特許 5792165 ヒストンマクロＨ２Ａアイソフォームに基づいて癌再発のリスクを予測する診断のための判断材料を提供する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5792165

(24)【登録日】2015年8月14日

(45)【発行日】2015年10月7日

(54)【発明の名称】ヒストンマクロＨ２Ａアイソフォームに基づいて癌再発のリスクを予測する診断のための判断材料を提供する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20150917BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20150917BHJP

   C40B 30/04 20060101ALI20150917BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20150917BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150917BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150917BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20150917BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150917BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68ZNA

   G01N33/574 A

   C40B30/04

   C12Q1/68 A

   C07K14/47

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   A61K45/00

   !C12N15/00 A

【請求項の数】12

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2012-518798(P2012-518798)

(86)(22)【出願日】2010年7月2日

(65)【公表番号】特表2012-531612(P2012-531612A)

(43)【公表日】2012年12月10日

(86)【国際出願番号】EP2010004008

(87)【国際公開番号】WO2011000573

(87)【国際公開日】20110106

【審査請求日】2013年6月19日

(31)【優先権主張番号】09008679.4

(32)【優先日】2009年7月2日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509064820

【氏名又は名称】エーエムベーエル ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリー

(73)【特許権者】

【識別番号】512003858

【氏名又は名称】ソラックスクリニック−ハイデルベルク ゲーゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100152319

【弁理士】

【氏名又は名称】曽我 亜紀

(72)【発明者】

【氏名】ラデゥルネル，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】スポーン，ジュディス

(72)【発明者】

【氏名】ミュリー，トーマス

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０３／０６４４７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５１９２１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２９２４２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PEHRSON JOHN R，DEVELOPMENTAL AND TISSUE EXPRESSION PATTERNS OF HISTONE MACROH2A1 SUBTYPES，JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY，１９９７年，V65 N1，P107-113

【文献】 CHANGOLKAR LAKSHMI N，DEVELOPMENTAL CHANGES IN HISTONE MACROH2A1-MEDIATED GENE REGULATION，MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，２００７年 ４月，V27 N7，P2758-2764

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳類患者における増殖性又は悪性腫瘍の診断のための判断材料を提供する方法であって、前記患者から取得された全血、血清、血漿を含む生体試料においてマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現を検出することを含み、前記患者における増殖性又は悪性腫瘍の指標は、腫瘍疾患のない健康な患者由来の対照試料における前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現と比較した前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の低さ又は減少である、方法。

【請求項2】

哺乳類患者における緩徐な増殖性、前悪性又は良性腫瘍の診断のための判断材料を提供する方法であって、前記患者から取得された全血、血清、血漿を含む生体試料においてマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現を検出することを含み、前記患者における緩徐な増殖性、前悪性又は良性腫瘍の指標は、腫瘍疾患のない健康な患者由来の対照試料における前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現と比較した前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の高さ又は増加である、方法。

【請求項3】

哺乳類患者における老化癌細胞を含む老化細胞の診断のための判断材料を提供する方法であって、前記患者から取得された全血、血清、血漿を含む生体試料においてマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現を検出することを含み、前記患者における老化細胞の指標は、腫瘍疾患のない健康な患者由来の対照試料における前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現と比較した前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の高さ又は増加である、方法。

【請求項4】

哺乳類患者における癌再発のリスクの診断のための判断材料を提供する方法であって、前記患者から取得された全血、血清、血漿を含む生体試料においてマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現を検出することを含み、前記患者における癌再発のリスクの指標は、腫瘍疾患のない健康な患者由来の対照試料における前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現と比較した前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の低さ又は減少である、方法。

【請求項5】

試料及び／又は対照試料におけるマクロＨ２Ａ１．２の発現を正規化することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

癌が、固形癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、甲状腺癌、食道癌及び脳癌の群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

さらなる癌マーカーであるＫｉ−６７の発現を検出することを更に含み、試料におけるマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現が、Ｋｉ−６７の発現に逆相関する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

マクロＨ２Ａ１．１の発現に基づく、該腫瘍における老化細胞、又は癌細胞の検出を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

発現を検出することが、ＰＣＲ若しくはｒｔＰＣＲ、マクロＨ２Ａ１．１に特異的な若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体を用いる免疫組織化学染色、及び／又はｍＲＮＡ解析を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

マクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体、又はそのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体の断片を、追加の補助剤とともに具備する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を行うための診断キット。

【請求項11】

マクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体、又はそのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体の断片を有効成分として含む、癌の診断、又は癌再発の診断のための薬剤。

【請求項12】

癌が、固形癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、甲状腺癌、食道癌及び脳癌の群から選択される、請求項１１に記載の薬剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、哺乳類患者における癌再発のリスクを診断する方法であって、前記患者から取得される生体試料においてマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現を検出することを含み、前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の低下又は減弱は、前記患者における癌再発のリスクの増大を示す、方法に関する。本発明は、更に、前記診断方法に基づいて、癌、特に乳癌及び／又は肺癌を治療する改善された方法に関する。

【背景技術】

【0002】

癌の中でも特に、肺癌は、新患に関して２番目に多い癌であり（米国ではすべての癌の１５％）（Jemal他、２００７）、世界中で癌死の主な原因である（米国では男性の３１％及び女性の２６％）。４／５の肺癌腫が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であり、ＮＳＣＬＣ患者の約１／３が、早期の疾患で診断される。これらの患者には、手術が最良の治療の選択肢であるが、高い確率の患者が再発し、大部分がその疾患で死亡する。同じ病期の癌である患者であっても異なる再発率を示すことが多く（Zhu他、２００６）、したがって、手術後に再発する可能性がより高い患者を特定することができる分子マーカーに関心が持たれている（D'Amico、２００８）。ＮＳＣＬＣの転移性再発のためのいくつかの潜在的なマーカーが検査されてきたが、それらのいずれも十分に有用であることが証明されていない（Zhu他、２００６）。

【0003】

ヒストンは、多くの場合、別個の細胞タイプにおいて同様のレベルで存在すると推定される。ヘテロクロマチンヒストン変異体であるマクロＨ２Ａは、いくつかの分子及び細胞の構造的特徴では特異である。構造レベルにおいて、マクロＨ２Ａは、大型Ｃ末端伸長、マクロドメイン、およそ２５ｋＤａの球状モジュールを有し、マクロＨ２Ａ１．１の場合、特異性の高いＡＤＰリボースを結合する（Kustatscher他、２００５）。さらに、すべての脊椎動物で観察されるマクロＨ２Ａと、小分子を結合することができない、マクロＨ２Ａ１．２として知られるマクロＨ２Ａ１の第２のスプライス変異体とに対する２つの遺伝子がある。

【0004】

マクロＨ２Ａは、老化として知られる永久増殖停止に関係している（Pehrson及びFried、１９９２、Zhang他、２００５）。この現象は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代細胞培養に対して述べられており（Hayflick、１９６５）、テロメア短縮、ＤＮＡ損傷の蓄積及び特定の癌遺伝子の過剰発現のようなストレスに応答する（Serrano他、１９９１）。

【0005】

更に、癌遺伝子によって誘発される老化が、ｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍メカニズムとして現れたことに注目すると興味深い（Braig他、２００５、Chen他、２００５、Collado他、２００５、Michaloglou他、２００５）。

【0006】

Holdenrieder他は（非特許文献１において）、化学療法を受けている２０人の患者からの血清試料及び放射線療法を受けている１６人の患者からの血清試料において、ヌクレオソーム及びヌクレオソームの濃度の動態を観察した。悪性腫瘍を有する患者の血清は、健康な人及び良性疾患の患者に比較して、著しく高いヌクレオソームの濃度を含んでいた。彼らは、血清中のヌクレオソームの濃度が、特に治療効力の初期の推定のために、抗腫瘍治療中、生物化学的応答をモニタリングする有用なツールであり得ることを提案している。

【0007】

Kurdistaniは（非特許文献２において）、ヒストンの修飾の変化が、癌の発症及び進行に重要な役割を有する多くの遺伝子の脱調節発現に関連してきたことを記載している。これらの変化の効果は、これまで、プロモーターに特異的な観点から解釈され、遺伝子間のヒストン修飾のパターンの相違に焦点を当ててきた。さらに、癌組織は、特定のヒストン修飾の全体の量における細胞間の相違も表すことが示唆されている。この新規な細胞のエピジェネティックな不均一性は、癌患者の臨床転帰に関連し、予後の貴重なマーカーとしての役割を果たすことができる。

【0008】

Barlesi他は（非特許文献３において）、エピジェネティックな修飾が癌の発症及び進行に寄与する可能性があるか否かを検査する研究を記載している。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の予後に影響を与える、複数のヒストンを含むエピジェネティックな変化が検査された。１３８人のＮＳＣＬＣ患者の切除された腫瘍試料における、ヒストン３リジン４の脱メチル（Ｈ３Ｋ４ｄｉＭｅ）、並びにヒストン２Ａリジン５のアセチル化（Ｈ２ＡＫ５Ａｃ）、ヒストン２Ｂリジン１２のアセチル化、ヒストン３リジン９のアセチル化（Ｈ３ＡＫ９Ａｃ）及びヒストン４リジン８のアセチル化を検査した。Ｉ期患者（第１の節より下位）によって確定されるグループは、劇的な生存期間の差異を示した（中央値、Ｈ３Ｋ９Ａｃ６８％の腺癌患者の場合１０か月、Ｈ３Ｋ４ｄｉＭｅ８５％の非腺癌患者の場合１４７か月）。開示されているデータは、ヒストン脱アセチル化阻害剤等、ヒストン修飾と相互作用する薬物による標準的な化学療法との組合せを用いるための論拠を提供すると考えられた。

【0009】

Deligezer他は（非特許文献４において）、ＤＮＡメチル化及びヒストン修飾の変化が、発癌に関連してきたことを記載しており、ヒストンメチル化が、ヒストン修飾のモデルとして、血漿において検出可能であるか否かを調べた。したがって、クロマチン免疫沈降により、血漿においてモノメチル化Ｈ３Ｋ９（Ｈ３Ｋ９ｍｅｌ）が解析された。循環におけるヒストン修飾の癌に特異的な変化を証明するためには、さらなる検証が必要であった。

【0010】

最後に、Seligson他は（非特許文献５において）、癌細胞が、個々の遺伝子において、かつ個々の細胞の単一核のレベルにおいて全体的に（globally）、ヒストン修飾パターンの変化を示すことを開示している。前立腺癌再発の高いリスクを予測するために、ヒストンＨ３リジン４脱メチル（Ｈ３Ｋ４ｍｅ２）及びＨ３Ｋ１８アセトン化（ａｃ）のより低い全体的／細胞レベルが開示されており、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ１８ａｃの両方の細胞レベルはまた、肺癌患者及び腎臓癌患者の臨床転帰も予測し、より低いレベルが、両癌グループにおいて大幅に下がった生存確率を予測することが示された。彼らはまた、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、すなわち遺伝子活性及び抑制の両方に関連する修飾のより低い細胞レベルが、前立腺癌又は腎臓癌のいずれかである個人に対しより不良の転帰の予後でもあることも示している。これらのヒストン修飾の予測能力は、増殖マーカーＫｉ−６７とは無関係であった。クロマチン免疫沈降実験により、より悪性の癌細胞株におけるヒストン修飾のより低い細胞レベルが、ゲノムにわたる遺伝子プロモーターではなく、ＤＮＡ繰返し要素における修飾のより低いレベルに相関することが示された。結果は、ヒストン修飾のより低い全体的レベルが、より悪性の癌の表現型を予測することを示唆し、種々の組織起源の腺癌の予後のエピジェネティックパターンにおける驚くべき共通性を明らかにした。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Holdenrieder S、Stieber P、Bodenmuller H、Busch M、Fertig G、Furst H、Schalhorn A、Schmeller N、Untch M、SeidelD著、Nucleosomes in serum of patients with benign andmalignant diseases. Int J Cancer 2001 Mar 20;95(2):114-20

【非特許文献2】Kurdistani SK著、Histone modifications as markers of cancer prognosis: a cellularview. Br J Cancer. 2007 Jul 2;97(1):1-5. Epub 2007 Jun 26

【非特許文献3】Barlesi F、Giaccone G、Gallegos-Ruiz MI、Loundou A、Span SW、Lefesvre P、Kruyt FA、Rodriguez JA著、Global histone modifications predict prognosis of resected nonsmall-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2007 Oct 1;25(28):4358-64

【非特許文献4】Deligezer U、Akisik EE、Erten N、DalayN著、Sequence-specific histone methylation is detectableon circulating nucleosomes in plasma. Clin Chem. 2008 Jul;54(7):1125-31. Epub2008 May 16

【非特許文献5】Seligson DB、Horvath S、McBrian MA、Mah V、Yu H、Tze S、Wang Q、Chia D、GoodglickL、Kurdistani SK著、Global Levelsof Histone Modifications Predict Prognosis in Different Cancers. Am J Pathol.2009 Apr 6

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

肺癌は、癌死の主な原因である。最適な診断及び早期治療にも関らず、多くの患者が再発疾患で死亡する。癌、特に肺癌等の固形癌における腫瘍再発のリスクを予測するために十分有用なバイオマーカーはない。したがって、本発明の目的は、こうした再発癌のための新しい診断アッセイを、該アッセイを行うための適切な手段とともに提供することである。さらなる目的及び利点は、本発明の以下のより詳細な説明を読むことにより当業者には明らかとなろう。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の好ましい第１の態様では、本発明は、哺乳類患者における癌再発のリスクを診断する方法であって、前記患者から取得される生体試料においてマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現を検出することを含み、前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の低下又は減弱は、前記患者における肺癌再発のリスクの増大を示す、方法に関する。好ましくは、本発明による方法は、前記診断に基づく前記癌再発、更に好ましくは転移性再発の予測を更に含む。

【0014】

本発明の好ましい第２の態様では、本発明は、上記のように哺乳類患者における癌再発のリスクを診断する方法であって、マクロＨ２Ａ１．１の発現に基づいて腫瘍における老化細胞、特に癌細胞の診断を更に含む、方法に関する。

【0015】

本発明の好ましい第３の態様では、本発明は、マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に特異的な薬剤に対するスクリーニング方法であって、マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に潜在的に特異的な薬剤とマクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａを接触させること、及び前記薬剤が特にマクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａと結合するか否かを判断することを含む、方法に関する。

【0016】

本発明の好ましい第４の態様では、本発明は、本発明による、マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に特異的な薬剤をスクリーニングする方法に従ってスクリーニングされた、診断薬及び／又は治療薬に関する。

【0017】

本発明の好ましい第５の態様では、本発明は、マクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体、若しくはそのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な断片を製造する方法であって、ａ）クロマトグラフィカラムに結合されたマクロＨ２Ａ１．１ドメイン若しくはマクロＨ２Ａ２ドメインを用いる、抗体を含む血清若しくは細胞培養上清のアフィニティ精製、又はｂ）マクロＨ２Ａ１．１ドメイン若しくはマクロＨ２Ａ２ドメインを用いてｓｃ−Ｆｖファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることを含む、方法に関する。

【0018】

本発明の好ましい第６の態様では、本発明は、本発明に記載の診断薬、及び／又は、本発明に記載のマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体若しくはそのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な断片を、任意選択的に上記のように本発明に記載の方法を行うための追加の補助剤とともに具備する診断キットに関する。

【0019】

本発明の好ましい第７の態様では、本発明は、哺乳類患者の癌を治療する方法であって、上記のように本発明に記載の方法、並びに前記患者における癌再発のリスクが増大していると特定された患者の前記癌の再発、好ましくは転移性再発を治療及び／又は予防することを含む、方法に関する。

【0020】

本発明の好ましい第７の態様では、本発明は、本発明に記載の方法によってスクリーニングされる薬剤、並びに／又は、本発明に記載のマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体、若しくはそのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な断片、又は癌の予防、治療及び／若しくは診断、特に癌再発、好ましくはその転移性再発の予防、治療及び／若しくは診断のための本発明に記載のキットの使用に関する。

【0021】

本発明は、概して、ヒストンマクロＨ２Ａ１．１及びマクロＨ２Ａ２の発現が肺癌再発を予測するという発見に基づき、これらのヒストン変異体を、癌患者の改善されたリスク層別化のための新規な手段として同定する。マクロＨ２Ａアイソフォームは、老化している細胞、すなわち既知の抗腫瘍メカニズムにおいて、発現上昇及び高発現し、マクロＨ２Ａ１．１を、腫瘍における老化細胞に対する有用なバイオマーカーとして示唆する。マクロＨ２Ａ１．１は、予後が良好な腫瘍においてより高発現する。

【0022】

さらに、本発明の関連において、マクロＨ２Ａ１．１発現の予後相関が、癌患者予後を評価するために一般に用いられている増殖マーカーＫｉ−６７よりも優れていることが分かった。本発明者らは、マクロＨ２Ａ１．１及びマクロＨ２Ａ２の発現と腫瘍増殖率との間に強い負の相関を観察する。低速で増殖する腫瘍は、マクロＨ２Ａ１．１及びマクロＨ２Ａ２の高発現を示す傾向があり、一方で臨床的により悪性であることが多い、増殖指数が高い腫瘍は、発現がより低下若しくは減弱しているか、又は更には発現がない。

【0023】

したがって、本発明は、その第１の態様では、哺乳類患者における癌再発のリスクを診断する方法であって、前記患者から取得される生体試料においてマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現を検出することを含み、前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の低下又は減弱は、前記患者における肺癌再発のリスクの増大を示す、方法に関する。好ましくは、発現解析の結果（複数の場合あり）を、適切な装置で表示することができる。本発明の文脈では、マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の「低下」又は「減弱」とは、再発前の同じ患者か若しくは再発のリスクがない異なる患者、又は健康な患者若しくは患者群からの試料と比較して、マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現が減弱していることを意味するものとする。発現が低下又は減弱を確定する別の方策は、更に後述するように、好ましくはマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体を用いる組織学的スライドにおける染色の欠如である。更に別の方策は、発現マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２を、試料（複数の場合あり）のマクロＨ２Ａ１．２の発現と比較することであり、本発明による方法の好ましい実施の形態では、発現は、前記試料及び／又は対照試料におけるマクロＨ２Ａ１．２の発現に正規化される。この場合もまた、対照試料を、再発前の同じ患者か若しくは再発のリスクがない異なる患者、又は健康な患者若しくは患者群からの試料とすることができる。

【0024】

本発明は、その好ましい実施の形態において、哺乳類患者における癌再発のリスクを診断する方法であって、前記患者から取得される生体試料においてマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現を検出すること、及びマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の前記発現を対照試料と比較することを含み、前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現の低下又は減弱は、前記患者における肺癌再発のリスクの増大を示す、方法に関する。好ましくは、発現解析及び／又は比較の結果（複数の場合あり）を、診断コンピューター等の適切な装置で表示又は出力することができる。

【0025】

本発明による方法のさらなる好ましい実施の形態では、マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２の発現と無病生存期間との相関は、Ｐ＜０．０５、好ましくはＰ＜０．０１、より好ましくはＰ＜０．００６の重要性を有する。

【0026】

本発明による方法のさらなる好ましい実施の形態は、Ｋｉ−６７等のさらなる癌マーカーの発現を検出することを更に含む。好ましくは、前記生体試料における前記マクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２の発現が、Ｋｉ−６７の発現に逆相関する。

【0027】

本発明による方法の更に別の好ましい態様は、本発明による前記診断に基づく前記癌再発の予測工程を更に含む。本明細書で用いる「再発」とは、好ましくは腫瘍組織の発現及び転移等、患者の無病生存期間後の癌（複数の場合あり）のパラメータの臨床症状を指す。予測（又は可能性）は、例えば患者又は患者群の臨床パラメータ、腫瘍のタイプ等のような、さらなるパラメータを含むことも可能である。予測の結果を、好ましくは、適切な装置で表示することができる。

【0028】

本発明による方法を用いて、いかなるタイプの固形癌も診断することができる。したがって、前記癌が、固形癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、甲状腺癌、食道癌及び脳癌の群から選択される、本発明による方法が好ましい。乳癌又は肺癌の診断方法がより好ましい。

【0029】

本発明によるマーカーの発現の直接又は間接的検出が可能である限り、本発明による方法に対していかなる生体試料を用いることも可能である。したがって、生体試料は、肺腫瘍、乳腺腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、頭頸部腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍、甲状腺腫瘍、食道腫瘍及び脳腫瘍、全血、血清、血漿、尿、リンパ液、脳液、組織試料、並びに組織学的スライド等の調製された組織試料からの細胞群から選択することができる。前記試料が、手術中の患者から採取されるか又は血清試料である、本発明による方法が好ましい。

【0030】

そして、本発明による方法の別の好ましい態様は、マクロＨ２Ａ１．１の発現に基づく、腫瘍における老化細胞、特に癌細胞の診断又はさらなる診断に関する。マクロＨ２Ａ１．１が、多数の老化細胞を有していることが知られている齧歯動物の肺腺腫に豊富であるが、老化を克服し制御されない増殖を示す肺癌では、発現低下しているか又は存在していないという発見もまた、これらの結論と一貫し、抗腫瘍メカニズムとしての老化の概念を強調する。したがって、本発明による方法のこの好ましい態様では、発現を用いて、マーカーのマクロＨ２Ａ１．１の発現に基づいて腫瘍における老化細胞、特に癌細胞の量又は比を概してモニタリングすることができる。老化細胞の量又は比は、患者の再発を示すものとして、化学療養又は放射線等の抗腫瘍治療の成功又は効果をモニタリングするため、又は、癌細胞の数が増大しているか否かを確認するために用いられる、腫瘍細胞の成長に対する指標である。他の老化マーカーを測定することもでき、前記マーカーを測定又は検出する方法は、当業者には既知であり、マーカーのマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２に対して本明細書に記載した通りである。

【0031】

本発明による方法との関連で、マーカーの発現を測定するのを可能にする当業者に既知であるいかなる方法も使用することができる。方法の選択は、発現が核酸及び／又はタンパク質レベルで測定されるか否かと、解析される試料とによって決まる。前記発現を検出することが、特に、本明細書に記載するように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、すなわち核酸増幅、特にｒｔＰＣＲ、マクロＨ２Ａ１．１に特異的な抗体若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体を用いる、免疫組織化学染色（すなわちタンパク質レベル）、及び／又はｍＲＮＡ解析を含む、本発明による方法が好ましい。

【0032】

そして、本発明の別の好ましい態様は、マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に特異的な薬剤に対するスクリーニング方法であって、マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に潜在的に特異的な薬剤とマクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａを接触させること、及び前記薬剤が特にマクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａと結合するか否かを判断することを含む、方法に関する。スクリーニングの特定の方法は本技術分野において既知であり、例えば、In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997及び米国特許第５，０３０，０１５号において論じられている。潜在的にマクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に特異的な前記薬剤が、化合物ライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、特にｓｃ−Ｆｖファージディスプレイライブラリにおいて、又は抗体のライブラリに存在する、本発明によるスクリーニング方法が好ましい。

【0033】

マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に潜在的に特異的な前記薬剤が診断薬及び／又は治療薬である、本発明によるスクリーニング方法が更に好ましい。すなわち、薬剤を、例えば哺乳類患者における癌再発のリスクを診断するか、若しくは老化細胞の量若しくは比をモニタリングする等、上述したような診断方法で用いることができるか、又は、例えば腫瘍細胞の老化を増大させるために用いることができる治療薬とすることができる。

【0034】

そして、本発明の別の態様は、本発明による方法によってスクリーニングされる、診断薬及び／又は治療薬に関する。この薬剤を、本発明によれば、上述したようにスクリーニングし、かつ前記薬剤を医薬的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は安定剤と共に処方する方法を含む、医薬組成物を製造する方法において、医薬組成物内に処方することができる。任意にラベルを有する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及び／若しくは組換え抗体、又はそれらの機能的断片から選択される、本発明によるマクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体である薬剤が好ましい。

【0035】

許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、採用される投薬量及び濃度において受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノールアルコール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール、メチルパラベン若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール及びｍ−クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の造塩対イオン、金属複合物（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合物）並びに／又はＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭ若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤を含む。

【0036】

そして、本発明の別の態様は、上記のように本発明による方法によってスクリーニングされる、診断薬及び／又は治療薬を含む上記のように製造される、医薬組成物又は医薬製剤に関する。

【0037】

そして、本発明の別の態様は、マクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体、若しくはそのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な断片を製造する方法であって、ａ）クロマトグラフィカラムに結合されたマクロＨ２Ａ１．１ドメイン若しくはマクロＨ２Ａ２ドメインを用いる、抗体を含む血清をアフィニティ精製する工程、又はｂ）マクロＨ２Ａ１．１ドメイン若しくはマクロＨ２Ａ２ドメインを用いてｓｃ−Ｆｖファージディスプレイライブラリをスクリーニングする工程を含む、方法に関する。これらの方法のそれぞれの詳細は、当業者には既知であり、本明細書に記載するように、例えば、ａ）の場合は、マクロＨ２Ａ１．１ドメイン又はマクロＨ２Ａ２ドメインに対して特異的な抗体を含むウサギ血清を使用し、又はｂ）の場合は組換えマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２ドメインを使用する。

【0038】

したがって、本発明の別の態様は、本発明による方法によって製造される、マクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体、又はｓｃ−Ｆｖ断片等、そのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な断片に関する。好ましくは、本発明による前記マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体は、任意にラベルを有する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及び／又は組換え抗体から選択される。本発明の文脈では、「マクロＨ２Ａ１．１又は（若しくは）マクロＨ２Ａ２に特異的な」とは、抗体が、マクロＨ２Ａ１．１又はマクロＨ２Ａ２のマクロドメインのエピトープと特異的に結合し、解析される試料内の他の抗原と交差反応性又は実質的な交差反応性を示さないことを意味するものとする。

【0039】

そして、本発明の更に別の態様は、本発明に記載の診断薬、及び／又は、本発明に記載のマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体、若しくはそのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な断片を、任意選択的に本発明に記載の方法を行うための追加の補助剤とともに具備する診断キットに関する。本キットは、好ましくは、本発明による方法を実行するために必要な化学物質、染料、緩衝剤等を含む。本キットはまた、解析のためのＤＮＡ又はタンパク質のチップ又はマイクロアレイとともに、診断の結果を表示及び解釈するためにマニュアル及びソフトウェア及び機械も含むことができる。

【0040】

そして、本発明の更に別の態様は、哺乳類患者の癌を治療する方法であって、本発明に記載の方法、並びに前記患者における癌再発のリスクが増大していると特定された患者の前記癌の再発を治療及び／又は予防することを含む、方法に関する。本明細書で用いる「治療（treatment）」は、治療的処置（therapeutic treatment）及び予防的（prophylactic又はpreventative）手段の両方を指し、目的は、標的となる病理学的状態又は疾患、特に癌再発を防止するか又は遅らせる（低下させる）ことである。治療を必要としている人には、すでに疾患がある人と、疾患がある傾向のある人又は疾患を予防すべき人とが含まれる。治療は、補助治療と治療未経験者の一次（first line）治療との両方を含むことができ、治療を、化学療法及び／又は放射線等の他の抗癌方策と組み合わせることができる。

【0041】

前記治療が、その治療を必要としている前記患者に、好ましくは上記のような医薬組成物の形態である、上述したように本発明の方法によってスクリーニングされる薬剤を投与することを含む、本発明による哺乳類患者の癌を治療する方法が好ましい。好ましい薬剤は、上述したような小型化学分子若しくは抗体又はそれらの断片である。

【0042】

本発明による哺乳類患者の癌を治療する方法であって、マクロＨ２Ａ１．１の発現に基づいて、前記治療に応じて腫瘍における老化細胞、特に癌細胞の量及び／又は比をモニタリングすることを更に含む、方法が更に好ましい。マクロＨ２Ａ１．１が、多数の老化細胞を有していることが知られている齧歯動物の肺腺腫に豊富であるが、老化を克服し制御されない増殖を示す肺癌では、発現低下しているか又は存在していないという発見もまた、これらの結論と一貫し、抗腫瘍メカニズムとしての老化の概念を強調する。したがって、本発明による方法のこの好ましい実施の形態では、発現を用いて、マーカーのマクロＨ２Ａ１．１の発現に基づいて腫瘍における老化細胞、特に癌細胞の量又は比を概してモニタリングすることができる。老化細胞の量又は比は、患者の再発を示すものとして、化学療養又は放射線等の抗腫瘍治療の成功又は効果をモニタリングするため、又は癌細胞の数が増大しているか否かを確認するために用いられる、腫瘍細胞の成長に対する指標である。他の老化マーカーを測定することもでき、前記マーカーを測定又は検出する方法は、当業者には既知であり、マーカーのマクロＨ２Ａ１．１及び／又はマクロＨ２Ａ２に対して本明細書に記載した通りである。

【0043】

本発明によって治療される癌を、固形癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、甲状腺癌、骨癌、食道癌及び脳癌から選択することができ、好ましくは乳癌及び／又は肺癌である。示す癌はまた、その転移形態も含む。

【0044】

そして、本発明の更に別の態様は、本発明による方法によってスクリーニングされる薬剤、並びに／又は、本発明によるマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ２に特異的な抗体、若しくはそのマクロＨ２Ａ１．１若しくはマクロＨ２Ａ１に特異的な断片、又は、癌の予防、治療及び／若しくは診断のため、特に癌再発、特に乳癌及び／若しくは肺癌再発の予防、治療及び／若しくは診断のための、若しくは癌の予防、治療及び／若しくは診断のため、特に癌再発、特に乳癌及び／若しくは肺癌再発の予防、治療及び／若しくは診断のための薬物の製造のための、本発明によるキットの使用に関する。

【0045】

前記癌は、固形癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、甲状腺癌、骨癌、食道癌及び脳癌の群から選択され、好ましくは乳癌及び／又は肺癌である、本発明に記載の使用が好ましい。示す癌はまた、その転移形態も含む。

【0046】

ヒストンは、別個の細胞タイプにおいて同様のレベルで存在するものと想定されることが多い。ヘテロクロマチンのヒストン変異体マクロＨ２Ａは、いくつかの分子及び細胞の構造的特徴では特異である。構造レベルにおいて、マクロＨ２Ａは、大型Ｃ末端伸長、マクロドメイン、およそ２５ｋＤａの球状モジュールを有し、マクロＨ２Ａ１．１の場合、特異性の高いＡＤＰリボースを結合する（Kustatscher他、２００５）。さらに、すべての脊椎動物で観察されるマクロＨ２Ａと、小分子を結合することができない、マクロＨ２Ａ１．２として知られるマクロＨ２Ａ１に対する第２のスプライス変異体とに対する２つの遺伝子がある。ここで、本発明者らは、すべてのマクロＨ２Ａアイソフォーム（マクロＨ２Ａ１．１、マクロＨ２Ａ１．２及びマクロＨ２Ａ２）に対してポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を開発し、これらの抗体を用いて、培養された細胞においてかつｉｎ ｖｉｖｏでマクロＨ２Ａヒストンの細胞局在化及び存在量を研究した。本発明者らは、マクロＨ２Ａが、複製老化した一次線維芽細胞において発現上昇することが分かった。さらに、ヒトの癌においてマクロＨ２Ａ１．１の発現とＫｉ−６７との間の強い負の相関がある。急速に細胞分裂する腫瘍（増殖マーカーＫｉ−６７の高発現によってマークされる）は、低レベルのマクロＨ２Ａ１．１を表し、分裂指数の低い腫瘍は、ヒストンが豊富である。両発見は、マクロＨ２Ａ１．１が、細胞の分化の程度に相関し、細胞周期から出た細胞をマークするということを論じている。

【0047】

マクロＨ２Ａ１．１が、多数の老化細胞を有していることが知られている齧歯動物の肺腺腫に豊富であるが、老化を克服し制御されない増殖を示す肺癌では、発現低下しているか又は存在していないという発見もまた、これらの結論と一貫し、抗腫瘍メカニズムとしての老化の概念を強調する。有意に、本発明者らは、マクロＨ２Ａ１．１レベルが、肺癌における腫瘍再発のリスクに対して優れた予測因子であることが分かる。本発明者らが解析することができる明確な数の患者では、マクロＨ２Ａ１．１レベルは、一般的な増殖マーカーであるＫｉ−６７との相関に対して統計的に優れていることが分かった（マクロＨ２Ａ１．１の場合はＰ＝０．００５８、Ｋｉ−６７の場合はＰ＝０．０７９８３）。

【0048】

乳癌組織アレイに対する現時点で利用可能な患者情報は、マクロＨ２Ａ１．１レベルと臨床転帰との相関を評価するには不十分である。肺腫瘍からのデータに基づいて、マクロＨ２Ａ１．１は、乳癌においても有用な予後バイオマーカーであるように見える。さらなる検査により、他の癌におけるその有用性が明らかになる。

【0049】

細胞老化中のマクロＨ２Ａ１．１遺伝子産物の発現上昇及び発癌におけるその役割を確認するメカニズムは、未だ解明されていない。予備的証拠は、ｍＲＮＡレベルが老化中は変化しないことを示唆し、転写後プロセスはマクロＨ２Ａ１．１の発現上昇を考慮することができることを示唆する。

【0050】

無病生存期間と共にマクロＨ２Ａ１．１発現を統計的に支持されて観察することにより、癌、特に肺癌患者における再発のリスクの改善された層別化の可能性が広がり、その観察を、より大きい患者集団で繰り返すべきである。将来の研究は、マクロＨ２Ａ１．１発現上昇がヒトの腫瘍における老化細胞の一般的な特徴であるか否かと、高いマクロＨ２Ａ１．１染色が、概して腫瘍細胞における細胞分化の程度を反映するか否かとについてさらなる洞察を提供するであろう。本発明の新たなツールは、ハイリスク型の癌、特に乳癌又は肺癌患者の特定を改善し、したがって、予後が厳しい癌において治療方策のより優れた標的化を可能にする。

【0051】

ここで、本発明を、添付図面を参照して以下の実施例で、ただしそれに限定されずに、更に説明する。本発明の目的で、本明細書に列挙するすべての参照文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1】マクロＨ２Ａアイソフォームの発現が増殖に相関することを示す図である。（ａ）２６０の乳癌試料のセットにおけるヒストン変異体の増殖指数及びレベルが、増殖マーカーＫｉ−６７、マクロＨ１Ａ１．１、マクロＨ２Ａ１．２及びマクロＨ２Ａ２に対する抗体を用いて免疫組織化学によって確定される。Ｋｉ−６７は、コア内のすべての腫瘍細胞に対してポジティブ染色された腫瘍細胞のパーセンテージとしてスコアリングされた。マクロＨ２Ａ１．１の発現レベルは、半定量的に確定された（スコアリング：０〜１、ネガティブ／弱染色；１〜２、中染色；２〜３、強い核陽性）。（ｂ）増殖指数の増大により低減するマクロＨ２Ａ１．１の発現を示す箱ひげ図（Ｐ＜０．００１）。（ｃ）同じ相関がマクロＨ２Ａ２に対して観察される。マクロＨ２Ａ１．２は、これらの試料において高レベルで遍在的に発現する。

【図2】マクロＨ２Ａ１．１発現が癌、好ましくは肺癌再発を予測することを示す図である。（ａ）肺腫瘍の増殖指数は、Ｋｉ−６７に対する抗体を用いて免疫組織化学によって確定される。（ｂ）マクロＨ２Ａ１．１の発現レベルは増殖指数の増大により低下する（Ｐ＜０．００１）。（ｃ）発現レベルは、肺腫瘍試料における無病生存期間との著しい相関を示す（Ｐ＝０．００５８）。

【図3】マクロＨ２Ａアイソフォームが老化中に発現上昇することを示す図である。（ａ）Ｋ−Ｒａｓ＋／ＬＳＬＣ１２Ｖｇｅｏノックインマウスの肺におけるマクロＨ２Ａ１アイソフォームの発現。マクロＨ２Ａ１．１レベル（上部パネル）及びマクロＨ２Ａ１．２レベル（下部パネル）の免疫組織化学的検出は、低異形度腺腫（Ｌ）及び高悪性度胎児肺型腺癌（Ｈ）の両方を含むパラフィン包理肺組織の連続部分において解析された。マクロＨ２Ａ１．１発現は、低異形度腺腫において老化中に豊富である。（ｂ）増殖している（小核）Ｗ１３８一次線維芽細胞及び老化を示す（拡大した核）Ｗ１３８一次線維芽細胞。マクロＨ２Ａ１．１及びマクロＨ２Ａ１．２は、ＳＡＨＦ（senescence-associated heterochromatic foci）に局在化し、老化細胞においてより高いレベルで発現する。対照的に、標準的な（canonical）ヒストンＨ２Ａは、老化によって変化しない。（ｅ）老化ＩＴＭ細胞中のマクロＨ２Ａ１発現上昇のウエスタンブロットは、タモキシフェンアナログ４ＯＨＴの添加時に、同時に癌遺伝子によって老化が誘発されるように設計された一次線維芽細胞である（Collado他、２００５）。本発明者らは、老化細胞におけるマクロＨ２Ａ１の上昇レベルを一貫して観察する。標準的なヒストンＨ２Ａ及びＨ３のタンパク質レベルは、老化細胞では僅かに低下する。

【図4】３つのマクロＨ２Ａアイソフォームに対するアフィニティ精製された抗体の特異度を示すウエスタンブロットを示す図である。ＨＡタグ付きマクロＨ２Ａアイソフォームは、ＨＥＫ２９３細胞において発現し、ウエスタンブロット解析のために全細胞抽出物が投入された。

【図5】２６０の乳癌試料のセットにおけるマクロＨ２Ａアイソフォームの発現を示す図である。（ａ）ヒストン変異体の増殖指数及びレベルは、Ｋｉ−６７、マクロＨ２Ａ１．１、マクロＨ２Ａ１．２、マクロＨ２Ａ２に対する抗体を用いて免疫組織化学によって確定される。（ｂ）マクロＨ２Ａ１．１の発現レベルが増殖指数の増大により低下することを示す箱ひげ図（Ｐ＜０．００１）。（ｃ）マクロＨ２Ａ２アイソフォームに対して同じ相関が観察される。マクロＨ２Ａ１．２が、これらの試料において高レベルで遍在的に発現することに留意されたい。

【図6】肺癌におけるマクロＨ２Ａ２の発現レベルを示す図である。（ａ）ヒストン変異体の増殖指数及び発現レベルは、Ｋｉ−６７及びマクロＨ２Ａ２の免疫組織化学的検出によって確定される。（ｂ）マクロＨ２Ａ２の発現レベルは、増殖の増大により低下する（Ｐ＜０．００１）。（ｃ）マクロＨ２Ａ２の発現レベルは腫瘍再発に相関する（Ｐ＝０．０４１４６）。

【図7】マクロＨ２Ａ１．２が大部分の肺腫瘍において高レベルで発現することを示す図である。増殖指数、ヒストン変異体の発現及びコアヒストンは、Ｋｉ−６７、マクロＨ２Ａ１．２及びＨ３の免疫組織化学的検出によって確定される。マクロＨ２Ａ１．２発現とＫｉ−６７発現との間に相関はなく、すべての細胞においてヒストンＨ３が強く発現する。

【符号の説明】

【0053】

図１
macro マクロ
in percent パーセント
Sample, Patient 試料、患者
protein expression level タンパク質発現レベル
図２
macro マクロ
in percent パーセント
Sample, Patient 試料、患者
Provability 確率
protein expression level タンパク質発現レベル
Disease-free survival time (in months) 無病生存期間（月）
図３
macro マクロ
Antibody 抗体
Overlay オーバーレイ
anti 抗
図４
Empty vector 空ベクター
Anti-macro 抗マクロ
図５
Histone ヒストン
Sample, Patient 試料、患者
図６
macro マクロ
Sample, Patient 試料、患者
in percent パーセント
Provability 確率
protein expression level タンパク質発現レベル
Disease-free survival time (in months) 無病生存期間（月）
図７
macro マクロ
Sample, Patient 試料、患者

【発明を実施するための形態】

【0054】

配列番号１から配列番号８は、以下の実施例で用いられるオリゴヌクレオチドの配列を示す。

【実施例】

【0055】

物質及び方法
ヒストン及びｍＲＮＡ抽出、ウエスタンブロッティング並びにリアルタイムＰＣＲ
スイッチ可能なＭＥＫ１−ＥＲ融合タンパク質を発現するＩＴＭ細胞の生成について上述した。４０ＨＴあり又はなしでのインキュベーションの後、細胞を採取し分注した。１つの細胞アリコットを、０．４Ｍ ＨＣｌ内に再懸濁させ、４時間インキュベートしてヒストンタンパク質を抽出し、遠心分離して、水に透析した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐキット（Qiagen）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡｅａｓｙスピンカラムのフロースルーから、アセトンによりタンパク質を沈殿させた。タンパク質抽出物を、投入前にブラッドフォード（Bradford）アッセイにより正規化した。アイソフォーム特異的なマクロＨ２Ａ抗体とともに、Ｈ２Ａに対する市販の抗体（Abcam、ａｂ１５６５３、１：３０００）及びＨ３に対する市販の抗体（Abcam、ａｂ１７９１、１：３００００）を用いて、ウエスタンブロットを行った。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を用いて、第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡを、以下のオリゴを用いてリアルタイムＰＣＲ（Applied Biosystems）によって連続的に解析した。
mH2A1.1 AAGTTGTACAGGCTGACATTGC（配列番号１）；
GTTCTTTTTCCGGAGTTCCA（配列番号２）、
mH2A1.2 CTTTGAGGTGGAGGCCATAA（配列番号３）；
CACAAACTCCTTGCCACCTT（配列番号４）、
mH2A2 GGACGTCCAAAAAGTCCAAA（配列番号５）；
GCTTCTGTCCCAGAACAAGG（配列番号６）、
and GAPDH TGGGTGTGAACCATGAGAAGTA（配列番号７）；
CCTTCCACGATACCAAAGTTGT（配列番号８）。
試料を、本発明者らが試験実行におけるこれらの実験に対して信頼性の高い対照として事前に同定したＧＡＰＤＨに正規化した。

【0056】

抗体の生成
マクロＨ２Ａ１．１（アミノ酸１９８〜２２６）及びマクロＨ２Ａ１．２（アミノ酸１９８〜２２８）を発現させ、ＧＳＴ融合タンパク質として精製した。マクロＨ２Ａ２（アミノ酸１６２〜３７２）のマクロドメインを、（Ｈｉｓ）６−タグ融合タンパク質として精製した。抗原をウサギ（Eurogentec）に注入した。製造業者の指示に従って、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ ＨＰカラム（GE Healthcare Life Sciences）を用いてウサギ血清から抗体を回収した。３つのマクロＨ２Ａアイソフォームの組換え（Ｈｉｓ）６−タグ付きマクロドメインを、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰ（GE Healthcare）に結合した。これらのカラムを、後に、アイソフォームに特異的な抗体のアフィニティ精製に用いた。

【0057】

乳癌組織マイクロアレイ
National Center of TumorDiseases（ＮＣＴ）、Heidelberg、Germanyによって、乳癌ＴＭＡが提供された。それらは、異なるブロックに分散された、各スライドに患者当り２つの試料で、２６０人の患者のホルマリン固定されかつパラフィン包理された試料を含んでいた。すべての乳癌患者は女性、中央年齢は５８歳（範囲、３０歳〜８８歳）であった。これらの患者に関する臨床データは、さらなる解析には不十分であった。

【0058】

肺癌患者及び肺組織マイクロアレイ
Thoraxklinik Heidelberg、Germany及びＮＣＴによって肺癌ＴＭＡが提供された。スライドは、切除可能であることが分かり、かつ２００４年３月から１２月の間に手術を受けた、ＮＳＣＬＣの４１人の患者の試料を含んでいた（２３人が腺腫、１８人が扁平上皮癌）。

【0059】

手術中に収集されたこれらの患者の試料をホルマリン固定しパラフィン包理し、対照試料も含むＴＭＡを構成するために用いた。品質の理由で、２人の患者の試料は解析することができず、そのため、解析には３９人の患者の試料が含まれていた。研究対象集団の臨床的特徴について表１を参照されたい。人的資源の収集及び使用が、地域の倫理委員会によって承認された（ethical vote #270/2001、２００５年更新）。患者からはインフォームドコンセントを得た。

【0060】

（表１）非小細胞肺癌研究対象集団の特徴
特徴 中央（範囲）／度数
性別（男／女） 31/8
診断時の年齢（歳） 64（43-80）
全身状態（0/1/2） 28/11/0
腫瘍細胞タイプ（AC/SCC) 22/17
手術のタイプ（LO-BI-PN) 26/2/11
切除状態（R0/R1/R2) 32/5/2
疾患の病期（手術後）(Ia/Ib/IIa/IIb/IIIa/IIIb/IV)
1/11/0/4/13/6/4
１年以内の腫瘍再発(y/n) 18/21

（AC:腺癌、SCC:扁平上皮癌、BI:二葉切除、LO:肺葉切除、PN:肺全摘出）

Ｒ２切除患者のうち、１人が再発（遠隔転移）、１人が再発なく生存、Ｒ１切除患者のうち、３人が再発（２人は局所転移、１人は遠隔転移）、２人は再発なく生存、Ｒ０切除患者のうち、１５人が再発、１７人が再発なく生存。

【0061】

免疫組織化学
連続ＴＭＡスライドを用いて、マクロＨ２Ａ１．１、マクロＨ２Ａ１．２、マクロＨ２Ａ２、Ｋｉ−６７（Dako Cytomation、モノクローナルマウス抗ヒトＫｉ−６７、クローンＭＩＢ−１、１：１００）及びヒストンＨ３（Abcam；ａｂ１７９１；１：１０００希釈液）に対する免疫組織化学染色を行った。Ａｐｅｒｉｏ Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ及びＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを用いてDepartment of Pathology（HeidelbergUniversity）でスライドをスキャンした。

【0062】

マクロＨ２Ａの発現レベルを、スコアリング：０〜１、ネガティブ／弱染色；１〜２、中染色；２〜３、強い核陽性を用いて、半定量的に評価した。増殖指数を、増殖マーカーＫｉ−６７に対する抗体を用いて確定し、コア内のすべての腫瘍細胞とのポジティブ染色された腫瘍の比較のパーセンテージとしてスコアリングした。すべてのスライドを盲目的に評価しかつスコアリングし、２回繰り返した。

【0063】

マウス腫瘍におけるマクロＨ２Ａアイソフォームの解析のために、活性化された７か月〜９か月のＫ−Ｒａｓ Ｐ／Ｇ１２Ｖｇｅｏマウスからの肺（Guerra他、２００３）を解剖し、１０％緩衝ホルマリン（Sigma）に固定し、パラフィンで包理した。連続した３ｍｍ〜５ｍｍ厚さの切除部分を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、マクロＨ２Ａ１．１抗体及びマクロＨ２Ａ１．２抗体（１：７５希釈液）を用いて免疫組織化学染色に対して処理した。肺病変の重症度分類を、専門家の病理医によってマウス肺癌に対して最新の形態学的に許容される基準に従って行った（Jacson他、２００５）。グレード１〜３新生物が腺腫（良性病変）と分類され、グレード４〜５が腺癌（悪性病変）として分類された。

【0064】

統計的分析
Ｋｉ−６７とマクロＨ２Ａ１．１との関係を、アレイによって層別化された条件付き線形関連検定（conditional linear association test）を用いて評価した（Hothorn他、２００６）。無病生存期間の依存度を、同様にアレイで層別化された条件付きログ−ランク検定（long-rank test）によって確立した（Hothorn他、２００６)。

【0065】

２つのヒトマクロＨ２Ａ遺伝子に対して３つの遺伝子産物があり、すべてがＮ末端Ｈ２Ａ状フォールド及びＣ末端マクロドメインを含む。マクロＨ２Ａ１．１及びマクロＨ２Ａ１．２は、Ｈ２ＡＦＹ遺伝子産物の選択的スプライシング（alternative splicing）を通して生成され、マクロＨ２Ａ２は第２の遺伝子Ｈ２ＡＦＹ２によってコード化される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、他のアイソフォームではなくマクロＨ２Ａ１．１のマクロドメインがＡＤＰリボース及び関連するＮＡＤメタボライトを結合する（Kustatscher他、２００５）。本発明者らは、種々のマクロＨ２Ａアイソフォームを検出し識別するために特異的な抗体を生成した（図４）。

【0066】

マクロＨ２Ａ１．１発現を、分化した非増殖性組織に制限することができることが示唆された（Pehrson他、１９９７）。マクロＨ２Ａ１．１タンパク質発現と細胞増殖とのあらゆる相関を解析するために、本発明者らは、２６０人の患者の乳癌試料を含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に対して免疫組織化学染色を行った（図１）。本発明者らは、コア内のすべての腫瘍細胞におけるマクロＨ２Ａ及び増殖マーカーＫｉ−６７の発現レベルを評価した。ヒストンＨ３染色は陽性対照としての役割を果たし、コア内のすべての細胞において強い核染色を示した（図５）。本発明者らは、アレイによって層別化された条件付き線形関連検定を用いてＫｉ−６７発現とマクロＨ２Ａ１．１発現との関係を評価した。本発明者らは、マクロＨ２Ａ１．１発現がＫｉ−６７レベルと非常に相関しており（Ｐ＜０．００１）、Ｋｉ−６７陽性癌細胞の増大によるマクロＨ２Ａ１．１の減少を示すことが分かる。マクロＨ２Ａ２に対して同様の関係が観察され（Ｐ＜０．００１）、マクロＨ２Ａ１．２はこれらの腫瘍において遍在的に発現する（図１）。後者は、一部には、マクロＨ２Ａ１．２に対する抗体のアフィニティが高いためである可能性があり、それにより、発現レベルの僅かな変化を比較することが困難になる可能性がある。しかしながら、明らかに、本発明者らがマクロＨ２Ａ１．２に対する非常に変化する発現レベルを認識し識別することができる組織がある（骨格筋等）。

【0067】

これらのアッセイは、スプライス変異体マクロＨ２Ａ１．１の発現が、低い増殖指数を示している腫瘍に限定されることを確立している。

【0068】

細胞増殖レベル及びマクロＨ２Ａ１．１レベルが、ヒト腫瘍のセットにおいて完全な臨床パラメータといかに相関するかを検査するために、本発明者らは、切除可能であることが分かりかつ手術を受けた３９人のＮＳＣＬＣ患者（２２人が腺癌、１７人が扁平上皮癌、表１）からの試料をスコアリングした。手術の１年以内に、腫瘍は１８人の患者で再発し、２１人の患者は再発がないままであった。本発明者らが乳癌及び他の癌アレイにおいて観察するものと同様に、肺腫瘍アレイの統計的分析により、マクロＨ２Ａ１．１発現が、Ｋｉ−６７レベルと強く相関しており（Ｐ＜０．００１）、Ｋｉ−６７陽性癌細胞の増大により低減することが明らかになる（図２ａ及び図２ｂ）。これは、マクロＨ２Ａ１．１が、細胞周期を出た細胞に対するマーカーであるという証拠を立証している。

【0069】

この概念を更に検査するために、本発明者らは、Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖによって誘発される腫瘍老化のマウスモデルから免疫組織化学的部分を解析した（Guerra他、２００３）。染色により、対応する悪性腺癌と比較して（図３ａ）、前癌状態腺腫病変におけるより高いマクロＨ２Ａ１．１発現が明らかになり、そこでは、ホールマークは多数の老化細胞である（Braig他、２００５；Chen他、２００５；Collado他、２００５）。対照的に、スプライス変異体であるマクロＨ２Ａ１．２は、腺腫及び腺癌において同様のレベルで発現する。この発現パターンにより、マクロＨ２Ａ１．１が癌遺伝子によって誘発された老化マーカーとして定義される。

【0070】

マクロＨ２Ａ１．１発現による無病生存期間の依存度があるか否かを特定するために、本発明者らは、アレイによって層別化される条件付きログ−ランク検定を行った（Hothorn他、２００６）。

【0071】

興味深いことに、それにより、マクロＨ２Ａ１．１発現と無病生存期間との間の著しい相関が明らかになる（Ｐ＝０．００５８）。肺腫瘍試料においてマクロＨ２Ａ１．１レベルが低い患者は、核マクロＨ２Ａ１．１染色が強い患者よりも再発する可能性が高い（図２ｃ）。マクロＨ２Ａ２の発現に対して、同様であるがより弱い相関もまた観察される（Ｐ＝０．０４１４６；図６）。対照的に、遍在的に発現するマクロＨ２Ａ１．２（図７）は、腫瘍再発に対して予後相関を示さない。一般的な増殖マーカーＫｉ−６７の発現は、無病生存期間との著しい相関は示さない（Ｐ＝０．０７９８３）ことに留意されたい。したがって、本発明者らの免疫染色及び臨床データは、ヒストンマクロＨ２Ａ１．１を、肺癌再発の新規で優れた、かつ潜在的に有用なバイオマーカーとして同定する。

【0072】

老化中のヘテロクロマチンヒストンマクロＨ２Ａを更に特徴付けるために、本発明者らは、一次線維芽細胞の免疫蛍光染色を行い、マクロＨ２Ａ１アイソフォームが複製老化中に発現上昇することを観察する。マクロＨ２Ａ１．１は、老化前細胞及び老化細胞においてより高いレベルで発現するとともに、老化細胞においてＳＡＨＦに局在化する。同様に、マクロＨ２Ａ１．２もまた、標準的なヒストンＨ２Ａ等の対照タンパク質とは対照的に発現上昇する。さらに、ＳＡＨＦにおいてマクロＨ２Ａの高濃度は、ＳＡＨＦクロマチンの凝縮した特質の単なる結果ではなく、それは、細胞マクロＨ２Ａ高濃度及びＳＡＨＦの取込みが、高濃度ＤＡＰＩのヘテロクロマチン構造の形成より低速な動態に従うためであり、このことは、以前の報告（Zhang他、２００５）を裏付ける。この発見は、ｈＴＥＲＴ及びＭＥＫ：ＥＲ（ITMcells；Collado他、２００５）を表すヒト正常二倍体線維芽細胞ＩＭＲ９０に対してウエスタンブロットによって支持される。このシステムにより、ＭＥＫキナーゼ、すなわちＲａｓによって誘発される老化の下流エフェクターのスイッチ可能な活性化が可能になる。結果は、老化細胞におけるマクロＨ２Ａ１．１及びマクロＨ２Ａ１．１ヒストンタンパク質の発現上昇を示す（図３ｃ）。対照的に、標準的なヒストンＨ２Ａは、老化の誘発時に緩やかに発現低下するように見える。

【引用文献】

【0073】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]