特許 5792176 シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5792176

(24)【登録日】2015年8月14日

(45)【発行日】2015年10月7日

(54)【発明の名称】シアヌル酸誘導体及びそれを用いるメラミンの検出方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 251/34 20060101AFI20150917BHJP

   G01N 33/02 20060101ALI20150917BHJP

【ＦＩ】

   C07D251/34 FCSP

   G01N33/02

【請求項の数】10

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2012-531977(P2012-531977)

(86)(22)【出願日】2011年9月2日

(86)【国際出願番号】JP2011070056

(87)【国際公開番号】WO2012029955

(87)【国際公開日】20120308

【審査請求日】2014年8月25日

(31)【優先権主張番号】特願2010-196987(P2010-196987)

(32)【優先日】2010年9月2日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100068618

【弁理士】

【氏名又は名称】萼 経夫

(74)【代理人】

【識別番号】100104145

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 嘉夫

(74)【代理人】

【識別番号】100104385

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 勉

(74)【代理人】

【識別番号】100163360

【弁理士】

【氏名又は名称】伴 知篤

(72)【発明者】

【氏名】田中 正人

(72)【発明者】

【氏名】三治 敬信

(72)【発明者】

【氏名】中村 光孝

(72)【発明者】

【氏名】新井 和孝

【審査官】 清水 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−２４９６３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０４−２１０９７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０９０７５１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特開２０１２−０５１８１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 KLOK,H. et al，Self-Assembly of Rodlike Hydrogen-Bonded Nanostructures，J. Am. Chem. Soc.，１９９９年，Vol.121, No.30，p.7154-5

【文献】 CHOI,I.S. et al，Self-Assembly of Hydrogen-Bonded Polymeric Rods Based on the Cyanuric Acid?Melamine Lattice，Chem. Mater.，１９９９年，Vol.11, No.3，p.684-690

【文献】 PLATER M.J. et al.，Tetrahedron，２００４年，Vol.60，p.6385-94

【文献】 DARZAC M. et al.，Journal of Chemical Research, Synopses，２００２年，Vol.8，p.359-360

【文献】 AI K. et al.，J. Am. Chem. Soc.，２００９年，Vol.131, No.27，p.9496-7

【文献】 HONG,Y. et al.，Aggregation-induced emission: phenomenon, mechanism and application，Chem. Comm.，２００９年，p.4332-53

【文献】 中村光孝ら，凝集誘起型発光特性を利用したメラミン検出センサーの開発，日本化学会講演予稿集，２０１１年 ３月１１日，Vol.91st, No.4，p.1484

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ２５１／３４

Ｇ０１Ｎ ３３／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式（１）

【化1】

（式中、Ａは共役化合物Ａ’からｎ個の水素原子を除いたｎ価の残基を表し、Ｂは、単結合を表すか、もしくは、１ないし３個の酸素原子で中断されていてもよい炭素原子数１ないし９のアルキレン基（該アルキレン基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、ｎは２≦ｎ≦８を満足する正の整数を示す。）で表されるシアヌル酸誘導体であって、
該共役化合物Ａ’が、一般式（２）

【化2】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、Ｒ^１とＲ^２は互いに同じであっても異なっていてもよい。式中の波線は二重結合に対してＥ体、Ｚ体、又はそれらの任意の割合の混合物であることを示す。）で表されるジフェニルエテンであるシアヌル酸誘導体。

【請求項2】

基Ａが、下記式（２−ａ）又は式（２−ａ’）

【化5】

（式（２−ａ）中、Ｒ^１及びＲ^２は、各々独立して、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、Ｒ^１とＲ^２は互いに同じであっても異なっていてもよい。式中の波線は二重結合に対してＥ体、Ｚ体、又はそれらの任意の割合の混合物であることを示す。）
で表される基である、請求項１に記載のシアヌル酸誘導体。

【請求項3】

一般式（１）で表される化合物が、式（５）、式（６）、式（７）又は式（８）

【化6】

で表される化合物である、請求項１又は２に記載のシアヌル酸誘導体。

【請求項4】

検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
ｉ）請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液に検体を添加し、混合する工程、及び
ｉｉ）検体が混合された溶液に光を照射し、該溶液からの蛍光強度を測定する工程
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。

【請求項5】

検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
ｉ）検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる操作を１回為すか、又は同操作を最大１０回まで繰り返す工程、
ｉｉ）工程ｉ）で形成されたメンブラン上の付着スポットに、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液をスポット付着させる工程、及び
ｉｉｉ）前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。

【請求項6】

検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
ｉ）請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる工程、
ｉｉ）検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液を、工程ｉ）で形成されたメンブラン上の付着スポットにスポット付着させ、乾燥させる操作を１回為すか、又は同操作を最大１０回まで繰り返す工程、及び
ｉｉｉ）前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。

【請求項7】

前記工程ｉｉｉ）の前に、該メンブランを密閉容器に入れるか、又は該メンブラン表面上に溶媒をスポット付着させることにより、メンブラン表面の乾燥を防ぐ工程をさらに含む、請求項５又は請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記シアヌル酸誘導体を含む溶液に使用する溶媒、及び、検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液に使用する溶媒が、水、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合溶媒である、請求項４ないし請求項７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記光が紫外線である、請求項４ないし請求項８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記蛍光強度を測定する工程が、目視により行われるか又は蛍光光度計を用いて行われる、請求項４ないし請求項９のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メラミンを高感度、迅速かつ簡便に検出するための検出方法並びにメラミンの検出に好適に用いられるシアヌル酸誘導体に関する。

【背景技術】

【0002】

動物用飼料、幼児用粉ミルク、鶏卵製品、菓子等に混入しているメラミンを標的とする検出方法として、米国食品医薬品局では、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ、ＬＣ−ＭＳを用いる方法を、中国国家標準ではＧＣ−ＭＳ、ＬＣ、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳを用いる方法を発表している。これらおよび関連の技術に関し、非特許文献１ではＣＩＭＳ、非特許文献２ではＥＥＳＩ−ＭＳ、非特許文献３ではＭＡＬＤＩ−ＭＳ、非特許文献４ではＬＣ−ＭＳ、非特許文献５−６ではＨＰＬＣ、非特許文献７−８では近赤外分光、非特許文献９−１０ではＳＥＲＳ、非特許文献１１ではミセル導電クロマトグラフィー、等の機器を用いる方法を開示しているが、これらの方法は機器の設置場所に検体を持ち込む必要があることから簡便さに欠け、また、検体毎に時間をかけた分析を行うため、スループットの観点から優れた方法とは考えられない。

【0003】

このような機器の設置の必要性に関わる問題点を回避する試みとして、化学センサーを用いる方法も提案されており、非特許文献１２−１７には金または銀のナノ粒子やその表面をメラミンと相互作用し得る部位を持つ配位子で修飾したものを検出材料として用い、これらがメラミンとの相互作用により色の変化を示すことを利用する方法が、非特許文献１８にはエライザによる方法が、非特許文献１９にはグリコウリル７単位からなるキューカービチュリルにメラミンが包接された際に蛍光の強度が著しく増大することを利用して検出する方法が提案されている。2007年から2008年にかけて乳製品または牛乳にメラミンおよびメラミン関連化合物が違法に混入される事件が起き、特に中国で多くの乳幼児に健康被害が生じた。この事件以降、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）ではメラミンの食品への最大許容値を２．５ｐｐｍ、また乳幼児用粉ミルクなど特殊調製粉乳では１ｐｐｍと定めた。上記の検出法により、幼児用粉ミルクについて米国食品医薬品局が定めた安全基準を満たす検出限界値が得られている。しかし、メラミンからの蛍光は紫外光の領域にあり、蛍光光度計の設置を必要とするため、先と同様の問題点を含んでいる。一方、非特許文献２０にはメラミンを鋳型に用いてゾル−ゲル法により作成したモレキュラーインプリンティング材料とメラミンの親和性をケミルミネッセンスの強度で評価する方法、非特許文献２１には酸化多結晶金電極を用いる微分パルスボルタンメトリーにおける酸化波がメラミン濃度増大とともに強くなることを利用する方法が提案されているが、分析コストの面で有利とは言えない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Analytical Chemistry、2009年、81巻、2426頁

【非特許文献2】Chemical Communications、2009年、559頁

【非特許文献3】Analytical Chemistry、2009年、81巻、3676頁

【非特許文献4】Chinese Science Bulletin、2009年、54巻、732頁

【非特許文献5】Food Control、2010年、21巻、686-691頁

【非特許文献6】American Laboratory、2009年、41巻、38頁

【非特許文献7】HYPERLINK "http://www.impublications.com/nir/journal/jnirs" Journal of Near Infrared Spectroscopy、2010年、 HYPERLINK "http://www.impublications.com/nir/jtoc/18#2" 18巻、113頁

【非特許文献8】Journal of Near Infrared Spectroscopy、2009年、17巻、59頁

【非特許文献9】Journal of Physical Chemistry C、2010年、114巻、93頁

【非特許文献10】Journal of Physical Chemistry C、2010年、114巻、7738頁

【非特許文献11】Journal of Chromatography A、2009年、1216巻、8296頁

【非特許文献12】Journal of the American Chemical Society、2009年、131巻、9496頁

【非特許文献13】Analyst、2010年、135巻、1070頁

【非特許文献14】HYPERLINK "http://www.sciencedirect.com/science/journal/09565663" Biosensors and Bioelectronics、2010年、25巻、2680頁

【非特許文献15】Food Chemistry 、2010年、122巻、895頁

【非特許文献16】Applied Physics Letters、2010年、96巻、133702/1-133702/3頁

【非特許文献17】Analyst、2010年、135巻、1070頁

【非特許文献18】Journal of Food Protection、2010年、73巻、701頁

【非特許文献19】Journal of Luminescence、2010年、130巻、817頁

【非特許文献20】Analytica Chimica Acta、2009年、651巻、209頁

【非特許文献21】Journal of Agricultural and Food Chemistry、2010年、58巻、4537頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上述したように、従来のメラミンの検出手法は、高価な測定機器類を必要とし、また操作も容易ではなく、より経済的に検出でき、且つより簡便な検出手法が求められている。
本発明の課題は、前記の従来技術の問題を克服した、標的に前処理を必要とせず、迅速、高感度、高選択的、かつ安価にメラミンを検出でき、裸眼でも容易に判定可能な検出方法並びに該検出に好適に用いられる検出材料を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、各種共役分子の吸収・発光機能について研究中に、該共役分子に導入した官能基が、ある種の分子の存在下に該共役分子に基づく蛍光の強度を著しく増大させるという興味ある事実を見いだし、特に、シアヌル酸部位を導入した共役分子がメラミン（下記構造）の存在下に蛍光強度を著しく増大させる、いわゆる「ターンオン型」の検出方法の端緒を見いだし、これらの事実に基づいて鋭意研究の結果、本発明を完成させるに至った。

【0007】

【化1】

【0008】

すなわち本発明は、以下の［１］〜［１３］に関する。
［１］一般式（１）

【化2】

（式中、Ａは共役化合物Ａ′からｎ個の水素原子を除いたｎ価の残基を表し、Ｂは、単結合を表すか、もしくは、１ないし３個の酸素原子で中断されていてもよい炭素原子数１ないし９のアルキレン基（該アルキレン基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、ｎは２≦ｎ≦８を満足する正の整数を示す。）で表されるシアヌル酸誘導体。

【0009】

［２］共役化合物Ａ′が、一般式（２）

【化3】

（式中、Ｒ¹及びＲ²は、各々独立して、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、Ｒ¹とＲ²は互いに同じであっても異なっていてもよい。式中の波線は二重結合に対してＥ体、Ｚ体、又はそれらの任意の割合の混合物であることを示す。）で表されるジフェニルエテンである、［１］に記載のシアヌル酸誘導体。

【0010】

［３］共役化合物Ａ′が、一般式（３）

【化4】

（式中、Ｒ³は、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表す。）で表されるホスホールオキシドである、［１］に記載のシアヌル酸誘導体。

【0011】

［４］共役化合物Ａ′が、一般式（４）

【化5】

（式中、Ｒ⁴及びＲ⁵は、各々独立して、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、Ｒ⁴とＲ⁵は互いに同じであっても異なっていてもよい。）で表されるシロールである、［１］に記載のシアヌル酸誘導体。

【0012】

［５］基Ａが、下記式（２−ａ）、式（３−ａ）、式（４−ａ）又は式（２−ａ’）

【化6】

（式（２−ａ）中、Ｒ¹及びＲ²は、各々独立して、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、Ｒ¹とＲ²は互いに同じであっても異なっていてもよい。式中の波線は二重結合に対してＥ体、Ｚ体、又はそれらの任意の割合の混合物であることを示す。
式（３−ａ）中、Ｒ³は、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表す。
式（４−ａ）中、Ｒ⁴及びＲ⁵は、各々独立して、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、Ｒ⁴とＲ⁵は互いに同じであっても異なっていてもよい。）
で表される基である、［１］に記載のシアヌル酸誘導体。

【0013】

［６］一般式（１）で表される化合物が、式（５）、式（６）、式（７）又は式（８）

【化7】

で表される化合物である、［１］又は［２］に記載のシアヌル酸誘導体。

【0014】

［７］検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
ｉ）［１］ないし［６］のいずれか１項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液に検体を添加し、混合する工程、及び
ｉｉ）検体が混合された溶液に光を照射し、該溶液からの蛍光強度を測定する工程
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。

【0015】

［８］検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
ｉ）検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる操作を１回為すか、又は同操作を最大１０回まで繰り返す工程、
ｉｉ）工程ｉ）で形成されたメンブラン上の付着スポットに、［１］ないし［６］のいずれか１項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液をスポット付着させる工程、及び
ｉｉｉ）前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。

【0016】

［９］検体に含まれるメラミンの検出方法であって、
ｉ）［１］ないし［６］のいずれか１項に記載のシアヌル酸誘導体を含む溶液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる工程、
ｉｉ）検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液を、工程ｉ）で形成されたメンブラン上の付着スポットにスポット付着させ、乾燥させる操作を１回為すか、又は同操作を最大１０回まで繰り返す工程、及び
ｉｉｉ）前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法。

【0017】

［１０］前記工程ｉｉｉ）の前に、該メンブランを密閉容器に入れるか、又は該メンブラン表面上に溶媒をスポット付着させることにより、メンブラン表面の乾燥を防ぐ工程をさらに含む、［８］又は［９］に記載の方法。

【0018】

［１１］前記シアヌル酸誘導体を含む溶液に使用する溶媒、及び、検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液に使用する溶媒が、水、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合溶媒である、［７］ないし［１０］のいずれか１項に記載の方法。

【0019】

［１２］前記光が紫外線である、［７］ないし［１１］のいずれか１項に記載の方法。

【0020】

［１３］前記蛍光強度を測定する工程が、目視により行われるか又は蛍光光度計を用いて行われる、［７］ないし［１２］のいずれか１項に記載の方法。

【発明の効果】

【0021】

本発明の一般式（１）で表される化合物は、既知の反応手法を準用して容易に合成することが出来、分離精製もクロマトグラフィーや再結晶により行うこと出来る。また、一般式（１）で示される化合物自身が示す蛍光に比べ、メラミンとの選択的な相互作用や凝集体形成により飛躍的に強い蛍光を示すため、メラミンを迅速、高感度に検出するための材料として有用であり、かつ、オンサイトでの検出も簡便に行うことが出来るため、実用技術として極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、実施例５〜１０で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（５）のアセトニトリル溶液（化合物（５）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の、メラミン添加後の超音波照射時間に対する、波長５００ｎｍにおける蛍光強度（励起波長：３５０ｎｍ）の変化を示す図である。

【図2】図２は、実施例１１〜２５で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（５）のアセトニトリル溶液（化合物（５）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の、３時間超音波照射後の、メラミン濃度に対する、波長５００ｎｍにおける蛍光強度（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図3】図３は、実施例１１ないし１８及び実施例２５で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（５）のアセトニトリル溶液（化合物（５）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の、３時間超音波照射後の、蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図4】図４は、実施例２６及び２８ないし３１で調製した、検体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩの蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図5】図５は、実施例２６ないし２９で調製した、検体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに３６５ｎｍのＵＶランプを光照射して撮影した写真である。

【図6】図６は、実施例３２ないし３５で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（５）のアセトニトリル−水（１：１）混合溶媒（化合物（５）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図7】図７は、実施例３６及び３７で調製した、メラミンを濃度０又は５００μＭにて、化合物（５）のＴＨＦ溶液（化合物（５）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図8】図８は、実施例３８ないし４４で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（５）のエタノール溶液（化合物（５）の濃度：１００μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図9】図９は、実施例４５ないし５１で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（５）のエチレングリコールジメチルエーテル溶液（化合物（５）の濃度：１００μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図10】図１０は、実施例５２ないし５５で調製した、メラミンを濃度０又は１ｐｐｍで化合物（５）のアセトン溶液（化合物（５）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図11】図１１は、実施例５６及び５７で調製した、調製粉乳のみ又はメラミン１０ｐｐｍを混入させた調製粉乳のアセトン溶液を濾過し、化合物（５）を加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図12】図１２は、実施例５６及び５７で調製した、調製粉乳のみ又はメラミン１０ｐｐｍを混入させた調製粉乳のアセトン溶液を濾過し、化合物（５）を加えた試料に３６５ｎｍのＵＶランプを光照射して撮影した写真である。

【図13】図１３は、参考例１ないし７で調製した、メラミン又はその類似化合物を化合物（５）のアセトニトリル溶液（化合物（５）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の、３時間超音波照射後の、波長５００ｎｍにおける蛍光強度（励起波長：３５０ｎｍ）（上段）、並びに、３６５ｎｍのＵＶランプを光照射した際に撮影した写真を示す図である。

【図14】図１４は、実施例５８ないし６２で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（６）のＴＨＦ溶液（化合物（６）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図15】図１５は、実施例６３ないし６９で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（７）のアセトニトリル溶液（化合物（７）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図16】図１６は、実施例７０ないし７６で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（８）のアセトン溶液（化合物（８）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図17】図１７は、実施例７７ないし８３で調製した、種々の濃度のメラミンを化合物（８）のアセトニトリル溶液（化合物（８）の濃度：１０μＭ）に加えた試料の蛍光スペクトル（励起波長：３５０ｎｍ）を示す図である。

【図18】図１８は、＜方法１＞により、標準ろ紙と、０または１０ｐｐｍのメラミン溶液を用いて作製した試験片をバイアル中に３時間静置後、３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８５）。

【図19】図１９は、＜方法１＞により、ＰＶＤＦメンブランと、０または１０ｐｐｍのメラミン溶液を用いて作製した試験片をバイアル中に３時間静置後、３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８５）。

【図20】図２０は、＜方法１＞により、ＰＶＤＦメンブランと、種々の濃度を有するメラミン溶液を用いて作製した試験片をバイアル中に３時間静置後、３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８５）。

【図21】図２１は、＜方法１＞により、ＰＶＤＦメンブランと、種々の濃度を有するメラミン溶液を用いて作製した試験片をバイアル中に静置し、３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真の画像解析により算出される蛍光強度の時間変化を示す図である（実施例８５）。

【図22】図２２は、＜方法２＞により、ＰＶＤＦメンブランと、０、１または１０ｐｐｍのメラミン溶液を用いて作製した試験片に対して、作製後１分経過後に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８６）。

【図23】図２３は、＜方法２＞により、ナイロンメンブランと、０、１または１０ｐｐｍのメラミン溶液を用いて作製した試験片に対して、作製後１分経過後に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８６）。

【図24】図２４は、＜方法２＞により、コーヒーフィルタと、０、１または１０ｐｐｍのメラミン溶液を用いて作製した試験片に対して、作製後１分経過後に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８６）。

【図25】図２５は、＜方法２＞により、ＰＶＤＦメンブランと、調製粉乳を混入させた０、１、５または１０ｐｐｍのメラミン溶液を用いて作製した試験片に対して、作製後１分経過後に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８６）。

【図26】図２６は、＜方法２＞により、ＰＶＤＦメンブランと、調製粉乳を混入させた１０ｐｐｍのメラミン溶液を用い、ただし溶液のスポット数を変化させて作製した試験片に対して、作製後１分経過後に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８６）。

【図27】図２７は、＜方法２＞により、ＰＶＤＦメンブランと、０、１あるいは１０ｐｐｍのメラミン溶液（抽出溶媒としてアセトンを使用）を用いて作製した試験片に対して、エタノールをスポット付着させた直後に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８７）。

【図28】図２８は、＜方法２＞により、ＰＶＤＦメンブランと、調製粉乳を混入させた０、１、５あるいは１０ｐｐｍのメラミン溶液（抽出溶媒としてアセトンを使用）を用いて作製した試験片に対して、エタノールをスポット付着させた直後に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して撮影した写真である（実施例８７）。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本明細書中「ｎ」はノルマルを、「ｓｅｃ」はセカンダリーを意味する。
本明細書において示される各基は、具体的には以下の通りである。

【0024】

炭素原子数１ないし９のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、１，３−プロピレン基、１，４−ブチレン基、１，６−ヘキシレン基、１，８−オクチレン基、ノナメチレン基等の直鎖状のアルキレン基、プロパン−１，２−ジイル基、３−メチルペンタン−１，５−ジイル基等の分枝鎖状のアルキレン基を例示することが出来る。

【0025】

１ないし３個の酸素原子で中断された炭素原子数１ないし９のアルキレン基とは、アルキレン鎖中に酸素原子が含まれる基、アルキレン鎖の少なくとも一方の末端に酸素原子が結合する基、又はアルキレン鎖中に酸素原子が含まれ且つアルキレン鎖の少なくとも一方の末端に酸素原子が結合する基、のいずれの場合の基をも意味するものである。
その具体例としては、１−オキシ−１，３−プロピレン基、１，４，７−トリオキシノナン−１，９−ジイル基、１−オキシペンタン−１，５−ジイル基、１，４−ジオキシヘキサン−１，６−ジイル基、３−オキシペンタン−１，５−ジイル基等のオキシアルキレン基を例示することが出来る。

【0026】

炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基としては、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、エチル基、メチル基等の、直鎖状、分枝鎖状又は環状のものを包含した脂肪族飽和炭化水素基を例示することが出来る。

【0027】

炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基としては、ビニル基、イソプロペニル基、１−プロペニル基、アリル基、１−ブテン−１−イル基、２−ブテン−１−イル基、３−ブテン−１−イル基、３−ブテン−２−イル基、２，２−ジメチルビニル基、１−ペンテン−１−イル基、２−ペンテン−１−イル基、３−ペンテン−１−イル基、３−ペンテン−２−イル基、４−ペンテン−１−イル基、４−ペンテン−２−イル基、４−ペンテン−３−イル基、４−ペンテン−４−イル基、１，２−ジメチル−１−ブテン−１−イル基、１−オクテン−１−イル基、１−デセン−１−イル基、１−ドデセン−１−イル基、１−シクロヘキセン−１−イル基、１−シクロヘキセン−３−イル基、１−シクロオクテン−１−イル基、１−メチル−１−シクロヘキセン−２−イル基、フェニル基、アルファナフチル基、ベータナフチル基、ベータアントリル基、オルトビフェニル基、メタビフェニル基、パラビフェニル基、ベンジル基、１−又は２−フェニルエチル基等の、直鎖状、分枝鎖状又は環状の脂肪族不飽和炭化水素基、及び、芳香族炭化水素基を例示することが出来る。

【0028】

炭素原子数７以下の置換基としては、前記炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基において挙げた基、ｎ−ヘプチル基、前記炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基において挙げた基の内の炭素原子数が７以下の基、ベンジル基、メトキシ基、エトキシ基、ブトキシ基、フェノキシ基、ベンジロキシ基、メチルチオ基、フェニルチオ基、メトキシメチル基、メトキシエチル基、ジメチルアミノ基、カルボメトキシ基、カルボエトキシ基、シアノ基、アセチル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基等を例示することができる。
またハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等を例示することが出来る。

【0029】

前記一般式（１）で表される化合物を構成する基Ａの母体となる共役化合物Ａ′は、光化学の研究において従来報告されて来たいかなるものでもよいが、検出の簡便さの面からは、可視光領域に蛍光を示すものが好ましく、電界発光材料として研究開発されてきた構造を含め、多様な共役分子を用いることが出来る。

【0030】

中でも好適なものとして、一般式（２）

【化8】

（式中、Ｒ¹及びＲ²は、各々独立して、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、Ｒ¹とＲ²互いに同じであっても異なっていてもよい。式中の波線は二重結合に対してＥ体、Ｚ体、又はそれらの任意の割合の混合物であることを示す。）で表される化合物、一般式（３）

【化9】

（式中、Ｒ³は、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表す。）で表される化合物、一般式（４）

【化10】

（式中、Ｒ⁴及びＲ⁵は、各々独立して、水素原子、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基（該飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）又は炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基（該不飽和炭化水素基は、炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子で置換されていても良い。）を表し、Ｒ⁴とＲ⁵は互いに同じであっても異なっていてもよい。）で表される化合物等を例示することが出来る。

【0031】

尚、一般式（２）、式（３）及び式（４）で表される化合物における、炭素原子数１ないし６の飽和炭化水素基、炭素原子数２ないし１２の不飽和炭化水素基及び炭素原子数７以下の置換基又はハロゲン原子としては、前述に例示した基又は原子と同様の基又は原子を挙げることが出来る。

【0032】

ｎが２又は４を示す場合の好ましい基Ａの具体例としては、以下の式（２−ａ）、式（３−ａ）、式（４−ａ）又は式（２−ａ’）で表される２価又は４価の基等が挙げられる。

【化11】

（式中、Ｒ¹ないしＲ⁵、並びに式中の波線は前述の定義と同じ意味を表す。）

【0033】

また、好適な一般式（１）で表される化合物として、下記式（５）、式（６）、式（７）又は式（８）で表される化合物を挙げることができる。

【化12】

【0034】

次に、一般式（１）で表される化合物の製造方法を説明する。

【0035】

一般式（１）で表される化合物は、例えば、以下のスキーム１に記載の方法に従って、製造することができる。

【0036】

【化13】

上記スキーム１中、Ａ、Ｂ及びｎは、前記と同じ意味を表し、Ｘは、ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子等）、脂肪族スルホニルオキシ基（メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基等）又は芳香族スルホニルオキシ基（ベンゼンスルホニルオキシ基、パラトルエンスルホニルオキシ基等）等の脱離基を表す。

【0037】

即ち、式（１−ａ）で表される化合物とシアヌル酸を無溶媒又は適当な溶媒中、塩基の存在下又は非存在下で縮合させることにより一般式（１）で表される化合物を製造することができる。

【0038】

尚、ｎが２又は４である場合における、好ましい式（１−ａ）で表される化合物としては、以下の式（２−ｂ）、式（３−ｂ）、式（４−ｂ）又は式（２−ｂ’）で表される化合物等が挙げられる。

【化14】

（式中、Ｒ¹ないしＲ⁵、Ｂ及びＸ、並びに式中の波線は前述の定義と同じ意味を表す。）

【0039】

本発明はまた、前記式（１）で表されるシアヌル酸誘導体を用いることを特徴とする、検体に含まれるメラミンの検出方法を対象とする。

【0040】

本発明のメラミンの検出方法は、
ｉ）前述の式（１）で表されるシアヌル酸誘導体を含む溶液に検体を添加し、混合する工程、及び
ｉｉ）検体が混合された溶液に光を照射し、該溶液からの蛍光強度を測定する工程
を含むことを特徴とする。

【0041】

メラミンの検出に当たっては、メラミンを含む検体と前記一般式（１）で表される化合物とを、適当な媒体中で混合して相互作用させ、目視又は蛍光光度計で蛍光強度の増大によって判定することが出来る。その際、媒体によっては相互作用を十分に進行させるために必要に応じて超音波照射等により混合物を振とうしてもよい。

【0042】

また、シアヌル酸誘導体を含む溶液に使用する溶媒は、水、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合溶媒であることが望ましい。
メラミンの検出方法に用いる媒体、すなわちシアヌル酸誘導体を含む溶液に使用する溶媒の具体例しては、水、または、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水とを混合した混合溶媒を用いることが出来る。

【0043】

また、検体が混合された溶液に照射する光が紫外線であること、並びに、蛍光強度を測定する測定が、目視により行われるか又は蛍光光度計を用いて行われることが好ましい。
なお、上記検出方法において、ｉｉ）蛍光強度を測定する工程の前に、当業者が通常使用し得る方法を用いて、検体が混合された溶液を濃縮してもよい。

【0044】

本発明によれば、メラミンの検出方法の別の手法として、検体及びシアヌル酸誘導体をメンブランにスポット付着させた試験片を用いることによっても、検体に含まれるメラミンを検出することができる。この場合、検体とシアヌル酸誘導体をメンブランに付着させる順序はいずれが先であってもよい。

【0045】

より具体的には、本発明は、
ｉ）検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる操作を１回為すか、又は同操作を最大１０回まで繰り返す工程、
ｉｉ）工程ｉ）で形成されたメンブラン上の付着スポットに、前記式（１）で表されるシアヌル酸誘導体を含む溶液をスポット付着させる工程、及び
ｉｉｉ）前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とするメラミンの検出方法に関する。

【0046】

また、本発明は、
ｉ）前記式（１）で表されるシアヌル酸誘導体を含む溶液をメンブランにスポット付着させ、乾燥させる工程、
ｉｉ）検体を混合、溶解又は懸濁させた試験液を、工程ｉ）で形成されたメンブラン上の付着スポットにスポット付着させ、乾燥させる操作を１回為すか、又は同操作を最大１０回まで繰り返す工程、及び
ｉｉｉ）前記メンブラン上の付着スポットに光を照射し、該付着スポットからの蛍光強度を測定する工程、
を含むことを特徴とする、メラミンの検出方法に関する。

【0047】

本発明のメラミンの検出方法に使用されるメンブランは、メンブラン自体が、例えば、紫外線照射によって蛍光を発するものを除いて、特に限定されない。
本発明で使用可能なメンブランは、例えば、市販の標準ろ紙（例えばアドバンテック社製など）、低蛍光ポリフッ化ビニリデン（ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＶＤＦ）メンブラン（例えばＧＥヘルスケア社製など）、ナイロンメンブラン（例えばワットマン社（現：ＧＥヘルスケア社）製など）、及び酵素漂白コーヒーフィルタ（例えば（株）カリタ製など）を使用することが挙げられる。これらの中でも好ましくは、ＰＶＤＦメンブランである。

【0048】

また、本発明において、メンブランを用いてメラミンを検出する場合、メラミンを含むことが疑われる検体は、固体又は液体のいずれであってもよい。メンブランに検体をスポット付着させる際には液体の形態として調製することが好ましく、使用可能な媒体（溶媒）としては、ただしこれらに限定されないが、水、または、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水とを混合した混合溶媒が挙げられる。好ましくは、エタノール又はアセトンである。

【0049】

メンブランを用いる本検出方法では、蛍光強度を測定する工程の前に、検体とシアヌル酸誘導体を付着させたメンブラン表面が乾燥している場合には、上記媒体（溶媒）をさらに付着させたスポットの上からスポット付着させてもよい。
したがって、本発明の検出方法において、前記工程ｉｉｉ）の前に、メンブラン表面上に前記溶媒をさらにスポット付着させるか、或いは、該メンブランを密閉容器（例えば、プラスチック製容器、バイアル、セル）に入れることにより、該メンブラン表面の乾燥を防ぐ工程をさらに含んでいてもよい。

【0050】

本発明のメラミンの検出方法では、メンブラン上にシアヌル酸誘導体を含む溶液と、検体を含む試験液をスポット付着させるが、検体を含む試験液はスポット付着させた後、乾燥させて、同試験液を同一個所に重ねてスポット付着させる工程を繰り返してもよい。繰り返しの数は、当業者であれば適宜調整することができ、特に限定されないが、好ましくは、最大１０回、１〜７回、１〜５回、２〜５回、３〜５回、１〜４回、２〜４回、５回、４回、３回、２回、１回である。

【0051】

上述の本発明の検出方法において、検体が混合された溶液（試験液）に照射する光、並びに、メンブラン上の付着スポットに照射する光は、好ましくは紫外線である。その光源は共役化合物Ａ′の吸収波長近辺の波長の光を放射するものであればいかなるものを用いてもよく、共役化合物の構造に応じて、キセノンランプ、低圧水銀灯、中圧水銀灯、高圧水銀灯等を用いることが出来るが、必要に応じて、キセノンランプからの放射光を分光して用いてもよく、簡便には、クロマトグラフィー作業において検出に用いる紫外線ランプを用いることも出来る。
光照射に用いる検出は、一般に裸眼による目視でも容易に行えるが、蛍光光度計を用いることにより定量的データを得ることも出来る。
尚、検出に用いる蛍光の好ましい波長範囲としては、例えば、４３０ｎｍないし６００ｎｍ、また、４６０ｎｍないし５５０ｎｍの範囲等が挙げられる。

【実施例】

【0052】

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
なお、実施例中の記載に使用されている略号の意味を以下に説明する。
ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカー７−エン
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド。

【0053】

実施例１ 化合物（５）の合成

【0054】

【化15】

【0055】

磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ二口フラスコを窒素置換した。窒素雰囲気下、シアヌル酸（１．２０ｇ、９．２６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（８ｍＬ）、ＤＢＵ（０．２９ｍＬ、１．８５ｍｍｏｌ）、１，２−ジフェニル−１，２−ジ[ｐ−（４−ブロモブトキシ）フェニル]エテン（５８７ｍｇ、０．９２６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液を加えた。その後、７０℃で２１時間２０分撹拌した。低沸点物を減圧留去し、ＴＨＦ（３０ｍＬ）を加えて、析出する固体を濾過により除いた。濾液を減圧留去し、再びＴＨＦ（１５ｍＬ）を加えて析出物を濾過し、濾液を減圧留去し、黄色固体（８００ｍｇ）を得た。このうち２００ｍｇを用いて次のようにＧＰＣ分取を行った。黄色固体をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、０．４５μＭのメンブレンフィルターで不溶物を取り除いた後にＧＰＣ分取（ＴＨＦ溶媒、流速２．５０ｍＬ／分）することにより、薄黄色固体を４０．１ｍｇ得た。このうち３０．５ｍｇにベンゼン（３ｍＬ）を加えて、凍結脱気することにより、化合物（５）（２８．３ｍｇ）を得た（０．２０３ｍｍｏｌ、収率２２％）。

【0056】

本化合物は文献未収載の新規化合物であり、物性値や分光学的データは以下の通りであった。
白色粉末（シス体とトランス体の混合物）、158.1℃（分解）。
¹H NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) δ 1.64 (br, 16H, OCH₂CH₂ + NCH₂CH₂), 3.66 (br, 8H, NCH₂), 3.87 (br, 8H, OCH₂), 6.65 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH), 6.69 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH), 6.81 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH), 6.85 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH), 6.92 ？ 6.97 (m, 8H, ArH), 7.06 ？ 7.17 (m, 12H, ArH), 11.40 (s, 8H, NH)
¹³C NMR (75 MHz, DMSO？d₆) δ 24.3 (× 2), 26.1 (× 2), 67.0 (× 2), 113.7 (× 2), 126.3 (× 2), 127.8 (× 2), 127.9 (× 2), 130.8 (× 2), 132.0 (× 2), 135.6 (× 2), 139.3 (× 2), 143.8 (× 2), 148.8 (× 2), 150.0 (× 2), 157.0 (× 2).
高分解能MS (FAB, マトリックス＝3？ニトロベンジルアルコール) C₄₀H₃₈N₆O₈ ([M]⁺) としての計算値 m/z 730.2751, 実測値 730.2740.

【0057】

実施例２ 化合物（６）の合成

【0058】

【化16】

【0059】

窒素置換し、磁気撹拌子を備えた５０ｍＬ二口メスフラスコに、シアヌル酸（１．２９ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１２ｍＬ）、ＤＢＵ（０．３０ｍＬ，２．０１ｍｍｏｌ）および１，１，２，２−テトラキス（４−（２−（２−ブロモエトキシ）エトキシ）フェニル）エテン（０．５０１ｇ，０．５００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（８ｍＬ）を加えた。その後７０℃で２４時間加熱撹拌した。低沸点物を減圧留去し、ＴＨＦ（３０ｍＬ）を加えて析出する固体を濾過により除去した。再びＴＨＦ（２０ｍＬ）を加えて、析出する固体を濾過により除去した。再度ＴＨＦ（１５ｍＬ）を加えて析出物を濾過し、濾液を減圧留去し、黄色固体（７８５ｍｇ）を得た。このうち３００ｍｇを用いて次のようにＧＰＣ分取を行った。黄色固体をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解させ、メンブレンフィルターで少量の不溶物を除去した後にＧＰＣ分取（流速：２．５０ｍＬ／分、ＴＨＦ溶媒）を行い、化合物（６）（２７．１ｍｇ）を得た（０．０２２７ｍｍｏｌ、換算収率１２％）。

【0060】

本化合物は文献未収載の新規化合物であり、物性値や分光学的データは以下の通りである。
黄色固体、融点110.4-111.3℃。
¹H NMR (THF-d₈, 300 MHz) δ 1.69 (br, 8H, CH₂N), 3.62 (t, J = 6.0 Hz, 8H, ArOCH₂CH₂), 3.70 (t, J = 4.8 Hz, 8H, CH₂CH₂N), 3.92 (t, J = 6.0 Hz, 8H, ArOCH₂), 6.59 (d, J = 8.1 Hz, 8H, ArH), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, 8H, ArH), 10.4 (s, 8H, NH)
¹³C NMR (THF-d₈, 75 MHz) δ 40.4, 68.0, 68.1, 69.7, 114.2, 133.1, 137.7, 139.2, 148.8, 150.4, 158.2
高分解能MS (FAB, マトリックス＝３−ニトロベンジルアルコール) C₅₄H₅₆N₁₂O₂₀ ([M⁺])としての計算値 m/z 1192.3734, 実測値1192.3728.

【0061】

実施例３ 化合物（７）の合成

【0062】

【化17】

【0063】

窒素置換し、磁気撹拌子を備えた３０ｍＬ二口フラスコに、シアヌル酸（０．８５５ｇ，６．６３ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１２ｍＬ）、ＤＢＵ（０．２００ｍＬ，１．３４ｍｍｏｌ）、及び１，２−ジフェニル−１，２−ビス（４−（２−（２−（２−ブロモエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェニル）エテン（４９８ｍｇ，０．６６１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）溶液を順次加えた。その後、６０℃で３日間加熱撹拌した。その後、反応溶液にトルエン（１５０ｍＬ）を加えて、濾過をし、白色濾物を０．９６２ｇ得た。この固体にＴＨＦ（１５ｍＬ）を加えて、析出する固体を濾過により除去した。濾液を減圧留去し、再びＴＨＦ（５ｍＬ）を加えて析出物を濾過し、低沸点物を減圧留去して白色固体（３５１ｍｇ）を得た。このうち、２２０ｍｇを用いて次のようにＧＰＣ分取を行った。白色固体をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、０．４５μｍメンブレンフィルターで少量の不溶物を取り除いた後にＧＰＣ分取（流速：２．５０ｍＬ／分、ＴＨＦ溶液）を行い、化合物（７）（１５．７ｍｇ）を得た（０．０１８５ｍｍｏｌ、換算収率４．５％）。

【0064】

本化合物は文献未収載の新規化合物であり、物性値や分光学的データは以下の通りである。
黄色固体（シス体とトランス体の混合物）、融点51.6-65.7℃。
¹H NMR (THF-d₈, 300 MHz) δ 1.67 (br, 8H, CH₂N, cis + trans), 3.52-3.59 (m, 24H, ArOCH₂CH₂OCH₂ + ArOCH₂CH₂OCH₂CH₂ + CH₂CH₂N, cis + trans), 3.67 (t, J = 4.5 Hz, 4H, OCH₂CH₂, cis or trans), 3.68 (t, J = 4.5 Hz, 4H, OCH₂CH₂, cis or trans), 3.92 (t, J = 4.5 Hz, 4H, OCH₂, cis or trans), 3.98 (t, J = 4.5 Hz, 4H, OCH₂, trans or cis), 6.58 (AA'BB', J = 9.0 Hz, 4H, ArH, cis or trans), 6.59 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH, cis or trans), 6.82 (AA'BB', J = 9.0 Hz, 4H, ArH, cis or trans), 6.83 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 4H, ArH, cis or trans), 6.90-7.04 (m, 20H, ArH, cis + trans)
¹³C NMR (THF-d₈, 75 MHz) δ 26.2 (× 2), 68.0, 68.1, 70.4 (× 2), 70.9 (× 2), 71.4 (× 2), 114.2, 114.3, 126.67, 126.73, 128.1, 128.2, 132.0, 132.1, 133.07, 133.10, 137.00, 137.03, 140.5 (× 2), 145.18, 145.24, 148.9 (× 2), 150.4 (× 2), 158.42, 158.45
高分解能MS (FAB, マトリックス＝３−ニトロベンジルアルコール) C₄₄H₄₆N₆O₁₂ （［Ｍ］⁺）としての計算値m/z 850.3174, 実測値850.3162.

【0065】

実施例４ 化合物（８）の合成

【0066】

【化18】

【0067】

窒素置換し、磁気撹拌子を備えた３０ｍＬ三口ナスフラスコに、シアヌル酸（０．４８０ｇ，３．７２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２ｍＬ）、ＤＢＵ（０．１１１ｍＬ，０．７４２ｍｍｏｌ）を加えた。その後１，２−ジフェニル−１，２−ビス（４−（２−（２−ブロモエトキシ）エトキシ）フェニル）エテン（０．２４７ｇ，０．３７１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液を加え、７０℃で２４時間撹拌した。低沸点物を減圧留去し、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を加え、析出した固体を濾過により除去した。濾液を減圧留去し、再度ＴＨＦ（５ｍＬ）を加えて析出物を濾過し、濾液を減圧留去し、白黄色固体（０．７１３ｇ）を得た。このうち、０．３００ｇを用いて次のようにＧＰＣ分取を行った。白黄色固体をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、０．４５μｍメンブレンフィルターで少量の不溶物を取り除いた後にＧＰＣ分取（流速：２．５０ｍＬ／分、ＴＨＦ溶液）を行い、化合物（８）（５９．５ｍｇ）を得た（０．０７８０ｍｍｏｌ、換算収率３６．１％）。

【0068】

本化合物は文献未収載の新規化合物であり、物性値や分光学的データは以下の通りである。
黄色固体（シス体とトランス体の混合物）、106.0℃（分解）。
¹H NMR (acetone-d₆, 300 MHz) δ 3.67 (t, J = 6.3 Hz, 4H, CH₂N, cis or trans), 3.71 (t, J = 6.0 Hz, 4H, CH₂N, cis or trans), 3.77 (t, J = 4.2 Hz, 4H, ArOCH₂CH₂, cis or trans), 3.80 (t, J = 3.6 Hz, 4H, ArOCH₂CH₂, cis or trans), 3.69-4.05 (m, 16H, CH₂CH₂N + ArOCH₂, cis + trans), 6.69 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 8H, ArH, cis + trans), 6.91 (AA'BB', J = 8.7 Hz, 8H, ArH, cis + trans), 6.99-7.15 (m, 20H, ArH, cis + trans), 10.3 (brs, 8H, NH, cis + trans)
¹³C NMR (acetone-d₆, 75 MHz) δ 40.3, 40.4, 67.68 (× 2), 67.72 (× 2), 69.5 (× 2), 114.1, 114.2, 126.7, 126.8, 128.1, 128.2, 131.69, 131.72, 132.8, 132.9, 136.8, 136.9, 140.3 (× 2), 144.8, 144.9, 148.5, 148.6, 150.16, 150.19, 157.99, 158.01
高分解能MS (FAB, マトリックス＝３−ニトロベンジルアルコール) C₄₀H₃₈N₆O₁₀ ([M]⁺)としての計算値 m/z 762.2649, 実測値762.2644.

【0069】

実施例５〜１０
アセトニトリルに化合物（５）を１０μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンをその濃度が１μＭ（実施例５）、５μＭ（実施例６）、７．７μＭ（実施例７）、１０μＭ（実施例８）、１５μＭ（実施例９）、又は２０μＭ（実施例１０）となるように加えた。
各溶液を超音波照射によって混合しながら、励起波長３５０ｎｍにて蛍光スペクトルを測定した。図１に、メラミン添加後の超音波照射時間（横軸）に対して、波長５００ｎｍにおける蛍光強度（励起波長：３５０ｎｍ）（縦軸）を示した図を示す。
図１に示す通り、メラミン濃度が１μＭ（実施例５）では、５時間経過後も蛍光強度の増大は認められなかったが、５μＭ以上（実施例６〜１０）では１．５時間以上の超音波照射で蛍光強度の著しい増大が認められ、その傾向はメラミンが高濃度であるほど著しくなった。なお、実施例７のメラミン濃度７．７μＭは米国食品医薬品局の定めた幼児用粉ミルク中に許容される最大メラミン濃度１ｐｐｍに相当し、この一連の実施例は、それより低濃度のメラミン（例えば実施例６）であっても、時間をかけることで、メラミンが検出可能であることを示している。

【0070】

実施例１１〜２５
実施例５〜１０と同様に、化合物（５）を１０μＭの濃度で溶解したアセトニトリル溶液に対して、濃度が１μＭ（０．１３ｐｐｍ相当：実施例１１）、２μＭ（０．２６ｐｐｍ相当：実施例１２）、３μＭ（０．３９ｐｐｍ相当：実施例１３）、５μＭ（０．６５ｐｐｍ相当：実施例１４）、７．７μＭ（１．０ｐｐｍ相当：実施例１５）、１０μＭ（１．３ｐｐｍ相当：実施例１６）、１５μＭ（１．９ｐｐｍ相当：実施例１７）、２０μＭ（２．６ｐｐｍ相当：実施例１８）、５０μＭ（６．５ｐｐｍ相当：実施例１９）、１００μＭ（１３ｐｐｍ相当：実施例２０）、２００μＭ（２６ｐｐｍ相当：実施例２１）、１５４０μＭ（２００ｐｐｍ相当：実施例２２）、７７００μＭ（１０００ｐｐｍ相当：実施例２３）、２３１００μＭ（３０００ｐｐｍ相当：実施例２４）又は４６２００μＭ（６０００ｐｐｍ相当：実施例２５）となるようにメラミンを加えて、３時間超音波照射し、その後蛍光スペクトルを測定した。
図２に、メラミン濃度（対数目盛、横軸）に対して、波長５００ｎｍにおける蛍光強度（励起波長：３５０ｎｍ）（縦軸）をプロットした図を示す。また、図３には、実施例１１〜１８及び実施例２５の、波長３７０ｎｍから６００ｎｍの蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を示す。
図２において点線で示す１ｐｐｍの濃度は、米国食品医薬品局の定めた幼児用粉ミルク中に許容される最大メラミン濃度であり、メラミン濃度７．７μＭに相当する。図２に示すように、１ｐｐｍ（７．７μＭ）の前後（５〜２０μＭ）でちょうど蛍光強度の立ち上がりが観測されており、米国食品医薬品局の許容基準によくマッチした検出感度であるとする結果が得られた。また、それより遙かに高濃度のメラミンを含む場合であっても、メラミンのない場合に比べて極めて大きな蛍光強度を示しており、本発明の検出方法が広い範囲のメラミン濃度に対応する検出能力を持っていることが確認された。

【0071】

実施例２６〜３１
メラミンを１ｐｐｍ含む検体を以下のように調製した。市販品の調製粉乳（明治ほほえみらくらくキューブ、（株）明治）を調乳方法に従い、粉乳（１ブロック）を蒸留水（４０ｍＬ）に溶解した。ここにメラミン（４．００ｍｇ、０．３１７μｍｏｌ）を加えて、３０分間超音波を照射した。その後、このうち２．０ｍＬを量りとり、アセトニトリル（７８ｍＬ）を加えて抽出操作を行った。アセトニトリルに不溶な白色沈殿物が析出するため、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、無色の上澄み液（２．０ｍＬ）を０．４５μｍのメンブレンフィルターを用いて濾過し、メラミンを含む調製粉乳抽出アセトニトリル溶液を得た。濾液を減圧留去した後、ここに化合物（５）の濃度が１００μＭとなるようにアセトニトリルに溶解したストックソリューション（０．５０ｍＬ）およびアセトニトリル（４．５ｍＬ）を加えて３時間超音波照射することにより、メラミンを１ｐｐｍ含む検体を得た。この検体をＩＩＩとする。
同様の方法で、メラミンを１０ｐｐｍ、３００ｐｐｍ、又は３０００ｐｐｍ含む検体を得た。これらの検体をそれぞれＩＶ、Ｖ、ＶＩとする。なお、対照試料として、メラミンを含まないサンプルＩ、ＩＩも同様の手順にて準備した。準備した６種の検体の詳細は以下のとおりである。

【表1】

こうして得られた各検体の蛍光スペクトルを測定し（励起波長：３５０ｎｍ）、また、検体Ｉ〜ＩＶに３６５ｎｍのＵＶランプで光照射して蛍光を観測し、写真撮影した。図４に蛍光スペクトルを、図５に蛍光観察の結果を示す。図４に示すように、メラミン濃度が１ｐｐｍ（検体ＩＩＩ）であっても蛍光強度の増大が観測され、また図５の写真に示すように、目視でも容易に判定可能であるとする結果が得られた。また、多量のメラミンを含む場合（検体ＩＶ〜ＶＩ）であっても、メラミンのない場合に比べて著しい蛍光強度の増大が認められ、本発明の検出方法が、広い濃度範囲のメラミンの検出が可能であることを示している。

【0072】

実施例３２〜３５
アセトニトリル−水（１：１）混合溶媒に、化合物（５）を１０μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が０μＭ（実施例３２）、５００μＭ（実施例３３）、１０００μＭ（実施例３４）又は５０００μＭ（実施例３５）となるように加えた試料を用意し、これらの蛍光スペクトルを測定した（励起波長：３５０ｎｍ）。得られた結果を図６に示す。
図６に示すように、メラミンの濃度が１０００μＭ（６３１ｐｐｍ）で蛍光強度が増加しはじめ、５０００μＭでは著しく高くなり、高濃度のメラミンを検出できるとする結果が得られた。

【0073】

実施例３６及び３７
ＴＨＦに化合物（５）を１０μＭの濃度で溶解し、メラミンをその濃度が５００μＭとなるように加えた試料（実施例３６）、及び、対照データとして、メラミンを加えない試料（実施例３７）を用意し、励起波長３５０ｎｍで励起した際の蛍光スペクトルを測定した。得られた結果を図７に示す。
図７に示すように、溶媒がＴＨＦの場合においてもメラミンの存在により蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。

【0074】

実施例３８〜４４
エタノールに化合物（５）を１００μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が０ｐｐｍ（実施例３８）、１ｐｐｍ（実施例３９）、２ｐｐｍ（実施例４０）、４ｐｐｍ（実施例４１）、６ｐｐｍ（実施例４２）、８ｐｐｍ（実施例４３）、又は１０ｐｐｍ（実施例４４）になるように加えた試料を用意し、２時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した（励起波長３５０ｎｍ）。得られた結果を図８に示す。
図８に示すように、溶媒がエタノールの場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。

【0075】

実施例４５〜５１
エチレングリコールジメチルエーテルに化合物（５）を１００μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が０ｐｐｍ（実施例４５）、１ｐｐｍ（実施例４６）、２ｐｐｍ（実施例４７）、４ｐｐｍ（実施例４８）、６ｐｐｍ（実施例４９）、８ｐｐｍ（実施例５０）、又は１０ｐｐｍ（実施例５１）になるように加えた試料を用意し、２時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した（励起波長３５０ｎｍ）。得られた結果を図９に示す。
図９に示すように、溶媒がエチレングリコールジメチルエーテルの場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。

【0076】

実施例５２〜５５
アセトンに化合物（５）を１０μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンを０ｐｐｍ（実施例５２）とした試料、またはメラミンを１ｐｐｍを加えた試料を２時間、超音波照射（実施例５３）、撹拌（実施例５４）あるいは静置（実施例５５）し、蛍光スペクトルを測定した（励起波長３５０ｎｍ）。得られた結果を図１０に示す。
図１０に示すように、溶媒としてアセトンを用いた場合でも、静置又は撹拌によってメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。

【0077】

実施例５６及び５７
化合物（５）（３．６５ｍｇ，５．００μｍｏｌ）をアセトン（２５ｍＬ）に溶解し、２００μＭの溶液を調製した。また市販品の調製粉乳（明治ほほえみらくらくキューブ、（株）明治）（１．３５ｇ）にメラミン（０．１０３ｇ：１０ｐｐｍに相当）を添加し、次いでアセトン（５ｍＬ）を加え、３分間激しく撹拌した。上澄み溶液を、脱脂綿を詰めたパスツールピペットで濾過し、この濾液（２．０ｍＬ）に先に調製した化合物（５）の溶液を２．０ｍＬ加え、室温で３時間静置した後に蛍光スペクトルを測定し、またＵＶ光（３６５ｎｍ）照射下での写真を撮影した（実施例５６）。なお、対照試料として、メラミンを含まないサンプルも同様に作成し、蛍光スペクトル測定及び写真撮影を行った（実施例５７）。得られた結果を図１１（蛍光スペクトル）及び図１２（ＵＶ光照射下の写真）に示す。
図１１に示すように、メラミンが混入した粉ミルクのサンプルでは、蛍光強度の著しい増加が観測され、また図１２に示すように目視によっても青色蛍光が観測されることから、アセトン中でも調製粉乳に混入したメラミンの検出が出来るとする結果が得られた。

【0078】

参考例１〜７
メラミンと類似構造を持つアンメリン（参考例３）、アンメリド（参考例４）、ウラシル（参考例５）、シトシン（参考例６）、チミン（参考例７）について、それぞれの濃度が１００μＭとなるように化合物（５）の１０μＭアセトニトリル溶液に加え、３時間超音波を照射した。同様に、アンメリン、アンメリド、ウラシル、シトシン、チミン、メラミンのいずれをも加えないブランクの試料（参考例１）、および、メラミンを加えた試料（参考例２）も調製したが、メラミンについてはその濃度が１０μＭとなるように加えた。これらの試料について蛍光スペクトルを測定（励起波長：３５０ｎｍ）し、また、ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射下での写真を撮影した。図１３の上段に波長５００ｎｍでの各試料の蛍光強度を、図１３の下段に各試料の蛍光の写真を示す。
図１３に示すように、メラミン以外は波長５００ｎｍ付近の青色蛍光は実質的にほとんど観測されず、本発明の検出方法がメラミンを特異的に検出できるとする結果が得られた。
尚、上記の化合物の構造は以下の通りである。

【化19】

【0079】

実施例５８〜６２
ＴＨＦに、化合物（６）を１０μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が０μＭ（実施例５８）、１０μＭ（実施例５９）、２０μＭ（実施例６０）、５０μＭ（実施例６１）、又は１００μＭ（実施例６２）となるように加えた試料を用意し、３時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した（励起波長３５０ｎｍ）。得られた結果を図１４に示す。
図１４に示すように、化合物（６）を用いた場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。

【0080】

実施例６３〜６９
アセトニトリルに、化合物（７）を１０μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が０ｐｐｍ（実施例６３）、１ｐｐｍ（実施例６４）、１０ｐｐｍ（実施例６５）、２０ｐｐｍ（実施例６６）、３０ｐｐｍ（実施例６７）、４０ｐｐｍ（実施例６８）、又は５０ｐｐｍ（実施例６９）となるように加えた試料を用意し、３時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した（励起波長３５０ｎｍ）。得られた結果を図１５に示す。
図１５に示すように、化合物（７）を用いた場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。

【0081】

実施例７０〜７６
アセトンに、化合物（８）を１０μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が０ｐｐｍ（実施例７０）、１ｐｐｍ（実施例７１）、２ｐｐｍ（実施例７２）、３ｐｐｍ（実施例７３）、４ｐｐｍ（実施例７４）、５ｐｐｍ（実施例７５）、又は１０ｐｐｍ（実施例７６）となるようにを加えた試料を用意し、これを３時間静置した後、蛍光スペクトルを測定した（励起波長３５０ｎｍ）。得られた結果を図１６に示す。
図１６に示すように、アセトン中で化合物（８）を用いた場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。

【0082】

実施例７７〜８３
アセトニトリルに、化合物（８）を１０μＭの濃度で溶解し、ここにメラミンを、それぞれ濃度が０ｐｐｍ（実施例７７）、１ｐｐｍ（実施例７８）、２ｐｐｍ（実施例７９）、３ｐｐｍ（実施例８０）、４ｐｐｍ（実施例８１）、５ｐｐｍ（実施例８２）、又は１０ｐｐｍ（実施例８３）となるように加えた試料を用意し、３時間超音波照射後に蛍光スペクトルを測定した（励起波長３５０ｎｍ）。得られた結果を図１７に示す。
図１７に示すように、アセトニトリル中で化合物（８）を用いた場合においてもメラミンの存在で蛍光が著しく強くなるとする結果が得られた。

【0083】

実施例８４
化合物（５）を用い、以下の方法１又は２に示す方法により試験片を作製し、メンブラン上でメラミンを検出する実験を行った。メンブランとしては、標準ろ紙（アドバンテック社製 Ｎｏ．２、サイズ：６Φあるいは５ｍｍ×５ｍｍ）、低蛍光ポリフッ化ビニリデン（ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＶＤＦ）メンブラン（ＧＥヘルスケア社製、Ｈｙｂｏｎｄ−ＬＦＰ、サイズ：６Φ）、ナイロンメンブラン（ワットマン社（現：ＧＥヘルスケア社）製、Ｎｙｔｒａｎ Ｎ、サイズ：６Φ）、酵素漂白コーヒーフィルタ（（株）カリタ製、サイズ：６Φ）を使用した。
＜方法１＞
各濃度のメラミンのエタノール溶液をメンブランにパスツールピペット（又はマイクロピペット）で２滴（１滴≒１０μＬ）スポット付着させた後、メンブランを乾燥させた。この操作を５回繰り返し、メンブラン上に合計１０滴分のメラミンの溶液をスポット付着させた。次いで、メラミンの溶液をスポット付着させた上記メンブランに、化合物（５）のエタノール溶液（１００μＭ）をパスツールピペットで２滴滴下し、バイアル（高さ５．５ｃｍ、底の直径１．６ｃｍ）中で蓋をして静置、又はメンブランをスライドガラスに載せ、そのまま静置した。
＜方法２＞
化合物（５）のエタノール溶液（１００μＭ）をパスツールピペット（又はマイクロピペット）でメンブランに２滴（１滴≒１０μＬ）滴下し、メンブランを乾燥させた。次いで、各濃度のメラミンのエタノール溶液をパスツールピペット（又はマイクロピペット）を用いてメンブランに２滴（１滴≒１０μＬ）スポット付着させ、そのまま静置した。メンブランの種類に応じて、メラミンのエタノール溶液をさらにスポット付着させた後、乾燥させる工程を１〜４回繰り返した。繰り返し操作の最終回においては、乾燥させずに、メンブランをスライドガラスに載せ、そのまま静置した。
また、上記方法に準じて、溶媒としてエタノールに代えてアセトンを使用する場合には、まず化合物（５）のアセトン溶液（１００μＭ）をメンブランに滴下し、乾燥させた。次いで、メラミンのアセトン溶液をスポット付着させ、乾燥させる工程を全５回行った（メンブラン上に合計１０滴のメラミンのアセトン溶液を滴下したことになる）。その後、メンブランをスライドガラスに載せ、乾いたメンブランを濡らすために、エタノールをパスツールピペット（又はマイクロピペット）で１滴滴下し、そのまま静置した。
なお、＜方法１＞および＜方法２＞のいずれの場合も、メラミン濃度が０ｐｐｍの対照試料として、メラミン溶液をメンブランにスポット付着させずに化合物（５）のエタノール溶液のみをスポット付着させた試験片を作製した。

【0084】

以上の＜方法１＞あるいは＜方法２＞で作製した試験片に、３６５ｎｍのＵＶ光を照射し、試験片の蛍光観測、又はＵＶ光照射下での写真を撮影し、さらに撮影したデジタル写真を用いてデータの画像解析（ＩｍａｇｅＪを使用）により蛍光の強度を数値化し、メラミンの検出実験を行った。

【0085】

次に、調製粉乳に混入させたメラミンの検出実験を行った。典型例として、調製粉乳に１０ｐｐｍのメラミンを混入させた検体をエタノールを用いて調製する方法を以下に記す。
乳児用調製粉乳（１．３５ｇ）にメラミン（０．１０１ｍｇ）を添加し、次いでエタノール（１０ｍＬ）を加え、室温で５分間撹拌した。得られた上澄み溶液を、綿を詰めたパスツールピペットを用いてろ過し、ろ液を検体として用いた。この検体と、化合物（５）（１００μＭ）のエタノール溶液を用い、前述の＜方法２＞と同じ操作を行い、試験片を作製した。
なお、アセトンを溶液の溶媒とした用いた場合、アセトンの気化が早く乾いた状態ではメラミンの有無にかかわらず蛍光が観測されるため、調製粉乳のアセトン溶液のろ液をスポット付着させた後、メンブランにエタノールを１滴スポット付着させたものを試験片として用いた。
また、メラミン０ｐｐｍの対照試料として、調製粉乳にメラミンを混入させず先と同様にろ過したろ液を用いた。

【0086】

実施例８５
方法１を用いて、メラミン検出における各メンブランの効果と、各種メラミン濃度に対する蛍光強度の変化を経時的に調べた。使用したメンブランは、標準ろ紙とＰＶＤＦメンブランである。各メンブランに、０又は１０ｐｐｍのメラミン溶液を用いて方法１によって作製した試験片をバイアル中に３時間静置し、３６５ｎｍのＵＶ光を照射して写真を撮影した。得られた結果を図１８と１９に示す。
ろ紙を使用した場合（図１８）、メラミン０ｐｐｍの試験片でろ紙自体の蛍光が観測されるものの、１０ｐｐｍのメラミン溶液をスポット付着させた試験片がより明るく蛍光を示していることから容易に識別でき、メラミンを検出可能であるとする結果が得られた。同様に、ＰＶＤＦメンブランを用いた場合（図１９）においても、１０ｐｐｍのメラミン溶液をスポット付着させた試験片がより強く蛍光を示しており、メラミンを検出可能であるとする結果が得られた。
両メンブランを比較すると、ＰＶＤＦメンブランの方がバックグランドの蛍光（０ｐｐｍ）が殆どなく、メラミンの検出において検出感度が優れていると言える。そこで、さらに、ＰＶＤＦメンブランを用いて、メラミン溶液の濃度を変化させた場合の検出限界について検討した。０ｐｐｍ、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ又は１０００ｐｐｍのメラミン溶液を用い、方法１にてＰＶＤＦメンブランにスポット付着させた試験片を用意し、それらをバイアル中に３時間静置した後、３６５ｎｍのＵＶ光を照射して蛍光観察を行った。得られた結果を図２０に示す。図２０から明らかなように、１ｐｐｍ以上のメラミン溶液を用いて作製した試験片の蛍光が目視により確認でき、メラミンが検出可能であるとする結果が得られた。
次に、上記の各種濃度のメラミン溶液を用いて作製した試験片における蛍光強度の経時変化を静置直後からのＵＶ光照射下での写真のデータの画像解析により算出した。得られた結果を図２１に示す。図２１に示すように、メラミン濃度が１０ｐｐｍ以上の試験片では、数分から数十分以内で蛍光強度の増加が観察された。一方、メラミン濃度が１ｐｐｍの試験片では、１時間以上経過してようやく蛍光強度が増加しているものの、１２０分程度経過後であれば十分に蛍光強度の増加を観察することができた。

【0087】

実施例８６
方法２を用いて、メラミン検出における各メンブランの効果を調べた。使用したメンブランは、ＰＶＤＦメンブラン、ナイロンメンブラン、及びコーヒーフィルタ（酵素漂白）である。メラミン溶液として濃度を０ｐｐｍ、１ｐｐｍ又は１０ｐｐｍに調製したものを用いて各メンブランに滴下（１０滴）した試験片を作製し、１分経過した試験片に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して写真を撮影した。得られた結果を図２２（ＰＶＤＦメンブラン）、図２３（ナイロンメンブラン）、図２４（コーヒーフィルタ）に示す。
図２２〜図２４に示すように、いずれの試験片においても、１０ｐｐｍのメラミン溶液をスポット付着させた試験片が蛍光を示していることがはっきりと確認でき、メラミンを検出することができた。特にＰＶＤＦメンブランを用いた試験片（図２２）では、メラミン濃度が１ｐｐｍであっても、方法１と同様にはっきりとメラミンを検出することができた。

【0088】

次に、検体としてメラミンを混入させた調製粉乳を用いた場合においても、上記と同様にメラミンを検出できるかどうかをＰＶＤＦメンブランを用いて試験した。方法２に従って調製した、調製粉乳に０ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ又は１０ｐｐｍの濃度でメラミンを混入させた検体をスポット付着（１０滴）させて試験片を作製し、１分経過時に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して写真を撮影した。得られた結果を図２５に示す。図２５に示すように、５ｐｐｍ及び１０ｐｐｍのメラミン溶液をスポット付着させた試験片が蛍光を示し明るく観測されることから、調製粉乳に混入したメラミンを検出可能であるとする結果が得られた。

【0089】

さらに、上記試験において検出限界を調べるために、調製粉乳の滴下数を変化させて試験を行った。調製粉乳に混入した１０ｐｐｍのメラミン溶液のスポット数を計０滴、２滴、４滴、６滴又は８滴としてＰＶＤＦメンブランにスポット付着させて試験片を作製し、１分経過後に３６５ｎｍのＵＶ光を照射して写真を撮影した。得られた結果を図２６に示す。図２６に示すように、４滴以上の１０ｐｐｍメラミン溶液をスポット付着させた試験片が蛍光を示し明るく観測されていることから、調製粉乳に混入したメラミンを検出可能であるとする結果が得られた。

【0090】

実施例８７
方法２において、ＰＶＤＦメンブランと、エタノールの代りにアセトンを抽出溶媒として用いた０ｐｐｍ、１ｐｐｍ又は１０ｐｐｍのメラミン溶液を用いて試験片を作製し、その後、アセトンの気化により乾燥した表面を濡らすためにエタノールをスポット付着させた。図２７に、エタノールのスポット直後に３６５ｎｍのＵＶ光照射下で撮影した写真を示す。図２７に示すように、１ｐｐｍ又は１０ｐｐｍメラミン溶液をスポット付着させた試験片が蛍光を示していることからアセトンを溶媒として用いた場合でもメラミンを検出可能であるとする結果が得られた。

【0091】

次に、同様にして、メラミンを混入させた調製粉乳におけるメラミン検出を検討した。方法２に従って調製した、調製粉乳に０ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ又は１０ｐｐｍの濃度でメラミンを混入させた検体をＰＶＤＦメンブランにスポット付着（１０滴）させて試験片を作製し、乾燥した表面を濡らすため、試験片表面にエタノールをスポット付着させた。図２８に、エタノールのスポット直後に３６５ｎｍのＵＶ光照射下で撮影した写真を示す。図２８に示すように、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ及び１０ｐｐｍメラミン溶液をスポット付着させた試験片が蛍光を示していることから調製粉乳に混入したメラミンを、アセトンを用いても検出可能であるとする結果が得られた。

【0092】

以上のように、メンブランを用いたメラミン検出系では、実施例５〜８３と比較して、短時間（数分から数十分）で、しかも容易にメラミンを検出することができた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図21】

【図5】

【図12】

【図13】

【図18】

【図19】

【図20】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】