特許 5793424 イソプレンと副生成物の産出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5793424

(24)【登録日】2015年8月14日

(45)【発行日】2015年10月14日

(54)【発明の名称】イソプレンと副生成物の産出方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 5/02 20060101AFI20150928BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20150928BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150928BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150928BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150928BHJP

   C12P 7/08 20060101ALI20150928BHJP

   C12P 7/18 20060101ALI20150928BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150928BHJP

【ＦＩ】

   C12P5/02

   C12N1/15ZNA

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   C12P7/08

   C12P7/18

   C12N15/00 A

【請求項の数】24

【全頁数】359

(21)【出願番号】特願2011-544612(P2011-544612)

(86)(22)【出願日】2009年12月30日

(65)【公表番号】特表2012-516677(P2012-516677A)

(43)【公表日】2012年7月26日

(86)【国際出願番号】US2009069862

(87)【国際公開番号】WO2010078457

(87)【国際公開日】20100708

【審査請求日】2012年12月26日

(31)【優先権主張番号】61/187,934

(32)【優先日】2009年6月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/141,652

(32)【優先日】2008年12月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】509240479

【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク

(73)【特許権者】

【識別番号】590002976

【氏名又は名称】ザ・グッドイヤー・タイヤ・アンド・ラバー・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＧＯＯＤＹＥＡＲ ＴＩＲＥ ＆ ＲＵＢＢＥＲ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100071010

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 行造

(72)【発明者】

【氏名】チョタニ、ゴーパル・ケイ

(72)【発明者】

【氏名】マコーリフ、ジョゼフ・シー

(72)【発明者】

【氏名】ペレス、カロリーヌ・エム

(72)【発明者】

【氏名】ウエルス、デレク・エイチ

(72)【発明者】

【氏名】サンフォード、カール・ジェー

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／００３０７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１３７０９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０５８４９９７０（ＵＳ，Ａ）

【文献】 Planta，２００１年，Vol.213，p.483-487

【文献】 FEBS Letters，２００５年，Vol.579，p.2514-2518

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸、（ｂ）イソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｃ）１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチド及び／または１以上のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする核酸及び（ｄ）ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹのポリペプチドをコードする核酸を含む組換え宿主細胞であって、当該細胞は、酸素移動速度（ＯＴＲ）が酸素取り込み速度（ＯＵＲ）よりも低い酸素制限培養条件下で、イソプレンと１、３−プロパンジオールとを同時に生成するものである、細胞。

【請求項2】

前記イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸がプロモーターに機能的に連結されている、請求項１記載の細胞。

【請求項3】

前記イソプレンシンターゼポリペプチドが植物イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項２記載の細胞。

【請求項4】

前記植物イソプレンシンターゼポリペプチドが、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）由来のものである、請求項３記載の細胞。

【請求項5】

ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含む、請求項４記載の細胞。

【請求項6】

デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸をさらに含む、請求項１の細胞。

【請求項7】

ＤＸＰ経路ポリペプチドとＭＶＡ経路ポリペプチドを含む、請求項１の細胞。

【請求項8】

（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド（ｉｖ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｖ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）または；（ｖｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）から選択される１以上のＭＶＡ経路ポリペプチドを含む、請求項１の細胞。

【請求項9】

０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性を有する、請求項１の細胞。

【請求項10】

４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間から２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間から２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間の速度で１，３−プロパンジオールを産出する、請求項１の細胞。

【請求項11】

大腸菌細胞である、請求項１の細胞。

【請求項12】

（ｉ）０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性を有するか、又は（ｉｉ）４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間から２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間から２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間の速度で１，３−プロパンジオールを産出する、請求項１１の細胞。

【請求項13】

イソプレンと副生成物を同時に生成する方法であって、
（１） 酸素移動速度（ＯＴＲ）が酸素取り込み速度（ＯＵＲ）よりも低い酸素制限培養条件下、イソプレンと１，３−プロパンジオールとを同時に生成することができる組換え宿主細胞を培養すること、ここで、前記細胞は、（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸、（ｂ）イソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｃ）１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチド及び／または１以上のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする核酸及び（ｄ）ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹのポリペプチドをコードする核酸、を含むものであり、
（２）イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成すること、を含む方法。

【請求項14】

前記イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸がプロモーターに機能的に連結されている、請求項１３記載の方法。

【請求項15】

前記イソプレンシンターゼポリペプチドが植物イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項１４記載の方法。

【請求項16】

前記植物イソプレンシンターゼポリペプチドが、ウラジロハコヤナギ由来のものである、請求項１５記載の方法。

【請求項17】

前記細胞が、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含む、請求項１６記載の方法。

【請求項18】

前記細胞が、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸をさらに含む請求項１３の方法。

【請求項19】

前記細胞が、ＤＸＰ経路ポリペプチドとＭＶＡ経路ポリペプチドを含む請求項１３の方法。

【請求項20】

前記細胞が（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド（ｉｖ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；または（ｖ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；または（ｖｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）から選択される１以上のＭＶＡ経路ポリペプチドを含む、請求項１３の方法。

【請求項21】

前記細胞が０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性を有する、請求項１３の方法。

【請求項22】

前記細胞が４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間から２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間から２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間の速度で１，３−プロパンジオールを産出する、請求項１３の方法。

【請求項23】

前記細胞が大腸菌細胞である、請求項１３の方法。

【請求項24】

前記細胞が（ｉ）０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性を有するか、又は（ｉｉ）４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間から２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間から２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間の速度で１，３−プロパンジオールを産出する、請求項２３の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２００８年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／１４１，６５２号、および２００９年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／１８７，９３４号に対する優先権を主張するものであり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、種々の合成ポリマー、中でも注目すべきは、合成ゴムの重要な出発材料である。イソプレンは、種々の微生物、植物、および動物種によって天然に産出される。イソプレンの生合成については、特に、２つの経路、すなわち、メバロン酸（ＭＶＡ）経路と非メバロン酸（ＤＸＰ）経路が同定されている（図１９Ａおよび１９Ｂ）。しかしながら、天然生物からのイソプレンの収率は、商業的には魅力がない。年間約８００，０００トンのｃｉｓ−ポリイソプレンがイソプレンの重合から生産されており、このポリイソプレンのほとんどは、タイヤおよびゴム産業で使用されている。イソプレンはまた、履き物、機械製品、医療製品、スポーツ用品、およびラテックスなどの他の製品において合成エラストマーとして使用するために共重合されている。

【0003】

現在、タイヤおよびゴム産業は、天然ゴムと合成ゴムの使用を基盤としている。天然ゴムは、アフリカの熱帯雨林に見られるゴムの木またはゴム植物の乳汁から得られる。合成ゴムは、主にブタジエンポリマーをベースにしている。これらのポリマーについて、ブタジエンは、エチレンとプロピレン製造からの副生成物として得られる。

【0004】

イソプレンは石油を分別することによって得ることができるが、この物質の精製は高価で、時間がかかる。炭化水素のＣ５ストリームの石油分解からは、わずか約１５％のイソプレンしか産出されない。したがって、より経済的なイソプレン産出方法が必要とされている。特に、しっかりした商業的プロセスの要求を満たすのに十分な速度、力価、および純度でイソプレンを産出する方法が望ましい。廉価な出発材料からイソプレンを産出する系も望ましい。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、酸素制限条件下で、イソプレンと副生成物を同時に生成することができる細胞、イソプレンと副生成物を同時に生成する酸素制限培養された細胞、イソプレンと副生成物を同時に生成する方法、およびイソプレンと副生成物を含む組成物を提供する。一態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む、酸素制限条件下で、イソプレンと、エタノール、１，３−プロパンジオール、および水素からなる群から選択される副生成物とを同時に生成することができる細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、（ｉ）約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る副生成物の平均容積生産性とを有するか；または（ｉｉ）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間の速度で副生成物を産出する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、植物イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）に由来するものである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。

【0006】

いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス属由来のものである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のものである。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；および（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、ＭＶＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ属に由来するものである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）に由来するものである。

【0007】

いくつかの実施形態では、副生成物はエタノールである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、エタノール発酵に関与するポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、エタノール発酵に関与するポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼＢ（ａｄｈＢ）ポリペプチド、アルコールデヒドロゲナーゼＥ（ａｄｈＥ）ポリペプチド、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、副生成物は１，３−プロパンジオールである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹである。いくつかの実施形態では、副生成物は水素である。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。

【0008】

別の態様では、イソプレンと副生成物を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと副生成物の同時生成に好適な条件下で、イソプレンと、エタノール、１，３−プロパンジオール、および水素からなる群から選択される副生成物とを同時に生成することができる細胞を培養すること、ここで、この細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む、と、（ｂ）イソプレンと副生成物を同時に生成すること、ここで、この細胞は（ｉ）約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る副生成物の平均容積生産性とを有するか；または（ｉｉ）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間の速度で副生成物を産出する、方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸はプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、植物イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ由来のものである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス属由来のものである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス・フェカーリス由来のものである。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；および（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、ＭＶＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ属に由来するものである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ・マゼイに由来するものである。

【0010】

いくつかの実施形態では、副生成物はエタノールである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、エタノール発酵に関与するポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、エタノール発酵に関与するポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼＢ（ａｄｈＢ）ポリペプチド、アルコールデヒドロゲナーゼＥ（ａｄｈＥ）ポリペプチド、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、副生成物は、１，３−プロパンジオールである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹである。いくつかの実施形態では、副生成物は水素である。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。

【0011】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供されている。いくつかの実施形態では、本発明は、約４００ｎｍｏｌｅのイソプレン／湿細胞質量のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間）を上回る速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅの水素／湿細胞質量のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間）を上回る速度で水素を産出する酸素制限培養された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチド、またはイソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0012】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素の平均容積生産性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、約０．５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素のピーク容積生産性とを有する酸素制限培養された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0013】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、細胞培養培地中の炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい量の水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0014】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、水素３モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンから水素４モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンの比率でイソプレンと水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0015】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約３．６×１０^−６気圧（１０μｇ／Ｌ_発生ガスに相当する）を上回る容積圧でイソプレンを産出し、約０．５５×１０^−６気圧を上回る容積圧で水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、約３．６×１０^−６気圧〜約０．４５気圧の容積圧でイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、約０．５５×１０^−６気圧〜約１．０×１０^−２気圧の容積圧で水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0016】

別の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、（ｉ）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る速度で水素を産出するか、（ｉｉ）約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．０５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有するか、または（ｉｉｉ）細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0017】

別の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結され、この細胞は、水素３モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンから水素４モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンの比率でイソプレンと水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0018】

別の態様では、イソプレンと、２−（Ｃ２）または３−炭素（Ｃ３）アルコールまたはジオールとを同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、前記Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは、エタノールである。したがって、一態様では、イソプレンとエタノールを同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、本発明は、約０．５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールのピーク容積生産性とを有する酸素制限培養された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下で、イソプレンと２−（Ｃ２）または３−炭素（Ｃ３）アルコールまたはジオールを同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、前記Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは、エタノールである。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、エタノール発酵関連ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、エタノール発酵関連ポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、エタノール発酵関連ポリペプチドは、ピルビン酸デカルボキシラーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが例えば、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0019】

いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，２−プロパンジオールである。したがって、別の態様では、イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、本発明は、約０．５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールのピーク容積生産性とを有する酸素制限培養された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下で、イソプレンと２−（Ｃ２）または３−炭素（Ｃ３）アルコールまたはジオールを同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，２−プロパンジオールである。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与する１以上のポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹである。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが例えば、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0020】

いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，３−プロパンジオールである。したがって、別の態様では、イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、本発明は、約０．５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールのピーク容積生産性とを有する酸素制限培養された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下で、イソプレンと２−（Ｃ２）または３−炭素（Ｃ３）アルコールまたはジオールを同時に生成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，３−プロパンジオールである。いくつかの実施形態では、前記細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与する１以上のポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹである。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが例えば、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0021】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが例えば、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞により産出されたイソプレンと水素を回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたイソプレンを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出された水素を精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。

【0022】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．０５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、約０．５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性でイソプレンを産出し、約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性で水素を産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞により産出されたイソプレンと水素を回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたイソプレンを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出された水素を精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。

【0023】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に相当する水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞により産出されたイソプレンと水素を回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたイソプレンを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出された水素を精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。

【0024】

別の態様では、イソプレンと、２−（Ｃ２）または３−炭素（Ｃ３）アルコールまたはジオールとを同時に生成する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは、エタノールである。したがって、一態様では、イソプレンとエタノールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンとエタノールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンとエタノールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、約０．５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性でイソプレンを産出し、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性でエタノールを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、エタノール発酵関連ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、エタノール発酵関連ポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、エタノール発酵関連ポリペプチドは、ピルビン酸デカルボキシラーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが例えば、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞により産出されたイソプレンとエタノールを回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたイソプレンを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたエタノールを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，２−プロパンジオールである。したがって、一態様では、イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと１，２−プロパンジオールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与する１以上のポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹである。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが例えば、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0026】

いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，３−プロパンジオールである。したがって、一態様では、イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと１，３−プロパンジオールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与する１以上のポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹである。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが例えば、炭水化物（例えば、キシロースもしくはグルコース）、酢酸、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0027】

本明細書に記載の様々な態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス属由来のものである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス・フェカーリス由来のものである。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；および（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、ＭＶＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ属に由来するものである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ・マゼイに由来するものである。

【0028】

別の態様では、イソプレンと水素を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、水素３モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンから水素４モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンの比率でイソプレンと水素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１〜１１モルパーセントのイソプレンと、４〜４４モルパーセントの水素とを含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、酸素、二酸化炭素、または窒素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、０〜２１モルパーセントの酸素、１８〜４４モルパーセントの二酸化炭素、および０〜７８モルパーセントの窒素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性不純物を含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセテート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセテート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセテート、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノールピリジン、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセテート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）およびシトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）または線状イソプレンポリマー（例えば、多数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：イソプレン組成物は、以下のうちの１または複数を含む：アルコール、アルデヒド、エステルまたはケトン（例えば、本明細書に記載のアルコール、アルデヒド、エステルまたはケトンのいずれか）。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。

【0029】

本明細書に記載の様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成させ得ることが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用にコドンが最適化されたクズ(植物)イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）である。ａｔｇ開始コドンはイタリック体になっており、終止コドンは太字になっており、付加されたＰｓｔＩ部位には下線が付されている。

【図2】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕのマップである。

【図3A】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号２）である。ＲＢＳには下線が付されており、クズイソプレンシンターゼ開始コドンは太字の大文字になっており、終止コドンは太字の大文字になっている。ベクター骨格は、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂである。

【図3B】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号２）である。ＲＢＳには下線が付されており、クズイソプレンシンターゼ開始コドンは太字の大文字になっており、終止コドンは太字の大文字になっている。ベクター骨格は、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂである。

【図3C】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号２）である。ＲＢＳには下線が付されており、クズイソプレンシンターゼ開始コドンは太字の大文字になっており、終止コドンは太字の大文字になっている。ベクター骨格は、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂである。

【図4】ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕのマップである。

【図5A】ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号３）である。

【図5B】ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号３）である。

【図5C】ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号３）である。

【図6】ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕのマップである。

【図7A】ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号４）である。

【図7B】ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号４）である。

【図7C】ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号４）である。

【図8A】ベクターを含まない大腸菌ＢＬ２１細胞におけるイソプレンの産出を示すグラフである。

【図8B】ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕを有する大腸菌ＢＬ２１細胞におけるイソプレンの産出を示すグラフである。

【図8C】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕを有する大腸菌ＢＬ２１細胞におけるイソプレンの産出を示すグラフである。

【図8D】ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕを有する大腸菌ＢＬ２１細胞におけるイソプレンの産出を示すグラフである。

【図9A】１４リットル流加発酵における大腸菌ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕの発酵時間に伴うＯＤを示すグラフである。

【図9B】１４リットル流加発酵における大腸菌ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕの発酵時間に伴うイソプレン産出を示すグラフである。

【図10A】パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｅｏａ ｃｉｔｒｅａ）におけるイソプレンの産出を示すグラフである。対照細胞は組換えクズイソプレンシンターゼを有さない。灰色の菱形はイソプレン合成を表し、黒い四角はＯＤ_６００を表す。

【図10B】ｐＣＬ−ｌａｃ Ｋｕｄｚｕを発現するパントエア・シトレアにおけるイソプレンの産出を示すグラフである。灰色の菱形はイソプレン合成を表し、黒い四角はＯＤ_６００を表す。

【図10C】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕを発現するパントエア・シトレアにおけるイソプレンの産出を示すグラフである。灰色の菱形はイソプレン合成を表し、黒い四角はＯＤ_６００を表す。

【図11】組換えイソプレンシンターゼを発現する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるイソプレンの産出を示すグラフである。ＢＧ３５９４ｃｏｍＫは、プラスミドを含まない枯草菌株である（非組換え体のイソプレン産出）。ＣＦ４４３は、ｐＢＳＫｕｄｚｕを有する枯草菌株ＢＧ３５９４ｃｏｍＫである（組換え体のイソプレン産出）。ｙ軸上のＩＳはイソプレンを示す。

【図12A】ｐＢＳ Ｋｕｄｚｕ ＃２のヌクレオチド配列（配列番号５）である。

【図12B】ｐＢＳ Ｋｕｄｚｕ ＃２のヌクレオチド配列（配列番号５）である。

【図12C】ｐＢＳ Ｋｕｄｚｕ ＃２のヌクレオチド配列（配列番号５）である。

【図13】ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）での発現用にコドン最適化されたクズイソプレンシンターゼのヌクレオチド配列（配列番号６）である。

【図14】ヤロウイアでの発現用にコドン最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子を含むｐＴｒｅｘ３ｇのマップである。

【図15A】ベクターｐＳＰＺ１（ＭＡＰ２９Ｓｐｂ）のヌクレオチド配列（配列番号７）である。

【図15B】ベクターｐＳＰＺ１（ＭＡＰ２９Ｓｐｂ）のヌクレオチド配列（配列番号７）である。

【図15C】ベクターｐＳＰＺ１（ＭＡＰ２９Ｓｐｂ）のヌクレオチド配列（配列番号７）である。

【図16】ヤロウイアでの発現用にコドン最適化された合成クズ（タイワンクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ））イソプレン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）である。

【図17】合成ハイブリッドポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ））イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）である。ＡＴＧ開始コドンは太字になっており、終止コドンには下線が付されている。

【図18A.B】ベクターｐＹＬＡ１、ｐＹＬ１およびｐＹＬ２の模式的で概説的な構築を示す。

【図18C】ベクターｐＹＬＡ（ＰＯＰ１）の模式的で概説的な構築を示す。

【図18D】ベクターｐＹＬＡ（ＫＺ１）の模式的で概説的な構築を示す。

【図18E】ベクターｐＹＬＩ（ＫＺ１）の模式的で概説的な構築を示す。

【図18F】ベクターｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）の模式的で概説的な構築を示す。

【図18G】ベクターｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）の模式的で概説的な構築を示す。

【図19A】イソプレンのＭＶＡ代謝経路とＤＸＰ代謝経路を示す（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：３５７−４２９，２００５に基づく）。以下の記載には、これらの経路内の各々のポリペプチドの別名と、示されたポリペプチドの活性を測定するためのアッセイを開示している参考文献とが含まれる（これらの参考文献の各々は、特に、ＭＶＡ経路とＤＸＰ経路内のポリペプチドのポリペプチド活性についてのアッセイに関して、各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ；アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＭｖａＥ、ＥＣ ２．３．１．９。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：２１１６−２１２２，２００２；ＨＭＧＳ；ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ、ＭｖａＳ、ＥＣ ２．３．３．１０。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４０６５−４０７０，２００２；ＨＭＧＲ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、ＭｖａＥ、ＥＣ １．１．１．３４。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：２１１６−２１２２，２００２；ＭＶＫ；メバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ１２、ＥＣ ２．７．１．３６。アッセイ：Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ １９：９−１４，１９９１。ＰＭＫ；ホスホメバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ８、ＥＣ ２．７．４．２、アッセイ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１：６２０−６３１，１９９１；ＤＰＭＤＣ；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、ＭＶＤ１、ＥＣ ４．１．１．３３。アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１３３５５−１３３６２，１９９４；ＩＤＩ；イソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ、ＩＤＩ１、ＥＣ ５．３．３．２。アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９１６９−１９１７５，１９８９。ＤＸＰ経路：ＤＸＳ；１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ、ｄｘｓ、ＥＣ ２．２．１．７。アッセイ：ＰＮＡＳ，９４：１２８５７−６２，１９９７；ＤＸＲ；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、ｄｘｒ、ＥＣ ２．２．１．７。アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４４６−４４５７，２００２；ＭＣＴ；４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、ＩｓｐＤ、ＥＣ ２．７．７．６０。アッセイ：ＰＮＡＳ，９７：６４５１−６４５６，２０００；ＣＭＫ；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、ＩｓｐＥ、ＥＣ ２．７．１．１４８。アッセイ：ＰＮＡＳ，９７：１０６２−１０６７，２０００；ＭＣＳ；２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＩｓｐＦ、ＥＣ ４．６．１．１２。アッセイ：ＰＮＡＳ，９６：１１７５８−１１７６３，１９９９；ＨＤＳ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ、ｉｓｐＧ、ＥＣ １．１７．４．３。アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，７０：９１６８−９１７４，２００５；ＨＤＲ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸レダクターゼ、ＩｓｐＨ、ＥＣ １．１７．１．２。アッセイ：ＪＡＣＳ，１２６：１２８４７−１２８５５，２００４。

【図19B】古典的ＭＶＡ経路と改変されたＭＶＡ経路を示す。１、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＣＴ）；２、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）；３、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；４、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；５、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；６、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤまたはＤＰＭＤＣ）；７、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）；８、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）；９、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）。古典的ＭＶＡ経路は、反応５と６を経由して、反応１から反応７へと進行するが、改変されたＭＶＡ経路は、反応８と９を通過する。構造式中のＰおよびＰＰは、それぞれ、リン酸およびピロリン酸である。この図は、Ｋｏｇａ ａｎｄ Ｍｏｒｉｉ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，７１：９７−１２０，２００７から抜粋されたものであり、これは、特に、改変されたＭＶＡ経路の核酸とポリペプチドに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。改変されたＭＶＡ経路は、例えば、いくつかの古細菌生物（例えば、メタノサルキナ・マゼイ）に存在する。

【図20】クズイソプレンシンターゼ遺伝子を有さない（左）またはクズイソプレンシンターゼ遺伝子を有する（右）組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株によるイソプレン産出のＧＣ−ＭＳ分析の結果を示すグラフである。矢印は、イソプレン標準品の溶出時間を示す。

【図21】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ Ｋａｎのマップである。

【図22A】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１０）である。

【図22B】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１０）である。

【図22C】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１０）である。

【図22D】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１０）である。

【図23A】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘導の時間である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ_６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ_６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。

【図23B】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ_６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ_６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。

【図23C】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ ｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ_６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ_６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。

【図23D】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩＤＸＳ ｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ_６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ_６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。

【図23E】ＢＬ２１／ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ_６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ_６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。

【図23F】ＢＬ２１／ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ_６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ_６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。

【図23G】ＢＬ２１／ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ_６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ_６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。

【図23H】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＩＤＩＤＸＳｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。矢印は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時を示す。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ_６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。黒い菱形はＯＤ_６００を表し、黒い三角はイソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、白い四角はイソプレン（μｇ／Ｌ／ＯＤ）の比生産性を表す。

【図24】ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ ｋａｎのマップである。

【図25A】ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１１）である。

【図25B】ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１１）である。

【図25C】ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１１）である。

【図25D】ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１１）である。

【図26】ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのマップである。

【図27A】ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのヌクレオチド配列（配列番号１２）である。

【図27B】ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのヌクレオチド配列（配列番号１２）である。

【図27C】ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのヌクレオチド配列（配列番号１２）である。

【図27D】ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのヌクレオチド配列（配列番号１２）である。

【図28】ｎｐｒＥ遺伝子座における枯草菌染色体への組込み用の、下流ＭＶＡ経路と酵母ｉｄｉを含有するカセットのマップを示す。ｎｐｒＥ上流／下流は、組み込まれるｎｐｒＥ遺伝子座から各々１ｋｂの配列を示す。ａｐｒＥプロモーター（アルカリ性セリンプロテアーゼプロモーター）は、ａｐｒＥ遺伝子のプロモーター（−３５、−１０、＋１転写開始部位、ＲＢＳ）を示す。ＭＶＫ１は、酵母メバロン酸キナーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＰＭＫは、開始部位の上流のバシルスＲＢＳを含む酵母ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＭＰＤは、開始部位の上流のバシルスＲＢＳを含む酵母ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＩＤＩは、開始部位の上流のバシルスＲＢＳを含む酵母ｉｄｉ遺伝子を示す。ターミネーターは、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のターミネーターのアルカリ性セリンプロテアーゼ転写ターミネーターを示す。ＳｐｅｃＲは、スペクチノマイシン耐性マーカーを示す。「増幅用のｎｐｒＥ上流反復」は、増幅に用いられる上流領域の直接的反復を示す。

【図29A】ｎｐｒＥ遺伝子座における枯草菌染色体への組込み用の、下流ＭＶＡ経路と酵母ｉｄｉを含有するカセットのヌクレオチド配列（配列番号１３）である。

【図29B】ｎｐｒＥ遺伝子座における枯草菌染色体への組込み用の、下流ＭＶＡ経路と酵母ｉｄｉを含有するカセットのヌクレオチド配列（配列番号１３）である。

【図29C】ｎｐｒＥ遺伝子座における枯草菌染色体への組込み用の、下流ＭＶＡ経路と酵母ｉｄｉを含有するカセットのヌクレオチド配列（配列番号１３）である。

【図29D】ｎｐｒＥ遺伝子座における枯草菌染色体への組込み用の、下流ＭＶＡ経路と酵母ｉｄｉを含有するカセットのヌクレオチド配列（配列番号１３）である。

【図30】ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒのマップである。

【図31A】ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒのヌクレオチド配列（配列番号１４）である。

【図31B】ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒのヌクレオチド配列（配列番号１４）である。

【図32】ｐＴｒｃＰｏｐｌａｒのマップである。

【図33A】ｐＴｒｃＰｏｐｌａｒのヌクレオチド配列（配列番号１５）である。

【図33B】ｐＴｒｃＰｏｐｌａｒのヌクレオチド配列（配列番号１５）である。

【図33C】ｐＴｒｃＰｏｐｌａｒのヌクレオチド配列（配列番号１５）である。

【図34】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ Ｋａｎのマップである。

【図35A】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１６）である。

【図35B】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１６）である。

【図35C】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１６）である。

【図36】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＤＸＳ Ｋａｎのマップである。

【図37A】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１７）である。

【図37B】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１７）である。

【図37C】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１７）である。

【図38】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕのマップである。

【図39A】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号１８）である。

【図39B】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号１８）である。

【図39C】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号１８）である。

【図40】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ Ａ３のマップである。

【図41A】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ Ａ３のヌクレオチド配列（配列番号１９）である。

【図41B】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ Ａ３のヌクレオチド配列（配列番号１９）である。

【図41C】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ Ａ３のヌクレオチド配列（配列番号１９）である。

【図42】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩのマップである。

【図43A】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩのヌクレオチド配列（配列番号２０）である。

【図43B】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩのヌクレオチド配列（配列番号２０）である。

【図43C】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩのヌクレオチド配列（配列番号２０）である。

【図44】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳのマップである。

【図45A】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳのヌクレオチド配列（配列番号２１）である。

【図45B】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳのヌクレオチド配列（配列番号２１）である。

【図45C】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳのヌクレオチド配列（配列番号２１）である。

【図45D】ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳのヌクレオチド配列（配列番号２１）である。

【図46A】バイオマス原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。パネルＡは、コーンストーバーからのイソプレン産出を示す。、灰色の四角は、示された播種後の時点での培養液のＯＤ_６００測定値を表し、黒い三角は、示された播種後の時点でのイソプレン産出を表す。

【図46B】バイオマス原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。パネルＢは、バガスからのイソプレン産出を示す。灰色の四角は、示された播種後の時点での培養液のＯＤ_６００測定値を表し、黒い三角は、示された播種後の時点でのイソプレン産出を表す。

【図46C】バイオマス原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。パネルＣは、針葉樹パルプからのイソプレン産出を示す。、灰色の四角は、示された播種後の時点での培養液のＯＤ_６００測定値を表し、黒い三角は、示された播種後の時点でのイソプレン産出を表す。

【図46D】バイオマス原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。パネルＤは、グルコースからのイソプレン産出を示す。灰色の四角は、示された播種後の時点での培養液のＯＤ_６００測定値を表し、黒い三角は、示された播種後の時点でのイソプレン産出を表す。

【図46E】バイオマス原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。パネルＥは、原料を加えない細胞からのイソプレン産出を示す。灰色の四角は、示された播種後の時点での培養液のＯＤ_６００測定値を表し、黒い三角は、示された播種後の時点でのイソプレン産出を表す。

【図47A】グルコースを添加していない培養液におけるＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）によるイソプレン産出を表すグラフを示す。四角はＯＤ_６００を表し、三角は産出されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表す。

【図47B】ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％グルコース原料転化糖からのイソプレン産出を表すグラフを示す。四角はＯＤ_６００を表し、三角は産出されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表す。

【図47C】ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％転化糖原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。四角はＯＤ_６００を表し、三角は産出されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表す。

【図47D】ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％ＡＦＥＸコーンストーバー原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。四角はＯＤ_６００を表し、三角は産出されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表す。

【図48A】イソプレン産出に対する酵母抽出物の影響を示すグラフを示す。パネルＡは、様々な量の酵母抽出物を供給した発酵槽内の光学密度の時間経過を示す。液体培地流加

【図48B】イソプレン産出に対する酵母抽出物の影響を示すグラフを示す。パネルＢは、様々な量の酵母抽出物を供給した発酵槽内のイソプレン力価の時間経過を示す。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。流加

【図48C】イソプレン産出に対する酵母抽出物の影響を示すグラフを示す。液体培地パネルＣは、流加流加培養で増殖した大腸菌でのイソプレン産出に対する酵母抽出物の影響を示す。

【図49A】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ＋ｙＩＤＩ＋ＤＸＳプラスミドを含有する大腸菌細胞を含む５００Ｌバイオリアクターからのイソプレン産出を示すグラフを示す。パネルＡは、グルコースと酵母抽出物を供給した５００Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過を示す。

【図49B】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ＋ｙＩＤＩ＋ＤＸＳプラスミドを含有する大腸菌細胞を含む５００Ｌバイオリアクターからのイソプレン産出を示すグラフを示す。パネルＢは、グルコースと酵母抽出物を供給した５００Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図49C】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ＋ｙＩＤＩ＋ＤＸＳプラスミドを含有する大腸菌細胞を含む５００Ｌバイオリアクターからのイソプレン産出を示すグラフを示す。液体培地パネルＣは、グルコースと酵母抽出物を供給した５００Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過を示す。

【図50】ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２のマップである。

【図51A】ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２のヌクレオチド配列（配列番号２２）である。

【図51B】ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２のヌクレオチド配列（配列番号２２）である。

【図51C】ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２のヌクレオチド配列（配列番号２２）である。

【図52】ｐＢＳ Ｋｕｄｚｕ ＃２のマップである。

【図53A】１４リットル流加発酵で組換えクズイソプレンシンターゼを発現するバシルスの発酵時の増殖を示すグラフである。黒い菱形は、組換えイソプレンシンターゼを有さない対照株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）（非組換体のイソプレン産出）を表し、灰色の三角は、ｐＢＳＫｕｄｚｕを有するバシルス株ＢＧ３５９４ｃｏｍＫであるＣＦ４４３（組換え体のイソプレン産出）を表す。

【図53B】１４リットル流加発酵で組換えクズイソプレンシンターゼを発現するバシルスの発酵時のイソプレン産出を示すグラフである。黒い菱形は、組換えイソプレンシンターゼを有さない対照株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）（非組換体のなイソプレン産出）を表し、灰色の三角は、ｐＢＳＫｕｄｚｕを有するバシルス株ＢＧ３５９４ｃｏｍＫであるＣＦ４４３（組換え体のイソプレン産出）を表す。

【図54】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図55】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図56】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。

【図57】グリセロールを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図58】グリセロールを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図59】グリセロールを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出された総イソプレンの時間経過である。

【図60A】グルコースを供給した１５０Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図60B】グルコースを供給した１５０Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図60C】グルコースを供給した１５０Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図61A】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図61B】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図61C】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図62A】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図62B】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図62C】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。

【図63A】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図63B】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図63C】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図64A】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図64B】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図64C】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図65A】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図65B】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図65C】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図66A】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図66B】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図66C】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図67A】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図67B】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図67C】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。

【図68】様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＡの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。例えば、図のキャプションの最初の項目（４０℃の大気中のイソプレン）は、グラフ中の最も上にある曲線に対応する。

【図69】４％水と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＢの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。

【図70】５％ＣＯ_２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＣの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。

【図71】１０％ＣＯ_２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＤの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。

【図72】１５％ＣＯ_２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＥの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。

【図73】２０％ＣＯ_２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＦの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。

【図74】３０％ＣＯ_２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＧの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。

【図75A】シリーズＡについてＣＡＦＴモデル結果を重量パーセントから容積パーセントに変換したものの表である。

【図75B】容積パーセントとしてプロットされた図６８のシリーズＡについてのＣＡＦＴモデルからの引火性結果のグラフである。

【図76A】シリーズＢについてＣＡＦＴモデル結果を重量パーセントから容積パーセントに変換したものの表である。

【図76B】容積パーセントとしてプロットされた図６９のシリーズＢについてのＣＡＦＴモデルからの引火性結果のグラフである。

【図77】引火性試験容器を示す図である。

【図78A】試験シリーズ１：０％ストリーム、０ｐｓｉｇ、および４０℃の引火性曲線のグラフである。

【図78B】試験シリーズ１の爆発および非爆発データ点をまとめた表である。

【図78C】ＣＡＦＴモデルと比較した試験シリーズ１の引火性曲線のグラフである。

【図79A】試験シリーズ２：４％ストリーム、０ｐｓｉｇ、および４０℃の引火性曲線のグラフである。

【図79B】試験シリーズ２の爆発および非爆発データ点をまとめた表である。

【図79C】ＣＡＦＴモデルと比較した試験シリーズ２の引火性曲線のグラフである。

【図80A】試験シリーズ１の詳細な実験条件および実験結果の表である。

【図80B】試験シリーズ１の詳細な実験条件および実験結果の表である。

【図81】試験シリーズ２の詳細な実験条件および実験結果の表である。

【図82】３気圧の圧力での様々な窒素／酸素比の燃料濃度の関数としてプロットされた計算断熱火炎温度のグラフである。

【図83】１気圧の圧力での様々な窒素／酸素比の燃料濃度の関数としてプロットされた計算断熱火炎温度のグラフである。

【図84】図８２からのデータを用いて、実施例１３に記載の方法論に従って構築された引火限度のグラフである。実験データ点（丸）は、１気圧の初期系圧で実施された本明細書に記載の試験からのものである。

【図85】図８３からのデータを用いて、実施例１３に記載の方法論に従って構築された引火限度のグラフである。実験データ点（丸）は、１気圧の初期系圧で実施された本明細書に記載の試験からのものである。

【図86A】発酵発生ガスのＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。

【図86B】発酵発生ガス中に存在するわずかな揮発性物質を示すための図８６Ａの拡大図である。

【図87A】−７８℃でクライオトラッピングした後の発生ガス中に存在する微量の揮発性物質のＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。

【図87B】−１９６℃でクライオトラッピングした後の発生ガス中に存在する微量の揮発性物質のＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。

【図87C】図８７Ｂの拡大図である。

【図87D】図８７Ｃの拡大図である。

【図88A】石油から得られたイソプレン由来のＣ５炭化水素（図８８Ａ）と生物学的に産出されたイソプレン由来のＣ５炭化水素（図８８Ｂ）を比較したＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。標準は、主要イソプレンピークの近くで分離する３つのＣ５炭化水素不純物を含有する（図８８Ａ）。対照的に、生物学的に産出されたイソプレンは、大量のエタノールとアセトン（実行時間３．４１分）を含有する（図８８Ａ）。

【図88B】石油から得られたイソプレン由来のＣ５炭化水素（図８８Ａ）と生物学的に産出されたイソプレン由来のＣ５炭化水素（図８８Ｂ）を比較したＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。標準は、主要イソプレンピークの近くで分離する３つのＣ５炭化水素不純物を含有する（図８８Ａ）。対照的に、生物学的に産出されたイソプレンは、大量のエタノールとアセトン（実行時間３．４１分）を含有する（図８８Ａ）。

【図89】３ｇ／Ｌの酵母抽出物とともにグルコースを供給した、クズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＴｒｃＩＳ株の発酵発生ガスの解析のグラフである。

【図90】イソプレンと構造が類似していて、重合触媒毒としても作用し得るいくつかの不純物の構造を示す。

【図91】ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡとも呼ばれる）のマップである。

【図92A】ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡとも呼ばれる）のヌクレオチド配列（配列番号２３）である。

【図92B】ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡとも呼ばれる）のヌクレオチド配列（配列番号２３）である。

【図92C】ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡとも呼ばれる）のヌクレオチド配列（配列番号２３）である。

【図93】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図94】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図95】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。

【図96】転化糖を供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図97】転化糖を供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図98】転化糖を供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。

【図99】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図100】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図101】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターからのイソプレン比活性の時間経過である。

【図102】ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２のマップである。

【図103A】ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２のヌクレオチド配列（配列番号２４）である。

【図103B】ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２のヌクレオチド配列（配列番号２４）である。

【図103C】ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２のヌクレオチド配列（配列番号２４）である。

【図104】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図105】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図106】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。

【図107】プラスミドＭＣＭ３３０（ＦＲＴ−ｃｍ−ＦＲＴ−ｇｉ１．２−ＫＫＤｙ ａｔ ａｔｔＴｎ７）のマップである。

【図108A】プラスミドＭＣＭ３３０のヌクレオチド配列（配列番号２５）である。

【図108B】プラスミドＭＣＭ３３０のヌクレオチド配列（配列番号２５）である。

【図108C】プラスミドＭＣＭ３３０のヌクレオチド配列（配列番号２５）である。

【図109】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕのマップである。

【図110A】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号２６）である。

【図110B】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号２６）である。

【図111A】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図111B】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図111C】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターにおけるイソプレンの比生産性の時間経過である。

【図112A】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのマップである。

【図112B】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのヌクレオチド配列（配列番号２７）である。

【図112C】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのヌクレオチド配列（配列番号２７）である。

【図113A】ＭＣＭ３８２−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（マゼイ）のマップである。

【図113B】ＭＣＭ３８２−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（マゼイ）のヌクレオチド配列（配列番号２８）である。

【図113C】ＭＣＭ３８２−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（マゼイ）のヌクレオチド配列（配列番号２８）である。

【図114A】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのマップである。

【図114B】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのヌクレオチド配列（配列番号２９）である。

【図114C】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのヌクレオチド配列（配列番号２９）である。

【図115A】ＭＶＫとイソプレンシンターゼの過剰発現によってイソプレン産出が増加することを示す。１００μＭおよび２００μＭのＩＰＴＧでイソプレン産出を誘導し、１００ｍＬバイオリアクター中、グルコースで増殖したときのＭＣＭ４０１およびＭＣＭ３４３からの蓄積したイソプレンおよびＣＯ_２を、２２時間の時間経過にわたって測定した。図１１５Ａは、ＭＣＭ３４３からの蓄積したイソプレン（％）のグラフである。

【図115B】ＭＶＫとイソプレンシンターゼの過剰発現によってイソプレン産出が増加することを示す。１００μＭおよび２００μＭのＩＰＴＧでイソプレン産出を誘導し、１００ｍＬバイオリアクター中、グルコースで増殖したときのＭＣＭ４０１およびＭＣＭ３４３からの蓄積したイソプレンおよびＣＯ_２を、２２時間の時間経過にわたって測定した。図図１１５Ｂは、ＭＣＭ４０１からの蓄積したイソプレン（％）のグラフである。

【図115C】ＭＶＫとイソプレンシンターゼの過剰発現によってイソプレン産出が増加することを示す。１００μＭおよび２００μＭのＩＰＴＧでイソプレン産出を誘導し、１００ｍＬバイオリアクター中、グルコースで増殖したときのＭＣＭ４０１およびＭＣＭ３４３からの蓄積したイソプレンおよびＣＯ_２を、２２時間の時間経過にわたって測定した。図１１５Ｃは、ＭＣＭ３４３からの蓄積したＣＯ_２（％）のグラフである。

【図115D】ＭＶＫとイソプレンシンターゼの過剰発現によってイソプレン産出が増加することを示す。１００μＭおよび２００μＭのＩＰＴＧでイソプレン産出を誘導し、１００ｍＬバイオリアクター中、グルコースで増殖したときのＭＣＭ４０１およびＭＣＭ３４３からの蓄積したイソプレンおよびＣＯ_２を、２２時間の時間経過にわたって測定した。図１１５Ｄは、ＭＣＭ４０１からの蓄積したＣＯ_２（％）のグラフである。

【図116】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図117】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図118】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。

【図119】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、すなわち、代謝活性プロファイルである。

【図120】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン産出時の細胞生存性のグラフである。ＴＶＣ／ＯＤは、光学密度単位（ＯＤ_５５０）当たりの液体培地１ｍＬ中の総生菌数（コロニー形成単位）である。

【図121】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図122】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図123】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。

【図124】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の容積生産性の時間経過である。容積生産性は１時間当たりに液体培地１リットルから産出されるイソプレンの量と定義される。

【図125】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の瞬間的収率の時間経過である。瞬間的収率は、データ点とデータ点の間の期間にバイオリアクターに供給されたグルコースの量（グラム）当たりに産出されるイソプレン（グラム）の量（ｗ／ｗ）と定義される。

【図126】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、すなわち、代謝活性プロファイルである。

【図127】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン産出時の細胞生存性のグラフである。ＴＶＣ／ＯＤは、光学密度単位（ＯＤ_５５０）当たりの液体培地１ｍＬ中の総生菌数（コロニー形成単位）である。

【図128】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。

【図129】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【図130】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。

【図131】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、すなわち、代謝活性プロファイルである。

【図132】バイオリアクターへの空気流量の一時的な減少によって、発生ガス中のイソプレンの濃度の急増（これは、代謝活性（ＴＣＥＲ）の劇的な減少をもたらさなかった）が生じたことを示すグラフである。ＴＣＥＲ、すなわち代謝活性とは、総二酸化炭素発生速度のことである。

【図133】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン産出時の細胞生存性のグラフである。ＴＶＣ／ＯＤは、光学密度単位（ＯＤ_５５０）当たりの液体培地１ｍＬ中の総生菌数（コロニー形成単位）である。

【図134】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。縦点線は、イソプレンを１ｇ／Ｌ／時間の速度でバイオリアクターに導入したときの時間間隔を表す。

【図135】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、すなわち、代謝活性プロファイルである。縦点線は、イソプレンを１ｇ／Ｌ／時間の速度でバイオリアクターに導入したときの時間間隔を表す。

【図136】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン産出時の細胞生存性のグラフである。ＴＶＣ／ＯＤは、光学密度単位（ＯＤ_５５０）当たりの液体培地１ｍＬ中の総生菌数（コロニー形成単位）である。縦点線は、イソプレンを１ｇ／Ｌ／時間の速度でバイオリアクターに導入したときの時間間隔を表す。

【図137A】ウラジロハコヤナギｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３０）である。

【図137B】ウラジロハコヤナギｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３０）である。

【図137C】クロヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ）ｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３１）である。

【図137D】クロヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ）ｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３１）である。

【図137E】アメリカヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）ｐＥＴ２４ａの配列（配列番号３２）である。

【図137F】アメリカヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）ｐＥＴ２４ａの配列（配列番号３２）である。

【図137G】アメリカヤマナラシイソプレンシンターゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号３３）である。

【図137H】ブラックコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）ｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３４）である。

【図137I】ブラックコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）ｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３４）である。

【図137J】ヨーロッパヤマナラシ×ウラジロハコヤナギｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３５）である。

【図137K】ヨーロッパヤマナラシ×ウラジロハコヤナギｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３５）である。

【図137L】ｐＣＲ２．１骨格中にクズＩｓｐＳコード配列を含有するＭＣＭ９３のマップである。

【図137M】ＭＣＭ９３の配列（配列番号３６）である。

【図137N】ＭＣＭ９３の配列（配列番号３６）である。

【図137O】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕのマップである。

【図137P】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕ（配列番号３７）の配列である。

【図137Q】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕ（配列番号３７）の配列である。

【図138】全細胞ヘッドスペースアッセイで測定したときの様々なポプラ種のイソプレンシンターゼ発現データである。Ｙ軸は、ＩＰＴＧで誘導した０．２ｍＬの培養物によって産出されたイソプレンのμｇ／Ｌ／ＯＤである。

【図139】ＤＭＡＰＰアッセイで測定したときのポプライソプレンシンターゼ酵素の相対活性である。ポプラ酵素は、クズ由来のイソプレンシンターゼよりも有意に高い活性を有する。ポプラ［ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ］だけは、微量（＜１％）の活性を有していた。これはプロットに示されていない。

【図140】ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０−ｈｙｂｒｉｄ＿ＨＧＳのマップである。

【図141】ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０−ｈｙｂｒｉｄ＿ＨＧＳのヌクレオチド配列、酵母にコドン最適化されたクズイソプレンシンターゼ（配列番号３８）の配列である。

【図142A】ｐＤＷ１４のマップである。

【図142B】ｐＤＷ１４の完全ヌクレオチド配列（配列番号３９）である。

【図142C】ｐＤＷ１４の完全ヌクレオチド配列（配列番号３９）である。

【図143】ｐＤＷ１４またはｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を保有する誘導されたＩＮＶＳｃ−１株である。図１４３Ａ．ガラクトースで誘導されたＩＮＶＳｃ−１株から生じ、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色されたライセートの４〜１２％ビストリスゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。図１４３Ｂ．ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた同じ株のウェスタンブロット解析。レーンは以下の通りである。１、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２；２、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＤＷ１４（分離株１）；３、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＤＷ１４（分離株２）。（ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２分子量標準を用いて）ＭＷ（ｋＤａ）を示す。

【図144】ｐＤＷ１４またはｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を保有する誘導されたＩＮＶＳｃ−１株である。図１４４Ａ．細胞溶解前のガラクトース誘導株のＯＤ_６００。ｙ軸はＯＤ_６００である。図１４４Ｂ．対照およびイソプレンシンターゼ保有株におけるイソプレンシンターゼヘッドスペースのＤＭＡＰＰアッセイ。比活性をμｇＨＧ／Ｌ／ＯＤとして算出した。試料は以下の通りである。対照、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２；ＨＧＳ−１、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＤＷ１４（分離株１）；ＨＧＳ−２、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＤＷ１４（分離株２）。

【図145A】コドン最適化されたイソプレンシンターゼｆｌｕｏ−ｏｐｔ２ｖ２のマップである。

【図145B】コドン最適化されたイソプレンシンターゼ ｆｌｕｏ−ｏｐｔ２ｖ２のヌクレオチド配列（配列番号４０）である。

【図146A】ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５のマップである。

【図146B】ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５のヌクレオチド配列（配列番号４１）である。

【図146C】ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５のヌクレオチド配列（配列番号４１）である。

【図147A】ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２のマップである。

【図147B】ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２のヌクレオチド配列（配列番号４２）である。

【図147C】ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２のヌクレオチド配列（配列番号４２）である。

【図148】誘導されていないか、ＩＰＴＧ（４×５０μｍｏｌ）で誘導されたか、またはＩＰＴＧ（２×１００μｍｏｌ）で誘導されたＭＣＭ４０１株についてのＣＥＲ対発酵時間のグラフである。

【図149】ｐＨ調整されたかまたはｐＨ調整されていない、サトウキビ溶液中のグルコースの濃度を、加圧滅菌サイクル（１サイクル＝３０分）の回数の関数として示す。

【図150】グルコース、サトウキビ、および転化サトウキビでのシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｆ１およびシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ１３５２５の増殖曲線（時間の関数としてのＯＤ_６００）を示す。

【図151】グルコース、サトウキビ、および転化サトウキビでの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＭＧ１６５５、ＡＴＣＣ１１３０３およびＢ ＲＥＬ ６０６の増殖曲線（時間の関数としてのＯＤ_６００）を示す。

【図152】プラスミドｐＥＴ２４ Ｐ．ａｌｂａ ＨＧＳのマップである。

【図153A】プラスミドｐＥＴ２４ Ｐ．ａｌｂａ ＨＧＳのヌクレオチド配列（配列番号４３）である。

【図153B】プラスミドｐＥＴ２４ Ｐ．ａｌｂａ ＨＧＳのヌクレオチド配列（配列番号４３）である。

【図154】構造体プラスミドＥＷＬ２３０に対するエンドヌクレアーゼ消化に用いられる制限部位およびＢｓｐＨＩ部位とＮｃｏＩ部位の間の互換性のある付着末端を示す模式図である。

【図155】プラスミドＥＷＬ２３０のマップである。

【図156A】プラスミドＥＷＬ２３０のヌクレオチド配列（配列番号４４）である。

【図156B】プラスミドＥＷＬ２３０のヌクレオチド配列（配列番号４４）である。

【図157】構造体プラスミドＥＷＬ２４４に対するエンドヌクレアーゼ消化に用いられる制限部位およびＮｓｉＩ部位とＰｓｔＩ部位の間の適合したのある付着末端を示す模式図である

【図158】プラスミドＥＷＬ２４４のマップである。

【図159A】プラスミドＥＷＬ２４４のヌクレオチド配列（配列番号４５）である。

【図159B】プラスミドＥＷＬ２４４のヌクレオチド配列（配列番号４５）である。

【図160A】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのマップである。

【図160B】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのヌクレオチド配列（配列番号４６）である。

【図160C】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのヌクレオチド配列（配列番号４６）である。

【図161A】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのマップである。

【図161B】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのヌクレオチド配列（配列番号４７）である。

【図161C】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのヌクレオチド配列（配列番号４７）である。

【図162】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのマップである。

【図163A】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのヌクレオチド配列（配列番号４８）である。

【図163B】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのヌクレオチド配列（配列番号４８）である。

【図164A】１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｐｇｌを発現する大腸菌株（ＲＨＭ１１１６０８−２）によるイソプレン産出のグラフである。図１６４Ａは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過を示す。

【図164B】１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｐｇｌを発現する大腸菌株（ＲＨＭ１１１６０８−２）によるイソプレン産出のグラフである。図１６４Ｂは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。力価は発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。イソプレンの算出方法：５９時間で産出される累積イソプレン、５９時間でのｇ／発酵槽容積、Ｌ［＝］ｇ／Ｌ液体培地。

【図164C】１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｐｇｌを発現する大腸菌株（ＲＨＭ１１１６０８−２）によるイソプレン産出のグラフである。液体培地液体培地図１６４Ｃもまた、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。イソプレンの算出方法：∫（瞬間的イソプレン産出速度、ｇ／Ｌ／時間）ｄｔ ｔ＝０〜５９時間［＝］ｇ／Ｌ液体培地。

【図164D】１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｐｇｌを発現する大腸菌株（ＲＨＭ１１１６０８−２）によるイソプレン産出のグラフである。図１６４Ａは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過を示す。液体培地液体培地図１６４Ｄは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過を示す。

【図164E】１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｐｇｌを発現する大腸菌株（ＲＨＭ１１１６０８−２）によるイソプレン産出のグラフである。図１６４Ｅは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の容積生産性を示す。

【図164F】１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｐｇｌを発現する大腸菌株（ＲＨＭ１１１６０８−２）によるイソプレン産出のグラフである。図１６４Ｆは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の二酸化炭素発生速度（ＣＥＲ）、すなわち代謝活性プロファイルを示す。

【図165A】１５Ｌバイオリアクターにおける発酵からの発生ガスの分析を示すグラフである。試料Ａは、６４．８時間でサンプリングされたＲＭ１１１６０８−２株である。試料ＢはＥＷＬ２５６株であり、これは、３４．５時間でサンプリングされた、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫであった。水素は、両方の試料について、ベースライン（０．９５×１０^−８ｔｏｒｒ）よりも上で検出される。

【図165B】１５Ｌバイオリアクターにおける発酵からの発生ガスの分析を示すグラフである。試料Ａは、６４．８時間でサンプリングされたＲＭ１１１６０８−２株である。試料ＢはＥＷＬ２５６株であり、これは、３４．５時間でサンプリングされた、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫであった。水素は、両方の試料について、ベースライン（０．９５×１０^−８ｔｏｒｒ）よりも上で検出される。

【図166】様々な炭素源を含むＳＣ最小培地における密封された２０ｍｌのＧＣバイアル中での増殖の前後にＯＤ_６００で測定された、コドン最適化されたＫｕｄｚｕＩｓｐＳを発現するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株（ＤＷ１１２）またはＵＲＡ３を発現する対照株（ＤＷ１１４）の増殖を示す。株を０．５％グルコース（初期ＯＤ）中で好気的に増殖させ、その後、１％ラフィノースまたは２％ガラクトースを追加して４８時間、嫌気的に増殖させた（嫌気的培養後のＯＤ）。Ａ．ＤＷ１１２（これは、ガラクトース誘導性ＩｓｐＳを保有する）の増殖。Ｂ．ＤＷ１１４（これは、ベクター対照を担持する）の増殖。

【図167】サッカロミセス・セレビシエ株によって産出されたヘッドスペースガスの未編集のＧＣトレースを示す。Ａ．１１２Ｇ−０．５％グルコース、２％ガラクトースで増殖させ、誘導したＤＷ１１２（ＩｓｐＳ発現）。Ｂ．１１２Ｒ−０．５％グルコース、１％ラフィノースで増殖させたＤＷ１１２。Ｃ．１１４Ｇ−０．５％グルコース、２％ガラクトースで増殖させ、誘導したＤＷ１１４（対照）。Ｄ．１１４Ｒ−０．５％グルコース、１％ラフィノースで増殖させたＤＷ１１４。試料１１２Ｇにおける唯一の検出可能なイソプレンピークが丸で囲まれている。

【図168】サッカロミセス・セレビシエ株によって産出された化合物の未編集のＨＰＬＣトレースを示す。Ａ．１１２Ｇ−０．５％グルコース、２％ガラクトースで増殖させ、誘導したＤＷ１１２（ＩｓｐＳ発現）。Ｂ．１１２Ｒ−０．５％グルコース、１％ラフィノースで増殖させたＤＷ１１２。Ｃ．１１４Ｇ−０．５％グルコース、２％ガラクトースで増殖させ、誘導したＤＷ１１４（対照）。Ｄ．１１４Ｒ−０．５％グルコース、１％ラフィノースで増殖させたＤＷ１１４。エタノールピークが丸で囲まれている。

【図169】ピルビン酸デカルボキシラーゼによるＤＸＰ経路およびエタノール発酵経路の概略図を示す。

【図170】大腸菌におけるピルビン酸周辺の反応の概略図を示す。大腸菌に内在する酵素は青で示されている。ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）由来の酵素は赤で示されている。矢印の上に記載されている数字は、その順に、ミカエリス・メンテン定数（Ｋ_ｍ）（ｍＭ）と触媒反応速度定数（Ｋ_ｃａｔ）（１／ｓ）である。数字が１つしか記載されていない場合は、Ｋ_ｍ（ｍＭ）である。

【図171A】プラスミドｐＢＢＲ５−Ｐｔｒｃｐｄｃのマップである。図１７１Ｂ〜Ｃは、Ｔｒｃプロモーターの制御下にあるジモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする、プラスミドｐＢＢＲ５−Ｐｔｒｃｐｄｃのヌクレオチド配列（配列番号１４８）である。

【図172A】プラスミドｐＤｕ−３９のマップである。図１７２Ｂ〜Ｄは、プラスミドｐＤｕ−３９のヌクレオチド配列（配列番号１５１）である。

【図173】プラスミドｐＭＣＭ７２のマップである。

【図174A】プラスミドｐＭＣＭ５９６のマップである。図１７４Ｂ〜Ｄは、プラスミドｐＭＣＭ５９６のヌクレオチド配列（配列番号１５４）である。

【図175】ＴＭ３＋０．５５グルコース＋抗生物質＋０．１％（四角）または１％（三角）酵母抽出物中のＣＭＰ１８２株とＣＭＰ１８３株の増殖曲線である。

【図176】０．１％（Ａ）（誘導５時間後）および１％（Ｂ）（誘導２時間後）酵母抽出物を含有するフラスコ中のエタノール濃度とイソプレン比生産性（任意単位で示す）を示す。両方の産物は同時に産出される。

【図177】１％酵母抽出物フラスコ中、誘導５時間後の発酵産物を示す。ｐｄｃを発現する株は、より高いエタノール中濃度を示すが、これにより、ｐｄｃが発現されて、活性があったという事実が確認される。ｌｄｈＡとｐｄｃのＫ_ｍの比較から予想されるように、ピルビン酸の乳酸への流れは、ｐｄｃが発現した時点で遮断される。また、ｐｄｃを発現する株では、アセチル−ＣｏＡに使われるよりも多くの炭素がアセトアルデヒドに使われ、酢酸が減少する。

【図178】プラスミドｐＤＵ４７−３−ｐＥＴ２４ａ−Ｐ．ａｌｂａ（−３）のマップである。

【図179A】プラスミドｐＤＵ４７−３−ｐＥＴ２４ａ−Ｐ．ａｌｂａ（−３）の配列（配列番号１５９）である。

【図179B】プラスミドｐＤＵ４７−３−ｐＥＴ２４ａ−Ｐ．ａｌｂａ（−３）の配列（配列番号１５９）である。

【図180】プラスミドｐＢＢＲ−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１のマップである。

【図181A】プラスミドｐＢＢＲ−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１の配列（配列番号１６０）である。

【図181B】プラスミドｐＢＢＲ−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１の配列（配列番号１６０）である。

【図182】ジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳおよびジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１によるイソプレンの産出を示す。

【図183A】エンテロバクター・フェカーリス由来の上流ＭＶＡ経路ポリペプチドｍｖａＥとｍｖａＳを発現するプラスミドｐＤＷ１５（配列番号１６１）のマップを示す。図１８３Ｂ〜Ｄは、ｐＤＷ１５の配列である。

【図184A】プラスミドｐＳＹＣＯ１０９のマップを示す。図１８４Ｂ〜Ｆは、ｐＳＹＣＯ１０９の配列（配列番号１６２）である。

【図185A】プラスミドｐＳＹＣＯ１０９Ｆ１．１のマップを示す。図１８５Ｂ〜Ｆは、ｐＳＹＣＯ１０９Ｆ１．１の配列（配列番号１６３）である。

【図186】ｐｇｌ遺伝子周辺の大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５の染色体構成を示す。角括弧（［］）は、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５と比較して大腸菌ＢＬ２１で欠失し、大腸菌株ＣＭＰ２４１で回復している領域を示す。丸で囲まれた遺伝子はｙｂｇＳである。順方向の矢印（→）は、ｇａｌＭＲプライマー（配列番号１８７）のアニーリング部位を示す。逆方向の矢印（←）は、ｇａｌＭＦプライマー（配列番号１８６）のアニーリング部位を示す。

【図187A】２００μＭ ＩＰＴＧ±１２５ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２の存在下での大腸菌株ＣＭＰ２４９によるグリセロールおよび／または１，３−プロパンジオールの産出を示す。黒塗りの記号：グリセロール、白抜きの記号：１，３−ＰＤＯ。灰色：＋Ｂ１２、黒色：−Ｂ１２。ＥＦＴ：経過発酵時間。図１８７Ｂは、２００μＭ ＩＰＴＧ±１２５ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２の存在下での大腸菌株ＣＭＰ２４９によるイソプレンの産出を示す。灰色：＋Ｂ１２、黒色：−Ｂ１２。ＥＦＴ：経過発酵時間。図１８７Ｃは、２００μＭ ＩＰＴＧ±１２５ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２の存在下での大腸菌株ＣＭＰ２４９によるＯＤプロファイルとグルコース消費を示す。黒塗りの記号：グルコース、白抜きの記号：ＯＤ。灰色：＋Ｂ１２、黒色：−Ｂ１２。ＥＦＴ：経過発酵時間。図１８７Ｄは、２００μＭ ＩＰＴＧ±１２５ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２の存在下で増殖させた大腸菌株ＣＭＰ２４９における１，３−プロパンジオールとグリセロールのモル収率を示す。灰色：＋Ｂ１２、黒色：−Ｂ１２。ＥＦＴ：経過発酵時間。

【図188】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターにおける光学密度の時間経過を示す。

【図189】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターにおけるイソプレン力価の時間経過を示す。イソプレン力価は、発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。イソプレン力価を算出する方程式：∫（瞬間的イソプレン産出速度、ｇ／Ｌ／時間）ｄｔ ｔ＝０〜ｔ時間［＝］ｇ／Ｌ液体培地。

【図190】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過を示す。

【図191】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターにおけるイソプレンの比生産性を示す。比生産性レベルを算出する方程式：（ｍｇイソプレン_ｔ−ｍｇイソプレン_ｔｏ）／（ＯＤ５５０_ｔ^＊Ｌ液体培地_ｔ−ＯＤ５５０_ｔｏ^＊Ｌ液体培地_ｔｏ）／（ｔ−ｔ_０）［＝］ｍｇイソプレン／ＯＤ／Ｌ／時間。

【図192】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターにおける１，３−プロパンジオール力価の時間経過を示す。力価は、発酵液体培地１リットル当たりに産出される物質の量と定義される。１，３−プロパンジオール力価を算出する方程式：産出される全物質（ｇ）／発酵槽液体培地の容積（Ｌ）［＝］ｇ／Ｌ液体培地。

【図193】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターから産出される総１，３−プロパンジオールの時間経過を示す。

【図194】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターにおける１，３−ＰＤＯの比生産性を示す。比生産性レベルを算出する方程式：（ｍｇ １，３−ＰＤＯ_ｔ−ｍｇ １，３−ＰＤＯ_ｔｏ）／（ＯＤ５５０_ｔ^＊Ｌ液体培地_ｔ−ＯＤ５５０_ｔｏ^＊Ｌ液体培地_ｔｏ）／（ｔ−ｔ_０）［＝］ｍｇイソプレン／ＯＤ／Ｌ／時間。

【図195】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターにおけるグリセロール力価の時間経過を示す。グリセロール力価は、発酵液体培地１リットル当たりに産出される物質の量と定義される。グリセロール力価を算出する方程式：産出される全物質（ｇ）／発酵槽液体培地の容積（Ｌ）［＝］ｇ／Ｌ液体培地。

【図196】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターから産出される総グリセロールの時間経過を示す。

【図197】グルコースを供給した大腸菌株ＣＭＰ２３９を含有する１５Ｌバイオリアクターにおけるグリセロールの比生産性を示す。比生産性レベルを算出する方程式：（ｍｇグリセロール_ｔ−ｍｇグリセロール_ｔｏ）／（ＯＤ５５０_ｔ^＊Ｌ液体培地_ｔ−ＯＤ５５０_ｔｏ^＊Ｌ液体培地_ｔｏ）／（ｔ−ｔ_０）［＝］ｍｇイソプレン／ＯＤ／Ｌ／時間。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本発明は、特に、イソプレンと副生成物を産出するための組成物および方法を提供する。一態様では、副生成物は水素である。別の態様では、副生成物はＣ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールである。いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは、エタノールである。いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，２−プロパンジオールである。いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，３−プロパンジオールである。

【0032】

イソプレンと水素の同時生成のために酸素制限培養された細胞、イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下でそのような細胞を培養することによりイソプレンと水素を同時に生成する方法、およびイソプレンと水素を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、酸素、二酸化炭素、または窒素、および１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性炭化水素をさらに含む。イソプレンと水素を両方とも回収し、必要に応じて精製することもできる。回収されたイソプレンを重合させて、合成ゴムを産出することができる。回収された水素を用いて、発酵プロセスに動力を供給し、それによりイソプレン産出のコストを下げ、従来の発酵における高エタノール濃度の蓄積に伴う潜在的な危険を減らし、このプロセスの全体の「二酸化炭素排出量」を減らすことができる。

【0033】

イソプレンの産出のための既存の好気的系は、メバロン酸（「ＭＶＡ」）経路または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（「ＤＸＰ」）経路のいずれかを介して、初期電子受容体としての酸素分子（Ｏ_２）とともに水素ガスを産出する。ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路は両方ともグルコースから出発して、酸素入力を必要とし、少量の水素ガスを発生させる。現在のピークイソプレン生産性（例えば、約６ｇ／Ｌ／時間）において、イソプレンを産出する好気性培養物は、＞２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の酸素取込み速度（「ＯＵＲ」）を有する。ＭＶＡ経路を介するグルコースの水素ガスへの変換は、処理する必要がある余剰の還元当量を流出させるが、その余剰分をＯ_２に放出させると、少なくとも２つの問題が生じる。すなわち、第１に、水素ガスとＯ_２の組合せは安全上の問題を引き起こし、第２に、ＯＵＲの高い発酵は資本とエネルギーを大量に消費する。余剰の還元当量は潜在的なエネルギーに相当するので、それらの余剰の還元当量をＯ_２に対して放出する代わりにＨ_２として捕捉すれば有用である。さらに、産出されるＨ_２を用いて、発酵プロセスに動力を供給し、それにより直接的にコストを下げ、間接的にこのプロセスの全体の「二酸化炭素排出量」を減らすことができる。水素は、組換え大腸菌ＢＬ２１を用いたバッチ系発酵と連続系発酵の両方によって産出されている。例えば、Ｇ．Ｃｈｉｔｔｉｂａｂｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ−２１，” Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１（３）：６８２−６８８（２００６）を参照されたく、これは、特に、組換え大腸菌ＢＬ２１を用いた発酵による水素の産出に関して、参照により本明細書に組み込まれる。

【0034】

大腸菌などの細菌系には、余剰の還元当量をヒドロゲナーゼに到達させるための少なくとも３つの経路がある。第１は、大腸菌ピルビン酸ギ酸リアーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ／ギ酸水素リアーゼ／ヒドロゲナーゼ−３系などの内在性細菌酵素を用いるもの。例えば、Ｇｅｒｈａｒｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”，１９４−１９６ページ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，初版．１９７９）を参照されたい。第２は、グリセルアルデヒド−３−リン酸オキシドレダクターゼ（「ＧＡＰＯＲ」）および／またはピルビン酸オキシドレダクターゼ（「ＰＯＲ」）などの異種電子捕獲系に、フェレドキシン依存的クロストリジウム・アセトブツリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｕｌｉｃｕｍ）ヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）などの異種ヒドロゲナーゼ活性と共役した、フェレドキシンオキシドレダクターゼを提供することによるもの。例えば、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００６）を参照されたく、これは、特に、ＨｙｄＡならびに３つのＨｙｄＡ関連成熟酵素（ＨｙｄＥ、ＨｙｄＧおよびＨｙｄＦ）による水素の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。第３は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ＮＡＤＰＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＮＦＯＲ）（例えば、Ｖｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２００８）を参照されたく、これは、特に、ＮＦＯＲによる水素の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる；また、ＰＣＴ刊行物ＷＯ／２００７／０８９９０１号を参照されたく、これは、特に、水素を産出するための大腸菌株の最適化に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）またはクロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＲｎｆＣＤＧＥＡＢ）（Ｈｅｎｎｉｎｇ Ｓｅｅｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ，ａ ｓｔｒｉｃｔ ａｎａｅｒｏｂｅ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（６）：２１２８−２１３３（２００８）、これは、特に、ＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼに関して、およびフェレドキシン依存的クロストリジウム・アセトブツリクムヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）などの異種ヒドロゲナーゼ活性と共役した、嫌気的エタノール−酢酸発酵経路）の構成要素に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの異種電子伝達系を提供することによるものである。例えば、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００６）を参照されたい。

【0035】

したがって、余剰の還元当量をＨ_２として捕獲するために本明細書で提供される１つの戦略は、嫌気的発酵を介してイソプレンを産出し、内在性ヒドロゲナーゼ系の発現によって水素を同時に生成する細菌系を人為的に作製することを含む。例えば、機能的なＨ_２生成系をもつイソプレンを産出する大腸菌細胞を人為的に作製して、大腸菌ヒドロゲナーゼ−３（Ｈｙｄ−３）ポリペプチド、大腸菌ピルビン酸ギ酸リアーゼ（「ＰＦＬ」）、および嫌気性条件下、酸性ｐＨでギ酸とＣＯ_２から水素ガスを産出する大腸菌ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体を発現させることができる（例えば、Ａｋｉｈｉｔｏ Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｍａｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｌｙａｓｅ ｏｆ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ ｇｒｏｗｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ａ ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，” Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：７５４−７６０（２００７）を参照されたく、これは、特に、大腸菌におけるギ酸水素リアーゼの発現の誘導に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0036】

余剰の還元当量をＨ_２として捕獲するために本明細書で提供される第２の戦略は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成するためのハイブリッド系を人為的に作製することを含む。このような系であれば、現在の好気的培養条件よりも少ない酸素を利用しながらイソプレンと水素を同時に生成するであろう。大部分のヒドロゲナーゼは、ある程度は酸素感受性であるが、細菌株を人為操作して、例えば、ルブリビバクス・ゲラチノースス（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ）ヒドロゲナーゼ（例えば、Ｐ．Ｃ．Ｍａｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｘｙｇｅｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ，” Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８（６）：２６３３−２６３６（２００２）を参照されたく、これは、特に、Ｒ．ゲラチノーススヒドロゲナーゼに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、またはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ヒドロゲナーゼ（例えば、Ｂｕｒｇｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，（２００５）を参照されたく、これは、特に、Ｒ．ユートロファヒドロゲナーゼポリペプチドに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの酸素耐性または酸素非感受性のヒドロゲナーゼを発現させることができる。あるいは、従来の酸素感受性ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を突然変異させ、標準的な方法およびアッセイ（例えば、Ｌ．Ｅ．Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ［ＦｅＦｅ］−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｓ．２９（３）４２１−４３０（２００７）を参照されたく、これは、特に、酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドの突然変異導入とスクリーニングに関して、参照により本明細書に組み込まれる）を用いて、、スクリーニングして、Ｏ_２耐性またはＯ_２非感受性のヒドロゲナーゼ突然変異体を同定することができる。

【0037】

余剰の還元当量をＨ_２として捕獲するために本明細書で提供される第３の戦略は、イソプレンと水素を同時に生成するように偏性嫌気性細菌を人為操作することを含む。このような系であれば、嫌気性培養でイソプレンと水素を同時に生成するであろう。例えば、偏性嫌気性菌を人為操作して、例えば、フェレドキシン依存的クロストリジウム・アセトブツリクムヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）（例えば、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００６）を参照されたく、これは、特に、ＨｙｄＡならびに３つのＨｙｄＡ関連成熟酵素（ＨｙｄＥ、ＨｙｄＧおよびＨｙｄＦ）による水素の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）またはＮＡＤＰＨ依存的ピロコックス・フリオススヒドロゲナーゼ（例えば、Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ，” Ｎａｔｕｒｅ ４０５（６７９０）：１０１５−１５（２０００）を参照されたく、これは、特に、ＮＡＤＰＨ依存的Ｐ．フリオススヒドロゲナーゼによる水素の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの異種ヒドロゲナーゼ活性と組み合わせた、グリセルアルデヒド−３−リン酸オキシドレダクターゼ（「ＧＡＰＯＲ」）および／またはピルビン酸オキシドレダクターゼ（「ＰＯＲ」）、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＮＦＯＲ）またはクロストリジウム・クルイベリＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＲｎｆＣＤＧＥＡＢ）を発現させることができる。

【0038】

本明細書に記載の戦略のいずれにおいても、水素収率は、乳酸、酢酸、ピルビン酸、エタノール、コハク酸、およびグリセロールなどの発酵副産物を産出するものまたは水素再取込みに関与するものをはじめとする非生産的代謝経路を遮断することにより、また、例えば、ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質または転写因子などの、適当な組のヒドロゲナーゼおよび／または他の代謝調節タンパク質を発現させることによっても、最大化することができる。例えば、Ｔｏｓｈｉｎｏｒｉ Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，” Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（４）：８７９−８９０（２００７）を参照されたく、これは、特に、グルコース代謝が改変された大腸菌株の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0039】

いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは、エタノールである。イソプレンとエタノールを同時に生成するために酸素制限培養された細胞、イソプレンとエタノールの同時生成に好適な条件下でそのような細胞を培養することによってイソプレンとエタノールを同時に生成する方法、およびイソプレンを含む組成物、エタノールを含む組成物またはイソプレンとエタノールを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、酸素、二酸化炭素、または窒素、および１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性炭化水素をさらに含む。イソプレンとエタノールを両方とも回収し、必要に応じて精製することもできる。回収されたイソプレンを重合させて、合成ゴムを産出することができる。回収されたエタノールを用いて、発酵プロセスに動力を供給し、それによりイソプレン産出のコストを下げ、従来の発酵における高エタノール濃度の蓄積に伴う潜在的な危険を減らし、このプロセスの全体の「二酸化炭素排出量」を減らすことができる。

【0040】

イソプレンとエタノールの同時生成によって、ＤＸＰ経路によるグルコースからのイソプレンの理論的収率を増加させる方法が提供されるが、それは、エタノールの産出において発生したＡＴＰをこの経路で利用して、イソプレンを作ることができるからである。さらに、このプロセスは嫌気的に行なわれ、酸素移動のための資本投資を減らす。このプロセスは、タンクの撹拌に関しては、既存のエタノール工場で行なうことすらできる。イソプレンとエタノールの同時生成は、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）や、細菌（例えば、大腸菌およびジモモナス・モビリス）を含む、種々の細胞型で行なうことができる。大腸菌は、嫌気的に増殖させた場合、アセチル−ＣｏＡからアセトアルデヒドを経てエタノールにする酵素ａｄｈＥを用いてエタノールを産出することができるが、大腸菌または他の細菌（例えば、ジモモナス・モビリス）におけるピルビン酸周辺の生化学的反応と関連する１以上の酵素を発現させることによってエタノール産出を改善することができる。例えば、大腸菌におけるエタノール産出を、ジモモナス・モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）の共発現によって大いに改善することができる（実施例２８参照）。

【0041】

いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，２−プロパンジオールである。イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成するために酸素制限培養された細胞、イソプレンと１，２−プロパンジオールの同時生成に好適な条件下でそのような細胞を培養することによってイソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成する方法、およびイソプレンを含む組成物、１，２−プロパンジオールを含む組成物またはイソプレンと１，２−プロパンジオールを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、酸素、二酸化炭素、または窒素、および１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性炭化水素をさらに含む。イソプレンと１，２−プロパンジオールを両方とも回収し、必要に応じて精製することもできる。回収されたイソプレンを重合させて、合成ゴムを産出することができる。回収された１，２−プロパンジオールを用いて、発酵プロセスに動力を供給し、それによりイソプレン産出のコストを下げ、従来の発酵時の高１，２−プロパンジオール濃度の蓄積に伴う潜在的な危険を減らし、このプロセスの全体の「二酸化炭素排出量」を減らすことができる。

【0042】

いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは１，３−プロパンジオールである。イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成するために酸素制限培養された細胞、イソプレンと１，３−プロパンジオールの共産出に好適な条件下でそのような細胞を培養することによってイソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成する方法、およびイソプレンを含む組成物、１，３−プロパンジオールを含む組成物またはイソプレンと１，３−プロパンジオールを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、酸素、二酸化炭素、または窒素、および１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性炭化水素をさらに含む。イソプレンと１，３−プロパンジオールを両方とも回収し、必要に応じて精製することもできる。回収されたイソプレンを重合させて、合成ゴムを産出することができる。回収された１，３−プロパンジオールを用いて、発酵プロセスに動力を供給し、それによりイソプレン産出のコストを下げ、従来の発酵時の高１，３−プロパンジオール濃度の蓄積に伴う潜在的な危険を減らし、このプロセスの全体の「二酸化炭素排出量」を減らすことができる。

【0043】

定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるものである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本発明で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。記載された特定の方法、プロトコル、および試薬は様々に異なり得るので、本発明は、これらに限定されるものではないことが理解されるべきである。また、当業者であれば、本発明を実施または試験するために、本明細書に記載された方法および材料と同様または同等の任意の方法および材料を用いることができることも理解するであろう。

【0044】

本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。本発明の様々な態様または実施形態は、本明細書を全体として参照することによって捉えることができる。

【0045】

本明細書で使用する場合、特に明確に断りがない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」などの用語の使用は、１つまたは複数を指す。

【0046】

本明細書中の「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそれ自体に対する実施形態を含む（記述する）。例えば、「約Ｘ」に関する記述は、「Ｘ」に関する記述を含む。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。

【0047】

本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、態様および実施形態「からなる」ならびに態様および実施形態「から本質的になる」ことを含むことが理解されるべきである。

【0048】

本明細書で使用される場合、「Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオール」という用語は、エタノール（ＣＡＳ番号６４−１７−５）、１−プロパノール（ＣＡＳ番号７１−２３−８）、２−プロパノール（ＣＡＳ番号６７−６３−０）、１，２−プロパンジオール（ＣＡＳ番号５７−５５−６）、１，３−プロパンジオール（ＣＡＳ番号５０４−６３−２）、およびグリセロール（ＣＡＳ番号５６−８１−５）を含むが、これらに限定されない。特に断りのない限り、「１，２−プロパンジオール」という用語は、１，２−（Ｒ）−プロパンジオール、１，２−（Ｓ）−プロパンジオール、または１，２−（Ｒ／Ｓ）−プロパンジオールのラセミ混合物を指す。

【0049】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドの断片、および融合ポリペプチドを含む。

【0050】

本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドのライブラリー、例えば、２、５、１０、２０、５０個またはそれより多くの異なるポリペプチドのライブラリーの一部ではなく、それが天然に生じる少なくとも１つの構成要素から分離されている。単離されたポリペプチドは、例えば、そのポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって得ることができる。

【0051】

「異種ポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列が同じ宿主細胞で天然に発現される別のポリペプチドのアミノ酸配列とは同一でないポリペプチドを意味する。特に、異種ポリペプチドは、天然で同じ宿主細胞中に見出される野生型ポリペプチドとは同一でない。

【0052】

「コドン縮重」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝暗号の相違を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について十分に知っている。そのため、宿主細胞での発現を改善する核酸を合成する場合、いくつかの実施形態では、そのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように核酸を設計することが望ましい。

【0053】

本明細書で使用される場合、「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態で共有結合した２以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを指す。単一ヌクレオチド突然変異を含む突然変異が、本明細書で定義されるような核酸の内部で生じ得ることが理解されるべきである。

【0054】

「組換え核酸」とは、目的の核酸が得られる生物の天然に存在するゲノム中で目的の核酸に隣接する１以上の核酸（例えば、遺伝子）が含まれない目的の核酸を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクターに、自律複製するプラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる、あるいは他の配列から独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、またはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。単一ヌクレオチド突然変異を含む突然変異が、本明細書で定義されるような核酸の内部で生じ得ることが理解されるべきである。

【0055】

「異種核酸」とは、その核酸配列が同じ宿主細胞で天然に見出される別の核酸の核酸配列とは同一でない核酸を意味する。特に、異種核酸は、天然で同じ宿主細胞中に見出される野生型核酸とは同一でない。

【0056】

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、１以上の目的の核酸を運び、望ましくは宿主細胞内でこれを発現することができる構造体を意味する。ベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、コスミド、およびファージベクターが挙げられる。

【0057】

本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、目的の核酸の転写を導く核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター（例えば、恒常的もしくは誘導性プロモーター）、またはエンハンサーであることができる。「誘導性プロモーター」は、環境的または発生的調節の下で活性のあるプロモーターである。発現制御配列は、転写される核酸断片に機能的に連結されている。

【0058】

「選択マーカー」または「選択可能マーカー」という用語は、導入された核酸またはベクターを含有する宿主細胞の選択を容易にする宿主細胞で発現可能な核酸を指す。選択可能マーカーの例としては、限定するものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に代謝上の優位（例えば、栄養上の優位）を付与する核酸が挙げられる。例示的な栄養選択マーカーとしては、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、およびｐｙｒ４のような当該技術分野で公知のマーカーが挙げられる。

【0059】

イソプレン
本明細書で使用される場合、「イソプレン」または「２−メチル−１，３−ブタジエン」（ＣＡＳ＃７８−７９−５）という用語は、３，３−ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）からのピロリン酸の放出により直接的かつ最終的に得られる揮発性Ｃ５炭化水素産物を指し、１以上のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）分子の１以上のＤＭＡＰＰ分子への連結または重合を必要としない。「イソプレン」という用語は、本明細書において特に断りのない限り、通常、その産出方法に限定されることを意図するものではない。

【0060】

イソプレンの大部分は、石油化学源から純粋でないＣ５炭化水素画分として得られ、この画分は、この物質が重合に適したものとなる前に徹底的に精製される必要がある。いくつかの不純物は、その構造がイソプレンと類似していることや、それらが重合触媒毒として作用し得る事実を考えると、特に問題である。このような化合物としては、１，３−シクロペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、およびｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インが挙げられる（図９０）。いくつかの実施形態では、本発明のイソプレン組成物は、任意の汚染不飽和Ｃ５炭化水素を実質的に含まない。実施例１０にさらに記載されるように、イソプレン以外の検出可能な量の不飽和Ｃ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）は、本明細書に記載の方法を用いて産出されるイソプレン組成物中に見出されなかった。本明細書に記載の方法を用いて産出されるイソプレン組成物の中には、ＧＣ／ＭＳ分析で測定した場合に、エタノール、アセトン、およびＣ５プレニルアルコールを含有するものがあった。これらの成分は全て、石油化学源から得られるイソプレン組成物中に存在する異性体Ｃ５炭化水素画分よりもはるかに容易にイソプレン流から除去される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のイソプレン組成物は、重合用品質であるために、最小限の処理しか必要としない。

【0061】

一態様では、本発明の組成物および方法は、イソプレン産出の速度を増加させ、産出されるイソプレンの総量を増加させる。例えば、４．８×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間のイソプレンを生成する細胞培養系が作製されている（表１）。これらの系の効率は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約２．２％がイソプレンに変換されることによって示される。実施例および表２に示すように、液体培地１リットル当たり約３ｇのイソプレンが生成された。所望により、他の条件（例えば、本明細書に記載の他の条件）を用いて、一層より多くの量のイソプレンを得ることができる。いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源をイソプレンの産出に使用する。いくつかの実施形態では、イソプレンの産出は、細胞の増殖とは切り離されている。いくつかの実施形態では、イソプレンと任意の酸化体の濃度は、イソプレンの産出または回収時に火災が発生し得る危険性を低下させるかまたは排除するために非引火範囲内とする。本発明の組成物および方法は、細胞当たりの高いイソプレン収率、高い炭素収率、高いイソプレン純度、高い生産性、低いエネルギー使用、低い生産コストと生産投資、および最小限の副反応を可能にするので望ましい。この効率的で、大規模なイソプレン産出のための生合成プロセスは、合成イソプレン系ゴムのためのイソプレン源を提供し、天然ゴムの使用に代わる望ましい低コスト代替物を提供する。

【0062】

以下でさらに論じるように、細胞によって産出されるイソプレンの量を、イソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、植物イソプレンシンターゼポリペプチド）をコードする異種核酸を細胞に導入することによって大いに増加させることができる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。実施例に示すように、異種タイワンクズ（クズ）イソプレンシンターゼポリペプチドを、大腸菌、パントエア・シトレア、枯草菌、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの、種々の宿主細胞で発現させた。これらの細胞は全て、異種イソプレンシンターゼポリペプチドを有さない対応する細胞よりも多くのイソプレンを産出した。表１および２に示すように、本明細書に記載の方法を用いて、大量のイソプレンが産出される。例えば、異種イソプレンシンターゼ核酸を有する枯草菌細胞は、１４リットル発酵槽において、異種核酸を有さない対応する対照枯草菌細胞よりも約１０倍多いイソプレンを産出した（表２）。発酵槽における大腸菌による３００ｍｇのイソプレン／液体培地１リットル（ｍｇ／Ｌ、ここで、液体培地の容積は、細胞培地の容量と細胞の容積の両方を含む）および枯草菌による３０ｍｇ／Ｌは、相当な量のイソプレンを生成させることができることを示している（表２）。所望により、イソプレンを一層より大きい規模で産出させることができ、または本明細書に記載の他の条件を用いて、イソプレンの量をさらに増加させることができる。表１および２ならびに実験条件に記載のベクターは、以下および実施例の節でさらに詳細に記載されている。

【表1】

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【表2】

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【0063】

さらに、異種イソプレンシンターゼ核酸を含有する細胞によるイソプレン産出を、細胞によって発現される１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチドおよび／またはイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドの量を増加させることによって増強することができる。例えば、ＤＸＳ核酸および／またはＩＤＩ核酸を細胞に導入することができる。ＤＸＳ核酸は、異種核酸または内在性核酸の重複コピーであり得る。同様に、ＩＤＩ核酸は、異種核酸またはの内在性核酸の重複コピーであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＸＳおよび／またはＩＤＩポリペプチドの量を、内在性ＤＸＳおよび／またはＩＤＩのプロモーターまたは調節領域をＤＸＳおよび／またはＩＤＩ核酸のより多くの転写をもたらす他のプロモーターおよび／または調節領域と置き換えることによって増加させる。いくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、植物イソプレンシンターゼ核酸）をコードする異種核酸とイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸の重複コピーの両方を含有する。

【0064】

コードされたＤＸＳおよびＩＤＩポリペプチドは、イソプレンの生合成のためのＤＸＰ経路の一部である（図１９Ａ）。ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、ＤＸＳポリペプチドの量を増加させると、ＤＸＰ経路を通る炭素の流れが増加して、より多くのイソプレン産出が生じると考えられている。ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、細胞内のＩＤＩポリペプチドの量を増加させると、ＤＭＡＰＰ（これはイソプレンに変換される）に変換されるＩＰＰの量（および変換速度）が増加すると考えられている。

【0065】

例えば、クズイソプレンシンターゼ、S.セレビシエＩＤＩ、および大腸菌ＤＸＳ核酸を有する大腸菌細胞の発酵を用いて、イソプレンを産出させた。イソプレンのレベルは、１５時間の間に５０から３００μｇ／Ｌの間で変動した（実施例７、第ＶＩＩ部）。

【0066】

いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＳ核酸の存在のために、これらの異種のまたは余分な内在性核酸のうちの１つだけまたは２つを有する対応する細胞と比べて、細胞がより繁殖して増殖するかまたはより長く生存し続ける。例えば、異種イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＳ核酸を含有する細胞は、異種イソプレンシンターゼとＤＸＳ核酸のみを有するかまたは異種イソプレンシンターゼ核酸のみを有する細胞よりも良好に増殖した。また、異種イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＳ核酸を、大腸菌細胞により維持される高コピープラスミド上の強力なプロモーターに機能的に連結することができたが、これは、細胞に対して過剰量の毒性を引き起こすことなく、大量のこれらのポリペプチドを細胞内で発現し得ることを示唆する。特定の理論に束縛されるつもりはないが、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼおよびＩＤＩ核酸の存在によって、それがなければ、異種のまたは余分な内在性ＤＸＳ核酸のみが細胞内に存在する場合に蓄積するであろう１以上の潜在的な毒性中間体の量を減らし得ると考えられている。

【0067】

いくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸を含有する細胞によるイソプレンの産出を、細胞によって発現されるＭＶＡポリペプチドの量を増加させることによって強化する（図１９Ａおよび１９Ｂ）。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、以下のポリペプチドのいずれかが挙げられる：アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）。例えば、１以上のＭＶＡ経路核酸を細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ核酸を含む上流ＭＶＡ経路を含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、およびＩＤＩ核酸を含む下流ＭＶＡ経路を含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、およびＩＤＩ核酸を含む全ＭＶＡ経路を含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＭＶＫ、ＰＭＤＣ、ＩＰＫ、およびＩＤＩ核酸を含む全ＭＶＡ経路を含有する。ＭＶＡ経路核酸は、異種核酸または内在性核酸の重複コピーのであり得る。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの量を、ＭＶＡ経路核酸の内在性プロモーターまたは調節領域をＭＶＡ経路核酸のより多くの転写をもたらす他のプロモーターおよび／または調節領域と置き換えることによって増加させる。いくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、植物イソプレンシンターゼ核酸）をコードする異種核酸とイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸の重複コピーの両方を含有する。

【0068】

例えば、クズイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸と、サッカロマイセス・セレビシエのＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、およびＩＤＩポリペプチドをコードする核酸とを含有する大腸菌細胞は、６．６７×１０^−４ｍｏｌ／Ｌ_液体培地／ＯＤ_６００／時間の速度でイソプレンを生成させた（実施例８参照）。さらに、エンテロコックス・フェカーリスのＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードする核酸を有する大腸菌細胞の１４リットル発酵は、２２グラムのメバロン酸（ＭＶＡ経路の中間物）を産出した。これらの細胞の振盪フラスコは、１リットル当たり２〜４グラムのメバロン酸を産出した。これらの結果は、異種ＭＶＡ経路核酸が大腸菌において活性があることを示している。上流ＭＶＡ経路と下流ＭＶＡ経路の両方およびクズイソプレンシンターゼの核酸を含有する大腸菌細胞（ＭＣＭ１２７株）は、下流ＭＶＡ経路のみとクズイソプレンシンターゼの核酸を有する大腸菌細胞（ＭＣＭ１３１株）と比べて有意により多いイソプレン（８７４μｇ／Ｌ）を産出した（表３および実施例８、第ＶＩＩＩ部を参照されたい）。

【0069】

いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくとも約５、１０、２０、５０、７５、１００、２００、３００回、またはそれより多くの細胞分裂の間、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路核酸を維持する。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種または重複コピーの内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路核酸を含む核酸はまた、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール抗生物質耐性核酸などの選択マーカーを含む。

【0070】

実施例７、第ＶＩ部に示すように、産出されるイソプレンの量を、酵母抽出物を細胞培養培地に添加することによってさらに増加させることができる。この実施例では、産出されたイソプレンの量は、試験された濃度について細胞培地中の酵母抽出物の量に直線的に比例した（図４８Ｃ）。さらに、液体培地１リットル当たり約０．１１グラムのイソプレンが、酵母抽出物とグルコースを含む細胞培地から産出された（実施例７、第ＶＩＩＩ部）。これらの実験は両方とも、イソプレンをさせるために、クズイソプレンシンターゼ、S.セレビシエＩＤＩ、および大腸菌ＤＸＳ核酸を有する大腸菌細胞を用いた。グルコースの存在下で酵母抽出物の量を増加させると、酵母抽出物の存在下でグルコースの量を増加させるよりもより多くのイソプレンが産出された。また、酵母抽出物の量を増加させることで、細胞により長い間にわたって高レベルのイソプレンを産出させることが可能になり、細胞の健康が改善された。

【0071】

イソプレン産出はまた、３種類の加水分解されたバイオマス（バガス、コーンストーバー、および針葉樹パルプ）を炭素源として用いて示された（図４６Ａ〜Ｃ）。クズイソプレンシンターゼ、S.セレビシエＩＤＩ、および大腸菌ＤＸＳ核酸を有する大腸菌細胞は、等量のグルコース（例えば、１％グルコース、ｗ／ｖ）からと同じだけのこれらの加水分解されたバイオマス炭素源からのイソプレンを産出した。所望により、任意の他のバイオマス炭素源を本発明の組成物および方法で用いることができる。多くの従来の細胞培地よりも安価であり、それによりイソプレンの経済的な生産が促進されるので、バイオマス炭素源が望ましい。

【0072】

さらに、転化糖は、イソプレンを生成させるための炭素源として機能することが示された（図４７Ｃおよび９６〜９８）。例えば、２．４ｇ／Ｌのイソプレンが、ＭＶＡ経路ポリペプチドとクズイソプレンシンターゼを発現する細胞から産出された（実施例８、第ＸＶ部）。グリセロールも、クズイソプレンシンターゼを発現する細胞から２．２ｍｇ／Ｌのイソプレンの生成させるための炭素源として用いられた（実施例８、第ＸＩＶ部）。イソプレンシンターゼ核酸に加えて、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、および／または１以上のＭＶＡ経路核酸（例えば、全ＭＶＡ経路をコードする核酸）を発現させると、グリセロールからのイソプレンの産出が増加し得る。

【0073】

いくつかの実施形態では、油を細胞培地に含める。例えば、クズイソプレンシンターゼ核酸を含有する枯草菌細胞は、油とグルコース源とを含有する細胞培地で培養した場合、イソプレンを産出した（実施例４、第ＩＩＩ部）。いくつかの実施形態では、２種以上の油（例えば、２、３、４、５種またはそれより多くの油）を細胞培地に含める。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、（ｉ）油がイソプレンへの変換に利用可能な細胞内の炭素量を増加させ得る、（ｉｉ）油が細胞内のアセチル−ＣｏＡの量を増加させ、それによりＭＶＡ経路を通る炭素の流れを増加させ得る、および／または（ｉｉ）油が細胞に余分な栄養を提供し得る（これは、細胞内の炭素の多くが他の産物ではなくイソプレンに変換されるので望ましい）と考えられている。いくつかの実施形態では、油を含有する細胞培地中で培養される細胞は、自然にＭＶＡ経路を用いてイソプレンを産出するかまたは全ＭＶＡ経路の核酸を含有するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、油は部分的または完全に加水分解された後、宿主細胞による油の使用を促進するために細胞培養培地に添加される。

【0074】

細胞（例えば、細菌）内でイソプレンなどの小分子を商業的に産出させる上での大きな障害の１つは、分子の産出と細胞の増殖とを脱共役させることである。商業的に実現可能なイソプレン産出のためのいくつかの実施形態では、原料由来炭素の相当な量が、細胞の増殖や維持にではなく、イソプレンに変換される（「炭素効率」）。様々な実施形態では、細胞は、細胞培養培地中の炭素の０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、もしくは８．０％よりも多くまたは約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、もしくは８．０％をイソプレンに変換する。特定の実施形態では、下流産物に変換される原料由来炭素の相当な部分が、イソプレンに変換される。実施例１１でさらに記載するように、ＭＶＡ経路とクズイソプレンシンターゼ核酸を発現する大腸菌細胞は、イソプレンまたは中間体メバロン酸の産出と増殖とを脱共役させ、高い炭素効率を得ていることが示された。特に、メバロン酸は、エンテロコックス・フェカーリス由来の上流ＭＶＡ経路を発現する細胞から形成された。イソプレンは、エンテロコックス・フェカーリス由来の上流ＭＶＡ経路、サッカロマイセス・セレビシエ由来の下流ＭＶＡ経路、およびタイワンクズ（クズ）由来のイソプレンシンターゼを発現する細胞から形成された。このイソプレンまたはメバロン酸産出と増殖の脱共役は、４つの異なる大腸菌株：ＢＬ２１（ＬＤＥ３）、ＢＬ２１（ＬＤＥ３）Ｔｕｎｅｒ、ＦＭ５、およびＭＧ１６５５で示された。最初の２つの大腸菌株はＢ株であり、後者２つは、Ｋ１２株である。産出と増殖の脱共役は、ａｃｋ遺伝子とｐｔａ遺伝子が欠失している変異体ＭＧ１６５５でも示された。この変異体は、より少ない酢酸の産出も示した。

【0075】

例示的なポリペプチドおよび核酸
様々なイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドおよび核酸を本発明の組成物および方法で用いることができる。

【0076】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、第１のポリペプチド（例えば、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドまたはそれらの触媒活性断片）の一部または全てを含み、第２のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドの精製または検出を容易にするペプチド、例えば、Ｈｉｓタグ）の一部または全てを任意で含み得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、２以上のＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチド）の活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有する天然のポリペプチド（例えば、エンテロコックス・フェカーリスｍｖａＥ核酸によってコードされるポリペプチド）である。

【0077】

様々な実施形態では、ポリペプチドは、少なくともまたは約５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００個、またはそれより多くのアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片は、全長ポリペプチド由来の少なくともまたは約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００個、またはそれより多くの連続するアミノ酸を含有し、かつ対応する全長ポリペプチドの活性の少なくともまたは約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を有する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、任意の天然のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドのアミノ酸配列の部分またはアミノ酸配列全体を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型（すなわち、天然に生じる配列）のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドの配列と比べて、１以上の突然変異有する。

【0078】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは単離されたポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは異種ポリペプチドである。

【0079】

いくつかの実施形態では、核酸は組換え核酸である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、組換え核酸が、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドを含む融合ポリペプチドおよび別のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドの精製または検出を容易にするペプチド、例えば、Ｈｉｓタグ）の全てまたは一部をコードするように、別のポリペプチドの全てまたは一部をコードする別の核酸に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、組換え核酸の一部または全てを化学合成する。

【0080】

いくつかの実施形態では、核酸は異種核酸である。特定の実施形態では、核酸は、任意の天然のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の核酸配列の部分または核酸配列全体を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然のイソプレンシンターゼ核酸ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸由来の少なくともまたは約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００個、またはそれより多くの連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、野生型（すなわち、天然に生じる配列）イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の配列と比べて、１以上の突然変異を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、または転写因子核酸の転写または翻訳を増加させる１以上の突然変異（例えば、サイレント突然変異）を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドをコードする任意の核酸の縮重変異体である。

【0081】

例示的なイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路のポリペプチドと核酸のアクセッション番号を別表１に掲載する（別表１のアクセッション番号およびその対応する配列は、特に、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドと核酸のアミノ酸配列と核酸配列に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｋｅｇｇデータベースもまた、多数の例示的なイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路のポリペプチドと核酸のアミノ酸配列と核酸配列を含有する（例えば、“ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ／ｍａｐ／ｍａｐ００１００．ｈｔｍｌ”のワールド・ワイド・ウェブ、およびその中の配列を参照されたく、これらは各々、特に、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路のポリペプチドと核酸のアミノ酸配列と核酸配列に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドおよび／または核酸の１つ以上は、２００７年１２月１２日または２００８年９月１４日に公的に入手可能になった配列と同一の配列（例えば、配列のいずれかが、別表１のアクセッション番号のいずれか、またはＫｅｇｇデータベース中に存在する配列のいずれかに対応する）を有する。さらなる例示的なイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路のポリペプチドと核酸が以下でさらに記載されている。

【0082】

例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドおよび核酸
上述のように、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドには、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが含まれる。標準的な方法を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボでＤＭＡＰＰをイソプレンに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。例示的なアッセイでは、細胞抽出物を、実施例１に記載されるような振盪フラスコ法で株（例えば、上記の大腸菌／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ株）を増殖させることにより調製する。誘導が終わった後、約１０ｍＬの細胞を７０００×ｇで１０分間の遠心分離でペレット化し、グリセロールを含まない５ｍｌのＰＥＢに再懸濁する。標準的な手順を用いて、フレンチプレス細胞破砕機（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を用いて、細胞を溶解する。あるいは、−８０℃で凍結／融解した後、細胞をリゾチーム（Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液；ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）で処理する。

【0083】

細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０−１３０１６，１９９５およびその中の参考文献（これらは各々、特に、イソプレンシンターゼポリペプチド活性のアッセイに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように測定することができる。ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）を窒素流下で蒸発乾固させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．２中１００ｍＭの濃度になるように再水和させ、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、５μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍｌ）のＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出物緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％グリセロール、および２ｍＭ ＤＴＴ）の溶液を、金属スクリューキャップとテフロンコーティングされたシリコンセプタムが付いた２０ｍｌヘッドスペースバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の２５μＬの細胞抽出物に添加し、振盪させながら３７℃で１５分間培養する。２００μＬの２５０ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応をクエンチし、実施例１、第ＩＩ部に記載されるようにＧＣ／ＭＳで定量する。

【0084】

例示的なイソプレンシンターゼ核酸としては、イソプレンシンターゼポリペプチド核酸の少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。

【0085】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、マメ科（例えば、マメ亜科）に由来するものである。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、タイワンクズ（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３７：７００−７１２，２００５）、クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシ、ブラックコットンウッド、もしくはウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ（ＣＡＣ３５６９６） Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ２１３：４８３−４８７，２００１）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ） Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７０（２２）：１３０１０−１３１６，１９９５）、またはヨーロッパナラ（ヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｒｏｂｕｒ））（Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／０２５５０号）（これらは各々、特に、イソプレンシンターゼ核酸と、イソプレンシンターゼポリペプチドの発現とに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に由来するポリペプチドまたは核酸である。好適なイソプレンシンターゼとしては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、およびＡＹ１８２２４１（これらは各々、特に、イソプレンシンターゼ核酸およびポリペプチドの配列に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により特定されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、ヨーロッパナラ由来の天然のポリペプチドまたは核酸ではない（すなわち、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、ヨーロッパナラ由来の天然のポリペプチドまたは核酸以外のイソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸である）。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、ポプラ由来の天然のポリペプチドまたは核酸である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、ポプラ由来の天然のポリペプチドまたは核酸ではない。

【0086】

例示的なＤＸＳポリペプチドおよび核酸
上述のように、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチドは、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する。例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。例示的なＤＸＳ核酸としては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＤＸＳポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。

【0087】

例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼまたはＩＤＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換するおよび／またはＤＭＡＰＰをＩＰＰに変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、ＩＰＰとＤＭＡＰＰを相互変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。例示的なＩＤＩ核酸としては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。

【0088】

例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸
例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチドおよび２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＭＶＡ経路核酸としては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。

【0089】

特に、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼポリペプチド（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼまたはＡＡＣＴ）は、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＡＡ−ＣｏＡチオラーゼポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。

【0090】

３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼまたはＨＭＧＳ）ポリペプチドは、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。

【0091】

３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼまたはＨＭＧＲ）ポリペプチドは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。

【0092】

メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチドはメバロン酸をリン酸化して、メバロン酸−５−リン酸を形成させる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、メバロン酸をメバロン酸−５−リン酸に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＭＶＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。

【0093】

ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチドはメバロン酸−５−リン酸をリン酸化して、メバロン酸−５−二リン酸を形成させる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、メバロン酸−５−リン酸をメバロン酸−５−二リン酸に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＰＭＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。

【0094】

ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤまたはＤＰＭＤＣ）ポリペプチドは、メバロン酸−５−二リン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、メバロン酸−５−二リン酸をＩＰＰに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＭＶＤポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。

【0095】

ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチドは、メバロン酸−５−リン酸をイソペンテニルリン酸（ＩＰ）に変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、メバロン酸−５−リン酸 をＩＰに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＰＭＤＣポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。

【0096】

イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチドはイソペンテニルリン酸（ＩＰ）をリン酸化して、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を形成させる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、ＩＰをＩＰＰに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＩＰＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。

【0097】

例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸は上に記載されている。

【0098】

例示的なヒドロゲナーゼポリペプチドおよび核酸
ヒドロゲナーゼポリペプチドは、次の反応を触媒する：２Ｈ^＋＋２ｅ⁻←→Ｈ_２。インビトロでは、その反応は可逆的であるが、ある種のヒドロゲナーゼは、インビボでは、Ｈ_２を酸化するかまたはＨ^＋を還元するかのいずれかの、一方向でしか働かない場合がある。ヒドロゲナーゼポリペプチドは酸素感受性で、その触媒中心の一部として錯体金属補因子を含有することがあり、時には複数のサブユニットからなることもあり、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現には、「成熟」因子または転写調節因子（すなわち、活性化因子または抑制因子）などのさらなるアクセサリーポリペプチドが必要になることもある。ヒドロゲナーゼは、その触媒中心の金属補因子の種類に基づいて大きく少なくとも３つのグループに分類される。すなわち、（１）ニッケル−鉄（「ＮｉＦｅ」）ヒドロゲナーゼは、ニッケル／鉄補因子を有し、（２）鉄−鉄ヒドロゲナーゼ（「ＦｅＦｅ」）は、鉄／鉄補因子を有し、（３）鉄／非硫黄含有（「Ｆｅ」）ヒドロゲナーゼ（これは、グループ（１）と（２）に見られる４Ｆｅ４Ｓクラスターを欠く）は、鉄補因子とメテニル−テトラヒドロメタノプテリン電子担体とを有する。例えば、Ｃｈｕｎｇ−Ｊｕｎｇ Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ，” Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．１０：３９４−４０４（２００８）、およびＧｏｎｕｌ Ｖａｒｄａｒ−Ｓｃｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｖｉａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，” Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１（２）：１０７−１２５（２００８）を参照されたく、これらは両方とも、特に、様々な種類およびクラスのヒドロゲナーゼに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。多くの生物は複数のヒドロゲナーゼを含有しているが、ＮｉＦｅヒドロゲナーゼとＦｅＦｅヒドロゲナーゼの両方の遺伝子を含有するものはわずかである。

【0099】

ＮｉＦｅヒドロゲナーゼの触媒中心はニッケル原子と鉄原子からなり、各々、２つの一酸化炭素（ＣＯ）配位子と２つのシアン化物（ＣＮ⁻）配位子を有する。ＮｉＦｅヒドロゲナーゼは全て、触媒中心の内外に電子を伝達するための複数の鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）中心を含有する少なくとも第２のサブユニットを含む。ＮｉＦｅヒドロゲナーゼは、４つの主なクラスにさらに分けることができる：（１）呼吸酵素。これは、Ｈ_２の酸化を、嫌気性条件下での最終電子受容体（例えば、ＳＯ_４^２−もしくはＮＯ_３⁻）の還元、または好気性微生物でのＯ_２と共役させる多酵素系の一部である；（２）Ｈ_２センサー。これは、代謝活性のあるＮｉＦｅヒドロゲナーゼの発現を活性化させる；（３）ＮＡＤＰ^＋を利用することができる多サブユニットを含有する細胞質ヒドロゲナーゼ。これは、インビトロでは容易に可逆性となるが、インビボではＨ_２の酸化しかしない場合がある；および（４）細菌や古細菌でも見出されている膜結合型のエネルギー変換多酵素複合体。Ｃｈｕｎｇ−Ｊｕｎｇ Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ，” Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．１０：３９４−４０４（２００８）。

【0100】

ＦｅＦｅヒドロゲナーゼの触媒中心は、単一のタンパク質（システイン）配位子によって［４Ｆｅ−４Ｓ］中心に架橋した二核（ＦｅＦｅ）部位を配位する触媒「Ｈクラスター」を含有する。二核中心の２つの鉄原子は各々、２つの一酸化炭素（ＣＯ）配位子と２つのシアン化物（ＣＮ⁻）配位子を有し、小有機分子の一部となる２つの硫黄原子によっても架橋される。大部分のＦｅＦｅヒドロゲナーゼは、約５０キロダルトン（ｋＤａ）の単量体酵素であり、インビボでは主に、プロトンを水素ガスに還元することによって余剰の還元当量を廃棄するように働くように思われる。Ｃｈｕｎｇ−Ｊｕｎｇ Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ，” Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．１０：３９４−４０４（２００８）。

【0101】

Ｆｅヒドロゲナーゼの触媒中心は、当初、有機補因子を基礎にした活性部位を有し、金属は含まないと考えられたが、後に単核Ｆｅ原子を含有することが示された。３種類のヒドロゲナーゼには系統発生上の違いがあるものの、少なくとも１つの鉄原子の他に、３種類のヒドロゲナーゼは全て、その活性部位に鉄原子に対する少なくとも１つの一酸化炭素（ＣＯ）配位子を含有し、この配位子によって、Ｈ_２の触媒による酸化やプロトンの還元が促進される。Ｃｈｕｎｇ−Ｊｕｎｇ Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ，” Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．１０：３９４−４０４（２００８）。

【0102】

例示的なヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、限定するものではないが、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（Ｈｙｄ−１）ポリペプチド、大腸菌ヒドロゲナーゼ−２（Ｈｙｄ−２）ポリペプチド、大腸菌ヒドロゲナーゼ−３（Ｈｙｄ−３）ポリペプチド、大腸菌ヒドロゲナーゼ−４（Ｈｙｄ−４）ポリペプチド、大腸菌ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体（これは、酸性ｐＨ、嫌気性条件下で、ギ酸とＣＯ_２から水素ガスを産出させる（例えば、Ａｋｉｈｉｔｏ Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｍａｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｌｙａｓｅ ｏｆ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ ｇｒｏｗｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ａ ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，” Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：７５４−７６０（２００７）を参照されたく、これは、特に、大腸菌におけるギ酸水素リアーゼの発現の誘導に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｈ１６ヒドロゲナーゼ（Ｒ．ユートロファＨｏｘＨ）、ロドコックス・オパクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＭＲ１１ヒドロゲナーゼ（Ｒ．オパクスＨｏｘＨ）ポリペプチド、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ ６８０３ヒドロゲナーゼ（Ｓｙｎ．ＰＣＣ ６８０３ ＨｏｘＨ）ポリペプチド、デスルフォビブリオ・ギガス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｇｉｇａｓ）ヒドロゲナーゼ（Ｄ．ギガス）ポリペプチド、およびデスルホビブリオ・デスルフリカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ ７７５７ヒドロゲナーゼ（Ｄ．デスルフリカンス）ポリペプチド（例えば、Ｇｏｎｕｌ Ｖａｒｄａｒ−Ｓｃｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｖｉａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，” Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１（２）：１０７−１２５（２００８）を参照されたく、これは、特に、様々な種類およびクラスのヒドロゲナーゼに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ならびに２以上のヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、ヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なヒドロゲナーゼ核酸としては、ヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性、またはヒドロゲナーゼポリペプチドの発現、プロセッシング、もしくは成熟に必要な少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なヒドロゲナーゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。

【0103】

嫌気性ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体の一部である、大腸菌Ｈｙｄ−３は、（ｈｙｃＡ、ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦ、ｈｙｃＧ、ｈｙｃＨ、およびｈｙｃＩ遺伝子を含む）ｈｙｃオペロンによってコードされている。大腸菌Ｈｙｄ−４は、（ｈｙｆＡ、ｈｙｆＢ、ｈｙｆＣ、ｈｙｆＤ、ｈｙｆＥ、ｈｙｆＦ、ｈｙｆＧ、ｈｙｆＨ、ｈｙｆＩ、ｈｙｆＪ、およびｈｙｆＲ遺伝子を含む）ｈｙｆオペロンによってコードされている。大腸菌ＦＨＬは、ｈｙｃオペロン由来の６つの遺伝子（ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦおよびｈｙｃＧ）と、（ギ酸デヒドロゲナーゼＨ（Ｆｄｈ−Ｈ）をコードする）ｆｄｈＦ遺伝子とによってコードされている。ＦＨＬ複合体の発現はさらに、ｆｄｈＦおよびｈｙｃオペロンの転写を活性化する転写因子であるピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）のＦｈｌＡの発現、またはＦＨＬの転写を負に調節するｈｙｃＡ遺伝子によってコードされる転写因子であるＨｙｃＡの欠失／不活化を必要とすることがある。イソプレンと水素の同時生成は、ヒドロゲナーゼおよび例えば、鉄−硫黄錯体転写調節因子（ｉｓｃＲ）（Ｋａｌｉｍ−Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃＲ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｆｅ／Ｆｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｈ_２−ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３），” Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８：８５３−８６２（２００８）、これは、特に、ｉｓｃＲ遺伝子を欠失させることによるクロストリジウムのＦｅ／Ｆｅヒドロゲナーゼ活性の刺激および大腸菌における水素蓄積に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの他の酵素の遺伝子発現の調節に関与するさらなるタンパク質の発現または不活化／欠失によって改善することができる。

【0104】

例示的なフェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、限定するものではないが、クロストリジウム・アセトブツリクムヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）（例えば、Ｐ．Ｗ．Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ［ＦｅＦｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８（６）：１６３−１７２（２００６）を参照されたく、これは、特に、ＨｙｄＡと３つのＨｙｄＡ関連成熟酵素（ＨｙｄＥ、ＨｙｄＧおよびＨｙｄＦ）（これらは、単独でまたは以下のうちの１つまたは複数とともに発現させてもよい：（１）枯草菌ＮＡＤＰＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＮＦＯＲ）（例えば、Ｖｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２００８））を参照されたく、これは、特に、ＮＦＯＲによる水素の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる；また、ＰＣＴ刊行物ＷＯ／２００７／０８９９０１号を参照されたく、これは、特に、水素を産出するための大腸菌株の最適化に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、クロストリジウム・クルイベリＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＲｎｆＣＤＧＥＡＢ）（Ｈｅｎｎｉｎｇ Ｓｅｅｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ， ａ ｓｔｒｉｃｔ ａｎａｅｒｏｂｅ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ，” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（６）：２１２８−２１３３（２００８）、これは、特に、ＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼに関して、および嫌気的エタノール−酢酸発酵経路の構成要素に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、もしくはクロストリジウム・パスツラニヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒａｎｉｕｍ）フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｆｄｘ）；（２）グリセルアルデヒド−６−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（「ＧＡＰＯＲ」）；または（３）ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（「ＰＯＲ」））による水素の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、および２以上のヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を有するかまたは１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドの活性と１以上のフェレドキシン依存的オキシドレダクターゼの活性とを有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。

【0105】

例示的なＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、限定するものではないが、ピロコックス・フリオススヒドロゲナーゼ（例えば、Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ，” Ｎａｔｕｒｅ ４０５（６７９０）：１０１４−１０１５（２０００）を参照されたい）などの好熱性ヒドロゲナーゼポリペプチド、および２以上のＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。

【0106】

例示的な酸素耐性または酸素非感受性ヒドロゲナーゼとしては、限定するものではないが、ルブリビバクス・ゲラチノーススヒドロゲナーゼ（例えば、Ｐ．Ｃ．Ｍａｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｘｙｇｅｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ，” Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８（６）：２６３３−２６３６（２００２）を参照されたく、これは、特に、Ｒ．ゲラチノーススヒドロゲナーゼに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、およびラルストニア・ユートロファヒドロゲナーゼポリペプチド（例えば、Ｔ．Ｂｕｒｇｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，“［ＮｉＦｅ］−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｏｆ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６：ｍｏｄｕｌａｒ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｏｘｙｇｅｎ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（２−４）：１８１−１９６（２００５）を参照されたく、これは、特に、Ｒ．ユートロファヒドロゲナーゼポリペプチドに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。あるいは、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を、標準的な方法およびアッセイを用いて突然変異させ、Ｏ_２耐性またはＯ_２非感受性についてスクリーニングすることができる（例えば、Ｌ．Ｅ．Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ［ＦｅＦｅ］−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｓ．２９（３）４２１−４３０（２００７）を参照されたく、これは、特に、酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドの突然変異導入およびスクリーニングに関して、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0107】

標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、水素ガスを産出するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがヒドロゲナーゼ活性を有するかどうかを決定することができる。

【0108】

発酵副産物の産出に関する遺伝子の例示的なポリペプチドおよび核酸
大腸菌における異種または固有のなヒドロゲナーゼの発現または過剰発現の他に、イソプレンと水素の同時生成を、嫌気性生合成経路を不活化し、それにより、限定するものではないが、乳酸、酢酸、ピルビン酸、エタノール、コハク酸、およびグリセロールをはじめとする、酸素制限条件または嫌気性条件の下で産出される種々の代謝産物（すなわち、発酵副産物）への炭素の流れを遮断することによって改善することができる。発酵副産物の産出に関与する例示的なポリペプチドとしては、ギ酸デヒドロゲナーゼＮ、αサブユニット（ｆｄｎＧ）、ギ酸デヒドロゲナーゼＯ、大サブユニット（ｆｄｏＧ）、硝酸レダクターゼ（ｎａｒＧ）、ギ酸輸送体Ａ（ｆｏｃＡ）、ギ酸輸送体Ｂ（ｆｏｃＢ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分ａｃｋＡ／ｐｔａ（ａｃｅＥ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、フマル酸レダクターゼ膜タンパク質（ｆｒｄＣ）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）が挙げられる。例えば、Ｔｏｓｈｉｎｏｒｉ Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，” Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（４）：８７９−８９０（２００７）を参照されたく、これは、特に、グルコース代謝が改変された大腸菌株の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。イソプレンと水素の同時生成を改善するために不活化することも可能な発酵副産物の産出に関与する遺伝子の調節または発現に関与する例示的なポリペプチドとしては、限定するものではないが、ギ酸水素リアーゼ（ｈｙｃＡ）の抑制因子、フマル酸レダクターゼ調節因子（ｆｎｒ）、アセチル−補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、およびギ酸デヒドロゲナーゼ調節タンパク質（ｈｙｃＡ）（これは、転写調節因子ｆｈｌＡ（ギ酸水素リアーゼ転写活性化因子）の発現を調節する）が挙げられる。

【0109】

水素再取込みに関連する遺伝子の例示的なポリペプチドおよび核酸
イソプレンと水素の同時生成を改善するために不活化することが同じく可能な水素再取込みに関与する例示的なポリペプチドとしては、限定するものではないが、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（Ｈｙｄ−１）（ｈｙａオペロン）および大腸菌ヒドロゲナーゼ−２（Ｈｙｄ−２）（ｈｙｂオペロン）が挙げられる。大腸菌Ｈｙｄ−１は、（ｈｙａＡ、ｈｙａＢ、ｈｙａＣ、ｈｙａＤ、ｈｙａＥ、およびｈｙａＦ遺伝子を含む）ｈｙａオペロンによってコードされている。大腸菌Ｈｙｄ−２は、（ｈｙｂＡ、ｈｙｂＢ、ｈｙｂＣ、ｈｙｂＤ、ｈｙｂＥ、ｈｙｂＦ、ｈｙｂＧ、およびｈｙｂＯ遺伝子を含む）ｈｙｂオペロンによってコードされている。

【0110】

エタノール発酵に関連する遺伝子の例示的なポリペプチドおよび核酸
エタノール発酵に関与する例示的なポリペプチドとしては、限定するものではないが、アルコールデヒドロゲナーゼＢ（ａｄｈＢ）、アルコールデヒドロゲナーゼＥ（ａｄｈＥ）およびピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）が挙げられる。

【0111】

アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）は、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元を伴って、アルコールとアルデヒドまたはケトンの相互変換を促進する。ヒトや多くの動物では、アルコールデヒドロゲナーゼは、分解されなければ毒性となる可能性があるアルコールを分解する。酵母や多くの細菌では、いくつかのアルコールデヒドロゲナーゼは、発酵の一部として逆の反応を触媒する。ヒトでは、ａｄｈは複数の形態で二量体として存在し、少なくとも７つの異なる遺伝子によってコードされている。アルコールデヒドロゲナーゼには５つのクラス（Ｉ〜Ｖ）があるが、ヒトで用いられる主な肝形態はクラスＩである。クラス１は、ＡＤＨ１Ａ、ＡＤＨ１Ｂ、およびＡＤＨ１Ｃという遺伝子によってコードされるＡ、Ｂ、およびＣサブユニットからなる。クラスＩのＡＤＨは胃の内層または肝臓に見られ、エタノールを酸化してアセトアルデヒドにする（ＣＨ_３ＣＨ_２ＯＨ＋ＮＡＤ^＋→ＣＨ_３ＣＨＯ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋）のを触媒する。これにより、アルコール飲料の消費が可能になるが、その進化上の目的は、おそらく、食物中に天然に含まれるかまたは消化管の細菌によって産出されるアルコールの分解と考えられる。

【0112】

ヒトとは異なり、酵母や細菌は、グルコースを乳酸に発酵させない。その代わりに、酵母や細菌は、グルコースをエタノールとＣＯ_２に発酵させる。酵母や多くの細菌では、アルコールデヒドロゲナーゼが発酵において重要な役割を果たしている。解糖によって生じるピルビン酸はアセトアルデヒドと二酸化炭素に変換され、次に、アセトアルデヒドは、ａｄｈＥと呼ばれるアルコールデヒドロゲナーゼによりエタノールに還元される。この後半の工程の目的は、エネルギーを発生する解糖が続けられるように、ＮＡＤ＋を再生することである。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルビン酸からカルボキシル基を除去して、アセトアルデヒドと二酸化炭素にするのを触媒するホモ四量体の酵素である。嫌気性条件下では、この酵素は、発酵によってエタノールを産出するために、特に、サッカロミセス属の酵母に存在する発酵プロセスの一部である。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、大腸菌種（例えば、大腸菌）、およびジモモナス種（例えば、Ｚ．モビリス）をはじめとする、多くの細菌にも同様に存在する。

【0113】

例示的なグリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路のポリペプチドおよび核酸
例示的なグリセロール経路ポリペプチドとしては、限定するものではないが、ＤＡＲ１（ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ）、ＧＰＰ２（グリセロール−リン酸ホスファターゼ）が挙げられる。例示的な１，３−プロパンジオール経路ポリペプチドとしては、限定するものではないが、ｄｈａＢ１〜３（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３；グリセロールデヒドラターゼＢ１、Ｂ２、およびＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ（タンパク質Ｘ）、およびｏｒｆＹ（タンパク質Ｙ）、ならびに米国特許公開第２００８／０２９３１１９ Ａ１号（これは、特に、反応速度が改善された変異体のグリセロールデヒドラターゼ変異体に関する開示に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている変異体などの、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、およびｄｈａＢ３の変異体をはじめとする、反応速度が改善されたグリセロールデヒドラターゼ変異体が挙げられる。ｄｈａレギュロンは、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの生物がグリセロールで嫌気的に増殖し、１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）を産出するのを可能にする。大腸菌はｄｈａ系を有しておらず、したがって、外因性の電子受容体がなければグリセロールで嫌気的に増殖することができず、１，３−プロパンジオールを産出しない。ｄｈａレギュロンは、少なくとも４つの遺伝子：グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）を含む。４つの活性は全て、グリセロールの存在下で誘導可能であった。

【0114】

核酸を単離するための例示的な方法
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を標準的な方法を用いて単離することができる。目的の供給源生物由来の所望の核酸（例えば、細菌ゲノム）を得る方法は、分子生物学の技術分野において一般的かつ周知である（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、目的の核酸の単離に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、核酸の配列が既知（例えば、本明細書に記載の既知の核酸のいずれか）である場合、好適なゲノムライブラリーを、制限エンドヌクレアーゼ消化によって作製し得、所望の核酸配列に相補的なプローブでスクリーニングし得る。配列が単離されれば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号、これは、特に、ＰＣＲ法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの標準的なプライマー特異的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、適当なベクターを用いた形質転換に好適な大量のＤＮＡを入手し得る。

【0115】

あるいは、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸（例えば、既知の核酸配列を有する任意のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸）を、標準的な方法を用いて化学合成することができる。

【0116】

本明細書に記載の組成物および方法で用いるのに好適であり得るさらなるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドおよび核酸を、標準的な方法を用いて同定することができる。例えば、天然にイソプレンを産出することが知られている生物の染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーを、大腸菌などの生物において構築し、その後、イソプレン産出についてスクリーニングすることができる。特に、巨大なゲノムＤＮＡ断片（３５〜４５ｋｂ）がベクターにパッケージングされていて、適当な宿主を形質転換するのに用いられるコスミドライブラリーを作製し得る。コスミドベクターは、大量のＤＮＡを収容することができる点が独特である。通常、コスミドベクターは、異種ＤＮＡのパッケージングとその後の環状化に必要な少なくとも１コピーのｃｏｓ ＤＮＡ配列を有する。ｃｏｓ配列の他に、これらのベクターは、複製起点（例えば、ＣｏｌＥＩ）や薬剤耐性マーカー（例えば、アンピシリンまたはネオマイシンに耐性のある核酸）も含有する。好適な細菌宿主の形質転換にコスミドベクターを用いる方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（これは、特に、形質転換法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に十分に記載されている。

【0117】

通常、コスミドをクローニングするためには、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて異種ＤＮＡを単離し、適当なリガーゼを用いてコスミドベクターのｃｏｓ領域の隣りに連結する。その後、線状化した異種ＤＮＡを含有するコスミドベクターを、バクテリオファージなどのＤＮＡパッケージングビヒクルと反応させる。パッケージングプロセスの間に、ｃｏｓ部位が切断され、異種ＤＮＡが細菌ウイルス粒子の頭部にパッケージングされる。その後、これらの粒子を用いて、大腸菌などの好適な宿主細胞をトランスフェクトする。細胞に注入されれば、異種ＤＮＡは、ｃｏｓ付着末端の影響を受けて環状化する。このようにして、巨大な異種ＤＮＡ断片を導入し、宿主細胞で発現させることができる。

【0118】

イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を入手するさらなる方法としては、アッセイ（例えば、本明細書に記載のヘッドスペースアッセイ）によるかまたはある長さの保存されたアミノ酸（例えば、少なくとも３つの保存されたアミノ酸）をコードするヌクレオチドに対するプライマーを用いるＰＣＲによるメタゲノムライブラリーのスクリーニングが挙げられる。保存されたアミノ酸は、既知のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすることによって同定することができる。イソプレンシンターゼポリペプチドの保存されたアミノ酸は、アラインした既知のイソプレンシンターゼポリペプチドの配列に基づいて同定することができる。天然にイソプレンを産出することが分かった生物を（当該技術分野で周知の）標準的なタンパク質精製法に供することができ、得られた精製ポリペプチドを、標準的な方法を用いてシークエンシングすることができる。他の方法が文献中に見出される（例えば、Ｊｕｌｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５：１３７７−８４，２００７；Ｗｉｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３（１９）：６２７７−８３，２００７を参照されたく、これらは各々、特に、イソプレンの合成に関与する核酸の同定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0119】

さらに、標準的な配列アラインメントおよび／または構造予測プログラムを用いて、その一次構造および／または予測されるポリペプチド二次構造と、既知のＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドおよび核酸の一次構造および／または予測されるポリペプチド二次構造との類似性に基づいて、さらなるＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドおよび核酸を同定することができる。ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ−ｔｒｅｍｂｌデータベース（“ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ”のワールド・ワイド・ウェブ，Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｇｒｏｕｐ ＣＭＵ − １ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ｓｅｒｖｅｔ ＣＨ−１２１１ Ｇｅｎｅｖａ ４，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などの標準的なデータベースを用いて、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟および／または転写調節のポリペプチドおよび核酸を同定することもできる。イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドの二次および／または三次構造を、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（６３０ Ｗｅｓｔ，１６８ Ｓｔｒｅｅｔ，ＢＢ２１７，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００３２，ＵＳＡ）などの、標準的な構造予測プログラムのデフォルト設定を用いて予測することができる。あるいは、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドの実際の二次および／または三次構造を、標準的な方法を用いて決定することができる。さらなるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を、既知のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸から作製したプローブに対するハイブリダイゼーションによって同定することもできる。

【0120】

例示的なプロモーターおよびベクター
本明細書に記載のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸のいずれかを１以上のベクターに含めることができる。したがって、本発明はまた、本明細書に記載のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドのいずれかをコードする１以上の核酸を含むベクターを特徴とする。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現制御配列の制御下にある核酸を含有する。

【0121】

いくつかの実施形態では、ベクターは、選択マーカーまたは選択可能マーカーを含有する。トリコデルマの形質転換用のベクター系で有用なマーカーが当該技術分野で知られている（例えば、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ 第６章，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，編．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，第６章，１９９２；およびＫｉｎｇｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９２を参照されたく、これらは各々、特に、選択マーカーに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、ａｍｄＳ核酸であり、これは、酵素アセトアミダーゼをコードし、形質転換細胞が窒素源としてのアセトアミドで増殖するをの可能にする。選択マーカーとしてのＡ．ニヅランスａｍｄＳ核酸の使用がＫｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５−４７９，１９８５およびＰｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６１：１５５−１６４，１９８７に記載されている（これらは各々、特に、選択マーカーに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟、または転写調節の核酸は、選択マーカーを伴わずに細胞の染色体に組み込まれる。

【0122】

好適なベクターは、使用される宿主細胞と適合するベクターである。好適なベクターを、例えば、細菌、ウイルス（例えば、バクテリオファージＴ７またはＭ−１３由来のファージ）、コスミド、酵母、または植物から得ることができる。このようなベクターを入手および使用するためのプロトコルは、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照されたく、これは、特に、ベクターの使用に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0123】

プロモーターは当該技術分野で周知である。宿主細胞において機能するプロモーターはいずれも、宿主細胞におけるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の発現に用いることができる。様々な宿主細胞においてイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の発現を促進するために有用な開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、当業者によく知られている（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、目的の核酸を発現させるためのベクターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの核酸を促進することができるほとんど全てのプロモーターが本発明のために好適であり、これらには、限定するものではないが、（サッカロミセスでの発現に有用な）ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、およびＴＰＩ；（ピキアでの発現に有用な）ＡＯＸ１；ならびに（大腸菌での発現に有用な）ｌａｃ、ｔｒｐ、λＰ_Ｌ、λＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃが含まれる。

【0124】

いくつかの実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモーターを使用する（例えば、米国特許第７，１３２，５２７号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、目的のポリペプチドを発現させるためのプロモーターおよびプラスミド系に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。報告されているグルコースイソメラーゼプロモーター突然変異体を用いて、グルコースイソメラーゼプロモーターに機能的に連結された核酸によってコードされるポリペプチドの発現のレベルを変化させることができる（米国特許第７，１３２，５２７号）。様々な実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモーターは、低、中、または高コピーのプラスミドの含まれている（米国特許第７，１３２，５２７号）。

【0125】

様々な実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、低コピープラスミド（例えば、細胞当たり約１〜約４コピーで維持されるプラスミド）、中コピープラスミド（例えば、細胞当たり約１０〜約１５コピーで維持されるプラスミド）、または高コピープラスミド（例えば、細胞当たり約５０コピー以上で維持されるプラスミド）に含まれている。いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｔ７プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターに機能的に連結された異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、中または高コピープラスミドに含まれている、いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｔｒｃプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｔｒｃプロモーターに機能的に連結された異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、中または高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｌａｃプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｌａｃプロモーターに機能的に連結された異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、低コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、内在性エシェリキア、パントエア、バシルス、ヤロウイア、ストレプトミセス、またはトリコデルマプロモーターまたは内在性アルカリ性セリンプロテアーゼ、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のプロモーターなどの、内在性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、内在性プロモーターに機能的に連結された異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞内で染色体に組み込まれない複製プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターの一部または全てが細胞内で染色体に組み込まれる。

【0126】

いくつかの実施形態では、ベクターは、真菌宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞ゲノムに組み込まれて、複製する任意のベクターである。ベクターのリストについては、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ（ＦＧＳＣ、“ｆｇｓｃ．ｎｅｔ”のワールド・ワイド・ウェブおよびその中に引用された参考文献、これらは各々、特に、ベクターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。好適な発現ベクターおよび／または組込みベクターのさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編） １９８７，補遺３０巻，第７．７．１８節）；Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｌａｓｕｒｅ（編） Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３９６−４２８，１９９１のｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．；および米国特許第５，８７４，２７６号（これらは各々、特に、ベクターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。特に有用なベクターとしては、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００、およびｐＥＮＴＲ／Ｄが挙げられる。

【0127】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、真菌宿主細胞で転写活性を示す好適なプロモーターに機能的に連結されている。プロモーターは、宿主細胞にとって内在性または異種のいずれかのポリペプチドをコードする１以上の核酸に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、トリコデルマ宿主において有用である。プロモーターの好適な非限定例としては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｐｅｐＡ、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、およびａｍｙが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとって固有ななプロモーターである。例えば、Ｔ．リーゼイが宿主であるいくつかの実施形態では、プロモーターは、固有のＴ．リーゼイプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ．リーゼイのｃｂｈ１であるが、これは、誘導性プロモーターであり、アクセッション番号Ｄ８６２３５（これは、特に、プロモーターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の下でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、真菌宿主細胞にとって異種のプロモーターである。有用なプロモーターの他の例としては、Ａ．アワモリおよびＡ．ニゲルのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５，１９８４およびＢｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：１５８１−１５８５，１９８４（これらは各々、特に、プロモーターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のαアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、Ｔ．リーゼイのｘｌｎ１、およびＴ．リーゼイのセロビオヒドラーゼ１（欧州特許第１３７２８０号（これは、特に、プロモーターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。

【0128】

いくつかの実施形態では、発現ベクターには終結配列も含まれる。終結制御領域はまた、宿主細胞に固有な様々な遺伝子に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、終結配列およびプロモーター配列は同じ源に由来するものである。別の実施形態では、終結配列は宿主細胞にとって内在性である。特に好適なターミネーター配列は、トリコデルマ株（例えば、Ｔ．リーゼイ）に由来するｃｂｈ１である。他の有用な真菌ターミネーターとしては、。Ａ．ニゲルまたはＡ．アワモリのグルコアミラーゼ核酸（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５，１９８４およびＢｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：１５８１−１５８５，１９８４；これらは各々、特に、真菌ターミネーターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に由来するターミネーターが挙げられる。場合により、終結部位を含めてもよい。ポリペプチドの効率的な発現のために、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現によって適切なメッセンジャーＲＮＡが形成されるように、開始コドンを介して選択された発現制御領域に機能的に連結されている。

【0129】

いくつかの実施形態では、プロモーター、コード領域およびターミネーターが全て、発現されるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸に由来する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸のコード領域は、発現構造体のプロモーター配列とターミネーター配列の転写制御下にあるように、汎用発現ベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子またはその部分は、強力なｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。

【0130】

イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を、標準的な技術を用いて、発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８２、これは、特に、適当なＤＮＡ配列のスクリーニングおよびベクターの構築に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。目的の核酸（例えば、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸）、プロモーター、ターミネーターならびに他の配列を含むＤＮＡ構造体を連結するために、およびそれらを好適なベクターに挿入するために用いられる方法は、当該技術分野で周知である。例えば、制限酵素を用いて、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸とベクターとを切断することができる。その後、切断されたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸と切断されたベクターの互換性のある末端を連結することができる。連結は、通常、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の慣行に従って合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、およびＢｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｌａｓｕｒｅ，Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ７０−７６，１９９１を参照されたく、これらは各々、特に、オリゴヌクレオチドリンカーに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ベクターを、既知の組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。

【0131】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を、天然の細胞で現在見られるよりもずっと高いレベルで過剰発現させることが望ましい場合がある。この結果は、それらのポリペプチドをコードする核酸を多コピープラスミドに選択的にクローニングするかまたはそれらの核酸を強力な誘導性もしくは構成的プロモーターの下に置くことによって達成され得る。所望のポリペプチドを過剰発現させる方法は、分子生物学の分野では一般的かつ周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（これは、特に、クローニング技術に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に例を見出し得る。

【0132】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟、または転写因子ポリペプチドをコードする核酸を、天然の細胞で現在見られるよりもずっと低いレベルで過小発現する（例えば、突然変異させる、不活化する、または欠失させる）ことが望ましい場合がある。この結果は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の発現に必要な転写調節タンパク質の突然変異または不活化によるか、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の欠失によるか、あるいはそれらの核酸を強力な抑制性プロモーターの制御下に置くことによって達成され得る。所望のポリペプチドを突然変異させるか、不活化するか、または欠失させる方法は、分子生物学の分野では一般的かつ周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（これは、特に、クローニング技術および突然変異導入技術に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に例を見出し得る。

【0133】

以下のリソースは、本発明に従って有用なさらなる一般的方法論に関する記載を含む：Ｋｒｅｉｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９９０およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，編．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（これらは各々、特に、分子生物学およびクローニング技術に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0134】

例示的な供給源生物
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸（ならびにそれらのコードされたポリペプチド）を、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を天然に含有する任意の生物から入手することができる。上述のように、イソプレンは、種々の生物（例えば、細菌、酵母、植物、および動物）によって天然に形成される。生物は、イソプレンを産出するためのＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、またはＭＶＡ経路とＤＸＰ経路の両方を含有している（図１９Ａおよび１９Ｂ）。したがって、ＤＸＳ核酸を、例えば、ＤＸＰ経路を含有するかまたはＭＶＡ経路とＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から入手することができる。ＩＤＩおよびイソプレンシンターゼの核酸を、例えば、ＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、またはＭＶＡ経路とＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から入手することができる。ＭＶＡ経路核酸を、例えば、ＭＶＡ経路を含有するかまたはＭＶＡ経路とＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から入手することができる。エタノール発酵関連核酸を、例えば、グルコースまたは他の炭素源から天然にアルコールを産出する任意の生物から入手することができる。グリセロール経路および／または１，３−プロパンジオール経路関連の核酸を、例えば、一次炭素源としてのグリセロールで増殖する能力を天然に有する任意の生物から入手することができる。ヒドロゲナーゼ核酸を、例えば、水素を酸化するかまたは水素イオンを還元する任意の生物から入手することができる。発酵副産物遺伝子を、例えば、酸素制限呼吸または嫌気性呼吸（例えば、解糖）をする任意の生物から入手または同定することができる。

【0135】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の核酸配列は、以下の天然生物のいずれかによって産出される核酸の配列と同一である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の天然生物のいずれかによって産出されるポリペプチドの配列と同一である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸またはポリペプチドは、本明細書に記載の生物のいずれかに由来する突然変異体核酸またはポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「に由来する」とは、１以上の突然変異が導入される核酸またはポリペプチドの供給源を指す。例えば、「植物ポリペプチド」に由来するポリペプチドは、１以上の突然変異を野生型（すなわち、天然に生じる配列）の植物ポリペプチドの配列に導入することによって得られる目的のポリペプチドを指す。

【0136】

いくつかの実施形態では、供給源生物は真菌であり、その例は、Ａ．オリザエやＡ．ニゲルなどのアスペルギルスの種、サッカロミセス・セレビシエなどのサッカロミセスの種、分裂酵母などのスキゾサッカロミセスの種、およびＴ．リーゼイなどのトリコデルマの種である。いくつかの実施形態では、供給源生物は糸状真菌細胞である。「糸状真菌」という用語は、ユーミコチナ亜分類の全ての糸状形態を指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖類から構成された細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。糸状真菌は、形態学的に、生理学的に、および遺伝学的に酵母とは異なる。糸状真菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、炭素代謝は絶対好気性である。糸状真菌親細胞は、限定するものではないが、トリコデルマ（例えば、以前はＴ．ロンギブラキアツムと分類されていた、ヒポクレア・ジェコリナの無性モルフであるトリコデルマ・リーゼイ、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・ハルジアヌム）（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：４６−５３，１９８４；ＡＴＣＣ番号５６７６５およびＡＴＣＣ番号２６９２１）；ペニシリウム種、フミコラ種（例えば、Ｈ．イソレンス、Ｈ．ラヌギノス、またはＨ．グリセア）；クリソスポリウム種（例えば、Ｃ．ルクノウェンス）、グリオクラジウム種、アスペルギルス種（例えば、Ａ．オリザエ、Ａ．ニゲル、Ａ．ソーエ、Ａ．ジャポニクス、Ａ．ニヅランス、またはＡ．アワモリ）（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８０７４３，１９９３およびＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ ４１：８９−９８，２００２）、フサリウム種（例えば、Ｆ．ロセウム、Ｆ．グラミヌム、Ｆ．セレアリス、Ｆ．オキシスポリウム、またはＦ．ベネナツム）、ネウロスポラ種（例えば、Ｎ．クラッサ）、ヒポクレア種、ムコール種（例えば、Ｍ．ミエエイ）、リゾプス種、およびエメリセラ種（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．２２８：２１−２６，１９８５も参照されたい）の種の細胞であってもよい。「トリコデルマ」または「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）」または「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）」という用語は、以前にトリコデルマと分類されていたかまたは現在トリコデルマと分類されている任意の真菌属を指す。

【0137】

いくつかの実施形態では、真菌は、Ａ．ニヅランス、Ａ．アワモリ、Ａ．オリザエ、Ａ．アクレータス、Ａ．ニゲル、Ａ．ジャポニクス、Ｔ．リーゼイ、Ｔ．ビリデ、Ｆ．オキシスポルム、またはＦ．ソラニである。アスペルギルス株は、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８−７４３，１９９３およびＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ ４１：８９−９８，２００２（これらは各々、特に、真菌に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。特定の実施形態では、真菌は、トリコデルマの株、例えば、Ｔ．リーゼイの株である。Ｔ．リーゼイの株は既知であり、非限定例としては、ＡＴＣＣ番号１３６３１、ＡＴＣＣ番号２６９２１、ＡＴＣＣ番号５６７６４、ＡＴＣＣ番号５６７６５、ＡＴＣＣ番号５６７６７、およびＮＲＲＬ １５７０９（これらは各々、特に、Ｔ．リーゼイの株に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主株は、ＲＬ−Ｐ３７という派生体である。ＲＬ−Ｐ３７は、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：４６−５３，１９８４、これは、特に、Ｔ．リーゼイの株に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0138】

いくつかの実施形態では、供給源生物は、サッカロミセス種、スキゾサッカロミセス種、ピキア種、またはカンジダ種などの酵母である。いくつかの実施形態では、サッカロミセス種はサッカロミセス・セレビシエである。

【0139】

いくつかの実施形態では、供給源生物は、バシルスの株（例えば、Ｂ．リケニフォルミスまたは枯草菌）、パントエアの株（例えば、Ｐ．シトレア）、シュードモナスの株（例えば、Ｐ．アルカリゲンス、Ｐ．プチダ、もしくはＰ．フルオレセンス）、ストレプトミセスの株（例えば、Ｓ．リビダンスもしくはＳ．ルビギノスス）、コリネバクテリウム種の株（例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム）、ロドシュードモナス種の株（例えば、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、またはエシェリキアの株（例えば、大腸菌）などの細菌である。

【0140】

本明細書で使用される場合、「バシルス属」は、当業者に知られているような「バシルス」属内の全ての種を含み、これには、限定するものではないが、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンツス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロテルモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．ハロヅランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．ラウツス、およびＢ．ツリンギエンシスが含まれる。バシルス属は、分類上の再編成が引き続き行なわれていることが認められる。したがって、この属には、限定するものではないが、現在「ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス」と名付けられているＢ．ステアロテルモフィルスなどの生物をはじめとする、再分類された種が含まれることが意図される。酸素の存在下での耐性内性胞子の産出は、バシルス属の特徴を規定するものと考えられているが、この特徴は、最近名付けられたアリシクロバシルス、アムフィバシルス、アネウリニバシルス、アノキシバシルス、ブレビバシルス、フィロバシルス、グラシリバシルス、ハロバシルス、パエニバシルス、サリバシルス、テルモバシルス、ウレイバシルス、およびビルギバシルスにも当てはまる。

【0141】

いくつかの実施形態では、供給源生物はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトミセスの株（例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリコロール、またはＳ．グリセウス）およびバシルスの株が挙げられる。いくつかの実施形態では、供給源生物は、大腸菌、ロドシュードモナス属の種（例えば、ロドシュードモナス・パルストリス）、またはシュードモナス属の種（例えば、Ｐ．アルカリゲネス、Ｐ．プチダ、もしくはＰ．フルオレセンス）、ジモモナス属の種（例えば、Ｚ．モビリス）などの、グラム陰性細菌である。

【0142】

いくつかの実施形態では、供給源生物は、マメ科（例えば、マメ亜科）由来の植物などの植物である。いくつかの実施形態では、供給源生物は、クズ、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシＣＡＣ３５６９６）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ）、またはヨーロッパナラである。

【0143】

いくつかの実施形態では、供給源生物は、緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ藻、クロミスタ、または渦鞭毛藻などの藻類である。

【0144】

いくつかの実施形態では、供給源生物は、形態に基づいて以下のグループ：クロオコックス目、プレウロカプサ目、ユレモ目、ネンジュモ目、またはスティゴネマ目のいずれかに分類されるシアノバクテリアなどのシアノバクテリアである。

【0145】

例示的な宿主細胞
種々の宿主細胞を用いて、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドを発現させ、特許請求された発明の方法においてイソプレンと水素を同時生成させることができる。例示的な宿主細胞としては、先の「例示的な供給源生物」という見出しの節で記載された生物のいずれかに由来する生物が挙げられる。宿主細胞は、天然にイソプレンを産出する細胞であっても、天然にはイソプレンを産出しない細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路を用いて天然にイソプレンを産出しており、この経路を用いたイソプレンの産出を増強するためにイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、および／またはＩＤＩ核酸が付加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、イソプレンを用いて天然にイソプレンを産出しており、この経路を用いたイソプレンの産出を増強するためにイソプレンシンターゼおよび／または１以上のＭＶＡ経路核酸が付加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路を用いて天然にイソプレンを産出しており、ＭＶＡ経路およびＤＸＰ経路の一部または全てを用いてイソプレンを産出するために１以上のＭＶＡ経路核酸が付加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方を用いて天然にイソプレンを産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加される。

【0146】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方を用いて天然にイソプレンを産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ核酸が付加され、発酵副産物の産出を制限するために、発酵副産物を産出する１以上の遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方を用いて天然にイソプレンと水素を産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ核酸が付加され、発酵副産物の産出を制限するために、発酵副産物を産出する１以上の遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられ、水素産出を増加させるために１以上の水素再取込み遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方およびヒドロゲナーゼを用いて天然にイソプレンと水素を産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ成熟核酸が付加され、発酵副産物の産出を制限するために、発酵副産物を産出する１以上の遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられ、水素産出を増加させるために１以上の水素再取込み遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方を用いて天然にイソプレンと水素を産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ成熟核酸が付加され、ヒドロゲナーゼ産出を増強するために１以上の転写因子核酸が付加されるかまたは不活化されるもしくは欠失させられ、発酵副産物の産出を制限するために、発酵副産物を産出する１以上の遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられ、水素産出を増加させるために１以上の水素再取込み遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられる。

【0147】

例示的な形質転換方法
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸あるいはそれらを含有するベクターを、コードされたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連、グリセロール経路、１，３−プロパンジオール経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドの発現させるための標準的な技術を用いて宿主細胞（例えば、本明細書に記載の植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞）に挿入することができる。形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクションを介するまたはＤＥＡＥ−デキストランを介するトランスフェクションまたは組換えファージウイルスを用いるトランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いるインキュベーション、ＤＮＡをコーティングした微粒子銃を用いる高速衝突、およびプトロプラスト融合などの技術を用いて、ＤＮＡ構造体またはベクターの宿主細胞への導入を行なうことができる。一般的な形質転換技術は当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編） 第９章，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；およびＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９を参照されたく、これらは各々、特に、形質転換方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。トリコデルマにおける異種ポリペプチドの発現は、米国特許第６，０２２，７２５号；米国特許第６，２６８，３２８号；米国特許第７，２６２，０４１号；ＷＯ２００５／００１０３６号；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７−２３３，１９９１；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：５９６−６０３，１９８９；欧州特許第２４４，２３４号；欧州特許第２１５，５９４号；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｌｅｏｎｇ ａｎｄ Ｂｅｒｋａ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，ＮＹ ｐｐ．１２９−１４８，１９９２中のＮｅｖａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ”（これらは各々、特に、形質転換方法および発現方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。アスペルギルス株の形質転換については、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｓｃｉ．９：９９１−１００１，２０００；欧州特許第２３８０２３号；およびＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４，１９８４（これらは各々、特に、形質転換方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得るかまたは染色体外の複製配列として維持され得る。

【0148】

当該技術分野で公知の任意の方法を用いて形質転換体を選択し得る。１つの非限定的な例では、ａｍｄＳマーカーを含む安定な形質転換体を、そのより速い増殖速度や、アセトアミドを含有する固形培養培地上でのギザギザではなく、滑らかな輪郭を有する円形コロニーの形成によって、不安定な形質転換体から区別する。さらに、場合によっては、形質転換体を固形非選択培地（例えば、アセトアミドを欠く培地）上で増殖させ、この培養培地から胞子を採取し、アセトアミドを含有する選択培地上で後に発芽および増殖するこれらの胞子のパーセンテージを決定することによって、さらなる安定性の試験を実施する。

【0149】

いくつかの実施形態では、真菌細胞を、プロトプラスト形成およびプロトプラストの形質転換、それに続く既知の方法での細胞壁の再生を伴うプロセスによって形質転換する。特定の一実施形態では、形質転換用のトリコデルマ種の調製は、真菌菌糸からのプロトプラストの調製を必要とする（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９を参照されたく、これは、特に、形質転換方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、菌糸を、発芽した栄養胞子から得る。菌糸を、細胞壁を消化する酵素で処理して、プロトプラストを生じさせる。次に、プロトプラストを、懸濁媒体中に浸透圧安定化剤を存在させることによって保護する。これらの安定化剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。通常、これらの安定化剤の濃度は、０．８Ｍから１．２Ｍの間で変動する。懸濁媒体中約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが望ましい。

【0150】

宿主トリコデルマ種株へのＤＮＡの取込みは、カルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭ ＣａＣｌ_２から５０ｍＭ ＣａＣｌ_２を取込み溶液中で使用する。取込み溶液中のカルシウムイオンの他に、通常含まれる他の化合物は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ）または１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０緩衝液（モルホリンプロパンスルホン酸）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの緩衝系である。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させるように働き、それにより、媒体の内容物をトリコデルマ種株の細胞質に送達し、プラスミドＤＮＡを核に移すことを可能にすると考えられている。この融合によって、複数コピーのプラスミドＤＮＡが宿主染色体に組み込まれたままになることが多い。

【0151】

通常、１０^５〜１０^７／ｍＬ（例えば、２×１０^６／ｍＬ）の密度で透過処理を受けさせたトリコデルマ種のプロトプラストまたは細胞を含有する懸濁液を形質転換で用いる。適当な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトールおよび５０ｍＭのＣａＣｌ_２）中の１００μＬの容量のこれらのプロトプラストまたは細胞を、所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを取込み溶液に添加する。０．１〜１容量の２５％ＰＥＧ ４０００をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。いくつかの実施形態では、約０．２５容量をプロトプラスト懸濁液に添加する。また、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどのような添加剤を取込み溶液に添加して、形質転換を助けてもよい。同様の手順が他の真菌宿主細胞に利用可能である（例えば、米国特許第６，０２２，７２５号および第６，２６８，３２８号を参照されたく、これらは各々、特に、形質転換に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0152】

通常は、その後、混合物を約０℃で１０〜３０分間培養する。その後、この混合物にＰＥＧをさらに添加して、所望の核酸配列の取込みをさらに増強する。通常、２５％のＰＥＧ ４０００を、形質転換混合物の容量の５〜１５倍の容量で添加するが、より多いまたはより少ない容量が好適である場合もある。２５％のＰＥＧ ４０００は、望ましくは形質転換混合物の容量の約１０倍である。ＰＥＧを添加した後、形質転換混合物を室温または氷上のいずれかで培養し、その後、ソルビトール／ＣａＣｌ_２溶液を添加する。その後、プロトプラスト懸濁液を、培養培地の溶融液にさらに添加する。増殖培地に増殖を選択するもの（例えば、アセトアミドまたは抗生物質）が含まれる場合、それによって、形質転換体の増殖のみが許容される。

【0153】

細菌細胞の形質転換を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８２（これは、特に、形質転換方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような従来の方法に従って行なってもよい。

【0154】

例示的な細胞培養培地
本発明はまた、イソプレンと水素を同時に生成する培養細胞かまたは培養細胞の集団を含む。「培養細胞」とは、細胞が１回以上の細胞分裂を経るのを可能にする溶液（例えば、細胞増殖培地）中の２以上の細胞を意味する。「培養細胞」には、植物組織に分化した細胞を含有する生きた多細胞植物の部分である植物細胞は含まれない。様々な実施形態では、細胞培養物には、少なくともまたは約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００個またはそれより多くの細胞が含まれる。

【0155】

「酸素制限培養された細胞」とは、細胞が１回以上の細胞分裂を経るのを可能にする溶液（例えば、細胞増殖培地）中の２以上の細胞を意味し、その場合、この溶液は制限量の酸素を含有する。「酸素制限培養」という用語は、培養が無酸素性であるかまたは還元当量の酸素への生物学的移動を介した呼吸を支えるための所要量に満たない酸素を含有するかのいずれかであることを意味し、嫌気性培養も包含する。酸素制限培養条件下では、酸素濃度が低すぎるために、炭素代謝から得られるいくつかの電子を受容することができず、細胞が電子を受容するための適当な代謝経路を含まない場合、細胞を水素産出に切り替えさせる。酸素制限培養条件は、培養培地中のゼロに近い溶存酸素濃度で示される、酸素移動速度（「ＯＴＲ」）が酸素取込み速度（「ＯＵＲ」）よりも低い場合に発生する。

【0156】

任意の炭素源を用いて、宿主細胞を培養することができる。「炭素源」という用語は、宿主細胞または生物によって代謝されることができる１以上の炭素含有化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するために用いられる細胞培地は、宿主細胞の生存または増殖を維持するのに好適な任意の炭素源を含んでいてもよい。

【0157】

いくつかの実施形態では、炭素源は、炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、もしくは多糖類）、転化糖（例えば、酵素処理したスクロースシロップ）、グリセロール、グリセリン（例えば、バイオディーゼルもしくは石鹸製造プロセスのグリセリン副生成物）、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油（例えば、植物油もしくは植物性油、例えば、トウモロコシ油、ヤシ油、もしくは大豆油）、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸（例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、もしくは多価不飽和脂肪酸）、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、再生可能な炭素源（例えば、バイオマス炭素源、例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、酵母抽出物、酵母抽出物由来の成分、ポリマー、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、コハク酸、乳酸、酢酸、エタノール、または上述のもののうちの２つ以上の任意の組合せである。いくつかの実施形態では、炭素源は、限定するものではないが、グルコースをはじめとする光合成産物である。

【0158】

例示的な単糖としては、グルコースおよびフルクトースが挙げられ、例示的なオリゴ糖としては、ラクトースおよびスクロースが挙げられ、例示的な多糖類としては、デンプンおよびセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース）およびＣ５糖（例えば、キシロースまたはアラビノース）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞培地は、炭水化物および炭水化物（例えば、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、または酵母抽出物由来の成分）以外の１以上の炭素源を含む。いくつかの実施形態では、細胞培地は、炭水化物およびポリペプチド（例えば、微生物または植物のタンパク質またはペプチド）を含む。いくつかの実施形態では、微生物ポリペプチドは、酵母または細菌由来のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、植物ポリペプチドは、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ゴマ、またはアマニ由来のポリペプチドである。

【0159】

いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は、少なくともまたは約５グラム／液体培地１リットル（ｇ／Ｌ、ここで、液体培地の容積は、細胞培地の容量と細胞の容積の両方を含む）、例えば、少なくともまたは約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００ｇ／Ｌ、またはそれよりも多い。いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は、約５０〜約４００ｇ／Ｌ、例えば、約１００〜約３６０ｇ／Ｌ、約１２０〜約３６０ｇ／Ｌ、または約２００〜約３００ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、炭水化物のこの濃度は、宿主細胞の培養前および／または培養中に添加される炭水化物の総量を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。「制限グルコース条件」とは、添加されるグルコースの量が、細胞によって消費されるグルコースの量の１０５％未満または約１０５％（例えば、約１００％）であることを意味する。特定の実施形態では、培養培地に添加されるグルコースの量は、一定期間内に細胞によって消費されるグルコースの量とほぼ同じである。いくつかの実施形態では、細胞培地中のグルコースの量で支えることができる速度で細胞が増殖するように、細胞増殖の速度を、添加されるグルコースの量を制限することで制御する。いくつかの実施形態では、グルコースは細胞培養中に蓄積しない。様々な実施形態では、１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、もしくは７０時間を超えてまたは約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、もしくは７０時間の間、細胞を制限グルコース条件下で培養する。様々な実施形態では、細胞が培養される総時間の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％を超えてまたは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％の間、細胞を制限グルコース条件下で培養する。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、制限グルコース条件が細胞のより有利な調節を可能にし得ると考えられている。

【0161】

いくつかの実施形態では、細胞を過剰なグルコースの存在下で培養する。特定の実施形態では、添加されるグルコースの量は、一定期間内に細胞によって消費されるグルコースの量の約１０５％超（例えば、約１１０、１２０、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、もしくは５００％または１１０、１２０、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、もしくは５００％超）あるいはそれを上回る。いくつかの実施形態では、グルコースは細胞培養中に蓄積する。

【0162】

例示的な脂質は、飽和しているか、不飽和であるか、または分岐しているＣ４およびそれを上回る脂肪酸である１以上の脂肪酸を含有する任意の物質である。

【0163】

例示的な油は、室温で液体である脂質である。いくつかの実施形態では、脂質は、１以上のＣ４またはそれを上回る脂肪酸を含有する（例えば、４以上の炭素を有する１以上の飽和、不飽和、または分岐脂肪酸を含有する）。いくつかの実施形態では、油は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ゴマ、アマニ、油脂性微生物細胞、ナンキンハゼ、または上述のもののうちの２つ以上の任意の組合せから得られる。

【0164】

例示的な脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨの化合物（式中、「Ｒ」は炭化水素である）が挙げられる。例示的な不飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む化合物が挙げられる。例示的な不飽和脂肪酸としては、限定するものではないが、オレイン酸、バクセン酸、リノレイン酸、パルミトレイン酸酸、およびアラキドン酸が挙げられる。例示的な多価不飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が複数の炭素−炭素二重結合を含む化合物が挙げられる。例示的な飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、炭素源は、１以上のＣ_１２−Ｃ_２２脂肪酸、例えば、Ｃ_１２飽和脂肪酸、Ｃ_１４飽和脂肪酸、Ｃ_１６飽和脂肪酸、Ｃ_１８飽和脂肪酸、Ｃ_２０飽和脂肪酸、またはＣ_２２飽和脂肪酸を含む。例示的な実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。いくつかの実施形態では、炭素源は、脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の塩、脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の誘導体、または脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の誘導体の塩である。好適な塩としては、限定するものではないが、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩などが挙げられる。ジグリセリドおよびトリグリセリドは、グリセロールの脂肪酸エステルである。

【0165】

いくつかの実施形態では、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドの濃度は、少なくともまたは約１グラム／液体培地１リットル（ｇ／Ｌ、ここで、液体培地の容積は、細胞培地の容量と細胞の容積の両方を含む）、例えば、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００ｇ／Ｌ、またはそれよりも多い。いくつかの実施形態では、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドの濃度は、約１０〜約４００ｇ／Ｌ、例えば、約２５〜約３００ｇ／Ｌ、約６０〜約１８０ｇ／Ｌ、または約７５〜約１５０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、この濃度は、宿主細胞の培養前および／または培養中に添加される脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドの総量を含む。いくつかの実施形態では、炭素源は、（ｉ）脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドおよび（ｉｉ）炭水化物（例えば、グルコース）を含む。いくつかの実施形態では、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドと炭水化物の比率は、炭素ベースで約１：１（すなわち、炭水化物の炭素１個当たりに脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリド中の炭素が１個）である。特定の実施形態では、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドの量は約６０〜１８０ｇ／Ｌであり、炭水化物の量は約１２０〜３６０ｇ／Ｌである。

【0166】

例示的な微生物ポリペプチド炭素源としては、酵母または細菌由来の１以上のポリペプチドが挙げられる。例示的な植物ポリペプチド炭素源としては、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ゴマ、またはアマニ由来の１以上のポリペプチドが挙げられる。

【0167】

例示的な再生可能な炭素源としては、チーズホエー浸透液、コーンスティープリカー、甜菜糖液、大麦麦芽、および上述のもののいずれかに由来する成分が挙げられる。例示的な再生可能な炭素源としては、バイオマス（例えば、トウモロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、発酵プロセスの細胞廃棄物、および大豆、トウモロコシ、または小麦の製粉からのタンパク質副産物）中に存在するグルコース、ヘキソース、ペントース、およびキシロースも挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオマス炭素源は、限定するものではないが、草、小麦、麦わら、バガス、サトウキビバガス、針葉樹パルプ、トウモロコシ、トウモロコシの軸または皮、トウモロコシの実、トウモロコシの実からの繊維、コーンストーバー、スイッチグラス、籾殻産物、または穀物（例えば、トウモロコシ、ソルガム、ライ麦、ライ小麦、大麦、小麦、および／またはディスティラーズグレイン）の湿式もしくは乾式製粉からの副産物などの、リグノセルロース系材料、ヘミセルロース系材料、またはセルロース系材料である。例示的なセルロース系材料としては、木材、紙およびパルプ廃棄物、草本植物、および果肉が挙げられる。いくつかの実施形態では、炭素源としては、茎、穀粒、根、または塊根などの任意の植物部分が挙げられる。いくつかの実施形態では、以下の植物のいずれかの全てまたは一部を炭素源として用いる：トウモロコシ、小麦、ライ麦、ソルガム、ライ小麦、米、キビ、大麦、キャッサバ、マメ（例えば、豆およびエンドウ豆）、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、および／またはタピオカ。いくつかの実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物（例えば、キシロースとグルコースの両方を含むかまたはスクロースとグルコースの両方を含むバイオマス加水分解物）である。

【0168】

いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源（例えば、バイオマス）を、細胞培養培地に添加する前に前処理する。いくつかの実施形態では、前処理は、酵素的前処理、化学的前処理または酵素的前処理と化学的前処理の両方の組合せを含む（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９６（１８）：２０１４−２０１８，２００５；米国特許第６，１７６，１７６号；米国特許第６，１０６，８８８号を参照されたく、これらは各々、特に、再生可能な炭素源の前処理に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源を、細胞培養培地に添加する前に、部分的にまたは完全に加水分解する。

【0169】

いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源（例えば、コーンストーバー）を細胞培養培地に添加する前にアンモニア繊維膨潤（ＡＦＥＸ）前処理する（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９６（１８）：２０１４−２０１８，２００５を参照されたい）。ＡＦＥＸ前処理の間、再生可能な炭素源を、液体無水アンモニアにより、穏やかな温度（例えば、約６０〜約１００℃）において高圧（例えば、約２５０〜約３００ｐｓｉ）で約５分間処理する。その後、圧力を速やかに解放する。このプロセスでは、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロース脱結晶化、および表面積の増加の化学的効果と物理的効果の組合せにより、セルロースとヘミセルロースを酵素的に変換して、ほぼ完全に発酵性糖にすることができる。ＡＦＥＸ前処理には、アンモニアのほぼ全量を回収して再使用することができるとともに、残量が下流プロセス中の微生物の窒素源として役立てられるという利点がある。また、ＡＦＥＸ前処理には洗浄ストリームが必要ない。したがって、ＡＦＥＸ処理後の乾燥物質の回収率は、本質的に１００％である。ＡＦＥＸは、基本的には、乾燥状態から乾燥状態へのプロセスである。処理された再生可能な炭素源は長期間安定であり、極めて高い固体含有量で酵素的加水分解または発酵プロセスに供給することができる。セルロースおよびヘミセルロースは、ほとんどまたは全く分解せず、ＡＦＥＸプロセスで十分に保存される。ＡＦＥＸ前処理した再生可能な炭素源の酵素的加水分解の前に中和する必要はない。ＡＦＥＸ処理した炭素源の酵素的加水分解により、次の発酵で使用するための清浄な糖ストリームが産出される。

【0170】

いくつかの実施形態では、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）の濃度は、少なくともまたは約０.１、０.５、１、１.５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０％グルコース（ｗ／ｖ）に等しい。グルコースの当量は、グルコースを参照として標準的なＨＰＬＣ法を用いて、炭素源から生成されるグルコースの量を測定することにより決定することができる。いくつかの実施形態では、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）の濃度は、約０.１〜約２０％グルコース、例えば、約０.１〜約１０％グルコース、約０.５〜約１０％グルコース、約１〜約１０％グルコース、約１〜約５％グルコース、または約１〜約２％グルコースに等しい。

【0171】

いくつかの実施形態では、炭素源には、酵母抽出物または酵母抽出物の１以上の成分が含まれる。いくつかの実施形態では、酵母抽出物の濃度は、少なくとも１グラムの酵母抽出物／液体培地１リットル（ｇ／Ｌ、ここで、液体培地の容積は、細胞培地の容量と細胞の容積の両方を含む）、例えば、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００ｇ／Ｌ、またはそれより多い。いくつかの実施形態では、酵母抽出物の濃度は、約１〜約３００ｇ／Ｌ、例えば、約１〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約１００ｇ／Ｌ、または約５〜約６０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、濃度は、宿主細胞の培養前および／または培養中に添加される酵母抽出物の総量を含む。いくつかの実施形態では、炭素源は、酵母抽出物（または１以上のその成分）と別の炭素源（例えば、グルコース）の両方を含む。いくつかの実施形態では、酵母抽出物と他の炭素源の比率は、約１：５、約１：１０、または約１：２０（ｗ／ｗ）である。

【0172】

さらに、炭素源はまた、二酸化炭素またはメタノールなどの１炭素基質であってもよい。メチルトローフ酵母（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（２） ５４１−５４３，１９８９、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）や細菌（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，４１４８−４１５５，１９８５、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において、１炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒド、またはギ酸）からグリセロールが産出されることが報告されている。これらの生物は、メタンからギ酸の範囲の酸化状態にある１炭素化合物を同化して、グリセロールを産出することができる。炭素同化の経路は、リブロース一リン酸経由、セリン経由、またはキシルロース−一リン酸経由であることができる（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。リブロース一リン酸経路では、ギ酸とリブロース−５−リン酸の縮合によって、フルクトースとなる６単糖が形成され、最終的に炭素数３の産物であるグリセルアルデヒド−３−リン酸になる。同様に、セリン経路では、１炭素化合物がメチレンテトラヒドロ葉酸を経由して解糖経路に取り込まれる。

【0173】

１炭素基質および２炭素基質の他に、メチルトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための種々のアミノ酸などの、いくつかの他の炭素含有化合物を利用することも知られている。例えば、メチルトローフ酵母は、メチルアミンの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｌ Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，第７版．，４１５−３２．編者：Ｍｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ，１９９３、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、カンジダの様々な種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３（５），４８５−９，１９９０、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0174】

いくつかの実施形態では、細胞を生理的塩と栄養素を含有する標準的な培地中で培養する（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，編．Ａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１−８６，１９８８およびＩｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６，１９９７を参照されたく、これらは各々、特に、細胞培地に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例示的な増殖培地は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）液体培地、サブロー・デキストロース（ＳＤ）液体培地、または酵母培地（ＹＭ）液体培地などの、一般的な市販調製培地である。また、他の規定増殖培地または合成増殖培地を用いてもよく、特定の宿主細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の分野の当業者に知られている。

【0175】

適当な炭素源の他に、細胞培地は、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤、および培養物の増殖またはイソプレン産出の増強に好適であることが当業者に知られている他の成分を含有することが望ましい（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６号およびその中に引用された参考文献ならびにＷＯ９６／３５７９６号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、細胞培地および細胞培養条件に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路核酸が誘導性プロモーターの制御下にあるいくつかの実施形態では、誘導剤（例えば、糖、金属塩または抗微生物薬）を、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を誘導するために有効な濃度で培地に添加することが望ましい。いくつかの実施形態では、細胞培地は、１以上のＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸を有するベクター上の抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン耐性核酸）に対応する抗生物質（例えば、カナマイシン）を有する。

【0176】

例示的な細胞培養条件
細菌培養物の維持および増殖に好適な材料および方法は、当該技術分野で周知である。例示的な技術を、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，編），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）またはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９） Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ中のＢｒｏｃｋ（これらは各々、特に、細胞培養技術に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出し得る。いくつかの実施形態では、細胞を、宿主細胞に挿入された核酸によってコードされる１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を許容する条件下、培養培地中で培養する。

【0177】

標準的な細胞培養条件を用いて細胞を培養することができる（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、細胞培養条件および発酵条件に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。細胞を、適当な温度、ガス混合、およびｐＨで（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％ＣＯ_２、およびｐＨ約５〜約９で）増殖させ、維持する。いくつかの実施形態では、細胞を適当な細胞培地中、３５℃で増殖させる。いくつかの実施形態では、例えば、培養物を、所望量のイソプレンと水素の同時生成が達成されるまで、振盪培養液または発酵槽中の適当な培地中、約２８℃で培養する。いくつかの実施形態では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ５.０〜約ｐＨ９.０（例えば、約ｐＨ６.０〜約ｐＨ８.０または約６.５〜約７.０）である。反応は、宿主細胞の要件に基づいて、好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で行なわれてもよい。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限条件下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を嫌気性条件下で培養する。所与の糸状真菌のための例示的な培養条件は当該技術分野で公知であり、科学文献でおよび／またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒなどの真菌の供給源から見出し得る。

【0178】

様々な実施形態では、バッチプロセス、流加プロセス、または連続プロセスなどの任意の既知の発酵様式を用いて増殖させる。いくつかの実施形態では、バッチ発酵法を用いる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成物を発酵の開始時に仕込み、発酵中に人為的な変更は行なわない閉鎖系である。したがって、発酵の開始時に、細胞培地に所望の宿主細胞を植菌し、この系に何も添加せずに発酵させる。しかしながら、通常、「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチであり、ｐＨや酸素濃度などの因子を制御する試みはよく行なわれる。バッチ系では、系の代謝産物とバイオマスの組成が発酵が停止するまで絶えず変化する。バッチ培養では、細胞は、穏やかに静的遅滞期から高増殖対数増殖期を経て、最終的に増殖速度が減弱または停止する定常期に至る。いくつかの実施形態では、対数増殖期の細胞が、大部分のイソプレン産出に関与する。いくつかの実施形態では、定常期の細胞がイソプレンを産出する。

【0179】

いくつかの実施形態では、流加系などの標準的なバッチ系に対する変更を用いる。流加発酵プロセスは、発酵が進行するにしたがって炭素源を徐々に添加する点を除き、通常のバッチ系を含む。流加系は、異化代謝産物抑制によって細胞の代謝が抑制される傾向があって、細胞培地中の炭素源の量を制限することが望ましいときに有用である。流加発酵を、制限された量または過剰な量の炭素源（例えば、グルコース）を用いて行なってもよい。流加系において実際の炭素源濃度を測定することは難しいので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ_２等の排気ガスの分圧などの、測定可能な因子の変化に基づいて推定する。バッチ発酵および流加発酵は当該技術分野で一般的かつ公知であり、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９） Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（これは、特に、細胞培養条件および発酵条件に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に例を見出し得る。

【0180】

いくつかの実施形態では、連続発酵法を用いる。連続発酵は、所定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に処理のために等量の馴化培地が取り除かれる開放系である。連続発酵では、通常、培養物が一定の高密度に維持され、細胞は主に対数期増殖にある。

【0181】

連続発酵では、細胞増殖またはイソプレン産出に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子を調節することができる。例えば、ある方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限栄養素を一定の割合に維持し、他の全てのパラメータを調節することができる。他の系では、細胞濃度（例えば、培地の濁度によって測定される濃度）を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの因子を連続的に変化させることができる。連続系は、安定な増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞の損失を、発酵における細胞増殖速度で釣り合わせる。連続発酵プロセスの栄養素および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大化する技術は、工業微生物学の分野で周知であり、種々の方法がＢｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９） Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（これは、特に、細胞培養条件および発酵条件に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳述されている。

【0182】

いくつかの実施形態では、細胞を全細胞触媒として基板上に固定し、イソプレンを産出するための発酵条件下に置く。

【0183】

いくつかの実施形態では、酸素を液体に導入し、かつ培養物の均一性を維持するために培養液のボトルを振盪器の中に置く。いくつかの実施形態では、インキュベーターを用いて、温度、湿度、振盪速度、および／または培養物を増殖させる他の条件を制御する。最も簡単なインキュベーターは、通常約６５℃まで上昇する、調整可能なヒーターの付いた断熱箱である。より洗練されたインキュベーターは、（冷却により）温度を下げる能力、または湿度もしくはＣＯ_２レベルを制御する能力も含むことができる。ほとんどのインキュベーターはタイマーを含み、異なる温度、湿度レベルなどを周期的に繰り返すようにプログラムできるものもある。インキュベーターのサイズは、卓上型から小さな部屋程度のものまで様々であり得る。

【0184】

所望により、細胞培地の一部または全てを取り換えて、栄養素を補給しかつ／または潜在的に有害な代謝副生成物と死んだ細胞の蓄積を防ぐことができる。懸濁培養物の場合、懸濁培養物を遠心分離または濾過し、次に、新鮮な培地に再懸濁することにより、細胞を培地から分離することができる。付着培養物の場合、培地をアスピレーションにより直接除去して、入れ換えることができる。いくつかの実施形態では、細胞培地は、細胞の少なくとも一部を、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５回、またはそれより多くの細胞分裂の間、分裂させることができる。

【0185】

いくつかの実施形態では、構成的または漏出型(leaky)プロモーター（例えば、Ｔｒｃプロモーター）を用い、プロモーターに機能的に連結されたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸の発現を誘導するために化合物（例えば、ＩＰＴＧ）を添加することはない。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結されたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸の発現を誘導するために化合物（例えば、ＩＰＴＧ）を添加する。

【0186】

イソプレン産出を細胞増殖から脱共役する例示的な方法
望ましくは、原料由来の炭素を、細胞の増殖や維持にではなく、イソプレンに変換する。いくつかの実施形態では、細胞を低から中程度のＯＤ_６００まで増殖させ、その後、イソプレンの産出を開始または増加させる。この戦略により、炭素の大部分をイソプレンに変換することができる。

【0187】

いくつかの実施形態では、細胞は、もはや分裂しないかまたは極端にゆっくりと分裂するが、数時間（例えば、約２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０時間、またはそれより長い時間）の間、イソプレンを作り続けるような光学密度に達する。例えば、図６０Ａ〜６７Ｃは、細胞がもはや分裂しないかまたは極端にゆっくりと分裂する光学密度に達した後に、細胞が相当な量のメバロン酸またはイソプレンを産出し続け得ることを示している。場合によっては、５５０ｎｍにおける光学密度が時間の経過とともに減少し（例えば、細胞溶解によって細胞がもはや指数関数的増殖期にはいなくなった後の光学密度の減少）、細胞は相当な量のメバロン酸またはイソプレンを産出し続ける。いくつかの実施形態では、５５０ｎｍにおける細胞の光学密度は、一定の期間（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間超または約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間）、５０％未満または約５０％（例えば、４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％未満または約４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％）増加し、細胞は、この期間中に、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ、もしくはそれより多くを超えるかまたは約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ、もしくはそれより多くのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間である。

【0188】

いくつかの実施形態では、５５０ｎｍにおける細胞の光学密度は、一定の期間（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間超または約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間）、５０％未満または約５０％（例えば、４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％未満または約４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％）増加し、細胞は、この期間中に、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多くを超えるかまたは約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／液体培地のＬ（ｍｇ／Ｌ_液体培地、ここで、液体培地の容積は、細胞と細胞培地の容積を含む）の累積力価（総量）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地である。

【0189】

いくつかの実施形態では、５５０ｎｍにおける細胞の光学密度は、一定の期間（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間超または約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間）、５０％未満または約５０％（例えば、４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％未満または約４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％）増加し、細胞は、この期間中に、細胞培養培地中の炭素の０.００１５、０.００２、０.００５、０.０１、０.０２、０.０５、０.１、０.１２、０.１４、０.１６、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.２、１.４、１.６、１.８、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、５.０、６.０、７.０、もしくは８.０％超または約０.００１５、０.００２、０.００５、０.０１、０.０２、０.０５、０.１、０.１２、０.１４、０.１６、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.２、１.４、１.６、１.８、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、５.０、６.０、７.０、もしくは８.０％をイソプレンに変換する。いくつかの実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は、例えば、約０．００２〜約４．０％、約０．００２〜約３．０％、約０．００２〜約２．０％、約０．００２〜約１．６％、約０．００２〜約０．００５％、約０．００５〜約０．０１％、約０．０１〜約０．０５％、約０．０５〜約０．１５％、０．１５〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．５％、約０．５〜約０．８％、約０．８〜約１．０％、または約１．０〜約１．６％である。いくつかの実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は、約０．００２〜約０．４％、０．００２〜約０．１６％、０．０４〜約０．１６％、約０．００５〜約０．３％、約０．０１〜約０．３％、または約０．０５〜約０．３％である。

【0190】

いくつかの実施形態では、イソプレンは定常期にのみ産出される。いくつかの実施形態では、イソプレンは増殖期と定常期の両方に産出される。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍、もしくはそれより多くを超えるかまたは約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍、もしくはそれより多い。様々な実施形態では、細胞が定常期にいる間に、産出されるイソプレンの総量（例えば、一定の時間、例えば、２０時間の発酵におけるイソプレンの産出）の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％もしくはそれより多くを超えるかまたは約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％もしくはそれより多くが産出される。様々な実施形態では、５５０ｎｍにおける細胞の光学密度が、５０％未満または約５０％（例えば、４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％未満または約４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％）増加するように細胞がゆっくりと分裂するかまたは全く分裂しない間に、産出されるイソプレンの総量（例えば、一定の時間、例えば、２０時間の発酵におけるイソプレンの産出）の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％もしくはそれより多くを超えるかまたは約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％もしくはそれより多くが産出される。いくつかの実施形態では、イソプレンは増殖期にのみ産出される。

【0191】

いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、増殖期よりも定常期に活性の高いプロモーターまたは因子の制御下に置かれている。例えば、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、定常期σ因子（例えば、ＲｐｏＳ）の制御下に置かれていてもよい。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、定常期に誘導可能なプロモーター（例えば、定常期に活性のある応答調節因子によって誘導可能なプロモーター）の制御下に置かれている。

【0192】

安全操作範囲内のイソプレンの産出
その引火特性に従う安全操作レベル内のイソプレンの産出によって、商業施設の設計と構築が単純化され、安全に操作する能力が大いに改善され、火災が発生する可能性が制限される。特に、イソプレン産出の最適な範囲は、安全圏、すなわち、イソプレン濃度の非引火範囲内である。そのような一態様では、本発明は、イソプレン濃度の非引火範囲内（イソプレンの引火限度外）でのイソプレン産出方法を特徴とする。

【0193】

したがって、プロセスの安全性を確保するために、コンピュータモデリングと実験的試験を用いて、イソプレン（例えば、Ｏ_２、Ｎ_２、ＣＯ_２または前述のガスのうちの２つ以上の任意の組合せの存在下のイソプレン）の引火限界を決定した。引火限度は、引火下限（ＬＦＬ）、引火上限（ＵＦＬ）、限界酸素濃度（ＬＯＣ）、および制限温度によって特徴付けられる。系が引火性である場合、最少量の酸化体（通常、酸素）の存在下で、最少量の燃料（例えば、イソプレン）でなければならない。ＬＦＬは、燃焼を持続させるために存在しなければならないイソプレンの最少量であり、一方、ＵＦＬは、存在することができるイソプレンの最大量である。この限度を超えると、混合物は燃料過多となり、酸素の割合が低くなりすぎて、引火性混合物でなくなる。ＬＯＣは、引火性混合物を得るために存在しなければならない酸素の最低限の割合を示す。制限温度は、イソプレンの引火点に基づくものであり、イソプレンの燃焼を伝播させることができる最低の温度である。これらの限度は、イソプレンの濃度、酸化体の種類や濃度、系に存在する不活性ガス、温度、および系の圧力に特異的である。引火限度の限度内に収まる組成物は、燃焼を伝播させ、プロセス装置の設計と操作の両方におけるさらなる安全対策を必要とする。

【0194】

コンピュータシミュレーションと数理解析と実験的試験を用いて、以下の条件を試験した。所望により、本明細書に記載の方法を用いて、他の条件（例えば、他の温度、圧力、および永久ガス組成）を試験し、ＬＦＬ、ＵＦＬ、およびＬＯＣ濃度を決定してもよい。

【0195】

（１）コンピュータシミュレーションおよび数理解析
試験項目１：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ_２：６重量％〜２１重量％
Ｎ_２：７９重量％〜９４重量％

試験項目２：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ_２：６重量％〜２１重量％
Ｎ_２：７９重量％〜９４重量％
Ｈ_２Ｏで飽和する

試験項目３：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ_２：６重量％〜２１重量％
Ｎ_２：７９重量％〜９４重量％
ＣＯ_２：５重量％〜３０重量％

（２）引火限界の最終決定のための実験的試験
試験項目１：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ_２：６重量％〜２１重量％
Ｎ_２：７９重量％〜９４重量％

試験項目２：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ_２：６重量％〜２１重量％
Ｎ_２：７９重量％〜９４重量％
Ｈ_２Ｏで飽和する

【0196】

シミュレーションソフトウェアを用いて、いくつかの異なる検討条件について系の引火特性を推定した。ＣＯ_２は、系の引火限界にそれほど影響を示さなかった。試験項目１と２は、実験的試験で確認した。モデリングの結果は、実験的試験結果と一致した。水を添加した場合に、ほんのわずかな変動が見られた。

【0197】

ＬＯＣは、イソプレンとＯ_２とＮ_２とＣＯ_２の混合物について、４０℃、１気圧で９.５体積％であると決定された。最大３０％までのＣＯ_２を添加しても、イソプレンとＯ_２とＮ_２の混合物の引火特性にそれほど影響がなかった。乾燥したイソプレンとＯ_２とＮ_２の系と、水飽和したイソプレンとＯ_２とＮ_２の系の間で、ほんのわずかな引火特性の変動が示された。制限温度は約−５４℃である。約−５４℃未満の温度では低すぎて、イソプレンの燃焼を伝播させることができない。

【0198】

いくつかの実施形態では、系中の酸素の量に応じて、イソプレンのＬＦＬは約１.５体積％〜約２.０体積％であり、イソプレンのＵＦＬは約２.０体積％〜約１２.０体積％である。いくつかの実施形態では、ＬＯＣは約９.５体積％酸素である。いくつかの実施形態では、温度が約２５℃〜約５５℃（例えば、約４０℃）であり、圧力が約１気圧〜３気圧であるとき、イソプレンのＬＦＬは約１.５体積％〜約２.０体積％であり、イソプレンのＵＦＬは約２.０体積％〜約１２.０体積％であり、ＬＯＣは約９.５体積％酸素である。

【0199】

いくつかの実施形態では、イソプレンは、約９.５体積％未満の酸素（すなわち、イソプレンの引火性混合物を得るために必要なＬＯＣ未満）の存在下で産出される。イソプレンが９.５体積％超または約９.５体積％の酸素の存在下で産出されるいくつかの実施形態では、イソプレン濃度は、ＬＦＬ未満（例えば、約１.５体積％未満）である。例えば、不活性ガスでイソプレン組成物を希釈することによって（例えば、イソプレン組成物をＬＦＬ未満に保つために窒素などの不活性ガスを連続的にまたは定期的に添加することによって）イソプレンの量をＬＦＬ未満に保つことができる。イソプレンが９.５体積％超または約９.５体積％の酸素の存在下で産出されるいくつかの実施形態では、イソプレン濃度はＵＦＬを上回る（例えば、約１２体積％を上回る）。例えば、イソプレンの量を、ＵＦＬを上回る濃度のイソプレンを産出する系（例えば、本明細書に記載の細胞培養系のいずれか）を用いることによって、ＵＦＬよりも大きく保つことができる。所望により、ＵＦＬも比較的低くなるように、比較的低レベルの酸素を用いることができる。この場合、ＵＦＬを上回り続けるためには、より低いイソプレン濃度がで良い。

【0200】

イソプレンが９.５体積％超または約９.５体積％の酸素の存在下で産出されるいくつかの実施形態では、イソプレン濃度は引火限度内（例えば、ＬＦＬとＵＦＬの間）である。イソプレン濃度が引火限度内に収まり得るいくつかの実施形態では、火災または爆発の可能性を低下させるために１以上の工程を行なう。例えば、１以上の発火源（例えば、火花を発生させるおそれのある任意の物質）を避けることができる。いくつかの実施形態では、イソプレンの濃度が引火限度内にあり続ける時間の量を減らすために１以上の工程を行なう。いくつかの実施形態では、センサーを用いて、イソプレンの濃度が引火限度に近いかまたは引火限度内にあるときに検出する。所望により、イソプレンの濃度を、細胞培養期間中の１以上の時点で測定することができ、イソプレンの濃度が引火限度に近いかまたは引火限度内にある場合、標準的な方法を用いて、細胞培養条件および／または不活性ガスの量を調整することができる。特定の実施形態では、細胞培養条件（例えば、発酵条件）を調整して、イソプレンの濃度をＬＦＬ未満に減らすかまたはイソプレンの濃度をＵＦＬよりも大きく増加させる。いくつかの実施形態では、不活性ガスでイソプレン組成物を希釈することによって（例えば、イソプレン組成物をＬＦＬ未満に保つために不活性ガスを連続的にまたは定期的に添加することによって）イソプレンの量をＬＦＬ未満に保つ。

【0201】

いくつかの実施形態では、イソプレン以外の引火性揮発性物質（例えば、１以上の糖類）の量は、産出されるイソプレンの量よりも少なくとも約２、５、１０、５０、７５、または１００倍少ない。いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外の気相の部分は、約０％〜約１００％（体積）の酸素、例えば、約０％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約９０％〜約９０％、または約９０％〜約１００％（体積）の酸素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外の気相の部分は、約０％〜約９９％（体積）の窒素、例えば、約０％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約９０％〜約９０％、または約９０％〜約９９％（体積）の窒素を含む。

【0202】

いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外の気相の部分は、約１％〜約５０％（体積）のＣＯ_２、例えば、約１％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、または約４０％〜約５０％（体積）のＣＯ_２を含む。

【0203】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物はまた、エタノールを含む。例えば、エタノールをイソプレンの抽出蒸留に用いて、エタノールとイソプレンの両方を含む組成物（例えば、中間産物ストリーム）を生じさせてもよい。望ましくは、エタノールの量は、エタノールの引火限度外にある。エタノールのＬＯＣは約８.７体積％であり、エタノールのＬＦＬは、標準的な条件（例えば、約１気圧、約６０°Ｆ）で約３.３体積％である（ＮＦＰＡ ６９ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｎ Ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２００８年版、これは、特に、ＬＯＣ値、ＬＦＬ値、およびＵＦＬ値に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、イソプレンとエタノールを含む組成物は、エタノールの引火性混合物を得るために必要なＬＯＣ未満（例えば、約８.７％体積％未満）の存在下で産出される。イソプレンとエタノールを含む組成物が、エタノールの引火性混合物を得るために必要なＬＯＣよりも高い、またはエタノールの引火性混合物を得るために必要なおよそのＬＯＣの存在下で産出されるいくつかの実施形態では、エタノール濃度はＬＦＬ未満（例えば、約３.３体積％未満）である。

【0204】

様々な実施形態では、酸化体（例えば、酸素）の量は、系中の任意の燃料（例えば、イソプレンまたはエタノール）のＬＯＣ未満である。様々な実施形態では、酸化体（例えば、酸素）の量は、イソプレンまたはエタノールのＬＯＣの約６０、４０、３０、２０、１０、または５％未満である。様々な実施形態では、酸化体（例えば、酸素）の量は、少なくとも２、４、５、またはそれを上回る絶対百分率点（体積％）だけ、イソプレンまたはエタノールのＬＯＣよりも少ない。特定の実施形態では、酸素の量は、イソプレンまたはエタノールのＬＯＣよりも少なくとも２絶対百分率点（体積％）少ない（例えば、イソプレンのＬＯＣが９.５体積％であるとき、酸素濃度は７.５体積％未満である）。様々な実施形態では、燃料（例えば、イソプレンまたはエタノール）の量は、燃料のＬＦＬの２５、２０、１５、１０、もしくは５％未満または約２５、２０、１５、１０、もしくは５％である。

【0205】

揮発性炭化水素であるイソプレンの発酵による高効率産出および回収
イソプレンを産出する方法であって、ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、ｂ）イソプレンを産出することとを含む方法が提供されており、ここで、イソプレンの液相濃度は約２００ｍｇ／Ｌ未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、１７５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または２.５ｍｇ／Ｌのいずれか程度未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、０.１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、または１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ程度のいずれかである。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンは、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、液相濃度は、イソプレンの溶解限界未満である。

【0206】

本方法のいくつかの実施形態では、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１ｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜４０ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜４ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜２５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、２５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜５００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または５００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１０００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間程度のいずれかである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１.５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、２ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間程度のいずれかである。

【0207】

ヘンリー係数の値が低いことは、イソプレンを、低い注入速度（例えば、０.０１ｖｖｍ〜２ｖｖｍ）でのガスストリッピングにより発酵ブロスから回収することができることを意味する。いくつかの実施形態では、ガス注入速度は、０.１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、０.０１ｖｖｍ〜０.５ｖｖｍ、０.２ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、または０.５ｖｖｍ〜１ｖｖｍ程度のいずれかである。いくつかの実施形態では、ガス注入速度は、０.１ｖｖｍ、０.２５ｖｖｍ、０.５ｖｖｍ、０.７５ｖｖｍ、１ｖｖｍ、１.２５ｖｖｍ、１.５ｖｖｍ、１.７５ｖｖｍ、または２ｖｖｍ程度のいずれかである。いくつかの実施形態では、低い注入速度を、発酵操作の全期間、増殖期の間、または定常期の間、維持する。いくつかの実施形態では、低い注入速度を、１時間〜５時間、５時間〜１０時間、１０時間〜２０時間、２０時間〜３０時間、３０時間〜４０時間、４０時間〜５０時間、または５０時間〜６０時間のいずれか程度の間、維持する。より望ましいガス注入速度の下限は、水相がイソプレンで飽和するようになり、液体有機相が形成される時点によって規定される。これは、イソプレンの沸点（１気圧で３４.１℃）未満でしか起こり得ず、これより上で、液体イソプレン相が形成されることは決してない。イソプレンの沸点未満の温度では、液相の形成はイソプレンの水溶解度によって決定され、これは、２５℃で約６５０ｍｇ／Ｌである。液体イソプレン相の形成を避けることが極めて望ましいが、細胞が毒性効果を伴わずに液体イソプレンの存在に耐えることができるならば、これが絶対的に必要であるというわけではない。

【0208】

いくつかの実施形態では、酸素、ＣＯ_２、およびイソプレンは、「安全操作範囲のイソプレンの産出」という題の節に論じられている量または濃度のいずれかである。いくつかの実施形態では、完全に好気的な代謝を維持しながら、全ての酸素が細胞によって消費される。いくつかの実施形態では、細胞の酸素必要量を満たすために、過剰の酸素が用いられる。発生ガス中の望ましい酸素範囲は、２０％未満または１５％未満または１０％未満（ｖ／ｖ）である。イソプレンの燃焼に必要な限界酸素濃度未満の酸素レベル（１気圧で９．５％ｖ／ｖ）が特に望ましい。いくつかの実施形態では、細胞の酸素必要量を満たしながら、最低限のガス通過速度を可能にする目的で、酸素濃縮空気を利用する。いくつかの実施形態では、ガス移動層の気相の部分は、約０.１％〜約１０％、約１０％〜約２０％、または約２０％〜約３０％（体積）の酸素を含む。いくつかの実施形態では、液相中の所要の溶存酸素レベルを維持するために必要とされる余分な酸素量を最小限に抑えるために、イソプレン発酵を高圧下で行なう。

【0209】

いくつかの実施形態では、発酵槽全体のガス通過速度の低下は、そのような条件によって、細胞の生理機能に悪影響を及ぼすことなく、発生ガスイソプレンレベルが最大約３０，０００μｇ／Ｌ（約１％ｖ／ｖ）まで濃縮されるという点でイソプレン産出プロセスの統合に有利である。

【0210】

いくつかの実施形態では、ガス注入速度の低下は、細胞の生理機能にそれほど悪影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、ガス注入速度を低下させた場合の培養細胞の二酸化炭素発生速度は、１×１０^-１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間程度のいずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間程度のいずれかである。いくつかの実施形態では、ガス注入速度を低下させた場合の細胞生存性は、１.７５倍、１.５倍、１.２５倍、１倍、０.７５倍、０.５倍、または０.２５倍程度のいずれかより低くだけ低下する。いくつかの実施形態では、ガス注入速度を低下させた場合の細胞生存性は、約２倍だけ低下する。いくつかの実施形態では、ガス注入速度を低下させた場合の一以上の異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸からＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路のＲＮＡおよび／またはタンパク質を発現する細胞の細胞生存性は、、ガス注入速度を低下させた場合の異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路核酸の１つ以上を欠く対照細胞に匹敵する。いくつかの実施形態では、ガス注入速度を低下させた場合の、誘導性プロモーターの制御下にある異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸の１つ以上からＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路のＲＮＡおよび／またはタンパク質を発現する細胞（この場合、プロモーターは誘導されている）の細胞生存性は、、ガス注入速度を低下させた場合の、誘導性プロモーターの制御下にある異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸の１つ以上を含有する対照細胞（この場合、プロモーターは誘導されていない（未誘導である））に匹敵する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、β−ガラクトシダーゼプロモーターである。

【0211】

いくつかの実施形態では、生物によって消費される総炭素の少なくとも５％を揮発性の不飽和炭化水素に変換する遺伝子改変された宿主生物の発酵。いくつかの実施形態では、１００μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌ、１０００μｇ／Ｌ、２，５００μｇ／Ｌ、５，０００μｇ／Ｌ、７，５００μｇ／Ｌ、または１０，０００μｇ／Ｌのいずれかのレベル程度以上の発酵発生ガス中に存在するような割合での不飽和炭化水素の産出。

【0212】

いくつかの実施形態では、１００μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌ、１０００μｇ／Ｌ、２，５００μｇ／Ｌ、５，０００μｇ／Ｌ、７，５００μｇ／Ｌ、または１０，０００μｇ／Ｌのいずれか程度以上の発生ガス中の濃度に相当する、高率産出に相応しいやり方で、不飽和炭化水素を発生ガス流から回収する。いくつかの実施形態では、得られる発生ガスが目的の揮発性成分中に濃縮されるように、特に低いガス通過速度での発酵発生ガスからの不飽和炭化水素の連続的な抽出および回収。いくつかの実施形態では、揮発性物質の濃度の上昇に依存する方法による揮発性炭化水素の回収。例えば、圧縮／凝結技術または抽出蒸留技術の使用による発酵発生ガス中のイソプレン効率的な捕獲。シリカゲル吸着剤に加えた活性炭カートリッジの使用、炭素カートリッジからのイソプレンの解離および濃縮、および／またはグルコース基質の約５％またはそれより多くをイソプレンに変換し、約１５，０００μｇ／Ｌイソプレンを上回る発生ガス濃度を生じさせることができる宿主生物（例えば、大腸菌株）の構築および発酵も企図される。回収方法は、本明細書に記載の方法のいずれかを含む。

【0213】

また、化合物の産出方法が本明細書で提供され、ここで、この化合物は、（ａ）約２５０Ｍ／ａｔｍ未満のヘンリー則係数と（ｂ）約１００ｇ／Ｌ未満の水溶解度からなる群から選択される１以上の特徴を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）化合物の産出に好適な条件下で細胞を培養すること、ここで、ガスは約０.０１ｖｖｍ〜約２ｖｖｍのガス注入速度で添加される（例えば、発酵系などの系へのガスの添加）と、ｂ）化合物を産出することとを含む。

【0214】

いくつかの実施形態では、細胞質量に含まれるされる化合物の量は、液相溶解度値には含まれない。いくつかの実施形態では、液相濃度は化合物の溶解限界未満である。

【0215】

いくつかの実施形態では、化合物、特に、２５０Ｍ／ａｔｍ、２００Ｍ／ａｔｍ、１５０Ｍ／ａｔｍ、１００Ｍ／ａｔｍ、７５Ｍ／ａｔｍ、５０Ｍ／ａｔｍ、２５Ｍ／ａｔｍ、１０Ｍ／ａｔｍ、５Ｍ／ａｔｍ、または１Ｍ／ａｔｍ未満のいずれか程度のヘンリー則係数を有する化合物を、中から低ガス注入速度でのガスストリッピングによって発酵液体培地から連続的に回収することができる。例としては、アセトアルデヒド（１５Ｍ／ａｔｍ）などのアルデヒド、アセトン（３０Ｍ／ａｔｍ）もしくは２−ブタノン（２０Ｍ／ａｔｍ）などのケトン、またはメタノール（２２０Ｍ／ａｔｍ）、エタノール（２００Ｍ／ａｔｍ）、１−ブタノール（１２０Ｍ／ａｔｍ）もしくはＣ５アルコール（３−メチル−３−ブテン−１−オール、および３−メチル−２−ブテン−１−オールを含む）（５０〜１００Ｍ／ａｔｍ）をはじめとするアルコールが挙げられる。アルコールのエステルは、通常、それぞれのアルコールよりも低いヘンリー定数を有する（例えば、酢酸エチル（６〜９Ｍ／ａｔｍ）またはＣ５アルコールのアセチルエステル（＜５Ｍ／ａｔｍ））。１Ｍ／ａｔｍ未満のヘンリー則係数を有する化合物が特に望ましい。例としては、Ｃ１〜Ｃ５炭化水素（例えば、メタン、エタン、エチレン、またはプロピレン）などの他の炭化水素の他に、ヘミテルペン、モノテルペン、またはセスキテルペンが挙げられる。いくつかの実施形態では、炭化水素（例えば、Ｃ１〜Ｃ５炭化水素）は、飽和したもの、不飽和のもの、または分岐したものである。

【0216】

一般に、係数の極めて低い化合物が水に溶けにくい（実質的に水に溶けない）という点でヘンリー則係数と水溶解度の間には相関関係がある。水に無限に溶ける揮発性物質（例えば、アセトンまたはエタノール）をガスストリッピングによって除去することができるが、望ましい溶解限界は、１００ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌのいずれか程度未満である。

【0217】

上記の化合物のいずれかを産出する方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ガス注入速度は、およそ０.１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、０.２ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、または０.５ｖｖｍ〜１ｖｖｍのいずれかである。いくつかの実施形態では、ガス注入速度は、０.１ｖｖｍ、０.２５ｖｖｍ、０.５ｖｖｍ、０.７５ｖｖｍ、１ｖｖｍ、１.２５ｖｖｍ、１.５ｖｖｍ、１.７５ｖｖｍ、または２ｖｖｍのいずれか程度である。いくつかの実施形態では、低注入速度を、発酵操作の全期間、増殖期の間、または定常期の間、維持する。いくつかの実施形態では、低注入速度を、１時間〜５時間、５時間〜１０時間、１０時間〜２０時間、２０時間〜３０時間、３０時間〜４０時間、４０時間〜５０時間、または５０時間〜６０時間のいずれか程度の間、維持する。

【0218】

本明細書に記載の系はいずれも、上記の化合物を産出する方法において使用することができる。「例示的な精製方法」と題された節に記載されているような標準的な方法を用いて、精製することができる。例えば、蒸留または選択的吸着技術によって、回収後に分離を行なうことができる。

【0219】

イソプレンの例示的な産出
いくつかの実施形態では、細胞を、細胞によるイソプレンの産出を可能にする条件下で培養培地中で培養する。

【0220】

「ピーク絶対生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）発生ガス中のイソプレンの最大絶対量を意味する。「ピーク絶対生産性時点」とは、発生ガス中のイソプレンの絶対量が、特定の時間、細胞を培養したときに（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときに）最大となる発酵操作中の時点を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレン量をピーク絶対生産性時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク絶対生産性は、本明細書に開示されたイソプレン量のいずれか程度である。

【0221】

「ピーク比生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）細胞当たりに産出されるイソプレンの最大量を意味する。「ピーク比生産性時点」とは、細胞当たりに産出されるイソプレンの量が最大になる、特定の時間細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）時点を意味する。ピーク比生産性は、総生産性を６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ_６００）により求められる細胞の量で割ることにより求められる。いくつかの実施形態では、イソプレン量をピーク比生産性時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク比生産性は、本明細書に開示された細胞当たりのイソプレン量のいずれか程度である。

【0222】

「ピーク容積生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）液体培地（細胞と細胞培地の容積を含む）の容積当たりに産出されるイソプレンの最大量を意味する。「ピーク比容積生産性時点」とは、液体培地の容積当たりに産出されるイソプレンの量が最大になる、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）時点を意味する。ピーク比容積生産性は、総生産性を液体培地の容積と時間とで割ることにより求められる。いくつかの実施形態では、イソプレン量をピーク比容積生産性時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク比容積生産性は、本明細書に開示された時間当たり容積当たりのイソプレン量のいずれか程度である。

【0223】

「ピーク濃度」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）産出されるイソプレンの最大量を意味する。「ピーク濃度時点」とは、細胞当たりに産出されるイソプレンの量が最大になる、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）時点を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレン量をピーク濃度時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク濃度は、本明細書に開示されたイソプレン量のいずれか程度である。

【0224】

「平均容積生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）液体培地（細胞と細胞培地の容積を含む）の容積当たりに産出されるイソプレンの平均量を意味する。平均容積生産性は、総生産性を液体培地の容積と時間とで割ることにより求められる。いくつかの実施形態では、細胞の平均比容積生産性は、本明細書に開示された時間当たり容積当たりのイソプレン量のいずれか程度である。

【0225】

「累計生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）産出されるイソプレンの累積総量を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンの累積総量を測定する。いくつかの実施形態では、細胞の累計生産性は、本明細書に開示されたイソプレン量のいずれか程度である。

【0226】

「相対検出器応答」とは、ある化合物（例えば、イソプレン）の検出器応答（例えば、ＧＣ／ＭＳ面積）と１以上の化合物（例えば、全てのＣ５炭化水素）の検出器応答（例えば、ＧＣ／ＭＳ面積）の比を指す。検出器応答を、本明細書に記載の通りに、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×２５０μｍ；０．２５μｍ膜厚）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣ／ＭＳシステムで実施されるＧＣ／ＭＳ分析により、測定してもよい。所望により、相対検出器応答を、各々の化合物の応答係数を用いて重量パーセントに換算することができる。この応答係数は、シグナルが所与の量の特定の化合物についてどの程度発生するか（すなわち、検出器が特定の化合物に対してどの程度の感度を有するか）という尺度である。検出器が比較されている化合物に対して様々な感度を有する場合は、この応答係数を、相対検出器応答を重量パーセントに換算するための相関係数として用いることができる。あるいは、比較されている化合物について応答係数が同じであると仮定して、重量パーセントを概算することができる。したがって、重量パーセントを相対検出器応答とほぼ同じものであると仮定することができる。

【0227】

いくつかの実施形態では、培養細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ、もしくはそれより多くを超えるかまたは約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ、もしくはそれより多くのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間である。

【0228】

ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間という単位で表されるイソプレンの量を、米国特許第５，８４９，９７０号（これは、特に、イソプレン産出の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように測定することができる。例えば、２ｍＬのヘッドスペース（例えば、２００ｒｐｍで約３時間振盪しながら、密封バイアル中、３２℃で培養された２ｍＬの培養物などの培養物のヘッドスペース）を、標準的なガスクロマトグラフィーシステム、例えば、等温（８５℃）で操作され、ｎ−オクタン／ｐｏｒａｓｉｌ Ｃカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．）を備え、ＲＧＤ２酸化水銀還元ガス検出器に接続されているシステムを用いて、イソプレンについて分析する（Ｔｒａｃｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ａｔｍｏｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．２７Ａ：２６８９−２６９２，１９９３；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１５８８−１５９１，１９９１を参照されたく、これらは各々、特に、イソプレン産出の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ガスクロマトグラフィーの面積単位を、標準イソプレン濃度検量線を用いてｎｍｏｌイソプレンに換算する。いくつかの実施形態では、細胞の湿重量を表す細胞のグラム数は、細胞培養物のサンプルについてのＡ_６００値を取得し、次に、このＡ_６００値を、既知のＡ_６００値を有する細胞培養物についての湿重量の検量線に基づいて細胞のグラムに換算することにより算出される。いくつかの実施形態では、細胞のグラムは、Ａ_６００値が１の１リットル液体培地（細胞培地と細胞を含む）に１グラムの湿細胞重量が含まれると仮定することにより推定される。また、この値を、培養物をインキュベートした時間（例えば、３時間）で割り算する。

【0229】

いくつかの実施形態では、培養細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇ、もしくはそれより多くを超えるかまたは約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、または約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ、または約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈである。ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈで示されるイソプレンの量を、上で論じたｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間という単位で表されるイソプレン産出値に（下記の方程式５に記載したように）６８.１を掛けることで算出することができる。」

【0230】

いくつかの実施形態では、培養細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多くを超えるかまたは約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／液体培地のＬ（ｍｇ／Ｌ_液体培地、ここで、液体培地の容積は、細胞と細胞培地の容積を含む）累積力価（総量）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地である。

【0231】

イソプレンのｍｇ／振盪フラスコ培養または同様の培養のヘッドスペースのＬで表されるイソプレンの比生産性は、（例えば、実施例Ｉ、第ＩＩ部に記載されているように）ＯＤ_６００の値が約１．０の細胞培養物から１ｍｌサンプルを採取し、それを２０ｍＬバイアルに入れ、３０分間インキュベートした後、ヘッドスペース中のイソプレンの量を測定することによって測定することができる。ＯＤ_６００の値が１．０でない場合は、ＯＤ_６００の値で割ることにより、測定値を１．０のＯＤ_６００の値に標準化することができる。ｍｇイソプレン／Ｌヘッドスペースの値は、３８という係数を掛けることにより、ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間／培養液体培地のＯＤ_６００に換算することができる。ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間／ＯＤ_６００という単位で表される値に時間数とＯＤ_６００の値を掛けることにより、イソプレンのｍｇ／液体培地のＬという単位で表される累積力価を得ることができる。

【0232】

いくつかの実施形態では、培養細胞は、０.１、１.０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００ｍｇ、もしくはそれより多くを超えるかまたは約０.１、１.０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００ｍｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／液体培地のＬ／時間（ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、ここで、液体培地の容積は、細胞と細胞培地の容積を含む）イソプレンの平均容積生産性を有する。いくつかの実施形態では、イソプレンの平均容積生産性は、約０．１〜約３，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、例えば、約０．１〜約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１，０００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１，５００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２，０００〜約２，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、または約３，０００〜約３，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間である。いくつかの実施形態では、イソプレンの平均容積生産性は、約１０〜約３，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００〜約３，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１，０００〜約３，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、または約１，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間である。

【0233】

いくつかの実施形態では、培養細胞は、０.５、１.０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，７５０、４，０００、４，２５０、４，５００、４，７５０、５，０００、５，２５０、５，５００、５，７５０、６，０００、６，２５０、６，５００、６，７５０、７，０００、７，２５０、７，５００、７，７５０、８，０００、８，２５０、８，５００、８，７５０、９，０００、９，２５０、９，５００、９，７５０、１０，０００、１２，５００、１５，０００ｍｇ、もしくはそれより多くを超えるかまたは約０.５、１.０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，７５０、４，０００、４，２５０、４，５００、４，７５０、５，０００、５，２５０、５，５００、５，７５０、６，０００、６，２５０、６，５００、６，７５０、７，０００、７，２５０、７，５００、７，７５０、８，０００、８，２５０、８，５００、８，７５０、９，０００、９，２５０、９，５００、９，７５０、１０，０００、１２，５００、１５，０００ｍｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／液体培地のＬ／時間（ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、ここで、液体培地の容積は、細胞と細胞培地の容積を含む）のイソプレンのピーク容積生産性を有する。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク容積生産性は、約０．５〜約１５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、例えば、約０．５〜約１０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１．０〜約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１，０００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１，５００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２，０００〜約２，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約３，０００〜約３，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約３，５００〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５，０００〜約７，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約７，５００〜約１０，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０，０００〜約１２，５００ｍｇ／Ｌ液体培地／時間、または約１２，５００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間である。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク容積生産性は、約１０〜約１５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００〜約２，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２，５００〜約７，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５，０００〜約１０，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約７，５００〜約１２，５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、または約１０，０００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間である。

【0234】

ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間で表される発酵槽における瞬間イソプレン産出速度は、発酵槽発生ガスのサンプルを採取し、それを、例えば、実施例Ｉ、第ＩＩ部に記載されているように、イソプレンの量（イソプレンのｍｇ／Ｌ_ガスなどの単位で表される）について分析し、この値に、液体培地１リットルごとにオフガスが通過する速度（例えば、１ｖｖｍ（空気の容積／液体培地の容積／分）、これは、６０Ｌ_ガス／時間である）を掛けることにより測定することができる。したがって、１ｍｇ／Ｌ_ガスの発生ガスレベルは、１ｖｖｍの空気流量における６０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間の瞬間産出速度に相当する。所望により、ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間という単位で表される値をＯＤ_６００の値で割って、ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間／ＯＤという単位で表される比速度を得ることができる。ｍｇイソプレン／Ｌ_ガスの平均値は、この平均発生ガスイソプレン濃度に発酵中に発酵液体培地１リットルから放出された発生ガスの総量を掛けることにより、総産物生産性（発酵液体培地１リットル当たりのイソプレンのグラム、ｍｇ／Ｌ_液体培地）に換算することができる。したがって、１ｖｖｍで１０時間の０.５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間の平均発生ガスイソプレン濃度は、３００ｍｇイソプレン／Ｌ_液体培地の総産物濃度に相当する。

【0235】

いくつかの実施形態では、培養細胞は、細胞培養培地中の炭素の０.００１５、０.００２、０.００５、０.０１、０.０２、０.０５、０.１、０.１２、０.１４、０.１６、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.２、１.４、１.６、１.８、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、５.０、６.０、７.０、もしくは８.０％超または約０.００１５、０.００２、０.００５、０.０１、０.０２、０.０５、０.１、０.１２、０.１４、０.１６、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.２、１.４、１.６、１.８、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、５.０、６.０、７.０、もしくは８.０％をイソプレンに変換する。いくつかの実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は、例えば、約０．００２〜約４．０％、約０．００２〜約３．０％、約０．００２〜約２．０％、約０．００２〜約１．６％、約０．００２〜約０．００５％、約０．００５〜約０．０１％、約０．０１〜約０．０５％、約０．０５〜約０．１５％、０．１５〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．５％、約０．５〜約０．８％、約０．８〜約１．０％、または約１．０〜約１．６％である。いくつかの実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は、約０．００２〜約０．４％、０．００２〜約０．１６％、０．０４〜約０．１６％、約０．００５〜約０．３％、約０．０１〜約０．３％、または約０．０５〜約０．３％である。

【0236】

炭素のイソプレンへの変換パーセント（「炭素収率％」とも呼ぶ）は、産出されたイソプレン中の炭素モル数を炭素源中の炭素モル数（例えば、バッチで供給されたグルコースおよび酵母抽出物中の炭素モル数）で割ることにより測定することができる。（方程式１に示すように）この数字に１００％を掛けると、パーセントの値が得られる。
方程式１

【数1】

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【0237】

この計算では、酵母抽出物は、５０％ｗ／ｗ炭素を含有すると仮定することができる。一例として、実施例７、第ＶＩＩＩ部に記載されている５００リットルの場合、炭素のイソプレンへの変換パーセントは、方程式２に示すように計算される。
方程式２

【数2】

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【0238】

本明細書に記載の２例の５００リットル発酵（実施例７、第ＶＩＩ部および第ＶＩＩＩ部）では、炭素のイソプレンへの変換パーセントは、０．０４〜０．０６％であった。本明細書に記載の１４リットルの系を用いて０．１１〜０．１６％の炭素収率が達成されている。実施例１１、第Ｖ部には、本明細書に記載の方法を用いて、炭素の１．５３％がイソプレンに変換されたことが記載されている。

【0239】

当業者であれば、イソプレンの産出速度または産出されたイソプレンの量を任意の他の単位に容易に変換することができる。以下に、単位間で相互変換するための例示的な方程式を記載する。

【0240】

イソプレン産出速度の単位（全体および比）
方程式３

【数3】

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【0241】

方程式４

【数4】

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【0242】

方程式５

【数5】

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【0243】

方程式６

【数6】

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【0244】

方程式７

【数7】

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【0245】

力価の単位（全体および比）
方程式８

【数8】

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【0246】

方程式９

【数9】

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【0247】

所望により、方程式１０を用いて、細胞の湿重量を含む単位のいずれかを細胞の乾燥重量を含む対応する単位に変換することができる。

【0248】

方程式１０

【数10】

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【0249】

所望により、方程式１１を用いて、単位ｐｐｍとμｇ／Ｌを変換することができる。特に、「ｐｐｍ」は、μｇ／ｇ（ｗ／ｗ）で定義される百万分率を意味する。ガスの濃度は、μＬ／Ｌ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で定義される「ｐｐｍｖ」（容積による百万分率）を用いて容積ベースで表すこともできる。発生ガス１Ｌ当たりの質量（すなわち、ガスの密度）を測定することにより、μｇ／Ｌのｐｐｍへの変換（例えば、ガス１ｇ当たりの分析物のμｇ）を行なうことができる。例えば、標準的な温度および圧力（ＳＴＰ；１０１．３ｋＰａ（１ｂａｒ）および２７３．１５Ｋ）の空気の１リットルは、約１．２９ｇ／Ｌの密度を有する。したがって、１ｐｐｍ（μｇ／ｇ）の濃度は、ＳＴＰにおいて１．２９μｇ／Ｌに等しい（方程式１１）。ｐｐｍ（μｇ／ｇ）のμｇ／Ｌへの変換は、圧力と温度と発生ガスの全組成の関数である。

【0250】

方程式１１

【数11】

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【0251】

一般ガス法則（方程式１２）を用いて、μｇ／Ｌのｐｐｍｖ（例えば、ガス１ｇ当たりの分析物のμＬ）への変換を行なうことができる。例えば、１０００μｇ／Ｌ_ガスの発生ガス濃度は、１４．７μｍｏｌ／Ｌ_ガスに相当する。一般ガス定数は、０．０８２０５７Ｌ．ａｔｍ Ｋ^−１ｍｏｌ^−１であるので、方程式１２を用いると、ＳＴＰにおいて１４．７μｍｏｌのＨＧが占める容積は０．３２９ｍＬに等しい。したがって、１０００μｇ／ＬのＨＧの濃度は、ＳＴＰにおいて３２９ｐｐｍｖまたは０．０３２９％（ｖ／ｖ）に等しい。

【0252】

方程式１２

【数12】

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【0253】

イソプレン組成物中の不純物の量は、本明細書では通常、μｇ／Ｌなどの単位で表される重量／容積（ｗ／ｖ）ベースで測定される。所望により、μｇ／Ｌという単位の測定値を方程式１３を用いてｍｇ／ｍ^３という単位に変換することができる。

【0254】

方程式１３

【数13】

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【0255】

本発明によって包含されるいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含まない本質的に同じ条件下で増殖した対応する細胞から産出されるイソプレンの量よりも少なくともまたは約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、またはそれを上回る量のイソプレンを産出する。

【0256】

本発明によって包含されるいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸とＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸とを含む細胞は、異種核酸を含まない本質的に同じ条件下で増殖した対応する細胞から産出されるイソプレンの量よりも少なくともまたは約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、またはそれを上回る量のイソプレンを産出する。

【0257】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、９９.９０、９９.９１、９９.９２、９９.９３、９９.９４、９９.９５、９９.９６、９９.９７、９９.９８、９９.９９、もしくは１００％超または約９９.９０、９９.９１、９９.９２、９９.９３、９９.９４、９９.９５、９９.９６、９９.９７、９９.９８、９９.９９、もしくは１００％のイソプレンの相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９９.９０〜約９９.９２、約９９.９２〜約９９.９４、約９９.９４〜約９９.９６、約９９.９６〜約９９.９８、約９９.９８〜１００重量％のイソプレンを含む。

【0258】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１重量％未満または約０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１％未満または約０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１％のイソプレン以外のＣ５炭化水素の相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１％未満または約０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１％の１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インの相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約０．０２〜約０．０４％、約０．０４〜約０．０６％、約０.０６〜０.０８％、約０.０８〜０.１０％、または約０．１０〜約０．１２重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。

【0259】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌの化合物を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約０.００５〜約５０、例えば、約０.０１〜約１０、約０.０１〜約５、約０.０１〜約１、約０.０１〜約０.５、または約０.０１〜約０.００５μｇ／Ｌの化合物を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌのイソプレン以外の炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約０.００５〜約５０、例えば、約０.０１〜約１０、約０.０１〜約５、約０.０１〜約１、約０.０１〜約０.５、または約０.０１〜約０.００５μｇ／Ｌのイソプレン以外の炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌのタンパク質または脂肪酸（例えば、天然ゴムと天然に関連しているタンパク質または脂肪酸）を含む。

【0260】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、１０、５、１、０.８、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍ未満または約１０、５、１、０.８、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍのα−アセチレン、ピペリレン、アセトニトリル、または１，３−シクロペンタジエンを含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍ未満または約５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍの硫黄またはアレンを含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、３０、２０、１５、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍ未満または約３０、２０、１５、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍの全アセチレン（例えば、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、ｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン、ペンチン−１、ブチン−２、２ＭＢ１−３イン、および１−ペンチン−４イン）を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、２０００、１０００、５００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍ未満または約２０００、１０００、５００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍのイソプレン二量体、例えば、環状イソプレン二量体（例えば、２つのイソプレン単位の二量体化から得られる環状Ｃ１０化合物）を含む。

【0261】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、エタノール、アセトンＣ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。特定の実施形態では、イソプレン組成物は、０.００５、０.０１、０.０５、０.１、０.５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌ超または約０.００５、０.０１、０.０５、０.１、０.５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌのエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約０.００５〜約１２０、例えば、約０.０１〜約８０、約０.０１〜約６０、約０.０１〜約４０、約０.０１〜約３０、約０.０１〜約２０、約０.０１〜約１０、約０.１〜約８０、約０.１〜約６０、約０.１〜約４０、約５〜約８０、約５〜約６０、または約５〜約４０μｇ／Ｌのエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。

【0262】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、以下の成分：２-ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセテート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセテート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセテート、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、または線状イソプレンポリマー（例えば、複数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）のうちの１つまたは複数を含む。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの成分の１つの量は、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）超または約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）である。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの成分の１つの量は、約０.０１〜約１０５％（ｗ／ｗ）、例えば、約０.０１〜約９０、約０.０１〜約８０、約０.０１〜約５０、約０.０１〜約２０、約０.０１〜約１０、約０.０２〜約５０、約０.０５〜約５０、約０.１〜約５０、または０.１〜約２０％（ｗ／ｗ）である。

【0263】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、以下のもの：アルコール、アルデヒド、エステル、またはケトン（例えば、本明細書に記載のアルコール、アルデヒド、エステル、またはケトンのいずれか）のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。

【0264】

いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、以下のもの：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドールのうちの１つまたは複数を含有する。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、１ｐｐｍまたはそれより多くの以下のうちの１つまたは複数を含有する：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。いくつかの実施形態では、以下のもの：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドールのうちの１つまたは複数よりも多くの濃度は、イソプレン組成物中（例えば、精製される前の発生ガス）約１〜約１０，０００ｐｐｍである。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物（例えば、１以上の精製工程を経た後の発生ガス）は、以下のもの：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドールのうちの１つまたは複数を、約１〜約１００ｐｐｍ、例えば、約１〜約１０ｐｐｍ、約１０〜約２０ｐｐｍ、約２０〜約３０ｐｐｍ、約３０〜約４０ｐｐｍ、約４０〜約５０ｐｐｍ、約５０〜約６０ｐｐｍ、約６０〜約７０ｐｐｍ、約７０〜約８０ｐｐｍ、約８０〜約９０ｐｐｍ、または約９０〜約１００ｐｐｍの濃度で含む。細胞培養物由来の揮発性有機化合物（例えば、細胞培養物のヘッドスペース中の揮発性有機化合物）を、本明細書に記載した方法のなどの標準的な方法またはプロトン転移反応−マススペクトロメトリーなどの他の標準的な方法を用いて分析することができる（例えば、Ｂｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７４（７）：２１７９−２１８６，２００８を参照されたく、これは、特に、揮発性有機化合物の分析に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0265】

いくつかの実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレン、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｍｇ超または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｍｇのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇ超または約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のイソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ、例えば、約２〜約１００ｍｇ、約１００〜約５００ｍｇ、約５００〜約１，０００ｍｇ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ、または約２，０００〜約５，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、組成物中のイソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ、約１００〜約５，０００ｍｇ、約２００〜約２，０００ｍｇ、約２００〜約１，０００ｍｇ、約３００〜約１，０００ｍｇ、または約４００〜約１，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、組成物の揮発性有機画分の２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは９５重量％超または約２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは９５重量％がイソプレンである。

【0266】

いくつかの実施形態では、組成物はエタノールを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約７５〜約９０重量％のエタノール、例えば、約７５〜約８０％、約８０〜約８５％、または約８５〜約９０重量％のエタノールを含む。組成物がエタノールを含むいくつかの実施形態では、組成物は、約４〜約１５重量％のイソプレン、例えば、約４〜約８％、約８〜約１２％、または約１２〜約１５重量％のイソプレンも含む。

【0267】

本発明によって包含されるいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む細胞は、１以上の異種核酸を含まない本質的に同じ条件下で増殖した対応する細胞から産出されるイソプレノイド化合物の量よりも２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、もしくはそれより多くを超えるかまたは約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、もしくはそれより多くの量のイソプレノイド化合物（例えば、１以上のＩＰＰ分子と１以上のＤＭＡＰＰ分子との反応から形成される１０個またはそれより多くの炭素原子を含む化合物）を産出する。本発明によって包含されるいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む細胞は、１以上の異種核酸を含まない本質的に同じ条件下で増殖した対応する細胞から産出されるＣ５プレニルアルコールの量よりも２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、もしくはそれより多くを超えるかまたは約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、もしくはそれより多くの量のＣ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールまたは３−メチル−２−ブテン−１−オール）を産出する。

【0268】

イソプレンと水素の例示的な同時生成
いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結された、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む本明細書に記載のイソプレン産出細胞はいずれも、１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドまたはヒドロゲナーゼポリペプチドの調節または発現に関与する１以上のポリペプチド（例えば、ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質または転写因子）をコードする同様にプロモーターに機能的に連結された異種核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結された、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドまたはヒドロゲナーゼポリペプチドの調節または発現に関与する１以上のポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む本明細書に記載のイソプレン産出細胞はいずれも、発酵副産物の産出に関与する１以上のポリペプチド、発酵副産物の産出に関する遺伝子の調節または発現に関与する１以上のポリペプチド、または水素再取込みに関与する１以上のポリペプチドを不活化する突然変異または欠失をさらに含む。このような細胞は、イソプレンと水素を同時に生成することができる。

【0269】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陽性細菌細胞（例えば、枯草菌細胞などのバシルス細胞またはストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、もしくはストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞などのストレプトミセス細胞）などの細菌細胞である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陰性細菌細胞（例えば、大腸菌細胞などのエシェリキア細胞、ロドシュードモナス・パルストリス細胞などのロドシュードモナス属の種、シュードモナス・フルオレセンス細胞またはシュードモナス・プチダ細胞などのシュードモナス属の種、またはパントエア・シトレア細胞などのパントエア細胞）である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、糸状真菌細胞（例えば、トリコデルマ・リーゼイ細胞などのトリコデルマ細胞もしくはアスペルギルス・オリザエおよびアスペルギルス・ニゲルなどのアスペルギルス細胞）または酵母細胞（例えば、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞またはサッカロミセス・セレビシエなどのサッカロミセス細胞）などの真菌細胞である。

【0270】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（例えば、タイワンクズもしくはクズ）またはポプラ属（例えば、アメリカヤマナラシ、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシ、ブラックコットンウッド、もしくは交配種であるウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）植物由来のポリペプチドである。

【0271】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする１以上の核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つのベクターが、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、選択マーカーまたは選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性核酸）を含む。

【0272】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、サッカロマイセス・セレビシエまたはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、サッカロマイセス。セレビシエまたはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、およびＭＶＡ経路核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、およびＭＶＡ経路核酸を含む。

【0273】

いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス属由来のものである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス・フェカーリス由来のものである。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；および（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、ＭＶＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ属に由来するものである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ・マゼイに由来するものである。

【0274】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、プロモーターに機能的に連結された、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（Ｈｙｄ−１）、大腸菌ヒドロゲナーゼ−２（Ｈｙｄ−２）、大腸菌ヒドロゲナーゼ−３（Ｈｙｄ−３）、大腸菌ヒドロゲナーゼ−４（Ｈｙｄ−４）、大腸菌ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体（これは、酸性ｐＨ、嫌気性条件下で、ギ酸とＣＯ_２から水素ガスを産出させる）、ロドコックス・オパクスＭＲ１１ヒドロゲナーゼ（Ｒ．オパクス ＨｏｘＨ）、シネコシスティス属の種ＰＣＣ ６８０３ヒドロゲナーゼ（Ｓｙｎ．ＰＣＣ ６８０３ ＨｏｘＨ）、デスルフォビブリオ・ギガスヒドロゲナーゼ（Ｄ．ギガス）、およびデスルホビブリオ・デスルフリカンスＡＴＣＣ ７７５７ヒドロゲナーゼ（Ｄ．デスルフリカンス）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結されたヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含むイソプレン産出細胞はさらに、大腸菌ヒドロゲナーゼ−３（Ｈｙｄ−３）、大腸菌ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）、および大腸菌ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体を含む。

【0275】

いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドは、クロストリジウム・アセトブツリクムヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）を含み、これは、以下のもの：（１）枯草菌ＮＡＤＰＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＮＦＯＲ）もしくはクロストリジウム・クルイベリＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＲｎｆＣＤＧＥＡＢ）、クロストリジウム・パスツラニヌムフェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｆｄｘ）；（２）グリセルアルデヒド−６−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）；または（３）ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）のうちの１つまたは複数とともに発現させることができる。いくつかの実施形態では、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドクロストリジウム・アセトブツリクムヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）を３つのＨｙｄＡ関連成熟酵素（ＨｙｄＥ、ＨｙｄＧおよびＨｙｄＦ）とともに、またさらに以下のもの：（１）枯草菌ＮＡＤＰＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＮＦＯＲ）もしくはクロストリジウム・クルイベリＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＲｎｆＣＤＧＥＡＢ）、クロストリジウム・パスツラニヌムフェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｆｄｘ）；（２）グリセルアルデヒド−６−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）；または（３）ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）のうちの１つまたは複数とともに発現させる。

【0276】

いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドは、ピロコックス・フリオススヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、酸素耐性ヒドロゲナーゼをコードする。いくつかの実施形態では、酸素耐性ヒドロゲナーゼは、ルブリビバクス・ゲラチノーススヒドロゲナーゼ、およびラルストニア・ユートロファヒドロゲナーゼを含む。

【0277】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、鉄−硫黄錯体転写調節因子（ｉｓｃＲ）などの、ヒドロゲナーゼ活性の調節に関与する遺伝子を不活化する突然変異または欠失を含む（Ｋａｌｉｍ−Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃＲ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｆｅ／Ｆｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｈ_２−ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３），” Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８：８５３−８６２（２００８）、これは、特に、ｉｓｃＲ遺伝子を欠失させることによるクロストリジウムＦｅ／Ｆｅヒドロゲナーゼ活性の刺激および大腸菌における水素蓄積に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0278】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、乳酸、酢酸、ピルビン酸、エタノール、コハク酸、およびグリセロールなどの発酵副産物の産出に関与する１以上の細胞ポリペプチドをコードする遺伝子を不活化する突然変異または欠失を含む。いくつかの実施形態では、発酵副産物の産出に関与する不活化ポリペプチドは、ギ酸デヒドロゲナーゼＮ、αサブユニット（ｆｄｎＧ）、ギ酸デヒドロゲナーゼＯ、大サブユニット（ｆｄｏＧ）、硝酸レダクターゼ（ｎａｒＧ）、ギ酸輸送体Ａ（ｆｏｃＡ）、ギ酸輸送体Ｂ（ｆｏｃＢ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分ａｃｋＡ／ｐｔａ（ａｃｅＥ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、フマル酸レダクターゼ膜タンパク質（ｆｒｄＣ）、または乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードする１以上のポリペプチドを含む。

【0279】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、発酵副産物の産出に関与する遺伝子の調節または発現に関与する１以上の細胞ポリペプチドをコードする遺伝子を不活化する突然変異または欠失を含む。いくつかの実施形態では、発酵副産物の産出に関与する遺伝子の調節または発現に関与する不活化ポリペプチドは、ギ酸水素リアーゼ（ｈｙｃＡ）、フマル酸レダクターゼ調節因子（ｆｎｒ）、アセチル−補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、およびギ酸デヒドロゲナーゼ調節タンパク質（ｈｙｃＡ）の抑制因子を含む。

【0280】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、水素再取込みに関与する１以上の細胞ポリペプチドをコードする遺伝子を不活化する突然変異または欠失を含む。いくつかの実施形態では、水素再取込みに関与する不活化ポリペプチドは、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（Ｈｙｄ−１）（ｈｙａオペロン）および大腸菌ヒドロゲナーゼ−２（Ｈｙｄ−２）（ｈｙｂオペロン）を含む。

【0281】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドまたは核酸は、Ｔ７プロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴ７プロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｔｒｃプロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴｒｃプロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｌａｃプロモーター（例えば、低コピープラスミドに含まれるＬａｃプロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、内在性プロモーター（例えば、内在性アルカリ性セリンプロテアーゼプロモーター）に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、選択マーカーを伴わずにまたは選択可能マーカーを伴わずに、細胞のゲノムに組み込まれる。

【0282】

いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、増殖期よりも定常期に活性の高いプロモーターまたは因子の制御下に置かれている。例えば、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、定常期σ因子（例えば、ＲｐｏＳ）の制御下に置かれていてもよい。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、定常期に誘導可能なプロモーター（例えば、定常期に活性のある応答調節因子によって誘導可能なプロモーター）の制御下に置かれている。

【0283】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５回、またはそれより多くの細胞分裂の間、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を維持する。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸を含む核酸はまた、選択マーカーまたは選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性核酸）を含む。

【0284】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンと水素を同時に生成する細胞を、細胞によるイソプレンと水素の同時生成を促進する酸素制限条件下で、本明細書に記載の培養培地のいずれかにおいて培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、イソプレン１モル当たり０．５モルの酸素の存在下で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0285】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも酸素制限培養で増殖し、イソプレンと水素を同時に生成する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．５×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、および約１×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、またはそれより多くを超えるイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１２５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、および約１．００×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１２５、２５０、５００、７５０、１０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、１０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、またはそれより多くを超える水素を産出する。

【0286】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも酸素制限培養で増殖し、イソプレンと水素を同時に生成する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素のピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約３０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素のピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素のピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間の水素の平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２５０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、および約２５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．０１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約０．２５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約０．５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、および約２．５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間の水素の平均容積生産性とを有する。

【0287】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも酸素制限培養で増殖し、イソプレンと水素を同時に生成する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約４００モルパーセント超に等しい水素を産出する。

【0288】

いくつかの実施形態では、イソプレンと水素を同時に生成する本明細書に記載の細胞をいずれかを酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、水素３モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンから水素４モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンの比率でイソプレンと水素を同時に生成する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、１〜１１モルパーセントのイソプレンと、３〜３３モルパーセントの水素とを産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、１〜１１モルパーセントのイソプレンと、４〜４４モルパーセントの水素とを産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、酸素、二酸化炭素、または窒素も産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、０〜２１モルパーセントの酸素と、１８〜４４モルパーセントの二酸化炭素と、０〜７８モルパーセントの窒素とを産出する。

【0289】

別の態様では、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞であって、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞を本明細書で提供し、ここで、細胞は、（ｉ）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る速度で水素を産出するか、（ｉｉ）約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有するか、または（ｉｉｉ）細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を同時に生成することができる。

【0290】

いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンと、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る水素とを産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超を水素に変換する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。

【0291】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．５×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、および 約１×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１２５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、および 約１．００×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。

【0292】

いくつかの実施形態では、イソプレンと水素を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞は、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。

【0293】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．５×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、および約１×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１２５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、および約１．００×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。

【0294】

いくつかの実施形態では、イソプレンと水素を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限条件下で増殖させる。

【0295】

いくつかの実施形態では、イソプレンと水素を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限条件下で増殖させる。

【0296】

いくつかの実施形態では、水素３モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンから水素４モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンの比率のイソプレンおよび水素と、０．１モルパーセントまたはそれ未満の揮発性不純物とを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１〜１１モルパーセントのイソプレンと、４〜４４モルパーセントの水素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、酸素、二酸化炭素、または窒素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、０〜２１モルパーセントの酸素、１８〜４４モルパーセントの二酸化炭素、および０〜７８モルパーセントの窒素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性不純物を含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセテート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセテート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセテート、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセテート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）およびシトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）または線状イソプレンポリマー（例えば、多数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：イソプレン組成物は、以下のうちの１または複数を含む：アルコール、アルデヒド、エステル、またはケトン（例えば、本明細書に記載のアルコール、アルデヒド、エステルまたはケトンのいずれか）。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。

【0297】

また、イソプレンと水素を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、酸素制限培養された細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、細胞の水素発生速度は、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間を上回る。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限条件下で増殖させる。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、水素発生速度は、０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、および約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度である。

【0298】

また、イソプレンと水素を同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、イソプレンの液相濃度は、約２００ｍｇ／ｍＬ未満であり、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の水素発生速度は、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限条件下で増殖させる。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、１７５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または２．５ｍｇ／Ｌのいずれか程度未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、または１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌのいずれか程度である。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、水素発生速度は、０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、および約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度である。

【0299】

一態様では、イソプレンと水素を同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、本発明は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンと、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る水素を産出する酸素制限培養された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１以上の炭素源を含む培養培地中で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0300】

いくつかの実施形態では、細胞培養培地中の炭素の約０．００２％超をイソプレンに変換し、細胞培養培地中の炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１以上の炭素源を含む培養培地中で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0301】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１以上の炭素源を含む培養培地中で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0302】

一態様では、イソプレンを別の化合物とともに同時に生成する方法、例えば、本明細書に記載の細胞のいずれかを用いてイソプレンと水素を同時に生成する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンと約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回る水素を産出するのに十分な酸素制限条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞によって産出されたイソプレンと水素を回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、細胞によって産出されたイソプレンと水素を精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１以上の炭素源を含む培養培地中で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の２倍以上よりも多いかまたは約２倍以上である。

【0303】

いくつかの実施形態では、本方法は、細胞培養培地の炭素（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の約０．００２％超をイソプレンに変換し、細胞培養培地中の炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出するのに十分な酸素制限条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞によって産出されたイソプレンと水素を回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、細胞によって産出されたイソプレンと水素を精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１以上の炭素源を含む培養培地中で培養する。

【0304】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、微生物ポリペプチド炭素源は、酵母または細菌由来の１以上のポリペプチドを含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、植物ポリペプチド炭素源は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ゴマ、またはアマニ由来の１以上のポリペプチドを含む。

【0305】

いくつかの実施形態では、イソプレンと水素は、定常期にのみ同時生成される。いくつかの実施形態では、イソプレンと水素は、増殖期と定常期の両方に同時生成される。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多くを超えるかまたは約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多い。様々な実施形態では、定常期に産出される水素の量（例えば、産出される水素の総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出される水素の量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出される水素の量の２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多くを超えるかまたは約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多い。

【0306】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、水素と、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インについて、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％を有する。特定の実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、かつ組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌの化合物を有する。特定の実施形態では、組成物はまた、約２ｍｇ超のイソプレンと、約０．４８ｍｇ超の水素とを含む。

【0307】

いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンの重合を阻害する、気相の揮発性有機画分中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌの化合物を有する。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分はまた、約２ｍｇ超のイソプレンと、約０．４８ｍｇ超の水素とを含む。

【0308】

いくつかの実施形態では、本発明はまた、本明細書に記載の細胞および／または組成物のいずれかを含む系を特徴とする。いくつかの実施形態では、この系は、チャンバーが、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、またはそれより多くを上回るイソプレンと、約１２５、２５０、５００、７５０、１０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、１０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、またはそれより多くを上回る水素とを産出する酸素制限培養された細胞を含む反応器を含む。いくつかの実施形態では、この系は、閉鎖系ではない。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部をこの系から取り出す。いくつかの実施形態では、この系は、イソプレンと水素とを含む気相を含む。様々な実施形態では、この気相は、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む。

【0309】

一態様では、本発明は、ポリイソプレンを含む力価を提供する。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンは、（ｉ）本明細書に記載の組成物のいずれかにおけるイソプレンを重合させるか、または（ｉｉ）本明細書に記載の組成物のいずれかから回収されるイソプレンを重合させることによって産出される。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンは、ｃｉｓ−１，４−ポリイソプレンを含む。

【0310】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物または方法のいずれかによって産出される産物を特徴とする。

【0311】

イソプレンとエタノールの例示的な同時生成
本発明はまた、イソプレンとＣ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールとを同時に生成する組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは、エタノールである。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結された、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む本明細書に記載のイソプレン産出細胞はいずれも、エタノール発酵に関与する１以上のポリペプチドまたはエタノール発酵に関与する１以上のポリペプチドの調節もしくは発現に関与するペプチド（例えば、転写因子など）をコードする、プロモーターに機能的に連結された異種核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結された、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、エタノール発酵に関与する１以上のポリペプチドまたはエタノール発酵に関与する１以上のポリペプチドの調節もしくは発現に関与するペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む本明細書に記載のイソプレン産出細胞はいずれも、発酵副産物の産出に関与する１以上のポリペプチド、または発酵副産物の産出に関する遺伝子の調節または発現に関与する１以上のポリペプチドを不活化する突然変異または欠失をさらに含む。このような細胞は、イソプレンとエタノールを同時に生成することができる。

【0312】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陽性細菌細胞（例えば、枯草菌細胞などのバシルス細胞またはストレプトミセス・リビダンス、ストレプトミセス・コエリコロル、もしくはストレプトミセス・グリセウス細胞などのストレプトミセス細胞）などの細菌細胞である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陰性細菌細胞（例えば、大腸菌細胞などのエシェリキア細胞、ロドシュードモナス・パルストリス細胞などのロドシュードモナス属の種、シュードモナス・フルオレセンス細胞またはシュードモナス・プチダ細胞などのシュードモナス属の種、パントエア・シトレア細胞などのパントエア細胞、またはジモモナス・モビリス細胞などのジモモナス細胞）である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、グラム陰性細菌細胞は大腸菌である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、グラム陰性細菌細胞はジモモナス・モビリスである。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、糸状真菌細胞（例えば、トリコデルマ・リーゼイ細胞などのトリコデルマ細胞もしくはアスペルギルス・オリザエおよびアスペルギルス・ニゲルなどのアスペルギルス細胞）または酵母細胞（例えば、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞もしくはサッカロミセス・セレビシエなどのサッカロミセス細胞）などの真菌細胞である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエである。

【0313】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（例えば、タイワンクズもしくはクズ）（別名「クズ（Ｋｕｄｚｕ）」）またはポプラ属（例えば、アメリカヤマナラシ、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシ、ブラックコットンウッド、もしくは交配種であるウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）などの植物由来のポリペプチドである。

【0314】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする１以上の核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つのベクターが、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、選択マーカーまたは選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性核酸）を含む。

【0315】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、およびＭＶＡ経路核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、およびＭＶＡ経路核酸を含む。

【0316】

いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス属由来のものである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス・フェカーリス由来のものである。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；および（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、ＭＶＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ属に由来するものである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ・マゼイに由来するものである。

【0317】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、プロモーターに機能的に連結された、エタノール発酵に関与する１以上のポリペプチドまたはエタノール発酵に関与する１以上のポリペプチドの調節もしくは発現に関与するペプチド（例えば、転写因子など）をコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、プロモーターに機能的に連結された、ジモモナス・モビリス由来のアルコールデヒドロゲナーゼＢ（ａｄｈＢ）をコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、プロモーターに機能的に連結された、ジモモナス・モビリス由来のアルコールデヒドロゲナーゼＥ（ａｄｈＥ）をコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、プロモーターに機能的に連結された、ジモモナス・モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）をコードする異種核酸を含む。

【0318】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子ポリペプチドまたは核酸は、Ｔ７プロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴ７プロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸は、Ｔｒｃプロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴｒｃプロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸は、Ｌａｃプロモーター（例えば、低コピープラスミドに含まれるＬａｃプロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連ポリペプチドまたは転写因子核酸は、内在性プロモーター（例えば、内在性アルカリ性セリンプロテアーゼプロモーター）に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸は、選択マーカーを伴わずにまたは選択可能マーカーを伴わずに、細胞のゲノムに組み込まれる。

【0319】

いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸は、増殖期よりも定常期に活性の高いプロモーターまたは因子の制御下に置かれている。例えば、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、エタノール発酵関連および／または転写因子もしくは転写因子核酸は、定常期σ因子（例えば、ＲｐｏＳ）の制御下に置かれていてもよい。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、エタノール発酵関連および／または転写因子もしくは転写因子核酸は、定常期に誘導可能なプロモーター（例えば、定常期に活性のある応答調節因子によって誘導可能なプロモーター）の制御下に置かれている。

【0320】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５回、またはそれより多くの細胞分裂の間、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸を維持する。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸を含む核酸はまた、選択マーカーまたは選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性核酸）を含む。

【0321】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンとエタノールを同時に生成する細胞を、細胞によるイソプレンとエタノールの同時生成を促進する酸素制限条件下、本明細書に記載の培養培地のいずれかにおいて培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、イソプレン１モル当たり０．５モルの酸素の存在下で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0322】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも、酸素制限培養で増殖して、イソプレンとエタノールを同時に生成する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約１５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約３０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約４５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のエタノールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２５０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、および約２５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、および約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のエタノールの平均容積生産性とを有する。

【0323】

いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。

【0324】

いくつかの実施形態では、イソプレンとエタノールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンとエタノールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンとエタノールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るエタノールの平均容積生産性とを有する。

【0325】

いくつかの実施形態では、エタノールを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性不純物を含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセテート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセテート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセテート、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセテート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）およびシトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）または線状イソプレンポリマー（例えば、多数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：イソプレン組成物は、以下のうちの１または複数を含む：アルコール、アルデヒド、エステルまたはケトン（例えば、本明細書に記載のアルコール、アルデヒド、エステルまたはケトンのいずれか）。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。

【0326】

また、イソプレンとエタノールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンとエタノールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンとエタノールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、酸素制限培養された細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、細胞のエタノール産出速度は、約０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間を上回る。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、エタノール産出速度は、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約７５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、および約１５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度である。

【0327】

また、イソプレンとエタノールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンとエタノールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンとエタノールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、イソプレンの液相濃度は、約２００ｍｇ／ｍＬ未満であり、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞のエタノール産出速度は約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間を上回る。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、１７５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または２．５ｍｇ／Ｌのいずれか程度未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、または１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌのいずれか程度である。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．５×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、および約１×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約７５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、および約１５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度の速度でエタノールを産出する。

【0328】

一態様では、イソプレンとエタノールを同時に生成する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、例えば炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0329】

いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、例えば炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0330】

一態様では、イソプレンを別の化合物とともに同時に生成する方法、例えば、本明細書に記載の細胞のいずれかを用いてイソプレンとエタノールを同時に生成する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、酸素制限条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞によって産出されたイソプレンとエタノールを回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、細胞によって産出されたイソプレンとエタノールを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、例えば炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の２倍以上よりも多いかまたは約２倍以上である。

【0331】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、微生物ポリペプチド炭素源は、酵母または細菌由来の１以上のポリペプチドを含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、植物ポリペプチド炭素源は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ゴマ、またはアマニ由来の１以上のポリペプチドを含む。

【0332】

いくつかの実施形態では、イソプレンとエタノールは、定常期にのみ同時生成される。いくつかの実施形態では、イソプレンとエタノールは、増殖期と定常期の両方に同時生成される。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多くを超えるかまたは約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多い。様々な実施形態では、定常期に産出されるエタノールの量（例えば、産出されるエタノールの総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出されるエタノールの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるエタノールの量の２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多くを超えるかまたは約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多い。

【0333】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、エタノールと、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インについて、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％を有する。特定の実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、かつ組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％よりも多いかまたは約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌの化合物を有する。特定の実施形態では、組成物はまた、約２ｍｇ超のイソプレンと、約０．４８ｍｇ超のエタノールとを含む。

【0334】

いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンの重合を阻害する、気相の揮発性有機画分中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌの化合物を有する。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分はまた、約２ｍｇ超のイソプレンと、約０．４８ｍｇ超のエタノールとを含む。

【0335】

いくつかの実施形態では、本発明はまた、本明細書に記載の細胞および／または組成物のいずれかを含む系を特徴とする。いくつかの実施形態では、この系は、チャンバーが、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、またはそれより多くを上回るイソプレンと、約０．１、０．２５、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、またはそれより多くを上回るエタノールとを産出する酸素制限培養された細胞を含む反応器を含む。いくつかの実施形態では、この系は、閉鎖系ではない。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部をこの系から除去する。いくつかの実施形態では、この系は、イソプレンとエタノールとを含む気相を含む。イソプレンを含む気相と、エタノールを含む液相とを含む。様々な実施形態では、この気相は、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む。様々な実施形態では、この液相は、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む。

【0336】

一態様では、本発明は、ポリイソプレンを含むタイヤを提供する。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンは、（ｉ）本明細書に記載の組成物のいずれかにおけるイソプレンを重合させるか、または（ｉｉ）本明細書に記載の組成物のいずれかから回収されるイソプレンを重合させることによって産出される。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンは、ｃｉｓ−１，４−ポリイソプレンを含む。

【0337】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物または方法のいずれかによって産出される産物を特徴とする。

【0338】

イソプレンと１，２−プロパンジオールまたは１，３−プロパンジオールの例示的な同時生成
いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは、１，２−プロパンジオールである。いくつかの実施形態では、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオールは、１，３−プロパンジオールである。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結された、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む本明細書に記載のイソプレン産出細胞はいずれも、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路中の１以上のポリペプチドをコードする、同様にプロモーターに機能的に連結された異種核酸をさらに含む。このような細胞は、イソプレンと１，２−プロパンジオールまたは１，３−プロパンジオールを同時に生成することができる。

【0339】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陽性細菌細胞（例えば、枯草菌細胞などのバシルス細胞またはストレプトミセス・リビダンス、ストレプトミセス・コエリコロル、もしくはストレプトミセス・グリセウス細胞などのストレプトミセス細胞）などの細菌細胞である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陰性細菌細胞（例えば、大腸菌細胞などのエシェリキア細胞、ロドシュードモナス・パルストリス細胞などのロドシュードモナス属の種、シュードモナス・フルオレセンス細胞またはシュードモナス・プチダ細胞などのシュードモナス属の種、パントエア・シトレア細胞などのパントエア細胞、またはジモモナス・モビリス細胞などのジモモナス細胞）である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、グラム陰性細菌細胞は大腸菌である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、グラム陰性細菌細胞はジモモナス・モビリスである。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、糸状真菌細胞（例えば、トリコデルマ・リーゼイ細胞などのトリコデルマ細胞もしくはアスペルギルス・オリザエおよびアスペルギルス・ニゲルなどのアスペルギルス細胞）または酵母細胞（例えば、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞もしくはサッカロミセス・セレビシエなどのサッカロミセス細胞）などの真菌細胞である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、酵母細胞はS・セレビシエである。

【0340】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（例えば、タイワンクズもしくはクズ）（別名「クズ（Ｋｕｄｚｕ）」）またはポプラ属（例えば、アメリカヤマナラシ、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシ、ブラックコットンウッド、もしくは交配種であるウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）などの植物由来のポリペプチドである。

【0341】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする１以上の核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つのベクターが、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、選択マーカーまたは選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性核酸）を含む。

【0342】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、およびＭＶＡ経路核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、およびＭＶＡ経路核酸を含む。

【0343】

いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス属由来のものである。いくつかの実施形態では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコックス・フェカーリス由来のものである。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；および（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、ＭＶＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ属に由来するものである。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルキナ・マゼイに由来するものである。

【0344】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、プロモーターに機能的に連結された、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路中の１以上のポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、プロモーターに機能的に連結された、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である。いくつかの実施形態では、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路に関与するポリペプチドは、プロモーターに機能的に連結された、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹである。

【0345】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路ポリペプチドまたは核酸は、Ｔ７プロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴ７プロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸は、Ｔｒｃプロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴｒｃプロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸は、Ｌａｃプロモーター（例えば、低コピープラスミドに含まれるＬａｃプロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸は、内在性プロモーター（例えば、内在性アルカリ性セリンプロテアーゼプロモーター）に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸は、選択マーカーを伴わずにまたは選択可能マーカーを伴わずに、細胞のゲノムに組み込まれる。

【0346】

いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸は、増殖期よりも定常期に活性の高いプロモーターまたは因子の制御下に置かれている。例えば、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸は、定常期σ因子（例えば、ＲｐｏＳ）の制御下に置かれていてもよい。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸は、定常期に誘導可能なプロモーター（例えば、定常期に活性のある応答調節因子によって誘導可能なプロモーター）の制御下に置かれている。

【0347】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５回、またはそれより多くの細胞分裂の間、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸を維持する。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、グリセロール経路または１，３−プロパンジオール経路核酸異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸を含む核酸はまた、選択マーカーまたは選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性核酸）を含む。

【0348】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成する細胞を、細胞によるイソプレンと１，２−プロパンジオールの同時生成を促進する酸素制限条件下、本明細書に記載の培養培地のいずれかにおいて培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、イソプレン１モル当たり０．５モルの酸素の存在下で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0349】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも、酸素制限培養で増殖して、イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約１５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約３０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約４５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間の１，２−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約１０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約２５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約５０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約２５０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、および約２５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約１０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間約２５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、および約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間の１，２−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。

【0350】

いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。

【0351】

いくつかの実施形態では、イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと１，２−プロパンジオールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，２−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。

【0352】

いくつかの実施形態では、１，２−プロパンジオールを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性不純物を含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセテート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセテート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセテート、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセテート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）およびシトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）または線状イソプレンポリマー（例えば、多数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：イソプレン組成物は、以下のうちの１または複数を含む：アルコール、アルデヒド、エステルまたはケトン（例えば、本明細書に記載のアルコール、アルデヒド、エステルまたはケトンのいずれか）。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。

【0353】

また、イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと１，２−プロパンジオールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと１，２−プロパンジオールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、酸素制限培養された細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、１，２−プロパンジオール産出速度は、約０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間を上回る。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、１，２−プロパンジオール産出速度は、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約７５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、および約１５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度である。

【0354】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成する細胞を、細胞によるイソプレンと１，３−プロパンジオールの同時生成を促進する酸素制限条件下、本明細書に記載の培養培地のいずれかにおいて培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、イソプレン１モル当たり０．５モルの酸素の存在下で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の非存在下で、嫌気的に増殖させる。

【0355】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも、酸素制限培養で増殖して、イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約１５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約３０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約４５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールのピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間の１，３−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２５ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２５０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、および約２５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約１０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、約２５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間、および約５０００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜約７５００ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間の１，３−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。

【0356】

いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。

【0357】

いくつかの実施形態では、イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと１，３−プロパンジオールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．１ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性とを有する。

【0358】

いくつかの実施形態では、１，３−プロパンジオールを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１．０×１０^−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性不純物を含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセテート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセテート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセテート、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセテート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）およびシトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）または線状イソプレンポリマー（例えば、多数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：イソプレン組成物は、以下のうちの１または複数を含む：アルコール、アルデヒド、エステルまたはケトン（例えば、本明細書に記載のアルコール、アルデヒド、エステルまたはケトンのいずれか）。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１または複数を含む：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。

【0359】

また、イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと１，３−プロパンジオールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、酸素制限培養された細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、１，３−プロパンジオール産出速度は、約０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間を上回る。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、１，３−プロパンジオール産出速度は、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約７５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、および約１５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度である。

【0360】

また、イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成する方法であって、（ａ）イソプレンと１，３−プロパンジオールの同時生成に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時に生成することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、イソプレンの液相濃度は、約２００ｍｇ／ｍＬ未満であり、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の１，３−プロパンジオール産出速度は、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間を上回る。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、１７５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または２．５ｍｇ／ｍＬの約いずれか未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、または１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌのいずれか程度である。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約２．０×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１．５×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、および約１×１０^４ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜約１×１０^５ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約２５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約７５ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、約１００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間、および約１５０ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間〜約２００ｍｍｏｌ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度の速度で１，３−プロパンジオールを産出する。

【0361】

例示的な精製方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、同時生成された化合物を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、イソプレンを回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、極低温膜吸着マトリックスに基づく分離方法によって水素を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、エタノールを回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、１，３−プロパンジオールを回収することをさらに含む。

【0362】

本発明の組成物および方法を用いて産出される、イソプレンと副生成物（例えば、水素、エタノール、１，２−プロパンジオールまたは１，３−プロパンジオール）を、イソプレンのガスストリッピング、膜増強分離、分別、吸着／脱離、浸透気化法、固相からの熱脱離もしくは真空脱離、または溶媒による固相に固定化もしくは吸収されたイソプレンの抽出などの標準的な技術を用いて回収することができる（例えば、米国特許第４，７０３，００７号、第４，５７０，０２９号、および第４，７４０，２２２号（“Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｒｅｆｉｎｅｒｙ ａｎｄ Ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｏｆｆ−ｇａｓ Ｓｔｒｅａｍｓ”）を参照されたく、これらは各々、特に、イソプレンの回収および精製方法（’００７号および’０２９号特許）に関して、および水素の回収および精製方法（’２２２号特許）に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）。特定の実施形態では、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、またはそれらの組合せ）による抽出蒸留を用いて、イソプレンを回収する。いくつかの実施形態では、イソプレンの回収は、液体形態のイソプレン（例えば、イソプレンの非希釈液または溶媒中のイソプレン溶液）の単離を含む。ガスストリッピングは、連続的に発酵発生ガス流からイソプレン蒸気を除去することを含む。このような除去を、以下に限定するものではないが、固相への吸着、液相への分離、または直接的な凝結（例えば、凝結コイルへの曝露もしくは圧力の増加による凝結）をはじめとするいくつかの異なる方法で達成することができる。いくつかの実施形態では、蒸気の露点を超えた希薄なイソプレン蒸気流の膜濃縮により、液体イソプレンの凝結が生じる。いくつかの実施形態では、イソプレンを圧縮および凝結させる。

【0363】

イソプレンの回収は、１工程または複数工程を含み得る。いくつかの実施形態では、発酵発生ガスからのイソプレン蒸気の除去とイソプレンの液相への変換を同時に行なう。例えば、イソプレンを発生ガス流から直接凝結させて、液体を形成させることができる。いくつかの実施形態では、発酵発生ガスからのイソプレン蒸気の除去とイソプレンの液相への変換を順次行なう。例えば、イソプレンを固相に吸着させ、その後、溶媒を用いて固相から抽出させ得る。

【0364】

水素の回収は、１工程または複数工程を含み得る。いくつかの実施形態では、発酵発生ガスからの水素ガスの除去と水素の液相への変換を同時に行なう。いくつかの実施形態では、発酵発生ガスからの水素ガスの除去と水素の液相への変換を順次行なう。例えば、水素を固相に吸着させ、その後、圧力スイングによって固相から脱離させ得る。

【0365】

エタノールの回収は、１工程または複数工程を含み得る。いくつかの実施形態では、エタノールを、蒸留により発酵液体培地から回収する。いくつかの実施形態では、遠心分離、濾過または同様の方法により、発酵液体培地からまず細胞と破片を取り除く。

【0366】

１，２−プロパンジオールまたは１，３−プロパンジオールの回収は、１工程または複数工程を含み得る。いくつかの実施形態では、１，２−プロパンジオールまたは１，３−プロパンジオールを、蒸留により発酵液体培地から回収する。いくつかの実施形態では、１，２−プロパンジオールまたは１，３−プロパンジオールを、クロマトグラフィーまたは他の標準的な方法により、発酵液体培地から回収する。いくつかの実施形態では、遠心分離、濾過または同様の方法により、発酵液体培地からまず細胞と破片を取り除く。

【0367】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、イソプレンを精製することをさらに含む。例えば、本発明の組成物および方法を用いて産出されたイソプレンを、標準的な技術を用いて精製することができる。精製とは、イソプレンが産出されるときに存在する１以上の成分からイソプレンを分離するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、イソプレンを実質的に純粋な形態として得る。精製方法の例としては、（ｉ）液体抽出剤中の溶液からの蒸留および（ｉｉ）クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用される場合、「精製イソプレン」は、イソプレンが産出されるときに存在する１以上の成分から分離されたイソプレンを意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンは、少なくとも約２０重量％であり、イソプレンが産出されるときに存在する他の成分を含まない。様々な実施形態では、イソプレンは、少なくともまたは約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または９９重量％で、純粋である。純度は、任意の適切な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、またはＧＣ−ＭＳ分析により、アッセイすることができる。

【0368】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、水素を精製することをさらに含む。例えば、本発明の組成物および方法を用いて産出された水素を、標準的な技術を用いて精製することができる。精製とは、水素が産出されるときに存在する１以上の成分から水素を分離するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、水素を実質的に純粋なガスとして得る。精製方法の例としては、（ｉ）極低温凝結および（ｉｉ）固体マトリックス吸着が挙げられる。本明細書で使用される場合、「精製水素」は、水素が産出されるときに存在する１以上の成分から分離された水素を意味する。いくつかの実施形態では、水素は、少なくとも約２０重量％であり、水素が産出されるときに存在する他の成分を含まない。様々な実施形態では、水素は、少なくともまたは約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または９９重量％で、純粋である。純度は、任意の適切な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィーまたはＧＣ−ＭＳ分析により、アッセイすることができる。

【0369】

いくつかの実施形態では、イソプレンを除去するための１以上の回収工程の後に残存する気相の少なくとも一部が、この気相をイソプレン産出用の細胞培養系（例えば、発酵槽）に導入することにより再利用される。

【0370】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、イソプレンを重合させることをさらに含む。例えば、標準的な方法を用いて精製イソプレンを重合させて、ｃｉｓ−ポリイソプレンを形成させるかまたは標準的な方法を用いて他の下流産物を形成させることができる。したがって、本発明はまた、本明細書に開示されたイソプレン組成物のいずれかから作られるポリイソプレン（例えば、ｃｉｓ−１，４−ポリイソプレンおよび／またはｔｒａｎｓ−１，４−ポリイソプレン）を含むタイヤを特徴とする。

【0371】

高イソプレン力価での細胞生存性
イソプレンは、多くの植物、動物、および微生物によって分泌される疎水性分子である。バシルスなどの細菌は、かなり低いレベルでイソプレンを産出する。植物がイソプレンを分泌して熱保護を助けるという証拠もあるが、イソプレンは、シアノバクテリアもしくは真菌に対してアンタゴニストとして作用し得る、または抗微生物剤として作用し得るという仮説が立てられている。例えば、Ｌａｄｙｇｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１００１−１０１４（２００６）を参照されたく、これは、特に、アンタゴニストとして作用するイソプレンに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。抗微生物性であるには、自然で発生する極めて低い産出レベルで十分なので、イソプレンの商業化に必要なイソプレンの力価および産出レベルでは宿主微生物が死滅するということが大きな懸念であった。

【0372】

本発明者らは、二酸化炭素発生速度または総二酸化炭素発生速度によって示されるような細胞生存性および／または代謝活性を維持すると同時に、イソプレンの商業化のためのイソプレンの力価および産出レベルを産出する方法を見出した。

【0373】

イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンは、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１ｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜４０ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜４ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜２５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、２５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜５００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または５００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１０００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、２ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。

【0374】

また、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞生存性は、約２倍未満低下する。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンは、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１ｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜４０ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜４ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜２５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、２５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜５００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または５００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１０００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、２ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、１．７５倍、１．５倍、１．２５倍、１倍、０．７５倍、０．５倍、または０．２５倍のいずれか程度未満低下する。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、約２倍低下する。

【0375】

さらに、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜５ｇ／Ｌ_液体培地／時間、０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜１ｇ／Ｌ_液体培地／時間、１ｇ／Ｌ_液体培地／時間〜２．５ｇ／Ｌ_液体培地／時間、２．５ｇ／Ｌ_液体培地／時間〜５ｇ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。

【0376】

イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回り、細胞生存性は約２倍未満低下する。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜５ｇ／Ｌ_液体培地／時間、０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜１ｇ／Ｌ_液体培地／時間、１ｇ／Ｌ_液体培地／時間〜２．５ｇ／Ｌ_液体培地／時間、２．５ｇ／Ｌ_液体培地／時間〜５ｇ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、１．７５倍、１．５倍、１．２５倍、１倍、０．７５倍、０．５倍、または０．２５倍のいずれか程度より少なく低下する。

【0377】

また、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、１０ｎｇ／Ｌ_液体培地〜５００ｎｇ／Ｌ_液体培地、５００ｎｇ／Ｌ_液体培地〜１μｇ／Ｌ_液体培地、１μｇ／Ｌ_液体培地〜５μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜５０μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜１００μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜２５０μｇ／Ｌ_液体培地、２５０μｇ／Ｌ_液体培地〜５００μｇ／Ｌ_液体培地、５００μｇ／Ｌ_液体培地〜１ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜５０ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_液体培地、１０ｎｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または５μｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_液体培地のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、ピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地、１００ｎｇ／Ｌ_液体培地、１μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地、３０ｍｇ／Ｌ_液体培地、１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または２００ｍｇ／Ｌ_液体培地のいずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。

【0378】

さらに、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、細胞生存性は約２倍未満低下する。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、１０ｎｇ／Ｌ_液体培地〜５００ｎｇ／Ｌ_液体培地、５００ｎｇ／Ｌ_液体培地〜１μｇ／Ｌ_液体培地、１μｇ／Ｌ_液体培地〜５μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜５０μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜１００μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜２５０μｇ／Ｌ_液体培地、２５０μｇ／Ｌ_液体培地〜５００μｇ／Ｌ_液体培地、５００μｇ／Ｌ_液体培地〜１ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜５０ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_液体培地、１０ｎｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または５μｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_液体培地のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、ピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地、１００ｎｇ／Ｌ_液体培地、１μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地、３０ｍｇ／Ｌ_液体培地、１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または２００ｍｇ／Ｌ_液体培地のいずれかである。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、１．７５倍、１．５倍、１．２５倍、１倍、０．７５倍、０．５倍、または０．２５倍のいずれか程度より少なく低下する。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、約２倍低下する。

【0379】

また、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンは、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１ｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜４０ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜４ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜２５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、２５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜５００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または５００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間〜１０００ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、１ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、２ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、４ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、または５ｍｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。

【0380】

また、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、この培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜５ｇ／Ｌ_液体培地／時間、０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間〜１ｇ／Ｌ_液体培地／時間、１ｇ／Ｌ_液体培地／時間〜２．５ｇ／Ｌ_液体培地／時間、２．５ｇ／Ｌ_液体培地／時間〜５ｇ／Ｌ_液体培地／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。

【0381】

さらに、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、この培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、１０ｎｇ／Ｌ_液体培地〜５００ｎｇ／Ｌ_液体培地、５００ｎｇ／Ｌ_液体培地〜１μｇ／Ｌ_液体培地、１μｇ／Ｌ_液体培地〜５μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜５０μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜１００μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜２５０μｇ／Ｌ_液体培地、２５０μｇ／Ｌ_液体培地〜５００μｇ／Ｌ_液体培地、５００μｇ／Ｌ_液体培地〜１ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜５０ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_液体培地、１０ｎｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地〜１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または５μｇ／Ｌ_液体培地〜２００ｍｇ／Ｌ_{液体培地。}いくつかの実施形態では、ピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地、１００ｎｇ／Ｌ_液体培地、１μｇ／Ｌ_液体培地、５μｇ／Ｌ_液体培地、１ｍｇ／Ｌ_液体培地、３０ｍｇ／Ｌ_液体培地、１００ｍｇ／Ｌ_液体培地、または２００ｍｇ／Ｌ_液体培地のいずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。

【0382】

本明細書に記載の方法および細胞のいずれかのいくつかの実施形態では、一以上の異種および／または重複したコピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路のＲＮＡを発現する、及び/又は１つ以上の異種及び/又は重複したコピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸からタンパク質を発現する細胞の二酸化炭素発生速度および／または細胞生存性は、一以上の異種および／または重複したコピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路核酸を欠く対照細胞に匹敵する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下にある異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路のＲＮＡを発現する、および／または異種及び/又は重複したコピーのＤＸＰ経路の核酸の１つまたは複数からタンパク質を発現する細胞の二酸化炭素発生速度および／または細胞生存性（この場合、プロモーターは誘導されている）を、誘導性プロモーターの制御下にある一以上の異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路核酸を含有する対照細胞（この場合、プロモーターは誘導されていない（未誘導である））に匹敵する。。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、β−ガラクトシダーゼプロモーターである。」」」8/3

【0383】

本発明は、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法を提供し、ここで、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。さらに、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。また、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間または約５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間である。

【0384】

さらに、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。また、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌ_液体培地／時間を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。さらに、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌ_液体培地を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。これらの培養細胞のいずれかのいくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０^−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間または約５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間である。

【0385】

また、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、イソプレンの液相濃度は、約２００ｍｇ／Ｌ未満であり、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、１７５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または２．５ｍｇ／Ｌのいずれか程度未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、または１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌのいずれか程度である。

【0386】

また、化合物を産出する方法が本明細書で提供され、ここで、この化合物は、（ａ）約２５０Ｍ／ａｔｍ未満のヘンリー則係数および（ｂ）約１００ｇ／Ｌ未満の水溶解度からなる群から選択される１以上の特徴を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）化合物の産出に好適な条件下で細胞を培養すること、その場合、約０．０１ｖｖｍ〜約２ｖｖｍのガス注入速度でガスを添加する（例えば、ガスを発酵系などの系に添加する）と、ｂ）化合物を産出することとを含む。いくつかの実施形態では、化合物のヘンリー則係数は、２００Ｍ／ａｔｍ、１５０Ｍ／ａｔｍ、１００Ｍ／ａｔｍ、７５Ｍ／ａｔｍ、５０Ｍ／ａｔｍ、２５Ｍ／ａｔｍ、１０Ｍ／ａｔｍ、５Ｍ／ａｔｍ、または１Ｍ／ａｔｍのいずれか程度未満である。いくつかの実施形態では、化合物の水溶解度は、７５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌのいずれか程度未満である。いくつかの実施形態では、化合物は、イソプレン、アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド）、ケトン（例えば、アセトンまたは２−ブタノン）、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、１−ブタノール、またはＣ５アルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールまたは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、アルコールのエステル（例えば、酢酸エチルまたはＣ５アルコールのアセチルエステル）、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、およびＣ１〜Ｃ５炭化水素（例えば、メタン、エタン、エチレン、またはプロピレン）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１〜Ｃ５炭化水素は、飽和したもの、不飽和のもの、または分岐したものである。特定の実施形態では、化合物はイソプレンである。上記の化合物のいずれかを産出する方法のいくつかの実施形態では、ガス注入速度は、０．１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、０．２ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、または０．５ｖｖｍ〜１ｖｖｍのいずれか程度である。

【0387】

一態様では、本発明は、イソプレンを産出する培養細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明は、約４００ｎｍｏｌｅのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間）を上回るイソプレンを産出する培養細胞を提供する。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、例えば、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0388】

いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養培地中の炭素の約０．００２％超をイソプレンに変換する培養細胞を提供する。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、例えば炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0389】

いくつかの実施形態では、本発明は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む培養細胞を提供する。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、例えば、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0390】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞のいずれかを用いてイソプレンを産出する方法などの、イソプレンを産出する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、本方法は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出するのに十分な条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞により産出されたイソプレンを回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたイソプレンを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、例えば炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の２倍以上よりも多いかまたは約２倍以上である。いくつかの実施形態では、気相は、９．５％超または約９．５％（体積）の酸素を含み、気相中のイソプレンの濃度は、引火下限未満であるかまたは引火上限を上回る。特定の実施形態では、（ｉ）気相中のイソプレンの濃度は、引火下限未満であるかまたは引火上限を上回り、（ｉｉ）細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出する。

【0391】

いくつかの実施形態では、本方法は、細胞培養培地中の炭素（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の約０．００２％超をイソプレンに変換するのに十分な条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞により産出されたイソプレンを回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたイソプレンを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、以下に限定するものではないが、例えば炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの、１以上の炭素源を含む培養培地で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。

【0392】

いくつかの実施形態では、イソプレンは定常期にのみ産出される。いくつかの実施形態では、イソプレンは増殖期と定常期の両方に産出される。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ_６００で１時間当たり液体培地１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の ２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多くを超えるかまたは約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多い

【0393】

一態様では、本発明は、イソプレンを含む組成物および系を特徴とする。いくつかの実施形態では、組成物は、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｍｇ超または約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｍｇのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇ超または約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇのイソプレン（ｗ／ｗ）を含み、組成物の揮発性有機画分はイソプレンである。

【0394】

いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インについて、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％を有する。特定の実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを有する。

【0395】

いくつかの実施形態では、組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌの化合物を有する。特定の実施形態では、組成物はまた、約２ｍｇ超のイソプレンを有する。

【0396】

いくつかの実施形態では、組成物は、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌ超または約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌのエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を有する。特定の実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。

【0397】

いくつかの実施形態では、組成物は、イソプレンと、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセテート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセテート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセテート、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の第２の化合物とを含む。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの第２の成分の１つの量は、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）超または約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）である。

【0398】

いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）イソプレンを含む気相と、（ｉｉ）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出する培養細胞とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は閉鎖系を含み、気相は、１時間培養した１ｍＬの１ＯＤ_６００に対して標準化したとき、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／Ｌ超または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／Ｌのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、開放系を含み、気相は、１ｖｖｍの速度で放出されるとき、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／Ｌ超または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／Ｌのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ｔｒａｎｓ−ピペリレン、ｃｉｓ−ピペリレン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インについて、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを有する。

【0399】

いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンの重合を阻害する、気相の揮発性有機画分中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌの化合物を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分はまた、約２ｍｇ超のイソプレンを有する。

【0400】

いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌまたは約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌのエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールまたは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。

【0401】

いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンと、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセテート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセテート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセテート、３−メチルブチルアセテート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセテート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセテート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の第２の化合物とを含む。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの第２の成分の１つの量は、気相の揮発性有機画分中、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）超または約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）である。

【0402】

本発明の組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部は気相中にある。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部は、液相（例えば、凝結物）中にある。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部は固相中にある。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部は、シリカおよび／または活性炭を含む支持体などの固体支持体に吸着する。いくつかの実施形態では、組成物は、エタノールを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約７５〜約９０重量％のエタノール、例えば、約７５〜約８０重量％、約８０〜約８５重量％、または約８５〜約９０重量％のエタノールを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約４〜約１５重量％のイソプレン、例えば、約４〜約８重量％、約８〜約１２重量％、または約１２〜約１５重量％のイソプレンを含む。

【0403】

いくつかの実施形態では、本方法はまた、本明細書に記載の細胞および／または組成物のいずれかを含む系を特徴とする。いくつかの実施形態では、この系は、チャンバーが、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、またはそれより多くを超えるイソプレンを産出する培養細胞を含む反応器を含む。いくつかの実施形態では、この系は、閉鎖系ではない。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部をこの系から除去する。いくつかの実施形態では、この系は、イソプレンを含む気相を含む。様々な実施形態では、この気相は、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む。

【0404】

一態様では、本発明は、ポリイソプレンを含むタイヤを提供する。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンは、（ｉ）本明細書に記載の組成物のいずれかにおけるイソプレンを重合させるか、または（ｉｉ）本明細書に記載の組成物のいずれかから回収されるイソプレンを重合させることによって産出される。いくつかの実施形態では、ポリイソプレンは、ｃｉｓ−１，４−ポリイソプレンを含む。

【0405】

本発明の組成物、系および方法のいずれかのいくつかの実施形態では、気相中の引火しない濃度のイソプレンが産出される。いくつかの実施形態では、気相は、約９．５ ％（体積）未満の酸素を含む。いくつかの実施形態では、気相は、９．５％（体積）超または約９．５％（体積）の酸素を含み、気相中のイソプレンの濃度は、引火下限未満であるかまたは引火上限を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約０％〜約１００％（体積）の酸素、例えば、約１０％〜約１００％（体積）の酸素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約０％〜約９９％（体積）の窒素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約１％〜約５０％（体積）のＣＯ_２を含む。

【0406】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養細胞は、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、もしくはそれより多くを超えるかまたは約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇ_ｗｃｍ／時間、またはそれより多くのイソプレンを産出する。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養細胞は、細胞培養培地中の炭素の０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６％、もしくはそれより多くを超えるかまたは約０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６％、もしくはそれより多くをイソプレンに変換する。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇ、もしくはそれより多くを超えるイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ）または約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇ、もしくはそれより多いイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｇ／ｇ_ｗｃｍ／ｈ）でイソプレンを産出する。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多くを超えるイソプレン／液体培地のＬ（ｍｇ／Ｌ_液体培地、ここで、液体培地の容量は、細胞と細胞培地の容量を含む）または約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多いイソプレン／液体培地のＬ（ｍｇ／Ｌ_液体培地）で累積力価（総量）のイソプレンを産出する。他の例示的なイソプレン産出の速度とイソプレン産出の総量が本明細書に開示されている。

【0407】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする１以上の核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つのベクターが、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、抗生物質耐性核酸などの選択マーカーを含む。

【0408】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、Ｔ７プロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴ７プロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、Ｔｒｃプロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴｒｃプロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、Ｌａｃプロモーター（例えば、低コピープラスミドに含まれるＬａｃプロモーター）に機能的に連結されている。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、内在性プロモーター（例えば、内在性アルカリ性セリンプロテアーゼプロモーター）に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、選択マーカーを伴わずに細胞の染色体に組み込まれる。

【0409】

いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、増殖期よりも定常期に活性の高いプロモーターまたは因子の制御下に置かれている。例えば、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、定常期σ因子（例えば、ＲｐｏＳ）の制御下に置かれていてもよい。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、定常期に誘導可能なプロモーター（例えば、定常期に活性のある応答調節因子によって誘導可能なプロモーター）の制御下に置かれている。

【0410】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５回、またはそれより多くの細胞分裂の間、異種イソプレンシンターゼ核酸を維持する。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、またはＤＸＳ核酸を含む核酸はまた、抗生物質耐性核酸などの選択マーカーを含む。

【0411】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする異種核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、およびＭＶＡ経路核酸を含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、および（ＩＤＩ核酸に加えて）ＭＶＡ経路核酸を含む。

【0412】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（例えば、タイワンクズもしくはクズ）またはポプラ属（例えば、アメリカヤマナラシ、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシ、ブラックコットンウッド、もしくは交配種であるウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）などの植物由来のポリペプチドである。

【0413】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陽性細菌細胞（例えば、枯草菌細胞などのバシルス細胞またはストレプトミセス・リビダンス、ストレプトミセス・コエリコロル、もしくはストレプトミセス・グリセウス細胞などのストレプトミセス細胞）などの細菌細胞である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陰性細菌細胞（例えば、大腸菌細胞などのエシェリキア細胞、ロドシュードモナス・パルストリス細胞などのロドシュードモナス属の種、シュードモナス・フルオレセンス細胞またはシュードモナス・プチダ細胞などのシュードモナス属の種、またはパントエア・シトレア細胞などのパントエア細胞）である。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、糸状真菌細胞（例えば、トリコデルマ・リーゼイ細胞などのトリコデルマ細胞もしくはアスペルギルス・オリザエおよびアスペルギルス・ニゲルなどのアスペルギルス細胞）または酵母細胞（例えば、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞またはサッカロミセス・セレビシエなどのサッカロミセス細胞）などの真菌細胞である。

【0414】

本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、微生物ポリペプチド炭素源は、酵母または細菌由来の１以上のポリペプチドを含む。本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、植物ポリペプチド炭素源は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ゴマ、またはアマニ由来の１以上のポリペプチドを含む。

【0415】

一態様では、本発明は、本発明の組成物または方法のいずれかによって産出される産物を特徴とする。

【実施例】

【0416】

実施例は、本発明の純粋な例示を目的とするものであり、したがって、本発明を限定するものと決してみなされるべきではない。また、実施例は、上で論じられた本発明の態様および実施形態を説明し、詳述するものである。特に断りのない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。上述の実施例および詳細な説明は、説明するために提示されているのであって、限定するために提示されているのではない。

【0417】

本明細書に引用されている刊行物、特許出願、および特許は全て、あたかも各々の個々の刊行物、特許出願、または特許が具体的かつ個別的に参照により組み込まれることが示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書に引用されている刊行物は全て、本発明に関連して使用し得る組成物および方法を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。上述の発明は、理解を明確にするために説明や例によってある程度詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、本発明を種々変更および修正し得ることが当業者には明白となるであろう。

【0418】

実施例１：組換えクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌におけるイソプレンの産出
Ｉ．大腸菌でクズイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築
クズ（タイワンクズ）イソプレンシンターゼ遺伝子（ＩｓｐＳ）のタンパク質配列をＧｅｎＢａｎｋ（ＡＡＱ８４１７０）から得た。大腸菌コドン使用に最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子を、ＤＮＡ２．０から購入した（配列番号１）。イソプレンシンターゼ遺伝子を、供給されたプラスミドからＢｓｐＬＵ１１Ｉ／ＰｓｔＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化で取り出し、ゲル精製し、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化しておいたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。構造体を、イソプレンシンターゼ遺伝子の終止コドンがＰｓｔＩ部位の５’になるように設計した。結果として、この構造体が発現されたときに、Ｈｉｓタグはイソプレンシンターゼタンパク質に付加されない。得られたプラスミド、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕをシークエンシングで確認した（図２および３；配列番号２）。

【0419】

イソプレンシンターゼ遺伝子をｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にもクローニングした。この場合は、組換えイソプレンシンターゼタンパク質がＮ末端Ｈｉｓタグを含有するように、イソプレンシンターゼ遺伝子をｐＥＴ１６ｂに挿入した。イソプレンシンターゼ遺伝子を、プライマーセットのｐＥＴ−Ｈｉｓ−Ｋｕｄｚｕ−２Ｆ：５’−ＣＧＴＧＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＣ（配列番号４９）およびｐＥＴ−Ｈｉｓ−Ｋｕｄｚｕ−Ｒ：５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）を用いたＰＣＲにより、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕから増幅した。これらのプライマーにより、遺伝子の５’末端と３’末端に、それぞれ、ＮｄｅＩ部位とＢａｍＨ１部位が付加された。上記のプラスミド、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕを鋳型ＤＮＡとして用い、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元の取扱説明書に従って用い、プライマーを１０ｐＭｏｌの濃度で添加した。ＰＣＲを総量２５μｌで行なった。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨ１で消化し、同じ酵素で消化したｐＥＴ１６ｂにクローニングした。ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、正しいクローンをシークエンシングで選択した。得られたプラスミドは、クズイソプレンシンターゼ遺伝子がＴ７プロモーターから発現されるが、これを、ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕと命名した（図４および５；配列番号３）。

【0420】

クズイソプレンシンターゼ遺伝子を低コピー数プラスミドｐＣＬ１９２０にもクローニングした。プライマーを用いて、上記のｐＴｒｃＫｕｄｚｕからクズイソプレンシンターゼ遺伝子を増幅した。フォワードプライマーには、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位と大腸菌コンセンサスＲＢＳを付加した。ＰｓｔＩクローニング部位は、終止コドンのすぐ３’でｐＴｒｃＫｕｄｚｕに既に存在していたので、リバースプライマーは、最終的なＰＣＲ産物がＰｓｔＩ部位を含むように構築された。プライマーの配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ−ｒｂｓ−Ｋｕｄｚｕ Ｆ：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣ（配列番号５１）およびＢａｍＨ１−Ｋｕｄｚｕ Ｒ：５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）であった。１０ｐｍｏｌの濃度のプライマーと１ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ）とともにＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼを用いてＰＣＲ産物を増幅した。増幅プロトコルは３０サイクルの（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分）が含まれた。この産物をＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、同じくＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化しておいたｐＣＬ１９２０に連結した。ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換した。いくつかの形質転換体をシークエンシングで調べた。得られたプラスミドをｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕと命名した（図６および７；配列番号４）。

【0421】

ＩＩ．イソプレン産出の測定
振盪フラスコ培養のために、１ｍｌの培養物を振盪フラスコから２０ｍｌＣＴＣヘッドスペースバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔバイアルカタログ番号５１８８ ２７５３；キャップカタログ番号５１８８ ２７５９）に移した。キャップを回して堅く締め、２５０ｒｐｍで振盪させながらバイアルを等価温度でインキュベートした。３０分後、バイアルをインキュベーターから取り出し、以下に記載するように分析した（このアッセイから得られるいくつかの実験的値については、表１を参照されたい）。

【0422】

発酵槽中のイソプレン産出を測定する場合、サンプルを発酵槽の発生ガスから採取し、以下に記載するように直接分析した（このアッセイから得られるいくつかの実験的値については、表２を参照されたい）。

【0423】

ヘッドスペースモードで操作するＣＴＣ Ａｎａｌｙｓｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ） ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーを接続したＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣ／ＭＳシステムを用いて分析を行なった。分析物の分離にはＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×０.２５ｍｍ；０．２５μｍ膜厚）を用いた。５００μＬのヘッドスペースガスを注入するようにサンプラーを設定した。ＧＣ／ＭＳ法では、キャリアガスとして１ｍｌ／分の流量でヘリウムを用いた。注入口を２５０℃に保ち、分割比を５０：１とした。２分間の分析の間、オーブン温度を３７℃に保った。ｍ／ｚ ６７での単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードでＡｇｉｌｅｎｔ ５７９３Ｎ質量選択検出器を操作した。１．４分から１．７分まで検出器を切り、永久ガスを溶出させた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、１．７８分で溶出することが観察された。較正表を用いて、イソプレンの絶対量を定量し、１μｇ／Ｌ〜２０００μｇ／Ｌまで線形であることが分かった。この方法を用いて、検出限界は５０〜１００ｎｇ／Ｌと推定された。

【0424】

ＩＩＩ．組換えイソプレンシンターゼを発現する大腸菌細胞を含有する振盪フラスコにおけるイソプレンの産出
上記のベクターを大腸菌株ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入して、ＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕ株、ＢＬ２１／ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕ株およびＢＬ２１／ｐＥＴＨｉｓＫｕｄｚｕ株を作製した。単離するために、これらの株をＬＡ（ルリア寒天）＋カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）上に播き、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを、２０ｍｌルリア・ベルターニ液体培地（ＬＢ）とカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに植菌した。培養物を、２００ｒｐｍで振盪させながら２０℃で一晩増殖させた。終夜培養物のＯＤ_６００を測定し、培養物を、３０ｍｌ ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに入れてＯＤ_６００が約０．０５になるまで希釈した。培養物を２００ｒｐｍで振盪させながら３０℃でインキュベートした。ＯＤ_６００が約０．５〜０．８になったとき、４００μＭのＩＰＴＧを添加し、２００ｒｐｍで振盪させながら、細胞をさらに３０℃で６時間インキュベートした。ＩＰＴＧによる誘導の０、２、４および６時間後、培養物の１ｍｌアリコートを回収し、ＯＤ_６００を測定し、産出されたイソプレンの量を上記のように測定した。結果を図８に示す。

【0425】

ＩＶ．１４リットル発酵におけるＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕからのイソプレンの産出
組換えクズイソプレンシンターゼ遺伝子を含有する大腸菌からのイソプレンの大規模産出を流加培養物から測定した。発酵培地１リットル当たりの発酵培地（ＴＭ２）のレシピは次の通りであった：Ｋ_２ＨＰＯ_４ １３．６ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １３．６ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ３．２ｇ、酵母抽出物５ｇ、１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏ(脱イオン水)に溶解させた。水酸化カリウム（ＫＯＨ）でｐＨを６．８に調整し、適量を加えて全量とした。最終産物を０．２２μフィルターで濾過滅菌した（濾過滅菌のみで、加圧滅菌なしない）。１０００×改変微量金属溶液のレシピは次の通りであった：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、適量を加えて全量とし、０．２２μフィルターで濾過滅菌した。

【0426】

所望の発酵（ｐＨ６．７および温度３４℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために、この実験を１４Ｌバイオリアクターで行なった。凍結バイアルから採取した大腸菌株ＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕの種菌をソイトン−酵母抽出物−グルコース培地中に調製した。種菌が増殖してＯＤ_５５０＝０．６になったときに、２つの６００ｍｌフラスコを遠心分離し、その中身を７０ｍｌ上清に再懸濁して、細胞ペレット（ＯＤ３．１の材料７０ｍｌ）をバイオリアクターに移した。植菌後の様々な時点で、サンプルを取り出し、産出されたイソプレンの量を上記のように測定した。結果を図９に示す。

【0427】

実施例２：組換えポプライソプレンシンターゼを発現する大腸菌におけるイソプレンの産出
ポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）イソプレンシンターゼのタンパク質配列（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ，Ｊ−Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｐｌａｎｔａ ２２２：７７７−７８６）をＧｅｎＢａｎｋ（ＣＡＣ３５６９６）から得た。大腸菌用にコドンが最適化された遺伝子をＤＮＡ２．０から購入した（ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒ、図３０および３１；配列番号１４）。このイソプレンシンターゼ遺伝子を、供給されたプラスミドからＢｓｐＬＵ１１Ｉ／ＰｓｔＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化によって取り出し、ゲル精製し、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化しておいたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂに連結した。この構造体は、挿入物中の終止コドンがＰｓｔＩ部位の前にあるようにクローニングされ、Ｈｉｓタグがイソプレンシンターゼタンパク質に付加されない構造体を生じさせる。得られたプラスミドｐＴｒｃＰｏｐｌａｒ（図３２および３３；配列番号１５）をシークエンシングで確認した。

【0428】

実施例２Ｂ：いくつかのポプラ属イソプレンシンターゼのイソプレンシンターゼ活性の証明
以下のイソプレンシンターゼ；ウラジロハコヤナギ（アクセッション番号ＢＡＤ９８２４３；図１３７ＡおよびＢ；配列番号３０）、クロヤマナラシ（アクセッション番号ＣＡＬ６９９１８；図１３７ＣおよびＤ；配列番号３１）、アメリカヤマナラシ（アクセッション番号ＡＡＱ１６５８８；図１３７Ｅ、Ｆ、およびＧ；配列番号３２〜３３）、ブラックコットンウッド（アクセッション番号ＡＣＤ７０４０４；図１３７ＨおよびＩ；配列番号３４）、ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ（アクセッション番号ＣＡＪ２９３０３；図１３７ＪおよびＫ；配列番号３５）、ならびにＭＣＭ１１２−Ｋｕｄｚｕを調べた。

【0429】

ｐＥＴ２４Ｋｕｄｚｕ（ＭＣＭ１１２とも呼ぶ）を以下のように構築した。クズイソプレンシンターゼ遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からｐＥＴ２４ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。クズＩｓｐＳ遺伝子を、プライマーのＭＣＭ５０ ５’−ｇａｔｃａｔｇｃａｔ ｔｃｇｃｃｃｔｔａｇ ｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｔｇｔｇｃｇａｃｃｔｃｔｔｃ ｔｃａａｔｔｔａｃｔ（配列番号５２）；およびＭＣＭ５３ ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧ ＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣ ＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）を用いて、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ鋳型ＤＮＡから増幅した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ反応を行ない、得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ−寒天にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有する５ｍｌのルリア液体培地培養液に単一の形質転換体を植菌し、３７℃で一晩増殖させた。１ｍｌの培養液（ルリア液体培地）から単離されたプラスミドＤＮＡのシークエンシングにより、５つのコロニーを正しい挿入についてスクリーニングし、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＭＣＭ９３と命名された、得られたプラスミドは、ｐＣＲ２．１骨格中にクズＩｓｐＳコード配列を含有する（図１３７Ｌ）。ＭＣＭ９３の配列（配列番号３６）を図１３７ＭおよびＮに示す。

【0430】

クズコード配列をＰｃｉＩとＢａｍＨ１（Ｒｏｃｈｅ）を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により取り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ｐＥＴ２４ｄベクターＤＮＡをＮｃｏＩとＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。クズＩｓｐＳ断片を、２０μｌの全容量中、５：１の断片対ベクター比で迅速ＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨ１消化したｐＥＴ２４ｄに連結した。このライゲーション混合物（５μｌ）の一部を大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセルに形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にプレーティングした。正しい形質転換体をシークエンシングで確認し、化学的コンピテントＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で、３７℃で一晩増殖させた後、単一コロニーを選択した。ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕと命名された得られたプラスミドのマップを図１３７Ｏに示す。ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕの配列（配列番号３７）を図１３７ＰおよびＱに示す。

【0431】

アメリカヤマナラシ、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシおよびブラックコットンウッドについては、ｐＥＴ２４ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングされた大腸菌に最適化されたイソプレンシンターゼ遺伝子をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）から購入した。葉緑体輸送ペプチド配列を除去して遺伝子を合成し、成熟タンパク質を発現させた。

【0432】

クズイソプレンシンターゼの構造体をこの実施例の対照として用いた。このプラスミドを大腸菌発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳに形質転換し、形質転換体を０.６ｍｌのＴＭ３培地中で増殖させた。ＴＭ３培地のレシピは次の通りである：Ｋ_２ＨＰＯ_４（１３．６ｇ／ｌ） ＫＨ_２ＰＯ_４（１３．６ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ（２ｇ／Ｌ） クエン酸一水和物（２ｇ／Ｌ） クエン酸第二鉄アンモニウム（０．３ｇ／Ｌ）（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（３．２ｇ／Ｌ） 酵母抽出物（０．２ｇ／Ｌ） １０００×微量元素溶液１ｍｌ（これらを水酸化アンモニウムでｐＨを６．８に調整し、滅菌ＤＩＨ_２Ｏを適量を加えて全量とし、０.２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した）。１０００×微量元素溶液のレシピは次の通りである：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ（４０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ（３０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ（１ｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ（１ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ（１ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ（１００ｍｇ／Ｌ）、Ｈ_３ＢＯ_３（１００ｍｇ／Ｌ）、ＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ（１００ｍｇ／Ｌ）。各成分を一度にＤＩＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整し、適量を加えて全量とし、０.２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0433】

培養物を４００μＭのＩＰＴＧで誘導し、ＯＤ_６００が約５になるまで増殖させ続けた。培養物のアリコートを深ウェルガラスプレートに移し、ウェルをアルミニウムプレートシーラーで密封した。プレートを、４５０ｒｐｍで振盪させながら、２５℃で３０分間インキュベートした。この反応液を、５分間、温度を７０℃に上昇させることにより、熱不活化した。全細胞ヘッドスペースを、実施例１、第ＩＩ部に記載したようなＧＣＭＳ法により測定した。

【0434】

同様の方法で増殖させたが、細胞を回収して、凍結／融解リゾチームプロトコルで溶解させた培養物からＫ_ｍ値を得た。容量４００μＬの培養物を新しい９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号６００８２９０）に移し、細胞を、２５００×ｇで、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ遠心分離器で遠心分離することにより回収した。ペレットを２００ｍＬの低張緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣＬ_２、５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ８．０）に再懸濁し、プレートを−８０℃で最低６０分間、凍結させた。プレートを融解し、３２ｍＬのイソプレンシンターゼＤＭＡＰＰアッセイ緩衝液（５７ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１９ｍＭ ＭｇＣｌ_２、７４ｍｇ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＤＮ−２５）、２．６３×１０^５Ｕ／ｍＬのＲｅａｄｙＬｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号Ｒ１８０２Ｍ）、および５ｍｇ／ｍＬの分子生物学等級ＢＳＡを添加することにより、細胞ライセートを調製した。プレートを振盪させながら２５℃で３０分間インキュベートした後、氷上に置いた。上記の全細胞ヘッドスペースアッセイのために、ＤＭＡＰＰおよびライセートを、密封した深ウェルガラスブロック中に所望の濃度で添加した。この反応を１時間進行させておいた後、上記の加熱工程で終了させ、同じく上記のようにヘッドスペース活性を測定した。

【0435】

代わりのアプローチでは、２５ｍＬ容量で培養し、上記のように誘導した細胞から酵素の活性を測定した。細胞を遠心分離により回収し、５０％グリセロールと２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを１：１で混合したものからなる緩衝液中でフレンチプレスで破壊することによりペレットを溶解させた。容量２５μＬのライセートを、７５μＬのアッセイ緩衝液（６６．６ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８、６．６６ｍＭ ＤＭＡＰＰ、４３ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を含有する２ｍＬスクリューキャップバイアル中でイソプレンシンターゼ活性についてアッセイした。反応液を３０℃で１５分間インキュベートし、バイアルのセプタムを通して１００μＬの２５０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによりクエンチした。イソプレンを実施例１、第ＩＩ部で記載したようなＧＣ／ＭＳで測定した。

【0436】

全ての活性測定方法により、純系のポプラに由来するポプラ酵素は、ポプラ［ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ］よりも数倍高いことが示された。図１３８および１３９は、それぞれ、これらの全細胞ヘッドスペースアッセイおよびＤＭＡＰＰアッセイの結果を示し、驚くべきことに、クロヤマナラシ、アメリカヤマナラシ、ブラックコットンウッド、およびウラジロハコヤナギ由来の酵素が全て、交配種の［ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ］よりも有意に高い活性を有していたことを示している。

【0437】

ＤＭＡＰＰアッセイを次のように行なった。容量４００μＬの培養物を新しい９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号６００８２９０）に移し、細胞を、２５００×ｇで、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ遠心分離器で遠心分離することにより回収した。ペレットを２００ｍＬの低張緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣＬ_２、５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ８．０）に再懸濁し、プレートを−８０℃で最低６０分間、凍結させた。プレートを融解し、３２ｍＬのイソプレンシンターゼＤＭＡＰＰアッセイ緩衝液（５７ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１９ｍＭ ＭｇＣｌ_２、７４ｍｇ／ｍＬ ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＤＮ−２５）、２．６３×１０^５Ｕ／ｍＬのＲｅａｄｙＬｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号Ｒ１８０２Ｍ）、および５ｍｇ／ｍＬの分子生物学等級ＢＳＡを添加することにより、細胞ライセートを調製した。プレートを振盪させながら２５℃で３０分間インキュベートした後、氷上に置いた。イソプレン産出のために、ライセートのアリコート８０ｍＬを９６深ウェルガラスプレート（Ｚｉｎｓｓｅｒカタログ番号３６００６００）に移し、１００ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号６３１８０）中の２０ｍＬの１０ｍＭ ＤＭＡＰＰ溶液を添加した。このプレートをアルミニウムプレートシール（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｏｒカタログ番号５３８６１９）で密封し、浸透させながら３０℃で６０分間インキュベートした。ガラスブロックを加熱することにより（７０℃、５分間）、酵素反応を終了させた。実施例１、第ＩＩ部に記載したように、各ウェルの細胞ヘッドスペースを定量的に分析した。

【0438】

注目すべきことに、ウラジロハコヤナギ、Ｐ．トレムロイデス、Ｐ．トリコカルパは、クズ由来のイソプレンシンターゼよりも高い活性を有していた。ウラジロハコヤナギ由来の酵素は、試験した全ての酵素のうち最も大きい活性を有して発現した。全細胞ヘッドスペースアッセイと比べてより高い活性が細胞ライセートで観察されたのは、細胞の内在性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路によって合成される、これらの酵素の基質であるＤＭＡＰＰが制限されていたためである可能性が高い。

【0439】

速度論的パラメータＫ_ｍは、値が測定された全ての酵素について約２〜３ｍＭと測定された。

【0440】

実施例３：組換えクズイソプレンシンターゼを発現するパントエア・シトレアにおけるイソプレンの産出
実施例１に記載のｐＴｒｃＫｕｄｚｕプラスミドおよびｐＣＬ−ｌａｃ ＫｕｄｚｕプラスミドをＰ．シトレア（米国特許第７，２４１，５８７号）にエレクトロポレートした。形質転換体をそれぞれ、カルベニシリン（２００μｇ／ｍｌ）またはスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択した。振盪フラスコからのイソプレンの産出と産出されたイソプレンの量の測定を、組換えクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌株について実施例１に記載したように行なった。結果を図１０に示す。

【0441】

実施例４：組換えクズイソプレンシンターゼを発現する枯草菌におけるイソプレンの産出
Ｉ．クズイソプレンシンターゼを発現させるための枯草菌複製プラスミドの構築
クズイソプレンシンターゼ遺伝子を、ａｐｒＥプロモーターの制御下にある複製プラスミド（クロラムフェニコール耐性カセットを有するｐＢＳ１９）を用いて枯草菌ａｐｒＥｎｐｒＥ Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫ株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）で発現させた。イソプレンシンターゼ遺伝子、ａｐｒＥプロモーターおよび転写ターミネーターを別々に増幅し、ＰＣＲを用いて融合させた。その後、構造体をｐＢＳ１９にクローニングし、枯草菌に形質転換した。

【0442】

ａ）ａｐｒＥプロモーターの増幅
ａｐｒＥプロモーターを、以下のプライマーを用いて枯草菌由来の染色体ＤＮＡから増幅した。
ＣＦ ７９７（＋） 開始点 ａｐｒＥプロモーター ＭｆｅＩ

５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣ（配列番号５３）

ＣＦ ０７−４３（−） ａｐｒＥプロモーターをクズｉｓｐＳに融合する

５’−ＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡ（配列番号５４）

【0443】

ｂ）イソプレンシンターゼ遺伝子の増幅
クズイソプレンシンターゼ遺伝子をプラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（配列番号２）から増幅した。この遺伝子は大腸菌用にコドンが最適化されており、ＤＮＡ２.０により合成されていた。以下のプライマーを用いた。
ＣＦ ０７−４２（＋） ａｐｒＥプロモーターをクズイソプレンシンターゼ遺伝子（ＧＴＧ開始コドン）に融合する

５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴ（配列番号５５）

ＣＦ ０７−４５（−） クズイソプレンシンターゼ遺伝子３’末端をターミネーターに融合する

５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＣ（配列番号５６）

【0444】

ｃ）転写ターミネーターの増幅
バシルス・アミリケファシエンスのアルカリ性セリンプロテアーゼ由来のターミネーターを、以前に配列が決定されたプラスミドｐＪＨＰｍｓ３８２から、以下のプライマーを用いて増幅した。
ＣＦ ０７−４４（＋） クズイソプレンシンターゼの３’末端をターミネーターに融合する

５’−ＧＡＴＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧ（配列番号５７）

ＣＦ ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンスターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端

５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）

【0445】

このクズ断片を、以下のプライマーを用いたＰＣＲを用いてターミネーター断片に融合した。
ＣＦ ０７−４２（＋） ａｐｒＥプロモーターをクズイソプレンシンターゼ遺伝子（ＧＴＧ開始コドン）に融合する

５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴ（配列番号５５）

ＣＦ ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンスターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端

５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）

【0446】

このクズターミネーター断片を、以下のプライマーを用いたＰＣＲを用いてプロモーター断片に融合した。
ＣＦ ７９７（＋） 開始点 ａｐｒＥプロモーター ＭｆｅＩ

５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣ（配列番号５３）

ＣＦ ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンスターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端

５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）

【0447】

この融合ＰＣＲ断片をＱｉａｇｅｎキットを用いて精製し、制限酵素のＭｆｅＩとＢａｍＨＩで消化した。この消化したＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎキットを用いてゲル精製した。これを、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製しておいたｐＢＳ１９として知られるベクターに連結した。

【0448】

このライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、コロニーをＬＡ＋５０カルベニシリンプレート上で選択した。合計６つのコロニーを選び、ＬＢ＋５０カルベニシリン中で一晩増殖させた後、Ｑｉａｇｅｎキットを用いてプラスミドを単離した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、挿入物を調べ、正しいプラスミドのうちの３つを、以下のプライマーを用いるシークエンシングに回した。
ＣＦ １４９（＋） ＥｃｏＲＩ ａｐｒＥプロモーターの開始点

５’−ＧＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号５９）

ＣＦ ８４７（＋） ｐＸＸ ０４９中の配列（ａｐｒＥプロモーターの終点）

５’−ＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＧ（配列番号６０）

ＣＦ ０７−４５（−） クズイソプレンシンターゼの３’末端をターミネーターに融合する

５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＣ（配列番号５６）

ＣＦ ０７−４８（＋） クズイソプレンシンターゼのシークエンシングプライマー

５’−ＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧ（配列番号６１）

ＣＦ ０７−４９（＋） クズイソプレンシンターゼ中の配列

５’−ＧＧＣＧＡＡＡＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ（配列番号６２）

【0449】

ｐＢＳ Ｋｕｄｚｕ ＃２（図５２および１２；配列番号５）と命名されたプラスミドは、シークエンシングにより正しいものであった。これを、枯草菌宿主株のＢＧ ３５９４ ｃｏｍＫに形質転換した。ＬＡ＋５クロラムフェニコールプレート上で選択を行なった。形質転換体を選び、ＬＡ＋５クロラムフェニコール上で単一コロニーを突いた後、ＯＤ_６００が１．５に達するまで、ＬＢ＋５クロラムフェニコール中で増殖させた。これを、グリセロールの存在下、−８０℃でバイアル中に凍結保存した。得られた株をＣＦ ４４３と命名した。

【0450】

ＩＩ．組換えイソプレンシンターゼを発現する枯草菌細胞を含有する振盪フラスコにおけるイソプレンの産出
終夜培養液に、ＬＡ＋クロラムフェニコール（Ｃｍ、２５μｇ／ｍｌ）からのＣＦ ４４３の単一コロニーを植菌した。培養物を２００ｒｐｍで振盪させながらＬＢ＋Ｃｍ中、３７℃で増殖させた。これらの終夜培養物（１ｍｌ）を用いて、２５ｍｌのＧｒａｎｔｓ ＩＩ培地と最終濃度２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含有する２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに植菌した。Ｇｒａｎｔｓ ＩＩ培地のレシピは、１０ｇソイトン、３ｍｌ １Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４、７５ｇグルコース、３．６ｇ尿素、１００ｍｌ １０×ＭＯＰＳを、Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７．２）を適量加えて１Ｌにしたものであり；１０×ＭＯＰＳのレシピは、８３．７２ｇ ＭＯＰＳ、７．１７ｇトリシン、１２ｇ ＫＯＨペレット、１０ｍｌ ０．２７６Ｍ Ｋ_２ＳＯ_４溶液、１０ｍｌ ０．５２８Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液、２９．２２ｇ ＮａＣｌ、１００ｍｌ １００×微量栄養素を、Ｈ_２Ｏを適量加えて１Ｌにしたものであり；１００×微量栄養素のレシピは、１．４７ｇ ＣａＣｌ_２^＊２Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２０、０．１ｇ ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２０、０．１ｇ ＺｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ ＣｕＣｌ_２^＊２Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏを、Ｈ_２Ｏを適量加えて１Ｌにしたものであった。振盪フラスコを３７℃でインキュベートし、サンプルを１８、２４、および４４時間で採取した。１８時間で、ＣＦ４４３および対照株のヘッドスペースをサンプリングした。これは、イソプレンが１８時間蓄積したものに相当した。イソプレンの量を、実施例１に記載したようにガスクロマトグラフィーで測定した。イソプレンの産出は、組換えイソプレンシンターゼを発現させることにより有意に増強された（図１１）。

【0451】

ＩＩＩ．１４Ｌ発酵におけるＣＦ４４３によるイソプレンの産出
複製プラスミド上に組換えクズイソプレンシンターゼ遺伝子を含有する枯草菌からのイソプレンの大規模産出を、流加培養から測定した。クズイソプレンシンターゼ遺伝子を発現するバシルス株ＣＦ ４４３、またはクズイソプレンシンターゼ遺伝子を発現しない対照株を、大豆ミール（Ｃａｒｇｉｌｌ）、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、硫酸マグネシウムならびにクエン酸、塩化第二鉄および塩化マンガンの溶液を含有する栄養培地中で従来の流加発酵により培養した。発酵前に、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼを含む酵素の混合物を用いて、培地を９０分間軟化させる（ｍａｃｅｒａｔｅ）（ＷＯ９５／０４１３４号を参照されたい）。１４Ｌバッチ発酵に、６０％ｗｔ／ｗｔグルコース（Ｃａｒｇｉｌｌ ＤＥ９９デキストロース、ＡＤＭ Ｖｅｒｓａｄｅｘ ｇｒｅｅｎｓまたはＤａｎｉｓｃｏ転化糖）と９９％ｗｔ／ｗｔ油（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｆａｍｉｌｙ大豆油、ここで、９９％ｗｔ／ｗｔとは、細胞培養培地に添加されてしまう前の油の濃度である）とを供給する。バッチ中のグルコースが検出されなくなったときに供給を開始した。供給速度を数時間かけて上昇させ、炭素量が等しくなるように油が添加されるように調整した。２８％ｗ／ｖ水酸化アンモニウムを用いてｐＨを６．８〜７．４に調節した。泡が立つ場合、消泡剤を培地に添加した。発酵温度を３７℃に調節し、発酵培養物を７５０ｒｐｍで撹拌した。ｐＨ、ＤＯ％、空気流量、および圧力などの様々な他のパラメータを、プロセス全体を通じてモニタリングした。ＤＯ％は２０より高く維持される。サンプルを３６時間にわたってずっと採取し、細胞増殖（ＯＤ_５５０）およびイソプレン産出について分析した。これらの実験の結果を図５３Ａおよび５３Ｂに示す。

【0452】

ＩＶ．クズイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）の枯草菌への組込み
クズイソプレンシンターゼ遺伝子を、ａｐｒＥプロモーターの制御下にある組込みプラスミド（ｐＪＨ１０１−ｃｍｐＲ）にクローニングした。試験した条件下では、イソプレンが検出されなかった。

【0453】

実施例５：トリコデルマにおけるイソプレンの産出
Ｉ．トリコデルマ・リーゼイにおいてクズイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築
ヤロウイア・リポリティカのコドンに最適化されたクズＩＳ遺伝子はＤＮＡ２.０によって合成された（配列番号６）（図１３）。このプラスミドは、以下のＰＣＲ増幅反応（全反応容量５０μｌ中、１μｌのプラスミド鋳型（２０ｎｇ／ｕｌ）、１μｌのプライマーＥＬ−９４５（１０μＭ）５’−ＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＣＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＧ（配列番号６３）、１μｌのプライマーＥＬ−９６５（１０μＭ）５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＡＣ（配列番号６４）、１μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、５μｌの１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、１μｌのＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、４０μｌの水）の鋳型としての役割を果たした。フォワードプライマーは、Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子に対応するものではないが、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへのクローニングに必要な５’末端の追加の４ヌクレオチドを含んでいた。リバースプライマーは、Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子に対応するものではないが、他のベクター骨格にクローニングするために挿入される５’末端の追加の２１ヌクレオチドを含んでいた。ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを用いて、以下のようにＰＣＲ反応を行なった。９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間（２７サイクル繰り返す）、最後のサイクルの後に７２℃で１分間。ＰＣＲ産物を１．２％Ｅ−ゲル上で解析して、Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子が増幅できたことを確認した。

【0454】

次に、このＰＣＲ産物を、製造元のプロトコル（全反応容量６μｌ中、１μｌのＰＣＲ反応液、１μｌの塩溶液、１μｌのＴＯＰＯ ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターおよび３μｌの水）に従って、ＴＯＰＯ ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯクローニングキットを用いてクローニングした。反応液を室温で５分間インキュベートした。１μｌのＴＯＰＯ反応液をＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシンプレート上で選択した。いくつかのコロニーを取り、各々をＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５ｍｌチューブに植菌し、培養物を、２００ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で一晩増殖させた。製造元のプロトコルに従って、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキットを用いて終夜培養チューブからプラスミドを単離した。いくつかのプラスミドをシークエンシングし、ＤＮＡ配列が正しいことを確認した。

【0455】

Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子をコードする単一のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯプラスミドを、オーダーメイドのｐＴｒｅｘ３ｇベクターへのＧａｔｅｗａｙクローニングに用いた。ｐＴｒｅｘ３ｇの構築については、ＷＯ２００５／００１０３６ Ａ２号に記載されている。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲクロナーゼＩＩ酵素ミックスキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用の製造元のプロトコル（全反応容量８μｌ中、１μｌのＹ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯドナーベクター、１μｌのｐＴｒｅｘ３ｇデスティネーションベクター、６μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０））に従って、反応を行なった。反応液を室温で１時間インキュベートした後、１μｌのプロテイナーゼＫ溶液を添加し、３７℃で１０分間インキュベーションを続けた。その後、反応液１μｌをＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリンプレート上で選択した。いくつかのコロニーを取り、各々をＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５ｍｌチューブに植菌し、培養物を、２００ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で一晩増殖させた。製造元のプロトコルに従って、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキットを用いて終夜培養チューブからプラスミドを単離した。いくつかのプラスミドをシークエンシングし、ＤＮＡ配列が正しいことを確認した。

【0456】

Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼｐＴｒｅｘ３ｇプラスミド（図１４）の四重欠失トリコデルマ・リーゼイ株への微粒子銃による形質転換を、微粒子銃ＰＤＳ−１０００／ＨＥ粒子送達系を用いて行なった（ＷＯ２００５／００１０３６ Ａ２号参照）。安定な形質転換体の単離と振盪フラスコの評価は、特許刊行物ＷＯ２００５／００１０３６ Ａ２号の実施例１１に記載のプロトコルを用いて行なった。

【0457】

ＩＩ．組換えＴ．リーゼイの株におけるイソプレンの産出
上記のイソプレンシンターゼ形質転換体の１５時間および３６時間培養物１ｍｌをヘッドスペースバイアルに移した。このバイアルを密封し、３０℃で５時間インキュベートした。ヘッドスペースガスを測定し、実施例１に記載の方法によりイソプレンを同定した。これらの形質転換体のうちの２つは、微量のイソプレンを示した。１４時間インキュベートすることにより、イソプレンの量を増加させることができた。この２つの陽性サンプルは、１４時間のインキュベーンで約０.５μｇ／Ｌのレベルのイソプレンを示した。形質転換していない対照は、検出可能なレベルのイソプレンを示さなかった。この実験により、Ｔ．リーゼイが、外因性イソプレンシンターゼを供給したときに内在性前駆体からイソプレンを産出することができることが示される。

【0458】

実施例６：ヤロウイアにおけるイソプレンの産出
Ｉ．ヤロウイア・リポリティカにおいてクズイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築
ヤロウイア・リポリティカにおいてクズイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築するための出発点は、ベクターｐＳＰＺ１（ＭＡＰ２９Ｓｐｂ）であった。このベクターの全配列（配列番号７）を図１５に示す。

【0459】

Ｙ．リポリティカ株ＧＩＣＣ １２０２８５の染色体ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、以下の断片を増幅した：プロモーターを欠く形態のＵＲＡ３遺伝子、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の断片、Ｙ．リポリティカＸＰＲ２遺伝子の転写ターミネーターならびにＸＰＲ２遺伝子およびＩＣＬ１遺伝子のプロモーターを含有する２つのＤＮＡ断片。以下のＰＣＲプライマーを用いた。
ＩＣＬ１ ３

５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣ（配列番号６５）

ＩＣＬ１ ５

５’−ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号６６）

ＸＰＲ ３

５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧ（配列番号６７）

ＸＰＲ ５

５’−ＧＧＴＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＣＣ（配列番号６８）

ＸＰＲＴ３

５’−ＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号６９）

ＸＰＲＴ ５

５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＧＧ（配列番号７０）

Ｙ１８Ｓ３

５’−ＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＧ（配列番号７１）

Ｙ１８Ｓ ５

５’−ＧＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＡＡＡＴＣＡＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧ（配列番号７２）

ＹＵＲＡ３

５’−ＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ（配列番号７３）

ＹＵＲＡ ５０

５’−ＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＣＴＡＴＧ（配列番号７４）

ＹＵＲＡ ５１

５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＴＣＣ（配列番号７５）

【0460】

ＰＣＲ増幅のために、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、供給元により提供された緩衝液およびｄＮＴＰ、２．５μＭプライマーならびに示された鋳型ＤＮＡを製造元の取扱説明書の通りに用いた。以下のサイクル：９５℃で１分間；３４サイクル（９５℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３分）および７２℃、１０分を用いて増殖を行ない、次いで、４℃でインキュベーションした。

【0461】

ヤロウイアにおける発現のためにコドンが最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子をコードする合成ＤＮＡ分子を、ＤＮＡ２．０から得た（図１６；配列番号８）。それぞれ、ＸＰＲ２プロモーターおよびＩＣＬ１プロモーターの制御下にある合成クズイソプレンシンターゼ遺伝子を担持するプラスミドであるｐＹＬＡ（ＫＺ１）およびｐＹＬＩ（ＫＺ１）の構築スキームの完全な詳細を図１８に示す。接合因子遺伝子（ＭＡＰ２９）がイソプレンシンターゼ遺伝子の代わりに挿入されている対照プラスミドも構築した（図１８Ｆおよび１８Ｇ）。

【0462】

同様のクローニング手順を用いて、ポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）イソプレンシンターゼ遺伝子を発現させることができる。ポプライソプレンの配列は、Ｍｉｌｌｅｒ Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｐｌａｎｔａ ２１３，４８３−４８７に記載されており、これを図１７に示す（配列番号９）。それぞれ、ＸＰＲ２プロモーターおよびＩＣＬ１プロモーターの制御下にある合成ポプライソプレンシンターゼ遺伝子を担持するプラスミドであるｐＹＬＡ（ＰＯＰ１）およびｐＹＬＩ（ＰＯＰ１）を作製するための構築スキームを図１８Ａ、ＢおよびＣに示す。

【0463】

ＩＩ．Ｙ．リポリティカの組換え株によるイソプレンの産出
ベクターｐＹＬＡ（ＫＺ１）、ｐＹＬＩ（ＫＺ１）、ｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）およびｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）をＳａｃＩＩで消化し、これらを用いて、標準的な酢酸リチウム／ポリエチレングリコール手順によってＹ．リポリティカ株ＣＬＩＢ １２２をウリジン原栄養性に形質転換した。簡潔に述べると、ＹＥＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）中で一晩増殖させた酵母細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）で回収し、滅菌水で１回洗浄し、０．１Ｍ酢酸リチウム、ｐＨ６．０に懸濁した。細胞懸濁液のアリコート２００μｌを線状化プラスミドＤＮＡ溶液（１０〜２０μｇ）と混合し、室温で１０分間インキュベートし、同じ緩衝剤中で１ｍｌの５０％ＰＥＧ ４０００と混合した。この懸濁液を室温でさらに１時間インキュベートした後、４２℃で２分間熱ショックを与えた。次に、細胞をＳＣ ｈｉｓ ｌｅｕプレート（０．６７％酵母窒素塩基、２％グルコース、各々１００ｍｇ／Ｌのロイシンおよびヒスチジン）上にプレーティングした。３０℃で３〜４日間インキュベートした後に形質転換体が現われた。

【0464】

ｐＹＬＡ（ＫＺ１）形質転換からの３つの単離株、ｐＹＬＩ（ＫＺ１）形質転換からの３つの単離株、ｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）形質転換からの２つの単離株およびｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）形質転換からの２つの単離株を、振盪させながらＹＥＰ７培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、ｐＨ７．０）中、３０℃で２４時間増殖させた。培養物１０ｍｌから遠心分離により細胞を回収し、３ｍｌの新鮮なＹＥＰ７に再懸濁し、１５ｍｌスクリューキャップバイアルに入れた。このバイアルを穏やかに（６０ｒｐｍ）振盪させながら室温で一晩インキュベートした。これらのバイアルのヘッドスペース中のイソプレン含有量を、実施例１に記載したようにマススペクトロメトリー検出器を用いてガスクロマトグラフィーで分析した。ｐＹＬＡ（ＫＺ１）およびｐＹＬＩ（ＫＺ１）で得られた形質転換体は全て、すぐに検出可能な量のイソプレン（０．５μｇ／Ｌ〜１μｇ／Ｌ、図２０）を産出した。イソプレンシンターゼ遺伝子の代わりにフィターゼ遺伝子を担持する対照株のヘッドスペースにはイソプレンが検出されなかった。

【0465】

実施例７：クズイソプレンシンターゼとｉｄｉ、またはｄｘｓ、またはｉｄｉとｄｘｓを発現する大腸菌におけるイソプレンの産出
Ｉ．大腸菌においてイソプレンを産出させるためのクズイソプレンシンターゼとｉｄｉ、またはｄｘｓ、またはｉｄｉとｄｘｓをコードするベクターの構築
ｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎの構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（実施例１に記載）のｂｌａ遺伝子を、カナマイシン耐性を付与する遺伝子と置き換えた。ｂｌａ遺伝子を取り除くために、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕをＢｓｐＨＩで消化し、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理し、６５℃で熱不活化した後、クレノー断片とｄＮＴＰで末端を充填した。５ｋｂｐの大きな断片をアガロースゲルから精製し、ｋａｎ^ｒ遺伝子に連結した。このｋａｎ^ｒ遺伝子は、プライマーのＭＣＭ２２ ５’−ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧ（配列番号７６）およびＭＣＭ２３ ５’−ＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号７７）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯからＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｖｕＩで消化し、末端を充填しておいたものである。カナマイシン耐性を付与するプラスミドを担持する形質転換体（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ Ｋａｎ）をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ上で選択した。

【0466】

ｉｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ Ｋａｎの構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎをＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化し、ゲル精製した。これを、合成ＲＢＳとともにサッカロミセス・セレビシエ由来のｉｄｉをコードするＰＣＲ産物に連結した。ＰＣＲ用のプライマーは、ＮｓｉＩ−ＹＩＤＩ １Ｆ ５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣ（配列番号７８）およびＰｓｔＩ−ＹＩＤＩ １Ｒ ５’−ＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＣ（配列番号７９）であり、鋳型はサッカロミセス・セレビシエゲノムＤＮＡであった。ＰＣＲ産物をＮｓｉＩとＰｓｔＩで消化し、ライゲーションの前にゲル精製した。このライゲーション混合物を化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＡ上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、配列を決定し、得られたプラスミドをｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（ｋａｎ）と名付けた（図３４および３５；配列番号１６）。

【0467】

ｉｉｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ Ｋａｎの構築
プラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ＫａｎをＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化し、ゲル精製した。これを、合成ＲＢＳとともに大腸菌由来のｄｘｓをコードするＰＣＲ産物に連結した。ＰＣＲ用のプライマーは、ＭＣＭ１３ ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧ（配列番号８０）およびＭＣＭ１４ ５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴ（配列番号８１）であり、鋳型は大腸菌ゲノムＤＮＡであった。ＰＣＲ産物をＮｓｉＩとＰｓｔＩで消化し、ライゲーションの前にゲル精製した。得られた形質転換反応液をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、配列を決定し、得られたプラスミドをｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ（ｋａｎ）と名付けた（図３６および３７；配列番号１７）。

【0468】

ｉｖ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）の構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（ｋａｎ）をＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化し、ゲル精製した。これを、合成ＲＢＳとともに大腸菌ｄｘｓをコードするＰＣＲ産物に連結した（プライマーはＭＣＭ１３ ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧ（配列番号８０）およびＭＣＭ１４ ５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴ（配列番号８１）；鋳型はＴＯＰ１０細胞）。このＰＣＲ産物は、ＮｓｉＩおよびＰｓｔＩで消化し、ゲル精製しておいたものである。最終的なプラスミドをｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）と名付けた（図２１および２２；配列番号１０）。

【0469】

ｖ）ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕの構築
上記の実施例１由来のプロモーター、構造遺伝子およびターミネーターを含有するＤＮＡの断片をＳｓｐＩを用いてｐＴｒｃＫｕｄｚｕから消化し、ゲル精製した。これを、ＰｖｕＩＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化しておいたｐＣＬ１９２０に連結した。得られたライゲーション混合物をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ中で選択した。いくつかのクローンを単離し、配列を決定し、２つを選択した。ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕおよびｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ａ３）は、反対の向きで挿入物を有している（図３８〜４１；配列番号１８〜１９）。

【0470】

ｖｉ）ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩの構築
ＮｓｉＩ−ＰｓｔＩ消化し、ゲル精製した上記（ｉｉ）由来のＩＤＩのＰＣＲアンプリコンを、ＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化しておいたｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕに連結した。このライゲーション混合物をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ中で選択した。いくつかのクローンを単離し、配列を決定し、得られたプラスミドをｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩと名付けた（図４２および４３；配列番号２０）。

【0471】

ｖｉｉ）ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳの構築
ＮｓｉＩ−ＰｓｔＩ消化し、ゲル精製した上記（ｉｉｉ）由来のＤＸＳ ＰＣＲアンプリコンを、ＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化しておいたｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ａ３）に連結した。このライゲーション混合物をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ中で選択した。いくつかのクローンを単離し、配列を決定し、得られたプラスミドをｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳと名付けた（図４４および４５；配列番号２１）。

【0472】

ＩＩ．様々なコピー数でクズイソプレンシンターゼ、ｉｄｉ、および／またはｄｘｓを発現する培養物からのヘッドスペース中のイソプレンの測定
プラスミドのｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（ｋａｎ）（Ａ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ ｋａｎ（Ｂ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ ｋａｎ（Ｃ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ＤＸＳ ｋａｎ（Ｄ）で以前に形質転換した大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）の培養物をＬＢカナマイシン５０μｇ／ｍＬ中で増殖させた。ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ｅ）、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（Ｆ）およびｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ（Ｇ）の培養物をＬＢスペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ中で増殖させた。培養物を、時間０（ＯＤ_６００ 約０．５）において４００μＭのＩＰＴＧで誘導し、イソプレンヘッドスペース測定用にサンプルを採取した（実施例１参照）。結果を図２３Ａ〜２３Ｇに示す。

【0473】

プラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）を形質転換により大腸菌株ＢＬ２１に導入した。得られた株ＢＬ２１／ｐＴｒｃ Ｋｕｄｚｕ ＩＤＩ ＤＸＳをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ中、２０℃で一晩増殖させ、これを用いて、１％グルコースを含有するＴＭ３（１３．６ｇ Ｋ_２ＰＯ_４、１３．６ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．０ｇ ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、２．０ｇクエン酸一水和物、０．３ｇクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２ｇ酵母抽出物、１．０ｍｌ １０００×改変微量金属溶液をｐＨ６．８に調整し、適量のＨ_２Ｏを加えて全量とし、濾過滅菌したもの）の振盪フラスコに植菌した。ＯＤ_６００が０．８に達するまでフラスコを３０℃でインキュベートした後、４００μＭのＩＰＴＧで誘導した。サンプルを誘導後の様々な時点で採取し、ヘッドスペース中のイソプレンの量を実施例１に記載したように測定した。結果を図２３Ｈに示す。

【0474】

ＩＩＩ．Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩＤＸＳにおけるバイオマスからのイソプレンの産出
ＢＬ２１ ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ＩＤＩ ＤＸＳ株を、グルコースを対照として、３種類のバイオマス；バガス、コーンストーバーおよび針葉樹パルプからイソプレンを生成する能力について試験した。バイオマスの加水分解物を酵素的加水分解（Ｂｒｏｗｎ，Ｌ ａｎｄ Ｔｏｒｇｅｔ，Ｒ．，１９９６，ＮＲＥＬ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ Ｌａｐ−００９ “Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ”）により調製し、グルコース当量に基づく希釈で用いた。この実施例では、グルコース当量は１％グルコースに等しかった。新たに形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）細胞のプレート由来の単一コロニーを用いて、５ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に植菌した。この培養物を振盪させながら２５℃で一晩インキュベートした。翌日、終夜培養物を、ＯＤ_６００が０．０５になるまで２５ｍｌのＴＭ３＋０．２％ＹＥ＋１％原料中で希釈した。原料は、コーンストーバー、バガス、または針葉樹パルプであった。グルコースを陽性対照として用い、グルコースなしを陰性対照として用いた。培養物を１８０ｒｐｍで振盪させながら３０℃でインキュベートした。培養物をＯＤ_６００についてモニタリングし、ＯＤ_６００が約０.８に達したとき、培養物を、実施例１に記載したようにイソプレン産出について、１時間および３時間で分析した。培養物は誘導されていない。追加した原料を含有する培養物は全て、グルコース陽性対照のイソプレンと同等のイソプレンを産出する。実験は２つ１組で行なわれた。これを図４６に示す。

【0475】

ＩＶ．Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＩＤＩＤＸＳにおける転化糖からのイソプレンの産出
新たに形質転換したＢＬ２１（λＤＥ３）／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）細胞のプレート由来の単一コロニーを用いて、５ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に植菌した。この培養物を振盪させながら２５℃で一晩インキュベートした。翌日、終夜培養物を、ＯＤ_６００が０．０５になるまで２５ｍｌのＴＭ３＋０．２％ＹＥ＋１％原料中で希釈した。原料はグルコース、転化グルコースまたはコーンストーバーであった。転化糖原料（Ｄａｎｉｓｃｏ転化糖）は、スクロースシロップを酵素処理することにより調製した。ＡＦＥＸコーンストーバーは、以下（第Ｖ部）に記載するように調製した。細胞を３０℃で増殖させ、培養物のＯＤ_６００が約０.８〜１.０に達したとき（０時間）、最初のサンプルを測定した。この培養物を、ＯＤ_６００によって測定される増殖と、実施例１に記載の０、１および３時間でのイソプレン産出について分析した。結果を図４７に示す。

【0476】

Ｖ．ＡＦＥＸ前処理コーンストーバーからの加水分解物の調製
ＡＦＥＸ前処理コーンストーバーをＭｉｃｈｉｇａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。前処理条件は、湿度６０％、アンモニア負荷１：１、および９０℃、３０分間とし、その後、風乾した。ＡＦＥＸ前処理コーンストーバーの含水率は２１．２７％であった。ＡＦＥＸ前処理コーンストーバーにおけるグルカンとキシランの含有率は、それぞれ３１．７％と１９．１％（乾燥ベース）であった。糖化プロセスは次の通りであった。２０ｇのＡＦＥＸ前処理コーンストーバーを、５ｍｌの１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．８、２．２５ｍｌのアセレラーゼ１０００、０．１ｍｌのグリンダミルＨ１２１（製パン業界用のアスペルギルス・ニゲル由来のＤａｎｉｓｃｏキシラナーゼ製品）、および７２．６５ｍｌのＤＩ水とともに５００ｍｌフラスコに添加した。フラスコをオービタルシェーカー内に置き、５０℃で９６時間インキュベートした。シェーカーからサンプルを１つ採取し、ＨＰＬＣを用いて分析した。この加水分解物は、３８．５ｇ／ｌのグルコース、２１．８ｇ／ｌのキシロース、および１０．３ｇ／ｌのグルコースおよび／またはキシロースのオリゴマーを含有していた。

【0477】

ＶＩ．流加培養で増殖した大腸菌におけるイソプレン産出に対する酵母抽出物の影響
上記のｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳプラスミドを含有する大腸菌細胞に関して記載したように、１４Ｌスケールで発酵を行なった。酵母抽出物（Ｂｉｏ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を指数関数的割合で供給した。発酵槽に送達した酵母抽出物の総量は、４０時間の発酵の間に７０から８３０ｇの間で変動した。発酵液体培地の光学密度を５５０ｎｍの波長で測定した。発酵槽内の最終的な光学密度は、添加された酵母抽出物の量に比例した（図４８Ａ）。発酵槽からの発生ガス中のイソプレンレベルを先に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に増加した（図４８Ｂ）。産出されたイソプレンの量は、供給された酵母抽出物の量に直線的に比例した（図４８Ｃ）。

【0478】

ＶＩＩ．ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ ｙＩＤＩの５００Ｌ発酵におけるイソプレンの産出
クズイソプレンシンターゼ、サッカロミセス・セレビシエＩＤＩ、および大腸菌ＤＸＳ核酸（大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３） ｐＴｒｃ Ｋｕｄｚｕ ｄｘｓ ｙｉｄｉ）を有する大腸菌細胞の５００リットル発酵を用いて、イソプレンを産出した。イソプレンのレベルは、１５時間の間に５０から３００μｇ／Ｌの間で変動した。平均イソプレン濃度、装置を通る平均流量およびイソプレン分解の散逸（breakthrough）に基づくと、回収されたイソプレンの量は約１７ｇと計算された。

【0479】

ＶＩＩＩ．流加培養で増殖した大腸菌の５００Ｌ発酵におけるイソプレンの産出
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０.３ｇ、酵母抽出物０.５ｇ、１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した。アンモニアガス（ＮＨ_３）でｐＨを７.０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０g、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0480】

１０００×改変微量金属溶液：
クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にＤＩＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0481】

ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳプラスミドを含有する大腸菌細胞を含む５００Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）でグルコースと酵母抽出物からのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をソイトン−酵母抽出物−グルコース培地中に調製した。種菌をＯＤが０．１５になるまで増殖させ、５５０ｎｍで測定し、２０ｍｌを用いて、２．５Ｌのソイトン−酵母抽出物−グルコース培地を含有するバイオリアクターに植菌した。２．５ＬのバイオリアクターをＯＤが１．０になるまで３０℃で増殖させ、２．０Ｌを５００Ｌバイオリアクターに移した。

【0482】

酵母抽出物（Ｂｉｏ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）とグルコースを指数関数的割合で供給した。５０時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースと酵母抽出物の総量は、ぞれぞれ、１８１．２ｋｇと１７．６ｋｇであった。バイオリアクター内の経時的な光学密度を図４９Ａに示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルを先に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に増加した（図４９Ｂ）。５０時間の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は５５．１ｇであった。産出の時間経過を図４９Ｃに示す。

【0483】

実施例８：クズイソプレンシンターゼと組換えメバロン酸経路遺伝子を発現する大腸菌におけるイソプレンの産出
Ｉ．下流ＭＶＡ経路のクローニング
下流メバロン酸経路のクローニング戦略は以下の通りであった。メバロン酸生合成経路の４つの遺伝子；メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）およびイソペンテニルジホスホイソメラーゼ遺伝子をサッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡからＰＣＲで増幅し、個々にｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。場合によっては、ｉｄｉ遺伝子を大腸菌染色体ＤＮＡから増幅した。大腸菌コンセンサスＲＢＳ（ＡＧＧＡＧＧＴ（配列番号８２）またはＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号８３））が、５’末端で、開始コドンの８ｂｐ上流に挿入され、ＰｓｔＩ部位が３’末端で付加されるように、プライマーを設計した。次に、これらの遺伝子を経路全体がアセンブルされるまで１つずつｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにクローニングした。

【0484】

サッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ由来の染色体ＤＮＡを、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ２０４５０８Ｄ）から得た。製造元の取扱説明書の通りにＰｆｕＴｕｒｂｏを用いて、プライマー、ＭＶＫＦ（５’−ＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＴＴＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧＣ、配列番号８４）およびＭＶＫ−Ｐｓｔ１−Ｒ（５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＧＴＧ、配列番号８５）を用いて、ＭＶＫ遺伝子をサッカロミセス・セレビシエの染色体から増幅した。サイズの正しいＰＣＲ産物（１３７０ｂｐ）を、１．２％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通した電気泳動で同定し、ｐＺｅｒｏＢＬＵＮＴ ＴＯＰＯにクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＶＫ１と命名した。このプラスミドｐＭＶＫ１を制限エンドヌクレアーゼのＳａｃＩとＴａｑ１で消化し、その断片をゲル精製して、ＳａｃＩとＢｓｔＢＩで消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂに連結した。得られたプラスミドをｐＴｒｃＭＶＫ１と名付けた。

【0485】

メバロン酸生合成経路中の２番目の遺伝子であるＰＭＫを、プライマー：ＰｓｔＩ−ＰＭＫ１ Ｒ（５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＣ、配列番号８６）およびＢｓｉＨＫＡ Ｉ−ＰＭＫ１ Ｆ（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧ、配列番号８７）を用いたＰＣＲで増幅させた。製造元の取扱説明書の通りにＰｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲ反応を行なった。サイズの正しい産物（１３８７ｂｐ）をＰｓｔＩとＢｓｉＨＫＩで消化し、ＰｓｔＩで消化したｐＴｒｃＭＶＫ１に連結した。得られたプラスミドをｐＴｒｃＫＫと名付けた。ＭＶＤ遺伝子とｉｄｉ遺伝子を同じようにクローニングした。ＭＶＤ遺伝子を増幅するために、プライマー対のＰｓｔＩ−ＭＶＤ １ Ｒ（５’−ＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣ、配列番号８８）およびＮｓｉＩ−ＭＶＤ １ Ｆ（５’−ＧＴＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧ、配列番号８９）を用いて、ｙＩＤＩ遺伝子を増幅するために、プライマー対のＰｓｔＩ−ＹＩＤＩ １ Ｒ（５’−ＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＣ、配列番号７９）およびＮｓｉＩ−ＹＩＤＩ １ Ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣ、配列番号７８）を用いて、ＰＣＲを行った。場合によって、大腸菌由来のＩＰＰイソメラーゼ遺伝子であるｉｄｉを用いた。大腸菌染色体ＤＮＡからｉｄｉを増幅するために、以下のプライマーセットを用いた：ＰｓｔＩ−ＣＩＤＩ １ Ｒ（５’−ＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧ、配列番号９０）およびＮｓｉＩ−ＣＩＤＩ １ Ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧ、配列番号９１）。鋳型ＤＮＡは、標準的な方法で大腸菌ＦＭ５から単離された染色体ＤＮＡであった（ＷＯ９６／３５７９６号およびＷＯ２００４／０３３６４６号、これらは各々、特に、核酸の単離に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。最終的なプラスミドを、酵母ｉｄｉ遺伝子コードする構造体を表すｐＫＫＤＩｙまたは大腸菌ｉｄｉ遺伝子をコードする構造体を表すｐＫＫＤＩｃと名付けた。後に解析するために、これらのプラスミドを大腸菌宿主ＢＬ２１に形質転換した。場合によって、クズ由来のイソプレンシンターゼをｐＫＫＤＩｙにクローニングして、プラスミドｐＫＫＤＩｙＩＳを得た。

【0486】

下流ＭＶＡ経路を、カナマイシン抗生物質耐性マーカーを含有するｐＴｒｃにもクローニングした。プラスミドｐＴｒｃＫＫＤＩｙを制限エンドヌクレアーゼのＡｐａＩとＰｓｔＩで消化し、５９３０ｂｐ断片を１．２％アガロースＥ−ゲル上で分離し、製造元の取扱説明書に従ってＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製した。実施例７に記載のプラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ Ｋａｎを制限エンドヌクレアーゼのＡｐａＩとＰｓｔＩで消化し、このベクターを含有する３３３８ｂｐ断片を、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルから精製した。この３３３８ｂｐのベクター断片と５９３０ｂｐの下流ＭＶＡ経路断片を、Ｒｏｃｈｅクイックライゲーションキットを用いて連結した。このライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択しながら、３７℃で一晩増殖させた。形質転換体を制限酵素消化で確認し、１つをストックとして凍結させた。このプラスミドをｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙと命名した。

【0487】

ＩＩ．ｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙへのクズイソプレンシンターゼ遺伝子のクローニング
クズイソプレンシンターゼ遺伝子を、プライマーのＭＣＭ５０ ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＣＴ（配列番号９２）およびＭＣＭ５３ ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）を用いて、実施例１に記載のｐＴｒｃＫｕｄｚｕからＰＣＲで増幅させた。得られたＰＣＲ断片をｐＣＲ２．１にクローニングし、大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。この断片は、クズイソプレンシンターゼのコード配列と、大腸菌由来のＲＢＳを含有する上流領域とを含有する。形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択しながら、３７℃で一晩インキュベートした。断片の正しい挿入をシークエンシングで確認し、この株をＭＣＭ９３と命名した。

【0488】

ＭＣＭ９３株由来のプラスミドを制限エンドヌクレアーゼのＮｓｉＩとＰｓｔＩで消化して、ＲＢＳとクズイソプレンシンターゼとを含有する１７２４ｂｐ挿入物を遊離させた。この１７２４ｂｐ断片を１．２％アガロースＥ−ゲル上で分離し、製造元の取扱説明書に従ってＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製した。プラスミドｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰを用いて３７℃で３０分間処理し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製した。このプラスミドとクズイソプレンシンターゼをコードするＤＮＡ断片を、Ｒｏｃｈｅクイックライゲーションキットを用いて連結した。このライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌでカナマイシンを含有するＬＡ上で選択しながら、形質転換体を３７℃で一晩増殖させた。正しい形質転換体を制限消化で確認し、このプラスミドをｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳＫａｎと命名した（図２４および２５；配列番号１１）。このプラスミドをＢＬ２１（λＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。

【0489】

ＩＩＩ．クズ由来の組換え下流メバロン酸経路とイソプレンシンターゼを発現する大腸菌におけるメバロン酸からのイソプレン産出
ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳＫａｎ株を、ｐＨを７．１に調整し、０．５％グルコースおよび０．５％メバロン酸を補充したＭＯＰＳ培地（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９７４） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １１９：７３６−７４７）中で培養した。同一条件を用いるが、０．５％メバロン酸を添加しないで、対照培養物も用意した。培養を１％の種菌を含む終夜種培養物から始め、培養物が０．３〜０．５のＯＤ_６００に達したときに５００μＭのＩＰＴＧで誘導した。この培養物を２５０ｒｐｍで振盪させながら３０℃で増殖させた。誘導して３時間後、実施例１に記載のヘッドスペースアッセイを用いてイソプレンの産出を分析した。イソプレンの最大産出は、６．６７×１０^−４ｍｏｌ／Ｌ_液体培地／ＯＤ_６００／時間（ここで、Ｌ_液体培地は液体培地の容積であり、細胞培地の容積と細胞の容積の両方を含む）であった。メバロン酸を添加していない対照培養物は、測定可能なイソプレンを産出しなかった。

【0490】

ＩＶ．上流ＭＶＡ経路のクローニング
３つの酵素活性をコードする２つの遺伝子を含む、上流メバロン酸生合成経路を、エンテロコックス・フェカーリスからクローニングした。ｍｖａＥ遺伝子は、この経路の最初のタンパク質と３番目のタンパク質である、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼと３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼの両方の酵素活性を持つタンパク質をコードしており、ｍｖａＳ遺伝子は、この経路中の２番目の酵素である、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている。ｍｖａＥ遺伝子を、以下のプライマーを用いて、大腸菌リボソーム結合部位とスペーサーとを前に付けて、Ｅ．フェカーリスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７００８０２Ｄ−５）から増幅させた。
ＣＦ ０７−６０（＋） ｍｖａＥの開始点（ＲＢＳを含む）＋ＡＴＧ開始コドン ＳａｃＩ

５’−ＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号９３）

ＣＦ ０７−６２（−） ｍｖａＥをその間にあるＲＢＳとともにｍｖａＳと融合する

５’−ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣ（配列番号９４）

【0491】

ｍｖａＳ遺伝子を、以下のプライマーを用いて、大腸菌由来のＲＢＳとスペーサーを前に付けて、Ｅ．フェカーリスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７００８０２Ｄ−５）から増幅させた。
ＣＦ ０７−６１（＋） ｍｖａＥをその間にあるＲＢＳとともにｍｖａＳと融合する

５’−ＧＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡ（配列番号９５）

ＣＦ ０７−１０２（−） ｍｖａＳ遺伝子の終点 ＢｇｌＩＩ

５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号９６）

【0492】

ＰＣＲ断片を、以下のプライマーを用いるＰＣＲで１つに融合した。
ＣＦ ０７−６０（＋） ｍｖａＥの開始点（ＲＢＳを含む）＋ＡＴＧ開始コドン ＳａｃＩ

５’−ＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号９３）

ＣＦ ０７−１０２（−） ｍｖａＳ遺伝子の終点 ＢｇｌＩＩ

５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号９６）

【0493】

融合ＰＣＲ断片を、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて精製し、制限酵素のＳａｃＩとＢｇｌＩＩで消化した。この消化したＤＮＡ断片を、Ｑｉａｇｅｎキットを用いてゲル精製し、ＳａｃＩとＢｇｌＩＩで消化し、ゲル精製しておいた市販のベクターｐＴｒｃＨｉｓ２Ａに連結した。

【0494】

ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、コロニーをＬＡ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリンプレート上で選択した。合計６つのコロニーを選び、ＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中で一晩増殖させ、Ｑｉａｇｅｎキットを用いてプラスミドを単離した。このプラスミドをＳａｃＩとＢｇｌＩＩで消化して、挿入物について調べ、１つの正しいプラスミドを、以下のプライマーを用いてシークエンシングした。
ＣＦ ０７−５８（＋） ｍｖａＥ遺伝子の開始点

５’−ＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号９７）

ＣＦ ０７−５９（−） ｍｖａＥ遺伝子の終点

５’−ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号９８）

ＣＦ ０７−８２（＋） ｍｖａＳ遺伝子の開始点

５’−ＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号９９）

ＣＦ ０７−８３（−） ｍｖａＳ遺伝子の終点

５’−ＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１００）

ＣＦ ０７−８６（＋） ｍｖａＥ中の配列

５’−ＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＣ（配列番号１０１）

ＣＦ ０７−８７（＋） ｍｖａＥ中の配列

５’−ＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣ（配列番号１０２）

ＣＦ ０７−８８（＋） ｍｖａＥ中の配列

５’−ＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号１０３）

ＣＦ ０７−８９（＋） 配列ｍｖａＳ

５’−ＧＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号１０４）

【0495】

ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１と呼ばれるプラスミドは、シークエンシングにより正しかった。これを市販の大腸菌株ＢＬ２１に形質転換した。ＬＡ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン上で選択を行なった。２つの形質転換体を選び、ＯＤ_６００が１．５に達するまでＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中で増殖させた。両方の株を、グリセロールの存在下、バイアル中、−８０℃で凍結させた。株を、ＢＬ２１中のｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１（単離株＃１）についてはＣＦ ４４９、およびＢＬ２１中のｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１（単離株＃２）についてはＣＦ ４５０と命名した。解析したとき、両方のクローンは同一の挙動を示すことが分かった。

【0496】

Ｖ．上流ＭＶＡ経路のｐＣＬ１９２０へのクローニング
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙを制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩで消化して、ｐＴｒｃ−ｍｖａＥ−ｍｖａＳ−（Ｈｉｓタグ）−ターミネーターを含有する断片を遊離させた。この断片では、ｈｉｓタグは翻訳されなかった。この平滑末端の４．５ｋｂｐ断片をＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルから精製した。ベクターを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで消化し、ＳＡＰで処理し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルから精製することにより、ｐＣＬ１９２０由来のリン酸化された平滑末端の４．２ｋｂｐ断片を調製した。２つの断片をＲｏｃｈｅ迅速ライゲーションキットを用いて連結し、ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換した。形質転換体をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択した。ＰＣＲで挿入物の存在をスクリーニングすることにより、正しいコロニーを同定した。このプラスミドをｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙと命名した（図２６および２７Ａ〜２７Ｄ；配列番号１２）。

【0497】

ＶＩ．組み合わせた上流メバロン酸経路と下流メバロン酸経路を発現する株
完全なメバロン酸経路とクズイソプレンシンターゼとを有する株を得るために、プラスミドｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳｋａｎおよびｐＣＬｐＴｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙを両方ともＢＬ２１（λＤＥ３）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択した。形質転換体をプラスミドプレップで調べて、両方のプラスミドが宿主内に保持されていることを保証した。この株をＭＣＭ１２７と命名した。

【0498】

ＶＩＩ．大腸菌／ｐＵｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙにおけるグルコースからのメバロン酸の産出
ＢＬ２１／ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ−ｍｖａＥ／ｍｖａＳまたはＦＭ５／ｐ ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ−ｍｖａＥ／ｍｖａＳの単一コロニーをＬＢ＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）に植菌し、２００ｒｐｍで振盪させながら３７℃で一晩増殖させる。これらの培養物を、ＯＤ_６００が０．１になるまで２５０ｍｌバッフル付きフラスコ中の５０ｍｌ培地中に希釈する。この培地は、ＴＭ３＋１または２％グルコース＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）またはＴＭ３＋１％グルコース＋加水分解した大豆油＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）またはＴＭ３＋バイオマス（調製済みのバガス、コーンストーバーまたはスイッチグラス）であった。培養物を、２００ｒｐｍで振盪させながら、ＯＤ_６００が０．４に達するまで３０℃で約２〜３時間増殖させた。この時点で、ＩＰＴＧ（４００μＭ）を添加することにより、ｍｖａＥ ｍｖａＳ構造体からの発現を誘導した。培養物をさらに２０または４０時間インキュベートし、２時間間隔で誘導６時間後まで、また、その後、必要に応じて２４、３６および４８時間でサンプルを採取した。サンプリングは、１ｍｌの培養物を取り出し、そのＯＤ_６００を測定し、微量遠心管中で細胞をペレット化し、上清を除去し、それをメバロン酸について分析することにより行なった。

【0499】

エンテロコックス・フェカーリスＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードする核酸を有する大腸菌細胞の１４リットル発酵は、ＴＭ３培地と２％グルコースを細胞培地として用いた場合、２２グラムのメバロン酸を産出した。これらの細胞の振盪フラスコは、ＬＢ培地と１％グルコースを細胞培養培地として用いた場合、１リットル当たり２〜４グラムのメバロン酸を産出した。これらの株におけるメバロン酸の産出は、ＭＶＡ経路が大腸菌内で機能的であることを示した。

【0500】

ＶＩＩＩ．上流ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路＋クズイソプレンシンターゼを含有する大腸菌ＢＬ２１からのイソプレンの産出
上記の上流ＭＶＡ経路遺伝子および下流ＭＶＡ経路遺伝子およびクズイソプレンシンターゼ遺伝子を含有するプラスミドと、実施例７に記載のｉｄｉ遺伝子、ｄｘｓ遺伝子、およびｄｘｒ遺伝子ならびにイソプレンシンターゼ遺伝子を含有するプラスミドの様々な組合せで形質転換することにより以下の株を作製した。使用した宿主細胞は化学的コンピテントＢＬ２１（λＤＥ３）であり、形質転換は標準的な方法により行なった。形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはカナマイシン＋スペクチノマイシン（両方とも５０μｇ／ｍｌの濃度）を含有するＬ寒天上で選択した。プレートを３７℃で増殖させた。得られた株を次のように命名した。
カナマイシン＋スペクチノマイシン（各５０μｇ／ｍｌ）上で増殖したもの
ＭＣＭ１２７−ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ＋ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
ＭＣＭ１３１−ｐＣＬ１９２０＋ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
ＭＣＭ１２５−ｐＣＬ 上流 ＭＶＡ＋ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）

カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）上で増殖したもの
ＭＣＭ６４−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩＤＸＳ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
ＭＣＭ５０−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
ＭＣＭ１２３−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩＤＸＳ ＤＸＲ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）

【0501】

上記の株を凍結ストックからＬＡ＋適当な抗生物質にストリークし、３７℃で一晩増殖させた。各プレート由来の単一コロニーを用いて振盪フラスコ（２５ｍｌのＬＢ＋適当な抗生物質）に植菌した。このフラスコを２００ｒｐｍで振盪させながら２２℃で一晩インキュベートした。翌朝、フラスコを３７℃インキュベーターに移し、２００ｒｐｍで振盪させながらさらに４．５時間増殖させた。２５ｍｌ培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、この細胞を５ｍｌのＬＢ＋適当な抗生物質に再懸濁した。次に、この培養物を、ＯＤ_６００が０．１になるまで２５ｍｌのＬＢ＋１％グルコース＋適当な抗生物質中に希釈した。各株に２つのフラスコを用意し、１つの組はＩＰＴＧ（８００μＭ）で誘導し、２つ目の組は誘導しなかった。培養物を２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃でインキュベートした。これらの培養物のうちの１つの組を１．５０時間後（サンプリング時点１の直後）に誘導した。各サンプリング時点で、ＯＤ_６００を測定し、実施例１に記載したようにイソプレンの量を決定した。結果を表３に示す。生成されたイソプレンの量は、特定の株についてのピーク産出時の量として示されている。

【表3】

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【0502】

ＩＸ．メバロン酸の分析
メバロノラクトン（１．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ＃５０３−４８−０）は、シロップとしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＷＩ，ＵＳＡ）から供給された。これは、メバロン酸のカリウム塩を生成するために水（７．７ｍＬ）に溶解され、水酸化カリウム（７．７ｍｍｏｌ）で処理された。メバロン酸への変換は^１Ｈ ＮＭＲ分析により確認した。ＨＰＬＣ分析用のサンプルは、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を除去し、次いで上清のアリコート３００μｌを９００μｌのＨ_２Ｏに添加して調製した。次に、過塩素酸（３６μｌの７０％溶液）を添加し、その後、混合して、氷上で５分間冷却させた。次に、サンプルを再度遠心分離し（１４，０００ｒｐｍ、５分間）、上清をＨＰＬＣにかけた。メバロン酸標準（２０、１０、５、１および０．５ｇ／Ｌ）を同じように調製した。メバロン酸（２０μＬ注入容量）の分析は、屈折率（ＲＩ）を検出しながら、５ｍＭ硫酸を０．６ｍＬ／分で用いて溶出させるＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ８７−Ｈ＋カラム（３００ｍｍ×７．０ｍｍ）を用いるＨＰＬＣで行なった。これらの条件下では、メバロン酸は、１８．５分でラクトン形態として溶出した。

【0503】

Ｘ．上流ＭＶＡ経路＋クズイソプレンシンターゼを含有する大腸菌ＢＬ２１からのイソプレンの産出
メバロン酸経路ポリペプチドとクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、流加培養された細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、グルコース制限条件下で細胞を増殖させることにより、２．２ｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。

【0504】

培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液は加圧滅菌された。水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0505】

１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0506】

ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙプラスミド（図２６）およびｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをソイトン−酵母抽出物−グルコース培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定したときに種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。

【0507】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５４時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３．７ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_５５０）が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ_５５０が１９０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。発酵して３８時間でＩＰＴＧ濃度を１００μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図５４に示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２．２ｇ／Ｌまで増加した（図５５）。５４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１５．９ｇであった。産出の時間経過を図５６に示す。

【0508】

ＸＩ．メバロン酸経路の遺伝子を発現し、１５Ｌスケールの流加培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
メバロン酸経路ポリペプチドとクズイソプレンシンターゼとを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、流加培養された細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、グルコース制限条件下で細胞を増殖させることにより、３．０ｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。

【0509】

培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0510】

１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ， Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0511】

ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドとｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。

【0512】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５９時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、２．２ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_５５０）が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ_５５０が１９０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図９３に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値３．０ｇ／Ｌまで増加した（図９４）。５９時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は２２．８ｇであった。産出の時間経過を図９５に示す。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は２．２％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は１．０％であった。

【0513】

ＸＩＩ．メバロン酸経路の遺伝子を発現し、１５Ｌスケールの流加培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
メバロン酸経路ポリペプチド、クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）イソプレンシンターゼ、およびクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、流加培養された細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、グルコース制限条件下で細胞を増殖させることにより、３．３ｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。

【0514】

ｉ）ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２の構築
クズ由来のイソプレンシンターゼをコードする遺伝子を、プライマーのＮｓｉＩ−ＲＢＳ−ＨＧＳ Ｆ（ｃｔｔｇＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧ、配列番号１０５）およびｐＴｒｃ Ｒ（ＣＣＡＧＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧ、配列番号１０６）と、鋳型としてのｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳとを用いてＰＣＲ増幅した。このようにして得られたＰＣＲ産物をＮｓｉＩとＰｓｔＩで制限消化し、ゲル精製した。プラスミドｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙをＰｓｔＩで制限消化し、製造元の取扱説明書に従ってｒＡＰｉｄアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて脱リン酸化した。

【0515】

これらのＤＮＡ断片を１つに連結し、ライゲーション反応液を大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋスピンミニプレップキットを用いて６つのコロニーから調製した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素のＥｃｏＲＶとＭｌｕＩで消化し、挿入物が正しい向きを有するクローン（すなわち、ｐＴｒｃプロモーターと同じ方向に向いた遺伝子）を同定した。

【0516】

得られた正しいプラスミドをｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２と命名した。このプラスミドを本明細書に記載のヘッドスペースアッセイを用いてアッセイし、大腸菌Ｔｏｐ１０においてイソプレンを産出することが分かった。したがって、この遺伝子の機能性を確認した。プラスミドをｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳを含有するＢＬ２１（ＬＤＥ３）に形質転換して、ＢＬ２１／ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２−ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ株を得た。この株は、ＢＬ２１／ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡ＋ｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳ株（実施例８、第ＸＩ部）と比べて、余分なコピーのイソプレンシンターゼを有する。この株はまた、実施例８、第ＸＩ部で使用されたＢＬ２１／ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡ＋ｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳ株と比べて、ＨＭＧＳの発現と活性が増加していた。

【0517】

ｉｉ）ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２−ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳを発現し、１５Ｌスケールの流加培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0518】

１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ， Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで滅菌濾過した。

【0519】

ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２プラスミドとｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。

【0520】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５８時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、２．１ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ_５５０が１７０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図１０４に示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値３．３ｇ／Ｌまで増加した（図１０５）。５８時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は２４．５ｇであった。産出の時間経過を図１０６に示す。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は２．５％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は１．２％であった。分析により、イソプレンシンターゼの活性が、ＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドとｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＢＬ２１と比較して約３〜４倍増加したことが示された（データは示さない）。

【0521】

ＸＩＩＩ．大腸菌における下流メバロン酸経路の染色体組込み
メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼを含有する合成オペロンを大腸菌の染色体に組み込んだ。所望により、様々なプロモーターをオペロンの５’に組み込むことにより、発現を変化させてもよい。

【表4】

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【0522】

ｉ）標的ベクター構築
ａｔｔＴｎ７部位を組込み用に選択した。上流（ａｔｔＴｎ７ ｕｐ）（プライマー、ＭＣＭ７８およびＭＣＭ７９）と下流（ａｔｔＴｎ７ ｄｏｗｎ）（プライマー、ＭＣＭ８８およびＭＣＭ８９）の相同領域をＭＧ１６５５細胞からＰＣＲで増幅した。１μＬの１０μＭプライマー、３μＬのｄｄＨ２Ｏ、４５μＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙを含む５０μＬの反応液と、擦り取ったＭＧ１６５５のコロニーとを９４℃で２分間変性させ、２５サイクル繰り返し（９４℃で２分、５０℃で３０秒、および６８℃で１分）、７２℃で７分伸長させ、４℃に冷却した。この得られたＤＮＡを製造元の取扱説明書に従ってｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、プラスミドのＭＣＭ２７８（ａｔｔＴｎ７ ｕｐ）とＭＣＭ２５２（ａｔｔＴｎ７ ｄｏｗｎ）を得た。ＭＣＭ２５２から消化してゲル精製した８３２ｂｐのＡｐａＩ−ＰｖｕＩ断片を、ＡｐａＩ−ＰｖｕＩ消化し、ゲル精製したプラスミドｐＲ６Ｋにクローニングし、プラスミドＭＣＭ２７６を作製した。ＭＣＭ２７８から消化し、ゲル精製した８２５ｂｐのＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片を、ＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ消化し、ゲル精製したＭＣＭ２７６にクローニングし、プラスミドＭＣＭ２８１を作製した。

【0523】

ｉｉ）下流経路およびプロモーターのクローニング
ＭＶＫ−ＰＭＫ−ＭＶＤ−ＩＤＩ遺伝子を製造元の取扱説明書に従ってＲｏｃｈｅ Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ ＰＣＲシステムを用い、プライマーのＭＣＭ１０４とＭＣＭ１０５を用いてｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳから増幅した。この産物をＮｏｔＩとＡｐａＩで消化し、ＮｏｔＩとＡｐａＩで消化し、ゲル精製しておいたＭＣＭ２８１にクローニングした。プライマーのＭＣＭ１２０とＭＣＭ１２７を用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩを用いてＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴ鋳型ＤＮＡからＣＭＲカセットを増幅した。１μＬの約１０ｎｇ／μＬの鋳型、１μＬの各プライマー、１．２５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５μＬの１０×緩衝液、１μＬの酵素、および３９．７５μＬのｄｄＨ２０を含有する４つの５０μＬのＰＣＲ反応液で、９５℃で４分間の変性、５サイクルの９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で２分、２５サイクルの９５℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で２分、７２℃で１０分、その後４℃に冷却というＰＣＲプログラムを用いた。反応液をプールし、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラム上で精製し、これを用いて、プラスミドＭＣＭ２９６を含有する水で洗浄したＰｉｒ１細胞にエレクトロポレートした。エレクトロポレーションは、２ｍＭキュベット中、２．５Ｖおよび２００ｏｈｍで行なった。エレクトロポレーション反応体をＬＢ中、３０℃で３時間、回復させた。形質転換体ＭＣＭ３３０をＣＭＰ５、Ｋａｎ５０を含むＬＡ上で選択した（図１０７および１０８Ａ〜１０８Ｃ；配列番号２５）。

【0524】

ｉｉｉ）大腸菌染色体への組込み
ＭＣＭ３３０由来のミニプレップＤＮＡ（Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンキット）をＳｎａＢＩで消化し、これを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓプラスミドｐＲｅｄＥＴ Ｃａｒｂを含有するＭＧ１６５５にエレクトロポレートした。細胞を３０℃で約ＯＤ１まで増殖させた後、０．４％のＬ−アラビノースを用いて、３７℃で１．５時間誘導した。これらの細胞を４℃のｄｄＨ２Ｏ中で３回洗浄した後、細胞に２μＬのＤＮＡをエレクトロポレートした。組込み体をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で選択し、その後、Ｌ寒天＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）上で増殖しないことを確認した。ＢＬ２１組込み体ＭＣＭ３３１およびＭＧ１６５５組込み体ＭＣＭ３３３を凍結させた。

【0525】

ｉｖ）クズイソプレンシンターゼをコードするｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕの構築
クズイソプレンシンターゼ遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のｐＥＴ２４ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。特に、クズイソプレンシンターゼ遺伝子を、プライマーのＭＣＭ５０ ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴ ＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧ ＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡ ＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧ ＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣ ＴＣＡＡＴＴＴＡＣＴ（配列番号５２）およびＭＣＭ５３ ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧ ＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧ ＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣ ＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）を用いてｐＴｒｃＫｕｄｚｕ鋳型ＤＮＡから増幅した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ反応を行ない、得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有する５ｍｌのルリア液体培地培養液に単一の形質転換体を植菌し、３７℃で一晩増殖させた。１ｍｌの培養液（ルリア液体培地）から単離したプラスミドＤＮＡをシークエンシングすることにより、５つのコロニーを正しい挿入についてスクリーニングし、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＭＣＭ９３と命名された得られたプラスミドは、ｐＣＲ２．１骨格中にクズイソプレンシンターゼコード配列を含有している。

【0526】

クズコード配列をＰｃｉＩとＢａｍＨ１（Ｒｏｃｈｅ）を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により取り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ｐＥＴ２４ｄベクターＤＮＡをＮｃｏＩとＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。クズイソプレンシンターゼ断片を、迅速ＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＮｃｏＩ／ＢａｍＨ１消化したｐＥＴ２４ｄに総容量２０μｌ中５：１の断片対ベクター比で連結した。ライゲーション混合物（５μｌ）の一部を大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセルに形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にプレーティングした。正しい形質転換体をシークエンシングで確認し、化学的コンピテントＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で、３７℃で一晩増殖させた後、単一コロニーを選択した。ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕと命名された得られたプラスミドのマップを図１０９に示す。ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕの配列（配列番号２６）を図１１０Ａおよび１１０Ｂに示す。イソプレンシンターゼ活性は、ヘッドスペースアッセイを用いて確認した。

【0527】

ｖ）産出株
ＭＣＭ３３１株とＭＣＭ３３３株にプラスミドｐＣＬＰｔｒｃｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙとｐＴｒｃＫｕｄｚｕまたはｐＥＴＫｕｄｚｕのいずれかを共形質転換し、表５に示す株を得た。

【表5】

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【0528】

ｖｉ）メバロン酸経路の遺伝子を発現し、１５Ｌスケールの流加培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0529】

１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0530】

上記のｇｉ１．２組込み下流ＭＶＡ経路とｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃＫｕｄｚｕプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。

【0531】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５７時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３．９ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。二酸化炭素発生速度が１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間に達したときＩＰＴＧ濃度を１００μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図１１１Ａに示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値１．６ｇ／Ｌまで増加した（図１１１Ｂ）。イソプレン発酵の間の比生産性が図１１１Ｃに示されており、１．２ｍｇ／ＯＤ／時間でピークであった。５７時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１６．２ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は０．９％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は０．４％であった。

【0532】

ＸＩＶ．グリセロールを炭素源として用いたクズイソプレンシンターゼを含有する大腸菌ＢＬ２１からのイソプレンの産出
クズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、流加培養でグリセロールを供給した細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、グリセロール（グルコースなし）の存在下で細胞を増殖させることにより、２．２ｍｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。

【0533】

培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した。水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グリセロール５．１ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0534】

１０００×改変微量金属溶液：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0535】

ｐＴｒｃＫｕｄｚｕプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３５℃）におけるグリセロールからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＡ液体培地寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをソイトン−酵母抽出物−グルコース培地中に植菌し、３５℃で増殖させた。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、６００ｍＬを用いて、７．５Ｌバイオリアクターに植菌した。

【0536】

細胞が１５３という５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_５５０）に達するまでグリセロールを指数関数的割合で供給した。３６時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されるグリセロールの総量は１．７ｋｇであった。種菌中のグルコース以外に、グルコースはバイオリアクターに添加されなかった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。ＯＤ_５５０が５０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２０μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図５７に示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２．２ｍｇ／Ｌまで増加した（図５８）。５４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は２０．９ｍｇであった。産出の時間経過を図５９に示す。

【0537】

ＸＶ．メバロン酸経路の遺伝子を発現し、転化糖を炭素源として用いた１５Ｌスケールの流加培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
メバロン酸経路ポリペプチドとクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、流加培養で転化糖を供給した細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、転化糖の存在下で細胞を培養することにより、２．４ｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。

【0538】

培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した。水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。転化糖１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0539】

１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで滅菌濾過した。

【0540】

ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドとｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）における転化糖からのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。

【0541】

細胞が定常期に達するまで転化糖を指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるように転化糖供給を減らした。４４時間の発酵の間にバイオリアクターに送達される転化糖の総量は２．４ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ_５５０が２００に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図９６に示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２．４ｇ／Ｌまで増加した（図９７）。４４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１８．４ｇであった。産出の時間経過を図９８に示す。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１．７％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は０．８％であった。

【0542】

実施例９．枯草菌に組み込むための上流ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路の構築
Ｉ．枯草菌における上流ＭＶＡ経路の構築
エンテロコックス・フェカーリス由来の上流経路をａｐｒＥプロモーターの制御下に枯草菌に組み込む。この上流経路は、２つの遺伝子；ｍｖａＥ（これはＡＡＣＴおよびＨＭＧＲをコードする）とｍｖａＳ（これはＨＭＧＳをコードする）からなる。この２つの遺伝子は、間に終止コドンを挟み、ＲＢＳ部位をｍｖａＳの前にして１つに融合され、ａｐｒＥプロモーターの制御下に置かれる。ターミネーターはｍｖａＥ遺伝子の後に置かれる。クロラムフェニコール耐性マーカーをｍｖａＥ遺伝子の後ろにクローニングし、この構造体を相同な隣接領域を用いた二重乗換えによってａｐｒＥ遺伝子座に組み込む。

【0543】

４つのＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応で１つに融合されることができる突出を含有するように、ＰＣＲで増幅する。製造元の説明書に従ってＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を行なう。
１．ＰａｐｒＥ
ＣＦ ０７−１３４（＋） ａｐｒＥプロモーターの開始点 ＰｓｔＩ

５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１１５）

ＣＦ ０７−９４（−） ＰａｐｒＥをｍｖａＥに融合する

５’−ＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＡ（配列番号１１６）

鋳型：枯草菌染色体ＤＮＡ

２．ｍｖａＥ
ＣＦ ０７−９３（＋） ｍｖａＥをａｐｒＥプロモーター（ＧＴＧ開始コドン）に融合する

５’−ＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号１１７）

ＣＦ ０７−６２（−） ｍｖａＥを間にあるＲＢＳとともにｍｖａＳに融合する

５’−ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣ（配列番号９４）

鋳型：エンテロコックス・フェカーリス染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣから得た）

３．ｍｖａＳ
ＣＦ ０７−６１（＋） ｍｖａＥを間にあるＲＢＳとともにｍｖａＳに融合する

５’−ＧＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡ（配列番号９５）

ＣＦ ０７−１２４（−） ｍｖａＳの末端をターミネーターに融合する

５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１１８）

鋳型：エンテロコックス・フェカーリス染色体ＤＮＡ

４．Ｂ．アミロリケファシエンスアルカリ性セリンプロテアーゼターミネーター
ＣＦ ０７−１２３（＋） ｍｖａＳの終点をターミネーターに融合する

５’−ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ（配列番号１１９）

ＣＦ ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンスの終点 ターミネーター ＢａｍＨＩ

５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）

鋳型：バシルス・アミリケファシエンス染色体ＤＮＡ

ＰＣＲ融合反応
５．ｍｖａＥをｍｖａＳに融合する
ＣＦ ０７−９３（＋） ｍｖａＥをａｐｒＥプロモーター（ＧＴＧ開始コドン）に融合する

５’−ＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号１１７）

ＣＦ ０７−１２４（−） ｍｖａＳの末端をターミネーターに融合する

５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１１８）

鋳型：上記の＃２および＃３

６．ｍｖａＥ−ｍｖａＳをａｐｒＥプロモーターに融合する
ＣＦ ０７−１３４（＋） ａｐｒＥプロモーターの開始点 ＰｓｔＩ

５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１１５）

ＣＦ ０７−１２４（−） ｍｖａＳの末端をターミネーターに融合する

５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１１８）

上記の鋳型＃１および＃４

７．ＰａｐｒＥ−ｍｖａＥ−ｍｖａＳをターミネーターに融合する
ＣＦ ０７−１３４（＋） ａｐｒＥプロモーターの開始点 ＰｓｔＩ

５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１１５）

ＣＦ ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンスの終点 ターミネーター ＢａｍＨＩ

５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）

鋳型：＃４および＃６

【0544】

産物を制限エンドヌクレアーゼのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化されているｐＪＭ１０２に連結する（Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ，ａｎｄ Ｒ．Ｌｏｓｉｃｋ（編），Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．中のＰｅｒｅｇｏ，Ｍ．１９９３．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｐ．６１５−６２４）。このライゲーション液を大腸菌ＴＯＰ １０化学的コンピテントセルに形質転換し、形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択する。正しいプラスミドをシークエンシングで同定し、ｐＪＭＵｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２と命名する（図５０および５１；配列番号２２）。精製したプラスミドＤＮＡを枯草菌ａｐｒＥｎｐｒＥ Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫに形質転換し、形質転換体をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で選択する。正しいクローンを選択し、１０、１５および２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天上に順次プレーティングして、上流経路を含有するカセットのコピー数を増幅する。

【0545】

１％グルコースと１％を含有するＬＢ中で増殖させることにより、得られた株をメバロン酸産出について試験する。培養物をメバロン酸の産出についてＧＣで分析する。

【0546】

この株は、後に、下流メバロン酸経路を組み込むための宿主として用いる。

【0547】

以下のプライマーを用いて、上記の様々な構造体をシークエンシングする。
シークエンシングプライマー：
ＣＦ ０７−１３４（＋） ａｐｒＥプロモーターの開始点 ＰｓｔＩ

５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１１５）

ＣＦ ０７−５８（＋） ｍｖａＥ遺伝子の開始点

５’−ＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号９７）

ＣＦ ０７−５９（−） ｍｖａＥ遺伝子の開始点

５’−ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号９８）

ＣＦ ０７−８２（＋） ｍｖａＳ遺伝子の開始点

５’−ＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号９９）

ＣＦ ０７−８３（−） ｍｖａＳ遺伝子の終点

５’−ＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１００）

ＣＦ ０７−８６（＋） ｍｖａＥ中の終点

５’−ＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＣ（配列番号１０１）

ＣＦ ０７−８７（＋） ｍｖａＥ中の配列

５’−ＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣ（配列番号１０２）

ＣＦ ０７−８８（＋） ｍｖａＥ中の配列

５’−ＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号１０３）

ＣＦ ０７−８９（＋） 配列ｍｖａＳ

５’−ＧＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号１０４）

【0548】

形質転換体を５μｇ／ｍｌの濃度のクロラムフェニコールを含有するＬＡ上で選択する。あるコロニーが正しい組込みを有することをシークエンシングで確認し、最終レベル２５μｇ／ｍｌまで数日かけて増加する濃度のクロラムフェニコールを含有するＬＡ上にプレーティングする。これにより、目的の遺伝子を含有するカセットが増幅される。得られた株をＣＦ ４５５：ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ＃１×Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ ａｐｒＥｎｐｒＥ Ｐｘｙｌ ｃｏｍＫと命名する（増幅して、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬＡ上で増殖させる）。

【0549】

ＩＩ．枯草菌における下流ＭＶＡ経路の構築
遺伝子ｍｖｋ１、ｐｍｋ、ｍｐｄおよびｉｄｉからなる下流ＭＶＡ経路を、枯草菌染色体（組込み部位）のｎｐｒＥ領域由来の隣接ＤＮＡ領域、ａｐｒＥプロモーター、およびスペクチノマイシン耐性マーカーからなるカセット中で組み合わせる（図２８および２９；配列番号１３参照）。このカセットをＤＮＡ２．０により合成し、ａｐｒＥ遺伝子座に組み込まれた上流ＭＶＡ経路を含有する枯草菌の染色体に組み込む。このクズイソプレンシンターゼ遺伝子を実施例４に記載の複製プラスミドから発現させ、上流経路と下流経路の両方が組み込まれた株に形質転換する。

【0550】

実施例１０：例示的なイソプレン組成物とその作製方法
Ｉ．イソプレンを含有する発酵発生ガスの組成分析
イソプレノイド前駆体生合成のための完全なメバロン酸経路をコードする２つのプラスミド（ｐＣＬ ｕｐｐｅｒＭｅｖ；ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ）、酵母由来のイソプレニルピロリン酸イソメラーゼ、およびクズ由来のイソプレンシンターゼを含有する組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いて、１４Ｌスケール発酵を行なった。１４Ｌタンクからの発酵発生ガスをピークイソプレン生産性（２７．９時間の経過発酵時間、「ＥＦＴ」）の時点の前後で２０ｍＬヘッドスペースバイアルに回収し、揮発性物質成分についてヘッドスペースＧＣ／ＭＳで分析した。

【0551】

Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×２５０μｍ；０．２５μｍ膜厚）に取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣ／ＭＳシステムを用いて、ヘッドスペース分析を行なった。２０ｍＬヘッドスペースバイアルからの５００μＬアリコートのサンプリングにはｃｏｍｂｉＰＡＬオートインジェクターを用いた。ＧＣ／ＭＳ法では、ヘリウムがキャリアガスとして１ｍＬ／分の流量で利用された。注入口を２５０℃に保ち、分割比を５０：１とした。オーブン温度は、最初の２分間は３７℃に保ち、次いで１０分間の全方法時間の間、２５℃／分の速度で２３７℃にまで上昇させた。Ａｇｉｌｅｎｔ ５７９３Ｎ質量選択検出器をｍ／ｚ ２９からｍ／ｚ ３００までスキャンした。このシステムの検出限界は、約０．１μｇ／Ｌ_ガスまたは約０．１ｐｐｍである。所望により、検出限界がより低い、より感度の高い装置を用いてもよい。

【0552】

発生ガスは、９９．９２５％（ｖ／ｖ）の永久ガス（Ｎ_２、ＣＯ_２およびＯ_２）、約０．０７５％のイソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）（約７５０ｐｐｍｖ、２１００μｇ／Ｌ）および微量（＜５０ｐｐｍｖ）のエタノール、アセトン、および２種のＣ５プレニルアルコールからなっていた。水蒸気の量は測定されなかったが、０℃における平衡蒸気圧に等しいと推定された。揮発性有機画分の組成は、ＧＣ／ＭＳクロマトグラムのピーク下面積を積分して決定された（図８６Ａおよび８６Ｂ）。これを表６に記載する。エタノール標準およびアセトン標準の検量線から、標準的な方法を用いてＧＣ面積をμｇ／Ｌという単位で表される気相濃度に変換することができた。

【表6】

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【0553】

ＩＩ．組換え大腸菌株の発酵の間にイソプレンとともに同時生成される微量の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）の測定
イソプレノイド前駆体生合成のための完全なメバロン酸経路をコードする２つのプラスミド（ｐＣＬ ｕｐｐｅｒＭｅｖ；ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ）、酵母由来のイソプレニルピロリン酸イソメラーゼ、およびクズ由来のイソプレンシンターゼを含有する組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いて、１４Ｌスケール発酵を行なった。

【0554】

微量の揮発性有機成分を濃縮し同定するために、発酵発生ガスを、冷却したヘッドスペースバイアルに通した。この発酵からの発生ガスを、石英ウール（２ｇ）を詰めた２０ｍＬヘッドスペースバイアルを通して、１Ｌ／分の速度で１０分間サンプリングし、ドライアイスで−７８℃に冷却した。このバイアルに新しいバイアルキャップで再度蓋をし、実施例１０、第Ｉ部に記載の条件を用いて、トラップしたＶＯＣについてヘッドスペースＧＣ／ＭＳで分析した。図８７Ａ〜８７Ｄに見られる化合物の比率は、発酵発生ガス中の全体的なレベルと−７８℃での相対蒸気圧と質量分析計の検出器応答を組み合わせたものである。例えば、酸素化した揮発性物質（例えば、アセトンおよびエタノール）と比べた低レベルのイソプレンは、−７８℃でヘッドスペースバイアルに蓄積しない程度のこの物質の高揮発性と関係している。

【0555】

これらの化合物の多くの存在は、生物学的発生源に由来するイソプレン組成物に特有である。これらの結果を図８７Ａ〜８７Ｄに示し、表７Ａおよび７Ｂにまとめる。

【表7】

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【表8】

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【0556】

ＩＩＩ．発酵から得られるイソプレンにおけるＣ５炭化水素異性体の不在
液体窒素中で冷却した２ｍＬヘッドスペースバイアルを用いて、発酵発生ガス中に存在するイソプレンのクライオトラッピングを行なった。２ｍＬバイアル（−１９６℃）中での氷と固体ＣＯ_２の蓄積を最小限に抑えるために、発生ガス（１Ｌ／分）を水酸化ナトリウムペレットを含有する２０ｍＬバイアルにまず通した。約１０Ｌの発生ガスをバイアルに通した後、排気しながら−７８℃まで温めておき、次に、新しいバイアルキャップで再度密封して、ＧＣ／ＭＳで分析した。

【0557】

ヘッドスペースモードで１００μＬガスタイトシリンジを用いるＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣ／ＭＳシステムでＧＣ／ＭＳヘッドスペース分析を行なった。分析物の分離には、Ｚｅｂｒｏｎ ＺＢ−６２４ ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×２５０μｍ；１．４０μｍ膜厚）を用いた。ＧＣオートインジェクターをガスタイト１００μＬシリンジに取り付け、２ｍＬのＧＣバイアルから５０μＬのヘッドスペースサンプルを注入することができるように針の高さを調整した。ＧＣ／ＭＳ法では、ヘリウムがキャリアガスとして１ｍＬ／分の流量で利用された。注入口は、分割比を２０：１にして２００℃に保った。オーブン温度は、５分間の分析の間、３７℃に保った。Ａｇｉｌｅｎｔ ５７９３Ｎ質量選択検出器を、ｍ／ｚ ５５、６６、６７および７０で単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードで操作した。これらの条件下では、イソプレンが２．９６６分で流出することが観察された（図８８Ｂ）。この方法を用いて、石油から得られたイソプレン標準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）も分析し、さらなるＣ５炭化水素異性体を含有することが分かった。この異性体は、主ピークのすぐ前またはすぐ後に流出し、補正したＧＣ面積に基づいて定量された（図８８Ａ）。

【表9】

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【表10】

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【0558】

別々の実験で、検出器応答が各々の化合物について同じであるかどうかを決定するために、Ｃ５炭化水素の標準混合物を分析した。化合物は、２−メチル−１−ブテン、２−メチル−１，３−ブタジエン、（Ｅ）−２−ペンテン、（Ｚ）−２−ペンテンおよび（Ｅ）−１，３−ペンタジエンであった。この例では、５０℃で１５分間保持されたＡｇｉｌｅｎｔ ＤＢ−Ｐｅｔｒｏカラム（１００ｍ×０．２５ｍｍ、０．５０μｍ膜厚）で分析を行なった。ＧＣ／ＭＳ法では、ヘリウムがキャリアガスとして１ｍＬ／分の流量で利用された。注入口は、分割比を５０：１にして２００℃に保った。Ａｇｉｌｅｎｔ ５７９３Ｎ質量選択検出器をフルスキャンモードでｍ／ｚ １９からｍ／ｚ ２５０まで操作した。これらの条件下では、１００μｇ／Ｌの濃度の各標準は、実験誤差の範囲内の同じ検出器応答を生じさせた。

【0559】

ＩＶ．固相に吸着したイソプレンを含む組成物
生物学的に産出されるイソプレンを活性炭に吸着させて、５０〜９９．９％炭素、０．１％〜５０％イソプレン、０．０１％〜５％水、および微量（＜０．１％）の他の揮発性有機成分を含有する固相を生じさせた。

【0560】

水蒸気を除去するために、発酵発生ガスを０℃に保持された銅凝結コイル、次いで粒状シリカ乾燥フィルターに通して流した。その後、除湿した発生ガスを、炭素含有フィルター（Ｋｏｂｙ Ｊｒ，Ｋｏｂｙ Ｆｉｌｔｅｒｓ，ＭＡ）を通して、ＧＣ／ＭＳでフィルター通過ガス中のイソプレンのフィルター通過分が検出される時点まで流した。カートリッジに吸着したイソプレンの量は、発生ガス中の濃度、全体的な流速および回収期間中の通過パーセントを計算することにより間接的に決定することができる。あるいは、吸着したイソプレンを熱、真空、または溶媒による脱離によってフィルターから回収することができる。

【0561】

Ｖ．凝結イソプレンの回収および分析
発酵発生ガスを除湿し、好適な吸着剤（例えば、アスカライト）に通して濾過することにより、ＣＯ_２を除去する。次に、ストリーム中のＶＯＣを凝結するために、得られる発生ガス流を、液体窒素で冷却した凝結器に通して流す。回収容器には、得られるイソプレンの重合(ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ)を阻害するためのｔ−ブチルカテコールが含まれる。本明細書に記載した方法などの標準的な方法を用いて純度を測定するために、この凝結物をＧＣ／ＭＳおよびＮＭＲで分析する。

【0562】

ＶＩ．発酵によるプレニルアルコールの産出
クズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株からの発生ガスの分析から、イソプレンと３−メチル−３−ブテン−１−オール（イソプレノール）の両方が存在することが明らかになった。ヘッドスペースＧＣ／ＭＳで測定した場合の発酵全体での発酵発生ガス中の２つの化合物のレベルを図８９に示す。得られたイソプレノール（３−メチル−３−ブテン−１−オール、３−ＭＢＡ）のレベルは、この実験ではほぼ１０μｇ／Ｌ_発生ガスであった。さらなる実験により、発酵発生ガス中に約２０μｇ／Ｌ_発生ガスのレベルが産出された。

【0563】

実施例１１：メバロン酸経路由来の遺伝子を発現し、流加培養で発酵させた大腸菌における増殖とイソプレン産出の脱共役
実施例１１は、メバロン酸およびイソプレン産出からの細胞増殖の脱共役を示す。

【0564】

Ｉ．発酵条件
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した。水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0565】

１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0566】

ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡとも呼ぶ、図９１および９２Ａ〜９２Ｃ；配列番号２３）（５０μｇ／ｍｌカルベニシリン）またはｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡ（ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙとも呼ぶ（図２６））（５０μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）プラスミドを含有する大腸菌細胞を用いて発酵を行なった。イソプレンを産出する実験の場合、大腸菌細胞は、ｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳ（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）プラスミドも含有していた。これらの実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのメバロン酸またはイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＡ液体培地寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定したときに種菌が光学密度１．０まで増殖した後、それをバイオリアクターに植菌するために用いた。

【0567】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。過塩素酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＃２４４２５２）処理したサンプル（０．３Ｍ、４℃で５分間インキュベートしたもの）を有機酸ＨＰＬＣカラム（ＢｉｏＲａｄ ＃１２５−０１４０）に適用して、発酵液体培地中のメバロン酸濃度を測定した。液体培地メバロン酸ピークサイズを、メバロノラクトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＃ Ｍ４６６７）を過塩素酸で処理して、Ｄ，Ｌ−メバロン酸を形成したものから作成した検量線と比較することにより、濃度を決定した。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は、発酵液体培地１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。

【0568】

ＩＩ．１５０ＬスケールでのｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からのメバロン酸産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、４５ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、１７０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で５時間インキュベートした。この溶液をトリプトン−酵母抽出物培地の５Ｌバイオリアクターに移し、培養物のＯＤ_５５０が１．０に達するまで、細胞を３０℃、２７．５ｒｐｍで増殖させた。５Ｌの種菌を４５ｋｇの培地を含有する１５０Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ_５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１．１ｍＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図６０Ａに示す。メバロン酸力価は、発酵の間に最終値６１．３ｇ／Ｌまで増加した（図６０Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６０Ｃに示す。図６０Ａとの比較から、増殖とメバロン酸産出の脱共役が示されている。５２．５時間の発酵の間に産出されるメバロン酸の総量は、利用されたグルコース１４．１ｋｇから４．０ｋｇであった。発酵の時にメバロン酸産出に回った利用炭素のモル収率は３４．２％であった。

【0569】

ＩＩＩ．１５ＬスケールでのｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からのメバロン酸産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ_５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ_５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１．０ｍＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図６１Ａに示す。メバロン酸力価は、発酵の間に最終値５３．９ｇ／Ｌまで増加した（図６１Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６１Ｃに示す。図６１Ａとの比較から、増殖とメバロン酸産出の脱共役が示されている。４６．６時間の発酵の間に産出されるメバロン酸の総量は、利用されたグルコース２．１ｋｇから４９１ｇであった。発酵の時にメバロン酸産出に回った利用炭素のモル収率は２８．８％であった。

【0570】

ＩＶ．１５ＬスケールでのｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドを発現する大腸菌ＦＭ５細胞からのメバロン酸産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたＦＭ５細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ_５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ_５５０が３０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１．０ｍＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図６２Ａに示す。メバロン酸力価は、発酵の間に最終値２３．７ｇ／Ｌまで増加した（図６２Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６２Ｃに示す。図６２Ａとの比較から、増殖とメバロン酸産出の脱共役が示されている。５１．２時間の発酵の間に産出されるメバロン酸の総量は、利用されたグルコース１．１ｋｇから１４０ｇであった。発酵の時にメバロン酸産出に回った利用炭素のモル収率は１５．２％であった。

【0571】

Ｖ．１５ＬスケールでのｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドとｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ_５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ_５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ_５５０が１９０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。発酵して３８時間でＩＰＴＧ濃度を１００μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図６３Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値２．２ｇ／Ｌ液体培地まで増加した（図６３Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産
性プロファイルを図６３Ｃに示す。図６３Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。５４．４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース２．３ｋｇから１５．９ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１．５３％であった。

【0572】

ＶＩ．１５ＬスケールでのｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）チューナー（ｔｕｎｅｒ）細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ_５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ_５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２６μＭにした。ＯＤ_５５０が１７５に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図６４Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値１．３ｇ／Ｌ液体培地まで増加した（図６４Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６４Ｃに示す。図６４Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。４８．６時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース１．６ｋｇから９．９ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１．３４％であった。

【0573】

ＶＩＩ．１５ＬスケールでのｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現する大腸菌ＭＧ１６５５細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＭＧ１６５５細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ_５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ_５５０が４５という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２４μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図６５Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値３９３ｍｇ／Ｌ液体培地まで増加した（図６５Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６５Ｃに示す。図６５Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。６７．４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース５２０ｇから２．２ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は０．９２％であった。

【0574】

ＶＩＩＩ．１５ＬスケールでのｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＭＧ１６５５ａｃｋ−ｐｔａ細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＭＧ１６５５ａｃｋ−ｐｔａ細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ_５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ_５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を３０μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図６６Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値３６８ｍｇ／Ｌ液体培地まで増加した（図６６Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６６Ｃに示す。図６６Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。５６．７時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース５３１ｇから１．８ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は０．７３％であった。

【0575】

ＩＸ．１５ＬスケールでのｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現する大腸菌ＦＭ５細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＦＭ５細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ_５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ_５５０が１５という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２７μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図６７Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値２３５ｍｇ／Ｌ液体培地まで増加した（図６７Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６７Ｃに示す。図６７Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。５２．３時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース９４８ｇから１．４ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は０．３２％であった。

【0576】

実施例１２：メバロン酸経路由来の遺伝子を発現し、流加培養で発酵させた大腸菌の指数関数的増殖期にお
けるイソプレンの産出
実施例１２は、細胞の指数関数的増殖期におけるイソプレンの産出を示す。

【0577】

培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0578】

１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで滅菌濾過した。

【0579】

ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＡＴＣＣ１１３０３大腸菌細胞により１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。

【0580】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５０時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、２．０ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_５５０）が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ_５５０が１９０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図９９に示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値１．４ｇ／Ｌまで増加した（図１００）。５０時間の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は１０．０ｇであった。バイオリアクター内の経時的なイソプレン比生産性のプロファイルを図１０１に示す。発酵の時にイソプレン産出に寄与した利用炭素のモル収率は１．１％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は０．５％であった。

【0581】

実施例１３：イソプレンの引火性のモデリングと試験
Ｉ．イソプレンの引火性のモデリングと試験の概要
引火性のモデリングと実験を様々な炭化水素／酸素／窒素／水／二酸化炭素混合物について行なった。試験されたこのモデリングと実験は、一定の圧力および温度における特定の蒸気および一酸化炭素濃度下のイソプレンおよび酸素／窒素引火性曲線を規定することが目的であった。モデル条件のマトリックスを表９に示し、実施された実験のマトリックスを表５に示す。

【表11】

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【表12】

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【0582】

ＩＩ．計算断熱火炎温度（ＣＡＦＴ）モデルの説明
計算断熱火炎温度（ＣＡＦＴ）を燃焼伝播のための選択限界火炎温度とともに用いて、イソプレンの引火限度を決定した。この研究で火炎温度を計算するために用いられたコンピュータプログラムは、ＮＡＳＡ Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ＣＥＡ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｗｉｔｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）ソフトウェアである。

【0583】

均質な燃焼機構（この場合、燃料と酸化体の両方がガス状態にある）に関する断熱火炎温度モデルを用いた引火限度の決定には、５つの工程、すなわち、所望の反応剤の選択、試験条件の選択、限界火炎温度の選択、反応剤の修飾、および計算値からの引火限度の構築が関与している。

【0584】

この最初の工程である、所望の反応剤の選択では、この系に存在する反応剤種と各々の量に関して決定がなされなければならない。多くの場合、計算に用いられるコンピュータプログラムは、反応剤および産物種のリストを有している。調査すべき種に関するデータがプログラム中に見つからない場合は、ＪＡＮＡＦ表などの他の情報源またはインターネットから取得してもよい。この現在のモデルでは、水、窒素、酸素および二酸化炭素に関するデータが、プログラムデータベース中に存在していた。このプログラムデータベースは、イソプレンを種として含んでいなかった。そのため、熱力学特性を手動で組み入れた。

【0585】

次の工程は、燃焼プロセスが生じる初期の圧力および温度条件を決定することである。このモデルでは、圧力は１気圧（絶対気圧）、温度は、イソプレンの沸点である４０℃である。

【0586】

燃焼の限界火炎温度は、理論的原理に基づいて選択されるかまたは実験的に決定されるかのいずれかであることができる。各々の方法にそれ独自の限界がある。

【0587】

先行研究に基づくと、炭化水素の限界火炎温度は、１０００Ｋ〜１５００Ｋの範囲に収まる。このモデルでは、１５００Ｋという値を選択した。これは、一酸化炭素から二酸化炭素への反応（高発熱反応であり、火炎エネルギーのかなりの割合を占める）が自律的になる温度である。

【0588】

ひとたび限界火炎温度が決定されれば、所与の反応剤混合物に対してモデル計算を行ない（種濃度）、断熱火炎温度を決定する。温度が限界火炎温度を超えた場合にのみ、火炎伝播が起こったと考えられる。次に、反応剤混合物の組成を変更して、伝播混合物と非伝播混合物のデータセットを作成する。

【0589】

この種のモデルは、実験的に決定される引火限界と十分一致する。得られた限度外の領域が非引火性であり、得られた限度の範囲内の領域が引火性である。限度の形状は先端を形成する。限度の先端は、ガス燃料の限界酸素濃度（ＬＯＣ）に関連する。

【0590】

ＩＩＩ．計算断熱火炎温度（ＣＡＦＴ）モデルからの結果
シリーズＡからＧまでのＣＡＦＴモデル結果が、それぞれ、図６８から図７４にかけてプロットされている。これらの図では、計算断熱火炎温度が、（ＮＡＳＡ ＣＥＡプログラムを用いて）いくつかの酸素／窒素比（重量による）に対する燃料濃度（重量による）の関数としてプロットされている。１５００Ｋを超える曲線の部分である、選択限界火炎温度は、火炎伝播に十分な燃料レベルを含有している。これらの結果は、図６８から図７４にかけて提示された形で解釈するのは困難な場合がある。さらに、現在の形は、通常は容積パーセントの単位で提示される実験データと比較することができない。

【0591】

シリーズＡを例として用いて、図６８のデータを従来的な引火限度の形でプロットすることができる。図６８および縦座標上の１５００Ｋの温度線と交差する読取り値を用いて、それが交わる各曲線（酸素対窒素比）の横座標に向かって接線を引くことにより、この限界火炎温度の燃料濃度を決定することができる。次に、これらの値を、所与の酸化体の重量パーセントに対する燃料の重量パーセントとして一覧にすることができる（図７５Ａ）。次に、燃料の組成（１００重量％イソプレン）と酸化体の組成（水、酸素および窒素の相対含有量）が分かれば、モル量を確定することができる。

【0592】

これらのモル量から、容積濃度パーセントを計算することができる。次に、容積パーセント単位の濃度をプロットして、引火限度を生成することができる（図７５Ｂ）。この限度によって囲まれる部分が爆発範囲であり、除外される部分が非爆発範囲である。この限度の「先端」が限界酸素濃度である。図７６Ａおよび７６Ｂは、図６９に提示されたデータから生成されたシリーズＢの引火限度の計算容積濃度を含有している。図７０〜７４に提示されたデータに対して同様の手法を用いることができる。

【0593】

ＩＶ．引火性試験実験装置および手順
引火性試験は、４リットル高圧容器内で行なわれた。容器は円筒状で、内径が６インチ、内のり高さが８．６２５インチであった。容器（および内部のガス）の温度は、ＰＩＤコントローラーで制御される外部加熱器を用いて維持された。熱損失を防ぐために、セラミックウールと反射断熱材とを圧力容器の周囲に巻き付けた。Ｋタイプの熱電温度計を用いて、ガススペースの温度および容器それ自体の温度を測定した。図７７に試験容器を示す。

【0594】

試験を実施する前に、容器を空にし、窒素でパージして、それまでの試験で発生したガスを全て確実に除去した。次に、容器に真空を引いた。これが行なわれた後の圧力は、通常、約０．０６ｂａｒであった（ａ）。窒素パージングしたため、この初期の圧力の原因となるガスは、窒素であると仮定された。分圧を用いて、次に、水、イソプレン、窒素、および酸素を適当な量で添加して、問題とする試験条件を達成した。容器内の磁気駆動型ミキシングファンで、ガス内容物を確実に混合した。点火の約１分前に切れるファンを用いて、ガスを約２分間混合させておいた。

【0595】

点火装置は、タイマー回路上の１．５ｏｈｍのニクロムコイルとＡＣ電源から構成されていた。オシロスコープを用いて、３４．４のＶＡＣがこの点火装置に３．２秒間送達されると決定された。点火サイクルのほぼ中間で３．８ａｍｐの最大電流が発生した。したがって、最大出力は１３１Ｗであり、点火サイクルの間に提供される総エネルギーは、約２１０Ｊであった。

【0596】

データ獲得システムに接続された可変リラクタンスＶａｌｉｄｙｎｅ ＤＰ２１５圧力変換器を用いて爆燃データを獲得した。ガス混合物は、圧力が５％以上上昇した場合に爆燃すると考えられた。

【0597】

Ｖ．引火性試験の結果
最初の実験シリーズ（シリーズ１）は、４０℃、０ｐｓｉｇ、蒸気なしで実施された。様々な濃度のイソプレンと酸素で試験を実施すると、図７８Ａに示す引火性曲線が生成された。この曲線で示すデータ点は、曲線に接するもののみである。このシリーズで取得された全データ点の詳細なリストを図８０Ａおよび８０Ｂに示す。

【0598】

図７８Ａで示した爆発データ点を図７８Ｂにまとめる。図７８Ｃは、実験データをＣＡＦＴモデルで予測された引火限度と比較したものである。このモデルは、実験データと非常によく一致している。不一致は、試験チャンバーの非断熱性とモデルの限界とによるものであり得る。このモデルは、酸化反応に対して無限時間軸を考えており、反応の動力学的な限界を全く考慮していない。

【0599】

さらに、このモデルは、そのデータベースに含まれる平衡化学種の数によって制限され、したがって、熱分解種を適切に予測し得ない。また、このモデルで生じる引火限度では、限界火炎温度（１５００Ｋ）に対して１つの値が用いられる。限界火炎温度は、反応する化学種によって、１，０００Ｋ〜１，５００Ｋの範囲の値であることができる。化学量論的燃料／酸化体レベルを上回る燃料濃度で形成される熱分解化学種の複雑な性質は、このモデルでこの系の引火上限を正確に予測し得ない１つの理由である。

【0600】

第２の実験シリーズ（シリーズ２）は、４０℃、０ｐｓｉｇ、４％という一定の蒸気濃度で実施された。様々な濃度のイソプレンと酸素で試験を実施すると、図７９Ａに示す引火性曲線が生成された。この曲線で示すデータ点は、曲線に接するもののみである。このシリーズで取得された全データ点の詳細なリストを図８１に示す。シリーズ１のデータと類似しているので、引火下限、限界酸素濃度、および引火上限といった重要な点だけを試験した。試験混合物に４％の蒸気を添加しても、引火限度の主要な限界はそれほど変化しなかった。より高濃度の蒸気／水および／または他の不活性ガスが引火限度に影響を与えた可能性があることに留意すべきである。

【0601】

図７９Ａで示した爆発データ点を図７９Ｂにまとめる。図７９Ｃは、実験データをＣＡＦＴモデルで予測された引火限度と比較したものである。このモデルは、実験データと非常によく一致している。不一致は、シリーズ１に記載したものと同じ要因によるものであり得る。

【0602】

Ｖ．３気圧の空気中のイソプレンの引火限界の計算
３気圧の絶対系圧および４０℃におけるイソプレンの引火限界を計算するために、実施例１３の第Ｉ部から第ＩＶ部に記載された方法も用いた。これらの結果を、１気圧の絶対系圧および４０℃における実施例１３の第Ｉ部から第ＩＶ部の結果と比較した。初期の系圧が増加するにつれて引火限度が拡大するかまたは大きくなるので、このより高い圧力を試験した。引火上限が最も影響を受け、制限酸素組成物がそれに続く。引火下限は最も影響を受けなかった（例えば、“Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ６２７−Ｆｌａｍｍａｂｉｌｉｔｙ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｏｍｂｕｓｔｉｂｌｅ Ｇａｓｅｓ ａｎｄ Ｖａｐｏｒｓ” ｗｒｉｔｔｅｎ ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇ．Ｚａｂｅｔａｋｉｓ ａｎｄ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｒ ＵＳ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｍｉｎｅｓ（１９６５）を参照されたく、これは、特に、引火限界の計算に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0603】

図８２では、計算断熱火炎温度が、総燃料／窒素／酸素の重量パーセントで表されるイソプレン（燃料）濃度の関数としてプロットされており、ここで、系圧は最初は３気圧であった。計算火炎温度は、１気圧の系で最初に決定されたものと非常によく似ている（図８３）。結果として、計算断熱引火性データを用いて引火限度が生成される場合は、曲線が非常によく似ている（図８４および８５を参照）。それゆえ、これらの理論的計算に基づくと、１気圧から３気圧への系圧増加は、引火限度の著しい増加／拡大をもたらさない。所望により、これらのモデル結果の妥当性を、実験的試験（例えば、１気圧の圧力における本明細書に記載の実験的試験）を用いて確認してもよい。

【0604】

ＶＩＩ．引火性研究のまとめ
計算断熱温度モデルを、４０℃および０ｐｓｉｇにおけるイソプレン／酸素／窒素／水／二酸化炭素の系の引火限度のために開発した。開発されたＣＡＦＴモデルは、この研究で実施された試験によって生成された実験データとよく一致した。シリーズ１および２の実験結果により、シリーズＡおよびＢのモデル結果の妥当性が確認された。

【0605】

実施例１４：発現構造体および株
Ｉ．メバロン酸キナーゼをコードするプラスミドの構築
メタノサルキナ・マゼイの下流ＭＶＡ経路（アクセッション番号ＮＣ＿００３９０１．１、ＮＣ＿００３９０１．１、ＮＣ＿００３９０１．１、およびＮＣ＿００３９０１．１、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をコードする構造体を、大腸菌での発現のためにコドンを最適化して合成した。この構造体は、Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンと名付けられ（図１１２Ａ〜１１２Ｃ；配列番号２７）、Ｍ．マゼイのＭＶＫ酵素（デカルボキシラーゼと推定される）、ＩＰＫ酵素、およびＩＤＩ酵素をコードしている。ＭＶＫ（アクセッション番号ＮＣ＿００３９０１．１）をコードする遺伝子を、アニーリング温度５５℃および伸長時間６０秒の３０サイクルを用いて、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎキットを用いて、プライマーのＭＣＭ１６５およびＭＣＭ１７７（表１１）を用いてＰＣＲ増幅した。このアンプリコンをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲカラムを用いて精製した後、ＰｍｅＩを含む１０μＬの反応液（ＮＥＢ緩衝液４とＢＳＡの存在下）中３７℃で消化した。１時間後、ＮｓｉＩとＲｏｃｈｅの緩衝液Ｈとを３７℃でさらに１時間添加した。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲカラムで精製し、同じように消化され、精製されたプラスミドＭＣＭ２９（ＭＣＭ２９は、クズイソプレンシンターゼをコードするｐＴｒｃＫｕｄｚｕで形質転換した大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である）に、１１μＬの反応液（５μＬのＲｏｃｈｅ Ｑｕｉｃｋリガーゼ緩衝液１、１μＬの緩衝液２、１μＬのプラスミド、３μＬのアンプリコン、および１μＬのリガーゼ）中で連結した（室温で１時間）。ＭＣＭ２９はｐＴｒｃＫｕｄｚｕ Ｋａｎである。ライゲーション反応液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体を３７℃で一晩インキュベートしたＬＡ／ｋａｎ５０プレート上で選択した。得られたプラスミドＭＣＭ３８２中のＭＶＫ挿入物をシークエンシングした（図１１３Ａ〜１１３Ｃ；配列番号２８）。

【表13】

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【0606】

ＩＩ．メバロン酸キナーゼとイソプレンシンターゼを過剰発現する株の作製
プラスミドＭＣＭ３８２を、ＬＢ培地中で対数増殖期中期（ｍｉｄｌｏｇ）まで増殖させ、氷冷滅菌水で３回洗浄しておいたＭＣＭ３３１細胞（サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードする染色体構造体ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを含有する）に形質転換した。１μＬのＤＮＡを５０μＬの細胞懸濁液に添加し、この混合物を２ｍｍキュベット中、２．５ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートし、その後すぐに、５００μＬのＬＢ培地中、３７℃で１時間回復させた。形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択し、ＭＣＭ３９１と名付けた。プラスミドＭＣＭ８２を同じエレクトロポレーションプロトコルでこの株に導入し、その後、ＬＡ／ｋａｎ５０／ｓｐｅｃ５０上で選択した。得られた株ＭＣＭ４０１は、ｃｍｐをマーカーとする染色体構造体ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩと、ｋａｎをマーカーとするプラスミドＭＣＭ３８２と、ｓｐｅｃをマーカーとするプラスミドＭＣＭ８２（これは、Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙである）とを含有している。表１２を参照されたい。

【表14】

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【0607】

ＩＩＩ．プラスミドＭＣＭ３７６の構築−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄ
Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロン由来のＭＶＫ ＯＲＦ（図１１２Ａ〜１１２Ｃ；配列番号２７）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ ＰＣＲミックスを用いて、プライマーのＭＣＭ１６１およびＭＣＭ１６２（表１１）を用いてＰＣＲ増幅した。４５μＬのＰＣＲミックスを、１μＬの鋳型、１μＬの１０μＭの各プライマー、および２μＬの水と合わせた。反応を以下のようなサイクルで繰り返した：９４℃、２分；９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、および６８℃、１分１５秒を３０サイクル；その後、７２℃、７分、４℃、冷えるまで。３μＬのこのＰＣＲ反応液を、製造元のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＥＴ２００Ｄプラスミドに連結した。３μＬのこのライゲーション液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択した。形質転換体からのプラスミドを単離し、挿入物をシークエンシングし、ＭＣＭ３７６が得られた（図１１４Ａ〜１１４Ｃ；配列番号２９）。

【0608】

Ｖ．発現株ＭＣＭ３７８の作製
プラスミドＭＣＭ３７６を、製造元のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。形質転換体ＭＣＭ３７８をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択した。

【0609】

実施例１５：上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを発現し、２０ｍＬバッチスケールで流加培養された大腸菌によるイソプレンの産出
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １３．６ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １３．６ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ３．２ｇ、酵母抽出物１ｇ、および１０００×微量金属溶液１ｍｌが含まれていた。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）を用いてｐＨを６．８に調整し、全量とした。培地を０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。グルコース（２．５ｇ）と抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0610】

１０００×微量金属溶液：
１０００×微量金属溶液には、クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にｄｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0611】

株：
ＭＣＭ３４３細胞は、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、クズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ）とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞である。

【0612】

ＭＣＭ４０１細胞は、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞である。

【0613】

２０ｍＬワーキング容量を含む１００ｍＬバイオリアクター中、３０℃で、これらの株を増殖させることにより、イソプレン産出を分析した。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３０℃でインキュベートした。単一コロニーを培地に植菌し、一晩増殖させた。細菌を２０ｍＬの培地中に希釈し、５５０ｎｍで測定して０．０５の光学密度に達した。１００ｍＬバイオリアクターを密封し、８ｍＬ／分の速度で空気をポンプで送り出した。磁気撹拌子を用いて６００ｒｐｍで撹拌することにより、培地を十分に撹拌した。オンライン式のＨｉｄｅｎ ＨＰＲ−２０質量分析計を用いて、バイオリアクターからのオフガスを分析した。イソプレン、ＣＯ_２、および空気中に天然に存在する他のガスに対応する質量をモニタリングした。それぞれのガスの経時的な濃度（パーセント単位）を合計することにより、蓄積したイソプレンおよびＣＯ_２産出を計算した。代謝活性により放出されたＣＯ_２を推定するために、大気のＣＯ_２を全体から差し引いた。

【0614】

完全なメバロン酸経路とクズイソプレンシンターゼとを発現する株（ＭＣＭ３４３）からのイソプレン産出を、これに加えて、Ｍ．マゼイ由来のＭＶＫとクズイソプレンシンターゼとを過剰発現する株（ＭＣＭ４０１）と、１００ｍＬバイオリアクターにおいて比較した。グルコースを炭素源として用いる規定培地中、同一条件下で、細菌を増殖させた。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１００μＭまたは２００μＭのいずれかの最終濃度で添加することにより、イソプレン産出の誘導を達成した。図１１５Ａ〜１１５Ｄに示すように、発生ガス測定から、ＭＶＫとイソプレンシンターゼの両方をを過剰発現する株（ＭＣＭ４０１）は、メバロン酸経路とクズイソプレンシンターゼのみを発現する株（ＭＣＭ３４３）と比べて有意に多いイソプレンを産出することが明らかになった。１００μＭによる誘導では、ＭＣＭ４０１株は、ＭＣＭ３４３株と比べて２倍多いイソプレンを産出した。２００μＭのＩＰＴＧによる誘導では、ＭＣＭ４０１株は、ＭＣＭ３４３株と比べて３．４倍多いイソプレンを産出した。代謝活性の尺度となる、バイオリアクターからのオフガス中のＣＯ_２の分析により、代謝活性がＩＰＴＧ誘導やイソプレン産出とは無関係であったことが示される。

【0615】

実施例１６：上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを発現し、１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた大腸菌によるイソプレンの産出
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌが含まれていた。全ての成分を一緒に添加し、ＤＩＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0616】

１０００×改変微量金属溶液：
１０００×改変微量金属溶液には、クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にＤＩＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0617】

上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードするｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて、１５Ｌバイオリアクター中の５Ｌの培地に植菌した。

【0618】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。６８時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３．８ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度が（ＯＤ_５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５１μＭにした。ＯＤ_５５０が１４９に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を８８μＭに上昇させた。ＯＤ_５５０＝１９５で１１９μＭまで、ＯＤ_５５０＝２１０で１５２μＭまで、ＩＰＴＧをさらに添加して濃度を上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図１１６に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２３．８ｇ／Ｌまで増加した（図１１７）。６８時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は２２７．２ｇであった。産出の時間経過を図１１８に示す。ＴＣＥＲで測定したときの代謝活性プロファイルを図１１９に示す。総生菌数（総コロニー形成単位）は、発酵１０時間から３９時間で２桁減少した（図１２０）。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１３．０％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は６．３％であった。

【0619】

実施例１７：上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを発現し、１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた大腸菌によるイソプレンの産出（２×１００μＭのＩＰＴＧによる誘導）
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌが含まれていた。全ての成分を一緒に添加し、ＤＩＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0620】

１０００×改変微量金属溶液：
１０００×改変微量金属溶液には、クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ， Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にＤＩＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0621】

上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードするｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて、１５Ｌバイオリアクター中の５Ｌの培地に植菌した。

【0622】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５５時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、１．９ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度が（ＯＤ_５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１１１μＭにした。ＯＤ_５５０が１５５に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１９３μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図１２１に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値１９．５ｇ／Ｌまで増加した（図１２２）。５５時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１３３．８ｇであった。産出の時間経過を図１２３に示す。瞬間的容積生産性レベルは、１．５ｇイソプレン／Ｌ液体培地／時間と同じくらい高い値に達した（図１２４）。瞬間的収率レベルは、１７．７％ｗ／ｗにも達した（図１２５）。ＴＣＥＲで測定したときの代謝活性プロファイルを図１２６に示す。総生菌数（総コロニー形成単位）は、発酵８時間から３６時間で２桁減少した（図１２７）。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１５．８％であった。発酵全体を通じたグルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は７．４％であった。

【0623】

さらに、対照として、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードするｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのＣＥＲフォーマットで測定した場合の誘導されていない細胞代謝活性をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株（上記のＭＣＭ４０１）の種菌をＬＢ液体培地寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて、１５Ｌバイオリアクター中の５Ｌの培地に植菌した。細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。

【0624】

図１４８は、上記の誘導されていない細胞と実施例１６および１７に見られるイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して誘導された細胞のＣＥＲプロファイルを比較したものである。

【0625】

実施例１８：上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを発現し、１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた大腸菌によるイソプレンの産出（１×５０μＭのＩＰＴＧ＋１５０μＭの供給ＩＰＴＧによる誘導）
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、が含まれていた。Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0626】

１０００×改変微量金属溶液：
１０００×改変微量金属溶液には、クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にＤＩＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0627】

上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードするｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天ンプレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて、１５Ｌバイオリアクター中の５Ｌの培地に植菌した。

【0628】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５５時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、２．２ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度が（ＯＤ_５５０）が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５１μＭにした。ＯＤ_５５０＝１０でＩＰＴＧを添加したのに加えて、定期的な供給を開始し、１８時間かけて１６４ｍｇのＩＰＴＧを供給した。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図１２８に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２２．０ｇ／Ｌまで増加した（図１２９）。５５時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１７０．５ｇであった。産出の時間経過を図１３０に示す。ＴＣＥＲで測定したときの代謝活性プロファイルを図１３１に示す。バイオリアクターへの空気流量が約１．７時間の間に８ｓｌｐｍから４ｓｌｐｍへと減少したとき、発生ガス中のイソプレンの濃度は、０．５１ｗ／ｗ％から０．９２ｗ／ｗ％へと増加した（図１３２）。これらのイソプレンレベルの上昇は、総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）で測定したとき、３７．２時間から３９．３時間の間にわずか７％しか低下しなかったので、細胞代謝活性に負の影響を及ぼすようには見えなかった（図１３２）。総生菌数（総コロニー形成単位）は、発酵７時間から３６時間で２桁減少した（図１３３）。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１６．６％であった。発酵全体を通じたグルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は７．７％であった。

【0629】

実施例１９：１Ｌスケールの野生型流加培養で増殖した大腸菌に対する外部適用したイソプレンの影響
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、が含まれていた。Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0630】

１０００×改変微量金属溶液：
１０００×改変微量金属溶液には、クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にＤＩＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0631】

ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコース流加バイオリアクター内の細胞生存性および代謝活性に対するイソプレンの影響をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルからの大腸菌株の種菌をトリプトン−酵母抽出物培地に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５０ｍを用いて、１Ｌバイオリアクター中の０．５Ｌの培地に植菌した。

【0632】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を供給した。窒素をキャリアとして用いて、イソプレンをバイオリアクターに供給した。イソプレン供給速度は、中間の増殖期（ＯＤ_５５０＝３１〜４４）は１ｇ／Ｌ／時間であり、計７５分（１３．２〜１４．４時間）持続した。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図１３４に示す。ＴＣＥＲで測定したときの代謝活性プロファイルを図１３５に示す。総生菌数（総コロニー形成単位）は、イソプレンがバイオリアクターに導入されている間に１４倍増加した（図１３６）。

【0633】

実施例２０：サッカロミセス・セレビシエによるイソプレンの産出とイソプレンシンターゼの発現
クズイソプレンシンターゼ酵素を、交配種のサッカロミセス・セレビシエ／ピキア・パストリスのコドン使用表に従って発現のため最適し、合成し、ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０（ＤＮＡ２．０製、マップについては図１４０、配列については図１４１（配列番号３８））にクローニングした。製造元のプロトコルに従って、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応を行なった。ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０は「エントリー」ベクターであるので、ＬＲクロナーゼＩＩ酵素（ＬＲ反応）を用いて、コドン最適化イソプレンシンターゼを「デスティネーション」ベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。

【0634】

次に、ＬＲ反応液を製造元のプロトコルに従ってＴｏｐ１０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、イソプレンシンターゼＯＲＦを含むｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２プラスミドを有する細菌を５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＡプレート上で選択した。個々の陽性形質転換体を、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＰｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（商標）ＰＣＲビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＴ７フォワードプライマーおよび酵母イソプレンシンターゼ−Ｒｅｖ２プライマー（表１３参照）とともに用いるコロニーＰＣＲで試験した（プライマー濃度およびサーモサイクリングパラメータについては下記参照）。

【表15】

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【0635】

正しいサイズ（１３５４ｂｐ）のＰＣＲ断片を生じさせたプラスミドをミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｔ７フォワードプライマーおよび酵母イソプレンシンターゼ−Ｆｏｒ２プライマー（表１３参照）を用いるシークエンシング（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）に回した。シークエンシング実施から得た結果を、（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを使用して）既知のｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０配列と比較し、単一のプラスミド、ｐＤＷ１４をさらなる研究用に選択した（マップについては図１４２Ａ、完全な配列については図１４２ＢおよびＣ（配列番号３９））。ｐＤＷ１４の配列は、１ヌクレオチド（図１４２Ｂ中、太字で目印が付けられている）だけ、ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０の配列と違っていた。リジンをコードするコドンの３番目の位置にあったので、１ヌクレオチドの変化（ＧからＡ）によりＯＲＦに変化は生じなかった。この塩基変化がＬＲクローニング反応で導入されたのか、またはＤＮＡ２．０により合成されたもとの配列中のエラーであったのかは不明である。シークエンシングされたプラスミドは全て、この塩基変化を含有していた。

【0636】

精製したｐＤＷ１４をＳ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載されたプロトコルに従って、サッカロミセス・セレビシエ株ＩＮＶＳｃ−１に形質転換した。ｐＤＷ１４または（インタクトのＵＲＡ３遺伝子を含有する）ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を有するＩＮＶＳｃ−１株を、ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２ Ｇａｔｅｗａｙベクターマニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載されているように選択し、ＳＣ最小培地（２％グルコース含有、ウラシル非含有）上で維持した。ｐＤＷ１４を含有するＩＮＶＳｃ−１２つの独立した単離株とｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を含む１つの対照株をさらなる解析用に選んだ。

【0637】

イソプレンシンターゼ発現を誘導するために、培養物を液体ＳＣ最小培地中で一晩増殖させた。次に、この培養物をＯＤ_６００が約０．２になるまで希釈し、２〜３時間増殖させた。培養物を遠心分離でスピンし、１回洗浄し、等量（１０ｍｌ）のＳＣ最小培地（１％ラフィノース含有、２％ガラクトース含有、ウラシル非含有）に再懸濁し、一晩増殖させて、イソプレンシンターゼの発現を誘導した。この株のＯＤ_６００を測定し（図１４４Ａ）、株を遠心分離で回収し、２ｍｌの溶解緩衝液（５０％グリセロールとＰＥＢ ｐＨ７．４：Ｔｒｉｓベース２．４２３ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ_２（無水物） １．９０４ｇ／Ｌ、ＫＣｌ １４．９１０ｇ／Ｌ、ＤＴＴ ０．１５４ｇ／Ｌ、グリセロール５０ｍＬ／Ｌの１：１混合液）に再懸濁した。

【0638】

溶解混合物をフレンチプレスに３回通し、ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。クマシーゲル解析（図１４３Ａ）のために、サンプルを、還元剤を含む２×ＳＤＳローディング緩衝液で１：１に希釈し、４−１２％ビス−ｔｒｉｓゲルに充填し（２０μｌ総容量）、ＭＥＳ緩衝液中で泳動し、製造元のプロトコルに従って、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏｖｅｘ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて染色した。

【0639】

ニトロセルロース膜へのイソプレンシンターゼの転写およびニトロセルロース膜上での発色による検出には、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ抗体希釈液中で１：１０００倍に薄く希釈した１７９９Ａ １０であった。１次抗体の結合後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ−１１００８）を用いて発色させて、定量的なシグナル測定を可能にした。ウェスタンブロット手順は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに記載の通りに行なった。蛍光シグナルを青のフィルターセッティングを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ装置で記録し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ画像解析ソフトウェアパッケージで定量的に解析した。誘導培養物のＡ６００か、またはウェスタンブロットで測定されたイソプレンシンターゼタンパク質濃度のいずれかで割った産出されたイソプレンの量の比からライブラリーメンバーの比活性を算出した。図１４３Ｂは、イソプレンシンターゼが、ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（レーン１）を有する対照と比較してｐＤＷ１４を有する誘導されたＩＮＶＳｃ−１株（レーン２および３）中に存在したことを示す。

【0640】

各々の株から得た２５μＬのライセート（５μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２、５μＬの１００ｍＭ ＤＭＡＰＰ、および６５μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を添加した）に対して、イソプレンシンターゼヘッドスペースのＤＭＡＰＰアッセイを行なった。ガスタイト１．８ｍＬ ＧＣチューブ中、３０℃で１５分間、反応を行なった。１００μＬの２５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を添加して、反応を停止させた。図１４４Ｂには、対照と比較してｐＤＷ１４を有する誘導された株の比活性値（μｇ ＨＧ／Ｌ／ＯＤ単位）を示した。ｐＤＷ１４を有する誘導された株は、イソプレンシンターゼを欠く対照よりも約２０倍高い活性を示した。

【0641】

ＰＣＲサイクリングパラメータ
Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＰｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（商標）ＰＣＲビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、各々２５μｌの総容量／反応で、濃度０．４μＭのオリゴヌクレオチドプライマー対とともに用いた。ＬＲクロナーゼ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得られるプラスミドを解析するために、選択プレート上の個々のコロニー由来の少量の細菌を、上記のＰＣＲミックスを含有する各チューブに添加した。反応サイクルは、次の通りであった。１）９５℃、４分；２）９５℃、２０秒；３）５２℃、２０秒；４）７２℃、３０秒；ステップ２から４までを５サイクル；５）９５℃、２０秒；６）５５℃、２０秒；７）７２℃、３０秒；ステップ５から７までを２５サイクル、７２℃、１０分、および冷えるまで４℃。

【0642】

実施例２１：シュードモナスおよび他のグラム陰性細菌におけるイソプレンの産出
ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２の構築、シュードモナスにおける接合およびイソプレンシンターゼ活性の測定
クズ（クズ植物）由来のイソプレンシンターゼをコードする遺伝子を目的の様々な微生物種用にコドン最適化され（表１４；ｆｌｕｏ−ｏｐｔ２ｖ２は選ばれた配列であった）、ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡにより合成されたものであった。ｆｌｕｏ−ｏｐｔ２ｖ２のマップと配列を、図１４５Ａと１４５Ｂ（配列番号４０）に見出すことができる。クローニングしやすくするために、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位を合成された配列に付加し、転写を増強するためにＲＢＳをＡＴＧの前に付加した。

【0643】

様々なバージョンのコドン最適化されたクズ由来イソプレンシンターゼにおける、微生物種の関数としての、レアコドンの数。数回の最適化によって、目的の全ての種においてレアコドンのない遺伝子が生じた。

【表16】

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【0644】

遺伝子は、ＤＮＡ２．０によりクローニングベクター中に提供された。ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、目的の挿入物に対応するバンドをゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｋｏｖａｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １６６：１７５−１７６，１９９５、これは、特に、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。マップについては図１４６Ａ、配列については図１４６ＢおよびＣ（配列番号４１））に再び連結した。これにより、プラスミドｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２が得られ（マップについては図１４７Ａ、配列については図１４７ＢおよびＣ（配列番号４２））、このプラスミドにおいて、イソプレンシンターゼは、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５に提供されているｌａｃプロモーターから発現された。

【0645】

ベクターを大腸菌Ｓ１７−１に形質転換し、シュードモナス・プチダＦ１ ＡＴＣＣ７００００７およびシュードモナス・フルオレセンスＡＴＣＣ １３５２５と接合させた。ＬＢ上で接合させた後、プラスミドを保有するシュードモナス株の選択をＭ９＋１６ｍＭクエン酸ナトリウム＋ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ上で行なった。Ｑｉａｇｅｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてプラスミドを調製することにより、このように生成された株にプラスミドが存在することを調べた。

【0646】

組換え株であるＰ．プチダ、ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２およびＰ．フルオレセンス、ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２のイソプレンシンターゼ活性をこれらの株を、ＴＭ３培地（実施例１、第ＩＩ部に記載されたもの）＋１０ｇ／Ｌグルコース中で増殖させ、対数増殖期中期のバイオマスを回収し、細胞をフレンチプレスで破壊し、ＤＭＡＰＰアッセイに進めることにより、アッセイした。アッセイの結果を表１５に示した。ＤＭＡＰＰアッセイで測定された活性の存在から、イソプレンシンターゼがシュードモナスで発現されることを確認された。

【0647】

イソプレンシンターゼ活性を、プラスミドｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２を用いて、ｌａｃプロモーターからイソプレンシンターゼを発現するシュードモナス・プチダおよびシュードモナス・フルオレセンスで調べた。

【表17】

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【0648】

実施例２２：グルコースと比べたサトウキビでの大腸菌株およびシュードモナス株の増殖、ならびに両方の基質を用いたイソプレンシンターゼの発現
Ｉ．液体サトウキビの調製
結晶化した原料サトウキビ糖を次のように水に溶解させた。７５０ｇのＨ_２Ｏを２５０ｇの糖に添加した。この溶液を撹拌し、溶解するまで穏やかに加熱した。溶けない物質もあった。溶解した後に溶液の重量を１ｋｇに調整して、蒸発した水を補った。溶液の容量を測定すると、９４０ｍＬであった。したがって、溶液の濃度は２６５ｇ／Ｌであった。製品ラベルには、原料サトウキビ１５ｇで炭水化物１４ｇと書かれていた。したがって、溶液の炭水化物濃度は２４８ｇ／Ｌであった。乾燥固体を測定すると、２４．０３％であり、予想された２５０ｇ／ｋｇと大差なかった。溶液のｐＨは５．４９であった。グルコース濃度は、グルコースオキシダーゼを用いる酵素／分光学アッセイを用いて測定した。グルコース濃度は１７．４ｇ／Ｌであった。

【0649】

大部分の微生物はスクロースを利用しないが、グルコースとフルクトースを利用することができるので、この溶液を２つに分けた。一方の半分は、（未処理のサトウキビを）１回、３０分間加圧滅菌した。グルコース含有量が２９．７５ｇ／Ｌにまで増加したとき、ある程度の転化が生じた（図１４９参照）。溶液のもう一方の半分は、リン酸を用いてｐＨ４．０に調整し、次に、この溶液を加圧滅菌して転化させた（転化サトウキビ）。図１４９に示すように、完全な転化を達成するのに３０分間３サイクルで十分であった。両方の溶液を下記の増殖曲線に用いた。

【0650】

ＩＩ．グルコースと比べたサトウキビでの様々な大腸菌株およびシュードモナス株の増殖曲線
表１６に示す各々の株の１つのコロニーを２５ｍｌ ＴＭ３＋１０ｇ／Ｌグルコースに植菌し、２００ｒｐｍ、３０℃で一晩増殖させた。ＴＭ３は実施例７、第ＩＩ節に記載されている。翌朝、各々の培養物１ｍｌを用いて、２５ｍＬのＴＭ３と１０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの未処理のサトウキビ、または１０ｇ／Ｌ転化サトウキビ（上記のサトウキビ溶液）とを含有するフラスコに植菌した。このフラスコを３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートし、サンプルを定期的に採取して、ＯＤ_６００を測定した。図１５０および１５１は、増殖速度とバイオマス収率が、シュードモナス株と大腸菌株の両方について、グルコースと転化サトウキビで同程度であったことを示している。Ｐ．フルオレセンスは、あまり転化されていないサトウキビを利用することができるいくつかの兆候を示した。

【表18】

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【0651】

ＩＩＩ．グルコースまたはサトウキビで増殖させた場合のイソプレンシンターゼを発現する大腸菌からのイソプレン産出の比較
実施例１４、第ＩＩ節に記載したような、完全なＭＶＡ経路と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを含有する大腸菌ＭＣＭ４０１（ＢＬ２１（ＤＥ３））をＴＭ３＋１０ｇ／Ｌグルコースまたは１０ｇ／Ｌ転化サトウキビ（シロップの炭水化物濃度に基づく）中で増殖させた。ＯＤ_６００＝０．２でＴＭ３＋１０ｇ／Ｌグルコースに終夜培養物からフラスコに植菌した。必要な場合、抗生物質を添加した。２時間後、大腸菌培養物を４００μＭのＩＰＴＧで誘導した。増殖して６時間後、実施例２Ｂに記載のＤＭＡＰＰアッセイを用いて、イソプレン産出およびイソプレンシンターゼ活性を測定した。結果を表１７に示す。これにより、転化サトウキビが１細胞ベースのイソプレンおよびイソプレンシンターゼ産出に関してグルコースと等価であることが明白に示されている。

【表19】

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【0652】

実施例２３：サッカロミセス・セレビシエｇｉ１．２ＫＫＤｙＩオペロンと、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼと、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼと、ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳ）と、ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）とを発現する大腸菌株の構築
（ｉ）ＥＷＬ２０１（ＢＬ２１、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）株の構築
大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎブランド，ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、ＭＣＭ３３１ Ｐ１ライセート（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載の方法によって調製されたライセート）を形質導入された、レシピエント株であった。ＭＣＭ３３１細胞は、サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼ（すなわち、サッカロミセス・セレビシエ由来のｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロン）をコードする染色体構造体ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを含有している。細胞をＬ寒天＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコール上に広げることにより、形質導入体を選択した。このプレートを３０℃で一晩インキュベートした。形質導入体の解析から対照プレート上にはコロニーがないことが示された（復帰については、水＋細胞対照プレート、ライセート汚染については水＋Ｐ１ライセート対照プレート）。

【0653】

４つの形質導入体を選び、これらを用いて５ｍＬ Ｌ液体培地＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコールに植菌した。これらの培養物を２００ｒｐｍで振盪させながら３０℃で一晩増殖させた。ＰＣＲ解析用の各形質導入体のゲノムＤＮＡプレップを作製するために、１．５ｍＬの終夜細胞培養物を遠心分離した。細胞ペレットを４００μｌの再懸濁緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で再懸濁し、ＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を４μｌ添加した。チューブを３７℃で３０分間インキュベートした後、４μｌの１０％ＳＤＳおよび４μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫストック溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。チューブを３７℃で１時間インキュベートした。細胞ライセートを２ｍｌ Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｌｉｇｈｔ Ｇｅｌチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、各々２００μｌの飽和フェノールｐＨ７．９（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）とクロロフォルムを添加した。チューブをよく混合し、５分間微量遠心分離した。４００μｌクロロフォルムで２回目の抽出を行ない、水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。１ｍｌの１００％エタノールを添加し、５分間遠心分離して、ゲノムＤＮＡを沈殿させた。ゲノムＤＮＡペレットを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄した。エタノールを除去し、ゲノムＤＮＡペレットを短時間風乾させておいた。ゲノムＤＮＡペレットを２００μｌのＴＥに再懸濁した。

【0654】

Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と、鋳型としての２００ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡとを用いて、製造元のプロトコルに従って、２つの異なるＰＣＲ反応チューブのセットを準備した。セット１の場合、プライマーのＭＣＭ１３０およびＧＢ Ｃｍ−Ｒｅｖ（表１８）を用いて、形質導入体がａｔｔＴｎ７遺伝子座にうまく組み込まれることを保証した。セット１のＰＣＲパラメータは、９５℃で２分（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で２５秒（ステップ２〜４を２８サイクル繰り返す）、７２℃で１分であった。セット２の場合、プライマーのＭＶＤ ＦｏｒおよびＭＶＤ Ｒｅｖ（表１８）を用いて、ｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロンが適切に組み込まれることを保証した。セット２のＰＣＲパラメータは、９５℃で２分（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で１０秒（ステップ２〜４を２８サイクル繰り返す）、７２℃で１分であった。１．２％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）でのＰＣＲアンプリコンの解析から、４つの形質導入体クローンの全てが正しいことが示された。１つを選んで、ＥＷＬ２０１株と命名した。

【0655】

（ｉｉ）ＥＷＬ２０４（ＢＬ２１、ｌｏｏｐｏｕｔ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）株の構築
Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（２０００）（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：６６４０−６６４５，２０００）に記載されているように、プラスミドｐＣＰ２０を用いて、クロラムフェニコールマーカーをＥＷＬ２０１株からループアウトさせた。Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７：６６４０−６６４５，２０００）。ＥＷＬ２０１細胞を対数増殖期中期までＬ液体培地中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液のアリコート５０μｌを、１μｌのｐＣＰ２０と混合し、細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．）を用いて、２ｍｍキュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加し、その後、金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。３０℃で１時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬ寒天＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコール＋５０μｇ／μｌカルベニシリン上で選択し、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、対数増殖期初期まで単一クローンを１０ｍｌＬ液体培地＋５０μｇ／μｌカルベニシリン中、３０℃で増殖させた。その後、増殖中の培養物の温度を２時間４２℃に変えた。連続希釈物を作製した後、細胞をＬＡプレート（抗生物質選択なし）上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、２０個のコロニーを選び、Ｌ寒天（抗生物質なし）プレートおよびＬＡ＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコールプレート上に当てた。その後、プレートを３０℃で一晩インキュベートした。細胞はＬＡプレート上では増殖することができたが、ＬＡ＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコール上では増殖することができず、クロラムフェニコールマーカーがループアウトしたとみなされた（１つ選んで、ＥＷＬ２０４株と命名した）。

【0656】

（ｉｉｉ）プラスミドｐＥＷＬ２３０（ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ）の構築
大腸菌発現用のコドン最適化方法に基づくウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ（ウラジロハコヤナギＨＧＳ）をコードする合成遺伝子の作製を、ＤＮＡ２．０ Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）に外注した。合成遺伝子は、プラスミドｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎブランド，ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）にカスタムクローニングされ、凍結乾燥品として配送された（図１５２、１５３Ａ〜Ｂ；配列番号４３）。

【0657】

鋳型としてのｐＥＴ２４ａ Ｐ．ａｌｂａ ＨＧＳと、プライマーのＭＣＭ１８２およびＭＣＭ１９２と、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元のプロトコルに従って用いて、ＰＣＲ反応を行なって、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ（ウラジロハコヤナギＨＧＳ）遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りであった。９５℃で２分（最初のサイクルのみ）、２５サイクルの９５℃で２５秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分の繰返し、７２℃で３分の最後の伸長。ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。

【0658】

次に、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼのＰＣＲ産物を、１μｌのＢｓｐＨＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と２μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液４を含有する２０μｌ反応液中で消化した。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。１μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と２μｌの１０×緩衝液Ｈを含有する２０μｌ反応液中で２回目の制限消化を行なった。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を、１μｌのＮｃｏＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と、１μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼと、２μｌの１０×緩衝液Ｈを含有する２０μｌ反応液中で消化した。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターを１．２％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した（図１５４）。ＢｓｐＨＩ部位とＮｃｏＩ部位という互換的な付着末端を用いて、５μｌのウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ挿入物、２μｌのｐＴｒｃベクター、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μｌの１０×リガーゼ緩衝液、および１０μｌのｄｄＨ_２Ｏを含有する２０μｌライゲーション反応液を調製した。このライゲーション混合物を室温で４０分間インキュベートした。ペトリ皿のｄｄＨ_２Ｏに０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を浮かべ、このニトロセルロース膜フィルターの上にライゲーション混合物を室温で３０分間軽く適用することにより、ライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞（第ＩＩ節参照）を対数増殖期中期までＬＢ中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液のアリコート５０μｌを、５μｌの脱塩ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ ＨＧＳライゲーションミックスと混合した。この細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２ｍｍキュベット中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加し、その後、金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。３０℃で２時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬ寒天＋５０μｇ／μｌカルベニシリン＋１０ｍＭ メバロン酸上で選択し、３０℃でインキュベートした。翌日、６個の形質転換体を選び、５ｍｌのＬ液体培地＋５０μｇ／μｌカルベニシリンチューブ中、３０℃で一晩増殖させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、終夜培養物に対してプラスミドプレップを行なった。プラスミド増殖にＢＬ２１細胞を用いたため、高品質のプラスミドＤＮＡを得るための標準的な製造元のプロトコルに、スピンカラムをＰＢ緩衝液で５回、ＰＥ緩衝液で３回洗浄するという変更を組み入れた。プラスミドを、２０μｌ反応液中のＰｓｔＩで消化して、正しいサイズの線状断片を保証した。６つのプラスミドは全てサイズが正しく、プライマーのＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００（表１８）を用いるシークエンシングのためにＱｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）に送った。ＤＮＡシークエンシングの結果から、６つのプラスミド全てが正しいことが示された。１つのプラスミドを選び、プラスミドＥＷＬ２３０と命名した（図１５５、１５６Ａ〜Ｂ；配列番号４４）。

【0659】

（ｉｖ）プラスミドｐＥＷＬ２４４（ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）の構築
鋳型としてのＭＣＭ３７６（下記第（ｖ）節参照）と、プライマーのＭＣＭ１６５およびＭＣＭ１７７（表１８参照）と、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩフュージョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とを製造元のプロトコルに従って用いて、ＰＣＲ反応を行ない、メタノサルキナ・マゼイ（Ｍ．マゼイ）ＭＶＫ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りであった。９５℃で２分（最初のサイクルのみ）、２８サイクルの９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で１８秒の繰返し、７２℃で１分の最後の伸長。Ｍ．マゼイＭＶＫのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。

【0660】

次に、Ｍ．マゼイＭＶＫのＰＣＲ産物を、８μｌのＰＣＲ産物、２μｌのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、４μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液４、４μｌの１０×ＮＥＢ ＢＳＡ、および２２μｌのｄｄＨ_２Ｏを含有する４０μｌ反応液中で消化した。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。２μｌのＮｓｉＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、４．７μｌの１０×緩衝液Ｈ、および４０μｌのＰｍｅＩ 消化したＭ．マゼイＭＶＫ断片を含有する４７μｌ反応液中で２回目の消化を行なった。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片を１．２％Ｅ−ゲルを用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて抽出した。プラスミドＥＷＬ２３０を、１０μｌのプラスミド、２μｌのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ、４μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液４、４μｌの１０×ＮＥＢ ＢＳＡ、および２０μｌのｄｄＨ_２Ｏを含有する４０μｌ反応液中で消化した。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。２μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ、４．７μｌの１０×緩衝液Ｈ、および４０μｌのＰｍｅＩ消化したＥＷＬ２３０線状断片を含有する４７μｌ反応液中で２回目の消化を行なった。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片を１．２％Ｅ−ゲルを用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した（図１５７）。ＮｓｉＩ部位とＰｓｔＩ部位の互換性のある付着末端を用いて、８μｌのＭ．マゼイＭＶＫ挿入物、３μｌのＥＷＬ２３０プラスミド、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、２μｌの１０×リガーゼ緩衝液、および６μｌのｄｄＨ_２Ｏを含有する２０μｌのライゲーション反応液を調製した。このライゲーション混合物を１６℃で一晩インキュベートした。翌日、ペトリ皿のｄｄＨ_２Ｏに０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルターを浮かべ、このニトロセルロース膜フィルターの上にライゲーション混合物を室温で３０分間軽く適用することにより、ライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞を対数増殖期中期までＬＢ中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液のアリコート５０μｌを、５μｌの脱塩ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ ｍＭＶＫライゲーションミックスと混合した。細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２ｍｍキュベット中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加し、その後、金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブに移した。３０℃で２時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／μｌカルベニシリン＋５ｍＭ メバロン酸プレート上で選択し、３０℃でインキュベートした。翌日、６個の形質転換体を選び、５ｍｌのＬＢ＋５０μｇ／μｌカルベニシリンチューブ中、３０℃で一晩増殖させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、終夜培養物に対してプラスミドプレップを行なった。プラスミド増殖にＢＬ２１細胞を用いたため、高品質のプラスミドＤＮＡを得るための標準的な製造元のプロトコルに、スピンカラムをＰＢ緩衝液で５回、ＰＥ緩衝液で３回洗浄するという変更を組み入れた。正しいサイズのプラスミドの線状断片を選ぶためプラスミドを、２０μｌ反応液中のＰｓｔＩで消化した。、６つのプラスミドのうち３つはサイズが正しく、プライマーのＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００、ＥＬ１００３、およびＥＬ１００６（表１８）を用いるシークエンシングのためにＱｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに送った。ＤＮＡシークエンシングの結果から、３つのプラスミド全てが正しいことが示された。１つのプラスミドを選び、プラスミドＥＷＬ２４４と命名した（図１５８、１５９Ａ〜Ｂ；配列番号４５）。

【0661】

（ｖ）ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄの構築プラスミド
Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロン由来のＭＶＫ ＯＲＦ（図１６０Ａ〜Ｃ；配列番号４６）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉ ＰＣＲミックスを用い、プライマーのＭＣＭ１６１およびＭＣＭ１６２（表）を用いてＰＣＲ増幅した。４５μＬのＰＣＲミックスを１μＬの鋳型、１μＬの各プライマー（１０μＭ）、および２μＬの水と合わせた。反応を次のようなサイクルで行なった。９４℃で２分；３０サイクルの９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および６８℃で１分１５秒；次に、７２℃で７分、そして、冷えるまで４℃。３μＬのこのＰＣＲ反応液を製造元のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＥＴ２００Ｄプラスミドに連結した。３μＬのこのライゲーション液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択した。形質転換体から得たプラスミドを単離し、挿入物をシークエンシングし、ＭＣＭ３７６を得た（図１６１Ａ〜Ｃ；配列番号４７）。

【0662】

（ｖｉ）ＥＷＬ２５１株（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）の構築
ＭＣＭ３３１細胞（これは、サッカロミセス・セレビシエメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードする染色体構造体ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを含有する）を対数増殖期中期までＬＢ中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。５０μｌの細胞懸濁液を１μｌのプラスミドＥＷＬ２４４混合した。細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２ｍｍキュベット中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加し、その後、金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブに移した。３０℃で２時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／μｌカルベニシリン＋５ｍＭ メバロン酸プレート上で選択し、３７℃でインキュベートした。１つのコロニーを選択し、ＥＷＬ２５１株と命名した。

【0663】

（ｖｉｉ）ＥＷＬ２５６株（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ， ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ）の構築
ＥＷＬ２５１細胞を対数増殖期中期までＬＢ中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。５０μｌの細胞懸濁液を１μｌのプラスミドＭＣＭ８２（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードする、ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（別名「ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ」）を含む）と混合した。プラスミドｐＣＬ Ｐｔｒｃ Ｕｐｐｅｒ Ｐａｔｈｗａｙは上記の実施例８に記載したように構築した。この細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２ｍｍキュベット中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加した。その後、細胞を金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブに移した。３０℃で２時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／μｌカルベニシリン＋５０μｇ／μｌスペクチノマイシンプレート上で選択し、３７℃でインキュベートした。１つのコロニーを選び、ＥＷＬ２５６株と命名した。

【表20】

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【0664】

（ｖｉｉｉ）ＲＭ１１１６０８−２株（Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ、ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ、ｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ）の構築
複製プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）（Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ博士，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手）上のｙｂｈＥ遺伝子（大腸菌６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする）を構成的に発現する、イソプレンを産出するＢＬ２１株の大腸菌（ＥＷＬ２５６）を構築した。

【0665】

ＦＲＴに基づく組換えカセットと、Ｒｅｄ／ＥＴによる組込みおよび抗生物質のマーカーループアウト用のプラスミドをＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。これらの材料を用いた処理を、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓのプロトコルに従って行なった。プライマーのＰｇｌ−Ｆ（配列番号１３９）およびＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ（配列番号１４０）を用い、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎキットを用いて、ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴ鋳型の耐性カセットを増幅した。ＰＣＲ反応液（最終容量５０μＬ）は、５μＬの緩衝液、１μＬの鋳型ＤＮＡ（Ｇｅｎｅ ＢｒｉｄｇｅｓからのＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−Ｆ）、１０ｐｍｏｌの各プライマー、および１．５μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰミックスを含んでおり、これをｄＨ_２Ｏで５０μＬにした。反応を次のようなサイクルで行なった。１×２分、９５℃、次に、３０サイクルの（９５℃、３０秒；６３℃、３０秒；７２℃、３分）。

【0666】

得られたＰＣＲ産物をＱｉａＱｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、以下のように、ｐＲｅｄ−ＥＴリコンビナーゼ含有プラスミドを有するエレクトロコンピテントＭＧ１６５５細胞にエレクトロポレートした。ＯＤ_６００が約０．６になるまで５ｍＬのＬ液体培地中、３０℃で増殖させることにより、細胞を調製した。リコンビナーゼを発現させるために４％アラビノースを添加して細胞を誘導し、３０℃で３０分間増殖させておき、その後、３７℃で３０分間増殖させた。細胞のアリコート１．５ｍＬを、氷冷ｄＨ_２Ｏで３〜４回洗浄した。最終的な細胞ペレットを４０μＬの氷冷ｄＨ_２Ｏに再懸濁し、２〜５μＬのＰＣＲ産物を添加した。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．）で、１ｍｍのギャップのキュベット中、１．３ｋＶでエレクトロポレーションを行なった。細胞を３０℃で１〜２時間回復させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上にプレーティングした。５つの形質転換体をＰＣＲで解析し、組込み部位に隣接するプライマー（２つのプライマーセット：ｐｇｌ＋４９ ｒｅｖおよび３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ；Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｇｂ２およびＴｏｐ ＧＢ’ｓ ＣＭＰ（９４６））を用いてシークエンシングした。正しい形質転換体を選択し、この株をＭＧ１６５５ ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰと命名した。

【0667】

ＭＧ１６５５ ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰの染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ＦＲＴ−ＣＭＰ−ＦＲＴ−ＧＩ１．５−ｙｂｈＥ構造体を含有するＰＣＲ断片を生成させた。この構造体を以下のようにｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）にクローニングした。この断片（ここでは、ＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌと呼ぶ）を、５’プライマーのＰｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ（配列番号１４１）および３’プライマーの３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ（配列番号１４２）を用いて増幅した。得られた断片を、製造元が提案するようにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングキットを用いてプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。ＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌ断片を有するＮｓｉＩ断片をｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）のＰｓｔＩ部位にクローニングした。５μｌのＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌ挿入物、２μｌのｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）ベクター、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μｌの１０×リガーゼ緩衝液、および１０μｌのｄｄＨ_２Ｏを含有する２０μｌのライゲーション液を調製した。このライゲーション混合物を室温で４０分間インキュベートした後、２〜４μＬを、上で開示したパラメータを用いてエレクトロコンピテントＴｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にエレクトロポレートした。形質転換体を１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＬ寒天上で選択した。上記のいくつかのプライマーならびにＳｅｑｕｅｔｅｃｈ，ＣＡによって提供された自社製のＴ３プライマーおよびリバースプライマーを用いて、選択されたクローンの配列を決定した。このプラスミドをｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ（図１６２、１６３Ａ〜Ｂおよび配列番号４８）と命名した。

【0668】

プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌを上記のようにＥＷＬ２５６にエレクトロポレートし、形質転換体をクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、およびカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上にプレーティングした。１つの形質転換体を選択し、ＲＭ１１１６０８−２株と命名した。

【0669】

プライマー：
Ｐｇｌ−Ｆ

５’−ａｃｃｇｃｃａａａａｇｃｇａｃｔａａｔｔｔｔａｇｃｔｇｔｔａｃａｇｔｃａｇｔｔｇａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃ−３’（配列番号１３９）


ＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ
５’−ｇｃｔｇｇｃｇａｔａｔａａａｃｔｇｔｔｔｇｃｔｔｃａｔｇａａｔｇｃｔｃｃｔｔｔｇｇｇｔｔａｃｃｔｃｃｇｇｇａａａｃｇｃｇｇｔｔｇａｔｔｔｇｔｔｔａｇｔｇｇｔｔｇａａｔｔａｔｔｔｇｃｔｃａｇｇａｔｇｔｇｇｃａｔａｇｔｃａａｇｇｇｃｇｔｇａｃｇｇｃｔｃｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｃｇａｇ−３’（配列番号１４０）

３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ：

５’−ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＡＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ（配列番号１４２）


ｐｇｌ＋４９ ｒｅｖ：ＣＧＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧ（配列番号１４３）


Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｇｂ２：ＧＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号１４４）


Ｔｏｐ ＧＢ’ｓ ＣＭＰ（９４６）：ＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＣ（配列番号１４５）

Ｐｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ

５’−ａｃｃｇｃｃａａａａｇｃｇａｃｔａａｔｔｔｔａｇｃｔ−３’（配列番号１４１）

【0670】

実施例２４：大腸菌におけるｙｂｈＥ（ｐｇｌ）の構成的発現によるイソプレン産出の改善
この実施例は、野生型レベルでｙｂｈＥを発現する対照株（すなわち、ＥＷＬ２５６）と比べた、大腸菌ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を構成的に発現する株におけるイソプレンの産出を示す。遺伝子ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）は、異種発現されたタンパク質の翻訳後グルコニル化を抑制し、産物の溶解度と収率を改善すると同時に、バイオマスの収率とペントースリン酸経路への流量を改善する大腸菌６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする。（Ａｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７４（４）：９５０−９５８，２００８）。

【0671】

小規模解析
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：Ｋ_２ＨＰＯ_４ １３．６ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １３．６ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ３．２ｇ、酵母抽出物１ｇ、１０００×微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）を用いてｐＨを６．８に調整し、全量に合わせた。培地を０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。グルコース５．０ｇおよび抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0672】

１０００×微量金属溶液（発酵培地１リットル当たり）：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ_２Ｏに溶解させる。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を全量に合わせ、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。

【0673】

（ａ）実験手順
ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＣｅｌｌｅｒａｔｏｒ（商標）で株を増殖させることにより、イソプレン産出を分析した。各々２４ウェル中のワーキング容量は４．５ｍＬであった。温度は３０℃で維持され、ｐＨ定値は７．０であり、酸素流量定値は２０ｓｃｃｍであり、撹拌速度は８００ｒｐｍであった。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢ液体培地寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３０℃でインキュベートした。単一コロニーを抗生物質を含む培地に植菌し、一晩増殖させた。５５０ｎｍで測定して光学密度が０．０５に達するように、細菌を抗生物質を含む４．５ｍＬの培地に希釈した。

【0674】

ガスクロマトグラフ−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペースアッセイを用いて、イソプレンの発生ガス分析を行なった。サンプル調製は次のようにした。１００μＬの全液体培地を密封ＧＣバイアルに入れ、３０℃で３０分という一定時間インキュベートした。７０℃で５分間のインキュベーションからなる熱不活化工程の後、サンプルをＧＣに投入した。

【0675】

実行中にマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を用いて波長５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を得た。イソプレン濃度（μｇ／Ｌ）をこのＯＤ測定値と時間（時間）で割って比生産性を得た。

【0676】

２００および４００μＭのＩＰＴＧ誘導レベルで、２つの株、ＥＷＬ２５６およびＲＭ１１６０８−２を評価した。誘導後１、２．５、４．７５、および８時間でのイソプレン産出および細胞増殖（ＯＤ５５０）について、サンプルを分析した。サンプルは２つ１組で作製した。

【0677】

（ｂ）結果
２つの異なるＩＰＴＧ濃度で、ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を発現する株は、対照株と比べて劇的に２〜３倍イソプレン比生産性を増加させることが実験により示された。

【0678】

Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＲＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた大腸菌からのイソプレン発酵
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。これらの成分を全て一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を加圧滅菌した。ｐＨを水酸化アンモニウム（３０％）で７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン^＊ＨＣｌ ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0679】

１０００×改変微量金属溶液：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0680】

上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびウラジロハコヤナギ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）と、高発現の大腸菌ｐｇｌ（ｐＢＢＲ−ｐｇｌ）とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３４℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。大腸菌株の凍結バイアルを解凍し、トリプトン−酵母抽出物培地に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて１５Ｌバイオリアクターに植菌し、初期容量を５Ｌにした。

【0681】

細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。４０時間（５９時間）の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は３．１ｋｇ（５９時間で４．２ｋｇ）であった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_５５０）が４という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１１０μＭにした。ＯＤ_５５０が１５０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１９２μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図１６４Ａに示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は、発酵の間に、４０時間で最大値３３．２ｇ／Ｌ（５９時間で最大値４８．６ｇ／Ｌ）まで増加した（図１６４Ｂ）。イソプレン力価は、発酵の間に、４０時間で最大値４０．０ｇ／Ｌ（５９時間で最大値６０．５ｇ／Ｌ）まで増加した（図１６４Ｃ）。４０時間（５９時間）の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は、２８１．３ｇ（５９時間で４５１．０ｇ）であった。産出の時間経過を図１６４Ｄに示す。容積生産性の時間経過を図１６４Ｅに示す。これは、１．０ｇ／Ｌ／時間という平均速度が０〜４０時間の間（１９〜５９時間では１．４ｇ／Ｌ／時間）に維持されたことを示す。ＣＥＲで測定された場合の代謝活性プロファイルを図１６４Ｆに示す。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は、４０時間で１９．６％であった（５９時間で（２３．６％）。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は、４０時間で８．９％（５９時間で１０．７％）であった。

【0682】

実施例２５：Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼと、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼと、ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳ）とｙｂｈＥ（ｐｇｌ）とを発現する大腸菌株におけるイソプレンと水素の同時生成
発酵発生ガスの回収ならびに発酵発生ガスの水素レベルおよびイソプレンレベルの分析
ＲＭ１１１６０８−２株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ、ｐＢＢＲ ｃｍＲ−ｇｉ１．５−ｐｇｌ）およびＥＷＬ ２５６株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）を用いて発酵を行なった。細菌株の構築は上の実施例２３に記載されている。

【0683】

大腸菌からのイソプレンの大量産出を、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼと、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼと、ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳ）と、構成的に発現するｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＲＭ１１１６０８−２）または正常に発現するｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＥＷＬ２５６）のいずれかとを発現する大腸菌株のＥＷＬ２５６およびＲＭ１１１６０８−２の流加培養から決定した。この実験により、グルコースの存在下で細胞を増殖させると、イソプレンと水素の同時生成が生じたことが示されている。

【0684】

ＴＭ２発酵培地１リットル当たりの発酵培地（ＴＭ２）のレシピは次の通りであった。Ｋ_２ＨＰＯ_４ １３．６ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １３．６ｇ、ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ３．２ｇ、酵母抽出物５ｇ、１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。１０００×改変微量金属溶液：クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ １００ｍｇ。１０００×改変微量金属溶液の場合、各成分を一度にＤｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、蒸留水中で最終容量に合わせ、０．２２ミクロン（μｍ）フィルターで滅菌濾過する（この溶液は加圧滅菌しない）。ＴＭ２発酵培地の場合、全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させ、水酸化カリウム（ＫＯＨ）でｐＨを６．８に調整し、適量を加えて全量とし、培地を０．２２ミクロン（μｍ）フィルターで濾過滅菌した。グルコースは、９９ＤＥ（デキストロース当量）の７１％ＤＳ（乾燥固体）シロップとしてＣａｒｇｉｌｌから供給された。

【0685】

上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、ウラジロハコヤナギ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）と、構成的に発現するｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＲＭ１１１６０８−２）または正常に発現するｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＥＷＬ２５６）とを含有する大腸菌株のＥＷＬ２５６またはＲＭ１１１６０８−２を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵条件（ｐＨ７．０および温度３４℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。

【0686】

凍結バイアルから採取された適当な大腸菌株の種菌をペプトン−酵母抽出物培地中に調製した。種菌がＯＤ_５５０＝０．６まで増殖した後、６００ｍＬを用いて、ＴＭ２培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに植菌した。細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。６７時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３．９ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１０２μＭにした。ＯＤ_５５０が１４０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１９２μＭに上昇させた。植菌後の様々な時点で、サンプルを取り出し、産出されたイソプレンの量を以下のように測定した。バイオリアクターからの発生ガス中の水素、窒素、酸素、二酸化炭素、およびイソプレンのレベルを、以下に論じるように、Ｈｉｄｅｎ ＨＰＲ−２０質量分析計を用いて測定した。

【0687】

１５Ｌバイオリアクターからの発酵発生ガスのサンプルを、１Ｌ_発生ガス／分で１０秒間、バイアルに放出することにより、２０ｍＬガラスヘッドスペースバイアル中に回収し、テフロンコートしたセプタム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＣＡ）が付いた金属スクリューキャップで密封した。このバイアルを回収から３０分以内に分析した。

【0688】

質量分析計の注入チューブをキャップしていないヘッドスペースバイアルに１〜２分間入れることによって４ｓｃｃ／分（４ｍＬ／分）の速度でＨｉｄｅｎ ＨＰＲ−２０質量分析計（Ｈｉｄｅｎ Ａｎａｌｙｓｔｉｃ，Ｕ．Ｋ．）に注入することにより、２つのサンプルの分析を行なった。ＨＰＲ−２０装置は、水素（ｍ／ｚ ２）、窒素（ｍ／ｚ ２８）、酸素（ｍ／ｚ ３２）、二酸化炭素（ｍ／ｚ ４４）およびイソプレン（ｍ／ｚ ６７）に対応する質量をスキャンするように構成された。質量２８、３２、４４および６７にはＦａｒａｄａｙ検出器を用いた。水素（ｍ／ｚ ２）にはＳＥＭ検出器を用いた。検出器応答を任意単位の圧力（Ｔｏｒｒ）として測定した。絶対水素レベルを信頼のおける水素ガス標準との比較により推定した。ＭＡＳｓｏｆｔ Ｖ ６．２１．０．５１ソフトウェア（Ｈｉｄｅｎ Ａｎａｌｙｓｔｉｃ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて結果を記録した。

【0689】

結果
発生ガスサンプルを２つの発酵操作から採取し、上記のように分析した。
Ａ）ＲＭ１１１６０８−２株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ、ｐＢＢＲ ｃｍＲ−ｇｉ１．５−ｐｇｌ）。サンプルは６４．８時間でｒｕｎに取り込まれたが、その間、発酵は、窒素注入１ｖｖｍで嫌気的に行なわれていた。

【0690】

Ｂ）ＥＷＬ２５６株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）。サンプルは、３４．５時間でに取り込まれたが、その間、発酵は、空気注入１ｖｖｍで好気的行なわれていた。

【0691】

結果を図１６５Ａ〜Ｂに示す。両方の場合において、イソプレン、酸素および二酸化炭素の他に、低レベルの水素を検出した。水素のベースライン測定値は０．９５×１０^−８トール（ＴＯＲＲ）であった。サンプルＡとＢは両方とも、約１．３×１０^−８トールという測定値を与えた。水素標準との比較を基にすると、サンプルＡとＢの発生ガス中に存在する水素の量は、１０ｐｐｍｖ（容積百万分率）未満であると推定されたが、ベースラインを上回っていた。図１６５Ａ〜Ｂに示すように、サンプルＡとＢは両方とも、かなりの量のイソプレンと二酸化炭素も含んでいた。

【0692】

実施例２６：Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼと、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼと、ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳ）とｙｂｈＥ（ｐｇｌ）とを発現する大腸菌株におけるイソプレンと水素の同時生成
発酵発生ガスの回収ならびに発酵発生ガスの水素レベルおよびイソプレンレベルの分析
この実験の目的は、人為操作した大腸菌株において水素とイソプレンを同時生成させることである。この目的のために、上記のように調製される大腸菌ヒドロゲナーゼ−３を発現するｈｙｃオペロンの一部をＥＷＬ２５６株［ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ］で発現させるが、ＲＭ１１１６０８−２などの、上記の細菌株のどれかを同じように改変することができる。ｈｙｃオペロン遺伝子のｈｙｃＢ（ｇｉ｜１６１３０６３１）、ｈｙｃＣ（ｇｉ｜１６１３０６３０）、ｈｙｃＤ（ｇｉ｜１６１３０６２９）、ｈｙｃＥ（ｇｉ｜１６１３０６２８）、ｈｙｃＦ（ｇｉ｜１６１３０６２７）、およびｈｙｃＧ（ｇｉ｜１６１３０６２６）を含む発現構造体を、公けに利用可能な遺伝子配列に基づいて当該技術分野で公知の標準的なクローニング方法で調製し、ＥＷＬ２５６株に導入して、新しいＥＷＬ２５６＋Ｈｙｄ−３株を作製する。

【0693】

変異の追加が水素とイソプレンの同時生成に与える影響をそれのみでまたはＥＷＬ２５６＋Ｈｙｄ−３と組み合わせて評価した。即ち、ヒドロゲナーゼ−３の成熟もしくは調節に関与する遺伝子（例えば、ｈｙｃＨ（ｇｉ｜１６１３０６２５）およびｈｙｃＩ（ｇｉ｜１６１３０６２４））を導入することによって、水素取込みもしくは輸送に関与する遺伝子（例えば、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（ｈｙａオペロン）およびヒドロゲナーゼ−２（ｈｙｂオペロン））もしくは関連タンパク質（例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ｆｄｈＦ（ｇｉ｜１６１３０６２４））、ギ酸リアーゼのリプレッサー（ｈｙｃＡ（ｇｉ｜１６１３０６３２））、ギ酸デヒドロゲナーゼＮ、αサブユニット（ｆｄｎＧ（ｇｉ｜１６１２９４３３））、ギ酸デヒドロゲナーゼＯ、大サブユニット（ｆｄｏＧ（ｇｉ｜１６１３１７３４））、硝酸レダクターゼ（ｎａｒＧ（ｇｉ｜１６１２９１８７））、フマル酸レダクターゼ調節因子（ｆｎｒ（ｇｉ｜１６１２９２９５））、およびアセチル−補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ（ｇｉ｜１６１３１８９５）））を不活化もしくは欠失させることによって、ヒドロゲナーゼの上方調節に関与する遺伝子（例えば、ギ酸水素リアーゼの活性化因子（ｆｈｌＡ（ｇｉ｜１６１３０６３８））を活性化することによって、発酵副産物の産出に関与する遺伝子（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ（ｇｉ｜１６１２９３４１））、フマル酸レダクターゼ膜タンパク質（ｆｒｄＣ（ｇｉ｜１６１３１９７７））、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ（ｇｉ｜１６１２９２０２））、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ（ｇｉ｜１６１２８８３９））、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分ａｃｋＡ／ｐｔａ（ａｃｅＥ（ｇｉ｜１６１２８１０７））、ギ酸デヒドロゲナーゼ調節タンパク質（ｈｙｃＡ（ｇｉ｜１６１３０６３２ ））、およびギ酸輸送体ＡおよびＢ（ＦｏｃＡ（ｇｉ｜１６１２８８７１）ならびにＦｏｃＢ（ｇｉ｜１６１３０４１７））を不活化もしくは欠失させることによって、または水素代謝に関与する異種遺伝子（例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｆｒｏｍ クロストリジウム・アセトブツリクム（ｇａｐＣ（ｇｉ｜１５８９３９９７））を発現させることによる影響の評価を行った。、

【0694】

本質的に上記の実施例２５に記載したように、単独でまたは組み合わせて、上記のような１以上の追加の変異を含むように改変された、ＥＷＬ２５６＋Ｈｙｄ−３株（ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫおよびｈｙｃＢ−Ｆ）という人為操作した変異体を用いて発酵を行なう。水素とイソプレンの同時生成を、本質的に上に記載したように、発生ガスサンプルの分析によって評価する。株をイソプレンと水素の同時生成の速度に基づくさらなる分析用に選択する。

【0695】

実施例２７：サッカロミセス・セレビシエによるエタノールとイソプレンの同時生成
サッカロミセス・セレビシエ株におけるイソプレンとエタノールの同時生成の実行可能性を明らかにするために、ＩｓｐＳ（イソプレンシンターゼ）発現サッカロミセス・セレビシエを誘導条件下で４８時間嫌気的に増殖させ、イソプレンとエタノールの産出を測定した。

【0696】

この実施例で使用される株。（１）ＤＷ１１２：サッカロミセス・セレビシエ（ＩｎｖＳＣ１）＋２ミクロンプラスミド（ｕｒａ）上でコドン最適化ＩｓｐＳ（クズ）をコードするｐＤＷ１４；および（２）ＤＷ１１４：サッカロミセス・セレビシエ（ＩｎｖＳＣ１）＋ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−空ベクター対照（ｕｒａ）。

【0697】

この実施例で使用される略語。（１）１１２Ｇ（１１２ｇａｌ）：誘導されたＤＷ１１２株（０．５％グルコース、２％ガラクトース）；（２）１１２Ｒ（１１２ｒａｆ）：誘導されていないＤＷ１１２株（０．５％グルコース、１％ラフィノース）；（３）１１４Ｇ（１１４ｇａｌ）：誘導されたＤＷ１１４株（０．５％グルコース、２％ガラクトース）；および（４）１１４Ｒ（１１４ｒａｆ）：誘導されていないＤＷ１１４株（０．５％グルコース、１％ラフィノース）。

【0698】

増殖および誘導条件。ｐＤＷ１４（ＤＷ１１２株）またはｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（ＤＷ１１４株）を有するＩＮＶＳｃ−１株（ベクター構築の詳細については実施例２０参照）を、ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２ Ｇａｔｅｗａｙベクターマニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載されているように、ＳＣ最小培地（２％グルコース含有、ウラシル非含有）上で選択した。ウラシル非含有ＳＣ最小培地は、０．６７％の酵母窒素塩基（アミノ酸非含有；硫酸アンモニア含有）；２％の炭素源（例えば、繁殖用のグルコースまたは誘導用のガラクトース）；０．０１％の（アデニン、アルギニン、システイン、ロイシン、リジン、トレオニン、トリプトファン）；０．００５％の（アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、チロシン、バリン）；および場合により２％の寒天（プレート用）を含有する。図１４１は、コドン最適化されたクズ由来ＩｓｐＳの配列を示し；図１４２Ａは、酵母におけるガラクトース誘導性発現用の複製ベクターのマップを示し；図１４２Ｂ〜Ｃは、サッカロミセス・セレビシエにおけるクズＩｓｐＳのガラクトース誘導性発現用の発現ベクターの完全なヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す。

【0699】

繁殖させるために、固体または液体のいずれかのＳＣ最小培地（ウラシル非含有、２％グルコース含有）中、３０℃で、株を好気的に増殖させた。一晩インキュベートした後、２０ｍｌのＳＣ最小培地（ウラシル非含有、０．５％グルコース含有）中でＯＤ_６００が１．０になるまで株を希釈し、さらに２時間増殖させた。ＯＤ_６００が約１．４のとき（図１６６参照）、１０ｍｌの各株を密封した２０ｍｌガスクロマトグラフィー（ＧＣ）バイアルに移し、ラフィノースまたはガラクトースのいずれかを、それぞれ、最終濃度１％または２％になるまで添加した。これにより、ＤＷ１１２とＤＷ１１４の両方の誘導されていない増殖（ラフィノースを表すＲ）と誘導された増殖（ガラクトースを表すＧ）の両方が生じた。ＧＣバイアルを密封し、３０℃で４８時間インキュベートした。

【0700】

ＧＣ−ＭＳによるイソプレンの検出。密封したＧＣバイアル中で４８時間インキュベートした後、ＧＣ−ＭＳにより、株をイソプレン産出についてアッセイした（方法については下記参照）。対照サンプル（１１２Ｒ、１１４Ｇ、および１１４Ｒ）はイソプレン産出を示さなかったが、クズＩｓｐＳを含有し、２％ガラクトースの存在下で増殖させた株（１１２Ｇ）は、検出可能なレベルのイソプレンを産出した（表１９および図１６７を参照）。対照では、イソプレンの保持時間（０．４９分）に検出可能なピークがなく、したがって、イソプレンの積分値を生成することができなかった（図１６７参照）。８８８／μｇという較正係数を用いると、１１２Ｇのピーク面積は、４．９７μｇ／Ｌというヘッドスペースガス中のイソプレン濃度に相当する。

【表21】

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【0701】

イソプレン検出のためのＧＣ−ＭＳ法。ヘッドスペースモードで操作するＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ） ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーに接続されたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣ／ＭＳシステムを用いて分析を行なった。分析物の分離にはＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（１５ｍ×０．２５ｍｍ；０．２５μｍ膜圧）を用いた。１００μＬのヘッドスペースガスを注入するようにサンプラーを設定した。ＧＣ／ＭＳ法では、ヘリウムがキャリアガスとして２ｍＬ／分の流速で用いられた。注入口を２５０℃に保ち、分割比を５０：１とした。オーブン温度は、２分の分析期間中、３７℃に保った。ｍ／ｚ ６７での単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードでＡｇｉｌｅｎｔ ５７９３Ｎ質量選択検出器を操作した。０．０１分から０．４５分まで検出器を切り、永久ガスを流出させた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、０．４９分で流出することが観察された。較正表を用いて、イソプレンの絶対量を定量し、１μｇ／Ｌ〜２００００μｇ／Ｌまで線形であることが分かった。この方法を用いて、検出限界は５０〜１００ｎｇ／Ｌと推定された。

【0702】

ＨＰＬＣによるエタノールの検出。ＧＣ−ＭＳでイソプレンを検出した後、バイアルを開けて、各培養物のＯＤ_６００を測定した。ＯＤ_６００の値は５．０〜５．７であり、全ての株について、増殖が４８時間のインキュベーションの間に起こったことを示している（図１６６参照）。次に、全てのサンプルにおけるエタノールの産出をＨＰＬＣで測定した（下記参照）。４つの培養物全てがエタノールを産出した。図１６８は、エタノールのピークと積分値（ｇ／Ｌ）を示しており、表２０は、ＨＰＬＣプロトコルから得た全てのデータを示している。

【0703】

有機酸ＨＰＬＣ法。この方法は、発酵プロセスからの典型的な有機酸を分離および定量するために開発された。移動相緩衝液は、０．０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４緩衝液（５ｍＭに等しい）であった。移動相緩衝液を次のように調製した。４Ｌメスシリンダーを用いて、１７．７５ｍｌの１０％Ｈ_２ＳＯ_４ストック溶液を４．０Ｌの脱イオン水に添加する。この溶液を用いて、ＨＰＬＣ緩衝液ボトルを満たす。検出器。Ｋｎａｕｅｒ Ｋ２３０１ ＲＩ検出器を用いて、カラムから出るときにピークを定量した。

【0704】

ＨＰＬＣ用の液体培地サンプルの調製。ＨＰＬＣ用に液体培地サンプルを次のように調製した。（１）液体培地をラベルしたエッペンドルフチューブ（約１．８ｍＬ）に入れた。（２）チューブを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞をペレット化した。（３）３００μＬの上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。（４）９００μＬのＨ_２Ｏを上清に添加した。低濃度の分析物を調べたい場合はサンプルをより濃く希釈することができるが、これはカラムをより汚すことになる。サンプルは、４倍より多くに希釈したものに限定されるべきである。（５）３６μＬの７０％過塩素酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２４４２５２）を添加し、チューブを数回逆さまにして、混合した。（６）チューブを氷上で５分間インキュベートして、タンパク質を沈殿させ、その後、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この時点で、上清は解析の準備ができていた。

【0705】

次に、上清をプラスチック製の円錐底のＨＰＬＣバイアルに入れた。蓋をバイアルにねじ込み、バイアルを硬い表面で叩いて、底から泡を取り除き（そうしなければ、ＨＰＬＣ注入針が空気のみを取り出すことになる）、サンプルをＨＰＬＣにかけた。このＨＰＬＣは、５０℃で稼働され、Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｈ ｒｅｆｉｌｌ ３０ｍｍ×４．６ｍｍガードカラム（カタログ＃ １２５−０１２９；Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｕｅｓ，ＣＡ）を備え、０．０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を、流速０．６ｍｌ／分、おおよその稼働圧約９５０ｐｓｉで移動相緩衝液として用い、注入容量が２０マイクロリットルであるＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム３００ｍｍ×７．８ｍｍ（カタログ＃ １２５−０１４０；Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を搭載していた。流出時間は約２６〜３６分であり、例えば、ボイドは約６分で溶出し、グルコースは８．５分で溶出し、酢酸は１４分で溶出し、エタノールは２１分で溶出した。カラムおよびガードカラムを使用しない場合は、これらは０．０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４中で保存する。

【表22】

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【0706】

実施例２８：大腸菌におけるイソプレン（ＤＸＰ経路を経由）とエタノールの同時生成
図１６９に示すように、イソプレンとエタノールの同時生成は、ＤＸＰ経路によるグルコースからのイソプレンの理論的収率を増加させる方法であるが、それは、エタノールの産出において生成されるＡＴＰが、この経路で利用されてイソプレンを産出することができるからである。このとき、最大理論質量収率（バイオマスを作るのに用いた炭素は数に入れない）は３２．３％である。ＣＰＩ（細胞生産性指数）を５と仮定すれば、質量収率は、ＤＸＰ経路のみの場合の２７％と比べて２９％となる。したがって、このプロセスを嫌気的に行なう場合、酸素移動のための資本投資は減少する。このプロセスであれば、タンクの撹拌に関して、既存のエタノール工場で行なうことができる。

【0707】

大腸菌は、嫌気的に増殖させた場合、アセチル−ＣｏＡからアセトアルデヒドを経てエタノールにする酵素ａｄｈＥを用いてエタノールを産出することができるが、ジモモナス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）を発現させることによってエタノール産出は大いに改善される。図１７０に示すように、ｐｄｃはピルビン酸を基質として用いて、Ｋｍが低く、ｐｄｃとａｄｈＥ（大腸菌）またはａｄｈＢ（ジモモナス）によるエタノールの産出には、ｐｆｌとａｄｈＥによるものよりも少ない還元当量が必要となる。ｐｄｃ発現のみであっても、大腸菌によって産出されるエタノールの量を既に有意に増加させるが、ジモモナス由来のａｄｈＢを付加すると、産出されるエタノールの量を２０倍よりも多く増加させることが分かっている（Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．１９８７）。

【0708】

ｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５中のＴｒｃプロモーターの後部へのジモモナス・モビリスピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）のクローニング。ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）を、プライマーのＳｐｅＩ−ＰＴｒｃ−ｒｂｓ−ｐｄｃＦ（５’−ｇｔｔａｃｔＡＣＴＡＧＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴａｇｇａｇｇａａａａａａａａＡＴＧＡＧＴＴＡＴＡＣＴＧＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＴＴＴＡＧ−３’；配列番号１４６）およびＰｓｔＩ−ｐｄｃＲ（５’−ｇｔｔａｇａｔＣＴＧＣＡＧｇｔｔｔａｔｔｔａａａａａｃｔａｇａｇｇａｇｃｔｔｇ−３’；配列番号１４７）を用いて、ジモモナス・モビリスＺＭ４ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ３１８２１）から増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製し、ＳｐｅＩ／ＰｓｔＩで消化し、ＳｐｅＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５（Ｋｏｖａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９４） ５：８００−８０２）と再び連結した。ＬＢ＋ゲンタマイシン（５ｐｐｍ）＋Ｘｇａｌ上で選択された白色コロニーからプラスミドを抽出し、シークエンシングで正しいことが分かった。このプラスミドクローンをｐＢＢＲ５−Ｐｔｒｃｐｄｃと名付けた（図１７１Ａは、ｐＢＢＲ５−Ｐｔｒｃｐｄｃのマップを示し、図１７１Ｂ〜Ｃは、ｐＢＢＲ５−Ｐｔｒｃｐｄｃの配列；配列番号１４８を示している）。

【0709】

ｐｄｃとＤＸＰ経路とを共発現する大腸菌株の構築
ＭＣＭ５９７株（ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＥＴ２４（ＭＥＡ）α＋ＤＸＳ＋ｙＩＤＩ）の構築。ｐＤＵ−３９の構築。プライマー配列：（１）Ａｌｂａ ＴＲＣ（ＭＥＡ）−ＮｄｅＩ−Ｆ：５’−ｇａａａｃｔｇａａａｃｃＣＡＴＡＴＧｇａａｇｃｔｃｇｔｃｇｔｔｃｔｇｃ−３’（配列番号１４９）；（２）Ａｌｂａ ＦＬＴＲＣ（−） ＴＥＲ−Ｒ：５’−ｃｃｃｇｃｇｃｔｔａＣＴＣＧＡＧｇｃｇｔｔｃａａａｃｇｇｃａｇａａｔｃｇｇｔｔｃａｇｔｇ−３’（配列番号１５０）。プライマーセットのＡｌｂａ ＴＲＣ（ＭＥＡ）−ＮｄｅＩ−Ｆ／Ａｌｂａ ＦＬＴＲＣ（−） ＴＥＲ−Ｒおよび鋳型のｐＥＴ２４ａＰ．ａｌｂａＨＧＳを用いて遺伝子を増幅することにより、切断型のウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼを作製した（例えば、実施例２３（ｉｉｉ）、配列番号４３、ならびに図１５２、１５３Ａ、および１５３Ｂを参照されたい）。ＰＣＲ反応液を次のように準備した。１μｌ（ｐＥＴ２４ａ−Ｐ．ａｌｂａ）；５μｌの１０×Ｐｆｕ ＵｌｔｒａＩＩフュージョン緩衝液；１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ；１μｌのプライマー（５０μＭ） セット＃１ フォワード；１μｌのプライマー（５０μＭ） セット＃１ リバース；４１μｌのｄｄｉＨ２Ｏ；＋１μｌのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩフュージョンＤＮＡポリメラーゼ。サイクリングパラメータは、９５℃／１分、次に、２９サイクルの９５℃／３０秒、５５℃／２０秒、７２℃／２５秒、次に、７２℃／３分。その後、冷えるまで反応液を４℃で保持した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）。

【0710】

ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、製造元の取扱説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ゲル精製した。精製産物のアリコート３μｌを、Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、それまでにＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで消化し、ゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ、Ｒｏｃｈｅ）で処理しておいたｐＥＴ−２４ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。ライゲーションを１６℃で一晩行なった。

【0711】

終夜ライゲーション混合物のアリコート５μＬをＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で、３７℃で一晩選択した。プラスミドを、製造元の取扱説明書に従ってＱｉａＱｕｉｃｋスピンキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、少数の形質転換体から単離した。挿入物をＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ消化で確認し、これらのクローンを市販のＴ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマー（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）でシークエンシングした。正しいプラスミドをｐＤｕ−３９と命名した（図１７２；配列番号１５１）。

【0712】

ＭＣＭ５９７の構築。プライマー配列：（１）ＭＣＭ２７０ ５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡ−３’（配列番号１５２）；および（２）ＭＣＭ２７１ ５’−ＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＴＴ−３’（配列番号１５３）。

【0713】

ＤＸＳ−ｙＩＤＩ遺伝子をプライマーのＭＣＭ２７０／ＭＣＭ２７１および鋳型のｐＭＣＭ７２を用いたＰＣＲで増幅した（図１７３はｐＭＣＭ７２のマップである）。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の製造元のプロトコルに従って、２つの同一のＰＣＲ反応液を準備した。３５μＬの水、１０μＬの緩衝液、１．２５μＬの各プライマー、０．５μＬのｄＮＴＰ、１μＬのポリメラーゼ。反応を以下のサイクルで行なった。９５℃／２分、次に３０サイクルの９５℃／１５秒、５５℃／１５秒、７２℃／１分４５秒、次に７２℃／３分。その後、冷えるまで反応液を４℃で保持した。

【0714】

得られたＰＣＲ断片をＢａｍＨＩとＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、次に、Ｒｏｃｈｅ迅速ライゲーションキットを用いて、同じ制限エンドヌクレアーゼで消化しておいたｐＤｕ３９に連結した。ライゲーション反応液を５μＬの緩衝液１、１μＬのベクター、３μＬの挿入物、および１μＬのリガーゼを含有する１０μＬ中に準備し、その後、室温で１時間インキュベートした。５μＬのアリコートを大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で、３７℃で一晩選択した。プラスミドを少数の形質転換体から精製し、挿入物の存在について、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）：１７．５μＬの水、５μＬの緩衝液、０．６２５μＬの各プライマー、０．２５μＬのｄＮＴＰ、０．５μＬのポリメラーゼを用いたＰＣＲでスクリーニングした。反応を次のようなサイクルで行なった。９５℃／２分、次に３０サイクルの９５℃／１５秒、５２℃／１５秒、７２℃／４５秒、その後、７２℃／３分保持する。その後、冷えるまで反応液を４℃で保持した。ほぼ１．５ｋｂｐの長さのＰＣＲ産物を含むクローンをシークエンシングした（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＣＡ）。正しいプラスミドをｐＭＣＭ５９６と命名した（図１７４Ａは、ｐＭＣＭ５９６のマップであり；図１７４Ｂ〜Ｄは、ｐＭＣＭ５９６の配列（配列番号 １５４）である）。次に、このプラスミドをエレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上で選択した。１つのコロニーを選択し、ＭＣＭ５９７と命名した。

【0715】

ＭＣＭ５９７（ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＥＴ２４（ＭＥＡ）ａｌｂａ＋ＤＸＳ＋ｙＩＤＩ）をｐＢＢＲ５−Ｐｔｒｃｐｄｃおよび対照としてのｐＢＢＲ１−ＭＣＳ５で形質転換した。コロニーをＬＢ＋カナマイシン５０ｐｐｍ、クロラムフェニコール（３５ｐｐｍ）、ゲンタマイシン（５ｐｐｍ）上で選択した。各々１つのコロニーを選択し、それぞれ、ＣＭＰ１８２株およびＣＭＰ１８３株と命名した。

【0716】

大腸菌におけるイソプレンとエタノールの同時生成。ＣＭＰ１８２株およびＣＭＰ１８３株の各々１つのコロニーを１％グルコースおよび１％酵母抽出物、および適当な抗生物質を含むＴＭ３培地中、３０℃、１７０ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌朝、培養物を０．５％グルコース、および０．１１％または１％酵母抽出物を含有する２０ｍＬの同じ培地中でＯＤ＝１になるまで希釈し、３０℃、１７０ｒｐｍでインキュベートした。１％酵母抽出物のフラスコを２つ１組で用意した。２つとも非常によく似ていたので、１組のフラスコのみからの結果を示した。２時間後、２００μＭのＩＰＴＧを添加し、撹拌を４０ｒｐｍまで低下させた。誘導して２時間後と５時間後にサンプルを採取し、ＯＤ、有機酸（ＨＰＬＣ（イオン排除カラム Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ、３００ｍｍ×７．８ｍｍ）による）およびイソプレンの比生産性について分析した。イソプレン濃度を本明細書に記載のＧＣ／ＭＳによって発生ガス中で測定した各株の比生産性をμｇ／Ｌ／ＯＤ／時間として報告している。３０分のインキュベーションの間のアッセイバイアル中のヘッドスペース１９００μｌ：液体培地１００μｌという比率から、次のようにイソプレンμｇ／培養物のＬを比生産性に変換されるに留意されたい（ＧＣ−ＭＳで測定されたイソプレン／Ｌ）×（３８）／（培養物のＯＤ ６００ｎｍ）。１％の酵母抽出物の場合、誘導して５時間にグルコースが枯渇した。

【0717】

図１７５は、ｐｄｃの発現によって増殖が影響を受けなかったことを示す。１％酵母抽出物を含有する培養物はより高いＯＤにまで増殖した。

【0718】

図１７６は、（Ａ）０．１％の酵母抽出物を含有するフラスコ（誘導５時間後）および（Ｂ）０．１％の酵母抽出物を含有するフラスコ（誘導２時間後）におけるエタノール濃度およびイソプレン比生産性（任意単位で示す）を示す。これらの株がイソプレンとエタノールの両方に炭素を向けていることを理解することができる。ｐｄｃの機能から予測されるように、ｐｄｃを有する株ではより多くのエタノールが産出される。より多くの炭素流がエタノールに回るので、イソプレンの比生産性は、ｐｄｃを有する株ではより低いが、それでも大きく、ｄｘｓ（ピルビン酸とグリセルアルデヒドを基質として用いる）がｐｄｃから炭素流を取ることができることを示す。

【0719】

図１７７は、１％酵母抽出物フラスコにおける５時間誘導した後の発酵産物を示す。ｐｄｃを発現する株はより高いエタノール濃度を示しており、ｐｄｃが発現され、またｐｄｃに活性があったという事実が確認されている。ｌｄｈＡとｐｄｃのＫ_ｍの比較から予測されるように、ひとたびｐｄｃが発現されると、乳酸へのピルビン酸流は遮断される。また、ｐｄｃを発現する株では、より多くの炭素が、アセチル−ＣｏＡよりもアセトアルデヒドに回り、酢酸が減少する。

【0720】

実施例２９：ジモモナス・モビリスにおけるイソプレンとエタノールの同時生成
ジモモナス・モビリスでイソプレンを発現させるためのプラスミドの構築。ジモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。これを、振盪させながら、ＲＭ培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ／ＬをｐＨ６．０に調整したもの）を含有する１０ｍｌチューブ中、３０℃でごく普通に増殖させた。ジモモナス・モビリスは、エタノールを産出するその能力でよく知られている。Ｊ．Ｓｗｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．４１：１−４６。

【0721】

ウラジロハコヤナギ由来の切断型のイソプレンシンターゼをコードする遺伝子の前にＺ．モビリスのｐｄｃプロモーターを含有するＰＣＲ産物を、ｐｄｃプロモーターを増幅するためのプライマーＸｂａＩ−ＰｐｄｃＦ（５’−ｃｔａａａｃＴＣＴＡＧＡＧＣ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＴＧ−３’；配列番号１５５）およびプライマーＦｕｓＰｐｄｃ−ＨＧＳＲ（５’−ｇｃａｇａａｃｇａｃｇａｇｃｔｔｃｇｇｔｃａｔｔｇｃｔｔａｃｔｃｃａｔａｔａｔｔｃａａａａｃａｃｔａｔｇ−３’；配列番号１５６）と、イソプレンシンターゼ遺伝子を増幅するためのプライマーＰｓｔＩ−ＭＴＥＡＲＲａｌｂａｈｐＲ（５’−ｃｔａｃｇａＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣ−３’；配列番号１５７）およびＦｕｓＰｐｄｃ−ＨＧＳＦ（５’−ｃａｔａｇｔｇｔｔｔｔｇａａｔａｔａｔｇｇａｇｔａａｇｃａＡｔｇａｃｃｇａａｇｃｔｃｇｔｃｇｔｔｃｔｇｃ−３’；配列番号１５８）とを用いたＰＣＲ ＳＯＥｉｎｇ（ポリメラーゼ連鎖反応−重複伸長によるスプライシング）で生成させ、工程１で得られた２つの産物の混合物に対して、プライマーのＸｂａＩ−ＰｐｄｃＦ（配列番号１５５）およびＰｓｔＩ−ＭＴＥＡＲＲａｌｂａｈｐＲ（配列番号１５７）を用いたＰＣＲ反応を行なった。ｐｄｃプロモーターの鋳型はＺ．モビリスＺＭ４のゲノムＤＮＡであり、切断型イソプレンシンターゼはプラスミドｐＤＵ４７から増幅した（ｐＤＵ４７のマップを図１７８に示し、プラスミドｐＤＵ４７の配列（配列番号１５９）を図１７９に示す）。その遺伝子のコドンの偏りは大腸菌用に最適化されている。

【0722】

得られたＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＰｓｔＩで消化し、ＸｂａＩ／ＰｓｔＩで消化したｐＢＢＲ１−ＭＣＳと再び連結した（Ｋｏｖａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１９９４） ５：８００−８０２）。ｐＢＢＲ１−ＭＣＳは、ジモモナスで安定に複製することが示されている宿主範囲の広いプラスミドである（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５） ２４４：８５−９２）。得られたプラスミドをｐＢＢＲ−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１と名付けた（プラスミドｐＢＢＲ−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１のマップを図１８０に示し、プラスミドｐＢＢＲ−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１の配列（配列番号１６０）を図１８１に示す）。

【0723】

Ｚ．モビリスＺＭ４のｐＢＢＲ１−ＭＣＳまたはｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１による形質転換。Ｃｏｎｗａｙら（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８７） ５３：２３５−２４１）による（大腸菌Ｓ１７−１を介する）二親接合（ｂｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）、またはＪｅｏｎら（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００５） ２４４：８５−９２）によるエレクトロポレーションによって、プラスミドのｐＢＢＲ１−ＭＣＳおよびｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１をＺ．モビリスＺＭ４に形質転換した。形質転換体は、エレクトロポレーション後にＲＭ＋クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌ上で選択され、嫌気性条件において３０℃で４８時間後に出現した。接合体培養をＲＭ上で一晩行った後、ＹＰＧ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、グルコース７０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０）＋４０μｇ／ｍｌナリジクス酸＋クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌ上に再ストリークした。

【0724】

両方の方法により、ＲＭ＋クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌまたはＹＰＧ＋４０μｇ／ｍｌナリジクス酸＋クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌ上にたくさんのコロニーが生じた。Ｑｉａｇｅｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてジモモナス細胞からプラスミドを抽出し、ゲル電気泳動により存在することが示された。

【0725】

Ｚ．モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１によるイソプレンの産出およびイソプレンとエタノールの同時生成。ジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳおよびジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１のコロニーを１つずつ、密封された２０ｍｌヘッドスペースバイアル中の１０ｍｌＲＭ＋クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌに植菌し、３０で一晩インキュベートした。１６時間後、バイアルを取り出し、ヘッドスペース中のイソプレン濃度と、ＯＤと、有機酸またはアルコールとについて分析した。その同じバイアル中のイソプレン産出を以下のようなヘッドスペースアッセイを用いて測定した。ヘッドスペースモードで操作するＣＴＣ Ａｎａｌｙｓｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ） ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーを接続したＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣ／ＭＳシステムを用いて分析を行なった。分析物の分離にはＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ；０．２５μｍ膜厚）を用いた。５００μＬのヘッドスペースガスを注入するようにサンプラーを設定した。ＧＣ／ＭＳ法では、キャリアガスとして１ｍｌ／分の流速でヘリウムを用いた。注入口を２５０℃に保ち、分割比を５０：１とした。２分間の分析の間、オーブン温度を３７℃に保った。ｍ／ｚ ６７での単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードでＡｇｉｌｅｎｔ ５７９３Ｎ質量選択検出器を操作した。１．４分から１．７分まで検出器を切り、永久ガスを流出させた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、１．７８分で溶出することが観察された。較正表を用いて、イソプレンの絶対量を定量し、１μｇ／Ｌ〜２００μｇ／Ｌまで線形であることが分かった。この方法を用いて、検出限界は５０〜１００ｎｇ／Ｌと推定された。

【0726】

ＨＰＬＣ（イオン排除カラム Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ、３００ｍｍ×７．８ｍｍ、移動相としての０．００５Ｍ Ｈ２ＳＯ４、０．６ｍＬ／分）により、有機酸およびアルコールを分析した。ｐＢＢＲ１−ＭＣＳで形質転換したジモモナス・モビリスＺＭ４の細胞は、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１で形質転換したジモモナス・モビリスＺＭ４の細胞よりも速く増殖した（データは示さない）。培養の最後に、細胞を回収し、フレンチプレスに２回通して溶解させ、精製ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼに対するモノクローナル抗体でプロービングして抽出物をウェスタンブロットで解析した。タンパク質は、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１で形質転換したジモモナス・モビリスＺＭ４の細胞で検出されたが、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳで形質転換したジモモナス・モビリスＺＭ４の細胞では検出されなかった。

【0727】

図１８２は、ＯＤで割った検出されたイソプレンの量を示す。ＯＤ_６００は、ジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳおよびジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１について、それぞれ、１．９ および２．１であった（有意差はなかった）。ジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１は、ジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳよりも１６倍大きいイソプレン／ＯＤを生じさせた。表２１は、ジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳと比べたジモモナス・モビリス ＺＭ４、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１の相対ＯＤおよび相対エタノール産出を示す。乳酸はこれらの培養物中で検出されず、酢酸レベルは０．１ｇ／Ｌ未満であった。エタノール（９ｇ／Ｌを上回る）は、ジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳとジモモナス・モビリスＺＭ４、ｐＢＢＲ１−Ｐｐｄｃ−ＨＧＳ１の両方で、同じ濃度で産出された。

【表23】

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【0728】

種菌が増殖中の培養物からなる場合、同じ設定でＯＤ当たりのイソプレンの量の増加が得られることが分かった（データは示さない）。

【0729】

実施例３０：イソプレンと１，３−プロパンジオールの同時生成
他の２炭素（Ｃ２）および三炭素（Ｃ３）アルコールおよびジオール、例えば、１，２−プロパンジオールまたは１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤＯ）は、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母、ならびにエシェリキア属の種（例えば、大腸菌）およびジモモナス属の種（例えば、Ｚ．モビリス）などの細菌をはじめとする種々の生物において、イソプレンとともに同時生成される。イソプレンと１，３−ＰＤＯの収率は、以下の方程式から推定される。

【数14】

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【0730】

６というＣＰＩ（細胞生産性指数）では、糖でのイソプレン収率＝１３％；糖でのＰＤＯ収率＝３０％である。

【0731】

イソプレン産出（ＭＶＡ経路を経由）および１，３−プロパンジオール産出の経路を発現する大腸菌株ＣＭＰ２５０の構築。ｐＤＷ１５の構築。プラスミドｐＢＢｒ１−ＭＣＳ５（Ｋｏｖａｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １６６：１７５−１７６，１９９５）をＸｈｏＩ／ＸｂａＩ で消化し、ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙから増幅したＰｔｒｃ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ片と再び連結した（図２６および２７Ａ〜２７Ｄ；配列番号１２）。得られたプラスミドをｐＤＷ１５と名付けた（配列番号１６１；プラスミドマップについては図１８３Ａを、プラスミド配列については図１８３Ｂ〜Ｄを参照）。プラスミドｐＤＷ１５は、エンテロバクター・フェカーリス由来の上流メバロン酸経路ポリペプチドｍｖａＥおよびｍｖａＳを発現した。

【0732】

大腸菌株ＣＭＰ２５０の構築。ＥＷＬ２０４株にｐＥＷＬ２４４およびｐＤＷ１５をエレクトロポレートした（プロトコルは実施例２３に記載されている）（ＥＷＬ２０４株およびプラスミドｐＥＷＬ２４４の構築に関する情報ならびにエレクトロポレーションプロトコルについては実施例２３を参照されたい）。形質転換体をＬＢ＋カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）＋ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）上で選択した。次に、得られた株にプラスミドｐＳＹＣＯ１０９をエレクトロポレートした（米国特許第７，３７１，５５８を参照されたく、これは、特に、ｐＳＹＣＯ１０９を含むｐＳＹＣＯ１０１（以下参照）と命名されたプラスミドの構築に関して、参照により本明細書に組み込まれる）（配列番号１６２；プラスミドマップについては図１８４Ａを、配列については図１８４Ｂ〜Ｆを参照されたい）。プラスミドｐＳＹＣＯ１０９は、（１）ＤＡＲ１（ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ）およびＧＰＰ２（グリセロール−リン酸ホスファターゼ）（両遺伝子ともグリセロール経路に由来する）と、（２）ｄｈａＢ１〜３、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、およびｏｒｆＹ（全遺伝子が１，３−プロパンジオール経路に由来する）とをコードする。プラスミドｐＳＹＣＯ１０９には、大腸菌トレオニンオペレーターアテニュエーター（Ｔｈｒ ａｔｔｅｎ）、大腸菌ＴｏｎＢターミネーター（ＴｏｎＢ ｔｅｒｍ）、ｔｒｃプロモーター（ｔｒｃ）、およびアスパラギン酸アンモニアリアーゼ遺伝子ターミネーター（ＡｓｐＡ ｔｅｒｍ）も含まれる。形質転換体をＬＢ＋カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）＋ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）＋スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ上で選択した。得られた株をＣＭＰ２５０と命名した。

【0733】

あるいは、大腸菌ＭＧ１６５５固有のｐｇｌプロモーター、大腸菌ＭＧ１６５５ 固有のｐｇｌ遺伝子（ｙｂｈＥ、ＢＬ２１には存在しない）、およびＦＲＴ−クロラムフェニコール−ＦＲＴカセット（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をこの順に含有するカセットをＲｅｄ／ＥＴ組換えによりＥＷＬ２０４の染色体中で組み換えた（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。選ばれた組込み部位は、ｙｂｈＪとｙｂｈＣの間であった。このマーカーを７０６−Ｆｌｐ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてループアウトさせ、このように生成された株をＣＭＰ２５１と名付けた。ＣＭＰ２５１株にプラスミドｐＥＷＬ２４４、ｐＤＷ１５およびｐＳＹＣＯ１０９をこの段落に記載した順にエレクトロポレートして、ＣＭＰ２５２株を作製した。

【0734】

さらなる株が、（１）ｇｌｐＫ遺伝子およびｇｌｄＡ遺伝子が欠失している株、（２）ｔｐｉＡ遺伝子が欠失している株、または（３）ｐｔｓＨＩｃｒｒが欠失している株であって、ｇａｌＰ遺伝子およびｇｌｋ遺伝子が構成的に発現されている株をはじめとする、Ｃ２−またはＣ３−アルコールまたはジオール（例えば、１，３−プロパンジオール）の産出に関連する代謝経路と関連する種々の遺伝子の欠失により構築される（例えば、“Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｕｔａｎｔｓ Ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ”というタイトルの米国特許公開第２００９／０１４２８４３−Ａ１号を参照されたく、これは、特に、様々な細菌株の構築に関して、参照により本明細書に組み込まれる）。他の株が、例えば、ｅｄｄ、ｎｄｈ、ａｒｃＡ、ｍｇｓＡ、ｑｏｒ、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡの欠失、またはｇａｐＡの下方調節もしくはｐｐｃの上方調節をもたらす変異をはじめとする１以上の有用な突然変異を含めて構築される。これらのおよびその他の欠失は、目的の欠失を有するＫｅｉｏ突然変異体からのライセートの作製（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８（２００６年２月にオンライン公表された）および例えば、ＣＭＰ２５０またはＣＭＰ２５２などの所望の細菌株への目的の変異の形質導入などの、一般的に用いられる方法により構築される。

【0735】

イソプレンと１，３−プロパンジオールの同時生成。ＣＭＰ２５０株、ＣＭＰ２５２株、またはＣＭＰ２５０株およびＣＭＰ２５２株に由来するが、上記の他の変異のうちの１つ以上を組み込んだ他の株をＨＭ１培地中で嫌気的に増殖させ、ＭＶＡ経路ポリペプチドおよび／または本明細書中の別の場所に記載したような他の異種ポリペプチドを組み込んだ様々なプラスミドの発現を誘導する。発生ガス中のイソプレン濃度を本明細書中の別の場所に記載したようなＧＣ／ＭＳで測定し、発酵液体培地中の１，３−プロパンジオール濃度を本明細書中の別の場所に記載したようなＨＰＬＣか、または当業者に公知の他の好適な方法で測定する。様々な細菌株が、約１３：３０というモル比で産出される、イソプレンと１，３−プロパンジオールの両方の生産性が高いことが示される。

【0736】

実施例３１：イソプレンと１，３−プロパンジオールを同時生成させるための大腸菌株ＣＭＰ２４９の構築
次の方程式に基づくイソプレンと１，３−ＰＤＯの同時生成の収率計算：

【数15】

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【0737】

６という細胞生産性指数（ＣＰＩ）では、糖でのイソプレン収率＝１３％、最大１４．８％；糖での１，３−プロパンジオール収率＝３０％、最大３３％。ピーク酸素取込み（ＯＵＲ）約１７は、３ｇ／Ｌ／時間である。

【0738】

同時生成株ＣＭＰ２４９（ＢＬ２１ ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩｇｌｄＡｇｌｐＫ：：Ｋａｎ ｔｐｇｌ、ｐＤＷ１５、ｐＥＷＬ２４４、ｐＳＹＣＯ１０９）の構築。プラスミドｐＥＷＬ２４４、ｐＳＹＣＯ１０９およびｐＤＷ１５。プラスミドｐＳＹＣＯ１０９（配列番号１６２；プラスミドマップについては図１８４Ａ、配列については図１８４Ｂ〜Ｆ）は、ジヒドロキシアセトン−リン酸をグリセロールを介して１，３−プロパンジオールに変換するために必要な経路遺伝子の全てを含有しており、これは、米国特許第７，３７１，５５８号に記載されている。ｐＳＹＣＯ１０９Ｆ１．１（配列番号１６３；プラスミドマップについては図１８５Ａを、プラスミド配列については図１８５Ｂ〜Ｆを参照されたい）は、アミノ酸変化を有するグリセロールデヒドラターゼ酵素の２つのサブユニットの融合体を含有している。プラスミドＥＷＬ２４４（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）は、本明細書中、実施例２３に記載されたように構築される、ｔｒｃプロモーターから転写されるウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼおよびメタノサルキナ・マゼイメバロン酸キナーゼ（ｍＭＶＫ）をコードする遺伝子を含有している（配列番号４５；プラスミドＥＷＬ２４４のマップについては図１５８を、プラスミド配列については図１５９Ａ〜Ｂを参照されたい）。

【0739】

ｐＤＷ１５（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５上のＰｔｒｃ−上流ＭＶＡ経路）の構築。上流ＭＶＡ経路をｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５ベクターに挿入するために、ｐＴｒｃ、ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、およびｒｒｎターミネーターを含有する発現カセット全体を、プライマーのＵｐｐｅｒ５’ＸｈｏＩ（配列番号１６４）およびＵｐｐｅｒ３’ＸｂａＩ（配列番号１６５）を用いて、プラスミドＭＣＭ８２（本明細書中、実施例２３に記載）からＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応液は、１μｌのＭＣＭ８２（約３０ｎｇ）、１０μｌの５×Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、０．５μｌのｄＮＴＰ（１００ｍＭ）、１μｌのＵｐｐｅｒ５’ＸｈｏＩ（配列番号１６４）（２０μＭ）、１μｌのＵｐｐｅｒ３’ＸｂａＩ（配列番号１６５）（２０μＭ）、３５．５μｌのｄｉＨ_２Ｏ、および１μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含んでいた。反応を次のようなサイクルで行なった。９５℃／４分；５サイクルの９５℃／２０分、５２℃／２０秒、７２℃／４分；２５サイクルの９５℃／２０分、５５℃／２０秒、７２℃／４分；７２℃／１０分、その後、４℃に冷却。

【0740】

約４．２ｋｂのＰＣＲ産物のサイズをゲル電気泳動（Ｅ−Ｇｅｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で確認した後、製造元の推奨するプロトコルに従ってＱｉａＱｕｉｃｋ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて精製した。次に、精製ＰＣＲ産物およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５ベクターを、３７℃で一晩、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼとＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した。消化は次のように行なった。６μｌのｄｉＨ_２Ｏ、２μｌの１０×緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ）、１０μｌのＤＮＡ（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５またはＰＣＲ挿入物）、１μｌのＸｈｏＩ（Ｒｏｃｈｅ）、および１μｌのＸｂａＩ（Ｒｏｃｈｅ）を３７℃で一晩インキュベートした。次に、制限酵素をライゲーション前に６５℃で２０分間熱不活化した。

【0741】

次のようにライゲーション反応を４℃で一晩行なった。２μｌのｄｉＨ２０、１μｌの１０×リガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、２μｌのベクター（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５）、および４μｌの挿入物（上流のＭＶＡ発現カセット）。次に、反応混合物を微量透析した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。約５μｌのライゲーション反応液を製造元の推奨するプロトコルに従って化学的コンピテント大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、ＬＢ中３７℃で１時間回復させた後、Ｘ−ｇａｌと１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するＬＢプレート上にプレーティングした。β−ガラクトシダーゼ活性を示さないコロニーを、プライマーのＭ１３リバースおよびＭＣＭ１６３を用いたＰＣＲでさらに解析して、挿入物の存在を確認するために選択した。これらのコロニーのうちの１つから得たプラスミドを精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、完全にシークエンシングして（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、プライマー配列については表１参照）、それが正しい向きで完全な上流ＭＶＡ経路発現カセットを含有することを確認した。図１８３Ａは、エンテロバクター・フェカーリス由来の上流ＭＶＡ経路ポリペプチドｍｖａＥおよびｍｖａＳを発現するプラスミドｐＤＷ１５（配列番号１６１）のマップを示している。図１８３Ｂ〜ＤはｐＤＷ１５の配列を示す。

【表24】

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【0742】

ＭＣＭ５１８−５２１株および５２８−５３１株の構築：組み込まれたｍＫＫＤｙＩを促進するＬａｍｂｄプロモーター。プライマーのＭＣＭ１２０およびＭＣＭ２２４を用い、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎキットを用いて、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴ鋳型由来の耐性カセットを増幅した。４つの５０μＬのＰＣＲ反応液を次のようなサイクルにかけた。９５℃／２分；３０サイクルの９５℃／２０秒、５５℃／２０秒、７２℃／１分；７２℃／３分；および４℃に冷却。４つの反応液をプールし、製造元のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ ＰＣＲカラムで精製し、５５℃の６０μＬ溶出緩衝液で溶出させた。

【0743】

プラスミドｐＲｅｄＥＴ−ｃａｒｂ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を、本明細書中の別の場所に記載したような、ＭＣＭ４４６（大腸菌ＢＬ２１ｃｍＲ−ｇｉ１．６ｍＫＫＤｙＩ Ａ１−３（Ａ）、国際公開ＷＯ２００９／０７６６７６ Ａ２号（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通りに構築された）にエレクトロポレートした。ＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３０℃で１時間振盪させることによって形質転換体を回復させた後、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天プレート上で３０℃で一晩選択した。カルベニシリン耐性コロニーをＭＣＭ５０８として凍結させた。

【0744】

ＭＣＭ５０８株を、ＯＤ_６００が約０．５になるまで、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する５ｍＬのＬ液体培地中の新鮮なストリークから３０℃で増殖させた。４０ｍＭのＬ−アラビノースを添加し、培養物を３７℃で１．５時間インキュベートした。細胞を回収し、３μＬの精製アンプリコンを先程のようにエレクトロポレートし、次に、５００μＬのＳＯＣ中、３７℃で１．５〜３時間回復させた。形質転換体を１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上で３７℃で選択した。

【0745】

標的遺伝子座でのアンプリコンの組換えを、プライマーのＧＢ−ＤＷ（配列番号１７７）およびＭＣＭ２０８（配列番号１７５）を用いたＰＣＲで確認した。得られたアンプリコンをシークエンシングして、下記の配列を含む４つのクローンを同定した。カルベニシリン感受性クローンをＭＣＭ５１８〜５２１株として凍結させた。

【0746】

ＭＣＭ５１８〜５２１を、１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬ寒天上に再びストリークし、３７℃で一晩増殖させた。

【0747】

ＭＣＭ５１８〜５２１株をカナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ液体培地中、３７℃培養した後、プラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションで形質転換した。細胞を３０℃で１時間振盪させながら５００μＬのＳＯＣ中で回復させた。形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天プレート上で３０℃で一晩選択した。翌朝、各々の形質転換からのコロニーを、濁りが明白になるまで、液体ＬＢ／カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）中、３０℃で増殖させた。その後、培養物を少なくとも３時間３７℃に移した。細胞をこの培養物からＬ寒天プレートにストリークし、３７℃で一晩増殖させた。

【0748】

次の日、Ｌ寒天、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天、およびカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にコロニーを付けた。カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）上でもカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）上でも増殖しなかったクローンをＬ寒天上の斑点から液体ＬＢ中で培養し、ＭＣＭ５２８〜５３１として凍結させた。

【表25】

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【表26】

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【0749】

これらのアセンブリには、ＭＣＭ５１８〜５２１株の染色体上に挿入された新しいプロモーター、およびｍＭＶＫ ＯＲＦの最初が含まれる。これらのアセンブリの上流は、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴカセット由来の配列である。下流は、ｍＭＶＫ ＯＲＦの残りの部分、さらにＭＣＭ５０８株由来の下流ＭＶＡ経路インテグロンの残部である。

ＭＣＭ５１８：ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ（配列番号１７８）。

ＭＣＭ５１９：ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｃｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ（配列番号１７９）。

ＭＣＭ５２０：ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｃｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ（配列番号１８０）。

ＭＣＭ５２１：ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｇｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ（配列番号１８１）。

【0750】

ＭＣＭ５３１におけるｇｌｐＫおよびｇｌｄＡの欠失。Ｐ１ライセートをＫｅｉｏコレクション（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．２００６）由来のＪＷ３８９７株（ｇｌｐＫ：：Ｋａｎ）またはＪＷ５５５６株（ｇｌｄＡ：：Ｋａｎ）から作製した。ｇｌｄＡ：Ｋａｎ Ｐ１ライセートを用いてＭＣＭ５３１に形質導入し、形質導入体をカナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上で選択した。３個のコロニーをプライマーのＣＭＰ５（配列番号１８４）およびＣＭＰ６（配列番号１８５）を用いたＰＣＲでスクリーニングして、ｇｌｄＡの欠失を確認した。１つの正しいコロニーを選択し、ＣＭＰ２１２（ＭＣＭ５３１ｇｌｄＡ：：Ｋａｎ）と命名した。ＣＭＰ２１２にｐＣＰ２０を形質転換し、形質転換体をＬＢ＋カルベニシリン５０μｇ／Ｌ上で３０℃で選択し、２つの形質転換体を４２℃で一晩ＬＢ上にストリークし、それからカナマイシンおよびカルベニシリンに感受性のあるクローンを選択することにより、Ｋａｎ抗生物質耐性マーカーをループアウトさせた。得られた株をＣＭＰ２１９（ＭＣＭ５３１ ｇｌｄＡ ＭＬ）と命名した。ｇｌｐＫ：Ｋａｎ Ｐ１ライセートを用いて、ＣＭＰ２１９株に形質導入し、形質導入体をカナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上で選択した。３つのコロニーをプライマーのＣＭＰ１（配列番号１８２）およびＣＭＰ３（配列番号１８３）を用いたＰＣＲでスクリーニングして、ｇｌｐＫの欠失を確認した。１つの正しいコロニーを選択し、ＣＭＰ２２９（ＣＭＰ２１９ ｇｌｐＫ：：Ｋａｎ）と命名した。

【表27】

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【0751】

ＣＭＰ２３９の構築。大腸菌株ＣＭＰ２３９は、イソプレンを産出するための経路と１，３−プロパンジオールを産出するための経路を有する大腸菌ＢＬ２１に由来する。（上記のように構築された）ＣＭＰ２２９株にｐＥＷＬ２４４（配列番号４５および図１５８〜１５９）とｐＤＷ１５（配列番号１６１および図１８３）とをエレクトロポレートした。形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）とゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）とを含有するＬ寒天上で選択した。得られた株にプラスミドｐＳＹＣＯ１０９Ｆ１．１（配列番号１６３および図１８５；また、米国特許公開第２００８／０２９３１１９ Ａ１号も参照されたく、これは、特に、プラスミドｐＳＹＣＯ１０９Ｆ１．１に関する開示に関して、参照により本明細書に組み込まれる）をエレクトロポレートし、形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）およびスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上で選択した。このように生成された株をＣＭＰ２３９と名付けた。

【0752】

ＣＭＰ２２９におけるｐｇｌの回復。この実施例では、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡを含有するＰ１ファージを形質導入したＢＬ２１に由来し、ＭＧ１６５５には存在するが、ＢＬ２１およびＢＬ２１（ＤＥ３）には存在しない１７，２５７ｂｐ片の組換えについて選択された大腸菌株が記載されている。

【0753】

Ｐ１ライセートを大腸菌株ＭＧ１６５５から作製した。ライセートを用いてＣＭＰ２２９株に感染させた。０．５％（ｗ／ｖ）のガラクトース（ガラクトース利用オペロンはｐｇｌ遺伝子に隣接している）を補充したＭ９培地上に細胞をプレーティングすることにより、形質導入体を選択した。各１リットルのＭ９培地は、２００ｍｌのＭ９塩、２ｍｌの滅菌１Ｍ ＭｇＳＯ_４、および１００μｌの滅菌１Ｍ ＣａＣｌ_２を含有する。容量を蒸留Ｈ_２Ｏで１０００ｍｌに調整し、この溶液を濾過滅菌する。各１リットルのＭ９塩は、６４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、１５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２．５ｇのＮａＣｌ、および５．０ｇのＮＨ_４Ｃｌを含有する。この溶液を塩が溶解するまで撹拌する。その後、容量を蒸留Ｈ_２Ｏで１０００ｍｌに調整し、この溶液を濾過滅菌する。Ｍ９＋ガラクトースで増殖するコロニーにおける１７，２５７ｂｐ断片の組込みを、プロトコルを用いて、図１８６に示すようにｇａｌＭ遺伝子にアニーリングするｇａｌＭＦプライマー（５’−ＧＡＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＧ；配列番号１８６）およびｇａｌＭＲプライマー（５’−Ｇｔｃａｇｇｃｔｇｇａａｔａｃｔｃｔｔｃｇ；配列番号１８７）を用いたＰＣＲで確認した。１つのコロニーを３０μＬのＨ２Ｏ中で撹拌し、９５℃に５分間加熱した。得られた溶液をスピンダウンし、２μＬの上清を以下のＰＣＲ反応における鋳型として用いた。２μｌのＨ２Ｏ中のコロニー、５μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）緩衝液、１μｌの１００ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの１０μＭフォワードプライマー、１μｌの１０μＭリバースプライマー、３９．５μＬのＨ２Ｏ＋０．５μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製）。反応液を次のようなサイクルにかけた。９５℃／２分；３０サイクルの９５℃／３０秒、５２℃（プライマーの下方のＴ^ｍよりも３℃低い）／３０秒、７２℃／６０秒（約６０秒／ｋｂｐ）；７２℃／７分；その後、４℃に冷却（ＰＣＲＥｘｐｒｅｓｓ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ｆｒｏｍ ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ）。鋳型が、大腸菌株ＭＧ１６５５から得られる１７，２５７ｂｐ断片を欠くＢＬ２１の染色体ＤＮＡである場合、これらのプライマーを用いたＰＣＲでは産物が生じない（図１８６参照）。

【0754】

ＤＮＡ分子量Ｘ（Ｒｏｃｈｅ）をラダーとして用いて、得られたＰＣＲ断片のサイズを０．８％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で決定した。正しいコロニーを選択し、ＣＭＰ２４１（ＢＬ２１ ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ（ＭＣＭ５３１） ｔ ｇｌｄＡＭＬ ｔ ｇｌｐＫ：：Ｋａｎ ｔ ｐｇｌ＋４）と命名した。

【0755】

大腸菌株ＣＭＰ２４９の構築。この実験では、イソプレンを産出するための経路と１，３−プロパンジオールを産出するための経路とを有するＢＬ２１に由来する株の構築が記載されている。この株はまた、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５株には存在するが、ＢＬ２１およびＢＬ２１（ＤＥ３）には存在しない１７，２５７ｂｐ片を含有する。（上記のように構築された）ＣＭＰ２４１株にｐＥＷＬ２４４（配列番号４５および図１５８〜１５９）とｐＤＷ１５（配列番号１６１および図１８３）とをエレクトロポレートした。形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）とゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）とを含有するＬ寒天上で選択した。得られた株にプラスミドｐＳＹＣＯ１０９Ｆ１．１をエレクトロポレートし、形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）およびスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上で選択した。このように生成された株をＣＭＰ２４９と名付けた。

【0756】

大腸菌株ＣＭＰ２４９によるイソプレンと１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤＯ）の同時生成。ＣＭＰ２４９をイソプレンと１，３−ＰＤＯの両方の産出について振盪フラスコ中で試験した。

【0757】

培養条件。振盪フラスコ実験を、２％グルコース、２００μＭ ＩＰＴＧおよび合計１ｇ／Ｌに達する余分の酵母抽出物を含有する、２５ｍＬのＴＭ３培地（１リットル当たり：ｐＨ６．８に調整し、Ｈ_２０で最終容量にし、濾過滅菌した、１３．６ｇ Ｋ_２ＰＯ_４、１３．６ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．０ｇ ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、２．０ｇ クエン酸一水和物、０．３ｇ クエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２ｇ酵母抽出物、１．０ｍｌ １０００×改変微量金属溶液）を含有する２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で行なった。振盪フラスコをビタミンＢ１２ありおよびビタミンＢ１２なしで操作した。各１リットルの１０００×改変微量金属溶液は、クエン酸^＊Ｈ_２Ｏ（４．０ｇ／Ｌ）ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ（３．０ｇ／Ｌ）ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）ＣＯＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ（０．１０ｇ／Ｌ）ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）Ｈ_３ＢＯ_３（０．０１０ｇ／Ｌ）、およびＮａ_２ＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ（０．０１０ｇ／Ｌ）を含有する。培養物を２５０ｒｐｍで振盪させながら、Ｉｎｆｏｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎシェーカー中、３０℃で増殖させた。ｐＳＹＣＯ１０９からのグリセロールの産出をＩＰＴＧ誘導性Ｔｒｃプロモーター（ｌａｃＩ遺伝子産物の存在下で誘導される）で促進する一方、１，３−ＰＤＯの産出をビタミンＢ１２を（５〜１２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で）添加して誘導した。イソプレンの産出をＩＰＴＧを（例えば、２００μＭで）添加して誘導した。培養物を増殖させた後、６００ｎＭの波長の光学密度（ＯＤ）をモニタリングした。

【0758】

グリセロールと１，３−ＰＤＯの検出。使用される方法は、米国特許公開第２００８／０１７６３０２ Ａ１号（これは、特に、ＨＰＬＣによって１，３−ＰＤＯの産出の検出する方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。簡潔に述べると、グルコースの１，３−プロパンジオールへの変換をＨＰＬＣでモニタリングした。標準的なクロマトグラフィーを用いて分析を行なった。１つの好適な方法では、Ｒ１検出を用いるＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステムが利用された。温度が５０℃に制御され、５ｍＭのＨ_２ＳＯ_４を０．４ｍＬ／分の流速で移動相として用いたＣａｔｉｏｎ Ｈ Ｒｅｆｉｌｌカートリッジプレカラム（４．６ｍｍ×３０ｍｍ、Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を備えたＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ８７Ｈカラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に、サンプルを注入した。このシステムを既知の濃度の標準に対して毎週較正した。典型的には、グルコース、グリセロール、１，３−プロパンジオール、および酢酸の保持時間は、それぞれ、１２．７分、１９．０分、２５．２分、および２１．５分であった。

【0759】

イソプレンの産出のヘッドスペース分析。国際公開ＷＯ２００９／０７６６７６ Ａ２（これは、特に、イソプレンを検出するためのヘッドスペース分析の方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通りにヘッドスペース分析を行なった。簡潔に述べると、１ｍｌの振盪フラスコ培養物を２０ｍｌのＣＴＣヘッドスペースバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔバイアルカタログ番号５１８８ ２７５３；キャップカタログ番号５１８８ ２７５９）に移した。キャップを回して堅く締め、バイアルを２５０ｒｐｍで振盪させながら等温でインキュベートした。３０分後、バイアルをインキュベーターから取り出し、次のように分析した。ヘッドスペースモードで操作するＣＴＣ Ａｎａｌｙｓｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ） ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーに接続したＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣ／ＭＳシステムを用いて分析を行なった。分析物の分離には、Ａｇｉｌｅｎｔ ΗＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ；０．２５μｍ膜厚）を用いた。５００μＬのヘッドスペースガスを注入するようにサンプラーを設定した。ＧＣ／ＭＳ法では、キャリアガスとして１ｍｌ／分の流量でヘリウムを用いた。注入口を２５０℃に保ち、分割比を５０：１とした。２分間の分析の間、オーブン温度を３７℃に保った。ｍ／ｚ ６７での単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードでＡｇｉｌｅｎｔ ５７９３Ｎ質量選択検出器を操作した。１．４分から１．７分まで検出器を切り、永久ガスを流出させた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、１．７８分で流出することが観察された。較正表を用いて、イソプレンの絶対量を定量し、１μｇ／Ｌ〜２００μｇ／Ｌまで線形であることが分かった。この方法を用いて、検出限界は５０〜１００ｎｇ／Ｌと推定された。

【0760】

振盪フラスコ実験。ＣＭＰ２４９株を用いて振盪フラスコ実験を行なった。様々な濃度のビタミンＢ１２を試験し（データは示さない）、１２５ｍｇ／Ｌおよびそれより多い量では、同量の１，３−プロパンジオールを示した（より低い濃度では、より少ない１，３−プロパンジオールの産出がもたらされた）。イソプレンとグリセロールまたは１，３−プロパンジオールの同時産出を測定した。図１８７Ａ〜Ｄは、同じ組の振盪フラスコからのデータを示す。図１８７Ａは、２００μＭ ＩＰＴＧの存在下での大腸菌株ＣＭＰ２４９によるグリセロールと１，３−プロパンジオールの産出を示す。図１８７Ｂは、２００μＭ ＩＰＴＧ±１２５ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２の存在下での大腸菌株ＣＭＰ２４９によるイソプレンの産出を示す。図１８７Ｃは、２００μＭ ＩＰＴＧ±１２５ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２の存在下での大腸菌ＣＭＰ２４９株によるＯＤプロファイルおよびグルコース消費を示す。図１８７Ｄは、２００μＭ ＩＰＴＧ±１２５ｍｇ／Ｌ ビタミンＢ１２の存在下でのＣＭＰ２４９株からの１，３−プロパンジオールとグリセロールのモル収率を示す。グリセロール／１，３−プロパンジオールモル収率は次のように計算される：モル収率＝（産出されるグリセロール（ｇ／Ｌ）／９２＋産出される１，３−プロパンジオール（ｇ／Ｌ）／７６）／（消費されるグルコース（ｇ／Ｌ）／１８０）。

【0761】

実施例３２：１５Ｌスケールの流加培養で増殖させた大腸菌ＢＬ２１におけるイソプレンと１，３−プロパンジオールの同時生成
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：７．５ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４、２ｇ ＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、２ｇクエン酸一水和物、０．３ｇクエン酸第二鉄アンモニウム、０．５ｇ酵母抽出物、１ｍｌ １０００×改変微量金属溶液。これらの成分を全て一緒に添加し、ｄｉＨ_２Ｏに溶解させた。この溶液を１２１℃で２０分間加熱滅菌した後、ｐＨを２８％水酸化アンモニウムで７．０に調整し、最終容量にした。１０ｇのグルコース、８ｍＬのマーキュリービタミン溶液（Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、および適当な抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。

【0762】

１０００×改変微量金属溶液（１リットル当たり）：４０gクエン酸*Ｈ_２Ｏ、３０ｇ ＭｎＳＯ_４^＊Ｈ_２Ｏ、１０ｇ ＮａＣｌ、１ｇ ＦｅＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、１ｇ ＣｏＣｌ_２^＊６Ｈ_２Ｏ、１ｇ ＺｎＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇ ＣｕＳＯ_４^＊５Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇ Ｈ_３ＢＯ_３、１００ｍｇ ＮａＭｏＯ_４^＊２Ｈ_２Ｏ。各成分を一度にｄｉＨ_２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整し、溶液を最終容量とした後、０.２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0763】

マーキュリービタミン溶液（１リットル当たり）：１．０ｇチアミン塩酸塩、１．０ｇ Ｄ−（＋）−ビオチン、１．０ｇニコチン酸、４．８ｇ Ｄ−パントテン酸、４．０ｇ塩酸ピリドキシン。各成分を一度にｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整し、溶液を最終容量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0764】

供給溶液（１キログラム当たり）：０．５７ｋｇグルコース、０．３８ｋｇ ｄｉＨ_２Ｏ、７．５ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４、および１０ｇ １００％フォームブラスト。全ての成分を一緒に混合して加圧滅菌した。溶液が２５℃にまで冷めた後、５．６ｍＬのマクロ塩溶液（Ｍａｃｒｏ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、０．８ｍＬの１０００×改変微量金属溶液、および６．７ｍＬのマーキュリービタミン溶液を添加した。

【0765】

マクロ塩溶液（１リットル当たり）：２９６ｇのＭｇＳＯ_４^＊７Ｈ_２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、および４９．６ｇのクエン酸第二鉄アンモニウムを水に溶解させ、最終容量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。

【0766】

この実験では、所望の発酵ｐＨ（７．０）および温度（３４℃）におけるグルコースからのイソプレンと１，３−プロパンジオールの形成がモニタリングされる。（上記のように調製される）ＣＭＰ２３９株の大腸菌ＢＬ２１細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。ＣＭＰ２３９株は、ｐｇｌ遺伝子の回復がなくても、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＤＷ１５；上記実施例３０参照）、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ＰＬ．２ ｍＫＫＤｙＩ）、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびウラジロハコヤナギ由来の切断型イソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ） ｍＭＶＫ（ｐＤＷ３４））、ならびに１，３−プロパンジオール産出に必要な遺伝子（ｐＳＹＣＯ１０９Ｆ１．１）を発現する。大腸菌株ＣＭＰ２３９の凍結バイアルを融解し、トリプトン−酵母抽出物培地に植菌した。種菌が、５５０ｎｍで測定した光学密度（ＯＤ_５５０）１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて１５Ｌバイオリアクターに植菌し、初期のタンク容量を５Ｌにした。

【0767】

５．８ｇ／分という最大供給速度に達するまで、供給溶液を指数関数的割合で供給した。最大供給速度に達して以降、グルコース供給を代謝要求量を満足させるように５．８ｇ／分以下の速度で調整した。バイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３７時間の発酵期間を通して４．２ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を表２３に示すような段階的なやり方で添加することにより、誘導を達成した。

【0768】

２０８ｍｇのビタミンＢ１２を１２．８時間と３５．８時間で２回投入した。バイオリアクター内の経時的なＯＤ_５５０プロファイルを図１８８に示す。バイオリアクターからの発生ガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は発酵の間に３７時間で最大値２．２ｇ／Ｌにまで増加した（図１８９）。３７時間の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は１７．７ｇであった。産出の時間経過を図１９０に示す。イソプレン比生産性の時間経過を図１９１に示す。１，３−プロパンジオール力価は発酵の間に３７時間で最大値５３．３ｇ／Ｌにまで増加した（図１９２）。３７時間の発酵の間に産出された１，３−プロパンジオールの総量は５０７．９ｇであった。産出の時間経過を図１９３に示す。１，３−プロパンジオール比生産性の時間経過を図１９４に示す。グリセロール力価は発酵の間に３７時間で最大値２７．３ｇ／Ｌにまで増加した（図１９５）。３７時間の発酵の間に産出されたグリセロールの総量は２５９．８ｇであった。産出の時間経過を図１９６に示す。グリセロール比生産性の時間経過を図１９７に示す。最終的な生産収率を表２４に示す。

【表28】

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【表29】

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別表１
例示的な１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−リン酸シンターゼ核酸およびポリペプチド

ATH: AT3G21500(DXPS1) AT4G15560(CLA1) AT5G11380(DXPS3)
OSA: 4338768 4340090 4342614
CME: CMF089C
PFA: MAL13P1.186
TAN: TA20470
TPV: TP01_0516
ECO: b0420(dxs)
ECJ: JW0410(dxs)
ECE: Z0523(dxs)
ECS: ECs0474
ECC: c0531(dxs)
ECI: UTI89_C0443(dxs)
ECP: ECP_0479
ECV: APECO1_1590(dxs)
ECW: EcE24377A_0451(dxs)
ECX: EcHS_A0491
STY: STY0461(dxs)
STT: t2441(dxs)
SPT: SPA2301(dxs)
SEC: SC0463(dxs)
STM: STM0422(dxs)
YPE: YPO3177(dxs)
YPK: y1008(dxs)
YPM: YP_0754(dxs)
YPA: YPA_2671
YPN: YPN_0911
YPP: YPDSF_2812
YPS: YPTB0939(dxs)
YPI: YpsIP31758_3112(dxs)
SFL: SF0357(dxs)
SFX: S0365(dxs)
SFV: SFV_0385(dxs)
SSN: SSON_0397(dxs)
SBO: SBO_0314(dxs)
SDY: SDY_0310(dxs)
ECA: ECA1131(dxs)
PLU: plu3887(dxs)
BUC: BU464(dxs)
BAS: BUsg448(dxs)
WBR: WGLp144(dxs)
SGL: SG0656
KPN: KPN_00372(dxs)
BFL: Bfl238(dxs)
BPN: BPEN_244(dxs)
HIN: HI1439(dxs)
HIT: NTHI1691(dxs)
HIP: CGSHiEE_04795
HIQ: CGSHiGG_01080
HDU: HD0441(dxs)
HSO: HS_0905(dxs)
PMU: PM0532(dxs)
MSU: MS1059(dxs)
APL: APL_0207(dxs)
XFA: XF2249
XFT: PD1293(dxs)
XCC: XCC2434(dxs)
XCB: XC_1678
XCV: XCV2764(dxs)
XAC: XAC2565(dxs)
XOO: XOO2017(dxs)
XOM: XOO_1900(XOO1900)
VCH: VC0889
VVU: VV1_0315
VVY: VV0868
VPA: VP0686
VFI: VF0711
PPR: PBPRA0805
PAE: PA4044(dxs)
PAU: PA14_11550(dxs)
PAP: PSPA7_1057(dxs)
PPU: PP_0527(dxs)
PST: PSPTO_0698(dxs)
PSB: Psyr_0604
PSP: PSPPH_0599(dxs)
PFL: PFL_5510(dxs)
PFO: Pfl_5007
PEN: PSEEN0600(dxs)
PMY: Pmen_3844
PAR: Psyc_0221(dxs)
PCR: Pcryo_0245
ACI: ACIAD3247(dxs)
SON: SO_1525(dxs)
SDN: Sden_2571
SFR: Sfri_2790
SAZ: Sama_2436
SBL: Sbal_1357
SLO: Shew_2771
SHE: Shewmr4_2731
SHM: Shewmr7_2804
SHN: Shewana3_2901
SHW: Sputw3181_2831
ILO: IL2138(dxs)
CPS: CPS_1088(dxs)
PHA: PSHAa2366(dxs)
PAT: Patl_1319
SDE: Sde_3381
PIN: Ping_2240
MAQ: Maqu_2438
MCA: MCA0817(dxs)
FTU: FTT1018c(dxs)
FTF: FTF1018c(dxs)
FTW: FTW_0925(dxs)
FTL: FTL_1072
FTH: FTH_1047(dxs)
FTA: FTA_1131(dxs)
FTN: FTN_0896(dxs)
NOC: Noc_1743
AEH: Mlg_1381
HCH: HCH_05866(dxs)
CSA: Csal_0099
ABO: ABO_2166(dxs)
AHA: AHA_3321(dxs)
BCI: BCI_0275(dxs)
RMA: Rmag_0386
VOK: COSY_0360(dxs)
NME: NMB1867
NMA: NMA0589(dxs)
NMC: NMC0352(dxs)
NGO: NGO0036
CVI: CV_2692(dxs)
RSO: RSc2221(dxs)
REU: Reut_A0882
REH: H16_A2732(dxs)
RME: Rmet_2615
BMA: BMAA0330(dxs)
BMV: BMASAVP1_1512(dxs)
BML: BMA10299_1706(dxs)
BMN: BMA10247_A0364(dxs)
BXE: Bxe_B2827
BUR: Bcep18194_B2211
BCN: Bcen_4486
BCH: Bcen2424_3879
BAM: Bamb_3250
BPS: BPSS1762(dxs)
BPM: BURPS1710b_A0842(dxs)
BPL: BURPS1106A_A2392(dxs)
BPD: BURPS668_A2534(dxs)
BTE: BTH_II0614(dxs)
BPE: BP2798(dxs)
BPA: BPP2464(dxs)
BBR: BB1912(dxs)
RFR: Rfer_2875
POL: Bpro_1747
PNA: Pnap_1501
AJS: Ajs_1038
MPT: Mpe_A2631
HAR: HEAR0279(dxs)
MMS: mma_0331
NEU: NE1161(dxs)
NET: Neut_1501
NMU: Nmul_A0236
EBA: ebA4439(dxs)
AZO: azo1198(dxs)
DAR: Daro_3061
TBD: Tbd_0879
MFA: Mfla_2133
HPY: HP0354(dxs)
HPJ: jhp0328(dxs)
HPA: HPAG1_0349
HHE: HH0608(dxs)
HAC: Hac_0968(dxs)
WSU: WS1996
TDN: Tmden_0475
CJE: Cj0321(dxs)
CJR: CJE0366(dxs)
CJJ: CJJ81176_0343(dxs)
CJU: C8J_0298(dxs)
CJD: JJD26997_1642(dxs)
CFF: CFF8240_0264(dxs)
CCV: CCV52592_1671(dxs) CCV52592_1722
CHA: CHAB381_1297(dxs)
CCO: CCC13826_1594(dxs)
ABU: Abu_2139(dxs)
NIS: NIS_0391(dxs)
SUN: SUN_2055(dxs)
GSU: GSU0686(dxs-1) GSU1764(dxs-2)
GME: Gmet_1934 Gmet_2822
PCA: Pcar_1667
PPD: Ppro_1191 Ppro_2403
DVU: DVU1350(dxs)
DVL: Dvul_1718
DDE: Dde_2200
LIP: LI0408(dsx)
DPS: DP2700
ADE: Adeh_1097
MXA: MXAN_4643(dxs)
SAT: SYN_02456
SFU: Sfum_1418
PUB: SAR11_0611(dxs)
MLO: mlr7474
MES: Meso_0735
SME: SMc00972(dxs)
ATU: Atu0745(dxs)
ATC: AGR_C_1351
RET: RHE_CH00913(dxs)
RLE: RL0973(dxs)
BME: BMEI1498
BMF: BAB1_0462(dxs)
BMS: BR0436(dxs)
BMB: BruAb1_0458(dxs)
BOV: BOV_0443(dxs)
BJA: bll2651(dxs)
BRA: BRADO2161(dxs)
BBT: BBta_2479(dxs)
RPA: RPA0952(dxs)
RPB: RPB_4460
RPC: RPC_1149
RPD: RPD_4305
RPE: RPE_1067
NWI: Nwi_0633
NHA: Nham_0778
BHE: BH04350(dxs)
BQU: BQ03540(dxs)
BBK: BARBAKC583_0400(dxs)
CCR: CC_2068
SIL: SPO0247(dxs)
SIT: TM1040_2920
RSP: RSP_0254(dxsA) RSP_1134(dxs)
JAN: Jann_0088 Jann_0170
RDE: RD1_0101(dxs) RD1_0548(dxs)
MMR: Mmar10_0849
HNE: HNE_1838(dxs)
ZMO: ZMO1234(dxs) ZMO1598(dxs)
NAR: Saro_0161
SAL: Sala_2354
ELI: ELI_12520
GOX: GOX0252
GBE: GbCGDNIH1_0221 GbCGDNIH1_2404
RRU: Rru_A0054 Rru_A2619
MAG: amb2904
MGM: Mmc1_1048
SUS: Acid_1783
BSU: BG11715(dxs)
BHA: BH2779
BAN: BA4400(dxs)
BAR: GBAA4400(dxs)
BAA: BA_4853
BAT: BAS4081
BCE: BC4176(dxs)
BCA: BCE_4249(dxs)
BCZ: BCZK3930(dxs)
BTK: BT9727_3919(dxs)
BTL: BALH_3785(dxs)
BLI: BL01523(dxs)
BLD: BLi02598(dxs)
BCL: ABC2462(dxs)
BAY: RBAM_022600
BPU: BPUM_2159
GKA: GK2392
GTN: GTNG_2322
LMO: lmo1365(tktB)
LMF: LMOf2365_1382(dxs)
LIN: lin1402(tktB)
LWE: lwe1380(tktB)
LLA: L108911(dxsA) L123365(dxsB)
LLC: LACR_1572 LACR_1843
LLM: llmg_0749(dxsB)
SAK: SAK_0263
LPL: lp_2610(dxs)
LJO: LJ0406
LAC: LBA0356
LSL: LSL_0209(dxs)
LGA: LGAS_0350
STH: STH1842
CAC: CAC2077 CA_P0106(dxs)
CPE: CPE1819
CPF: CPF_2073(dxs)
CPR: CPR_1787(dxs)
CTC: CTC01575
CNO: NT01CX_1983
CTH: Cthe_0828
CDF: CD1207(dxs)
CBO: CBO1881(dxs)
CBA: CLB_1818(dxs)
CBH: CLC_1825(dxs)
CBF: CLI_1945(dxs)
CKL: CKL_1231(dxs)
CHY: CHY_1985(dxs)
DSY: DSY2348
DRM: Dred_1078
PTH: PTH_1196(dxs)
SWO: Swol_0582
CSC: Csac_1853
TTE: TTE1298(dxs)
MTA: Moth_1511
MPE: MYPE730
MGA: MGA_1268(dxs)
MTU: Rv2682c(dxs1) Rv3379c(dxs2)
MTC: MT2756(dxs)
MBO: Mb2701c(dxs1) Mb3413c(dxs2)
MLE: ML1038(dxs)
MPA: MAP2803c(dxs)
MAV: MAV_3577(dxs)
MSM: MSMEG_2776(dxs)
MMC: Mmcs_2208
CGL: NCgl1827(cgl1902)
CGB: cg2083(dxs)
CEF: CE1796
CDI: DIP1397(dxs)
CJK: jk1078(dxs)
NFA: nfa37410(dxs)
RHA: RHA1_ro06843
SCO: SCO6013(SC1C3.01) SCO6768(SC6A5.17)
SMA: SAV1646(dxs1) SAV2244(dxs2)
TWH: TWT484
TWS: TW280(Dxs)
LXX: Lxx10450(dxs)
CMI: CMM_1660(dxsA)
AAU: AAur_1790(dxs)
PAC: PPA1062
TFU: Tfu_1917
FRA: Francci3_1326
FAL: FRAAL2088(dxs)
ACE: Acel_1393
SEN: SACE_1815(dxs) SACE_4351
BLO: BL1132(dxs)
BAD: BAD_0513(dxs)
FNU: FN1208 FN1464
RBA: RB2143(dxs)
CTR: CT331(dxs)
CTA: CTA_0359(dxs)
CMU: TC0608
CPN: CPn1060(tktB_2)
CPA: CP0790
CPJ: CPj1060(tktB_2)
CPT: CpB1102
CCA: CCA00304(dxs)
CAB: CAB301(dxs)
CFE: CF0699(dxs)
PCU: pc0619(dxs)
TPA: TP0824
TDE: TDE1910(dxs)
LIL: LA3285(dxs)
LIC: LIC10863(dxs)
LBJ: LBJ_0917(dxs)
LBL: LBL_0932(dxs)
SYN: sll1945(dxs)
SYW: SYNW1292(Dxs)
SYC: syc1087_c(dxs)
SYF: Synpcc7942_0430
SYD: Syncc9605_1430
SYE: Syncc9902_1069
SYG: sync_1410(dxs)
SYR: SynRCC307_1390(dxs)
SYX: SynWH7803_1223(dxs)
CYA: CYA_1701(dxs)
CYB: CYB_1983(dxs)
TEL: tll0623
GVI: gll0194
ANA: alr0599
AVA: Ava_4532
PMA: Pro0928(dxs)
PMM: PMM0907(Dxs)
PMT: PMT0685(dxs)
PMN: PMN2A_0300
PMI: PMT9312_0893
PMB: A9601_09541(dxs)
PMC: P9515_09901(dxs)
PMF: P9303_15371(dxs)
PMG: P9301_09521(dxs)
PMH: P9215_09851
PMJ: P9211_08521
PME: NATL1_09721(dxs)
TER: Tery_3042
BTH: BT_1403 BT_4099
BFR: BF0873 BF4306
BFS: BF0796(dxs) BF4114
PGI: PG2217(dxs)
CHU: CHU_3643(dxs)
GFO: GFO_3470(dxs)
FPS: FP0279(dxs)
CTE: CT0337(dxs)
CPH: Cpha266_0671
PVI: Cvib_0498
PLT: Plut_0450
DET: DET0745(dxs)
DEH: cbdb_A720(dxs)
DRA: DR_1475
DGE: Dgeo_0994
TTH: TTC1614
TTJ: TTHA0006
AAE: aq_881
TMA: TM1770
PMO: Pmob_1001
例示的なアセチル−ＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ核酸およびポリペプチド

HSA: 38(ACAT1) 39(ACAT2)
PTR: 451528(ACAT1)
MCC: 707653(ACAT1) 708750(ACAT2)
MMU: 110446(Acat1) 110460(Acat2)
RNO: 25014(Acat1)
CFA: 484063(ACAT2) 489421(ACAT1)
GGA: 418968(ACAT1) 421587(RCJMB04_34i5)
XLA: 379569(MGC69098) 414622(MGC81403) 414639(MGC81256) 444457(MGC83664)
XTR: 394562(acat2)
DRE: 30643(acat2)
SPU: 759502(LOC759502)
DME: Dmel_CG10932 Dmel_CG9149
CEL: T02G5.4 T02G5.7 T02G5.8(kat-1)
ATH: AT5G48230(ACAT2/EMB1276)
OSA: 4326136 4346520
CME: CMA042C CME087C
SCE: YPL028W(ERG10)
AGO: AGOS_ADR165C
PIC: PICST_31707(ERG10)
CAL: CaO19.1591(erg10)
CGR: CAGL0L12364g
SPO: SPBC215.09c
MGR: MGG_01755 MGG_13499
ANI: AN1409.2
AFM: AFUA_6G14200 AFUA_8G04000
AOR: AO090103000012 AO090103000406
CNE: CNC05280
UMA: UM03571.1
DDI: DDB_0231621
PFA: PF14_0484
TET: TTHERM_00091590 TTHERM_00277470 TTHERM_00926980
TCR: 511003.60
ECO: b2224(atoB)
ECJ: JW2218(atoB) JW5453(yqeF)
ECE: Z4164(yqeF)
ECS: ECs3701
ECC: c2767(atoB) c3441(yqeF)
ECI: UTI89_C2506(atoB) UTI89_C3247(yqeF)
ECP: ECP_2268 ECP_2857
ECV: APECO1_3662(yqeF) APECO1_4335(atoB) APECO1_43352(atoB)
ECX: EcHS_A2365
STY: STY3164(yqeF)
STT: t2929(yqeF)
SPT: SPA2886(yqeF)
SEC: SC2958(yqeF)
STM: STM3019(yqeF)
SFL: SF2854(yqeF)
SFX: S3052(yqeF)
SFV: SFV_2922(yqeF)
SSN: SSON_2283(atoB) SSON_3004(yqeF)
SBO: SBO_2736(yqeF)
ECA: ECA1282(atoB)
ENT: Ent638_3299
SPE: Spro_0592
HIT: NTHI0932(atoB)
XCC: XCC1297(atoB)
XCB: XC_2943
XCV: XCV1401(thlA)
XAC: XAC1348(atoB)
XOO: XOO1881(atoB)
XOM: XOO_1778(XOO1778)
VCH: VCA0690
VCO: VC0395_0630
VVU: VV2_0494 VV2_0741
VVY: VVA1043 VVA1210
VPA: VPA0620 VPA1123 VPA1204
PPR: PBPRB1112 PBPRB1840
PAE: PA2001(atoB) PA2553 PA3454 PA3589 PA3925
PAU: PA14_38630(atoB)
PPU: PP_2051(atoB) PP_2215(fadAx) PP_3754 PP_4636
PPF: Pput_2009 Pput_2403 Pput_3523 Pput_4498
PST: PSPTO_0957(phbA-1) PSPTO_3164(phbA-2)
PSB: Psyr_0824 Psyr_3031
PSP: PSPPH_0850(phbA1) PSPPH_2209(phbA2)
PFL: PFL_1478(atoB-2) PFL_2321 PFL_3066 PFL_4330(atoB-2) PFL_5283
PFO: Pfl_1269 Pfl_1739 Pfl_2074 Pfl_2868
PEN: PSEEN3197 PSEEN3547(fadAx) PSEEN4635(phbA)
PMY: Pmen_1138 Pmen_2036 Pmen_3597 Pmen_3662 Pmen_3820
PAR: Psyc_0252 Psyc_1169
PCR: Pcryo_0278 Pcryo_1236 Pcryo_1260
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BTE: BTH_I2144 BTH_I2256 BTH_I2261
PNU: Pnuc_0927
BPE: BP0447 BP0668 BP2059
BPA: BPP0608 BPP1744 BPP3805 BPP4216 BPP4361
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PNA: Pnap_0060 Pnap_0458 Pnap_0867 Pnap_1159 Pnap_2136 Pnap_2804
AAV: Aave_0031 Aave_2478 Aave_3944 Aave_4368
AJS: Ajs_0014 Ajs_0124 Ajs_1931 Ajs_2073 Ajs_2317 Ajs_3548 Ajs_3738 Ajs_3776
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DAC: Daci_0025 Daci_0192 Daci_3601 Daci_5988
MPT: Mpe_A1536 Mpe_A1776 Mpe_A1869 Mpe_A3367
HAR: HEAR0577(phbA)
MMS: mma_0555
NEU: NE2262(bktB)
NET: Neut_0610
EBA: ebA5202 p2A409(tioL)
AZO: azo0464(fadA1) azo0469(fadA2) azo2172(thlA)
DAR: Daro_0098 Daro_3022
HPA: HPAG1_0675
HAC: Hac_0958(atoB)
GME: Gmet_1719 Gmet_2074 Gmet_2213 Gmet_2268 Gmet_3302
GUR: Gura_3043
BBA: Bd0404(atoB) Bd2095
DOL: Dole_0671 Dole_1778 Dole_2160 Dole_2187
ADE: Adeh_0062 Adeh_2365
AFW: Anae109_0064 Anae109_1504
MXA: MXAN_3791
SAT: SYN_02642
SFU: Sfum_2280 Sfum_3582
RPR: RP737
RCO: RC1134 RC1135
RFE: RF_0163(paaJ)
RBE: RBE_0139(paaJ)
RAK: A1C_05820
RBO: A1I_07215
RCM: A1E_04760
PUB: SAR11_0428(thlA)
MLO: mlr3847
MES: Meso_3374
PLA: Plav_1573 Plav_2783
SME: SMa1450 SMc03879(phbA)
SMD: Smed_0499 Smed_3117 Smed_5094 Smed_5096
ATU: Atu2769(atoB) Atu3475
ATC: AGR_C_5022(phbA) AGR_L_2713
RET: RHE_CH04018(phbAch) RHE_PC00068(ypc00040) RHE_PF00014(phbAf)
RLE: RL4621(phaA) pRL100301 pRL120369
BME: BMEI0274 BMEII0817
BMF: BAB1_1783(phbA-1) BAB2_0790(phbA-2)
BMS: BR1772(phbA-1) BRA0448(phbA-2)
BMB: BruAb1_1756(phbA-1) BruAb2_0774(phbA-2)
BOV: BOV_1707(phbA-1)
OAN: Oant_1130 Oant_3107 Oant_3718 Oant_4020
BJA: bll0226(atoB) bll3949 bll7400 bll7819 blr3724(phbA)
BRA: BRADO0562(phbA) BRADO0983(pimB) BRADO3110 BRADO3134(atoB)
BBT: BBta_3558 BBta_3575(atoB) BBta_5147(pimB) BBta_7072(pimB) BBta_7614(phbA)
RPA: RPA0513(pcaF) RPA0531 RPA3715(pimB)
RPB: RPB_0509 RPB_0525 RPB_1748
RPC: RPC_0504 RPC_0636 RPC_0641 RPC_0832 RPC_1050 RPC_2005 RPC_2194 RPC_2228
RPD: RPD_0306 RPD_0320 RPD_3105 RPD_3306
RPE: RPE_0168 RPE_0248 RPE_3827
NWI: Nwi_3060
XAU: Xaut_3108 Xaut_4665
CCR: CC_0510 CC_0894 CC_3462
SIL: SPO0142(bktB) SPO0326(phbA) SPO0773 SPO3408
SIT: TM1040_0067 TM1040_2790 TM1040_3026 TM1040_3735
RSP: RSP_0745 RSP_1354 RSP_3184
RSH: Rsph17029_0022 Rsph17029_2401 Rsph17029_3179 Rsph17029_3921
RSQ: Rsph17025_0012 Rsph17025_2466 Rsph17025_2833
JAN: Jann_0262 Jann_0493 Jann_4050
RDE: RD1_0025 RD1_0201(bktB) RD1_3394(phbA)
PDE: Pden_2026 Pden_2663 Pden_2870 Pden_2907 Pden_4811 Pden_5022
DSH: Dshi_0074 Dshi_3066 Dshi_3331
MMR: Mmar10_0697
HNE: HNE_2706 HNE_3065 HNE_3133
NAR: Saro_0809 Saro_1069 Saro_1222 Saro_2306 Saro_2349
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SWI: Swit_0632 Swit_0752 Swit_2893 Swit_3602 Swit_4887 Swit_5019 Swit_5309
ELI: ELI_01475 ELI_06705 ELI_12035
GBE: GbCGDNIH1_0447
ACR: Acry_1847 Acry_2256
RRU: Rru_A0274 Rru_A1380 Rru_A1469 Rru_A1946 Rru_A3387
MAG: amb0842
MGM: Mmc1_1165
ABA: Acid345_3239
BSU: BG11319(mmgA) BG13063(yhfS)
BHA: BH1997 BH2029 BH3801(mmgA)
BAN: BA3687 BA4240 BA5589
BAR: GBAA3687 GBAA4240 GBAA5589
BAA: BA_0445 BA_4172 BA_4700
BAT: BAS3418 BAS3932 BAS5193
BCE: BC3627 BC4023 BC5344
BCA: BCE_3646 BCE_4076 BCE_5475
BCZ: BCZK3329(mmgA) BCZK3780(thl) BCZK5044(atoB)
BCY: Bcer98_2722 Bcer98_3865
BTK: BT9727_3379(mmgA) BT9727_3765(thl) BT9727_5028(atoB)
BTL: BALH_3262(mmgA) BALH_3642(fadA) BALH_4843(atoB)
BLI: BL03925(mmgA)
BLD: BLi03968(mmgA)
BCL: ABC0345 ABC2989 ABC3617 ABC3891(mmgA)
BAY: RBAM_022450
BPU: BPUM_2374(yhfS) BPUM_2941 BPUM_3373
OIH: OB0676 OB0689 OB2632 OB3013
GKA: GK1658 GK3397
SAU: SA0342 SA0534(vraB)
SAV: SAV0354 SAV0576(vraB)
SAM: MW0330 MW0531(vraB)
SAR: SAR0351(thl) SAR0581
SAS: SAS0330 SAS0534
SAC: SACOL0426 SACOL0622(atoB)
SAB: SAB0304(th1) SAB0526
SAA: SAUSA300_0355 SAUSA300_0560(vraB)
SAO: SAOUHSC_00336 SAOUHSC_00558
SAJ: SaurJH9_0402
SAH: SaurJH1_0412
SEP: SE0346 SE2384
SER: SERP0032 SERP0220
SHA: SH0510(mvaC) SH2417
SSP: SSP0325 SSP2145
LMO: lmo1414
LMF: LMOf2365_1433
LIN: lin1453
LWE: lwe1431
LLA: L11745(thiL) L25946(fadA)
LLC: LACR_1665 LACR_1956
LLM: llmg_0930(thiL)
SPY: SPy_0140 SPy_1637(atoB)
SPZ: M5005_Spy_0119 M5005_Spy_0432 M5005_Spy_1344(atoB)
SPM: spyM18_0136 spyM18_1645(atoB)
SPG: SpyM3_0108 SpyM3_1378(atoB)
SPS: SPs0110 SPs0484
SPH: MGAS10270_Spy0121 MGAS10270_Spy0433 MGAS10270_Spy1461(atoB)
SPI: MGAS10750_Spy0124 MGAS10750_Spy0452 MGAS10750_Spy1453(atoB)
SPJ: MGAS2096_Spy0123 MGAS2096_Spy0451 MGAS2096_Spy1365(atoB)
SPK: MGAS9429_Spy0121 MGAS9429_Spy0431 MGAS9429_Spy1339(atoB)
SPF: SpyM50447(atoB2)
SPA: M6_Spy0166 M6_Spy0466 M6_Spy1390
SPB: M28_Spy0117 M28_Spy0420 M28_Spy1385(atoB)
SAK: SAK_0568
LJO: LJ1609
LAC: LBA0626(thiL)
LSA: LSA1486
LDB: Ldb0879
LBU: LBUL_0804
LBR: LVIS_2218
LCA: LSEI_1787
LGA: LGAS_1374
LRE: Lreu_0052
EFA: EF1364
OOE: OEOE_0529
STH: STH2913 STH725 STH804
CAC: CAC2873 CA_P0078(thiL)
CPE: CPE2195(atoB)
CPF: CPF_2460
CPR: CPR_2170
CTC: CTC00312
CNO: NT01CX_0538 NT01CX_0603
CDF: CD1059(thlA1) CD2676(thlA2)
CBO: CBO3200(thl)
CBE: Cbei_0411 Cbei_3630
CKL: CKL_3696(thlA1) CKL_3697(thlA2) CKL_3698(thlA3)
AMT: Amet_4630
AOE: Clos_0084 Clos_0258
CHY: CHY_1288 CHY_1355(atoB) CHY_1604 CHY_1738
DSY: DSY0632 DSY0639 DSY1567 DSY1710 DSY2402 DSY3302
DRM: Dred_0400 Dred_1491 Dred_1784 Dred_1892
SWO: Swol_0308 Swol_0675 Swol_0789 Swol_1486 Swol_1934 Swol_2051
TTE: TTE0549(paaJ)
MTA: Moth_1260
MTU: Rv1135A Rv1323(fadA4) Rv3546(fadA5)
MTC: MT1365(phbA)
MBO: Mb1167 Mb1358(fadA4) Mb3576(fadA5) Mb3586c(fadA6)
MBB: BCG_1197 BCG_1385(fadA4) BCG_3610(fadA5) BCG_3620c(fadA6)
MLE: ML1158(fadA4)
MPA: MAP2407c(fadA3) MAP2436c(fadA4)
MAV: MAV_1544 MAV_1573 MAV_1863 MAV_5081
MSM: MSMEG_2224 MSMEG_4920
MUL: MUL_0357
MVA: Mvan_1976 Mvan_1988 Mvan_4305 Mvan_4677 Mvan_4891
MGI: Mflv_1347 Mflv_1484 Mflv_2040 Mflv_2340 Mflv_4356 Mflv_4368
MMC: Mmcs_1758 Mmcs_1769 Mmcs_3796 Mmcs_3864
MKM: Mkms_0251 Mkms_1540 Mkms_1805 Mkms_1816 Mkms_2836 Mkms_3159 Mkms_3286 Mkms_3869 Mkms_3938 Mkms_4227 Mkms_4411 Mkms_4580 Mkms_4724 Mkms_4764 Mkms_4776
MJL: Mjls_0231 Mjls_1739 Mjls_1750 Mjls_2819 Mjls_3119 Mjls_3235 Mjls_3800 Mjls_3850 Mjls_4110 Mjls_4383 Mjls_4705 Mjls_4876 Mjls_5018 Mjls_5063 Mjls_5075
CGL: NCgl2309(cgl2392)
CGB: cg2625(pcaF)
CEF: CE0731 CE2295
CJK: jk1543(fadA3)
NFA: nfa10750(fadA4)
RHA: RHA1_ro01455 RHA1_ro01623 RHA1_ro01876 RHA1_ro02517(catF) RHA1_ro03022 RHA1_ro03024 RHA1_ro03391 RHA1_ro03892 RHA1_ro04599 RHA1_ro05257 RHA1_ro08871
SCO: SCO5399(SC8F4.03)
SMA: SAV1384(fadA5) SAV2856(fadA1)
ART: Arth_1160 Arth_2986 Arth_3268 Arth_4073
NCA: Noca_1371 Noca_1797 Noca_1828 Noca_2764 Noca_4142
TFU: Tfu_1520 Tfu_2394
FRA: Francci3_3687
FRE: Franean1_1044 Franean1_2711 Franean1_2726 Franean1_3929 Franean1_4037 Franean1_4577
FAL: FRAAL2514 FRAAL2618 FRAAL5910(atoB)
ACE: Acel_0626 Acel_0672
SEN: SACE_1192(mmgA) SACE_2736(fadA6) SACE_4011(catF) SACE_6236(fadA4)
STP: Strop_3610
SAQ: Sare_1316 Sare_3991
RXY: Rxyl_1582 Rxyl_1842 Rxyl_2389 Rxyl_2530
FNU: FN0495
BGA: BG0110(fadA)
BAF: BAPKO_0110(fadA)
LIL: LA0457(thiL1) LA0828(thiL2) LA4139(fadA)
LIC: LIC10396(phbA)
LBJ: LBJ_2862(paaJ-4)
LBL: LBL_0209(paaJ-4)
SYN: slr1993(phaA)
SRU: SRU_1211(atoB) SRU_1547
CHU: CHU_1910(atoB)
GFO: GFO_1507(atoB)
FJO: Fjoh_4612
FPS: FP0770 FP1586 FP1725
RRS: RoseRS_3911 RoseRS_4348
RCA: Rcas_0702 Rcas_3206
HAU: Haur_0522
DRA: DR_1072 DR_1428 DR_1960 DR_2480 DR_A0053
DGE: Dgeo_0755 Dgeo_1305 Dgeo_1441 Dgeo_1883
TTH: TTC0191 TTC0330
TTJ: TTHA0559
TME: Tmel_1134
FNO: Fnod_0314
PMO: Pmob_0515
HMA: rrnAC0896(acaB3) rrnAC2815(aca2) rrnAC3497(yqeF) rrnB0240(aca1) rrnB0242(acaB2) rrnB0309(acaB1)
TAC: Ta0582
TVO: TVN0649
PTO: PTO1505
APE: APE_2108
SSO: SSO2377(acaB-4)
STO: ST0514
SAI: Saci_0963 Saci_1361(acaB1)
MSE: Msed_0656
PAI: PAE1220
PIS: Pisl_0029 Pisl_1301
PCL: Pcal_0781
PAS: Pars_0309 Pars_1071
CMA: Cmaq_1941
例示的なＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ核酸およびポリペプチド

HSA: 3157(HMGCS1) 3158(HMGCS2)
PTR: 457169(HMGCS2) 461892(HMGCS1)
MCC: 702553(HMGCS1) 713541(HMGCS2)
MMU: 15360(Hmgcs2) 208715(Hmgcs1)
RNO: 24450(Hmgcs2) 29637(Hmgcs1)
CFA: 479344(HMGCS1) 607923(HMGCS2)
BTA: 407767(HMGCS1)
SSC: 397673(CH242-38B5.1)
GGA: 396379(HMGCS1)
XLA: 380091(hmgcs1) 447204(MGC80816)
DRE: 394060(hmgcs1)
SPU: 578259(LOC578259)
DME: Dmel_CG4311(Hmgs)
CEL: F25B4.6
ATH: AT4G11820(BAP1)
OSA: 4331418 4347614
CME: CMM189C
SCE: YML126C(ERG13)
AGO: AGOS_ADL356C
PIC: PICST_83020
CAL: CaO19_7312(CaO19.7312)
CGR: CAGL0H04081g
SPO: SPAC4F8.14c(hcs)
MGR: MGG_01026
ANI: AN4923.2
AFM: AFUA_3G10660 AFUA_8G07210
AOR: AO090003000611 AO090010000487
CNE: CNC05080 CNG02670
UMA: UM05362.1
ECU: ECU10_0510
DDI: DDBDRAFT_0217522 DDB_0219924(hgsA)
TET: TTHERM_00691190
TBR: Tb927.8.6110
YPE: YPO1457
YPK: y2712(pksG)
YPM: YP_1349(pksG)
YPA: YPA_0750
YPN: YPN_2521
YPP: YPDSF_1517
YPS: YPTB1475
CBD: COXBU7E912_1931
TCX: Tcr_1719
DNO: DNO_0799
BMA: BMAA1212
BPS: BPSS1002
BPM: BURPS1710b_A2613
BPL: BURPS1106A_A1384
BPD: BURPS668_A1470
BTE: BTH_II1670
MXA: MXAN_3948(tac) MXAN_4267(mvaS)
BSU: BG10926(pksG)
OIH: OB2248
SAU: SA2334(mvaS)
SAV: SAV2546(mvaS)
SAM: MW2467(mvaS)
SAR: SAR2626(mvaS)
SAS: SAS2432
SAC: SACOL2561
SAB: SAB2420(mvaS)
SAA: SAUSA300_2484
SAO: SAOUHSC_02860
SAJ: SaurJH9_2569
SAH: SaurJH1_2622
SEP: SE2110
SER: SERP2122
SHA: SH0508(mvaS)
SSP: SSP0324
LMO: lmo1415
LMF: LMOf2365_1434(mvaS)
LIN: lin1454
LWE: lwe1432(mvaS)
LLA: L13187(hmcM)
LLC: LACR_1666
LLM: llmg_0929(hmcM)
SPY: SPy_0881(mvaS.2)
SPZ: M5005_Spy_0687(mvaS.1)
SPM: spyM18_0942(mvaS2)
SPG: SpyM3_0600(mvaS.2)
SPS: SPs1253
SPH: MGAS10270_Spy0745(mvaS1)
SPI: MGAS10750_Spy0779(mvaS1)
SPJ: MGAS2096_Spy0759(mvaS1)
SPK: MGAS9429_Spy0743(mvaS1)
SPF: SpyM51121(mvaS)
SPA: M6_Spy0704
SPB: M28_Spy0667(mvaS.1)
SPN: SP_1727
SPR: spr1571(mvaS)
SPD: SPD_1537(mvaS)
SAG: SAG1316
SAN: gbs1386
SAK: SAK_1347
SMU: SMU.943c
STC: str0577(mvaS)
STL: stu0577(mvaS)
STE: STER_0621
SSA: SSA_0338(mvaS)
SSU: SSU05_1641
SSV: SSU98_1652
SGO: SGO_0244
LPL: lp_2067(mvaS)
LJO: LJ1607
LAC: LBA0628(hmcS)
LSA: LSA1484(mvaS)
LSL: LSL_0526
LDB: Ldb0881(mvaS)
LBU: LBUL_0806
LBR: LVIS_1363
LCA: LSEI_1785
LGA: LGAS_1372
LRE: Lreu_0676
PPE: PEPE_0868
EFA: EF1363
OOE: OEOE_0968
LME: LEUM_1184
NFA: nfa22120
SEN: SACE_4570(pksG)
BBU: BB0683
BGA: BG0706
BAF: BAPKO_0727
FJO: Fjoh_0678
HAL: VNG1615G(mvaB)
HMA: rrnAC1740(mvaS)
HWA: HQ2868A(mvaB)
NPH: NP2608A(mvaB_1) NP4836A(mvaB_2)
例示的なヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ核酸およびポリペプチド

HSA: 3156(HMGCR)
PTR: 471516(HMGCR)
MCC: 705479(HMGCR)
MMU: 15357(Hmgcr)
RNO: 25675(Hmgcr)
CFA: 479182(HMGCR)
BTA: 407159(HMGCR)
GGA: 395145(RCJMB04_14m24)
SPU: 373355(LOC373355)
DME: Dmel_CG10367(Hmgcr)
CEL: F08F8.2
OSA: 4347443
SCE: YLR450W(HMG2) YML075C(HMG1)
AGO: AGOS_AER152W
CGR: CAGL0L11506g
SPO: SPCC162.09c(hmg1)
ANI: AN3817.2
AFM: AFUA_1G11230 AFUA_2G03700
AOR: AO090103000311 AO090120000217
CNE: CNF04830
UMA: UM03014.1
ECU: ECU10_1720
DDI: DDB_0191125(hmgA) DDB_0215357(hmgB)
TBR: Tb927.6.4540
TCR: 506831.40 509167.20
LMA: LmjF30.3190
VCH: VCA0723
VCO: VC0395_0662
VVU: VV2_0117
VVY: VVA0625
VPA: VPA0968
VFI: VFA0841
PAT: Patl_0427
CBU: CBU_0030 CBU_0610
CBD: COXBU7E912_0151 COXBU7E912_0622(hmgA)
TCX: Tcr_1717
DNO: DNO_0797
CVI: CV_1806
SUS: Acid_5728 Acid_6132
SAU: SA2333(mvaA)
SAV: SAV2545(mvaA)
SAM: MW2466(mvaA)
SAB: SAB2419c(mvaA)
SEP: SE2109
LWE: lwe0819(mvaA)
LLA: L10433(mvaA)
LLC: LACR_1664
LLM: llmg_0931(mvaA)
SPY: SPy_0880(mvaS.1)
SPM: spyM18_0941(mvaS1)
SPG: SpyM3_0599(mvaS.1)
SPS: SPs1254
SPH: MGAS10270_Spy0744
SPI: MGAS10750_Spy0778
SPJ: MGAS2096_Spy0758
SPK: MGAS9429_Spy0742
SPA: M6_Spy0703
SPN: SP_1726
SAG: SAG1317
SAN: gbs1387
STC: str0576(mvaA)
STL: stu0576(mvaA)
STE: STER_0620
SSA: SSA_0337(mvaA)
LPL: lp_0447(mvaA)
LJO: LJ1608
LSL: LSL_0224
LBR: LVIS_0450
LGA: LGAS_1373
EFA: EF1364
NFA: nfa22110
BGA: BG0708(mvaA)
SRU: SRU_2422
FPS: FP2341
MMP: MMP0087(hmgA)
MMQ: MmarC5_1589
MAC: MA3073(hmgA)
MBA: Mbar_A1972
MMA: MM_0335
MBU: Mbur_1098
MHU: Mhun_3004
MEM: Memar_2365
MBN: Mboo_0137
MTH: MTH562
MST: Msp_0584(hmgA)
MSI: Msm_0227
MKA: MK0355(HMG1)
AFU: AF1736(mvaA)
HAL: VNG1875G(mvaA)
HMA: rrnAC3412(mvaA)
HWA: HQ3215A(hmgR)
NPH: NP0368A(mvaA_2) NP2422A(mvaA_1)
TAC: Ta0406m
TVO: TVN1168
PTO: PTO1143
PAB: PAB2106(mvaA)
PFU: PF1848
TKO: TK0914
RCI: RCIX1027(hmgA) RCIX376(hmgA)
APE: APE_1869
IHO: Igni_0476
HBU: Hbut_1531
SSO: SSO0531
STO: ST1352
SAI: Saci_1359
PAI: PAE2182
PIS: Pisl_0814
PCL: Pcal_1085
PAS: Pars_0796
例示的なメバロン酸キナーゼ核酸およびポリペプチド

HSA: 4598(MVK)
MCC: 707645(MVK)
MMU: 17855(Mvk)
RNO: 81727(Mvk)
CFA: 486309(MVK)
BTA: 505792(MVK)
GGA: 768555(MVK)
DRE: 492477(zgc:103473)
SPU: 585785(LOC585785)
DME: Dmel_CG33671
OSA: 4348331
SCE: YMR208W(ERG12)
AGO: AGOS_AER335W
PIC: PICST_40742(ERG12)
CGR: CAGL0F03861g
SPO: SPAC13G6.11c
MGR: MGG_06946
ANI: AN3869.2
AFM: AFUA_4G07780
AOR: AO090023000793
CNE: CNK01740
ECU: ECU09_1780
DDI: DDBDRAFT_0168621
TET: TTHERM_00637680
TBR: Tb927.4.4070
TCR: 436521.9 509237.10
LMA: LmjF31.0560
CBU: CBU_0608 CBU_0609
CBD: COXBU7E912_0620(mvk)
LPN: lpg2039
LPF: lpl2017
LPP: lpp2022
BBA: Bd1027(lmbP) Bd1630(mvk)
MXA: MXAN_5019(mvk)
OIH: OB0225
SAU: SA0547(mvaK1)
SAV: SAV0590(mvaK1)
SAM: MW0545(mvaK1)
SAR: SAR0596(mvaK1)
SAS: SAS0549
SAC: SACOL0636(mvk)
SAB: SAB0540(mvaK1)
SAA: SAUSA300_0572(mvk)
SAO: SAOUHSC_00577
SEP: SE0361
SER: SERP0238(mvk)
SHA: SH2402(mvaK1)
SSP: SSP2122
LMO: lmo0010
LMF: LMOf2365_0011
LIN: lin0010
LWE: lwe0011(mvk)
LLA: L7866(yeaG)
LLC: LACR_0454
LLM: llmg_0425(mvk)
SPY: SPy_0876(mvaK1)
SPZ: M5005_Spy_0682(mvaK1)
SPM: spyM18_0937(mvaK1)
SPG: SpyM3_0595(mvaK1)
SPS: SPs1258
SPH: MGAS10270_Spy0740(mvaK1)
SPI: MGAS10750_Spy0774(mvaK1)
SPJ: MGAS2096_Spy0753(mvaK1)
SPK: MGAS9429_Spy0737(mvaK1)
SPF: SpyM51126(mvaK1)
SPA: M6_Spy0699
SPB: M28_Spy0662(mvaK1)
SPN: SP_0381
SPR: spr0338(mvk)
SPD: SPD_0346(mvk)
SAG: SAG1326
SAN: gbs1396
SAK: SAK_1357(mvk)
SMU: SMU.181
STC: str0559(mvaK1)
STL: stu0559(mvaK1)
STE: STER_0598
SSA: SSA_0333(mvaK1)
SSU: SSU05_0289
SSV: SSU98_0285
SGO: SGO_0239(mvk)
LPL: lp_1735(mvaK1)
LJO: LJ1205
LAC: LBA1167(mvaK)
LSA: LSA0908(mvaK1)
LSL: LSL_0685(eRG)
LDB: Ldb0999(mvk)
LBU: LBUL_0906
LBR: LVIS_0858
LCA: LSEI_1491
LGA: LGAS_1033
LRE: Lreu_0915
PPE: PEPE_0927
EFA: EF0904(mvk)
OOE: OEOE_1100
LME: LEUM_1385
NFA: nfa22070
BGA: BG0711
BAF: BAPKO_0732
FPS: FP0313
MMP: MMP1335
MAE: Maeo_0775
MAC: MA0602(mvk)
MBA: Mbar_A1421
MMA: MM_1762
MBU: Mbur_2395
MHU: Mhun_2890
MEM: Memar_1812
MBN: Mboo_2213
MST: Msp_0858(mvk)
MSI: Msm_1439
MKA: MK0993(ERG12)
HAL: VNG1145G(mvk)
HMA: rrnAC0077(mvk)
HWA: HQ2925A(mvk)
NPH: NP2850A(mvk)
PTO: PTO1352
PHO: PH1625
PAB: PAB0372(mvk)
PFU: PF1637(mvk)
TKO: TK1474
RCI: LRC399(mvk)
APE: APE_2439
HBU: Hbut_0877
SSO: SSO0383
STO: ST2185
SAI: Saci_2365(mvk)
MSE: Msed_1602
PAI: PAE3108
PIS: Pisl_0467
PCL: Pcal_1835
例示的なホスホメバロン酸キナーゼ核酸およびポリペプチド

HSA: 10654(PMVK)
PTR: 457350(PMVK)
MCC: 717014(PMVK)
MMU: 68603(Pmvk)
CFA: 612251(PMVK)
BTA: 513533(PMVK)
DME: Dmel_CG10268
ATH: AT1G31910
OSA: 4332275
SCE: YMR220W(ERG8)
AGO: AGOS_AER354W
PIC: PICST_52257(ERG8)
CGR: CAGL0F03993g
SPO: SPAC343.01c
MGR: MGG_05812
ANI: AN2311.2
AFM: AFUA_5G10680
AOR: AO090010000471
CNE: CNM00100
UMA: UM00760.1
DDI: DDBDRAFT_0184512
TBR: Tb09.160.3690
TCR: 507913.20 508277.140
LMA: LmjF15.1460
MXA: MXAN_5017
OIH: OB0227
SAU: SA0549(mvaK2)
SAV: SAV0592(mvaK2)
SAM: MW0547(mvaK2)
SAR: SAR0598(mvaK2)
SAS: SAS0551
SAC: SACOL0638
SAB: SAB0542(mvaK2)
SAA: SAUSA300_0574
SAO: SAOUHSC_00579
SAJ: SaurJH9_0615
SEP: SE0363
SER: SERP0240
SHA: SH2400(mvaK2)
SSP: SSP2120
LMO: lmo0012
LMF: LMOf2365_0013
LIN: lin0012
LWE: lwe0013
LLA: L10014(yebA)
LLC: LACR_0456
LLM: llmg_0427
SPY: SPy_0878(mvaK2)
SPZ: M5005_Spy_0684(mvaK2)
SPM: spyM18_0939
SPG: SpyM3_0597(mvaK2)
SPS: SPs1256
SPH: MGAS10270_Spy0742(mvaK2)
SPI: MGAS10750_Spy0776(mvaK2)
SPJ: MGAS2096_Spy0755(mvaK2)
SPK: MGAS9429_Spy0739(mvaK2)
SPF: SpyM51124(mvaK2)
SPA: M6_Spy0701
SPB: M28_Spy0664(mvaK2)
SPN: SP_0383
SPR: spr0340(mvaK2)
SPD: SPD_0348(mvaK2)
SAG: SAG1324
SAN: gbs1394
SAK: SAK_1355
SMU: SMU.938
STC: str0561(mvaK2)
STL: stu0561(mvaK2)
STE: STER_0600
SSA: SSA_0335(mvaK2)
SSU: SSU05_0291
SSV: SSU98_0287
SGO: SGO_0241
LPL: lp_1733(mvaK2)
LJO: LJ1207
LAC: LBA1169
LSA: LSA0906(mvaK2)
LSL: LSL_0683
LDB: Ldb0997(mvaK)
LBU: LBUL_0904
LBR: LVIS_0860
LCA: LSEI_1092
LGA: LGAS_1035
LRE: Lreu_0913
PPE: PEPE_0925
EFA: EF0902
NFA: nfa22090
BGA: BG0710
BAF: BAPKO_0731
NPH: NP2852A
SSO: SSO2988
STO: ST0978
SAI: Saci_1244
例示的なジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ核酸およびポリペプチド

HSA: 4597(MVD)
PTR: 468069(MVD)
MCC: 696865(MVD)
MMU: 192156(Mvd)
RNO: 81726(Mvd)
CFA: 489663(MVD)
GGA: 425359(MVD)
DME: Dmel_CG8239
SCE: YNR043W(MVD1)
AGO: AGOS_AGL232C
PIC: PICST_90752
CGR: CAGL0C03630g
SPO: SPAC24C9.03
MGR: MGG_09750
ANI: AN4414.2
AFM: AFUA_4G07130
AOR: AO090023000862
CNE: CNL04950
UMA: UM05179.1
DDI: DDBDRAFT_0218058
TET: TTHERM_00849200
TBR: Tb10.05.0010 Tb10.61.2745
TCR: 507993.330 511281.40
LMA: LmjF18.0020
CBU: CBU_0607(mvaD)
CBD: COXBU7E912_0619(mvaD)
LPN: lpg2040
LPF: lpl2018
LPP: lpp2023
TCX: Tcr_1734
DNO: DNO_0504(mvaD)
BBA: Bd1629
MXA: MXAN_5018(mvaD)
OIH: OB0226
SAU: SA0548(mvaD)
SAV: SAV0591(mvaD)
SAM: MW0546(mvaD)
SAR: SAR0597(mvaD)
SAS: SAS0550
SAC: SACOL0637(mvaD)
SAB: SAB0541(mvaD)
SAA: SAUSA300_0573(mvaD)
SAO: SAOUHSC_00578
SAJ: SaurJH9_0614
SAH: SaurJH1_0629
SEP: SE0362
SER: SERP0239(mvaD)
SHA: SH2401(mvaD)
SSP: SSP2121
LMO: lmo0011
LMF: LMOf2365_0012(mvaD)
LIN: lin0011
LWE: lwe0012(mvaD)
LLA: L9089(yeaH)
LLC: LACR_0455
LLM: llmg_0426(mvaD)
SPY: SPy_0877(mvaD)
SPZ: M5005_Spy_0683(mvaD)
SPM: spyM18_0938(mvd)
SPG: SpyM3_0596(mvaD)
SPS: SPs1257
SPH: MGAS10270_Spy0741(mvaD)
SPI: MGAS10750_Spy0775(mvaD)
SPJ: MGAS2096_Spy0754(mvaD)
SPK: MGAS9429_Spy0738(mvaD)
SPF: SpyM51125(mvaD)
SPA: M6_Spy0700
SPB: M28_Spy0663(mvaD)
SPN: SP_0382
SPR: spr0339(mvd1)
SPD: SPD_0347(mvaD)
SAG: SAG1325(mvaD)
SAN: gbs1395
SAK: SAK_1356(mvaD)
SMU: SMU.937
STC: str0560(mvaD)
STL: stu0560(mvaD)
STE: STER_0599
SSA: SSA_0334(mvaD)
SSU: SSU05_0290
SSV: SSU98_0286
SGO: SGO_0240(mvaD)
LPL: lp_1734(mvaD)
LJO: LJ1206
LAC: LBA1168(mvaD)
LSA: LSA0907(mvaD)
LSL: LSL_0684
LDB: Ldb0998(mvaD)
LBU: LBUL_0905
LBR: LVIS_0859
LCA: LSEI_1492
LGA: LGAS_1034
LRE: Lreu_0914
PPE: PEPE_0926
EFA: EF0903(mvaD)
LME: LEUM_1386
NFA: nfa22080
BBU: BB0686
BGA: BG0709
BAF: BAPKO_0730
GFO: GFO_3632
FPS: FP0310(mvaD)
HAU: Haur_1612
HAL: VNG0593G(dmd)
HMA: rrnAC1489(dmd)
HWA: HQ1525A(mvaD)
NPH: NP1580A(mvaD)
PTO: PTO0478 PTO1356
SSO: SSO2989
STO: ST0977
SAI: Saci_1245(mvd)
MSE: Msed_1576
例示的なイソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）核酸およびポリペプチド

メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクムgi|2621082
メタノコックス・ヤンナスキイDSM 2661 gi|1590842 ;
メタノカルドコックス・ヤンナスキイgi|1590842
メタノテルモバクテル・テルモアウトトロフィクムgi|2621082

ピクロフィルス・トルリヅスDSM9790 (IG-57) gi|48477569
ピロコックス・アビシイgi|14520758
ピロコックス・ホリコシイOT3 gi|3258052
アルカエログロブス・フンギヅスDSM4304 gi|2648231
例示的なイソペンテニル-二リン酸デルタ-イソメラーゼ(IDI) 核酸およびポリペプチド

HSA: 3422(IDI1) 91734(IDI2)
PTR: 450262(IDI2) 450263(IDI1)
MCC: 710052(LOC710052) 721730(LOC721730)
MMU: 319554(Idi1)
RNO: 89784(Idi1)
GGA: 420459(IDI1)
XLA: 494671(LOC494671)
XTR: 496783(idi2)
SPU: 586184(LOC586184)
CEL: K06H7.9(idi-1)
ATH: AT3G02780(IPP2)
OSA: 4338791 4343523
CME: CMB062C
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CBD: COXBU7E912_0619(mvaD)
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HHA: Hhal_1623
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DVU: DVU1679(idi)
DDE: Dde_1991
LIP: LI1134
BBA: Bd1626
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RPR: RP452
RTY: RT0439(idi)
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RBE: RBE_0731(fni)
RAK: A1C_04190
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RRI: A1G_04195
MLO: mlr6371
RET: RHE_PD00245(ypd00046)
XAU: Xaut_4134
SIL: SPO0131
SIT: TM1040_3442
RSP: RSP_0276
RSH: Rsph17029_1919
RSQ: Rsph17025_1019
JAN: Jann_0168
RDE: RD1_0147(idi)
DSH: Dshi_3527
BSU: BG11440(ypgA)
BAN: BA1520
BAR: GBAA1520
BAA: BA_2041
BAT: BAS1409
BCE: BC1499
BCA: BCE_1626
BCZ: BCZK1380(fni)
BCY: Bcer98_1222
BTK: BT9727_1381(fni)
BTL: BALH_1354
BLI: BL02217(fni)
BLD: BLi02426
BAY: RBAM_021020(fni)
BPU: BPUM_2020(fni)
OIH: OB0537
SAU: SA2136(fni)
SAV: SAV2346(fni)
SAM: MW2267(fni)
SAR: SAR2431(fni)
SAS: SAS2237
SAC: SACOL2341(fni)
SAB: SAB2225c(fni)
SAA: SAUSA300_2292(fni)
SAO: SAOUHSC_02623
SEP: SE1925
SER: SERP1937(fni-2)
SHA: SH0712(fni)
SSP: SSP0556
LMO: lmo1383
LMF: LMOf2365_1402(fni)
LIN: lin1420
LWE: lwe1399(fni)
LLA: L11083(yebB)
LLC: LACR_0457
LLM: llmg_0428(fni)
SPY: SPy_0879
SPZ: M5005_Spy_0685
SPM: spyM18_0940
SPG: SpyM3_0598
SPS: SPs1255
SPH: MGAS10270_Spy0743
SPI: MGAS10750_Spy0777
SPJ: MGAS2096_Spy0756
SPK: MGAS9429_Spy0740
SPF: SpyM51123(fni)
SPA: M6_Spy0702
SPB: M28_Spy0665
SPN: SP_0384
SPR: spr0341(fni)
SPD: SPD_0349(fni)
SAG: SAG1323
SAN: gbs1393
SAK: SAK_1354(fni)
SMU: SMU.939
STC: str0562(idi)
STL: stu0562(idi)
STE: STER_0601
SSA: SSA_0336
SGO: SGO_0242
LPL: lp_1732(idi1)
LJO: LJ1208
LAC: LBA1171
LSA: LSA0905(idi)
LSL: LSL_0682
LDB: Ldb0996(fni)
LBU: LBUL_0903
LBR: LVIS_0861
LCA: LSEI_1493
LGA: LGAS_1036
LRE: Lreu_0912
EFA: EF0901
OOE: OEOE_1103
STH: STH1674
CBE: Cbei_3081
DRM: Dred_0474
SWO: Swol_1341
MTA: Moth_1328
MTU: Rv1745c(idi)
MTC: MT1787(idi)
MBO: Mb1774c(idi)
MBB: BCG_1784c(idi)
MPA: MAP3079c
MAV: MAV_3894(fni)
MSM: MSMEG_1057(fni) MSMEG_2337(fni)
MUL: MUL_0380(idi2)
MVA: Mvan_1582 Mvan_2176
MGI: Mflv_1842 Mflv_4187
MMC: Mmcs_1954
MKM: Mkms_2000
MJL: Mjls_1934
CGL: NCgl2223(cgl2305)
CGB: cg2531(idi)
CEF: CE2207
CDI: DIP1730(idi)
NFA: nfa19790 nfa22100
RHA: RHA1_ro00239
SCO: SCO6750(SC5F2A.33c)
SMA: SAV1663(idi)
LXX: Lxx23810(idi)
CMI: CMM_2889(idiA)
AAU: AAur_0321(idi)
PAC: PPA2115
FRA: Francci3_4188
FRE: Franean1_5570
FAL: FRAAL6504(idi)
KRA: Krad_3991
SEN: SACE_2627(idiB_2) SACE_5210(idi)
STP: Strop_4438
SAQ: Sare_4564 Sare_4928
RXY: Rxyl_0400
BBU: BB0684
BGA: BG0707
SYN: sll1556
SYC: syc2161_c
SYF: Synpcc7942_1933
CYA: CYA_2395(fni)
CYB: CYB_2691(fni)
TEL: tll1403
ANA: all4591
AVA: Ava_2461 Ava_B0346
TER: Tery_1589
SRU: SRU_1900(idi)
CHU: CHU_0674(idi)
GFO: GFO_2363(idi)
FJO: Fjoh_0269
FPS: FP1792(idi)
CTE: CT0257
CCH: Cag_1445
CPH: Cpha266_0385
PVI: Cvib_1545
PLT: Plut_1764
RRS: RoseRS_2437
RCA: Rcas_2215
HAU: Haur_4687
DRA: DR_1087
DGE: Dgeo_1381
TTH: TT_P0067
TTJ: TTHB110
MJA: MJ0862
MMP: MMP0043
MMQ: MmarC5_1637
MMX: MmarC6_0906
MMZ: MmarC7_1040
MAE: Maeo_1184
MVN: Mevan_1058
MAC: MA0604(idi)
MBA: Mbar_A1419
MMA: MM_1764
MBU: Mbur_2397
MTP: Mthe_0474
MHU: Mhun_2888
MLA: Mlab_1665
MEM: Memar_1814
MBN: Mboo_2211
MTH: MTH48
MST: Msp_0856(fni)
MSI: Msm_1441
MKA: MK0776(lldD)
AFU: AF2287
HAL: VNG1818G(idi) VNG6081G(crt_1) VNG6445G(crt_2) VNG7060 VNG7149
HMA: rrnAC3484(idi)
HWA: HQ2772A(idiA) HQ2847A(idiB)
NPH: NP0360A(idiB_1) NP4826A(idiA) NP5124A(idiB_2)
TAC: Ta0102
TVO: TVN0179
PTO: PTO0496
PHO: PH1202
PAB: PAB1662
PFU: PF0856
TKO: TK1470
RCI: LRC397(fni)
APE: APE_1765.1
SMR: Smar_0822
IHO: Igni_0804
HBU: Hbut_0539
SSO: SSO0063
STO: ST2059
SAI: Saci_0091
MSE: Msed_2136
PAI: PAE0801
PIS: Pisl_1093
PCL: Pcal_0017
PAS: Pars_0051
TPE: Tpen_0272
例示的なイソプレンシンターゼ 核酸およびポリペプチド

Genbankアクセッション番号
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241

【図1】

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【図2】

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【図3A】

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【図3B】

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【図3C】

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【図4】

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【図5A】

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【図5B】

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【図5C】

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【図6】

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【図7A】

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【図7B】

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【図7C】

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【図8A】

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【図8B】

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【図8C】

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【図8D】

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【図9A】

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【図9B】

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【図10A】

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【図10B】

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【図10C】

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【図11】

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【図12A】

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【図12B】

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【図12C】

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【図13】

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【図14】

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【図15A】

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【図15B】

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【図15C】

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【図16】

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【図17】

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【図18A】

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【図18A2】

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【図18B】

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【図18C】

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【図18D】

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【図18E】

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【図18F】

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【図18G】

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【図19A】

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【図19B】

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【図20A】

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【図20B】

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【図21】

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【図22A】

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【図22B】

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【図22C】

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【図22D】

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【図23A】

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【図23B】

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【図23C】

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【図23D】

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【図23E】

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【図23F】

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【図23G】

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【図23H】

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【図24】

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【図25A】

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【図25B】

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【図25C】

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【図25D】

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【図26】

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【図27A】

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【図27B】

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【図27C】

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【図27D】

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【図28】

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【図29A】

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【図29B】

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【図29C】

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【図29D】

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【図30】

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【図31A】

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【図31B】

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【図32】

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【図33A】

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【図33B】

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【図33C】

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【図34】

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【図35A】

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【図35B】

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【図35C】

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【図36】

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【図37A】

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【図37B】

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【図37C】

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【図38】

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【図39A】

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【図39B】

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【図39C】

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【図40】

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【図41A】

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【図41B】

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【図41C】

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【図42】

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【図43A】

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【図43B】

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【図43C】

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【図44】

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【図45A】

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【図45B】

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【図45C】

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【図45D】

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【図46A】

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【図46B】

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【図46C】

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【図46D】

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【図46E】

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【図47A】

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【図47B】

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【図47C】

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【図47D】

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【図48A】

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【図48B】

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【図48C】

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【図49A】

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【図49B】

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【図49C】

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【図50】

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【図51A】

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【図51B】

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【図51C】

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【図52】

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【図53A】

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【図53B】

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【図54】

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【図55】

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【図56】

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【図57】

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【図58】

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【図59】

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【図60A】

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【図60B】

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【図60C】

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【図61A】

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【図61B】

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【図61C】

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【図62A】

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【図62B】

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【図62C】

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【図63A】

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【図63B】

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【図63C】

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【図64A】

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【図64B】

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【図64C】

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【図65A】

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【図65B】

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【図65C】

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【図66A】

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【図66B】

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【図66C】

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【図67A】

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【図67B】

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【図67C】

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【図68】

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【図69】

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【図70】

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【図71】

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【図72】

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【図73】

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【図74】

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【図75A】

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【図75B】

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【図76A】

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【図76B】

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【図77】

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【図78A】

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【図78B】

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【図78C】

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【図79A】

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【図79B】

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【図79C】

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【図80A】

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【図80B】

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【図81】

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【図82】

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【図83】

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【図84】

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【図85】

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【図86A】

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【図86B】

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【図87A】

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【図87B】

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【図87C】

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【図87D】

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【図88A】

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【図88B】

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【図89】

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【図90】

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【図91】

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【図92A】

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【図92B】

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【図92C】

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【図93】

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【図94】

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【図95】

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【図96】

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【図97】

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【図98】

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【図99】

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【図100】

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【図101】

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【図102】

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【図103A】

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【図103B】

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【図103C】

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【図104】

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【図105】

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【図106】

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【図107】

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【図108A】

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【図108B】

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【図108C】

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【図109】

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【図110A】

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【図110B】

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【図111A】

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【図111B】

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【図111C】

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【図112A】

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【図112B】

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【図112C】

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【図113A】

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【図113B】

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【図113C】

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【図114A】

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【図114B】

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【図114C】

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【図115A】

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【図115B】

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【図115C】

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【図115D】

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【図116】

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【図117】

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【図118】

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【図119】

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【図121】

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【図122】

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【図123】

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【図124】

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【図125】

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【図126】

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【図127】

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【図128】

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【図129】

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【図130】

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【図131】

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【図132】

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【図133】

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【図134】

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【図135】

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【図136】

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【図137A】

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【図137C】

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【図140】

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【図142A】

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【図142B】

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【図143】

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【図145A】

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【図146A】

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【図153A】

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【図156A】

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【図157】

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【図158】

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【図159A】

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【図160A】

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【図161A】

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【図162】

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【図163A】

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【図164A】

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【図165】

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【図166】

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【図167A】

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【図167C】

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【図168】

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【図169】

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【図170】

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【図171A】

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【図171B】

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【図172A】

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【図173】

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【図174A】

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【図175】

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【図176】

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【図178】

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【図179A】

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【図179B】

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【図180】

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【図181A】

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【図181B】

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【図182】

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【図183A】

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【図184A】

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【図186】

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【図187A】

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【図188】

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【図189】

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【図190】

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【図191】

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【図192】

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【図193】

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【図194】

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【図195】

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【図196】

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【図197】

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