特許 5795295 遊離チオール部分を有するタンパク質の安定化された組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5795295

(24)【登録日】2015年8月21日

(45)【発行日】2015年10月14日

(54)【発明の名称】遊離チオール部分を有するタンパク質の安定化された組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/46 20060101AFI20150928BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20150928BHJP

   A61K 47/34 20060101ALI20150928BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20150928BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/54

   A61K47/26

   A61K9/08

   A61K47/20

   A61K47/34

   A61P3/00

【請求項の数】26

【外国語出願】

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2012-205511(P2012-205511)

(22)【出願日】2012年9月19日

(62)【分割の表示】特願2008-554476(P2008-554476)の分割

【原出願日】2007年2月6日

(65)【公開番号】特開2013-10785(P2013-10785A)

(43)【公開日】2013年1月17日

【審査請求日】2012年9月19日

(31)【優先権主張番号】60/771,555

(32)【優先日】2006年2月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507159304

【氏名又は名称】シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】カオチョン チュー

(72)【発明者】

【氏名】クリス ロウ

(72)【発明者】

【氏名】ザーラ シャーロク

(72)【発明者】

【氏名】ビン グエン

【審査官】 上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】 特許第５３６４３８２（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 国際公開第２００４／００７５２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平０８−５０７６７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５０５４３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０６９１９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 KATAKAM,M. et al，Journal of Pharmacy and Pharmacology，１９９５年，Vol.47, No.2，p.103-107

【文献】 LEE,Y. et al，Journal of protein chemistry，１９９５年，Vol.14, No.3，p.127-37

【文献】 ANDYA,J.D. et al，Pharmaceutical research，１９９９年，Vol.16, No.3，p.350-8

【文献】 ANDYA,J.D. et al，AAPS PharmSci，２００３年，Vol.5, No.2，Article 10

【文献】 ANDERSSON,M.M. et al，Biotechnology and applied biochemistry，２０００年，Vol.32，p.145-53

【文献】 MIROLIAEI,M. et al，Enzyme and Microbial Technology，２００１年，Vol.29, No.8-9，p.554-559

【文献】 PASSOT,S. et al，European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics，２００５年，Vol.60, No.3，p.335-48

【文献】 NGUYEN,T.H. et al，ACS Symp Ser，１９９４年，No.567，p.59-71

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−５８

Ａ６１Ｋ ９／００−７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）を含む薬学的組成物の製造方法であって、該方法は、ＧＣＢ調製物を提供する工程および該ＧＣＢをスクロースとともに処方する工程、ならびに、該ＧＣＢを不活性ガスと接触させて反応性種の量を減少させる工程、および、該ＧＣＢと該不活性ガスと該スクロースを気密性容器に導入する工程によって該組成物を包装する工程、を包含し、該容器が、Ｏ_２が３％未満のヘッドスペースを含み、該組成物のｐＨが４．５と６．５との間であり、スクロースの量が少なくとも５％であり、そして該スクロースが、該ＧＣＢの安定性の維持に十分な量で存在する、方法。

【請求項2】

前記スクロースが前記ＧＣＢの安定性の増大に十分な量で存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記安定性が、予め選択された条件下で、前記スクロースを欠くことが相違点である組成物の安定性よりも少なくとも５〜８０％高い、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記スクロースは、前記ＧＣＢの第１の分子上の遊離チオールが該ＧＣＢの第２の分子上の遊離チオールと反応して凝集体を形成するのを阻害するのに十分な量で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記スクロースは、前記ＧＣＢの第１の分子上の遊離チオールと該ＧＣＢの第２の分子上の遊離チオールとの反応によって形成された凝集体の形成を、予め選択された条件下で、該スクロースを欠く同一の組成物と比較して少なくとも５〜８０％阻害するのに十分な量で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記スクロースが、２〜８℃の温度の気密性容器中で６ヶ月間の保存の際、前記組成物が、前記組成物が保存前に有していた安定性の少なくとも８５％を保持するのに十分な量で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記保存を暗所で行う、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記スクロースが、スクロース、０．０１％ポリソルベート−２０、ｐＨ６．０、５０ｍＭクエン酸塩を含む凍結乾燥組成物の安定性に匹敵する安定性を有するのに十分な量で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記スクロースが、前記ＧＣＢの生化学的完全性および生物活性の性質を維持するのに十分な量で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記組成物が抗酸化剤をさらに含み、該抗酸化剤および前記スクロースが前記ＧＣＢの安定性の維持に十分な量で存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記抗酸化剤が、システイン、システイン−ＨＣｌ、またはメチオニンである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記組成物が界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記界面活性剤がポロクサマー１８８である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記組成物が１０％未満のＯ_２を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記組成物からのＯ_２の物理的除去をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＧＣＢが、ＧＣＢの活性単位あたり、２つ、３つまたはそれを超える遊離チオール基を有し、スルフヒドリル架橋を形成する０、２つ、４つまたはそれを超えるチオール基を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記組成物を不活性ガスに曝露する工程をさらに含み、該不活性ガスが、周囲大気よりも高い濃度で存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記ヘッドスペースが、少なくとも９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の不活性ガスを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記容器が、予め充填されたシリンジ、バイアル、またはアンプルである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記予め充填されたシリンジが針無しシリンジである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記不活性ガスがＮ_２またはＡｒであり、前記反応性種がＯ_２である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記組成物が液体である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記組成物が抗酸化剤をさらに含み、該抗酸化剤が、０．００１％と１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間で存在する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記組成物が、ｐＨ５．５〜６．０で０．１〜４０ｍｇ／ｍｌ ＧＣＢ、０．００１〜１０％システイン、５〜３０％スクロースを含み、溶存酸素レベルが１０％未満である、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

前記組成物がポリソルベートを含まない、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記組成物のｐＨが５．５と６．０との間である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願への相互参照）
この出願は、２００６年２月７日に出願された米国出願第６０／７７１，５５５号への優先権を主張する。先の出願の開示は、この出願の開示の一部とみなされる（参考として、この出願の開示に援用される）。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、遊離チオールを有するタンパク質の組成物ならびにかかる組成物の作製方法および使用方法に関する。組成物は、至適な安定性を有する。

【背景技術】

【0003】

（発明の背景）
薬品（例えば、タンパク質を含む）を、液体または凍結乾燥（すなわち、フリーズドライ）形態で保存することができる。凍結乾燥薬品は、しばしば、患者への使用直前に適切な投与希釈剤の添加によって再構成される。

【0004】

活性タンパク質は、物理的不安定性（変性および凝集が含まれる）および化学的不安定性（例えば、加水分解、脱アミド化、および酸化が含まれる）の結果として失活し得る。特定の形態（例えば、液体または凍結乾燥形態）のタンパク質薬の安定性は、製品形態の選択における重要な検討材料であり得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

（発明の概要）
一般に、本発明は、炭水化物がタンパク質（したがって、組成物）の安定性を維持するのに十分な量で存在する、遊離チオール（−Ｓ−Ｈ）を有するタンパク質（例えば、システイン残基）および／または酸化の影響を受けやすい他の部分（例えば、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔ部分）および炭水化物を含む組成物を特徴とする。特に好ましい実施形態では、保護すべき部分は、遊離チオールである。

【0006】

本明細書中に記載の組成物および方法により、組成物中に含まれるタンパク質の安定性の増大によって安定性および保存期間が増大する。

【0007】

本明細書中に記載の組成物（例えば、タンパク質を含む液体組成物）は、安定な期間が長い。例えば、予め選択した条件下で（例えば、２〜８℃で３、６、９、１２、または２４ヶ月間（またはいくつかの実施形態ではより長い）の気密性容器での保存の際）、組成物中のタンパク質は、保存前の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の安定性を保持するであろう。本明細書中で使用する場合、安定性は、タンパク質構造（例えば、タンパク質構造の変化の最小化または防止（例えば、タンパク質凝集またはタンパク質変性（例えば、断片化）））、および／またはタンパク質の生物学的活性（例えば、基質を生成物に変換する能力）などのパラメーターを含む。

【0008】

タンパク質安定性を、例えば、タンパク質凝集、タンパク質分解、またはタンパク質の生物学的活性レベルの測定によって測定することができる。タンパク質凝集を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、非変性ＰＡＧＥ、または他のサイズ決定方法などによって決定することができる。例えば、組成物は、保存（例えば、２〜８℃で３、６、９、１２、または２４ヶ月間まで（またはそれ以上）の保存）前の組成物中に存在するタンパク質凝集量と比較して、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィによって測定した場合）タンパク質凝集量の増加量が１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％未満であり得る。タンパク質分解を、例えば、逆相ＨＰＬＣ、非変性ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィ、ペプチドマッピング、または類似の方法によって決定することができる。例として、組成物は、保存（例えば、２〜８℃で３、６、９、１２、または２４ヶ月間まで（またはそれ以上）の保存）前の組成物中に存在するタンパク質凝集量と比較して、（例えば、逆相ＨＰＬＣによって測定した場合）タンパク質分解量の増加量が１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％未満であり得る。タンパク質の生物学的活性を、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ（結合または酵素活性を測定するため））および多の酵素アッセイ（例えば、分光学的アッセイ、蛍光測定アッセイ、熱量測定アッセイ、化学発光アッセイ、放射分析アッセイ、またはクロマトグラフィアッセイ）、およびキナーゼアッセイなどによって測定することができる。例として、組成物は、保存（例えば、２〜８℃で３、６、９、１２、または２４ヶ月間まで（またはそれ以上）の保存）前の組成物中に存在する生物学的活性と比較して、タンパク質の生物学的活性（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって測定した酵素活性）の減少量が１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％未満であり得る。

【0009】

１つの態様では、タンパク質は、組成物のいかなる他の成分も改変（例えば、切断）しない。例えば、１つの好ましい実施形態では、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）を含む組成物では、ＧＣＢは基質としてポリソルベートを認識してポリソルベートを切断して遊離脂肪酸を放出することができるので、組成物は、界面活性剤としてポリソルベートを含まない。

【0010】

本発明の実施形態は、同一タンパク質の凍結乾燥組成物に匹敵する安定性を有する。本明細書中に記載の液体組成物は、３、６、１２、１８、または２４ヶ月間の保存後に、凍結乾燥組成物の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％のタンパク質安定性レベル（例えば、保持活性）を有し得る（例えば、凍結乾燥組成物が１８ヶ月間でその活性を９０％保持する場合、本発明の組成物は、そのレベルを少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％保持する）。

【0011】

１つの態様では、開示は、遊離チオールを有するタンパク質および炭水化物を含む組成物であって、炭水化物がタンパク質の安定性の維持に十分な量で存在し、組成物のｐＨが７．０未満である、組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、組成物は抗酸化剤も含み、抗酸化剤および炭水化物がタンパク質（したがって、組成物）の安定性の維持に十分な量で存在し、組成物のｐＨは７．０未満である。例えば、抗酸化剤は、システイン、システイン塩酸塩（システイン−ＨＣｌ）、またはメチオニンであり（例えば、約０．００１％と約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間で存在する）、炭水化物はスクロースまたはトレハロースである（例えば、約１％と約４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間で存在する）。一定の実施形態では、ｐＨは、約４．５〜約６．５の範囲であり、例えば、約５．０と６．０との間が好ましく、例えば、約５．５と約５．８との間（例えば、約５．７）がより好ましい。好ましい実施形態では、組成物は、界面活性剤（例えば、ポロクサマー１８８）を含む。

【0012】

好ましい実施形態では、組成物のｐＨは、例えば、約４．５と約６．５との間、例えば、約５．０と約６．０との間、例えば、約５．５と約５．８との間（例えば、約５．７）である。

【0013】

一定の実施形態では、安定性は、予め選択された条件下で、炭水化物（使用する場合、および抗酸化剤）を欠くことが相違点である組成物の安定性よりも少なくとも５〜８０％高い（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％高い）。

【0014】

一定の実施形態では、炭水化物（および任意選択的に抗酸化剤）は、タンパク質の遊離チオールの安定に十分な量で存在する（例えば、タンパク質は、より少ない凝集体形成を示す（例えば、タンパク質は、予め選択された条件下で、炭水化物（使用する場合、および抗酸化剤）を含まない同一タンパク質の組成物よりも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、少ない凝集体形成を示す））。

【0015】

一定の実施形態では、炭水化物（および任意選択的に抗酸化剤）は、タンパク質の安定性の増大に十分な量で存在する（例えば、タンパク質は、より少ない凝集体形成を示す（例えば、タンパク質は、予め選択された条件下で、炭水化物（使用する場合、および抗酸化剤）を含まない同一タンパク質の組成物よりも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、少ない凝集体形成を示す））。

【0016】

一定の実施形態では、炭水化物（および任意選択的に抗酸化剤）は、タンパク質の第１の分子上の遊離チオールがタンパク質の第２の分子上の遊離チオールと反応して凝集体を形成するのを阻害するのに十分な量で存在する。

【0017】

一定の実施形態では、炭水化物（および任意選択的に抗酸化剤）は、タンパク質の第１の分子上の遊離チオールのタンパク質の第２の分子上の遊離チオールとの反応によって形成された凝集体の形成を、予め選択された条件下で、炭水化物（存在する場合、および抗酸化剤）を欠く同一の組成物と比較して少なくとも５〜８０％阻害するのに十分な量で存在する（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％高い）。

【0018】

一定の実施形態では、炭水化物（および任意選択的に抗酸化剤）は、２〜８℃の気密性容器中で６ヶ月間の保存の際、組成物の保存前の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の安定性を保持するのに十分な量で存在する。好ましい実施形態では、保存を暗所で行う。

【0019】

一定の実施形態では、炭水化物（および任意選択的に抗酸化剤）は、約０．０１％ポリソルベート−２０、ｐＨ６．０、５０ｍＭクエン酸塩を含む凍結乾燥組成物に匹敵する安定性を有するのに十分な量で存在する。一定の実施形態では、組成物は、約１〜４０％（例えば、約５〜約３０％、例えば、約８〜約２４％、例えば、約１６％、例えば、約３〜５％（体積あたり重量）（ｗ／ｖ））の炭水化物（例えば、スクロースまたはトレハロース）をさらに含む。いくつかの実施形態では、炭水化物は、好ましくは、スクロースである。

【0020】

好ましい実施形態では、組成物は液体である。

【0021】

一定の実施形態では、組成物は、約１０％未満のＯ_２（例えば、約５％未満のＯ_２、例えば、約２％未満のＯ_２）を含む。好ましい実施形態では、溶存Ｏ_２量は、組成物中の溶存不活性ガス量未満である。

【0022】

一定の実施形態では、組成物を、組成物からのＯ_２の物理的除去（例えば、組成物の脱気、Ｏ_２以外の気体（例えば、不活性ガス（例えば、Ｎ_２またはＡｒ））での溶液のパージング、例えば、組成物へのＯ_２以外の気体（例えば、Ｎ_２またはＡｒ）のバブリング）を含む方法によって作製する。

【0023】

一定の実施形態では、遊離チオールを含む組成物中のタンパク質は、スルフヒドリル架橋を形成する０、２つ、４つ、６つ、またはそれを超えるチオール基を有する。一定の実施形態では、遊離チオールを含むタンパク質は、タンパク質の活性単位あたり、スルフヒドリル架橋を形成する２つ、３つ、またはそれを超える遊離チオール基を有し、０、２つ、４つ、またはそれを超えるチオール基を有する。

【0024】

一定の実施形態では、遊離チオールを含むタンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、ヘモグロビン、チオレドキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）、β−ラクトグロブリンＢ、β−ラクトグロブリンＡＢ、血清アルブミン、抗体（例えば、ヒト抗体、例えば、ＩｇＡ（例えば、二量体ＩｇＡ）、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２）、およびＩｇＭ；組換えヒト抗体）、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、（例えば、第３の重鎖定常ドメイン（例えば、ＥＵ／ＯＵナンバリングにおける４４２位）；モノクローナル抗体ＭＮ−１４（高親和性抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ｍａｂ）中に）システイン残基が導入されるように（例えば、抗体または抗体フラグメントを、例えば、９９ｍＴｃで臨床画像に標識することができるように）操作された抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’（例えば、モノクローナル抗体フラグメントＣ４６．３）およびｓｃＦｖ）、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｍ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−β）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、グルテンタンパク質、酸性スフィンゴミエリナーゼ（組換え酸性スフィンゴミエリナーゼ）、デスフロイルセフチオフル（ＤＦＣ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ）および他の低密度リポタンパク質ドメイン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異型（ｖａｒｉａｎｔ）（例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ミラノ）およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（パリ））、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、ＣＡＡＸモチーフを含むタンパク質およびペプチド模倣物（例えば、Ｒａｓ）、粘液溶解物質、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、骨格筋Ｃａ^２＋放出チャネル／リアノジン受容体（ＲｙＲ１）、核性因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、ＡＰ−１、タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、糖タンパク質１ｂα（ＧＰ１ｂα）、カルシニューリン（ＣａＮ）、フィブリン−１、ＣＤ４、Ｓ１００Ａ３（Ｓ１００Ｅとしても公知）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ヒトインターαインヒビター重鎖１、α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）、トロンボスポンジン（糖タンパク質Ｇとしても公知）、ゲルソリン、ムチン、クレアチンキナーゼ（例えば、Ｓ−チオメチル修飾クレアチンキナーゼ）、第ＶＩＩＩ因子、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、インスリン受容体βサブユニット、アセチルコリンエステラーゼ、プロキモシン、修飾α２−マクログロブリン（α２Ｍ）（例えば、プロテイナーゼまたはメチルアミン反応性α２Ｍ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、補体成分Ｃ２（例えば、２ａ）、補体成分Ｃ３（例えば、Ｃ３ｂ）、補体成分４（例えば、４ｄ）、補体因子Ｂ（例えば、Ｂｂ）、α−ラクトアルブミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、ＲＮアーゼインヒビター、リポコルチン１（アネキシン１としても公知）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アクチン（例えば、球状アクチン）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（例えば、ブチル−ＣｏＡシンテターゼ）、３−２トランス−エノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼ前駆体、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）感受性グアニル酸シクラーゼ、Ｐｚ−ペプチダーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｐ−４５０およびＮＡＤＰＨ−Ｐ−４５０レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンテターゼ、ルトロピン受容体、低分子量酸性ホスファターゼ、血清コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アドレノドキシン、ヒアルロニダーゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、シトクロムｃ１ヘムサブユニット、Ｓ−タンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶＲＳ）、α−アミラーゼＩ、筋肉ＡＭＰデアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびソマトスタチン結合タンパク質からなる群から選択される。

【0025】

好ましい実施形態では、遊離チオールを有するタンパク質はＧＣＢである。

【0026】

別の好ましい実施形態では、遊離チオールを有するタンパク質はｂＦＧＦである。

【0027】

１つの態様では、開示は、ｐＨ７．０未満でＧＣＢおよび炭水化物を含み、組成物の不活性ガス（例えば、Ｎ_２）への曝露によって生成し、不活性ガスが、周囲雰囲気（ａｍｂｉｅｎｔ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）よりも高い濃度で存在する（例えば、組成物は、少なくとも約８５％、９０％、９５％、または９９％、または好ましくは１００％の不活性ガスを含む）、ＧＣＢの液体組成物を特徴とする。一定の実施形態では、組成物は、抗酸化剤も含む。例えば、抗酸化剤は、システイン、システインHCｌ、またはメチオニン（例えば、約０．００１％と約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間で存在する）であり、炭水化物はスクロースまたはトレハロース（約１％と約４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間で存在する）である。一定の実施形態では、ｐＨは、約４．５〜約６．５の範囲であり、例えば、約５．０と６．０との間が好ましく、例えば、約５．５と約５．８との間（例えば、約５．７）がより好ましい。一定の実施形態では、組成物は、界面活性剤（例えば、ポロクサマー１８８）も含む。

【0028】

１つの態様では、開示は、遊離チオールおよび炭水化物を含み、タンパク質上の遊離チオールのｐＫａ未満のｐＨであるタンパク質を含む組成物であって、炭水化物が、前述のｐＨでタンパク質の安定性を増大するのに十分な量で存在する、組成物を特徴とする。

【0029】

一定の実施形態では、安定性は、予め選択された条件下で、炭水化物を欠き、且つタンパク質上の遊離チオールのｐＫａを超えるｐＨを有する組成物の安定性よりも少なくとも５〜８０％高い（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％高い）。

【0030】

一定の実施形態では、炭水化物は、タンパク質上の遊離チオールの安定化に十分な量で存在する。

【0031】

一定の実施形態では、炭水化物は、タンパク質の第１の分子上の遊離チオールがタンパク質の第２の分子上の遊離チオールと反応して凝集体を形成するのを阻害するのに十分な量で存在する。

【0032】

一定の実施形態では、炭水化物は、タンパク質の第１の分子上の遊離チオールのタンパク質の第２の分子上の遊離チオールとの反応によって形成された凝集体の形成を、予め選択された条件下で、炭水化物を欠く同一の組成物と比較して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％阻害するのに十分な量で存在する。

【0033】

好ましい実施形態では、炭水化物は、２〜８℃の気密性容器中で３、６、９、１２、または２４ヶ月間（またはそれを超える）の暗所での保存の際、組成物が保存前の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の安定性を保持するのに十分な量で存在する。

【0034】

一定の実施形態では、炭水化物は、組成物が凍結乾燥組成物に匹敵する安定性を有するのに十分な量で存在する。

【0035】

好ましい実施形態では、組成物は液体である。

【0036】

一定の実施形態では、組成物は、約１０％未満のＯ_２（例えば、約５％未満のＯ_２、例えば、約２％未満のＯ_２）を含む。一定の実施形態では、溶存Ｏ_２量は、組成物中の溶存不活性ガス量未満である。

【0037】

一定の実施形態では、組成物を、組成物からのＯ_２の物理的除去（例えば、組成物の脱気、Ｏ_２以外の気体（例えば、不活性ガス（例えば、Ｎ_２またはＡｒ））での溶液のパージング、例えば、組成物へのＯ_２以外の気体（えば、Ｎ_２またはＡｒ）のバブリング）を含む方法によって作製する。

【0038】

一定の実施形態では、遊離チオールを含む組成物中のタンパク質は、タンパク質の活性単位あたり、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える遊離チオール基を有する。

【0039】

一定の実施形態では、遊離チオールを含む組成物中のタンパク質は、タンパク質の活性単位（例えば、二量体）あたり、スルフヒドリル架橋を形成する２つ、４つ、６つ、またはそれを超えるチオール基を有する。一定の実施形態では、遊離チオールを含むタンパク質は、タンパク質の活性単位あたり、スルフヒドリル架橋を形成する２つ、３つ、またはそれを超える遊離チオール基を有し、２つ、４つ、またはそれを超えるチオール基を有する。

【0040】

一定の実施形態では、遊離チオールを含むタンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、ヘモグロビン、チオレドキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）、β−ラクトグロブリンＢ、β−ラクトグロブリンＡＢ、血清アルブミン、抗体（例えば、ヒト抗体、例えば、ＩｇＡ（例えば、二量体ＩｇＡ）、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２）、およびＩｇＭ；組換えヒト抗体）、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、（例えば、第３の重鎖定常ドメイン（例えば、ＥＵ／ＯＵナンバリングにおける４４２位）；モノクローナル抗体ＭＮ−１４（高親和性抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ｍａｂ）中に）システイン残基が導入されるように（例えば、抗体または抗体フラグメントを、例えば、９９ｍＴｃで臨床画像に標識することができるように）操作された抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’（例えば、モノクローナル抗体フラグメントＣ４６．３）およびｓｃＦｖ）、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｍ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−β）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、グルテンタンパク質、酸性スフィンゴミエリナーゼ（組換え酸性スフィンゴミエリナーゼ）、デスフロイルセフチオフル（ＤＦＣ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ）および他の低密度リポタンパク質ドメイン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異型（例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ミラノ）およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（パリ））、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、ＣＡＡＸモチーフを含むタンパク質およびペプチド模倣物（例えば、Ｒａｓ）、粘液溶解物質、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、骨格筋Ｃａ^２＋放出チャネル／リアノジン受容体（ＲｙＲ１）、核性因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、ＡＰ−１、タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、糖タンパク質１ｂα（ＧＰ１ｂα）、カルシニューリン（ＣａＮ）、フィブリン−１、ＣＤ４、Ｓ１００Ａ３（Ｓ１００Ｅとしても公知）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ヒトインターαインヒビター重鎖１、α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）、トロンボスポンジン（糖タンパク質Ｇとしても公知）、ゲルソリン、ムチン、クレアチンキナーゼ（例えば、Ｓ−チオメチル修飾クレアチンキナーゼ）、第ＶＩＩＩ因子、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、インスリン受容体βサブユニット、アセチルコリンエステラーゼ、プロキモシン、修飾α２−マクログロブリン（α２Ｍ）（例えば、プロテイナーゼまたはメチルアミン反応性α２Ｍ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、補体成分Ｃ２（例えば、２ａ）、補体成分Ｃ３（例えば、Ｃ３ｂ）、補体成分４（例えば、４ｄ）、補体因子Ｂ（例えば、Ｂｂ）、α−ラクトアルブミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、ＲＮアーゼインヒビター、リポコルチン１（アネキシン１としても公知）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アクチン（例えば、球状アクチン）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（例えば、ブチル−ＣｏＡシンテターゼ）、３−２トランス−エノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼ前駆体、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）感受性グアニル酸シクラーゼ、Ｐｚ−ペプチダーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｐ−４５０およびＮＡＤＰＨ−Ｐ−４５０レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンテターゼ、ルトロピン受容体、低分子量酸性ホスファターゼ、血清コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アドレノドキシン、ヒアルロニダーゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、シトクロムｃ１ヘムサブユニット、Ｓ−タンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶＲＳ）、α−アミラーゼＩ、筋肉ＡＭＰデアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびソマトスタチン結合タンパク質からなる群から選択される。

【0041】

好ましい実施形態では、遊離チオールを有するタンパク質はＧＣＢである。

【0042】

別の好ましい実施形態では、遊離チオールを有するタンパク質はｂＦＧＦである。

【0043】

１つの態様では、開示は、ＧＣＢおよび炭水化物を含み、約ｐＨ０と約ｐＨ７との間であり、炭水化物が、前述のｐＨでＧＣＢの生物物理学的／生化学的完全性（例えば、分子量、電荷分布）および生物活性の特徴／特性を維持するのに十分な量で存在する、ＧＣＢの液体組成物を特徴とする。例えば、組成物は、保存（例えば、２〜８℃で３、６、９、１２、または２４ヶ月間まで（またはそれ以上）の保存）前の生物学的活性の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％を保持する。別の例として、組成物中のタンパク質の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％が、保存（例えば、２〜８℃で３、６、９、１２、または２４ヶ月間まで（またはそれ以上）の保存）前の平均分子量または平均電荷分布を保持する。

【0044】

一定の実施形態では、ｐＨは、約４．５〜約６．５の範囲であり、例えば、約５．０〜６．０である（例えば、ｐＨは、約５．５〜約５．８（例えば、約５．７）である）。

【0045】

好ましい実施形態では、炭水化物は、スクロースまたはトレハロースである（例えば、約１％と約４０％との間、例えば、約３％と約５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の量で存在する）。

【0046】

１つの態様では、開示は、ＧＣＢ、抗酸化剤、炭水化物を含み、ｐＨ４．５〜６．５であるＧＣＢの液体組成物であって、組成物が、組成物の不活性ガス（例えば、Ｎ_２またはＡｒ）への曝露によって生成される、ＧＣＢの液体組成物を特徴とする。一定の実施形態では、ｐＨは、約４．５〜約６．５の範囲であり、例えば、約５．０〜６．０である（例えば、ｐＨは、約５．５〜約５．８（例えば、約５．７）である）。

【0047】

一定の実施形態では、液体組成物は、約０．１〜４０ｍｇ／ｍｌのＧＣＢ（例えば、より好ましくは、約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約２〜８ｍｇ／ｍｌまたは約５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約２ｍｇ／ｍｌ））、約０．００１〜１０％のシステイン（例えば、約０．０７５％）、約１〜４０％のスクロース（例えば、約１６％）、約ｐＨ５．５〜６．０（例えば、約５．７）を含み、溶存Ｏ_２量は約１０％未満（例えば、約５％未満、例えば、約２％未満）である。

【0048】

好ましい実施形態では、組成物は、界面活性剤（例えば、ポロクサマー１８８）も含む。

【0049】

１つの態様では、開示は、タンパク質成分およびヘッドスペースを含む気密性容器であって、タンパク質成分が遊離チオールを有するタンパク質であり、ヘッドスペースは少なくとも９０％、９５％、または９９％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の不活性ガスが存在する、気密性容器を特徴とする。

【0050】

一定の実施形態では、気密性容器は、予め充填されたシリンジ、バイアル、またはアンプルである。より好ましい実施形態では、予め充填されたシリンジは針無しシリンジである。

【0051】

一定の実施形態では、遊離チオールを含むタンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、ヘモグロビン、チオレドキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）、β−ラクトグロブリンＢ、β−ラクトグロブリンＡＢ、血清アルブミン、抗体（例えば、ヒト抗体、例えば、ＩｇＡ（例えば、二量体ＩｇＡ）、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２）、およびＩｇＭ；組換えヒト抗体）、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、（例えば、第３の重鎖定常ドメイン（例えば、ＥＵ／ＯＵナンバリングにおける４４２位）；モノクローナル抗体ＭＮ−１４（高親和性抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ｍａｂ）中に）システイン残基が導入されるように（例えば、抗体または抗体フラグメントを、例えば、９９ｍＴｃで臨床画像に標識することができるように）操作された抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’（例えば、モノクローナル抗体フラグメントＣ４６．３）およびｓｃＦｖ）、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｍ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−β）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、グルテンタンパク質、酸性スフィンゴミエリナーゼ（組換え酸性スフィンゴミエリナーゼ）、デスフロイルセフチオフル（ＤＦＣ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ）および他の低密度リポタンパク質ドメイン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異型（例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ミラノ）およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（パリ））、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、ＣＡＡＸモチーフを含むタンパク質およびペプチド模倣物（例えば、Ｒａｓ）、粘液溶解物質、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、骨格筋Ｃａ^２＋放出チャネル／リアノジン受容体（ＲｙＲ１）、核性因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、ＡＰ−１、タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、糖タンパク質１ｂα（ＧＰ１ｂα）、カルシニューリン（ＣａＮ）、フィブリン−１、ＣＤ４、Ｓ１００Ａ３（Ｓ１００Ｅとしても公知）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ヒトインターαインヒビター重鎖１、α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）、トロンボスポンジン（糖タンパク質Ｇとしても公知）、ゲルソリン、ムチン、クレアチンキナーゼ（例えば、Ｓ−チオメチル修飾クレアチンキナーゼ）、第ＶＩＩＩ因子、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、インスリン受容体βサブユニット、アセチルコリンエステラーゼ、プロキモシン、修飾α２−マクログロブリン（α２Ｍ）（例えば、プロテイナーゼまたはメチルアミン反応性α２Ｍ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、補体成分Ｃ２（例えば、２ａ）、補体成分Ｃ３（例えば、Ｃ３ｂ）、補体成分４（例えば、４ｄ）、補体因子Ｂ（例えば、Ｂｂ）、α−ラクトアルブミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、ＲＮアーゼインヒビター、リポコルチン１（アネキシン１としても公知）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アクチン（例えば、球状アクチン）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（例えば、ブチル−ＣｏＡシンテターゼ）、３−２トランス−エノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼ前駆体、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）感受性グアニル酸シクラーゼ、Ｐｚ−ペプチダーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｐ−４５０およびＮＡＤＰＨ−Ｐ−４５０レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンテターゼ、ルトロピン受容体、低分子量酸性ホスファターゼ、血清コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アドレノドキシン、ヒアルロニダーゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、シトクロムｃ１ヘムサブユニット、Ｓ−タンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶＲＳ）、α−アミラーゼＩ、筋肉ＡＭＰデアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびソマトスタチン結合タンパク質からなる群から選択される。

【0052】

好ましい実施形態では、遊離チオールを有するタンパク質はＧＣＢである。

【0053】

別の好ましい実施形態では、遊離チオールを有するタンパク質はｂＦＧＦである。

【0054】

１つの態様では、開示は、遊離チオールを有するタンパク質を不活性ガス（例えば、Ｎ_２またはＡｒ）と接触させて一定量の反応性種（例えば、Ｏ_２）の量を減少させる、接触する工程およびタンパク質および不活性ガスを気密性容器に導入する工程を含む、組成物を包装する方法を特徴とする。用語「反応性種」には、酸素の不完全な一電子還元によって形成された分子またはイオンが含まれる。これらの反応性種には、Ｏ_２、スーパーオキシド、過酸化物、ヒドロキシリルラジカル、および次亜塩素酸が含まれる。

【0055】

好ましい実施形態では、不活性ガスはＮ_２またはＡｒであり、反応性種がＯ_２である。

【0056】

一定の実施形態では、遊離チオール含有タンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、ヘモグロビン、チオレドキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）、β−ラクトグロブリンＢ、β−ラクトグロブリンＡＢ、血清アルブミン、抗体（例えば、ヒト抗体、例えば、ＩｇＡ（例えば、二量体ＩｇＡ）、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２）、およびＩｇＭ；組換えヒト抗体）、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、（例えば、第３の重鎖定常ドメイン（例えば、ＥＵ／ＯＵナンバリングにおける４４２位）；モノクローナル抗体ＭＮ−１４（高親和性抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ｍａｂ）中に）システイン残基が導入されるように（例えば、抗体または抗体フラグメントを、例えば、９９ｍＴｃで臨床画像に標識することができるように）操作された抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’（例えば、モノクローナル抗体フラグメントＣ４６．３）およびｓｃＦｖ）、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｍ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−β）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、グルテンタンパク質、酸性スフィンゴミエリナーゼ（組換え酸性スフィンゴミエリナーゼ）、デスフロイルセフチオフル（ＤＦＣ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ）および他の低密度リポタンパク質ドメイン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異型（例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ミラノ）およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（パリ））、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、ＣＡＡＸモチーフを含むタンパク質およびペプチド模倣物（例えば、Ｒａｓ）、粘液溶解物質、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、骨格筋Ｃａ^２＋放出チャネル／リアノジン受容体（ＲｙＲ１）、核性因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、ＡＰ−１、タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、糖タンパク質１ｂα（ＧＰ１ｂα）、カルシニューリン（ＣａＮ）、フィブリン−１、ＣＤ４、Ｓ１００Ａ３（Ｓ１００Ｅとしても公知）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ヒトインターαインヒビター重鎖１、α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）、トロンボスポンジン（糖タンパク質Ｇとしても公知）、ゲルソリン、ムチン、クレアチンキナーゼ（例えば、Ｓ−チオメチル修飾クレアチンキナーゼ）、第ＶＩＩＩ因子、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、インスリン受容体βサブユニット、アセチルコリンエステラーゼ、プロキモシン、修飾α２−マクログロブリン（α２Ｍ）（例えば、プロテイナーゼまたはメチルアミン反応性α２Ｍ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、補体成分Ｃ２（例えば、２ａ）、補体成分Ｃ３（例えば、Ｃ３ｂ）、補体成分４（例えば、４ｄ）、補体因子Ｂ（例えば、Ｂｂ）、α−ラクトアルブミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、ＲＮアーゼインヒビター、リポコルチン１（アネキシン１としても公知）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アクチン（例えば、球状アクチン）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（例えば、ブチル−コエンザイムＡシンテターゼ）、３−２トランス−エノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼ前駆体、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）感受性グアニル酸シクラーゼ、Ｐｚ−ペプチダーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｐ−４５０およびＮＡＤＰＨ−Ｐ−４５０レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンテターゼ、ルトロピン受容体、低分子量酸性ホスファターゼ、血清コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アドレノドキシン、ヒアルロニダーゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、シトクロムｃ１ヘムサブユニット、Ｓ−タンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶＲＳ）、α−アミラーゼＩ、筋肉ＡＭＰデアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびソマトスタチン結合タンパク質からなる群から選択される。

【0057】

好ましい実施形態では、遊離チオールを有するタンパク質はＧＣＢである。

【0058】

別の好ましい実施形態では、遊離チオールを有するタンパク質はｂＦＧＦである。

【0059】

１つの態様では、開示は、本明細書中に記載の組成物（例えば、遊離チオールタンパク質（例えば、ＧＣＢ）を含む組成物）を患者に投与する工程を含む、患者（例えば、遊離チオール含有タンパク質を使用した治療を必要とする患者、例えば、遊離チオールタンパク質欠損症の患者）の治療方法を特徴とする。例えば、患者に投与する薬学的組成物には、例えば、治療有効量の本明細書中に記載の組成物が含まれる。

【0060】

好ましい実施形態では、投与は、ＩＶ注入または皮下投与による。

【0061】

１つの実施形態では、遊離チオールタンパク質（例えば、ＧＣＢ）を含む本明細書中に記載の組成物を治療で使用する。

【0062】

１つの実施形態では、遊離チオールタンパク質（例えば、ＧＣＢ）を含む本明細書中に記載の組成物を、遊離チオール含有タンパク質を必要とする容態の治療薬の製造のために使用する（例えば、グルコセレブロシダーゼ欠損症（例えば、ゴーシェ病）の治療のための本明細書中に記載のＧＣＢ組成物の使用）。例えば、患者に投与するための薬物には、例えば、治療有効量の本明細書中に記載の組成物が含まれる。

【0063】

１つの態様では、開示は、本明細書中に記載のＧＣＢ組成物を投与する工程を含む、グルコセレブロシダーゼ欠損症を罹患した患者の治療方法を特徴とする。

【0064】

一定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼ欠損症は、ゴーシェ病である。

【0065】

他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書と類似または等価な方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な材料および方法を以下に記載する。引用した全ての刊行物、特許出願、特許、および本明細書中で言及した他の引例は、その全体が本明細書中で参考として援用される。不一致がある場合、定義を含む本明細書を調節する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。

【0066】

本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
遊離チオールを有するタンパク質および炭水化物を含む組成物であって、該炭水化物が、該タンパク質の安定性の維持に十分な量で存在し、該組成物のｐＨが７．０未満である、組成物。
（項目２）
抗酸化剤をさらに含み、該抗酸化剤および前記炭水化物が前記タンパク質の安定性の維持に十分な量で存在し、前記組成物のｐＨが７．０未満である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
界面活性剤をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物のｐＨが約４．５と約６．５との間である、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記安定性が、予め選択された条件下で、前記炭水化物を欠くことが相違点である組成物の安定性よりも少なくとも５〜８０％高い、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記炭水化物が、前記タンパク質の安定性の増大に十分な量で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記炭水化物は、前記タンパク質の第１の分子上の遊離チオールが該タンパク質の第２の分子上の遊離チオールと反応して凝集体を形成するのを阻害するのに十分な量で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記炭水化物は、前記タンパク質の第１の分子上の遊離チオールの該タンパク質の第２の分子上の遊離チオールとの反応によって形成された凝集体の形成を、予め選択された条件下で、該炭水化物を欠く同一の組成物と比較して少なくとも５〜８０％阻害するのに十分な量で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記炭水化物が、２〜８℃の温度の気密性容器中で６ヶ月間の保存の際、前記組成物の保存前の少なくとも８５％の安定性を保持するのに十分な量で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記保存を暗所で行う、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記炭水化物が、スクロース、０．０１％ポリソルベート−２０、ｐＨ６．０、５０ｍＭクエン酸塩を含む凍結乾燥組成物に匹敵する安定性を有するのに十分な量で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
約１〜４０％の炭水化物を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
前記炭水化物がスクロースまたはトレハロースである、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
前記組成物が液体である、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
前記組成物が約１０％未満のＯ_２を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
前記組成物を、前記組成物のＯ_２の物理的除去を含む方法によって作製する、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
前記遊離チオールを含むタンパク質が、前記タンパク質の活性単位あたり、スルフヒドリル架橋を形成する２つ、３つ、またはそれを超える遊離チオール基を有し、０、２つ、４つ、またはそれを超えるチオール基を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１８）
前記遊離チオールを有するタンパク質が、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、ヘモグロビン、チオレドキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）、β−ラクトグロブリンＢ、β−ラクトグロブリンＡＢ、血清アルブミン、抗体、抗体フラグメント、システイン残基が導入されるように操作された抗体および抗体フラグメント、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｍ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−β）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、グルテンタンパク質、酸性スフィンゴミエリナーゼ、デスフロイルセフチオフル（ＤＦＣ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ）および他の低密度リポタンパク質ドメイン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異型（ｖａｒｉａｎｔ）、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、ＣＡＡＸモチーフを含むタンパク質およびペプチド模倣物、粘液溶解物質、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、骨格筋Ｃａ^２＋放出チャネル／リアノジン受容体（ＲｙＲ１）、核性因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、ＡＰ−１、タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、糖タンパク質１ｂα（ＧＰ１ｂα）、カルシニューリン（ＣａＮ）、フィブリン−１、ＣＤ４、Ｓ１００Ａ３、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ヒトインターαインヒビター重鎖１、α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）、トロンボスポンジン、ゲルソリン、ムチン、クレアチンキナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、インスリン受容体βサブユニット、アセチルコリンエステラーゼ、プロキモシン、修飾α２−マクログロブリン（α２Ｍ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、補体成分Ｃ２、補体成分Ｃ３、補体成分４、補体因子Ｂ、α−ラクトアルブミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、ＲＮアーゼインヒビター、リポコルチン１、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アクチン、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、３−２トランス−エノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼ前駆体、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）感受性グアニル酸シクラーゼ、Ｐｚ−ペプチダーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｐ−４５０、ＮＡＤＰＨ−Ｐ−４５０レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンテターゼ、ルトロピン受容体、低分子量酸性ホスファターゼ、血清コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アドレノドキシン、ヒアルロニダーゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、シトクロムｃ１ヘムサブユニット、Ｓ−タンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶＲＳ）、α−アミラーゼＩ、筋肉ＡＭＰデアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびソマトスタチン結合タンパク質からなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目１９）
前記遊離チオールを有するタンパク質がＧＣＢである、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記遊離チオールを有するタンパク質がｂＦＧＦである、項目１８に記載の組成物。
（項目２１）
ＧＣＢの液体組成物であって、該組成物はＧＣＢおよび炭水化物を含み、該組成物のｐＨが７．０未満であり、該組成物を、該組成物の不活性ガスへの曝露によって生成し、該不活性ガスが、周囲雰囲気（ａｍｂｉｅｎｔ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）よりも高い濃度で存在する、組成物。
（項目２２）
抗酸化剤をさらに含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記抗酸化剤が、システイン、システインHCｌ、またはメチオニンであり、前記炭水化物がスクロースまたはトレハロースである、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記抗酸化剤が、システイン、システインHCｌ、またはメチオニンであり、約０．００１％と約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間で存在し、前記炭水化物がスクロースまたはトレハロースであり、約１％と約４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間で存在する、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
前記組成物のｐＨが、約４．５と約６．５との間である、項目２１に記載の組成物。
（項目２６）
界面活性剤をさらに含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２７）
前記界面活性剤がポロクサマー１８８である、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
ＧＣＢの液体組成物であって、該組成物がＧＣＢおよび炭水化物を含み、該組成物のｐＨが約０と約７との間であり、該炭水化物が、該ｐＨで該ＧＣＢの生化学的完全性および生物活性の性質を維持するのに十分な量で存在する、ＧＣＢの液体組成物。
（項目２９）
前記ｐＨが約５．０〜約６．０の範囲である、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記炭水化物がスクロースまたはトレハロースである、項目２８に記載の組成物。
（項目３１）
前記炭水化物がスクロースまたはトレハロースであり、約１％と約４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間で存在する、項目３０に記載の組成物。
（項目３２）
ＧＣＢ、抗酸化剤、炭水化物を含むＧＣＢの液体組成物であって、該組成物のｐＨが４．５〜６．５であり、該組成物が該組成物の不活性ガスへの曝露によって生成される、ＧＣＢの液体組成物。
（項目３３）
約ｐＨ５．５〜６．０で約０．１〜４０ｍｇ／ｍｌ ＧＣＢ、約０．００１〜１０％システイン、約１〜４０％スクロースを含み、溶存酸素レベルが約１０％未満である、項目３２に記載の液体組成物。
（項目３４）
界面活性剤をさらに含む、項目３２に記載の組成物。
（項目３５）
前記界面活性剤がポロクサマー１８８である、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
タンパク質成分およびヘッドスペースを含む気密性容器であって、該タンパク質成分が遊離チオールを有するタンパク質であり、該ヘッドスペースは少なくとも９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の不活性ガスである、気密性容器。
（項目３７）
前記容器が、予め充填されたシリンジ、バイアル、またはアンプルである、項目３６に記載の気密性容器。
（項目３８）
前記予め充填されたシリンジが針無しシリンジである、項目３７に記載の気密性容器。
（項目３９）
前記遊離チオールを有するタンパク質が、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、ヘモグロビン、チオレドキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）、β−ラクトグロブリンＢ、β−ラクトグロブリンＡＢ、血清アルブミン、抗体、抗体フラグメント、システイン残基が導入されるように操作された抗体および抗体フラグメント、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｍ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−β）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、グルテンタンパク質、酸性スフィンゴミエリナーゼ、デスフロイルセフチオフル（ＤＦＣ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ）および他の低密度リポタンパク質ドメイン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異型、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、ＣＡＡＸモチーフを含むタンパク質およびペプチド模倣物、粘液溶解物質、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、骨格筋Ｃａ^２＋放出チャネル／リアノジン受容体（ＲｙＲ１）、核性因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、ＡＰ−１、タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、糖タンパク質１ｂα（ＧＰ１ｂα）、カルシニューリン（ＣａＮ）、フィブリン−１、ＣＤ４、Ｓ１００Ａ３、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ヒトインターαインヒビター重鎖１、α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）、トロンボスポンジン、ゲルソリン、ムチン、クレアチンキナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、インスリン受容体βサブユニット、アセチルコリンエステラーゼ、プロキモシン、修飾α２−マクログロブリン（α２Ｍ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、補体成分Ｃ２、補体成分Ｃ３、補体成分４、補体因子Ｂ、α−ラクトアルブミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、ＲＮアーゼインヒビター、リポコルチン１、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アクチン、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、３−２トランス−エノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼ前駆体、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）感受性グアニル酸シクラーゼ、Ｐｚ−ペプチダーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｐ−４５０、ＮＡＤＰＨ−Ｐ−４５０レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンテターゼ、ルトロピン受容体、低分子量酸性ホスファターゼ、血清コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アドレノドキシン、ヒアルロニダーゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、シトクロムｃ１ヘムサブユニット、Ｓ−タンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶＲＳ）、α−アミラーゼＩ、筋肉ＡＭＰデアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびソマトスタチン結合タンパク質からなる群から選択される、項目３６に記載の気密性容器。
（項目４０）
前記遊離チオールを有するタンパク質がＧＣＢである、項目３９に記載の気密性容器。
（項目４１）
前記遊離チオールを有するタンパク質がｂＦＧＦである、項目３９に記載の気密性容器。
（項目４２）
項目１に記載の組成物を包装する方法であって、
遊離チオールを有するタンパク質を不活性ガスと接触させて反応性種の量を減少させる工程、および
該タンパク質および該不活性ガスを気密性容器に導入する工程、
を含む、方法。
（項目４３）
前記不活性ガスがＮ_２またはＡｒであり、前記反応性種がＯ_２である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記遊離チオールを有するタンパク質が、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、ヘモグロビン、チオレドキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）、β−ラクトグロブリンＢ、β−ラクトグロブリンＡＢ、血清アルブミン、抗体、抗体フラグメント、システイン残基が導入されるように操作された抗体および抗体フラグメント、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｍ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−β）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、グルテンタンパク質、酸性スフィンゴミエリナーゼ、デスフロイルセフチオフル（ＤＦＣ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ）および他の低密度リポタンパク質ドメイン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異型、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、ＣＡＡＸモチーフを含むタンパク質およびペプチド模倣物、粘液溶解物質、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、骨格筋Ｃａ^２＋放出チャネル／リアノジン受容体（ＲｙＲ１）、核性因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、ＡＰ−１、タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、糖タンパク質１ｂα（ＧＰ１ｂα）、カルシニューリン（ＣａＮ）、フィブリン−１、ＣＤ４、Ｓ１００Ａ３、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ヒトインターαインヒビター重鎖１、α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）、トロンボスポンジン、ゲルソリン、ムチン、クレアチンキナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、インスリン受容体βサブユニット、アセチルコリンエステラーゼ、プロキモシン、修飾α２−マクログロブリン（α２Ｍ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、補体成分Ｃ２、補体成分Ｃ３、補体成分４、補体因子Ｂ、α−ラクトアルブミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、ＲＮアーゼインヒビター、リポコルチン１、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アクチン、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、３−２トランス−エノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼ前駆体、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）感受性グアニル酸シクラーゼ、Ｐｚ−ペプチダーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｐ−４５０、ＮＡＤＰＨ−Ｐ−４５０レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンテターゼ、ルトロピン受容体、低分子量酸性ホスファターゼ、血清コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アドレノドキシン、ヒアルロニダーゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、シトクロムｃ１ヘムサブユニット、Ｓ−タンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶＲＳ）、α−アミラーゼＩ、筋肉ＡＭＰデアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびソマトスタチン結合タンパク質からなる群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記遊離チオールを有するタンパク質がＧＣＢである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記遊離チオールを有するタンパク質がｂＦＧＦである、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
項目１に記載の組成物を患者に投与する工程を含む、患者の治療方法。
（項目４８）
前記投与が、ＩＶ注入または皮下投与による、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
項目２１に記載の組成物を患者に投与する工程を含む、グルコセレブロシダーゼ欠損症を有する患者の治療方法。
（項目５０）
前記グルコセレブロシダーゼ欠損症がゴーシェ病である、項目４９に記載の方法。

【発明を実施するための形態】

【0067】

詳細な説明
概説
チオール含有タンパク質（例えば、ＧＣＢ）の組成物は、液体組成物として比較的不安定である。ＧＣＢ中の３つの露呈した遊離チオール基が反応し、例えば、ＧＣＢ分子の凝集によって安定性が低下し得る。例えば、ｐＨ６の緩衝液中で、１ヶ月間の保存で典型的には１〜２％のタンパク質が凝集し、６ヶ月間の保存後に約１５％が凝集する。理論または機構に厳格に拘束されることを望まないが、多数の要因（例えば、凝集反応）がタンパク質の安定性に寄与すると考えられる。例えば、溶液中の遊離Ｏ_２は遊離チオール基の架橋を加速し、凝集し得る。例えば、疎水性ドメイン中のシステイン残基の包埋によって遊離チオール基の反応が減少する場合および／またはタンパク質をより小型することができる場合、タンパク質凝集を減少させることができる。さらに、タンパク質分解（例えば、断片化）を減少させることができる。

【0068】

本明細書中に記載の実施形態は、１つまたは複数のこれらの問題に取り組むための１つまたは複数の手段を含む。例として、遊離チオール含有タンパク質の組成物（例えば、液体組成物）の安定性を増大させるための種々の要因（例えば、溶液中の反応性種（例えば、遊離Ｏ_２）の存在、タンパク質上の遊離スルフヒドリル基（例えば、遊離チオール）の利用能、タンパク質の高次構造、およびｐＨ）に取り組んだ。これらの要因の１つ、２つ、３つ、４つ、または全てを変化または制御して、目的のタンパク質の安定性を増大させる。

【0069】

遊離チオール含有タンパク質
遊離チオールを保有するタンパク質は、活性形態で１つまたは複数の−Ｓ−Ｈ部分を有するタンパク質である。好ましい実施形態では、−Ｓ−Ｈ−部分は、反応物質と接触し、安定するのに至適な条件下で、この反応物質（例えば、システインなどの還元剤）と反応することができる。あるいは、−Ｓ−Ｈ−部分は、生理学的条件下で１つまたは複数の生体液と反応することができ、それにより、患者に投与した場合に接触するようになる（例えば、この部分は血液中での反応に利用しやすい）。

【0070】

特に好ましい遊離チオール含有タンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）である。溶液中のＧＣＢの構造は、（包埋または立体障害と対照的に）比較的接近可能な遊離−Ｓ−Ｈ−部分を提供し、これにより、−Ｓ−Ｈ−部分との反応が促進される。

【0071】

別の特に好ましい遊離チオール含有タンパク質は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である。

【0072】

遊離チオール含有タンパク質の他の例には、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、ヘモグロビン、チオレドキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）、β−ラクトグロブリンＢ、β−ラクトグロブリンＡＢ、血清アルブミン、抗体（例えば、ヒト抗体、例えば、ＩｇＡ（例えば、二量体ＩｇＡ）、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２）、およびＩｇＭ；組換えヒト抗体）、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、（例えば、第３の重鎖定常ドメイン（例えば、ＥＵ／ＯＵナンバリングにおける４４２位）；モノクローナル抗体ＭＮ−１４（高親和性抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ｍａｂ）中に）システイン残基が導入されるように（例えば、抗体または抗体フラグメントを、例えば、９９ｍＴｃで臨床画像に標識することができるように）操作された抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’（例えば、モノクローナル抗体フラグメントＣ４６．３）およびｓｃＦｖ）、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｍ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ）、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）、血小板由来成長因子受容体−β（ＰＤＧＦ−β）、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質、グルテンタンパク質、酸性スフィンゴミエリナーゼ（組換え酸性スフィンゴミエリナーゼ）、デスフロイルセフチオフル（ＤＦＣ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ａｐｏＢ）および他の低密度リポタンパク質ドメイン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異型（例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ミラノ）およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（パリ））、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、ＣＡＡＸモチーフを含むタンパク質およびペプチド模倣物（例えば、Ｒａｓ）、粘液溶解物質、カルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、骨格筋Ｃａ^２＋放出チャネル／リアノジン受容体（ＲｙＲ１）、核性因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、ＡＰ−１、タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、糖タンパク質１ｂα（ＧＰ１ｂα）、カルシニューリン（ＣａＮ）、フィブリン−１、ＣＤ４、Ｓ１００Ａ３（Ｓ１００Ｅとしても公知）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ヒトインターαインヒビター重鎖１、α２−抗プラスミン（α２ＡＰ）、トロンボスポンジン（糖タンパク質Ｇとしても公知）、ゲルソリン、ムチン、クレアチンキナーゼ（例えば、Ｓ−チオメチル修飾クレアチンキナーゼ）、第ＶＩＩＩ因子、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、インスリン受容体βサブユニット、アセチルコリンエステラーゼ、プロキモシン、修飾α２−マクログロブリン（α２Ｍ）（例えば、プロテイナーゼまたはメチルアミン反応性α２Ｍ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、補体成分Ｃ２（例えば、２ａ）、補体成分Ｃ３（例えば、Ｃ３ｂ）、補体成分４（例えば、４ｄ）、補体因子Ｂ（例えば、Ｂｂ）、α−ラクトアルブミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、小胞体Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ、ＲＮアーゼインヒビター、リポコルチン１（アネキシン１としても公知）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アクチン（例えば、球状アクチン）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（例えば、ブチル−ＣｏＡシンテターゼ）、３−２トランス−エノイル−ＣｏＡ−イソメラーゼ前駆体、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）感受性グアニル酸シクラーゼ、Ｐｚ−ペプチダーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｐ−４５０およびＮＡＤＰＨ−Ｐ−４５０レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンテターゼ、ルトロピン受容体、低分子量酸性ホスファターゼ、血清コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、アドレノドキシン、ヒアルロニダーゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、シトクロムｃ１ヘムサブユニット、Ｓ−タンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶＲＳ）、α−アミラーゼＩ、筋肉ＡＭＰデアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびソマトスタチン結合タンパク質が含まれる。かかるタンパク質のフラグメント（例えば、活性ドメイン、構造ドメイン、およびドミナントネガティブフラグメントなど）も含まれる。遊離チオール基を含むタンパク質は、天然に存在するタンパク質、組換えタンパク質、システイン残基を含むように改変された（例えば、組換えＤＮＡテクノロジーによる）タンパク質、またはシステイン残基上のスルフヒドリル部分が還元状態である（すなわち、遊離−Ｓ−Ｈ−部分を有する）ように化学的または酵素的に処理されたタンパク質であり得る。

【0073】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の組成物は、天然に存在する配列を有するタンパク質を含む。他の実施形態では、本発明の配列は、天然に存在する配列と１、２、３、４、５、または１０個までのアミノ酸残基が異なるであろう。他の実施形態では、タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在する配列と１、２、３、４、５、または１０％まで異なるであろう。

【0074】

反応性種の除去
溶液中に溶解している反応性種（例えば、Ｏ_２または過酸化物）は、例えば、タンパク質凝集の促進によって組成物中のタンパク質の安定性を減少させ得る。しかし、Ｏ_２の非存在下でさえ、遊離−Ｓ−Ｈ−部分は架橋し得る。

【0075】

タンパク質の安定性を増大させるために、溶液中の反応性種（例えば、Ｏ_２）を、例えば、Ｏ_２スカベンジャー（例えば、亜硫酸塩）の使用によって化学的に除去することができる。化学的スカベンジャーは、タンパク質を分解させ得るので、しばしばあまり望ましくない。Ｏ_２を、例えば、溶液の脱気、例えば、溶液を吸引して溶液からＯ^２を除去し、不活性ガス（例えば、窒素またはアルゴン）と置換することによって溶液から物理的に除去することもできる。Ｏ_２レベルを、Ｏ_２以外の気体（例えば、不活性ガス（例えば、窒素またはアルゴン））での溶液のパージングによって物理的に減少させることもできる。溶液に気体をバブリングしてＯ_２をパージすることによってパージングすることができる。

【0076】

タンパク質（例えば、ＧＣＢ）組成物では、気体とタンパク質含有溶液との間に界面が生じるバブリングまたは他の操作は、タンパク質を変性させ得るので、タンパク質の処理でしばしば回避されるが、これらの操作は、本明細書中に開示のＧＣＢ法で十分に許容されることが発見された。

【0077】

例えば、Ｏ_２の存在を最小にする条件下での操作および保存（例えば、Ｏ_２以外の気体（例えば、不活性ガス（例えば、窒素またはアルゴン））の容器への充填またはかかる気体の容器の密封）によって、Ｏ_２除去を溶液のＯ_２との接触の最小化と組み合わせることができる。一般に、患者への投与の前に溶液のＯ_２との接触を最小化することが望ましい。ヘッドスペース中のＯ_２レベルを、約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約２％未満に減少させるべきである。

【0078】

例えば、他の部分（例えば、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、および／またはＭｅｔ残基）の酸化の最小化による反応性種の除去は、タンパク質の安定性を増大させることもできる。特に、ＧＣＢ中のこれらの部分の酸化を最小化することが望ましい。

【0079】

２ｍｇ／ｍｌ ＧＣＢ、０．０７５％システイン（抗酸化剤として）、１６％スクロース（−Ｓ−Ｈ利用可能性を減少させるため）を含む組成物を準備し、ｐＨ５．７に調整し、候補方法に適用することによってＯ_２の除去方法の候補を試験することができる。予め決定した時間で、例えば、凝集率または減少率として測定した候補方法によって生成されたＧＣＢ組成物の安定性を、１つまたは複数の標準と比較する。例えば、適切な標準は、Ｏ_２除去方法を適用しないこと以外は試験条件に類似の組成物であろう。処理済み（候補Ｏ_２除去方法を適用する）および未処理の（Ｏ_２除去方法を適用しない）組成物の安定性を比較する。適切性は、この標準と比較した場合の試験処理の安定性の増加によって示すことができる。別の標準は、候補除去方法の代わりに本明細書中に記載の方法（例えば、不活性ガスを使用したパージングまたは脱気）によってＯ_２を除去することを除いて試験組成物に類似の組成物であり得る。適切性を、本明細書中に記載の方法と比較して安定性に及ぼす類似するかより良好な影響を有する候補方法によって示すことができる。

【0080】

タンパク質安定性を、例えば、タンパク質凝集またはタンパク質分解の測定によって測定することができる。タンパク質凝集を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、非変性ＰＡＧＥ、または他のサイズ決定方法などによって決定することができる。タンパク質分解を、例えば、逆相ＨＰＬＣ、非変性ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィ、ペプチドマッピング、または類似の方法によって決定することができる。

【0081】

抗酸化剤
組成物中のタンパク質の安定性を、抗酸化剤（特に、遊離−Ｓ−Ｈと反応する部分（例えば、−Ｓ−Ｈ）を含む抗酸化剤（例えば、システイン、システインHCｌ、またはメチオニン））の添加によって増大させることができる（例えば、遊離−Ｓ−Ｈ部分によって媒介される架橋を減少させることができる）。タンパク質分子内に両遊離チオール基および内部ジスルフィド結合を含むタンパク質（例えば、ＧＣＢ）について、抗酸化剤（例えば、システイン）の使用レベルは、遊離チオール結合の架橋（例えば、凝集）を最小にするのに十分に高いが、断片化および／またはタンパク質分解および／または分解（例えば、逆相ＨＰＬＣで検出可能）を起こさないのに十分に低くするべきである。例えば、特にＧＣＢについてシステインを使用して、約０．００１％〜約１０％（例えば、約０．０１〜約０．１５％、例えば、約０．０５〜約０．１％）の封入が適切である。１０％を超えるレベルは、最適ではないかもしれない。

【0082】

例えば、２ｍｇ／ｍｌ ＧＣＢ、１６％スクロース（−Ｓ−Ｈ利用可能性を減少させるため）を含む組成物を準備し、ｐＨ５．７に調整し、候補抗酸化剤（例えば、本明細書中に記載の量、例えば、０．０７５％）を添加し、組成物のＯ_２をパージングすることによって候補抗酸化剤（溶液中の溶解Ｏ_２を除去または減少させることができる任意の薬剤であり得る）を試験することができる。予め決定した時間で、例えば、凝集率または減少率として測定した候補抗酸化剤を含むＧＣＢ組成物の安定性を、１つまたは複数の標準と比較する。例えば、適切な標準は、組成物に抗酸化剤を添加しないこと以外は試験条件に類似の組成物であろう。処理済み（抗酸化剤を含む）および未処理の（抗酸化剤を欠く）組成物の安定性を比較する。適切性は、この標準と比較した場合の試験処理の安定性の増加によって示すことができる。別の標準は、候補抗酸化剤の代わりに本明細書中に記載の抗酸化剤（例えば、システイン（例えば、本明細書中に記載の量、例えば、０．０７５％））を組成物に添加することを除いて試験組成物に類似の組成物であり得る。適切性を、本明細書中に記載の抗酸化剤と比較して安定性に及ぼす類似するかより良好な影響を有する候補抗酸化剤によって示すことができる。候補抗酸化剤が適切であると判断される場合（例えば、標準の１つと比較して組成物の安定性が増加する場合）、候補抗酸化剤の濃度を絞り込むことができる。例えば、濃度を一定範囲の値で増減して標準および試験した他の濃度と比較して、どの濃度が安定性を最も増加させるかを判断する。

【0083】

タンパク質安定性を、例えば、タンパク質凝集またはタンパク質分解の測定によって測定することができる。タンパク質凝集を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、非変性ＰＡＧＥ、または他のサイズ決定方法などによって決定することができる。タンパク質分解を、例えば、逆相ＨＰＬＣ、非変性ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィ、ペプチドマッピング、または類似の方法によって決定することができる。

【0084】

好ましい抗酸化剤はシステインである。使用に適切な他の抗酸化剤には、以下が含まれる：システインHCｌ、還元グルタチオン、チオエタノールアミン、チオジグリコール、チオ酢酸、モノチオグリセロール、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレイトール、ＤＬ−チオクト酸、メルカプトエタノール、ジメルカプトプロパノール、重亜硫酸塩、ジヒドロアスコルベート、メタ重亜硫酸塩、亜硫酸塩、ホルムアルデヒドスルホキシラート、チオ硫酸塩、および重亜硫酸アセトン。いくつかの実施形態では、２つまたはそれを超えるこれらの抗酸化剤の組み合わせを、本明細書中に記載の組み合わせで使用する。組み合わせの安定性を、候補抗酸化剤について上記のように試験することができる。

【0085】

抗酸化剤の添加は、例えば、他の部分（例えば、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、および／またはＭｅｔ残基）の酸化の最小化によってタンパク質の安定性を増加させることができる。特に、ＧＣＢ中のこれらの部分の酸化を最小化することが望ましい。

【0086】

炭水化物
いくつかの実施形態では、組成物中に炭水化物が含まれる。例えば、炭水化物は、タンパク質をより小型にすることができ、例えば、包埋するか、そうでなければ部分（例えば、システイン残基（例えば、システイン残基上の遊離−Ｓ−Ｈ部分）（例えば、疎水性ドメイン中のシステイン残基））への接近を妨害することができる。これにより（例えば、ＧＣＢを使用して）、例えば、タンパク質凝集の減少によってタンパク質安定性を増大させることができる。

【0087】

炭水化物には、この目的に適切な非還元糖（例えば、非還元二糖類（例えば、スクロースまたはトレハロース））が含まれる。組成物中の糖レベルは、極めて重要であり得る。約１〜約４０％（例えば、約５〜約３０％、例えば、約８〜約２４％、例えば、約１６％（体積あたり重量）（ｗ／ｖ））の糖含有量は、例えば、ＧＣＢとの使用に適切である。約３〜約５％の糖含有量も適切である。

【0088】

例えば、２ｍｇ／ｍｌ ＧＣＢ、０．０７５％システイン（抗酸化剤として）を含む組成物を準備し、ｐＨ５．７に調整し、候補物質（例えば、本明細書中に記載の量、例えば、１６％）を添加し、組成物のＯ_２をパージングすることによって−Ｓ−Ｈ利用可能性を減少させるための候補物質（例えば、候補炭水化物）を試験することができる。予め決定した時間で、例えば、凝集率または減少率として測定した候補抗酸化剤を含むＧＣＢ組成物の安定性を、１つまたは複数の標準と比較する。例えば、適切な標準は、組成物に物質を添加しないこと以外は試験条件に類似の組成物であろう。処理済み（物質を含む）および未処理の（物質を欠く）組成物の安定性を比較する。適切性は、この標準と比較した場合の試験処理の安定性の増加によって示すことができる。別の標準は、候補物質の代わりに本明細書中に記載の物質（例えば、スクロース（例えば、本明細書中に記載の量、例えば、１６％））を組成物に添加することを除いて試験組成物に類似の組成物であり得る。適切性を、本明細書中に記載の物質と比較して安定性に及ぼす類似するかより良好な影響を有する候補物質によって示すことができる。候補物質が適切であると判断される場合（例えば、標準の１つと比較して組成物の安定性が増加する場合）、候補物質の濃度を絞り込むことができる。例えば、濃度を一定範囲の値で増減して標準および試験した他の濃度と比較して、どの濃度が安定性を最も増加させるかを判断する。

【0089】

タンパク質安定性を、例えば、タンパク質凝集またはタンパク質分解の測定によって測定することができる。タンパク質凝集を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、非変性ＰＡＧＥ、または他のサイズ決定方法などによって決定することができる。タンパク質分解を、例えば、逆相ＨＰＬＣ、非変性ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィ、ペプチドマッピング、または類似の方法によって決定することができる。

【0090】

好ましい炭水化物はトレハロースまたはスクロースである。使用に適切な他の物質には、以下が含まれる：マルトース、ラフィノール、グルコース、ソルビトール。タンパク質の安定化のために使用することができる他の適切な物質には、以下が含まれる：ラクトースおよびアラビノースなどの炭水化物、マンニトール、グリセロール、およびキシリトールなどのポリオール、グリシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、メチオニン、およびロイシンなどのアミノ酸、ＰＥＧ、ポロクサマー、デキストラン、ポリプロピレングリコール、多糖類、メチルセルロース、カルボキシセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、加水分解ゼラチン、およびヒトアルブミンなどのポリマー。いくつかの実施形態では、２つまたはそれを超えるこれらの炭水化物（例えば、スクロースおよびトレハロース）の組み合わせを、本明細書中に記載の組み合わせで使用する。組み合わせの適切性を、候補炭水化物について上記のように試験することができる。

【0091】

ｐＨ
ｐＨは、タンパク質組成物の至適化（例えば、安定性が増大した液体タンパク質組成物）に極めて重要であり得る。ｐＨは、タンパク質の高次構造および／または凝集および／または分解および／または反応性に影響を及ぼすことによって作用することができる。例えば、ｐＨが高いほど、反応性がより高くなり得る。ｐＨは、好ましくはｐＨ７．０未満、より好ましくは約４．５〜約６．５の範囲であり、より好ましくは約５．０〜約６．０、より好ましくは約５．５〜約５．８、より好ましくは約５．７である。いくつかのタンパク質（例えば、ＧＣＢ）の場合、凝集は、ｐＨ７．０超で望ましくないレベルに到達し、分解（例えば、断片化）は、ｐＨ４．５または５．０未満またはｐＨ６．５または７．０超で望ましくないレベルに到達し得る。

【0092】

例えば、２ｍｇ／ｍｌ ＧＣＢ、０．０７５％システイン（抗酸化剤として）、１６％スクロース（−Ｓ−Ｈ利用可能性を減少させるため）を含む組成物を準備し、組成物を候補ｐＨに調整し、組成物のＯ_２をパージングすることによって候補ｐＨを試験することができる。予め決定した時間で、例えば、凝集率または減少率として測定した候補ｐＨでのＧＣＢ組成物の安定性を、１つまたは複数の標準と比較する。例えば、適切な標準は、組成物のｐＨを調整しないこと以外は試験条件に類似の組成物であろう。処理済み（候補ｐＨに調整した組成物）および未処理の（調整していないｐＨ）組成物の安定性を比較する。適切性は、この標準と比較した場合の試験処理の安定性の増加によって示すことができる。別の標準は、組成物が候補ｐＨの代わりに本明細書中に記載のｐＨ（例えば、ｐＨ５．７）を有することを除いて試験組成物に類似の組成物であり得る。適切性を、ｐＨ５．７の組成物と比較して安定性に及ぼす類似するかより良好な影響を有する候補ｐＨの組成物によって示すことができる。

【0093】

タンパク質安定性を、例えば、タンパク質凝集またはタンパク質分解の測定によって測定することができる。タンパク質凝集を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、非変性ＰＡＧＥ、または他のサイズ決定方法などによって決定することができる。タンパク質分解を、例えば、逆相ＨＰＬＣ、非変性ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィ、ペプチドマッピング、または類似の方法によって決定することができる。

【0094】

タンパク質組成物のｐＨの調製に使用することができる緩衝液には、以下が含まれる：ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、トリス緩衝液、酒石酸緩衝液、アスパラギン酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、および乳酸緩衝液。好ましい緩衝液は、クエン酸緩衝液。

【0095】

タンパク質濃度
好ましいタンパク質（例えば、ＧＣＢ）濃度は、約０．１〜約４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌ（例えば、約２〜約８ｍｇ／ｍｌまたは約５ｍｇ／ｍｌ）であり得る。

【0096】

０．０７５％システイン（抗酸化剤として）、１６％スクロース（−Ｓ−Ｈ利用可能性を減少させるため）を含む組成物を準備し、ｐＨ５．７に調整し、タンパク質（例えば、ＧＣＢ）を候補濃度に調整し、組成物のＯ_２をパージングすることによって適切なタンパク質濃度を試験することができる。予め決定した時間で、例えば、凝集率または減少率として測定した候補濃度でのタンパク質（例えば、ＧＣＢ）組成物の安定性を、１つまたは複数の標準と比較する。例えば、適切な標準は、タンパク質（例えば、ＧＣＢ）濃度が本明細書中に記載の濃度（例えば、２ｍｇ／ｍｌ）であること以外は試験条件に類似の組成物であろう。各濃度のタンパク質（例えば、ＧＣＢ）の安定性を比較する。適切性を、本明細書中に記載の濃度と比較して安定性に及ぼす類似するかより良好な影響を有する候補濃度によって示すことができる。

【0097】

タンパク質安定性を、例えば、タンパク質凝集またはタンパク質分解の測定によって測定することができる。タンパク質凝集を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、非変性ＰＡＧＥ、または他のサイズ決定方法などによって決定することができる。タンパク質分解を、例えば、逆相ＨＰＬＣ、非変性ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィ、ペプチドマッピング、または類似の方法によって決定することができる。

【0098】

界面活性剤
界面活性剤を、液体タンパク質（例えば、ＧＣＢ）組成物に添加することができる。好ましい実施形態では、これにより、タンパク質の安定性を増加させることができる（例えば、震盪／輸送の際の空気／液体界面に起因するタンパク質分解を減少させることができる）。液体組成物中でタンパク質の安定性を増大させる（例えば、タンパク質分解を起こさない）界面活性剤を選択する。使用に適切な界面活性剤は、例えば、ポロクサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８）である。界面活性剤は、約０．００５％と約５％との間（例えば、約０．０１％と約１％との間、例えば、約０．０２５％と約０．５％との間、例えば、０．０３％と約０．２５％との間、例えば、約０．０４％〜約０．１％、例えば、約０．０５％〜約０．０７５％（例えば、約０．０５％））の量で存在することができる。

【0099】

理想的には、本明細書中に記載のタンパク質組成物で使用するために選択される界面活性剤は、タンパク質によって改変（例えば、切断）されない界面活性剤である。

【0100】

例えば、２ｍｇ／ｍｌ ＧＣＢ、０．０７５％システイン（抗酸化剤として）、１６％スクロース（−Ｓ−Ｈ利用可能性を減少させるため）を含む組成物を準備し、ｐＨ５．７に調整し、候補界面活性剤（例えば、本明細書中に記載の量、例えば、０．０５％）を添加し、組成物のＯ_２をパージングすることによって候補界面活性剤を試験することができる。予め決定した時間で、例えば、凝集率または減少率として測定した候補界面活性剤を含むＧＣＢ組成物の安定性を、１つまたは複数の標準と比較する。例えば、適切な標準は、組成物に界面活性剤を添加しないこと以外は試験条件に類似の組成物であろう。処理済み（界面活性剤を含む）および未処理の（界面活性剤を欠く）組成物の安定性を、「現実世界」のシナリオ（例えば、輸送）をシミュレートする条件下で比較する。適切性は、この標準と比較した場合の試験処理の安定性の増加によって示すことができる。別の標準は、候補界面活性剤の代わりに本明細書中に記載の界面活性剤（例えば、ポロクサマー１８８（例えば、本明細書中に記載の量、例えば、０．０５％））を組成物に添加することを除いて試験組成物に類似の組成物であり得る。適切性を、本明細書中に記載の界面活性剤と比較して安定性に及ぼす類似するかより良好な影響を有する候補界面活性剤によって示すことができる。候補界面活性剤が適切であると判断される場合（例えば、標準の１つと比較して組成物の安定性が増加する場合）、候補界面活性剤の濃度を絞り込むことができる。例えば、濃度を一定範囲の値で増減して標準および試験した他の濃度と比較して、どの濃度が安定性を最も増加させるかを判断する。

【0101】

いくつかの実施形態では、２つまたはそれを超える界面活性剤の組み合わせを、本明細書中に記載の組成物で使用する。組成物の適切性を、候補界面活性剤について上記のように試験することができる。

【0102】

タンパク質安定性を、例えば、タンパク質凝集またはタンパク質分解の測定によって測定することができる。タンパク質凝集を、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、非変性ＰＡＧＥ、または他のサイズ決定方法などによって決定することができる。タンパク質分解を、例えば、逆相ＨＰＬＣ、非変性ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィ、ペプチドマッピング、または類似の方法によって決定することができる。

【0103】

ＧＣＢ
ゴーシェ病は、リソソーム酵素であるグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）の欠損によって特徴づけられる常染色体劣性リソソーム蓄積症である。ＧＣＢは、白血球および赤血球の膜内でのスフィンゴ糖脂質の分解後に形成される糖脂質であるグルコセレブロシドを加水分解する。この酵素の欠損により、ゴーシェ病患者の肝臓、脾臓、および骨髄中に存在する食細胞のリソソーム中にグルコセレブロシドが大量に蓄積される。これらの分子の蓄積により、一定範囲の臨床症状（脾腫、肝腫大、骨障害、血小板減少症、および貧血が含まれる）が生じる（Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｔ Ｇａｕｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５）ｐｐ．２６２５−２６３９）。

【0104】

この疾患を罹患した患者の治療は、骨痛の緩和のための鎮痛薬の投与、血液および血小板の輸液、いくつかの場合、脾摘除が含まれる。関節置換は、しばしば、骨浸食を経験した患者に必要である。ＧＣＢを使用した酵素補充療法を、ゴーシェ病治療として使用する。

【0105】

溶液中のＧＣＢの構造は、（包埋または立体障害と対照的に）比較的接近可能な遊離−Ｓ−Ｈ−部分であり、これにより、−Ｓ−Ｈ−部分との反応が促進される。

【0106】

ＧＣＢを、当該分野で公知の方法によって得ることができる。例えば、ＷＯ０２／１５９２７号、ＷＯ２００５／０８９０４７号、ＷＯ０３／０５６８９７号、ＷＯＯ１／７７３０７号、ＷＯ０１／０７０７８号、およびＷＯ９０／０７５７３：欧州特許公報番号ＥＰ１３９２８２６；米国特許公報２００５−００２６２４９号、２００５−００１９８６１ ，２００２−Ｏ１６８７５０号、２００５−０２６５９８８号、２００４−００４３４５７号、２００３−０２１５４３５号、および２００３−０１３３９２４；米国特許出願番号１０／９６８，８７０；米国特許第７，１３８，２６２号、６，４５１，６００号、６，０７４，８６４号、５，８７９，６８０号、５，５４９，８９２号、５，２３６，８３８号、および３，９１０，８２２は、ＧＣＢタンパク質の調製方法が記載されている。これらの特許書類および特許出願書類に記載の任意のＧＣＢタンパク質調製物を、本明細書中に記載の組成物に処方することができる。

【0107】

ＧＣＢ酵素活性を、本明細書に提供した例または当該分野（例えば、米国特許第７，１３８，２６２号）に記載のように測定することができる。

【0108】

包装および送達
タンパク質組成物（例えば、ＧＣＢ組成物（例えば、本明細書中およびＷＯ０２／１５９２７号、米国特許公報２００５−００２６２４９号、２００５−００１９８６１、および２００２−０１６８７５０号、ならびに米国特許出願番号０９／０４１，４７１号および同第１０／９６８，８７０号に記載の組成物））を、２室シリンジ中に包装することができる。例えば、凍結乾燥形態の組成物を、第１のシリンジ室に入れることができ、液体は第２のシリンジ室に存在することができる（例えば、米国特許公報２００４−０２４９３３９号を参照のこと）。

【0109】

タンパク質組成物（例えば、ＧＣＢ組成物（例えば、本明細書中およびＷＯ０２／１５９２７号、米国特許公報２００５−００２６２４９号、２００５−００１９８６１、および２００２−０１６８７５０号、ならびに米国特許出願番号０９／０４１，４７１号および同第１０／９６８，８７０号に記載の組成物））を、針無しシリンジに包装することができる（例えば、米国特許第６，４０６，４５５号および同第６，９３９，３２４号を参照のこと）。簡潔に述べれば、一例として、注射デバイスは、ガスまたはガス供給源を含むガス室；ガス室からガスを放出することができるポート；ガス室からのガスの放出の際に少なくとも第１のピストンを動かすことができるプランジャ；第１のピストン；第２のピストン；第１の室（例えば、薬物の貯蔵および混合に有用な室）；第１のピストン、第２のピストン、および第１の室が配置されたピストンハウジング；ガス室からのガスの原動力と無関係に、第１および第２のピストンの一方または両方を動かすことができる置換部材（置換部材は、プランジャまたは個別の部材であり得る）；第１の室に連結された針無し注射に適切な開口部を含み、ここで、第１および第２のピストンは、ピストンハウジング内にスライド可能に配置され、置換部材、ガス供給源、およびプランジャは、ピストンの第１の位置で、第２の室（例えば、液体リザーバ）が第１のピストン、ピストンハウジング、および第２のピストンによってピストンハウジング内に定められ、置換部材は、ピストンの一方または両方を第２の位置に移動することができるように配置され、ここで、第１のピストンは、液体リザーバであり得る第２の室が薬物保存および混合室であり得る第１の室と連結するような位置に存在し、第２のピストンが第１のピストンの方向に移動し、それにより、第２の室の容積が減少して第２の室から第１の室に流動物が移動し、ガス室からのガスの放出の際、プランジャによって第１のピストンを第１の室の容積を減少させるように移動して、開口部を介して室から例えば被験体に物質が発射される。

【0110】

針無しシリンジは、第１の成分（例えば、乾燥または液体成分）および第２の成分（例えば、液体成分）のための個別のモジュールを含み得る。モジュールを、２つの個別の成分として提供し、例えば、これらの成分を自身に投与する被験体または別の者、例えば、ヘルスケアを提供または供給する個人によって組み立てることができる。同時に、モジュールは、本明細書中に記載のデバイスのピストンハウジングの全部または一部を形成することができる。デバイスを使用して、任意の第１および第２の成分を提供することができ、このデバイスは、成分を個別に保存または提供し、被験体への投与前にこれらを合わせることが望ましい。

【0111】

本明細書中に記載のタンパク質（例えば、ＧＣＢ）組成物を、被験体（例えば、ヒト）への投与に適切な薬学的組成物に組み込むことができる。ＧＣＢ組成物は、ゴーシェ病を罹患した被験体を治療するのに十分な投薬量のＧＣＢを含むことができる。薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含むことができる。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合する任意および全ての溶媒、賦形剤、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸着遅延剤などが含まれることが意図される。薬学的処方物は、十分に確立された分野であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｎｉｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ（ｅｄ．）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３ｒｄ ｅｄ．（２０００）（ＩＳＢＮ；０９１７３３０９６Ｘ）にさらに記載されている。任意の従来の媒質または薬剤が活性化合物に不適合な場合を除き、かかる媒質を本発明の組成物で使用することができる。補助的活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。

【0112】

薬学的組成物は、本明細書中に記載の「治療有効量の」組成物を含むことができる。かかる有効量を、投与した組成物の影響に基づいて決定することができる。組成物の治療有効量はまた、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答（容態または障害（例えば、グルコセレブロシダーゼ欠損症（例えば、ゴーシェ病））の少なくとも１つの症状の改善）を誘発する化合物の能力などの要因にしたがって変化し得る。治療有効量はまた、治療に有利な影響が組成物の任意の毒作用および有害な影響を超える量である。

【0113】

本発明の薬学的組成物は、その意図する投与経路に適合するように処方する。例えば、組成物を、非経口様式（静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内への注射）で投与することができる。本明細書中で使用される場合、句「非経口投与」および「非経口で投与」は、通常、注射による経腸および局所以外の投与様式を意味し、以下が含まれるが、これらに限定されない：静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内への注射および注入。好ましくは、投与経路は、静脈内である。非経口適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌希釈剤（注射用の水、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など）；抗菌薬（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；緩衝液（酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはリン酸緩衝液など）；浸透圧調整剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。ｐＨを、酸または塩基（塩酸または水酸化ナトリウムなど）を使用して調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入することができる。

【0114】

注射に適切な薬学的組成物は、滅菌注射溶液または分散物の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌粉末（例えば、凍結乾燥調製物）を含む。静脈内投与のための適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合、組成物は滅菌されていなければならず、容易にシリンジで利用可能な範囲の流動物であるべきである。これは、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の夾雑作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリコール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散物の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなど）によって、微生物作用を防止することができる。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖類、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなど））を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の安定性を、吸着を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ヒト血清アルブミン、およびゼラチン）を組成物中に含めることによって延長することができる。

【0115】

上記列挙の成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の本明細書中に記載のＧＣＢ組成物を組み込み、必要に応じて、その後に濾過滅菌することによって、滅菌注射液を調製することができる。一般に、基剤となる分散媒および上記成分由来の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルへの活性化合物の組み込みによって分散物を調製する。滅菌注射液の組成物のための滅菌粉末の場合、組成物の好ましい方法は、有効成分およびその事前に濾過滅菌した溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥およびフリーズドライ（例えば、凍結乾燥）である。

【0116】

活性化合物（例えば、本明細書中に記載のＧＣＢ組成物）を、身体からの急速な排出から化合物を保護するキャリア（徐放性処方物（移植物およびマイクロカプセル化送達系が含まれる）など）を使用して調製することができる。生分解性生体適合性ポリマー（エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸など）を使用することができる。かかる処方物の調製方法は、当業者に明らかであろう。材料を、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞にターゲティングされるリポソームが含まれる）を、薬学的に許容可能なキャリアとしても使用することができる。これらを、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。

【0117】

本明細書中に記載のタンパク質組成物（例えば、ＧＣＢ組成物）を、当該分野で公知の医療機器を使用して投与することができる。例えば、本明細書中に記載のタンパク質（例えば、ＧＣＢ）組成物を、針無し皮下注射デバイス（米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示のデバイスなど）を使用して投与することができる。本発明で有用な周知の移植物およびモジュールの例には、以下が含まれる：徐放投薬のための埋め込み式微量注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を介した投薬のための治療デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号、正確な注入速度で薬物を送達させるための投薬注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、連続薬物送達のための種々の流速の埋め込み式注入装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、多室区画を有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号。勿論、多数の他のかかる移植物、送達系、およびモジュールも公知である。

【実施例】

【0118】

実施例１：材料と装置
実施例２〜６に示す結果を得るために以下の試薬を使用した。

【0119】

ＧＣＢ：国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／２５８８２号に記載の方法（これに限定されない）を使用して、グルコセレブロシダーゼを調製した。組換えＤＮＡテクノロジーを使用した当業者に公知の他の方法（例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８８／０４３１４、ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５８０１、およびＰＣＴ／ＵＳ９２／００４３１、ならびに米国特許第５，２３６，８３８Ｂ１号、同第５，６４１，６７０Ｂ１号、同第５，５４９，８９２Ｂ１号、および同第６，２７０，９８９Ｂ１号に記載の方法）も使用することができる。

【0120】

スクロース：Ｐ／Ｎ Ｓ−１２４−０１またはＳ−１２４−０２、Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ（Ｗａｕｋｅｇｅｎ，ＩＬ）
システインHCｌ：Ｐ／Ｎ ２０７１−０５，ＪＴＢａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）
ポロクサマー１８８：Ｐ／Ｎ Ｐ１１６９，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）
クエン酸ナトリウム：Ｐ／Ｎ ３６４９−０１，ＪＴＢａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）
２０ｍＬバイアル：Ｐ／Ｎ ６８００−０３２１，Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）
２ｍＬバイアル：Ｐ／Ｎ ６８００−０３１４，Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）
２０ｍｍストッパー：Ｐ／Ｎ １９５０−０４１４，Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）
１３ｍｍストッパー：Ｐ／Ｎ １９５０−０４１２，Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）
Ｎ_２ガス：Ｐ／Ｎ ＵＮ１０６６，Ａｉｒｇａｓ（Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）
凍結乾燥機：Ｇｅｎｅｓｉｓ ３５ＥＬ，ＳＰ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ，ＰＡ）。

【0121】

実施例２：ＧＣＢ安定性
１６％スクロース、０．０３％システインHCｌ、０．０５％ポロクサマー１８８，５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中に２．５ｍｇ／ｍＬでＧＣＢを配合した。２０ｍＬガラスバイアルに、それぞれ４．５ｍＬの処方溶液を充填した。充填したバイアルを、凍結乾燥機の棚にロードし、シェルフ温度２０℃で３分間、５００ｍＴにて真空脱気し、その後にＮ_２を９５０ｍＢａｒまで埋め戻し（ｂａｃｋｆｉｌｌ）、直ちに２０ｍｍの灰色のストッパーで栓をした。サンプルを、２〜８℃の安定室（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｈａｍｂｅｒ）に入れた。０、６、１２、１８、および２４ヶ月の保存後、サンプルを取り出し、酵素活性、ＳＥ−ＨＰＬＣによる凝集、およびＲＰ−ＨＰＬＣによる分解の変化について試験した。基質としてｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドを使用した比色アッセイによって酵素活性をアッセイした（例えば、米国特許第７，１３８，２６２号に記載のアッセイを使用しても活性をアッセイすることができる）。

【0122】

結果を表１にまとめる。この組成物由来のＧＣＢは、２〜８℃で２４ヶ月後、ベースラインと比較して５％しか変化しなかった。

【0123】

表１：２〜８℃で２４ヶ月の保存後の実施例２の安定性のまとめ

【0124】

【表1】

^＊ベースラインから保持された比率。

【0125】

実施例３：Ｏ_２レベルの影響
１６％スクロース、０．０３％システインHCｌ、０．０５％ポロクサマー１８８，５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中に２．５ｍｇ／ｍＬでＧＣＢを配合した。２ｍＬガラスバイアルに、それぞれ１ｍＬの処方溶液を充填した。バイアルのヘッドスペースを、Ｏ_２レベルが３％、６％、または１４％になるように凍結乾燥機で処理した。サンプルを、２〜８℃の安定室に入れた。６ヶ月の時点で、サンプルを取り出し、ＳＥ−ＨＰＬＣによる凝集の変化およびＲＰ−ＨＰＬＣによる分解の変化について試験した。結果を、表２にまとめる。この組成物由来のＧＣＢは、バイアルのヘッドスペース中の酸素レベルに感受性を示す。３％未満のＯ_２の場合、２〜８℃で６ヶ月後に本質的に変化は認められなかった。

【0126】

表２：２〜８℃で６ヶ月の保存後の実施例３の安定性のまとめ

【0127】

【表2】

^＊ベースラインから保持された比率。

【0128】

実施例４：スクロースレベルの影響
０％、５％、８％、または１６％のレベルのスクロースを含む０．０５％システインHCｌ、０．０５％ポロクサマー１８８、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中に２．５ｍｇ／ｍＬでＧＣＢを配合した。２ｍＬガラスバイアルに、それぞれ１ｍＬの処方溶液を充填した。バイアルを凍結乾燥機で真空脱気し、Ｎ_２で９５０ｍＢａｒまで重層し、その後に１３ｍｍストッパーで閉じた。サンプルを、２〜８℃の安定室に入れた。６ヶ月の時点で、サンプルを取り出し、ＳＥ−ＨＰＬＣによる凝集の変化およびＲＰ−ＨＰＬＣによる分解の変化について試験した。結果を、表３にまとめる。

【0129】

表３：２〜８℃で６ヶ月の保存後の実施例４の安定性のまとめ

【0130】

【表3】

^＊ベースラインから保持された比率。

【0131】

実施例５：システインレベルの影響
０％または０．０５％のシステインHCｌを含む１６％スクロース、０．０５％ポロクサマー１８８、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中に２．５ｍｇ／ｍＬでＧＣＢを配合した。２ｍＬガラスバイアルに、それぞれ１ｍＬの処方溶液を充填した。バイアルを凍結乾燥機で真空脱気し、ヘッドスペース中をＮ_２で９５０ｍＢａｒまで重層し、その後に１３ｍｍストッパーで閉じた。これらのサンプルを、２〜８℃の安定室に入れた。６ヶ月の時点で、サンプルを取り出し、ＳＥ−ＨＰＬＣによる凝集の変化およびＲＰ−ＨＰＬＣによる分解の変化について試験した。結果を、表４にまとめる。システインHCｌの添加により、凝集レベルは減少したが、ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出した分解レベルは増加した。

【0132】

表４：２〜８℃で６ヶ月の保存後の実施例５の安定性のまとめ

【0133】

【表4】

^＊ベースラインから保持された比率。

【0134】

実施例６：ｐＨレベルの影響
１６％スクロース、０．０５％システインHCｌ、０．０５％ポロクサマー１８８、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０、５．８、または５．５）中に２．５ｍｇ／ｍＬでＧＣＢを配合した。２ｍＬガラスバイアルに、それぞれ１ｍＬの処方溶液を充填した。バイアルを真空脱気し、ヘッドスペース中をＮ_２で９５０ｍＢａｒまで重層し、その後に１３ｍｍストッパーで閉じた。これらのサンプルを、１３〜１７℃の安定室に入れた。３ヶ月の時点で、サンプルを取り出し、ＳＥ−ＨＰＬＣによる凝集の変化およびＲＰ−ＨＰＬＣによる分解の変化について試験した。結果を、表５にまとめる。ｐＨの低下は、凝集レベルおよび分解レベルの両方を減少させることができる。

【0135】

表５：１３〜１７℃で３ヶ月の保存後の実施例６の安定性のまとめ

【0136】

【表5】

^＊ベースラインから保持された比率。

【0137】

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明しているが、上記説明は例示を意図し、添付の特許請求の範囲の範囲を制限することを意図しない。他の態様、利点、および修正形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。