特許 5794736 迅速取込みのためのインスリン製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5794736

(24)【登録日】2015年8月21日

(45)【発行日】2015年10月14日

(54)【発明の名称】迅速取込みのためのインスリン製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/28 20060101AFI20150928BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20150928BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20150928BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/26

   A61K9/08

   A61K47/18

   A61K47/12

   A61K47/36

   A61K47/22

   A61K47/20

   A61P3/10

   A61K9/14

【請求項の数】29

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2011-553081(P2011-553081)

(86)(22)【出願日】2010年3月3日

(65)【公表番号】特表2012-519695(P2012-519695A)

(43)【公表日】2012年8月30日

(86)【国際出願番号】US2010026073

(87)【国際公開番号】WO2010102020

(87)【国際公開日】20100910

【審査請求日】2013年2月28日

(31)【優先権主張番号】12/397,219

(32)【優先日】2009年3月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505390727

【氏名又は名称】バイオデル， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】スタイナー， ソロモン エス．

(72)【発明者】

【氏名】ポール， ロデリク

(72)【発明者】

【氏名】リー， ミン

(72)【発明者】

【氏名】ハウザー， ロバート

【審査官】 深草 亜子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００２／０７６４９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０００−５０２９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０８４２３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０４１４８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／１２１２５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５２８９０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 International Journal of Pharmaceutics，２００３年，Vol.254，pp.271-280

【文献】 Pharmaceutical Research，１９９１年，Vol.8 , No.7，pp.925-929

【文献】 International Journal of Pharmaceutics，２００１年，Vol.217，pp.71-78

【文献】 Journal of Colloid and Interface Science，１９８８年，Vol.122 , No.2，pp.557-566

【文献】 Journal of Pharmaceutical Sciences，１９８３年，Vol.72 , No.1，pp.75-78

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／２８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

インスリン、溶解剤及び亜鉛キレート剤を含むインスリン製剤であって、該製剤のｐＨはｐＨ７より大きくｐＨ７．６以下であり、該製剤は澄明水溶液であり、該インスリンは、該溶解剤および該亜鉛キレート剤の両方なしで投与される該インスリンに比較して、上皮細胞を経る取り込みおよび輸送の速度が増強されている、製剤。

【請求項2】

前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、クエン酸三ナトリウム（ＴＳＣ）、アルギン酸、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ＣＤＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）からなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。

【請求項3】

前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項２に記載の製剤。

【請求項4】

前記溶解剤が酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、アスパラギン酸、マレイン酸、フマル酸及びアジピン酸からなる群から選択される酸又はその塩である、請求項１に記載の製剤。

【請求項5】

前記溶解剤がクエン酸又はクエン酸ナトリウムである、請求項４に記載の製剤。

【請求項6】

前記ｐＨが７より大きく７．５以下である、請求項１に記載の製剤。

【請求項7】

インスリン溶液のｐＨをｐＨ４から生理的ｐＨに上昇させることにより調製される、請求項１に記載の製剤。

【請求項8】

前記インスリンがヒトインスリン、インスリン類似体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。

【請求項9】

前記インスリンが組換えヒトインスリンである、請求項８に記載の製剤。

【請求項10】

インスリン、溶解剤及び亜鉛キレート剤を含むインスリン製剤であって、該溶解剤が塩であり、該製剤のｐＨはｐＨ７より大きくｐＨ７．６以下であり、該製剤は澄明水溶液であり、該インスリンは、該溶解剤および該亜鉛キレート剤の両方なしで投与される該インスリンに比較して、上皮細胞を経る取り込みおよび輸送の速度が増強されている、製剤。

【請求項11】

前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、クエン酸三ナトリウム（ＴＳＣ）、アルギン酸、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ＣＤＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）からなる群から選択される、請求項１０に記載の製剤。

【請求項12】

前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項１０に記載の製剤。

【請求項13】

前記溶解剤が酢酸塩、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩及びアジピン酸塩、並びにＩ族金属又はＩＩ族金属の塩からなる群から選択される塩である、請求項１０に記載の製剤。

【請求項14】

前記溶解剤がアスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸及びアジピン酸のナトリウム塩又はカリウム塩からなる群から選択される、請求項１３に記載の製剤。

【請求項15】

前記溶解剤がクエン酸ナトリウムである、請求項１３に記載の製剤。

【請求項16】

前記ｐＨが７より大きく７．５以下である、請求項１０に記載の製剤。

【請求項17】

前記インスリンがヒトインスリン、インスリン類似体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の製剤。

【請求項18】

前記インスリンが組換えヒトインスリンである、請求項１０に記載の製剤。

【請求項19】

前記インスリンが第１の容器に入った乾燥粉末として提供され、前記キレート剤及び溶解剤の少なくとも１つが希釈剤を含有する第２の容器に入った状態で提供される、請求項１に記載の製剤。

【請求項20】

前記インスリンが第１の容器に入った乾燥粉末として提供され、前記キレート剤及び溶解剤の少なくとも１つが希釈剤を含有する第２の容器に入った状態で提供される、請求項１０に記載の製剤。

【請求項21】

糖尿病の治療用の薬学的に許容される凍結製剤として提供される、請求項１に記載の製剤。

【請求項22】

糖尿病の治療用の薬学的に許容される凍結製剤として提供される、請求項１０に記載の製剤。

【請求項23】

４℃での澄明水溶液として提供される、請求項１に記載の製剤。

【請求項24】

４℃での澄明水溶液として提供される、請求項１０に記載の製剤。

【請求項25】

上皮細胞を経るインスリンの取込み及び輸送を増大させるのに有効な量の溶解剤及び亜鉛キレート剤とを含む、有効量の注射用インスリン製剤を含み、該製剤のｐＨはｐＨ７より大きくｐＨ７．６以下であり、該製剤は澄明水溶液であり、該インスリンは、該溶解剤および該亜鉛キレート剤の両方なしで投与される該インスリンに比較して、上皮細胞を経る取り込みおよび輸送の速度が増強されている、糖尿病個体を治療するための組成物。

【請求項26】

前記ＩＩ族金属は、マグネシウム（Ｍｇ）である、請求項１３に記載の製剤。

【請求項27】

前記インスリン類似体は、インスリンリプロ、インスリングラルギン、インスリンアスペルト、インスリングルリシン、およびインスリンデテミルを含む、請求項８に記載の製剤。

【請求項28】

前記インスリン類似体は、インスリンリプロ、インスリングラルギン、インスリンアスペルト、インスリングルリシン、およびインスリンデテミルを含む、請求項１７に記載の製剤。

【請求項29】

インスリン、溶解剤及び亜鉛キレート剤を含むインスリン製剤であって、該製剤は生理的ｐＨを有し、該製剤は澄明水溶液であり、該製剤のｐＨはｐＨ６．８〜７の間ではなく、該インスリンは、該溶解剤および該亜鉛キレート剤の両方なしで投与される該インスリンに比較して、上皮細胞を経る取り込みおよび輸送の速度が増強されている、製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、注射用速効型薬物送達インスリン製剤の一般的分野に属する。

【背景技術】

【0002】

糖尿病の概要
グルコースは、エネルギーを生み出し、生命を維持するために身体のすべての細胞により使用されている単糖である。ヒトは、生き続けるために常時それらの血液中の最小限のレベルのグルコースを必要とする。身体が血糖を産生する主な方法は、食物の消化による。人がこのグルコースを食物の消化により得ていない場合、グルコースは、組織中の貯蔵物から産生され、肝臓により放出される。身体のグルコースレベルは、インスリンにより調節されている。インスリンは、膵臓により自然に分泌されるペプチドホルモンである。インスリンは、グルコースが生命維持に必要なエネルギー源を供給するために体細胞に入ることを助ける。

【0003】

健常者が食事を始めるとき、膵臓が第１相インスリン分泌と呼ばれるインスリンの自然スパイク（ｎａｔｕｒａｌ ｓｐｉｋｅ）を分泌する。第１相インスリン分泌は、食物の消化により血液中に入ってくるグルコースを処理するのに十分なインスリンを供給することに加えて、食物の消化が起こっている間にグルコースを産生することを停止させるための肝臓へのシグナルとして作用する。肝臓がグルコースを産生しておらず、消化によるグルコースを処理するのに十分なさらなるインスリンが存在するため、健常者の血糖値は比較的に一定のままであり、それらの血糖値は高くなりすぎることはない。

【0004】

糖尿病は、異常に高いレベルの血糖及び不十分なレベルのインスリンによって特徴づけられる。２つの主要なタイプの糖尿病、すなわち１型と２型が存在する。１型糖尿病において、身体はインスリンを産生しない。２型糖尿病の初期段階において、膵臓はインスリンを産生するが、身体は適切な時点にインスリンを産生しないか、又は体細胞はインスリンを無視する（インスリン抵抗性として公知の状態）。

【0005】

任意の他の症状が存在する前でさえ、２型糖尿病の最初の影響の１つは、食事誘発性の第１相インスリン分泌の喪失である。第１相インスリン分泌が存在しない場合、肝臓は、グルコースを産生することを停止させるそのシグナルを受けない。結果として、肝臓は、身体が食物の消化により新たなグルコースを産生し始めるときにグルコースを産生し続ける。結果として、糖尿病患者の血糖値は、高血糖として公知の状態である、食後に高すぎる状態になる。高血糖は、グルコースを血液中の特定のタンパク質に異常に結合させ、小血管の完全性を維持するという正常な機能を果たすタンパク質の能力を妨害する。毎回の食事の後に起こる高血糖により、毛細血管（ｔｉｎｙ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ）は、最終的に崩壊し、漏れる。高血糖の長期有害作用は、失明、腎臓機能の喪失、神経損傷及び感覚の喪失並びに四肢の切断を必要とする可能性がある末梢における不十分な循環を含む。

【0006】

食後２時間から３時間の間に、未治療糖尿病患者の血糖は非常に高くなるため、膵臓は異常に大量のインスリンを分泌するシグナルを受ける。初期２型糖尿病を有する患者において、膵臓は、まだ反応し、この大量のインスリンを分泌することができる。しかし、これは、消化がほぼ終了し、血糖値が低下し始めるときに起こる。この異常に大量のインスリンは、２つの好ましくない作用を有する。第１に、それは、既に障害が起きた膵臓に対して過度の極端な要求を課し、これが、その急速な悪化につながり、最終的に膵臓がインスリンを産生することをできなくする可能性がある。第２に、消化後のあまりにも多くのインスリンは、体重増加をもたらし、これが、疾患状態をさらに悪化させる可能性がある。

【0007】

糖尿病の現在の治療法及びそれらの限界
１型糖尿病患者はインスリンを産生しないので、１型糖尿病の主要な治療法は、日常の集中的なインスリン療法である。２型糖尿病の治療法は、一般的に食事及び運動の管理から開始する。短期間では有益であるが、食事及び運動のみによる治療は、２型糖尿病を有する大多数の患者に対する有効な長期の解決策ではない。食事及び運動がもはや十分でない場合、治療は、種々の非インスリン経口薬から始める。これらの経口薬は、膵臓により産生されるインスリンの量を増加させることにより、インスリン感受性細胞の感受性を増加させることにより、肝臓のグルコース産出量を減少させることにより、又はこれらのメカニズムのある組合せにより、作用する。これらの治療法は、疾患を効果的に管理するそれらの能力が限られており、一般的に、体重増加及び高血圧などの重大な副作用を有する。非インスリン療法に限界があるため、２型糖尿病を有する多くの患者は、時間の経過とともに悪化し、それらの代謝を維持するためのインスリン療法を最終的に必要とする。

【0008】

インスリン療法は、糖尿病を治療するために８０年間以上にわたり使用されている。この療法は、毎日インスリンの数回の注射を適用することを通常必要とする。これらの注射は、１日１回又は２回の長時間作用性基礎注射及び食事時の迅速作用性インスリンの注射を適用することからなる。この治療方法は、有効と認められているが、限界を有する。第１に、不便さと針の痛みのため、患者は一般的に自分でインスリンを注射することを好まない。結果として、患者は、処方された治療方法を十分に遵守しない傾向があり、しばしば薬物治療を不適切に受けることとなる。

【0009】

より重要なことに、適切に投与されている場合でさえ、インスリン注射は、インスリンの自然の時間−作用プロファイルを再現しない。特に、糖尿病を有さない人における第１相インスリン分泌の自然スパイクは、食物からのグルコースが血液中に入ってから数分以内の血中インスリンレベルの上昇をもたらす。これに反して、注射されたインスリンは、血液に徐々に入り、ピークのインスリンレベルは、レギュラーヒトインスリンの注射後８０〜１００分以内に生じる。

【0010】

可能な解決策は、食物を食べる直前に糖尿病患者の静脈内にインスリンを直接注射することである。インスリンの静脈内注射の試験において、患者は、食事後３〜６時間にわたる血糖のより良好なコントロールを示した。しかし、様々な医学的理由のため、毎回の食事の前のインスリンの静脈内注射は、実際的な療法ではない。

【0011】

インスリン治療の重要な改善の１つは、１９９０年代におけるインスリンリスプロ（ＩＬ）、インスリンアスパルト（ＩＡ）及びインスリングルリシン（ＩＧ）などの速効型インスリン類似体の導入であった。しかし、速効型インスリン類似体を用いた場合でさえ、最高インスリンレベルは、一般的に注射後５０〜９０分以内に生じる。速効型インスリン類似体は第１相インスリン分泌を十分に模倣するものではないため、インスリン療法を用いる糖尿病患者は、食事の開始時に存在する不十分なレベルのインスリン及び食間に存在する過剰なインスリンを有し続ける。このインスリンの送達の遅延は、食事の開始後の初期の高血糖をもたらし得る。さらに、食間の過剰なインスリンは、低血糖として公知の異常に低いレベルの血糖をもたらし得る。低血糖は、知力の喪失、精神錯乱、心拍数の増加、空腹感、発汗及び脱力をもたらし得る。非常に低い血糖値では、低血糖は、意識喪失、昏睡及び死亡さえをももたらし得る。米国糖尿病協会、すなわちＡＤＡによれば、インスリン使用糖尿病患者は、年間平均１．２件の重篤な低血糖事象を経験し、それらの事象の多くが患者による病院救急処置室への来訪を必要とする。

【0012】

血液へのインスリン送達の時間的経過が全体的なグルコース調節にそのような重要な役割を果たしているため、速効型インスリン類似体より速やかに血液に到達する注射用インスリンであるインスリンの重要なニーズがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

したがって、本発明の目的は、改善された安定性及び作用の速やかな発現を有する速効型注射用インスリン組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本明細書では、改善された安定性及び作用の速やかな発現を有する注射用インスリン製剤を記載する。この製剤は、皮下、皮内又は筋肉内投与用であってよい。好ましい実施形態において、製剤を皮下注射により投与する。製剤は、インスリンを、キレート剤及び溶解剤並びに場合によって追加の賦形剤と組み合わせて含有する。好ましい実施形態において、製剤は、ヒトインスリン、ＥＤＴＡなどの亜鉛キレート剤、及びクエン酸又はクエン酸ナトリウムなどのその塩などの溶解剤を含有する。これらの製剤は、皮下注射により投与するとき、血流中に速やかに吸収される。実施例で、ｐＨを生理的ｐＨに上昇させ、インスリンの溶解及び速やかな取込みを実現できることが実証されている。

【0015】

一実施形態において、インスリンは、滅菌済みバイアル中の乾燥粉末として提供される。投与の直前又は投与時点に、これを、水などの薬学的に許容されるキャリアを含有する希釈剤並びに場合によってＥＤＴＡなどの亜鉛キレート剤及び／又はクエン酸などの溶解剤と混合する。他の実施形態において、通常ｐＨが約４のインスリンを、解凍によって使える状態である凍結混合物として保存する。好ましい実施形態において、インスリンを、４℃で保存されているｐＨ７の水溶液として提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
インスリン、解離剤及び亜鉛キレート剤を含み、生理的ｐＨを有し、澄明水溶液であるインスリン製剤。
（項目２）
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、クエン酸三ナトリウム（ＴＳＣ）、アルギン酸、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ＣＤＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）からなる群から選択される、項目１に記載の製剤。
（項目３）
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、項目２に記載の製剤。
（項目４）
前記溶解剤が酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、アスパラギン酸、マレイン酸、フマル酸及びアジピン酸からなる群から選択される酸又はその塩である、項目１に記載の製剤。
（項目５）
前記解離剤がクエン酸又はクエン酸ナトリウムである、項目４に記載の製剤。
（項目６）
前記ｐＨが７から７．５の間である、項目１に記載の製剤。
（項目７）
インスリン溶液のｐＨを約ｐＨ４から生理的ｐＨに上昇させることにより調製される、項目１に記載の製剤。
（項目８）
前記インスリンがヒトインスリン、インスリン類似体及びそれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の製剤。
（項目９）
前記インスリンが組換えヒトインスリンである、項目８に記載の製剤。
（項目１０）
インスリン、解離剤及び亜鉛キレート剤を含み、該解離剤が塩であるインスリン製剤。
（項目１１）
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、クエン酸三ナトリウム（ＴＳＣ）、アルギン酸、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ＣＤＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）からなる群から選択される、項目１０に記載の製剤。
（項目１２）
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、項目１０に記載の製剤。
（項目１３）
前記溶解剤が酢酸塩、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩及びアジピン酸塩並びにＩ族金属又はＩＩ族金属からなる群から選択される塩である、項目１０に記載の製剤。
（項目１４）
前記溶解剤がアスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸及びアジピン酸のナトリウム塩又はカリウム塩からなる群から選択される、項目１３に記載の製剤。
（項目１５）
前記解離剤がクエン酸ナトリウムである、項目１３に記載の製剤。
（項目１６）
ｐＨが７から７．５の間である、項目１０に記載の製剤。
（項目１７）
ｐＨが約４である、項目１０に記載の製剤。
（項目１８）
前記インスリンがヒトインスリン、インスリン類似体及びそれらの組合せからなる群から選択される、項目１０に記載の製剤。
（項目１９）
前記インスリンが組換えヒトインスリンである、項目１０に記載の製剤。
（項目２０）
前記インスリンが第１の容器に入った乾燥粉末として提供され、前記キレート剤及び溶解剤の少なくとも１つが希釈剤を含有する第２の容器に入った状態で提供される、項目１に記載の製剤。
（項目２１）
前記インスリンが第１の容器に入った乾燥粉末として提供され、前記キレート剤及び溶解剤の少なくとも１つが希釈剤を含有する第２の容器に入った状態で提供される、項目１０に記載の製剤。
（項目２２）
糖尿病の治療用の薬学的に許容される凍結製剤として提供される、項目１に記載の製剤。
（項目２３）
糖尿病の治療用の薬学的に許容される凍結製剤として提供される、項目１０に記載の製剤。
（項目２４）
４℃での澄明水溶液として提供される、項目１に記載の製剤。
（項目２５）
４℃での澄明水溶液として提供される、項目１０に記載の製剤。
（項目２６）
項目１により定義される、インスリンと、亜鉛キレート剤及びＨＣｌと組み合わされたインスリンと比較して上皮細胞を経るインスリンの取込み及び輸送を増大させるのに有効な量の溶解剤及び亜鉛キレート剤とを含む、有効量の注射用インスリン製剤を注射することを含む、糖尿病個体を治療する方法。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、露出表面電荷及び電荷を遮へいするための適切なサイズの分子（「溶解剤及びキレート剤」）により表面を覆われた状態を示すインスリンの３次元概略図である。

【図2】図２は、０．１ミクロンフィルター１６の４〜５層の不死化口腔上皮細胞１４を経るドナーチャンバー１２からレシーバーチャンバー１８内へのインスリンの吸収を測定するために用いるトランスウエル装置１０の概略図である。

【図3】図３ａは、溶解剤として選択した酸の関数としての０．４５ｍｇＥＤＴＡ／ｍｌを含む及び含まない、図２のトランスウエルシステムにおける口腔上皮細胞を経るｉｎ ｖｉｔｒｏでのインスリン輸送（マイクロ単位での累積インスリン）を比較したグラフである。ＥＤＴＡは０．４５ｍｇ／ｍＬと一定であったが、酸濃度は次のように異なっていた：アスパラギン酸（０．４７ｍｇ／ｍＬ）、グルタミン酸（０．７４ｍｇ／ｍＬ）、コハク酸（０．４１ｍｇ／ｍＬ）、アジピン酸（０．７３ｍｇ／ｍＬ）及びクエン酸（０．２９ｍｇ／ｍＬ及び０．５６ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ範囲３．２〜３．８。比較分析のために２つの時間（１０及び３０分）を選択した。結果は、平均値±測定標準誤差（ｎ＝４）である。図３ｂは、溶解剤として選択した酸の関数としての０．４５ｍｇＥＤＴＡ／ｍｌを含む及び含まない、図２のトランスウエルシステムにおける口腔上皮細胞を経るｉｎ ｖｉｔｒｏでのインスリン輸送（マイクロ単位での累積インスリン）を比較したグラフである。ＥＤＴＡは０．４５ｍｇ／ｍＬと一定であったが、酸濃度は次のように異なっていた：マレイン（０．３２ｍｇ／ｍＬ）、フマル酸（１．２８ｍｇ／ｍＬ）及びシュウ酸（０．３２ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ範囲２〜３。比較分析のために２つの時間（１０及び３０分）を選択した。結果は、平均値±測定標準誤差（ｎ＝４）である。

【図4】図４ａは、０．５６ｍｇＥＤＴＡ／ｍｌを含み及び含まず、次の当モル（１．５０×１０^−３モル）濃度の酸：アスパラギン酸（０．２０ｍｇ／ｍＬ）、グルタミン酸（０．２２ｍｇ／ｍＬ）及びクエン酸（０．２９ｍｇ／ｍＬ）を含む、異なる溶解剤を比較した、図２に示したトランスウエルシステムにおける口腔上皮細胞を経るｉｎ ｖｉｔｒｏでのインスリン輸送（マイクロ単位での累積インスリン）のグラフである。比較分析のために２つの時間（１０及び３０分）を選択した。図４ｂは、０．５６ｍｇＥＤＴＡ／ｍｌを含み及び含まず、次の当モル（１．５０×１０^−３モル）濃度の酸：１．８０ｍｇ／ｍＬのクエン酸を含む、異なる溶解剤を比較した、図２に示したトランスウエルシステムにおける口腔上皮細胞を経るｉｎ ｖｉｔｒｏでのインスリン輸送（マイクロ単位での累積インスリン）のグラフである。比較分析のために２つの時間（１０及び３０分）を選択した。

【図5】図５は、異なるキレート剤の有効性を比較するための図２のトランスウエルシステムを用いた口腔上皮細胞を経るｉｎ ｖｉｔｒｏでのインスリン輸送のグラフである。図５は、同じモル濃度（４．８４×１０^−３モル）の異なるキレート剤を加えたグルタミン酸、クエン酸又はＨＣｌを含む溶液からの口腔上皮細胞を経たインスリン（１ｍｇ／ｍＬ）の輸送を測定したグラフである（累積インスリン、マイクロモル）。キレート剤は、キレート剤なし（対照）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＭＳＡ、ＣＤＴＡ及びＴＳＣであった。

【図6】図６は、平均グルコース注入速度（ＧＩＲ）／ｋｇとして測定された、ＩＬ（１２Ｕ）及びＲＨＩ（１２Ｕ）と比較したヒト被験体におけるクエン酸及びＥＤＴＡ（１２Ｕ）を用いて調製したインスリンのｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学的効果のグラフである。

【図7】図７は、ＲＨＩと比較した、ヒトにおけるクエン酸及びＥＤＴＡを用いて調製したインスリンのｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態学的効果、すなわちインスリン濃度（マイクロ単位／ｍｌ）の経時的（分）推移のグラフである。平均値（±ＳＥＭ、ｎ＝１０）。インスリンの用量は１２Ｕ／被験体であった。

【図8】図８は、血糖（ｍｇ／ｄｌ）を経時的（分）にプロットした、ＲＨＩ及びＩＬと比較した、１６例の２型糖尿病患者におけるクエン酸及びＥＤＴＡを用いて調製したインスリンのｉｎ ｖｉｖｏでの薬力学のグラフである。患者試験に用いた投与量は、それらの現在のインスリン療法に基づいて各患者について調節した患者特有のものであった。

【図9-1】図９Ａは、０．１７、０．５１、１．６８及び３．６２ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＨＩの沈降係数のグラフである。図９Ｂは、０．１５、０．５６、１．７５及び３．５９ｍｇ／ｍｌの濃度のＩＬの沈降係数のグラフである。

【図9-2】図９Ｃは、０．１６、０．５６、１．６６及び３．５６ｍｇ／ｍｌの濃度のＩＡの沈降係数のグラフである。図９Ｄは、０．１５、０．５５、１．７２及び３．４８ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＥ１００−４の沈降係数のグラフである。

【図10-1】図１０Ａは、０．１８、０．５５及び１．７２ｍｇ／ｍｌの濃度でのＲＨＩの沈降係数を負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のグラフである。図１０Ｂは、０．１７、０．５７及び１．８２ｍｇ／ｍｌの濃度でのＩＬの沈降係数を負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のグラフである。

【図10-2】図１０Ｃは、０．１９、０．５４及び１．８４ｍｇ／ｍｌの濃度でのＩＡの沈降係数を負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のグラフである。図１０Ｄは、０．１８、０．４０及び０．８４ｍｇ／ｍｌの濃度でのＣＥ１００−４を沈降係数の負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のグラフである。

【図11】図１１は、０．１８、０．５７、１．７４及び３．５２ｍｇ／ｍｌの濃度での対照インスリンｐＨ７の沈降係数を負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のグラフである。

【図12】図１２は、ＣＥ１００−４、ＣＥ１００−７及びＣＥＳ１００−７の希釈度の関数としてのインスリン平均粒径（ｎｍ）のグラフである。

【図13】図１３は、糖尿病ミニブタにおけるＥＬＩＳＡによるインスリン濃度（μ単位／ｍｌ）の経時的（分）な推移のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本明細書で記載する注射用ヒトインスリンのインスリン製剤は、食事の直前又は食事の終了時点に投与する。好ましい実施形態において、製剤は、組換えヒトインスリンと、ＦＤＡにより安全と一般的に見なされている特定の成分とを組み合わせている。製剤は、現在市販されている速効型インスリン類似体より速く血液中に吸収されるように設計されている。インスリンの製剤の重要な特徴の１つは、インスリンがインスリンの６分子形態、すなわち六量体形態からインスリンの単量体形態又は二量体形態に解離又は分離することを可能にし、六量体形態への再会合を阻止することである。人体は、インスリンが体内に吸収されてその望ましい生物学的効果をもたらすことができる前に、インスリンが単一分子の形態であることを要求するので、単量体形態又は二量体形態を有利にすることによって、この製剤が血液中へのインスリンのより速やかな送達を可能にすると考えられる。注射用に販売されているほとんどのヒトインスリンは、六量体形態である。インスリン六量体は最初に解離して、二量体、次に単量体を形成しなければならないので、これが、身体が吸収することをより困難にしている。

【0018】

Ｉ．定義
本明細書で用いているように、「インスリン」は、特に指定しない限り、ヒト若しくは非ヒト組換え、精製又は合成インスリン若しくはインスリン類似体を意味する。

【0019】

本明細書で用いているように、「ヒトインスリン」は、天然源から分離されたか、又は遺伝子改変した微生物により産生されたかにかかわりなく、膵臓により分泌されるヒトペプチドホルモンである。本明細書で用いているように、「非ヒトインスリン」は、ヒトインスリンと同じであるが、ブタ又はウシなどの動物源からのものである。

【0020】

本明細書で用いているように、インスリン類似体は、膵臓により分泌されるインスリンと異なるが、天然インスリンと同じ作用を果たすために身体に利用できる改変インスリンである。基礎をなすＤＮＡの遺伝子操作により、インスリンのアミノ酸配列を変化させて、そのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝及び排泄）特性を変化させることができる。例としては、インスリンリプロ、インスリングラルギン、インスリンアスペルト、インスリングルリシン、インスリンデテミルなどがある。インスリンは、化学的に、例えば、アセチル化により修飾することもできる。本明細書で用いているように、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンと同じ生物学的作用を果たすことができる改変ヒトインスリンである。

【0021】

本明細書で用いているように、「キレート剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）」又は「キレート化剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」は、亜鉛イオンに対する１つ以上の結合を形成する能力を有する化合物を意味する。結合は、一般的にイオン結合又は配位結合である。キレート剤は、無機又は有機化合物であってよい。キレート錯体は、金属イオンがキレート化剤の２つ以上の原子に結合している錯体である。

【0022】

本明細書で用いているように、「可溶化剤」は、溶媒中の物質、例えば、水溶液中のインスリンの溶解度を増加させる化合物である。可溶化剤の例としては、界面活性剤（ＴＷＥＥＮＳ（登録商標））；エタノールなどの溶媒、モノステアリン酸オキシエチレンなどのミセル形成化合物；及びｐＨ調整剤などがある。

【0023】

本明細書で用いているように、「溶解剤」は、インスリン及びＥＤＴＡに加えたとき、下の実施例で記載する上皮細胞トランスウエルプレートアッセイを用いて測定される、同じｐＨのＨＣｌ及びＥＤＴＡと比較してインスリンの輸送及び吸収を増加させる酸又は塩である。ＨＣｌは、溶解剤でなくて、可溶化剤であり得る。クエン酸及びクエン酸ナトリウムは、このアッセイで測定するとき溶解剤である。これは、一部が六量体からの解離の間に露出する、インスリンの電荷を遮へいすることによって少なくとも一部分達成されると考えられる。

【0024】

本明細書で用いているように、「賦形剤」は、インスリンのキャリアとして用いられる、又は製品が製造される過程を促進するのに用いられる、キレート剤又は溶解剤以外の不活性物質である。そのような場合に、活性物質は、賦形剤に溶解するか、又は賦形剤と混合する。

【0025】

本明細書で用いているように、「生理的ｐＨ」は、６．８から７．６まで、好ましくは７から７．５まで、最も好ましくは約７．４である。

【0026】

本明細書で用いているように、ＶＩＡＪＥＣＴ（商標）は、クエン酸などの溶解剤及びＥＤＴＡなどのキレート剤を用いて製剤化した組換えヒトインスリンの商品名である。Ｖｉａｊｅｃｔ ２５Ｕ／ｍＬ（ＣＥ２５−４）は、２５Ｕ／ｍＬ レギュラー組換えヒトインスリン、１．８ｍｇ／ｍＬ クエン酸、１．８ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ二ナトリウム、０．８２％ ＮａＣｌ（等張性）及び３ｍｇ／ｍＬ ｍ−クレゾールを含有する。それは、凍結保存されている水溶液として、又は乾燥粉末インスリン及び希釈剤（その少なくとも１つがクエン酸及びＥＤＴＡを含有する）からなる２部キットで提供される。再構成混合物及び凍結溶液両方のｐＨは、約ｐＨ４である。Ｖｉａｊｅｃｔ １００Ｕ／ｍＬ（ＣＥ１００−４）は、１００Ｕ／ｍＬ レギュラー組換えヒトインスリン、１．８ｍｇ／ｍＬ クエン酸、１．８ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ二ナトリウム、２２ｍｇ／ｍＬ グリセリン、３ｍｇ／ｍＬ ｍ−クレゾールを含有する。これも凍結水溶液又は乾燥粉末状インスリン及び希釈剤からなる２部キットとして提供される。再構成混合物及び凍結溶液の両方のｐＨは、約４である。Ｖｉａｊｅｃｔ １００Ｕ／ｍＬ（ＣＥ１００−７）は、１００Ｕ／ｍＬ レギュラー組換えヒトインスリン、１．８ｍｇ／ｍＬ クエン酸、１．８ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ二ナトリウム、２２ｍｇ／ｍＬ グリセリン、３ｍｇ／ｍＬ ｍ−クレゾールを含有する。これは、４℃で保存することができる約７．４のｐＨを有する水溶液として提供される。酸塩を含むＶＩＡｊｅｃｔ（ＣＳＥ１００−７）は、両方が１．８ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡとクエン酸三ナトリウムを水に加え、次に１００Ｕ／ｍＬのインスリンを加え、ｐＨを６に低下させ、次にｐＨを７．４に上昇させることにより、作製する。

【0027】

製剤
製剤は、インスリン、キレート剤及び溶解剤（単数又は複数）並びに場合によって１つ以上の他の賦形剤を含む。好ましい実施形態において、製剤は、皮下投与に適しており、脂肪皮下組織中に速やかに吸収される。溶解剤及びキレート剤の選択、溶解剤及びキレート剤の両方の濃度並びに製剤が調整されるｐＨは、すべてがシステムの有効性に対する著しい影響を有する。多くの組合せが有効性を有するが、好ましい実施形態は、安全性、安定性、規制プロファイル及び性能を含む多くの理由のために選択される。

【0028】

好ましい実施形態において、製剤成分の少なくとも１つが活性剤の電荷を遮へいするように選択される。これは、インスリンの膜透過輸送を促進し、それにより、インスリンの作用の発現及び生物学的利用能の両方を増加させる。成分はまた、水性媒体に速やかに溶解する組成物を構成するように選択される。好ましくは、インスリンは、吸収され、血漿に速やかに輸送され、作用の速やかな発現をもたらす（好ましくは投与後約５分以内に始まり、投与後約１５〜３０分目に最大に達する）。

【0029】

ＥＤＴＡなどのキレート剤は、インスリン中の亜鉛をキレートし、インスリン溶液から亜鉛を除去する。これにより、インスリンにその二量体及び単量体形態をとり、六量体の状態への再会合が妨害される。実施例で記載する試験で、解離しつつある六量体の全体的なサイズは亜鉛錯体化インスリン六量体より大きく、その後より小さい単位を形成する。六量体、二量体及び単量体は、濃度駆動平衡状態で存在するので、単量体が吸収されるとき、より多くの単量体が生ずる。したがって、インスリン単量体が皮下組織を通して吸収されるとき、さらなる二量体が分解されて（ｄｉｓｓｅｍｂｌｅ）、より多くの単量体を形成する。完全に解離した単量体形態は、単量体形態の分子量の１／６未満の分子量を有し、それにより、インスリンの吸収の速度と量の両方を著しく増加させる。キレート剤（ＥＤＴＡなど）及び／又は溶解剤（クエン酸など）がインスリンと水素結合する程度に応じて、それがインスリンの電荷を遮へいし、その膜透過輸送を促進し、それにより、インスリンの作用の発現及び生物学的利用能の両方を増加させる。

【0030】

インスリン
インスリンは、組換えること又は天然源から精製することができる。インスリンは、ヒト又は非ヒトであってよい。ヒトが好ましい。最も好ましい実施形態において、インスリンは、ヒト組換えインスリンである。組換えヒトインスリンは、多くの源から利用可能である。インスリンは、ヒトインスリンのアミノ酸配列に基づくものであってよいが、１つ以上のアミノ酸の差異を有するインスリン類似体、又は化学的に修飾されたインスリン若しくはインスリン類似体であってもよい。

【0031】

インスリンの投与量は、その生物学的利用能及び治療を受ける患者に依存する。インスリンは、一般的にヒトへの投薬につき１．５〜１００ＩＵ、好ましくは３〜５０ＩＵの投与量範囲に含まれる。一般的に、インスリンは、１００ＩＵバイアル入りで提供される。

【0032】

溶解剤
特定の酸又はそれらの塩は、図１に示すように、インスリンの電荷を遮へいし、取込み及び輸送を増大させるのは明らかである。溶解剤として有効であるそれらの酸は、下の実施例で記載するトランスウエルアッセイで測定されるように、塩酸を基準として、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸及びアジピン酸を含む。例えば、活性剤がインスリンである場合、好ましい溶解剤はクエン酸である。塩酸及び水酸化ナトリウムは、ｐＨ調整用の好ましい剤である。ＨＣｌは、製剤のいずれかと組み合わせて用いることができるが、溶解剤ではない。酸の塩は、酢酸ナトリウム、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩及びアジピン酸塩を含む。有機酸の塩は、金属水酸化物、金属酸化物、金属炭酸塩及び金属重炭酸塩、金属アミン、並びに塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム等などのアンモニウム塩基を含むが、これらに限定されない様々な塩基を用いて調製することができる。適切な金属は、一価及び多価金属イオンを含む。例としての金属イオンは、リチウム、ナトリウム及びカリウムなどのＩ族金属、バリウム、マグネシウム、カルシウム及びストロンチウムなどのＩＩ族金属、並びにアルミニウムなどのメタロイドを含む。多価金属イオンは、２つ以上のカルボン酸基と同時に錯体を形成できるので、複数のカルボン酸基を含有する有機酸が望ましい場合がある。

【0033】

溶解剤の範囲は、９．３７×１０^−４Ｍから９．３７×１０^−２Ｍクエン酸の間でのインスリン及びＥＤＴＡと組み合わされたクエン酸の有効量に対応する。

【0034】

キレート剤
好ましい実施形態において、亜鉛キレート剤をインスリンと混合する。キレート剤は、イオン性又は非イオン性であってよい。適切なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、アルギン酸、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ＣＤＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）、クエン酸三ナトリウム（ＴＳＣ）を含む。塩酸は、ｐＨを調整するのにＴＳＣとともに、また溶解剤であるクエン酸の形成を生じさせる工程に用いられる。

【0035】

好ましい実施形態において、キレート剤はＥＤＴＡである。キレート剤は、インスリンからの亜鉛を捕捉し、それにより、インスリンの二量体形態を六量体形態より有利にし、投与部位の周囲の組織（例えば、粘膜又は脂肪組織）によるインスリンの吸収を促進する。さらに、キレート剤の水素は、活性剤に結合し、それにより、インスリン単量体の電荷の遮へいを促進し、インスリン単量体の膜透過輸送を促進し得る。

【0036】

キレート剤の範囲は、２．４２×１０^−４Ｍから９．６８×１０^−２Ｍ ＥＤＴＡの間でのインスリン及びクエン酸と組み合わされたＥＤＴＡの有効量に対応する。

【0037】

賦形剤
薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性化合物の処理を促進する賦形剤及び助剤を含む１つ以上の生理的に許容されるキャリアを用いて従来の方法で処方することができる。薬物の処方は、例えば、Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９７５年）並びにＬｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ． Ａ．及びＬａｃｈｍａｎ， Ｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０年）に記載されている。

【0038】

好ましい実施形態において、水性媒体への速やかな溶解を促進するために、１つ以上の可溶化剤をインスリン薬とともに含める。適切な可溶化剤は、ポリソルベート、グリセリン及びポロキサマー類などの湿潤剤、非イオン性及びイオン性界面活性剤類、食用酸類及び食用塩基類（例えば、重炭酸ナトリウム）並びにアルコール類並びにｐＨ調節用の緩衝塩類を含む。

【0039】

安定化剤は、例として酸化反応を含む薬物分解反応を抑制又は妨害するために用いる。多くの安定化剤を用いることができる。適切な安定化剤は、セルロース及びセルロース誘導体などの多糖類、並びにグリセロールなどの単純アルコール類；フェノール、ｍ−クレゾール及びメチルパラベンなどの静菌剤；塩化ナトリウム、グリセロール及びグルコースなどの等張剤；例えば、天然レシチン類（例えば、卵黄レシチン又は大豆レシチン）及び合成又は半合成レシチン類（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン又はジステアロイルホスファチジルコリン）などのレシチン類；ホスファチジン酸類；ホスファチジルエタノールアミン類；ジステアロイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン及びジアラキドイルホスファチジルセリンなどのホスファチジルセリン類；ホスファチジルグリセロール類；ホスファチジルイノシトール類；カルジオリピン類；スフィンゴミエリン類を含む。一例として、安定化剤は、グリセロール、静菌剤及び等張剤の組合せであってよい。

【0040】

ＩＩ．製剤を製造する方法
注射製剤は、インスリン、キレート剤及び溶解剤を含有する。好ましい実施形態において、注射製剤は、インスリン、ＥＤＴＡ、クエン酸、食塩水及び／又はグリセリンを含有する。

【0041】

一実施形態において、皮下注射製剤は、食塩水及びグリセリン、クエン酸並びにＥＤＴＡを混合して溶液を作り、その溶液（「希釈剤」と呼ぶ）を滅菌することによって製造する。インスリンは、滅菌水に別個に加えて、溶液を作り、ろ過し、指定された量を多くの別個の滅菌済み注射ビンのそれぞれに入れる。インスリン溶液を凍結乾燥して、粉末を形成させ、その安定性を保持するために希釈剤と別個に保存すべきである。投与前に、希釈剤をインスリン注射ビンに加える。所定の量のインスリンを患者に皮下注射した後、残りのインスリン溶液は、好ましくは冷凍により保存することができる。

【0042】

他の実施形態において、インスリンを希釈剤、ｐＨ４と混合し、滅菌ろ過して複数回使用バイアル又はカートリッジに入れ、使用前に凍結する。

【0043】

好ましい実施形態において、インスリンをバイアル又はカートリッジ中ｐＨ７．０の水溶液として調製し、４℃で保存する。

【0044】

ＩＩＩ．製剤を使用する方法
製剤は、皮下又は筋肉内注射により投与することができる。製剤は、全身送達のために速やかに吸収され、血漿に輸送されるように設計されている。

【0045】

活性剤としてのインスリンを含有する製剤は、食事前又は食事中に１型又は２型糖尿病患者に投与することができる。速やかな吸収のため、組成物は、肝臓におけるグリコーゲンのグルコースへの変換を停止させ、それにより、糖尿病の合併症の主な原因であり、２型糖尿病の最初の症状である高血糖を予防する。現在入手できるヒトインスリンの標準的な皮下注射剤は、インスリンは吸収されるのが遅すぎて肝臓におけるグルコースの産生を停止させることができないため、所望とは言えない効果を得るために摂食の約１／２〜１時間前に投与しなければならない。さらに、疾患の進行における十分に早期に投与する場合、皮下インスリン組成物は、２型糖尿病の進行を遅くするか、又は停止させることができる場合がある。

【0046】

低ｐＨ製剤の利点は、いずれも非混和性及び沈殿のため他のタイプの市販のインスリンと混合することができない、ＢＹＥＴＴＡ（登録商標）（エクゼナチド）、ＳＹＭＬＩＮ（登録商標）（酢酸プラムリンチド）及びＬＡＮＴＵＳ（登録商標）（長時間作用型インスリン類似体）と混合することがきることである。

【0047】

より高いｐＨのインスリンの利点は、より低いｐＨのインスリンより保存中安定であることである。

【0048】

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによりさらに理解される。以下のインスリンを実施例で用いた。

【0049】

ＨＵＭＵＬＩＮ（登録商標）（ＲＨＩ）は、組換えヒトインスリンである。１ミリリットルが１００単位のレギュラー組換えヒトインスリン、０．２２％ ｍ−クレゾール、１．４〜１．８％ グリセリン、ｐＨ７を含有する。これは、いくつかの供給元から商業的に入手可能である。

【0050】

Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ製のＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）（ＩＬ）（インスリンリスプロ注射剤）は、インスリンＢ鎖の２８位と２９位のアミノ酸を逆転させるときに生ずるＬｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリン類似体である組換えヒトインスリン類似体である。ＩＬ注射剤の１ミリリットルがインスリンリスプロ１００単位、１６ｍｇ グリセリン、１．８８ｍｇ リン酸水素二ナトリウム、３．１５ｍｇ メタクレゾール、亜鉛イオンが０．０１９７ｍｇとなるように調整された酸化亜鉛の量、微量のフェノール及び注射用水を含有する。インスリンリスプロは、７．０〜７．８のｐＨを有する。ｐＨを調整するために塩酸１０％及び／又は水酸化ナトリウム１０％を加えることができる。１単位のＩＬは、１単位のレギュラーヒトインスリンと同じグルコース低下作用を有するが、その作用は、より速やかであり、持続時間がより短い。

【0051】

ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標）（ＩＡ）は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓから入手可能な組換えインスリン類似体である。該類似体は、Ｂ２８位におけるアミノ酸プロリンのアスパラギン酸による単一置換を含み、組換え酵母により産生される。それは、１００単位 インスリンアスパルト／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ グリセリン、１．５０ｍｇ フェノール／ｍｌ、１．７２ｍｇ メタクレゾール／ｍｌ、１９．６ｍｇ 亜鉛／ｍｌ、１．２５ｍｇ リン酸水素二ナトリウム二水和物／ｍｌ、０．５８ｍｇ 塩化ナトリウム／ｍｌを含み、１０％ＨＣｌ又はＮａＯＨで調整された７．２〜７．６のｐＨを有する滅菌済み水溶液で提供される。

【0052】

ＶＩＡＪＥＣＴ（商標）は、クエン酸及びＥＤＴＡを用いて製剤化された組換えヒトインスリンである。Ｖｉａｊｅｃｔ ２５Ｕ／ｍＬ（ＣＥ２５−４）は、２５Ｕ／ｍＬ レギュラー組換えヒトインスリン、１．８ｍｇ／ｍＬ クエン酸、１．８ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ二ナトリウム、０．８２％ ＮａＣｌ（等張性）及び３ｍｇ／ｍＬ ｍ−クレゾールを含有する。それは、凍結保存されている水溶液として、又は乾燥粉末インスリン及び希釈剤（その少なくとも１つがクエン酸及びＥＤＴＡを含有する）からなる２部キットで提供される。再構成混合物及び凍結溶液の両方のｐＨは、約ｐＨ４である。再構成粉末は、実施例において用いたものである。Ｖｉａｊｅｃｔ １００Ｕ／ｍＬ（ＣＥ１００−４）は、１００Ｕ／ｍＬ レギュラー組換えヒトインスリン、１．８ｍｇ／ｍＬ クエン酸、１．８ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ二ナトリウム、２２ｍｇ／ｍＬ グリセリン、３ｍｇ／ｍＬ ｍ−クレゾールを含有する。これも凍結水溶液として又は乾燥粉末状インスリン及び希釈剤からなる２部キットとして提供される。再構成混合物及び凍結溶液の両方のｐＨは、約４である。凍結水溶液のみを分析用遠心分離機データ及びマルバーンに用いた。Ｖｉａｊｅｃｔ １００Ｕ／ｍＬ（ＣＥ１００−７）は、１００Ｕ／ｍＬ レギュラー組換えヒトインスリン、１．８ｍｇ／ｍＬ クエン酸、１．８ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ二ナトリウム、２２ｍｇ／ｍＬ グリセリン、３ｍｇ／ｍＬ ｍ−クレゾールを含有する。これは、４℃で保存することができる約７．４のｐＨを有する水溶液として提供される。これは、ブタ試験に用いた。酸塩を含むＶＩＡｊｅｃｔ（ＣＳＥ１００−７）は、両方が水中１．８ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ及びクエン酸三ナトリウムと、１００Ｕ／ｍＬ インスリン及びグリセリン（２２ｍｇ／ｍＬ）を用いて調製する。最終ｐＨは、水酸化ナトリウムを用いて７．４に調整する。これは、マルバーン情報に関する最終実施例に用いた。

【実施例】

【0053】

（実施例１）
溶解剤に応じた、上皮細胞トランスウエルアッセイを用いたインスリンの取込み及び輸送のｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較
材料及び方法
口腔上皮細胞を、図２に示すように複数（４〜５層）の細胞層が形成されるまでトランスウエルインサートで２週間にわたり増殖させた。適切な溶液をドナーウエルに加え、１０分後にレシーバーウエルから試料を除去することにより、輸送試験を行った。溶液は、水、＋／−ＥＤＴＡ（０．４５ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＣｌ（０．８５重量／容積％）、１ｍｇ／ｍｌ インスリン及びｐＨを３．８に維持するために十分な量の酸からなっていた。レシーバーウエル中のインスリンの量をＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。

【0054】

結果
図３ａ及び３ｂに示す結果は、いくつかの酸が上皮細胞を経るインスリンの取込み及び輸送を増大させるのにより有効であることを実証している。これらは、容易に試験し、ＨＣｌを用いて得られた結果と比較することができ、それにより、任意の酸を試験し、溶解剤（すなわち、ＨＣｌと比較して取込み及び輸送を増大させる）であるか、否かを決定することができる基準を得ることができる。

【0055】

３．２〜３．８のｐＨ範囲を有する酸を用いて得られた結果を図３ａでグループ化する。より強い酸（ｐＨ＜３）を図３ｂでグループ化する。

【0056】

結果から、同じ濃度のキレート剤を用いての酸の選択が細胞培養物を経るインスリンの輸送に実質的な影響を有することが確認される。好ましい酸は、クエン酸である。

【0057】

（実施例２）
溶解剤の濃度に応じた、上皮細胞トランスウエルアッセイを用いたインスリンの取込み及び輸送のｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較
材料及び方法
実施例１の材料及び方法を異なる濃度の試薬で用いた。試験において、等モル濃度の酸及びキレート剤を加えた。溶液は、水、＋／−ＥＤＴＡ（０．５６ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＣｌ（０．８５重量／容積％）、１ｍｇ／ｍＬ インスリン及び酸：アスパラギン酸（０．２０ｍｇ／ｍＬ）、グルタミン酸（０．２２ｍｇ／ｍＬ）又はクエン酸（０．２０ｍｇ／ｍＬ）からなっていた。クエン酸は、キレート剤の存在下及び不存在下で１．８ｍｇ／ｍＬというより高い濃度で試験した。このデータは、細胞ドナーチャンバーの投与後の２つの時間、１０及び３０分について示す。

【0058】

結果
アスパラギン酸（０．２０ｍｇ／ｍＬ）、グルタミン酸（０．２２ｍｇ／ｍＬ）又はクエン酸（０．２９ｍｇ／ｍＬ）を用いて得られた結果を図４ａに示す。この場合、キレート剤の添加に関して有意差は認められなかった。

【0059】

これに反して、１．８０ｍｇ／ｍＬでの、より高い濃度のクエン酸を用いた試験では、その溶液へのキレート剤の添加による有意な増加が示されている（ｔ検定比較、片側）。図４ｂを参照のこと。これは、取込み及び輸送を最適化するうえで両成分の濃度が重要であることを実証するものである。

【0060】

（実施例３）
キレート剤に応じた、上皮細胞トランスウエルアッセイを用いたインスリンの取込み及び輸送のｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較
材料及び方法
口腔上皮細胞を、複数（４〜５層）の細胞層が形成されるまでトランスウエルインサートで２週間にわたり増殖させた。適切な溶液をドナーウエルに加え、１０、２０及び３０分後にレシーバーウエルから試料を除去することにより、輸送試験を行った。

【0061】

溶液は、トランスウエル実験の直前に次の方法で調製した：１．８ｍｇ／ｍｌのクエン酸を０．８５重量／容積％の食塩水に溶解し、次いで、次のキレート剤の１つをこの溶液に、示す濃度で加えた：１．８０ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ、１．８４ｍｇ／ｍｌのＥＧＴＡ、０．８８ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＡ及び１．４２ｍｇ／ｍｌのＴＳＣ。ＣＤＴＡはその液体形態で用いたため、クエン酸をＣＤＴＡに直接加えた。これらの場合のそれぞれにおいて、キレート剤の濃度は、４．８４×１０^−３モルで一定であった。

【0062】

インスリンを次に１ｍｇ／ｍｌで加え、必要な場合、ｐＨを３．８に再調整した。ｐＨ調整用にＨＣｌのみを用いた試料の対照セットを比較のために含めた。０．２ｍｌの各溶液をドナーウエルに加えることにより、トランスウエル実験を行った。

【0063】

レシーバーウエル中のインスリンの量をＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。

【0064】

結果
３０分のインスリンデータのグラフを図５に示す。ＴＳＣ（クエン酸三ナトリウム）を用いて得られた結果と比較したときを除いて、クエン酸又はグルタミン酸を用いた場合に細胞を経て送達された有意により多くのインスリンが存在した。ＴＳＣの場合、ｐＨ調整のためにＨＣｌを用いた。ｐＨの調整によりクエン酸が発生したが、これにより、これらの結果が説明される。

【0065】

これらの結果により実証されたように、取込み及び輸送の増大は、キレート剤の選択に依存する。

【0066】

（実施例４）
ブタにおけるクエン酸をベースとするインスリン製剤中のキレート剤の前臨床評価
材料及び方法
公表された試験、Ａ． Ｐｌｕｍ、Ｈ． Ａｇｅｒｓｏ及びＬ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ−ａｃｔｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ，ｉｎｓｕｌｉｎ ａｓｐａｒｔ，ｉｎ ｒａｔｓ，ｄｏｇｓ，ａｎｄ ｐｉｇｓ，ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｓｐａｒｔ ｉｎ ｐｉｇｓ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ．，２８巻（２号）、１５５〜６０頁（２０００年）と調和して、消失の遅延は注射部位からの吸収がより遅いことを意味するので、消失半減期がインスリンの吸収の有効な決定因子であると決定した。したがって、ミニブタ試験の非コンパートメント解析を行って、ＰＫ及びＰＤパラメーター、特に消失半減期を調査した。

【0067】

糖尿病ブタにインスリンの４つの製剤のうちの１つを皮下注射した。３つの製剤は、キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ又はＴＳＣ）を含んでおり、第４の対照は、レギュラーヒトインスリンＲＨＩのみを含み、キレート剤を含んでいなかった。クエン酸（１．８ｍｇ／ｍｌ）をすべてのキレート剤製剤における酸として用い、ＮａＣｌ及びｍ−クレゾールをすべての場合に等張性及び製剤の無菌性のために加えた。キレート剤は、すべて４．８４×１０^−３モルという同じモル濃度であった。

【0068】

ブタには、一夜絶食させ、ＥＤＴＡを含有する０．１２５Ｕ／ｋｇヒトインスリン（ｎ＝３）又はＥＧＴＡ若しくはＴＳＣを含有する０．０８Ｕ／ｋｇヒトインスリン（ｎ＝２）の用量を皮下投与した。より高用量では極度の血糖の低下のため、用量を低くした。血糖及びインスリンレベルを投薬後８時間までのすべての時点で測定した。

【0069】

薬物動態モデリングは、均一重み付きの非コンパートメントモデルを用いてＷｉｎ Ｎｏｎｌｉｎを用いて行われた。消失半減期を以下の表１で比較した。

【0070】

表１：キレート剤に応じたブタにおける血糖の比較

【0071】

【表1】

ブタにおけるこのパイロット試験におけるレギュラーヒトインスリンの消失半減期（１２０分）は、文献にみられるものと一致しており、データをバリデートするためのテストポイントとして用いた。これは静脈投与後よりかなり長いので、注射後の注射部位からの持続的な遅い吸収があることがこれによって確認される。クエン酸製剤中のキレート剤は、このパラメーターの低下を明らかに示しており、これらの３つのキレート剤が、程度は異なるが、レギュラーヒトインスリンの吸収を増大させるのに有効であることが実証されている。

【0072】

（実施例５）
ヒト臨床試験におけるＥＤＴＡクエン酸インスリン製剤とレギュラーヒトインスリンとの比較
材料及び方法
本試験の目的は、クエン酸及びＥＤＴＡと組み合わせてインスリンを含有する試験製剤（「ＣＥ２５−４」）の薬力学的（ＰＤ）特性を評価することであった。５回の正常血糖グルコースクランプ（Ｂｉｏｓｔａｔｏｒ；標的血糖９０ｍｇ／ｄｌ）を１０例の絶食健常志願者（平均年齢４０歳（年齢範囲２０〜６２歳）；ＢＭＩ２２．５（１９．２〜２４．９）ｋｇ／ｍ^２）において実施した。固定された治療順序でのクロスオーバーデザインを用いて、１２ＩＵのレギュラーインスリン及び１２ＩＵのＣＥインスリン製剤を腹部に皮下注射した。

【0073】

結果
結果を図６及び７に示す。ＣＥ２５−４のＳＣ注射は、グルコース消費レギュラーヒトインスリンの有意により速やかな上昇をもたらした時間−作用プロファイルをもたらした（図６）。平均薬物動態データは、ＰＤ結果を確認するものとなっている（図７）。

【0074】

本試験は、レギュラーヒトインスリンへのクエン酸及びＥＤＴＡの添加が、レギュラーインスリン単独と比較して最高濃度までのより速い到達時間（図７）及び作用のより速やかな発現（図６）によって実証されるように、インスリンの吸収速度を改善することを示している。

【0075】

（実施例６）
１型糖尿病患者における食事の直前に皮下注射した場合のＣＥインスリン、インスリンリプロ及びレギュラーヒトインスリンの薬物動態及び薬力学
背景及び目的：
本試験の目的は、１型糖尿病患者における標準食後の食後血糖（ＢＧ）の逸脱に対するＣＥ２５−４、ＲＨＩ及びＩＬの作用を測定することであった。

【0076】

材料及び方法
９例の患者（男性５例及び女性４例；年齢４０±１０歳、ＢＭＩ２４．０±２．０ｋｇ／ｍ^２）のＢＧを、食事摂取前のグルコースクランプにより安定化させた（標的ＢＧ１２０ｍｇ／ｄｌ）。グルコースの注入は、標準食及びインスリン投薬の前に止めた。固定された治療順序でのクロスオーバー試験デザインを用いて、ＶＩＡｊｅｃｔ（商標）（ＣＥ２５−４）、ＩＬ又はＲＨＩの同一患者固有の用量を食事の直前にｓ．ｃ．注射した。その後、食後血糖逸脱を８時間にわたり連続的にモニターし、ＢＧが６０ｍｇ／ｄｌ未満であった場合にはグルコース注入を再開した。試験中、血漿インスリンレベルを測定した。

【0077】

結果
平均値±標準偏差として表２に示す結果は、食事、レギュラーヒトインスリン、インスリン＋クエン酸及びＥＤＴＡ（ＣＥ）並びにリスプロ後の２型糖尿病患者への皮下注射後のインスリンＴｍａｘを比較したものである。表３における結果は、同じ被験者の血糖を比較したものである。

【0078】

表２：インスリンＴｍａｘ（分）の比較

【0079】

【表2】

＊ｐ＜．００１、対応のあるｔ検定
表３：インスリン薬物動態の比較 血糖

【0080】

【表3】

＊ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定
注射後３〜８時間の低血糖事象の総数（グルコース注入を必要とする時間）は、ＲＨＩ製剤で１３、ＩＬ製剤で１１、ＣＥ２５−４製剤で４であった。この時間中の低血糖を予防するために注入したグルコースの平均総量は、ＣＥ２５−４を用いた場合よりＲＨＩでは６倍高く、ＩＬでは２倍多かった。群ごとのすべての患者について合計した正常血糖標的ゾーンの上及び下の面積（１４０ｍｇ／ｄＬを上回る及び８０ｍｇ／ｄＬを下回るＢＧ ＡＵＣ）は、ＲＨＩで８１，８９５ｍｇ／ｄＬ＊分、ＩＬで５７，４２３ｍｇ／ｄＬ＊分、ＣＥ２５−４で３８，７４０ｍｇ／ｄＬ＊分であった。平均血糖値を図８に示す。

【0081】

ＣＥ２５−４は、標準食後の血糖の上昇を逆転させるのが最も速かった。ＣＥ２５−４で治療した患者は、低い食後血糖逸脱を経験した。対照的に、ＲＨＩは、そのより遅い吸収速度と一致する、最も高い血糖逸脱を有した。血糖値の変動（最大値と最小値との間の平均値の差）は、ＣＥ２５−４でＩＬより有意に小さく、これらの１型糖尿病患者におけるＣＥ２５−４のより良好な血糖調節が実証されている。

【0082】

（実施例７）
光散乱によるインスリンのサイズの特徴づけ：
ＣＥ１００−４は、患者において作用の非常に速やかな発現を有する。この速やかな吸収プロファイルの基礎を理解するために、ＣＥ１００−４のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を他の市販の組換えヒトインスリン及びインスリンの速効型類似体と比較して実施した。光散乱法を最初の製品並びに合成細胞外液緩衝液による希釈系列に適用した。結果から、レギュラー組換えインスリン及び速効型類似体と異なり、ＣＥ１００−４が１：３希釈後にほぼ二量体のサイズにサイズを減少することが示される。これは、その速やかな吸収プロファイルと一致している。

【0083】

材料及び方法
この速やかな作用の発現のメカニズムを解明するために、皮下注射後に自然に起こることをシミュレートする手段としての合成細胞外液緩衝液による伝統的な製剤の希釈の効果を試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を設計した。光散乱法を用いて、平均サイズ分布（ｎｍ）を評価した。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験での比較のために用いた市販の速効型又は食事インスリン製剤は、ＩＬ、ＩＡ、ＲＨＩ及びＣＥ１００−４であった。サイズの比較のために、単量体（ｐＨ２．０）及び六量体亜鉛インスリン（ｐＨ７）の標準調製物を基準のために用いた。

【0084】

市販のインスリンをＺｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔ、ＵＫ）を用いてサイズについて特徴づけした。１ｍＬの試料をガラスキュベットに入れ、分析して溶解したインスリンの平均体積平均サイズ分布（ｎｍ）を測定した。３つの試料（各試料を数回測定）の平均値を比較のための基礎として用いた。最初の完全な強度解析の後に、細胞外液の同様なｐＨ及び緩衝能力を有する緩衝液（ＥＣＦ、０．７ｍＮ ＭｇＣｌ_２、１．２ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．２ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、１０４ｍＭ ＮａＣｌ、２８．３ｍＭ ＮａＨＣＯ_３）による１：２〜１：１６の希釈系列を実施した。各製剤の単量体／二量体／六量体のサイズ分布を理解するために、市販のインスリン及びＣＥ１００−４のそれぞれの平均サイズをすべての希釈度について測定した。

【0085】

インスリン
ＲＨＩ、ＩＬ、ＩＡ及びＣＥ１００−４
希釈剤
滅菌水中ＥＣＦ、０．７ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．２ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、１０４ｍＭ ＮａＣｌ、２８．３ｍＭ ＮａＨＣＯ_３
結果
サイズ測定試験において、未希釈ＣＥ１００−４は、ＩＬ、ＩＡ及びＲＨＩより大きい。しかし、１：３の希釈度については、ＣＥ１００−４の平均サイズは、単量体／二量体のサイズまでの２ｎｍに減少したが、試験した他のインスリンは、約５ｎｍの六量体サイズのままであった。ＩＬ、ＩＡ及びＲＨＩは別として、ＣＥ１００−４は、希釈度の増加に伴ってさらに減少した。未希釈ＲＨＩは、明らかにより小さいが、一旦、１：１に希釈されたならば５ｎｍより大きなサイズに成長し、１：１６の希釈度までこのサイズ範囲のままである。

【0086】

未希釈ＣＥ１００−４は、最初は試験した他のインスリンより明らかに大きく、これは、表面電荷を遮へいすることにより皮下部位からの吸収速度をさらに増加させる役割を果たし得る、表面に弱く結合しているクエン酸及びＥＤＴＡにおそらく起因する。電荷は、吸収の妨げとなり得る。皮下投与の直後に、注射された物質がＥＣＦにより希釈されるので、ＣＥ１００−４は、同じ希釈度の速効型インスリン類似体及びＲＨＩより小さい平均サイズを有する。

【0087】

（実施例８）
インスリンの分析用超遠心分離
材料及び方法
浮力有効モル重量に比例する推定の重量平均沈降係数（Ｓｖｅｄｂｅｒｇｓ ２０℃、水 Ｓ（２０、ｗ））を決定する、分析用超遠心法を用いた一連の実験を開発した。この分析の手順は、光散乱サイズ測定と多少異なっていた。第１に、各試料を、市販製品の希釈剤と組成が同じ希釈剤で希釈する。これを得るために、３ｋＤａ ＭＷカットオフを有するＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３膜フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてインスリンを希釈剤から分離した。最初の希釈剤を回収し、インスリン含量の存在について分析した。インスリン不含有が確認済みの希釈剤を用いて市販製品を希釈した。

【0088】

これらの最初のデータセットを用いて、安定単一種、又はそれ自体の希釈剤中の六量体、二量体、単量体から変化するもののいずれかとしてのインスリンを特徴づけした。分析用超遠心分離を用いて２セットのデータを得た。第１のセットのデータは、製剤の希釈剤を厳密に希釈することにより得た。市販の製剤の場合、これは、インスリン又は類似体を希釈剤から分離するセンチプレプ（ｃｅｎｔｉｐｒｅｐ）チューブにより得た。ろ液をタンパク質含量についてチェックし、確認後のものを第１回の実験における希釈剤に用いた。

【0089】

第２のセットの試料は、希釈剤の代わりにＥＣＦ緩衝液を置換して調製した。これが有効になるために、最も濃い試料を最初にＥＣＦで１：２に希釈した。次いで、ＥＣＦを用いてさらなる希釈を行った。ＣＥ１００−４の場合、ＥＣＦによる最初の希釈は、等電点を越えさせて任意の沈殿物を除去することを確実にするために１：４であった。これらの実験は、皮下注射後を模倣することを意図するものであった。

【0090】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。速度分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＸＬ分析用超遠心分離機により、干渉光学機器を用いて２０℃、５５，０００ＲＰＭにおいて実施した。サファイアウインドウを装着したダブルセクター合成バウンダリセルを用いて、試料及び基準メニスカスを一致させた。ローターを真空中２０℃で平衡化させ、２０℃で約１時間の後、ローターを５５，０００ＲＰＭまで加速した。干渉スキャンを５時間にわたり６０秒間隔で得た。

【0091】

いくつかの解析プログラムをデータについて実行して（ＤｃＤｔ＋ｖｅｒｓ．２．１．０２及びＳｅｄｆｉｔ、ｖｅｒｓ１１．３ｂ３）各試料に固有の情報を引き出した。Ｓｅｄｆｉｔプログラムからのデータを下の結果に示す。ＤｃＤｔは、濃度プロファイルの時間導関数を用いるモデル非依存性沈降係数分布ｇ（ｓ^＊）である。濃度の増加に伴うＳのより高い値への変化がない場合、それは、可逆的反応が起こっていない（すなわち、単量体、二量体、六量体）という強い証拠である。希釈によりサイズ及び形状が変化する場合（六量体から、二量体、単量体への変化）、推定の分子量を決定することは可能でないが、沈降係数Ｓ（ｗ）に関するＳｅｄｆｉｔプログラムから有用な情報を得ることができる。さらに、このプログラムは、Ｌａｍｍ方程式^３によるモデルに基づく数値解を用い、個々のデータセットについて直接的境界モデルを産出する。それは、連続沈降係数ｃ（ｓ）を沈降係数（ｓ）に対してプロットして、沈降種の相対的サイズを記述する曲線を作製する。

【0092】

インスリン固有の希釈剤による各インスリンの希釈：
Ａ．ＲＨＩ
ＲＨＩを沈降速度超遠心分離による分析にかけた。推定保存溶液濃度は、３．７４５ｍｇ／ｍｌであった。希釈剤は、上記の通りであった。

【0093】

以下の物理定数は、Ｓｅｄｎｔｅｒｐプログラム^５を用いてそのタンパク質のアミノ酸組成から計算した。
ＲＨＩ： ＭＷ_ｓｅｑ＝５７９２Ｄａ Ｎ_２０°＝０．７２６ｍｌ／ｇ
希釈剤の密度及び粘度は、Ｓｅｄｎｔｅｒｐを用いてそれぞれ２０℃で１．００２３１ｇ／ｍｌ及び０．０１０４１ポイズと計算された。

【0094】

結果
図９ＡにＲＨＩ（商標）の負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のプロットを示す。正規化ｃ（ｓ）プロットについて示したデータは、ＤｃＤｔ＋からのｇ（ｓ^＊）データと一致している。濃度の増加に伴う沈降におけるＳのより低値への著しい変化がある。

【0095】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0096】

【表4】

結論：
これら解析は、ＲＨＩがその実験条件下で主として六量体として存在することを示している。より低濃度の試料中存在する少量のより遅い沈降性物質並びに六量体からの二量体と思われるものが存在する。

【0097】

Ｂ．ＩＬ
材料及び方法は、上記の通りであった。

【0098】

結果
図９Ｂは、各濃度についての重量平均沈降係数のプロットである。そのタンパク質は、希釈により解離する。さらに、おそらく六量体からの二量体である少量（＜５％）のより速い沈降性種が存在するのは明らかである。

【0099】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0100】

【表5】

結論：
これら解析は、そのタンパク質試料ＩＬがこの実験の条件下で主として六量体として存在することを示している。希釈によるＩＬの解離の証拠があり、存在する六量体からの二量体であると思われるものが少量存在する。試験した濃度は、約３０μｍ、１００μｍ、３００μｍ及び６００μｍ（単量体単位）であった。

【0101】

Ｃ．ＩＡ
材料及び方法は、上記の通りであった。

【0102】

結果
図９Ｃに、負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のプロットを示す。正規化ｃ（ｓ）プロットについて示したデータは、ＤｃＤｔ＋からのｇ（ｓ^＊）データと一致している。低濃度におけるｃ（ｓ）曲線は、濃度が増加するにつれて減少するより小さい種（単量体）の寄与を示している。濃度の増加に伴う沈降におけるＳのより低値へのわずかな変化もある。おそらく六量体からの二量体である少量（＜５％）のより速い沈降性種が存在することは明らかである。

【0103】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0104】

【表6】

結論：
これら解析は、ＩＡがこの実験の条件下で主として六量体として存在することを示している。希釈によるＩＡの解離の証拠があり、存在する六量体からの二量体であると思われるものが少量存在する。試験した濃度は、約３０μｍ、１００μｍ、３００μｍ及び６００μｍ（単量体単位）であった。

【0105】

Ｄ．ＣＥ−１００ ４
材料及び方法は、上記の通りであった。

【0106】

結果
ＣＥ−１００ ４のデータベースをＳｅｄｆｉｔ及びｃ（ｓ）モデルを用いて解析した。厳密に言えば、このモデルは、非相互作用性混合物にのみ適用できるが、相互作用性種の場合、溶解して存在する種についてのアイデアを得ることができる。図９Ｄでは、負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のプロットを示す。ｃ（ｓ）プロットは、希釈により、より低いＳ値への著しい変化があるという点でＤｃＤｔ＋からのｇ（ｓ^＊）データと一致している。より高い濃度におけるｃ（ｓ）プロットは、ＣＥ１００−４が六量体より大きい場合があることを明確に示している。

【0107】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0108】

【表7】

結論：
これら解析は、タンパク質試料ＣＥ１００−４がこの実験の条件下で単量体、二量体、六量体及びおそらくより大きいオリゴマーの間の平衡状態で存在することを示している。試験した濃度は、約３０μｍ、１００μｍ、３００μｍ及び６００μｍ（単量体単位）であった。

【0109】

ＥＣＦ緩衝液による希釈：
市販の製剤を最初にＥＣＦで１：２に希釈した。ただし、１：４に希釈したＣＥ１００−４を除く。ｐＨ４で開始するので、等電点による沈殿を避けるために、これを別に処理しなければならなかった。他の市販のインスリンは、既にｐＨ７であり、そのため最初の希釈は１：２とした。

【0110】

Ａ．ＲＨＩ
ＲＨＩを沈降速度超遠心分離による分析にかけた。推定保存液濃度は、等容量の供給されたＥＣＦで希釈した後に１．８７ｍｇ／ｍｌであった。

【0111】

以下の物理定数は、Ｓｅｄｎｔｅｒｐプログラム^５を用いてそのタンパク質のアミノ酸組成から計算した。
ＲＨＩ： ＭＷ_ｓｅｑ＝５７９２Ｄａ、 Ｎ_２０°＝０．７２６ｍｌ／ｇ
希釈剤の密度及び粘度は、Ｓｅｄｎｔｅｒｐを用いてそれぞれ２０℃で１．００２７３ｇ／ｍｌ及び０．０１０４３ポイズと計算された。

【0112】

分析に用いた３つのセルについての保存溶液を用いた希釈スキームを下表に示す。

【0113】

【表8】

Ｌａｍｍ方程式^３によるモデルに基づく数値解を用いた個々のデータセットに対して、直接境界モデリングプログラムとともに、Ｓｅｄｆｉｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ １１．７１を用いた。

【0114】

連続沈降係数分布ｃ（ｓ）モデルを計算した。ｃ（ｓ）分布プロットは、摩擦係数の平均値を用いることにより拡散の広がり効果が除去されているため、他の解析方法と比べて鋭い。

【0115】

結果
図１０Ａでは、負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のプロットを示す。正規化ｃ（ｓ）プロットについて示したデータは、ＤｃＤｔ＋からのｇ（ｓ^＊）データと一致している。ｃ（ｓ）プロットはほぼ一致しているが、濃度の増加に伴う沈降におけるＳのより低値へのわずかな変化がある。

【0116】

２つの最低濃度試料中に少量（＜１％）のより遅い沈降性物質、及びおそらく六量体からの二量体である少量（＜３％）のより速い沈降性種が存在することは明らかである。濃度の増加に伴うより遅い種の減少及びより速い種の増加は、試験した濃度範囲にわたるＲＨＩの自己会合の非常にわずかな変化があるにすぎないことを意味する。

【0117】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0118】

【表9】

結論：
これら解析は、ＲＨＩがこの実験の条件下で主として六量体として存在することを示している。より低濃度の試料中に非常に少量のより遅い沈降性物質並びに六量体からの二量体と思われるものが存在する。試験する濃度は、約３０μＭ、１００μ及び３００μＭ（単量体単位）であった。

【0119】

ＩＬ
方法は上記した。

【0120】

結果
図１０Ｂでは、負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のプロットを示す。正規化ｃ（ｓ）プロットについて示したデータは、ＤｃＤｔ＋からのｇ（ｓ^＊）データと一致している。低濃度におけるｃ（ｓ）曲線は、濃度が増加するにつれて減少するより小さい種（おそらく二量体）の有意な寄与を示している。濃度の増加に伴う沈降におけるＳのより低値へのわずかな変化もある。

【0121】

２つのより高濃度の試料で特に明らかである、少量（＜２％）のより速い沈降性種があることは明らかである。

【0122】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0123】

【表10】

結論：
これら解析は、ＩＬがこの実験の条件下で主として六量体として存在することを示している。希釈によるＩＬの解離の証拠があり、存在する六量体からの二量体であると思われるものが少量存在する。試験する濃度は、約３０μＭ、１００μ及び３００μＭ（単量体単位）であった。

【0124】

インスリンアスパルト（ＩＡ）
方法は上記した。

【0125】

結果
図１０Ｃでは、負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のプロットを示す。正規化ｃ（ｓ）プロットについて示したデータは、ＤｃＤｔ＋からのｇ（ｓ^＊）データと一致している。低濃度におけるｃ（ｓ）曲線は、濃度が増加するにつれて減少する少量のより小さい種（単量体／二量体）を示している。濃度の増加に伴う沈降におけるＳのより低値へのわずかな変化もある。グラフは、そのタンパク質が希釈によりわずかに解離することを示している。さらに、六量体からの二量体であり得る少量（最高濃度試料で約３％）のより速い沈降性種が存在することは明らかである。

【0126】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0127】

【表11】

結論：
これら解析は、ＩＡがこの実験の条件下で主として六量体として存在することを示している。希釈によるＩＡの解離の証拠があり、存在する六量体からの二量体であると思われるものが少量存在する。試験する濃度は、約３０μＭ、１００μ及び３００μＭ（単量体単位）であった。

【0128】

Ｄ．ＣＥ１００−４
材料
推定保存液濃度は、３容量の供給されたＥＣＦで１容量の溶液を希釈した後に０．９３６ｍｇ／ｍｌであった。

【0129】

方法
分析に用いた４つのセルについて、保存溶液を用いた希釈スキームを以下の表に示す。

【0130】

【表12】

結果
ＣＥ１００−４についてデータベースをＳｅｄｆｉｔ及びｃ（ｓ）モデルを用いて解析した。厳密に言えば、このモデルは、非相互作用性混合物にのみ適用できるが、相互作用性種の場合、溶解して存在する種についてのアイデアを得ることができる。図１０Ｄに負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のプロットを示す。ｃ（ｓ）プロットは、希釈によりより低いＳ値への著しい変化があるという点で、ＤｃＤｔ＋からのｇ（ｓ^＊）データと一致している。より高い濃度におけるｃ（ｓ）プロットは、ＣＥ１００−４が六量体より大きくあり得ることを明確に示している。

【0131】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0132】

【表13】

これら解析は、ＣＥ１００−４がこの実験の条件下で、最高濃度では単量体、二量体、六量体及びおそらくより大きいオリゴマーの間の平衡状態で存在することを示している。試験した濃度は、約３０μＭ、７０μＭ及び１４５μＭ（単量体単位）であった。

【0133】

ＨＣｌ ｐＨ２又はＮａＯＨ ｐＨ７で調整した水中の対照
以下の物理定数は、Ｓｅｄｎｔｅｒｐプログラム^５を用いてそのタンパク質のアミノ酸組成から計算した。
ＩＣ−ｐＨ７： ＭＷ_ｓｅｑ＝５７９２Ｄａ Ｎ_２０°＝０．７２６ｍｌ／ｇ
希釈剤の密度及び粘度は、Ｓｅｄｎｔｅｒｐを用いてそれぞれ２０℃で０．９９８２３ｇ／ｍｌ及び０．０１００２ポイズと計算された。

【0134】

内部対照ＩＣ ｐＨ７
方法
分析に用いた４つのセルについての希釈剤としてのＮａＯＨを含む水、ｐＨ７を用いた希釈スキームを下表に示す。

【0135】

【表14】

連続沈降係数分布ｃ（ｓ）
ｃ（ｓ）分布プロットは、摩擦係数の平均値を用いることにより拡散の広がり効果が除去されているため、他の解析方法と比べて鋭い。

【0136】

結果
ＩＣ−ｐＨ７についてのデータセットをＳｅｄｆｉｔ及びｃ（ｓ）モデルを用いて解析した。厳密に言えば、このモデルは、非相互作用性混合物にのみ適用できるが、相互作用性種の場合、溶解して存在する種についてのアイデアを得ることができる。図１１では、負荷濃度に対して正規化したｃ（ｓ）分布のプロットを示す。ｃ（ｓ）プロットは、希釈によりより低いＳ値への著しい変化があるという点でＤｃＤｔ＋からのｇ（ｓ^＊）データと一致している。

【0137】

標準状態に補正した、各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値を下表に示す。

【0138】

【表15】

解析は、この実験の条件下において、試料ＩＣ−ｐＨ７が、最低希釈度では二量体−六量体平衡状態で存在し、ここで用いた３つの最高濃度では六量体状態が著しく有利であることを示している。試験した濃度は、約３０μＭ、１００μＭ、３０５μＭ及び６２０μＭ（単量体単位）であった。

【0139】

内部対照ＩＣ ｐＨ２
方法：
上記のようにインスリンを０．０１Ｎ ＨＣｌで希釈した。

【0140】

結果：
主として負荷濃度の良好な推定を得るために、ＩＣ−ｐＨ２のデータセットをＳｅｄｆｉｔ及びｃ（ｓ）モデルを用いて解析した。各負荷濃度についての重量平均沈降係数について得られた値は、ＤｃＤｔ＋を用いて決定された値とかなり良く一致していた。Ｓｅｄｆｉｔを用いて決定されたＳ_２０．ｗ値の表を下に示す。

【0141】

【表16】

これらの解析は、ＩＣ−ｐＨ２が、この実験の条件下で主として単一種（おそらくインスリン単量体）として存在し、さらなる自己会合の傾向がないことを示している。溶媒の状態は、支持電解質の欠如のため高度に非理想的であった。試験した濃度は、約３０μＭ、９７μＭ、３０５μＭ及び６２０μＭ（単量体単位）であった。

【0142】

全般的結論、沈降分析
ＤｃＤｔソフトウエアを用いたＲＨＩ分子量の推定により、その分子量が全希釈範囲にわたって六量体と一致していること（３５．６±１．６ｋＤａ）が確認された。単量体インスリン（２．２９ｎｍ）の標準であるｐＨ２インスリンの対照値は、希釈系列にわたって本質的に未変化のままである１．２８Ｓ（２０、ｗ）の沈降係数値を有し、その単量体状態が確認される。全濃度における対照の非安定化インスリン、ｐＨ７は、六量体であるが、ｐＨ７希釈剤による希釈によるサイズの減少によって実証されたように、より小さい二量体形態と動的平衡状態にある。ＩＡ及びＩＬは、六量体サイズ範囲で始まり、ＥＣＦで１：１６に希釈した後に単量体／二量体形態の小集団を有する。ＣＥ１００−４の単量体／二量体粒子の割合がより高いことは、そのより速やかな吸収プロファイルと一致する。

【0143】

（実施例１０）
インスリン、ｐＨ７．４へのクエン酸ナトリウム及びＥＤＴＡの添加によるインスリンサイズに対する効果の測定
ＣＥＳ１００−４のｐＨの７への上昇がブタモデルにおける速やかな吸収及びＭａｌｖｅｒｎによるサイズの減少を示したので、クエン酸三ナトリウムの代わりにクエン酸を用いることがｐＨ７．４でも有効であるかどうかを確認するために代替方法を設計した。

【0144】

材料及び方法
ＥＤＴＡ二ナトリウム（１．８ｍｇ／ｍＬ）及びクエン酸三ナトリウム（１．８ｍｇ／ｍＬ）をグリセリン（２２ｍｇ／ｍＬ）を含む水に溶解した。インスリンを３．８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶液に加えた。水酸化ナトリウムを滴下して加えｐＨを７．４に上昇させた。次いで、未希釈物質を平均粒径についてＭａｌｖｅｒｎで分析し、次いで、細胞外液緩衝液（ＥＣＦ）で希釈し、希釈系列に沿った各時点に粒径を決定した。

【0145】

結果
ＣＳＥ１００−７、すなわち、ＥＣＦ緩衝液で希釈したクエン酸ナトリウムインスリンｐＨ７．４を酸性及び中性環境におけるクエン酸製剤と比較した。結果を図１２に示す。図１２は、ＣＥ１００−７ ｐＨ７．５及びクエン酸の代わりにクエン酸ナトリウムを含有するＣＳＥ１００−７、ｐＨ７．４について、希釈度に応じたインスリン平均粒径（ｎｍ）のグラフである。

【0146】

結果は、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ及び中性ｐＨで溶解したインスリンを混合することによって、速やかに解離するインスリンを得ることができることを示している。平均粒径は、最初は一般的な六量体より大きく、これは、六量体が解離し、インスリン分子の緩く会合した多量体の形態にあることを推定して示している。注射後環境（ＥＣＦにより希釈）における１：２希釈により、インスリンは、より小さい単位（インスリン二量体である可能性が最も高い）に速やかに解離する。新たな製剤は、最初にｐＨ４で調製され、次にｐＨ７にされたクエン酸／ＥＤＴＡインスリン製剤として正確に挙動する。

【0147】

（実施例１１）
糖尿病ミニブタにおけるクエン酸ＥＤＴＡインスリンｐＨ７
材料及び方法
インスリンは、インスリン（３．８ｍｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ二ナトリウム（１．８ｍｇ／ｍｌ）、クエン酸（１．８ｍｇ／ｍｌ）、グリセリン及びｍ−クレゾール（３ｍｇ／ｍｌ）を混合し、ＨＣｌを用いてｐＨを４に調整することにより調製した。次いで、溶液のｐＨをＮａＯＨの添加によりｐＨ７に上昇させた。これにより、製剤がインスリンの等電点を短時間通過して、混濁した混合物が生じ、それは、７．４の最終ｐＨに到達したときに清澄化した。ＣＥ１００−７は、食事の前にブタに食事インスリンとして投与した。

【0148】

６匹の雄糖尿病ミニブタ（３０〜５０ｋｇ）に最初に０．２５Ｕ／ｋｇの試験インスリンを投与し、次いで、直ちに５００ｇの標準ブタ飼料を与えた。血液試料を給餌前−３０、−２０、−１０、０分に、次いで投薬後５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０分に採取した。２ｍＬの血液試料を頸静脈カテーテルを介して採取し、そのうちの１滴を標準グルコースストリップ法を用いてグルコース測定をチェックするのに用い、残りの試料をＫ_２ＥＤＴＡで処理し、血漿試料を将来の分析用に凍結した。

【0149】

結果
ｐＨ７製剤の薬物動態プロファイルを図１３に示す。この非常に速やかなプロファイルは、実施例６において糖尿病患者で示されたデータと一致している。クエン酸及びＥＤＴＡを含有する酸製剤のｐＨの７への上昇は、糖尿病ミニブタにおいて非常に十分に機能した。このｐＨの変化により、クエン酸がクエン酸ナトリウムになった。したがって、クエン酸の塩形態が酸と同様に十分に働く。

【0150】

本発明の改変及び変形は、上述の記載から当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【図6】