特許 5792223 核酸の検出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5792223

(24)【登録日】2015年8月14日

(45)【発行日】2015年10月7日

(54)【発明の名称】核酸の検出

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20150917BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20150917BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 GZNA

   C12Q1/68 A

【請求項の数】17

【全頁数】80

(21)【出願番号】特願2013-91939(P2013-91939)

(22)【出願日】2013年4月25日

(62)【分割の表示】特願2009-513296(P2009-513296)の分割

【原出願日】2007年6月1日

(65)【公開番号】特開2013-176378(P2013-176378A)

(43)【公開日】2013年9月9日

【審査請求日】2013年4月25日

(31)【優先権主張番号】60/810,078

(32)【優先日】2006年6月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507238193

【氏名又は名称】サード ウェーブ テクノロジーズ，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100096183

【弁理士】

【氏名又は名称】石井 貞次

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(72)【発明者】

【氏名】アラウィ，ハティム，ティー．

(72)【発明者】

【氏名】リャミチェフ，ビクター

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５１０３７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２７２０７５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０５０４９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 RNA，２００４年，Vol.10，P.1153-1161

【文献】 Nat. Biotechnol.，２００１年，Vol.19，P.673-676

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＰｕｂＭｅｄ

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｍｉＲＮＡ標的を検出する方法であって、
ａ）ｉ）ｍｉＲＮＡ標的、
ｉｉ）前記ｍｉＲＮＡ標的の第一領域に相補的な第一部分および前記ｍｉＲＮＡ標的の第一領域に相補的でない第二部分を含む、第一オリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）前記ｍｉＲＮＡ標的の第二領域に相同な第一部分および前記ｍｉＲＮＡ標的の前記第二領域に相同でない第二部分を含む、第二オリゴヌクレオチド、
ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ、
ｖ）プローブオリゴヌクレオチド、
ｖｉ）少なくとも一部が、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第二部分中の領域に相補的である、スタッカーオリゴヌクレオチド、
を提供するステップ、
ｂ）検出構造を形成するような条件下で成分（ｉ）〜（ｖｉ）をインキュベートするステップであって、その条件下で：
１）前記第一オリゴヌクレオチドが前記ｍｉＲＮＡ標的および前記スタッカーオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズし、さらに前記ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて前記ｍｉＲＮＡ標的に相補的な第一の伸長生成物を生成し、
２）前記第一の伸長生成物が、前記第一オリゴヌクレオチドおよび前記第二オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ標的を形成し、
３）前記プローブオリゴヌクレオチドが前記ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ標的にハイブリダイズして、検出構造を形成する、
前記ステップ、および
ｃ）前記検出構造を検出するステップ
を含む方法。

【請求項2】

前記検出ステップが、前記プローブオリゴヌクレオチドおよび前記ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ標的を含む侵入的切断構造を形成するステップ、前記侵入的切断構造を切断するステップ、および前記侵入的切断構造の切断を検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、逆転写酵素を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第一オリゴヌクレオチドが、前記プローブオリゴヌクレオチドに隣接してハイブリダイズし、前記侵入的切断反応において侵入的切断構造を形成する、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記提供ステップが、（ｖｉｉ）検出構造を切断できる酵素を提供するステップをさらに含み、前記インキュベートステップが、成分（ｉ）〜（ｖｉｉ）をインキュベートするステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記酵素が、５'ヌクレアーゼを含み、ポリメラーゼ活性がない、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記酵素が、古細菌種のＦＥＮ−１ヌクレアーゼである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記プローブオリゴヌクレオチドが未標識である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記第一オリゴヌクレオチドおよび／または前記第二オリゴヌクレオチドが未標識である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記第一オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドと前記ｍｉＲＮＡ標的間で６〜１０塩基対の二重鎖を形成するような核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記第一および前記第二オリゴヌクレオチドの、一方もしくは両方の前記第二部分が、第一領域と第二領域を含み、第二部分中のその第一領域とその第二領域が、互いにハイブリダイズして、ヘアピン構造を形成することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

少なくとも一部が、前記第二オリゴヌクレオチドの前記第二部分中の領域に相補的である、第二スタッカーオリゴヌクレオチド、を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記検出ステップは、標識したプローブの使用を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記標識したプローブが、FRET検出用に構成されている、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ｍｉＲＮＡが、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ１２５ｂ、ｍｉＲ−１ｄ、およびｍｉＲ１２４ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

ｍｉＲＮＡを検出するために使用される場合のキットであって、
ｉ）ｍｉＲＮＡ標的の第一領域に相補的な第一領域および前記ｍｉＲＮＡ標的の第一領域に相補的でない第二領域を含む、第一オリゴヌクレオチド、
ｉｉ）前記ｍｉＲＮＡ標的の第二領域に相同な第一領域および前記ｍｉＲＮＡ標的の前記第二領域に相同でない第二領域を含む、第二オリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、
ｉｖ）プローブオリゴヌクレオチドであって、前記第一オリゴヌクレオチドおよび前記第二オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するポリメラーゼ連鎖反応によって前記ｍｉＲＮＡ標的に相補的な伸長生成物が増幅されるときに形成されるｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡに相補的である、プローブオリゴヌクレオチド、
ｖ）５'末端部分を含むスタッカーオリゴヌクレオチドであって、前記スタッカーオリゴヌクレオチドの少なくとも５'末端部分が、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第一領域に隣接する、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第二領域中の領域に相補的である、スタッカーオリゴヌクレオチド、
ｖｉ）検出構造を切断できる酵素
を含む、キット。

【請求項17】

前記検出構造が侵入的切断構造を含む、請求項１６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸分子［例えば、ＲＮＡ｛例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのスモールＲＮＡ｝および他の短い核酸分子］を検出し特徴付ける組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、ＲＮＡの発現を検出し定量化する方法に関する。本発明は、ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの突然変異体（例えば欠失突然変異体）、および変異体の検出法をさらに提供する。

【背景技術】

【0002】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、無脊椎動物および脊椎動物のゲノム中、短い逆方向反復としてコードされる新規な非コードＲＮＡクラスである（（非特許文献１）；（非特許文献２））。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの翻訳および安定のモジュレーターであるが、ほとんどの標的ｍＲＮＡはまだ同定されていない。ｍｉＲＮＡ配列は、３’非翻訳領域のアンチセンス相補性部位と結合することによって、標的ｍＲＮＡの翻訳を特異的に制御する（ＵＴＲ）（Ambros上掲、Moss上掲、（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５））。ｍｉＲＮＡは、他の機序よっても遺伝子発現を阻害しうる（例えば（非特許文献６）、（非特許文献７）を参照）。

【0003】

数個のｍｉＲＮＡ、例えば、ｌｅｔ−７ＲＮＡ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−６０、およびｍｉＲ−８７は、無脊椎動物および脊椎動物間では高度に保存されており、おそらく保存されている機能の複数の部位および／または複数の標的を認識しうると推測される（Lagos-Quintanaら上掲、Lauら上掲、Lee ら上掲、（非特許文献８））。スモールテンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ：small temporal RNA）ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７は、線虫（Caenorhabditis elegans）の遺伝子解析によって同定されたｍｉＲＮＡサブクラスを表すが、これらのｓｔＲＮＡは、発生的に調節され、それ自体が発生プログラム、例えば、ニューロンの再配線接続（neuronal rewiring）のタイミング、耐性幼虫形成、産卵口形成、および皮下組織細胞終末分化を制御する。

【0004】

ｍｉＲＮＡは、典型的には、６０〜７０ヌクレオチドのフォールドバックＲＮＡ前駆体構造から切り取られ、ｍｉＲＮＡ前駆体の発現開始時（（非特許文献９）、（非特許文献１０）、（非特許文献１１））または非常に豊富なｍｉＲＮＡの発現中（Lagos-Quintanaら上掲、Lauら上掲、Lee ら上掲）に検出されることもある。一般的に、ヘアピン前駆体分子鎖の一本のみが切り取られ蓄積するが、おそらく、その一本が付随するタンパク質によってＲＮＡ分解から保護されているからであろう。これらの推定タンパク質が、翻訳抑制を媒介している可能性がある。ｍｉＲＮＡ前駆体プロセッシング反応には、Dicer RNase IIIおよびアルゴノートファミリーメンバーが必要である（Grishokら上掲、Hutvagnerら上掲、Kettingら上掲）。

【0005】

遺伝子発現に及ぼす影響に加えて、スモールＲＮＡ、（例えば、１８〜２５ヌクレオチドの範囲のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）は、治療剤および創薬の領域で（例えば、薬物標的または医薬品として）有用性を見出すことができよう。すなわち、状況によっては、（例えば治療前、治療中、または治療後に）細胞中にそれぞれのｍｉＲＮＡが、およそどれほど存在するかを知ることが重要である。

【0006】

さらに、ｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失および下方調節は、癌（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））に関連付けられており、ｍｉＲＮＡ発現を検出し特徴付けることが当技術分野で必要とされている（例えば（非特許文献１２を参照））。ある場合には、異なる種類の組織で、または刺激、例えば化学的もしくは物理的介入を行なう前後で、ｍｉＲＮＡのレベルを比較することも重要であろう。

【0007】

関連するｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが、細胞に少量ずつ存在する可能性があるので、検出方法は敏感かつ特異的なものが望ましい。さらに、ある種の適用では、高処理スクリーニング法、例えば、均質な方法、多重的方法に適した方法、または高度並列自動操作および限定的温度変化に適した方法を同定することに有益であろう。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ambros, (2001) Cell 107, 823−826

【非特許文献2】Moss (2002) Curr. Biol. 12, R138−R140

【非特許文献3】Lagos-Quintanaら, (2001) Science 294, 853−858

【非特許文献4】Lauら, (2001) Science 294, 858−862

【非特許文献5】Leeら, (2001) Science 294, 862−864

【非特許文献6】Pillaiら, Science 309, 1573-1576 (2005)

【非特許文献7】Humphreysら, Proc Natl Acad Sci USA 102, 16961-16966 (2005)

【非特許文献8】Pasquinelliら, (2000) Nature 408:86

【非特許文献9】Grishokら, (2001) Cell 106, 23−34

【非特許文献10】Hutvagnerら, (2001) Science 93, 834−838

【非特許文献11】Kettingら, (2001) Genes Dev. 15, 2654−2659

【非特許文献12】Calinら, Proc Natl Acad Sci USA, 99, 15524-15529 (2002)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

遺伝子発現の調節で、ｍｉＲＮＡは重要な役割を果たしているが、ｍｉＲＮＡの発現を検出し定量するのに有効な技術はない。ｍｉＲＮＡの定量に使用されている方法は、ゲル電気泳動に基づいてきた。ｍｉＲＮＡは、ノーザンブロッティング、または放射性RNase耐性二重鎖の存在によって検出する。ノーザンブロッティングおよびチップハイブリダイゼーション方法は、分析感度がやや低く（Krichevskyら、２００３）、したがってマイクログラム量のＲＮＡが、分析には必要であり、さらには、スモールＲＮＡをフィルターに転移することが、定量再現性に問題をもたらしかねず、一般的には、ハイスループット用に手直しすることができない。さらに、RNase耐性に基づく検出方法には、高度放射性プローブが必要である。さらに、プローブハイブリダイゼーションのみに基づくアッセイでは、配列が密接に関連するアイソタイプ間を適切に判別することができない。代替の手法には、ｍｉＲＮＡをクローニングするステップ、次いでその挿入物を配列決定するステップが含まれる。この手法は、密接に関連するｍｉＲＮＡ種相互間で、一個の塩基の相異を区別するのに適切であろうが、時間も手間もかかる。

【0010】

ｍｉＲＮＡのように、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称する応答を通じて、例えばウイルスＲＮＡからの細胞防御に関与する、スモールＲＮＡ分子である［Cullen, B.R., Nature Immunology, 3: 597-599 (2002)］。細胞中の二本鎖ＲＮＡの存在に対するＲＮＡｉ応答の一部として、ダイサー酵素と、ＲＮＡが誘発するサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質複合体との作用を通じて、ｓｉＲＮＡの一クラスが生成される［Khvorova, A.ら, Cell 115: 209-216 (2003)］。ｓｉＲＮＡの別のクラスは、合成物であり、形質移入もしくは導入ベクターからの発現によって直接細胞中に導入した特徴的なジヌクレオチドオーバーハングを有する、通常２１〜２３ｎｔの短い二重鎖を包含する［Elbashir, S.M.ら, EMBO J. 20: 6877-6888 (2001)］（Paul, C.P.ら, Nature Biotechnology 20: 505-508 (2002)、米国特許出願公開第２００３／０１４８５１９号Ａ１。あらゆる目的のために、その全体を参照により本明細書に組み込む］。ある場合には、ｓｉＲＮＡは、所定の配列を固持するように見え、それによって機能および組成がｍｉＲＮＡと類似するようになる（Elbashir, S.M.ら上掲）。ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡレベルを検出し特徴づける（例えば定量する）効率的で正確な方法が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、核酸分子［例えば、ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのスモールＲＮＡ］、および他の短い核酸分子を検出し特徴付ける組成物および方法に関する。より具体的に、本発明は、ＲＮＡの発現を検出し特徴付ける（例えば定量化する）改善された方法に関する。

【0012】

例えば、本発明は、少なくとも一個の核酸（例えば、その干渉ＲＮＡに相補的でない配列を含む核酸）と、干渉ＲＮＡ標的とをハイブリダイズして、検出構造を生成するステップ、およびその検出構造を検出するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その干渉ＲＮＡ標的はｍｉＲＮＡである。他の実施形態では、その干渉ＲＮＡ標的はｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのｓｉＲＮＡは二本鎖である。

【0013】

いくつかの実施形態では、検出構造は侵入的切断構造を含む。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、ｍｉＲＮＡと組み合せて、侵入的切断構造を形成するように構成された、第一と第二オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、前記ｍｉＲＮＡと組み合せて、侵入的切断構造を形成するように構成された第一オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第一オリゴヌクレオチドは５’部分と３’部分を含み、その際、前記３’部分は、前記標的配列とハイブリダイズするように構成し、前記５’部分は、前記標的配列とハイブリダイズしないように構成する。第二オリゴヌクレオチドを使用するいくつかの実施形態では、第二オリゴヌクレオチドは５’部分と３’部分を含み、その際、前記５’部分は、前記標的配列とハイブリダイズするように構成し、前記３’部分は、前記標的配列とハイブリダイズしないように構成する。いくつかの実施形態では、検出ステップはINVADERアッセイの使用を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、検出構造は、環状検出構造を生成するために、前記スモールＲＮＡとハイブリダイズさせた環状オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出ステップは、ローリングサークル型複製アッセイの使用を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、検出構造は、ポリメラーゼによって伸長する（例えば鋳型依存性伸長）遊離３’−ＯＨ基を有する核酸分子を含み、その伸長配列を直接的または間接的に検出する。

【0016】

いくつかの実施形態では、検出ステップには、それだけには限らないが、配列決定アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、突然変異に相補的なプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ、マイクロアレイアッセイ、ビーズアレイアッセイ、プライマー伸長法アッセイ、酵素ミスマッチ切断アッセイ、分枝ハイブリダイゼーションアッセイ、NASBAアッセイ、分子ビーコンアッセイ、サイクリングプローブアッセイ、リガーゼ連鎖反応アッセイ、侵入的切断構造アッセイ、ARMSアッセイ、およびサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを含む検出アッセイの使用が含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、検出ステップは細胞ライセートで実施する。

【0017】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、第二核酸標的を検出するステップを含む。いくつかの好ましい実施形態では、第二核酸標的はＲＮＡである。いくつかの特に好ましい実施形態では、第二核酸標的は、Ｕ６ ＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡである。

【0018】

いくつかの実施形態では、検出構造を形成するために使用する核酸は、スモールＲＮＡに十分に相補的な一個もしくは複数の部位を有する鋳型を含む。ＲＮＡが、その鋳型とハイブリダイズし、伸長反応で伸長するようにするためである。いくつかの実施形態では、伸長反応はポリメラーゼ連鎖反応であり、ポリメラーゼ連鎖反応ではプライマーとして一個もしくは複数のＲＮＡを使用する。いくつかのそのような実施形態では、一本型ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーを提供するために、鋳型の２つの位置に結合する。他の実施形態では、プライマーとして、２個またはそれ以上のＲＮＡが使用される。そのような実施形態では、増幅生成物の検出は、試料中の２個またはそれ以上のＲＮＡの存在を意味する（すなわちｍｉＲＮＡ多重アッセイ）。リガーゼ連鎖反応で類似の方法を使用してもよく、その際、連結したオリゴヌクレオチドとしてｍｉＲＮＡを使用する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ鋳型の少なくとも一部を超えてプライマーを伸長することによって、検出複合体を改変する鋳型としてＲＮＡを使用する。

【0019】

いくつかの実施形態では、本方法は複数のｍｉＲＮＡの検出を含む。いくつかのそのような実施形態では、複数のｍｉＲＮＡは同じｍｉＲＮＡの多型を含む。他の実施形態では、複数のｍｉＲＮＡは異なるｍｉＲＮＡを含む（例えば、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２４ａ、またはｍｉＲ１２５ｂ）。

【0020】

本発明は、上記方法のいずれかを実施するためのキットも提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＮＡ標的配列とハイブリダイズしたとき、検出構造を形成するように構成された核酸を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、ｍｉＲＮＡを検出するように構成されている。いくつかの好ましい実施形態では、キットは、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１ｂ、ｍｉＲ−１２４ａ、またはｍｉＲ１２５ｂのｍｉＲＮＡを検出するように構成されている。いくつかの好ましい実施形態では、キットは、ｍｉＲＮＡ標的と共に、第二ＲＮＡ標的を共検出するように構成されている。

【0021】

本発明はまた、（ｉ）ｍｉＲＮＡ標的、（ｉｉ）第一の未標識オリゴヌクレオチド、（ｉｉｉ）第二の未標識オリゴヌクレオチド、（ｉｖ）逆転写酵素、（ｖ）ポリメラーゼ、および（ｖｉ）プローブオリゴヌクレオチドを提供するステップ、検出構造を形成するような条件下で（ｉ）〜（ｖｉ）をインキュベートするステップ、およびその検出構造を検出するステップを含む、ｍｉＲＮＡ標的を検出する方法も提供する。いくつかの実施形態では、第一の未標識オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ標的に相補的な第一領域およびｍｉＲＮＡ標的に相補的でない第二領域を含む。いくつかの実施形態では、第二の未標識オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ標的の第二領域に相補的な第一領域およびｍｉＲＮＡ標的の第二領域に相補的でない第二領域を含む。いくつかの実施形態では、検出は、侵入的切断構造を形成するステップ、侵入的切断構造を切断するステップ、およびその侵入的切断構造の切断を検出するステップを含む。いくつかの実施形態では、前記インキュベーションステップは、検出構造は切断できるがポリメラーゼ活性はない酵素と共に、インキュベートするステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、酵素は５’ヌクレアーゼであるが、いくつかの実施形態では、酵素はＦＥＮ−１ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、侵入的切断構造の切断は４５℃〜６０℃の温度で生じる。いくつかの実施形態では、侵入的切断構造の切断は約５０℃の温度で生じる。いくつかの実施形態では、第一の未標識オリゴヌクレオチドは、逆転写用プライマーとして使用される。いくつかの実施形態では、第一の未標識オリゴヌクレオチドは、侵入的切断反応でINVADERオリゴヌクレオチドとして使用される。いくつかの実施形態では、（ｉ）〜（ｖｉ）は、同じ反応槽中に存在する。いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、（ｖｉｉ）第二プローブオリゴヌクレオチドを提供するステップを含む。いくつかの実施形態では、第一の未標識オリゴヌクレオチドと逆転写酵素が、ｍｉＲＮＡ標的を逆転写する。いくつかの実施形態では、逆転写されたｍｉＲＮＡ標的（すなわち、ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ標的）は、ポリメラーゼ連鎖反応において、第一の未標識オリゴヌクレオチドと、第二の未標識オリゴヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される。いくつかの実施形態では、増幅した逆転写ｍｉＲＮＡ標的が、プローブオリゴヌクレオチドの存在下で検出構造を形成する。いくつかの実施形態では、第一の未標識オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドとｍｉＲＮＡ標的間で約６〜７塩基対の二重鎖が形成されるように核酸配列を含む。本発明は、非常に少数のコピー数で存在するｍｉＲＮＡを検出することができる。例えば、いくつかの実施形態では、試料中の２００未満コピーのｍｉＲＮＡを検出する。いくつかの実施形態では、試料中の１００未満コピーのｍｉＲＮＡを検出する。いくつかの実施形態では、第二の未標識オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドとｍｉＲＮＡ標的間で約９塩基対の二重鎖が形成されるように核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと、ｍｉＲＮＡ標的もしくは増幅したコピーのｍｉＲＮＡ標的との間に、約８〜１０塩基対の二重鎖が形成されるように核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第一の未標識オリゴヌクレオチドプローブの第二領域は、第一部分と第二部分を含み、第一部分と第二部分は、互いにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、第一部分と第二部分が互いにハイブリダイズすると、第一の未標識オリゴヌクレオチドプローブ中にヘアピン構造が形成される。いくつかの実施形態では、第二の未標識オリゴヌクレオチドプローブの第二領域は、第一部分と第二部分を含み、第一部分と第二部分は、互いにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、第一部分と第二部分が互いにハイブリダイズすると、第二の未標識オリゴヌクレオチドプローブ中にヘアピン構造が形成される。ある実施形態では、本方法は、（ｖｉｉ）第一の未標識オリゴヌクレオチドプローブ領域に相補的なオリゴヌクレオチドを提供するステップをさらに含む。ある実施形態では、本方法は、（ｖｉｉ）第二の未標識オリゴヌクレオチドプローブ領域に相補的なオリゴヌクレオチドを提供するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、約５０℃の温度で侵入的切断構造を切断することによって、標的配列を高忠実度で判別できるようになるが、最適な性能を得るためには、配列、緩衝成分などに基づき、他の温度を選択することもできる。いくつかの実施形態では、標的配列は単一種の変異体ｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの濃度が上昇すると、ｍｉＲＮＡ標的を検出する感度が増大する。いくつかの実施形態では、２個またはそれ以上のｍｉＲＮＡを検出する。いくつかの実施形態では、検出は標識したプローブの使用を含む。いくつかの実施形態では、標識したプローブは蛍光標識されている。いくつかの実施形態では、標識したプローブは、FRET検出用に構成されている。いくつかの実施形態では、標識したプローブは、二重鎖でハイブリダイズされなかったとき第一の立体配座を有し、二重鎖でハイブリダイズされたとき第二立体配座を有する。いくつかの実施形態では、標識したプローブは、二重鎖でハイブリダイズされたとき蛍光が増大する。本発明は、検出するｍｉＲＮＡによって限定されない。実際、本発明の組成物および方法を使用し、それだけには限らないが、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ１２５ｂ、ｍｉＲ−１ｄ、およびｍｉＲ１２４ａを含む、様々なｍｉＲＮＡを検出することができる。

【0022】

本発明は、ｍｉＲＮＡ標的に相補的な第一領域およびｍｉＲＮＡ標的に相補的でない第二領域とを含む第一の未標識オリゴヌクレオチドの一個もしくは複数と、ｍｉＲＮＡ標的の第二領域に相補的な第一領域およびｍｉＲＮＡ標的の第二領域に相補的でない第二領域を含む第二の未標識オリゴヌクレオチドと、逆転写酵素と、ＤＮＡポリメラーゼと、プローブオリゴヌクレオチドと、検出構造を切断できる酵素とを含むキットも提供する。いくつかの実施形態では、検出構造は、侵入的切断構造を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ｍｉＲＮＡ標的と、少なくとも一個の他のＲＮＡ標的とを検出するように構成されている。いくつかの実施形態では、キットは、細胞ライセート中のｍｉＲＮＡ標的配列を検出するように構成されている。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、１回の反応で、（例えば、単一のヌクレオチドによって異なる）２個の異なる対立遺伝子を検出する、INVADERオリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド、およびFRETカセットの図式である。

【図2】図２は、本発明のいくつかの実施形態で使用する例示的な検出構造を示す図である。

【図3】図３は、本発明のいくつかの実施形態で使用する第二の例示的な検出構造を示す図である。

【図4】図４は、本発明のいくつかの実施形態で使用する第三の例示的な検出構造を示す図である。

【図5A】図５Ａは、本発明で使用する例示的なオリゴヌクレオチドを示す図である。標的ｍｉＲＮＡの塩基を小文字で書き下線を付ける。プローブまたはINVADERオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ残基は大文字で示す。小文字種は、２’−Ｏ−メチル残基を示す。

【図5B】図５Ｂは、本発明で使用する例示的なオリゴヌクレオチドを示す図である(図５Ａの続き)。標的ｍｉＲＮＡの塩基を小文字で書き下線を付ける。プローブまたはINVADERオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ残基は大文字で示す。小文字種は、２’−Ｏ−メチル残基を示す。

【図5C】図５Ｃは、本発明で使用する例示的なオリゴヌクレオチドを示す図である(図５Ｂの続き)。標的ｍｉＲＮＡの塩基を小文字で書き下線を付ける。プローブまたはINVADERオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ残基は大文字で示す。小文字種は、２’−Ｏ−メチル残基を示す。

【図6】図６は、ｌｅｔ−７についての温度最適化実験の結果を示す図である。

【図7】図７は、ｌｅｔ−７についての温度最適化実験の結果を示す図である。

【図8】図８は、ｌｅｔ−７についての検出限界（ＬＯＤ）実験の結果を示す図である。

【図9】図９は、ｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡを使用する交差反応性実験の結果を示す図である。

【図10】図１０は、ｍｉＲ−１についてのＬＯＤ実験の結果を示す図である。

【図11】図１１は、ｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡを使用し、CLEAVASE酵素ＩＸとＸＩＩを比較した結果を示す図である。

【図12】図１２は、様々な生物に由来するＵ６ ＲＮＡ配列の部分的な配列アラインメントを示す図である。

【図13】図１３は、ｍｉｒ−１３５についての温度最適化実験の結果を示す図である。

【図14】図１４は、ｍｉｒ−１３５についてのＬＯＤ実験の結果を示す図である。

【図15】図１５は、細胞ライセート中のｌｅｔ−７の検出で得られた平均カウント数のグラフを含む図である。

【図16】図１６は、RNAse A処理の有無による、細胞ライセート中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの結果を示す図である。

【図17】図１７は、全長ARRESTORオリゴヌクレオチドを含む効果 対 短縮ARRESTORオリゴヌクレオチドを含む効果を比較する侵入的切断アッセイの結果を示す図である。

【図18】図１８は、図１６に記載のアッセイの設計を使用する温度最適化実験の結果を示す図である。

【図19】図１９は、１０−ｍｅｒプローブおよび１２−ｍｅｒ INVADERオリゴヌクレオチドの設計を使用する、温度最適化実験の結果を示す図である。

【図20】図２０は、２個の代替オリゴヌクレオチドの設計のＬＯＤを比較する実験の結果を示す図である。

【図21】図２１は、プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチド中の２’−Ｏ−メチル残基の一部もしくは全てに、２’−デオキシ残基を置換した効果を比較した結果を示す図である。

【図22】図２２は、ｍｉＲ−１２４ａを検出する侵入的切断アッセイの結果を示す図である。

【図23】図２３は、２０個の異なる組織種から単離した全ＲＮＡ中から、異なる５個のｍｉＲＮＡ種を検出する実験の結果を示す図である。

【図24】図２４は、プローブおよびオリゴヌクレオチド長を変化させることによるｍｉＲＮＡ検出に与える影響を試験する実験の結果を示す図である。

【図25】図２５は、ｓｉＲＮＡを検出するための例示的な侵入的切断オリゴヌクレオチドの設計を示す図である。小文字の残基は２’−Ｏ−メチルをさす。

【図26】図２６は、同じｌｅｔ−７ａハイブリダイズ領域と、異なる５’−フラップ「アーム」配列とを有する２個のプローブを示す図である。

【図27】図２７は、１５４４−８２−０１プローブと２３４３−２５−０１プローブを、それぞれ、１μＭと１０ｎＭ（ミックスｖｉｉ）および１μＭと４ｎＭ（ミックスｉｘ）で混合した、コピー数対正味シグナルを描くチャートである。

【図28】図２８は、同じＵ６ ＲＮＡハイブリダイズ領域と、異なる５’−フラップ「アーム」配列を有する２個のオリゴヌクレオチドプローブを示す図である。

【図29】図２９は、１７９６−５３−０１プローブと２３４３−３０−０１プローブを１μＭと４ｎＭミックスでそれぞれ混合した、コピー数対正味シグナルのプロットを描くチャートである。

【図30】図３０は、二重（biplex）のＵ６とＬｅｔ−７を検出するためのコピー数対正味シグナルのプロットを描くチャートである。

【図31A】図３１Ａは、癌に伴うｍｉＲＮＡを検出し特徴付ける本発明を開発中に生じた様々なオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図31B】図３１Ｂは、癌に伴うｍｉＲＮＡを検出し特徴付ける本発明を開発中に生じた様々なオリゴヌクレオチドを示す図である(図３１Ａの続き)。

【図32】図３２は、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応を含むアッセイを使用する、ｍｉＲＮＡを検出するための一般的設計を示す図である。

【図33】図３３は、一反応ごとのＬｅｔ−７ａの正味シグナル対コピー数を示す図である。

【図34】図３４は、温度の関数として正味シグナルを示す図である。

【図35】図３５は、ｌｅｔ−７ａコピー数の関数としてプロットした、ｌｅｔ−７反応の未処理シグナルを示す図である。

【図36】図３６は、ｌｅｔ−７ａ ＲＮＡコピー数の関数としてプロットした、ｌｅｔ−７ａのスタッカーおよびヘアピンアッセイの未処理シグナルを示す図である。

【図37】図３７は、ｌｅｔ−７ａコピー数の関数として、一段階および二段階のｌｅｔ−７ａアッセイによって生じた正味シグナルを示す図である。

【図38】図３８は、ｌｅｔ−７ａコピー数の関数として、１７１６−９４−１、１７１７−９４−１０、または１７１６−９４−１１プローブによるｌｅｔ−７ａアッセイによって生じた正味シグナルを示す図である。

【図39】図３９は、ｌｅｔ−７ａコピー数の関数として、異なる割合での１７１６−９４−１および１７１７−９４−１１プローブによるｌｅｔ−７ａアッセイによって生じた正味シグナルを示す図である。

【図40】図４０は、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、またはｌｅｔ−７ｆコピー数の関数として、ｌｅｔ−７ａアッセイによって生じた正味シグナルを示す図である。

【図41A】図４１Ａは、実施例１９（Ｍ）に収載したガイドラインに従って設計した癌に伴うｍｉＲＮＡの検出で生じたオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図41B】図４１Ｂは、実施例１９（Ｍ）に収載したガイドラインに従って設計した癌に伴うｍｉＲＮＡの検出で生じたオリゴヌクレオチドを示す図である（図４１Ａの続き）。

【図42A】図４２Ａは、様々な長さの一次プローブとＰＣＲプライマーのハイブリダイズ領域を有する、ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−１６の別の設計を示す図である。

【図42B】図４２Ｂは、様々な長さの一次プローブとＰＣＲプライマーのハイブリダイズ領域を有する、ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−１６の別の設計を示す図である。(図４２Ａの続き)

【図43】図４３は、実施例１９で使用した全オリゴヌクレオチド、それぞれ、配列番号１４４〜２８５を収載する表である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

定義
本発明を分りやすくするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。

【0025】

本明細書で使用するように、「ｍｉＲＮＡ」という用語はマイクロＲＮＡをさす。本明細書で使用するように、「ｍｉＲＮＡ標的配列」という用語は、（例えば他の核酸の存在下で）検出するｍｉＲＮＡをさす。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列はｍｉＲＮＡ変異体である。

【0026】

本明細書で使用するように、「ＲＮＡ検出構造」および「検出構造」という用語は、核酸（例えばオリゴヌクレオチド）をＲＮＡ標的、例えばｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡとハイブリダイズすることによって形成される構造をさす。いくつかの実施形態では、核酸は単一核酸［例えば、ｍｉＲＮＡと相同する小領域を有するより大型の核酸］である。他の実施形態では、核酸は、［例えば、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズしてヘアピン（例えば、一重もしくは二重ヘアピン）構造を形成する］２個の核酸を含む。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ検出構造は、それだけには限らないが、本明細書に開示した方法を含む公知の核酸検出方法を使用し検出することができる。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ検出構造は、ハイブリダイゼーションステップ後にさらに改変する。例えば、いくつかの実施形態では、検出構造の一種もしくは複数の成分は、核酸ポリメラーゼによって伸長するための鋳型を提供する。他の実施形態では、検出構造の一種もしくは複数の成分をリガーゼと接触させ、別の核酸にライゲートする。

【0028】

「ｓｉＲＮＡ」という用語は短鎖干渉ＲＮＡをさす。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域の各鎖が約１８〜２５ヌクレオチド長である二重鎖、すなわち二本鎖領域を含み、その際、アンチセンス鎖によって長さを決定した場合、二本鎖領域は短くても１６塩基対長、長くても２９塩基対長でありうる。ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端に約２〜４個の不対ヌクレオチドを有することが多い。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物および脊椎動物ではＲＮＡ干渉を誘発し、植物では転写後遺伝子サイレンシング中に配列特異的ＲＮＡ分解を誘発する主要な中間物として機能すると思われる。ｓｉＲＮＡの二重鎖もしくは二本鎖領域の少なくとも一鎖は、標的ＲＮＡ分子と実質的に相同し、もしくは実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的である鎖が「アンチセンス」鎖であり、標的ＲＮＡ分子と相同する鎖が「センス」鎖であり、さらにｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に相補的である。二本鎖領域の一鎖は、反対鎖と同一長でなくてもよく、すなわち一鎖は、反対相補鎖よりもヌクレオチドが少なくとも一個少なくてよく、結果として反対鎖中に「バブル」、すなわち少なくとも一個の非対応塩基がもたらされる。二本鎖領域の一鎖は、反対鎖に厳密に相補的でなくてもよく、すなわち、その鎖、好ましくはセンス鎖は、少なくとも一個のミスマッチ塩基対を有してもよい。

【0029】

ｓｉＲＮＡは、追加の配列を含んでもよく、そのような配列の限定しない例には、二重鎖領域の二本鎖を結合するリンキング配列、すなわちループが含まれる。このｓｉＲＮＡ形を「ｓｉ様ＲＮＡ」「短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡ」（短鎖はｓｉＲＮＡの二重鎖領域をさす）、または「ヘアピンｓｉＲＮＡ」をさす。ｓｉＲＮＡ中に存在する別の配列の別の限定しない例には、ステム構造および他のフォールド構造が含まれる。別の配列は、公知の機能を有しても、有していなくてもよく、そのような機能の限定しない例には、ｓｉＲＮＡ分子の安定性増加、または細胞目的シグナルの提供が含まれる。

【0030】

本明細書で使用するように、「対象」および「患者」という用語は、植物、微生物、および動物（例えば、イヌ、ネコ、家畜、およびヒトなど、哺乳動物）含む任意の生物をさす。

【0031】

本明細書で使用するように、「INVADERアッセイ試薬」または「侵入的切断アッセイ試薬」という用語は、標的配列の存在下で侵入的切断構造を形成できるオリゴヌクレオチドを含む、標的配列を検出する一種もしくは複数の試薬をさす。いくつかの実施形態では、INVADERアッセイ試薬は、侵入的切断構造の存在を検出する薬剤（例えば切断剤）をさらに含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第一と第二オリゴヌクレオチドを含み、前記第一オリゴヌクレオチドは標的核酸の第一領域に相補的な５’部分を含み、前記第二オリゴヌクレオチドは３’部分と５’部分を含み、前記５’部分は、第一部分の下流にあって第一部分と近接している標的核酸の第二領域に相補的である。いくつかの実施形態では、第二オリゴヌクレオチドの３’部分は、標的核酸に相補的でない３’末端ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、第二オリゴヌクレオチドの３’部分は、標的核酸に相補的でない単一のヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、第一と第二オリゴヌクレオチドは、（例えばリンカーを通じて）互いに共有結合している。

【0032】

いくつかの実施形態では、INVADERアッセイ試薬は固相支持体をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、アッセイ試薬の一個もしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、橋掛けされていようが、いまいが、第一および／または第二オリゴヌクレオチド）を固相支持体に取り付ける。いくつかの実施形態では、INVADERアッセイ試薬は緩衝液をさらに含む。いくつかの好ましい実施形態では、緩衝液は二価のカチオン源を含む（例えば、Ｍｎ^２＋および／またはＭｇ^２＋イオン）。INVADERアッセイ試薬を集合的に構成する個々の成分（例えば、オリゴヌクレオチド、酵素、緩衝液、標的核酸）を、「INVADERアッセイ試薬成分」と呼ぶ。

【0033】

いくつかの実施形態では、INVADERアッセイ試薬は、第一の標的核酸の第一部分の上流にある標的核酸の第三部分に相補的な第三のオリゴヌクレオチドをさらに含む。さらに別の実施形態では、INVADERアッセイ試薬は標的核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、INVADERアッセイ試薬は第二標的核酸をさらに含む。さらに別の実施形態では、INVADERアッセイ試薬は、第二標的核酸の第一領域に相補的な５’部分を含む、第三のオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの具体的な実施形態では、第三のオリゴヌクレオチドの３’部分は第二標的核酸に共有結合している。他の具体的な実施形態では、第二標的核酸は５’部分をさらに含み、その際、第二標的核酸の５’部分は第三のオリゴヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、INVADERアッセイ試薬は、ARRESTOR分子（例えばARRESTORオリゴヌクレオチド）をさらに含む。

【0034】

各プローブの標的特異的領域に完全に、およびその５’−フラップ領域に部分的に塩基対が形成された２’Ｏ−メチル化ARRESTORオリゴヌクレオチドを封入すると、二次反応で非切断プローブは隔離され、Ｘ構造の形成は防止される（Eisら, Nature Biotechnology, 19:673-676 （2001）；当該文献は、あらゆる目的のために、その全体を参照により本明細書に組み込む）。

【0035】

いくつかの好ましい実施形態では、INVADERアッセイ試薬は核酸切断生成物を検出する試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、INVADERアッセイ試薬中の一個もしくは複数のオリゴヌクレオチドは標識を含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記第一オリゴヌクレオチドは標識を含む。他の好ましい実施形態では、前記第三のオリゴヌクレオチドは標識を含む。特に好ましい実施形態では、試薬は、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）効果を発生させる部分で標識した、第一および／または第三のオリゴヌクレオチドを含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、（すなわち、再測定または再調合がない手順ステップで使用するために予め測定した）予め調合する型式で、一個もしくは複数のINVADERアッセイ試薬を提供してよい。いくつかの実施形態では、選択したINVADERアッセイ試薬成分を混合し、一緒に予め調合する。好ましい実施形態では、予め調合したアッセイ試薬成分を、予め調合し、（反応チューブ、または例えばマイクロタイタープレート中のウェル含むが、それだけには限らない）反応槽で提供する。特に好ましい実施形態では、予め調合したINVADERアッセイ試薬成分を反応槽で乾燥させる（例えば、乾燥保存しまたは凍結乾燥する）。

【0037】

いくつかの実施形態では、INVADERアッセイ試薬をキットとして提供する。本明細書で使用するように、「キット」という用語は物質を配達するための任意の配達系をさす。反応アッセイと関連して、そのような配達系は、ある場所から別の場所へ、反応試薬の保存、輸送、または配達を可能にするシステム（例えば、好適な容器に入れたオリゴヌクレオチド、酵素など）および／または支持物質（例えば、緩衝液、アッセイを実施するために記載された使用説明書など）を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持物質を入れる、一個もしくは複数の入れ物（例えば箱）を含む。本明細書で使用するように、「細分化キット」という用語は、それぞれ、全キット成分のサブポーションを入れた、２個またはそれ以上の分離した容器を含む配達系をさす。容器は、意図したレシピエントに一緒にまたは別々に配達しうる。例えば、第一容器には、アッセイで使用する酵素を入れ、第二容器にはオリゴヌクレオチドを入れる。「細分化キット」という用語は、連邦食品医薬品化粧品法第５２０（ｅ）節に定められている検体特異的試薬（ＡＳＲ：Analyte specific reagents）を含むキットを包含するものとするが、それだけには限らない。実際、「細分化キット」という用語には、それぞれが、全キット成分のサブポーションを入れた、２個またはそれ以上の分離した容器を含む任意の配達系が含まれる。それに反して、「混合キット」は、１個の容器に反応アッセイの成分の全てを入れた（例えば、所望成分のそれぞれを単一ボックスに収容した）配達系さす。「キット」という用語には、細分化キットおよび混合キットが含まれる。

【0038】

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明を実施するのに必要な成分の一個もしくは複数を入れたINVADERアッセイ試薬キットを提供する。例えば、本発明は、INVADERアッセイの実施に必要な酵素および／または反応成分を貯蔵しまたは配達するキットを提供する。キットには、アッセイに必要なもしくは所望されるあらゆる成分、それだけには限らないが、試薬自体、緩衝液、対照試薬（例えば、組織試料、正および負の対照標的オリゴヌクレオチドなど）、固相支持体、標識、記載および／または図解使用説明書、および製品情報、阻害薬、標識および／または検出試薬、パッケージ環境対照（例えば氷、乾燥剤など）などを含む成分を入れて良い。いくつかの実施形態では、キットは、使用者が残りの成分を供給すると予想される、必要成分のサブセットを提供する。いくつかの実施形態では、キットには、それぞれ容器が配達すべき成分のサブセットを収容する、２個またはそれ以上の分離した容器が含まれる。例えば、第一の容器（例えばボックス）には、酵素（例えば、適切な保存緩衝液中の構造特異的切断酵素、および容器）を入れ、第二ボックスには、オリゴヌクレオチド（例えば、INVADERオリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド、対照標的オリゴヌクレオチドなど）を入れてよい。

【0039】

本明細書で使用する「標識」という用語は、検出可能（好ましくは定量化可能）効果を得るために使用でき、核酸もしくはタンパク質に取り付けることができる、任意の原子または分子をさす。標識には、それだけには限らないが、色素；^３２Ｐなどの放射標識；ビオチンなどの結合部分；ディグオキシジェニンなどのハプテン；発光発生的（luminogenic）、リン光、もしくは蛍光発生的部分；質量タグ；および蛍光色素単独、あるいは蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）により、発光スペクトルを抑制し、またはシフトさせることができる部分と組み合わせた蛍光色素が含まれる。標識によって、蛍光、放射能、比色分析、重量測定、Ｘ線回析もしくは吸収、磁性、酵素活性、質量特性または質量により左右される挙動特性（例えば、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析、蛍光偏光）などによって検出可能なシグナルが得られる。標識は、荷電部分（正もしくは負の電荷）であってよく、または別法として中性電荷であってよい。標識は、標識を含む配列が検出可能であれば、核酸もしくはタンパク質配列を含み、またはそれらからなっていてもよい。

【0040】

本明細書で使用するように、シグナルに関して「別個（distinct）」という用語は、例えば、スペクトル特性、例えば、蛍光発光波長、色彩、吸光度、質量、サイズ、蛍光偏光特性、電荷などによって、または別の部分と、例えば化学試薬、酵素、抗体などと相互作用する能力によって、ある物と別の物を区別することができるシグナルをさす。

【0041】

本明細書で使用するように、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成規則により関連し合うポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチド配列）に関して使用される。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は「部分的」であってよく、その際、核酸塩基の一部のみが、塩基対形成規則に従って適合する。または、核酸間に「完全」または「全」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しく影響する。これは、増幅反応、および核酸間の結合によって決まる検出方法では特に重要性である。どちらの用語も、個々のヌクレオチドに関して使用してよく、特にポリヌクレオチドに関連して使用してよい。例えば、オリゴヌクレオチド中の特定のヌクレオチドは、別の核酸鎖中のヌクレオチドに対するその相補性、またはその相補性が欠けていることによって注目されようが、それはそのオリゴヌクレオチドの残りの部分とその核酸鎖との間の相補性に反して、またはその相補性と比較してのものである。

【0042】

「相同性」および「相同」という用語は、同一性の程度をさす。部分的相同性と完全相同性がありうる。部分的相同配列は、別の配列との同一性が１００％未満というものである。

【0043】

本明細書で使用するように、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸対に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち核酸間の会合強度）は、核酸間の相補程度、関与する条件のストリンジェンシー、および形成されたハイブリッドのＴ_ｍなどの要因の影響を受ける。「ハイブリダイゼーション」方法には、ある核酸と、別の相補的核酸、すなわち相補的ヌクレオチド配列を含む核酸とのアニーリングが含まれる。互いに相手を見つけ、かつ塩基対形成相互作用を通じてアニールする、相補的配列を含む２個の核酸ポリマーの能力は、十分に認識されている現象である。Marmur and Lane, Proc． Natl． Acad． Sci． USA 46:453 (1960)およびDotyら, Proc． Natl． Acad． Sci． USA 46:461 (1960)による「ハイブリダイゼーション」過程の初期観察後、この過程は洗練されて現代生物学の不可欠なツールになった。

【0044】

本明細書で使用する核酸配列の相補鎖（complement）は、ある配列の５’末端が別の配列の３’末端と対を形成するように核酸配列が整列しているとき、「逆平行関係」にあるオリゴヌクレオチドをさす。天然核酸には一般に見られないある種の塩基を本発明の核酸に含めてよく、例えば、イノシンおよび７−デアザグアニンが含まれる。相補性は完全でなくてもよく、安定した二重鎖は、ミスマッチ塩基対または非対応塩基を含みうる。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチド長、オリゴヌクレオチドの塩基組成と配列、イオン強度、およびミスマッチ塩基対の発生率を含む、いくつかの変数を経験的に考慮して、二重鎖の安定性を決定することができる。

【0045】

本明細書で使用するように、「Ｔ_ｍ」という用語は「融解温度」に関して使用される。融解温度は、二本鎖核酸分子集団が半解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴ_ｍを算出するいくつかの方程式は、当技術分野で周知されている。標準的参照文献によって示されるように、核酸を水溶液に１Ｍ ＮａＣｌで入れた場合のＴ_ｍ値の単純な推定は、次方程式によって計算しうる。Ｔ_ｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）［例えばAnderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)を参照］。別の参照文献［例えば、Allawi and SantaLucia, Biochemistry 36: 10581-94 (1997)］には、Ｔ_ｍの計算に、構造的、環境的、および配列特性を考慮するより高性能な計算が含まれる。

【0046】

「遺伝子」という用語は、非コーディング機能を有するＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡもしくは転移ＲＮＡ）、ポリペプチド、または前駆体の生成に必要な、対照配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列をさす。所望の活性または機能が保持されている限り、ＲＮＡまたはポリペプチドは、全長コード配列またはコード配列の任意の部分によってコードされていてよい。

【0047】

「野生型」という用語は、天然源から単離したとき、その遺伝子もしくは遺伝子産物の特性を有する、遺伝子もしくは遺伝子産物をさす。野生型遺伝子は、集団で最も頻繁に観察され、従って遺伝子の「正常」型または「野生」型と任意に指定されるものである。それに反して、野生型遺伝子もしくは遺伝子産物と比較した場合、「改変体」、「突然変異体」、または「多形」という用語は、配列および／または機能特性に改変（すなわち変化した特性）が見られる遺伝子もしくは遺伝子産物をさす。自然発生の変異体は、単離できることに留意されたい。自然発生の突然変異体は、野生型遺伝子もしくは遺伝子産物と比較した場合、変化した特性をそれらが有することによって同定される。

【0048】

本明細書で使用する「組換えＤＮＡベクター」という用語は、所望の異種配列を含むＤＮＡ配列をさす。例えば、その用語は、発現した配列または発現産生物をコードする配列の使用に限定されないが、いくつかの実施形態では、異種配列は、コード配列、および宿主生物でコード配列を複製するのに、もしくは特定の宿主生物で作動可能に連結したコード配列を発現させるのに必要な好適ＤＮＡ配列である。原核生物での発現に必要なＤＮＡ配列には、プロモーター、任意によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、およびおそらく他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化（polyadenlyation）シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。

【0049】

本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、好ましくは少なくとも５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１５〜３０個のヌクレオチドを含む分子として定義される。正確なサイズは、多くの要因に依存し、次いで、それは、オリゴヌクレオチドの究極の機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、またはそれらの組合せを含む、いかなる方式によっても生成しうる。

【0050】

モノヌクレオチド同士は、反応して、１個のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、リン酸ジエステル結合を通じて、一方向のその隣接配列の３’酸素に付着するような方法で、オリゴヌクレオチドを作製するので、オリゴヌクレオチド端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合は「５’末端」と称し、その３’酸素が続くモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合していない場合は「３’末端」と称する。本明細書で使用するように、たとえ大型オリゴヌクレオチドの内部にあっても、核酸配列は５’および３’末端を有すると言ってよい。核酸鎖に沿って５’から３’方向へ移動したとき、第一領域の３’末端が第二領域の５’末端の前にある場合、核酸鎖に沿う第一領域は、別の領域の上流にあると言う。

【0051】

異なる２個の非重複オリゴヌクレオチドが、同じ直鎖相補的核酸配列の異なる領域にアニールし、一オリゴヌクレオチドの３’末端が、別のオリゴヌクレオチドの５’末端を目指している場合、前者は「上流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ、後者は「下流」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。同様に、その５’末端が第二オリゴヌクレオチドの５’末端の上流にあり、第一オリゴヌクレオチドの３’末端が第二オリゴヌクレオチドの３’末端の上流にあるように、第一オリゴヌクレオチドが位置して、２個の重複オリゴヌクレオチドが、同じ直鎖相補的核酸配列とハイブリダイズするとき、第一オリゴヌクレオチドを「上流」オリゴヌクレオチドと呼び、第二オリゴヌクレオチドを「下流」オリゴヌクレオチドと呼んでよい。

【0052】

「プライマー」という用語は、プライマー伸長が開始する条件下に置いたとき、合成開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドをさす。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、精製制限消化で自然に生成させることも、または合成により生成することもできる。

【0053】

プライマーは、鋳型の特異的配列鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。プライマーは、プライマーの伸張が起きるためには、鋳型鎖とハイブリダイズするのに十分な相補性がなければならない。プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映しなくてもよい。例えば、プライマー配列の残り部分がその鎖に実質的に相補的である、プライマーの５’末端に非相補的ヌクレオチドフラグメントを取り付けてよい。プライマー配列が、ハイブリダイズする鋳型配列に十分な相補性を有し、それによってプライマー伸長生成物合成用の鋳型プライマー複合体が形成されるのであれば、プライマー中に非相補的塩基または長い配列を散在させることもできる。

【0054】

本明細書で使用する「切断構造」という用語は、少なくとも一個のプローブオリゴヌクレオチドと標的核酸との相互作用によって形成され、二重鎖を含む構造を形成し、それだけには限らないが、酵素を含む切断手段によって得られた構造を切断できる構造をさす。切断構造は、切断手段によって特異的に切断するための基質であり、二次構造に考慮することなく（すなわち、二重鎖構造を形成しないことは必要ではない）、核酸分子を切断するホスホジエステラーゼなどの薬剤によって、非特異的に切断するための基質である核酸分子とは対照的である。

【0055】

本明細書で使用する「切断手段」または「切断剤」という用語は、切断構造を切断することが可能な任意の手段をさし、それだけには限らないが酵素が含まれる。「構造特異的ヌクレアーゼ」または「構造特異的酵素」は、核酸分子の特異的二次構造を認識し、これらの構造を切断する酵素である。本発明の切断手段は、切断構造の形成に応答して核酸分子を切断し、切断手段が、切断構造中の任意の特定の位置で切断構造を切断しなくてもよい。

【0056】

切断手段は、CLEAVASE酵素（Third Wave Technologies, Madison, WI）、（ＲＡＤ２およびＸＰＧタンパク質、ならびに古細菌に由来するＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ含む）ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ、Taq ＤＮＡポリメラーゼおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを含む様々な供給源から得たヌクレアーゼ活性を含みうる。切断手段は、５’ヌクレアーゼ活性（例えば、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ）を有する酵素を含みうる。切断手段には、５’ヌクレアーゼ活性は有するが、合成活性は持たない改変ＤＮＡポリメラーゼを含めてもよい。本方法および本発明のキットで使用するのに適切な切断手段の例は、米国特許第５，６１４，４０２号、米国特許第５，７９５，７６３号、米国特許第５，８４３，６６９号、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９８／２３７７４号、ＷＯ ０２／０７０７５５Ａ２、およびＷＯ ０１９０３３７Ａ２に提供され、その各々を参照によりそれら全体を本明細書に組み込む。

【0057】

「熱安定性」という用語は、５’ヌクレアーゼなどの酵素に関して使用する場合、酵素が、高温、すなわち約５５℃以上（例えば、それだけには限らないが、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃を含む）で、機能性または活性を有する（すなわち、触媒作用を示すことができる）ことを示す。

【0058】

本明細書で使用する「切断生成物」という用語は、切断構造による切断手段の反応（すなわち、切断手段による切断構造の処理）によって生じた生成物をさす。

【0059】

「非標的切断生成物」という用語は、標的核酸に由来しない切断反応生成物をさす。先に述べたように、本発明のいくつかの方法では、切断構造の切断は、一般的にプローブオリゴヌクレオチド中で生じる。この標的核酸依存的切断によって生じたプローブオリゴヌクレオチドフラグメントは、「非標的切断生成物」である。

【0060】

「プローブオリゴヌクレオチド」という用語は、INVADERアッセイ反応と関連しては、INVADERオリゴヌクレオチドの存在もしくは非存在下で、標的核酸と相互作用して、切断構造を形成するオリゴヌクレオチドをさす。標的核酸にアニールすると、プローブオリゴヌクレオチドと標的は、切断構造を形成し、そのプローブオリゴヌクレオチド中で切断が行なわれる。

【0061】

「INVADERオリゴヌクレオチド」という用語は、プローブと標的核酸間のハイブリダイゼーション領域近傍位置で、標的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをさし、その場合、INVADERオリゴヌクレオチドは、プローブと標的間のハイブリダイゼーション領域と重複する部分（化学的部分、またはその標的に相補的であろうと、なかろうとヌクレオチドなど）を含む。いくつかの実施形態では、INVADERオリゴヌクレオチドは、その３’末端に、プローブオリゴヌクレオチドの５’末端にある配列と事実上同じ配列を含む。

【0062】

「ARRESTOR分子」という用語は、一種もしくは複数の反応成分が、その後の作用もしくは反応に参加しないようにするために、侵入的切断反応に加えられ、または含める薬剤をさす。これは、いくつかの反応成分を隔離または不活性化することによって（例えば、核酸成分を結合し、もしくは塩基対形成すること、またはタンパク質成分に結合することによって）行いうる。「ARRESTORオリゴヌクレオチド」という用語は、任意の反応（例えば、第一の反応および／または任意のそれに続く反応もしくは作用。ARRESTORオリゴヌクレオチドは、任意の特定の反応もしくは反応ステップに限定されないものとする）の一つまたは複数の態様を停止しまたは抑止するために、侵入的切断反応に含まれるオリゴヌクレオチドをさす。これは、いくつかの反応成分を隔離すること（例えば、別の核酸との塩基対形成、またはタンパク質成分と結合）によって行いうる。しかし、単に反応成分を隔離するという状況などに限定されないものとする。

【0063】

本明細書で使用する「カセット」という用語は、INVADERアッセイでプローブオリゴヌクレオチドの切断に応答して、検出可能なシグナルを発生するように構成した、オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの組合せをさす。好ましい実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの切断から得られた非標的切断生成物とカセットをハイブリダイズして、次いでそのカセットが切断されるように、第二の侵入的切断構造を形成する。

【0064】

本発明のいくつかの好ましい実施形態で、二次切断反応にはFRETカセットの使用が含まれる。そのような分子によって、二次標的（Secondary Reaction TargetすなわちＳＲＴ）とFRET標識した切断可能配列が両方とも得られ、（すなわち、反応後の生成物の分離または他の操作なしに）逐次侵入的切断反応の均質な検出が可能になる。他の好ましい実施形態では、FRETプローブと合成標的が、別々のオリゴヌクレオチドとして得られる二次反応系で使用される。一次反応から切断された５’−フラップは、二次反応で侵入型オリゴヌクレオチドとして働き、その際フラップは好適な二次反応標的（ＳＲＴ）に結合する。

【0065】

いくつかの実施形態では、カセットは、ヘアピン部分（すなわち、カセットオリゴヌクレオチドの一部が、反応条件下で、同じオリゴヌクレオチドの第二部分にハイブリダイズして二重鎖を形成する領域）を含む単一オリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、カセットは、反応条件下で二重鎖を形成できる相補部分を含む、少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、カセットは標識を含む。特に好ましい実施形態では、カセットは、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）効果を生み出す標識部分を含む。

【0066】

「実質的に一本鎖」という用語は、核酸基質に関して使用する場合、鎖間塩基対形成相互作用によって一緒に保持される核酸の二本鎖として存在する二本鎖基質とは対照的に、基質分子が主として核酸の一本鎖として存在することを意味する。

【0067】

本明細書で使用する「非増幅オリゴヌクレオチド検出アッセイ」という語句は、標的配列のコピーを作製することなく、（例えばＰＣＲによって）増幅されない特定の標的配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ＳＮＰ、反復配列など）の存在もしくは非存在を検出するように構成された検出アッセイをさす。「非増幅オリゴヌクレオチド検出アッセイ」は、例えば、標的配列がコピーされない限り、標的配列中の特定の標的配列もしくは多形の存在もしくは非存在を示すために使用されるシグナルを増幅しうる。

【0068】

本明細書で使用するように、「非増幅オリゴヌクレオチド検出アッセイ」という語句は、標的配列のコピーを作製することなく、標的配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ＳＮＰ、反復配列など）の存在もしくは非存在を検出するように構成された検出アッセイをさす。「非増幅オリゴヌクレオチド検出アッセイ」は、例えば、標的配列がコピーされない限り、標的配列中の特定の標的配列もしくは多形の存在もしくは非存在を示すために使用されるシグナルを増幅しうる。

【0069】

本明細書で使用する「配列多様性」という用語は、２個の核酸間の核酸配列の差異をさす。例えば、野生型構造遺伝子およびこの野生型構造遺伝子の突然変異体は、１個の塩基の置換および／もしくは欠失または一個もしくは複数のヌクレオチドの挿入が存在することによって、配列が変化しうる。これらの２個の構造遺伝子形態は、互いに配列が異なると言う。第二の構造遺伝子突然変異体も存在しうる。この第二突然変異体は、野生型遺伝子およびその遺伝子の第一突然変異体とも、配列が異なると言う。

【0070】

本明細書で使用する「遊離すること」という用語は、５’ヌクレアーゼなどの作用によって、オリゴヌクレオチドなどの大きい核酸フラグメントから、核酸フラグメントが遊離することをさし、放出されたフラグメントが、そのオリゴヌクレオチドの残部にそれ以上共有結合することはない。

【0071】

本明細書で使用する「Ｋ_ｍ」という用語は、酵素におけるミカエリス−メンテン定数をさし、所与の酵素が、酵素触媒反応でその最高速度の１／２を得られる特定の基質の濃度として定義される。

【0072】

本明細書で使用する「ヌクレオチド類似体」という用語は、改変ヌクレオチドもしくは自然に存在しないヌクレオチドをさし、それだけには限らないが、７−デアザプリン（すなわち、７−デアザ−ｄＡＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰ）など、変化した積層（stacking）相互作用を有する類似体、代替の水素結合構成を有する塩基類似体［例えば、S. Bennerに付与され、参照により本明細書に組み込む米国特許第６，００１，９８３号に記載されている、Ｉｓｏ−ＣやＩｓｏ−Ｇおよび他の非標準的塩基対など］、非水素結合類似体［例えば、その各々を参照により本明細書に組み込むB.A. Schweitzer and E.T. Kool, J. Org． Chem., 1994, 59, 7238-7242、B.A. Schweitzer and E.T. Kool, J. Am． Chem． Soc., 1995, 117, 1863-1872に記載されている２，４−ジフルオロトルエンなどの非極性芳香族ヌクレオシド類似体］、５−ニトロインドールおよび３−ニトロピロールなどの「ユニバーサル」塩基、ならびにユニバーサルプリンおよびピリミジン［「Ｋ」および「Ｐ」ヌクレオチドなど、それぞれ、P. Kong,ら, Nucleic Acids Res., 1989, 17, 10373-10383、P. Kongら, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5149-5152］が含まれる。ヌクレオチド類似体には、糖部分が修飾されているヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド類似体には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの改変形態が含まれる。

【0073】

「多形遺伝子座」という用語は、集団メンバー間に変動がある集団中に存在する遺伝子座である（例えば、最も一般的な対立遺伝子の頻度は０．９５未満である）。それに反して、「単形遺伝子座」は、集団メンバー間に変動がほとんど、またはまったく見られない遺伝子遺伝子座である（一般的に、集団の遺伝子プール中、最も一般的な対立遺伝子の頻度が０．９５を超える遺伝子座をさす）。

【0074】

本明細書で使用する「微生物」という用語は、余りに小さくて肉眼で観察できない生物を意味し、それらだけには限らないが、細菌、ウイルス、原生動物、真菌、および繊毛虫類が含まれる。

【0075】

「微生物性遺伝子配列」という用語は、微生物に由来する遺伝子配列をさす。

【0076】

「細菌」という用語は、真正細菌種および古細菌種を含む任意の菌種をさす。

【0077】

「ウイルス」という用語は、自律増殖能がない偏性寄生虫、極微寄生虫、細胞内寄生虫をさす（すなわち、複製するためには、宿主細胞の機構を使用しなければならない）。

【0078】

本明細書および特許請求の範囲内で「試料」という用語は、その最も広範な意味で使用される。一方で、試料は、標本または培養物（例えば、微生物学的培養物）を含むものとする。他方で、試料は、生物学的および環境的試料を含むものとする。試料は、合成起源の標本を含みうる。

【0079】

生物試料は、ヒト、液体、固体（例えば糞便）または組織、さらに液体および固体の食物および餌製品、および成分、例えば、乳製品目、野菜、食肉と食肉副産物、および廃棄物を含め、動物性であってよい。生物試料は、それだけには限らないが、有蹄動物、クマ、魚類、ウサギ、げっ歯類などの動物を含め、様々な家畜ファミリー、および自然もしくは野生動物の全てから得られる。

【0080】

環境的試料には、地上物質、土壌、水などの環境的物質、および工業的試料、ならびに食物および乳を加工する機器、装置、設備、用具、使い捨て品および非使い捨て品から入手した試料が含まれる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を制限しないと解釈される。

【0081】

「標的核酸源」という用語は、核酸［ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）またはＤＮＡ］を含む任意の試料をさす。特に好ましい標的核酸源は、それだけには限らないが、血液、唾液、大脳髄液、胸水、乳、リンパ、痰、および精液を含む生物試料である。

【0082】

オリゴヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド（または標的核酸配列）よりも高モル濃度で存在する場合、別のオリゴヌクレオチド（または標的核酸配列）に比べて、オリゴヌクレオチドが「過剰に」存在すると言う。プローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドが、相補的である標的核酸配列濃度に比べて過剰に切断反応中に存在する場合、存在する標的核酸の量を示すために反応を使用しうる。典型的には、過剰に存在するというとき、プローブオリゴヌクレオチドは、少なくとも１００倍モル過剰に存在し、典型的には、標的核酸配列が約１０fmole以下で存在するとき、各プローブオリゴヌクレオチドは少なくとも１pmole使用されよう。

【0083】

第一および第二標的核酸「を含むことが推測される」試料は、いずれかの標的核酸分子もしくは両方の標的核酸分子を含み、またはどちらの標的核酸分子も含まない場合がある。

【0084】

「反応体」という用語は、本明細書でその最も広範な意味で使用される。反応体には、例えば、酵素的反応体、化学的反応体または光（例えば、紫外線、特に短波長紫外線は、オリゴヌクレオチド鎖を破壊することが知られている）を含めることができる。オリゴヌクレオチドと反応して、オリゴヌクレオチドを短縮（例えば切断）し、または伸長することが可能な任意の薬剤を「反応体」という用語内に包含する。

【0085】

本明細書で使用するように、「精製」という用語は、試料から混入物質を除去することをさす。例えば、いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞で組換えCLEAVASEヌクレアーゼを発現させ、宿主細胞タンパク質を除去することによってそのヌクレアーゼを精製するが、それによって試料中のこの組換えヌクレアーゼの％割合は増加する。

【0086】

本明細書で使用する「部分」という用語は、（「所与のタンパク質の一部」として）タンパク質に関する場合、そのタンパク質のフラグメントをさす。フラグメントのサイズは、４アミノ酸残基から、アミノ酸配列全体から１個のアミノ酸を引いた数（例えば４、５、６、．．．、ｎ−１）までの範囲であろう。

【0087】

本明細書で使用する「核酸配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントもしくは部分、およびゲノム起源または合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡをさし、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、センス鎖もしくはアンチセンス鎖を表してもよい。同様に、本明細書で使用する「アミノ酸配列」は、ペプチドもしくはタンパク質配列をさす。

【0088】

本明細書で使用するように、「精製」または「実質的に精製」という用語は、その自然環境から取り出し、単離もしくは分離し、自然に付随している他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは９０％を含まない核酸もしくはアミノ酸配列である分子をさす。従って「単離ポリヌクレオチド」または「単離オリゴヌクレオチド」は、実質的に精製ポリヌクレオチドである。

【0089】

本明細書で使用する「核酸連続鎖」という用語は、切れ目もしくは他の撹乱なしに、連続に共有結合する主鎖構造を有する核酸鎖を意味する。各ヌクレオチドの塩基部分の配置は、塩基対を形成し、一本鎖であり、もしくはミスマッチであろうと、連続鎖の定義の要素ではない。連続鎖の主鎖は、自然発生の未修飾核酸に見出されるリボースリン酸もしくはデオキシリボースリン酸組成に限定されない。本発明の核酸は、主鎖構造に、それだけには限らないが、ホスホロチオ酸残基、ホスホネート残基、２’置換リボース残基（例えば、２’Ｏメチルリボース）、および代替の糖（例えばアラビノース）を有する残基を含む修飾を含みうる。

【0090】

本明細書で使用する「連続的二重鎖」という用語は、二重鎖での塩基対の進行に撹乱がない二本鎖核酸領域をさす（すなわち、二重鎖に沿う塩基対が、連続的二重鎖領域の限定に伴うギャップ、バルジ、もしくはミスマッチを収容するように歪められていない）。本明細書で使用するように、この用語は、核酸鎖主鎖部分の連続性を意味することなく、二重鎖中の塩基対配列のみをさす。塩基対形成は連続的であるが、片方または両方の鎖に切れ目がある二重鎖核酸も、連続的二重鎖の定義内にある。

【0091】

「二重鎖」という用語は、一鎖のヌクレオチドの塩基部分が、第二鎖に並んでいるその相補的塩基に水素結合を通じて結合している核酸状態をさす。二重鎖形であるという状態が、核酸の塩基状態を反映する。塩基対形成により、一般的に、核酸鎖から大小の溝を有する二重螺旋の三次構造が想定される。その螺旋形の仮説は、二重鎖になるという作用において絶対的である。

【0092】

「鋳型」という用語は、相補的コピーが、鋳型依存的核酸ポリメラーゼの活性により、ヌクレオシド三リン酸から構築される核酸鎖をさす。二重鎖内では、鋳型鎖は、慣例により「底部」鎖として描かれ記載される。同様に、非鋳型鎖は、「上部」鎖として描かれ記載されることが多い。

【0093】

（発明の詳細な説明）
本発明は、核酸分子を検出し特徴付ける組成物および方法［例えば、ＲＮＡ｛例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのスモールＲＮＡ｝および他の短い核酸分子］に関する。本発明は、ｍｉＲＮＡの発現を検出し、特徴付け、そして定量する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、検出に役立てるためにｍｉＲＮＡに核酸を加えるステップを含む、ｍｉＲＮＡの発現を検出する方法を提供する。次いで、それだけには限らないが、本明細書に開示した方法を含め、任意の適切な方法を使用し、得られた「ｍｉＲＮＡ検出構造」を検出する。以下の記述は、ｍｉＲＮＡの検出および定量に焦点を当てているが、本発明が、他の短い核酸分子（例えば、例えば、５０、４０、３０、または２０ヌクレオチド長未満のＤＮＡおよびＲＮＡ）を用いても役立つことは理解されるものとする。

【0094】

ｍｉＲＮＡを一例として使用する様々な実施形態を以下に例示する。しかし、本方法が、他の小型核酸分子にも利用しうることは理解されるものとする。

【0095】

Ｉ．ｍｉＲＮＡ検出構造形成
いくつかの実施形態では、本発明は、ｍｉＲＮＡの検出に役立つｍｉＲＮＡ検出構造を生成する方法を提供する。ｍｉＲＮＡは、サイズが小さく［約２１ヌクレオチド（例えば、およそ１８〜２５ヌクレオチド）］、従って標準化されたハイブリダイゼーション法を使用して検出するのは困難である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、（例えばハイブリダイゼーション、伸長、またはライゲーションにより）ｍｉＲＮＡに核酸分子を加えて、検出構造を生成するステップを含む。次いで、任意の適切な方法を使用し、そのような検出構造を検出することができる。

【0096】

具体的一実施形態では、ｍｉＲＮＡを検出するために図２に記載した検出構造を生成する。この実施形態では、２個のオリゴヌクレオチドをｍｉＲＮＡにアニールして、二重ループすなわち「亜鈴」様構造を形成する。ｍｉＲＮＡの両端をオリゴヌクレオチドの二本鎖領域で伸長することによって、亜鈴構造から大型の二本鎖核酸領域が形成される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの各端部は、２〜５ヌクレオチド伸長される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの両端に、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズしない追加の核酸配列を含める。いくつかの実施形態では、これらの追加の配列によって、侵入的切断構造（例えば、INVADERアッセイ侵入的切断構造）が形成される。いくつかの実施形態では、侵入的切断構造をINVADERアッセイ（例えば以下の記述を参照）によって検出する。例えば、いくつかの実施形態では、実施例１８に記載したオリゴヌクレオチド（例えば図３１を参照）は、癌に伴うｍｉＲＮＡを検出する（例えば、INVADERアッセイによって検出できる侵入的切断構造を形成する）ために使用される。

【0097】

他の実施形態では、ｍｉＲＮＡを検出するために、図３に記載する検出構造を生成する。この実施形態では、一オリゴヌクレオチドをｍｉＲＮＡにアニールして、アーチ形構造を生成する。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの非存在下よりも高い効率でオリゴヌクレオチドの両端を結合する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの両端に、ｍｉＲＮＡを超えて伸長し、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズしない追加の配列を含める。いくつかの実施形態では、これらの追加の配列によって、侵入的切断構造（例えば、INVADERアッセイ侵入的切断構造）が形成される。いくつかの実施形態では、侵入的切断構造はINVADERアッセイによって検出する（例えば以下の記述を参照）。他の実施形態では、INVADERアッセイ侵入的切断構造の切断後、得られた両端をライゲートして環状構造を形成する。他の実施形態では、一オリゴヌクレオチドとｍｉＲＮＡをハイブリダイズ（例えば、ｍｉＲＮＡの隣接ヌクレオチドとハイブリダイズ）し、その結果、オリゴヌクレオチドの両端が接近し、次いでライゲートされる。

【0098】

さらに別の実施形態では、図２４、２５に記載する検出構造が生成される。この実施形態では、プローブまたはINVADERオリゴヌクレオチドが伸長して、単一ヘアピンループすなわち「半亜鈴」構造を形成する。例えば、いくつかの実施形態では、実施例１８に記載したオリゴヌクレオチド（例えば図３１を参照）は、癌に伴うｍｉＲＮＡを検出する（例えば、INVADERアッセイによって検出できる侵入的切断構造を形成する）ために使用される。

【0099】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの両端には、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズしない追加の核酸配列が含まれる（例えば実施例１９Ｇおよび１９Ｈを参照）。いくつかの実施形態では、これらの追加の配列は、侵入的切断構造（例えば、INVADERアッセイ侵入的切断構造）を形成する。いくつかの実施形態では、侵入的切断構造は、INVADERアッセイによって検出する（例えば以下の記述を参照）。

【0100】

他の実施形態では、切断構造、例えば、INVADERアッセイ侵入的切断構造を安定化させるために、これらの追加の配列は、反応混合物に付加した追加のオリゴヌクレオチドに相補的である（図４）。

【0101】

いくつかの実施形態では、ローリングサークル型複製アッセイを使用して、上記のように生成された環状構造を検出する（例えば、ローリングサークル型複製についての以下の記述を参照）。

【0102】

さらに別の実施形態では、検出構造は、長鎖オリゴヌクレオチド（例えば、５０、１００、１０００ヌクレオチド長以上）と、ｍｉＲＮＡに相同な短鎖領域とから形成される。一個もしくは複数のｍｉＲＮＡをオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、検出構造を生成する。いくつかの実施形態では、これらの検出構造は、（例えば、ライゲーション、またはＲＴ−ＰＣＲなどの重合反応を通じて）ｍｉＲＮＡが伸長することによって検出する。いくつかの実施形態では、これらの検出構造は、さらに、微小球、または他の表面、または構造などの固相支持体にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることによって検出する。いくつかの実施形態では、非ｍｉＲＮＡ成分は、伸長し、または別の核酸とライゲートし、そして直接的にまたは間接的に検出する。

【0103】

いくつかの実施形態では、検出構造を形成するのに使用するオリゴヌクレオチドは、一個もしくは複数のヌクレオチド類似体を含む。例えば、いくつかの実施形態では、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを使用する。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、その機序を理解することは、本発明を実施する上で必ずしも必要ではない。それにもかかわらず、２’−Ｏ−メチル塩基が存在すると、ハイブリダイズした検出構造の安定性は増大し、それ以上の検出方法に役立つと考えられる。

【0104】

ＩＩ．核酸の検出（例えば干渉ＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、本発明はｍｉＲＮＡを検出する方法を提供する。本発明は、特定の検出アッセイに限定されない。それだけには限らないが、本明細書に開示した方法を含め、任意の適切な方法を使用してよい。

【0105】

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ検出方法は定量的である。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、その機序を理解することは、本発明を実施する上で必ずしも必要でない。それにもかかわらず、体内の特定のｍｉＲＮＡのレベルは、その同族遺伝子からの遺伝子発現レベルに関連付けられると考えられる。従って、本発明は、特定の遺伝子［例えば疾患状態（例えば癌）または代謝に関与する遺伝子］の遺伝子発現と相関するｍｉＲＮＡの方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、特定のｍｉＲＮＡの異常な（例えば高もしくは低）レベル（例えば癌に伴うｍｉＲＮＡの発現）が存在するかどうかを判定するために、［Calinら, Proc Natl Acad Sci USA, 99, 15524-15529 (2002)などを参照されたい。例えば実施例１８および図３１に記載したオリゴヌクレオチドを使用する］、または介入（例えば薬物）がｍｉＲＮＡの発現に与える効果を判定するために、本発明の方法を使用する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現系の効率を特徴付けるために、（例えば、発現ベクター、遺伝子導入構築体、形質移入などの）異種ｍｉＲＮＡを検出する。

【0106】

いくつかの実施形態では、本発明は、特定のｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ−１またはｍｉｒ−１３５などのｍｉＲＮＡ）を検出する方法を提供する。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、特定のｍｉＲＮＡの変異体（例えば、多型または突然変異型）を識別する。さらに別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲＮＡの存在について試験する細胞を溶解する方法を提供する。

【0107】

Ａ．INVADERアッセイ
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出にINVADERアッセイを使用する。いくつかの実施形態では、INVADERアッセイは、標的核酸の存在に依存する核酸切断構造を形成するステップ、および特徴的な切断生成物を遊離するために、核酸切断構造を切断するステップを含む。例えば５’ヌクレアーゼ活性を使用して、標的依存的切断構造を切断するが、その得られた切断生成物もしくは切断構造の切断物が、試料中の特異的標的核酸配列の存在を示す。１本もしくは２本の（またはそれ以上の）核酸鎖、またはオリゴヌクレオチドは、両方が標的核酸鎖にハイブリダイズし、その結果、重複する侵入的切断構造を形成すると、以下に記述するように侵入的切断が生じうる。切断剤（例えば、５’ヌクレアーゼ）と上流オリゴヌクレオチドの相互作用を通じて、特徴的なフラグメントを生成するような方式で、切断剤は、下流オリゴヌクレオチドを内部部位で切断できるようになる。そのような実施形態が、INVADERアッセイ（Third Wave Technologies）と呼ばれ、米国特許第５，８４６，７１７号、米国特許第５，９８５，５５７号、米国特許第５，９９４，０６９号、米国特許第６，００１，５６７号、米国特許第６，０９０，５４３号、米国特許第６，３４８，３１４号、および米国特許第６，４５８，５３５号、ＷＯ ９７／２７２１４、ＷＯ ９８／４２８７３、Lyamichevら, Nat． Biotech., 17:292 (1999)，Hallら, PNAS, USA, 97:8272 (2000)に記載されている。その各々は、あらゆる目的において、その全体を参照により本明細書に組み込む。

【0108】

INVADERアッセイは、構造特異的酵素によって特異的構造を酵素切断することによって、プローブと標的のハイブリダイゼーションを検出する［INVADERアッセイ、Third Wave Technologiesを参照。例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、米国特許第６，０９０，５４３号、米国特許第６，００１，５６７号、米国特許第５，９８５，５５７号、米国特許第５，９９４，０６９号、米国特許第６，０９０，５４３号、米国特許第６，３４８，３１４号、米国特許第６，４５８，５３５号、米国特許出願番号第２００３０１８６２３８号（第１０／０８４８３９号）、米国特許出願番号第２００３０１０４３７８号Ａ１（第０９／８６４６３６号）、Lyamichevら, Nat． Biotech., 17:292 (1999)、Hallら, PNAS, USA, 97:8272 (2000)、ＷＯ ９７／２７２１４およびＷＯ ９８／４２８７３を参照されたい。その各々を、あらゆる目的において、その全体を参照により本明細書に組み込む］。

【0109】

INVADERアッセイは、重複するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって形成された複合体を切断する構造特異的酵素（例えばＦＥＮエンドヌクレアーゼ）の使用によって、特異的ＤＮＡとＲＮＡ配列を検出する（例えば、図１を参照）。高温と過剰な１個のプローブによって、温度サイクリングなしに、存在する各標的配列用の複数のプローブを切断できるようになる。いくつかの実施形態では、次いで、これらの切断したプローブが、第二の標識したプローブの切断を指揮する。二次プローブオリゴヌクレオチドは、内部色素によって消光するフルオレセインで、５’末端標識することができる。切断されると、脱消光フルオレセイン標識した生成物は、標準蛍光プレートリーダーを使用し検出することができる。

【0110】

INVADERアッセイは、増幅物と同様に未増幅物の特異的配列、突然変異、およびＳＮＰ（例えば実施例１９、図３２を参照）、ＲＮＡ、およびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡを検出する。図１に概略的に示す実施形態では、INVADERアッセイでは、連続する２つの工程（一次および二次反応）が使用されるが、どちらも標的特異的シグナルを発生し、次いでこれを増幅する。便宜上、以下の考察では、たとえ、この用語法が全ての遺伝子の変化に当てはまらないとしても、対立遺伝子を野生型（ＷＴ）および突然変異体（ＭＴ）と記載する。一次反応（図１パネルＡ）では、ＷＴ一次プローブとINVADERオリゴヌクレオチドが、標的核酸に直列でハイブリダイズして重複構造を形成する。ＷＴ一次プローブの５’末端に、不対「フラップ」が含まれる。構造特異的酵素（例えば、CLEAVASE酵素、Third Wave Technologies）が重複を認識し、不対フラップを切り離し、標的特異的生成物としてそれを放出する。二次反応では、この切断生成物が、ＷＴ蛍光共鳴エネルギー転移（ＷＴ−FRET）プローブで、INVADERオリゴヌクレオチドとして役立ち、再度構造特異的酵素によって認識される構造を形成する（パネルＡ）。１個のFRETプローブ上の２個の色素が、（図１で矢印によって示す）切断によって分離すると、バックグラウンド蛍光で検出可能な蛍光シグナルが発生する。従って、この第二構造の切断によって蛍光が増大し、ＷＴ対立遺伝子（または検出可能なシグナルを発生させるために、突然変異対立遺伝子用にアッセイを構成した場合は突然変異対立遺伝子）の存在が示される。いくつかの実施形態では、１回の反応で異なる対立遺伝子もしくは遺伝子座を検出できるように、検出すべき各対立遺伝子もしくは遺伝子座用に、（例えば、発光もしくは励起波長の差異によって分析可能、または時間分解型蛍光検出によって分析可能な）異なる標識を有するFRETプローブを準備する。そのような実施形態では、１つのアッセイで一次プローブセットと異なるFRETプローブを混合すると、同じ試料中の各対立遺伝子もしくは遺伝子座から、そのシグナルの比較が可能になる。

【0111】

一次プローブオリゴヌクレオチドと標的ヌクレオチド配列が、切断部位で完全にマッチしない場合（例えば、ＭＴ一次プローブとＷＴ標的のように、図１パネルＢ）、重複構造は形成されず切断が抑制される。構造特異的酵素（例えば、CLEAVASE VIII酵素、Third Wave Technologies）を使用すると、非重複構造よりも効率よく（例えば、少なくとも３４０倍）重複構造が切断され、対立遺伝子を高度に判別できるようになる。

【0112】

プローブは、温度サイクリングなしにターンオーバーして、一個の標的につき多くのシグナルを発生する（すなわち直線的シグナル増幅）。同様に、各標的特異的生成物によって、多くのFRETプローブを切断できるようになる。

【0113】

一次INVADERアッセイ反応は、検出する標的ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を対象とする。標的ＤＮＡは、第一の侵入的切断では制限的成分である。INVADERと一次プローブがモル過剰で供給されるからである。第二の侵入的切断では、制限的なものは放出されたフラップである。これらの２つの切断反応を逐次実施すると、標的ＤＮＡ量に関して複合体反応からの蛍光シグナルが直線的に蓄積する。

【0114】

ある実施形態では、INVADERアッセイまたは他のヌクレオチド検出アッセイは、利用可能部位で設計したオリゴヌクレオチドおよび／または橋掛けオリゴヌクレオチドを用いて実施する。そのような方法、手順、および組成は、米国特許第６，１９４，１４９号、米国特許第６，３５８，６９１号、米国特許第６３５５，４３７号、米国特許出願番号第０９／８８２，９４５号、およびＰＣＴ出願ＷＯ ９８５０４０３、およびＷＯ ０１９８５３７に記載されており、それらの全てはその全体を特に参照により組み込む。

【0115】

いくつかの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドとその薬剤に、試料［例えば核酸配列｛例えば干渉ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ）｝］を曝露することには、前記標的配列が前記試料中に存在する場合、前記標的配列と前記オリゴヌクレオチド間に侵入的切断構造が形成される条件下で、オリゴヌクレオチドとその薬剤に試料を曝露するステップを含み、その際、前記切断剤によって前記侵入的切断構造は切断されて、切断生成物を形成する。

【0116】

いくつかの実施形態では、標的配列（例えばｍｉＲＮＡ）は、第一領域と第二領域を含み、その第二領域は第一領域の下流にあり近接し、オリゴヌクレオチドは、第一と第二オリゴヌクレオチドを含み、その際、第一オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、標的配列の第一部分に完全に相補的であり、第二オリゴヌクレオチドは３’部分と５’部分を含み、その５’部分は、標的核酸の第二部分に完全に相補的である。

【0117】

いくつかの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドとその薬剤に試料を曝露することには、標的配列が試料中に存在する場合、標的配列とオリゴヌクレオチド間に侵入的切断構造が形成される条件下で、オリゴヌクレオチドとその薬剤に試料を曝露するステップを含み、その際、切断剤によって侵入的切断構造は切断されて切断生成物を形成する。

【0118】

いくつかの特に好ましい実施形態では、標的配列は、第一領域と第二領域を含み、前記第二領域は前記第一領域の下流にあり近接し、前記オリゴヌクレオチドは、第一と第二オリゴヌクレオチドを含み、その際、前記第一オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、前記標的配列の前記第一部分に完全に相補的であり、前記第二オリゴヌクレオチドは３’部分と５’部分を含み、前記５’部分は、前記標的核酸の前記第二部分に完全に相補的である。

【0119】

ある実施形態では、本発明は、INVADER検出試薬（例えば、一次プローブ、INVADERプローブ、およびFRETカセット）を使用し、プールした試料（例えば、プールした血液試料もしくはプールした細胞ライセート）をアッセイするキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは、INVADERアッセイの実施方法、いくつかの実施形態では、多くの個体から得たプールした試料、または一対象から得た多くの細胞（例えば生検試料）の「プールした」試料に、INVADER検出アッセイを利用する方法についての使用説明書をさらに含む。

【0120】

本発明は、さらに、複数ラウンドのオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションおよびプローブの切断中、標的核酸が再利用もしくはリサイクルされるアッセイであって、温度サイクリング（すなわち、標的核酸鎖の周期的変性）または核酸合成（すなわち、標的鎖もしくはプローブ核酸鎖の重合に基づく置換）を使用する必要がないアッセイを提供する。標的鎖上でプローブが［例えば、プローブ−プローブ置換または、プローブ／標的の会合と分離の平衡、またはこれらの機序を含む組合せを通じて（Reynaldoら, J. Mol． Biol． 97: 511-520 (2000)］連続的に置換される条件下で切断反応を行なうと、複数のプローブを同じ標的にハイブリダイズすることができ、複数の切断と複数の切断生成物の生成が可能になる。

【0121】

INVADERアッセイ反応
INVADER ＤＮＡアッセイの好ましい実施形態では、２個のオリゴヌクレオチド（特徴的一次プローブとINVADERオリゴ）が、標的ＤＮＡに直列でハイブリダイズして重複構造を形成する。一次プローブの５’末端には、標的ＤＮＡにハイブリダイズしない５’−フラップが含まれる（図１）。結合したINVADERオリゴヌクレオチドの３’−ヌクレオチドは、一次プローブに重複するが、標的ＤＮＡにハイブリダイズしなくてもよい（例えば、実施例１５および１６を参照）。CLEAVASE酵素は、この重複構造を認識し、一次プローブの不対５’−フラップを切り離し、標的特異的生成物としてそれを放出する。一次プローブは、融解温度が反応温度に近似するように設計されている。従って、等温アッセイ条件下では、過剰に提供された一次プローブは標的ＤＮＡ上でサイクルされる。これにより、各標的ＤＮＡについて複数ラウンドの一次プローブの切断、および放出された５’−フラップ数の増幅が可能になる。

【0122】

二次反応では、それぞれの放出された５’−フラップは、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）カセットで、INVADERオリゴヌクレオチドとして役立ち、CLEAVASE酵素によって認識、切断される別の重複構造を形成することができる（図１）。FRETカセットが切断されると、フルオロフォア（Ｆ）とクエンチャー（Ｑ）が分離し、検出可能な蛍光シグナルが発生する。一次反応に類似して、放出された５’−フラップとFRETカセットは循環して、結果として蛍光シグナルが増幅する。一次および二次反応は、同じウェルで同時に行なう。

【0123】

二重（biplex）型式のINVADER ＤＮＡアッセイによって、単一ウェルで２個のＤＮＡ配列を同時に検出できるようになる（例えば、実施例１７および１９（Ｌ）を参照）。これには、（例えばｍｉＲＮＡ中）特定の多形の２変異体の検出が伴うことが極めて多い。二重型式では、それぞれ特有の５’−フラップを有する異なる２個の特徴的な一次プローブと、それぞれスペクトルが異なるフルオロフォアを有する異なる２個のFRETカセットが使用される。設計によっては、放出される５’−フラップは、その各々のFRETカセットのみに結合して標的特異的シグナルを発生する。

【0124】

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明を実施するのに必要な成分の一個もしくは複数を含むキットを提供する。例えば、本発明は、本発明の酵素および／または切断アッセイ（例えば、INVADERアッセイ）を実施する必要な反応成分を貯蔵しまたは配達するキットを提供する。例として、そして任意の特定の成分構成もしくは成分の組合せに本発明のキットを限定する意図はないが、以下の節では、本発明を実施するためのキットの一実施形態について記載する。

【0125】

いくつかの実施形態では、本発明のキットは以下の試薬を提供する。

【0126】

CLEAVASE酵素 一次プローブオリゴ
ＤＮＡ反応緩衝液１ INVADERオリゴ
FRETカセット１（例えばＦ）
FRETカセット２（例えばＲ）
突然変異体ＤＮＡ対照
野生型ＤＮＡ対照
「標的なし」ブランク対照
他の実施形態では、本発明のキットは、ＲＮＡを直接検出するため構成されている。このキットは、以下の試薬を提供しうる。

【0127】

CLEAVASE酵素 一次プローブ
オリゴヌクレオチド
ＤＮＡ反応緩衝液１ INVADERオリゴ
FRETプローブ１（例えばＦ）
FRETプローブ２（例えばＲ）
二次反応標的１
二次反応標的２
ARRESTORオリゴヌクレオチド１
ARRESTORオリゴヌクレオチド２
突然変異体ＤＮＡ対照
野生型ＤＮＡ対照
「標的なし」ブランク対照
追加の考察は、１回の反応でオリゴヌクレオチドの特定の組合せから生じた望ましくない作用に関するものである。そのような一作用は、標的に依存しないバックグラウンドシグナルの発生である。他のものと組み合わさったある種のオリゴヌクレオチドは、INVADERアッセイで、検出する特定の標的の非存在下シグナルを発生しかねない。この作用を緩和するために、異なるプールにこれらのオリゴヌクレオチドの組合せを分離する方法を使用できる。同様に、ある種のオリゴヌクレオチドの組合せによって、所望の標的からのシグナルの発生を人工的に抑制することができる。繰り返すが、これらの組合せを異なるプールに分離することによって、この作用を緩和することができる。

【0128】

本明細書（例えば実験の節を参照）に示す反応設計および最適化のガイドラインを使用し、ｍｉＲＮＡ検出アッセイでの使用にプローブセットの設計（例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはそれらの配列）を適応させる。例えば、いくつかの実施形態では、より小さいハイブリダイゼーション領域に合わせて反応温度を（例えば５０〜６０℃に）低下させる。

【0129】

いくつかの実施形態では、本発明の方法を実施するために、本発明のキットは、使用者が揃えるべき追加成分（例えば試薬、供給物、および／または設備）のリストを提供する。例えば、そのような追加成分リストを任意の特定の成分に限定する意図はないが、そのようなリストの一実施形態には以下のものが含まれる。

【0130】

Clear CHILLOUT−14液体ワックス（MJ Research）またはRNase不含光学等級鉱油（Sigma、カタログ番号M−5904）
９６穴ポリプロピレンマイクロプレート（MJ Research、カタログ番号MSP−9601）
滅菌１．５−ｍｌまたは２．０−ｍｌマイクロ遠心管
滅菌、DNase／RNase不含使い捨てエアロゾルバリアピペットチップ
マルチチャンネルピペット（０．５−１０μｌ、２．５−２０μｌ）
サーマルサイクラーまたは他の熱源（例えば、ラボ用オーブンまたは加熱ブロック）。

【0131】

諸研究室設備（試験管立て、マイクロピペッター、マルチチャンネルピペット、マイクロ遠心機、ボルテックスミキサー）。

【0132】

蛍光マイクロプレートリーダー（好ましいプレートリーダーは、上部読取り式であり光フィルターを備える）は以下の特性を有する。

【0133】

励起 発光
（波長／バンド幅） （波長／バンド幅）
４８５ｎｍ／２０ｎｍ ５３０ｎｍ／２５ｎｍ
５６０ｎｍ／２０ｎｍ ６２０ｎｍ／４０ｎｍ
いくつかの実施形態では、本発明の方法の性能を高めるために、本発明のキットは、使用者が揃えるべき任意選択成分（例えば、試薬、供給物、および／または設備）のリストを提供する。例えば、そのような任意選択成分リストを任意の特定の成分に限定する意図はないが、そのようなリストの一実施形態には以下ものが含まれる。

【0134】

滅菌８−チューブストリップまたはマイクロプレート（任意）
使い捨てプラスチックトラフ（任意）
プレートシーリングテープ（任意）
いくつかの実施形態では、本発明の方法の性能を高めるために、本発明のキットは、複数の代替物（例えば試料調製キット）も許容されるが、使用者が揃えるべき必要成分のリストを提供する。例えば、そのような任意選択成分リストを任意の特定の成分に限定する意図はないが、そのようなリストの一実施形態には以下ものが含まれる。

【0135】

QIAGEN QIAAMP Bloodキット
Gentra Systems PUREGENEキット
Gentra Systems GENERATION製品
キットのいくつかの実施形態に詳細なプロトコルを提供する。好ましい実施形態では、INVADERアッセイ反応を組み立てるプロトコル（例えば、製剤および反応混合物を作製する好ましい手順）を提供する。特に好ましい実施形態では、反応混合物を組み立てるプロトコルには、本発明の方法の性能での過誤の危険性を減少させる、コンピューター的または図式的補助物が含まれる（例えば、複数の反応に必要な試薬容量の計算を容易にする表、および多数のアッセイ反応を含めるための、マルチウェルアッセイプレートの構成に役立つプレートレイアウトガイド）。

【0136】

いくつかの実施形態では、補足的書類、例えば追加の試薬を調製し、または本発明の方法で使用する試料を調製するための補助的手順のプロトコルなどを提供する。好ましい実施形態では、補足的書類には、未熟練なもしくは不慣れな使用者が、本方法およびキットを首尾よく使用する助けとなるガイドラインおよび注意書きリストを含める。特に好ましい実施形態では、補足的書類には、故障点検ガイド、例えば、使用者が直面するであろう潜在的問題について記載し、そのような問題を解決しもしくは回避する際に、使用者に役立てるために示唆する解決策または修正案を提供するガイドが含まれる。

【0137】

好ましい実施形態では、一反応につき１０−μｌ添加に相当する濃度に試料を希釈する。１００−ｎｇ試料の濃度は１５ｎｇ／μｌである。

【0138】

Ｂ．ローリングサークル型複製
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ検出構造を検出するために、ローリングサークル型複製法（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）を使用する［例えば、米国特許第６，３４４，３２９号、米国特許第６，１４３，４９５号、米国特許第６，３１６，２２９号、米国特許第６，２１０，８８４号、米国特許第６，１８３，９６０号、および米国特許第６，２３５，５０２号を参照されたい。その各々を参照により本明細書に組み込む］。いくつかの実施形態では、ローリングサークル型複製は、ｍｉＲＮＡとアニールする単一オリゴヌクレオチドの両端アニーリングから発生した、環状ｍｉＲＮＡ検出構造を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの両端は、重複することなくｍｉＲＮＡとハイブリダイズする。このオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡの存在もしくは非存在下でライゲートさせることができる。しかし、ライゲーション反応は、ｍｉＲＮＡの存在下でより効率的になる。そのような実施形態では、ｍｉＲＮＡを含まない対照反応と、経時的に検出する環状分子レベルを比較する。

【0139】

他の実施形態では、侵入的切断構造を生成するために、端部を重複させてオリゴヌクレオチドの両端をｍｉＲＮＡとハイブリダイズする。そのような構造は、ライゲーション前に切断され、それによって環状検出構造の生成特異性が改善される。

【0140】

ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）には、環状一本鎖ＤＮＡ分子の複製が伴う。ＲＣＡでは、ローリングサークル型複製プライマーは、環状核酸分子とハイブリダイズし、続いて鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用する核酸分子のローリングサークル型複製が行なわれる。増幅は、１回反応サイクルではローリングサークル型複製中に生じる。ローリングサークル型複製によって、核酸配列の縦列反復を含む、大型ＤＮＡ分子がもたらされる。このＤＮＡ分子を直列配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）と称する。

【0141】

いくつかの実施形態では、複製前にライゲーションの操作を伴うライゲーション媒介ローリングサークル型増幅（ＬＭ−ＲＣＡ）が使用される。ライゲーションの操作では、プローブは、その同族標的核酸配列が存在する場合は、それとハイブリダイズし、続いてハイブリダイズしたプローブの両端をライゲーションして、共有結合で閉じた一本鎖核酸を形成する。ライゲーション後、ローリングサークル型複製プライマーは、プローブ分子とハイブリダイズし、続いて鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用する環状分子のローリングサークル型複製が行なわれる。一般的に、ＬＭ−ＲＣＡは、開環プローブと標的試料を混合し、結果としてプローブ−標的試料混合物を得るステップ、およびその開環プローブと標的配列間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、そのプローブ−標的試料混合物をインキュベートするステップ、リガーゼとそのプローブ−標的試料混合物を混合し、結果としてライゲーション混合物を得るステップ、およびその開環プローブのライゲーションを促進する条件下で、そのライゲーション混合物をインキュベートして、増幅標的環（ＡＴＣ）を形成するステップ、ローリングサークル型複製プライマー（ＲＣＲＰ）とそのライゲーション混合物を混合して、結果としてプライマー−ＡＴＣ混合物を得るステップ、およびその増幅標的環とローリングサークル型複製プライマー間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、そのプライマー−ＡＴＣ混合物をインキュベートするステップ、ＤＮＡポリメラーゼとそのプライマー−ＡＴＣ混合物を混合し、結果としてポリメラーゼ−ＡＴＣ混合物を得るステップ、およびその増幅標的環の複製を促進する条件下で、そのポリメラーゼ−ＡＴＣ混合物をインキュベートするステップを含み、その際、その増幅標的環の複製によって直列配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）が形成される。

【0142】

Ｃ．追加の検出方法
本発明は、INVADERアッセイまたはローリングサークル型アッセイ検出に限定されない。ｍｉＲＮＡ検出構造の検出を可能にする任意の方法を使用してよい。本発明の方法に使用される例示的な限定しない検出アッセイを以下に記載する。

【0143】

１．ハイブリダイゼーションアッセイ
本発明のいくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイを使用し検出構造を検出する。ハイブリダイゼーションアッセイでは、試料から得たＤＮＡが相補ＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づき、所与の核酸配列の有無を判定する。ハイブリダイゼーションおよび検出用の様々な技術を使用する、様々なハイブリダイゼーションアッセイを利用することができる。アッセイの選択について以下に記載する。

【0144】

ａ．「ＤＮＡチップ」アッセイを使用するハイブリダイゼーションの検出
本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡチップハイブリダイゼーションアッセイを使用し配列を検出する。このアッセイでは、一連のオリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に固定する。オリゴヌクレオチドプローブは、所与の標的配列（例えば検出複合体成分）に特有であるように設計されている。当該試料をＤＮＡ「チップ」と接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。

【0145】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡチップアッセイは、GeneChip［Affymetrix,Santa Clara,CA；例えば、米国特許第６，０４５，９９６号、米国特許第５，９２５，５２５号、および米国特許第５，８５８，６５９号を参照されたい。その各々を参照により本明細書に組み込む］アッセイである。GeneChip技術では、「チップ」に固定したオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度アレイが使用される。プローブアレイは、Affymetrix社製光指向性化学合成法によって製造するが、その方法は、固相化学合成と、半導体業界で使用されるフォトリソグラフ製作技術を組み合わせている。チップの曝露部位を限定するために一連のフォトリソグラフマスク、続いて特異的化学合成ステップを使用し、その過程は、アレイの所定の位置に各プローブを配して、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを構築する。大型ガラスウェーハ上に複数のプローブアレイを同時に合成する。次いで、ウェーハをダイシングして、射出成形したプラスチックカートリッジ中に個々のプローブアレイを封入するが、このカートリッジはプローブアレイを環境から保護し、かつハイブリダイゼーション用チャンバーとして役立つ。

【0146】

分析する核酸を単離し、ＰＣＲによって増幅し、蛍光レポーター基で標識する。次いで、フルーイディクスステーション（fluidics station）を使用し、標識ＤＮＡをアレイと共にインキュベートする。次いで、アレイをスキャナーに挿入し、そこでハイブリダイゼーションパターンを検出する。プローブアレイに結合させた標的に、既に組み込まれている蛍光レポーター基から発せられた光として、ハイブリダイゼーションデータを採取する。標的に完全適合するプローブは、ミスマッチを含むプローブよりも一般的に強力なシグナルを発する。アレイ上の各プローブの配列および位置は分っているので、相補性によって、プローブアレイに利用した標的核酸の同一性を定量することができる。

【0147】

他の実施形態では、電子的に捕捉したプローブを含むＤＮＡマイクロチップ（Nanogen, San Diego, CA）を使用する［例えば、米国特許第６，０１７，６９６号、米国特許第６，０６８，８１８号、および米国特許第６，０５１，３８０号を参照されたい。その各々を参照により本明細書に組み込む］。マイクロエレクトロニクスの使用によって、Nanogen社の技術は、荷電分子の活性な動作および濃度が、その半導体マイクロチップ上の指定試験部位へ行き来するのを可能にするものである。所与の標的配列に特有なＤＮＡ捕捉プローブをマイクロチップ上の特異的部位に電子的に配置し、または「アドレス化」する。ＤＮＡは、強力な負電荷を有するので、正電荷領域に電子的に移動しうる。

【0148】

第一に、マイクロチップ上の試験部位もしくは試験部位列に、正電荷をかけて電子的に活性化させる。次に、マイクロチップ上にＤＮＡプローブを含む溶液を導入する。負荷電プローブは、正電荷部位に急速に移動し、そこで濃縮され、マイクロチップ上の部位に化学的に結合する。次いで、マイクロチップを洗浄し、特異的に結合したＤＮＡプローブのアレイが完成するまで、別個のＤＮＡプローブの別の溶液を加える。

【0149】

次いで、ＤＮＡ捕捉プローブのどれが、標的配列とハイブリダイズしているかを判定することによって、標的配列の存在について試験試料を分析する。マイクロチップ上の一個もしくは複数の試験部位に、標的分子を移動し濃縮させるために、電子電荷も使用される。各試験部位での試料ＤＮＡの電子濃縮は、試料ＤＮＡと相補的捕捉プローブの迅速なハイブリダイゼーションを促進する（ハイブリダイゼーションは数分で生じるであろう）。各部位からいかなる未結合ＤＮＡもしくは非特異的結合ＤＮＡも除去するために、その部位の極性もしくは電荷を負に逆転させ、それによっていかなる未結合ＤＮＡもしくは非特異的結合ＤＮＡも捕捉プローブから剥がして溶液に強制的に戻す。結合を検出するために、レーザーをベースにした蛍光スキャナーが使用される。

【0150】

さらに別の実施形態では、表面張力の差による平面（チップ）での液体分離に基づくアレイ技術（ProtoGene, Palo Alto, CA）を使用する［例えば米国特許第６，００１，３１１号、米国特許第５，９８５，５５１号、および米国特許第５，４７４，７９６号を参照されたい。その各々を参照により本明細書に組み込む］。Protogeneの技術は、化学コーティングにより付与された表面張力の差により、液体が、平面で分離できるという事実に基づく。一度そのように分離されたならば、試薬をインクジェット印刷することによって、オリゴヌクレオチドプローブを直接チップ上に合成する。表面張力によって定義したその反応部位を備えたアレイを、４個の圧電ノズルセットの下、Ｘ／Ｙ翻訳ステージ上にマウントするが、４個の標準的ＤＮＡ塩基の各々について１個のノズルである。翻訳ステージは、アレイ列の各々に沿って移動し、反応部位の各々に好適な試薬を配達する。例えば、Ａアミダイトは、アミダイトＡがその合成ステップ中に結合する部位のみに配達され、以下同様である。一般的試薬の配薬および洗浄は、表面全体に流し込み、次いで遠心分離除去することによって行なう。

【0151】

Protogeneの技術を使用し、当該標的配列（例えば検出複合体成分）に特有なＤＮＡプローブをチップに固定する。次いで、チップをＰＣＲ増幅した当該遺伝子と接触させる。ハイブリダイゼーション後、未結合ＤＮＡを除去し、任意の適切な方法（例えば、組み込み蛍光基の蛍光脱消光によって）を使用してハイブリダイゼーションを検出する。

【0152】

さらに別の実施形態では、多型の検出に「ビーズアレイ」を使用する［Illumina, San Diego, CA；例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９９／６７６４１およびＷＯ ００／３９５８７を参照されたい。その各々を参照により本明細書に組み込む］。Illuminaは、光ファイバー束と、アレイに自己組織化するビーズを組み合わせたビーズアレイ技術を使用している。各光ファイバー束には、束の径に応じて数千から数百万の個々の繊維が含まれる。所与のＳＮＰもしくは突然変異体の検出に特異的なオリゴヌクレオチドでビーズをコートする。ビーズのバッチを混合して、そのアレイに特異的なプールを形成する。アッセイを実施するために、調製した対象試料（例えば核酸試料）にビーズアレイを接触させる。任意の適切な方法を使用し、ハイブリダイゼーションを検出する。
ｂ．酵素的ハイブリダイゼーションの検出
本発明のいくつかの実施形態では、特異的構造の酵素切断によってハイブリダイゼーションを検出する。

【0153】

いくつかの実施形態では、TaqManアッセイ［PE Biosystems, Foster City, CA；例えば米国特許第５，９６２，２３３号および米国特許第５，５３８，８４８号を参照されたい。その各々を参照により本明細書に組み込む］を使用し、結合したプローブのハイブリダイゼーションを検出する。アッセイは、ＰＣＲ反応中に実施される。TaqManアッセイは、AMPLITAQ GOLD ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性を利用する。所与の対立遺伝子もしくは突然変異体に特異的なプローブがＰＣＲ反応に含まれる。プローブは、５’−レポーター色素（例えば蛍光色素）と３’−クエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドからなる。ＰＣＲ中、プローブがその標的に結合した場合、AMPLITAQ GOLDポリメラーゼの５’−３’核酸分解活性によって、レポーター色素とクエンチャー色素間でプローブが切断される。クエンチャー色素からレポーター色素が分離すると、蛍光が増大する。ＰＣＲの各サイクルでシグナルは蓄積し、蛍光計でモニターすることができる。

【0154】

さらに別の実施形態では、SNP ITプライマー伸長法アッセイ［Orchid Biosciences, Princeton, NJ；例えば米国特許第５，９５２，１７４号および米国特許第５，９１９，６２６号を参照されたい。その各々を参照により本明細書に組み込む］を使用して多型を検出する。このアッセイでは、特別に合成したＤＮＡプライマーとＤＮＡポリメラーゼを使用して、推測されるＳＮＰ位置で、一塩基によってＤＮＡ鎖を選択的に伸長することによって、ＳＮＰを同定する。当該領域中のＤＮＡを増幅し変性する。次いで、マイクロフルイディクスと称する小型化されたシステムを使用し、ポリメラーゼ反応を実施する。標的配列位置と推測されるヌクレオチドに標識を付加することによって検出を行なう。ＤＮＡ中への標識の取り込みは、任意の適切な方法によって検出することができる（例えば、ヌクレオチドが、ビオチン標識を含む場合、検出は、蛍光標識したビオチン特異的抗体による）。

【0155】

２．他の検出アッセイ
ｍｉＲＮＡ検出構造の検出に有用な別の検出アッセイには、それだけには限らないが、以下のものが含まれる。酵素ミスマッチ切断方法［例えばVariagenics、米国特許第６，１１０，６８４号、米国特許第５，９５８，６９２号、米国特許第５，８５１，７７０号、その全体を参照により本明細書に組み込む］、ポリメラーゼ連鎖反応［例えば、実施例１９および図３２を参照］、分枝ハイブリダイゼーション法［例えば、Chiron、米国特許第５，８４９，４８１号、米国特許第５，７１０，２６４号、米国特許第５，１２４，２４６号、および米国特許第５，６２４，８０２号。その全体を参照により本明細書に組み込む］、NASBA［例えば米国特許第５，４０９，８１８号。その全体を参照により本明細書に組み込む］、分子ビーコン技術［例えば米国特許第６，１５０，０９７号、その全体を参照により本明細書に組み込む］、Ｅ−センサー技術［Motorola、米国特許第６，２４８，２２９号、米国特許第６，２２１，５８３号、米国特許第６，０１３，１７０号、および米国特許第６，０６３，５７３号、その全体を参照により本明細書に組み込む］、サイクリングプローブ技術［例えば米国特許第５，４０３，７１１号、米国特許第５，０１１，７６９号、および米国特許第５，６６０，９８８号、その全体を参照により本明細書に組み込む］、Dade Behringシグナル増幅法［例えば米国特許第６，１２１，００１号、米国特許第６，１１０，６７７号、米国特許第５，９１４，２３０号、米国特許第５，８８２，８６７号、および米国特許第５，７９２，６１４号、その全体を参照により本明細書に組み込む］、リガーゼ連鎖反応［Barnay Proc． Natl． Acad． Sci USA 88, 189-93 (1991)］、およびサンドイッチハイブリダイゼーション法［例えば米国特許第５，２８８，６０９号、その全体を参照により本明細書に組み込む］。

【0156】

実験
本発明のある好ましい実施形態および態様を実証し、さらに例示するために、以下の実施例を提供するが、その範囲を制限するものとは解釈されない。

【実施例1】

【0157】

材料および方法
以下の終濃度を実施例１〜１８の全ての反応に使用した（本明細書中にて特に明記しない限り）。

【0158】

プローブ＝１μＭ
INVADER＝１μＭ
ARRESTOR＝２．６７μＭ
CLEAVASE XII酵素＝３０ｎｇ
合成ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは全て、Dharmaconから購入し、２０％変性アクリルアミドでゲル精製した。合成ｍｉＲＮＡを使用して、温度最適条件（以下を参照）およびＬＯＤを決定した。

【0159】

別段の指示が無い限り、一体型ＤＮＡ技術（ＩＤＴ：Integrated DNA Technologies）またはThird Wave Technologiesによって、INVADERオリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド、およびARRESTORオリゴヌクレオチドを合成し、２０％変性アクリルアミドで精製した。

【0160】

全ての反応に、（別段の記載が無い限り）以下の２．５×一次反応緩衝液を使用した。

【0161】

２５ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）
６２．５ｍＭ ＫＣｌ
０．１２５％ Tween 20
０．１２５％ Nonidet NP40
６２．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４
５％ ＰＥＧ
別段の記載が無い限り、最初の熱インキュベーション前に、全ての反応は１０μｌの鉱油で被覆した。

【0162】

別段の記載が無い限り、合成ｍｉＲＮＡには５’ＯＨを含めた。５’リン酸化合成ｍｉＲＮＡ標的 対 非リン酸化合成ｍｉＲＮＡ標的の検出比較実験により、これら２個の異なるタイプの合成分子を検出するINVADERアッセイの能力に、有意差はないことが示唆された。

【実施例2】

【0163】

ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−１について温度最適化実験
ｌｅｔ−７に対するオリゴヌクレオチドの設計を図５に示す。ｍｉｒ−１に対するオリゴヌクレオチドの設計を図５に示す。以下の一次混合物を作製し、９６穴プレート中５０℃±１０℃で３０分間インキュベートした。さらに、標的基本混合物は調製しなかった（ＲＮＡの代わりにＨ_２Ｏの添加）。全反応を鉱油で覆って蒸発を防いだ。

【表1】

【0164】

一次反応完了後、以下の二次反応混合物の５μｌを加え、次いで反応を６０℃で１０〜１５分間反応インキュベートした。

【表2】

【0165】

反応の完了後、CYTOFLUOR 4000蛍光マイクロプレートリーダーで、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３０ｎｍを使用し、プレートを読み取った。結果を図６および７に示す。INVADERオリゴヌクレオチドの３’末端が２’−Ｏ−メチル化されていると、ｍｉＲＮＡ３’末端へのINVADERオリゴヌクレオチド５’末端の積層は強化される。さらに、INVADERオリゴヌクレオチド５’末端の２’−Ｏ−メチル化によって、反応温度は上昇する。INVADERオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化塩基が、ｍｉＲＮＡの最初の２個の塩基と塩基対を形成するように、それらの２’−Ｏ−メチル化塩基を伸長すると［ｌｅｔ−７ａの配列番号９（１４９６−９６−０１Ｒ）の設計で配列番号８（１４９６−９６−０２） 対 配列番号２３（１４９６−９６−０３）］、記載の反応の最適温度は上昇するが、検出は強化されない。

【実施例3】

【0166】

ｌｅｔ−７およびｍｉＲ−１についてＬＯＤ実験
プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドの各セットについて最適の反応温度を決定し、（温度最適化正味シグナル（net signal）から）最良の作業設計を決定した後、合成ＲＮＡを使用する設計のＬＯＤを定量するために以下の実験を準備した。以下の反応混合物を９６穴プレートに分注した（以下のプレート設定を参照）。各ウェルには次のものが含まれる。

【表3】

【0167】

以下の設定を使用し、三つ組または四つ組で、以下の濃度のｍｉＲＮＡを２．５μｌ加えた。

【表4】

【0168】

プレートに鉱油（１０μｌ）を重層し、５０℃で２時間インキュベートした。一次反応完了後、以下のものを５μｌ各ウェルに加え、そのプレートを６０℃で１．５時間インキュベートした。上記の設定を使用しプレートを読み取った（実施例２を参照）。

【表5】

【0169】

次に、ヒトＲＮＡ試料で、ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−１のＬＯＤを試験した。上記プロトコルを使用した。組織特異的全ヒトＲＮＡ試料（Clonetech, Palo Alto, CA）を５０〜１００ｎｇ使用した。結果を図８および１０に示す。全ＲＮＡを使用すると、組織源に応じてｌｅｔ−７ａ発現レベルで以前に見られたものと、同じ組織発現プロフィールが、ｌｅｔ−７ａ INVADERアッセイによって検出される［Pasquinelliら, 408:86 (2000)］。

【実施例4】

【0170】

ｌｅｔ−７ａ、ｃ、ｅ、およびｆの交差反応性実験
この実施例は、別の下位型の代わりに１個の下位型ｌｅｔ−７に対する、プローブおよび／またはINVADERオリゴヌクレオチドの交差反応性の分析について記載する。実施例３に記載した合成ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡの設定のプロトコルを使用した。図５にオリゴヌクレオチドの設計を示す。以下のプレートの設定を使用した。

【表6】

【0171】

結果を図９に示す。Ｌｅｔ−７ａの設計では、ｍｉＲＮＡがその切断部位から離れて一塩基変化を有するものと同じ長さであるとき、交差反応性は最高である。すなわち、INVADERオリゴヌクレオチド／ｍｉＲＮＡハイブリダイズ領域でのミスマッチは、それが、切断部位から最も離れているときに（ｌｅｔ−７ｃ）、高い交差反応性が得られる。塩基変化が切断部位の反対（または近似）にあるとき、交差反応性は最低である。Ｌｅｔ−７ａでは、最悪の交差反応性はｌｅｔ−７ｃで得られ、そのシグナルの２５％である。INVADERアッセイによって、極めて類似するｍｉＲＮＡ同士を弁別できることをこの実施例は実証する。

【実施例5】

【0172】

CLEAVASE IX酵素 対CLEAVASE XII酵素
この実施例は、ｍｉＲＮＡアッセイで使用するCLEAVASE酵素の最適化について記載する。上記の温度最適化プロトコルを使用した。CLEAVASE IX酵素（Third Wave Technologies, Madison, WI）２０ｎｇまたはCLEAVASE XII酵素（Third Wave Technologies, Madison, WI）３０ｎｇを使用した。CLEAVASE IX酵素に以下の緩衝液を使用した。

【0173】

２．５×一次反応緩衝液：２５ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１２５％ Tween 20、０．１２５％ Nonidet NP40、３１．２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１０％ ＰＥＧ。
７．５×二次反応緩衝液：８７．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４

【0174】

CLEAVASE XII酵素に以下の緩衝液を使用した。

【0175】

２．５×一次反応緩衝液：２５ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、６２．５ｍＭ ＫＣｌ、０．１２５％ Tween 20、０．１２５％ Nonidet NP40、６２．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５％ ＰＥＧ。
７．５×二次反応緩衝液：Ｈ_２Ｏ

【0176】

CLEAVASE IXまたはXII酵素を用いてＬＯＤ実験プロトコルを使用した。両酵素についてＬＯＤを定量した。結果を図１１に示す。

【0177】

CLEAVASE IX酵素またはCLEAVASE XII酵素によりアッセイしたとき、増加量のｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡにより、シグナルは直線的に増大した。しかし、Ｒ^２値はCLEAVASE XII酵素で高く、高い直線性が示された。さらに、ＬＯＤはCLEAVASE XII酵素で低かった。２．５amoleの検出の正味シグナルは、CLEAVASE IX酵素で２０カウント、そしてCLEAVASE XII酵素で６６．７５カウントであった。

【実施例6】

【0178】

ｍｉＲ−１３５、ＧＡＰＤＨとＵ６ ＲＮＡ
Ａ．ｍｉＲ１３５を検出するためのオリゴヌクレオチドの設計
この実施例は、ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ１３５のアッセイ設計およびＬＯＤの定量について記載している。ｍｉＲ−１について実施例２および３に記載したように実験を実施した。オリゴヌクレオチドの設計を図５に記載する。ｍｉｒ−１３５ ｍｉＲＮＡの検出に、設計（Ａ〜Ｄ）のそれぞれで、異なるINVADERオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドを利用する。設計の全て性能を比較する温度最適化実験の結果を図１３に示す。設計Ｄで最高シグナルが示された。アッセイ設計Ｄを使用するＬＯＤ実験の結果を図１４に示す。

【0179】

図１４Ａは、表示した標的濃度のそれぞれで、４回の反復アッセイから発生した未処理数を示す。各標的濃度で得られた平均カウントを、正味シグナルおよび「０を超える倍数」（ＦＯＺ：fold-over-zero）として示す。この実験でｍｉＲ−１３５標的の検出限界は、９８，７４３分子に等しい１６４zmoleであった。図１４Ｂに各濃度で得られた平均カウントグラフを含めるが、試験した濃度範囲のほとんど全体にわたって、INVADERアッセイが直線的であったことを示す。

【0180】

Ｂ．ＧＡＰＤＨとＵ６ ＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドの設計
状況によっては、例えば、二重アッセイでは、組織特異的方式で発現する可能性がある一種もしくは複数のｍｉＲＮＡ種に加えて、一般的に一定のレベルで全細胞中に存在するＲＮＡを共検出するのが望ましいこともあり得る。従って、一般的に全細胞型に見られる２個の別個のＲＮＡ：ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｈＧＡＰＤＨ）とＵ６ ＲＮＡに対して、INVADERアッセイを設計した。

【0181】

ｈＧＡＰＤＨの場合には、二重ｍｉＲＮＡ検出アッセイで以下のオリゴヌクレオチドを使用した。INVADERオリゴヌクレオチド（配列番号４１）、プローブ（配列番号４２）、ARRESTORオリゴヌクレオチド（配列番号４３）、ＳＲＴオリゴヌクレオチド（配列番号４９）、FRETオリゴヌクレオチド（赤色素）（配列番号４８）。

【0182】

Ｕ６の場合には、「ユニバーサル」INVADERアッセイの設計に適切な領域を同定するために、Ｃ．エレガンスからマウス、シロイヌナズナ、ヒトに至る８種の異なる種のＵ６ ＲＮＡの配列アライメント。アライメントを図１２に示す。この配列を検出するために形成したオリゴヌクレオチド配列は配列番号９３〜９５である。

【0183】

配列番号４５〜４７を使用し、細胞ライセートでこれらのオリゴヌクレオチドを用いて実施した初期実験では、Ｕ６反応からのシグナルが、ｍｉＲＮＡのシグナルの前に十分飽和に達したことが実証されたが、おそらく細胞中の大量のＵ６ ＲＮＡのためと思われる。従って、プローブとINVADERオリゴヌクレオチドの濃度を希釈することによって、INVADERとプローブの最終濃度範囲が１μＭ〜１２．５ｎＭである、二重ｍｉＲＮＡ検出アッセイでの使用に、このプローブセットが適切なものになるかどうかを判定するために、滴定反応を実施した。終濃度が１２．５〜５０ｎＭであるINVADERオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−１ｄとｌｅｔ−７ａの二重ｍｉＲＮＡ検出に適切であった。ARRESTOR、ＳＲＴ、およびFRETプローブの濃度は、先の実施例に記載した。さらなる実験によって、「ユニバーサル」Ｕ６ ＲＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号９３〜９５）でＵ６ ＲＮＡを検出することは、配列番号４５〜４７で検出することに匹敵することが実証されている。

【実施例7】

【0184】

細胞ライセート中のｌｅｔ−７、ＧＡＰＤＨ、およびＵ６ ＲＮＡの検出
Ａ．細胞ライセート中のｌｅｔ７ａの検出
この実施例は、直接全細胞ＲＮＡ中、およびヒト骨肉腫細胞系、ＭＧ６３（Third Wave Technologies, Madison, WI；カタログ番号ＣＲＬ−１４２７）から得た未誘発線維芽細胞中のｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡの検出について記載している。TRIZOL（Gibco-BRL）を使用し、先に述べた通り［Chomczynskiら, Anal． Biochem． 162: 156-156 (1987)］全細胞ＲＮＡを抽出し、かつEisら, Nature Biotechnology, 19: 673-6 (2001)に記載されているように細胞ライセートを調製した。両刊行物を参照により本明細書に組み込む。

【0185】

以下のように反応を準備した。マイクロタイタープレートの好適なウェルに、細胞ライセート５μｌのアリコート、表示濃度で溶解緩衝液［Eisら, Nature Biotechnology, 19: 673-6 (2001)］に含まれている合成ｍｉＲＮＡ標的、または２０ｎｇ／μｌ ｔＲＮＡ（標的無対照用）５μｌをピペットで取り入れた。以下の試薬を含む９６反応用に一次反応基本混合物を作製した。

【表7】

【0186】

好適な標的もしくは対照を含むウェルに、一次反応基本混合物の５μｌのアリコートを加えた。プレートに鉱油（１０μｌ）を重層し、５３℃で２時間インキュベートした。一次反応完了後、以下のものの５μｌを各ウェルに加え、そのプレートを６０℃で１．５時間インキュベートした。上記の設定を使用しプレートを読み取った（実施例２を参照）。

【表8】

【0187】

全標的を四つ組でアッセイした。全ＲＮＡと細胞ライセートについてアッセイした、異なる数の細胞から得られた平均カウントを図１５にプロットした。既知量の合成ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡによるINVADERアッセイから得られた検量線を使用して、細胞当たりｌｅｔ−７ａコピー数を推定した。Eisら, Nature Biotechnology, 19: 673-6 (2001)（参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、細胞溶解前の播種手順中に、細胞ライセートを作製した細胞数を定量した。この実験では、１５６細胞から得た全ＲＮＡ抽出物で、細胞ライセートの検出限界に到達した。

【0188】

Ｂ．Ｍｇ^＋＋不存在下での溶解
代替の溶解手順を以下のように開発した。上記溶解手順を使用したとき、長鎖ｍＲＮＡ、すなわちＧＡＰＤＨの長鎖ｍＲＮＡは、推定した量では検出されないことに留意した。ライセート中のＲＮＡ抽出に及ぼすＭｇ^＋＋の影響を検査するために実験を実施した。この実施例中上記のTRIZOLを使用し調製した全細胞ＲＮＡ抽出物と、ＭｇＣｌ_２の存在もしくは非存在下で溶解している抽出物とを比較した。

【0189】

１００ｍＭ ＫＣｌを加えた１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）の溶液１００μｌに、Ｈｅｌａ細胞（７．５×１０^６細胞）を懸濁させた。アリコート１０μｌを別々のチューブに加え、以下のように調製した異なる２種の溶解緩衝液１００μｌで溶解した。

【表9】

【0190】

次いで、全チューブを８０℃で１５分間インキュベートして細胞を溶解し、次いでペレット片に遠心分離した。以下のように、様々なライセートの５μｌのアリコートをINVADER反応に加えた。

【0191】

一次INVADER反応は、ｌｅｔ−７ａについて上記した通りであった。ＰＩオリゴヌクレオチド混合物をＧＡＰＤＨ（配列番号４１〜４３）およびＵ６（５０ｎＭ終濃度で配列番号４５〜４７）用に作製した。

【表10】

【0192】

＊一次INVADER反応は、ｌｅｔ−７ａについて上記した通りであった。ＰＩオリゴヌクレオチド混合物をＧＡＰＤＨ（配列番号４１〜４３）およびＵ６（５０ｎＭ終濃度で配列番号４５〜４７）用に作製した。

【0193】

一次反応混合物を４９℃で１時間インキュベートした。次いで、以下の二次反応混合物のアリコートを加えた。

【表11】

【0194】

二次反応混合物には、実施例７Ａに示した濃度で、ＳＲＴ（ｌｅｔ−７用に配列番号２２；ＧＡＰＤＨとＵ６用に配列番号４９）標的、FRETオリゴヌクレオチド（ｌｅｔ−７用に配列番号２１；ＧＡＰＤＨとＵ６用に配列番号４８）、ARRESTOR（ｌｅｔ−７用に配列番号７、ＧＡＰＤＨ用に配列番号４３、およびＵ６用に配列番号４７）を含めた。

【0195】

二次反応を６０℃で１時間実施した。実施例２に記載したように、CYTOFLUORマイクロプレートリーダーで反応を読み取った。結果を図１６に示すが、結果からＧＡＰＤＨシグナルの存在は、溶解緩衝液にＭｇ＋＋が存在しないことに依存するが、Ｕ６ ＲＮＡシグナルは、Ｍｇ＋＋の存在にも関わらず比較的一定に保たれていることが示唆される。追加の実験によって、Ｍｇ＋＋非存在下での溶解から得たものと匹敵するレベルで、全てのＲＮＡは、全細胞ＲＮＡ中で検出可能であったことが確認された。

【実施例8】

【0196】

様々なｍｉＲＮＡを検出するための代替INVADERアッセイの設計
Ａ．ｌｅｔ−７Ａ検出用の代替設計
この実施例は、ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを検出するための代替オリゴヌクレオチドの設計の作成および試験について記載している。一連の実験では、INVADERオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドの標的特異的領域が１１ヌクレオチド長である、代替の設計セットを作製した。プローブオリゴヌクレオチドの標的特異的領域が１０ヌクレオチド長であり、INVADERオリゴヌクレオチドの標的特異的領域が１２ヌクレオチド長である、第二の設計セットを作製した。

【0197】

１．オリゴヌクレオチドの設計
ａ．１１−ｍｅｒプローブとINVADERオリゴヌクレオチドの設計
図５には、プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドの標的特異的領域が１１ヌクレオチド長である、ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを検出するための代替オリゴヌクレオチドの設計セットを示す。配列番号５０〜５１に、INVADERオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドが直線的である設計を示す。配列番号６は、ステムループ構造を形成するプローブオリゴヌクレオチドを含み、配列番号５は、ステムループ構造を形成するINVADERオリゴヌクレオチドを含み、配列番号５〜６は、ステムループを有する、プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドを含む。

【0198】

ｂ．１０−ｍｅｒプローブおよび１２−ｍｅｒ INVADERオリゴヌクレオチドの設計
図５には、プローブの標的特異的領域が１０ヌクレオチドを含み、INVADERオリゴヌクレオチドの標的特異的領域が１２ヌクレオチドを含む、ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを検出するための代替オリゴヌクレオチドの設計セットを示す。配列番号５２〜５３に、INVADERオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドが直線的である設計を示す。配列番号２は、ステムループ構造を形成するプローブオリゴヌクレオチドを含み、配列番号１はステムループ構造を形成するINVADERオリゴヌクレオチドを含む。

【0199】

２．ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを検出するための代替オリゴヌクレオチド設計の温度最適化プロフィール
以下のように温度最適化実験を実施した。２４反応用に基本混合物を作製した。各反応に以下のものを含めた。

【表12】

【0200】

図１６〜１７に示すように、この実験では、プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドの様々な組合せを使用した。

【0201】

二次反応混合物は、ｌｅｔ−７について実施例３に記載した通りであった。適宜、ループ全体と、プローブの標的特異的領域と、およびプローブの５’末端に向って伸長する６塩基とに相補するARRESTOR配列を作製した。

【0202】

１１−ｍｅｒ温度最適化実験の場合には、実施例２に記載したように、５０℃±９℃で１時間一次反応を実施し、続いて６０℃で１５分間の二次反応を実施した。１０−ｍｅｒプローブに関して、１２−ｍｅｒ INVADERオリゴを用いて、５０℃±９℃で１５分間一次反応を実施し、続いて二次反応を６０℃にて１５分間実施した。

【0203】

INVADERオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドの標的特異的部分が１１ヌクレオチド長である設計の結果を図１８に示す。図１８Ａは、各設計の温度最適化プロフィールを示す。図１８Ｂは、それぞれの最適温度を含む各設計の規準化した最高性能を示す。プローブオリゴヌクレオチドの標的特異的部分が１０塩基であり、INVADERオリゴヌクレオチドの標的特異的部分が１２塩基である設計の結果を図１９に示す。図１９Ａは、温度最適化プロフィールを示し、図１９Ｂは、各設計の規準化した最高性能を示す。

【0204】

これらの結果を検証すると、どの設計が最高性能をもたらすかは、反応条件と、形成されたｍｉＲＮＡ−オリゴヌクレオチドハイブリッドの相対的安定性に応じて変化することが示唆される。例えば、両オリゴヌクレオチドの標的特異的領域が１１塩基長である場合、プローブの標的特異的領域のＴｍは４９℃であり、INVADERのＴｍは３７℃であると予想される。この場合、INVADERオリゴヌクレオチド−ｍｉＲＮＡの相互作用を安定化させることによって、この設計でアッセイ性能が向上する。しかし、プローブが１０−ｍｅｒであり、INVADERオリゴヌクレオチドが１２−ｍｅｒであるｌｅｔ−７ａ設計では、２個のオリゴヌクレオチドの標的特異的領域のＴｍはおよそ同等である。この場合は、両オリゴヌクレオチドがループを形成している設計が最も優れた働きをする。

【0205】

３．２個の代替設計を使用するｌｅｔ−７ａのＬＯＤ
実施例３に記載したように、INVADERオリゴヌクレオチドがステムループ構造を形成する、二重ループ設計と単一ループ設計のＬＯＤを比較するために実験を準備した。

【0206】

ＬＯＤを定量する反応は四つ組で実施した。反応混合物には以下の試薬（終濃度）を含めた。

【表13】

【0207】

図２０に示す終濃度の反応混合物を含むウェルに、ｍｉＲＮＡの５μｌのアリコートを加えた。実施例８Ｂで決定したように設計した各々について、一次反応を最適温度で１．５時間実施した（ループを形成したINVADERオリゴヌクレオチドの設計には５０℃、二重ループの設計には５３℃）。実施例２および３に記載したように二次反応を準備し、６０℃で１時間行なった。

【0208】

図２０の結果は、ｍｉＲＮＡのモル関数として発生した正味シグナルを示している。プロットの直線範囲は、二重ループ設計からよりも、INVADERループ設計を使用する所与量のｍｉＲＮＡから、より多くのシグナルが発生したことを示している。同様に、図２０の表の検証から、各ｍｉＲＮＡレベルのfold-over-zero値は単一ループ設計の方が高いことが分る。両設計によって、試験した最低濃度で、約１６，０００分子に等しい２．６８×１０^−２０モル、すなわち２６．８ゼプトモルで十分なＦＯＺが得られた。

【0209】

４．全長対短縮ARRESTORオリゴヌクレオチド
例えば、図４および１２に示すように、全長ARRESTOR分子の相対的性能を評価するために実験を行ったが、その際、ARRESTOR分子は、プローブのｍｉＲＮＡ特異的領域の長さ全体と、５’フラップ領域中に、ループ周囲のその５’末端を伸長し、それに対して短縮ARRESTOR分子は、プローブのｍｉＲＮＡ特異的領域と５’フラップの一部にのみ相補的であるが、ループ領域中に、またはそれを超えて伸長することはない。合成ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを検出するために、以下のように反応を準備した。

【表14】

【0210】

マイクロタイタープレートの好適なウェルに、一次反応混合物の６μｌのアリコートを加え、続いて下表に示した終濃度で合成ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡの４μｌのアリコートまたはｄＨ_２Ｏ中１０ｎｇ／μｌ ｔＲＮＡを４μｌ加えた。一次INVADER反応を５３℃で１．５時間インキュベートした。

【0211】

以下のように、二次反応混合物のアリコートを加えた。

【表15】

【0212】

二次反応を６０℃で１．５時間インキュベートした。実施例２に記載したように、マイクロタイタープレートを読み取った。結果を図１７に示した。

【0213】

これらの結果は、二次INVADER反応に、プローブのｍｉＲＮＡ特異的部分に相補的な、全長もしくは短縮ARRESTORオリゴヌクレオチドを使用した場合、シグナルの発生または検出限界に著しい差異はないことを示している。

【0214】

Ｂ．直鎖プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドを使用する代替設計
プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドが、ユニバーサル配列を含み、どちらのオリゴヌクレオチドもヘアピンを形成しない代替設計を試験した。設計図を図４に示す。ユニバーサル配列は、INVADERオリゴヌクレオチドの５’末端、およびプローブオリゴの３’末端に存在する。短い相補的「捕捉」オリゴヌクレオチドを付加し、２’−Ｏ−メチル残基を含めると、ｍｉＲＮＡ（例えば配列番号６０）の存在下で、同軸性の積層が促進されるようになる。ｍｉＲ−１５（配列番号５８〜５９および６１）およびｍｉｒ−１３５（配列番号６３〜６５）用に設計を作成する。ｍｉＲＮＡ標的の非存在下では、非特異的バックグラウンドシグナルは高くなるが、それにもかかわらず初期設計は、そのようなユニバーサル捕捉オリゴヌクレオチドで、ｍｉＲＮＡを検出することも可能であることを示唆している。

【実施例9】

【0215】

ループ中のヌクレオチド残基の２’−Ｏ−メチル化の効果
この実施例は、ｍｉＲＮＡを検出するのに使用するプローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチド中に組み込まれた２’−Ｏ−メチル残基の一部もしくは全てに、２’−デオキシ残基を置換する効果を評価することを目標とした実験について記載している。実施例２に記載したように、前記実施例に示した設計の全ては、ループ領域に２’−Ｏ−メチル残基を含む。ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを検出するように設計したINVADERオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチド中の２’−Ｏ−メチル残基の一部もしくは全てに、２’デオキシ残基を置換する効果を試験するために実験を行った。

【0216】

図５は、改変したｌｅｔ−７ａ設計を示す。実施例２に記載したように、配列番号５〜６は２’−Ｏ−メチル残基を含む。配列番号７３〜７４の設計は、全ての位置に２’デオキシ残基を含み、配列番号７５〜７６の設計は、標的に隣接するステム部分に２’−Ｏ−メチル残基を含む。

【0217】

異なる３個の設計のシグナルの発生と温度最適条件を比較するために、INVADER反応を準備した。反応は、実施例８のＬＯＤ実験に記載した通りであり、１００ｐＭ合成ｍｉＲＮＡ、１μＭプローブ、および１０μＭ INVADERオリゴヌクレオチドを含めた。一次反応を示した温度で１５分間実施し、二次反応を６０℃で５分間実施した。

【0218】

INVADERアッセイの結果を図２１に示すが、ステムループ構造が２’−Ｏ−メチル残基を含む設計が最もシグナルを発生し、標的に隣接する塩基が２’−Ｏ−メチル残基を含む設計がそれに続くことが示唆される。２’−デオキシ残基を全体的に含むオリゴヌクレオチドが、最低レベルのシグナルを発生した。

【0219】

以下のように追加の設計変化を試験するために、さらなる実験セットを設計した。短いヘアピンを有する、プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチド；より安定したループもしくは別法として短いループを有する、プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチド；あるいは３個の２’−Ｏ−メチル残基のみを有する、プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチド。ｍｉＲ−１５の検出を試験するために、以下のように一次反応を準備した。

【0220】

以下のプローブ／INVADERオリゴヌクレオチドの組合せを試験した。

【表16】

【0221】

以下のように、一次反応混合物を作製した。

【表17】

【0222】

合成ｍｉＲ−１５ＲＮＡ５μｌに以下の最終量：０、０．１amole、０．３３amole、１．０９amoleで、一次反応混合物の５μｌのアリコートを加えた。一次反応を５２．５℃で２時間インキュベートした。

【0223】

以下のように、二次反応混合物を作製した。

【表18】

【0224】

５μｌのアリコートを加え、反応を６０℃で４５分間インキュベートした。相対的蛍光単位（ＲＦＵ）の結果を以下に示す。

【表19】

【0225】

これらの結果から、プローブオリゴヌクレオチドが短縮したヘアピンを含み、かつ高度に安定したテトラループが、元のINVADERオリゴヌクレオチド設計と組み合せて２’−Ｏ−メチル残基を含む設計（２’−Ｏ−メチル残基、ＴＴＴＴループ、長いヘアピン）が、多少高めのＦＯＺ値を生成しうることが示唆される。他の方法では、代替設計オリゴヌクレオチドセットのどれも、元の設計にいかなる改善ももたらさなかった。全ＤＮＡ （all-DNA）INVADERオリゴヌクレオチドと、元のキメラプローブオリゴヌクレオチドとの組合せによって、キメラプローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドで得られたＦＯＺ値と、ほぼ等しいＦＯＺ値が得られたことは注目に値する。いくつかの適用例では、オリゴヌクレオチド合成費用の削減に、全ＤＮＡINVADERオリゴヌクレオチドを置換するのが望ましく、検出限界を犠牲にすることなく実施できよう。

【0226】

さらなる実験から、より多くのＲＮＡ（例えば、ライセート、精製全ＲＮＡ、合成ｍｉＲＮＡ）を反応に加えることによって、特定のオリゴヌクレオチドセットによる準最適シグナルの発生を補償できることが実証された。同様に、実施例１に記載したように、様々なオリゴヌクレオチド（すなわちプローブ、INVADER、ARRESTOR、または様々なそれらの組合せ）をゲル精製した追加の実験から、全３種のオリゴヌクレオチドを標準的ゲル精製にかけると、最大のシグナルが得られることが示唆された。その他のオリゴヌクレオチド、すなわちINVADERおよびARRESTORオリゴヌクレオチドを脱塩後合成した場合、ゲル精製したプローブでの最高レベルにほぼ等しいシグナルレベルを実現することができる。

【実施例10】

【0227】

複数の組織種由来の全ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ発現の検出
多様な組織種から抽出した全ＲＮＡ中の異なるｍｉＲＮＡ種を検出するために、この実施例は、INVADERアッセイの適合性を試験するために行なった実験について記載する。組織特異的遺伝子発現を評価するために、それぞれの設計について温度最適条件とＬＯＤをまず決定した。

【0228】

１．INVADERオリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドの設計
ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−１２５ｂ ｍｉＲＮＡ種を検出するために、INVADERアッセイオリゴヌクレオチドを設計した。これらのアッセイの設計を図５に示す。ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−１３５の設計を、それぞれ実施例２および６に記載する。

【0229】

２．温度最適条件およびＬＯＤの決定
実施例８に記載したように、これらのオリゴヌクレオチドセットのそれぞれについて、温度最適化実験を行った。各一次反応に１ｎＭの標的とするｍｉＲＮＡを含め、５０℃±９℃の範囲の温度で１５分間実施した。二次反応は、実施例２に記載した通りであり、６０℃で１〜１．５時間実施した。最適温度は、以下の通りであった。

【表20】

【0230】

一度温度最適条件が得られたならば、実施例８に記載したように各ｍｉＲＮＡ種についてＬＯＤを定量した。全ＬＯＤは≦３０ゼプトモルであった。

【0231】

３．遺伝子発現プロファイリング
異なる２０組織種から抽出した全ＲＮＡで、遺伝子発現プロファイリングを実施した。全ＲＮＡをClontech（Palo Alto、CA、カタログ番号K4008-1、Human Total RNA Master Panel II）から購入した。Ｌｅｔ−７ａについては、各反応で全ＲＮＡ５０ｎｇを試験し、その他のｍｉＲＮＡ種については、全ＲＮＡ１００ｎｇを試験した。実施例８に記載したように全反応を準備し、一次反応を温度最適条件で１．５時間実施し、二次反応は上記の通りであった。各ｍｉＲＮＡ種についての遺伝子発現プロファイルを図２３に示す。これらの結果は、異なる組織種中のｍｉＲＮＡの発現を検査するのに、INVADERアッセイを使用できることを示している。これらのデータから、さらに、ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−１２５ｂが多様な組織で発現することが示唆され、その他のｍｉＲＮＡ種は、限られた数の組織種により特異的であるように見える。

【実施例11】

【0232】

ｍｉＲＮＡのINVADERアッセイ検出に及ぼす、可変オリゴヌクレオチド長の影響
この実施例は、ｌｅｔ−７ａ ２２−ｎｔ ｍｉＲＮＡの検出に及ぼす、プローブとINVADERオリゴヌクレオチドの長さの変化の影響について記載する。特に、これらの実験では、プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドの端部間に、完全積層相互作用を形成するｍｉＲＮＡ検出と、５’および３’重複を形成するｍｉＲＮＡ検出と、さらに両５’および３’末端に１個のヌクレオチドギャップをもたらすｍｉＲＮＡ検出を比較する。

【0233】

図２４は、異なる３つの型の設計の分析の結果を示す。配列番号５〜６は、２２−ｎｔ標的と、ループを形成したプローブオリゴヌクレオチドおよびINVADERオリゴヌクレオチドのフランキング端間の完全積層体を示す。配列番号８３〜８４では、両プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドが、１個の塩基によって伸長され、結果として５’および３’重複がもたらされる。配列番号８５〜８６では、両プローブオリゴヌクレオチドとINVADERオリゴヌクレオチドが、配列番号５〜６の設計に比べて１個の塩基によって短縮され、結果として両端に１個のヌクレオチドギャップがもたらされる。

【0234】

これらのオリゴヌクレオチドセットが、合成ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを検出する性能を試験するために、INVADERアッセイを準備した。実施例８に記載したように反応を実施し、１００ｐＭ合成ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ、１μＭプローブ、および１０μＭ INVADERオリゴヌクレオチドを含めた。実施例２に記載したように、一次反応を５３℃で１５分間実施し、二次反応を６０℃で５分間実施した。結果を図２４示す。

【0235】

これらのデータから、この実験では、ｍｉＲＮＡ標的の両端の単一ヌクレオチドの重複が、シグナルの発生を約３０％減少させ、同様に最適温度を２℃低下させることが示唆される。しかし、標的の両端の１個のヌクレオチドギャップは、最適反応温度を５℃低下させたが、シグナル発生は減少しなかった。

【実施例12】

【0236】

前駆体ＲＮＡ由来ｍｉＲＮＡとコードＤＮＡ由来ｍｉＲＮＡの判別
INVADERｍｉＲＮＡアッセイが、ｍｉＲＮＡ標的自体と、その前駆体ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡとを区別するかどうかを判定するために実験を実施した。

【0237】

Ａ．前駆体交差反応試験
ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを模倣する可能性がある任意のフラグメントを含むかどうか判定するために、前駆体ｌｅｔ−７ ＲＮＡ（配列番号８７）をインビトロ転写し、キャピラリー電気泳動によって分析した。最短混入フラグメントは約４５ｎｔであろうと推定された。実質的に実施例３に記載したように、下表に示す前駆体または合成５’Ｐ ｌｅｔ−７ａ ｍｉ−ＲＮＡの濃度で、ＬＯＤ反応を実施した。ＰＩ混合物には、１０μＭプローブ（配列番号６）および１００μＭ INVADERオリゴヌクレオチド（配列番号５）を含めた。実質的に実施例３に記載したように、一次反応を５３℃で１時間実施し、二次反応を二次反応混合物により５８℃で１時間実施した（FRETプローブ配列番号２１、ＳＲＴ配列番号２２、およびARRESTOR配列番号７）。この実験の結果からこのｍｉＲＮＡアッセイは、前駆体ＲＮＡに対して約４％交差反応性であることが示唆された。

【0238】

Ｂ．ＲＮＡ対ＤＮＡシグナルの判別
細胞ライセート中のｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡを検出するために、実施例７に記載したように反応を実施した。INVADERアッセイで検出する前に、細胞ライセート８０μｌに、８μｇ／μｌ RNAse A（Qiagen, Inc．）のアリコート１μｌを加え、３７℃で２．２５時間インキュベートした。RNAse A処理した試料は、バックグラウンドより高いシグナルを発生させることができず、RNAse A不含アッセイで発生したシグナルは、ｍｉＲＮＡ標的の検出から生じたものであり、コードＤＮＡからのシグナルではないことが示唆された（図１６）。さらに、一次反応前にまたは二次反応前にRNAse Aを加える実験を実施した。一次反応前にRNAse Aを加えたとき、前の結果に一致してシグナルは発生しなかった。一次反応後にRNAse Aを加えたとき、シグナルの損失は観察されず、検出するシグナルはＲＮＡによるもので、CLEAVASE酵素など、他の反応成分に与えるRNAseの有害作用はないことがさらに示唆された。

【実施例13】

【0239】

二重形態ｍｉＲＮＡの検出
ｍｉＲ−１２４ａ用にオリゴヌクレオチドの設計を作成した。１つは２１ｎｔ長であり、他方は２２ｎｔ長である、２個の自然発生ｍｉＲＮＡを検出するために、これらのオリゴヌクレオチドを使用することができる。

【0240】

実質的に実施例３に記載したように、１ｎＭの合成ｍｉＲＮＡ標的、２５分間の一次反応および１５分間の二次反応を使用し、温度最適化反応を準備した。これらの反応に使用するオリゴヌクレオチドの一覧を図５に示す（配列番号９０〜９２）。２本の長さが異なるｍｉＲＮＡ標的の温度プロフィールを図２２に示すが、両標的を検出するために、同じオリゴヌクレオチドの設計を使用できることが示唆される。

【実施例14】

【0241】

ｓｉＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの設計
ｓｉＲＮＡを検出するために、前記実施例に記載の手法に類似する手法を同様に使用してよい。図２５には、β−アクチンｓｉＲＮＡを検出するために、２個の代替INVADERアッセイの設計を例示する。このｓｉＲＮＡはHarborth, J.ら, Journal of Cell Science, 114: 4557-4565 (2001)に記載されている。各センス鎖およびアンチセンス鎖に対して一設計が存在し、このｓｉＲＮＡを検出する例示的なオリゴヌクレオチドの一覧を図２６の配列番号１０１〜１０６に示す。

【実施例15】

【0242】

ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ検出の動的範囲を拡大するための最適化
ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ INVADERアッセイ検出の動的範囲を拡大する試みでは、同じｌｅｔ−７ａハイブリダイズ領域を有するが、５’−フラップ「アーム」配列が異なる２個のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。異なる５’−フラップまたはアームは、切断されるとFAMシグナルを発生するように設計されたFRETカセットに行く。オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであった（「Ｚ２８」は、ECLIPSEクエンチャー、Nanogen, Inc., San Diego, CAをさす）。

【表21】

【0243】

また、当該配列を図２６に示す。試験した反応条件は、以下の通りであった。

【表22】

【0244】

合計９種のプローブ濃度条件について、一次Ｌｅｔ−７ａ INVADER反応は１０μＬ反応で設定した。試験した９種のプローブ濃度条件は：（ｉ）１μＭ プローブ１５４４−８２−０１、（ｉｉ）１μＭ プローブ２３４３−２５−０１、（ｉｉｉ）１μＭ １５４４−８２−０１プローブおよび２３４３−２５−０１プローブ、（ｉｖ）１００ｎＭ プローブ２３４３−２５−０１、（ｖ）１μＭ プローブ１５４４−８２−０１および１００ｎＭ ２３４３−２５−０１、（ｖｉ）１０ｎＭ ２３４３−２５−０１、（ｖｉｉ）１μＭ １５４４−８２−０１および１０ｎＭ ２３４３−２５−０１、（ｖｉｉ）４ｎＭ ２３４３−２５−０１、および（ｉｘ）１μＭ １５４４−８２−０１および４ｎＭ ２３４３−２５−０１であった。これらのプローブオリゴ濃度に加えて、反応には１μＭ INVADERオリゴ１４９６−７８−０２、３０ｎｇ CLEAVASE XII酵素、および１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ Tween 20、０．０５％ Nonidet P40、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４、および２％ ＰＥＧを含めた。

【0245】

各プローブ濃度条件には、一反応につき、終濃度が６×１０^９、６×１０^８、６×１０^７、６×１０^６、６×１０^５、６×１０^４、６×１０^３、および０コピーの反応混合物に、Ｌｅｔ−７ａ合成ＲＮＡを加えた。Rnase不含水で希釈した２０ｎｇ／μｌ ｔＲＮＡ溶液で、Ｌｅｔ−７ａ ＲＮＡを希釈した。９６穴プレートで反応を組み立て、透明鉱油１０μｌを各ウェルに加えて蒸発を防いだ。次いで、プレートをサーマルブロックに移し、４９℃で９０分間インキュベートした。

【0246】

インキュベーション完了後、０．３μＭ 二次反応鋳型１１０７−１０−０２と２３４３−２３−０１；８μＭ ARRESTORオリゴヌクレオチド１５８１−６３−０１と２３４３−２５−０２；および２μＭ FRETプローブ２３−１８２と２３４３−２３−０１を含む二次反応混合物５μＬを加え、反応プレートを６０℃で９０分間インキュベートした。反応の完了後、そのプレートを蛍光プレートリーダー（Cytofluor）に移送し、取得設定（gain setting）４３で励起波長と発光波長は、それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍを使用し、その蛍光を読取ることによってデータを得た。

【0247】

生成された未処理および処理データは、以下の通りであった。

【0248】

１−未処理データ

【表23】

【0249】

２−処理データ

【表24】

【0250】

そして図２７に示す。

【0251】

結果から、１５４４−８２−０１プローブと２３４３−２５−０１プローブを、それぞれ、１ｍＭと１０ｎＭで混合し（混合ｖｉｉ）、１ｍＭと４ｎＭで混合した混合（ｉｘ）とき、動的範囲＞６ｌｏｇが得られることが判明している。

【実施例16】

【0252】

Ｕ６ ＲＮＡ検出の動的範囲を拡大する最適化
INVADERアッセイを使用する、Ｕ６ ＲＮＡ検出の動的範囲を拡大する試みでは、同じＵ６ ＲＮＡハイブリダイズ領域を有するが、５’−フラップ「アーム」配列が異なる２個のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。異なる５’−フラップまたはアームは、切断されると、REDシグナルを発生させるように設計されたFRETカセットに行く。オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであった（RED色素は、REDMOND RED、Nanogen Inc, San Diego, CAをさす）。

【表25】

【0253】

そして図２８に示す。

【0254】

反応条件は、以下の通りであった。

【0255】

試薬：

【表26】

【0256】

一次INVADER反応は、プローブ濃度で、１μＭ １７９６−５３−０１；４ｎＭ プローブ２３４３−３０−０１；または１μＭおよび４ｎＭの１７９６−５３−０１および２３４３−３０−０１をそれぞれ含む１０μＬ容量で設定した。さらに、これらの反応に、１μＭ INVADERオリゴ１７９６−５３−０２、３０ｎｇ CLEAVASE XII酵素、および１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ Tween 20、０．０５％ Nonidet P40、２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、および２％ ＰＥＧを含めた。

【0257】

各プローブ濃度条件には、一反応につき終濃度が１０２×１０^９、１０２×１０^８、１０２×１０^７、１０２×１０^６、１０２×１０^５、１０２×１０^４、１０２×１０^３、１０，２００、５，１００、２，５５０、および０コピーの反応混合物に、Ｕ６合成ＲＮＡを加えた。Rnase不含水で希釈した２０ｎｇ／μｌ ｔＲＮＡの溶液で、Ｕ６合成ＲＮＡを希釈した。９６穴プレートで反応を組み立て、透明鉱油１０μｌを各ウェルに加えて蒸発を防いだ。次いで、プレートをサーマルブロックに移し、５０℃で９０分間インキュベートした。

【0258】

インキュベーション完了後、０．３μＭ 二次反応鋳型２３−１８３と２３４３−３０−０２；７．５μＭ ARRESTORオリゴヌクレオチド１７９６−５３−０３と２３４３−３０−０４；および１．５μＭ FRETプローブ２３−１８１と２３４３−３０−０２を含む、二次反応混合物５μＬを加え、次いで反応プレートを６０℃で９０分間インキュベートした。反応の完了後、そのプレートを蛍光プレートリーダー（Cytofluor）に移し、取得設定４５で励起波長と発光波長は、それぞれ５６０ｎｍおよび６２０ｎｍを使用し、その蛍光を読取ることによってデータを得た。

【0259】

生成されたデータは、以下の通りであった。

【表27】

【0260】

そして、コピー数対正味シグナルプロットとして図２９に示す。

【0261】

結果から、１７９６−５３−０１プローブと２３４３−３０−０１プローブを、それぞれ１μＭと４ｎＭ混合で混合したとき、動的範囲＞６ｌｏｇが得られることが判明している。

【実施例17】

【0262】

単独反応槽で、Ｌｅｔ−７ａおよびＵ６検出の動的範囲を拡大する最適化
二重INVADERアッセイでの、ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡおよびＵ６ ＲＮＡ検出の動的範囲を拡大する試みでは、数個のパラメーターを試験し評価した。

【0263】

プローブ濃度で１μＭ １７９６−５３−０１；１μＭ １５４４−８２−０１；４ｎＭ ２３４３−３０−０１；４ｎＭ ２３４３−２５−０１；１μＭ INVADERオリゴ１７９６−５３−０２と１４９６−７８−０２；３０ｎｇ CLEAVASE XII酵素；および１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ Tween 20、０．０５％ Nonidet P40、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４、および２％ ＰＥＧを含む１０μＬ容量で、一次INVADER反応を設定した。

【0264】

Ｕ６ ＲＮＡおよびＬｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ濃度が、一反応につき６×１０^９、１．２×１０^９、２．４×１０^８，４．８×１０^７、９．６×１０^６、１．９２×１０^６、３８４，０００、７６，８００、１５，３６０、３，０７２、および０コピーで二つ組反応を設定した。９６穴プレートで反応を組み立て、透明鉱油１０μｌを各ウェルに加えて蒸発を防いだ。次いで、プレートをサーマルブロックに移し、４９℃で９０分間インキュベートした。

【0265】

インキュベーション完了後、０．３μＭの二次反応鋳型１１０７−１０−０２と、２３４３−３０−０２と、２３−１８３と、２３４３−３０−０３；７．５μＭ ARRESTOR１７９６−５３−０３と１５８１−６３−０１；および３０ｎＭ ARRESTOR２３４３−３０−０４と２３４３−２５−０２；１．５μＭ FRETプローブ２３−１８１と、２３４３−３０−０２と、２３−１８２と、２３４３−２３−０１を含む二次反応混合物５μＬを加えた。次いで、反応プレートを６０℃で９０分間インキュベートした。反応の完了後、そのプレートを蛍光プレートリーダー（Cytofluor）に移し、RED色素用に取得設定４５で励起波長と発光波長はそれぞれ５６０ｎｍおよび６２０ｎｍを使用し、そしてFAM色素用に取得設定４３で励起波長と発光波長はそれぞれ４８５ｎｍおよび５３０ｎｍを使用し、その蛍光を読取ることによってデータを得た。

【0266】

生成されたデータは、以下の通りであった。

【表28】

【0267】

そして、コピー数対正味シグナルプロットとして図３０に示す。

【0268】

結果から、二重Ｕ６およびＬｅｔ−７ａ検出用に、動的範囲＞６ｌｏｇが得られることが判明している。

【実施例18】

【0269】

癌に付随し、癌を予後するｍｉＲＮＡを検出するための組成
ｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失および下方調節は、癌に関連付けられてきた［Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）など］［例えばCalinら, Proc Natl Acad Sci USA, 99, 15524-15529 (2002)を参照されたい］。従って、癌に伴うｍｉＲＮＡを検出し特徴付けるために、本明細書では様々なオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドを図３１［図中、ｍ＝２’−Ｏ−メチル；ｒ＝リボース（ＤＮＡの代わりにＲＮＡを示すため）］に記載する。

【実施例19】

【0270】

逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応を含むアッセイを使用するｍｉＲＮＡ検出
逆転写（ＲＴ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および侵入的切断反応アッセイ［例えば、二段階または一段階反応（例えば単一チューブ）］を使用し、ｍｉＲＮＡを検出し特徴付けるための実験を行った。これらのアッセイに使用される化学（例えば、一段階ＲＴ、ＰＣＲおよび侵入的切断反応）は、例えば、米国特許第６，９１３，８８１号、米国特許第６，８７５，５７２号、米国特許第６，８７２，８１６号、および米国特許第７，０１１，９４４号、および２００５年１１月３日出願米国特許出願第１１／２６６，７２３号に記載されており、その各々をこれによりその全体を参照により組み込む。この方法を使用するｍｉＲＮＡを検出するための一般的設計を図３２に示す。手短に言えば、逆転写（ＲＴ）プライマーオリゴヌクレオチド（好ましい実施形態では、侵入的切断反応アッセイで、INVADERオリゴヌクレオチドとしても役立つ）および逆転写酵素を、標的ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）を（ｃＤＮＡに）逆転写するために使用し、続いて（例えば二段階アッセイで）または同時に［例えば一段階アッセイ（単一チューブなど）で］、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼを使用して、一次プローブの存在下で、ｃＤＮＡ生成物を増幅し、それによって（例えば、侵入的切断反応アッセイによって検出することができる）検出構造が形成されるようにする。

【0271】

本発明を開発中、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応を含むアッセイを使用し、ｍｉＲＮＡ検出能力および感度を最適化するために、複数の要因を検査し特徴付けた。これらには、（例えばオリゴヌクレオチドの設計による）形成されるＲＴプライマー／ｍｉＲＮＡ二重鎖の長さ［例えば４〜０（６〜７など）塩基対］；検出用試料で利用可能なｍｉＲＮＡコピー数；（例えばオリゴヌクレオチドの設計による）形成されるＰＣＲ前進プライマー／ｍｉＲＮＡ二重鎖の長さ［例えば４〜１０（７〜９など）塩基対］；使用するオリゴヌクレオチドの濃度；アッセイを実施できる反応温度；スタッカーオリゴヌクレオチドの影響（例えば、ＲＴプライマー／INVADERオリゴもしくはＰＣＲプライマーに結合するオリゴヌクレオチド）；ヘアピン構造を形成するオリゴヌクレオチドの使用；一段階もしくは二段階アッセイ構成の使用；INVADER一次プローブの長さ（例えば８〜１０）塩基対の影響；単一ｍｉＲＮＡ種の変異体（突然変異体など）相互間を区別するアッセイの能力；および１回の反応で一個を超えるｍｉＲＮＡを検出するアッセイの能力（二重アッセイなど）が含まれる。

【0272】

Ａ）ＲＴ−プライマー／ｍｉＲＮＡ二重鎖の長さ
様々な長さのＲＴ−プライマー／ｍｉＲＮＡ二重鎖を試験し特徴付けた。ｍｉＲＮＡを検出する能力を備えた、ＲＴプライマー−ｍｉＲＮＡ二重鎖の長さの影響を試験するために、ＲＴプライマーとｍｉＲＮＡ間に、６もしくは７塩基対の二重鎖が形成されるように、ＲＴプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを設計した。一反応につき、様々なレベルのｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡ分子（例えば、３００，０００、５０，０００、８，３３３、１，３８９、２３１、３９、および０）を使用し、これらのプライマーを三つ組で性能試験した。１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２５μＭ ｄＮＴＰを含む緩衝液中に、０．５μＭ 前進ＰＣＲプライマー２３４３−１６−０１；０．０３４単位／μＬ 未変性Taqポリメラーゼ；２単位／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素；および６．６７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素を含む、２５μＬ容量で反応を実施した。６塩基対二重鎖の長さについては、０．５μＭ ＲＴプライマー２３４３−１４−０１；０．５μＭプローブ２３４３−１４−０５；０．２５μＭ FRETプローブ２３−２１１を反応混合物に加えた。７塩基対二重鎖の長さについては、０．５μＭ ＲＴプライマー２３４３−０３−０１；０．５μＭ プローブ２３４３−１４−０８；０．２５μＭ FRETプローブ２３−７５５を反応混合物に加えた。鉱油１０μＬで覆った９６穴スカートプレートで反応を組み立てた。次いで、プレートを、４２℃で３０分間の単一ステップ、続いて９５℃で２分間、および９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で４５秒間の３０サイクルにかけた。サイクルの完了後、反応プレートを９９℃で１０分間加熱し、次いで５０℃で１５分間冷却し、次いで取得設定４５で励起波長と発光波長それぞれ５６０ｎｍおよび６２０ｎｍを使用し、Cytofluorプレートリーダーで読み取った。

【0273】

ｍｉＲＮＡ標的を備えた７塩基対二重鎖が得られるように構成した、ＲＴオリゴヌクレオチドプライマーを使用し生成されたデータは、以下の通りであった。

【表29】

【0274】

ｍｉＲＮＡ標的を備えた６塩基対二重鎖が得られるように構成した、ＲＴオリゴヌクレオチドプライマーを使用し生成されたデータは、以下の通りであった。

【表30】

【0275】

従って、本発明は、一反応につき同じコピー数のｌｅｔ−７ａを比較したとき、短い二重鎖の検出に十分なシグナルレベルを提供するが、正味シグナルは、６塩基対ＲＴプライマー−ｍｉＲＮＡ二重鎖よりも、７塩基対ＲＴプライマー−ｍｉＲＮＡ二重鎖の方が高いということを示す。従って、いくつかの実施形態では、ＲＴプライマー／INVADERオリゴヌクレオチドとｍｉＲＮＡ標的との間が短い（例えば、１０ヌクレオチド未満；８ヌクレオチド未満；または７ヌクレオチド未満）相同性領域を有するオリゴヌクレオチドを使用する場合でも、本発明のアッセイ（例えば、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応、ならびに検出構造を含む）は、ｍｉＲＮＡ標的を検出することができる。いくつかの実施形態では、ＲＴプライマー／INVADERオリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡと（例えば相補的ではない）二重鎖を形成しない他の配列を含む。いくつかの実施形態では、二重鎖を形成しないその他の配列は、ヘアピン構造（例えば、標的ＲＮＡと二重鎖を形成しない配列内の配列は、折り畳まれ、それ自体と結合することができる）を形成する。

【0276】

従って、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドとｍｉＲＮＡ標的の間に、６塩基対二重鎖が形成されるように、ＲＴプライマー／INVADERオリゴヌクレオチドを設計する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドとｍｉＲＮＡ標的の間に、７塩基対二重鎖が形成されるように、ＲＴプライマーオリゴヌクレオチドを設計する。その機序を理解することは、本発明を実施する上で必ずしも必要でなく、本発明は、任意の特定の作用機序に限定されないが、ＲＴプライマーとｍｉＲＮＡ標的の間の二重鎖形成の長さが増加すると、（例えば、さらに、図３２に記載した一次INVADERオリゴヌクレオチドとして、ＲＴプライマーオリゴヌクレオチドを使用する場合）検出構造がより容易に形成できるようになり、次いで短い二重鎖と比較して正味シグナルがより高くなる。

【0277】

Ｂ）低レベルｍｉＲＮＡの検出
一反応につき３×１０^６〜２コピーの範囲の、様々なレベルのｍｉＲ−１６ ｍｉＲＮＡを使用した検出レベル範囲を定量する実験を、２５μＬ反応容量を使用し試験した。１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２５μＭ ｄＮＴＰを含む緩衝液中に、０．５μＭ プライマー２３４３−０３−０５および２３４３−０３−０６；０．６７μＭ プローブ２３４３−０３−０７；０．２５μＭ FRETプローブ２３−２１０；０．０３４単位／μＬ未変性Taqポリメラーゼ；２単位／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素；および６．６７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素を含む反応を設定した。９６穴スカートプレートで反応を組み立て、鉱油１０μＬで覆った。次いで、プレートを４２℃で４５分間の単一ステップ、続いて９５℃で２分間、および９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の３０サイクルにかけた。サイクルの完了後、反応プレートを９９℃で１０分間加熱し、次いで５０℃で３０分間冷却し、次いで取得設定４３で励起波長と発光波長それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍを使用し、Cytofluorプレートリーダーで読み取った。

【0278】

生成されたデータは、以下の通りであった。

【表31】

【0279】

従って、本発明の組成および方法［例えば、（一段階もしくは二段階アッセイなど）、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応を含むアッセイならびに検出構造を使用する］を使用すると、コピー数が約３８〜１９２コピー程度と少ないｍｉＲＮＡ種を測定することができる。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、低コピー数（例えば、５００コピー未満、４００コピー未満、３００コピー未満、２００コピー未満、１００コピー未満、５０コピー未満）で存在する、ｍｉＲＮＡを検出し特徴付ける組成および方法を提供する。その機序を理解することは、本発明を実施する上で必ずしも必要でなく、本発明は、任意の特定の作用機序に限定されないが、いくつかの実施形態では、（例えば、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応を含むアッセイにおいて）INVADERオリゴヌクレオチドとしても使用されるＲＴプライマーオリゴヌクレオチドを使用すると、非常に少ないコピー数［例えば１００未満（５０未満など）］の標的ｍｉＲＮＡを検出できる検出構造の生成と検出に関与する、侵入的切断酵素（CLEAVASE酵素など）によって、（例えばｍｉＲＮＡ鋳型から）伸長し認識されるのに好適な会合量が得られる。

【0280】

Ｃ）ＰＣＲ前進プライマー／ｍｉＲＮＡ二重鎖（７、８、および９塩基対）の長さの最適化
ｍｉＲＮＡとＰＣＲ前進プライマーの最適のハイブリダイズ長を試験するために、一反応につき、３，０００〜４７分子の範囲の様々なレベルのｍｉＲ−１６ ｍｉＲＮＡを使用した。０．５μＭの以下のプライマー２３４３−０３−０６（９ｂ．ｐ．）、２３４３−１０−０５（８ｂ．ｐ．）、２３４３−１０−０６（７ｂ．ｐ．）の各々を使用し、０．５μＭ ＲＴプライマー２３４３−０３−０５；０．６７μＭ プローブ２３４３−０３−０７；０．２５μＭ FRETプローブ２３−２１０を混合して、ハイブリダイズ領域長７、８、および９塩基対（ｂ．ｐ．）を試験した。２５μＬ反応には、０．０３４単位／μＬ未変性Taqポリメラーゼ、２単位／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素、および６．６７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素、ならびに１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２５μＭ ｄＮＴＰの緩衝液が含まれた。鉱油１０μＬで覆った９６穴スカートプレートで反応を組み立てた。次いで、プレートを４２℃で４５分間の単一ステップ、続いて９５℃で２分間、および９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で６０秒間の３０サイクルにかけた。サイクルの完了後、反応プレートを９９℃で１０分間加熱し、次いで５０℃で１５分間冷却し、次いで取得設定４３で励起波長と発光波長それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍを使用し、Cytofluorプレートリーダーで読み取った。

【0281】

結果は、以下の通りであった。

【0282】

未処理データ：

【表32】

【0283】

処理データ：

【表33】

【0284】

従って、本発明によって、ＰＣＲプライマー−ｍｉＲＮＡ二重鎖の長さが、９から７塩基対に減少するにつれ、ｍｉＲＮＡ検出アッセイの性能（例えば、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応、ならびに検出構造含む）も減少することが実証されている。従って、いくつかの実施形態では、プライマーオリゴヌクレオチドと標的ｍｉＲＮＡの間に、約９塩基対の二重鎖が形成されるように、ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを設計する。いくつかの実施形態では、プライマーオリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡもしくはそれから発生したｃＤＮＡと、二重鎖を形成しない（例えば相補的ではない）他の配列を含む。いくつかの実施形態では、二重鎖を形成しないその他の配列は、ヘアピン構造を形成する（例えば、標的配列もしくはそれから発生したｃＤＮＡを有する二重鎖を形成しない配列中の配列は、折り畳まれ、それ自体と結合することができる）。

【0285】

Ｄ）１個もしくは複数のプローブを使用するＬｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡの検出
プローブの１つが存在し、または両方が存在する反応で、以下の２個のプローブ２３４３−１４−０２を０．５μＭで、そして２３４３−１４−０３を４０ｎＭで使用し、一反応につき３×１０^８〜３分子範囲のＬｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡレベルを試験した。全ての反応について、０．０３４単位／μＬ未変性Taqポリメラーゼ、２単位／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素、および６．６７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２５μＭ ｄＮＴＰを含む緩衝液中、好適なレベルのＬｅｔ−７ａ；０．５μＭ プライマー２３４３−１４−０１および２３４３−１６−０１；および０．２５μＭ FRETプローブ２３−２１０および２３−２０４を含む２５μＬ容量中で、上記濃度の個々のプローブもしくは混合したプローブを混合した。鉱油１０μＬで覆った９６穴スカートプレートで反応を組み立てた。次いで、プレートを４２℃で４５分間の単一ステップ、続いて９５℃で２分間、および９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で４５秒間の２９サイクルにかけた。サイクルの完了後、反応プレートを９９℃で１０分間加熱し、次いで５０℃で３０分間冷却し、次いで取得設定４３で励起波長と発光波長それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍを使用し、Cytofluorプレートリーダーで読み取った。

【0286】

生成された蛍光データは、以下の通りであった。

【表34】

【0287】

そして図３２に示す。

【0288】

従って、本発明によって、プローブ２３４３−１４−０２（０．５μＭ）と２３４３−１４−０３（４０ｎＭ）を組み合わせると、ｍｉＲＮＡ検出の動的範囲が＞６桁に拡大する。従って、いくつかの実施形態では、（例えば低コピー数ｍｉＲＮＡの）検出感度を増大するために、本発明のｍｉＲＮＡ検出アッセイ（例えば、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応を含む）は、一個を超える（例えば２個、３個またはそれ以上の）プローブオリゴヌクレオチドを使用する。

【0289】

Ｅ）短い標的ハイブリダイゼーション領域を備えた一次プローブを使用する反応温度の影響
短い標的ハイブリダイゼーション領域を備えた一次プローブを使用し、アッセイの温度感度（またはそれを欠く）を定量する実験を行った。インキュベーション温度４５℃〜６０℃の範囲を超えて、標的ハイブリダイゼーションが１０および１１塩基の２個の一次プローブを検証した。

【0290】

１．INVADERアッセイ用オリゴヌクレオチド：

【表35】

【0291】

２．Ｌｅｔ−７ａ単位複製配列の生成：２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ 各ｄＮＴＰ、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−６、０．４μＭ １７１６−９４−８、０．５ｆＭ ｌｅｔ−７ａ ＲＮＡ、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌを含むＲＴ−ＰＣＲ反応でｌｅｔ−７ａ単位複製配列を生成した。ＰＣＲサイクリングプロフィール：３７℃で３０分間、続いて９５℃で３０秒間および６０℃で１分間を２８サイクル。

【0292】

３．Ｌｅｔ−７ａ単位複製配列ＲＴ−ＰＣＲの図式

【表36】

【0293】

４． INVADERアッセイ：１７１６−９４−１プローブによるINVADER反応は、０．６７μＭ １７１６−９４−１、０．４μＭ １７１６−９４−３、標的として使用する１μｌの１０倍に希釈したｌｅｔ−７ａ単位複製配列、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素を含む、１８μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中で９９℃で１０分間、次いで４５〜６０℃の温度勾配で１時間実施した。この後、２μｌの２３−２１０アーム３−FAM FRETカセットをチューブに加え、９５℃で１分間、次いで５４℃で１０分間反応を続けた。

【0294】

５．１７１６−９４−１プローブによるINVADERアッセイの図式

【表37】

【0295】

６． １７１６−９４−２プローブによるINVADER反応は、０．６７μＭ １７１６−９４−２、０．４μＭ １７１６−９４−５、標的として使用する１μｌの１０倍に希釈したｌｅｔ−７ａ単位複製配列、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素含む、１８μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中で、９９℃で１０分間、次いで４５〜６０℃の温度勾配で１時間実施した。この後、２μｌの２３−２１０アーム３−FAM FRETカセットをチューブに加え、９５℃で１分間、次いで５４℃で１０分間反応を続けた。「標的対照無し」には、単位複製配列の代わりに２μｌのＨ_２Ｏを使用した。

【0296】

７．１７１６−９４−２プローブによるINVADERアッセイの図式

【表38】

【0297】

温度の関数としてプロットした、プローブ１７１６−９４−１および１７１６−９４−２によるINVADER反応の正味シグナルを図３４に示す。

【0298】

従って、本発明は、標的ハイブリダイゼーション領域が１０もしくは１１塩基の一次プローブを使用すると、広い温度範囲を超えて十分に機能することを実証する。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、ｍｉＲＮＡ検出アッセイ（例えば逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応、ならびに検出構造を含む）が、侵入的切断酵素（例えばCLEAVASE酵素）と共に、４５〜６０℃の温度（例えば、いくつかの好ましい実施形態では、５０℃、別の好ましい実施形態では４９℃、さらに別の好ましい実施形態では４８℃、さらに好ましい実施形態では４７℃）でのインキュベーションを含むことを実証する。

【0299】

Ｆ）ＲＴ−プライマーとＰＣＲ前進プライマーオリゴヌクレオチドに及ぼす、スタッカーオリゴヌクレオチドの影響
ＲＴプライマー／INVADERオリゴヌクレオチドと、ＰＣＲ前進オリゴヌクレオチドプライマーオリゴヌクレオチドに及ぼす、スタッカーオリゴヌクレオチドの影響を試験するために実験を設計し実施した。

【0300】

ｌｅｔ−７ａアッセイ用オリゴヌクレオチド：

【表39】

【0301】

１．ｌｅｔ−７ａアッセイの図式

【表40】

【0302】

２．Ｌｅｔ−７ａアッセイは、０．６７μＭ １７１６−９４−１、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−６、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素を含む、２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ；０．２５μＭ ２３−２１０アーム３−FAM FRETカセット；６０，０００、６，０００、６００または０コピーのｌｅｔ−７ａ ＲＮＡ；両１７１６−９４−８と１７１６−９４−９スタッカー（８＋９）、１７１６−９４−８スタッカー（８）、１７１６−９４−９スタッカー（９）、またはスタッカーなし（無し）の存在下で実施した。温度プロフィールは、３７℃で３０分間；９５℃で１分間；９５℃で３０秒間、次いで６０℃で１分間の２８サイクル；９９℃で１０分間；４９℃で３０分間であった。

【0303】

ｌｅｔ−７ａ ＲＮＡコピー数の関数としてプロットしたｌｅｔ−７反応の未処理シグナルを図３５に示す。

【0304】

従って、本発明は、いくつかの実施形態では、［例えば低レベル（コピー数など）標的ｍｉＲＮＡでは］スタッカー無しよりも、いくらかのスタッカーの使用が好ましいことを実証する。いくつかの実施形態では、より高いレベル（コピー数など）の標的核酸（ｍｉＲＮＡなど）で、スタッカーの使用により、より高いシグナルがもたらされる。ＰＣＲ前進オリゴヌクレオチドプライマーで、スタッカーオリゴヌクレオチドを使用することは、反応にいかなる正の利益ももたらすとは思われなかった。そして場合によっては実際、シグナルを低減させかねない。それに反して、ＲＴプライマー／INVADERオリゴヌクレオチドのスタッカーの使用によって、アッセイ感度が増強された。

【0305】

Ｇ）スタッカーオリゴヌクレオチド 対 ヘアピン形成化ＲＴ−プライマー使用の比較
同じ領域での、ＲＴ／プライマー／INVADERオリゴヌクレオチドの５’末端のヘアピン形成化領域の使用 対 スタッカーオリゴヌクレオチドの使用を比較するために、実験を設計し実施した。

【0306】

１．INVADERアッセイ用オリゴヌクレオチド：

【表41】

【0307】

２．ｌｅｔ−７ａアッセイ用スタッカー設計の図式：

【表42】

【0308】

３．ｌｅｔ−７ａアッセイ用のヘアピン設計の図式：

【表43】

【0309】

４． Ｌｅｔ−７ａスタッカーアッセイは、１７１６−９４−８スタッカーの存在下で、０．６７μＭ １７１６−９４−１、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−６、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素；０．２５μＭ ２３−２１０アーム３−FAM FRETカセット；６０，０００、６，０００、６００またはゼロコピーのｌｅｔ−７ａ ＲＮＡを含む２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰで実施した。温度プロフィールは、３７℃で３０分間；９５℃で１分間；９５℃で３０秒間、次いで６０℃で１分間の２８サイクル；９９℃で１０分間；４９℃で３０分間であった。

【0310】

Ｌｅｔ−７ａヘアピンアッセイは、１７１６−９４−３および１７１６−９４−８の代わりに、０．４μＭ ２３４３−０３−１を使用したことを除き、スタッカーアッセイについて記載した通りに実施した。

【0311】

ｌｅｔ−７ａ ＲＮＡコピー数の関数としてプロットしたｌｅｔ−７ａのスタッカーアッセイおよびヘアピンアッセイの未処理シグナルを図３６に示す。

【0312】

従って、本発明は、スタッカーの使用 対 ヘアピン形成化オリゴヌクレオチドの間で、検出能力（感度など）に著しい差異がないことが観察されることを実証する。

【0313】

Ｈ）一段階対二段階反応構成の比較
一段階対二段階反応構成を比較するために実験を設計し実施した。一段階構成では、反応槽には試薬も加えないで、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応のそれぞれを逐次実施する。それとは対照的に、二段階構成では、逆転写反応ステップ後、ポリメラーゼ連鎖反応および侵入的切断アッセイ反応を行なうために、試薬を含む反応槽に逆転写反応容量の１／１０段階（1/10^ｔｈ）を加える。

【0314】

１． 一段階ｌｅｔ−７ａアッセイ。Ｌｅｔ−７ａ一段階アッセイは、０．６７μＭ １７１６−９４−１、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−６、０．４μＭ １７１６−９４−８、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素；０．２５μＭ ２３−２１０アーム３−FAM FRETカセットと共に６０，０００、６，０００、６００またはゼロコピーのｌｅｔ−７ａ ＲＮＡを含む、２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中で実施した。温度プロフィールは、３７℃で３０分間；９５℃で１分間；９５℃で３０秒間、次いで６０℃で１分間の２７サイクル；９９℃で１０分間；４９℃で３０分間であった。

【0315】

二段階ｌｅｔ−７ａアッセイ。第一段階は、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−８、５単位／μｌ ＭＭＬＶと共に６０，０００、６，０００、６００またはゼロコピーのｌｅｔ−７ａ ＲＮＡを含む２０μｌのＭＭＬＶ反応緩衝液（Promega）中３７℃で３０分間実施した。ＭＭＬＶを９５℃で１分間不活化した。第二段階は、０．６７μＭ １７１６−９４−１、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−６、０．４μＭ １７１６−９４−８、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素；０．２５μＭ ２３−２１０アーム３−FAM FRETカセットと共に２μｌの第一のステップ反応試料を含む、２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中で実施した。温度プロフィールは、９５℃で１分間；９５℃で３０秒間、次いで６０℃で１分間の２７サイクル；９９℃で１０分間；４９℃で３０分間であった。

【0316】

ｌｅｔ−７ａコピー数の関数として、一段階および二段階ｌｅｔ−７ａアッセイによって生じた正味シグナルを図３７に示す。

【0317】

従って、本発明は、一段階もしくは二段階アッセイ構成を使用した場合、二段階構成で鋳型の１／１０段階希釈を補正したとき、シグナル強度、検出限界、または動的範囲に著しい差異がないことを実証する。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応を全て含むアッセイを使用する、標的核酸［例えばＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）］の、単一ステップ（例えば単一チューブ）による検出を提供し、それによって時間と費用を節約し、試料の混入および／または手違いの可能性を減少させる。いくつかの実施形態では、本発明は、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応を含むアッセイを使用する、標的核酸［例えばＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）］の、２ステップ反応での検出を提供し、その際、逆転写反応ステップから得た核酸（ｃＤＮＡなど）の一部を、ポリメラーゼ連鎖反応および侵入的切断反応アッセイを含む後続ステップで使用する。

【0318】

Ｉ）低温侵入的切断アッセイ反応の一次プローブ
低温反応において、異なる一次プローブ長の影響を試験するために実験を設計し実施した。標的ハイブリダイゼーション領域が８、９および１０塩基対長の一次プローブを５０℃のINVADER反応で試験した。

【0319】

１．INVADERアッセイ用オリゴヌクレオチド：

【表44】

【0320】

２．長さが異なるプローブによるｌｅｔ−７ａアッセイの図式

【表45】

【0321】

３． ０．６７μＭ １７１６−９４−１、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−４、０．４μＭ １７１６−９４−８、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素；０．２５μＭ ２３−２１０アーム３−FAM FRETカセットと共に６１０^６、６１０^５、６１０^４、６，０００、６００、６０、またはゼロコピーのｌｅｔ−７ａ ＲＮＡを含む、２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中で、１７１６−９４−１プローブによるＬｅｔ−７ａアッセイを実施した。温度プロフィールは、４２℃で３０分間；９５℃で１分間；９５℃で２０秒間、次いで６０℃で１分間の２５サイクル；９９℃で６分間；５０℃で３０分間であった。

【0322】

４． ０．６７μＭ １７１６−９４−１０もしくは１７１６−９４−１１、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−４、０．４μＭ １７１６−９４−８、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素；０．２５μＭ ２３−２０４アーム４−FAM FRETカセットと共に６１０^６、６１０^５、６１０^４、６，０００、６００、６０、またはゼロコピーのｌｅｔ−７ａ ＲＮＡを含む、２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中でプローブ１７１６−９４−１０もしくは１７１６−９４−１１によるＬｅｔ−７ａアッセイを実施した。温度プロフィールは、４２℃で３０分間；９５℃で１分間；９５℃で２０秒間、次いで６０℃で１分間の２５サイクル；９９℃で６分間；５０℃で３０分間であった。

【0323】

ｌｅｔ−７ａコピー数の関数として、１７１６−９４−１、１７１６−９４−１０、もしくは１７１６−９４−１１プローブを用いるｌｅｔ−７ａアッセイによって生じた正味シグナルを図３８に示す。

【0324】

従って、本発明は、８〜１０塩基対長の［例えば標的核酸（ｍｉＲＮＡなど）に関連する］標的ハイブリダイゼーション領域を有する一次プローブが、アッセイで異なるレベルで機能することを実証する。具体的には、一次プローブの長さが伸長するにつれて、シグナル強度も増大し（例えば、図３８、プローブ１７１６−９４−１を参照）、一次プローブの長さが減少すると、シグナル強度も減少する（例えば、図３８、プローブ１７１６−９４−１１を参照）。

【0325】

Ｊ）プローブ長および濃度
標的ハイブリダイズ領域の長さが異なる一次プローブを用いて、アッセイの動的範囲を拡大することができるかどうか判定するために実験を行った。この場合は、８対１０ｂｐを試験した。さらに、１０ｂｐを含む一次プローブの濃度は異なった。

【0326】

１． ０．６７μＭ １７１６−９４−１；０．０６７、０．１６７、もしくは０．３３μＭ １７１６−９４−１１；０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−４、０．４μＭ １７１６−９４−８、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素；０．２５μＭ ２３−２１０アーム３−FAMと０．２５μＭ ２３−２０４アーム４−FAM FRETカセットと共に６１０^６、６１０^５、６１０^４、６，０００、６００、６０、またはゼロコピーのｌｅｔ−７ａ ＲＮＡを含む２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中で、動的範囲が拡大したＬｅｔ−７ａアッセイを実施した。温度プロフィールは、４２℃で３０分間；９５℃で１分間；９５℃で２０秒間、次いで６０℃で１分間の２５サイクル；９９℃で６分間；５０℃で３０分間であった。

【0327】

ｌｅｔ−７ａコピー数の関数として、異なる割合で得られた１７１６−９４−１および１７１６−９４−１１プローブ用いる、ｌｅｔ−７ａアッセイによって発生した正味シグナルを図３９に示す。

【0328】

従って、本発明は、０．０６７μＭ〜０．３３μＭの一次プローブの濃度が、本発明のアッセイで機能することを実証し、その際、いくつかの実施形態では、より高濃度のプローブ（例えば０．３３μＭ）を使用すると、低濃度（例えば０．０６７μＭ）の使用と比較してアッセイ感度は上昇する。従って、いくつかの実施形態では、本発明の検出アッセイ（例えば逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応、ならびに検出構造を含む）で一次プローブの濃度を修正（例えば上昇）すると、反応感度は修正（例えば上昇）される。

【0329】

Ｋ）Ｌｅｔ−７アイソフォームの特異的判別
Ｌｅｔ−７の密接に関連するアイソフォーム（例えばＬｅｔ−７変異体）間を区別するＬｅｔ−７ａアッセイの能力を試験するために実験を設計し実施した。

【0330】

使用したｌｅｔ−７変異体：

【表46】

【0331】

０．６７μＭ １７１６−９４−１、０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−４、０．４μＭ １７１６−９４−８、２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素；０．２５μＭ ２３−２１０アーム３−FAM FRETカセットと共に６１０^５、６１０^４、６，０００、６００、６０、またはゼロコピーのｌｅｔ−７ａ ＲＮＡを含む、２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中でＬｅｔ−７ａアッセイを実施した。温度プロフィールは、４２℃で３０分間；９５℃で１分間；９５℃で２０秒間、次いで６０℃で１分間の２５サイクル；９９℃で６分間；４９℃で３０分間であった。

【0332】

ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、またはｌｅｔ−７ｆコピー数の関数として、ｌｅｔ−７ａアッセイによって発生した正味シグナルを図４０に示す。

【0333】

従って、本発明は、本明細書に記載した核酸［例えばＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）］検出アッセイ（例えば、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入的切断アッセイ反応、ならびに検出構造含む）が、その変異体配列（例えばＬｅｔ−７ｃ）と比較して、標的核酸（例えばＬｅｔ−７ａ）に、１００倍の特異性を示すことを実証する。

【0334】

Ｌ）内部標準としてｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡおよびＵ６ ＲＮＡの二重アッセイ。

【0335】

同じ反応槽で、それぞれが別々のｍｉＲＮＡに対応する、２つの蛍光シグナルの検出を試験するために実験を設計し実施した。

【0336】

１． FAM色素に伝える範囲拡張ｌｅｔ−７ａアッセイ、およびRED色素に伝えるＵ６ ＲＮＡアッセイの図式。

【表47】

【0337】

２． ０．６７μＭ １７１６−９４−１；０．３３μＭ １７１６−９４−１１；０．４μＭ １７１６−９４−３、０．４μＭ １７１６−９４−４、０．４μＭ １７１６−９４−８、０．４μＭ １７１６−９６−５；０．０４μＭ １７１６−９６−４；０．０４μＭ １７１６−９６−８；２単位／μｌ ＭＭＬＶ、０．０３３単位／μｌ TaqＰｏｌ、６．７ｎｇ／μｌ CLEAVASE VIII酵素；０．２５μＭ ２３−２１０アーム３−FAM、０．２５μＭ ２３−２０４アーム４−FAM FRET、および０．２５μＭアーム７−REDカセットを含む、２０μｌの１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭ各ｄＮＴＰ中で、Ｕ６で二重にしたＬｅｔ−７ａアッセイを実施した。ｌｅｔ−７ａ、およびＵ６ ＲＮＡ、または異なる組織由来の全ＲＮＡ（Clontech）を既知量含むアリコートを試料として使用した。温度プロフィールは、４２℃で３０分間；９５℃で１分間；９５℃で２０秒間、次いで６０℃で１分間の２０サイクル；９９℃で６分間；５０℃で１０分間であった。

【0338】

３． ｌｅｔ−７ａ／Ｕ６二重アッセイによって発生したＬｅｔ−７ａおよびＵ６特異的シグナルを以下に示す。

【表48】

【0339】

上記データに示すように、本発明は、一段階反応（例えば単独反応槽）で２個の別個のｍｉＲＮＡを同時に増幅し検出できること実証する。

【0340】

Ｍ）癌に伴うｍｉＲＮＡを検出する設計
本発明を開発中、癌に伴う様々なｍｉＲＮＡを検出できる数個のオリゴヌクレオチドを生成した。以下のガイドライン従ってオリゴヌクレオチドを設計した。

【0341】

１）６塩基対のＲＴプライマー−ｍｉＲＮＡハイブリダイズ領域。

【0342】

２）以下の３つの方法を使用する、標的とするｍｉＲＮＡとハイブリダイズすると、同軸性積層体を形成するＲＴプライマー。

【0343】

ａ．ＲＴプライマーの５’末端がそれ自体に折り畳まれて、ｍｉＲＮＡの３’末端に積層するヘアピンを形成する。

【0344】

ｂ．ＤＮＡオリゴヌクレオチドを加えて、一度ｍｉＲＮＡとハイブリダイズすると同軸性積層体を形成するＲＴプライマーとハイブリダイズさせる。

【0345】

ｃ．２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドを加えて、一度ｍｉＲＮＡとハイブリダイズすると同軸性積層体を形成するＲＴプライマーとハイブリダイズさせる。

【0346】

３）９塩基対のＰＣＲプライマーｃＤＮＡハイブリダイズ領域。

【0347】

１０および８塩基対のINVADERプローブは、それぞれアーム３および４を使用し、ｍｉＲＮＡと相補する。

【0348】

これらのガイドライン従って設計したオリゴヌクレオチドを図４１に記載する。

【0349】

様々な長さの一次プローブおよびＰＣＲプライマーハイブリダイズ領域を有する、ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−１６の追加の設計を図４２に示す。

【0350】

この実施例で使用した全てのオリゴヌクレオチドの一覧を図４３に記載する。

【0351】

上記明細書に記載した全刊行物および特許を参照により本明細書に組み込む。本発明の範囲および趣旨から逸脱しない、本発明の記載の方法および系の様々な変更形態および変形形態は、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求する本発明は、そのような具体的実施形態に極度に限定すべきではないことは理解されるものとする。実際、分子生物学、遺伝学、または関連分野の当業者に明白な、本発明を実施するために記載された方式の様々な変更形態も、特許請求の範囲内にあるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41A】

【図41B】

【図42A】

【図42B】

【図43】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]