5793237 オートロガス生殖細胞系ミトコンドリアエネルギー移動のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5793237

(24)【登録日】2015年8月14日

(45)【発行日】2015年10月14日

(54)【発明の名称】オートロガス生殖細胞系ミトコンドリアエネルギー移動のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/075 20100101AFI20150928BHJP

   A61K 35/54 20150101ALI20150928BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20150928BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150928BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20150928BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/00 202E

   A61K35/54ZNA

   A61P15/08

   !C12N15/00 A

   !C12Q1/02

【請求項の数】29

【全頁数】53

(21)【出願番号】特願2014-505369(P2014-505369)

(86)(22)【出願日】2012年4月13日

(65)【公表番号】特表2014-514928(P2014-514928A)

(43)【公表日】2014年6月26日

(86)【国際出願番号】US2012033643

(87)【国際公開番号】WO2012142500

(87)【国際公開日】20121018

【審査請求日】2015年1月5日

(31)【優先権主張番号】61/475,561

(32)【優先日】2011年4月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/600,505

(32)【優先日】2012年2月17日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】592017633

【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100102668

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 憲生

(74)【代理人】

【識別番号】100182486

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 正展

(74)【代理人】

【識別番号】100189131

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 拓郎

(74)【代理人】

【識別番号】100147289

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100158872

【弁理士】

【氏名又は名称】牛山 直子

(72)【発明者】

【氏名】ティリー， ジョナサン リー

(72)【発明者】

【氏名】ウッズ， ドリ シー．

【審査官】 鶴 剛史

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５２０５２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０１／０３０９８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／００１０５０８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Zou, K et al.，Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries.，Nat. Cell Biol.，２００９年，Vol.11 No.5，pages 631-636

【文献】 Pacchiarotti, J.，Differentiation potential of germ line stem cells derived from the postnatal mouse ovary.，Differentiation，２０１０年，Vol.79 No.3，pages 159-170

【文献】 White, Y.A. et al.，Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women.，Nat. Med.，２０１２年 ２月２６日，Vol.18 No.3，pages 413-421

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／０７５

Ａ６１Ｋ ３５／５４

Ａ６１Ｐ １５／０８

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｑ １／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）卵原幹細胞（ＯＳＣ）ミトコンドリア、又は
ｉｉ）ＯＳＣの子孫から単離されるミトコンドリア
を含み、そして卵母細胞へ移入される、体外受精（ＩＶＦ）又は人工授精のための卵母細胞を調製するための組成物であって、ここで、該ＯＳＣは該卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び場合によりStage-Specific Embryonic Antigen（ＳＳＥＡ）を発現する、
組成物。

【請求項2】

卵母細胞が、受精卵を形成するために卵母細胞をインビトロで受精させることを含む体外受精方法で用いられる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

組成物の自己卵母細胞への移入と卵母細胞の受精が実質的に同時に行われる、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫から得られる自己ミトコンドリアを含み、そして卵母細胞へ移入される、卵母細胞のＡＴＰ生産能を増大させるための組成物であって、ここで、該ＯＳＣは該卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離される非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び場合によりＳＳＥＡを発現する、
組成物。

【請求項5】

少なくとも１つのＯＳＣ又は少なくとも１つのＯＳＣの子孫から単離されたミトコンドリアを含み、そして卵母細胞へ注入される、卵母細胞のＡＴＰ生産能を増大させるための組成物であって、ここで、該ＯＳＣは該卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離される非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び場合によりＳＳＥＡを発現する、
組成物。

【請求項6】

卵母細胞の体外受精方法で用いるための組成物であって、該組成物は卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫から取得された単離されたミトコンドリアを含み、該組成物は体外受精用の卵母細胞を調製するために卵母細胞へ移入されるものであり、ここで、該ＯＳＣは該卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離される非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び場合によりＳＳＥＡを発現する、
組成物。

【請求項7】

卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫から取得された単離された機能的なミトコンドリアを含む、卵母細胞へ移入するための組成物であって、ここで、該ＯＳＣは単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び場合によりＳＳＥＡを発現する、
組成物。

【請求項8】

ミトコンドリアが遠心分離によって単離される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

ミトコンドリアが、ミトコンドリア膜電位差依存性細胞選別によって単離される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

組成物が、１×１０^３〜５×１０^４個のミトコンドリアを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫が、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡ ｆｇ当り少なくとも５倍多いＡＴＰを生産する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

卵巣体細胞又は間葉系幹細胞が自己である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

組成物が、
（ａ）ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫に由来するミトコンドリア精製調製物である、又は
（ｂ）ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫の核を含まない細胞質である、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

組成物が、注入によって卵母細胞へ移入される、請求項１、４又は６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

卵母細胞が体外受精に用いられる、請求項４又は５に記載の組成物。

【請求項16】

組成物が、卵細胞質内精子注入と実質的に同時に該卵母細胞へ移入される、請求項１、２、３、６又は１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

ＯＳＣが卵巣組織から単離される、請求項７に記載の組成物。

【請求項18】

ＯＳＣが、母体年齢の高いヒト女性から単離される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

ミトコンドリアの２％超、５％超、１０％超、又は２０％超が機能的なミトコンドリアである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

組成物中の機能的なミトコンドリアの少なくとも７５％、８５％又は９０％が高ＡＴＰ生産能ミトコンドリアである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫が、卵巣体細胞よりｍｔＤＮＡ ｆｇ当り少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、又は少なくとも１０倍多いＡＴＰを生産する、請求項１〜１０又は１３〜１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

卵巣体細胞が、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫に対して自己である、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫が、間葉系幹細胞よりｍｔＤＮＡ ｆｇ当り少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、又は少なくとも１０倍多いＡＴＰを生産する、請求項１〜１０又は１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

間葉系幹細胞が、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫に対して自己である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

ミトコンドリアの２％、５％、１０％、又は２０％超が機能的なミトコンドリアであることを、工程：
（ａ）蛍光ミトコンドリア追跡用プローブを組成物中のミトコンドリアと結合させること、ここで、当該追跡用プローブは、非酸化依存性プローブ、蓄積依存性プローブ、又は還元型酸化状態プローブよりなる群から選ばれるものである；
（ｂ）追跡用プローブの結合に基づいてミトコンドリアを選別すること；及び
（ｃ）追跡用プローブに結合したミトコンドリアの割合に基づいて機能的なミトコンドリアの割合を決定すること、
によって確認する、請求項１９に記載の組成物。

【請求項26】

自己卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫から単離された外来性の機能的なミトコンドリアを含む、卵母細胞であって、ここで、該ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び場合によりＳＳＥＡを発現する、
卵母細胞。

【請求項27】

工程：
（ａ）卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫から得られた１つ又はそれ以上の自己ミトコンドリアを含む組成物を得ること、ここで、ＯＳＣは卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び場合によりＳＳＥＡを発現するものである；及び
（ｂ）組成物を卵母細胞へ移入すること
を含む方法で調製された、卵母細胞。

【請求項28】

組成物が、注入によって卵母細胞へ移入される、請求項２７に記載の卵母細胞。

【請求項29】

該ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は該卵母細胞に対して自己である、請求項７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、２０１１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／４７５，５６１号明細書及び２０１２年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６００，５０５号明細書の利益を請求する。尚、これらの文献の全開示内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。

【0002】

連邦政府による支援の下で達成された本発明に対する権利についての声明
この研究は、国立老化研究所助成金（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｎ Ａｇｉｎｇ Ｇｒａｎｔ）第ＮＩＨＲ３７−ＡＧ０１２２７９号及び国立衛生研究所研究サービス賞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ａｗａｒｄ）（Ｆ３２−ＡＧ０３４８０９）によって一部資金援助を受けた。政府は、本発明に所定の権利を有する。

【0003】

配列表
本発明は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全内容を参照として本明細書に組み込むものとする。２０１２年６月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、８８５１１ＷＯ５．ｔｘｔと称し、サイズは１５，４４８バイトである。

【背景技術】

【0004】

この数十年で、文化及び社会的変化により、先進国の女性は、出産時期がかなり遅くなっている。例えば、米国における３５〜４４歳の初産率は、この４０年間で８倍超増加した（Ｖｅｎｔｕｒａ Ｖｉｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔ ４７：１−２７，１９８９ Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＮＣＨＳ Ｄａｔａ Ｂｒｉｅｆ ２００９ ２１：１−８）。年齢が３５歳以上の女性の妊娠率が、自然妊娠及び生殖補助医療による妊娠のいずれも、有意に低下していることは周知である。出産率の低下は、卵巣刺激法に対する応答の低下、胚の質及び妊娠率の低下、並びに流産及び胎児異数性の発生率増加を反映している。さらに、卵子における加齢に関連する染色体及び減数分裂紡錘体異常が、高出産年齢の女性における不妊、胎児喪失（流産）並びに先天異常（最も顕著には、２１−トリソミー又はダウン症候群）につながる受胎の発生増加の原因であると考えられる（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９６８ ２１８：２２−２８，Ｈａｓｓｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５ ７０：１１−１７，Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９６ １１：２２１７−２２２２，Ｈｕｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ２００８ ２４：８６−９３）。

【0005】

現在のところ、高齢の女性患者の妊娠結果を改善するための公知の介入はない。動物試験では、幼若期間中及び成体生殖期全体にわたる、薬理学的用量の抗酸化剤の長期投与が、高齢雌マウスにおいて卵母細胞の質を改善することが報告されている（Ｔａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ ２００２ ６１：３８５−３９７）。しかし、この手法は、卵巣及び子宮の機能に有意な長期のマイナスの作用をもたらし、治療した動物において、胎児死亡及び吸収の増加、並びに同腹子の頻度及び大きさの減少を招く（Ｔａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００２ ５７：１５３９−１５５０）。従って、高齢女性において卵母細胞の質を維持又は改善するための長期抗酸化剤治療の臨床移行（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）は実際的ではない。

【0006】

老化及び加齢関連の疾病は、多くの場合、ミトコンドリア数（生合成）の減少、ミトコンドリア活性（細胞の主要エネルギー源である、ＡＴＰの生産）の低減、及び／又はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）突然変異及び欠失の蓄積による、ミトコンドリア機能の喪失と関連している。卵母細胞が老化し、卵母細胞のミトコンドリアエネルギー生産が減少するにつれて、コンピテント卵子を産生するのに必要な、卵母細胞成熟の重要なプロセス（特に、核紡錘体活性及び染色体分離）の多くが損なわれる（Ｂａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｓｓｉｓｔ Ｒｅｐｒｏｄ Ｇｅｎｅｔ ２００４ ２１：７９−８３，Ｗｉｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｚｙｇｏｔｅ ２００５ １３：３１７−２３）。

【0007】

若いドナー卵母細胞（異なる女性から取得したもの）由来の細胞質抽出物の、生殖障害の病歴を持つ高齢女性の卵母細胞への異種移入は、卵細胞質移植又は卵細胞質移入として知られる方法であるが、この方法によって、胎児胚形成及び生存子孫の分娩の改善が明らかにされた。しかし、残念なことに、この方法に従って生まれた子供は、ミトコンドリアヘテロプラスミー又は２つの異なる由来のミトコンドリアの存在を呈示する（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９８ ４：２６９−８０，Ｂａｒｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ２００１ １６：５１３−６，Ｍｕｇｇｌｅｔｏｎ−Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８２ ２９９：４６０−２，Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２００７ ７７：２２９−４９。このことは、精子からの父親由来のミトコンドリアが受精から間もなく破壊されるため、卵子に存在する母親由来のミトコンドリアが、胚にミトコンドリアを「接種」するのに用いられる事実と一致している（Ｓｕｔｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２０００ ６３：５８２０５９０）。上記の方法は、ドナー卵子からの精製若しくは単離ミトコンドリアの移入ではなく、細胞質の移入を含むものであるが、移入された細胞質におけるドナーミトコンドリアの存在は、子孫への「外来」ミトコンドリアの継代によって確認されており、これが、異種卵細胞質移入が受胎能利益をもたらす理由であると考えられる。それにもかかわらず、これらの子供における誘導ミトコンドリアヘテロプラスミーの健康への影響はまだ未知である；しかし、ミトコンドリアヘテロプラスミーのマウスモデルは、代謝症候群と一致する表現型を生成することが明らかにされている（Ａｃｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２００７ ７７：５６９−７６）。おそらく、異種卵細胞質移入に関する最も重要な課題は、ミトコンドリアも、生物学的母親及び生物学的父親が寄与する核遺伝子とは異なる遺伝子材料を含む事実と関連している。

【0008】

従って、この方法に従って受胎された子供には、３人の遺伝上の親（生物学的母親、生物学的父親、卵子ドナー）がいることから、胚の形成のためのヒト生殖細胞系の遺伝子操作の例を代表するものとなる。従って、ミトコンドリアヘテロプラスミーを招く卵細胞質移植方法は、現在、規制され、ＦＤＡによって広範に禁止されている。詳細については、ＣＢＥＲ ２００２ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｉｎｕｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｍａｙ ９，２００２（ＦＤＡから一般に閲覧可能）、並びに“Ｌｅｔｔｅｒ ｔｏ Ｓｐｏｎｓｏｒｓ／Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ − Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｂｙ Ｍｅａｎｓ Ｏｔｈｅｒ Ｔｈａｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｇａｍｅｔｅ Ｎｕｃｌｅｉ”（やはりＦＤＡから一般に閲覧可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／ＳａｆｅｔｙＡｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ／ｕｃｍ１０５８５２．ｈｔｍ）を参照されたい。

【0009】

体細胞からのオートロガスミトコンドリアの使用は、ミトコンドリアヘテロプラスミーを回避しうるが、体細胞のミトコンドリアもまた、ミトコンドリア数（生合成）の減少、ミトコンドリア活性（細胞の主要エネルギー源である、ＡＴＰの生産）の低減、及び／又はミトコンドリアｍｔＤＮＡ突然変異及び欠失の蓄積による、ミトコンドリア機能の加齢に関連する喪失を被る。従って、母体年齢が高い女性の場合、オートロガス体細胞由来のミトコンドリアを卵母細胞に移入することから有意な利益は期待されていない。さらに、様々な幹細胞が、低いミトコンドリア活性を有することがわかっている（Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｕｐｄａｔｅ．２００９（５）：５５３−７２）ため、成体幹細胞は、高い活性のミトコンドリアの生存性供給源であると考えられていなかった。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、部分的に、卵巣の体細胞組織に存在する、哺乳動物雌性生殖系幹細胞若しくは卵原幹細胞（ＯＳＣ）が、評価したあらゆる幹細胞型の最も高い既知ＡＴＰ生産能力を有し、しかも、蓄積突然変異の量が低い（例えば、場合によっては、体細胞に加齢と共に蓄積することがわかっている一般的ｍｔＤＮＡのレベルが検出限界以下である）ｍｔＤＮＡを含有する、ミトコンドリアを含むという意外な発見に基づく。

【0011】

一態様では、本発明は、体外受精（ＩＶＦ）又は人工受精のための卵母細胞を作製する方法を提供する。本方法は、ＯＳＣミトコンドリア、又はＯＳＣの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物をオートロガス卵母細胞に移入することにより、体外受精又は人工受精のための卵母細胞を作製することを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＯＳＣは、有糸分裂能が高く、かつ、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意選択でステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）（例えば、ＳＳＥＡ−１、−２、−３、及び−４）を発現する、単離された非胚性幹細胞である。ＯＳＣは、卵巣組織、又は非卵巣組織／供給源、例えば、骨髄若しくは血液、例えば、末梢血及び臍帯血から得ることができる。

【0013】

別の実施形態では、ＯＳＣミトコンドリア、又はＯＳＣの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物は、核を含まない細胞の細胞質である。

【0014】

また別の実施形態では、ＯＳＣミトコンドリア、又はＯＳＣの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物は、精製調製物である。特定の実施形態では、精製調製物は、ＯＳＣ、ＯＳＣ子孫及び／又は非機能性ミトコンドリアを含まないか、又はこれらを少なくとも約８５％、９０％、９５％含まない。

【0015】

いくつかの実施形態では、組成物は、１×１０^３〜５×１０^４個のミトコンドリアを含む。

【0016】

別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0017】

さらに別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0018】

さらにまた別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0019】

別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１００倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0020】

いくつかの実施形態では、卵母細胞は、母体年齢の高い女性から得られる。他の実施形態では、卵母細胞は、卵巣予備能の低い女性から得られる。

【0021】

いくつかの実施形態では、組成物は、遠心分離によって単離されたミトコンドリアを含む。別の実施形態では、組成物は、ミトコンドリア膜電位差依存性細胞選別によって単離されたミトコンドリアを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物は、核を含まない細胞の細胞質である。別の実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物は、ミトコンドリアの精製調製物である。

【0023】

別の態様では、本発明は、単離されたＯＳＣミトコンドリア、又はＯＳＣの子孫から得られるミトコンドリアを含む、組成物を提供する。

【0024】

いくつかの実施形態では、本組成物は、細胞又は非機能性ミトコンドリアを少なくとも約８５％、９０％、９５％を含まない。

【0025】

いくつかの実施形態では、本組成物は、１×１０^３〜５×１０^４個のミトコンドリアを含む。

【0026】

別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0028】

別の態様では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0029】

別の態様では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１００倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、母体年齢の高い女性から得られる。他の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣予備能の低い女性から得られる。

【0031】

いくつかの実施形態では、組成物は、遠心分離によって単離されたミトコンドリアを含む。別の実施形態では、組成物は、ミトコンドリア膜電位差依存性細胞選別によって単離されたミトコンドリアを含む。

【0032】

別の態様では、本発明は、ＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られる少なくとも１個の単離されたミトコンドリアを含む、組成物を提供する。

【0033】

いくつかの実施形態では、本組成物は、１×１０^３〜５×１０^４個のミトコンドリアを含む。

【0034】

別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0036】

別の態様では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0037】

いくつかの態様では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１００倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0038】

いくつかの実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、母体年齢の高い女性から得られる。他の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣予備能の低い女性から得られる。

【0039】

いくつかの実施形態では、本組成物は、遠心分離によって単離されたミトコンドリアを含む。別の実施形態では、本組成物は、ミトコンドリア膜電位差依存性細胞選別によって単離されたミトコンドリアを含む。

【0040】

別の態様では、本発明は、前述した方法のいずれかに従って作製された卵母細胞を提供する。

【0041】

別の態様では、本発明は、外性、オートロガスＯＳＣミトコンドリア、又はＯＳＣの子孫から得られるミトコンドリアを含む、卵母細胞を提供する。

【0042】

また別の態様では、本発明は、体外受精の方法を提供する。この方法は、ａ）ｉ）ＯＳＣから得られるミトコンドリア、又はｉｉ）ＯＳＣの子孫から得られるミトコンドリアを含有する組成物を取得するステップ；ｂ）この組成物を、単離されたオートロガス卵母細胞に移入するステップ；及びｃ）このオートロガス卵母細胞を体外受精させることによって、受精卵を形成するステップを含む。一実施形態では、本方法は、受精卵、又は受精卵から得られた着床前期胚を女性被検者の子宮又は卵管に移入することを含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、本組成物は、１×１０^３〜５×１０^４個のミトコンドリアを含む。

【0044】

別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0045】

また別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0046】

さらに別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0047】

別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１００倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0048】

いくつかの実施形態では、卵母細胞は、母体年齢の高い女性から得られる。他の実施形態では、卵母細胞は、卵巣予備能の低い女性から得られる。

【0049】

いくつかの実施形態では、本組成物は、遠心分離によって単離されたミトコンドリアを含む。別の実施形態では、本組成物は、ミトコンドリア膜電位差依存性細胞選別によって単離されたミトコンドリアを含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣは、卵巣組織から得られる。別の実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣは、非卵巣組織から得られる。

【0051】

いくつかの実施形態では、非卵巣組織は、血液である。別の実施形態では、非卵巣組織は、骨髄である。

【0052】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物は、核を含まない細胞の細胞質である。別の実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物は、ミトコンドリアの精製調製物である。

【0053】

また別の態様では、本発明は、少なくとも１つのＯＳＣ、又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から機能性ミトコンドリアの集団を単離する方法を提供する。この方法は、機能性ミトコンドリアにプローブを結合するのに十分な条件下で、ミトコンドリア追跡用プローブと一緒に、少なくとも１つのＯＳＣ、又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫を含有する組成物をインキュベートするステップ、並びに非機能性ミトコンドリアから機能性ミトコンドリアを選別することにより、少なくとも１つのＯＳＣ、又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から機能性ミトコンドリアの集団を単離するステップを含む。いくつかの実施形態では、非機能性ミトコンドリアを機能性ミトコンドリアの集団から排除する。

【0054】

いくつかの実施形態では、ミトコンドリア追跡用プローブは、非酸化依存性プローブである。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア追跡用プローブは、蓄積依存性プローブである。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア追跡用プローブは、低酸化状態プローブである。いくつかの実施形態では、選別ステップは、蛍光活性化細胞選別を含む。

【0055】

また別の態様では、本発明は、少なくとも１つのＯＳＣ、又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られる機能性ミトコンドリアの集団を識別する方法を提供する。この方法は、ａ）組成物中の機能性ミトコンドリアに、蛍光低酸化状態プローブを結合すると共に、組成物中の全ミトコンドリアに、蛍光蓄積依存性プローブを結合するのに十分な条件下で、蛍光低酸化状態プローブ及び蛍光蓄積依存性プローブと一緒に、少なくとも１つのＯＳＣ、又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫を含有する組成物をインキュベートするステップ；ｂ）蛍光活性化細胞選別を用いて、機能性ミトコンドリアを含む組成物を取得するステップであって、ここで、組成物から、非機能性ミトコンドリアは排除されているステップ；ｃ）機能性ミトコンドリアの量及び全ミトコンドリアの量を決定するステップ；ｄ）全ミトコンドリアに対する機能性ミトコンドリアの比率を計算するステップ；並びにｅ）この比率が約０．０２を上回るか否かを決定することにより、少なくとも１つのＯＳＣ、又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られる機能性ミトコンドリアの集団を識別するステップを含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、蛍光蓄積依存性プローブは、スペクトルの一部（例えば、緑色）に蛍光を放出することができる。別の実施形態では、蛍光低酸化状態プローブは、スペクトルの異なる部分（例えば、赤色）に蛍光を放出することができる。

【0057】

別の態様では、本発明は、以下：ａ）組成物中の機能性ミトコンドリアに、蛍光低酸化状態プローブを結合すると共に、組成物中の全ミトコンドリアに、蛍光蓄積依存性プローブを結合するのに十分な条件下で、蛍光低酸化状態プローブ及び蛍光蓄積依存性プローブと一緒に、少なくとも１つのＯＳＣ、又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫を含有する組成物をインキュベートするステップ；ｂ）蛍光活性化細胞選別を用いて、機能性ミトコンドリアを含む組成物を取得するステップを含み、ここで、組成物から、非機能性ミトコンドリアは排除されている、方法によって、得られる機能性ミトコンドリアを含む組成物を提供する。

【0058】

別の態様では、本発明は、単離されたＯＳＣミトコンドリア又はＯＳＣの子孫から得られるミトコンドリアを含有する組成物と、使用説明書とを含むキットを提供する。一実施形態では、本組成物は、細胞又は非機能性ミトコンドリアを少なくとも約８５％、９０％、９５％含まない。

【0059】

本発明のまた別の態様は、ＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られる少なくとも１つの単離されたミトコンドリアと、使用説明書とを含むキットを提供する。

【0060】

本発明の別の態様は、卵母細胞のＡＴＰ生産能を増大する方法を提供する。この方法は、以下：ａ）卵母細胞にオートロガスである少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物を取得するステップ；及びｂ）ミトコンドリアの組成物を卵母細胞に注入するステップを含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、本組成物は、１×１０^３〜５×１０^４個のミトコンドリアを含む。

【0062】

別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0063】

また別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0064】

さらに別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも５０倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0065】

別の実施形態では、ＯＳＣ又はＯＳＣの子孫は、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり少なくとも１００倍多いＡＴＰを生産する。特定の実施形態では、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞は、オートロガスである。

【0066】

いくつかの実施形態では、卵母細胞は、母体年齢の高い女性から得られる。他の実施形態では、卵母細胞は、卵巣予備能の低い女性から得られる。

【0067】

いくつかの実施形態では、本組成物は、遠心分離によって単離されたミトコンドリアを含む。別の実施形態では、本組成物は、ミトコンドリア膜電位差依存性細胞選別によって単離されたミトコンドリアを含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣは、卵巣組織から得られる。別の実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣは、非卵巣組織から得られる。

【0069】

いくつかの実施形態では、非卵巣組織は、血液である。別の実施形態では、非卵巣組織は、骨髄である。

【0070】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物は、核を含まない細胞の細胞質である。別の実施形態では、少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物は、ミトコンドリアの精製調製物である。

【0071】

別の態様では、本発明は、以下：ａ）卵母細胞にオートロガスである少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアを含む組成物を取得するステップ；及びｂ）ミトコンドリアの組成物を卵母細胞に注入するステップを含む方法によって調製される卵母細胞を提供する。

【0072】

本発明のまた別の態様は、少なくとも１つのＯＳＣ又はＯＳＣの少なくとも１つの子孫から得られるミトコンドリアの組成物を提供し、この組成物は、約７５％、８５％、９０％、若しくは約９９％超のミトコンドリアが、高ＡＴＰ生産能ミトコンドリアである、ミトコンドリアの集団を含む。

【0073】

さらに別の態様では、本発明は、約５％〜約２５％未満のｍｔＤＮＡが、ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド８４７０〜１３４４７内に欠失突然変異を有する、ミトコンドリアの集団を含む組成物と、このような組成物に関する方法を提供する。

【0074】

本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかになるだろう。従って、本発明の他の態様を以下の開示内容に記載するが、これらは本発明の範囲に含まれる。

【0075】

以下の詳細な説明は、例として記載するが、記載される特定の実施形態に本発明を限定する意図はなく、参照として本明細書に組み込む添付の図面と一緒に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0076】

【図1】ＯＳＣ単離のための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づくプロトコルの実証を示す。図１ａには、ＶＡＳＡ発現（ＤＡＰＩ対比染色）の免疫蛍光分析を、ＶＡＳＡのＮＨ_２又はＣＯＯＨ末端に対する抗体を用いた成体マウス卵巣において示す（スケールバー、５０μｍ）。図１ｂには、分散マウス卵巣又は単離卵母細胞の免疫磁気分離を、ＶＡＳＡのＮＨ_２又はＣＯＯＨ末端に対する抗体を用いて示す。画分１は、分離前の細胞とビーズを含み、画分２は、洗浄若しくは通過画分（非免疫反応性）であり、また、画分３は、ビーズ画分（ＶＡＳＡ陽性細胞）である。図１ｃには、ＶＡＳＡのＮＨ_２又はＣＯＯＨ末端に対する抗体を用いた分散マウス卵巣からの生存細胞若しくは透過処理細胞のＦＡＣＳ分析を示す。生存ＶＡＳＡ陽性細胞は、ＣＯＯＨ抗体でしか検出されない（点線の四角）が、透過処理によって、ＮＨ_２抗体を用いたＶＡＳＡ陽性細胞の単離が可能になる（点線の四角）。図１ｄでは、ＣＯＯＨ抗体で得られた生存ＶＡＳＡ陽性細胞の透過処理（点線の四角）によって、ＮＨ_２抗体を用いたＦＡＣＳによる同じ細胞の再単離が可能になる（点線の四角）。図１ｅには、生存ＯＳＣの単離のためにＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いたＦＡＣＳプロトコルの概略図を示す。図１ｆは、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いたＯＳＣのＦＡＣＳによる単離用の細胞を得るための卵巣分散工程中に調製された各細胞画分における、生殖細胞系マーカ［Ｂｌｉｍｐ１（ＺＮＦドメインと共に１を含むＰＲドメイン、若しくはＰｒｄｍ１とも呼ばれる）、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ（インターフェロン誘導貫膜タンパク質３若しくはＩｆｉｔｍ３とも呼ばれる）、Ｔｅｒｔ（テロメラーゼ逆転写酵素）、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ（無精子症などで欠失する）］及び卵母細胞マーカ［Ｎｏｂｏｘ（卵胞特異的ホメオボックス）、Ｚｐ３（透明帯糖タンパク質３）、Ｇｄｆ９（増殖分化因子９）］の遺伝子発現分析を表す（＋ｖｅ、ＦＡＣＳ後のＶＡＳＡ陽性生存細胞画分；−ｖｅ、ＦＡＣＳ後のＶＡＳＡ陰性生存細胞画分；ＲＴなし、すなわち、逆転写なしのＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）。

【図2】混入卵母細胞を含む免疫磁気ビーズ分離による成体マウス卵巣から単離したＯＳＣ画分を表す。遺伝子発現分析の生殖細胞系マーカ（Ｂｌｉｍｐ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｔｅｒｔ、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ）及び卵母細胞特異的マーカ（Ｎｏｂｏｘ、Ｚｐ３、Ｇｄｆ９）が、若い成体マウス卵巣（陽性対照）又は分散した若い成体マウス卵巣のＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体に基づく免疫磁気ビーズ分離によって得られた最終細胞画分においてみとめられる（ＲＴなし、すなわち、逆転写なしの選別細胞ＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）。

【図3】ＦＡＣＳを用いた、成体マウス及びヒト卵巣からのＶＡＳＡ陽性細胞の単離を表す。図３ａ及びｂには、ヒト（ａ）及びマウス（ｂ）ＯＳＣ単離のために用いた成体卵巣組織の典型的組織学的出現を示す。スケールバー、１００μｍ。図３ｃ及びｄには、ＶＡＳＡの細胞表面発現に基づくＦＡＣＳによって単離した生存細胞の形態を示す。スケールバー、１０μｍ。図３ｅは、出発卵巣材料及び新しく単離したＯＳＣの遺伝子発現プロフィールを提供し、ヒト組織分析のための例として３人の患者の評価を示す（ＲＴなし：逆転写なしのＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）。図３ｆ〜図３ｋには、マウス胚性幹細胞（ＥＣＳ）の注射から３週間後のマウスにおける腫瘍の発生と比較した、マウスＯＳＣの注射から２４週間後のマウスにおける腫瘍の非存在（３ｆ）を呈示する、奇形腫形成アッセイを、実験結果のまとめ（３ｋ）と一緒に示す（図３ｇ〜図３ｊ；パネル３ｈ〜３ｊは、３つ全ての胚葉由来の細胞の例を示し、パネル３ｈに神経前駆細胞を強調表示する（挿入））。

【図4】卵巣内移植後のマウスＯＳＣから得られた機能性卵を表す。図４ａ及びｂでは、５〜６ヵ月早くＧＦＰ発現ＯＳＣを注射した野生型マウスの卵巣において、ＧＦＰ陰性及びＧＦＰ陽性（ヘマトキシリン対比染色）卵母細胞を含む成長卵胞の例を示す。図４ｃには、５〜６ヵ月早くＧＦＰ発現ＯＳＣの卵巣内移植を受けた野生型雌マウスの誘導排卵後に、排卵したＧＦＰ陰性卵（卵丘−卵母細胞複合体中の）、並びにその結果、ＩＶＦによって発生した胚［例として２細胞、４細胞、充桑実胚（ＣＭ）及び初期胚盤胞（ＥＢ）期を示す］の例を示す。図４ｄ及び４ｅには、５〜６ヵ月早くＧＦＰ発現ＯＳＣの卵巣内移植を受けた野生型雌マウスの誘導排卵後に、卵管から得られたＧＦＰ陽性卵（卵丘−卵母細胞複合体中の）を示す。これらの卵を、野生型精子を用いて、体外受精させると、着床前発生によって進行した２細胞胚が得られ［ＧＥＰ陽性胚の例として２細胞、４細胞、８細胞、充桑実胚（ＣＭ）、拡張桑実胚（ＥＭ）、胚盤胞（Ｂ）及び孵化胚盤胞（ＨＢ）期を示す］、受精から５〜６日後に孵化中胚盤胞を形成した。

【図5】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス及びヒトＯＳＣによる生殖細胞コロニー形成を表す。ＶＡＳＡ発現の免疫蛍光に基づく分析を図５ｂ及び５ｄに；（ＤＡＰＩ対比染色を用いて）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上に樹立後のマウス（５ａ、５ｂ）及びヒト（５ｃ、５ｄ）ＯＳＣによって形成された典型的生殖細胞コロニーにおいて示す（典型的コロニーを白い点線で強調表示する）。

【図6】規定培地におけるマウス及びヒト卵巣由来のＶＡＳＡ陽性細胞の評価を表す。図６ａ〜６ｄは、ＭＥＦ非含有培地中に維持したマウス（６ａ、６ｂ）及びヒト（６ｃ、６ｄ）ＯＳＣにおけるＶＡＳＡ発現及びＢｒｄＵ組込みの二重検出によるＯＳＣ増殖の評価を示す。図６ｅは、継代、並びに２４ウェル培養プレートにおけるウェル当たり２．５×１０^４細胞の接種後のマウスＯＳＣのＭＥＦ非含有培養についての典型的増殖曲線を示す。図６ｆは、数か月後の増殖後（図示する例では、継代４５）のマウスＯＳＣにおけるＶＡＳＡの細胞表面発現を検出するために、ＣＯＯＨ抗体を用いたＦＡＣＳ分析を示す。図６ｇは、出発卵巣材料、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏでの４か月以上の増殖後の培養マウス及びヒトＯＳＣの遺伝子発現プロフィールを示す（ＲＴなし、すなわち、逆転写なしのＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）。２人の患者から樹立した２つの異なるヒトＯＳＣ系（ＯＳＣ１及びＯＳＣ２）を例として示す。図６ｈ及び６ｉは、ＭＥＦ非含有培地中のマウス（ｈ）及びヒト（ｉ）ＯＳＣにおけるＢＬＩＭＰ１、ＳＴＥＬＬＡ及びＦＲＡＧＩＬＩＳ発現の典型的免疫蛍光分析を示す。細胞は、核ＤＮＡ及び細胞質Ｆ−アクチンをそれぞれ視覚化するために、ＤＡＰＩ及びローダミン−ファロイジンで対比染色した。

【図7】培養したマウス及びヒトＯＳＣからの自然卵形成を表す。図７ａ〜７ｃは、培養中のマウスＯＳＣによって形成された未成熟卵母細胞の例を提供する図であり、形態学的評価（７ａ）、卵母細胞マーカタンパク質ＶＡＳＡ及びＫＩＴ（７ｂ；ＶＡＳＡの細胞質局在化に注意）、並びに卵母細胞マーカ遺伝子Ｖａｓａ、Ｋｉｔ、Ｍｓｙ２（Ｙボックスタンパク質２若しくはＹｂｘ２とも呼ばれる）、Ｎｏｂｏｘ、Ｌｈｘ８、Ｇｄｆ９、Ｚｐ１、Ｚｐ２及びＺｐ３をコードするｍＲＮＡの存在（７ｃ；ＲＴなし、すなわち、逆転写なしのＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）を示す。スケールバー、２５μｍ。図７ｄは、継代、並びに２４ウェル培養プレートにおけるウェル当たり２．５×１０^４細胞の接種から２４、４８及び７２時間後のマウスＯＳＣによって形成された未成熟卵母細胞の数を示す（決定のために各時点で、培養上澄みを回収した。従って、これらの値は、各々２４時間のブロックにわたって産生された数を表し、卵丘の数ではない；平均±ＳＥＭ、ｎ＝３つの独立した培養物）。図７ｅ〜７ｇは、ヒトＯＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏ卵形成を示し、培養中のヒトＯＳＣによって形成された未成熟卵母細胞の例（７ｆ、形態学；７ｇ、卵母細胞マーカタンパク質ＶＡＳＡ、ＫＩＴ、ＭＳＹ２及びＬＨＸ８の発現）並びに継代、及び２４ウェル培養プレートにおけるウェル当たり２．５×１０^４細胞の接種後に形成された数（７ｅ；平均±ＳＥＭ、ｎ＝３つの独立した培養物）を示す。マウスＯＳＣ由来の卵母細胞についての結果と共に、ヒトＯＳＣ由来の卵母細胞における卵母細胞マーカ遺伝子（Ｖａｓａ、Ｋｉｔ、Ｍｓｙ２、Ｎｏｂｏｘ、Ｌｈｘ８、Ｇｄｆ９、Ｚｐ１、Ｚｐ２及びＺｐ３）をコードするｍＲＮＡの存在をパネルｃに示す。スケールバー、２５μｍ。図７ｈには、免疫蛍光検出の減数分裂組換えマーカ、ＤＭＣ１（ｍｃｋ１相同体の用量サプレッサー）及びＳＹＣＰ３（シナプトネマ構造タンパク質３）（ＤＡＰＩ対比染色）を、培養したヒトＯＳＣの核において示す：ヒト卵巣間質細胞を負の対照として用いた。図７ｉには、継代から７２時間後の培養ヒトＯＳＣのＦＡＣＳによる倍数性分析を示す。培養ヒト線維芽細胞（負の対照）及び培養マウスＯＳＣの倍数性分析の結果を図９に示す。

【図8】成人卵巣における卵母細胞特異的マーカの検出を表す。成人卵巣皮質細胞における卵母細胞でのＶＡＳＡ（８ａ）、ＫＩＴ（８ｂ）、ＭＳＹ２（８ｃ）及びＬＨＸ８（８ｄ）発現の免疫蛍光分析を示す（図１０ｈも参照）。核の視覚化のために、切片をＤＡＰＩで対比染色した。スケールバー、２５μｍ。

【図9】培養中のヒト線維芽細胞及びマウスＯＳＣの倍数性分析を表す。図９ａ及び９ｂは、活発に分裂するヒト胎児腎線維芽細胞の培養物（９ａ）及び継代から４８時間後に回収したマウスＯＳＣ（９ｂ）における倍数性状態の典型的なＦＡＣＳ評価を示す。半数体（１ｎ）細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持したヒトＯＳＣの分析の結果（図７ｉ）と一致して、生殖細胞系培養物中にしか検出されなかったが、全ての培養物が、細胞の二倍体（２ｎ）及び四倍体集団（４ｎ）を含んでいた。

【図10】ヒト卵巣組織におけるヒトＯＳＣからの卵母細胞の産生を表す。分散、ＧＦＰ−ｈＯＳＣとの再凝集（１０ａ）及び２４〜７２時間にわたるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養（１０ｂ、１０ｃ）後のヒト卵巣皮質組織の直接（生存細胞）ＧＦＰ蛍光分析を示す。卵胞に類似する緊密な構造で、より小さなＧＦＰ陰性細胞に取り囲まれる大きなＧＦＰ陽性単細胞の形成に注意されたい（図１０ｂ及び１０ｃ；スケールバー、５０μｍ）。ＧＦＰ−ｈＯＳＣを注射して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスに異種移植した成人卵巣皮質組織におけるＧＦＰ陽性卵母細胞（黒い矢印で示す；ヘマトキシリン対比染色に対して）を含む未成熟卵胞の例を示す（図１０ｄ、移植から１週間後；図１０ｆ、移植から２週間後）。同じ移植片におけるＧＦＰ陰性卵母細胞を含む同等の卵胞に注意されたい。負の対照として、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射及び異種移植の前のヒト卵巣皮質組織（１０ｅ）又は異種移植の前にビヒクル注射（ＧＦＰ−ｈＯＳＣなし）を受けたもの（１０ｇ）における未成熟卵胞は、全て、上に示したサンプルと並行して行ったＧＦＰ検出のための処理の後、ＧＦＰ陰性卵母細胞を含んでいた。図１０ｈは、ＧＦＰ発現の二重免疫蛍光分析、並びにＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射を受けた異種移植片における複糸期卵母細胞特異的マーカＭＳＹ２又は卵母細胞転写因子ＬＨＸ８のいずれかを示す。ＧＦＰは、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射前の移植片に検出されなかったが、ＭＳＹ２及びＬＨＸ８が、全ての卵母細胞に検出されたことに注意されたい。核の視覚化のために、切片をＤＡＰＩで対比染色した。スケールバー、２５μｍ。

【図11】ＧＦＰ−ｈＯＳＣ移植後のヒト卵巣異種移植片における卵母細胞形成の形態計測に基づく評価を表す。３つのランダムに選択したヒト卵巣皮質組織サンプル（標識１、２及び３）における原始及び一次卵胞の総数を示すが、これらは、ＧＦＰ−ｈＯＳＣの注射及びＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの異種移植から７日後であり、ＧＦＰ陰性（宿主由来）又はＧＦＰ陽性（ＯＳＣ由来）卵母細胞を含む（例えば、図１０ｄ〜１０ｇを参照）。

【図12】ヒト卵巣皮質組織及び新しく単離したヒトＯＳＣの低温保存及び解凍を表す。図１２ａ及び１２ｂは、ガラス化前後の成人卵巣皮質組織の組織学的外観を示し、組織統合性の維持及び凍結−解凍処置に耐えて生存する多数の卵母細胞を強調表示する（黒の矢印）。図１２ｃでは、新しく単離したヒトＯＳＣの凍結−解凍後の細胞喪失のパーセントを示す（２人の患者から得られた結果）。

【図13】オートロガス生殖細胞系ミトコンドリアエネルギー移動（ＡＵＧＭＥＮＴ）方法の概要を表す図である。エネルギー移動のためのミトコンドリアの供給源として用いられるＯＳＣ、並びにＯＳＣミトコンドリアを受ける、受精させようとする卵は、同じ被検者から得られることに注意されたい。

【図14】同じ患者から得られた培養ヒト卵巣体細胞及び培養ヒトＯＳＣにおけるＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍ７５１４，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるミトコンドリア染色を表す。

【図15】培養ＯＳＣ及び患者一致卵巣体細胞由来のｍｔＤＮＡの４９７７ｂｐ欠失のＰＣＲ分析を示す。

【図16】ＡＴＰアッセイの結果を表す。

【図17】細胞を単離するためにＶａｓａの細胞表面発現を用いた、雌生殖周期の発情期中の成体雌マウスの骨髄調製物からのＦＡＣＳによる生殖細胞精製又は単離を表す。

【図18】細胞を単離するためにＶａｓａの細胞表面発現を用いた、雌生殖周期の発情期中の成体雌マウスの末梢血調製物からのＦＡＣＳによる生殖細胞精製又は単離を表す。

【図19】ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＭ７５１４による染色及び細胞溶解後のミトコンドリアを表す。ヒトＯＳＣをＭ７５１４と一緒にインキュベートした後、溶解することにより、浸透圧衝撃を用いて、染色したミトコンドリアを放出させた。集団全体（溶解細胞及び残る非溶解染色細胞からのミトコンドリア）をＦＡＣＳによって分析した。左のパネルは、溶解細胞からのミトコンドリアを示すが、これらは、大きさに基づいて、残りの非溶解細胞に含まれるミトコンドリアから容易に識別することができる（前方散乱、ＦＳＣ−Ａ）。蛍光強度（ＦＩＴＣ−Ａ）によって、溶解細胞由来のミトコンドリアの２つの異なる集団が明らかにされ、１つは高い強度（Ｍｉｔｏ Ｍｔ高）を、もう１つは低い強度（Ｍｉｔｏ Ｍｔ低）を有していた。機能性ミトコンドリアは、より高い取込み及び色素の保持を有することがわかっており、従って、より高い強度で蛍光を放出する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｔａｆｆ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。

【図20】異なるヒト細胞型から単離したミトコンドリアによるＡＴＰ産生能の動態を表す。

【図21】異なるヒト細胞型から単離したミトコンドリアによる１０分間のＡＴＰ産生能の動態を表す。

【図22】ヒト間葉系幹細胞及びヒト卵巣体細胞におけるｍｔＤＮＡ欠失分析を示す。

【発明を実施するための形態】

【0077】

定義
別途定義されていない限り、本明細書で用いる技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。不一致が生じる場合には、定義を含む本願が優先されるものとする。

【0078】

雌性生殖系幹細胞としても知られる「卵原幹細胞」（ＯＳＣ）は、出生後の供給源から得られるものであり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、並びに場合によってはＳＳＥＡなどのマーカを発現する。ＯＳＣは、有糸分裂能があり（すなわち、有糸分裂することができる）、増殖／分化因子９（「ＧＤＦ−９」）などの卵母細胞マーカ、及び透明帯糖タンパク質（例えば、透明帯糖タンパク質３、「ＺＰ３」）、又はシナプトネマ構造タンパク質３（「ＳＹＣＰ３」若しくは「ＳＣＰ３」）などの減数分裂組換えのマーカを発現しない。ＯＳＣは、出生後の卵巣から得ることができる。ＯＳＣは当分野では公知であり、米国特許第７，９５５，８４６号明細書に記載されており、この文献の全内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。さらに、ＯＳＣは、以下：Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２８：１４５−１５０；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００５ １２２：３０３−３１５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２０１０ ９：３３９−３４９；Ｎｉｉｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｉｎｇ ２０１０ ２：９９９−１００３；Ｔｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２００９ ８０：２−１２，Ｔｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ２００９ １５：３９３−３９８；Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６；Ｐａｃｃｈｉａｒｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０１０ ７９：１５９−１７０）にも記載されており、これらの文献の内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。好ましくは、本発明のＯＳＣは、ヒトＯＳＣである。

【0079】

本明細書で用いる場合、「ＯＳＣの子孫」は、本発明のＯＳＣに由来する全ての娘細胞を指し、卵形成能力（すなわち、卵母細胞を形成する能力）及び機能性ミトコンドリアを維持若しくは達成する始原細胞及び分化細胞が含まれる。好ましくは、本発明のＯＳＣ子孫は、ヒトＯＳＣ子孫である。

【0080】

本明細書で用いる場合、「機能性ミトコンドリア」という用語は、ＡＴＰを生産するミトコンドリアを指し、用語「呼吸するミトコンドリア」と置換え可能に用いることができる。

【0081】

ＯＳＣは、また、骨髄、末梢血又は臍帯血からも得ることができる。本発明の骨髄由来ＯＳＣは、身体全体に循環させてもよく、最も好ましくは、骨髄、臍帯血及び卵巣に局在化させてよい。骨髄由来のＯＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ、並びに場合によってはＮｏｂｏｘ、Ｋｉｔ及びＳｃａ−１などのマーカを発現する。骨髄由来のＯＳＣは、有糸分裂能があり（すなわち、有糸分裂することができる）、かつ、ＧＤＦ−９、透明帯糖タンパク質（例えば、ＺＰ３）又はＳＣＰ３を発現しない。骨髄由来のＯＳＣについて、さらに詳しくは、米国特許第２００６００１０５０９号明細書を参照されたい。尚、この文献の全内容は、骨髄におけるＯＳＣの説明のために、参照として本明細書に組み込むものとする。末梢血及び臍帯血由来のＯＳＣについて、さらに詳しくは、米国特許第２００６００１５９６１号明細書を参照されたい。尚、この文献の全内容は、末梢血におけるＯＳＣの説明のために、参照として本明細書に組み込むものとする。

【0082】

Ｏｃｔ−４は、ＰＯＵドメインクラス５転写因子１若しくはＰｏｕ５ｆ１とも呼ばれ、雌性生殖系幹細胞及びその始原細胞に発現する遺伝子である。Ｏｃｔ−４遺伝子は、哺乳動物生殖細胞系の樹立に関与する転写因子をコードし、初期生殖細胞分化決定に有意な役割を果たす（Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９９１ ７（１０）：３２３−３２９を参照）。発生中の哺乳動物胚において、Ｏｃｔ−４は、胚盤葉上層の分化中に下方制御され、その結果、生殖細胞系に閉じ込められることになる。生殖細胞系では、Ｏｃｔ−４発現は、胚盤葉上層発現とは別に調節される。Ｏｃｔ−４の発現は、全能性の表現型マーカである（Ｙｅｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９６ １２２：８８１−８８８）。

【0083】

Ｓｔｅｌｌａは、一般に、発生多分化能関連３若しくはＤｐｐａ３とも呼ばれ、雌性生殖系幹細胞及びそれらの始原細胞に発現する遺伝子である。Ｓｔｅｌｌａは、始原生殖細胞及びその子孫（卵母細胞など）に特異的に発現する新しい遺伝子である（Ｂｏｒｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４ ４（２）：１−５）。Ｓｔｅｌｌａは、ＳＡＰ様ドメイン及びスプライシング因子モチーフ様構造を有するタンパク質をコードする。Ｓｔｅｌｌａ発現が欠損した胚は、着床前発生が損なわれ、稀にしか芽細胞期に到達しない。従って、Ｓｔｅｌｌａは、初期胚発生に関与する母性因子である。

【0084】

Ｄａｚｌは、雌性生殖系幹細胞及びその始原細胞に発現する遺伝子である。常染色体遺伝子Ｄａｚｌは、共通ＲＮＡ結合ドメインを含む遺伝子のファミリーのメンバーであり、生殖細胞に発現する。マウスにおいてインタクトなＤａｚｌタンパク質の発現の欠失は、生殖細胞が減数分裂前期を完了できないことに関連する。特に、Ｄａｚｌが欠損した雌マウスでは、減数分裂前期を通した生殖細胞の進行と同時期の胎児期の間に生殖細胞の喪失が起こる。Ｄａｚｌが欠損した雄マウスでは、生殖細胞は、減数分裂前期Ｉのレプトテン期を越えて進行することができない。従って、Ｄａｚｌの非存在下では、有糸分裂前期を通した進行が中断する（Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２００３ １２６：５８９−５９７）。

【0085】

Ｖａｓａは、ＤＥＡＤボックスポリペプチド４（配列番号１として開示される「ＤＥＡＤ」）又はＤｄｘ４とも呼ばれ、雌性生殖系幹細胞及びその始原細胞に発現する遺伝子である。Ｖａｓａは、ＤＥＡＤファミリー（配列番号１として開示される「ＤＥＡＤ」）ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼをコードする生殖質の成分である（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９４ １２０：１２０１−１２１１；Ｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８８ ３３５；６１１−１６７）。Ｖａｓａの分子機能は、生殖細胞樹立（例えば、Ｏｓｋａｒ及びＮａｎｏｓ）、卵形成、（例えば、Ｇｒｕｋｅｎ）、及び翻訳開始（Ｇｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９６ １１０：５２１−５２８）に関与する標的ｍＲＮＡに結合することに向けられる。Ｖａｓａは、極細胞形成に必要であり、発生全体を通して専ら生殖細胞系に制限される。従って、Ｖａｓａは、ほとんどの動物種における生殖細胞系の分子マーカである（Ｔｏｓｈｉａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ２００１ ２６：１３１−１３６）。

【0086】

ステージ特異的胎児抗原は、任意選択で雌の生殖細胞系幹細胞に発現させ、また、本発明の雌の生殖細胞系幹細胞に発現させる。ステージ特異的胎児抗原−１（ＳＳＥＡ−１）は、細胞表面胎児抗原であり、その機能は、細胞接着、遊走及び分化に関連している。胚盤葉下層形成中に、ＳＳＥＡ−１陽性細胞は、胞胚腔及び胚盤葉下層に、また後に生殖三日月環にみいだすことができる。ＳＳＥＡ−１は、初期生殖細胞及び神経細胞発生において機能する（Ｄ’Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９９ ４３（４）：３４９−３５６；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００２ ２０：３２９−３３７）。特定の実施形態では、雌性生殖系幹細胞におけるＳＳＥＡの発現は、細胞が分化するにつれて起こりうる。本発明で有用なＳＳＥＡとして、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−２、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４がある。

【0087】

本明細書で用いる場合、「オートロガス」という用語は、同じ被検者から得られる生物学的組成物を指す。一実施形態では、生物学的組成物は、ＯＳＣ、ＯＳＣ由来の組成物及び卵母細胞（すなわち、成熟卵母細胞）を含む。従って、本発明の方法を実施する上で、移入に用いる雌性生殖細胞の細胞質又はミトコンドリア、並びに前述の組成物を移入するレシピエント卵母細胞は、同じ被検者から得られる。

【0088】

本明細書で用いる場合、「単離された」という用語は、その天然の生物学的環境から物理的に分離された、又は取り出された、ＯＳＣ、ＯＳＣ由来のミトコンドリア又は組成物（例えば、細胞質、ミトコンドリア調製物）を指す。単離されたＯＳＣ、ミトコンドリア又は組成物を精製する必要はない。

【0089】

本明細書で用いる場合、「外性」という用語は、１つの細胞から取り出され、別の細胞に移入される、移入細胞材料（例えば、ミトコンドリア）を指す。例えば、卵母細胞に移入されたＯＳＣ由来のミトコンドリアは、たとえ両者が同じ被検者に由来する場合でも、外性である。

【0090】

「被検者」とは、哺乳類のあらゆる胎生メンバーであり、このような動物として、ヒト、飼育及び農場動物、及び動物園、競技又はペット動物、例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、畜牛及び高等霊長類が挙げられる。

【0091】

本明細書で用いる用語「高い母体年齢」は、ヒトに関する場合、３４歳以上の女性を指す。本明細書で用いる用語「卵母細胞に関連する不妊症」は、ヒトに関する場合、解剖学的異常（例えば、卵管閉塞）又は疾病状態（例えば、子宮筋腫、重度の子宮内膜症、ＩＩ型糖尿病、多嚢胞性卵巣）が原因ではなく、１年間の避妊なしの性交後に受精することができないことを指す。

【0092】

本明細書で用いる用語「低い卵巣予備能」は、ヒトに関する場合、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，１９８９ ５１：６５１−４に記載されているように、「Ｄａｙ３ＦＳＨ試験」で、１５ｍｉｕ／ｍｌを超える循環卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、又は０．６ｎｇ／ｍｌ未満の循環抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、又は７未満の胞状卵胞数（超音波によって測定される）を示す女性を指す。

【0093】

本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法で定義される意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味すると考えてよく；同様に、「〜からほぼ構成される」又は「ほぼ構成する」は、米国特許法で定義される意味を有し、この用語には制限がなく、記載されるものより多い存在によって記載されるものの基本的若しくは新規の特徴が変化しない限り、記載されるものより多い存在を許容するが、従来技術の実施形態は除外する。

【0094】

本明細書で用いる場合、「低下（低減）した」又は「低下（低減）する」又は「減少する」という用語は、一般に、この用語が本明細書において定義されているように、また、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）を達成する方法によって決定されるように、基準レベルと比較して、少なくとも５％の減少、例えば、少なくとも約１０％の減少、又は少なくとも約２０％の減少、又は少なくとも約３０％の減少、又は少なくとも約４０％の減少、又は少なくとも約５０％の減少、又は少なくとも約６０％の減少、又は少なくとも約７０％の減少、又は少なくとも約８０％の減少、又は少なくとも約９０％の減少、又は１００％以下の減少（すなわち、実質的に存在しないか、若しくは検出レベルに満たない）、あるいは、５〜１００％のいずれかの減少を意味する。

【0095】

本明細書で用いる場合、「増加する」という用語は、一般に、この用語が本明細書で定義されているように、また、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）を達成する方法によって決定されるように、基準レベルと比較して、少なくとも５％の増加、例えば、少なくとも約１０％の増加、又は少なくとも約２０％の増加、又は少なくとも約３０％の増加、又は少なくとも約４０％の増加、又は少なくとも約５０％の増加、又は少なくとも約６０％の増加、又は少なくとも約７０％の増加、又は少なくとも約８０％の増加、又は少なくとも約９０％の増加、又は１００％以下の増加（すなわち、検出レベルを実質的に超える）、あるいは、５〜１００％のいずれかの増加を意味する。

【0096】

本明細書で用いる場合、「ＡＴＰ産生又は生産の増加」とは、この用語が本明細書で定義されているように、基準レベルでのＡＴＰ生産の量と比較して、少なくとも約１倍（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、１０，０００倍以上）多いＡＴＰ生産の量を指す。ＡＴＰ生産は、当分野では公知の標準的方法によって測定することができる。

【0097】

本明細書で用いる場合、「高ＡＴＰ産生能ミトコンドリア」とは、高及び低（又は高及び中／低）膜電位を識別することができるプローブによって決定される、高いミトコンドリア膜電位を有するミトコンドリアを指す。高いミトコンドリア膜電位を有するミトコンドリアを識別する１つの方法は、蛍光プローブ５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨウ化物（ＪＣ−１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔ３１６８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するものであり、このプローブは、質の高いミトコンドリアでは、赤−オレンジ色（５９０ｎｍ）の蛍光を発するが、質が中程度及び／又は低いミトコンドリアでは緑色（５１０〜５２０ｎｍ）の蛍光を発する。（例えば、以下を参照：Ｇａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９９７ ５７：１４０１−１４０６；Ｒｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１ ３０：４４８０−４４８６；Ｃｏｓｓａｒｉｚａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９３ １９７：４０−４５；Ｓｍｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９１ ８８：３６７１−３６７５）。

【0098】

本明細書で用いる場合、「標準」又は「基準（参照）」という用語は、測定された生物学的パラメータを指し、限定するものではないが、別のサンプルと比較する既知のサンプルにおける、異数性、突然変異、染色体のミスアラインメント、減数分裂紡錘体異常、及び／又はミトコンドリア機能不全（凝集、ＡＴＰ生産の障害）などの欠陥、又は、このような欠陥の低減若しくは排除を含み；あるいは、標準は、単純に、比較のためのベースラインを画定する、測定された生物学的パラメータの量を表す基準数である場合もある。基準数は、個体から採取したサンプル、又は個体の集団若しくはそこから得られた細胞（例えば、卵母細胞、ＯＳＣ）のいずれからも得ることができる。すなわち、「標準」は、試験するサンプルである必要はなく、許容される基準数又は値であってもよい。個体の状態（例えば、年齢、性別、体重、身長、民族的背景など）を考慮に入れた一連の標準を作成することができる。標準レベルは、例えば、異なる個体（例えば、試験しようとする個体以外の）由来の既知サンプルから得ることができる。既知サンプルは、平均化集団に対する標準を得るために、複数の個体（又はそこから得られた細胞）由来のサンプルをプールすることにより取得することもできる。さらに、標準は、一連の標準を用いて、個体のサンプルにおける生物学的パラメータを定量するように、標準を合成することもできる。試験しようとする個体由来のサンプルは、早期の時点（おそらく治療の開始前）で取得することができ、治療の開始後に同じ個体から採取したサンプルと比較される標準若しくは基準として役立つ。こうした例では、標準は、治療の効果の測度を提供することができる。特定の実施形態では、「標準」若しくは「基準」は、卵巣体細胞（例えば、機能性生殖系を有する女性被検者から得られる年齢相応の卵巣体細胞）又は年齢相応の間葉系幹細胞である。

【0099】

本明細書に記載する範囲は、その範囲に含まれる値の全てを意味すると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０からなる群からの、あらゆる数、数の組合せ、又は小範囲を含むと理解される。

【0100】

その他の定義は、本明細書全体を通して本文に記載される。

【0101】

本発明の組成物及び方法
ＯＳＣの単離
小さな（例えば、３×３×１ｍｍ）卵巣皮質生検を採取するための、当分野では公知の小規模な腹腔鏡手術を用いて、成体卵巣皮質組織を得ることができ、次に、これをＯＳＣ単離のために処理する。Ｇｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００４ ２０（１）：７２−７８を参照。

【0102】

成体卵巣皮質組織からのヒトＯＳＣの単離は、実施例１、図１又は当分野で既述のように、あるいは、同等の技術を用いて、実施することができる。例えば、米国特許第２００６００１０５０８号明細書の段落０１１６、及びＺｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００９ ５：６３１−６．Ｅｐｕｂ ２００９ Ａｐｒ １２を参照されたい。ＯＳＣはまた、骨髄又は末梢血などの非卵巣供給源から得ることもできる。骨髄又は末梢血由来のＯＳＣは、例えば、骨髄又は血液から幹細胞を分離するための当分野では公知の標準的手段（例えば、細胞選別）によって単離することができる。任意選択で、単離プロトコルは、造血細胞を除去したｋｉｔ＋／ｌｉｎ−画分の作製を含む。ＯＳＣにおける遺伝子発現（例えば、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ）の特有のプロフィールに基づく別の選択手段を用いて、所望の細胞集団をさらに精製若しくは単離し、これらを取得した生体サンプル（例えば、骨髄、末梢血）から他の細胞及び物質を低減若しくは排除することができる。例えば、実施例１、図１ｂに記載する方法は、非卵巣供給源から、精製若しくは単離したＯＳＣを取得するために、血液細胞及び骨髄細胞の単核画分に適用されている。手短には、ウサギ抗ＶＡＳＡ抗体（ａｂ１３８４０；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と一緒に細胞を２０分間インキュベートした後、洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合させたヤギ抗−ウサギＩｇＧと一緒に２０分間インキュベートした後、再度洗浄した。負の（非染色で、一次抗体なし）対照に対してゲーティングした、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩサイトメーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、溶出液中の標識細胞を単離した。死滅細胞を排除するための選別の直前に、ヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に添加した。非卵巣供給源からＯＳＣを単離するために、Ｖａｓａの細胞表面発現を用いて得られた結果を図１７及び１８に示すが、これらの図面には、雌性生殖周期の発情期中の成体雌マウスに由来する骨髄及び末梢血調製物のＦＡＣＳによる生殖細胞精製を示す。

【0103】

ＯＳＣ由来の組成物の作製及び移入方法
ミトコンドリアの作製及び移入方法は、当分野では公知であり、当分野で既述されているように、又は同等の技術を用いて、実施することができる。例えば、Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２００７ ３：５２４−３３．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｏｃｔ １３、及びＰｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０００，４０３：５００−１（これらの各内容は、参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。手短には、前述したように、ＯＳＣを単離した後、培養することができる。一方法では、ＯＳＣ培養物が、８０％培養飽和密度に達したら、２ｍｌのミトコンドリア溶解バッファー（０．３Ｍショ糖、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＢＳＡ）を各プレートに添加し、セルスクレーパーを用いて、細胞を回収する。細胞懸濁液を小ガラス製組織ダウンサーに移して、滑らかになるまで均質化（約１０往復行程）した後、溶解物を４℃にて３０分間６００ｇで遠心分離する。上澄みを回収し、４℃にて１２分間１０，０００ｇでスピンした後、得られた粗ミトコンドリアペレットを０．２ｍｌの０．２５Ｍショ糖中に再懸濁させる。次に、このサンプルを０．２５Ｍショ糖で希釈した２５〜６０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）密度勾配で積層する。界面バンドを勾配から抽出して、２容量の０．２５Ｍショ糖で洗浄した後、４℃にて１０分間１４，０００ｇでの最終遠心分離にかけることにより、ミトコンドリアペレットを得る。

【0104】

ミトコンドリアペレットはまた、Ｆｒｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００７ ２：２８７−２９５（この内容は、参照として本明細書に組み込む）に記載されているように、調製することもできる。本発明の特定の実施形態では、ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）に非依存的様式で、ミトコンドリアに特異的に結合する蛍光プローブを含むＦＡＣＳによる方法を用いて、組織、細胞、溶解細胞、又はその画分中の全ＯＳＣ由来ミトコンドリア集団を単離、特性決定及び／又は列挙することができる。ＭＭＰ非依存的様式で、ミトコンドリアに特異的に結合する蛍光プローブとしては、限定するものではないが、蓄積依存性プローブ（例えば、ＪＣ−１（赤色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔ３１６８，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍ２２４２６，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＪＣ−１（緑色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔ３１６８，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。機能性（例えば、呼吸）ミトコンドリアは、限定するものではないが、非酸化依存性プローブ（例えば、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍ７５１４，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）など、ミトコンドリア塊を示すミトコンドリア追跡用プローブを用いて、大きさ及び蛍光強度に基づいて、選別及び収集することができ、好ましくは、残留する非溶解細胞及び非機能性ミトコンドリアは排除する。非酸化依存性プローブを用いて、ＦＡＣＳを実施するプロトコル例の詳細については、以下の実施例９に記載する。任意選択で、ＦＡＣＳによる方法は、ＭＭＰ依存的様式でミトコンドリアに特異的に結合するミトコンドリア膜蛍光プローブを用いて、機能性（例えば、呼吸）ミトコンドリアの実質的に純粋な集団を選択的に得るために使用することもできる。ＭＭＰ依存的様式でミトコンドリアに特異的に結合する蛍光プローブとしては、限定するものではないが、低酸化状態ミトトラッカー（ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）プローブ（例えば、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍ７５１３，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭ−Ｈ２ＴＭＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍ７５１１，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）がある。さらに、ＭＭＰ依存性及びＭＭＰ非依存性プローブを用いた二重標識を実施して、組織、細胞、溶解細胞又はこれらに由来する画分中の全ミトコンドリアに対する機能性ミトコンドリアの比率を定量することができる。特定の実施形態では、この比率は、約０．０２、０．０２５、０．０３３、０．０４、０．０５、０．１、又は約０．２を超える。ＭＭＰに基づく示差スクリーニングのためのプローブを用いる場合、スペクトルの色が、機能性ミトコンドリアを示す主要な決定因子であり、残留する非溶解細胞に依然として含まれるものから、溶解細胞から放出される蛍光ミトコンドリアを識別するのに、前方散乱を用いることができる。

【0105】

ミトコンドリアペレットはまた、Ｔａｙｌｏｒらにより、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ ２１（３）：２３９−４０；Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２００１ ２２（５）：９５０−９；及びＨａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１ ２７６（１９）：１６２９６−３０１に記載されているように、調製することができる。本発明の特定の実施形態では、実施例１０に記載するような示差遠心分離方法を用いて、又は本明細書の実施例１１に記載するようなショ糖密度勾配分離方法を用いて、組織、細胞、溶解細胞又はこれらの画分中の全ＯＳＣ由来ミトコンドリア集団を単離、特性決定及び／又は列挙することができる。

【0106】

単離後、ミトコンドリア機能又はｍｔＤＮＡ統合性（例えば、突然変異及び欠失）の評価を当分野では公知の方法に従って実施することができる（Ｄｕｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ２０１１ ９６（２）：３８４−３８８；Ａｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０ ３３：１−４；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２００５ １１（１２）：８４３−８４６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１１ １２：８及び実施例８）。機能性パラメータ（例えば、ＭＭＰ依存性／活性若しくはＭＭＰ非依存性／活性及び非活性）に従って選別したミトコンドリア又はあまり好ましくないＯＳＣ供給源（大きさが限定されたサンプルなど）からのミトコンドリアの集団を本発明の方法に従って取得することができる。本発明のミトコンドリア組成物は、例えば、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり約１ｐモルのＡＴＰ〜ｍｔＤＮＡｆｇ当たり約６ｐモルのＡＴＰ（例えば、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり約１、２、３、４、５、若しくは６ｐモルのＡＴＰ）を生産することができる。特定の実施形態では、ｍｔＤＮＡｆｇ当たり約１．０ｐモル〜１．４ｐモルのＡＴＰが、約１０分〜約１５分内に生産される。

【0107】

ミトコンドリアの集団中の突然変異のパーセンテージは、まず、生体サンプル中に存在するミトコンドリアの数を決定し、次に、サンプル中に存在するミトコンドリアＤＮＡのコピー数を決定することによって、評価することができる。標準突然変異分析を用いて、ミトコンドリアの数及びミトコンドリアＤＮＡのコピー数と比較することにより、ミトコンドリアの集団における突然変異のパーセンテージを計算することができる。例えば、本発明の組成物及び方法は、ミトコンドリアＤＮＡの約５％〜約２５％未満（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％〜約２５％）が、ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド８４７０〜１３４４７内に欠失突然変異を含む、ミトコンドリアの集団を提供することができる。

【0108】

当分野では公知の方法に従い、注射しようとする物質（例えば、ミトコンドリア懸濁液）をマイクロインジェクション用針に移す。マイクロインジェクション用針及びホールディングピペットは、Ｓｕｔｔｅｒ ｐｕｌｌｅｒ（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＤｅ Ｆｏｎｂｒｕｎｅ Ｍｉｃｒｏｆｏｒｇｅ（ＥＢ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅａｓｔ Ｇｒａｎｂｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて、達成することができる。マイクロインジェクション用針は、内径が５μｍで、先端が丸い。注射しようとする物質は、吸引圧によって針に吸引される。約１×１０^３〜約５×１０^４個のＯＳＣ又はその子孫由来のミトコンドリアを注射することができる（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８〜９×１０^３；約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９〜約５×１０^４個のミトコンドリア）。ピエゾ（Ｐｉｅｚｏ）マイクロマニピュレータを用いて、ショ糖中のミトコンドリア懸濁液（例えば、約１×１０^３〜約５×１０^４個のＯＳＣ又はその子孫由来のミトコンドリアを含む５〜７ｐｌ）を卵母細胞に注射することができる。マイクロインジェクション工程に耐えて生存する卵母細胞を、体外受精若しくは子宮内人工授精の前に、培養、並びに任意選択で、評価若しくは低温保存するために回収する。卵母細胞の低温保存の方法は、当分野では公知である。詳細については、例えば、Ｐｏｒｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０００ １６９：３３−３７；Ｍａｎｄｅｌｂａｕｍ， Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２０００ １５：４３‐４７；及びＦａｂｂｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０００ １６９：３９−４２（これらの内容は、参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。

【0109】

無核細胞質画分の調製及び移動方法は、当分野では公知であり、既述されているように実施することができる。例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９８ ４：２６９〜８０（これらの内容は、参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。手短には、一方法では、採卵から約４時間後に、レシピエント卵を０．１％ヒアルロニダーゼに暴露し、注射用の成熟卵を選択する。放線冠細胞を微細ピペットで全て除去する。卵細胞質の移入は、ＯＳＣ卵細胞質とインタクトなＭＩＩ卵母細胞の電気細胞融合によって実施することができる。０．１％ヒアルロニダーゼに暴露後、マイクロスピア（ｍｉｃｒｏｓｐｅａｒ）を用いて、帯層を機械的に切開する。ＯＳＣを、サイトカラシンＢ（ＣＣＢ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）含有のｈＨＴＦ培地に３７℃で１０分間暴露する。ヒトＭＩＩ卵母細胞の分割には、その感受性に応じた様々なサイトカラシンＢ濃度（約２．５ｍｇ／ｍｌ）を必要とする。原形質膜に囲まれている卵細胞質の１部分を取り出すことによって、様々な大きさの卵母細胞をＯＳＣから分離する。極体を除去したレシピエント卵の囲卵腔中にＯＳＣ由来の卵細胞質を挿入後に、マンニトール溶液中でのアラインメント及び電気細胞融合を実施する。これは、直径が約３０〜４０μｍの大孔径研磨マイクロツールを用いて、実施することができる。卵細胞質をマイクロツールに吸引し、囲卵腔の深部にツールを導入したら、放出する。電気細胞融合工程に耐えて生存する卵母細胞を、体外受精若しくは子宮内人工授精の前に、培養、並びに任意選択で、評価若しくは低温保存するために回収する。

【0110】

あるいは、無核細胞質画分又は単離ミトコンドリアの移入に関して、従来の卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）法を用いることもできる。例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９８ ４：２６９−８０（これらの内容は、参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。一例として、マイクロスピアを用いて、レシピエント卵の帯層を極体にわたって機械的に切開する。閉じたマイクロスピアで帯層を解剖することができるように、卵母細胞をホールディングピペット上に移した後、極体を除去する。同じ位置を用いて、極体が入っていた領域の約９０°左側に卵細胞質を挿入する。同じツールを用いて、帯層を密閉する。電気融合した細胞を洗浄し、ｍＨＴＦ中に４０〜９０分間インキュベートした後、ＩＣＳＩを実施する。ＩＣＳＩのために１０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中に精子を固定化する。この手順は、ｈＨＴＦ中で実施するが、その間、アパーチャの短辺は約３時である。標準ＩＣＳＩの間に、帯層の孔形成時に卵細胞質が押し出されるのを回避するために、ＩＣＳＩツールは人工の隙間から動かす。体外受精の方法は、当分野では公知である。カップル（夫婦）は、一般に、まず、その具体的不妊の問題を診断するために、評価される。これらは、両パートナーの不明な不妊症から、女性（例えば、生理不順又は多嚢胞性卵巣疾患を伴う非開存性卵管を引き起こす子宮内膜症）又は男性（例えば、形態異常を伴う低精子数、又は通常、脊髄病変を伴う射精不能、逆行性射精、又は精管切断術の逆転）の深刻な問題まで、多岐にわたりうる。これらの評価の結果によっても、各カップルについて実施すべき具体的方法を決定する。

【0111】

施術は、多くの場合、視床下部／下垂体系を下方制御する薬剤（ＧｎＲＨアゴニスト）の投与で開始する。この方法は、ゴナドトロピンの血清濃度を低下させ、発生する卵胞が退化するため、発生の初期に一群の新しい卵胞がもたらされる。これにより、視床下部下垂体軸による影響の非存在下で、外性ゴナドトロピンの投与によるこれら新しい卵胞の成熟をより正確に制御することが可能になる。超音波を用いた毎日の観察及び血清エストラジオールの決定により、成熟の進行及び増殖する卵胞（通常、卵巣当たり４〜１０個を刺激する）の数をモニターする。卵胞が排卵前期の大きさ（１８〜２１ｍｍ）に達し、エストラジオール濃度が線形に増加し続ける場合、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の外性投与により、排卵応答を開始させる。

【0112】

移植手順に続いて、個々の卵母細胞を形態学的に評価した後、培地及び熱不活性化血清を含むペトリ皿に移すことができる。精液サンプルが男性パートナーから提供されると、これを「スイムアップ」法を用いて処理し、これによって、最も活性の運動精子を授精のために取得する。女性の卵管が存在すれば、この時点で、ＧＩＦＴ（配偶子卵管内移植）と呼ばれる方法を実施することができる。この手法によって、精子が取り囲む卵母細胞−卵丘複合体を腹腔鏡検査法によって卵管に直接導入する。この方法は、通常の一連のイベントを最もよく刺激し、卵管内で受精が起こるようにすることができる。当然のことながら、ＧＩＦＴは、１９９０年に採卵を受けた３，７５０人の患者のうち、２２％が出産するという最も高い成功率を有する。別の方法ＺＩＦＴ（接合子卵管内移植）によって、採卵の翌日に、卵管に移植する体外受精卵の選択が可能である。余剰の受精卵は、将来の移植のために、又は雌性配偶子のないカップルへの供与のために、この時点で低温保存することができる。しかし、さらに重症の不妊障害を有するほとんどの患者は、子宮若しくは卵管への移植のために、初期卵割状態の着床前胚を選択することができるように、さらに１〜２日の培地中でのインキュベーションを必要とする。このＩＶＦ−ＵＴ（体外受精子宮移植）法は、複数、すなわち２〜６個の細胞（第２日）又は８〜１６（第３日）個の着床前胚の子宮底への頸管経由移植を必要とする（４〜５個の着床前胚が、最適な成功をもたらす）。

【0113】

体外受精の方法は、以下：米国特許第６，６１０，５４３号明細書、同第６，５８５，９８２号明細書、同第６，５４４，１６６号明細書、同第６，３５２，９９７号明細書、同第６，２８１，０１３号明細書、同第６，１９６，９６５号明細書、同第６，１３０，０８６号明細書、同第６，１１０，７４１号明細書、同第６，０４０，３４０号明細書、同第６，０１１，０１５号明細書、同第６，０１０，４４８号明細書、同第５，９６１，４４４号明細書、同第５，８８２，９２８号明細書、同第５，８２７，１７４号明細書、同第５，７６０，０２４号明細書、同第５，７４４，３６６号明細書、同第５，６３５，３６６号明細書、同第５，６９１，１９４号明細書、同第５，６２７，０６６号明細書、同第５，５６３，０５９号明細書、同第５，５４１，０８１号明細書、同第５，５３８，９４８号明細書、同第５，５３２，１５５号明細書、同第５，５１２，４７６号明細書、同第５，３６０，３８９号明細書、同第５，２９６，３７５号明細書、同第５，１６０，３１２号明細書、同第５，１４７，３１５号明細書、同第５，０８４，００４号明細書、同第４，９０２，２８６号明細書、同第４，８６５，５８９号明細書、同第４，８４６，７８５号明細書、同第４，８４５，０７７号明細書、同第４，８３２，６８１号明細書、同第４，７９０，８１４号明細書、同第４，７２５，５７９号明細書、同第４，７０１，１６１号明細書、同第４，６５４，０２５号明細書、同第４，６４２，０９４号明細書、同第４，５８９，４０２号明細書、同第４，３３９，４３４号明細書、同第４，３２６，５０５号明細書、同第４，１９３，３９２号明細書、同第４，０６２，９４２号明細書、及び同第３，８５４，４７０号明細書（これらの内容は、上記の方法の説明のために、参照として本明細書に明示的に組み込む）にも記載されている。

【0114】

あるいは、患者は、外性の、オートロガスＯＳＣミトコンドリアを含む卵母細胞を、子宮内人工授精（ＩＵＩ）を用いて、再移植及び体外受精させるように選択することもできる。ＩＵＩは、高度に濃縮された量の活性運動精子を調製し、これを頸管から子宮に直接送達することを含む、公知の方法である。ＩＵＩのための精子を調製するのに利用可能な複数の方法がある。第１に、精子を精液から分離する。精子分離の一方法は、「密度勾配分離」として公知である。この方法では、粘性溶液を用いて、運動精子を死滅精子及び他の細胞から分離する。調製後、薄く、柔軟なカテーテルを用いて、精子濃縮物を頸管から子宮に導入すると、再移植した卵母細胞の受精が起こる。

【0115】

本発明及びその多くの利点をさらに明瞭な理解を促す以下の例示的、非制限的実施例によって、本発明をさらに説明する。

【実施例】

【0116】

ここでは、承認されたプロトコルを用いて、ＯＳＣを健康な若い女性の組織から単離して、後の臨床処置に用いるためにｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖することができることを証明する。以下の実施例は、例示を目的として記載するに過ぎず、本発明者らがその発明と考えるものの範囲を限定することを意図するわけではない。

【0117】

実施例１：ＯＳＣ単離のためのＦＡＣＳによるプロトコル
免疫磁気分離によってマウスＯＳＣを単離するために、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６によって用いられるＶＡＳＡ抗体は、ヒトＶＡＳＡのＣＯＯＨ−末端の最後の２５アミノ酸に対するウサギポリクローナルである（ＤＤＸ４）（ａｂ１３８４０；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。この領域は、マウスＶＡＳＡ（ＭＶＨ）の対応領域と９６％の全体相同性を共有する。比較研究のために、ヒトＶＡＳＡのＮＨ_２−末端の最初の１４５アミノ酸に対するヤギポリクローナル抗体（ＡＦ２０３０；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いたが、これは、マウスＶＡＳＡの対応領域と９１％の全体相同性を共有する。

【0118】

いずれの抗体を用いた若い成体（生後２ヶ月）マウス卵巣の免疫蛍光分析も、予想通り、卵母細胞に制限されたＶＡＳＡ発現の同じパターンを示した（図１ａ）。次いで、分散した若い成体マウス卵巣組織の免疫磁気分離のために、各抗体を用いた（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６）。細胞の各調製のために、４匹のマウスからの卵巣をプールして、細かく刻んだ後、８００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ［ＩＶ型；カルシウム及びマグネシウムを除いたハンクス平衡塩類溶液中で調製される（ＨＢＳＳ）］と一緒に１５分のインキュベーション、続いて、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡと一緒に１０分のインキュベーションを含む２ステップ酵素消化により解離させた。消化は、細胞調製物における粘着性を最小限にするために、１μｇ／ｍｌＤＮａｓｅ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で実施し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の添加により、トリプシンを中和した。卵巣分散質を、７０μｍナイロンメッシュを介して濾過した後、ＨＢＳＳ中に、１％正常ヤギ血清（ＥＭＤ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨに対するａｂ１３８４０を用いた後の反応のために）又は１％正常ロバ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ＶＡＳＡ−ＮＨ_２に対するＡＦ２０３０を用いた後の反応のために）のいずれかを含む１％脂肪酸遊離ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から構成される溶液中で、氷上で２０分間ブロックした。次に、ＣＯＯＨ末端（ａｂ１３８４０）又はＮＨ_２末端（ＡＦ２０３０）のいずれかを認識するＶＡＳＡ抗体の１：１０希釈物と細胞を氷上で２０分間反応させた。その後、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄した後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ結合マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ａｂ１３８４０検出）又はビオチン結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ；ＡＦ２０３０検出）のいずれかの１：１０希釈物と一緒に氷上で２０分間インキュベートし、続いて、ストレプトアビジン結合マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と一緒にインキュベーションを行った。ＨＢＳＳ中でもう１回洗浄した後、製造業者の指定事項（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、細胞調製物をＭＡＣＳカラムにロードし、分離した。個々の卵母細胞と起こりうる抗体−ビーズ相互作用を視覚化する実験のために、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、１０ＩＵ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の注射、それから４６〜４８時間後のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、１０ＩＵ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の注射により、成体雌マウスを過排卵させた。ｈＣＧ注射から１５〜１６時間後、卵管から卵母細胞を採取し、ヒアルロニダーゼ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を用いて、卵丘細胞を除去してから、ＢＳＡを添加したヒト卵管液（ＨＴＦ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）で洗浄した。前述したように、分散した卵巣細胞又は単離した卵母細胞をブロックし、ＶＡＳＡに対して一次抗体と一緒にインキュベートした。ＨＢＳＳで洗浄した後、２．５μｍＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に結合した、種適性二次抗体と反応させた。Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）−Ｓ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｄｙｎａｌ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた分離のために、懸濁液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに導入した。

【0119】

ＶＡＳＡ−ＮＨ_２抗体を用いた場合には、ビーズ画分中に細胞は全く得られなかった；しかし、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いた場合、磁気ビーズに結合した５〜８μｍの細胞が観察された（図１ｂ）。これらの細胞の分析から、免疫磁気分離を用いて、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６により以前単離されたＯＳＣについて報告されたものと一致する生殖系遺伝子発現が明らかになった（図２）。ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いて同時に評価した単離卵母細胞は、非免疫反応性洗浄液画分に常に検出された（図１ｂ）が、免疫磁気分離によって得られたＶＡＳＡ陽性細胞画分の別のマーカ分析から、Ｎｏｂｏｘ、Ｚｐ３及びＧｄｆ９などの複数の卵母細胞特異的ｍＲＮＡが明らかになった（図２）。これらの知見から、卵母細胞は、個別の実体として分析すると、ＶＡＳＡの細胞表面発現を呈示しない（図１ｂ）が、卵母細胞は、分散卵巣組織からＯＳＣを免疫磁気分離すると、やはり混入細胞型であることがわかる。この結果は、恐らく、ビーズの遠心分離ステップ中の卵母細胞の非特異的な物理的キャリーオーバー（ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）、又は原形質膜損傷（破損）卵母細胞中の細胞質ＶＡＳＡとＣＯＯＨ抗体の反応性のいずれかを表していると考えられる。いずれの場合も、ＦＡＣＳの使用により緩和される。

【0120】

次に、各抗体と分散マウス卵巣細胞の反応性をＦＡＣＳによって評価した。各実験のために、前述したように、卵巣組織（マウス：４つの卵巣をプール；ヒト：１０×１０×１ｍｍ厚さ、皮質のみ）を解離し、ブロックした後、一次抗体（ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨに対するａｂ１３８４０、又はＶＡＳＡ−ＮＨ_２に対するＡＦ２０３０）と反応させた。ＨＢＳＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ａｂ１３８４０検出）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＡＦ２０３０）に結合したロバ抗ヤギＩｇＧの１：５００希釈物と一緒に、細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、ＨＢＳＳで洗浄した。次に、標識細胞を再度濾過（３５μｍ孔径）し、負の（非染色で、一次抗体なし）対照に対してゲーティングした、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて、ＦＡＣＳによって単離した。死滅細胞排除のための選別の直前に、ヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に添加した。新しく単離したＶＡＳＡ陽性生存細胞を、遺伝子発現プロファイリング、奇形腫形成能の評価又はｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のために収集した。実験によっては、２％中性緩衝パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に細胞を固定し、０．１％トリトン−Ｘ１００で透過処理した後、ＶＡＳＡ（ＡＦ２０３０）のＮＨ_２末端に対する一次抗体と反応させ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合したロバ抗ヤギＩｇＧとの反応後にＦＡＣＳによる検出を行った。再選別実験の場合には、生存細胞をＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体（ａｂ１３８４０）と反応させ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧとの反応後、ＦＡＣＳによって選別した。得られたＡＰＣ陽性（ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ陽性）生存細胞をインタクトのままにしておくか、又は、固定及び透過処理した後、ＶＡＳＡ−ＮＨ_２抗体（ＡＦ２０３０）とのインキュベーション、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合したロバ抗ヤギＩｇＧとのインキュベーションを行ってから、ＦＡＣＳ分析を実施した。

【0121】

磁気ビーズ分離結果と一致して、生存ＶＡＳＡ陽性細胞は、ＣＯＯＨ抗体を用いた場合にしか得られなかった（図１ｃ）。しかし、ＦＡＣＳの前に卵巣細胞を透過処理すると、ＮＨ_２抗体を用いても、ＶＡＳＡ陽性細胞集団が得られた（図１ｃ）。さらに、ＣＯＯＨ抗体を用いたＦＡＣＳによって単離した生存ＶＡＳＡ陽性細胞を透過処理し、再選別した場合には、同じ細胞集団が、ＶＡＳＡ−ＮＨ_２抗体によって認識された（図１ｄ）。このＯＳＣ単離方法の妥当性を確認する最後の手段として、プロトコルの各ステップでの細胞の画分を、生殖細胞についてのマーカ（Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｄｍ１、Ｓｔｅｌｌａ／Ｄｐｐａ３、Ｆｒａｇｉｌｉｓ／Ｉｆｉｔｍ３、Ｔｅｒｔ、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ）及び卵母細胞についてのマーカ（Ｎｏｂｏｘ、Ｚｐ３、Ｇｄｆ９）の組合せを用いた遺伝子発現分析によって評価した。ＦＡＣＳのための細胞を取得するために、卵巣組織を細かく刻み、コラゲナーゼ及びトリプシンで酵素的に消化し、７０μｍフィルターで濾過することにより、大きな組織凝集塊を除去した後、３５μｍフィルターで濾過することにより、細胞の最終画分を取得した。ＦＡＣＳによって得られたＶＡＳＡ陽性生存細胞画分を除いて、プロトコルの各ステップから得られた細胞の全ての画分が、全ての生殖細胞系及び卵母細胞マーカを発現した（図１ｆ）。ＦＡＣＳで選別したＶＡＳＡ陽性細胞画分は、全ての生殖細胞系マーカを発現したが、卵母細胞マーカは一切検出されなかった（図１ｆ）。従って、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いた免疫磁気分離によってＯＳＣを単離したときに観察された卵母細胞混入（図２参照）とは異なり、ＦＡＣＳでこの同じ抗体を使用すれば、卵母細胞を含まない成体卵巣由来ＯＳＣ画分を取得する優れた方法が提供される。

【0122】

実施例２：ヒト卵巣からのＯＳＣの単離
書面でのインフォームドコンセントと共に、埼玉医療センター（Ｓａｉｔａｍａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）で、性同一性障害を持つ年齢２２〜３３（２８．５±４．０）歳の６人の女性患者から卵巣を外科手術で摘出した。外側の皮質層を注意深く取り出し、ガラス化した後、低温保存した（Ｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．２００９ Ｏｎｌｉｎｅ １８：５６８−５７７；図１２）。手短には、厚さ１ｍｍの皮質断片を１００ｍｍ^２（１０×１０ｍｍ）の切片に切断し、７．５％エチレングリコール（ＥＧ）及び７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む平衡溶液中、２６℃で２５分間インキュベートし、２０％ＥＧ、２０％ＤＭＳＯ及び０．５Ｍショ糖を含むガラス化溶液中で、２６℃で１５分間インキュベートした後、液体窒素に浸漬した。実験分析のために、低温保存した卵巣組織を、Ｃｒｙｏｔｉｓｓｕｅ Ｔｈａｗｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｋｉｔａｚａｔｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、静岡県富士市、日本国）を用いて解凍してから、組織学、異種移植又はＯＳＣ単離のために直ちに処理した。ＣＯＯＨ抗体を用いて、年齢が２２〜３３歳の全患者のヒト卵巣皮質組織生検から、直径５〜８μｍの生存ＶＡＳＡ陽性細胞もＦＡＣＳにより一貫して単離したが、その収率（％）（選別した全生存細胞に対して１．７％±０．６％ＶＡＳＡ陽性；平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）は、並行して処理した若い成体マウス卵巣からのＯＳＣの収率（選別した全生存細胞に対して１．５％±０．２％ＶＡＳＡ陽性；平均±ＳＥＭ、ｎ＝１５）と同等であった。この収率（％）は、ＦＡＣＳによって選別した生存単細胞の最終プール中のこれら細胞の出現率であり、これは、処理前の卵巣中に存在する細胞の総数の小部分を表している。卵巣当たりのＯＳＣの出現率を推定するために、生後１．５〜２ヶ月のマウスの卵巣当たりのゲノムＤＮＡ量を決定し（１，７７４４．４４±４２６．１５μｇ；平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０）、卵巣毎に選別した生存細胞の画分当たりのゲノムＤＮＡ量に分割した（１６．４１±４．０１μｇ；平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０）。細胞当たりのゲノムＤＮＡ量が同等であると想定して、全卵巣細胞プールのどれくらいが、処理後に得られた全生存選別細胞画分によって表されるかを決定した。この相関係数を用いて、卵巣当たりのＯＳＣの出現率を０．０１４％±０．００２％［０．００９２６Ｘ（１．５％±０．２％）］であると推定した。ＯＳＣ収率に関して、この数は、複製によって変動したが、４つの卵巣のプールから最初に調製した分散質のＦＡＣＳ後に、成体卵巣当たり２５０〜わずかに１，０００を超える生存ＶＡＳＡ陽性細胞が、一貫して得られた。

【0123】

マウス及びヒト卵巣からの新たに単離したＶＡＳＡ陽性細胞の分析（図３ａ、３ｂ）により、類似した大きさ及び形態（図３ｃ、３ｄ）、並びに初期生殖細胞のマーカが豊富なマッチした遺伝子発現プロフィールが明らかになった（Ｓａｉｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００２ ４１８：２９３−３００；Ｏｈｉｎａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００５ ４３６：２０７−２１３；Ｄｏｌｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００２ １１５：１６４３−１６４９）（Ｂｌｉｍｐ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ及びＴｅｒｔ；図３ｅ）。これらの結果は、科学文献（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６；Ｐａｃｃｈｉａｒｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０１０ ７９：１５９−１７０）に報告されているマウスＯＳＣの形態学及び遺伝子プロフィールと一致している。

【0124】

成体卵巣から得られたＶＡＳＡ陽性細胞に特有の特徴をさらに決定するために、ｉｎ ｖｉｖｏ奇形腫形成アッセイを用いて、マウスＯＳＣを試験した。これは、近年の研究で、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の奇形腫形成能を有する成体マウスからのＯｃｔ３／４−陽性幹細胞の単離が報告されている（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．２０１０ ９３：２５９４−２６０１）ことから、重要である。前述のように、合計１００匹の若い成体雌マウスから卵巣を採取し、解離させた後、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ陽性生存細胞の単離のためにＦＡＣＳに付した。新しく単離したマウスＯＳＣを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスの後ろ臀部付近に皮下注射した（マウス当たり１×１０^５細胞を注射）。対照として、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣｖ６．５）を並行して対応齢の雌マウスに注射した（レシピエントマウス当たり１×１０^５細胞を注射）。腫瘍形成について、６ヵ月までの間マウスをモニターした。

【0125】

予想通り、正の対照として用いたマウスＥＳＣを移植したマウスの１００％が、３週間以内に奇形腫を形成した；しかし、成体マウス卵巣から単離したＶＡＳＡ陽性細胞を並行して移植したマウスには、移植から２４週間後であっても奇形腫は観察されなかった（図３ｆ〜ｋ）。従って、ＯＳＣは、多数の幹細胞及び原始胚細胞マーカを発現する（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６；Ｐａｃｃｈｉａｒｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０１０ ７９：１５９−１７０；また、図１ｆ及び図３ｅも参照のこと）が、これらの細胞は、これまで記載されている他のタイプの多能性幹細胞とは明らかに異なる。

【0126】

実施例３：ＦＡＣＳ精製マウスＯＳＣからの卵母細胞の産生
レトロウイルス形質導入によりＧＦＰを発現するように操作されたＦＡＣＳ精製マウスＯＳＣ（ｉｎ ｖｉｔｒｏで活発に分裂する生殖細胞だけの培養物として樹立後）が、成体雌マウスの卵巣への移植後に卵母細胞を産生する能力を評価した。得られる結果が、卵巣への移植細胞の安定な組込みを表すものであり、また、移植前に誘導された生殖腺への損傷によって複雑化しないことを確実にするために、１×１０^４ＧＦＰ発現マウスＯＳＣを、月齢２ヶ月の非化学療法条件付け野生型レシピエントの卵巣に注射し、分析まで５〜６ヵ月間マウスを維持した。月齢７〜８ヶ月の、移植マウスを、外性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ（１０ＩＵ）の単回腹腔内注射、その４６〜４８時間後ｈＣＧ（１０ＩＵ））で排卵を誘導した後、それらの卵巣と、卵管に放出された全ての卵母細胞を採取した。排卵された卵丘−卵母細胞複合体を、０．４％ＢＳＡ添加ＨＴＦに移して、ＧＦＰ発現について直接蛍光顕微鏡検査によって評価した。最初にＦＡＣＳにより精製したＧＦＰ発現マウスＯＳＣを受けた雌の卵巣において、ＧＦＰ陰性卵母細胞を含む卵胞と一緒に、ＧＦＰ陽性卵母細胞を含む発生中の卵胞が容易に検出可能であった（図４ａ）。

【0127】

卵管のフラッシング後、の中央に位置する卵母細胞を取り囲む拡張した卵丘細胞を含む複合体が観察され、これらは、ＧＦＰ欠失及びＧＦＰ発現の両方を含んだ。これらの複合体と野生型雄由来の精子を混合すると、受精が起こり、着床前胚が発生した。体外受精（ＩＶＦ）のために、精巣上体尾及び精管を成体野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスから摘出し、ＢＳＡ添加ＨＴＦ培地に導入した。ピンセットで組織を穏やかに絞ることによって精子を取得し、３７℃で１時間にわたり受精能を獲得させた後、卵丘−卵母細胞複合体（ＢＳＡ添加ＨＴＦ培地中１〜２×１０^６精子／ｍｌ）と４〜５時間にわたって混合した。次に、授精した卵母細胞を洗浄して精子を洗い流してから、新鮮な培地に移した。授精から４〜５時間後、卵母細胞（受精及び非受精）を５０μｌ液滴のＫＳＯＭ−ＡＡ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）に移し、液滴を鉱油で被覆することにより、着床前胚発生をさらに支持した。合計１４４時間にわたり、２４時間毎に光学及び蛍光顕微鏡検査を実施して、孵化胚盤胞期まで胚発生をモニターした（Ｓｅｌｅｓｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０１１ １０８：１２３１９〜１２３２４）。卵管からの排卵した卵母細胞の回収時に採取した卵巣組織を固定し、既に詳述されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００７ ２５：３１９８−３２０４）ように、ＭＯＭ（商標）キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に、ＧＦＰに対するマウスモノクローナル抗体（ｓｃ９９９６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いて、ＧＦＰ発現の免疫組織化学的検出のために、処理した。非移植野生型雌マウス及びＴｇＯＧ２トランスジーン雌マウスからの卵巣を、それぞれ、ＧＦＰ検出のための負及び正の対照として用いた。

【0128】

受精ＧＦＰ陽性卵から得られた着床前胚は、孵化胚盤胞期までＧＦＰ発現を保持した（図４ｂ〜ｄ）。５〜６ヵ月早くＧＦＰ発現ＯＳＣを移植した５匹の成体野生型雌マウスから、合計３１個の卵丘−卵母細胞複合体を卵管から採取したが、そのうちの２３個は、受精に成功し、胚を発生した。各卵母細胞の周りに卵丘細胞が存在するために、排卵したＧＦＰ陽性卵母細胞に対するＧＦＰ陰性細胞の数を正確に決定することができなかった。しかし、体外受精（ＩＶＦ）後に発生した２３の胚の評価により、８つがＧＦＰ陽性であり、試験した５匹の全てが、受精して、ＧＦＰ陽性胚を発生する少なくとも１つの卵を放出したことがわかった。これらの知見から、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体に基づくＦＡＣＳによって単離若しくは精製されたＯＳＣが、既に報告されている免疫電磁分離によって単離されたそれらの対応物（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６）と同様に、ｉｎ ｖｉｖｏで機能性卵母細胞を産生することがわかる。しかし、本発明者らのデータは、以前報告されている（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６）ように、ＯＳＣが成体卵巣組織に移植されて、機能性卵母細胞を産生するのに、移植前の化学療法条件付けは必要ないことも示している。

【0129】

実施例４：候補ヒトＯＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの特性決定
マウスＯＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖のために以前記載された（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６）パラメータを用いて、支持細胞として有糸分裂不活性マウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）を含む規定培地に、成体マウス及びヒト卵巣由来ＶＡＳＡ陽性細胞を導入した。手短には、以下：１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ非必須アミノ酸、１Ｘ濃縮ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、０．１ｍ Ｍβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１Ｘ濃縮Ｎ−２補充物（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ；１０^３単位／ｍｌ；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈＥＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、及び４０ｎｇ／ｍｌ神経膠細胞由来の神経栄養因子 （ＧＤＮＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を添加したＭＥＭα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において細胞を培養した。培養物は、隔日４０〜８０μｌの新しい培地を添加することにより新しくし、２週間毎に細胞を新鮮なＭＥＦＳに移しかえた。増殖を評価するために、ＭＥＦを含まないＯＳＣ培養物を１０μＭ ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で４８時間処理した後、記載されている（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９ １１：６３１−６３６）ように、ＢｒｄＵ組込み（有糸分裂活性細胞）及びＶＡＳＡ発現（生殖細胞）の二重免疫蛍光による検出のために、２％ＰＦＡ中に固定した。一次抗体が省かれるか、又は正常ウサギ血清の同等希釈物で置換された場合、シグナルは全く検出されなかった（示していない）。

【0130】

新しく単離したＯＳＣをクローン系として樹立することができ、ＭＥＦに接種していないヒトＯＳＣのコロニー形成効率は、０．１８％〜０．４０％の範囲であった。コロニー形成効率の正確な評価は、初期支持細胞としてＭＥＦを用いて実施することはできなかったが、これは、マウス及びヒトＯＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの樹立を非常に容易にする。１０〜１２週（マウス）又は４〜８週（ヒト）の培養後、活発に分裂する生殖細胞コロニーが容易に明らかになった（図５）。いったん樹立して、増殖すると、細胞は、増殖能力を喪失することなく、ＭＥＦの非存在下で生殖細胞だけの培養物として再樹立させることができた。ＭＥＦ非含有培地でのＶＡＳＡ発現及びブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組込みの二重分析によって、多数の二重陽性細胞が明らかになり（図６ａ〜ｄ）、成体マウス及びヒト卵巣由来のＶＡＳＡ陽性細胞が活発に分裂していることを証明している。この段階で、マウス細胞は、培養物分割比１：６〜１：８で、４〜５日毎に、培養飽和密度での継代を必要とした（推定倍加時間１４時間；図６ｅ）。マウスＯＳＣ増殖の速度は、並行して維持したヒト生殖細胞の速度より約２〜３倍高く、ヒト細胞の場合、培養物分割比１：３〜１：４で、７日毎に、培養飽和密度での継代を必要とした。ＶＡＳＡの細胞表面発現は、数ヵ月の増殖後も、９５％を超える細胞の表面で検出可能であった（図６ｆ）。ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いたＦＡＣＳによって検出されなかった残りの細胞は、マウス及びヒトＯＳＣによって自然に産生された大きな（直径３５〜５０μｍ）球形の細胞であり、これらは、ＶＡＳＡの細胞質発現を呈示しており、実施例５に詳しく説明する。

【0131】

培養した細胞の遺伝子発現分析により、初期生殖細胞系マーカの維持が証明された（図６ｇ）。複数の卵母細胞特異的マーカもこれらの培養物中に検出された。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＲＮＡのレベルを評価した。同一性を確認するために、全ての産物を配列決定した。対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号と共に、フォワード及びリバースプライマーの配列を表１（マウス）及び表２（ヒト）に記載する。

【0132】

【表1】

【0133】

【表2】

【0134】

Ｂｌｉｍｐ１、Ｓｔｅｌｌａ及びＦｒａｇｉｌｉｓのｍＲＮＡ分析を拡張するために、これら３つの伝統的原始生殖細胞系マーカの免疫蛍光分析を実施した（Ｓａｉｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００２ ４１８：２９３−３００；Ｏｈｉｎａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００５ ４３６：２０７−２１３）。培養したＯＳＣの分析のために、細胞を１Ｘ濃縮リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２０℃にて４５分間２％ＰＦＡ中で固定し、ＰＢＳ−Ｔ（０．０１％トリトン−Ｘ１００を含むＰＢＳ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（２％正常ヤギ血清及び２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で、２０℃にて１時間インキュベートした。次に、細胞を以下の一次抗体のうち１つの１：１００希釈物と一緒に２０℃で１時間インキュベートした：ＢＬＩＭＰ１に対するビオチン化マウスモノクローナル（ａｂ８１９６１、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＳＴＥＬＬＡに対するウサギポリクローナル（ａｂ１９８７８、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）又はＦＲＡＧＩＬＳに対するウサギポリクローナル（マウス：ａｂ１５５９２、ヒト：ａｂ７４６９９、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。細胞を洗浄して、ローダミン−ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下で、ストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＢＬＩＭＰ１検出）、又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＳＴＥＬＬＡ ａｎｄ ＦＲＡＧＩＬＩＳ検出）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧの１：５００希釈物と一緒に２０℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄して、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と一緒にインキュベートし、さらに３回洗浄した後、画像化した。一次抗体を省くか、又は代わりに正常血清を用いた場合、シグナルは全く検出されなかった（図示していない）。

【0135】

マウス及びヒトＯＳＣによりｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される卵母細胞の評価のために、個々の卵母細胞を培養物上澄みから収集して、洗浄し、３７℃にて０．５％ＢＳＡ含有の２％ＰＦＡで４５分間固定し、洗浄した後、０．５％ＢＳＡと、５％正常ヤギ血清（ＶＡＳＡ若しくはＬＨＸ８検出）又は１％正常ロバ血清（ｃ−ＫＩＴ検出）のいずれかを含むＰＢＳ中で、２０℃にて１時間ブロックした。ブロック後、卵母細胞を以下の一次抗体のうち１つの１：１００希釈物（０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中）と一緒に２０℃で２時間インキュベートした：ｃ−ＫＩＴに対するヤギポリクローナル（ｓｃ１４９４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＶＡＳＡに対するラビットポリクローナル（ａｂ１３８４０、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）又はＬＨＸ８に対するウサギポリクローナル（ａｂ４１５１９、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。次に、細胞を洗浄して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＶＡＳＡ検出）若しくはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＬＨＸ８検出）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧの１：２５０希釈物、又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合したロバ抗ヤギＩｇＧの１：２５０希釈物（ｃ−ＫＩＴ検出）と一緒にインキュベートした。細胞を洗浄して、ＤＡＰＩと一緒にインキュベートし、さらに３回洗浄した後、画像化した。一次抗体を省くか、又は代わりに正常の血清を用いた場合、シグナルは全く検出されなかった。

【0136】

これら後出の実験では、ＶＡＳＡ、ｃ−ＫＩＴの卵母細胞特異的発現、また、ヒト卵巣については、卵巣組織切片中におけるＬＨＸ８の発現の検出を正の対照として用いた。マウス及びヒト卵巣組織を４％ＰＦＡ中に固定し、パラフィン包埋して、スライス（６μｍ）した後、０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）を用いて、高温抗原賦活化処理を実施した。冷却後、切片を洗浄して、１％正常ヤギ血清（ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ若しくはＬＨＸ８検出）又は１％正常ロバ血清（ＶＡＳＡ−ＮＨ_２若しくはｃ−ＫＩＴ検出）のいずれかを含むＴＮＫバッファー（リン酸緩衝食塩水中の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．５５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ ｍＭ ＫＣＬ、０．５％ＢＳＡ、及び０．１％トリトン−Ｘ１００）を用いて、２０℃で１時間ブロックした。次いで、切片を一次抗体の１：１００希釈物（１％正常血清含有のＴＮＫバッファー）と一緒に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ヒト卵巣におけるＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ検出）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（マウス卵巣におけるＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ若しくはＬＨＸ８の検出）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（ｃ−ＫＩＴ又はＶＡＳＡ−ＮＨ_２検出）の１：５００希釈物と一緒に、２０℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いて、切片をカバーガラスで覆った。一次抗体を省くか、又は代わりに正常の血清を用いた場合、シグナルは全く検出されなかった。

【0137】

３つのタンパク質は全て、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持するマウス（図６ｈ）及びヒト（図６ｉ）ＯＳＣにおいて容易に、かつ均質に検出された。特に、これらの細胞でのＦＲＡＧＩＬＩＳの検出は、このタンパク質を用いて、免疫磁気ビーズ分離によりマウス卵巣からＯＳＣを単離することもできると報告する近年の研究と一致している（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ． ２０１１ ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１１．００９１）。

【0138】

実施例５：候補ヒトＯＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵形成能
他者（Ｐａｃｃｈｉａｒｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０１０ ７９：１５９−１７０）の結果と一致して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したマウスＯＳＣは、大きな（直径３５〜５０μｍ）球形の細胞を自然に産生したが、これは、形態学（図７ａ）及び遺伝子発現分析（図７ｂ、ｃ）によって、卵母細胞に類似していた。マウスＯＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏ卵形成のピークレベルは、各継代から２４〜４８時間以内に観察され（図７ｄ）、その後、次第に減少して、ＯＳＣが培養飽和密度に達する毎に、ほぼ検出不能レベルまで降下する。成体ヒト卵巣から単離して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持したＶＡＳＡ陽性細胞の並行分析から、これらの細胞は、マウスＯＳＣと同様に、形態学（図７ｆ）及び遺伝子発現（図７ｃ、ｇ）分析の両方から推定されるように、卵母細胞を自然に産生したことが明らかになった。ヒトＯＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏ卵形成の動態は、卵母細胞形成のピークレベルが各継代から７２時間後に観察された点で、マウスＯＳＣとはやや異なっていた（図７ｅ）。広く認められている多数の卵母細胞マーカ（Ｖａｓａ、ｃ−Ｋｉｔ、Ｎｏｂｏｘ、Ｌｈｘ８、Ｇｄｆ９、Ｚｐ１、Ｚｐ２、Ｚｐ３；（Ｓｕｚｕｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．２００２ １１１：１３７−１４１；Ｒａｊｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４ ３０５：１１５７−１１５９；Ｐａｎｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００６ １０３：８０９０−８０９５；Ｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９９ １３：１０３５−１０４８；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｍｅｄ．２００７ ２５：２４３−２５１）の検出に加えて、マウス及びヒトＯＳＣ由来の卵母細胞は、複糸期特異的マーカＭｓｙ２も発現した（図７ｃ）。ＭＳＹ２は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＦＲＧＹ２の哺乳動物相同体であり、これは、両性において減数分裂進行及び配偶子形成に必須の生殖細胞特異的核酸結合Ｙボックスタンパク質である（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９９８ ５９：１２６６−１２７４；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００５ １０２：５７５５−５７６０）。正の対照として成体ヒト卵巣皮質組織を用いた、市販の抗体の実証試験から、成体ヒト卵巣に存在する未熟の卵母細胞と特異的に反応する卵母細胞マーカ（ＶＡＳＡ、ｃ−ＫＩＴ、ＭＳＹ２、ＬＨＸ８；図８）に対する４つの抗体をみいだしたが；これらのタンパク質の４つ全ても、ヒトＯＳＣによってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される卵母細胞に検出された（図７ｇ）。

【0139】

ヒトＯＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏで新しく形成された卵母細胞における、減数分裂マーカＭＳＹ２をコードするｍＲＮＡの存在によって、本発明者らは、これらの培養物における減数分裂開始の見込みについて探ることにした。継代から７２時間後の結合（非卵母細胞生殖系）細胞の免疫蛍光分析によって、減数分裂特異的ＤＮＡリコンビナーゼの点状核局在を含む細胞、ＤＭＣ１と、減数分裂組換えタンパク質である、シナプトネマ構造タンパク質３（ＳＹＣＰ３）をみいだした（図７ｈ）。いずれのタンパク質も、生殖細胞に特異的であり、減数分裂組換えのために必要である（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００４ ２０：５２５−５５８；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２ ２９６：１１１５−１１１８；Ｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２０１０ ２７７：５９０−５９８）。

【0140】

継代から７２時間後のヒトＯＳＣ培養物の染色体ＤＮＡ量解析を決定した。培養したマウス（継代から４８時間後）又はヒト（継代から７２時間後）ＯＳＣをトリプシン処理によって収集して、洗浄し、氷冷ＰＢＳ中に再懸濁させてから、血球計で計数した。氷冷の７０％エタノール中で１時間の固定後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄して、０．２ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ−Ａと一緒に３７℃で１時間インキュベートした。次に、ヨウ化プロピジウムを添加（１０μｇ／ｍｌ最終）し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩサイトメーターを用いて、倍数性状態を決定した。対照体細胞系として、ヒト胎児腎線維芽細胞（ＨＥＫ２９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、上記の実験を繰り返した。この分析によって、予想した二倍体（２ｎ）細胞集団の存在が明らかになった；しかし、細胞の４ｎ及び１ｎ集団に一致するピークが検出され、後者は、半数体状態に達した生殖細胞を示している（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ． ２０１１ ２０：１０７９−１０８８）（図７ｉ）。対照として同時に分析した胎児腎線維芽細胞の活発に分裂する培養物では、細胞の２ｎ及び４ｎ集団（図９ａ）しか検出されなかった。マウスＯＳＣ培養物のＦＡＣＳによる染色体分析でも、同等の結果が観察された（図９ｂ）。

【0141】

実施例６：ヒトＯＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト卵巣皮質組織に卵母細胞を産生する
候補ヒトＯＳＣからの推定卵形成のｉｎ ｖｉｔｒｏ観察を確認し、拡張するために、２つの最終実験において、成体ヒト卵巣から単離したＶＡＳＡ陽性細胞に、ＧＦＰ発現ベクター（ＧＦＰ−ｈＯＳＣ）で安定に形質導入することにより、細胞追跡を容易にした。細胞追跡実験のために、レトロウイルスを用いて、ヒトＯＳＣに形質導入して、ＧＦＰ（ＧＦＰ−ｈＯＳＣ）の安定な発現を有する細胞を取得した。手短には、１μｇのｐＢａｂｅ−ＧｆｐベクターＤＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミドリポジトリ＃１０６６８）を、製造業者のプロトコル（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａレトロウイルスパッケージング細胞系（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後にウイルス上澄みを回収した。ヒトＯＳＣの形質導入は、新鮮なウイルス上澄みを用いて実施したが、これは、ポリブレン（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在によって促進した。４８時間後、ウイルスを除去し、新鮮なＯＳＣ培地と交換した。最初の１週間の増殖後、ＧＦＰの発現を有するヒトＯＳＣを精製又は単離し、精製又は単離した細胞をさらに２週間増殖させた後、２回目のＦＡＣＳ精製又は選別を行うことにより、ヒト卵巣組織再凝集又は異種移植実験のためのＧＦＰ−ｈＯＳＣを取得した。

【0142】

最初の実験では、次に、分散させた成体ヒト卵巣皮質組織と一緒に、約１×１０^５ＧＦＰ−ｈＯＳＣを再凝集させた。前述のように、ヒト卵巣皮質を解離して、洗浄した後、３５μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び１×１０^５ＧＦＰ−ｈＯＳＣと一緒に３７℃で１０分間インキュベートした。細胞混合物を遠心分離（９，３００ｘｇ、２０℃で１分間）によりペレット化して、組織凝集体を形成し、これを、１ｍｌのＯＳＣ培地を含む６ウェル培養皿内のＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ０．４μｍ培養プレートインサート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に塗布した。３７℃の５％ＣＯ_２−９５％空気中で凝集体をインキュベートし、２４、４８及び７２時間後、生存細胞ＧＦＰ画像化を実施した。

【0143】

予想通り、再凝集した組織全体に、多数のＧＦＰ陽性細胞が観察された（図１０ａ）。次に、凝集体を培養物に導入し、直接（生存細胞）ＧＦＰ蛍光によって２４〜７２時間後に評価した。２４時間以内に、複数の非常に大きな（≧５０μｍ）単細胞が凝集体中に観察され、それらの多くは、卵胞に似た緊密な構造で、より小さなＧＦＰ陰性細胞によって囲まれており；これらの構造は、７２時間を通じて検出可能であった（図１０ｂ、ｃ）。これらの知見から、ＧＦＰを発現するヒトＯＳＣは、卵母細胞を自然に産生し、これらは、成体ヒト卵巣分散質中に存在する体細胞（前顆粒膜／顆粒膜）によって取り囲まれることがわかった。

【0144】

次に、ＧＦＰ−ｈＯＳＣを成体ヒト卵巣皮質組織生検に注射した後、これをＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスに異種移植した（ｎ＝合計４０移植片）。３５ゲージ斜端針を備える１０μｌ ＮａｎｏＦｉｌ注射器（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を用いて、卵巣皮質組織切片（２×２×１ｍｍ）に個別に約１．３×１０^３個のＧＦＰ−ｈＯＳＣを注射した。レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスを麻酔し、ほぼ記載されている（Ｗｅｉｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９９９ ６０：１４６２−１４６７；Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２００１ ２８：３５５−３６０）通りに、ヒト卵巣皮質組織の皮下挿入のために背側脇腹に沿って小さな切開を施した。移植から７又は１４日後に異種移植片を取り出し、４％ＰＦＡ中に固定し、パラフィン包埋した後、ＧＦＰに対するマウスモノクローナル抗体（ｓｃ９９９６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いた免疫組織化学的分析のために、順次切断した（６μｍ）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００７ ２５：３１９８−３２０４）。手短には、０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）を用いて、高温抗原賦活化処理を実施した。冷却後、メタノール中の３％過酸化水素と一緒に切片を１０分間インキュベートすることにより、内生ペルオキシダーゼ活性をブロックし、洗浄した後、製造業者のプロトコル（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に従い、ストレプトアビジン−ビオチンプレブロック溶液中でインキュベートした。次に、１％正常ヤギ血清を含むＴＮＫバッファーを用いて、切片を２０℃で１時間ブロックした後、１％正常ヤギ血清含有のＴＮＫバッファー中に調製したＧＦＰ抗体の１：１００希釈物と一緒に４℃で一晩インキュベートした。次に、切片を洗浄し、ヤギ抗マウスビオチン化二次抗体の１：５００希釈物と一緒に２０℃で３０分間インキュベートした後、洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ試薬（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と２０℃で３０分間反応させた後、ジアミノベンジジン（ＤＡＫＯ Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いたＧＦＰ陽性細胞の検出を行った。細胞及び組織構造を視覚化するために、切片をヘマトキシリンで軽く対比染色した。負の対照（ビヒクル注射を受けた異種移植組織に対する完全免疫組織化学的染色）も並行して常に実施したが、陽性シグナルは示さなかった。これらの観察結果を確認及び拡張するために、免疫分析の説明で既に詳述したように、ＤＡＰＩ対比染色を用いて、異種移植したヒト卵巣組織におけるＧＦＰと、ＭＳＹ２（複糸期卵母細胞特異的マーカ）又はＬＨＸ８（初期卵母細胞転写因子）のいずれかの二重免疫蛍光による検出を実施した。

【0145】

ＧＦＰ発現の評価のために、７又は１４日後に移植片を収集した。ヒト卵巣移植片は全て、容易に認められる始原及び一次卵胞を含んでおり、その中心にＧＦＰ陽性卵母細胞が位置していた。恐らく、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射の前に組織中に存在していたこれらの卵胞の間、及び往々にしてこれらに隣接して、ＧＦＰ陽性卵母細胞を含む他の未成熟卵胞が散在していた（図１０ｄ、ｆ）。ＧＦＰ−ｈＯＳＣを注射した３つのランダムに選択したヒト卵巣組織生検の連続した切片組織形態計測的分析から、マウスへの異種移植から７日後に、移植片当たり１５〜２１個のＧＦＰ陽性卵母細胞の存在が明らかになった（図１１）。対照として、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射前のヒト卵巣皮質組織（図１０ｅ）又はＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの移植前に模擬注射（ＧＦＰ−ｈＯＳＣを含まないビヒクル）を受けた異種移植片（図１０ｇ）には、ＧＦＰ陽性卵母細胞は全く検出されなかった。複糸期卵母細胞特異的マーカＭＳＹ２（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ． １９９８ ５９：１２６６−１２７４；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００５ １０２：５７５５−５７６０）又は初期卵母細胞転写因子ＬＨＸ８（Ｐａｎｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００６ １０３：８０９０−８０９５）のいずれかを用いた二重免疫蛍光に基づくＧＦＰの検出によって、ＧＦＰ−ｈＯＳＣを注射した異種移植片全体に散在する多数の二重陽性細胞が認められた（図１０ｈ）。予想したように、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射前の卵巣組織又はＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射を受けなかった異種移植片には、ＧＦＰ陽性卵母細胞は全く検出されなかった（図示していない；図１０ｅ、ｇ参照）；しかし、これらの卵母細胞は、ＬＨＸ８及びＭＳＹ２に対しては一貫して陽性であった（図１０ｈ；図８）。

【0146】

実施例７：オートロガス生殖細胞系ミトコンドリアエネルギー移動（「ＡＵＧＭＥＮＴ」へのＯＳＣの使用
図１３は、体外受精（ＩＶＦ）前又は体外受精中の同じ被検者から得た卵母細胞に移入することができる卵形成細胞質又はミトコンドリア画分の誘導化のための雌性生殖細胞のオートロガス供給源としてのＯＳＣの使用の概観を表す。その結果起こったＡＵＧＭＥＮＴ後の卵におけるミトコンドリアＤＮＡコピー数及びＡＴＰ生産能力の増大によって、卵母細胞が、受精及び胚発生の成功に必要なエネルギー駆動イベントのためのＡＴＰの十分な蓄積を有することが確実になる。ＡＵＧＭＥＮＴにより卵母細胞に供給される追加のミトコンドリアは、卵母細胞を産生するために身体によって用いられる天然の前駆細胞に由来する。さらに、追加ミトコンドリアは、胚発生に必要なミトコンドリアの最小閾値数がほぼ４倍増大した場合でも、健全な胚形成が進行することを示すデータ（Ｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２０１０ ８３：５２−６２、図６参照）によれば、卵母細胞に有害な影響をもたらすことはない。異種卵細胞質移入の有益な作用については、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９８ ４：２６９−８０（その方法は、胚／子孫に、生殖細胞系遺伝子操作及びミトコンドリアのヘテロプラスミーをもたらすために、ヒトには適していない）によって早期に報告されており、このことは、卵母細胞が、追加のミトコンドリアによって利益を被ることを示している。

【0147】

ＡＵＧＭＥＮＴのための臨床プロトコルの一例は以下の通りである。標準的ＩＶＦの開始前に、月経周期の１〜７日の間に、被検者に腹腔鏡検査を実施して、１卵巣から卵巣上皮（卵巣皮質生検）の３つ以下の切片（各々約３×３×１ｍｍ）を採取する。この施術の間に、腹部内に２〜３つの切開を施し、装置を挿入して、滅菌手法を用いて、卵巣から組織を採取する。採取した組織を滅菌溶液に導入して、ＧＴＰ準拠試験施設に氷上で輸送し、そこで、ＡＵＧＭＥＮＴ／ＩＣＳＩの実施時まで低温保存した。組織は、酵素的解離の実施時まで凍結状態に維持した。これは、ミトコンドリアを精製又は単離するオートロガスＯＳＣの供給源として用いられる。

【0148】

次に、ＯＳＣを単離して、ＯＳＣからミトコンドリアを回収する。卵巣皮質生検組織を解凍した後、組織を細かく刻んで、組換えコラゲナーゼ及び組換えＤＮａｓｅ１を含む溶液に導入した後、単細胞懸濁液に均質化する。懸濁液をセルストレイナーに通過させて、単細胞の溶液を調製する。単細胞懸濁液を抗ＶＩＳＡ抗体と一緒にインキュベートする。次に、標識細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離する。ＯＳＣのアリコートを凍結するために標準的徐冷低温保存法を用いる。

【0149】

被検者に、ベースライン評価、ＧｎＲＨアンタゴニスト下方制御及びゴナドトロピン刺激などの標準的ＩＶＦプロトコルを実施する。ｈＣＧ投与から３４〜３８時間以内に卵母細胞を回収し、卵母細胞を質及び成熟状態について評価する。成熟卵母細胞をＩＣＳＩによって授精させる。

【0150】

卵母細胞の採取日に、当該被検者の凍結ＯＳＣバイアルを標準的方法で解凍する。ＯＳＣを処理して、ミトコンドリアペレットを取得する（Ｆｒｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００７ ２：２８７−２９５ ｏｒ Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２００７ ３：５２４−３３．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｏｃｔ １３）か、又は以下の実施例９（ここでは、ＦＡＣＳによる方法を用いて、組織中の全ミトコンドリア集団を単離する）に記載のように、また任意選択で、活発に呼吸するミトコンドリア集団をさらに単離する、あるいは、組織中の全ミトコンドリアに対する活性ミトコンドリアの比率を定量する。ミトコンドリア調製物の評価及び活性を評価し、記録する。ミトコンドリア機能のアッセイ例を実施例８に記載する。ミトコンドリアペレットを、卵母細胞の質を改善するミトコンドリア活性の標準化濃度まで、媒質中に再懸濁させる。ミトコンドリアを含むこの媒質を、送達しようとする精子を含むマイクロインジェクション針に吸引する。ミトコンドリアと精子の両方を一緒に、ＩＣＳＩによって卵母細胞に送達する。あるいは、ミトコンドリア又はその調製物を使用まで凍結する。

【0151】

受精及び胚培養後に、典型的には、最大３つのグレード１又はグレード２（ＳＡＲＴ格付けシステム（５０））胚を、胚発生の評価に基づき、３又は５日後、超音波誘導下で移入してもよい。βｈＣＧ試験によって妊娠が確認されたら、被検者は、後に約６及び２０週の妊娠期間で検査を受ける。

【0152】

実施例８：ヒト卵巣間質細胞に対するヒトＯＳＣ中のミトコンドリアパラメータの評価
同じ患者から得られた培養ヒト卵巣体細胞及び培養ヒトＯＳＣに、ミトコンドリア染色を実施した。ミトコンドリア塊を示す非酸化依存性Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｍ７５１４））ミトコンドリア追跡用プローブと一緒に、細胞を３７℃で４５分間インキュベートして、新鮮な培地で２回洗浄した後、生存細胞蛍光画像化を行った。両細胞型を並行して処理した。図１４では、分布パターンがヒトＯＳＣにおける核周辺局在化を示しており、これは、他のヒト幹細胞型と一致している。

【0153】

生物が老化するにつれて、細胞のｍｔＤＮＡに、共通欠失突然変異（ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド８４７０〜１３４４７の欠失）の蓄積が起こる。ＰＣＲプライマーは、この欠失を補うように設計されている。この欠失突然変異が存在しない場合（ｍｔＤＮＡゲノムがインタクトであることを意味する）、ＰＣＲアンプリコンは５０８０ｂｐとなる。欠失が存在すれば、１０３ｂｐ断片が増幅される。個々の細胞又は細胞集団内のミトコンドリアの間に不均質性が存在する場合には、いずれの産物も増幅しない。これは、欠失（小さなバンドによって示される）が、大きな５ｋｂ産物よりはるかに効率的に増幅するために起こる。小さな産物は、対数及びプラトー期により速く到達し、これにより、ＰＣＲ混合物中の利用可能な試薬を用いてしまい、効率の低い５ｋｂ産物の増幅用にほとんど又は全く残さない。図１５に示すＰＣＲ分析から、ヒトＯＳＣは突然変異の蓄積を保有していないが、患者に一致する卵巣体細胞は保有することがわかる。

【0154】

体細胞内のミトコンドリア集団が、突然変異に関して異種である（欠失を保有するミトコンドリアもあれば、保有しないものもある）ことを確認するために、欠失領域内の１配列を特異的にターゲティングする第２組のＰＣＲプライマーを用いて、卵巣体細胞におけるミトコンドリアの統合性を評価した。１９１ｂｐ産物の増幅によって、この領域が、これら細胞のミトコンドリアの少なくともいくつかにおいて、インタクトであること、並びに体細胞ミトコンドリアの集団全体は、欠失突然変異に関して異種であるが、ヒトＯＳＣは、突然変異がほぼないことがわかった。

【0155】

ミトコンドリアＤＮＡ分析のためのプライマー配列（５’から３’）は、以下の配列：ＴＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＣ（配列番号６４）（フォワード）及びＴＧＴＧＡＧＧＡＡＡＧＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＴ（配列番号６５）（リバース）を有する、５０８０ｂｐ（インタクト）又は１０３ｂｐ（欠失突然変異体）のためのアンプリコン１と、以下の配列：ＣＣＴＡＣＣＣＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＧＧ（配列番号６６）（フォワード）及びＡＴＣＧＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＧＣＣＡＡＧ（配列番号６７）（リバース）を有する、１９１ｂｐ（内部、欠失配列）のためのアンプリコン２を含む。

【0156】

図１６は、ＡＴＰアッセイ（ＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＨＳ ＩＩ，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の結果を示す。左のパネルは、ＡＴＰの希釈後の標準曲線を示す（モル比対化学発光）。図に示すように、アッセイは、ＡＴＰのレベルの検出において感受性が高い。右のパネルは、培養したヒトＯＳＣから単離したミトコンドリアからのＡＴＰの量を示す。約１００，０００、１０，０００、１，０００及び１００個の細胞を溶解して、分析に用いており、値及び検出能は、ｍＭ〜ｆＭの範囲内であった。１００個という少ないＯＳＣを含むサンプルが、６．００Ｅ−０８Ｍもの多量のＡＴＰを生産した（約６００ｐモル／細胞）。卵巣体細胞の卵細胞と比較して、ＯＳＣは、約１００倍少ないミトコンドリアで、より多くの、又は同等の量のＡＴＰ／細胞を生産する。

【0157】

実施例９：ミトコンドリアのＦＡＣＳによる単離
本実施例に記載するように、ＦＡＣＳによる方法は、組織内の全ミトコンドリア集団を単離するのに用いることができる。さらに、ミトコンドリア単離のためのＦＡＣＳによる方法は、機能性（例えば、活発に呼吸する）ミトコンドリア集団だけを単離するために、又は組織、細胞、溶解細胞若しくはそれらから得た画分における全ミトコンドリアに対する機能性ミトコンドリアの比率を定量するために、２つの異なる蛍光色素（ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）依存性及びＭＭＰ非依存性）を用いて、二重標識を用いることもできる。

【0158】

ミトコンドリア塊を示す非酸化依存性Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｍ７５１４）ミトコンドリア追跡用プローブを、以下に記載するように作製し、使用した。Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ原液（無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた１〜５ｍｇ／ｍｌ）を２５〜５００ｎＭの使用濃度に達するまで、無血清増殖培地に希釈した。新しく単離又は解凍したＯＳＣを５分間の３００ｘｇの遠心分離によりペレット化した。上澄みを吸引して、細胞ペレットを２００μｌの希釈Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ原液中に再懸濁させた。細胞を３７℃で４５分インキュベートし、予熱（３７℃）した無血清増殖培地で洗浄した後、５分間の３００ｘｇの遠心分離によりペレット化した（あるいは、目的のプローブとのインキュベーション前に、細胞を溶解させてもよい）。上澄みを吸引して、細胞ペレットを１００μｌのミトコンドリア溶解バッファー中に再懸濁させた後、急速な浸透圧刺激を用いた機械的透過処理による溶解のために、ＦＡＣＳソートチューブに移した。溶解後に、細胞を氷上で１５〜３０分平衡させ、２００μｌの（最小量）氷冷ＰＢＳ中でインキュベートした後、ボルテクスした。図１９に示すように、３つの異なる集団：残留Ｍ７５１４陽性細胞（細胞ＭＴ＋）、高蛍光ミトコンドリア（機能性、Ｍｉｔｏ ＭＴ高）、及び低発現ミトコンドリア（非機能性、Ｍｉｔｏ ＭＴ低）が観察された。溶解後の非機能性ミトコンドリアに対する機能性ミトコンドリアの比は、約１：１であった（１５５２ミトコンドリア；７４３は、機能性としてゲーティングし、７１６は、非機能性としてゲーティングし、残りはゲーティングしなかった；ミトコンドリアの各集団についてのゲートは、図１９に強調表示している）。

【0159】

従って、機能性ミトコンドリアを選別及び回収し、残る非溶解細胞及び非機能性ミトコンドリアを大きさ及び蛍光強度に基づいて排除した。複数のプローブ又はＪＣ−１プローブ（赤色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｔ３１６８）を用いた二重標識は、非機能性ミトコンドリアから機能性ミトコンドリアをさらに識別する上で役立ちうる。二重標識に用いるためのプローブとしては、限定するものではないが、低酸化状態ミトトラッカー（ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）プローブ（例えば、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｍ７５１３）、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭ−Ｈ２ＴＭＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｍ７５１１）、並びに蓄積依存性プローブ：ＪＣ−１（赤色スペクトル；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｔ３１６８）、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｍ２２４２６）及びＪＣ−１（緑色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｔ３１６８）が挙げられる。

【0160】

実施例１０：分画遠心分離法を用いたミトコンドリアの単離
本実施例に記載するように、組織中に存在するミトコンドリアを単離及び／又は分画するために、分画遠心分離法を用いることができる。任意の組織又は細胞からミトコンドリアを単離する場合の基本的ステップは、以下の通りである：（ｉ）機械及び／又は化学的手段により細胞を破砕するステップ、（ｉｉ）低速で分画遠心分離を実施することにより、残屑及び極めて大きな細胞小器官（ＳＰＩＮ１）を除去するステップ、並びに（ｉｉｉ）より高速で分画遠心分離を実施することにより、ミトコンドリア（ＳＰＩＮ２）を単離して、回収するステップ。

【0161】

組織を計量し、１．５ｍｌの市販の洗浄バッファー（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｃａｍ，ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で２回洗浄する。組織を細かく刻み、予冷したダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーに導入する。２．０ｍｌまでの市販の単離バッファー（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｃａｍ，ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を添加する。ダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーを用いて細胞を破砕し（１０〜４０行程）、ホモジネートをエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移す。各チューブを単離バッファーで２．０ｍｌまで充填する。４℃で、ホモジネートを１，０００ｇで１０分間遠心分離する。上澄みを保存し、新しいチューブに移し、これらチューブを各々、単離バッファーで２．０ｍｌまで充填する。４℃で、チューブを１２，０００ｇで１５分間遠心分離する。ペレットを保存する。所望であれば、質について上澄みを分析する。１０μｌの市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｃａｍ，ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を添加した１．０ｍｌの単離バッファーに再懸濁させることにより、ペレットを２回洗浄する。４℃で、チューブを１２，０００ｇで１５分間遠心分離する。洗浄後、ペレットを合わせて、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した５００μｌの単離バッファーに再懸濁させる。所望であれば、使用までアリコートを−８０℃で保存する。

【0162】

一手法では、市販の抗体、例えば、ＭＳＡ０６、ＭＳＡ０３、及びＭＳＡ０４（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｃａｍ，ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて、上澄み画分中のものに対する単離ミトコンドリア中のシトクロムｃ、ポリン、若しくはシクロフィリンＤをウェスタンブロットスクリーニングすることにより、ミトコンドリアの統合性を試験する。別の手法では、例えば、市販のＯＸＰＨＯＳ複合体検出（Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）カクテル（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｃａｍ，ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて、ミトコンドリアのサンプルをウェスタンブロットによりプロービングして、ミトコンドリア複合体の成分を検出する。

【0163】

実施例１１：ショ糖密度勾配分離法を用いたミトコンドリアの単離
このプロトコルは、市販されている以下の試薬：ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ラウリルマルトシド；ＭＳ９１０；ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｃａｍ，ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ショ糖溶液１５、２０、２５、２７．５、３０及び３５％、再蒸留水、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｃａｍ，ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、及び１３×５１ｍｍポリアロマー遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ ３２６８１９；Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用する。

【0164】

ショ糖密度勾配分離法は、ミトコンドリアのために最適化されたタンパク質細分画方法である。この方法は、サンプルを少なくとも１０の画分に分離する。可溶化した全細胞をはるかに複雑性の低い画分に分離することができるが、すでに単離したミトコンドリアを分析する場合には、これらの画分はさらに単純化される。ショ糖密度勾配分離法は、５ｍｇ／ｍｌタンパク質で０．５ｍｌまでの初期サンプル量のために設計されている。従って、２．５ｍｇ以下の全タンパク質を用いる必要がある。これより大きい量の場合には、複数の勾配を調製するか、又はより大きなスケールの勾配を作ることができる。

【0165】

サンプルを非イオン性界面活性剤中で可溶化させる。このタンパク質濃度で、ミトコンドリアは、２０ｍＭ ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（１％ｗ／ｖラウリルマルトシド）により完全に可溶化することがわかっている。この可溶化の工程で重要なのは、事前に膜包埋したマルチサブユニットＯＸＰＨＯＳ複合体をインタクトに維持しながら、膜を破砕することであり、これは、本明細書に記載するショ糖密度勾配分離法に必要なステップである。１つの重要な例外は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ）である。５ｍｇ／ｍｌミトコンドリアのタンパク質濃度で、ＰＤＨを単離するために、必要な界面活性剤の濃度は、わずか１０ｍＭ（０．５％）ラウリルマルトシドである。また、ＰＤＨ酵素もまた、より低い速度で遠心分離すべきであり、ＰＤＨ複合体には、１６，０００ｇの遠心力が最大である。

【0166】

ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌタンパク質のミトコンドリア膜懸濁液に、ラウリルマルトシドを１％の最終濃度まで添加する。これを十分に混合し、３０分氷上でインキュベートする。次に、混合物を７２，０００ｇで３０分間遠心分離する。小サンプル量には、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａベンチトップ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）が推奨される。しかし、最低でも、最大速度（例えば、約１６，０００ｇ）のベンチトップ微量高速遠心機で十分なはずである。遠心分離後、上澄みを回収し、ペレットを廃棄する。プロテアーゼ阻害剤カクテルをサンプルに添加して、これを遠心分離の実施まで氷上に維持する。ミトコンドリアが非常に豊富なサンプルでは、複合体ＩＩＩ及びＩＶ中のシトクロムが、上澄みに褐色の色を与えうるが、これは、後の分離の有効性を確認する際に有用である。

【0167】

順次密度を下げてショ糖溶液を次々と重ねることにより、不連続ショ糖密度勾配を調製する。１５〜３５％のショ糖溶液を含む不連続勾配の調製及び遠心分離を以下に説明する。この勾配は、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ複合体（密度２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ）の良好な分離をもたらす。しかし、この設定は、特定の複合体の分離又はより大きな量の材料の分離のために変更することができる。

【0168】

次第に密度を下げてショ糖溶液を次々と重ねることにより、勾配を調製する；そのために、適用する第１の溶液は、３５％ショ糖溶液である。溶液の一様な適用によって、最も再現性の高い勾配が得られる。この適用を補助するために、Ｂｅｃｋｍａｎポリアロマー管をチューブスタンドにまっすぐに立てる。次に、Ｒａｉｎｉｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎ２００μｌピぺットの先端を、Ｒａｉｎｉｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎ１０００μｌピぺットの先端に配置する。ぴったりと合わせた両先端をクランプスタンドで固定し、２００μｌピぺットの先端の末端を管の内壁と接触させる。次に、ショ糖溶液を１０００μｌピぺットの先端内に導入し、ゆっくりとしかも着実に管内に供給するが、その際、３５％溶液（０．２５ｍｌ）から開始する。

【0169】

３５％溶液を管内に排出したら、３０％溶液（０．５ｍｌ）を管内の３５％溶液の上にロードする。この手順を２７．５％（０．７５ｍｌ）、２５％（１．０ｍｌ）、２０％（１．０ｍｌ）及び１５％（１．０ｍｌ）溶液でそれぞれ続ける。管の上部に、０．５ｍｌの可溶化ミトコンドリアのサンプルを添加する十分なスペースを残しておく。

【0170】

ショ糖密度勾配が注ぎ込まれたら、それぞれのショ糖層を肉眼で見ることができる。勾配の上部にサンプルを導入した後、非常に注意深く管をロータに装着し、遠心分離を開始する。全ての遠心分離工程で、均衡のとれたロータが要求され、従って、厳密に同じ質量を含むもう１つの管が得られる。実際には、これは、２つの勾配を調製しなければならないことを意味するが、第２の勾配は、実験サンプルを含む必要はなく、０．５ｍｌのタンパク質サンプルの代わりに、０．５ｍｌの水を含んでよい。

【0171】

ポリアロマー管は、スイングバケットＳＷ５０．１型ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）において３７，５００ｒｐｍ（相対遠心力平均１３２，０００ｘｇ）で、加速プロフィール７及び減速プロフィール７を用いて、４℃で１６時間３０分にわたり遠心分離する必要がある。実施直後に、ショ糖層を乱さないように細心の注意を払いながら、管をロータから取り外さなければならない。ミトコンドリアを豊富に含むサンプルを分離すると、異なる色のタンパク質層が観察される。最も一般的には、これらは、管の底部から約１０ｍｍ地点の複合体ＩＩＩ（５００ｋＤａ：褐色）と、管の底部から２５ｍｍ地点の複合体ＩＶ（２００ｋＤａ：緑色）である。また、それ以外のバンドが観察される場合もある。これらは、別のＯＸＰＨＯＳ複合体である。

【0172】

画分の回収のために、クランプスタンドを用いて、管を一定かつまっすぐに維持する。細い針を用いて、管の最も底部に小さな孔をあける。この孔は、ショ糖溶液を毎秒約１滴を滴下させるのにちょうどの大きさである。あけた孔から、等量の画分をエッペンドルフチューブ中に回収する。合計１０×０．５ｍｌの画分が適切であるが、これより多い画分（従って、量はこれより小さい）も可能である（例えば、２０×０．２５ｍｌの画分）。画分は、分析まで−８０℃で保存する。本明細書に記載した方法（例えば、実施例９、１０）又は当分野で公知の方法のいずれかを用いて、ミトコンドリアの統合性を決定するために、回収した画分を分析する。

【0173】

実施例１２：ＯＣＳは、ミトコンドリア活性の増大を呈示する
低ミトコンドリア活性は、精原細胞、初期胚、内部細胞塊細胞及び胚性幹細胞にみとめられていることから、「幹細胞性」の特徴であると報告されている。Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｕｐｄａｔｅ．２００９ （５）：５５３−７２を参照されたい。ＯＳＣは、本質的に雄性精原幹細胞（精原細胞）の雌性同等物であるが、ＯＳＣは、多産のミトコンドリア活性を有することがわかっている。

【0174】

ＯＳＣ溶解後、ＡＴＰ（ｐモル）のミトコンドリア生産を１０、１５、２０及び３０分後に測定し、試験した各サンプルにおける総ｍｔＤＮＡ量（ｆｇ）に対して標準化する（ＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＨＳ ＩＩ，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。図２０に示すように、埼玉医療センター（Ｓａｉｔａｍａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）で、性転換手術のために、性同一性障害を持つ年齢２２〜３３（２８．５±４．０）歳の女性患者から得られた成人卵巣由来の卵原幹細胞（ＯＳＣ）は、骨髄由来のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手）、成人卵巣体細胞（用いたＯＳＣに一致する被検者）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、及びＩＭＲ９０胎児肺線維芽細胞由来のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）よりもはるかに高いレベルのＡＴＰを生産した。

【0175】

ＡＴＰ（ｐモル）のミトコンドリア生産を、試験した各サンプルにおける合計ｍｔＤＮＡ量（ｆｇ）に対して標準化した。図２１に示すように、成人卵巣由来の卵原幹細胞（ＯＳＣ）は、１０分で骨髄由来のヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の６倍超のＡＴＰを、また、１０分で成人卵巣体細胞（用いたＯＳＣに一致する被検者）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）、及びＩＭＲ９０胎児肺線維芽細胞由来のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の１０倍を超えるＡＴＰを生産した。図２１は、ｈＯＳＣ、ｈＭＳＣ、Ｓｏｍａ、ｈＥＳＣ、及びｈｉＰＳＣについて、それぞれ、１０分で生産された１．０３Ｅ−０９、１．４６Ｅ−１０、１．７６Ｅ−１１、４．５６Ｅ−１２、９．１０Ｅ−１１ｐモルＡＴＰを示す。標準誤差（同じ順序で）は、１．１５Ｅ−１０、４．５６Ｅ−１１、２．２８Ｅ−１２、１．７２Ｅ−１３及び７．９９Ｅ−１２である。

【0176】

欠失分析によって、ｈＭＳＣにおける共通４９７７−ｂｐ欠失の存在が明らかになった（図２２）。突然変異を有することがわかっているヒト卵巣体細胞を、サンプルなしの対照（ｖｅ）と一緒に正の対照として含ませた。産物のインタクトな部分は、いずれのサンプルでも検出されなかった。比較すると、共通４９７７−ｂｐ欠失は、ヒトＯＳＣにおいて検出不可能である（図１５）。

【0177】

他の実施形態
以上の説明から、本発明を様々な用途及び条件に合わせるために、本明細書に記載した本発明に、改変及び変更を実施しうることは明らかであろう。このような実施形態も、以下の特許請求の範囲に含まれる。

【0178】

ある変数のいずれかの定義における要素を列挙した記載は、単一の要素として、又は列挙された要素のあらゆる組合せ（若しくは部分的組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の記載は、いずれかの単一実施形態として、又はいずれか他の実施形態又はその一部との組合せとしてのその実施形態を含む。

【0179】

本出願は、２０１１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５０２，８４０号明細書及び２０１２年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６００，５２９号明細書に関連しうる主題を含む。尚、これらの文献は、その全開示内容を参照として本明細書に組み込むものとする。本明細書に記載するあらゆる特許及び刊行物は、あたかも各々の独立した特許及び刊行物が、参照として本明細書に組み込まれることを明示的かつ個別に示されているのと同じ程度まで、本明細書に組み込むものとする。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]