗原結合性構築物。

【請求項7】

リンカーが配列番号７の配列を含む、請求項６に記載の抗原結合性構築物。

【請求項8】

IL-13抗体を含み、さらにIL-4に対する特異性を有する免疫グロブリン単鎖可変ドメインを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項9】

配列番号１３の軽鎖配列を含む、請求項８に記載の抗原結合性構築物。

【請求項10】

IL-5抗体を含み、さらにIL-13に対する特異性を有する免疫グロブリン単鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項11】

重鎖および軽鎖を含み、該重鎖配列が配列番号65に示す配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する抗体配列を含み、該軽鎖が配列番号66に示す配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する抗体配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合性構築物。

【請求項12】

重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖配列が配列番号72に示す配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項１１に記載の抗原結合性構築物。

【請求項13】

重鎖配列が配列番号２６に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、軽鎖配列が配列番号１３に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、重鎖および軽鎖を含む、請求項１に記載の抗原結合性構築物。

【請求項14】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物の軽鎖および重鎖をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項15】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物の重鎖および軽鎖をコードする1以上のポリヌクレオチド配列を含む、形質転換またはトランスフェクトされた組み換え宿主細胞。

【請求項16】

請求項１５に記載の宿主細胞を培養するステップ、および抗原結合性構築物を単離するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物の製造方法。

【請求項17】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物および製薬上許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項18】

医療での使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項19】

喘息、関節リウマチまたは変形性関節炎などの炎症性疾患の治療のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、1以上のエピトープ結合性ドメインに連結されたタンパク質足場を含む抗原結合性構築物に関し、該抗原結合性構築物は、そのうちの少なくとも1つがエピトープ結合性ドメインに由来し、そのうちの少なくとも1つが対になったVH/VLドメインに由来する少なくとも2つの抗原結合部位を有する。本発明はまた、そのような構築物の製造方法およびその使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

抗体は、治療的適用における使用でよく知られている。

【0003】

抗体は、少なくとも2つの重鎖および2つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。IgMは別として、インタクトな抗体は、通常、2つの同一の軽(L)鎖および2つの同一の重(H)鎖から構成される、約150Kdaのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、各軽鎖は、1つの、共有結合であるジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間のジスルフィド連結の数は、変動する。各重鎖および軽鎖はまた、鎖内ジスルフィド架橋をも有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(VH)を有し、その後に多くの定常領域が続く。各軽鎖は、可変ドメイン(VL)およびその他方の端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は、重鎖の第1の定常領域と並び、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。ほとんどの脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる2つのタイプのうちの1つに指定することができる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、ヒト抗体は、5つの異なるクラスIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMに指定することができる。IgGおよびIgAは、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4ならびにIgA1およびIgA2にさらに細分することができる。種変異体は、少なくともIgG2a、IgG2bを有するマウスおよびラットで存在する。抗体の可変ドメインは、抗体に結合特異性を与え、ある領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる特有の可変性を示す。可変領域の、より保存された部分は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。インタクトな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、3つのCDRによってつながれる4つのFRを含む。各鎖におけるCDRは、他方の鎖に由来するCDRと共にFR領域によって近接して相互に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は、抗原への抗体の結合に直接的に関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)への参加、Fcγ受容体への結合を介する食作用、新生児Fc受容体(FcRn)を介する半減期/クリアランス速度、および補体カスケードのC1q成分を介する補体依存性細胞傷害などの様々なエフェクター機能を示す。

【0004】

IgG抗体の構造の性質は、2つの抗原結合性部位があり、これらの両方が、同じエピトープに特異的であるというようなものである。したがって、それらは、単一特異性である。

【0005】

二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。そのような抗体の製造方法は、当技術分野において知られている。

【0006】

従来、二重特異性抗体の組換え製造は、2つの免疫グロブリンH鎖-L鎖対の同時発現に基づくものであり、2つのH鎖は、異なる結合特異性を有する。Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659を参照されたい。H鎖およびL鎖の無作為な組合せのために、1種だけが所望の結合特異性を有する、10種の異なる抗体構造の可能な混合物が、生産される。代替のアプローチは、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域に、所望の結合特異性を有する可変ドメインを融合することを含む。軽鎖結合に必要な部位を含有するCH1領域を、少なくとも1つの融合体において存在させることが好ましい。これらの融合体および所望の場合、L鎖をコードするDNAは、別個の発現ベクターに挿入され、次いで、適した宿主生物に共トランスフェクトされる。しかし、2つまたは3つすべての鎖のコード配列を1つの発現ベクターに挿入することが可能である。あるアプローチにおいて、二重特異性抗体は、一方のアームにおいて第1の結合特異性を有するH鎖および他方のアームにおいて第2の結合特異性を提供するH-L鎖対から構成される。WO94/04690を参照されたい。Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986もまた参照されたい。他のアプローチは、WO2007/095338において記載される単一ドメイン結合部位を含む抗体分子を含む。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】WO93/08829

【特許文献2】WO94/04690

【特許文献3】WO2007/095338

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983)

【非特許文献2】Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659

【非特許文献3】Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986

【発明の概要】

【0009】

本発明は、1以上のエピトープ結合性ドメインに連結されたタンパク質足場を含む抗原結合性構築物であって、少なくとも2つの抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも1つがエピトープ結合性ドメインに由来し、そのうちの少なくとも1つが対になったVH/VLドメインに由来する、抗原結合性構築物に関する。

【0010】

本発明は、さらに、2以上の式Iの構造を含む少なくとも1つのホモ二量体を含む、抗原結合性構築物に関する:

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

【0011】

式中、
Xは、定常重鎖ドメイン2および定常重鎖ドメイン3を含む定常抗体領域を表し、
R¹、R⁴、R⁷およびR⁸は、エピトープ結合性ドメインから独立に選択されるドメインを表し、
R²は、定常重鎖1、およびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R³は、対になったVHおよびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R⁵は、定常軽鎖およびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R⁶は、対になったVLおよびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
nは、0、1、2、3および4から独立に選択される整数を表し、
mは、0および1から独立に選択される整数を表し、
定常重鎖1ドメインと定常軽鎖ドメインとが結合しており、
少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインが存在し、
R³が対になったVHドメインを表す場合、R⁶は対になったVLドメインを表し、それにより該2つのドメインは一緒になって抗原に結合することが可能である。

【0012】

本発明は、1以上のドメイン抗体に連結されたモノクローナル抗体または断片を含む、IgGベースの構造、ならびにそのような構築物の製造方法およびその使用、特に療法における使用に関する。

【0013】

本発明はまた、本明細書において記載される抗原結合性構築物のうちのいずれかの重鎖をコードするポリヌクレオチド配列、および本明細書において記載される抗原結合性構築物のうちのいずれかの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドは、等価なポリペプチド配列に対応するコード配列を表すが、そのようなポリヌクレオチド配列は、開始コドン、適切なシグナル配列、および終止コドンと共に発現ベクターにクローニングすることができることが理解されるであろう。

【0014】

本発明はまた、本明細書において記載される抗原結合性構築物のうちのいずれかの重鎖および軽鎖をコードする1以上のポリヌクレオチドを含む、形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞を提供する。

【0015】

本発明はさらに、本明細書において記載される抗原結合性構築物のうちのいずれかの製造方法であって、第1および第2のベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含み、無血清培養培地において、上述の第1のベクターは、本明細書において記載される抗原結合性構築物のうちのいずれかの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、上述の第2のベクターは、本明細書において記載される抗原結合性構築物のうちのいずれかの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む製造方法を提供する。

【0016】

本発明はさらに、本明細書において記載される抗原結合性構築物および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0017】

本発明はまた、配列番号2または配列番号3において記載されるポリペプチド配列を含むかまたはそれからなるドメイン抗体をも提供する。一態様において、本発明は、配列番号60または配列番号61において記載されるポリヌクレオチド配列から発現されるタンパク質を提供する。

【0018】

定義
本明細書において使用される場合、用語「タンパク質足場」は、免疫グロブリン(Ig)足場、例えばIgG足場を含むが、これらに限定されず、これは、4つの鎖もしくは2つの鎖の抗体であってもよく、またはこれは、抗体のFc領域だけを含んでいてもよく、またはこれは、抗体に由来する1以上の定常領域を含んでいてもよく、この定常領域は、ヒトもしくは霊長動物起源のものであってもよく、またはこれは、ヒトおよび霊長動物の定常領域の人工キメラであってもよい。そのようなタンパク質足場は、1以上の定常領域に加えて抗原結合性部位を含んでいてもよく、例えば、タンパク質足場は、全IgGを含む。そのようなタンパク質足場は、他のタンパク質ドメイン、例えば、抗原結合性部位を有するタンパク質ドメイン、例えばエピトープ結合性ドメインまたはScFvドメインに連結することが可能であろう。

【0019】

「ドメイン」は、残りのタンパク質とは独立した三次構造を有する折り畳みタンパク質構造である。一般に、ドメインは、タンパク質の別々の機能特性を担い、多くの場合において、タンパク質および/またはドメインの残部の機能を損失することなく、他のタンパク質に追加されてもよい、除去されてもよい、または移されてもよい。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳みポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全抗体可変ドメインならびに例えば、1以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列と交換されている修飾可変ドメインまたは切断されたまたはNもしくはC末端伸長部分を含む抗体可変ドメインならびに完全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳み断片を含む。

【0020】

語句「免疫グロブリン単鎖可変ドメイン」は、異なるV領域またはVドメインから独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(V_H、V_HH、V_L)を指す。免疫グロブリン単鎖可変ドメインは、他の異なる可変領域または可変ドメインと共に、ある形態(例えばホモまたはヘテロ多量体)において存在することができ、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない(つまり、免疫グロブリン単鎖可変ドメインは、その他の可変ドメインから独立して抗原に結合する)。「ドメイン抗体」または「dAb」は、この用語が、本明細書において使用されるように、抗原に結合することが可能である「免疫グロブリン単鎖可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単鎖可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、げっ歯動物(例えばWO 00/29004において開示される)、テンジクザメ、およびラクダV_HH dAbなどの他の生物種に由来する単一抗体可変ドメインをも含む。ラクダV_HHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む生物種に由来する免疫グロブリン単鎖可変ドメインポリペプチドであり、これらは、軽鎖を天然で欠いている重鎖抗体を生産する。そのようなV_HHドメインは、当技術分野において入手可能な標準的な技術に従ってヒト化されてもよく、そのようなドメインは、本発明に従って「ドメイン抗体」であるとなお考えられる。本明細書において使用されるように、「V_H」は、ラクダV_HHドメインを含む。NARVは、テンジクザメを含む軟骨魚類において同定された他のタイプの免疫グロブリン単鎖可変ドメインである。これらのドメインはまた、新規な抗原受容体可変領域(一般にV(NAR)またはNARVと略される)としても知られている。さらなる詳細については、Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)およびUS20050043519Aを参照されたい。

【0021】

用語「エピトープ結合性ドメイン」は、異なるV領域またはVドメインから独立して抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指し、これは、ドメイン抗体(dAb)、例えばヒト、ラクダ、もしくはサメ免疫グロブリン単鎖可変ドメインであってもよく、またはそれは、天然リガンド以外のリガンドへの結合を達成するためにタンパク質工学にかけられた、CTLA-4(Evibody);リポカリン;プロテインA由来分子、例えばプロテインAのZドメイン(Affibody、SpA)、Aドメイン(Avimer/Maxibody);熱ショックタンパク質、例えばGroEIおよびGroES、トランスフェリン(trans-body);アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(Tetranectin);ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン(affilins);PDZドメイン;ヒトプロテアーゼインヒビターのスコーピオントキシンクニッツ(scorpion toxinkunitz)型ドメイン;ならびにフィブロネクチン(アドネクチン)から選択される足場からなる群から選択される足場の誘導体であるドメインであってもよい。

【0022】

CTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球結合抗原4)は、主にCD4+T細胞上で発現されるCD28ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ig折り畳み部分を有する。抗体のCDRに対応するループは、異なる結合特性を与えるために異種配列と置換することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたCTLA-4分子はまた、Evibodyとしても知られている。さらなる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照されたい。

【0023】

リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド、および脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる、円錐体構造の開口端に多くのループを有する強固なβシート状二次構造を有する。Anticalinは、サイズが160〜180の間のアミノ酸であり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1、およびUS20070224633を参照されたい。

【0024】

affibodyは、抗原に結合するように操作することができる黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインAに由来する足場である。ドメインは、約58アミノ酸の3ヘリックスバンドルからなる。ライブラリーは、表面残基の無作為化によって生成された。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)およびEP1641818A1を参照されたい。

【0025】

Avimerは、Aドメイン足場ファミリーに由来する多ドメインタンパク質である。約35アミノ酸の天然ドメインは、明確なジスルフィド結合構造を採る。多様性は、Aドメインのファミリーによって示される自然変異をシャッフルすることによって生成される。さらなる詳細については、Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)およびExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照されたい。

【0026】

トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、任意の表面ループへのペプチド配列の挿入によって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例は、Trans-bodyを含む。さらなる詳細については、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照されたい。

【0027】

設計されたアンキリンリピートタンパク質(DARPin)は、不可欠な膜タンパク質の細胞骨格への結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一アンキリンリピートは、2α-ヘリックスおよびβ-ターンからなる33残基のモチーフである。それらは、各リピートの第1のα-ヘリックスおよびβ-ターンにおける残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合インターフェースは、モジュールの数を増加させることによって増加され得る(親和性成熟の方法)。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)およびJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)およびUS20040132028A1を参照されたい。

【0028】

フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンIII型(FN3)の15リピート単位の10番目のドメインの天然アミノ酸配列のバックボーンからなる。β-サンドイッチの一端の3つのループは、アドネクチンが興味のある治療上の標的を特異的に認識することを可能にするように操作することができる。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)、US20080139791、WO2005056764、およびUS6818418B1を参照されたい。

【0029】

ペプチドアプタマーは、普遍的な足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入された、制限された可変ペプチドループを含有するチオレドキシン(TrxA)からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照されたい。

【0030】

マイクロボディーは、長さが25〜50アミノ酸の、3〜4システイン架橋を含有する、天然に存在するマイクロタンパク質に由来し、マイクロタンパク質の例は、KalataB1およびコノトキシンおよびノッチンを含む。マイクロタンパク質は、マイクロタンパク質の全体的な折り畳み部分に影響を与えることなく、25までのアミノ酸を含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、WO2008098796を参照されたい。

【0031】

他のエピトープ結合性ドメインは、異なる標的抗原結合特性を操作するために足場として使用されてきたタンパク質を含み、ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン(affilins)、ヒトプロテアーゼインヒビターのクニッツ(kunitz)型ドメイン、Ras結合タンパク質AF-6のPDZドメイン、サソリ毒(カリブドトキシン)、C型レクチンドメイン(tetranectins)を含み、Chapter 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)およびProtein Science 15:14-27 (2006)において概説される。本発明のエピトープ結合性ドメインは、これらの代替のタンパク質ドメインのうちのいずれかに由来し得る。

【0032】

本明細書において使用される場合、用語「対になったVHドメイン」、「対になったVLドメイン」、および「対になったVH/VLドメイン」は、それらのパートナー可変ドメインと対になった場合だけ抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインを指す。あらゆる対形成において1つのVHおよび1つのVLが常にあり、用語「対になったVHドメイン」は、VHパートナーを指し、用語「対になったVLドメイン」は、VLパートナーを指し、用語「対になったVH/VLドメイン」は、2つのドメインを共に指す。

【0033】

本発明の一実施形態において、抗原結合部位は、方法4または5において記載されるBiacore(商標)法などのBiacore(商標)によって測定した場合、各抗原に対して少なくとも1mMのKd、例えば10nM、1nM、500pM、200pM、100pMのKdで、抗原に結合する。

【0034】

本明細書において使用される場合、用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合することが可能である、構築物上の部位を指し、これは、単一ドメイン、例えばエピトープ結合性ドメインであってもよく、またはそれは、標準的な抗体上に見つけることができるような、対になったVH/VLドメインであってもよい。本発明のいくつかの態様において、単鎖Fv(ScFv)ドメインは、抗原結合性部位を提供することができる。

【0035】

用語「mAb/dAb」および「dAb/mAb」は、本発明の抗原結合性構築物を指すように本明細書において使用される。2つの用語は、区別なく使用することができ、本明細書において使用される場合、同じ意味を有するように意図される。

【0036】

用語「定常重鎖1」は、免疫グロブリン重鎖のCH1ドメインを指すように本明細書において使用される。

【0037】

用語「定常軽鎖」は、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインを指すように本明細書において使用される。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】抗原結合性構築物の例である。

【図2】抗原結合性構築物の例である。

【図3】抗原結合性構築物の例である。

【図4】抗原結合性構築物の例である。

【図5】抗原結合性構築物の例である。

【図6】抗原結合性構築物の例である。

【図7】抗原結合性構築物の例である。

【図8】mAbdAb構築物の概略図である。

【図9】PascoH-G4S-474のSECおよびSDS-PAGE分析を示す図である。

【図10】PascoL-G4S-474のSECおよびSDS-PAGE分析を示す図である。

【図11】PascoH-474のSECおよびSDS-PAGE分析を示す図である。

【図12】PascoHL-G4S-474のSECおよびSDS-PAGE分析を示す図である。

【図13】直接結合ELISAにおいてヒトIL-13と結合したmAbdAb上清を示す図である。

【図14】直接結合ELISAにおいてヒトIL-4と結合したmAbdAb上清を示す図である。

【図15】直接結合ELISAにおいてヒトIL-13と結合した精製mAbdAbを示す図である。

【図16】直接結合ELISAにおいてヒトIL-4と結合した精製mAbdAbを示す図である。

【図17】直接結合ELISAにおいてヒトIL-4と結合したmAbdAb上清を示す図である。

【図18】直接結合ELISAにおいてヒトIL-13と結合したmAbdAb上清を示す図である。

【図19】直接結合ELISAにおいてヒトIL-4と結合した精製mAbdAbを示す図である。

【図20A】図20Aは、直接結合ELISAにおいてヒトIL-13と結合した精製mAbdAbを示す図である。

【図20B】図20Bは、直接結合ELISAにおいてカニクイザルIL-13と結合した精製mAbdAbを示す図である。

【図21】BIAcore(商標)を使用したIL-4に関するmAbdAb結合反応速度を示す図である。

【図22】BIAcore(商標)を使用したIL-4に関するmAbdAb結合反応速度を示す図である。

【図23】BIAcore(商標)を使用したIL-13に関するmAbdAb結合反応速度を示す図である。

【図24】TF-1細胞バイオアッセイでの、精製抗IL-13 mAb-抗IL4 dAbがヒトIL-13を中和する能力を示す図である。

【図25】TF-1細胞バイオアッセイでの、精製抗IL-13 mAb-抗IL4 dAbがヒトIL-4を中和する能力を示す図である。

【図26】TF-1細胞バイオアッセイでの、精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAbであるPascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474がヒトIL-4を中和する能力を示す図である。

【図27】TF-1細胞バイオアッセイでの、精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAbであるPascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474がヒトIL-13を中和する能力を示す図である。

【図28】二重中和TF-1細胞バイオアッセイでの、精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAbであるPascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474がヒトIL-4とヒトIL-13の両方を同時に中和する能力を示す図である。

【図29】DOM10-53-474 SEC-MALLSを示す図である。

【図30】DOM9-112-210 SEC-MALLSを示す図である。

【図31】DOM9-155-25 SEC-MALLSを示す図である。

【図32】DOM9-155-25 SEC-MALLSの全3個のシグナルの重ね合わせを示す図である。

【図33】DOM9-155-147 SEC-MALLSを示す図である。

【図34】DOM9-155-159 SEC-MALLSを示す図である。

【図35】SEC-MALLSによるMW割り当ての対照:BSAを示す図である。

【図36】三重特異性mAbdAb分子の概略図である。

【図37】直接結合ELISAにおいてヒトIL-18と結合した三重特異性mAbdAb IL18 mAb-210-474(上清)を示す図である。

【図38】直接結合ELISAにおいてヒトIL-13と結合した三重特異性mAbdAb IL18 mAb-210-474(上清)を示す図である。

【図39】直接結合ELISAにおいてヒトIL-4と結合した三重特異性mAbdAb IL18 mAb-210-474(上清)を示す図である。

【図40】直接結合ELISAにおいてヒトIL-13と結合した三重特異性mAbdAb Mepo-210-474(上清)を示す図である。

【図41】直接結合ELISAにおいてヒトIL-4と結合した三重特異性mAbdAb Mepo-210-474(上清)を示す図である。

【図42】抗TNF/抗EGFR mAb-dAbのクローニングを示す図である。

【図43】抗TNF/抗EGFR mAb-dAbのSDS-PAGE分析を示す図である。

【図44】抗TNF/抗EGFR mAb-dAbのSECプロファイルを示す図である(実施例10)。

【図45】実施例10の抗EGFR活性を示す図である。

【図46】実施例10の抗TNF活性を示す図である。

【図47】抗TNF/抗VEGF mAb-dAbのSDS-PAGE分析を示す図である(実施例11)。

【図48】抗TNF/抗VEGF mAb-dAbのSECプロファイルを示す図である(実施例11)。

【図49】実施例11の抗VEGF活性を示す図である。

【図50】実施例11の抗TNF活性を示す図である。

【図51】抗VEGF/抗IL1R1 dAb伸長IgGのクローニングを示す図である(実施例12)。

【図52】抗TNF/抗VEGF dAb伸長IgG AのSDS-PAGE分析を示す図である(実施例12)。

【図53】抗TNF/抗VEGF dAb伸長IgG BのSDS-PAGE分析を示す図である(実施例12)。

【図54】抗TNF/抗VEGF dAb伸長IgG AのSECプロファイルを示す図である(実施例12)。

【図55】抗TNF/抗VEGF dAb伸長IgG BのSECプロファイルを示す図である(実施例12)。

【図56】実施例12の抗VEGF活性を示す図である(DMS2091)。

【図57】実施例12の抗VEGF活性を示す図である(DMS2090)。

【図58】実施例12の抗IL1R1活性を示す図である(DMS2090)。

【図59】実施例12の抗IL1R1活性を示す図である(DMS2091)。

【図60】抗TNF/抗VEGF/抗EGFR mAb-dAbのクローニングを示す図である(実施例13)。

【図61】抗TNF/抗VEGF/抗EGFR mAb-dAbのSDS-PAGE分析を示す図である(実施例13)。

【図62】実施例13の抗VEGF活性を示す図である。

【図63】実施例13の抗TNF活性を示す図である。

【図64】実施例13の抗EGFR活性を示す図である。

【図65】精製二重特異性抗体、BPC1603(A)、BPC1604(B)、BPC1605(C)、BPC1606(D)のSEC分析を示す図である。

【図66】二重特異性抗体と固定化IGF-1Rの結合を示す図である。

【図67】二重特異性抗体と固定化VEGFの結合を示す図である。

【図68】様々な二重特異性抗体によるリガンド介在性受容体リン酸化の阻害を示す図である。

【図69】様々な二重特異性抗体によるリガンド介在性受容体リン酸化の阻害を示す図である。

【図70】抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたADCCアッセイを示す図である。

【図71】抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたADCCアッセイを示す図である。

【図72】より狭い用量範囲を使用した、抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたADCCアッセイを示す図である。

【図73】より狭い用量範囲を使用した、抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたADCCアッセイを示す図である。

【図74】抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたCDCアッセイを示す図である。

【図75】抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたCDCアッセイを示す図である。

【図76】組換えヒトIGF-1R ELISAにおけるBPC1803とBPC1804の結合を示す図である。

【図77】組換えVEGF結合ELISAにおけるBPC1803とBPC1804の結合を示す図である。

【図78】組換えヒトIGF-1R ELISAにおけるBPC1805とBPC1806の結合を示す図である。

【図79】組換えヒトHER2 ELISAにおけるBPC1805とBPC1806の結合を示す図である。

【図80】組換えヒトIGF-1R ELISAにおけるBPC1807とBPC1808の結合を示す図である。

【図81】組換えヒトHER2 ELISAにおけるBPC1807とBPC1808の結合を示す図である。

【図82】組換えヒトIL-4 ELISAにおけるBPC1809の結合を示す図である。

【図83】RNAseA ELISAにおけるBPC1809の結合を示す図である。

【図84】組換えヒトIL-4 ELISAにおけるBPC1816の結合を示す図である。

【図85】HEL ELISAにおけるBPC1816の結合を示す図である。

【図86】組換えヒトIGF-1R ELISAにおけるBPC1801とBPC1802の結合を示す図である。

【図87】組換えヒトVEGFR2 ELISAにおけるBPC1801とBPC1802の結合を示す図である。

【図88a】組換えヒトIL-4 ELISAにおけるBPC1823とBPC1822の結合を示す図である。

【図88b】組換えヒトIL-4 ELISAにおけるBPC1823(高濃度上清)の結合を示す図である。

【図89a】組換えヒトTNF-αELISAにおけるBPC1823とBPC1822の結合を示す図である。

【図89b】組換えヒトTNF-αELISAにおけるBPC1823(高濃度上清)の結合を示す図である。

【図90】PascoH-474 GS除去に関するSECプロファイルを示す図である。

【図91】PascoH-TVAAPS-474 GS除去に関するSECプロファイルを示す図である。

【図92】PascoH-GS-ASTKGPT-474 2^nd GS除去に関するSECプロファイルを示す図である。

【図93】586H-210 GS除去に関するSECプロファイルを示す図である。

【図94】586H-TVAAPS-210 GS除去に関するSECプロファイルを示す図である。

【図95】PascoH-474 GS除去(レーンB)およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去(レーンA)に関するSDS-PAGEを示す図である。

【図96】PascoH-GS-ASTKGPT-474 2^nd GS除去に関するSDS-PAGEを示す図である[A=非還元状態、B=還元状態]。

【図97】586H-210 GS除去(レーンA)に関するSDS-PAGEを示す図である。

【図98】586H-TVAAPS-210 GS除去(レーンA)に関するSDS-PAGEを示す図である。

【図99】ヒトIL-4 ELISAにおける精製PascoH-474 GS除去とPascoH-TVAAPS-474 GS除去の結合を示す図である。

【図100】ヒトIL-13 ELISAにおける精製PascoH-474 GS除去とPascoH-TVAAPS-474 GS除去の結合を示す図である。

【図101】カニクイザルIL-13 ELISAにおける、精製PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616の結合を示す図である。

【図102】ELISAによるヒトIL-4RαとのヒトIL-4の結合のmAbdAb阻害を示す図である。

【図103】ELISAによるヒトIL-4RαとのヒトIL-4の結合のmAbdAb阻害を示す図である。

【図104】mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイでのヒトIL-13の中和を示す図である。

【図105】mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイでのカニクイザルIL-13の中和を示す図である。

【図106】mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイでのヒトIL-4の中和を示す図である。

【図107】mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイでのカニクイザルIL-4の中和を示す図である。

【図108】ヒトIL-13Rα2とのヒトIL-13結合の結合を阻害するmAbdAbの能力を示す図である。

【図109】PascoH-616に関するSECプロファイルを示す図である。

【図110】PascoH-TVAAPS_616に関するSECプロファイルを示す図である。

【図111】PascoH-616に関するSDS-PAGEを示す図である[E1=非還元状態、E2=還元状態]。

【図112】PascoH-TVAAPS-616に関するSDS-PAGEを示す図である[A=非還元状態、B=還元状態]。

【図113】ヒトIL-13 ELISAにおける精製PascoH-616とPascoH-TVAAPS-616の結合を示す図である。

【図114-1】図114は、mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイでのヒトIL-13の中和を示す図である。

【図114-2】図114aは、mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイでのカニクイザルIL-13の中和を示す図である。

【図115】PascoH-474 GS除去によるIL-4活性の阻害を示す図である。

【図116】PascoH-474 GS除去によるIL-13活性の阻害を示す図である。

【図117】586-TVAAPS-210によるIL-4活性の阻害を示す図である。

【図118】586-TVAAPS-210によるIL-13活性の阻害を示す図である。

【図119】パスコリツマブによるIL-4活性の阻害を示す図である。

【図120】DOM9-112-210によるIL-4活性の阻害を示す図である。

【図121】抗IL-13 mAbによるIL-13活性の阻害を示す図である。

【図122】DOM10-53-474によるIL-13活性の阻害を示す図である。

【図123】IL-4全血アッセイにおける対照mAbおよびdAbの活性を示す図である。

【図124】IL-13全血アッセイにおける対照mAbおよびdAbの活性を示す図である。

【図125】TNFとEGFRの両方に対するELISAによって評価した、投与後の様々な時点での残留した薬物の濃度を示す図である。

【図126】TNFとVEGFの両方に対するELISAによって評価した、投与後の様々な時点での残留した薬物の濃度を示す図である。

【図127】IL1R1とVEGFの両方に対するELISAによって評価した、投与後の様々な時点での残留した薬物の濃度を示す図である。

【図128】精製DMS4010のSDS-PAGEを示す図である。

【図129】精製DMS4010のSECプロファイルを示す図である。

【図130】DMS4010の抗EGFR効力を示す図である。

【図131】抗VEGF受容体結合アッセイを示す図である。

【図132】抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの二重標的化の薬物動態プロファイルを示す図である。

【図133】精製DMS4011のSDS-PAGE分析を示す図である。

【図134】精製DMS4011のSECプロファイルを示す図である。

【図135】DMS4011の抗EGFR効力を示す図である。

【図136】抗VEGF受容体結合アッセイにおけるDMS4011を示す図である。

【図137】精製サンプルDMS4023およびDMS4024のSDS-PAGE分析を示す図である。

【図138】DMS4023に関するSECプロファイルを示す図である。

【図139】DMS4024に関するSECプロファイルを示す図である。

【図140】mAbdAb DMS4023の抗EGFR効力を示す図である。

【図141】抗VEGF受容体結合アッセイにおけるDMS4023およびDMS4024を示す図である。

【図142】精製DMS4009のSDS-PAGE分析を示す図である。

【図143】DMS4009に関するSECプロファイルを示す図である。

【図144】mAbdAb DMS4009の抗EGFR効力を示す図である。

【図145】抗VEGF受容体結合アッセイにおけるDMS4009を示す図である。

【図146】精製DMS4029のSDS-PAGE分析を示す図である。

【図147】DMS4029に関するSECプロファイルを示す図である。

【図148】mAbdAb DMS4029の抗EGFR効力を示す図である。

【図149】IL-13細胞ベースの中和アッセイにおけるDMS4029を示す図である。

【図150】精製サンプルDMS4013およびDMS4027のSDS-PAGE分析を示す図である。

【図151】DMS4013に関するSECプロファイルを示す図である。

【図152】DMS4027に関するSECプロファイルを示す図である。

【図153】mAbdAb DMS4013の抗EGFR効力を示す図である。

【図154】抗VEGF受容体結合アッセイにおけるDMS4013を示す図である。

【図155】組換えヒトIL-12 ELISAにおけるBPC1616の結合を示す図である。

【図156】組換えヒトIL-18 ELISAにおけるBPC1616の結合を示す図である。

【図157】組換えヒトIL-4 ELISAにおけるBPC1616の結合を示す図である。

【図158】組換えヒトIL-4 ELISAにおけるBPC1008、1009およびBPC1010の結合を示す図である。

【図159】組換えヒトIL-5 ELISAにおけるBPC1008の結合を示す図である。

【図160】組換えヒトIL-13 ELISAにおけるBPC1008、1009およびBPC1010の結合を示す図である。

【図161】組換えヒトc-MET ELISAにおけるBPC1017とBPC1018の結合を示す図である。

【図162】組換えヒトVEGF ELISAにおけるBPC1017とBPC1018の結合を示す図である。

【図163】PascoH-TVAAPS-546に関するSECプロファイルを示す図である。

【図164】PascoH-TVAAPS-567に関するSECプロファイルを示す図である。

【図165】PascoH-TVAAPS-546に関するSDS-PAGEを示す図である[A=非還元状態、B=還元状態]。

【図166】PascoH-TVAAPS-567に関するSDS-PAGEを示す図である[A=非還元状態、B=還元状態]。

【図167】TF-1細胞バイオアッセイ中のヒトIL-13に関する中和データを示す図である。

【図168】TF-1細胞バイオアッセイ中のカニクイザルIL-13に関する中和データを示す図である。

【図169】ヒトIL-4 ELISAにおける別のアイソタイプを含有するmAbdAbの結合を示す図である。

【図170】ヒトIL-13 ELISAにおける別のアイソタイプを含有するmAbdAbの結合を示す図である。

【図171】組換えヒトEGFR ELISAにおけるBPC1818とBPC1813の結合を示す図である。

【図172】組換えヒトVEGFR2 ELISAにおけるBPC1818とBPC1813の結合を示す図である。

【図173】IL-13 ELISAにおける抗IL5 mAb-抗IL13 dAb結合を示す図である。

【図174】IL-5 ELISAにおける抗IL5 mAb-抗IL13 dAb結合を示す図である。

【図175】組換えヒトVEGFR2 ELISAにおけるBPC1812結合を示す図である。

【図176】組換えヒトEGFR ELISAにおけるBPC1812結合を示す図である。

【図177】ヒトIL-13 ELISAにおけるmAbdAbを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本発明は、1以上のエピトープ結合性ドメインに連結されたタンパク質足場を含む抗原結合性構築物であって、少なくとも2つの抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも1つがエピトープ結合性ドメインに由来し、そのうちの少なくとも1つが対になったVH/VLドメインに由来する、抗原結合性構築物に関する。

【0040】

そのような抗原結合性構築物は、タンパク質足場、例えば、IgG、例えばモノクローナル抗体などのIg足場を含み、これは、1以上のエピトープ結合性ドメイン、例えばドメイン抗体に連結され、結合性構築物は、そのうちの少なくとも1つがエピトープ結合性ドメインに由来する少なくとも2つの抗原結合部位を有し、製造方法およびその使用、特に療法における使用に関する。

【0041】

本発明による抗原結合性構築物のいくつかの例は、図1において記載される。

【0042】

本発明の抗原結合性構築物はまた、mAbdAbとも呼ばれる。

【0043】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物のタンパク質足場は、Ig足場、例えばIgG足場またはIgA足場である。IgG足場は、抗体のドメイン(つまりCH1、CH2、CH3、VH、VL)をすべて含んでいてもよい。本発明の抗原結合性構築物は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIgG4PEから選択されるIgG足場を含んでいてもよい。

【0044】

本発明の抗原結合性構築物は、少なくとも2つの抗原結合部位を有し、例えば、それは、2つの結合部位を有し、例えば、第1の結合部位は、抗原上の第1のエピトープに対する特異性を有し、第2の結合部位は、同じ抗原上の第2のエピトープに対する特異性を有する。さらなる実施形態において、4つの抗原結合部位または6つの抗原結合部位または8つの抗原結合部位または10もしくはそれ以上の抗原結合性部位がある。一実施形態において、抗原結合性構築物は、1つを超える抗原、例えば2つの抗原または3つの抗原または4つの抗原に対する特異性を有する。

【0045】

他の態様において、本発明は、2以上の式Iの構造を含む少なくとも1つのホモ二量体を含む、抗原結合性構築物に関する:

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

【0046】

式中、
Xは、定常重鎖ドメイン2および定常重鎖ドメイン3を含む定常抗体領域を表し、
R¹、R⁴、R⁷およびR⁸は、エピトープ結合性ドメインから独立に選択されるドメインを表し、
R²は、定常重鎖1、およびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R³は、対になったVHおよびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R⁵は、定常軽鎖およびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
R⁶は、対になったVLおよびエピトープ結合性ドメインからなる群から選択されるドメインを表し、
nは、0、1、2、3および4から独立に選択される整数を表し、
mは、0および1から独立に選択される整数を表し、
定常重鎖1ドメインと定常軽鎖ドメインとが結合しており、
少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインが存在し、
R³が対になったVHドメインを表す場合、R⁶は対になったVLドメインを表し、それにより該2つのドメインは一緒になって抗原に結合することが可能である。

【0047】

一実施形態において、R⁶は、対になったVLを表し、R³は、対になったVHを表す。

【0048】

さらなる実施形態において、R⁷およびR⁸のいずれか一方または両方は、エピトープ結合性ドメインを表す。

【0049】

さらなる実施形態において、R¹およびR⁴両方のいずれか一方または両方は、エピトープ結合性ドメインを表す。

【0050】

一実施形態において、R⁴が存在する。

【0051】

一実施形態において、R¹ R⁷、およびR⁸は、エピトープ結合性ドメインを表す。

【0052】

一実施形態において、R¹ R⁷、およびR⁸ならびにR⁴は、エピトープ結合性ドメインを表す。

【0053】

一実施形態において、(R¹)_n、(R²)_m、(R⁴)_m、および(R⁵)_m=0、つまり存在せず、R³は、対になったVHドメインであり、R⁶は、対になったVLドメインであり、R⁸は、VH dAbであり、R⁷は、VL dAbである。

【0054】

他の実施形態において、(R¹)_n、(R²)_m、(R⁴)_m、および(R⁵)_mは、0、つまり存在せず、R³は、対になったVHドメインであり、R⁶は、対になったVLドメインであり、R⁸は、VH dAbであり、(R⁷)_m=0、つまり存在しない。

【0055】

他の実施形態において、(R²)_mおよび(R⁵)_mは、0、つまり存在せず、R¹は、dAbであり、R⁴は、dAbであり、R³は、対になったVHドメインであり、R⁶は、対になったVLドメインであり、(R⁸)_mおよび(R⁷)_m=0、つまり存在しない。

【0056】

本発明の一実施形態において、エピトープ結合性ドメインは、dAbである。

【0057】

本明細書において記載される抗原結合性構築物のうちのいずれも、1以上の抗原を中和することが可能であることが理解されるであろう。

【0058】

本発明の抗原結合性構築物に関連して本明細書の全体にわたって使用される場合、用語「中和する」およびその文法的な変化形は、標的の生物活性が、そのような抗原結合性構築物の非存在下における標的の活性と比較して、本発明の抗原結合性構築物の存在下において完全にまたは部分的に低下することを意味する。中和は、リガンド結合のブロック、受容体を活性化するリガンドの妨害、受容体のダウンレギュレート、またはエフェクター機能性に影響を与えることのうちの1以上によるものであってもよいが、これらに限定されない。

【0059】

中和のレベルは、いくつかの方法において、例えば、実施例および下記の方法において記載されるアッセイのうちのいずれかの使用によって、例えば、例えば方法12、19、もしくは21または実施例32のうちのいずれか1つにおいて記載されるように実行されてもよい、受容体へのリガンド結合の阻害を測定するアッセイにおいて測定することができる。これらのアッセイにおけるVEGF、IL-4、IL-13、またはHGFの中和は、中和抗原結合性構築物の存在下においてリガンドおよびその受容体の間の結合の減少を評価することによって測定される。

【0060】

中和のレベルはまた、例えば方法8、9、10、20、または21において記載されるように実行されてもよいTF1アッセイにおいて例えば測定することもできる。このアッセイにおけるIL-13、IL-4、またはこれらのサイトカインの両方の中和は、中和抗原結合性構築物の存在下においてTF1細胞増殖の阻害を評価することによって測定される。その代わりに、中和は、例えば方法13において記載されるように実行されてもよいEGFRリン酸化アッセイにおいて測定することができる。このアッセイにおけるEGFRの中和は、中和抗原結合性構築物の存在下において受容体のチロシンキナーゼリン酸化の阻害を評価することによって測定される。または、中和は、例えば方法14または15において記載されるように実行されてもよいMRC-5細胞におけるIL-8分泌アッセイにおいて測定することができる。このアッセイにおけるTNFαまたはIL-1R1の中和は、中和抗原結合性構築物の存在下においてIL-8分泌の阻害を評価することによって測定される。

【0061】

例えば中和抗原結合性構築物の存在下においてリガンドおよびその受容体の間の結合の減少を評価することによって、中和を評価するための他の方法は、当技術分野において知られており、例えばBiacore(商標)アッセイを含む。

【0062】

本発明の代替の態様において、本明細書において例示される抗体に対する少なくとも実質的に等価な中和活性を有する抗原結合性構築物、例えば、TF1細胞増殖アッセイにおいて586H-TVAAPS-210もしくはPascoH-G4S-474もしくはPascoH-474、PascoH-474 GS除去、PascoL-G4S-474、またはPascoHL-G4S-474の中和活性または実施例4および20においてそれぞれ記載されるpSTAT6シグナル伝達アッセイの阻害を保持する抗原結合性構築物または例えば、VEGFR結合アッセイにおいてBPC1603、BPC1604、BPC1605、BPC1606の中和活性もしくは実施例14.6および14.7において記載されるIGF-1R受容体リン酸化の阻害を保持する抗原結合性構築物が提供される。

【0063】

本発明の抗原結合性構築物は、IL-13に対する特異性を有するもの、例えば、IL-13に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはIL-13に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。抗原結合性構築物は、IL-13に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、IL-13に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0064】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、1つを超える抗原に対する特異性を有し、例えば、それは、IL-13、IL-5、およびIL-4から選択される2以上の抗原に結合することが可能であり、例えば、それは、IL-13およびIL-4に結合することが可能であり、またはそれは、IL-13およびIL-5に結合することが可能であり、またはそれは、IL-5およびIL-4に結合することが可能である。

【0065】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、1つを超える抗原に対する特異性を有し、例えば、それは、IL-13、IL-5、およびIL-4から選択される2以上の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、IL-13およびIL-4に同時に結合することが可能であり、またはそれは、IL-13およびIL-5に同時に結合することが可能であり、またはそれは、IL-5およびIL-4に同時に結合することが可能である。

【0066】

本明細書において記載される抗原結合性構築物のうちのいずれも、実施例の部、方法7において記載されるものなどの適したアッセイを使用することによって、例えば、化学量論的分析によって決定されるように、2以上の抗原に同時に結合することが可能であってもよいことが理解されるであろう。

【0067】

本発明の抗原結合性構築物の例は、IL-4に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-4 dAb、例えば、配列番号16〜39、配列番号41〜43、配列番号87〜90、配列番号151、配列番号152、もしくは配列番号155において記載される重鎖配列を有するmAbdAbを有するIL-13抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインを有するIL-13抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインを有するIL-13抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインを有するIL-13抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインを有するIL-13抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0068】

そのような抗原結合性構築物の例は、IL-13に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-13 dAb、例えば、配列番号48〜53、配列番号91、配列番号92、配列番号149、配列番号150、もしくは配列番号157〜160において記載される重鎖配列および/または配列番号54〜59において記載される軽鎖配列を有するmAbdAbを有するIL-4抗体を含む。

【0069】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-4抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-4抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-4抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-4抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0070】

そのような抗原結合性構築物の例は、IL-5に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-5 dAbを有するIL-13抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-5エピトープ結合性ドメインを有するIL-13抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-5エピトープ結合性ドメインを有するIL-13抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-5エピトープ結合性ドメインを有するIL-13抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-5エピトープ結合性ドメインを有するIL-13抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0071】

そのような抗原結合性構築物の例は、IL-13に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-13 dAb、例えば、配列番号72において記載される軽鎖配列を有するmAbdAbを有するIL-5抗体を含む。

【0072】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0073】

そのような抗原結合性構築物の例は、IL-5に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-5 dAbを有するIL-4抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-5エピトープ結合性ドメインを有するIL-4抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-5エピトープ結合性ドメインを有するIL-4抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-5エピトープ結合性ドメインを有するIL-4抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-5エピトープ結合性ドメインを有するIL-4抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0074】

そのような抗原結合性構築物の例は、IL-4に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-4 dAb、例えば、配列番号71において記載される重鎖配列を有するmAbdAbを有するIL-5抗体を含む。

【0075】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0076】

本発明はまた、IL-4、IL-13、およびIL-5に結合することが可能である三重特異性結合性構築物をも提供する。

【0077】

そのような抗原結合性構築物の例は、IL-4に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-4 dAbおよびIL-13に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-13 dAbを有するIL-5抗体を含む。

【0078】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0079】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0080】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0081】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0082】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0083】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0084】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0085】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0086】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0087】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0088】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0089】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-5抗体を含む。

【0090】

そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0091】

本発明の抗原結合性構築物は、IL-18に対する特異性を有するもの、例えば、IL-18に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはIL-18に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0092】

抗原結合性構築物は、IL-18に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、IL-18に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0093】

本発明はまた、IL-4、IL-13、およびIL-18に結合することが可能である三重特異性結合性構築物をも提供する。

【0094】

そのような抗原結合性構築物の例は、IL-4に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-4 dAbおよびIL-13に対して特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-13 dAbを有するIL-18抗体を含む。

【0095】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインIL-18抗体を含む。

【0096】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0097】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0098】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0099】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0100】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0101】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0102】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0103】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0104】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のC末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0105】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび重鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0106】

本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL-4エピトープ結合性ドメインおよび軽鎖のN末端に連結されたIL-13エピトープ結合性ドメインを有するIL-18抗体を含む。

【0107】

そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0108】

本発明の抗原結合性構築物は、TNFαに対する特異性を有するもの、例えば、TNFαに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはTNFαに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0109】

抗原結合性構築物は、TNFαに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、TNFαに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0110】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、1つを超える抗原に対する特異性を有し、例えば、それは、TNFα、EGFR、およびVEGFから選択される2以上の抗原に結合が可能である、例えば、それは、TNFαおよびEGFRに結合することが可能であり、またはそれは、TNFαおよびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびVEGFに結合することが可能である。そのような抗原結合性構築物の例は、EGFRに対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗EGFR dAb、例えば、配列番号74において記載される重鎖配列および/または配列番号79において記載される軽鎖配列を有するmAbdAbを有するTNFα抗体を含む。

【0111】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたEGFRエピトープ結合性ドメインを有するTNFα抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたEGFRエピトープ結合性ドメインを有するTNFα抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたEGFRエピトープ結合性ドメインを有するTNFα抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたEGFRエピトープ結合性ドメインを有するTNFα抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0112】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたTNFαエピトープ結合性ドメインを有するEGFR抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたTNFαエピトープ結合性ドメインを有するEGFR抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたTNFαエピトープ結合性ドメインを有するEGFR抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたTNFαエピトープ結合性ドメインを有するEGFR抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0113】

そのような抗原結合性構築物の例は、VEGFに対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗VEGF dAb、例えば、配列番号75、78、または185において記載される重鎖配列を有するmAbdAbを有するTNFα抗体を含む。

【0114】

本発明の抗原結合性構築物は、1つを超える抗原に対する特異性を有していてもよく、例えば、それは、TNFαならびにIL-4およびIL-13から選択される一方または両方の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、TNFαおよびIL-4に結合することが可能であり、またはそれは、TNFαおよびIL-13に結合することが可能であり、またはそれは、TNFαおよびIL-13およびIL-4に結合することが可能である。そのような抗原結合性構築物の例は、TNFαに対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗TNFαアドネクチン、例えば、配列番号134または135において記載される重鎖配列を有するmAbdAbを有するIL-13抗体を含む。そのような抗原結合性構築物の他の例は、TNFαに対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗TNFαアドネクチン、例えば、配列番号146または147において記載される重鎖配列を有するmAbdAbを有するIL-4抗体を含む。

【0115】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたVEGFエピトープ結合性ドメインを有するTNFα抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたVEGFエピトープ結合性ドメインを有するTNFα抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたVEGFエピトープ結合性ドメインを有するTNFα抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたVEGFエピトープ結合性ドメインを有するTNFα抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0116】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたTNFαエピトープ結合性ドメインを有するVEGF抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたTNFαエピトープ結合性ドメインを有するVEGF抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたTNFαエピトープ結合性ドメインを有するVEGF抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたTNFαエピトープ結合性ドメインを有するVEGF抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0117】

本発明の抗原結合性構築物は、CD-20に対する特異性を有するもの、例えば、CD-20に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはCD-20に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0118】

抗原結合性構築物は、CD-20に結合することが可能である抗体を含んでいてもよく、例えば、それは、配列番号120および117の重鎖配列および軽鎖配列を有する抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、CD-20に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。CD-20に対する特異性を有するmAbdAbの例は、配列番号116、118において記載される重鎖配列を有するものまたは配列番号119もしくは121において記載される軽鎖配列を有するものである。

【0119】

そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0120】

本発明の抗原結合性構築物は、IL1R1に対する特異性を有するもの、例えば、IL1R1に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはIL1R1に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0121】

抗原結合性構築物は、IL1R1に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、IL1R1に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0122】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、1つを超える抗原に対する特異性を有し、例えば、それは、IL1R1および第2の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、IL1R1およびVEGFに結合することが可能である。そのような抗原結合性構築物の例は、VEGFに対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗VEGF dAb、例えば、配列番号77において記載される軽鎖配列を有するmAbdAbを有するIL1R1抗体を含む。

【0123】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたVEGFエピトープ結合性ドメインを有するIL1R1抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたVEGFエピトープ結合性ドメインを有するIL1R1抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたVEGFエピトープ結合性ドメインを有するIL1R1抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたVEGFエピトープ結合性ドメインを有するIL1R1抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0124】

本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のN末端に連結されたIL1R1のエピトープ結合性ドメインを有するVEGF抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のN末端に連結されたIL1R1のエピトープ結合性ドメインを有するVEGF抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、重鎖のC末端に連結されたIL1R1のエピトープ結合性ドメインを有するVEGF抗体を含む。本発明の抗原結合性構築物は、軽鎖のC末端に連結されたIL1R1のエピトープ結合性ドメインを有するVEGF抗体を含む。そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0125】

本発明の抗原結合性構築物は、EGFRに対する特異性を有するもの、例えば、EGFRに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはEGFRに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0126】

抗原結合性構築物は、EGFRに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、EGFRに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。そのような抗原結合性構築物のいくつかの例は、配列番号103を含む、EGFRの上のエピトープに結合することが可能であろう、例えば、配列番号97〜配列番号102および配列番号104〜配列番号107において記載される1以上のCDRを含む抗原結合性構築物であろう。

【0127】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、1つを超える抗原に対する特異性を有し、例えば、それは、EGFR、IGF-1R、VEGFR2、およびVEGFから選択される2以上の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、EGFRおよびIGF-1Rに結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFおよびIGF-1Rに結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、IGF-1RおよびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFおよびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、EGFR、IGF-1R、およびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、VEGF、IGF-1R、およびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、EGFR、VEGF、およびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、EGFR、VEGF、およびIGF1Rに結合することが可能である。そのような抗原結合性構築物の例は、VEGFR2に対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗VEGFR2アドネクチン、配列番号136、140、もしくは144において記載される重鎖配列および/または配列番号138、142、もしくは145において記載される軽鎖配列を有するmAbdAbを有するEGFR抗体を含む。

【0128】

そのような抗原結合性構築物の例は、VEGFに対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗VEGF dAb、例えば、配列番号165、174、176、178、184、もしくは186において記載される重鎖配列および/または配列番号188もしくは190において記載される軽鎖配列を有するmAbdAbを有するEGFR抗体を含む。

【0129】

そのような抗原結合性構築物の例は、EGFRに対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗EGFR dAb、例えば、配列番号180において記載される重鎖配列を有するmAbdAbを有するVEGF抗体を含む。そのようなmAbdAbはまた、配列番号182において記載される軽鎖配列を含んでいてもよい。

【0130】

そのような抗原結合性構築物の例は、VEGFに対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗VEGFリポカリン、例えば、配列番号123または125において記載される重鎖配列を有するmAbdAbを有するIGF-1R抗体を含む。そのようなmAbdAbはまた、配列番号113において記載される軽鎖配列を含んでいてもよい。

【0131】

そのような抗原結合性構築物の例は、VEGFR2に対する特異性を有するエピトープ結合性ドメイン、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗VEGFR2アドネクチン、例えば配列番号124または133において記載される重鎖配列を有するmAbdAbを有するIGF-1R抗体を含む。そのようなmAbdAbはまた、配列番号113において記載される軽鎖配列を含んでいてもよい。

【0132】

本発明の抗原結合性構築物は、IL-23に対する特異性を有するもの、例えば、IL-23に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはIL-23に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0133】

抗原結合性構築物は、IL-23に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、IL-23に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0134】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、1つを超える抗原に対する特異性を有し、例えば、それは、TH17型サイトカイン、例えばIL-17、IL-22、またはIL-21から選択される2以上の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、IL-23およびIL-17に結合することが可能であり、またはそれは、IL-23およびIL-21に結合することが可能であり、またはそれは、IL-23およびIL-22に結合することが可能である。

【0135】

そのような抗原結合性構築物の例は、IL-17に対する特異性を有するエピトープ結合性ドメインを有するIL-23抗体、例えば、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に連結された抗IL-17 dAbを含む。

【0136】

本発明の抗原結合性構築物は、PDGFRαに対する特異性を有するもの、例えば、PDGFRαに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはPDGFRαに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。抗原結合性構築物は、PDGFRαに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、PDGFRαに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0137】

本発明の抗原結合性構築物は、FGFR1に対する特異性を有するもの、例えば、FGFR1に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはFGFR1に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。抗原結合性構築物は、FGFR1に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、FGFR1に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0138】

本発明の抗原結合性構築物は、FGFR3に対する特異性を有するもの、例えば、FGFR3に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはFGFR3に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。抗原結合性構築物は、FGFR3に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、FGFR3に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0139】

本発明の抗原結合性構築物は、VEGFR2に対する特異性を有するもの、例えば、VEGFR2に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはVEGFR2に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。抗原結合性構築物は、VEGFR2に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、VEGFR2に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0140】

本発明の抗原結合性構築物は、VEGFR3に対する特異性を有するもの、例えば、VEGFR3に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはVEGFR3に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0141】

抗原結合性構築物は、VEGFR3に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、VEGFR3に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0142】

本発明の抗原結合性構築物は、VEカドヘリンに対して特異性を有するもの、例えば、VEカドヘリンに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはVEカドヘリンに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0143】

抗原結合性構築物は、VEカドヘリンに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、VEカドヘリンに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0144】

本発明の抗原結合性構築物は、ニューロピリンに対して特異性を有するもの、例えば、ニューロピリンに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはニューロピリンに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0145】

抗原結合性構築物は、ニューロピリンに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、ニューロピリンに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0146】

本発明の抗原結合性構築物は、Flt-3に対する特異性を有するもの、例えば、Flt-3に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはFlt-3に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0147】

抗原結合性構築物は、Flt-3に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、Flt-3に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0148】

本発明の抗原結合性構築物は、ronに対する特異性を有するもの、例えば、ronに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはronに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0149】

抗原結合性構築物は、ronに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、ronに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0150】

本発明の抗原結合性構築物は、Trp-1に対する特異性を有するもの、例えば、Trp-1に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはTrp-1に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0151】

抗原結合性構築物は、Trp-1に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、Trp-1に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0152】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、1つを超える抗原に対する特異性を有し、例えば、それは、癌において関係する2以上の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、PDGFRα、FGFR1、FGFR3、VEGFR2、VEGFR3、IGF1R、EGFRおよびVEGF、VEカドヘリン、ニューロピリン、Flt-3、ron、Trp-1、CD-20から選択される2以上の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、PDGFRαおよびFGFR1に結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびFGFR3に結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびVEGFR3に結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびIGF1Rに結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびEGFRに結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびVEカドヘリンに結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびronに結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびTrp1に結合することが可能であり、またはそれは、PDGFRαおよびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびFGFR3に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびVEGR3に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびIGF1Rに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびEGFRに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびVEカドヘリンに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびronに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR1およびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびVEGFR2に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびVEGFR3に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびIGF1Rに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびEGFRに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびVEカドヘリンに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびronに結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、FGFR3およびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびVEGFR3に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびIGF1Rに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびEGFRに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびVEカドヘリンに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびronに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR2およびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR3およびIGF-1Rに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR3およびEGFRに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR3およびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR3およびVEカドヘリンに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR3およびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR3およびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR3およびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFR3およびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、IGF1RおよびEGFRに結合することが可能であり、またはそれは、IGF1RおよびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、IGF1RおよびVEカドヘリンに結合することが可能であり、またはそれは、IGF1Rおよびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、IGF1RおよびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、IGF1Rおよびronに結合することが可能であり、またはそれは、IGF1RおよびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、IGF1RおよびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびVEGFに結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびVEカドヘリンに結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびronに結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、EGFRおよびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFおよびVEカドヘリンに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFおよびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFおよびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFおよびronに結合することが可能であり、またはそれは、VEGFおよびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、VEGFおよびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、VEカドヘリンおよびニューロピリンに結合することが可能であり、またはそれは、VEカドヘリンおよびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、VEカドヘリンおよびronに結合することが可能であり、またはそれは、VEカドヘリンおよびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、VEカドヘリンおよびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、ニューロピリンおよびFlt-3に結合することが可能であり、またはそれは、ニューロピリンおよびronに結合することが可能であり、またはそれは、ニューロピリンおよびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、ニューロピリンおよびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、Flt-3およびronに結合することが可能であり、またはそれは、Flt-3およびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、Flt-3およびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、ronおよびTrp-1に結合することが可能であり、またはそれは、ronおよびCD-20に結合することが可能であり、またはそれは、Trp-1およびCD-20に結合することが可能である。

【0153】

そのような抗原結合性構築物はまた、重鎖のC末端および/もしくはN末端ならびに/または軽鎖のC末端および/もしくはN末端に連結された、同じかまたは異なる抗原特異性を有する1以上のエピトープ結合性ドメインをさらに有していてもよい。

【0154】

本発明の抗原結合性構築物は、βアミロイドに対する特異性を有するもの、例えば、βアミロイドに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはβアミロイドに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0155】

抗原結合性構築物は、βアミロイドに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、βアミロイドに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0156】

本発明の抗原結合性構築物は、CD-3に対する特異性を有するもの、例えば、CD-3に結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはCD-3に結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0157】

抗原結合性構築物は、CD-3に結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、CD-3に結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0158】

本発明の抗原結合性構築物は、gpIIIb/IIaに対する特異性を有するもの、例えば、gpIIIb/IIaに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはgpIIIb/IIaに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0159】

抗原結合性構築物は、gpIIIb/IIaに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、gpIIIb/IIaに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0160】

本発明の抗原結合性構築物は、TGFβに対する特異性を有するもの、例えば、TGFβに結合することが可能であるエピトープ結合性ドメインを含むものまたはTGFβに結合する、対になったVH/VLを含むものを含む。

【0161】

抗原結合性構築物は、TGFβに結合することが可能である抗体を含んでいてもよい。抗原結合性構築物は、TGFβに結合することが可能であるdAbを含んでいてもよい。

【0162】

本発明の一実施形態において、本明細書において記載される、抗体が、低下したADCCおよび/もしくは補体活性化またはエフェクター機能性を有するように定常領域を含む、本発明による抗原結合性構築物が提供される。そのような一実施形態において、重鎖定常領域は、IgG2アイソタイプもしくはIgG4アイソタイプの天然に無能力の定常領域または突然変異したIgG1定常領域を含んでいてもよい。適した修飾の例は、EP0307434において記載されている。ある一例は、位置235および237(EUインデックスナンバリング)にアラニン残基の置換を含む。

【0163】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、Fc機能性を保持するであろう、例えば、ADCCおよびCDCの活性の一方または両方の能力があるであろう。そのような抗原結合性構築物は、軽鎖上に、例えば軽鎖のC末端上に配置されるエピトープ結合性ドメインを含んでいてもよい。

【0164】

本発明はまた、抗体の軽鎖上にエピトープ結合性ドメインを位置させることによって、特に、軽鎖のC末端上にエピトープ結合性ドメインを位置させることによって、抗原結合性構築物のADCCおよびCDCの機能を維持するための方法をも提供する。そのようなADCCおよびCDCの機能は、任意の適したアッセイ、例えば実施例15.3において記載されるADCCアッセイおよび実施例15.4において記載されるCDCアッセイによって測定することができる。

【0165】

本発明はまた、抗体の重鎖上にエピトープ結合性ドメインを位置させることによって、特に、重鎖のC末端上にエピトープ結合性ドメインを位置させることによって、抗原結合性構築物のCDC機能を低下させる方法をも提供する。そのようなCDC機能は、任意の適したアッセイ、例えば実施例15.4において記載されるCDCアッセイによって測定することができる。

【0166】

さらなる実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、VEGF、IGF-1R、およびEGFRから選択される2以上の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、EGFRおよびVEGFもしくはEGFRおよびIGF1RもしくはIGF1RおよびVEGFに結合することが可能であり、または例えば、それは、TNFおよびIL1-Rに結合することが可能である。IGF-1R結合部位を含む、本発明の実施形態において、本発明の抗原結合性構築物のIGF-1R結合部位は、タンパク質足場において、対になったVH/VLドメインを含んでいてもよく、この対になったVH/VLドメインは、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、および配列番号86において記載されるものから選択される1以上のCDRを含んでいてもよい、例えば、それは、配列番号80において記載されるCDRH3を少なくとも含んでいてもよい、例えば、それは、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号85、および配列番号86において記載されるCDRをすべて含んでいてもよい。

【0167】

EGFR結合部位を含む本発明の実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、成熟または正常または野生型EGFR配列の残基273〜501を含むエピトープに結合してもよい、例えば、それは、成熟または正常または野生型EGFRの残基287〜302を含むエピトープに結合してもよい(配列番号103)。

【0168】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物のEGFR結合部位は、タンパク質足場において、対になったVH/VLドメインを含んでいてもよく、この対になったVH/VLドメインは、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号100、配列番号101、および配列番号102において記載されるものから選択される1以上のCDRを含んでいてもよい、例えば、それは、配列番号106において記載されるCDRH3を含んでいてもよく、またはそれは、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号100、配列番号101、および配列番号102において記載された6つのCDRをすべて含んでいてもよい。

【0169】

そのような対になったVH/VLドメインは、特に重鎖CDRにおいて、その他の残基をさらに含んでいてもよく、一実施形態において、CDRH1は、配列番号104に加えて5つまでのその他の残基、例えば、配列番号97において記載される、1以上の5つのその他の残基を含んでいてもよく、CDRH2は、配列番号105に加えて2つまでのその他の残基、例えば、配列番号98および配列番号107において記載される、2つのその他の残基のうちの一方または両方を含んでいてもよく、CDRH3は、配列番号106に加えて2つまでのその他の残基、例えば、配列番号99において記載される、2つのその他の残基のうちの一方または両方を含んでいてもよい。そのような一実施形態において、対になったVH/VLは、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、および配列番号102において記載される、1以上のCDRを含む、例えば、それは、配列番号99において記載されるCDRH3を少なくとも含んでいてもよく、例えば、それは、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、および配列番号102において記載される6つのCDRをすべて含んでいてもよい(適した抗体のより詳細については、WO02/092771およびWO2005/081854において知ることができる)。

【0170】

一実施形態において、抗原結合性構築物は、ドメイン抗体(dAb)であるエピトープ結合性ドメインを含む、例えば、エピトープ結合性ドメインは、ヒトVHもしくはヒトVLまたはラクダV_HHまたはサメdAb(NARV)であってもよい。

【0171】

一実施形態において、抗原結合性構築物は、CTLA-4(Evibody);リポカリン;プロテインA由来分子、例えばプロテインAのZドメイン(Affibody、SpA)、Aドメイン(Avimer/Maxibody);熱ショックタンパク質、例えばGroEIおよびGroES、トランスフェリン(trans-body);アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(Tetranectin);ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン(affilins);PDZドメイン;ヒトプロテアーゼインヒビターのスコーピオントキシンクニッツ(scorpion toxinkunitz)型ドメイン;ならびにフィブロネクチン(アドネクチン)からなる群から選択される足場の誘導体であるエピトープ結合性ドメインを含み、これは、天然リガンド以外のリガンドとの結合を実現するために、タンパク質工学に供されたものである。

【0172】

本発明の抗原結合性構築物は、アドネクチンであるエピトープ結合性ドメインに連結されたタンパク質足場、例えば、重鎖のC末端に連結されたアドネクチンを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、アドネクチンに連結されたタンパク質足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたアドネクチンを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、アドネクチンに連結されたタンパク質足場、例えば、軽鎖のC末端に連結されたアドネクチンを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、アドネクチンに連結されたタンパク質足場、例えば、軽鎖のN末端に連結されたアドネクチンを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0173】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、CTLA-4であるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたCTLA-4を有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたCTLA-4を有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたCTLA-4を有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたCTLA-4を有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0174】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、リポカリンであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたリポカリンを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたリポカリンを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたリポカリンを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたリポカリンを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0175】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、SpAであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたSpAを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたSpAを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたSpAを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたSpAを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0176】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、affibodyであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたaffibodyを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたaffibodyを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたaffibodyを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたaffibodyを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0177】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、affimerであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたaffimerを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたaffimerを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたaffimerを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたaffimerを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0178】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、GroEIであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたGroEIを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたGroEIを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたGroEIを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたGroEIを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0179】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、トランスフェリンであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたトランスフェリンを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたトランスフェリンを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたトランスフェリンを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたトランスフェリンを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0180】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、GroESであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたGroESを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたGroESを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたGroESを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたGroESを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0181】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、DARPinであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたDARPinを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたDARPinを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたDARPinを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたDARPinを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0182】

他の実施形態において、それは、タンパク質足場、例えば、ペプチドアプタマーであるエピトープ結合性ドメインに連結されたIgG足場、例えば、重鎖のN末端に連結されたペプチドアプタマーを有するIgG足場を含んでいてもよく、またはそれは、例えば、重鎖のC末端に連結されたペプチドアプタマーを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、例えば、軽鎖のN末端に連結されたペプチドアプタマーを有するIgG足場を含んでいてもよく、もしくはそれは、軽鎖のC末端に連結されたペプチドアプタマーを有するIgG足場を含んでいてもよい。

【0183】

本発明の一実施形態において、4つのエピトープ結合性ドメイン、例えば4つのドメイン抗体があり、エピトープ結合性ドメインのうちの2つは、同じ抗原に対する特異性を有していてもよく、または抗原結合性構築物中に存在するエピトープ結合性ドメインはすべて、同じ抗原に対する特異性を有していてもよい。

【0184】

本発明のタンパク質足場は、リンカーの使用によってエピトープ結合性ドメインに連結されていてもよい。適したリンカーの例は、長さが1アミノ酸〜150アミノ酸または1アミノ酸〜140アミノ酸、例えば1アミノ酸〜130アミノ酸または1〜120アミノ酸または1〜80アミノ酸または1〜50アミノ酸または1〜20アミノ酸または1〜10アミノ酸または5〜18アミノ酸であってもよいアミノ酸配列を含む。そのような配列は、それら自体の三次構造を有していてもよい、例えば、本発明のリンカーは、単鎖可変ドメインを含んでいてもよい。一実施形態におけるリンカーのサイズは、単鎖可変ドメインと等価である。適したリンカーは、1〜20オングストロームのサイズ、例えば15オングストローム未満または10オングストローム未満または5オングストローム未満であってもよい。

【0185】

本発明の一実施形態において、少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインは、1〜150アミノ酸、例えば1〜20アミノ酸、例えば1〜10アミノ酸を含むリンカーで、Ig足場に直接的に連結される。そのようなリンカーは、配列番号6〜11において記載されるもの、「STG」(セリン、トレオニン、グリシン)、「GSTG」、または「RS」のうちのいずれか1つから選択されてもよく、例えば、リンカーは、「TVAAPS」であってもよく、またはリンカーは、「GGGGS」であってもよい。本発明の抗原結合性構築物において有益なリンカーは、単独でまたは他のリンカーに加えて、GS残基の1以上のセット、例えば「GSTVAAPS」または「TVAAPSGS」または「GSTVAAPSGS」を含んでいてもよい。他の実施形態において、エピトープ結合性ドメイン、例えばdAbおよびIg足場の間にリンカーはない。他の実施形態において、エピトープ結合性ドメイン、例えばdAbは、リンカー「TVAAPS」によってIg足場に連結される。他の実施形態において、エピトープ結合性ドメイン、例えばdAbは、リンカー「TVAAPSGS」によってIg足場に連結される。他の実施形態において、エピトープ結合性ドメイン、例えばdAbは、リンカー「GS」によってIg足場に連結される。

【0186】

一実施形態において、本発明の抗原結合性構築物は、ヒト血清アルブミンに結合することが可能である、少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインを含む。

【0187】

一実施形態において、少なくとも3つの抗原結合部位があり、例えば、4または5または6または8または10の抗原結合部位があり、抗原結合性構築物は、少なくとも3または4または5または6または8または10の抗原に結合することが可能である、例えば、それは、3または4または5または6または8または10の抗原に同時に結合することが可能である。

【0188】

本発明はまた、医療における使用のための、例えば、癌または喘息、関節リウマチもしくは変形性関節炎などの炎症性疾患の治療のための医薬の製造における使用のための抗原結合性構築物を提供する。

【0189】

本発明は、治療的な量の本発明の抗原結合性構築物を投与するステップを含む、癌または喘息、関節リウマチもしくは変形性関節炎などの炎症性疾患に罹患した患者の治療方法を提供する。

【0190】

本発明の抗原結合性構築物は、癌または喘息、関節リウマチもしくは変形性関節炎などの炎症性疾患の治療のために使用されてもよい。

【0191】

本発明の抗原結合性構築物は、いくつかのエフェクター機能を有していてもよい。例えば、タンパク質足場が、エフェクター機能を有する抗体に由来するFc領域を含有する場合、例えば、タンパク質足場が、IgG1に由来するCH2およびCH3を含む場合。エフェクター機能のレベルは、公知の技術に従って、例えばCH2ドメインの突然変異によって変えることができ、例えば、IgG1 CH2ドメインは、抗体が、増強されたエフェクター機能を有するように、239および332および330から選択された位置に1以上の突然変異を有し、例えば、突然変異は、S239DおよびI332EおよびA330Lから選択されるならびに/またはFc領域のフコシル化が低下するように、例えば、本発明の抗原結合性構築物のグリコシル化プロファイルを変化させることによって変えることができる。

【0192】

本発明において有益なタンパク質足場は、抗体のドメインをすべて含む完全モノクローナル抗体足場を含むまたは本発明のタンパク質足場は、一価抗体などの、一般的ではない抗体構造を含んでいてもよい。そのような一価抗体は、対になった重鎖および軽鎖を含んでいてもよく、重鎖のヒンジ領域は、重鎖が、WO2007059782において記載される一価抗体などのようにホモ二量体化しないように、修飾される。他の一価抗体は、機能的な可変領域およびCH1領域を欠く第2の重鎖と二量体化する、対になった重鎖および軽鎖を含んでいてもよく、第1および第2の重鎖は、それらが、ホモ二量体ではなくヘテロ二量体を形成するように修飾され、WO2006015371において記載される一価抗体などの、2つの重鎖および1つの軽鎖を有する一価抗体がもたらされる。そのような一価抗体は、例えば、実施例32において記載される抗原結合性構築物などの、エピトープ結合性ドメインが連結することができる、本発明のタンパク質足場を提供することができる。

【0193】

本発明において有益なエピトープ結合性ドメインは、異なるV領域またはドメインから独立して抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインであり、これは、ドメイン抗体であってもよく、またはCTLA-4(Evibody);リポカリン;プロテインA由来分子、例えばプロテインAのZドメイン(Affibody、SpA)、Aドメイン(Avimer/Maxibody);熱ショックタンパク質、例えばGroEIおよびGroES、トランスフェリン(trans-body);アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(Tetranectin);ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン(affilins);PDZドメイン;ヒトプロテアーゼインヒビターのスコーピオントキシンクニッツ(scorpion toxinkunitz)型ドメイン;ならびにフィブロネクチン(アドネクチン)からなる群から選択された足場の誘導体であるドメインであってもよく、これは、天然リガンド以外のリガンドとの結合を実現するために、タンパク質工学に供されたものである。一実施形態において、これは、ドメイン抗体またはCTLA-4、リポカリン、SpA、Affibody、avimer、GroEl、トランスフェリン、GroES、およびフィブロネクチンからなる群から選択されたドメインなどの他の適したドメインであってもよい。一実施形態において、これは、dAb、Affibody、アンキリンリピートタンパク質(DARPin)、およびアドネクチンから選択されてもよい。他の実施形態において、これは、Affibody、アンキリンリピートタンパク質(DARPin)、およびアドネクチンから選択されてもよい。他の実施形態において、これは、ドメイン抗体、例えば、ヒト、ラクダ、またはサメ(NARV)ドメイン抗体から選択されたドメイン抗体であってもよい。

【0194】

エピトープ結合性ドメインは、1以上の位置でタンパク質足場に連結することができる。これらの位置は、タンパク質足場のC末端およびN末端、例えば、IgGの重鎖のC末端および/または軽鎖のC末端、例えば、IgGの重鎖のN末端および/または軽鎖のN末端を含む。

【0195】

一実施形態において、第1のエピトープ結合性ドメインは、タンパク質足場に連結され、第2のエピトープ結合性ドメインは、第1のエピトープ結合性ドメインに連結され、例えば、タンパク質足場は、IgG足場であり、第1のエピトープ結合性ドメインは、IgG足場の重鎖のC末端に連結されてもよく、そのエピトープ結合性ドメインは、第2のエピトープ結合性ドメインにそのC末端で連結することができ、または例えば、第1のエピトープ結合性ドメインは、IgG足場の軽鎖のC末端に連結されてもよく、第1のエピトープ結合性ドメインは、第2のエピトープ結合性ドメインにそのC末端でさらに連結されてもよく、または例えば、第1のエピトープ結合性ドメインは、IgG足場の軽鎖のN末端に連結されてもよく、第1のエピトープ結合性ドメインは、第2のエピトープ結合性ドメインにそのN末端でさらに連結されてもよく、または例えば、第1のエピトープ結合性ドメインは、IgG足場の重鎖のN末端に連結されてもよく、第1のエピトープ結合性ドメインは、第2のエピトープ結合性ドメインにそのN末端でさらに連結されてもよい。そのような抗原結合性構築物の例は、実施例31において記載される。

【0196】

エピトープ結合性ドメインが、ドメイン抗体である場合、いくつかのドメイン抗体は、足場内の特有の位置に適合していてもよい。

【0197】

本発明において有益なドメイン抗体は、従来のIgGの重鎖および/または軽鎖のC末端で連結することができる。加えて、いくつかのdAbは、従来の抗体の重鎖および軽鎖の両方のC末端で連結することができる。

【0198】

dAbのN末端が、抗体定常ドメイン(C_H3またはCLのいずれか)に融合される構築物において、ペプチドリンカーは、dAbが抗原に結合するのを支援してもよい。実際に、dAbのN末端は、抗原結合性活性に関与する相補性決定領域(CDR)の近くに配置される。したがって、短いペプチドリンカーは、エピトープ結合性ドメインおよびタンパク質足場の定常ドメインの間のスペーサーとして働き、これは、dAb CDRが抗原に、より容易に達することを可能にしてもよく、したがって、これは、高い親和性で結合してもよい。

【0199】

dAbがIgGに連結される環境は、それらがどの抗体鎖に融合されるかに依存して異なるであろう。IgG足場の抗体軽鎖のC末端に融合される場合、各dAbは、抗体ヒンジおよびFc部分の近くに配置されることが予想される。そのようなdAbは、互いに遠く離れて配置されるであろう。従来の抗体において、Fab断片の間の角度ならびに各Fab断片およびFc部分の間の角度は、かなり著しく変動し得る。mAbdAbでは、Fab断片の間の角度は、はなはだしく異ならないであろうが、いくらかの角度の制限は、各Fab断片およびFc部分の間の角度で観察されるかもしれない。IgG足場の抗体重鎖のC末端に融合される場合、各dAbは、Fc部分のC_H3ドメインの近くに配置されることが予想される。これらの受容体が、C_H2ドメイン(FcγRI、II、およびIIIクラスの受容体について)またはC_H2ドメインおよびCH3ドメインの間のヒンジ(例えばFcRn受容体)と結合するので、これは、Fc受容体(例えばFcγRI、II、III、FcRn)に対するFc結合特性に影響を与えるとは予想されない。そのような抗原結合性構築物の他の特徴としては、両方のdAbが、互いに空間的に近くにあることが予想され、適切なリンカーの提供によって柔軟性が提供されるとすれば、これらのdAbは、さらに、ホモ二量体種を形成するかもしれず、したがって、Fc部分の「ジップ型(zipped)」四次構造を増やし、これは、構築物の安定性を増強するかもしれない。

【0200】

そのような構造についての考察は、タンパク質足場、例えば抗体上に、エピトープ結合性ドメイン、例えばdAbを連結するための、最も適した位置の選択を助けることができる。

【0201】

抗原のサイズ、その局在性(血液中または細胞表面上)、その四次構造(単量体または多量体)は、変わり得る。従来の抗体は、ヒンジ領域の存在により、アダプター構築物として機能するように当然設計され、Fab断片の先端の2つの抗原結合性部位の配向は、はなはだしく変わり得る、したがって、抗原の分子の特徴およびその環境に適合することができる。対照的に、抗体または他のタンパク質足場、例えば、ヒンジ領域のない抗体を含むタンパク質足場に連結されたdAbは、直接的にもまたは間接的にも、構造的な柔軟性をそれほど有していないかもしれない。

【0202】

溶液状態およびdAbに結合するモードの理解もまた、役立つ。インビトロdAbが、溶液中で、単量体形態、ホモ二量体形態、または多量体形態で主に存在することができるという証拠が集まっている(Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698;Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553、Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903;Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165;Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614;Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365)。これは、ベンス-ジョーンズタンパク質(これらは、免疫グロブリン軽鎖の二量体である(Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952;Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857;Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301)およびアミロイド線維(James et al. (2007) J Mol Biol. 367:603-8)などのIgドメインでインビボにおいて観察される多量体化イベントを十分に思い出させる。

【0203】

例えば、溶液中で二量体化する傾向があるドメイン抗体を、軽鎖のC末端より優先してFc部分のC末端に連結することは、FcのC末端への連結が、それらのdAbが二量体化することを可能にするので、本発明の抗原結合性構築物との関連で望ましいかもしれない。

【0204】

本発明の抗原結合性構築物は、単一の抗原に特異的な抗原結合性部位を含んでいてもよく、または2以上の抗原もしくは単一の抗原上の2以上のエピトープに特異的な抗原結合性部位を有していてもよく、またはそれぞれの抗原結合性部位が、同じもしくは異なる抗原上の異なるエピトープに特異的である抗原結合性部位があってもよい。

【0205】

抗原結合性部位は、それぞれ、サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、酵素(例えばプロテアーゼ)、酵素に対する補助因子、DNA結合タンパク質、脂質、および炭水化物を含む、ヒトまたは動物タンパク質などの抗原に対する結合特異性を有することができる。サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、および他のタンパク質を含む、適した標的は、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、イオタキシン、イオタキシン-2、Exodus-2、FAPα、酸性FGF、塩基性FGF、線維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-1受容体1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72アミノ酸)、IL-8(77アミノ酸)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2(KGF-2)、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、c-fms、v-fmsMDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄系前駆細胞阻害因子-1(MPIF-1)、NAP-2、ニュールツリン、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清アルブミン、vWF、アミロイドタンパク質(例えばアミロイドα)、MMP12、PDK1、IgE、および本明細書において開示される他の標的を含むが、これらに限定されない。このリストが決して網羅的なものではないことは十分に理解されるであろう。

【0206】

いくつかの実施形態において、プロテアーゼ抵抗性ペプチドまたはポリペプチドは、TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23 IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、キマーゼ、FGF、フューリン、エンドセリン-1、イオタキシン(例えばイオタキシン、イオタキシン-2、イオタキシン-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、シグレック8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET、CD8、vWF、アミロイドタンパク質(例えばアミロイドアルファ)、MMP12、PDK1、およびIgEからなる群から選択された標的などの、肺組織中の標的に結合する。

【0207】

特に、本発明の抗原結合性構築物は、IL-13、IL-5、およびIL-4と関連する疾患、例えばアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、クローン病、COPD、特発性肺線維症などの線維性疾患または障害、進行性全身性硬化症、肝線維症、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、ホジキン病などの細胞周期調節の疾患、B細胞慢性リンパ球白血病を治療するのに有用である場合があり、例えば、構築物は、喘息を治療するのに有用である場合がある。

【0208】

本発明の抗原結合性構築物は、IGF-1R、VEGF、およびEGFRなどの成長因子と関連する疾患、例えば癌または関節リウマチを治療するのに有用である場合があり、そのような療法が有用である場合がある癌のタイプの例は、乳癌、前立腺癌、肺癌、および骨髄腫である。

【0209】

本発明の抗原結合性構築物は、TNFと関連する疾患、例えば関節炎、例えば関節リウマチまたは変形性関節炎を治療するのに有用である場合がある。

【0210】

本発明の抗原結合性構築物は、IL1-Rと関連する疾患、例えば関節炎、例えば関節リウマチまたは変形性関節炎を治療するのに有用である場合がある。

【0211】

本発明の抗原結合性構築物は、CD-20と関連する疾患、例えば、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、神経変性疾患、例えば多発性硬化症、好中球駆動疾患(neutrophil driven disease)、例えばCOPD、ウェゲナー血管炎(Wegeners vasculitis)、嚢胞性線維症、シェーグレン症候群、慢性移植拒絶反応、1型糖尿病、移植片対宿主病、喘息、アレルギー性疾患アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などの自己免疫疾患、甲状腺炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、多発性軟骨炎、もしくは強皮症を含む他の自己免疫疾患、または癌、例えば、CLLもしくはSLLなどのB細胞リンパ腫もしくは成熟B細胞新生物を治療するのに有用である場合がある。

【0212】

本発明の抗原結合性構築物は、IL-17およびIL-23と関連する疾患、例えば乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、神経変性疾患、例えば多発性硬化症、好中球駆動疾患、例えばCOPD、ウェゲナー血管炎、嚢胞性線維症、シェーグレン症候群、慢性移植拒絶反応、1型糖尿病、移植片対宿主病、喘息、アレルギー性疾患、アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などの自己免疫疾患、甲状腺炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎、多発性軟骨炎、または強皮症を含む他の自己免疫疾患を治療するのに有用である場合がある。

【0213】

本発明の抗原結合性構築物は、本発明の抗原結合性構築物に対するコード配列を含む発現ベクターを用いる、宿主細胞のトランスフェクションによって生産されてもよい。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞における複製および発現ならびに宿主細胞からの分泌を制御することが可能である従来の調節制御配列と機能的に連結して、抗原結合性構築物に対するこれらのコード配列を配置することによって生産される。調節配列は、プロモーター配列、例えばCMVプロモーターおよび他の知られている抗体に由来することができるシグナル配列を含む。同様に、相補的な抗原結合性構築物軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を有する第2の発現ベクターを作製することができる。ある実施形態において、この第2の発現ベクターは、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることを可能な限り確実にするために、コード配列および選択マーカーに関する限りを除き、第1のものと同一である。

【0214】

あるいはまた、抗原結合性構築物に対する重鎖コード配列および軽鎖コード配列は、単一のベクター上に、例えば同じベクター中の2つの発現カセット中に存在してもよい。

【0215】

選択された宿主細胞は、組換えまたは合成の軽鎖および重鎖の両方を含む、本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作製するために、第1および第2のベクターを用いて従来の技術によって同時にトランスフェクトされる(または単一のベクターによって単純にトランスフェクトされる)。次いで、トランスフェクトされた細胞は、本発明の操作された抗原結合性構築物を生産するために、従来の技術によって培養される。結合した組換え重鎖および/または軽鎖の両方を含む抗原結合性構築物は、ELISAまたはRIAなどの適切なアッセイによって培養物からスクリーニングされる。同様の従来の技術を、他の抗原結合性構築物を構築するために利用することができる。

【0216】

本発明の組成物の方法および構築において利用されるクローニングステップおよびサブクローニングステップに適したベクターは、当業者によって選択することができる。例えば、クローニングベクターの従来のpUCシリーズを、使用してもよい。1つのベクター、pUC19は、Amersham(Buckinghamshire、United Kingdom)またはPharmacia(Uppsala、Sweden)などの供給会社から市販で入手可能である。

【0217】

さらに、直ちに複製することが可能であり、豊富なクローニング部位および選択可能遺伝子(例えば抗生物質抵抗性)を有し、容易に操作される任意のベクターを、クローニングに使用されてもよい。したがって、クローニングベクターの選択は、本発明における限定要素ではない。

【0218】

発現ベクターはまた、異種DNA配列の発現を増幅するのに適した遺伝子、例えば哺乳動物ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)によって特徴付けられてもよい。他の好ましいベクター配列は、ウシ成長ホルモン(BGH)からなどのポリAシグナル配列およびベータグロビンプロモーター配列(betaglopro)を含む。本明細書において有用な発現ベクターは、当業者らによく知られている技術によって合成されてもよい。

【0219】

そのようなベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などは、商業的もしくは天然供給源から得ることができ、または選択された宿主において組換えDNAの産物の発現および/もしくは分泌の指示において使用される公知の手順によって合成されてもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、および菌類の発現について当技術分野において多数のタイプが知られている他の適切な発現ベクターもまた、この目的のために選択されてもよい。

【0220】

本発明はまた、本発明の抗原結合性構築物のコード配列を含有する組換えプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞株を包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞はまた、従来のものとする。しかしながら、大腸菌(E. coli)の様々な株に由来する細胞は、クローニングベクターの複製および本発明の抗原結合性構築物の構築の他のステップに使用されてもよい。

【0221】

本発明の抗原結合性構築物の発現に適した宿主細胞または細胞株は、NS0、Sp2/0、CHO(例えばDG44)、COS、HEK、線維芽細胞(例えば3T3)、および骨髄腫細胞などの哺乳動物細胞を含み、例えば、それは、CHOまたは骨髄腫細胞中で発現されてもよい。ヒト細胞を使用して、したがって、分子がヒトグリコシル化パターンで修飾されることを可能にしてもよい。あるいはまた、他の真核細胞株が利用されてもよい。形質転換、培養、増幅、スクリーニング、および生成物製造ならびに精製に適した哺乳動物宿主細胞の選択ならびに方法は、当技術分野において知られている。例えば、上記に引用したSambrook et al.を参照されたい。

【0222】

細菌細胞は、本発明の組換えFabまたは他の実施形態の発現に適した宿主細胞として有用であることが分かるかもしれない(例えばPluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)を参照されたい)。しかしながら、発現されたタンパク質が、細菌細胞中で、折り畳まれていないもしくは不適当に折り畳まれた形態または非グリコシル化形態をしている傾向により、細菌細胞中で生産されたあらゆる組換えFabは、抗原結合能力の保持についてスクリーニングされなければならないであろう。細菌細胞によって発現された分子が、適切に折り畳まれた形態で生産された場合、細菌細胞は、望ましい宿主となるであろう。または代替の実施形態において、分子は、細菌宿主において発現され、次いで、引き続いて再び折り畳まれてもよい。例えば、発現に使用される大腸菌の様々な株は、バイオテクノロジーの分野の宿主細胞としてよく知られている。枯草菌(B. subtilis)、ストレプトミセス属、他の桿菌などの様々な株もまた、本方法において利用されてもよい。

【0223】

所望される場合、昆虫細胞、例えばショウジョウバエおよび鱗翅類ならびにウイルス発現系と同様に、当業者らに知られている酵母細胞の株は、宿主細胞として入手可能である。例えばMiller et al.、Genetic Engineering、8:277-298, Plenum Press (1986)およびそこに引用される参考文献を参照されたい。

【0224】

ベクターを構築することができる一般的な方法、本発明の宿主細胞を生産するために必要とされるトランスフェクション方法、およびそのような宿主細胞から本発明の抗原結合性構築物を生産するのに必要な培養方法はすべて、従来の技術であってもよい。典型的には、本発明の培養方法は、通常、懸濁液中での無血清の細胞の培養による、無血清培養方法である。同様に、一度生産されたら、本発明の抗原結合性構築物は、硫酸アンモニウム沈殿法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野の標準的な手順に従って細胞培養内容物から精製されてもよい。そのような技術は、当技術分野の技術の範囲内にあり、本発明を限定しない。例えば、改変された抗体の調製は、WO 99/58679およびWO 96/16990において記載されている。

【0225】

しかし、抗原結合性構築物の発現の他の方法は、米国特許第4,873,316号において記載されるように、遺伝子導入動物における発現を利用してもよい。これは、哺乳動物に遺伝子導入で組み込まれた場合、雌が、その乳中に、所望の組換えタンパク質を生産することを可能にする、動物のカゼインプロモーターを使用する発現系に関する。

【0226】

本発明のさらなる態様において、本発明の抗体を生産するための方法であって、本発明の抗体の軽鎖および/または重鎖をコードするベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を培養するステップならびにそれによって生産された抗体を回収するステップを含む方法が提供される。

【0227】

本発明に従って、本発明の抗原結合性構築物を生産するための方法であって、
(a)抗原結合性構築物の重鎖をコードする第1のベクターを提供するステップ、
(b)抗原結合性構築物の軽鎖をコードする第2のベクターを提供するステップ、
(c)上述の第1および第2のベクターを用いて哺乳動物宿主細胞(例えばCHO)を形質転換するステップ、
(d)上述の培養培地への上述の宿主細胞からの抗原結合性構築物の分泌を促す条件下でステップ(c)の宿主細胞を培養するステップ、
(e)ステップ(d)の、分泌された抗原結合性構築物を回収するステップ
を含む方法が提供される。

【0228】

一度、所望の方法によって発現されたら、次いで、抗原結合性構築物は、適切なアッセイの使用によってインビトロ活性について検査される。現在、従来のELISAアッセイ形態は、その標的への抗原結合性構築物の質的および量的結合を評価するために利用される。さらに、他のインビトロアッセイもまた、通常のクリアランスメカニズムにもかかわらず身体における抗原結合性構築物の持続性を評価するために実行される続くヒト臨床研究に先立って中和効力を実証するために使用されてもよい。

【0229】

治療の用量および持続時間は、ヒト循環における本発明の分子の相対的な持続時間に関し、治療されている状態および患者の一般的な健康状態に依存して、当業者によって調節することができる。長期にわたる期間(例えば4〜6ヵ月)の繰り返しの投薬(例えば1週間に1回または2週間毎に1回)は、最大の治療上の効能を達成するために必要とされてもよいことが想定される。

【0230】

本発明の治療薬の投与のモードは、宿主にその作用物質を送達する任意の適した経路であってもよい。本発明の抗原結合性構築物および医薬組成物は、非経口投与、つまり、皮下(s.c.)、髄腔内、腹腔内、筋肉内(i.m.)、静脈内(i.v.)、または鼻腔内投与に特に有用である。

【0231】

本発明の治療薬は、製薬上許容される担体中に、有効成分として、有効量の本発明の抗原結合性構築物を含有する医薬組成物として調製されていてもよい。本発明の予防薬において、注射の準備ができている形態をした、好ましくは生理的pHに緩衝された、抗原結合性構築物を含有する水溶性懸濁液または溶液は、好ましい。非経口投与のための組成物は、一般に、本発明の抗原結合性構築物の溶液または製薬上許容される担体、好ましくは水溶性担体中で溶解されたその混合物を含むであろう。多種多様の水溶性担体、例えば0.9％食塩水、0.3％グリシンなどが、利用されてもよい。これらの溶液は、滅菌されてもよく、一般に、粒子状物質がなくてもよい。これらの溶液は従来のよく知られている滅菌技術(例えば濾過)によって滅菌されてもよい。組成物は、pH調節剤および緩衝剤などの、生理的条件に近づくために必要とされるような、製薬上許容される補助物質を含有していてもよい。そのような医薬製剤中の本発明の抗原結合性構築物の濃度は、広く、つまり、約0.5重量％未満、通常、約1重量％または少なくとも約1重量％〜15または20重量％までも変動し得る、また選択された投与の特定のモードに従って、主として、体液の容量および粘性などに基づいて選択されるであろう。

【0232】

例えば、筋肉内注射のための本発明の医薬組成物は、1ml滅菌緩衝水および約1ng〜約100mgの間の、例えば約50ng〜約30mgまたはより好ましくは約5mg〜約25mgの本発明の抗原結合性構築物を含有するように調製することができる。同様に、静脈内注入のための本発明の医薬組成物は、約250mlの滅菌リンガー溶液およびリンガー溶液1ml当たり約1〜約30、好ましくは5mg〜約25mgの本発明の抗原結合性構築物を含有するように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者らによく知られておりまたは明白であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにおいてより詳細に記載される。本発明の静脈内注射可能な抗原結合性構築物製剤の調製については、Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3^rd April 2000)、Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188,Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992),Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300,Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039,Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922を参照されたい。

【0233】

Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)、この全内容は、参照によって本明細書に組み込まれ、読者は、この全内容を特に参照する。

【0234】

本発明の治療薬は、医薬調製物中である場合、単位用量形態で存在することが好ましい。適切な治療的に有効な用量は、当業者らによって直ちに決定されるであろう。適した用量は、患者の体重に従って患者のために計算することができ、例えば、適した用量は、0.01〜20mg/kg、例えば0.1〜20mg/kg、例えば1〜20mg/kg、例えば10〜20mg/kg、例えば1〜15mg/kg、例えば10〜15mg/kgの範囲であってもよい。ヒトにおける、本発明において有益な状態を有効に治療するために、適した用量は、0.01〜1000mg、例えば0.1〜1000mg、例えば0.1〜500mg、例えば500mg、例えば0.1〜100mgまたは0.1〜80mgまたは0.1〜60mgまたは0.1〜40mgまたは例えば1〜100mgまたは1〜50mgの本発明の抗原結合性構築物の範囲内にあってもよく、これは、非経口的に、例えば皮下に、静脈内に、または筋肉内に投与されてもよい。そのような用量は、必要である場合、医師によって適切なように選択された適切な時間間隔で繰り返されてもよい。

【0235】

本明細書において記載される抗原結合性構築物は、保管のために凍結乾燥し、使用に先立って適した担体中で再調製することができる。本技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示され、当技術分野で知られている凍結乾燥および再調製技術を利用することができる。

【0236】

本発明において有益な、エピトープ結合性ドメインを見つけるために使用することができる、当技術分野において公知のいくつかの方法がある。

【0237】

用語「ライブラリー」は、異種性のポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリーは、メンバーから構成され、これらのそれぞれは、単一のポリペプチド配列または核酸配列を有する。この点で、「ライブラリー」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリーメンバーの間の配列差異は、ライブラリーにおいて存在する多様性を担う。ライブラリーは、ポリペプチドもしくは核酸の単純な混合物の形態を取っていてもよく、または生物もしくは細胞の形態、例えば、核酸のライブラリーを用いて形質転換された細菌、ウイルス、動物、または植物の細胞などの形態をしていてもよい。一例において、各個々の生物または細胞は、1つだけまたは限られた数のライブラリーメンバーを含有する。有利には、核酸は、核酸によってコードされたポリペプチドの発現を可能にするために発現ベクターに組み込まれる。一態様において、したがって、ライブラリーは、宿主生物の集団の形態を取っていてもよく、各生物は、その対応するポリペプチドメンバーを生産するために発現することができる、核酸の形態のライブラリーの単一のメンバーを含有する発現ベクターの1以上のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団は、多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードするための可能性を有する。

【0238】

「ユニバーサルフレームワーク」は、Kabatによって定義されるように、配列において保存される抗体の領域に対応する("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)またはChothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917によって定義されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリンのレパートリーまたは構造に対応する単一の抗体フレームワーク配列である。単一のフレームワークまたは1組のそのようなフレームワークがあってもよく、これは、超可変領域のみにおける変異を通して、実質的にあらゆる結合特異性の誘導を可能にすることが分かった。

【0239】

本明細書において定義されるような、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列のアライメントおよび相同性、類似性、または同一性については、一実施形態において、デフォルトパラメータを使用して、アルゴリズムBLAST 2 Sequencesを使用して処理され、決定される(Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999))。

【0240】

(1つまたは複数の)エピトープ結合性ドメインおよび抗原結合部位は、それぞれ、サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、酵素(例えばプロテアーゼ)、酵素に対する補因子、DNA結合タンパク質、脂質、および炭水化物を含む、ヒトまたは動物タンパク質などのジェネリックリガンドまたは任意の所望の標的リガンドに対する結合特異性を有することができる。サイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、および他のタンパク質を含む、適した標的は、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、イオタキシン、イオタキシン-2、Exodus-2、FAPα、酸性FGF、塩基性FGF、線維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-1受容体1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72アミノ酸)、IL-8(77アミノ酸)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2(KGF-2)、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、c-fms、v-fmsMDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67アミノ酸)、MDC(69アミノ酸)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄系前駆細胞阻害因子-1(MPIF-1)、NAP-2、ニュールツリン、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清アルブミン、vWF、アミロイドタンパク質(例えばアミロイドα)、MMP12、PDK1、IgE、および本明細書において開示される他の標的を含むが、これらに限定されない。このリストが決して網羅的はものではないことは十分に理解されるであろう。

【0241】

一部の実施形態において、結合は、TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23 IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、キマーゼ、FGF、フューリン、エンドセリン-1、イオタキシン(例えばイオタキシン、イオタキシン-2、イオタキシン-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、シグレック8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET、CD8、vWF、アミロイドタンパク質(例えばアミロイドα)、MMP12、PDK1、およびIgEからなる群から選択された標的などの、肺組織中の標的に対するものである。

【0242】

ディスプレイ系(例えば、核酸のコード機能および核酸によってコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能的な特徴を関連づけるディスプレイ系)は、本明細書において記載される方法において、例えば、dAbまたは他のエピトープ結合性ドメインの選択において使用され、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅または増加させることは有利であることが多い。これは、本明細書において記載される方法もしくは他の適した方法を使用する選択のさらなるラウンドのための十分な量の核酸および/またはペプチドもしくはポリペプチドを得るためのまたはさらなるレパートリー(例えば親和性成熟レパートリー)を調製するための効率的な方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態において、エピトープ結合性ドメインを選択するための方法は、ディスプレイ系を使用するステップを含み(例えば、ファージディスプレイなどのように、核酸のコード機能および核酸によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的な特徴を関連づける)、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅または増加させるステップをさらに含む。核酸は、ファージ増幅、細胞増殖、またはポリメラーゼ連鎖反応によってなどのように、任意の適した方法を使用して増幅することができる。

【0243】

一例において、方法は、核酸のコード機能ならびに核酸によってコードされるポリペプチドの物理的、化学的、および/または機能的な特徴を関連づけるディスプレイ系を利用する。そのようなディスプレイ系は、バクテリオファージまたは細胞(細菌)などの、複数の複製可能な遺伝子パッケージを含むことができる。

【0244】

ディスプレイ系は、バクテリオファージディスプレイライブラリーなどのライブラリーを含んでいてもよい。バクテリオファージディスプレイは、ディスプレイ系の例である。

【0245】

多くの適したバクテリオファージディスプレイ系(例えば一価ディスプレイ系および多価ディスプレイ系)が記載されている。(例えばGriffiths et al., 米国特許第6,555,313 B1号(参照によって本明細書において組み込まれる);Johnson et al., 米国特許第5,733,743号(参照によって本明細書において組み込まれる);McCafferty et al., 米国特許第5,969,108号(参照によって本明細書において組み込まれる);Mulligan-Kehoe, 米国特許第5,702,892号(参照によって本明細書において組み込まれる);Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994);Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994);Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)を参照されたい)。バクテリオファージディスプレイ系において提示されるペプチドまたはポリペプチドは、例えば線維状ファージ(例えばfd、M13、F1)、溶菌性ファージ(例えばT4、T7、ラムダ)、またはRNAファージ(例えばMS2)などの、任意の適したバクテリオファージ上に提示することができる。

【0246】

一般に、適したファージコートタンパク質(例えばfd pIIIタンパク質)との融合タンパク質として、ペプチドまたはファージポリペプチドのレパートリーを提示するファージのライブラリーが、生産されまたは提供される。融合タンパク質は、ファージコートタンパク質の先端にまたは所望される場合、内部の位置にペプチドまたはポリペプチドを提示することができる。例えば、提示されるペプチドまたはポリペプチドは、pIIIのドメイン1に対してアミノ末端である位置に存在することができる(pIIIのドメイン1はまたN1とも呼ばれる)。提示されるポリペプチドは、pIII(例えばpIIIのドメイン1のN末端)に直接的に融合することができ、またはリンカーを使用してpIIIに融合することができる。所望される場合、融合体は、タグ(例えばmycエピトープ、Hisタグ)をさらに含むことができる。ファージコートタンパク質との融合タンパク質として提示されるペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリーは、提示されるペプチドまたはポリペプチドをコードするファージベクターまたはファージミドベクターのライブラリーを適した宿主細菌に導入し、ファージを生産するように、結果として生じる細菌を培養することによってなどのように(例えば、所望される場合、適したヘルパーファージまたは補完プラスミドを使用して)、任意の適した方法を使用して生産することができる。ファージのライブラリーは、沈殿および遠心分離などの任意の適した方法を使用して培養物から回収することができる。

【0247】

ディスプレイ系は、任意の所望の量の多様性を含有する、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むことができる。例えば、レパートリーは、生物、生物の集団、所望の組織、もしくは所望の細胞型によって発現された天然に存在するポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドもしくはポリペプチドを含有することができ、または無作為なもしくは無作為化されたアミノ酸配列を有するペプチドもしくはポリペプチドを含有することができる。所望される場合、ポリペプチドは、共通のコアまたは足場を共有することができる。例えば、レパートリーまたはライブラリーにおけるポリペプチドはすべて、プロテインA、プロテインL、プロテインG、フィブロネクチンドメイン、anticalin、CTLA4、所望の酵素(例えばポリメラーゼ、セルラーゼ)、または抗体もしくは抗体の断片(例えば抗体可変ドメイン)などの、免疫グロブリンスーパーファミリーからのポリペプチドから選択された足場に基づくものとすることができる。そのようなレパートリーまたはライブラリーにおけるポリペプチドは、無作為なまた無作為化されたアミノ酸配列の明確な領域および共通のアミノ酸配列の領域を含むことができる。ある実施形態において、レパートリーにおけるすべてのまたは実質的にすべてのポリペプチドは、所望の酵素(例えばポリメラーゼ)または抗体の所望の抗原結合性断片(例えばヒトV_HもしくはヒトV_L)などの所望のタイプのものである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドディスプレイ系は、各ポリペプチドが抗体可変ドメインを含む、ポリペプチドのレパートリーを含む。例えば、レパートリーにおける各ポリペプチドは、V_H、V_L、またはFv(例えば単鎖Fv)を含有することができる。

【0248】

アミノ酸配列多様性は、任意の適した方法を使用して、ペプチドもしくはポリペプチドの任意の所望の領域または足場に導入することができる。例えば、アミノ酸配列多様性は、任意の適した突然変異誘発方法(例えば低フィデリティーPCR、オリゴヌクレオチド媒介性もしくは部位特異的突然変異誘発、NNKコドンを使用する多様化)または任意の他の適した方法を使用して、多様化されたポリペプチドをコードする核酸のライブラリーを調製することによって、抗体可変ドメインの相補性決定領域または疎水性ドメインなどの標的領域に導入することができる。所望される場合、多様化されることとなるポリペプチドの領域は、無作為化することができる。レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは、大抵は選択することができ、一定のポリペプチドサイズは、必要とされない。レパートリーにおけるポリペプチドは、三次構造を少なくとも有していてもよい(少なくとも1つのドメインを形成していてもよい)。

【0249】

選択/単離/回収
エピトープ結合性ドメインまたはドメインの集団は、任意の適した方法を使用して、レパートリーまたはライブラリー(例えばディスプレイ系における)から選択、回収および/または単離することができる。例えば、ドメインは、選択可能な特徴(例えば物理的特徴、化学的特徴、機能的特徴)に基づいて選択または単離される。適した選択可能な機能的特徴は、レパートリーにおけるペプチドまたはポリペプチドの生物活性、例えばジェネリックリガンド(例えばスーパー抗原)への結合、標的リガンド(例えば抗原、エピトープ、基質)への結合、抗体への結合(例えばペプチドまたはポリペプチド上に発現されるエピトープを通しての)、および触媒活性を含む(例えばTomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655を参照されたい)。

【0250】

いくつかの実施形態において、プロテアーゼ抵抗性ペプチドまたはポリペプチドは、実質的にすべてのドメインが共通の選択可能な特徴を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーから選択および/または単離される。例えば、ドメインは、実質的にすべてのドメインが、共通のジェネリックリガンドに結合する、共通の標的リガンドに結合する、共通の抗体に結合する(もしくは共通の抗体が結合する)、または共通の触媒活性を持つライブラリーまたはレパートリーから選択することができる。このタイプの選択は、例えば、免疫グロブリン単鎖可変ドメインの親和性成熟を実行する場合、所望の生物活性を有する親のペプチドまたはポリペプチドに基づくドメインのレパートリーを調製するのに特に有用である。

【0251】

共通のジェネリックリガンドへの結合に基づく選択により、元々のライブラリーまたはレパートリーの成分であったすべてのまたは実質的にすべてのドメインを含有するドメインの収集物または集団を得ることができる。例えば、プロテインA、プロテインL、または抗体などの、標的リガンドまたはジェネリックリガンドに結合するドメインは、パニングによってまたは適した親和性マトリックスを使用して選択、単離および/または回収することができる。パニングは、リガンド(例えばジェネリックリガンド、標的リガンド)の溶液を、適した容器(例えばチューブ、ペトリ皿)に追加し、リガンドが容器の壁上に沈着し、またはそれをコーティングするようになることを可能にすることによって達成することができる。過剰なリガンドは、洗い流すことができ、ドメインは、容器に追加することができ、容器は、ペプチドまたはポリペプチドが、固定化されたリガンドに結合するのに適した条件下で維持される。非結合ドメインは、洗い流すことができ、結合したドメインは、例えばスクラッピングまたはpHの低下などの任意の適した方法を使用して回収することができる。

【0252】

適したリガンド親和性マトリックスは、一般に、リガンドが、共有結合または非共有結合する固体支持体またはビーズ(例えばアガロース)を含有する。親和性マトリックスは、マトリックス上のリガンドにドメインが結合するのに適した条件下で、バッチプロセス、カラムプロセス、または任意の他の適したプロセスを使用して、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、プロテアーゼと共にインキュベートされたレパートリー)と結合することができる。親和性マトリックスに結合しないドメインは、洗い流すことができ、結合したドメインは、低pH緩衝剤を用いる、マイルドな変性剤(例えば尿素)を用いる、またはリガンドへの結合について競合するペプチドもしくはドメインを用いる溶出などの任意の適した方法を使用して、溶出し、回収することができる。一例において、ビオチン化標的リガンドは、レパートリーにおけるドメインが標的リガンドに結合するのに適した条件下でレパートリーと結合する。結合したドメインは、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジン(例えばビーズ上の)を使用して回収される。

【0253】

一部の実施形態において、ジェネリックリガンドまたは標的リガンドは、抗体またはその抗原結合性断片である。ライブラリーまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチドにおいて実質的に保存されるペプチドまたはポリペプチドの構造的な特徴に結合する抗体または抗原結合性断片は、ジェネリックリガンドとして特に有用である。

【0254】

プロテアーゼ抵抗性ペプチドまたはポリペプチドを単離、選択および/または回収するためのリガンドとしての使用に適した抗体および抗原結合性断片は、モノクローナルまたはポリクローナルとすることができ、任意の適した方法を使用して調製することができる。

【0255】

ライブラリー/レパートリー
プロテアーゼエピトープ結合性ドメインをコードおよび/または含有するライブラリーは、任意の適した方法を使用して調製し、または得ることができる。ライブラリーは、対象となるドメインまたは足場(例えばライブラリーから選択されたドメイン)に基づいて、ドメインをコードするように設計することができ、または本明細書において記載される方法を使用して、他のライブラリーから選択することができる。例えば、ドメインで豊富なライブラリーを、適したポリペプチドディスプレイ系を使用して調製することができる。

【0256】

所望のタイプのドメインのレパートリーをコードするライブラリーは、任意の適した方法を使用して、直ちに作製することができる。例えば、所望のタイプのポリペプチド(例えば免疫グロブリン可変ドメイン)をコードする核酸配列を得ることができ、それぞれ1以上の突然変異を含有する核酸の収集物は、例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(PCR)系を使用して、化学的突然変異誘発によって(Deng et al., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994))、または細菌突然変異誘発株を使用して(Low et al., J. Mol. Biol., 260:359 (1996))、核酸を増幅することによって調製することができる。

【0257】

他の実施形態において、核酸の特定の領域は、多様化のための標的とすることができる。選択された位置を突然変異させる方法はまた、当技術分野においてよく知られており、例えば、PCRを使用するまたは使用しない、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドの使用を含む。例えば、合成抗体ライブラリーは、抗原結合性ループに突然変異を向けることによって作製されている。無作為または準無作為抗体H3およびL3領域は、非突然変異フレームワーク領域と共に大きなライブラリーを生産するために、生殖系列免疫グロブリンV遺伝子セグメントに付加された(Hoogenboom and Winter (1992) 上掲; Nissim et al. (1994) 上掲; Griffiths et al. (1994) 上掲; DeKruif et al. (1995) 上掲)。そのような多様化は、他の抗原結合性ループのうちのいくつかまたはすべてを含むように拡張された(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, 上掲)。他の実施形態において、核酸の特定の領域は、例えば、「メガプライマー」としての第1のPCRの産物を利用する2段階PCR戦略によって、多様化のために標的とすることができる(例えばLandt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990)を参照されたい)。標的多様化はまた、例えばSOE PCRによって達成することができる(例えばHorton, R.M. et al., Gene 77:61-68 (1989)を参照されたい)。

【0258】

選択された位置での配列多様性は、多くの可能なアミノ酸(例えば20種すべてまたはそのサブセット)をその位置に組み込むことができるように、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を改変することによって達成することができる。IUPAC命名法を使用すると、最も用途の広いコドンは、NNKであり、これは、すべてのアミノ酸およびTAG終止コドンをコードする。NNKコドンは、必要とされる多様性を導入するために使用されてもよい。NNNコドンを含む、同じ目的を達成する他のコドンもまた有益であり、これは、さらなる終止コドンTGAおよびTAAの生成をもたらす。そのような標的アプローチは、標的エリアの完全配列空間を調査することを可能にすることができる。

【0259】

いくつかのライブラリーは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるドメインを含む(例えば抗体またはその一部分)。例えば、ライブラリーは、知られている主鎖高次構造を有するドメインを含むことができる(例えばTomlinson et al., WO 99/20749を参照されたい)。ライブラリーは、適したプラスミドまたはベクターにおいて調製することができる。本明細書において使用されるように、ベクターは、その発現および/または複製のために、異種DNAを細胞に導入するために使用される別々のエレメントを指す。プラスミド(例えば細菌プラスミド)、ウイルスベクターまたはバクテリオファージベクター、人工染色体、およびエピソームベクターを含む任意の適したベクターを使用することができる。そのようなベクターは、単純なクローニングおよび突然変異誘発に使用されてもよく、または発現ベクターは、ライブラリーの発現を駆動するために使用することができる。ベクターおよびプラスミドは、通常、1以上のクローニング部位(例えばポリリンカー)、複製開始点、および少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を含有する。発現ベクターは、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結シグナル、シグナル配列などの、ポリペプチドの転写および翻訳を駆動するためのエレメントをさらに含有することができる。これらのエレメントは、そのような発現ベクターが、発現に適した条件下で(例えば適した宿主細胞中で)維持される場合、ポリペプチドが、発現し、生産されるように、ポリペプチドをコードする、クローニングされた挿入物に機能的に連結されるように配置することができる。

【0260】

クローニングベクターおよび発現ベクターは、一般に、ベクターが、1以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含有する。典型的には、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが、宿主染色体DNAから独立して複製することを可能にし、複製開始点または自己複製配列を含むものである。そのような配列は、多種多様の細菌、酵母、およびウイルスでよく知られている。プラスミドpBR322からの複製開始点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、2ミクロン開始点は、酵母に適しており、様々なウイルス開始点(例えばSV40、アデノウイルス)は、哺乳動物細胞においてクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点は、哺乳動物発現ベクターが、COS細胞などの、高レベルでDNAを複製することができる哺乳動物細胞において使用されない限り、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。

【0261】

クローニングベクターまたは発現ベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有することができる。そのようなマーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する抵抗性を与える、栄養要求性の欠乏を補完する、または増殖培地中で入手可能ではない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

【0262】

適した発現ベクターは、多くの成分、例えば、複製開始点、選択マーカー遺伝子、転写制御エレメント(例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター)および/または1以上の翻訳シグナルなどの1以上の発現制御エレメント、シグナル配列またはリーダー配列などを含有することができる。発現制御エレメントおよびシグナル配列またはリーダー配列は、存在する場合、ベクターまたは他の供給源によって提供することができる。例えば、抗体鎖をコードする、クローニングされた核酸の転写および/または翻訳制御配列を、発現を指示するために使用することができる。

【0263】

プロモーターは、所望の宿主細胞中での発現のために提供することができる。プロモーターは、構成的なまたは誘発性のものとすることができる。例えば、プロモーターは、抗体、抗体鎖、またはその部分をコードする核酸に機能的に連結することができ、それは、核酸の転写を指示する。原核生物(例えば、大腸菌のためのβ-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、lac、tac、T3、T7プロモーター)ならびに真核生物(例えばシミアンウイルス40初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、EG-1aプロモーター)宿主のための多種多様の適したプロモーターは、入手可能である。

【0264】

加えて、発現ベクターは、典型的には、ベクターを運ぶ宿主細胞の選択のための選択マーカーおよび複製可能な発現ベクターの場合には複製開始点を含む。抗生物質または薬剤抵抗性を与える産物をコードする遺伝子は、共通の選択マーカーであり、原核細胞(例えばβ-ラクタマーゼ遺伝子(アンピシリン抵抗性)、テトラサイクリン抵抗性のためのTet遺伝子)および真核細胞(例えばネオマイシン(G418もしくはジェネテシン)、gpt(ミコフェノール酸)、アンピシリン、またはハイグロマイシン抵抗性遺伝子)において使用されてもよい。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、多種多様の宿主において、メトトレキサートを用いる選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子(例えばLEU2、URA3、HIS3)は、酵母において選択マーカーとして使用されることが多い。ウイルス(例えばバキュロウイルス)ベクターまたはファージベクターおよび宿主細胞のゲノムに統合することが可能であるレトロウイルスベクターなどのベクターの使用もまた企図される。

【0265】

原核細胞(例えば大腸菌などの細菌細胞)または哺乳動物細胞の発現に適した発現ベクターは、例えばpETベクター(例えばpET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40、Novagen、および他)、ファージベクター(例えばpCANTAB 5 E、Pharmacia)、pRIT2T(プロテインA融合ベクター、Pharmacia)、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-1(Invitrogen、Carlsbad、CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXT1(Stratagene、La Jolla、CA)、pCDEF3(Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996))、pSVSPORT(GibcoBRL、Rockville、MD)、pEF-Bos(Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990))などを含む。原核細胞(大腸菌)、昆虫細胞(ショウジョウバエシュナイダーS2細胞、Sf9)、酵母(P.メタノリカ(P.methanolica)、P.パトリス(P.pastoris)、S.セレビシエ(S.cerevisiae))、および哺乳動物細胞(例えばCOS細胞)などの様々な発現宿主における使用に適した発現ベクターは、入手可能である。

【0266】

ベクターのいくつかの例は、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、ジェネリックリガンドおよび/または標的リガンドを用いる選択は、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一のクローンの別個の増殖および発現によって実行することができる。上記に記載されるように、特定の選択ディスプレイ系は、バクテリオファージディスプレイである。したがって、ファージベクターまたはファージミドベクターは、使用されてもよく、例えば、ベクターは、大腸菌の複製開始点(二本鎖複製のため)およびさらにファージの複製開始点(一本鎖DNAの製造のため)を有するファージミドベクターであってもよい。そのようなベクターの操作および発現は、当技術分野においてよく知られている(Hoogenboom and Winter (1992) 上掲; Nissim et al. (1994) 上掲)。手短かに言えば、ベクターは、ファージミドに選択性を与えるためのβ-ラクタマーゼ遺伝子および適したリーダー配列を含有することができる発現カセットの上流のlacプロモーター、多数のクローニング部位、1以上のペプチドタグ、1以上のTAG終止コドン、ならびにファージタンパク質pIIIを含有することができる。したがって、大腸菌の様々な抑制株および非抑制株を使用し、グルコース、イソ-プロピルチオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)、またはVCS M13などのヘルパーファージを追加すると、ベクターは、発現せずにプラスミドとして複製することができ、大量のポリペプチドライブラリーメンバーのみまたは産物ファージを生産し、これらのいくつかは、それらの表面上にポリペプチド-pIII融合体の少なくとも1つのコピーを含有する。

【0267】

抗体可変ドメインは、標的リガンド結合部位および/またはジェネリックリガンド結合部位を含んでいてもよい。ある実施形態において、ジェネリックリガンド結合部位は、プロテインA、プロテインL、またはプロテインGなどのスーパー抗原に対する結合部位である。可変ドメインは、任意の所望の可変ドメイン、例えばヒトVH (例えばVH 1a、VH 1b、VH 2、VH 3、VH 4、VH 5、VH 6)、ヒトVλ(例えば、VλI、VλII、VλIII、VλIV、VλV、VλVI、もしくはVκ1)、またはヒトVκ(例えばVκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vκ7、Vκ8、Vκ9、もしくはVκ10)に基づくものとすることができる。

【0268】

さらなる種類の技術は、人工コンパートメントにおけるレパートリーの選択を含み、これは、その遺伝子産物との遺伝子の関連づけを可能にする。例えば、望ましい遺伝子産物をコードする核酸が、油中水型エマルションによって形成されたマイクロカプセル中で選択されてもよい選択系は、WO99/02671、WO00/40712、およびTawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6において記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは、マイクロカプセルの中へ区画化され、次いで、転写されおよび/または翻訳され、マイクロカプセル内でそれぞれの遺伝子産物(RNAまたはタンパク質)を生産する。所望の活性を有する遺伝子産物を生産する遺伝子エレメントは、引き続いてソーティングされる。このアプローチは、多種多様の手段によって所望の活性を検出することによって対象となる遺伝子産物を選択する。

【0269】

エピトープ結合性ドメインの特徴づけ
その特異的な抗原またはエピトープへのドメインの結合は、当業者らによく知られており、ELISAを含む方法によって試験することができる。一例において、結合は、モノクローナルファージELISAを使用して試験される。

【0270】

ファージELISAは、任意の適した手順に従って実行されてもよく、例示的なプロトコルは下記に述べられる。

【0271】

選択の各ラウンドで生産されたファージの集団は、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定するために、選択された抗原またはエピトープへのELISAによる結合についてスクリーニングすることができる。次いで、これらの集団からの単一の感染した細菌コロニーからのファージは、「モノクローナル」ファージ抗体を同定するためにELISAによってスクリーニングすることができる。抗原またはエピトープへの結合について可溶性抗体断片をスクリーニングすることもまた望ましく、これはまた、例えばCまたはN末端タグに対する試薬を使用してELISAによって試みることができる(例えばWinter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55およびその中に引用される参考文献を参照されたい)。

【0272】

選択されたファージモノクローナル抗体の多様性はまた、PCR産物のゲル電気泳動(Marks et al. 1991, 上掲; Nissim et al. 1994 上掲)、プロービング(Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776)、またはベクターDNAの配列決定によって評価されてもよい。

【0273】

E. dAbの構造
dAbが、例えば本明細書において記載されるファージディスプレイ技術を使用して選択されたV遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは、ユニバーサルフレームワーク領域を含み、それらは、本明細書において定義されるような特異的なジェネリックリガンドによって認識されてもよい。ユニバーサルフレームワーク、ジェネリックリガンドなどの使用は、WO99/20749において記載されている。

【0274】

V遺伝子レパートリーが使用される場合、ポリペプチド配列における変異は、可変ドメインの構造ループ内に配置されてもよい。いずれの可変ドメインのポリペプチド配列も、その相補的な対との各可変ドメインの相互作用を増強するために、DNAシャフリングによってまたは突然変異によって改変されてもよい。DNAシャフリングは、当技術分野において知られており、例えば、Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391および米国特許第6,297,053号によって教示され、これらの両方は、参照によって本明細書において組み込まれる。突然変異誘発の他の方法は、当業者らによく知られている。

【0275】

dAbの構築における使用のための足場
i.主鎖高次構造の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーはすべて、それらのポリペプチド鎖について類似の折り畳み部分を共有する。例えば、抗体は、それらの一次配列の点から高度に多様であるが、配列および結晶学的な構造の比較は、予想に反して、抗体の6つの抗原結合性ループのうちの5つ(H1、H2、L1、L2、L3)は、限られた数の主鎖高次構造または基本的な構造を取ることを明らかにした(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877)。したがって、ループ長および重要な残基の分析は、大多数のヒト抗体において見つけられるH1、H2、L1、L2、およびL3の主鎖高次構造の予測を可能にした(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220)。H3領域は、配列、長さ、および構造の点からはるかに、より多様であるが(Dセグメントの使用により)、それはまた、ループおよび抗体フレームワークにおける重要な位置の特定の残基の長さおよび存在または残基のタイプに依存する短いループ長のために、限られた数の主鎖高次構造を形成する(Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1)。

【0276】

dAbは、V_Hドメインのライブラリーおよび/またはV_Lドメインのライブラリーなどのドメインのライブラリーから有利には構築される。一態様において、メンバーの主鎖高次構造が分かることを確実にするように、あるループ長および重要な残基が選ばれた、ドメインのライブラリーが、設計される。有利には、これらは、上記に議論されるように、それらが非機能性であるという可能性を最小限にするために、自然界において見つけられる免疫グロブリンスーパーファミリー分子の実際の高次構造である。生殖系列V遺伝子セグメントは、抗体またはT細胞受容体のライブラリーの構築のためのある適した基本的なフレームワークとして役立ち、他の配列もまた、有益である。変異は、低頻度で生じてもよく、少数の機能的なメンバーは、改変された主鎖高次構造を持っていてもよく、これは、その機能に影響を与えない。

【0277】

基本的な構造の理論もまた、リガンドによってコードされる異なる主鎖高次構造の数を評価するために、リガンド配列に基づいて主鎖高次構造を予測するために、および基本的な構造に影響を与えない多様化のための残基を選ぶために有益である。ヒトVκドメインにおいて、L1ループは、4つの基本的な構造のうちの1つを取ることができ、L2ループは、単一の基本的な構造を有し、ヒトVκドメインの90％は、L3ループについて4つまたは5つの基本的な構造のうちの1つを取ることが知られており(Tomlinson et al. (1995) 上掲)、したがって、Vκドメインのみにおいて、異なる基本的な構造は、一連の異なる主鎖高次構造を作製するために組み合わせることができる。Vλドメインが、L1、L2、およびL3ループについて異なる範囲の基本的な構造をコードし、VκドメインおよびVλドメインは、H1およびH2ループについていくつかの基本的な構造をコードすることができる任意のV_Hドメインと対になることができるとすれば、これらの5つのループについて観察される基本的な構造の組合せの数は非常に多い。これは、主鎖高次構造における多様性の生成が、広範囲の結合特異性の生成にとって不可欠であるかもしれないことを暗示する。しかしながら、単一の知られている主鎖高次構造に基づいて抗体ライブラリーを構築することによって、予想に反して、主鎖高次構造における多様性は、すべての抗原を実質的に標的とするための十分な多様性を生成するために必要とされないことが分かった。さらに驚いたことに、単一の主鎖高次構造は、コンセンサス構造である必要がなく、単一の天然に存在する高次構造を、全ライブラリーのための基本として使用することができる。したがって、特定の一態様において、dAbは、単一の知られている主鎖高次構造を持つ。

【0278】

選ばれる単一の主鎖高次構造は、問題の免疫グロブリンスーパーファミリータイプの分子の中でありふれたものであってもよい。高次構造は、かなりの数の天然に存在する分子が、それを取るように観察される場合、ありふれたものとなる。したがって、一態様において、免疫グロブリンドメインの各結合ループの異なる主鎖高次構造の天然の存在は、別々に考慮され、次いで、異なるループについて主鎖高次構造の所望の組合せを持つ、天然に存在する可変ドメインが選ばれる。どれも利用可能ではない場合、最も近い等価物が選ばれてもよい。異なるループについての主鎖高次構造の所望の組合せは、所望の主鎖高次構造をコードする生殖系列遺伝子セグメントを選択することによって成されてもよい。一実施例において、選択された生殖系列遺伝子セグメントは、自然界において頻繁に発現され、特に、それらは、すべての天然生殖系列遺伝子セグメントのうちで最も頻繁に発現されてもよい。

【0279】

ライブラリーを設計する際に、6つの抗原結合性ループのそれぞれについての異なる主鎖高次構造の発生率は、別々に考慮されてもよい。H1、H2、L1、L2、およびL3について、天然に存在する分子の、20％〜100％の抗原結合性ループが取る所与の高次構造が選ばれる。典型的には、その観察される発生率は、35％を上回り(つまり35％〜100％であり)、理想的には、50％を上回る、または65％さえ上回る。H3ループの大部分が、基本的な構造を有していないので、基本的な構造を示すそれらのループの中でありふれた主鎖高次構造を選択することは好ましい。ループのそれぞれについて、したがって、天然レパートリーにおいて観察されるのが最も多い高次構造が選択される。ヒト抗体において、各ループについて最も一般的な基本的な構造(CS)は、以下の通りである:H1 -CS 1(発現されたレパートリーの79％)、H2 -CS 3(46％)、L1 -VκのCS 2(39％)、L2 -CS 1(100％)、L3 -VκのCS 1(36％)(計算は、κ:λ比を70:30と仮定、Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133)。基本的な構造を有するH3ループについて、残基94〜残基101に塩橋を有する7つの残基のCDR3長(Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)は、最も共通しているように思われる。EMBLデータライブラリーにおいて、この高次構造を形成するために必要とされるH3長および重要な残基を有する少なくとも16のヒト抗体配列があり、プロテインデータバンクにおいて、抗体モデリングのために基本として使用することができる、少なくとも2つの結晶学的な構造がある(2cgrおよび1tet)。基本的な構造のこの組合せで、最も頻繁に発現される生殖系列遺伝子セグメントは、V_Hセグメント3-23(DP-47)、J_HセグメントJH4b、VκセグメントO2/O12(DPK9)、およびJκセグメントJκ1である。V_HセグメントDP45およびDP38もまた適している。したがって、これらのセグメントは、所望の単一の主鎖高次構造を有するライブラリーを構築するために基本として組み合わせて使用することができる。

【0280】

あるいはまた、結合性ループのそれぞれについて、異なる主鎖高次構造の天然の存在に基づいて単一の主鎖高次構造を別個に選ぶ代わりに、主鎖高次構造の組合せの天然の存在は、単一の主鎖高次構造を選ぶための基本として使用される。抗体の場合には、例えば、抗原結合性ループの任意の2、3、4、5、または6つすべてについての基本的な構造の組合せの天然の存在は、決定することができる。ここで、選ばれた高次構造は、天然に存在する抗体においてありふれたものであってもよく、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されてもよい。したがって、ヒト抗体において、例えば、5つの抗原結合性ループ、H1、H2、L1、L2、およびL3の天然の組合せが考慮される場合、基本的な構造のうちで最も頻繁な組合せが、決定され、次いで、単一の主鎖高次構造を選ぶための基本として、H3ループについて最も一般的な高次構造と組み合わせられる。

【0281】

基本的な配列の多様化
いくつかの知られている主鎖高次構造または単一の知られている主鎖高次構造を選択したら、dAbは、構造的なおよび/または機能的な多様性を有するレパートリーを生成するために、分子の結合部位を変えることによって構築することができる。これは、変異体が一連の活性を提供することができるように、それらが、それらの構造および/またはそれらの機能において十分な多様性を持つようにそれらが生成されることを意味する。

【0282】

所望の多様性は、1以上の位置で、選択された分子を変えることによって典型的には生成される。変化させることとなる位置は、無作為に選ぶことができ、またはそれらは、選択されてもよい。次いで、変異は、無作為化によって達成することができ、この間に、内在のアミノ酸は、任意のアミノ酸または天然もしくは合成の類似体と交換され、非常に多くの変異体が生産されるまたは内在のアミノ酸を、アミノ酸の、1つ以上の明確なサブセットと交換することによって、限られた数の変異体を生産する。

【0283】

様々な方法が、そのような多様性を導入するために報告されている。エラープローンPCR(Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889)、化学的突然変異誘発(Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533)、または細菌突然変異誘発遺伝子株(Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359)は、分子をコードする遺伝子の中へ無作為突然変異を導入するために使用することができる。選択された位置を突然変異させる方法はまた、当技術分野においてよく知られており、PCRを使用するまたは使用しない、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドの使用を含む。例えば、いくつかの合成抗体ライブラリーは、抗原結合性ループに突然変異を向けることによって作製されている。ヒト破傷風トキソイド結合性FabのH3領域は、一連の新しい結合特異性を生じさせるために無作為化された(Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457)。無作為または準無作為H3およびL3領域は、非突然変異フレームワーク領域と共に大きなライブラリーを生産するために、生殖系列V遺伝子セグメントに付加された(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97)。そのような多様化は、他の抗原結合性ループのうちのいくつかまたはすべてを含むように拡張された(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, 上掲)。

【0284】

ループ無作為化が、H3のみについて約10¹⁵を超える構造および他の5つのループについて同様に多くの変異体を生じさせる可能性を有するので、あらゆる可能な組合せを表すライブラリーを生産することは、現在の形質転換技術を使用してもまたは無細胞系を使用することによってさえも実現可能ではない。例えば、現在までに構築された最大のライブラリーのうちの1つにおいて、6×10¹⁰の異なる抗体は、この設計のライブラリーについて可能な多様性のほんの一部にすぎないが、生成された(Griffiths et al. (1994) 上掲)。

【0285】

一実施形態において、分子の所望の機能を生じさせ、または修飾することに直接的に関与する残基のみが多様化される。多くの分子について、機能は、標的に結合することであろう、また、したがって、多様性は、分子の全体的なパッキングまたは選ばれた主鎖高次構造の維持に決定的である残基の変化を回避しながら、標的結合部位に集中させるべきである。

【0286】

一態様において、抗原結合部位におけるそれらの残基だけが変えられるdAbのライブラリーが、使用される。これらの残基は、ヒト抗体レパートリーにおいて非常に多様であり、高分解能で抗体/抗原の複合体において接触することが知られている。例えば、L2において、位置50および53は、天然に存在する抗体において多様であり、抗原と接触することが観察されることが知られている。対照的に、従来のアプローチは、ライブラリーにおいて多様化される2つと比較して、Kabat et al. (1991, 上掲)によって定義されるような対応する相補性決定領域(CDR1)における残基のすべて、約7つの残基を多様化することであろう。これは、一連の抗原結合特異性を生じさせるために必要とされる、機能的な多様性の点から著しい改善を表す。

【0287】

自然界において、抗体多様性は、2つのプロセスの結果である:ナイーブな一次レパートリーを生じさせるための生殖系列V、D、およびJ遺伝子セグメントの体細胞組換え(いわゆる生殖系列および接合部の多様性)ならびに結果として生じる、再配置されたV遺伝子の体細胞超突然変異。ヒト抗体配列の分析は、一次レパートリーにおける多様性が、抗原結合部位の中心に集中しているのに対して、体細胞超突然変異が、一次レパートリーにおいて高度に保存されている、抗原結合部位の周囲の領域まで多様性を広げることを示した(Tomlinson et al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813を参照されたい)。これは、おそらく、配列空間を調査するための効率的な戦略として相補的に進化したものであり、明らかに、抗体に特有であるが、それは、他のポリペプチドレパートリーに容易に適用することができる。変えられる残基は、標的に対する結合部位を形成するもののサブセットである。標的結合部位における残基の異なる(重複を含む)サブセットは、所望の場合、選択の間の異なる段階で多様化される。

【0288】

抗体レパートリーの場合には、最初の「ナイーブな」レパートリーは、作製され、すべてではなくいくつかの残基が、抗原結合部位において多様化されている。この文脈において本明細書において使用されるように、用語「ナイーブ」または「ダミー」は、所定の標的を有しない抗体分子を指す。これらの分子は、免疫系が、種々様々の抗原刺激によってまだ曝露されていない胎児および新生児の個人と同様に、免疫多様化を受けたことがない個人の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるものに似ている。次いで、このレパートリーは、一連の抗原またはエピトープに対して選択される。必要とされる場合、次いで、さらなる多様性を、最初のレパートリーにおいて多様化された領域の外側に導入することができる。この成熟レパートリーは、修飾された機能、特異性、または親和性について選択することができる。

【0289】

本明細書において記載される配列は、実質的に同一である配列、例えば、本明細書において記載される配列に少なくとも90％同一、例えば少なくとも91％または少なくとも92％または少なくとも93％または少なくとも94％または少なくとも95％または少なくとも96％または少なくとも97％または少なくとも98％または少なくとも99％同一の配列を含むことが理解されるであろう。

【0290】

核酸について、用語「実質的な同一性」は、2つの核酸またはその指定される配列が、最適にアライメントされ、比較される場合、ヌクレオチドの少なくとも約80％、通常、少なくとも約90％〜95％、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約98％〜99.5％において、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って、同一であることを示す。その代わりに、セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合、実質的な同一性は存在する。

【0291】

ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列について、用語「同一」は、適切な挿入または欠失を伴って、最適にアライメントされ、比較される場合の、2つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。その代わりに、DNAセグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合、実質的な同一性は存在する。

【0292】

2つの配列の間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり(つまり、同一性％=同一の位置の数/位置の合計数×100)、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れ、これらは、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要がある。配列の比較および2つの配列の間の同一性パーセントの決定は、非限定的な実施例において下記に記載されるように、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0293】

2つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリックスおよび40、50、60、70、または80のギャップウェイトおよび1、2、3、4、5、または6のレングスウェイトを使用し、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを使用して、決定することができる。2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、PAM120ウェイト残基表、12のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーを使用し、ALIGNプログラム(バージョン2.0)の中に組み込まれているE. MeyersおよびW. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを使用して、決定することもできる。加えて、2つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップウェイトおよび1、2、3、4、5、または6の長さウェイトを使用し、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムの中に組み込まれているNeedlemanおよびWunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))アルゴリズムを使用して決定することができる。

【0294】

例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、100％同一である配列番号122の参照配列と同一であってもよく、またはそれは、参照配列と比較して、ある整数の数までのヌクレオチド改変を含んでいてもよい。そのような改変は、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、転位および転換を含む置換、または挿入からなる群から選択され、上述の改変は、参照配列におけるヌクレオチドの間に個々に散在してまたは参照配列内の1以上の隣接する群において、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端の位置でまたはそれらの末端の位置の間のどこかで生じてもよい。ヌクレオチド改変の数は、配列番号122におけるヌクレオチドの合計数に、それぞれの同一性パーセントの数のパーセント(100で割る)を掛け、配列番号122におけるヌクレオチドの上述の合計数からその積を引くことによってまたは
nn≦xn-(xn・y)、
[式中、nnは、ヌクレオチド改変の数であり、xnは、配列番号122におけるヌクレオチドの合計数であり、yは、50％については0.50、60％については0.60、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.95、97％については0.97、もしくは100％については1.00であり、xnおよびyのいかなる非整数の積も、xnからそれを引く前に、最も近い整数まで切り捨てられる]によって決定される。配列番号122のポリヌクレオチド配列の改変は、このコード配列において、ナンセンス、ミスセンス、またはフレームシフト突然変異を生じさせてもよく、それによって、そのような改変に続いて、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを改変する。

【0295】

同様に、他の実施例において、本発明のポリペプチド配列は、100％同一である配列番号26によってコードされる参照配列と同一であってもよく、またはそれは、同一性％が100％未満となるように、参照配列と比較して、ある整数の数までのアミノ酸改変を含んでいてもよい。そのような改変は、少なくとも1つのアミノ酸の欠失、保存的および非保存的置換を含む置換、または挿入からなる群から選択され、上述の改変は、参照配列におけるアミノ酸の間に個々に散在してまたは参照配列内の1以上の隣接する群において、参照ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端の位置でまたはそれらの末端の位置の間のどこかで生じてもよい。所与の同一性％に対するアミノ酸改変の数が決定される。配列番号26によってコードされるポリペプチド配列におけるアミノ酸の合計数に、それぞれの同一性パーセントの数のパーセント(100で割る)を掛け、配列番号26によってコードされるポリペプチド配列におけるアミノ酸の上述の合計数からその積を引くことによってまたは
na≦xa-(xa・y)、
[式中、naは、アミノ酸改変の数であり、xaは、配列番号26によってコードされるポリペプチド配列におけるアミノ酸の合計数であり、yは、例えば、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85等であり、xaおよびyのいかなる非整数の積も、xaからそれを引く前に、最も近い整数まで切り捨てられる]によって決定される。

【実施例】

【0296】

以下の方法を、本明細書に記載する実施例中で使用した。

【0297】

方法1
ELISAによる大腸菌発現組換えヒトIL-13との結合
mAbdAb分子を、直接結合ELISAにおいて組換え大腸菌発現ヒトIL-13との結合に関して評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-13(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で1時間ブロッキングし、次いでmAbdAb構築物をプレートで滴定した(通常約3倍希釈液中に100nM〜約0.01nM)。結合は抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液、または抗ヒトIgGγ鎖特異的ペルオキシダーゼ結合検出抗体(カタログ番号A6029、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液を使用して検出した。

【0298】

方法2
ELISAによる大腸菌発現組換えヒトIL-4との結合
mAbdAb構築物を、直接結合ELISAにおいて組換え大腸菌発現ヒトIL-4との結合に関して評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-4(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で1時間ブロッキングし、次いでmAbdAb構築物をプレートで滴定した(通常約3倍希釈液中に100nM〜約0.01nM)。結合はヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液、または抗ヒトIgGγ鎖特異的ペルオキシダーゼ結合検出抗体(カタログ番号A6029、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液を使用して検出した。

【0299】

方法3
ELISAによる大腸菌発現組換えヒトIL-18との結合
mAbdAb構築物を、直接結合ELISAにおいて組換え大腸菌発現ヒトIL-18との結合に関して評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-18(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で1時間ブロッキングし、次いでmAbdAb構築物をプレートで滴定した(通常約3倍希釈液中に100nM〜約0.01nM)。結合は抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)の2000倍希釈液、または抗ヒトIgGγ鎖特異的ペルオキシダーゼ結合検出抗体(カタログ番号A6029、Sigma-Aldrich)の2000倍希釈液を使用して検出した。

【0300】

方法4
大腸菌発現組換えヒトIL-13との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現ヒトIL-13に関するmAbdAb構築物の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb構築物をこの表面上に捕捉し、ヒトIL-13(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-13結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl₂の使用のいずれかによって再生した。作業はBiacore(商標)3000、および/またはT100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。Biacore(商標)の作業は25℃または37℃で実施した。

【0301】

方法5
大腸菌発現組換えヒトIL-4との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現ヒトIL-4に関するmAbdAb構築物の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb構築物をこの表面上に捕捉し、ヒトIL-4(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-4結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl₂の使用のいずれかによって再生した。作業はBiacore(商標)3000、および/またはT100および/またはA100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。Biacore(商標)の作業は25℃または37℃で実施した。

【0302】

方法6
大腸菌発現組換えヒトIL-18との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現ヒトIL-18に関するmAbdAb構築物の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb構築物をこの表面上に捕捉し、ヒトIL-18(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-18結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl₂の使用のいずれかによって再生した。作業はBiacore(商標)3000、および/またはT100および/またはA100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。Biacore(商標)の作業は25℃で実施した。

【0303】

方法7
(Biacore(商標)を使用した)IL-13、IL-4またはIL-18に対するmAbdAb二重特異性抗体または三重特異性抗体の化学量論的評価
抗ヒトIgGは、第1級アミンカップリングによってCM5バイオセンサーチップ上に固定化した。mAbdAb構築物をこの表面上に捕捉し、その後、単一濃度のIL-13、IL-4またはIL-18サイトカインを与え、この濃度は結合表面を飽和するのに十分であり、観察した結合シグナルは完全R-maxに達した。次いで化学量論値を以下の式を使用して計算した:
化学量論値=Rmax*Mw(リガンド)/Mw(アナライト)*R(固定化または捕捉されたリガンド)
上式で、化学量論値を同時に2つ以上のアナライト結合に関して計算し、異なるサイトカインを飽和サイトカイン濃度で連続的に与え、化学量論値は前述のように計算した。作業はHBS-EPランニングバッファーを使用して25℃でBiacore3000において実施した。

【0304】

方法8
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えヒトIL-13の中和
TF-1細胞は、ヒトIL-13を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-13に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-13の生物活性を測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-13中和効力(IL-13の生物活性の阻害)を決定した。

【0305】

アッセイは滅菌条件下で滅菌96ウェルの組織培養プレートにおいて実施し、すべての試験ウェルは三連で実施した。約14ng/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-13を、50μlの合計体積で、様々な希釈のmAbdAb構築物(通常3倍希釈液で滴定した200nM〜0.02nM)と37℃で1時間プレインキュベートした。次いでこれらのサンプルを、滅菌96ウェルの組織培養プレート中に(1ml当たり細胞2×10⁵個の濃度で)50μlのTF-1細胞に加えた。したがって最終100μlのアッセイ体積は、(3倍希釈液で滴定した100nM〜0.01nMの最終濃度で)様々な希釈のmAbdAb構築物、(7ng/mlの最終濃度で)組換え大腸菌発現ヒトIL-13、および(1ml当たり細胞1×10⁵個の最終濃度で)TF-1細胞を含有した。アッセイプレートは、加湿CO₂インキュベーターにおいて約3日間37℃でインキュベートした。次いで細胞増殖の量を、製造者の説明書に記載されたのと同様に、Promegaからの「Cell Titre96(登録商標)Non-Radioactive Cell Proliferation Assay」(カタログ番号G4100)を使用して決定した。96ウェルプレート中のサンプルの吸光度は、570nmにおいてプレートリーダーで読み取った。

【0306】

組換え大腸菌発現ヒトIL-13の生物活性を中和するmAbdAb構築物の能力は、定義した量のヒトIL-13(7ng/ml)の生物活性を50％中和するのに必要とされるmAbdAb構築物の濃度(=ND₅₀)として表した。必要とされるmAbdAb構築物の濃度が低いほど、中和能力はより強くなる。本明細書で与えるND₅₀データは手作業で、またはマイクロソフトエクセルに固有であるRobosageソフトウェアパッケージを使用することによって計算した。

【0307】

方法9
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えヒトIL-4の中和
TF-1細胞は、ヒトIL-4を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-4に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-4の生物活性を測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-4中和効力(IL-4の生物活性の阻害)を決定した。

【0308】

アッセイは滅菌条件下で滅菌96ウェルの組織培養プレートにおいて実施し、すべての試験ウェルは三連で実施した。約2.2ng/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-4を、50μlの合計体積で、様々な希釈のmAbdAb構築物(通常3倍希釈液で滴定した200nM〜0.02nM)と37℃で1時間プレインキュベートした。次いでこれらのサンプルを、滅菌96ウェルの組織培養プレート中に(1ml当たり細胞2×10⁵個の濃度で)50μlのTF-1細胞に加えた。したがって最終100μlのアッセイ体積は、(3倍希釈液で滴定した100nM〜0.01nMの最終濃度で)様々な希釈のmAbdAb構築物、(1.1ng/mlの最終濃度で)組換え大腸菌発現ヒトIL-4、および(1ml当たり細胞1×10⁵個の最終濃度で)TF-1細胞を含有した。アッセイプレートは、加湿CO₂インキュベーターにおいて約3日間37℃でインキュベートした。次いで細胞増殖の量を、製造者の説明書に記載されたのと同様に、Promegaからの「Cell Titre96(登録商標)Non-Radioactive Cell Proliferation Assay」(カタログ番号G4100)を使用して決定した。96ウェルプレート中のサンプルの吸光度は、570nmにおいてプレートリーダーで読み取った。

【0309】

組換え大腸菌発現ヒトIL-4の生物活性を中和するmAbdAb構築物の能力は、定義した量のヒトIL-4(1.1ng/ml)の生物活性を50％中和するのに必要とされるmAbdAb構築物の濃度(=ND₅₀)として表した。必要とされるmAbdAb構築物の濃度が低いほど、中和能力はより強くなる。本明細書で与えるND₅₀データは手作業で、またはマイクロソフトエクセルに固有であるRobosageソフトウェアパッケージを使用することによって計算した。

【0310】

方法10
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えヒトIL-13と大腸菌発現組換えヒトIL-4の二重中和
TF-1細胞は、ヒトIL-13およびヒトIL-4を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-13およびヒトIL-4に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-13およびヒトIL-4の生物活性を同時に測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-13およびヒトIL-4二重中和効力(IL-13およびIL-4生物活性の二重阻害)を決定した。

【0311】

アッセイは滅菌条件下で滅菌96ウェルの組織培養プレートにおいて実施し、すべての試験ウェルは三連で実施した。約14ng/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-13および約2.2ng/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-4を、50μlの合計体積で、様々な希釈のmAbdAb構築物(通常3倍希釈液で滴定した200nM〜0.02nM)と37℃で1時間プレインキュベートした。次いでこれらのサンプルを、滅菌96ウェルの組織培養プレート中に(1ml当たり細胞2×10⁵個の濃度で)50μlのTF-1細胞に加えた。したがって最終100μlのアッセイ体積は、(3倍希釈液で滴定した100nM〜0.01nMの最終濃度で)様々な希釈のmAbdAb構築物、(7ng/mlの最終濃度で)組換え大腸菌発現ヒトIL-13、(1.1ng/mlの最終濃度で)組換え大腸菌発現ヒトIL-4、および(1ml当たり細胞1×10⁵個の最終濃度で)TF-1細胞を含有した。アッセイプレートは、加湿CO₂インキュベーターにおいて約3日間37℃でインキュベートした。次いで細胞増殖の量を、製造者の説明書に記載されたのと同様に、Promegaからの「Cell Titre96(登録商標)Non-Radioactive Cell Proliferation Assay」(カタログ番号G4100)を使用して決定した。96ウェルプレート中のサンプルの吸光度は、570nmにおいてプレートリーダーで読み取った。

【0312】

方法11
Sf21-発現組換えヒトIL-5との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換えSf21-発現ヒトIL-5に関するmAbdAb分子の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb分子をこの表面上に捕捉し、ヒトIL-5(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-5結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl₂の使用のいずれかによって再生した。作業はBiacore(商標)3000、T100およびA100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。Biacore(商標)の作業は25℃で実施した。

【0313】

方法12
VEGF受容体結合アッセイ
このアッセイはVEGF₁₆₅とVEGFR2(VEGF受容体)の結合、およびこの相互作用を阻害する試験分子の能力を測定する。ELISAプレートはVEGF受容体(R&D Systems、カタログ番号357-KD-050)(0.2M炭酸ナトリウム重炭酸ナトリウムpH9.4中に0.5μg/mlの最終濃度)で一晩コーティングし、PBSに溶かした2％BSAで洗浄しブロッキングした。VEGF(R&D Systems、カタログ番号293-VE-050)および(0.1％BSAを溶かした0.05％Tween20(商標)PBSに希釈した)試験分子を、プレートに加える前に(3ng/mlのVEGF最終濃度)1時間プレインキュベートした。VEGFとVEGF受容体の結合は、ビオチン化抗VEGF抗体(0.5μg/mlの最終濃度)(R&D Systems、カタログ番号BAF293)およびペルオキシダーゼ結合抗ビオチン二次抗体(5000倍希釈)(Stratech、カタログ番号200-032-096)を使用して検出し、等体積の1MのHClで反応を停止させた後に発色基質(Sure Blue TMBペルオキシダーゼ基質、KPL)を使用してOD450で可視化した。

【0314】

方法13
EGFRキナーゼアッセイ
EGFとのその相互作用を介してA431細胞の表面で発現されたEGFRの活性化は、受容体のチロシンキナーゼリン酸化をもたらす。EGFRのチロシンキナーゼリン酸化の低下を測定して、試験分子の効力を決定した。A431細胞は96ウェルの組織培養プレートに一晩接着させ、次いで試験分子を加え、1時間放置し、次いでEGF(300ng/mlで)(R&D Systemsカタログ番号236-EG)と共に10分間インキュベートした。細胞を溶解し、溶解調製物は抗EGFR抗体(1ug/mlで)(R&D Systemsカタログ番号AF231)でコーティングしたELISAプレートに移した。溶解細胞溶液中に存在したリン酸化EGFRと非リン酸化EGFRの両方を捕捉した。非結合物質を洗浄除去した後、HRP結合抗ホスホチロシン抗体(2000倍希釈)(Upstate Biotechnology、カタログ番号16-105)を使用してリン酸化EGFRを特異的に検出した。結合は発色基質を使用して可視化した。

【0315】

方法14
MRC-5/TNFアッセイ
ヒトTNFR1とのヒトTNF-aの結合を妨げてIL-8分泌を中和する試験分子の能力を、ヒト肺線維芽細胞MRC-5細胞を使用して決定した。希釈系の試験サンプルはTNF-a(500pg/ml)(Peprotech)と1時間インキュベートした。次いでこれをMRC-5細胞の懸濁液(ATCC、カタログ番号CCL-171)(5×10³個の細胞/ウェル)で2倍に希釈した。一晩のインキュベーション後、サンプルは10倍に希釈し、IL-8の放出はIL-8 ABI 8200細胞検出アッセイ(FMAT)を使用して決定し、この場合IL-8濃度は抗IL-8(R&D systems、カタログ番号208-IL)コーティングポリスチレンビーズ、ビオチン化抗IL-8(R&D systems、カタログ番号BAF208)およびストレプトアビジンAlexafluor647(Molecular Probes、カタログ番号S32357)を使用して決定した。アッセイの読み出し値は647nmでの局所蛍光発光であり、未知のIL-8濃度はアッセイ中に含まれたIL-8標準曲線を使用して内挿した。

【0316】

方法15
MRC-5/IL-1アッセイ
ヒトIL1-RとのヒトIL-1aの結合を妨げてIL-8分泌を中和する試験分子の能力を、ヒト肺線維芽細胞MRC-5細胞を使用して決定した。MRC-5細胞(ATCC、カタログ番号CCL-171)をトリプシン処理し、次いで懸濁液としての試験サンプルと1時間インキュベートした。IL-1a(200pg/mlの最終濃度)(R&D Systemsカタログ番号200-LA)を次いで加えた。一晩のインキュベーション後、IL-8の放出は抗IL-8コーティングELISAプレート、ビオチン化抗IL-8およびストレプトアビジンHRPを用いてIL-8定量化ELISAキット(R&D Systems)を使用して決定した。アッセイの読み出し値は450nmでの比色吸光度であり、未知のIL-8濃度はアッセイ中に含まれたIL-8標準曲線を使用して内挿した。

【0317】

方法16
全血ホスホ-STAT6バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えヒトIL-13またはIL-4の中和効力
全血細胞は組換え大腸菌発現ヒトIL-4(rhIL-14)またはIL-13(rhIL-13)を用いてex-vivoで刺激して、ホスホSTAT6(pSTAT6)を発現させることが可能である。このアッセイはpSTAT6を定量的に測定し、したがってmAbdAb構築物の中和効力(IL-4またはIL-13生物活性の阻害)を決定するために開発した。

【0318】

アッセイは滅菌条件下で滅菌96ウェルの組織培養プレートにおいて実施し、すべての試験ウェルは三連で実施した。12ng/mlのrhIL-13またはrhIL-4を無血清細胞培養培地中で調製し、31.2μLを96ウェルプレートのウェルに加えた。mAbdAb構築物またはアイソタイプ対照の9地点希釈曲線を6×最終アッセイ濃度で調製し、31.2μLのそれぞれの希釈液をrhIL-4またはrhIL-13のいずれかを含有するウェルに加えた。125μLのヘパリン化ヒト全血をすべてのウェルに加え、30秒間攪拌機で混合した。最終アッセイ体積は、2ng/mLの最終濃度でmAbdAb構築物およびrhIL-13またはrhIL-4の様々な希釈液を含有した。アッセイプレートは、60分間37℃、5％CO₂でインキュベートした。

【0319】

次いで細胞を、62.5μLの4×溶解バッファーの添加によって溶解した。溶解バッファーは、最終アッセイ濃度の50mMトリス塩酸塩、300mMの塩化ナトリウム、1％のNP40、0.5％のデオキシコール酸ナトリウム、50mMのフッ化ナトリウム、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、1mMのEDTA、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有した。プレートは30分間氷上に置き、次いでpSTAT6に関してアッセイするまで-80℃に凍結した。

【0320】

全血サンプル中のpSTAT6の測定は、電気化学発光イムノアッセイ(Meso-Scale-Discovery、MSD)を使用して実施した。簡潔には、アビジンコーティング96ウェルMSDプレートを、750rpmで攪拌機において室温で1時間、ウェル当たり150μLの5％MSDブロッカーAでブロッキングした。プレートはウェル当たり150μLのMSDトリス洗浄バッファーで3回洗浄した。ウェル当たり25μLの捕捉抗体(ビオチン化マウス抗ヒトSTAT6モノクローナル抗体)を加え、プレートは4℃で一晩インキュベートした。捕捉抗体は、50mMのトリス、150mMの塩化ナトリウム、0.2％のBSA、0.5％のTween20、1mMのEDTAからなるアッセイバッファー中に4μg/mLに希釈した。プレートはMSDトリス洗浄バッファーで3回洗浄し、次いで攪拌機において室温で1時間、150μLの5％MSDブロッカーAでブロッキングした。プレートは前述のように3回洗浄し、次いで25μLの全血溶解物またはpSTAT6キャリブレーターをウェル当たりに加えた。プレートは攪拌機において室温で3時間インキュベートした。プレートは3回洗浄し、次いで25μLのウサギ抗ヒトpSTAT6抗体(アッセイバッファー中に800倍希釈)を加え、次いで室温で1時間インキュベートした。さらなる洗浄後、ウェル当たり25μLの500倍希釈のMSD TAGヤギ抗ウサギIgG抗体を加え、次いで攪拌機において室温で1時間インキュベートした。ウェル当たり150μLの2×MSDリードバッファーTを加える前にプレートを再度洗浄した。プレートはMSD SECTOR撮像装置ですぐに読み取った。

【0321】

rhIL-13またはrhIL-4の生物活性を中和するmAbdAb構築物の能力は、2ng/mLのヒトIL-4またはヒトIL-13を50％中和するのに必要とされるmAbdAb構築物の濃度(IC₅₀)として表した。必要とされるmAbdAb構築物の濃度が低いほど、中和能力はより強くなる。

【0322】

方法17
ELISAによる大腸菌発現組換えカニクイザルIL-13との結合
mAbdAb分子を、直接結合ELISAにおいて組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13との結合に関して評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で1時間ブロッキングし、次いでmAbdAb分子をプレートで滴定した(通常約3倍希釈液中に100nM〜約0.01nM)。結合は抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液、または抗ヒトIgGγ鎖特異的ペルオキシダーゼ結合検出抗体(カタログ番号A6029、Sigma-Aldrich)の適切な希釈液を使用して検出した。

【0323】

方法18
使用せず。

【0324】

方法19
ELISAによるヒトIL4受容体α(IL4Rα)とのヒトIL-4の結合の阻害
特に明記しない限り、すべての試薬は、使用の直前にブロッキング溶液(4％ウシ血清アルブミン、トリス緩衝生理食塩水および0.05％Tween20中)中に必要とされる濃度に希釈した。ELISAプレートは、リン酸緩衝生理食塩水に溶かした5μg/mlの組換えヒトIL4Rα-Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号604-4R)を用いて4℃において一晩コーティングした。すべての後のステップは室温で実施した。プレートは、ブロッキング溶液中で2時間ブロッキングした後に、0.02μg/mlの組換えヒトIL-4(GSKで作製)と事前に混合した50μlの様々な濃度のmAbdAb(または陽性対照mAbsもしくはdAb)を加えた。プレートを1時間インキュベートした後に、洗浄バッファー(トリス緩衝生理食塩水および0.05％Tween20)中で4回洗浄した。ビオチン化抗ヒトIL-4(R&D Systems、カタログ番号BAF204)の0.5μg/ml溶液50μlをそれぞれのウェルに加え、1時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファー中で4回洗浄した後に、50μl/ウェルの2000倍希釈のエクストラバジン(Sigma、カタログ番号E2886)を加えた。1時間後、プレートは4回洗浄し、比色シグナルは(Sigmaからの)OPDペルオキシダーゼ基質とのインキュベーションによって検出し、反応は停止溶液(3MのH₂SO₄酸)を用いて停止させ、吸光度データは490nmでのプレートリーダーにおける読み取りによって得た。平均吸光度と標準誤差をGraphPad Prismでプロットし、IC₅₀値はCambridge Soft BioAssayを使用して計算した。

【0325】

方法20
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えカニクイザルIL-13の中和
TF-1細胞は、カニクイザルIL-13を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-13に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-13の生物活性を測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-13中和効力(IL-13の生物活性の阻害)を決定した。

【0326】

アッセイは滅菌条件下で滅菌96ウェルの組織培養プレートにおいて実施し、すべての試験ウェルは三連で実施した。約14ng/mlの組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13を、50μlの合計体積で、様々な希釈のmAbdAb構築物(通常3倍希釈液で滴定した1000nMまたは200nM〜1nMまたは0.02nM)と37℃で1時間プレインキュベートした。次いでこれらのサンプルを、滅菌96ウェルの組織培養プレート中に(1ml当たり細胞2×10⁵個の濃度で)50μlのTF-1細胞に加えた。したがって最終100μlのアッセイ体積は、(3倍希釈液で滴定した500nMまたは100nM〜0.5nMまたは0.01nMの最終濃度で)様々な希釈のmAbdAb構築物、(7ng/mlの最終濃度で)組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13、および(1ml当たり細胞1×10⁵個の最終濃度で)TF-1細胞を含有した。アッセイプレートは、加湿CO₂インキュベーターにおいて約3日間37℃でインキュベートした。次いで細胞増殖の量を、製造者の説明書に記載されたのと同様に、Promegaからの「Cell Titre96(登録商標)Non-Radioactive Cell Proliferation Assay」(カタログ番号G4100)を使用して決定した。96ウェルプレート中のサンプルの吸光度は、570nmにおいてプレートリーダーで読み取った。

【0327】

組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13の生物活性を中和するmAbdAb構築物の能力は、定義した量のカニクイザルIL-13(7ng/ml)の生物活性を50％中和するのに必要とされるmAbdAb構築物の濃度(=ND₅₀)として表した。必要とされるmAbdAb構築物の濃度が低いほど、中和能力はより強くなる。本明細書で与えるND₅₀データは手作業で、またはマイクロソフトエクセルに固有であるRobosageソフトウェアパッケージを使用することによって計算した。

【0328】

方法21
TF-1細胞増殖バイオアッセイにおける大腸菌発現組換えカニクイザルIL-4の中和
TF-1細胞は、カニクイザルIL-4を含めたいくつかの異なるサイトカインに応答して増殖する。したがってIL-4に関するこれらの細胞の増殖性応答を使用してIL-4の生物活性を測定することができ、後にアッセイを開発してmAbdAb構築物のIL-4中和効力(IL-4の生物活性の阻害)を決定した。

【0329】

アッセイは滅菌条件下で滅菌96ウェルの組織培養プレートにおいて実施し、すべての試験ウェルは三連で実施した。約2.2ng/mlの組換え大腸菌発現カニクイザルIL-4を、50μlの合計体積で、様々な希釈のmAbdAb構築物(通常3倍希釈液で滴定した200nM〜0.02nM)と37℃で1時間プレインキュベートした。次いでこれらのサンプルを、滅菌96ウェルの組織培養プレート中に(1ml当たり細胞2×10⁵個の濃度で)50μlのTF-1細胞に加えた。したがって最終100μlのアッセイ体積は、(3倍希釈液で滴定した100nM〜0.01nMの最終濃度で)様々な希釈のmAbdAb構築物、(1.1ng/mlの最終濃度で)組換え大腸菌発現カニクイザルIL-4、および(1ml当たり細胞1×10⁵個の最終濃度で)TF-1細胞を含有した。アッセイプレートは、加湿CO₂インキュベーターにおいて約3日間37℃でインキュベートした。次いで細胞増殖の量を、製造者の説明書に記載されたのと同様に、Promegaからの「Cell Titre96(登録商標)Non-Radioactive Cell Proliferation Assay」(カタログ番号G4100)を使用して決定した。96ウェルプレート中のサンプルの吸光度は、570nmにおいてプレートリーダーで読み取った。

【0330】

組換え大腸菌発現カニクイザルIL-4の生物活性を中和するmAbdAb構築物の能力は、定義した量のカニクイザルIL-4(1.1ng/ml)の生物活性を50％中和するのに必要とされるmAbdAb構築物の濃度(=ND₅₀)として表した。必要とされるmAbdAb構築物の濃度が低いほど、中和能力はより強くなる。本明細書で与えるND₅₀データは手作業で、またはマイクロソフトエクセルに固有であるRobosageソフトウェアパッケージを使用することによって計算した。

【0331】

方法22
ELISAによるヒトIL-13受容体α2(IL13Rα2)とのヒトIL-13の結合の阻害
特に明記しない限り、すべての試薬は、使用の直前にブロッキング溶液(1％ウシ血清アルブミン、トリス緩衝生理食塩水および0.05％Tween20中)中に必要とされる濃度に希釈した。ELISAプレートは、コーティングバッファー(0.05M重炭酸塩pH9.6、Sigma C-3041)の溶液中の5μg/mlのSf21細胞中で発現された組換えヒトIL13Rα2/Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号614-IR)を用いて4℃において一晩コーティングした。プレートは、ブロッキング溶液(1％BSA、TBST中)中で室温において1時間ブロッキングした後に、30ng/mlの組換えヒトIL-13(GSKで作製)と37℃で30分間プレインキュベートした様々な濃度のmAbdAb(または陽性対照mAbsもしくはdAb)を加えた。プレートを1時間インキュベートした後に、洗浄バッファー(トリス緩衝生理食塩水および0.05％Tween20)中で3回洗浄した。ビオチン化抗ヒトIL-13(R&D Systems、カタログ番号BAF213)の0.5μg/ml溶液50μlをそれぞれのウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファー中で3回洗浄した後に、適切な希釈のエクストラバジン(Sigma、カタログ番号E2886)を加えた。1時間後、プレートを洗浄し、比色シグナルは(Sigmaからの)OPDペルオキシダーゼ基質とのインキュベーションによって検出し、反応は停止溶液(3Mの酸)を用いて停止させ、吸光度データは490nmでのプレートリーダーにおける読み取りによって得た。平均吸光度と標準誤差をエクセルシートでプロットし、IC₅₀値はマイクロソフトエクセルからRobosageソフトウェアを使用して計算した。

【0332】

方法23
大腸菌発現組換えカニクイザルIL-13との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現カニクイザルIL-13に関するmAbdAb(またはmAb)分子の結合親和性を、Biacore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb(またはmAb)分子をこの表面上に捕捉し、カニクイザルIL-13(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-13結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。作業はBIAcore(商標)3000、および/またはT100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。BIAcore(商標)の作業は25℃または37℃で実施した。

【0333】

方法24
大腸菌発現組換えカニクイザルIL-4との結合に関するBiacore(商標)の結合親和性評価
組換え大腸菌発現カニクイザルIL-4に関するmAbdAb(またはmAb)分子の結合親和性を、BIAcore(商標)分析によって評価した。分析はプロテインAまたは抗ヒトIgG捕捉を使用して実施した。簡潔には、プロテインAまたは抗ヒトIgGを、製造者の推奨に従い第1級アミンカップリングによってCM5チップ上に結合させた。次いでmAbdAb(またはmAb)分子をこの表面上に捕捉し、カニクイザルIL-4(GSKで作製および精製)を定義した濃度で与えた。表面は弱酸性溶出条件(100mMリン酸など)を使用して再度プロテインA表面に再生し、これは後のIL-4結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。抗ヒトIgG表面は、プロテインA表面と同様の条件の使用、または3MのMgCl₂の使用のいずれかによって再生した。作業はBIAcore(商標)3000および/またはT100および/またはA100機器で実施し、データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルに適合させた。BIAcore(商標)の作業は25℃または37℃で実施した。

【0334】

方法25
IL-13細胞ベースの中和アッセイ
IL13に対する特異性を有するmAbdAbの効力を、遺伝子操作したレポーター細胞株HEK Blue-STAT6を使用してIL-13細胞アッセイにおいてアッセイした。

【0335】

転写因子STAT6は、重複する生物機能を有する2つのサイトカイン、IL-4RαおよびIL-13Rα1から構成される受容体複合体と結合するIL-4およびIL-13によって主に活性化される。リガンド結合によって、受容体複合体は受容体結合Janusキナーゼ(JAK1およびTyk2)を活性化し、STAT6の動員およびそのリン酸化をもたらす。活性化したSTAT6は核へ移行するホモ二量体を形成し、応答性プロモーターの制御下で遺伝子の転写を誘導する。HEK Blue-STAT6株を遺伝子操作して、このようなプロモーターの制御下で分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)を発現させる。

【0336】

細胞は96ウェルプレートに平板培養し、予め平衡状態にしたヒトIL-13および試験分子と20〜24時間インキュベートした。このインキュベーション時間後、IL-13刺激の結果として細胞によって生成されたSEAPの量を、次いでQuanti-blueシステム(Invivogen)を使用して測定した。

【0337】

実施例１
1. 二重標的化mAbdAbの作製
表1〜4に述べる二重標的化mAbdAbは以下の方法で構築した。発現構築物は、発現時にdAbが重鎖または軽鎖のC末端と結合するように、ドメイン抗体をコードする配列をモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖(または両方)をコードする配列に移植することによって作製した。いくつかの構築物用に、リンカー配列を使用してドメイン抗体を重鎖CH3または軽鎖Cκに連結した。他の構築物では、ドメイン抗体をリンカー配列なしで重鎖または軽鎖と直接連結する。これらのmAbdAb構築物の一般的な略図は図8に示す(mAb重鎖は灰色で描き、mAb軽鎖は白色で描き、dAbは黒色で描く)。

【0338】

図8に述べるmAbdAbタイプ1の一例はPascoH-G4S-474である。図8に述べるmAbdAbタイプ2の一例はPascoL-G4S-474である。図8に述べるmAbdAbタイプ3の一例はPascoHL-G4S-474である。mAbdAbタイプ1および2は四価構築物であり、mAbdAbタイプ3は六価構築物である。

【0339】

mAbdAb重鎖(上図)またはmAbdAb軽鎖(下図)の構築を示す略図を以下に示す。他に言及しない限り、これらの制限部位を使用して表1〜4に記載するmAbdAbを構築した。

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

【0340】

重鎖に関してここで留意すべきは、用語「V_H」はモノクローナル抗体可変重鎖配列であり、「CH1、CH2およびCH3」はヒトIgG1重鎖定常領域配列であり、「リンカー」は使用した特異的リンカー領域の配列であり、「dAb」はドメイン抗体配列であることである。軽鎖に関しては、用語「V_L」はモノクローナル抗体可変軽鎖配列であり、「Cκ」はヒト軽鎖定常領域配列であり、「リンカー」は使用した特異的リンカー領域の配列であり、「dAb」はドメイン抗体配列である。

【0341】

いくつかのDNA発現構築物をオリゴ構築によってde novoで作製した。さらに他のDNA発現構築物は、制限クローニングまたは部位特異的突然変異誘発によって(前に記載したように作製した)既存の構築物から誘導した。

【0342】

これらの構築物(mAbdAb重鎖または軽鎖)を、標準的な分子生物学の技法を使用して哺乳動物発現ベクター(RIn、RIdまたはpTTベクター系)にクローニングした。(配列番号64に示すような)哺乳動物アミノ酸シグナル配列をこれらの構築物の構築において使用した。

【0343】

dAbがモノクローナル抗体の重鎖のC末端と連結したmAbdAbの発現用に、適切な重鎖mAbdAb発現ベクターを、そのモノクローナル抗体に適した軽鎖発現ベクターと組み合わせた。dAbがモノクローナル抗体の軽鎖のC末端と連結したmAbdAbの発現用に、適切な軽鎖mAbdAb発現ベクターを、そのモノクローナル抗体に適した重鎖発現ベクターと組み合わせた。

【0344】

dAbがモノクローナル抗体の重鎖のC末端と連結し、かつdAbがモノクローナル抗体の軽鎖のC末端と連結したmAbdAbの発現用に、適切な重鎖mAbdAb発現ベクターを、適切な軽鎖mAbdAb発現ベクターと組み合わせた。

【0345】

1.1 使用した命名および略語
モノクローナル抗体(mAb)
複数のモノクローナル抗体(mAbs)
ドメイン抗体(dAb)
複数のドメイン抗体(dAbs)
重鎖(H鎖)
軽鎖(L鎖)
重鎖可変領域(V_H)
軽鎖可変領域(V_L)
ヒトIgG1定常重鎖領域1(CH1)
ヒトIgG1定常重鎖領域2(CH2)
ヒトIgG1定常重鎖領域3(CH3)
ヒトκ軽鎖定常領域(Cκ)。

【0346】

1.2 抗IL13 mAb-抗IL4 dAb
二重特異性抗IL13 mAb-抗IL4 dAbを前に記載したのと同様に構築した。いくつかの異なるリンカーを使用して、抗IL4ドメイン抗体とモノクローナル抗体を連結した。いくつかの構築物はリンカーを有していなかった。

【0347】

ここで留意すべきは、(アミノ酸残基GおよびSをコードする)BamHIクローニング部位を使用して、リンカーおよびdAbをmAb重鎖のCH3またはmAb軽鎖のCκのいずれかにクローニングしたことである。したがって所与のリンカー配列以外に、追加的なGおよびSアミノ酸残基が、重鎖と軽鎖発現構築物の両方に関してリンカー配列とドメイン抗体の間、またはすべてではないがいくつかの重鎖発現構築物中のCH3とリンカー配列の間に存在する。しかしながら、G4SリンカーがmAbdAb形式でmAbとdAbの間に位置したとき、(G4Sリンカー配列内に固有のGおよびSアミノ酸残基のため)BamHIクローニング部位が既に存在し、したがって追加的なGおよびSアミノ酸残基は、このリンカーを使用した構築物中のCH3またはCκとドメイン抗体の間に存在しなかった。mAbdAb形式でmAbとdAbの間にリンカー配列を使用しなかったとき、BamHIクローニング部位(したがってGおよびSアミノ酸残基)がCH3またはCκとドメイン抗体の間に依然存在した。mAbdAb重鎖および軽鎖のアミノ酸配列に関する完全な詳細は表1に述べる。

【0348】

以下の実施例のいくつかは、対照抗体としてIL-4 mAbを使用する。これらの実施例中で使用した対照IL-4 mAbは、配列番号14の重鎖配列および配列番号15の軽鎖配列を有する抗体のいずれかであり、または配列番号166の重鎖配列および配列番号15の軽鎖配列を有する抗体であり得る。これらのIL-4 mAbの両方が同じCDRを共有し、これらの抗体の両方が以下の実施例中で「パスコリツマブ」または「IL-4 mAb」と呼ばれるので、同じ形式で結合すると予想される。

【0349】

以下の実施例のいくつかは、対照抗体としてIL-5 mAbを使用する。これらの実施例中で使用した対照IL-5 mAbは、配列番号65の重鎖配列および配列番号66の軽鎖配列を有する抗体のいずれかであり、または配列番号191の重鎖配列および配列番号66の軽鎖配列を有する抗体であり得る。これらのIL-5抗体の両方が同じCDRを共有し、これらの抗体の両方が以下の実施例中で「メポリズマブ」または「IL-5 mAb」と呼ばれるので、同じ形式で結合すると予想される。

【0350】

表1中に述べるmAbdAbはCHOK1細胞上清中で一時的に発現された。mAbdAbの定量化後、これらのmAbdAbを含有した上清を、IL-13およびIL-4結合ELISAで活性に関して分析した。

【表1】

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【0351】

表2に述べるmAbdAbはCHOK1またはCHOE1a細胞上清の片方または両方中で発現され、複数のIL-13およびIL-4活性アッセイにおいて精製し分析した。

【表2】

[この文献は図面を表示できません]

【0352】

1.3 抗IL4 mAb-抗IL13 dAb
二重特異性抗IL4 mAb-抗IL13 dAbを前に記載したのと同様に構築した。いくつかの異なるリンカーを使用して、抗IL13ドメイン抗体とモノクローナル抗体を連結した。いくつかの構築物はリンカーを有していなかった。

【0353】

ここで留意すべきは、(アミノ酸残基GおよびSをコードする)BamHIクローニング部位を使用して、リンカーおよびdAbをmAb重鎖のCH3またはmAb軽鎖のCκのいずれかにクローニングしたことである。したがって所与のリンカー配列以外に、追加的なGおよびSアミノ酸残基が、重鎖と軽鎖発現構築物の両方に関してリンカー配列とドメイン抗体の間、またはすべてではないがいくつかの重鎖発現構築物中のCH3とリンカー配列の間に存在する。しかしながら、G4SリンカーがmAbdAb形式でmAbとdAbの間に位置したとき、(G4Sリンカー配列内に固有のGおよびSアミノ酸残基のため)BamHIクローニング部位が既に存在し、したがって追加的なGおよびSアミノ酸残基は、このリンカーを使用した構築物中のCH3またはCκとドメイン抗体の間に存在しなかった。mAbdAb形式でmAbとdAbの間にリンカー配列を使用しなかったとき、BamHIクローニング部位(したがってGおよびSアミノ酸残基)がCH3またはCκとドメイン抗体の間に依然存在した。mAbdAb重鎖および軽鎖のアミノ酸配列に関する完全な詳細は表3に述べる。

【0354】

表3に述べるmAbdAbはCHOK1細胞上清中で一時的に発現された。mAbdAbの定量化後、これらのmAbdAbを含有した上清を、IL-13およびIL-4結合ELISAで活性に関して分析した。

【表3】

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【0355】

表4に述べるmAbdAbは、CHOK1、CHOE1aまたはHEK293-6E細胞の1つまたは複数において発現された。

【表4】

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【0356】

1.4 モノクローナル抗体、ドメイン抗体およびリンカーに関する配列番号
mAbdAbを作製するために使用したモノクローナル抗体(mAb)、ドメイン抗体(dAb)およびリンカーに関する配列番号を以下の表5に示す。

【表5】

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【0357】

成熟ヒトIL-13アミノ酸配列(シグナル配列なし)は配列番号63として示す。

【0358】

成熟ヒトIL-4アミノ酸配列(シグナル配列なし)は配列番号62として示す。

【0359】

1.5 mAbdAbの発現および精製
実施例1に記載したmAbdAb発現構築物を、1つまたは複数のCHOK1細胞、CHOE1a細胞またはHEK293-6E細胞にトランスフェクトし、小規模(約3ml)または中規模(約50ml〜100ml)または大規模(約1リットル)で発現させ、次いでいくつかの構築物は固定化プロテインAカラムを使用して精製し、280nmで吸光度を読み取ることによって定量化した。

【0360】

1.6 精製mAbdAbのサイズ排除クロマトグラフィー分析
複数のmAbdAbは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析した。いくつかのこれらの分子(PascoH-G4S-474、PascoL-G4S-474、PascoH-474およびPascoHL-G4S-474)に関する代表的なデータは、それぞれ図9、10、11および12に示す。除去した「GS」モチーフを有するこれらの分子に関するSECおよびSDS-PAGE分析を示す代表的なデータは図90〜98に示す。

【0361】

いくつかの場合SECを使用して、これらの分子をさらに精製して凝集体を除去した。

【0362】

実施例２
ELISAによるmAbdAbとヒトIL-13およびヒトIL-4の結合
2.1 抗IL13 mAb-抗IL-4 dAbとIL-13およびIL-4の結合
mAbdAb上清を、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは図13に示す。

【0363】

図13は、すべてのこれらの抗IL13 mAb-抗IL-4 dAbがIL-13と結合したことを示す。さらにこれらのmAbdAbの結合活性は、IL-13結合の陽性対照としてmAbdAbと直接比較するためにこのアッセイ中に含めた、精製抗ヒトIL13 mAb単独とほぼ同等(2倍〜3倍以内)であった。精製抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)はIL-13結合の陰性対照として含めた。

【0364】

これらの分子は、(方法2に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-4との結合に関しても試験した。これらのデータは図14に示す。

【0365】

図14は、すべてのこれらの抗IL13 mAb-抗IL4 dAbはIL-4と結合したが、IL-4結合活性のいくらかのばらつきが観察された。mAbdAb構築物中に抗IL-4dAbが存在しなかったとき、IL-4との結合は観察されなかった。精製抗ヒトIL13 mAbも、IL-4との結合の陰性対照として含めた。ここで留意すべきは、dAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL-4 dAb単独はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、精製抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)を陽性対照として使用して、このアッセイ中のIL-4結合を実証したことである。

【0366】

mAbdAbの精製サンプルも、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは図15に示す。これらの精製抗IL13 mAb-抗IL4 dAbはIL-13と結合した。IL-13に関するこれらのmAbdAbの結合活性は、精製抗ヒトIL13 mAb単独のそれと同等であった。(無関係な抗原に対する特異性を有する)アイソタイプ適合mAbも、このアッセイ中のIL-13との結合の陰性対照として含めた。

【0367】

これらの精製mAbdAbは、(方法2に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおけるヒトIL-4との結合に関しても試験した。これらのデータは図16に示す。

【0368】

すべてのこれらの抗IL13 mAb-抗IL4 dAbはIL-4と結合した。ここで留意すべきは、dAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL4 dAb単独はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、精製抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)を陽性対照として使用して、このアッセイ中のIL-4結合を実証したことである。(無関係な抗原に対する特異性を有する)アイソタイプ適合mAbも、このアッセイ中のIL-4との結合の陰性対照として含めた。

【0369】

2.2 抗IL4 mAb-抗IL13 dAbとIL-13およびIL-4の結合
mAbdAb上清を、(方法2に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおけるヒトIL-4との結合に関して試験した。これらのデータは図17に示す(いくつかのサンプルを調製し、二連で試験し、これはサンプル1およびサンプル2として注記した)。

【0370】

図17は、すべてのこれらのmAbdAbがIL-4と結合したことを示す。精製抗ヒトIL4 mAbのみ(パスコリツマブ)をこのアッセイ中に含めたが、アッセイ中で使用するためにこのmAbを希釈したとき誤差が生じたので、結合曲線は作製しなかった(パスコリツマブをすべての他の後のIL-4結合ELISA中で首尾よく使用した)。精製抗ヒトIL13 mAbを、IL-4結合の陰性対照として含めた。

【0371】

同じmAbdAb上清を、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおけるヒトIL-13との結合に関しても試験した。これらのデータは図18に示す(いくつかのサンプルを調製し、二連で試験し、これはサンプル1およびサンプル2として注記した)。

【0372】

図18は、すべてのこれらの抗IL4 mAb-抗IL13 dAbがIL-13と結合したことを示す。精製抗ヒトIL13 mAb単独をこのアッセイ中に含めたが、アッセイ中で使用するためにこのmAbを希釈したとき誤差が生じたので、結合曲線は作製しなかった(精製抗ヒトIL13 mAbをすべての他の後のIL-13結合ELISA中で首尾よく使用した)。精製抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)をIL-13との結合の陰性対照として含めた。ここで留意すべきは、このdAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL13 dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイ中では試験しなかったことである。

【0373】

精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、「PascoH-G4S-474」、「PascoH-474」、「PascoL-G4S-474」および「PascoHL-G4S-474」は、(方法2に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおけるヒトIL-4との結合に関しても試験した。これらのデータは図19に示す。

【0374】

これらの精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAbはIL-4と結合した。これらのmAbdAbの結合活性は、精製抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)とほぼ同等(2倍以内)であった。(無関係な抗原に対する特異性を有する)アイソタイプ適合mAbも、このアッセイ中のIL-4との結合の陰性対照として含めた。

【0375】

これらの同じ精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474は、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおけるヒトIL-13との結合に関しても試験した。これらのデータは図20Aに示す。

【0376】

これらの精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAbはIL-13と結合した。(無関係な抗原に対する特異性を有する)アイソタイプ適合mAbも、このアッセイ中のIL-13との結合の陰性対照として含めた。ここで留意すべきは、dAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL13 dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbを陽性対照として使用して、このアッセイ中のIL-13結合を実証したことである。

【0377】

精製PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474およびPascoH-ELQLE-474は、方法17中に記載したのと同様に、直接結合ELISAにおけるカニクイザルIL-13との結合に関しても試験した(PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去もこのアッセイ中に含め、これらの分子の構築は実施例18に記載する)。代表的なデータを示すグラフは図20Bに示す。

【0378】

精製PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474およびPascoH-ELQLE-474は、いずれもカニクイザルIL-13と結合した。精製抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)は、IL-13との結合の陰性対照としてこのアッセイ中に含めた。精製抗ヒトIL13 mAbは、カニクイザルIL-13との結合の陽性対照として含めた。ここで留意すべきは、dAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbを陽性対照として使用して、このアッセイ中のIL-13結合を実証したことである。

【0379】

実施例３
表面プラズモン共鳴(BIAcore(商標))によるmAbdAbとヒトIL-13およびヒトIL-4の結合
3.1 BIAcore(商標)による抗IL13 mAb-抗IL4 dAbとIL-13およびIL-4の結合
mAbdAb(CHO細胞上清中、セクション1.5中に記載したのと同様に調製)を、(方法4に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-13との結合に関して試験した。このデータセット用に、2つのIL-13濃度曲線(100nMおよび1nM)を評価し、(およそ)1000と1300の間の相対的な応答捕捉レベルをそれぞれのmAbdAb構築物に関して得た。使用した限られた数の濃度のIL-13のため、生成したデータは正確な反応速度測定より構築物をランク付けするのにより適している。これらのデータは表6に示す。

【表6】

[この文献は図面を表示できません]

【0380】

すべてのこれらの抗IL13 mAb-抗IL4 dAbは、精製抗ヒトIL13 mAb単独の結合親和性とほぼ同等であった、類似した結合親和性でIL-13と結合した。これらのデータは、抗IL13 mAbの重鎖へのリンカーおよび/または抗IL4 dAbの付加は、これらのmAbdAb構築物内のmAb成分のIL-13結合親和性に影響を与えなかったことを示唆した。

【0381】

これらのmAbdAbは、(方法5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-4との結合に関しても試験した。これらのデータは表7に示す。このデータセット用に、4つのIL-4濃度曲線(512、128、32および8nM)を評価し、試験したそれぞれのmAbdAbに関するおよその相対的な応答捕捉レベルをこの表中に示す。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-4dAb単独はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)をこのアッセイ中のIL-4結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【表7】

[この文献は図面を表示できません]

【0382】

前述のデータセットの一部に関して注意すべき点が観察された。いくつかのデータセットに関して乏しい曲線フィッティングを観察し(^*)、これらのデータに関して決定した実際の結合親和性の値は、したがって注意深く処理しなければならない。いくつかの曲線に関して陽性解離が見られ(^**)、これらのデータに関して決定した実際の結合親和性の値は、したがって注意深く処理しなければならない。さらに、これらのmAbdAbとIL-4の非常に強い結合のために、BIAcore(商標)はDOM9-112-210dAbを含有するすべてのmAbdAb構築物に関するオンおよびオフレートを決定することができなかった(すなわち、十分な感度がなかった)。IL-4に対するこれらのmAbdAbの結合反応速度の決定は、観察した陽性解離効果によってさらに妨げられた。これらのデータは図21に示す。

【0383】

類似したデータを別の実験で得た。これらのデータは図22に示す。

【0384】

これら2つの独立したデータセットは、すべての抗IL13 mAb-抗IL4 dAbはIL-4と結合したが、抗IL4 dAbと抗IL13 mAb重鎖を連結するために使用したリンカーに応じて結合親和性が変わったことを示した。この実験では、リンカーの存在は、mAbdAb形式で(重鎖上に存在するとき)抗IL4 dAb成分のIL-4に対する結合親和性を高めることが分かった。例えば、TVAAPSまたはELQLEESCAEAQDGELDGリンカーを有する分子は、より強力な結合物質であるようである。mAbdAb構築物中に抗IL4 dAbが存在しなかったとき、IL-4との結合は観察されなかった。これらのmAbdAbのDOM9-112-210成分は非常に強く結合し、したがってオフレートはBIAcore(商標)を使用して決定するのに小さすぎるという事実のため、IL-4に対する586-リンカー-210mAbdAbの結合親和性を測定することはできなかった。

【0385】

精製抗IL13 mAb-抗IL4 dAbは、(方法4および5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-13およびヒトIL-4との結合に関しても試験した。これらのデータは表8に示す。

【表8】

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【0386】

586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154および586H-TVAAPS-210はいずれも類似した結合親和性でIL-13と結合し、これは精製抗ヒトIL13 mAb単独の結合親和性とほぼ同等であった。586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154および586H-TVAAPS-210はいずれもIL-4と結合した。このmAbdAbのDOM9-112-210成分は非常に強く結合し、したがってオフレートはBIAcore(商標)を使用して決定するのに小さすぎたという事実のため、IL-4に対する586-TVAAPS-210の結合親和性を測定することはできなかった。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-4dAb単独(DOM9-155-25、DOM9-155-154およびDOM9-112-210)はこのアッセイ形式では試験せず、その代わりに、抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)をこのアッセイ中のIL-4結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0387】

3.2 BIAcore(商標)による抗IL4 mAb-抗IL13 dAbとIL-4およびIL-13の結合
mAbdAb(CHO細胞上清中、セクション1.5中に記載したのと同様に調製)を、(方法5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-4との結合に関して試験した。これらのデータは表9に示す(いくつかのサンプルを二連で調製および試験し、これはサンプル1およびサンプル2として注記した)。このデータセット用に、4つのIL-4濃度曲線(100nM、10nM、1nMおよび0.lnM)を評価し、試験したそれぞれのmAbdAbに関するおよその相対的な応答捕捉レベルをこの表中に示す。(無関係な抗原に対する特異性を有する)アイソタイプ適合mAbも、このアッセイ中のIL-4との結合の陰性対照として含めた。

【表9】

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【0388】

試験した抗IL4 mAb-抗IL13 dAbのすべてが類似した結合親和性でIL-4と結合し、これは抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)の結合親和性とほぼ同等であった。PascoL-EPKSC-474は、パスコリツマブより約2倍弱くIL-4と結合した。これらのデータは、パスコリツマブの重鎖または軽鎖のいずれかへのリンカーおよび抗IL13 dAbの付加は、mAbdAb構築物内のmAb成分のIL-4結合親和性に影響を与えなかったことを示唆した。

【0389】

これらのmAbdAbは、(方法4に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-13との結合に関しても試験した。これらのデータは表10に示す(いくつかのサンプルを二連で調製および試験し、これはサンプル1およびサンプル2として注記した)。このデータセット用に、4つのIL-13濃度曲線(128nM、32nM、8nMおよび2nM)を評価し、試験したそれぞれのmAbdAbに関するおよその相対的な応答捕捉レベルをこの表中に示す。

【表10】

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【0390】

実験2で試験した構築物に関する結合親和性データは図23にも示す。

【0391】

すべての抗IL4 mAb-抗IL13 dAbがIL-13と結合した。大抵の場合、リンカーの存在は、抗IL4 mAbの重鎖上に存在したとき、抗IL13 dAb成分のIL-13に対する結合親和性は高めなかったようである。しかしながら、リンカーの存在は、抗IL4 mAbの軽鎖上に存在したとき、抗IL13 dAb成分のIL-13に対する結合親和性を高めたようである。PascoL-TVAAPS-474は、この実験中で最も強いIL-13結合親和性を有していたようである。

【0392】

ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-13dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、精製ヒト抗IL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。(無関係な抗原に対する特異性を有する)アイソタイプ適合mAbも、このアッセイ中のIL-13との結合の陰性対照として含めた。

【0393】

精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAbは、(方法4および5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-4およびヒトIL-13との結合に関しても試験した。これらのデータは表11に示す。

【表11】

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【0394】

この実験では、PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474はいずれも類似した結合親和性でIL-4と結合し、これは抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)の結合親和性とほぼ同等であった。これらはすべてIL-13とも結合した。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-13dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0395】

3.3 BIAcore(商標)を使用したIL-13およびIL-4と抗IL4 mAb-抗IL13 dAbの結合の化学量論値
精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAbは、(方法7に記載したのと同様に)BIAcore(商標)を使用してIL-13およびIL-4に関する結合の化学量論値に関して評価した。これらのデータは表12に示す。

【表12】

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【0396】

PascoH-G4S-474、PascoH-474およびPascoL-G4S-474は、IL-13の約2個の分子およびIL-4の2個の分子と結合することができた。PascoHL-G4S-474は、IL-4の約2個の分子およびIL-13の約4個の分子と結合することができた。これらのデータは、試験した構築物は、予想数のIL-13またはIL-4分子によって完全に占められる可能性があることを示した。

【0397】

実施例４
IL-13およびIL-4バイオアッセイにおけるmAbdAbの中和効力
4.1 抗IL13 mAb-抗IL4 dAb
精製抗IL13 mAb-抗IL4 dAbを、(方法8に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-13の中和に関して試験した。これらのデータは図24に示す。

【0398】

精製抗IL13 mAb-抗IL4 dAb、586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154および586H-TVAAPS-210は、TF-1細胞バイオアッセイにおいてIL-13の生物活性を完全に中和した。これらのmAbdAbの中和効力は、精製抗ヒトIL-13 mAb単独の2倍以内であった。精製抗ヒトIL-4mAb(パスコリツマブ)および精製抗IL-4dAb(DOM9-155-25、DOM9-155-154またはDOM9-112-210)は、このアッセイ中のIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。

【0399】

精製抗IL13 mAb-抗IL4 dAb、586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154および586H-TVAAPS-210は、(方法9に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-4の中和に関しても試験した。これらのデータは図25に示す。

【0400】

586H-TVAAPS-210は、このTF-1細胞バイオアッセイにおいてIL-4の生物活性を完全に中和した。このmAbdAbの中和効力は、精製抗ヒトIL-4dAb単独(DOM9-112-210)の2倍以内であった。586H-TVAAPS-25および586H-TVAAPS-154はIL-4の生物活性を中和せず、これは精製抗ヒトIL-4dAb単独(DOM9-155-25およびDOM9-155-154)と対照的であった。BIAcore(商標)によって実証したように、精製586H-TVAAPS-25および586H-TVAAPS-154は、IL-4に対して(それぞれ)1.1nMおよび0.49nMの結合親和性を有していた。IL-4はIL-4受容体と非常に強く結合し(約50pMの結合親和性が文献刊行物中で報告されている)、したがって、586H-TVAAPS-25または586H-TVAAPS-154の両方がTF-1細胞バイオアッセイにおいてIL-4の生物活性を効率よく中和することができなかったという観察結果は、IL-4受容体に対するIL-4の効力と比較した、IL-4に対するこれらのmAbdAbの相対的に低い親和性の結果である可能性がある。

【0401】

精製抗ヒトIL-4mAb(パスコリツマブ)は、このバイオアッセイ中のIL-4の中和に関する陽性対照として含めた。精製抗ヒトIL-13 mAbは、このバイオアッセイ中のIL-4の中和に関する陰性対照として含めた。

【0402】

4.2 抗IL4 mAb-抗IL13 dAb
精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474は、(方法9に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-4の中和に関して試験した。これらのデータは図26に示す。

【0403】

精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474は、TF-1細胞バイオアッセイにおいてIL-4の生物活性を完全に中和した。これらのmAbdAbの中和効力は、精製抗ヒトIL-4mAb(パスコリツマブ)のそれとほぼ同等であった。精製抗ヒトIL-13 mAb、精製DOM10-53-474dAb、および無関係な抗原に対する特異性を有するdAb(陰性対照dAb)も、このバイオアッセイ中のIL-4の中和に関する陰性対照として含めた。

【0404】

精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474は、(方法8に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-13の中和に関して試験した。これらのデータは図27に示す。

【0405】

精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474は、TF-1細胞バイオアッセイにおいてIL-13の生物活性を完全に中和した。これらのmAbdAbの中和効力は、精製抗IL13 dAb単独(DOM10-53-474)の3倍以内であった。精製抗ヒトIL-13 mAbも、このバイオアッセイ中のIL-13の中和に関する陽性対照として含めた。無関係な抗原に対する特異性を有するdAb(陰性対照dAb)および精製抗ヒトIL-4mAb単独(パスコリツマブ)も、このバイオアッセイ中のIL-4の中和に関する陰性対照として含めた。

【0406】

精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474およびPascoHL-G4S-474は、(方法10に記載したのと同様に)二重中和TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-4とヒトIL-13の同時中和に関しても試験した。これらのデータは図28に示す。

【0407】

精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-G4S-474、PascoH-474、Pasco-L-G4S-474およびPascoHL-G4S-474は、二重中和TF-1細胞バイオアッセイにおいてIL-4とIL-13の両方の生物活性を完全に中和した。これらのmAbdAbの中和効力は、精製抗ヒトIL-4mAb(パスコリツマブ)と精製抗IL13 dAb(DOM10-53-474)の組合せのそれとほぼ同等であった。(陰性対照として含めた)精製抗ヒトIL-13 mAb単独、精製抗ヒトIL-4mAb単独(パスコリツマブ)および精製抗IL13 dAb(DOM10-53-474)単独は、この二重IL-4およびIL-13中和バイオアッセイにおいてIL-4とIL-13の両方の生物活性を完全には中和しなかった。

【0408】

実施例５
dAbのSEC-MALLS分析
抗原特異的dAbを、SEC-MALLS(サイズ排除クロマトグラフィー-マルチアングルレーザー光散乱測定)によりそれらの溶液中状態によって特徴付け、結果は表13に示す。DOM10-53-474、dAbは溶液中にモノマーとして存在し、一方すべてのDOM9 dAb(DOM9-112-210、DOM9-155-25、DOM9-155-147およびDOM9-155-154)は安定した二量体(およびいくつかの場合は四量体)を形成することができる。

【0409】

5.1. タンパク質の調製
サンプルを精製し、適切なバッファー、例えばPBSに透析した。透析後にサンプルを濾過し、濃度を決定した(0.43mg/mlのDOM-155-25)、(1.35mg/mlのDOM9-155-147)および1.4mg/mlのDOM9-155-159)。DOM10-53-474およびDOM9-112-210は1mg/mlに調節した。
BSAはSigmaから購入し、さらに精製せず使用した。

【0410】

5.2. サイズ排除クロマトグラフィーおよび検出器設定
オートサンプラー(SIL-20A)およびSPD-20A Prominence UV/Vis検出器を有するShimadzu LC-20AD Prominence HPLCシステムを、Wyatt Mini Dawn Treos(MALLS、マルチアングルレーザー光散乱検出器)およびWyatt Optilab rEX DRI(示差屈折率)検出器に接続した。検出器は以下の順: LS-UV-RIで接続した。RIとLS装置の両方を488nmの波長で操作した。いずれもpH7.4での50mMリン酸バッファー(塩なし)、または1×PBSの移動相を有する、TSK2000(Tosoh corporation))カラムを使用した(シリカ系HPLCカラム)。使用した流速は0.5または1ml/分であり、作業の時間を調節して異なる流速を反映し(45分または23分)、分子の分離に対して有意な影響を有するとは予想しなかった。タンパク質はバッファー中で1mg/mlの濃度に調製し、注入体積は100ulであった。

【0411】

5.3. 検出器キャリブレーション
光散乱検出器を、製造者の説明書に従いトルエンを用いて調整した。

【0412】

5.4. BSAを用いた検出器キャリブレーション
UV検出器アウトプットおよびRI検出器アウトプットを、全3個の検出器からのシグナルをWyatt ASTRAソフトウェアで同時に回収することが可能であるように、光散乱測定装置に接続した。PBSの移動相中へのBSAの数回の注入(1ml/分)は、Tosoh TSK2000カラムならびにWyattソフトウェアによって回収したUV、LSおよびRIシグナルで実施する。次いでASTRAソフトウェアを使用して痕跡を分析し、シグナルは正常アラインメント化し、製造者の説明書に従いバンド拡大を補正する。次いでキャリブレーション定数を平均化し、後のサンプル実験に使用する鋳型にインプットする。

【0413】

5.5. 絶対的モル質量の計算
100ulのそれぞれのサンプルを適切な予め平衡化したカラムに注入した。

【0414】

SECカラム後、サンプルは3つのオンライン検出器-UV、MALLS(マルチアングルレーザー光散乱)およびDRI(示差屈折率)を通過し、絶対的モル質量の決定が可能となる。カラムで行う希釈は約10倍であり、溶液中状態の濃度を必要に応じて決定した。

【0415】

バッチサンプル形式で実施されることが多いASTRA中の計算およびZimmプロット技法の原理は、Zimm[J.Chem.Phys.16、1093〜1099(1948)]からの等式である:

【数1】

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【0416】

上式で
・cは溶媒中の溶質分子の質量濃度(g/mL)であり、
・Mは重量平均モル質量(g/mol)であり、
・A₂は第2ビリアル係数(mol mL/g²)であり、
・K^*=4p²n₀²(dn/dc)²l₀^-4N_A^-1は光学定数であり、n₀は入射放射線(真空)波長における溶媒の屈折率であり、l₀はナノメートルで表した入射放射線(真空)波長であり、N_Aは6.022×10²³mol^-1に等しいアボガドロ数であり、かつdn/dcはmL/gで表した溶質濃度の変化に対する溶媒-溶質溶液の示差屈折率の増加であり(この因子はdRI検出器を使用して別個に測定しなければならない)、
・P(q)は、

【数2】

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【0417】

にほぼ等しい理論的に導いた形状因子であり、かつ<r²>は平均二乗半径である。P(q)は分子のz-平均サイズ、形状、および構造の関数である。
・R_qは過剰なレイリー比(cm^-1)である。

【0418】

この等式は垂直に偏光した入射光を想定し、次数c²に有効である。

【0419】

R_q/K^*c vs.sin²(q/2)に適合するZimm適合法で計算を実施するために、本発明者らは等式1の一次数cの逆数を展開する必要がある:
R_q/K^*c vs.sin2(q/2)に適合するZimm適合法で計算を実施するために、本発明者らは等式1の一次数cの逆数を展開する必要がある:

【数3】

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【0420】

この場合の適切な結果は

【数4】

[この文献は図面を表示できません]

【0421】

および

【数5】

[この文献は図面を表示できません]

【0422】

上式で

【数6】

[この文献は図面を表示できません]

【0423】

である。

【0424】

計算はASTRAソフトウェアによって自動的に実施し、それぞれの部分に関して決定したモル質量とのプロットをもたらす[Astraマニュアル]。

【0425】

クロマトグラムで観察したそれぞれのピークに関するプロットから得たモル質量を、一単位のタンパク質の予想分子質量と比較した。これは、タンパク質の溶液中状態に関する結論を出す根拠を与える。代表的なデータは表13に示す。

【表13】

[この文献は図面を表示できません]

【0426】

DOM10-53-474
溶液中でのモノマー状態を示す約14kDaとして定義した平均モル質量を有する単一ピークを図29に示す。

【0427】

DOM9-112-210
溶液中での二量体状態を示す30kDaとして定義したモル質量を有する単一ピークを図30に示す。

【0428】

DOM9-155-25
美しい対称ピーク、ただしバッファーフロントで実施。ピークの中央部分をモル質量の決定に使用した(全3個のシグナルの重複に関しては以下の図参照)。モル質量は二量体dAbを表す28kDaであり、図31に示す。全3個のシグナルの重ね合わせ(図32)。

【0429】

DOM9-155-147
主要ピークはピークの右部分において26kDaのモル質量に割り当て、ピークの左部分において53kDaまで急激に増大する。このピークは、迅速平衡中の二量体およびごくわずかな四量体を表す可能性が最も高い。7.6分で溶出したはるかに小さなピークは、51kDaのモル質量を有する四量体タンパク質を表す(図33)。

【0430】

DOM9-155-159
約28kDaで割り当てた平均モル質量を有する1つの対称ピークとして現れたタンパク質は、溶液中で二量体状態を示す(図34)。

【0431】

SEC-MALLSによるMW割り当ての対照:BSA
前述のそれぞれの実験に関する各BSAの実施は、予想MW、例えば67および145kDa(モノマーおよび二量体)のモル質量を有する2ピークをもたらした(図35)。

【0432】

実施例６
三重特異性mAbdAbの作製
アセンブリーPCRによってVHおよびVL配列を作製し次いでそれらを既存のmAbdAb発現ベクターにクローニングすること、または発現時に三重特異性mAbdAbが重鎖と軽鎖の両方のC末端と結合したdAbを有するように、mAb発現ベクターから既存のmAbdAb発現ベクターに既存のVHおよびVL領域をサブクローニングすることのいずれかによって、三重特異性mAb-dAbを構築した。

【0433】

リンカー配列を使用してドメイン抗体を重鎖CH3または軽鎖CKに接合した。三重特異性mAbdAb分子の略図は図36に示す(mAb重鎖は灰色で描き、mAb軽鎖は白色で描き、dAbは黒色で描く)。

【0434】

三重特異性mAbdAb重鎖(上図)および三重特異性mAbdAb軽鎖(下図)の構築を示す略図を以下に示す。

【化4】

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【0435】

重鎖に関して、用語「V_H」はモノクローナル抗体可変重鎖配列であり、「CH1、CH2およびCH3」はヒトIgG1重鎖定常領域配列であり、「リンカー」は使用した特異的リンカー領域の配列であり、「dAb」はドメイン抗体配列である。軽鎖に関しては、用語「V_L」はモノクローナル抗体可変軽鎖配列であり、「Cκ」はヒト軽鎖定常領域配列であり、「リンカー」は使用した特異的リンカー領域の配列であり、「dAb」はドメイン抗体配列である。

【0436】

(配列番号64で示すような)哺乳動物アミノ酸シグナル配列をこれらの構築物の作製において使用した。

【0437】

6.1 三重特異性抗ILI8mAb-抗IL4 dAb-抗IL13 dAb
(IL18 mAb-210-474としても知られる)三重特異性抗IL18 mAb-抗IL4 dAb-抗IL13 dAbを、抗ヒトIL-4ドメイン抗体(DOM9-112-210)をコードする配列を重鎖をコードする配列に、および抗IL13ドメイン抗体(DOM10-53-474)をコードする配列を抗ヒトIL-18ヒト化モノクローナル抗体の軽鎖をコードする配列に移植することによって構築した。G4Sリンカーを使用して抗IL4ドメイン抗体をモノクローナル抗体の重鎖に連結した。G4Sリンカーをさらに使用して、抗IL13ドメイン抗体をモノクローナル抗体の軽鎖に連結した。

【0438】

IL18 mAb-210-474はCHOK1細胞上清中で一時的に発現され、かつ細胞上清のIL18 mAb-210-474の定量化後、複数のIL-18、IL-4およびIL-13結合アッセイにおいて分析した。

【表14】

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【0439】

6.2 三重特異性抗IL5 mAb-抗IL4 dAb-抗IL13 dAb
(Mepo-210-474としても知られる)三重特異性抗IL5 mAb-抗IL4 dAb-抗IL13 dAbを、抗ヒトIL-4ドメイン抗体DOM9-112-210をコードする配列(配列番号4)を抗ヒトIL-5ヒト化モノクローナル抗体の重鎖をコードする配列(配列番号65)に移植することによって、および抗IL13ドメイン抗体DOM10-53-474をコードする配列(配列番号5)を抗ヒトIL-5ヒト化モノクローナル抗体の軽鎖をコードする配列(配列番号66)に移植することによって構築した。G4Sリンカーを使用して抗IL4ドメイン抗体をモノクローナル抗体の重鎖に連結した。G4Sリンカーをさらに使用して、抗IL13ドメイン抗体をモノクローナル抗体の軽鎖に連結した。

【0440】

このmAbdAbはCHOK1およびHEK293-6E細胞上清中で一時的に発現され、かつ細胞上清における定量化後、複数のIL-4、IL-5およびIL-13結合アッセイにおいて分析した。

【表15】

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【0441】

6.3 モノクローナル抗体、ドメイン抗体およびリンカーの配列
三重特異性mAbdAbを作製するために使用した(または以下の例証中で対照試薬として使用した)モノクローナル抗体、ドメイン抗体およびリンカーに関する配列を以下の表14に示す。

【表16】

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【0442】

成熟ヒトIL-4アミノ酸配列(シグナル配列なし)は配列番号62として示す。

【0443】

成熟ヒトIL-13アミノ酸配列(シグナル配列なし)は配列番号63として示す。

【0444】

6.4 三重特異性mAbdAbの発現および精製
三重特異性mAbdAb分子をコードするDNA配列を、標準的な分子生物学の技法を使用して哺乳動物発現ベクター(RIn、RIdまたはpTT)にクローニングした。三重特異性mAbdAb発現構築物はCHOK1またはHEK293-6E細胞の一方または両方に一時的にトランスフェクトし、小規模(3mls〜150mls)で発現させた。三重特異性mAbdAbを作製するために使用した発現手順は、モノクローナル抗体を発現させるために通常使用される手順と同じであった。

【0445】

いくつかの構築物は固定化プロテインAカラムを使用して精製し、280nmで吸光度を読み取ることによって定量化した。

【0446】

実施例７
ELISAによる三重特異性mAbdAbとヒトIL-4、ヒトIL-13およびヒトIL-18の結合
7.1 ELISAによるIL-l8 mAb-210-474とIL-4、IL-13およびIL-18の結合
実施例6に記載したのと同様に調製した三重特異性mAbdAbIL18 mAb-210-474(上清)(配列番号69および70)を、(方法1、2および3に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-18、ヒトIL-13およびヒトIL-4との結合に関して試験し、これらのデータはそれぞれ図37、38および39に示す(IL18 mAb-210-474を調製し、数回試験し、これはサンプル1、サンプル2、サンプル3などとして図中に注記した)。

【0447】

これらの図は、ELISAによりIL-l8mAb-210-474とIL-4、IL-13およびIL-18が結合したことを示す。精製抗ヒトIL18 mAbは、IL-18結合の陽性対照としてIL-18結合ELISA中に含めた。dAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL-4dAb(DOM9-112-210)はIL-4結合ELISAでは試験せず、その代わりに、精製抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)を陽性対照として使用して、このELISA中のIL-4結合を実証した。このdAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL-13dAb(DOM10-53-474)はIL-13結合ELISAでは試験せず、その代わりに、精製抗ヒトIL-13 mAbをこのELISA中のIL-13結合を実証するための陽性対照として含めた。これらの図中に示すように、無関係な抗原に対する陰性対照mAbをそれぞれの結合ELISA中に含めた。

【0448】

それぞれのELISA中で、IL18 mAb-210-474サンプル5の結合曲線は他のIL18 mAb-210-474サンプルの結合曲線と離れている。この理由は分からないが、しかしながら、この特定のIL18 mAb-210-474サンプル5のヒトIgG定量化ELISAにおける定量化の問題に原因がある可能性がある。

【0449】

7.2 ELISAによるMepo-210-474とIL-4およびIL-13の結合
セクション1に記載したのと同様に調製した三重特異性mAbdAbMepo-210-474(上清)(配列番号71および72)を、(それぞれ方法1および2に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13およびヒトIL-4との結合に関して試験し、これらのデータはそれぞれ図40および41に示す(Mepo-210-474を調製し、四連で試験し、これはサンプル1、サンプル2、サンプル3およびサンプル4として図中に注記した)。

【0450】

これらの図は、ELISAによりMepo-210-474とIL-4およびIL-13が結合したことを示す。このdAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL-4dAb(DOM9-112-210)はIL-4結合ELISAでは試験せず、その代わりに、精製抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)を陽性対照として使用して、このELISA中のIL-4結合を実証した。このdAbは二次検出抗体によって検出不能であるので、抗IL-13dAb(DOM10-53-474)はこのIL-13結合ELISAでは試験せず、その代わりに、精製抗ヒトIL-13 mAbをこのELISA中のIL-13結合を実証するための陽性対照として含めた。図40および41に示すように、無関係な抗原に対する陰性対照mAbsをそれぞれの結合ELISA中に含めた。

【0451】

Mepo-210-474サンプル1およびサンプル2を1つの一時的トランスフェクション実験中で調製し、Mepo-210-474サンプル3およびサンプル4は他の別個の一時的トランスフェクション実験中で調製した。全4個のサンプルが、IL-13およびIL-4結合ELISAにおいてIL-13およびIL-4と結合した。しかしながら、サンプル1および2とサンプル3および4の異なる結合プロファイルに関する理由は分からないが、それぞれのトランスフェクション実験中で作製したmAbdAb(上清中)の質の違いを反映する可能性がある。

【0452】

実施例８
表面プラズモン共鳴(BIAcore(商標))による三重特異性mAbdAbとヒトIL-4、ヒトIL-5、ヒトIL-13およびヒトIL-18の結合
8.1 BIAcore(商標)によるIL-18mAb-210-474とIL-4、IL-13およびIL-18の結合
実施例6.1に記載したのと同様に調製した三重特異性mAbdAbIL18Ab-210-474(上清)(配列番号69および70)を、(それぞれ方法4、5および6に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-4、ヒトIL-13およびヒトIL-18との結合に関して試験した。応答捕捉レベルは約400〜850応答単位の範囲内であった。それぞれのアナライトの3種類の濃度を試験した(256、32および4nM)。生成したデータは表15に示す(サンプルを調製し、三連で試験し、これはサンプル1、サンプル2、およびサンプル3として注記した)。

【表17】

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【0453】

BIAcore(商標)を使用して三重特異性mAbdabはIL-4、IL-13およびIL-18と結合した。IL-18に対するmAbdAbの結合親和性は、IL-18結合の陽性対照としてmAbdabの結合親和性と直接比較するためにこのアッセイ中に含めた、精製抗ヒトIL18 mAb単独のそれとほぼ同等であった。この三重特異性mAbdAbのDOM9-112-210成分はIL-4と非常に強く結合し、したがってオフレートはBIAcore(商標)を使用して決定するのに小さすぎたという事実のため、IL-4に対するmAbdabの絶対的結合親和性を測定することはできなかった。このdAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-4 dAb単独(DOM9-112-210)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)をこのアッセイ中のIL-4結合を実証するための陽性対照として含めた。このdAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として含めた。

【0454】

8.2 BIAcore(商標)によるMepo-210-474とIL-4、IL-5およびIL-13の結合
実施例6.2中に記載したのと同様に調製した三重特異性mAbdAbMepo-210-474(上清)(配列番号71および72)を、(それぞれ方法5、11および4に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用してヒトIL-4、ヒトIL-5およびヒトIL-13との結合に関して試験した。応答捕捉レベルは約550〜900応答単位の範囲内であった。IL-4およびIL-13結合に関して、各アナライトの5つの濃度を試験した(256、64、16、4および1nM)。IL-5結合に関して、各アナライトの4つの濃度を試験した(64、16、4および1nM)。生成したデータは表16に示す。

【表18】

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【0455】

BIAcore(商標)を使用してMepo-210-474はIL-4、IL-5およびIL-13と結合した。IL-5に対するMepo-210-474の結合親和性は、IL-5結合の陽性対照としてMepo-210-474の結合親和性と直接比較するためにこのアッセイ中に含めた、精製抗ヒトIL5 mAb(メポリズマブ)単独のそれとほぼ同等であった。この三重特異性mAbdAbのDOM9-112-210成分はIL-4と非常に強く結合し、したがってオフレートはBIAcore(商標)を使用して決定するのに小さすぎたという事実のため、IL-4に対するMepo-210-474の絶対的結合親和性を測定することはできなかった。このdAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL4 dAb単独(DOM9-112-210)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)をこのアッセイ中のIL-4結合を実証するための陽性対照として含めた。このdAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として含めた。

【0456】

実施例９
化学量論
9.1 BIAcore(商標)を使用したIL-4、IL-13およびIL-18とIL-18mAb-210-474の結合の化学量論値
IL18 mAb-210-474(CHO細胞上清中、セクション1に記載したのと同様に調製した)(配列番号69および70)を、(方法7に記載したのと同様に)BIAcore(商標)を使用したIL-4、IL-13およびIL-18の結合の化学量論値に関して評価した。これらのデータは表17に示す(R-maxは飽和結合応答性であり、方法7に与えた式の通り、これは化学量論値を計算するのに必要とされる)。それぞれのサイトカインの濃度は500nMであった。注入部位は、それぞれのサイトカインを加えた順序を指す。

【表19】

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【0457】

化学量論値データは、IL18 mAb-210-474はIL-18の約2個の分子、IL-13の2個の分子およびIL-4の1分子のみと結合したことを示した。抗IL4 dAb単独(DOM9-112-210)は溶液状態で二量体であることが知られており、IL-4の1分子のみと結合することができる。したがって、IL18 mAb-210-474はIL-4の1分子のみと結合すると予想される。これらのデータは、試験した分子は、予想数のIL-18、IL-13およびIL-4分子によって完全に占められる可能性があることを示した。化学量論値データは、サイトカインの捕捉の順序はサイトカインの添加の順序とは無関係であるらしいことも示した。

【0458】

実施例１０
10.1 二重標的化抗TNF/抗EGFR mAbdAbの作製
この二重標的化mAbdAbは、mAb重鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗TNF mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。クローニングに使用した制限部位を以下に示す(図42)。

【0459】

重鎖中のdAb挿入用の制限部位を導入するために、部位特異的突然変異誘発を使用し、鋳型としてmAb重鎖発現ベクターを使用してSalIおよびHindIIIクローニング部位を作製した。次いで、抗EGFR dAb(DOM16-39-542)をコードするDNAをPCRによって(SalIおよびHindIII末端をコードするプライマーを使用して)増幅し、修飾3'コード領域中に挿入し、mAbとdAbの間に「STG」(セリン、スレオニン、グリシン)のリンカーをもたらした。

【0460】

それぞれ軽鎖および重鎖の配列を確認したクローン(配列番号170および169)を選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模調製した。軽鎖と重鎖(配列番号73および74)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物細胞HEK293-6E細胞中でmAbdAbを発現させた。

【0461】

10.2 二重標的化抗TNF/抗EGFR mAbdAbの精製およびSEC分析
抗TNF/抗EGFR mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルのSDS-PAGE分析(図43)は約170kDaで実施した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で実施した2つのバンドを示す。

【0462】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗TNF/抗EGFR mAbdAbを、事前に平衡化した(Akta Express FPLCシステムと結合した)Superdex-20010/30HRカラムに施し、0.5m/分においてPBS中で実施した。SECプロファイルは、対称ピークとして現れる1種を示す(図44)。

【0463】

10.3 二重標的化抗TNF/抗EGFR mAbdAbの結合親和性
EGFRおよびTNFに対する結合親和性を、それぞれ方法13および14に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAbの抗EGFR効力(図45)は39.1nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは3.4nMのEC50値を得た。抗TNFバイオアッセイ(図46)において、mAbdAbの効力は3pM(0.0028nM)であり、一方抗TNF対照mAbは104pMのEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例10の構築物、二重標的化抗TNF/抗EGFR mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0464】

10.4 二重標的化抗TNF/抗EGFR mAbdAbのラットPK
この分子をラットでのそのin vivo薬物動態特性に関して試験した。抗TNF/抗EGFR mAbdAbを3匹のラットに静脈内投与し、7日間(168時間)で血清サンプルを回収した。投与後の様々な時点で残存した薬剤の濃度は、TNFとEGFRの両方に対するELISAによって評価した。結果は図125に示す。

【0465】

PKパラメータによって、非修飾アダリムマブ(125時間)に関して前に観察したのと同じ領域において、この分子が長い半減期を有していたことを確認した。さらなる詳細は表17.1に示す。

【表20】

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【0466】

実施例１１
11.1 二重標的化抗TNF/抗VEGF mAbdAbの作製
抗TNF/抗VEGF mAbdAbを、実施例10に関して記載したのと同様の戦略を利用して生成した。重鎖発現カセットの構築用に、実施例10の重鎖をコードするベクターDNAを出発地点として得た。制限酵素SalIおよびHindIIIを使用して抗EGFR dAbを切除した。DOM15-26-593、抗VEGF dAbは、PCRによって(SalIおよびHindIII末端をコードするプライマーを使用して)増幅し、同じ制限部位を使用して切除した抗EGFR dAbを前に有していたベクター骨格に連結させ、mAbとdAbの間に「STG」(セリン、スレオニン、グリシン)のリンカーをもたらした。

【0467】

配列を確認したクローン(それぞれ軽鎖および重鎖の配列番号169および168)を選択し、大規模なDNA調製物を作製し、軽鎖と重鎖(配列番号73および75)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物HEK293-6E細胞中で抗TNF/抗VEGF mAbdAbを発現させた。

【0468】

11.2 二重標的化抗TNF/抗VEGF mAbdAbの精製およびSEC分析
抗TNF/抗VEGF mAbdAb(DMS4000と称する)を、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルのSDS-PAGE分析(図47)は約170kDaで実施した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で実施した2つのバンドを示す。

【0469】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗TNF/抗VEGF mAbdAbを、事前に平衡化した(Akta Express FPLCシステムと結合した)Superdex-20010/30HRカラムに供し、0.5m/分においてPBS中で実施した。SECプロファイルは、対称ピークとして現れる1種を示す(図48)。

【0470】

11.3 二重標的化抗TNF/抗VEGF mAbdAbの結合親和性
VEGFおよびTNFに対する結合親和性を、それぞれ方法12および14に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAbの抗VEGF効力(図49)は57pMであると計算し、一方で対照、抗VEGF mAbは366pMのEC50値を得た。抗TNFバイオアッセイ(図50)において、効力は10pMであり、一方抗TNF対照mAbは22pMのEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例11の分子、二重標的化抗TNF/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0471】

11.4 二重標的化抗TNF/抗VEGF mAbdAbのラットPK
この分子をラットでのそのin vivo薬物動態特性に関して試験した。抗TNF/抗VEGF mAbdAbを3匹のラットに静脈内投与し、10日間(240時間)で血清サンプルを回収した。投与後の様々な時点で残存した薬剤の濃度は、TNFとEGFRの両方に対するELISAによって評価した。結果は図126に示す。

【0472】

PKパラメータによって、この分子が、非修飾アダリムマブのそれに匹敵するin vivo薬物動態特性を有していたことを確認した。VEGF成分に関して観察した短いt_1/2βは有意であるとは考えられず、アッセイのアーチファクトであり得る。さらなる詳細は表17.2に示す。

【表21】

[この文献は図面を表示できません]

【0473】

11.5 別の抗TNF/抗VEGF mAbdAbの作製
別の抗TNF/抗VEGF mAbdAbを、STGリンカーを使用して重鎖のC末端上のVEGF dAbと連結した同じ抗TNF mAbを使用して、実施例11.1で前に記載した方法と同様の方法で構築した。この場合使用した抗VEGF dAbはDOM15-10-11であった。軽鎖と重鎖(配列番号73および185)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物HEK293-6E細胞中でこの分子を発現させた。この分子を発現させて、実施例11.2に記載したのと同様の発現レベルのmAbdAbを与えたが、しかしながら、実施例11.3に記載したのと同じVEGFアッセイ中で効力に関して試験すると、このアッセイでVEGF受容体とのVEGF結合の検出不能レベルの阻害があったことが分かった。

【0474】

実施例１２
12.1 二重標的化抗VEGF/抗IL1R1 dAb伸長IgGの作製
2つの二重標的化dAb伸長IgG分子を、dAbと両鎖の定常領域の間へのダミーVドメインコード領域の挿入の戦略に従い、標準的な分子生物学の技法を使用して構築した。

【0475】

軽鎖のために、抗IL1R1 dAbであるDOM4-130-54をSalIおよびBsiWI部位を有する発現カセットに事前にクローニングして(図51)、dAb-Ck鎖を生成した。dAb伸長IgG軽鎖を生成するために、ダミーVk領域を、両末端にBsiWIをコードするプライマーを用いてPCRによって増幅した。dAb-Ck発現カセットを含有するプラスミドはBsiWIで消化した。BsiWIで消化したダミーVkドメインをこれに連結させて、2つの可変ドメイン間に「TVAAPS」のリンカーを有するdAb伸長IgG軽鎖を生成した。

【0476】

同一の戦略を続けて、NheI末端を有するPCR増幅ダミーVHドメインをdAb DOM15-26とCH1の間のNheI消化dAb重鎖に連結し(図51)、2つの可変ドメイン間に「ASTKGPS」のリンカーを有するdAb伸長IgG重鎖を生成した。

【0477】

これはDMS2090と称し、配列番号163(DNA配列番号162)で述べる配列を有する。これを配列番号77(DNA配列番号171)で述べる軽鎖と組み合わせた。

【0478】

第2の重鎖を同じ方法で、ただしdAb DOM15-26-593を使用して構築した。これはDMS2091と称し、配列番号76(DNA配列番号172)で述べる配列を有する。これを配列番号77(DNA配列番号171)で述べる軽鎖と組み合わせた。

【0479】

配列を確認したクローンを選択し、大規模なDNA調製物を製造者のプロトコルに従いQiagen MaxiまたはMega Prepキットを使用して作製した。生成した構築物は、軽鎖および重鎖の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して哺乳動物細胞中で発現させた。

【0480】

12.2 二重標的化抗VEGF/抗IL1R1 mAbdAbの精製およびSEC分析
両方の抗IL1R1/抗VEGF dAb伸長IgG分子を、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。DMS2090に関するSDS-PAGE分析は図52中に示し、DMS2091に関するSDS-PAGE分析は図53に示す。両方の精製サンプルは190kDaで実施した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれdAb伸長軽鎖および重鎖に対応する35および60kDaで実施した2つのバンドを示す。

【0481】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗VEGF/抗IL1R1 dAb伸長IgGを、事前に平衡化した(Akta Express FPLCシステムと結合した)Superdex-20010/30HRカラムに供し、0.5m/分においてPBS中で実施した。DMS2090に関するSECプロファイル(図54)およびDMS2091に関するSECプロファイル(図55)はいずれも、対称ピークとして現れる1種を示す。

【0482】

12.3 二重標的化抗VEGF/抗IL1R1 mAbdAbの結合親和性
VEGFおよびIL1R1に対する結合親和性を、それぞれ方法12および15に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。DMS2090の抗VEGF効力(図57)は158.4pMであると算出され、一方で対照、抗VEGF mAbは689.2pMのEC50値を得た。DMS2091の抗VEGF効力(図56)は55pMであると算出され、一方で対照、抗VEGF mAbは766pMのEC50値を得た。

【0483】

抗IL1R1バイオアッセイにおいて、DMS2090の効力(図58)は32pMであり、一方抗IL1R1対照mAbは35pMのEC50をもたらした。DMS2091の効力(図59)は17.47pMであり、一方抗IL1-R1対照mAbは35.02pMのEC50をもたらした。

【0484】

結論として、アッセイデータは、実施例12の分子、二重標的化抗IL1R1/抗VEGFdAb伸長IgGは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0485】

12.4 二重標的化抗VEGF/抗IL1R1 mAbdAbのラットPK
この分子をラットでのそのin vivo薬物動態特性に関して試験した。抗IL1R1/抗VEGF dAb伸長IgGAを3匹のラットに静脈内投与し、7日間(168時間)で血清サンプルを回収した。投与後の様々な時点で残存した薬剤の濃度は、IL1R1とVEGFの両方に対するELISAによって評価した。結果は図127に示す。

【0486】

PKパラメータは表17.3に示す。

【表22】

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【0487】

実施例１３
13.1 三重標的化抗TNF/抗VEGF/抗EGFR mAbdAbの作製
三重標的化mAbを、標準的な分子生物学の技法を使用して、dAbと両鎖の定常領域の間のmAb Vドメインコード領域の挿入の戦略に従い構築した。

【0488】

軽鎖用に、抗EGFR dAbであるDOM16-39-542をSalIおよびBsiWI部位を有する発現カセットに事前にクローニングして(図15)、dAb-Ck鎖を生成した。mAbdAb軽鎖を生成するために、mAbVL領域を、両末端にBsiWIをコードするプライマーを用いてPCRによって増幅した。dAb-Ck発現カセットを含有するプラスミドはBsiWIで消化した。BsiWIで消化したmAbVLドメインをこれに連結させて、mAbdAb軽鎖を生成し、2つの可変ドメイン間に「TVAAPS」のリンカーをもたらした。

【0489】

同一の戦略を続けて、NheI末端を有するPCR増幅mAbVH領域がdAb(DOM15-26)とCH1の間のNheI消化dAb重鎖ベクターに連結したmAbdAb重鎖を生成し(図60)、2つの可変ドメイン間に「ASTKGPS」のリンカーをもたらした。

【0490】

配列を確認したクローン(それぞれ重鎖および軽鎖のアミノ酸配列番号78および79)を選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模なDNA調製物を作製した。軽鎖と重鎖の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物細胞中でmAbdAbを発現させた。

【0491】

13.2 三重標的化抗TNF/抗VEGF/抗EGFR mAbdAbの精製
抗TNF/抗VEGF/抗EGFR mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルのSDS-PAGE分析(図61)は190kDaで実施した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれdAb伸長軽鎖および重鎖に対応する35および60kDaで実施した2つのバンドを示す。

【0492】

13.3 三重標的化抗TNF/抗VEGF/抗EGFR mAbdAbの結合親和性
VEGF、EGFRおよびTNFに対する結合親和性を、それぞれ方法12、13および14に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAbの抗VEGF効力(図62)は1.885mMであると算出され、一方で対照、抗VEGF mAbは0.145nMのEC50値を得た。

【0493】

抗TNFバイオアッセイにおいて(図63)、効力は87pMであり、一方抗TNF対照mAbは104pMのEC50をもたらした。抗EGFRアッセイ(図64)では、三重標的化mAbdAbは約300nMで約20％の阻害をもたらした。VEGFおよびTNF結合に関してEC50値を計算したが、EGFR結合に関しては、EC50値を計算するための完全な曲線は生成しなかった。

【0494】

実施例１４
IGF-1R/VEGF mAbdAb
14.1 IGF-1R/VEGF mAbdAbの構築
抗IGF-1R可変重鎖および可変軽鎖遺伝子配列を、重複オリゴヌクレオチドのPCRからde novoで最初に構築した。これらの領域を、標準的な分子生物学の技法を使用して哺乳動物発現ベクターにおいてヒトIgG1またはκ定常領域と融合させた。抗VEGFドメイン抗体の遺伝子配列を重複オリゴヌクレオチドを使用したPCRによって同様に構築し、前に記載した抗IGF-1R成分の重鎖または軽鎖のいずれかの遺伝子の3'末端と融合させた。この融合体は、抗体とドメイン抗体成分の間に2つのアミノ酸(GS)リンカーまたは8アミノ酸(TVAAPSGS)リンカーのいずれかを取り込んだ。抗体重鎖および軽鎖もドメイン抗体およびリンカー配列なしで構築した。製造者のプロトコルに従いEndofree Qiagen Maxiprepキットを使用した大規模なDNA調製用に配列を確認したクローンを選択した。

【0495】

配列番号108、109、111および112の配列において、抗体とドメイン抗体の間のリンカー配列の位置に下線を引く。別の変異体は、リンカーを完全に除去することによって、または異なるリンカーを使用することによって構築することができた。他の適切なリンカーの例は配列番号6および8〜11として示す。表18は構築および発現した抗体の一覧を示す。

【表23】

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【0496】

実施例１４．２
IGF-1R/VEGF mAbdAbの発現、精製およびSECプロファイル
重鎖ベクターと軽鎖ベクターの組合せを、HEK293-6Eの一過性トランスフェクションにおいて発現させた。簡潔には、50mlのHEK293-6E細胞を1.5×10⁶個細胞/mlで、293fectin試薬(Invitrogen#51-0031)と事前にインキュベートした25μgの重鎖および25μgの軽鎖プラスミドでトランスフェクトした。細胞は振とうインキュベーター、37℃、5％CO₂、および95％相対湿度中に置いた。24時間後、トリプトン供給培地を加え、細胞をはさらに72時間増殖させた。上清を遠心分離、次に0.22μmフィルターを使用した濾過によって回収した。発現したタンパク質はプロテインAセファロースカラムを使用して精製し、PBSに透析した。精製したタンパク質はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分析し、それは図65に示す。

【0497】

IGF-1R抗体(H0L0)は以下のアッセイ中で比較の基準として使用した。この分子は配列番号110で述べる重鎖配列、および配列番号113で述べる軽鎖配列を有する。

【0498】

無関係な特異性を有する別のmAbdAbを以下のアッセイ中で比較の基準として使用した。この分子は配列番号87で述べる重鎖配列、および配列番号13で述べる軽鎖配列を有し、BPC1601と称する。

【0499】

実施例１４．３
IGF-1R結合ELISA
結合ELISAを実施して、精製抗IGF-1R/VEGF mAbdAbとIGF-1Rの結合を試験した。簡潔には、1μg/mlの抗ポリヒスチジン(AbCam AB9108)でコーティングしブロッキング溶液(4％BSA、トリス緩衝生理食塩水)でブロッキングしたELISAプレートに、PBSに溶かした400ng/mlの組換えヒトIGF-1R-hisタグ(R&D Systems 305-GR)をロードした。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05％Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中に希釈した、様々な濃度の精製mAbdAb、および抗IGF-1Rモノクローナル抗体(H0L0)および無関係なmAbdAb(BPC1601)を加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH₂SO₄の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。

【0500】

結合ELISAの結果は図66中に表し、試験したすべてのIGF1R-VEGF mAbdAb変異体(BPC1603〜1606)は、抗IGF-1R抗体H0L0に匹敵するレベルでIGF-1Rとの結合を示すことを確認する。EC50値はCambridgesoft Bioassayソフトウェアを使用して計算し、以下の通りである:H0L0(0.1797μg/ml))、BPC1603(0.1602μg/ml)、BPC1604(0.1160μg/ml)、BPC1605(0.1975μg/ml)、BPC1606(0.1403μg/ml)。無関係な対照二重特異性抗体BPC1601はここでIGF-1Rに対する検出可能な結合を示した。

【0501】

実施例１４．４
VEGF結合ELISA
結合ELISAを実施して、精製抗IGF-1R/VEGF二重特異性抗体とVEGFの結合を試験した。ELISAプレートはPBSに溶かした400ng/mlの組換えヒトVEGF(GSK)でコーティングし、次いでブロッキング溶液(4％BSA、TBS中)でブロッキングした。ブロッキング溶液中に希釈した様々な濃度の精製mAbdAbを加え、mAbdAb BPC1601は陰性対照として含めた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で40分間インキュベートした後、TBS中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH₂SO₄の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。

【0502】

結合ELISAの結果は図67中に表し、全4個の抗IGF-1R/VEGF mAbdAb(BPC1603〜1606)は、固定化VEGFと結合することができることを確認する。BPC1605およびBPC1606のみかけの低い結合活性は、ドメイン抗体(軽鎖のC末端に位置する)と検出抗体の間の干渉に原因がある可能性がある。EC50値はCambridgesoft Bioassayソフトウェアを使用して計算し、以下の通りである:BPC1603(0.044μg/ml)、BPC1604(0.059μg/ml)、BPC1605(0.571μg/ml)。低い応答値のために、BPC1606に関する正確なEC50値を計算することはできなかった。抗IGF-1R抗体H0L0および無関係な対照mAbdAb BPC1601は、VEGFとの検出可能な結合をここで示した。

【0503】

実施例１４．５
VEGFとの結合の反応速度
ヒトIgG(BiacoreBR-1008-39)に対するマウスモノクローナルを、第1級アミンカップリングによってCM5バイオセンサーチップに固定化した。抗体構築物はこの表面を使用して捕捉した。捕捉後、VEGFはその表面を通過させ、それは次いで3MのMgCl₂を使用して再生した。反応速度を生成するために使用したVEGFの濃度は256、64、16、4、1および0.25nMであり、二重参照に使用した捕捉表面にはバッファーのみを注入した。実験は25℃において1×HBS-EPバッファー(BR-1006-69)を使用してBiacoreT100機器で実施した。データはその分析ソフトウェア中で機器に固有の1:1モデルにフィッティングした。表19に示すデータは2つの独立した実験からのデータである。

【表24】

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【0504】

実施例１４．６
受容体とのVEGF結合の阻害
mAbdAbの活性を、方法12に記載したのと同様にVEGF受容体結合アッセイを使用して測定した。VEGFR2とのVEGFの結合の阻害に関してこのアッセイ中で得たIC50は以下の通りである:
BPC1603(0.037nM)
BPC1604(0.010nM)
BPC1605(0.167nM)
BPC1606(0.431nM)
これらの結果によって、全4個の抗原結合性構築物が受容体とのリガンド結合を阻害することが確認される。

【0505】

実施例１４．７
IGF-1R受容体リン酸化の阻害
3T3/LISN c4細胞を10000個細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートにプレートし、完全DMEM(DMEM-Hepes修飾+10％FCS)中で一晩インキュベートした。精製mAbdAbを細胞に加え、1時間インキュベートした。rhIGF-1を処理した細胞に加え50ng/mlの最終濃度を得て、さらに30分間インキュベートして受容体リン酸化を刺激した。培地を吸引し、次いでRIPA溶解バッファー(150mMのNaCl、50mMのTrisHCl、6mMのデオキシコール酸ナトリウム、1％のTween20)およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche 11697498001)の添加によって細胞を溶解した。プレートは一晩凍結した。解凍後、それぞれのウェルからの溶解物を、2μg/mlの抗IGF-1R捕捉抗体2B9(GSK)でプレコーティングし4％のBSA/TBSでブロッキングした96ウェルELISAプレートに移した。プレートはTBST(TBS+0.1％Tween20)で洗浄し、4％のBSA/TBS中に2500倍希釈したユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体(PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66)をそれぞれのウェルに加えた。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、DELFIA Enhancement(PerkinElmer1244-105)溶液を加えた。10分間のインキュベーション後、ユーロピウム時間分解蛍光(TRF)を測定するために設定したプレートリーダーを使用して受容体リン酸化のレベルを決定した。

【0506】

実験の結果は図68および69に表す。これらの結果によって、mAbdAb BPC1603〜1606は、抗IGF-1Rモノクローナル抗体H0L0に匹敵するレベルでIGF-1介在受容体リン酸化を阻害することができることを確認する。無関係な抗体(IgG1として示す、Sigma I5154)はこのアッセイで活性を示さなかった。

【0507】

実施例１５
抗CD20/IL-13抗原結合タンパク質
実施例１５．１
分子生物学
配列番号117および120で述べる抗CD20 mAbの重鎖および軽鎖配列をコードする哺乳動物発現ベクターを、PCRベースの手法および標準的な分子生物学の技法を使用してde novoで構築した。二重特異性抗CD20 mAb-抗IL13 dAb重鎖および軽鎖は、抗CD20 mAb重鎖および軽鎖可変領域をコードする配列を、抗ヒトIL-13ドメイン抗体(DOM10-53-474)と融合したヒト抗体定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングすることによって構築した。

【0508】

mAbdAb発現構築物はCHOE1a細胞にトランスフェクトした。上清を採取し、次いで固定化プロテインAを使用して抗体を精製し、280nmで吸光度を読み取ることによって定量化した。構築および試験したmAbdAb(および抗CD20対照mAb)は表20に挙げる。

【表25】

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【0509】

実施例１５．２
ヒトIL-13との結合の反応速度
ヒトIL-13に対するmAbdAb構築物の結合親和性をBIAcore(商標)分析によって評価した。分析は抗ヒトIgG捕捉で実施した。簡潔には、抗ヒトIgG(BiacoreBR-1008-39)を、第1級アミンカップリングによってCM5チップに固定化した。次いでMAbdAb構築物をこの表面に捕捉し、ヒトIL-13(GSKで作製および精製)を定義した濃度で通過させた。3MのMgCl₂を使用してその表面を再度抗ヒトIgG表面に再生した。この処理は後のIL-13結合事象に関して抗体を捕捉する能力に有意に影響を与えなかった。この作業はBiacore(商標)T100機器で、HBS-EPバッファーを使用して25℃で実施した。データは機器において評価ソフトウェアを使用して分析し、1:1結合モデルにフィッティングした。分析の結果は表48に表し、すべてのmAbdAb構築物に関して、IL-13との結合の反応速度が比較可能であることを確認する。

【表26】

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【0510】

CD20とmAb-dAbの結合を、CD20陽性細胞株(Wein133)を使用したフローサイトメトリーによって評価した。すべてのmAb-dAb(BPC1401〜BPC1404)および抗CD20対照抗体が、平均蛍光強度(MFI)の用量依存的増大を示した(データ示さず)。

【0511】

実施例１５．３
抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたADCCアッセイ
ADCCアッセイは、Boyd et al.(1995)J.Imm.Meth.184:29-38の公開済みの方法に基づいた。簡潔には、Raji細胞(標的)を以下のようにユーロピウムで標識した。細胞を採取し、計数し15mlのファルコンチューブ中に1×10⁷の最終密度に調製し、Hepesバッファー(50mMのHEPES、83mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのMgCl₂、H₂0、pH7.4)で1回洗浄した。細胞をペレット状にし、1mlの氷冷ユーロピウム標識バッファー(HEPESバッファーおよび600μMのEuCl₃、3mMのDTPAおよび25mg/mlの硫酸デキストラン)をそれぞれのチューブに加えた。細胞懸濁液を標識開始時、および次いで氷上での30分のインキュベーション時間中10分毎に激しく攪拌した。10mlの氷冷した回復バッファー(294mg/mlのCaCl₂.2H₂0、1.8g/lのD-グルコース、pH7.4を含有するHepesバッファー)を加え、細胞は氷上でさらに10分間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離にかけ、上清をデカントし、回復バッファーで2回、および次いで完全培地で1回洗浄した。次いで標識細胞を計数し、2×10⁵個細胞/mlで無血清培地に再懸濁し、氷上に保存した。

【0512】

ヒト精製血中単核細胞(PBMCまたはエフェクター細胞)を以下のように調製した。150mlの全血を2000rpmで10分間遠心分離にかけて、血清を除去した。次いで細胞をPBS(Invitrogen/Gibco、#14190)で元の体積の2倍希釈した。Accuspin密度勾配チューブ(Sigma、#A2055-10EA)は15m1のlymphoprep(Axis shield、#NYC1114547)を加えることによって調製し、1500rpmで1分間遠心分離にかけた。25mlの血液懸濁液を密度勾配チューブに加え、2500rpmで20分間遠心分離にかけ、遠心分離機を止めた。上清の上部10m1は廃棄した。(「淡黄色」層を含む)残りは清浄なチューブに注ぎ、PBSを補給し、1500rpmで5分間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、細胞ペレットをプールし、RPMI培地中で1回洗浄し、再度遠心分離にかけ計数した。エフェクター細胞は無血清RPMI培地中に5×10⁶個細胞/mlで調製した。

【0513】

アッセイプレートは以下のように96ウェル丸底プレート(Nuns96maxisorbプレート、#735-0199)で設定した。抗体希釈は、約12μg/mlの出発濃度および11段階のさらなる3倍希釈で無血清RPMI培地において実施した。以下のプレートレイアウトを使用して、50μ1の抗体サンプルを適切なウェル(列B-Gのみ)に加え、希釈当たり6個の複製を可能にした。50μ1のRPMI培地を列AおよびH中のすべてのウェルに加えた。50μ1のRPMI培地は、プレート標識培地中のすべてのウェルに加えた。RPMI培地中で4μg/ml(1μg/mlの最終濃度、GSK社内材料)に希釈した50μ1の組換えヒトIL-13を、+IL13標識プレート中のすべてのウェルに加えた。すべてのプレートは4℃で30分間インキュベートした。50μ1のユーロピウム標識標的細胞をすべてのプレートに加えた。20μ1の10×Tritonをすべてのプレート上の列H中のすべてのウェルに加えた。プレートは4℃で少なくとも30分間インキュベートした。50μ1のRPMI培地を、標的のみでラベルした縦列中のすべてのウェルに加えた。50μ1のPBMCをエフェクター:標的でラベルした縦列中のすべてのウェルに加えて25:1の比を得た。プレートは1500rpmで3分間遠心分離にかけ、37℃で3〜4時間インキュベートした。200μ1の増強溶液(Wallac/Perkin Elmer、カタログ番号1244-105)を、nunc免疫吸着ELISAプレート(それぞれのアッセイプレート用に1つのELISAプレート)のそれぞれのウェルに加えた。20μ1の血清をアッセイプレートからELISAプレートに移した。ELISAプレートは少なくとも30分間プレート攪拌機において室温でインキュベートし、4℃で一晩保存した。ユーロピウム放出は時間遅延型蛍光法(Wallac Victorプレートリーダー)を使用して測定する。自然溶解=細胞および培地単独から放出されたユーロピウムの測定。最大溶解=Triton-X100(非イオン性界面活性剤)の添加による標的細胞の非特異的溶解。

【表27】

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【0514】

ADCCアッセイは、2つの異なるドナーPBMCを使用して2回の別時に実施した。1回の代表的なアッセイからの結果を図70および71に表す。さらに、狭い用量範囲を使用した同様のADCCアッセイを、異なるドナーPBMCを使用して1回の別時に実施した。このアッセイからの結果を図72および73に表す。

【0515】

実施例１５．４
抗CD20/IL-13二重特異性抗体を用いたCDCアッセイ
WEIN細胞(標的)を以下のようにユーロピウムで標識した。簡潔には、細胞を採取し、計数し15mlのファルコンチューブ中に1×10⁷の最終密度に調製し、Hepesバッファー(50mMのHEPES、83mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのMgCl₂、H₂0、pH7.4)で1回洗浄した。細胞をペレット状にし、1mlの氷冷ユーロピウム標識バッファー(HEPESバッファーおよび600μMのEuCl₃、3mMのDTPAおよび25mg/mlの硫酸デキストラン)をそれぞれのチューブに加えた。細胞懸濁液を標識開始時、および次いで氷上での30分のインキュベーション時間中10分毎に激しく攪拌した。10mlの氷冷した回復バッファー(294mg/mlのCaCl₂.2H₂0、1.8g/lのD-グルコース、pH7.4を含有するHepesバッファー)を加え、細胞は氷上でさらに10分間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離にかけ、上清をデカントし、回復バッファーで2回、および次いで完全培地で1回洗浄した。次いで標識細胞を計数し、2×10⁵個細胞/mlで無血清培地に再懸濁し、氷上に保存した。

【0516】

遠心分離によって研究室内用ドナーから回収した全血から血清を除去した。サンプルの半分は30分間56℃での熱処理によって不活性化した。抗体サンプルは、12μg/mlおよび5つのさらなる3倍希釈で始めて無血清RPMI培地において希釈した。50μ1の抗体サンプルは(以下のプレートレイアウトに従い)列B〜Gのみ中の適切なウェルに加えた。50μ1のRPMI培地は縦列1〜6中のすべてのウェルに加えた。示した場合、(RPMI培地中に4μg/mlで)50μ1の組換えヒトIL-13を縦列7〜12中のすべてのウェルに加えた。プレートは4℃で少なくとも30分間インキュベートした。50μ1のユーロピウム標識標的細胞をすべてのプレートに加え、プレートは4℃で少なくとも30分間インキュベートした。50μ1の血清(活性または熱不活性化)を適切なウェルに加えた(以下のプレートレイアウト参照)。プレートは37℃のインキュベーターで2〜3時間インキュベートし、その時間の後プレートは3分間1500rpmで遠心分離にかけた。200μ1の増強溶液(Wallas/Perkin Elmer、カタログ番号1244-105)を、Nunc免疫吸着ELISAプレート(それぞれのアッセイプレート用に1つのELISAプレート)のそれぞれのウェルに加えた。20μ1の血清をアッセイプレートからELISAプレートに移した。ELISAプレートは少なくとも30分間プレート攪拌機において室温でインキュベートし、4℃で一晩保存した。ユーロピウム放出は時間遅延型蛍光法(Wallac Victorプレートリーダー)を使用して測定する。自然溶解=細胞および培地単独から放出されたユーロピウムの測定。最大溶解=Triton-X100(非イオン性界面活性剤)の添加による標的細胞の非特異的溶解。

【表28】

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【0517】

CDCアッセイは、3つの異なるドナー血清を使用して3回の別時に実施した。1回の代表的なアッセイからの結果を図74および75中に表し、抗体サンプルのCDC活性はIL-13の不在下で比較可能であることを示す。過剰なIL-13の存在下では、抗体サンプルBPC1401およびBPC1402(重鎖と融合したドメイン抗体)のCDC活性は低下し、一方BPC1403およびBPC1404(軽鎖と融合したドメイン抗体)のCDC活性はIL-13の存在によって大部分は影響を受けない。

【0518】

実施例１６
16.1 代替足場から構成されるエピトープ結合ドメインを含む抗原結合タンパク質の設計および構築
以下に挙げた5つの代替足場をモノクローナル抗体と組み合わせて、mAb-代替足場二重特異性分子を得た:
・抗VEGF涙液リポカリン(TLPC)
・抗HER2 Affibody(AFFI)
・抗HER2 DARPin(DRPN)
・抗ニワトリ卵白リゾチーム(NARV)
・抗RNaseAラクダVHH。

【0519】

TLPC(さらなる情報に関してはUS2007/0224633を参照)、AFFI(さらなる情報に関してはWO2005003156A1を参照)、DRPN(さらなる情報に関してはZahnd、C.et al.(2007)、J.Mal.Biol.、369、1015-1028を参照)およびNARV(さらなる情報に関してはUS20050043519Aを参照)のタンパク質配列はDNAに逆翻訳しコドン最適化した。N末端におけるBamHI部位およびC末端におけるEcoR1部位を、これら4つの代替足場のそれぞれに含めてクローニングを容易にした。

【0520】

これら4つの最終代替足場DNA配列をコードするDNA断片は、PCRベースの戦略および重複オリゴヌクレオチドを使用してde novoで構築した。TLPC、AFFIおよびDRPNのPCR産物は、H0L0、抗hIGF-1R抗体の重鎖を含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。生成するDNA配列は、TVAAPSGSリンカーまたはGSリンカーを介して重鎖のC末端と融合した代替足場をコードする。NARVのPCR産物は、パスコリツマブ(抗IL-4抗体)の重鎖をコードするDNAを含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。生成するDNA配列は、GSリンカーを介して重鎖のC末端と融合したNARVをコードする。

【0521】

抗RNaseAラクダVHHのDNA配列をPCRにより修飾して、5'末端にBamHI部位および3'末端におけるEcoR1部位を含めてクローニングを容易にした。PCR産物は、パスコリツマブ、抗IL-4抗体の重鎖を含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。生成するDNA配列は、GSリンカーを介して重鎖のC末端と融合したラクダVHHをコードする。

【0522】

以下の表21は、構築した抗原結合タンパク質の要約である。

【表29】

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【0523】

表21中に述べる抗原結合タンパク質の重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドは、293fectin(Invitrogen、12347019)を使用してHEK293-6E細胞に一過的に共トランスフェクトした。トリプトン供給培地を同日または翌日に細胞培養物のそれぞれに加え、上清材料は最初のトランスフェクションから約2〜6日後に回収した。結合アッセイ中で試験する前にプロテインAカラムを使用して、上清から抗原結合タンパク質を精製した。

【0524】

16.2: rhIGF-1R結合ELISA
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした1μg/mlの抗hisタグ抗体(Abcam、ab9108)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。0.4μg/mlのrhIGF-1R(R&D systems)をウェル当たり50μLでそれぞれのウェルに加えた。プレートは室温で1時間インキュベートし、次いで洗浄した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0525】

図76、78および80はELISAの結果を示し、抗原結合タンパク質BPC1803〜BPC1808は組換えヒトIGF-1Rと結合することを確認する。抗IGF-1Rモノクローナル抗体H0L0も組換えヒトIGF-1Rとの結合を示したが、一方で陰性対照抗体(sigma15154)はIGF-1Rとの結合を示さなかった。

【0526】

16.3: VEGF結合ELISA
96ウェル高結合プレートを0.4μg/mlのhVEGF165(R&D Systems)でコーティングし、4℃において一晩インキュベートした。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0527】

図77はVEGF結合ELISAの結果を示し、二重特異性抗体BPC1803およびBPC1804がヒトVEGFと結合することを確認する。抗VEGF二重特異性抗体(BPC1603)はこのアッセイ中では陽性対照として使用し、VEGFとの結合を示した。対照的に、抗IGF-1Rモノクローナル抗体H0L0はヒトVEGFとの結合を示さなかった。

【0528】

16.4: HER2結合ELISA
96ウェル高結合プレートを1μg/mlのHER2(R&D Systems)でコーティングし、4℃において一晩インキュベートした。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0529】

図79および81はHER2結合ELISAの結果を示し、抗原結合タンパク質BPC1805、BPC1806、BPC1807およびBPC1808が組換えヒトHER2と結合することを確認する。ハーセプチンをこのアッセイ中では陽性対照として使用し、HER2との結合を示した。対照的に、抗IGF-1Rモノクローナル抗体H0L0はヒトHER2との結合を示さなかった。

【0530】

16.5: IL-4結合ELISA
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした5μg/mlのヒトIL-4でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0531】

図82はELISAの結果を示し、抗原結合タンパク質BPC1809が抗IL-4モノクローナル抗体、パスコリツマブに匹敵するレベルでヒトIL-4と結合することを確認する。陰性対照抗体(SigmaI5154)はIL-4との結合を示さなかった。

【0532】

図84はELISAの結果を示し、抗原結合タンパク質BPC1816が抗IL-4モノクローナル抗体、パスコリツマブに匹敵するレベルでヒトIL-4と結合することを確認する。陰性対照抗体(SigmaI5154)はIL-4との結合を示さなかった。

【0533】

16.6: RNAseA結合ELISA
PBSに希釈した1ug/mLのRNAseA(Qiagen、19101)50uLを、96ウェルCostarプレートのそれぞれのウェルに加えた。プレートは室温で2時間インキュベートし、次いでそれぞれのウェルへの200uLの4％BSA/PBSブロックの添加前にPBSTで洗浄した。プレートは1時間インキュベートし、サンプルの添加前に洗浄した。精製抗体および抗原結合タンパク質BPC1809はカラム1のウェル中に2ug/mLの濃度で加え、次いでブロッキング溶液中プレートに2倍に連続希釈した。プレートは1時間インキュベートし、次いで洗浄した。50ul/ウェルのヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)は1000倍希釈で加えた。プレートは1時間インキュベートし、次いで洗浄した。50uLのOPDをそれぞれのウェルに加え、15〜30分後に3M硫酸を用いて反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0534】

図83はRNAseA結合ELISAの結果を示し、精製ヒトモノクローナル抗体-ラクダVHH二重特異性抗体BPC1809が、RNAseAとの結合を示すことを確認する。対照的に、IL-4モノクローナル抗体パスコリツマブと陰性対照(sigmaI5154)の両方がRNAseAとの結合を示さなかった。

【0535】

16.7: HEL結合ELISA
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした5μg/mlのHEL(ニワトリ卵リゾチーム、Sigma L6876)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。精製抗体はブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0536】

図85はHEL結合ELISAの結果を示し、精製ヒトモノクローナル抗体-NARV二重特異性抗体BPC1816がHELと結合することを確認する。対照的に、IL-4モノクローナル抗体パスコリツマブはHELとの結合を示さなかった。

【0537】

実施例１７
17.1 アドネクチンから構成されるエピトープ結合ドメインを含む抗原結合タンパク質の設計および構築
CT01アドネクチンは、VEGFR2に特異的である(さらなる情報に関してはWO2005/056764を参照)。CT01アドネクチンのタンパク質配列はDNAに逆翻訳しコドン最適化した。N末端におけるBamHI部位およびC末端におけるEcoR1部位を含めてクローニングを容易にした。

【0538】

最終CT01 DNA配列をコードするDNA断片は、PCRベースの戦略および重複オリゴヌクレオチドを使用してde novoで構築した。PCR産物は、H0L0(抗hIGF-1R抗体)の重鎖を含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングし、GSリンカーまたはTVAAPSGSリンカーのいずれかを介して重鎖のC末端にアドネクチンを融合させた。IGF-1R-VEGFR2二重特異性の重鎖および軽鎖のタンパク質配列は配列番号124、113および133として示す。

【0539】

抗TNF-αアドネクチン(さらなる情報に関してはUS20080139791を参照)をコードする別のアドネクチンタンパク質配列はDNAに逆翻訳し、コドン最適化し、前に記載した重複オリゴヌクレオチドPCR法を使用して構築する前に、修飾して末端BamHI部位およびEcoR1部位を含めた。PCR産物は、パスコリツマブ(抗IL-4抗体)の重鎖をコードするDNAを含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングし、GSリンカーまたはTVAAPSGSリンカーのいずれかを介して重鎖のC末端に抗TNF-αアドネクチンをコードするDNAを融合させた。IL-4-TNF-α二重特異性の重鎖および軽鎖のタンパク質配列は配列番号146、147および15として示す。

【0540】

TNF-α特異的アドネクチンを使用してIL-13モノクローナル抗体の重鎖のC末端と融合した抗原結合タンパク質も設計した。実施例のタンパク質配列は配列番号134、13および135として示す。さらに、抗EGFR抗体アービタックスおよびIMC-11F8の重鎖または軽鎖のC末端またはN末端のいずれかにおけるCTO1の融合に基づく二重特異性分子を設計した。設計したタンパク質配列の例は配列番号136〜145として示す。

【0541】

これらの実施例の配列の中で、いくつかを構築した。配列番号136(アービタックス重鎖のC末端と融合したCTO1)、配列番号144(アービタックス重鎖のN末端と融合したCTO1)および配列番号138(アービタックス軽鎖のC末端と融合したCTO1)をコードするDNA配列を構築した。PCRベースのクローニング法を使用して全3個の配列を構築し、哺乳動物発現ベクターにクローニングした。以下の表22は、設計および/または構築した抗原結合タンパク質の要約である。

【表30】

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【0542】

BPC1801、BPC1802、BPC1822、BPC1823、BPC1812、BPC1813およびBPC1818の重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドは、293fectin(Invitrogen、12347019)を使用してHEK293-6E細胞に一過的に共トランスフェクトした。トリプトン供給培地を同日または翌日に細胞培養物に加え、上清材料は最初のトランスフェクションから約2〜6日後に回収した。一部の場合、上清材料を結合アッセイ中で被験物質として使用した。他の場合、結合アッセイ中で試験する前にプロテインAカラムを使用して抗原結合タンパク質を精製した。

【0543】

17.2: rhIGF-1R結合ELISA
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした1μg/mlの抗hisタグ抗体(Abcam、ab9108)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。0.4μg/mlのrhIGF-1R(R&D systems)をウェル当たり50μLでそれぞれのウェルに加えた。プレートは室温で1時間インキュベートし、次いで洗浄した。精製抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0544】

図86はIGF-1R結合ELISAの結果を示し、精製ヒトモノクローナル抗体-アドネクチン二重特異性抗体(BPC1801およびBPC1802)が、抗IGF-1Rモノクローナル抗体H0L0に匹敵するレベルで組換えヒトIGF-1Rと結合することを確認する。陰性対照抗体(sigmaI5154)はIGF-1Rとの結合を示さなかった。

【0545】

17.3: VEGFR2結合ELISA
96ウェル高結合プレートを0.4μg/mlのVEGFR2(R&D Systems)でコーティングし、4℃において一晩インキュベートした。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。上清または精製抗体はブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0546】

図87はVEGFR2結合ELISAの結果を示し、精製ヒトモノクローナル抗体-アドネクチン二重特異性抗体(BPC1801およびBPC1802)が、組換えヒトVEGFR2と結合することを確認する。対照的に、抗IGF-1Rモノクローナル抗体H0L0はヒトVEGFR2との結合を示さなかった。

【0547】

図172はVEGFR2結合ELISAの結果を示し、抗原結合タンパク質BPC1813およびBPC1818が組換えヒトVEGFR2と結合することを確認する。対照的に、アービタックスはヒトVEGFR2との結合を示さなかった。抗原結合タンパク質BPC1813およびBPC1818に関しては、上清中の抗体の量は定量化せず、したがって図172中に表すデータは非希釈上清材料の希釈係数として表す。アービタックスに関しては、図172中の1という希釈係数に等しい2μg/mlの出発濃度でアッセイ中に精製物質を使用した。

【0548】

図175はVEGFR2結合ELISAの結果を示し、抗原結合タンパク質BPC1812が組換えヒトVEGFR2と結合することを確認する。対照的に、アービタックスおよび陰性対照Sigma IgG I5154抗体はヒトVEGFR2との結合を示さなかった。抗原結合タンパク質BPC1812に関しては、上清中の抗体の量は定量化せず、したがって図175中に表すデータは非希釈上清材料の希釈係数として表す。アービタックスおよびSigma IgG I5154に関しては、図175中の1という希釈係数に等しい2μg/mlの出発濃度アッセイ中に精製物質を使用した。

【0549】

17.4: IL-4結合ELISA
96ウェル高結合プレートを5μg/mlのヒトIL-4でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。上清または精製抗体/抗原結合タンパク質はブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0550】

図88はIL-4結合ELISAの結果を示し、ヒトモノクローナル抗体-アドネクチン二重特異性抗体(BPC1823およびBPC1822)が、組換えヒトIL-4と結合することを確認する。陽性対照抗IL-4モノクローナル抗体パスコリツマブはIL-4との結合を示し、陰性対照抗体(Sigma I5154)はIL-4との結合を示さなかった。

【0551】

この実験のHEKトランスフェクションを繰り返して、高い抗体濃度を有する上清材料を得た。図88bは、ELISAにより決定した、ヒトIL-4とのこの高濃度上清ヒトモノクローナル抗体-アドネクチン二重特異性抗体(BPC1823)の結合を示す。

【0552】

抗原結合タンパク質BPC1823およびBPC1822に関しては、上清中の抗体の量は定量化せず、したがって図88および88b中に表すデータは非希釈上清材料の希釈係数として表す。パスコリツマブおよび陰性対照抗体(Sigma I5154)に関しては、図88および88b中の1という希釈係数に等しい1μg/mlの出発濃度でアッセイ中に精製物質を使用した。

【0553】

17.5: TNF-α結合ELISA
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした0.4μg/mlの組換えヒトTNF-α(RnD Systems、210-TA-050/CF)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。上清または精製抗体はブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mLに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0554】

図89はTNF-α結合ELISAの結果を示し、ヒトモノクローナル抗体-アドネクチン二重特異性抗体(BPC1823およびBPC1822)が、組換えヒトTNF-αと結合することを確認する。対照的に、抗IL-4モノクローナル抗体パスコリツマブは組換えヒトTNF-αとの結合を示さなかった。

【0555】

この実験のHEKトランスフェクションを繰り返して、高い抗体濃度を有する上清材料を得た。図89bは、ELISAにより決定した、組換えヒトTNF-αとのこの高濃度上清ヒトモノクローナル抗体-アドネクチン二重特異性抗体(BPC1823)の結合を示す。IgG対照は組換えヒトTNF-αとの結合を示さなかった。

【0556】

抗原結合タンパク質BPC1822およびBPC1823に関しては、上清中の抗体の量は定量化せず、したがって図89および89b中に表すデータは非希釈上清材料の希釈係数として表す。パスコリツマブに関しては、図89および89b中の1という希釈係数に等しい1μg/mlの出発濃度でアッセイ中に精製物質を使用した。

【0557】

17.6: EGFR結合ELISA
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした0.67μg/mlの組換えヒトEGFRタンパク質でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20で2回洗浄した。200μLのブロッキング溶液(5％BSA、DPBSバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。抗原結合タンパク質/抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma、A7164)をブロッキング溶液中に1μg/mlに希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、50μ1のOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって15分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0558】

図171はEGFR結合ELISAの結果を示し、二重特異性抗体BPC1818およびBPC1813は組換えヒトEGFRと結合することを確認する。陽性対照抗体、アービタックスも組換えヒトEGFRとの結合を示した。対照的に、Sigma IgG I5154は組換えヒトEGFRとの結合を示さなかった。二重特異性抗体BPC1813およびBPC1818に関しては、上清中の抗体の量は定量化せず、したがって図171中に表すデータは非希釈上清材料の希釈係数として表す。アービタックスおよび陰性対照抗体(SigmaI5154)に関しては、図171中の1という希釈係数に等しいそれぞれ2μg/mlおよび1μg/mlの出発濃度でアッセイ中に精製物質を使用した。

【0559】

図176はEGFR結合ELISAの結果を示し、二重特異性抗体BPC1812は組換えヒトEGFRと結合することを確認する。陽性対照抗体、アービタックスも組換えヒトEGFRとの結合を示した。対照的に、Sigma IgG I5154は組換えヒトEGFRとの結合を示さなかった。二重特異性抗体BPC1812に関しては、上清中の抗体の量は定量化せず、したがって図176中に表すデータは非希釈上清材料の希釈係数として表す。アービタックスおよび陰性対照抗体(SigmaI5154)に関しては、図176中の1という希釈係数に等しいそれぞれ2μg/mlおよび1μg/mlの出発濃度でアッセイ中に精製物質を使用した。

【0560】

実施例１８
「G」および「S」アミノ酸残基を除去したIL-13/IL-4 mAbdAbの結合活性データ
18.1 mAbdAbの構築
(リンカー配列の隣の)GおよびSアミノ酸残基を除去したmAbdAbを構築した。標準的な分子生物学の技法を使用して発現プラスミドを構築した。これらのmAbdAbは表23中に記載する。それらをクローニングし、次いでHEK293-6E細胞、CHOK1細胞、またはCHOE1a細胞のうち1以上において発現させ、それらを精製し(それぞれ実施例1、1.3および1.5中に記載したのと同様に)、複数のIL-13およびIL-4活性アッセイ中で分析した。

【表31】

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【0561】

18.2 発現および精製
これらのmAbdAbを精製し、SECおよびSDS-PAGEによって分析した。いくつかの精製調製物を作製し、図90〜98に示すSECおよびSDS-PAGEのデータはこれらの調製物の代表的なものである。

【0562】

18.3 直接結合ELISAにおけるヒトIL-4との結合
精製PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去を、方法2に記載したのと同様に直接結合ELISAにおいてヒトIL-4との結合に関して試験した(PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474およびPascoH-ELQLE-474もこのアッセイにおいて結合に関して試験した)。いくつかのELISAアッセイをこれらの分子に関して実施し、図99に示すデータはこれらのアッセイの代表的なものである。

【0563】

PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去は、いずれもヒトIL-4と結合した。精製抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)は、IL-4との結合の陽性対照としてこのアッセイ中に含めた。精製抗ヒトIL13 mAbはIL-4結合の陰性対照として含めた。PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去の結合活性は、精製抗IL4 mAb単独(パスコリツマブ)、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474およびPascoH-ELQLE-474と類似していた。

【0564】

18.4 直接結合ELISAにおけるヒトIL-13との結合
精製PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去を、方法1中に記載したのと同様に直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関しても試験した(PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616もこのアッセイにおいて結合に関して試験し、これらの分子の作製は実施例19中に記載する)。複数のELISAアッセイをこれらの分子に関して実施し、図100に示すデータは全アッセイの代表的なものである。

【0565】

PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616は、いずれもヒトIL-13と結合した。精製抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)は、IL-13との結合の陰性対照としてこのアッセイ中に含めた。精製抗ヒトIL13 mAbはIL-13結合の陽性対照として含めた。ここで留意すべきは、dAbは二次検出抗体によって検出されないので、抗IL-13dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0566】

18.5 直接結合ELISAにおけるカニクイザルIL-13との結合
精製PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616 mAbdAbは、(方法17に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてカニクイザルIL-13との結合に関しても試験した。複数のELISAアッセイをこれらの分子に関して実施し、図101に示すデータは全アッセイの代表的なものである。

【0567】

PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616は、いずれもカニクイザルIL-13と結合した。精製抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)は、IL-13との結合の陰性対照としてこのアッセイ中に含めた。精製抗ヒトIL13 mAbはカニクイザルIL-13結合の陽性対照として含めた。ここで留意すべきは、dAbは二次検出抗体によって検出されないので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-474およびDOM10-53-616)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0568】

18.6 ヒトIL-4およびヒトIL-13との結合に関するBiacore分析
精製mAbdAbは、(方法4および5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、ヒトIL-4およびヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは表24に示す。

【0569】

実験1では、約600の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-13およびIL-4濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nM)を評価した。実験1中ではmAbに関してただ1つのIL-13(256nM)およびIL-4(256nM)濃度曲線を評価した。

【0570】

実験2では、約400の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-4(64nM、16nM、4nM、1nM、0.25nMおよび0.0625nM)および6個のIL-13濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nM)を評価した。実験2中では、ただ1つのIL-13濃度曲線(256nM)を抗IL13 mAbに関して評価し、かつ5個のIL-4濃度曲線(64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nM)をパスコリツマブに関して評価した。

【0571】

実験3では、約700の相対応答単位のmAbdAbまたはmAb捕捉レベルを得て、6個のIL-4濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nM)を評価し、6個のIL-13濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nM)を評価した。

【表32】

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【0572】

実験1および2では、PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去は、いずれも類似した結合親和性でIL-4と結合し、これは抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)の結合親和性とほぼ等しかった。PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去は、IL-13とも類似した結合親和性で結合した。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップで捕捉することができないので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-474)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0573】

実験3では、586H-210 GS除去および586H-TVAAPS-210 GS除去はいずれも類似した結合親和性でIL-13と結合し、これは抗ヒトIL13 mAbの結合親和性とほぼ等しかった。586H-210 GS除去および586H-TVAAPS-210 GS除去はIL-4とも非常に強く結合したが、しかしながらこの方法は、陽性解離効果およびBIAcore(商標)技法の感度レベルのために結合親和性を決定することができなかった(^*)。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップで捕捉することができないので、抗IL-4 dAb単独(DOM9-112-210)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)をこのアッセイ中のIL-4結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0574】

18.7 カニクイザルIL-4およびカニクイザルIL-13との結合に関するBiacore分析
精製mAbdAbは、(方法24および23に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、カニクイザルIL-4およびカニクイザルIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは表25に示す。約600の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-13濃度曲線(256、64、16、4、1、0.25nM)および5個のIL-4濃度曲線(64、16、4、1、0.25nM)を評価した。

【表33】

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【0575】

PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、PascoH-GS-ASTKGPT-474 2^nd GS除去、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474およびPascoH-ASTKG-474は、いずれも類似した結合親和性でカニクイザルIL-4と結合した。PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、PascoH-GS-ASTKGPT-474 2nd GS除去、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474およびPascoH-ASTKG-474はいずれも、IL-13とも類似した結合親和性で結合した。

【0576】

精製mAbdAbは、(方法24および23に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、カニクイザルIL-4およびカニクイザルIL-13との結合に関しても試験した。これらのデータは表26に示す。約600の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL13および6個のIL-4濃度曲線(256、64、16、4、1、0.25nM)を評価した。

【表34】

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【0577】

586H-210 GS除去および586H-TVAAPS-210 GS除去は、いずれも類似した結合親和性でカニクイザルIL-13と結合した。これらのmAbdAbは抗ヒトIL13 mAbより強くIL-13と結合するようであるが、しかしながらmAbの場合、全濃度範囲評価より本質的に精度が低いただ1つの濃度曲線を実施した。586H-210 GS除去および586H-TVAAPS-210 GS除去は、IL-4とも非常に強く結合したが、しかしながらこの方法は、陽性解離効果およびBIAcore(商標)技法の感度レベルのために結合親和性を決定することができなかった(^*)。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップで捕捉することができないので、抗IL-4 dAb単独(DOM9-112-210)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)をこのアッセイ中のIL-4結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0578】

18.8 後のIL-13結合反応速度に対するmAbdAbとのIL-4結合の影響およびその逆、および後のIL-4結合反応速度に対するmAbdAbとのIL-13結合の影響およびその逆のBiacore分析
IL-13およびIL-4 BIAcore(商標)結合アッセイを使用して、後のIL-13結合反応速度に対するPascoH-474 GS除去とのIL-4結合の影響およびその逆、および後のIL-4結合反応速度に対する586H-TVAAPS-210とのIL-13結合の影響およびその逆も調べた。mAbdAb(または陽性対照mAb)の抗ヒトIgG捕捉を使用して、分析は25℃においてBIAcore(商標)T100機器で実施した。簡潔には、製造者の推奨に従い、第1級アミンカップリングによってCM5チップに抗ヒトIgGを結合させた。次いでmAbdAb構築物(または陽性対照mAb)を(約250〜750RUで)この表面に捕捉し、第1アナライト(ヒトIL-13またはヒトIL-4のいずれか)は256nMで4分間通過させた。次いで第2アナライト(それぞれヒトIL-4またはヒトIL-13)を256nM、64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nMの濃度で通過させ、および二重参照のために、バッファー注入液を捕捉抗体またはmAbdAb表面上に通過させた。機器において評価用ソフトウェアを使用して(1:1結合モデルにフィッティングし)データを分析した。次いで3Mの塩化マグネシウムを使用して表面を再生した。これらの実験からのデータは表27および28に示す。

【表35】

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【0579】

ヒトIL-4がこの分子と結合したかどうかとは無関係に、ヒトIL-13に対するPascoH-474 GS除去の結合親和性は類似していた。さらに、ヒトIL-4がこの分子と結合したかどうかとは無関係に、ヒトIL-13に対する586H-TVAAPS-210の結合親和性は類似しており、それはヒトIL-13に対する抗IL-13 mAbの結合親和性とも類似していた。

【0580】

PascoH-474 GS除去および586H-TVAAPS-210に関して得たIL-4結合のオフレート(kd)は非常に緩慢であり、かつBIAcore(商標)T100の感度範囲外であり、したがって結合親和性の正確な決定値として使用することはできなかった(データ示さず)。しかしながらデータは、試験した構築物のすべてがヒトIL-4と非常に強く結合することを示す。したがって、ヒトIL-4に対するPascoH-474 GS除去の結合親和性は、ヒトIL-13がこの分子と結合したかどうかとは無関係に非常に強かった。さらに、ヒトIL-4に対する586H-TVAAPS-210の結合親和性は、ヒトIL-13がこの分子と結合したかどうかとは無関係に非常に強かった。

【0581】

18.9 mAbdAbの効力
方法19に記載したように、ELISAによりヒトIL-4RαとのヒトIL-4結合の阻害に関してmAbdAbを試験した。表28に示すすべての分子は1つの実験中で試験し、しかしながら、曲線プロット間を区別するためにデータは2つのグラフにプロットした(586H-TVAAPS-210は2回実施し、これはサンプル1およびサンプル2として表25に示す)。これらのデータは図102および103に示す。

【0582】

PascoH-474 GS除去は、パスコリツマブと同様にヒトIL4RαとのヒトIL-4の結合を阻害した。586H-210 GS除去、586H-TVAAPS-210 GS除去、586HTVAAPS-210、586H-210、586H-G4S-210および586H-ASTKG-210はいずれも、DOM9-112-210と同様にヒトIL4RαとのヒトIL-4の結合を阻害した。パスコリツマブおよびDOM9-112-210は、IL4RαとのIL-4結合の阻害の陽性対照として含めた。DOM10-53-474およびアイソタイプ適合mAb(無関係な抗原に対する特異性を有する)は、IL4RαとのIL-4結合の阻害の陰性対照として含めた。

【0583】

これらのデータを使用してそれぞれの分子に関するIC₅₀値も決定した。IC₅₀値は、ヒトIL4RαとのヒトIL-4の結合を50％阻害することができるmAbdAbまたはmAbまたはdAbの濃度である。IC₅₀値は表28に示す。

【表36】

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【0584】

これらのデータは、PascoH-474 GS除去はパスコリツマブと同様に挙動すること、およびすべての586H-210mAbdAb「ファミリーメンバー」はDOM9-112-210dAbと同様に挙動することを確認する。

【0585】

18.10 mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-13の中和
いくつかの精製mAbdAbを、(それぞれ方法8および方法20に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-13の中和に関して試験した。それぞれの分子はこれらのアッセイ中で1回〜9回試験し、すべてのグラフは示さないが、図104および105は、それぞれヒトIL-13およびカニクイザルIL-13に関する中和データを示す代表的なグラフである。DOM10-53-474は、バイオアッセイにおけるヒトまたはカニクイザルIL-13の中和の陽性対照として含めた。無関係な抗原に対する特異性を有するdAb(陰性対照dAb)も、バイオアッセイにおけるヒトまたはカニクイザルIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。

【0586】

PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去およびPascoH-ASTKGP-474 2^nd GS除去、ならびにPascoH-616、PascoH-TVAAPS-616およびDOM10-53-616(これらは実施例19に記載する)は、TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトとカニクイザル両方のIL-13の生物活性を完全に中和した。

【0587】

18.11 mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-4の中和
いくつかの精製mAbdAbを、(それぞれ方法9および方法21に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-4の中和に関しても試験した。それぞれの分子はこれらのアッセイ中で2回試験し、すべてのグラフは示さないが、図106および107は、それぞれヒトIL-4およびカニクイザルIL-4に関する中和データを示す(データセットからの)代表的なグラフである。抗IL-13 mAbは陰性対照として含め、パスコリツマブはバイオアッセイにおけるヒトまたはカニクイザルIL-4の中和に関する陽性対照として含めた。さらに、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474およびPascoH-G4S-474も、これらのバイオアッセイにおいてヒトおよびカニクイザルIL-4の中和に関して試験した。

【0588】

PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去は、TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトとカニクイザル両方のIL-4の生物活性を完全に中和した。さらに、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474およびPascoH-G4S-474も、TF-1細胞バイオアッセイにおいてヒトIL-4の生物活性を完全に中和した。

【0589】

ND₅₀値はいくつかの異なる実験から得たデータに基づいて誘導した。ND₅₀値は、IL-13またはIL-4の生物活性を50％中和することができるmAbdAbまたはmAbまたはdAbの濃度である。平均ND₅₀値、標準偏差(SD)および試験回数(n)は表29に示す。

【表37】

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【0590】

PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、およびPascoH-ASTKGPT-474 2^nd GS除去は、いずれもTF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-13の生物活性を完全に中和した。さらに、ヒトIL-13に対する、PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、およびPascoH-GS-ASTKGPT-474 2^nd GS除去の中和効力(ND₅₀値)は同様であり、精製抗IL13 dAb単独(DOM10-53-474)に関するND₅₀値の数倍内であった。

【0591】

PascoH-474 GS除去とPascoH-TVAAPS-474 GS除去は両方共に、TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-4の生物活性を完全に中和した。さらに、ヒトIL-13およびカニクイザルIL-13に対する、PascoH-474 GS除去およびPascoH-TVAAPS-474 GS除去の中和効力(ND₅₀値)は同様であり、パスコリツマブに関するND₅₀値の数倍内であった。

【0592】

18.12 ヒトIL-13Rα2とのヒトIL-13結合の結合を阻害するmAbdAbの能力
表30中に挙げた分子は、方法22中に記載したのと同様に、ELISAによるヒトIL-13Rα2とのヒトIL-13結合の阻害に関して試験した。すべての分子は1回の実験で試験した。データは図108に示す。

【0593】

試験したすべてのmAbdAbは、ヒトIL-13Rα2とのヒトIL-13の結合を阻害した。阻害のレベルはDOM10-53-474、DOM10-53-616および抗IL13 mAbのそれと同様であった。パスコリツマブおよび(無関係な抗原に対する特異性を有する)陰性対照dAbは、IL-13Rα2とのIL-13の結合の阻害に関する陰性対照として含めた。

【0594】

これらのデータを使用してそれぞれの分子に関するIC₅₀値も決定した。IC₅₀値は、ヒトIL-13とヒトIL-13Rα2の結合を50％阻害することができるmAbdAbまたはmAbまたはdAbの濃度である。IC₅₀値は表30に示す。

【表38】

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【0595】

これらのデータは、PascoH-474 GS除去、PascoH-TVAAPS-474 GS除去、PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616は、DOM10-53-474、DOM10-53-616および抗IL13 mAbと同様に挙動することを確認する。

【0596】

実施例１９
抗IL13 DOM10-53-616dAbを含有するmAbdAb
19.1 抗IL13 DOM10-53-616dAbを含有するmAbdAbの構築
表31に述べる2つの抗IL4 mAb-抗IL13 dAbを、実施例1に記載したのと同様に部位特異的突然変異誘発によって既存のベクターからクローニングした。

【表39】

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【0597】

19.2 抗IL13 DOM10-53-616dAbを含有するmAbdAbの発現および精製
実施例1.3に記載したのと同様に、HEK293-6E細胞およびCHOE1a細胞中でこれらのmAbdAbを発現させた。

【0598】

これらのmAbdAbを精製し、SECおよびSDS-PAGEによって分析した。PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616 mAbdAbのいくつかの精製調製物を作製し、図109(PascoH-616に関するSECプロファイル)、図110(PascoH-TVAAPS_616に関するSECプロファイル)、図111(PascoH-616に関するSDS-PAGE)および図112(PascoH-TVAAPS-616に関するSDS-PAGE)に示すSECおよびSDS-PAGEのデータはこれらの調製物の代表的なものである。

【0599】

19.3 直接結合ELISAにおけるヒトIL-13とmAbdAbの結合
PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616精製mAbdAbを、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは図113に示す。

【0600】

精製PascoH-616とPascoH-TVAAPS-616の両方がヒトIL-13と結合した。精製抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)は、IL-13との結合の陰性対照としてこのアッセイ中に含めた。精製抗ヒトIL13 mAbはIL-13結合の陽性対照として含めた。ここで留意すべきは、dAbは二次検出抗体によって検出されないので、抗IL-13dAb単独(DOM10-53-616)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0601】

19.4 ヒトIL-4およびヒトIL-13との結合に関するBiacore分析
精製mAbdAbは、(方法4および5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、ヒトIL-4およびヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは表32に示す。

【0602】

実験1では、約600の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-13およびIL-4濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nM)を評価した。実験1ではmAbに関してただ1つのIL-13(256nM)およびIL-4(256nM)濃度曲線を評価した。

【0603】

実験2では、約400の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-4(64nM、16nM、4nM、1nM、0.25nMおよび0.0625nM)および6個のIL-13濃度曲線(256nM、64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nM)を評価した。実験2では、ただ1つのIL-13濃度曲線(256nM)を抗IL13 mAbに関して評価し、かつ5個のIL-4濃度曲線(64nM、16nM、4nM、1nMおよび0.25nM)をパスコリツマブに関して評価した。

【表40】

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【0604】

PascoH-616とPascoH-TVAAPS-616の両方が類似した結合親和性でIL-4と結合し、これは抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)の結合親和性とほぼ等しかった。PascoH-616とPascoH-TVAAPS-616の両方がIL-13と結合した。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップで捕捉することができないので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-616)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0605】

19.5 カニクイザルIL-13との結合に関するBiacore分析
精製mAbdAbは、(方法30に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、カニクイザルIL-13との結合に関しても試験した。これらのデータは表33に示す。約400の相対応答単位のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-13濃度曲線(256、64、16、4、1、0.25nM)を評価した。抗IL13 mAbに関するただ1つのIL-13濃度曲線(256nM)が存在した。

【表41】

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【0606】

PascoH-616とPascoH-TVAAPS-616の両方が類似した結合親和性でカニクイザルIL-13と結合した。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップで捕捉することができないので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-616)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0607】

19.6 mAbdAbによるTF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-13の中和
精製mAbdAbを、(それぞれ方法8および方法20中に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-13およびカニクイザルIL-13の中和に関して試験した。これらの分子はそれぞれのアッセイ中で3回試験し、図114は、ヒトIL-13に関する中和データを示す代表的なグラフである。図114aは、カニクイザルIL-13に関する中和データを示す代表的なグラフである。DOM10-53-616は、このバイオアッセイにおけるIL-13の中和に関する陽性対照として含めた。無関係な抗原に対する特異性を有するdAb(陰性対照dAb)も、このバイオアッセイにおけるIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。

【0608】

平均ND₅₀値、標準偏差(SD)および試験回数(n)は表34に示す。

【表42】

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【0609】

PascoH-616とPascoH-TVAAPS-616の両方、および追加的にmAbdAbPascoH-TVAAPS-474 GS除去およびPascoH-474 GS除去が、TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-13の生物活性を完全に中和した。

【0610】

さらに、ヒトIL-13に対するPascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616の中和効力(ND₅₀値)は同様であり、精製抗IL-13dAb単独(DOM10-53-616)に関するND₅₀値の2倍以内であった。

【0611】

PascoH-616およびPascoHTVAAPS-616は、方法22に記載したのと同様に、ELISAによりヒトIL-13Rα2とのヒトIL-13結合の阻害に関しても試験した。これらのデータは実施例18.12に示す。

【0612】

実施例２０
ヒト全血ホスホSTAT6バイオアッセイにおけるヒトIL-13またはIL-4を中和するmAbdAbの能力
ヒト全血ホスホSTAT6バイオアッセイにおけるヒトIL-13またはIL-4を中和するmAbdAbの能力を、方法16に記載したのと同様に実施した。2つのmAbdAb構築物(精製抗IL13 mAb-抗IL4 dAb、586H-TVAAPS-210;および精製抗IL4 mAb-抗IL13 dAb、PascoH-474 GS除去)のIL-4またはIL-13の中和効力(すなわち、IL-4またはIL-13の生物活性の阻害)を決定した。精製抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)および精製抗IL4 dAb(DOM9-112-210)は、このアッセイにおけるrhIL-4の中和に関する陰性対照として含めた。精製抗ヒトIL-13 mAbおよび精製抗IL13 dAb(DOM10-53-474)は、rhIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。(いずれも無関係な抗原に対する特異性を有する)dAbと混合したアイソタイプ適合mAbは、rhIL-4またはrhIL-13の中和に関する陰性対照として含めた。それぞれの分子は、異なるドナー由来の血液を使用して少なくとも2回試験した。図115〜124は代表的なデータを示すグラフである。

【0613】

精製mAbdAbは、rhIL-13およびrhIL-4の生物活性を完全に中和した。

【0614】

方法16中に記載したのと同様に、rhIL-13またはrhIL-4の生物活性を中和する試験分子の能力は、2ng/mLのヒトIL-4またはヒトIL-13を50％中和するのに必要とされる分子(例えばmAbdAb)の濃度(IC₅₀)として表した。これらのデータは表35に示す。それぞれの分子に関するすべてのドナーから組み合わせた平均IC₅₀、および標準偏差を示す。

【表43】

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【0615】

IC₅₀値の比較は、586-TVAAPS-210が(それぞれIL-13およびIL-4全血アッセイにおいて)抗IL13 mAbおよびDOM9-112-210と同様にIL-13およびIL-4誘導pSTAT-6を阻害したことを示した。IC₅₀データの比較も、PascoH-474 GS除去が(それぞれIL-13およびIL-4全血アッセイにおいて)DOM10-53-474およびパスコリツマブと同様にIL-13およびIL-4誘導pSTAT-6を阻害したことを示した。対照mAbはすべてのドナーにおいて661nMの最大試験濃度まで阻害を示さず、かつ対照dAbはすべてのドナーにおいて2291nMの最大試験濃度まで中和を示さなかった。

【0616】

実施例２１
二重標的化抗IL4/抗IL13 mAbdAbのラットPK試験
PascoH-G4S-474、PascoL-G4S-474、586H-TVAAPS-210および586H-TVAAPS-154を(表35.1に要約したように)ラットPK試験において評価した。簡潔には、オスのSprague-Dawleyラット(体重約200グラム〜220グラム)に、2mg/kgの標的用量レベルでmAbdAbを単回静脈内(i/v)投与した。割り当てた時点(0時間〜312時間)で、100μlの血液サンプルを除去し、血漿に処理した。ラット血漿サンプルは、ヒトIgG検出アッセイ、および/またはIL-13リガンド結合アッセイ、および/またはIL-4リガンド結合アッセイにおいて試験分子の存在に関して評価した。さらに、(ラット中の)パスコリツマブに関する血漿中のPKプロファイルも評価した。この場合ラット血漿サンプルは、ヒトIgG検出アッセイおよびIL-4リガンド結合アッセイにおいてパスコリツマブの存在に関して評価した。

【0617】

第1試験では、パスコリツマブを4匹のラットに与えた。第2試験では、4つの治療群が存在し(2mg/kgのPascoH-G4S-474、2mg/kgのPascoL-G4S-474、2mg/kgの586H-TVAAPS-210および2mg/kgの586H-TVAAPS-154)、それぞれの群中には4匹のラットが存在した。

【0618】

(表35.1に示す)PKパラメータは、血漿濃度-時間プロファイルデータから誘導した(これらは示さない)。ここで留意すべきは、いくつかの血漿サンプルはこれらのアッセイ中では2回以上分析し、表35.1中のPKパラメータはこれらのデータベースの1つのみから誘導したことである。さらにここで留意すべきは、PKパラメータは個々の動物用量に標準化せず、その代わりに2mg/kgの名目上の用量を仮定したことである。ここで留意すべきは、PascoH-G4S-474に関するIgG PKアッセイを用いていくつかの技術的困難に直面したので、したがって濃度は過大評価され得ることである。さらに、IgG血漿濃度-時間プロファイルの分析を、いくつかの場合(表35.1中に注記したように、分析1および分析2で)2回実施した。IL-13およびIL-4リガンド結合PKアッセイから生成した血漿濃度-時間プロファイルデータの分析は、分析2のみで実施した。PascoL-G4S-474および586H-TVAAPS-154に関するIL-13およびIL-4リガンド結合アッセイから生成した血漿濃度-時間プロファイルデータは、これらの分子に関するPKパラメータを誘導するために使用しなかった。

【表44】

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【0619】

PascoH-G4S-474に関するIL-13およびIL-4アッセイにおいて生成した血漿濃度-時間プロファイルデータ(および後に誘導したPKパラメータ)は同程度である傾向があった。これは586H-TVAAPS-210に関するIL-13、IL-4およびIgG PKアッセイにおいて生成した血漿濃度-時間プロファイルデータ(および後に誘導したPKパラメータ)にも当てはまった。これは、試験行程を通じてラット血清中で、これらのmAbdAbは「完全」であったことを示唆する。586H-TVAAPS-154に関して誘導したPKパラメータは、任意の他のmAbdAbよりパスコリツマブに関して誘導したPKパラメータとより類似しているようであった。

【0620】

実施例２２
カニクイザルPK試験
PK試験をカニクイザルにおいて実施した。この動物に、1mg/kgの標的用量レベルで単回静脈内投与した。割り当てた時点で、500μlの血液サンプルを採取し血漿に加工した。次いでカニクイザルの血漿サンプルを、IL-13リガンド結合アッセイ、IL-4リガンド結合アッセイおよびIL-13/IL-4架橋アッセイにおいて試験分子の存在に関して評価した。

【0621】

mAbdAb「PascoH-474 GS除去」および「586H-TVAAPS-210」を用いたこれらの試験からの予備データは前に示したラットPKのデータと一致し、これらの分子はmAbより迅速に、ただしdAbよりは遅く体循環から除去されることを示した。

【0622】

実施例２３
23.1 二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
この二重標的化mAbdAbは、mAb重鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗EGFR mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。クローニングに使用した制限部位は、実施例10で述べた制限部位と同じである(SalIおよびHindIII)。

【0623】

抗VEGF dAb(DOM15-26-593)をコードするDNAを次いで(SalIおよびHindIII末端をコードするプライマーを使用して)PCRによって増幅し、修飾3'コード領域中に挿入し、mAbとdAbの間に「STG」(セリン、スレオニン、グリシン)のリンカーをもたらした。

【0624】

それぞれ軽鎖および重鎖の配列を確認したクローン(配列番号164および243)を選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模DNA調製物を作製した。軽鎖と重鎖(配列番号165および137)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物細胞HEK293-6E細胞中でmAbdAbを発現させた。

【0625】

23.2 二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの精製およびSEC分析
この二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプル(DMS4010と称する)のSDS-PAGE分析(図128)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。

【0626】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、事前に平衡化した(HPLCシステムと連結した)S-20010/30GLカラムに施し、1ml/分においてPBS中で実施した。SECプロファイルは、対称ピークとして現れる1種を示す(図129)。

【0627】

23.3 二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの効力
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAb(DMS4010と称する)の抗EGFR効力(図130)は4.784nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは4.214nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図131)において、mAbdAb(DMS4010と称する)のEC50は58pM(0.058nM)であり、一方で抗VEGF対照mAbは214.1pM(0.2141nM)のEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例23の構築物、二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0628】

23.4 二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbのPK
二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAb(DMS4010と称する)の薬物動態プロファイルを、カニクイザルへの投与後に決定した。化合物は5mg/kgの用量で静脈内投与し、投与後の多数の時点での血清中の薬剤レベルを、別のELISAアッセイにおいてEGFRとVEGFの両方との結合によって決定した。図132は、mAbsセツキシマブ(抗EGFR)およびベバシツマブ(抗VEGF)に関して生成した復元データとそのデータを比較した、このアッセイに関する結果を示す。さらなる詳細は表36に示す。

【表45】

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【0629】

23.5 別の抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
別の抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、STGリンカーを使用し重鎖のC末端上のVEGF dAbと連結した同じ抗EGFR mAbを使用して、実施例11.1中で前に記載した方法と類似した方法で構築した。この場合使用した抗VEGF dAbはDOM15-10-11であった。軽鎖と重鎖(配列番号165および186)の共トランスフェクションによる一過性トランスフェクション技法を使用して、この分子をHEK293-6E細胞中で発現させたが、しかしながら、発現の有意に低下したレベルを実施例23.2中に記載した分子の発現と比較して得た。実施例23.3中に記載したのと同様に同じVEGFアッセイにおいて効力に関して試験したとき、このアッセイにおいてVEGF受容体とのVEGF結合の検出不能なレベルの阻害があることが分かった。

【0630】

実施例２４
24.1 リンカーを含まない二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
dAbとmAbのCH3ドメインの間の「STG」リンカーを除去した、実施例23中で前に記載したmAbdAbの誘導体を作製した。SDMを使用して、重鎖をコードするプラスミドからSTGリンカーをコードする残基を欠失させた。それぞれ軽鎖および重鎖の配列を確認したクローン(配列番号243および174)を選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模DNA調製物を作製した。軽鎖と重鎖(配列番号175および137)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物細胞HEK293-6E細胞中でmAbdAbを発現させた。

【0631】

24.2 リンカーを含まない二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの精製およびSEC分析
この二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプル(DMS4011と称する)のSDS-PAGE分析(図133)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。

【0632】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、事前に平衡化した(HPLCシステムと連結した)S-20010/30GLカラムに供し、1ml/分においてPBS中で実施した。SECプロファイルは、対称ピークとして現れる1種を示す(図134)。

【0633】

24.3 リンカーを含まない二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの効力
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。このmAbdAb(DMS4011と称する)の抗EGFR効力(図135)は3.529nMであると計算し、一方で対照、抗EGFR mAbは3.647nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図136)において、mAbdAb(DMS4011と称する)のEC50は342.9pM(0.3429nM)であり、一方で抗VEGF対照mAbは214.1pM(0.2141nM)のEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例24の構築物、リンカーを含まない二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0634】

実施例２５
25.1 長いリンカーを有する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
dAbとmAbのCH3ドメインの間のリンカーが重鎖をコードするプラスミドへの柔軟性「GGGGS」モチーフの1つまたは2つの反復単位の挿入によって延長した、実施例23中で前に記載したmAbdAbの誘導体を作製した。

【0635】

配列番号175で述べる重鎖配列を有する第1分子はこのモチーフの1つの反復単位を有し、したがって「STGGGGGS」のリンカーを有する。

【0636】

配列番号177で述べる重鎖配列を有する第2分子はこのモチーフの2つの反復単位を有し、したがって「STGGGGGSGGGGS」のリンカーを有する。

【0637】

これらはいずれも、実施例23中で使用したのと同じ軽鎖(配列番号243)と独立に組み合わせた。

【0638】

軽鎖および重鎖の配列を確認したクローンを選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模DNA調製物を作製した。軽鎖と重鎖(DMS4023と称する配列番号176および137、ならびにDMS4024と称する配列番号178および137)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物細胞HEK293-6E細胞中でmAbdAbを発現させた。

【0639】

25.2 長いリンカーを有する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの精製およびSEC分析
これらの二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルDMS4023およびDMS4024のSDS-PAGE分析(図137)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。

【0640】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、事前に平衡化した(HPLCシステムと連結した)S-20010/30GLカラムに供し、1ml/分においてPBS中で実施した。DMS4023(図138)とDMS4024(図139)の両方に関するSECプロファイルは、わずかに垂れ下がるピークを有する1種を示す。

【0641】

25.3 長いリンカーを有する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの効力
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。mAbdAb DMS4023の抗EGFR効力(図140)は7.066nMであると算出され、mAbdAb DMS4024の効力は6.420nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは7.291nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図141)において、mAbdAb DMS4023のEC50は91.79pM(0.091nM)であり、mAbdAb DMS4024のEC50は90pM(0.0906nM)であり、一方で抗VEGF対照mAbは463.2pM(0.4632nM)のEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例25の構築物、長いリンカーを有する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0642】

実施例２６
26.1 二重標的化抗VEGF/抗EGFR mAbdAbの作製
この二重標的化mAbdAbは、mAb重鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗VEGF mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。クローニングに使用した制限部位は、実施例10中で述べた制限部位と同じである(SalIおよびHindIII)。

【0643】

抗EGFR dAb(DOM16-39-542)をコードするDNAを次いで(SalIおよびHindIII末端をコードするプライマーを使用して)PCRによって増幅し、修飾3'コード領域中に挿入し、mAbとdAbの間に「STG」(セリン、スレオニン、グリシン)のリンカーをもたらした。

【0644】

それぞれ軽鎖および重鎖の配列を確認したクローン(配列番号179および181)を選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模DNA調製物を作製した。軽鎖と重鎖(配列番号180および182)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物細胞HEK293-6E細胞中でmAbdAbを発現させた。

【0645】

26.2 二重標的化抗VEGF/抗EGFR mAbdAbの精製およびSEC分析
これらの二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプル(DMS4009と称する)のSDS-PAGE分析(図142)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。

【0646】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、事前に平衡化した(HPLCシステムと連結した)S-20010/30GLカラムに供し、1ml/分においてPBS中で実施した。この分子に関するSECプロファイル(図143)は、対称ピークを有する1種を示す。

【0647】

26.3 二重標的化抗VEGF/抗EGFR mAbdAbの効力
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。mAbdAb DMS4009の抗EGFR効力(図144)は132.4nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは6.585nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図145)において、mAbdAbのEC50は539.7pM(0.5397nM)であり、一方で抗VEGF対照mAbは380.5pM(0.3805nM)のEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例26の構築物、二重標的化抗VEGF/抗EGFR mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0648】

実施例２７
27.1 二重標的化抗EGFR/抗IL-13 mAbdAbの作製
この二重標的化mAbdAbは、mAb重鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗EGFR mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。クローニングに使用した制限部位は、実施例10で述べた制限部位と同じである(SalIおよびHindIII)。

【0649】

抗IL-13dAb(DOM10-53-474)をコードするDNAを次いで(SalIおよびHindIII末端をコードするプライマーを使用して)PCRによって増幅し、修飾3'コード領域中に挿入し、mAbとdAbの間に「STG」(セリン、スレオニン、グリシン)のリンカーをもたらした。

【0650】

それぞれ軽鎖および重鎖の配列を確認したクローン(配列番号243および183)を選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模DNA調製物を作製した。軽鎖と重鎖(配列番号137および184)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物細胞HEK293-6E細胞中でmAbdAbを発現させた。

【0651】

27.2 二重標的化抗EGFR/抗IL-13 mAbdAbの精製およびSEC分析
これらの二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプル(DMS4029と称する)のSDS-PAGE分析(図146)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約25および約60kDaの対応する軽鎖およびdAb融合重鎖で泳動した2つのバンドを示す。

【0652】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗EGFR/抗IL-13 mAbdAbを、事前に平衡化した(HPLCシステムと連結した)S-20010/30GLカラムに供し、0.5ml/分においてPBS中で実施した。この分子に関するSECプロファイル(図147)は、対称ピークを有する1種を示す。

【0653】

27.3 二重標的化抗EGFR/抗IL-13 mAbdAbの効力
EGFRおよびIL-13を中和する分子の能力を、それぞれ方法13および25に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。mAbdAb DMS4029の抗EGFR効力(図148)は9.033nMであると算出され、一方で対照、抗EGFR mAbは8.874nMのEC50値を得た。IL-13細胞ベースの中和アッセイ(図149)において、mAbdAbのEC50は1.654nMであり、一方で抗IL-13対照dAbは0.996nMのEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例27の構築物、二重標的化抗EGFR/抗IL-13 mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0654】

実施例２８
28.1 dAbが軽鎖上に位置する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの作製
二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、mAb軽鎖のC末端とdAbの融合によって構築した。抗EGFR mAb重鎖および軽鎖発現カセットを事前に構築した。

【0655】

軽鎖中dAb挿入用の制限部位を導入するために、部位特異的突然変異誘発を使用し、鋳型としてmAb軽鎖発現ベクターを使用してBamHIおよびHindIIIクローニング部位を作製した。抗VEGF dAb(DOM15-26-593)をコードするDNAを次いで(BamHIおよびHindIII末端をコードするプライマーを使用して)PCRによって増幅し、修飾3'コード領域中に挿入し、mAbとdAbの間に「GSTG」または「GSTVAAPS」のいずれかのリンカーをもたらした。

【0656】

配列番号187で述べる軽鎖配列を有する第1分子は「GSTG」のリンカーを有する。

【0657】

配列番号189で述べる軽鎖配列を有する第2分子は「GSTVAAPS」のリンカーを有する。

【0658】

これらはいずれも配列番号245の重鎖と独立に組み合わせた。

【0659】

軽鎖および重鎖の配列を確認したクローンを選択し、製造者のプロトコルに従いQiagen Mega Prepキットを使用して大規模DNA調製物を作製した。軽鎖と重鎖(DMS4013と称する配列番号188および139、ならびにDMS4027と称する配列番号190および139)の共トランスフェクションにより一過性トランスフェクション技法を使用して、哺乳動物HEK293-6E細胞中でmAbdAbを発現させた。

【0660】

28.2 dAbが軽鎖上に位置する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの精製およびSEC分析
これらの二重標的化mAbdAbを、確立したプロトコルに従いプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して浄化した発現上清から精製した。精製サンプルの濃度は、280nmでの吸光度の測定からの分光光度法によって決定した。精製サンプルDMS4013およびDMS4027のSDS-PAGE分析(図150)は約170kDaで泳動した非還元サンプルを示し、一方還元サンプルは、それぞれ約38および約50kDaの対応するdAb融合軽鎖および重鎖で泳動した2つのバンドを示す。

【0661】

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析用に、抗EGFR/抗VEGF mAbdAbを、事前に平衡化した(HPLCシステムと連結した)S-20010/300GLカラムに供し、1ml/分においてPBS中で実施した。DMS4013(図151)とDMS4027(図152)の両方に関するSECプロファイルは、対称ピークを有する1種を示す。

【0662】

28.3 dAbが軽鎖上に位置する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbの効力
VEGFおよびEGFRを中和する分子の能力を、それぞれ方法12および13に記載したのと同様に決定した。アッセイデータはGraphPad Prismを使用して分析した。効力値はS字形用量応答曲線を使用して決定し、データは最適モデルを使用してフィッティングした。mAbdAb DMS4013の抗EGFR効力(図153)は7.384nMであると算出され、mAbdAb DMS4027の効力は7.554nMであると算出され、一方で対照である抗EGFR mAbは7.093nMのEC50値を得た。抗VEGF受容体結合アッセイ(図154)において、mAbdAb DMS4013のEC50は1.179nMであり、mAbdAb DMS4027のEC50は0.1731nMであり、抗VEGF対照mAbは0.130nMのEC50をもたらした。結論として、アッセイデータは、実施例28の構築物、dAbが軽鎖上に位置する二重標的化抗EGFR/抗VEGF mAbdAbは両方の抗原に対して強力であることを示す。

【0663】

実施例２９
二重標的化抗EGFR/抗VEGFおよび抗TNF/抗VEGF mAbdAbのBiacore分析
実施例11(抗TNF/抗VEGF mAbdAb)および実施例23、24、25および28(抗EGFR/抗VEGF mAbdAb)中に記載したmAbdAbにBIAcore分析を施して、それらの対応する抗原との結合に関する反応速度結合定数および解離定数を決定した。分析はBIAcore(商標)3000機器で実施した。機器の温度は25℃に設定した。HBS-EPバッファーはランニングバッファーとして使用した。実験データは機器に関して最高の考えられる割合で回収した。実験用CM5チップ上の1つのフローセルは、製造者の説明書に従い標準的なアミンカップリング化学法を使用してプロテインAでコーティングし、第2のフローセルを同様に処理したが、プロテインAの代わりにバッファーを使用して参照表面を生成した。次いでプロテインAでコーティングしたフローセルを使用してmAbdAbを捕捉した。表37中に詳述するように、抗原は2倍連続希釈系として注入した。数回の希釈を二連で実施した。リガンドの代わりにバッファーのみの注入は、バックグラウンドサブトラクションに使用した。機器ソフトウェアに固有な反応速度ウィザードを使用して、サンプルはランダムな順序で注入した。10mMグリシン、pH1.5を注入することによって、それぞれのサイクルの最後に表面を再生した。データ処理と反応速度フィッティングの両方をBIA評価ソフトウェア4.1を使用して実施した。(同じ実験からの)二連の結果の平均を示すデータを表37に示す。DMS4010に関して示した多数の値は別時に実施した2回の実験を表す。分析したリガンドの濃度のため、787nMの値はおそらく親和性を過大評価する。

【表46】

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【0664】

実施例３０
二重特異性抗体足場と融合した単鎖ドメイン抗体を含む三重特異性抗体
30.1 構築
IL-18およびIL-12抗原に対して特異性を有する二重特異性抗体分子の可変重鎖および軽鎖ドメインをコードする遺伝子(さらなる情報に関してはWO2007/024715を参照)を適切な制限酵素部位を用いてde novoで構築し、シグナル配列を加えた。標準的な分子生物学の技法を使用して、可変重鎖ドメインを、定常領域のC末端でTVAAPSリンカーを介して抗IL4ドメイン抗体DOM9-112-210(配列番号4)と融合したIgG1重鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした。軽鎖可変ドメインを同様に、Ck定常領域配列を含有する発現ベクターにクローニングした。構築および発現した抗体は表38中に挙げる。

【表47】

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【0665】

30.2 発現および精製
簡潔には、25mlのHEK293細胞を1.5×10⁶個細胞/mlで、293fectin試薬(Invitrogen#51-0031)と事前にインキュベートした重鎖および軽鎖発現プラスミドで共トランスフェクトした。細胞は振とうインキュベーター、37℃、5％CO₂、および95％相対湿度中に置いた。24時間後、トリプトン供給培地を加え、細胞はさらに48時間増殖させた。上清は遠心分離によって回収し、IgGレベルはELISAによって定量化した。生成したmAbdAbはBPC1616(配列番号193および194)と称した。

【0666】

30.3 IL-12結合ELISA
トランスフェクションからの細胞上清を組換えヒトIL-12との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを2μg/mlで抗ヒトIL-12(R&D Systems AF219NA)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4％BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。次いでプレートに、ブロッキング溶液に溶かした25ng/mlの組換えヒトIL-12(PeproTech #200-12)をロードした。TBS+0.05％Tween20(TBST)中で洗浄する前に、プレートは室温で1時間インキュベートした。ブロッキング溶液に希釈した様々な希釈の細胞上清、ならびに無関係な対照抗体(パスコリツマブおよびアイソタイプ適合対照hIgG)を加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH₂SO₄の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。

【0667】

結果は図155に表し、BPC1616は組換えヒトIL-12と結合し、一方2つの対照抗体は結合を示さなかったことを示す。

【0668】

30.4 IL-18結合ELISA
トランスフェクションからの細胞上清を組換えヒトIL-18との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを1μg/mlでヒトIL-18(GSKで作製)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4％BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。ブロッキング溶液に希釈した様々な希釈の細胞上清、ならびに無関係な抗体(パスコリツマブおよびアイソタイプ適合対照ヒトIgG)を加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05％Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中の1000倍希釈のペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH₂SO₄の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。結果は図156中に表し、BPC1616は組換えヒトIL-18と結合し、一方2つの対照抗体は結合を示さなかったことを示す。

【0669】

30.5 IL-4結合ELISA
トランスフェクションからの細胞上清を組換えヒトIL-4との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを1μg/mlでヒトIL-4(GSKで作製)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4％BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。ブロッキング溶液に希釈した様々な希釈の細胞上清、ならびに抗IL-4モノクローナル抗体(パスコリツマブ)および無関係な抗体(アイソタイプ適合対照hIgG)を加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05％Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH₂SO₄の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。

【0670】

結果は図157に表し、BPC1616およびパスコリツマブは組換えヒトIL-4と結合し、一方対照抗体は結合を示さないことを示す。

【0671】

実施例３１
モノクローナル抗体のC末端に直列に融合した2つの単鎖ドメイン抗体を含む三重特異性mAbdAb
31.1 構築
2つの単鎖ドメイン抗体がモノクローナル抗体の重鎖のC末端に直列に融合した、3つの三重特異性抗体(mAbdAb-dAb)を構築した。

【0672】

簡潔には、N末端にBglII制限部位およびC末端にBamHI制限部位をPCRにより導入して、ドメイン抗体をコードするDNA配列をDOM10-53-474(配列番号5)、DOM9-155-154(配列番号3)およびDOM9-112-210(配列番号4)と隣接させた。

【0673】

次いでDOM10-53-474ドメイン抗体をコードするDNA断片を、抗IL-4ドメイン抗体DOM9-112-210(配列番号71)と融合した抗IL-5モノクローナル抗体の重鎖をコードする哺乳動物発現ベクターのBamHI部位にクローニングした。DOM9-155-154およびDOM9-112-210ドメイン抗体をコードするDNA断片は両方独立に、抗IL-13ドメイン抗体DOM10-53-474(配列番号116)と融合した抗CD20モノクローナル抗体の重鎖をコードする哺乳動物発現ベクターのBamHI部位にクローニングした。生成した発現ベクターは重鎖をコードし、2つの単鎖ドメイン抗体はC末端に融合する。重鎖のタンパク質配列は、表39に示すように配列番号195、196および197として示す。

【0674】

以下の表39は構築したmAdbAbのまとめである。

【表48】

[この文献は図面を表示できません]

【0675】

31.2 発現および精製
BPC1008、BPC1009およびBPC1010の重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドは、293fectin(Invitrogen、12347019)を使用してHEK2936E細胞に一過的に共トランスフェクトした。トリプトン供給培地を翌日に細胞培養物に加え、上清材料は最初のトランスフェクションから約2〜6日後に採取した。結合アッセイ中で試験する前にプロテインAカラムを使用して、抗体を精製した。

【0676】

31.3: IL-4結合ELISA
96ウェル高結合プレートをコーティングバッファー(0.05M重炭酸塩、pH9.6、Sigma C-3041)₃に溶かした5μg/mlのヒトIL-4(GSK)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(1％BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。精製抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(SigmaA7164)をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いでOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0677】

ELISAの結果は図158に示し、抗体BPC1008、1009およびBPC1010が組換えヒトIL-4と結合することを確認する。陽性対照パスコリツマブも組換えIL-4との結合を示したが、一方で陰性対照抗IL-13 mAbおよびメポリズマブは、IL-4との結合を示さなかった。抗体BPC1009およびBPC1010も別の実験で試験し、図158に示した結果と同様の結果を得た。

【0678】

31.4: IL-5結合ELISA
96ウェル高結合プレートをコーティングバッファー(0.05M重炭酸塩、pH9.6)に溶かした5.9μg/mlのヒトIL-5(GSK)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(1％BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。精製抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma A7164)をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いでOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0679】

図159はELISAの結果を示し、抗体BPC1008が組換えヒトIL-5と結合することを確認し、一方BPC1009およびBPC1010はIL-5との結合を示さなかった。陽性対照メポリズマブも組換えIL-5との結合を示したが、一方で陰性対照抗IL-13 mAbおよびパスコリツマブはIL-5との結合を示さなかった。

【0680】

IL-13結合ELISA
96ウェル高結合プレートをコーティングバッファー(0.05M重炭酸塩pH9.6、SigmaC-3041)₃に溶かした5μg/mlのヒトIL-13(GSK)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(1％BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。精製抗体は、ブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。1時間のインキュベーション後、プレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(SigmaA7164)をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、50μLをそれぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いでOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0681】

ELISAの結果は図160中に示し、抗体BPC1008、1009およびBPC1010が組換えヒトIL-13と結合することを確認する。陽性対照抗IL-13 mAbも組換えIL-13との結合を示したが、一方で陰性対照パスコリツマブおよびメポリズマブは、IL-13との結合を示さなかった。抗体BPC1009およびBPC1010も別の実験中で試験し、図160中に示した結果と同様の結果を得た。

【0682】

実施例３２
一価抗体足場と融合した単鎖ドメイン抗体を含むmAbdAb
32.1 mAbdAbの構築
一価抗体(さらなる情報に関してはWO2006015371およびWO2007059782を参照)とドメイン抗体DOM-15-26-293の融合体を含む二重特異性抗体を以下のように構築した。抗c-Met Knob-into-hole重鎖(配列番号202および203)をコードするDNA配列は、PCRベースの戦略、次に部位特異的突然変異誘発を使用して構築した。抗-c-Met Unibody重鎖(配列番号204)をコードするDNA配列は、PCRベースの戦略、次にPCRベースの手法によるヒンジ領域の除去を使用して構築した。さらに、融合構築物用に、BamHIおよびEcoRI制限部位を重鎖発現カセットのC末端に含めて、既存のベクターからBamHI-EcoRI断片として、抗VEGF-Aドメイン抗体(DOM-15-26-593)(配列番号75のアミノ酸455〜570をコードする)DNA配列の後のクローニングを容易にした。生成する発現ベクターは、GSリンカー(配列番号198、199および201)を介して重鎖のC末端と融合した抗VEGFAドメイン抗体をコードする。抗c-Met軽鎖(配列番号200)をコードするDNA配列は、PCRベースの戦略によって構築した。

【0683】

BPC1604の構築は実施例14に記載する。以下の表40は、一価抗体足場mAbdAbならびに生成および発現した抗体のまとめである。

【表49】

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【0684】

32.2 発現および精製
BPC1017、BPC1018、BPC1019およびBPC1020の重鎖をコードする発現プラスミドは、293fectin(Invitrogen、12347019)を使用してHEK2936E細胞に共トランスフェクトした。トリプトン供給培地を翌日に細胞培養物に加え、上清材料は最初のトランスフェクションから約2〜6日後に採取した。結合アッセイ中で試験する前にプロテインAカラムを使用して抗体を精製した。

【0685】

32.3 HGF受容体結合ELISA
96ウェル高結合プレートをコーティングバッファー(0.05M重炭酸塩、pH9.6、Sigma C-3041)₃に溶かした5μg/mlの組換えヒトHGFR(c-MET)/Fcキメラ(R&D system、カタログ番号:358-MT/CF)でコーティングし、4℃において一晩保存した。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(1％BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも30分間インキュベートした。プレートは3回洗浄した。次いで精製抗体をブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。室温で1時間のインキュベーション後、プレートを3回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体(Sigma A7164)をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、それぞれのウェルに加えた。プレートは1時間インキュベートした。これを3回洗浄し、次いでOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0686】

ELISAの結果は図161に示し、mAbdAb BPC1017およびBPC1018が、抗体BPC1019およびBPC1020に匹敵する活性で組換えヒトc-METと結合することを確認する。陰性対照パスコリツマブおよびBPC1604(IGF-1R/VEGF mAbdAb)はc-METとの結合を示さなかった。

【0687】

32.4 VEGF結合ELISA
96ウェル高結合プレートをPBSに溶かした0.4μg/mlのヒトVEGF(GSK)でコーティングし、4℃において一晩インキュベートした。プレートはトリス緩衝生理食塩水および0.05％のTween-20(TBST)で2回洗浄した。100μLのブロッキング溶液(4％BSA、TBSTバッファー中)をそれぞれのウェルに加え、プレートは室温で少なくとも1時間インキュベートした。次いでさらなる洗浄ステップを実施した。次いで精製抗体をブロッキング溶液中プレートで連続希釈した。室温で1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ペルオキシダーゼ結合抗体をブロッキング溶液中に2000倍に希釈し、それぞれのウェルに加えた。プレートは室温で1時間インキュベートした。さらなる洗浄ステップの後、OPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)SigmaFast基質溶液をそれぞれのウェルに加え、25μLの3M硫酸の添加によって5分後に反応を停止させた。基本終点プロトコルを使用して、VersaMax Tunableマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して490nmで吸光度を読み取った。

【0688】

図162はELISAの結果を示し、mAbdAb BPC1017およびBPC1018が組換えヒトVEGFと結合することを確認する。陽性対照BPC1604も組換えヒトVEGFとの結合を示し、一方でパスコリツマブ、BPC1019およびBPC1020はVEGFとの結合を示さなかった。

【0689】

実施例３３
抗IL13 dAb DOM10-53-546 dAbおよびDOM10-53-567を含有するmAbdAb
33.1 構築、発現および精製
(それぞれ実施例1、1.3および1.5に記載したのと同様に)表41に示す抗IL4 mAb-抗IL13 dAbをクローニングし、HEK2936E細胞中で一時的に発現させ、精製した。

【表50】

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【0690】

精製PascoH-TVAAPS-546およびPascoH-TVAAPS-567 mAbdAbは、還元条件下で、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析した。SECおよびSDS-PAGEデータは図163、164、165および166に示す。

【0691】

33.2 IL-13およびIL-4との結合のBiacore分析
精製PascoH-TVAAPS-546およびPascoH-TVAAPS-567は、(方法4および5に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、ヒトIL-13およびヒトIL-4との結合に関して試験した。これらのデータは表42に示す。

【表51】

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【0692】

このアッセイで試験したmAbdAbは、いずれも非常に高い親和性(NB、PascoH-TVAAPS-567に関して、これは機器の感度を超えていた)および抗ヒトIL4 mAb単独(パスコリツマブ)のそれと類似した結合親和性でIL-4と結合した。PascoH-TVAAPS-546およびPascoH-TVAAPS-567はいずれもIL-13と結合した。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-546およびDOM10-53-567)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0693】

これらのmAbdAbは、(方法23中に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)T100を使用して、カニクイザルIL-13との結合に関しても試験した。これらのデータは表43に示す。500〜750相対応答単位の間のmAbdAb捕捉レベルを得て、6個のIL-13濃度曲線(256、64、16、4、1および0.25nM)をmAbdAbと抗IL13 mAbの両方に関して評価した。

【表52】

[この文献は図面を表示できません]

【0694】

PascoH-TVAAPS-546とPascoH-TVAAPS-567はいずれも、類似した結合親和性でカニクイザルIL-13と結合した。ここで留意すべきは、dAbはプロテインAまたは抗ヒトIgGコーティングCM5チップにおいて捕捉することができないので、抗IL-13 dAb単独(DOM10-53-546およびDOM10-53-567)はこのアッセイでは試験せず、その代わりに、抗ヒトIL13 mAbをこのアッセイ中のIL-13結合を実証するための陽性対照として使用したことである。

【0695】

33.3 TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-13およびカニクイザルIL-13の中和
精製PascoH-TVAAPS-546とPascoH-TVAAPS-567を、(それぞれ方法8および方法20に記載したのと同様に)TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトIL-13およびカニクイザルIL-13の中和に関して試験した。図167および168は、それぞれ(TF-1細胞バイオアッセイ中の)ヒトIL-13およびカニクイザルIL-13に関する中和データを示す。DOM10-53-616は、これらのバイオアッセイ中のIL-13の中和に関する陽性対照として含めた。無関係な抗原に対する特異性を有するdAb(陰性対照dAb)も、IL-13の中和に関する陰性対照として含めた。さらに、PascoH-616およびPascoH-TVAAPS-616も、これらのバイオアッセイにおいて試験した。

【0696】

PascoH-TVAAPS-546とPascoH-TVAAPS-567の両方が、TF-1細胞バイオアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルIL-13の生物活性を完全に中和した。

【0697】

ND₅₀値はデータセットから計算した。ND₅₀値は、IL-13の生物活性を50％中和することができるmAbdAbまたはmAbまたはdAbの濃度である。平均ND₅₀値、標準偏差(SD)および試験回数(n)は表44に示す。

【表53】

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【0698】

実施例３４
IgG2、IgG4およびIgG4PE重鎖定常領域を有するmAbdAb
34.1 mAbdAbの構築
ヒト抗体アイソタイプIgG2、IgG4および変異体IgG4(IgG4PE)遺伝子の重鎖定常領域を、PCRによって既存の構築物から増幅し、標準的な分子生物学の技法を使用してPascoH-GS-474重鎖(配列番号48)をコードする発現ベクターにクローニングした。設計および試験したmAbdAb抗体は表45に挙げる。

【表54】

[この文献は図面を表示できません]

【0699】

34.2 発現
表45に述べるmAbdAbを、BPC1000と称するPascoH-GS-474(配列番号48および15)と共に発現させた。簡潔には、750μlのHEK293細胞を1.5×10⁶個細胞/mlで、293fectin試薬(Invitrogen#51-0031)と事前にインキュベートした重鎖および軽鎖発現プラスミドで共トランスフェクトした。これらを振とうインキュベーター、37℃、5％CO₂、および95％相対湿度中に置いた。1時間後、トリプトン供給培地を加え、細胞はさらに72時間増殖させた。上清は遠心分離によって回収した。

【0700】

34.3 IL-4結合ELISA
これらのmAbdAbを含有する上清を組換えヒトIL-4との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを1μg/mlでヒトIL-4(GSKで作製)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4％BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。様々な希釈の細胞上清、抗IL-4モノクローナル抗体(パスコリツマブ)および無関係な特異性の抗体(586抗IL-13)を加えた。すべてのサンプルはブロッキング溶液中に希釈した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05％Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中の1000倍希釈のペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(Sigma A7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH₂SO₄の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。

【0701】

図169に表す結果は、代わりのアイソタイプを含有するmAbdAbはいずれもヒトIL-4と結合することを示す。mAbdAb BPC1000、BPC1617、BPC1618およびBPC1619に関しては、上清中の抗体の量は定量化せず、したがって図169中に表すデータは非希釈上清材料の希釈係数として表す。抗IL4およびIL-13対照抗体に関しては、アッセイ中で精製物質を使用し、1μg/mlおよび1μg/mlの出発濃度をそれぞれ使用した(これは図169中の1という希釈係数に等しい)。

【0702】

34.4 IL-13結合ELISA
これらのmAbdAbを含有する上清を組換えヒトIL-13との結合に関して評価した。簡潔には、ELISAプレートを5μg/mlでヒトIL-13(GSKで作製)を用いてコーティングし、ブロッキング溶液(4％BSA、トリス緩衝生理食塩水中)でブロッキングした。様々な希釈の細胞上清、抗IL-13モノクローナル抗体(586)および無関係な特異性の抗体(パスコリツマブ抗IL-4)を加えた。すべてのサンプルはブロッキング溶液中に希釈した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBS+0.05％Tween20(TBST)中で洗浄した。ブロッキング溶液中に1000倍希釈でのペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ軽鎖抗体(SigmaA7164)の添加によって結合を検出した。プレートは室温で1時間インキュベートした後、TBST中で洗浄した。プレートはOPD基質(SigmaP9187)の添加によって発色させ、発色は3MのH₂SO₄の添加によって停止させた。吸光度はプレートリーダーを用いて490nmで測定し、平均吸光度をプロットした。

【0703】

図170に表す結果は、代わりのアイソタイプを含有する二重特異性抗体はいずれもヒトIL-13と結合することを示す。二重特異性抗体BPC1000、BPC1617、BPC1618およびBPC1619に関しては、上清中の抗体の量は定量化せず、したがって図170に表すデータは非希釈上清材料の希釈係数として表す。抗IL4およびIL-13対照抗体に関しては、アッセイ中で精製物質を使用し、1μg/mlおよび1μg/mlの出発濃度をそれぞれ使用した(これは図170中の1という希釈係数に等しい)。

【0704】

実施例３５
別の抗IL-13/IL-4 mAbdAb
35.1 別の可変領域配列を有する抗IL-13/IL-4 mAbdAbの構築
標準的な分子生物学の技法を使用して、「C1」および「D1」と称する別の重鎖可変領域抗IL-13 mAbをコードするDNA配列を、既存の構築物から、定常領域のC末端でTVAAPSGSリンカーを介して抗IL-4ドメイン抗体(DOM9-112-210)と融合した、hIgG1定常領域をコードするDNAを含有する発現ベクターに移した。「M0」および「N0」と称するIL-13 mAbの別の軽鎖可変領域をコードするDNA配列をde novoで構築し、ヒトCk定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした。これらの別の重鎖および軽鎖抗体可変領域は、配列番号12および13中に記載した抗IL-13抗体と同じCDR領域を、ただし他のヒト化可変フレームワーク領域と共に含む。

【0705】

35.2 抗IL-13 mAb「656」の可変領域を使用したmAbdAbの構築
標準的な分子生物学の技法を使用して、ヒト化抗IL-13 mAb「656」の重鎖可変領域をコードするDNA配列を既存の構築物から移し、定常領域のC末端でTVAAPSリンカーを介して抗IL-4ドメイン抗体(DOM9-112-210)と融合した、hIgG1定常領域をコードするDNAを含有する発現ベクターにクローニングした。可変軽鎖領域をコードするDNA配列は既存の構築物から移し、ヒトCk定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした。

【0706】

35.3 mAbdAbの発現
簡潔には、25mlのHEK293細胞を1.5×10⁶個細胞/mlで、293fectin試薬(Invitrogen#51-0031)と事前にインキュベートした重鎖および軽鎖発現プラスミドと共トランスフェクトした。これらを振とうインキュベーター、37℃、5％CO₂、および95％相対湿度中に置いた。24時間後、トリプトン供給培地を加え、細胞はさらに72時間増殖させた。上清は遠心分離によって回収し、IgGのレベルはELISAによって定量化した。構築および発現した抗体は表46に挙げる。

【表55】

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【0707】

35.4 IL-13とのmAbdAbの結合
IL-13とのmAbdAbの結合活性をELISAによって評価した。簡潔には、5μg/mlの組換え大腸菌発現ヒトIL-13(GSKで作製および精製)を96ウェルELISAプレートにコーティングした。ウェルを室温で2時間ブロッキングし、次いでmAbdAb構築物をプレートで滴定した。1000倍希釈の抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ結合抗体(カタログ番号A7164、Sigma-Aldrich)を使用して結合を検出した。

【0708】

図177は、試験した分子のすべてがヒトIL-13と結合することができたことを示す。BPC1615はこのELISA中で結合を示したが、この分子の濃度を正確に定量化することはできず、したがってこの分子に関するIL-13結合のELISAデータは図177にプロットしていない。BPC1615は独立したBiacoreアッセイにおいてIL-13に対して高い結合親和性を有することも示された(表47)。

【0709】

35.5 BIAcore(商標)によるIL-13との抗IL13 mAb-抗IL4 dAbの結合
HEK細胞トランスフェクションからの細胞上清を、(方法4に記載したのと同様に)25℃でBIAcore(商標)を使用して、組換え大腸菌発現ヒトIL-13との結合に関しても試験した。BPC1601は精製タンパク質として試験した。表47に示す結合親和性によって、すべての抗体がヒトIL-13に対して高い親和性結合を示すことを確認する。

【表56】

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【0710】

実施例３６
ヒトIL-5およびヒトIL-13に対する特異性を有するmAbdAbの作製
36.1 mAbdAbの構築および発現
配列番号65に示す重鎖および配列番号72に示す軽鎖を有するmAbdAb分子を、HEK2936E細胞中で発現させた。これはメポリズマブL-G4S-474またはBPC1021と称した。

【0711】

36.2 IL-5およびIL-13に対する抗IL5mAb抗IL13 dAbの結合
(細胞上清中の)このmAbdAbを、(方法1に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-13との結合に関して試験した。これらのデータは図173に示す。サンプルはトランスフェクトし、二連で試験し、これはサンプルAおよびサンプルBとして注記した。

【0712】

このmAbdAbはIL-13と結合した。精製抗ヒトIL13 mAb単独は、IL-13結合の陽性対照としてこのアッセイ中に含めた。精製抗ヒトIL-4 mAb(パスコリツマブ)および抗ヒトIL-5 mAb(メポリズマブ)は、IL-13結合の陰性対照として含めた。

【0713】

このmAbdAbは、(実施例31.4中に記載したのと同様に)直接結合ELISAにおいてヒトIL-5との結合に関しても試験した。これらのデータは図174に示す。

【0714】

メポリズマブL-G4S-474はIL-5と結合した。精製抗ヒトIL4 mAb(パスコリツマブ)および精製抗ヒト13 mAbは、IL-5との結合の陰性対照として含めた。精製抗ヒトIL5 mAb(メポリズマブ)は、このアッセイ中のIL-5を実証するための陽性対照として使用した。

【0715】

配列

【表57】

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【0716】

1. ドメイン抗体
配列番号1=DOM9-155-25

【化5】

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【0717】

配列番号2=DOM9-155-147

【化6】

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【0718】

配列番号3=DOM9-155-154

【化7】

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【0719】

配列番号4=DOM9-112-210

【化8】

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【0720】

配列番号5=DOM10-53-474

【化9】

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【0721】

配列番号60=DOM9-155-147のDNA配列(タンパク質=配列番号2)

【化10】

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【0722】

配列番号61=DOM9-155-154のDNA配列(タンパク質=配列番号3)

【化11】

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【0723】

2. リンカー
配列番号6=G4Sリンカー

【化12】

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【0724】

配列番号7=リンカー

【化13】

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【0725】

配列番号8=リンカー

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

【0726】

配列番号9=リンカー

【化15】

[この文献は図面を表示できません]

【0727】

配列番号10=リンカー

【化16】

[この文献は図面を表示できません]

【0728】

配列番号11=リンカー

【化17】

[この文献は図面を表示できません]

【0729】

3. モノクローナル抗体
配列番号12=抗ヒトIL13 mAb (H鎖)

【化18】

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【0730】

配列番号13=抗ヒトIL13 mAb (L鎖)

【化19】

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【0731】

配列番号14=パスコリツマブ(H鎖)

【化20】

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【0732】

配列番号15=パスコリツマブ(L鎖)

【化21】

[この文献は図面を表示できません]

【0733】

配列番号65=メポリズマブ(H鎖)

【化22】

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【0734】

配列番号66=メポリズマブ(L鎖)

【化23】

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【0735】

配列番号67=抗ヒトIL-18 mAb (H鎖)

【化24】

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【0736】

配列番号68=抗ヒトIL-18 mAb (L鎖)

【化25】

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【0737】

4. 二重特異的 mAbdAb
注記:「太字」テキスト中の配列の下線部はリンカーに対応する。「GS」アミノ酸残基(そのコード配列をBamHIクローニング部位として用いた)は「太字」テキストに入っていないが、下線を引いてある。

【0738】

配列番号16=586H-25 (H鎖)

【化26】

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【0739】

配列番号17=586H-147 (H鎖)

【化27】

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【0740】

配列番号18=586H-154 (H鎖)

【化28】

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【0741】

配列番号19=586H-210 (H鎖)

【化29】

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【0742】

配列番号20=586H-G4S-25 (H鎖)

【化30】

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【0743】

配列番号21=586H-G4S-147 (H鎖)

【化31】

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【0744】

配列番号22=586H-G4S-154 (H鎖)

【化32】

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【0745】

配列番号23=586H-G4S-210 (H鎖)

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

【0746】

配列番号24=586H-TVAAPS-25 (H鎖)

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

【0747】

配列番号25=586H-TVAAPS-147 (H鎖)

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

【0748】

配列番号26=586H-TVAAPS-154 (H鎖)

【化36】

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【0749】

配列番号27=586H-TVAAPS-210 (H鎖)

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

【0750】

配列番号28=586H-ASTKG-25 (H鎖)

【化38】

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【0751】

配列番号29=586H-ASTKG-147 (H鎖)

【化39】

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【0752】

配列番号30=586H-ASTKG-154 (H鎖)

【化40】

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【0753】

配列番号31=586H-ASTKG-210 (H鎖)

【化41】

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【0754】

配列番号32=586H-EPKSC-25 (H鎖)

【化42】

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【0755】

配列番号33=586H-EPKSC-147 (H鎖)

【化43】

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【0756】

配列番号34=586H-EPKSC-154 (H鎖)

【化44】

[この文献は図面を表示できません]

【0757】

配列番号35=586H-EPKSC-210 (H鎖)

【化45】

[この文献は図面を表示できません]

【0758】

配列番号36=586H-ELQLE-25 (H鎖)

【化46】

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【0759】

配列番号37=586H-ELQLE-147 (H鎖)

【化47】

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【0760】

配列番号38=586H-ELQLE-154 (H鎖)

【化48】

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【0761】

配列番号39=586H-ELQLE-210 (H鎖)

【化49】

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【0762】

配列番号40=586H-GS (H鎖)

【化50】

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【0763】

配列番号41=586H-ASTKG (H鎖)

【化51】

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【0764】

配列番号42=586H-EPKSC (H鎖)

【化52】

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【0765】

配列番号43=586H-ELQLE (H鎖)

【化53】

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【0766】

配列番号44=586L-G4S-25 (L鎖)

【化54】

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【0767】

配列番号45=586L-G4S-147 (L鎖)

【化55】

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【0768】

配列番号46=586L-G4S-154 (L鎖)

【化56】

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【0769】

配列番号47=586L-G4S-210 (L鎖)

【化57】

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【0770】

配列番号48=PascoH-474 (H鎖)

【化58】

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【0771】

配列番号49=PascoH-G4S-474 (H鎖)

【化59】

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【0772】

配列番号50=PascoH-TVAAPS-474 (H鎖)

【化60】

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【0773】

配列番号51=PascoH-ASTKG-474 (H鎖)

【化61】

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【0774】

配列番号52=PascoH-EPKSC-474 (H鎖)

【化62】

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【0775】

配列番号53=PascoH-ELQLE-474 (H鎖)

【化63】

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【0776】

配列番号54=PascoL-474 (L鎖)

【化64】

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【0777】

配列番号55=PascoL-G4S-474 (L鎖)

【化65】

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【0778】

配列番号56=PascoL-TVAAPS-474 (L鎖)

【化66】

[この文献は図面を表示できません]

【0779】

配列番号57=PascoL-ASTKG-474 (L鎖)

【化67】

[この文献は図面を表示できません]

【0780】

配列番号58=PascoL-EPKSC-474 (L鎖)

【化68】

[この文献は図面を表示できません]

【0781】

配列番号59=PascoL-ELQLE-474 (L鎖)

【化69】

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【0782】

5. サイトカイン
配列番号62=IL-4 (インターロイキン-4)

【化70】

[この文献は図面を表示できません]

【0783】

配列番号63=IL-13 (インターロイキン-13)

【化71】

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【0784】

6. シグナル配列
配列番号64=哺乳動物アミノ酸シグナル配列

【化72】

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【0785】

7. IGF-1R結合性CDR
配列番号80=VH CDR3

【化73】

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【0786】

配列番号81=VH CDR2

【化74】

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【0787】

配列番号82=VH CDR1

【化75】

[この文献は図面を表示できません]

【0788】

配列番号83=VL CDR1

【化76】

[この文献は図面を表示できません]

【0789】

配列番号84=代替VL CDR2

【化77】

[この文献は図面を表示できません]

【0790】

配列番号85=VL CDR3

【化78】

[この文献は図面を表示できません]

【0791】

配列番号86=VL CDR2

【化79】

[この文献は図面を表示できません]

【0792】

8. 三重特異的mAbdAb
配列番号69=IL18 mAb-G4S-DOM9-112-210 (H鎖)

【化80】

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【0793】

配列番号70=IL18 mAb-G4S-DOM10-53-474 (L鎖)

【化81】

[この文献は図面を表示できません]

【0794】

配列番号71=IL-5 mAb-G4S-DOM9-112-210重鎖

【化82】

[この文献は図面を表示できません]

【0795】

配列番号72=IL-5 mAb-G4S-DOM10-53-474軽鎖

【化83】

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【0796】

9. 二重標的化抗TNF/抗EGFR mAbdAb
配列番号73=抗TNF mAb (L鎖)

【化84】

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【0797】

配列番号74=抗TNF mAb-DOM16-39-542 (H鎖)

【化85】

[この文献は図面を表示できません]

【0798】

10. 二重標的化抗TNF/抗VEGF mAbdAb
配列番号75=抗TNF mAb-DOM15-26-593 (H鎖)

【化86】

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【0799】

11. 二重標的化抗IL1R1/抗VEGF dAb伸長IgG
配列番号76=DOM15-26-593-VHdUMMY (H鎖)

【化87】

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【0800】

配列番号77=DOM4-130-54-VkdUMMY (L鎖)

【化88】

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【0801】

12. 三重標的化抗TNF/抗EGFR/抗VEGF mAbdAb
配列番号78=DOM 15-26-抗TNF mAb (H鎖)

【化89】

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【0802】

配列番号79=DOM 16-39-542-抗TNF mAb (L鎖)

【化90】

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【0803】

配列番号87=586H-210 (H鎖) GS除去

【化91】

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【0804】

配列番号88=586H-TVAAPS-210 (H鎖) GS除去

【化92】

[この文献は図面を表示できません]

【0805】

配列番号89=586H-ASTKGPT-210 (H鎖) 両GS除去

【化93】

[この文献は図面を表示できません]

【0806】

配列番号90=586H-ASTKGPS-210 (H鎖) 両GS除去

【化94】

[この文献は図面を表示できません]

【0807】

配列番号91=PascoH-474 (H鎖) GS除去

【化95】

[この文献は図面を表示できません]

【0808】

配列番号92=PascoH-TVAAPS-474 (H鎖) GS除去

【化96】

[この文献は図面を表示できません]

【0809】

配列番号93=PascoH-ASTKGPT-474 (H鎖) 両GS除去

【化97】

[この文献は図面を表示できません]

【0810】

配列番号94=PascoH-ASTKGPS-474 (H鎖) 両GS除去

【化98】

[この文献は図面を表示できません]

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【0811】

配列番号95=PascoH-ASTKGPS-474 (H鎖) 2番目のGS除去

【化99】

[この文献は図面を表示できません]

【0812】

配列番号96=PascoH-ASTKGPT-474 (H鎖) 2番目のGS除去

【化100】

[この文献は図面を表示できません]

【0813】

配列番号97=CDRH1

【化101】

[この文献は図面を表示できません]

【0814】

配列番号98=CDRH2

【化102】

[この文献は図面を表示できません]

【0815】

配列番号99=CDRH3

【化103】

[この文献は図面を表示できません]

【0816】

配列番号100=CDRL1

【化104】

[この文献は図面を表示できません]

【0817】

配列番号101=CDRL2

【化105】

[この文献は図面を表示できません]

【0818】

配列番号102=CDRL3

【化106】

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【0819】

配列番号103=EGFRエピトープ

【化107】

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【0820】

配列番号104=CDRH1

【化108】

[この文献は図面を表示できません]

【0821】

配列番号105=CDRH2

【化109】

[この文献は図面を表示できません]

【0822】

配列番号106=CDRH3

【化110】

[この文献は図面を表示できません]

【0823】

配列番号107=CDRH2

【化111】

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【0824】

配列番号108=TVAAPSGSリンカーを有してC末端でDOM15-26-593と融合した抗IGF-1R抗体H0L0の重鎖

【化112】

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【0825】

配列番号109=GSリンカーを有してC末端でDOM15-26-593と融合した抗IGF-1R抗体H0L0の重鎖

【化113】

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【0826】

配列番号110=抗IGF-1R抗体H0L0の重鎖

【化114】

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【0827】

配列番号111=TVAAPSGSリンカーを有してC末端でDOM15-26-593と融合した抗IGF-1R抗体H0L0の軽鎖

【化115】

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【0828】

配列番号112=GSリンカーを有してC末端でDOM15-26-593と融合した抗IGF-1R抗体H0L0の軽鎖

【化116】

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【0829】

配列番号113=抗IGF-1R抗体H0L0の軽鎖

【化117】

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【0830】

配列番号114=抗体2B9の可変重鎖ドメイン

【化118】

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【0831】

配列番号115=抗体2B9の可変軽鎖ドメイン

【化119】

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【0832】

配列番号116=TVAAPSGSリンカーおよびC末端に融合したDOM10-53-474ドメイン抗体を有する抗CD20 mAb重鎖のタンパク質配列

【化120】

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【0833】

配列番号117=抗CD20 mAb VL-ヒトCκ軽鎖のタンパク質配列

【化121】

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【0834】

配列番号118=GSリンカーおよびC末端で融合したDOM10-53-474ドメイン抗体を有する抗CD20 mAb重鎖のタンパク質配列

【化122】

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【0835】

配列番号119=TVAAPSGSリンカーおよびC末端で融合したDOM10-53-474ドメイン抗体を有する抗CD20 mAb軽鎖のタンパク質配列

【化123】

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【0836】

配列番号120=抗CD20 mAb VH-ヒトIgG1重鎖のタンパク質配列

【化124】

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【0837】

配列番号121=GSリンカーおよびC末端で融合したDOM10-53-474ドメイン抗体を有する抗CD20 mAb軽鎖のタンパク質配列

【化125】

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【0838】

配列番号122: 586H-TVAAPS-154重鎖

【化126】

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【0839】

配列番号123

【化127】

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【0840】

配列番号124

【化128】

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【0841】

配列番号125

【化129】

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【0842】

配列番号126

【化130】

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【0843】

配列番号127

【化131】

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【0844】

配列番号128

【化132】

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【0845】

配列番号129

【化133】

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【0846】

配列番号130

【化134】

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【0847】

配列番号131

【化135】

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【0848】

配列番号132: 抗IL-4重鎖-TVAAPSGS-抗TNF-αアドネクチン

【化136】

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【0849】

配列番号133

【化137】

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【0850】

配列番号134

【化138】

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【0851】

配列番号135

【化139】

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【0852】

配列番号136

【化140】

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【0853】

配列番号137

【化141】

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【0854】

配列番号138

【化142】

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【0855】

配列番号139

【化143】

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【0856】

配列番号140

【化144】

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【0857】

配列番号141

【化145】

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【0858】

配列番号142

【化146】

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【0859】

配列番号143

【化147】

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【0860】

配列番号144

【化148】

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【0861】

配列番号145

【化149】

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【0862】

配列番号146

【化150】

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【0863】

配列番号147

【化151】

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【0864】

配列番号148=DOM10-53-616 (dAb)

【化152】

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【0865】

配列番号149=PascoH-616 (H鎖)

【化153】

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【0866】

配列番号150=PascoH-TVAAPS-616 (H鎖)

【化154】

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【0867】

配列番号151=C1-TVAAPSGS-210 (H鎖)

【化155】

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【0868】

配列番号152=D1-TVAAPSGS-210 (H鎖)

【化156】

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【0869】

配列番号153=N0 (L鎖)

【化157】

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【0870】

配列番号154=M0 (L鎖)

【化158】

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【0871】

配列番号155=656H-TVAAPS-210 (H鎖)

【化159】

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【0872】

配列番号156=656 (L鎖)

【化160】

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【0873】

配列番号157=PascoH-TVAAPS-546 (H鎖)

【化161】

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【0874】

配列番号158=PascoH-546 (H鎖)

【化162】

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【0875】

配列番号159=PascoH-TVAAPS-567 (H鎖)

【化163】

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【0876】

配列番号160=PascoH-567 (H鎖)

【化164】

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【0877】

配列番号161=656 (H鎖)

【化165】

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【0878】

配列番号162

【化166】

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【0879】

配列番号163

【化167】

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【0880】

配列番号164

【化168】

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【0881】

配列番号165

【化169】

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【0882】

配列番号166

【化170】

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【0883】

配列番号167 586H-TVAAPS-210重鎖

【化171】

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【0884】

配列番号168

【化172】

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【0885】

配列番号169

【化173】

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【0886】

配列番号170

【化174】

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【0887】

配列番号171

【化175】

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【0888】

配列番号172

【化176】

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【0889】

配列番号173

【化177】

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【0890】

配列番号174

【化178】

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【0891】

配列番号175

【化179】

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【0892】

配列番号176

【化180】

[この文献は図面を表示できません]

【0893】

配列番号177

【化181】

[この文献は図面を表示できません]

【0894】

配列番号178

【化182】

[この文献は図面を表示できません]

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【0895】

配列番号179

【化183】

[この文献は図面を表示できません]

【0896】

配列番号180

【化184】

[この文献は図面を表示できません]

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【0897】

配列番号181

【化185】

[この文献は図面を表示できません]

【0898】

配列番号182

【化186】

[この文献は図面を表示できません]

【0899】

配列番号183

【化187】

[この文献は図面を表示できません]

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【0900】

配列番号184

【化188】

[この文献は図面を表示できません]

【0901】

配列番号185

【化189】

[この文献は図面を表示できません]

【0902】

配列番号186

【化190】

[この文献は図面を表示できません]

【0903】

配列番号187

【化191】

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【0904】

配列番号188

【化192】

[この文献は図面を表示できません]

【0905】

配列番号189

【化193】

[この文献は図面を表示できません]

【0906】

配列番号190

【化194】

[この文献は図面を表示できません]

【0907】

配列番号191

【化195】

[この文献は図面を表示できません]

【0908】

配列番号192: 586H-ASTKG-210重鎖

【化196】

[この文献は図面を表示できません]

【0909】

配列番号193

【化197】

[この文献は図面を表示できません]

【0910】

配列番号194

【化198】

[この文献は図面を表示できません]

【0911】

配列番号195: 抗IL-5重鎖-G4S-dAb474-TVAAPSGS-dAb210

【化199】

[この文献は図面を表示できません]

【0912】

配列番号196: 抗CD20重鎖-TVAAPSGS-dAb154-TVAAPSGS-dAb474

【化200】

[この文献は図面を表示できません]

【0913】

配列番号197: 抗CD20重鎖-TVAAPSGS-dAb210-TVAAPSGS-dAb474

【化201】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0914】

配列番号198: 抗cMET 5D5v2重鎖(全体)-GS-dAb593

【化202】

[この文献は図面を表示できません]

【0915】

配列番号199: 抗cMET 5D5v2重鎖(ノブ)-GS-dAb593

【化203】

[この文献は図面を表示できません]

【0916】

配列番号200: 抗cMET 5D5v2軽鎖

【化204】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0917】

配列番号201: 抗cMET 5D5v2 IgG4重鎖(UNIBODY)-GS-dAb593

【化205】

[この文献は図面を表示できません]

【0918】

配列番号202: 抗cMET 5D5v2重鎖(全体)

【化206】

[この文献は図面を表示できません]

【0919】

配列番号203: 抗cMET 5D5v2重鎖(ノブ)

【化207】

[この文献は図面を表示できません]

【0920】

配列番号204: 抗cMET 5D5v2 IgG4重鎖(UNIBODY)

【化208】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0921】

配列番号205: 抗ヒトIL13 mAb重鎖

【化209】

[この文献は図面を表示できません]

【0922】

配列番号206: 代替抗ヒトIL13 mAb重鎖

【化210】

[この文献は図面を表示できません]

【0923】

配列番号207: PascoH IgG2-GS-474重鎖

【化211】

[この文献は図面を表示できません]

【0924】

配列番号208: PascoH IgG4-GS-474重鎖

【化212】

[この文献は図面を表示できません]

【0925】

配列番号209: PascoH IgG4 PE-GS-474重鎖

【化213】

[この文献は図面を表示できません]

【0926】

配列番号210: 抗ヒトIL13 mAb軽鎖

【化214】

[この文献は図面を表示できません]

【0927】

配列番号211: パスコリツマブ重鎖

【化215】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0928】

配列番号212: パスコリツマブ軽鎖

【化216】

[この文献は図面を表示できません]

【0929】

配列番号213: メポリズマブ重鎖

【化217】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0930】

配列番号214: メポリズマブ軽鎖

【化218】

[この文献は図面を表示できません]

【0931】

配列番号215: PascoH-474重鎖

【化219】

[この文献は図面を表示できません]

【0932】

配列番号216: PascoH-TVAAPS-474重鎖

【化220】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0933】

配列番号217: PascoL-474軽鎖

【化221】

[この文献は図面を表示できません]

【0934】

配列番号218: PascoL-TVAAPS-474軽鎖

【化222】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0935】

配列番号219: IL-5 mAb-G4S-DOM9-112-210重鎖

【化223】

[この文献は図面を表示できません]

【0936】

配列番号220: IL-5 mAb-G4S-DOM10-53-474軽鎖

【化224】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0937】

配列番号221: 586H-210重鎖(GS除去)

【化225】

[この文献は図面を表示できません]

【0938】

配列番号222: 586H-TVAAPS-210重鎖(GS除去)

【化226】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0939】

配列番号223: PascoH-474重鎖(GS除去)

【化227】

[この文献は図面を表示できません]

【0940】

配列番号224: PascoH-TVAAPS-474重鎖(GS除去)

【化228】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0941】

配列番号225: PascoH-ASTKGPT-474重鎖(2番目のGS除去)

【化229】

[この文献は図面を表示できません]

【0942】

配列番号226: TVAAPSGSリンカーを有してC末端にDOM15-26-593が融合した抗IGF-1R抗体H0L0の重鎖

【化230】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0943】

配列番号227: IGF1R mAb-GS-DOM15-26-593重鎖

【化231】

[この文献は図面を表示できません]

【0944】

配列番号228: 抗IGF-1R抗体重鎖

【化232】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0945】

配列番号229: TVAAPSGSリンカーを有してC末端にDOM15-26-593が融合した抗IGF-1R抗体H0L0の軽鎖

【化233】

[この文献は図面を表示できません]

【0946】

配列番号230: GSリンカーを有してC末端にDOM15-26-593が融合した抗IGF-1R抗体H0L0の軽鎖

【化234】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0947】

配列番号231: 抗IGF-1R抗体軽鎖

【化235】

[この文献は図面を表示できません]

【0948】

配列番号232: 抗IGF1R重鎖-GS-TLPC

【化236】

[この文献は図面を表示できません]

【0949】

配列番号233: 抗IGF1R重鎖-GS-CT01アドネクチン

【化237】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0950】

配列番号234: 抗IGF1R重鎖-TVAAPSGS-TLPC

【化238】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0951】

配列番号235: 抗IGF1R重鎖-GS-AFFI

【化239】

[この文献は図面を表示できません]

【0952】

配列番号236: 抗IGF1R重鎖-TVAAPSGS-AFFI

【化240】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0953】

配列番号237: 抗IGF1R重鎖-GS-DRPN

【化241】

[この文献は図面を表示できません]

【0954】

配列番号238: 抗IGF1R重鎖-TVAAPSGS-DRPN

【化242】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0955】

配列番号239: 抗IL-4重鎖-GS-抗RNAse AラクダV_HH

【化243】

[この文献は図面を表示できません]

【0956】

配列番号240: 抗IL-4重鎖-GS-NARV

【化244】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0957】

配列番号241: 抗IGF1R重鎖-TVAAPSGS-CT01アドネクチン

【化245】

[この文献は図面を表示できません]

【0958】

配列番号242: アービタックス重鎖-RS-CT01アドネクチン

【化246】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0959】

配列番号243:アービタックス軽鎖

【化247】

[この文献は図面を表示できません]

【0960】

配列番号244: アービタックス軽鎖-RS-CT01アドネクチン

【化248】

[この文献は図面を表示できません]

【0961】

配列番号245: アービタックス重鎖

【化249】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0962】

配列番号246: CT01アドネクチン-GSTG-アービタックス重鎖

【化250】

[この文献は図面を表示できません]

【0963】

配列番号247: CT01アドネクチン-STG-アービタックス軽鎖

【化251】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0964】

配列番号248: PascoH-616重鎖

【化252】

[この文献は図面を表示できません]

【0965】

配列番号249: PascoH-TVAAPS-616重鎖

【化253】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0966】

配列番号250: 656H-TVAAPS-210重鎖

【化254】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0967】

配列番号251: 656軽鎖

【化255】

[この文献は図面を表示できません]

【0968】

配列番号252: PascoH-TVAAPS-546重鎖

【化256】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0969】

配列番号253: PascoH-546重鎖

【化257】

[この文献は図面を表示できません]

【0970】

配列番号254: PascoH-TVAAPS-567重鎖

【化258】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0971】

配列番号255: PascoH-567重鎖

【化259】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0972】

配列番号256: 656重鎖

【化260】

[この文献は図面を表示できません]

【0973】

配列番号257: 抗IL-5重鎖-G4S-dAb474-TVAAPSGS-dAb210

【化261】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0974】

配列番号258: 抗CD-20重鎖-TVAAPSGS-dAb154-TVAAPSGS-dAb474

【化262】

[この文献は図面を表示できません]

【0975】

配列番号259: 抗CD-20重鎖-TVAAPSGS-dAb210-TVAAPSGS-dAb474

【化263】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0976】

配列番号260: 抗cMET 5D5v2重鎖(全体)-GS-dAb593

【化264】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0977】

配列番号261: 抗cMET 5D5v2重鎖(ノブ)-GS-dAb593

【化265】

[この文献は図面を表示できません]

【0978】

配列番号262: 抗cMET 5D5v2軽鎖

【化266】

[この文献は図面を表示できません]

【0979】

配列番号263:抗cMET 5D5v2 IgG4重鎖(UNIBODY)-GS-dAb593

【化267】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0980】

配列番号264: 抗cMET 5D5v2重鎖(全体)

【化268】

[この文献は図面を表示できません]

【0981】

配列番号265: 抗cMET 5D5v2重鎖(ノブ)

【化269】

[この文献は図面を表示できません]

【0982】

配列番号266: 抗cMET 5D5v2 IgG4重鎖(UNIBODY)

【化270】

[この文献は図面を表示できません]

【0983】

配列番号267: PascoH IgG2-GS-474重鎖

【化271】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0984】

配列番号268: PascoH IgG4-GS-474重鎖

【化272】

[この文献は図面を表示できません]

【0985】

配列番号269: PascoH IgG PE-GS-474重鎖

【化273】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

【0986】

配列番号270: 抗IL-4重鎖-GS-抗TNF-αアドネクチン

【化274】

[この文献は図面を表示できません]

[１] 1以上のエピトープ結合性ドメインに連結されたタンパク質足場を含む抗原結合性構築物であって、そのうちの少なくとも1つがエピトープ結合性ドメインに由来し、そのうちの少なくとも1つが対になったVH/VLドメインに由来する少なくとも2つの抗原結合部位を有する、上記抗原結合性構築物。
[２] 式I：

【化275】

[この文献は図面を表示できません]

[式中、
Xは定常重鎖ドメイン2および定常重鎖ドメイン3を含む定常抗体領域を表し、
R¹、R⁴、R⁷およびR⁸は、独立に、エピトープ結合性ドメインから選択されるドメインを表し、
R²は、定常重鎖1、およびエピトープ結合性ドメインからなる群より選択されるドメインを表し、
R³は、対になったVHおよびエピトープ結合性ドメインからなる群より選択されるドメインを表し、
R⁵は、定常軽鎖、およびエピトープ結合性ドメインからなる群より選択されるドメインを表し、
R⁶は、対になったVLおよびエピトープ結合性ドメインからなる群より選択されるドメインを表し、
nは、独立に、0、1、2、3および4より選択される整数を表し、
mは、独立に、0および1より選択される整数を表し、
定常重鎖1ドメインと定常軽鎖ドメインとが結合しており、
少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインが存在し、
R³が対になったVHドメインを表す場合、R⁶は対になったVLドメインを表し、それにより該2つのドメインは一緒に抗原に結合することが可能である]
の2つ以上の構造を含む少なくとも1つのホモ二量体を含む、抗原結合性構築物。
[３] R⁶が対になったVLを表し、R³が対になったVHを表す、２に記載の抗原結合性構築物。
[４] R⁷およびR⁸のいずれか一方または両方がエピトープ結合性ドメインを表す、３に記載の抗原結合性構築物。
[５] R¹およびR⁴のいずれか一方または両方がエピトープ結合性ドメインを表す、２〜４のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[６] R⁴が存在する、２〜４のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[７] R¹、R⁷およびR⁸がエピトープ結合性ドメインを表す、２〜６のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[８] R¹、R⁷およびR⁸、ならびにR⁴がエピトープ結合性ドメインを表す、２〜６のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[９] 少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインがdAbである、１〜８のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[１０] dAbがヒトdAbである、９に記載の抗原結合性構築物。
[１１] dAbがラクダdAbである、９に記載の抗原結合性構築物。
[１２] dAbがサメdAb(NARV)である、９に記載の抗原結合性構築物。
[１３] 少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインが、CTLA-4(Evibody)；リポカリン；プロテインA由来分子、例えばプロテインAのZドメイン(Affibody、SpA)、Aドメイン(Avimer/Maxibody)；熱ショックタンパク質、例えばGroEIおよびGroES、トランスフェリン(trans-body)；アンキリンリピートタンパク質(DARPin)；ペプチドアプタマー；C型レクチンドメイン(Tetranectin)；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン(affilins)；PDZドメイン；ヒトプロテアーゼインヒビターのスコーピオントキシンクニッツ(scorpion toxinkunitz)型ドメイン；およびフィブロネクチン(アドネクチン)より選択される足場に由来する、１〜８のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[１４] エピトープ結合性ドメインが、Affibody、アンキリンリピートタンパク質(DARPin)およびアドネクチンより選択される足場に由来する、１３に記載の抗原結合性構築物。
[１５] エピトープ結合性ドメインが、dAb、Affibody、アンキリンリピートタンパク質(DARPin)およびアドネクチンより選択される、１〜８のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[１６] 2以上の抗原に対する特異性を有する、１〜１５のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[１７] 第1の結合部位が抗原上の第1のエピトープに対する特異性を有し、第2の結合部位が同じ抗原上の第2のエピトープに対する特異性を有する、１〜１６のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[１８] IL-13に結合することが可能である、１〜１７のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[１９] IL-13、IL-5、およびIL-4より選択される2以上の抗原に結合することが可能である、１〜１８のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[２０] IL-13およびIL-4に同時に結合することが可能である、１９に記載の抗原結合性構築物。
[２１] VEGF、IGF-1RおよびEGFRより選択される2以上の抗原に結合することが可能である、１〜２０のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[２２] TNFに結合することが可能である、１〜２１のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[２３] TNFおよびIL1-Rに結合することが可能である、２２に記載の抗原結合性構築物。
[２４] タンパク質足場がIg足場である、１または９〜２３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[２５] Ig足場がIgG足場である、２４に記載の抗原結合性構築物。
[２６] IgG足場が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4より選択される、２５に記載の抗原結合性構築物。
[２７] タンパク質足場が一価抗体を含む、１または９〜２６のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[２８] IgG足場が抗体のすべてのドメインを含む、２５〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[２９] 4つのドメイン抗体を含む、９〜１２または１５〜２８のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[３０] ドメイン抗体のうち2つが同じ抗原に対する特異性を有する、２９に記載の抗原結合性構築物。
[３１] ドメイン抗体のすべてが同じ抗原に対する特異性を有する、２９に記載の抗原結合性構築物。
[３２] 単鎖可変ドメインのうち少なくとも1つが、1〜150アミノ酸を含むリンカーを用いてIg足場に直接的に連結されている、１〜３１のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[３３] 単鎖可変ドメインのうち少なくとも1つが、1〜20アミノ酸を含むリンカーを用いてIg足場に直接的に連結されている、３２に記載の抗原結合性構築物。
[３４] エピトープ結合性ドメインのうち少なくとも1つが、配列番号６〜１１のいずれか1つのリンカーもしくは「GS」、またはそれらのいずれかの組み合わせより選択されるリンカーを用いてIg足場に直接的に連結されている、３３に記載の抗原結合性構築物。
[３５] エピトープ結合性ドメインのうち少なくとも1つがヒト血清アルブミンに結合する、１〜３４のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[３６] 軽鎖のN末端でIg足場と連結したエピトープ結合性ドメインを含む、２１〜３３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[３７] 重鎖のN末端でIg足場と連結したエピトープ結合性ドメインを含む、２１〜３３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[３８] 軽鎖のC末端でIg足場と連結したエピトープ結合性ドメインを含む、２１〜３３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[３９] 重鎖のC末端でIg足場と連結したエピトープ結合性ドメインを含む、２１〜３３のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[４０] 4つの抗原結合部位を有し、4つの抗原に同時に結合することが可能である、１または２に記載の抗原結合性構築物。
[４１] 医療での使用のための、１〜４０のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[４２] 癌または喘息、関節リウマチもしくは変形性関節炎などの炎症性疾患の治療のための医薬の製造における使用のための、１〜４１のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[４３] 治療的な量の１〜４２のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物を投与するステップを含む、癌または喘息、関節リウマチもしくは変形性関節炎などの炎症性疾患に罹患した患者の治療方法。
[４４] 癌または喘息、関節リウマチもしくは変形性関節炎などの炎症性疾患の治療のための、１〜４２のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物。
[４５] １〜４０のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物の重鎖をコードする、ポリヌクレオチド配列。
[４６] １〜４０のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物の軽鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
[４７] １〜４２および４４のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物の重鎖および軽鎖をコードする1以上のポリヌクレオチド配列を含む、形質転換またはトランスフェクトされた組み換え宿主細胞。
[４８] ４７に記載の宿主細胞を培養するステップ、および抗原結合性構築物を単離するステップを含む、１〜４０のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物の製造方法。
[４９] １〜３８のいずれか１項に記載の抗原結合性構築物および製薬上許容される担体を含む医薬組成物。

【図1】

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【図2】

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【図3】

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【図4】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]