特許 5797280 高光学純度の乳酸生産用形質転換体およびそれを利用した乳酸生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5797280

(24)【登録日】2015年8月28日

(45)【発行日】2015年10月21日

(54)【発明の名称】高光学純度の乳酸生産用形質転換体およびそれを利用した乳酸生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20151001BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20151001BHJP

   C12P 7/56 20060101ALI20151001BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12N15/00 A

   C12P7/56

【請求項の数】10

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2013-555345(P2013-555345)

(86)(22)【出願日】2011年2月23日

(65)【公表番号】特表2014-506477(P2014-506477A)

(43)【公表日】2014年3月17日

(86)【国際出願番号】KR2011001240

(87)【国際公開番号】WO2012115290

(87)【国際公開日】20120830

【審査請求日】2013年8月23日

【微生物の受託番号】KCTC  11803BP

(73)【特許権者】

【識別番号】503137827

【氏名又は名称】マクロジェン・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100089037

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】ジェ−ヨン・キム

(72)【発明者】

【氏名】サン−フム・シン

(72)【発明者】

【氏名】ヒョン−ヨン・チョン

(72)【発明者】

【氏名】カプ−ソク・ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン−スン・セオ

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５１３６３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１５８１７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第４３９５１３２（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 国際公開第２０１０／１４０６０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006, Vol.101, No.2, p.172-177

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ７／００−７／６６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体。

【請求項2】

前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列で表されるペプチドをコーディングする遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。

【請求項3】

前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の塩基配列で表される、請求項１または２に記載の形質転換体。

【請求項4】

前記形質転換体は、寄託番号ＫＣＴＣ １１８０３ＢＰである、請求項１から３のいずれか一項に記載の形質転換体。

【請求項5】

ザイモモナス・モビリス菌株を準備する段階と、
前記ザイモモナス・モビリス菌株にロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含む
ザイモモナス・モビリス形質転換体製造方法。

【請求項6】

前記ザイモモナス・モビリス形質転換体は、請求項１から４のいずれか一項によるザイモモナス・モビリス形質転換体である、請求項５に記載のザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法。

【請求項7】

前記導入は、接合、電気穿孔法、および遺伝子銃方法からなる群より選ばれた方法で行う、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

ロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス菌株に導入してザイモモナス・モビリス形質転換体を製造する段階と、
前記製造されたザイモモナス・モビリス形質転換体を培養する段階とを含む
乳酸生産方法。

【請求項9】

前記ザイモモナス・モビリス形質転換体は、請求項１から４のいずれか一項によるザイモモナス・モビリス形質転換体である、請求項８に記載の乳酸生産方法。

【請求項10】

前記培養は、ｐＨ３．０からｐＨ７．０の条件下で行う、請求項８または９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物を利用した乳酸の生物学的な生産方法に関するものであって、簡便且つ経済的な方法で高光学純度の乳酸を高収率で生産することができる形質転換体、その製造方法およびそれを利用した乳酸生産方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ポリ乳酸（ＰＬＡ）は、商業的に生産されるバイオプラスチック（ｂｉｏ−ｐｌａｓｔｉｃ）の原料であって、ラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）の縮合重合（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）によって生成される脂肪族ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）である。ＰＬＡは、電子製品包装材、ミネラルウォーター瓶、自動車内装材、事務用家具、エンジニアリングプラスチック、繊維分野などのような非常に重要な用途を有しており、未来の代表的な生分解性バイオプラスチックとして脚光を浴びている。特に、近来の全世界的に活発に展開されている「地球環境保護運動」と共に地球温暖化、気候変化に対する環境親和的な次世代の代替繊維素材の必要性が台頭することに伴って、天然的に再利用が可能であり、汚染物質を排出せず、合成繊維と類似する物理化学的性質および機械的性質を有しながら生分解が可能なＰＬＡ生分解性繊維は無限の潜在力を有していると見ることができる。このような潜在力があるにもかかわらず、生分解性繊維はまだ一般の合成繊維に比べて５〜１０倍程度生産単価が高く、大量生産に困難が多いだけでなく、特性による用途開発が行われていないため、その実用化が微々たる実情である。

【0003】

乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅ）は、医薬品（ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、食品（ｆｏｏｄ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、化粧品（ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ）、化学製品（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）等の多様な分野の実用可能な原料物質（ｃｏｍｍｏｄｉｔｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ）として広く知られてきた。最近は生分解性高分子（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）であるポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＡ）の原料としても注目を浴びつつあり、使用量の急激な増加傾向と共に関連技術開発が活発が行われている。

【0004】

乳酸は、生物体内で炭水化物が酸化されたピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）の還元でｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ酵素により生産される。乳酸は、Ｌ−（＋）−Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄとＤ−（−）−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄの光学異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）を有する特性を有しており、化学合成方法によって生産されてきたが、最近は微生物を利用した生物学的な生産方法への転換技術を通じて直接生産している。
一般に乳酸発酵生産は、（１）発酵、（２）細胞菌体および蛋白質除去、（３）乳酸分離および精製、（４）乳酸濃縮、（５）脱色の５段階で構成される。乳酸発酵生産技術は、大部分新規な乳酸生産工程の開発と持続的な改善を通じてプラント（ｐｌａｎｔｓ）の規模と生産効率向上など生産技術と経済的な蒸発濃縮器（ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）とメンブレイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）技術と共に脱水工程の革新的な進歩のような優れた分離、精製技術開発を通じた分離精製費用節減と効率向上に集中されてきた。

【0005】

最近は多様なシステム分析技術と代謝工学技術を活用した温度、ｐＨ、有機酸物の生産に卓越な性能を有する一層優れた発酵微生物の開発に研究開発が集中している。しかし、現在発酵生産される乳酸は、石油から生産される乳酸に比べて高い光学選択度（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｕｒｉｔｙ）と純度の乳酸を生産するために生産単価が増加し、様々な応用分野に適した多様な品質の乳酸を経済的に生産することに限界を有している。

【0006】

乳酸発酵生産は、石油化学工程とは異なり、乳酸生産微生物に絶対的に依存的であるため、乳酸を大量で生産することができるのはもちろん、生産費用を節減することができるように高い光学純度の乳酸を生産することができる微生物を確保することが何よりも重要である。高純度光学選択度の乳酸を大量生産するためには、大量の乳酸原料が投入されなければならず、多段階の分離精製工程が必須に要求されるため、生産単価は急激に増加する。したがって、乳酸を大量で生産すると共に必須に要求される技術が高純度の光学選択度を有する乳酸生産微生物菌株を開発することである。そのためには、優れた光学選択度を有する乳酸生産遺伝子の確保と共に高い光学選択度の代謝流れを最適化できるシステム分析技術と高度な代謝工学技術が必須に要求される。

【0007】

一般に微生物の生存条件は、中温（３０−３７℃）と中性ｐＨ（ｎｅｕｔｒａｌ ｐＨ７．０）の条件であり、微生物は特にｐＨに非常に敏感であり、狭いｐＨ範囲でのみ活発な生存性と生産性を示す特性がある。しかし、弱酸性を有する乳酸を生産する乳酸生産工程では乳酸の生産自体で酸度を低下させて酸性化する特性があるため、最適ｐＨを維持するために、ＮａＯＨ、（ＮＨ_４）ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２のような塩基（ｂａｓｅ）または炭酸塩（ＣａＣＯ_３）を持続的に添加することによって中性発酵ｐＨを維持することが要求される。酸度７．０の中性ｐＨでの乳酸は本質的に全てイオン化される。中性ｐＨで生産された乳酸塩（ｌａｃｔａｔｅ ｓａｌｔ）形態の乳酸を分離および精製するために、硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）のような強酸を添加して乳酸塩を陽イオン化（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）する工程が必要である。この時、添加された硫酸１モルは２モルの乳酸を生産するようになる反面、１モルの沈殿物（ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ、ｅｇ． ＣａＳＯ_４）を同時に生産するようになる。

【0008】

結果的に生産された乳酸の量と同量の硫酸が必要である。これは、より多い乳酸の回収、精製のために投入されるべき硫酸の費用が持続的に増加するだけでなく、それによって生産される沈殿物の処理費用と環境的な問題を引き起こす非経済的な工程と知られている。これを改善し経済性を確保するために、高い酸度（酸性ｐＨ）でも乳酸を生産することができる乳酸生産微生物と、このような酸性条件で生成された乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）または乳酸塩（ｌａｃｔａｔｅ ｓａｌｔ）の沈澱廃棄物の生成なしに回収、精製することができる技術が切実に要求されてきた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｍａｌ Ｖｏｌ．１ Ｎｏ．７ ｐｐ． ８４１−８４５、１９８２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

そこで、本発明は、前記従来の技術の問題点を解決するために案出されたものであって、ｐＨ条件の制限や微生物内の代謝経路の調節なしにも高収率で乳酸を生産することができるだけでなく、別途の乳酸分離精製工程なしにも高い光学純度の乳酸を生産することができる形質転換体、その製造方法およびそれを利用した乳酸生産方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記のような課題を解決するために、本発明者らが高光学純度の乳酸を大量生産可能な乳酸生産微生物を研究している中、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）菌株に導入することによって、別途の複雑な工程や生産条件の制約なしに簡便且つ経済的な方法でＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を極大化することができ、ひいては高光学純度の乳酸生産を最大化することができることを確認して本発明を完成するように至った。

【0012】

本発明は、ロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナス・モビリス形質転換体を提供する。

【0013】

また本発明は、ザイモモナス・モビリス菌株を準備する段階と、前記ザイモモナス・モビリス菌株にロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含むザイモモナス・モビリス形質転換体製造方法を提供する。
また本発明は、ロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス菌株に導入してザイモモナス・モビリス形質転換体を製造する段階と、
前記製造されたザイモモナス・モビリス形質転換体を培養する段階とを含む乳酸生産方法を提供する。

【0014】

また本発明は、前記乳酸生産方法によって生産された高光学純度乳酸を提供する。
以下、本発明をより詳しく説明する。

【0015】

乳酸（ｌａｃｔａｔｅ／ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）は、カルボキシ基・ヒドロキシ基・メチル基・水素の４つの原子団が結合した非対称炭素原子を有する有機化合物（化学式：Ｃ_３Ｈ_６Ｏ_３）であって、Ｄ−、Ｌ−、ＤＬ−型の光学異性質体を全て含み、好ましくはＤ−型であり得る。

【0016】

前記乳酸の生産収率を高めるために、本発明の一実施形態は、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体を提供する。

【0017】

本発明はまた、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）菌株を準備する段階と、前記ザイモモナス・モビリス菌株にロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含むザイモモナス・モビリス形質転換体製造方法を提供する。

【0018】

前記ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）菌株は、アルコール発酵菌であって、細胞生長に比べて産物転換率に優れた菌株であるため、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコーディングする遺伝子を導入することに好ましい。

【0019】

前記ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体を利用することによって、ザイモモナス・モビリス菌株の代謝経路中のある特定の代謝経路を遮断して前記特定の代謝経路で生成される一次代謝産物以外の他の一次代謝産物の生産を増加させるなどの複雑な代謝経路の調節工程がなくても非常に簡単且つ容易な工程によって乳酸生産を顕著に向上させることができる。

【0020】

本明細書における「形質転換」とは、元来の細胞が有していたものとは異なる種類の遺伝子があるＤＮＡ鎖切れまたはプラスミドが細胞らの間に浸透して元来の細胞に存在していたＤＮＡと結合、細胞の遺伝型質が変化する分子生物学的な現象を意味する。

【0021】

特に本発明における形質転換とは、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス菌株内に導入することを意味し、「形質転換体」とは、前記遺伝子が導入されたザイモモナス・モビリス菌株を意味し、好ましくは前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列で表される遺伝子（Ｄｌｄｈ−Ｌｍｅｓ１８０１／ＤｌｍｅｓＣ２）が導入された寄託番号ＫＣＴＣ １１８０３ＢＰである形質転換体である。

【0022】

前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子はこれに制限されないが、好ましくはロイコノストック属菌株由来のものであり得、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列で表されるペプチドまたは前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列とアミノ酸一致度（ｉｄｅｎｔｉｔｙ、％）が４０％以上であるペプチドをコーディングする遺伝子であり得る。

【0023】

好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列で表されるペプチドをコーディングする遺伝子であり得る。

【0024】

前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列によって暗号化し、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の塩基配列によって暗号化し、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の塩基配列によって暗号化し、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の塩基配列によって暗号化するものであり得る。

【0025】

したがって、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子はこれに制限されないが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列で表される遺伝子または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列で表される遺伝子と塩基配列類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ、％）が８５％以上である遺伝子であり得る。

【0026】

好ましくは前記遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列で表される遺伝子（Ｄｌｄｈ−Ｌｍｅｓ１８０１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の塩基配列で表される遺伝子（ｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の塩基配列で表される遺伝子（ｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の塩基配列で表される遺伝子（Ｄ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６）であり得る。

【0027】

前記遺伝子の導入はこれに制限されないが、好ましくは接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、および遺伝子銃方法（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）からなる群より選ばれた方法を用いることができる。

【0028】

前記接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、細胞間（ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ、ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ）の細胞表面の接合性繊毛（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｐｉｌｉ）をよるＤＮＡ伝達機作を通じて遺伝子を導入する方法である（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｔａｔｕｍ， Ｎａｔｕｒｅ． Ｏｃｔ １９；１５８（４０１６）：ｐｐ．５５８．１９４６）。

【0029】

前記電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）は、細胞に電気衝撃を与えて細胞膜に一時的に小さい孔ができるようにして細胞のＤＮＡ吸収を増加させる方法であり（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｍａｌ Ｖｏｌ．１ Ｎｏ．７ ｐｐ． ８４１−８４５、１９８２；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ｐｐ８４９−８５８， ２００２参照）、前記遺伝子銃方法は、遺伝子を金属（タングステンまたは金）粒子にコーティングした後、高圧ガスの力で発射して遺伝子を導入する方法である（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ｐｐ８４９−８５８， ２００２参照）。

【0030】

前記遺伝子のザイモモナス・モビリス菌株内の導入位置は特に制限されず、導入される位置と関係なく高光学純度の乳酸を高い収率と効率で生産することができる。したがって、非常に簡単で便利なだけでなく、費用節減の効果がある。

【0031】

つまり、ザイモモナス・モビリス菌株の代謝経路と関連がない遺伝子またはその周辺地域に導入できることはもちろんであり、本発明によれば、ザイモモナス・モビリス菌株の代謝経路の調節が不要であり、代謝経路に対する影響有無とも関係がないため、代謝経路と関連した遺伝子位置に導入することも可能である。

【0032】

例えば、ザイモモナス・モビリス菌株のゲノム内、ＯＲＦ ＺＭＯ２７０−ＺＭＯ２６３、ＯＲＦ ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９、ＯＲＦ ＺＭＯ０３８１〜ＺＭＯ０３８４、ＯＲＦ ＺＭＯ０３９０〜ＺＭＯ０３９４またはＯＲＦ ＺＭＯ１７８６〜ＺＭＯ１７８９部位に導入することができ、または代謝経路関連遺伝子であるＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子、またはアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子位置に導入することもできる。

【0033】

前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、ザイモモナス・モビリス菌株のプロモーターと共にベクターに挿入して前記ザイモモナス・モビリス菌株内に導入させることができる。

【0034】

使用可能なベクターとしては、公知の全ての種類のベクターを含み、例えばｐＧＭＣ、ｐＺＹ５０７、ｐＺＹ５００、およびｐＺｙｍｏのようなザイモモナス・モビリス遺伝子発現ベクターだけでなく、ｐＵＣ ｓｅｒｉｅｓ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｓｅｒｉｅｓ、ｐＧＥＭ ｓｅｒｉｅｓなどのような一般クローニング用ベクターであり得る。好ましくは前記ベクターは、ザイモモナス・モビリスで調節可能なプロモーターを含み、選別マーカ、コンジュゲーター（ｃｏｎｊｕｇａｔｏｒ）などをさらに含むことができる。

【0035】

ザイモモナスで強力に発現するプロモーターは、通常の組み換え蛋白質の発現に使用される全ての種類のプロモーターであり得、またはザイモモナス・モビリスＺＭ４由来のプロモーターを使用することもできる。例えばＺＭ４由来のａｄｈＩ（ａｄｈＡ、ＺＭＯ１２３６）、ｐｄｃ（ｐｄｃ、ＺＭＯ１３６０）またはａｄｈＩＩ遺伝子（ａｄｈＢ、ＺＭＯ１５９６）のプロモーターがあり、それ以外にもザイモモナス・モビリスＺＭ４のそれぞれの遺伝子の上流配列５００ｂｐがプロモーターとして作用が可能である。一方、大腸菌で強力に発現するｔａｃプロモーターもまたザイモモナスで使用することができる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９５． Ｊａｎ １３；２６７（５１９５）：ｐｐ．２４０−２４３）。

【0036】

選別マーカは、抗生剤耐性遺伝子であり得、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが使用され得るが、これに限定されない。

【0037】

またベクターは、宿主細胞に形質転換されてエピソーマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）状態で存在する場合、複製に必要な複製オリジン（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）が要求される。複製オリジンとしては大部分のグラム（−）バクテリアで作用するＯｒｉＶ ｏｒｉｇｉｎがあり、前記ｏｒｉｇｉｎに作用するｒｅｐＡ、ｒｅｐＢ遺伝子がさらに要求され得る。

【0038】

前記ベクターは、微生物に形質導入の際、微生物の染色体に挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されたりプラスミド形態で細胞質内に存在することができ、これはベクターの種類によって適切に調節することができる。染色体内にベクターが挿入される場合は、ベクター内にザイモモナス菌株で複製に必要な複製オリジンがない場合として、染色体内にプラスミドと相同性を有する部分がある場合、相同性がある部分に挿入（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）されて同一の遺伝子が連続的に２ｃｏｐｙ存在（ｓｉｎｇｌｅ ｃｒｏｓｓ ｏｖｅｒ、ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）したり相同性部位がプラスミドの相同性部位に代替されるようになる（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ ｏｖｅｒ、ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）。もし染色体内にプラスミドと相同性がある部分が存在しないならば、無作為的な挿入（Ｒａｎｄｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起こるようになる。

【0039】

また本発明は、ロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス菌株に導入してザイモモナス・モビリス形質転換体を製造する段階と、前記製造されたザイモモナス・モビリス形質転換体を培養する段階とを含む乳酸生産方法を提供する。

【0040】

前記培養は、正常発酵条件であるｐＨ５．０ではもちろん、酸性発酵条件やその他ｐＨ非調節条件でも制限なしに行うことができる。例えば、ｐＨ３．０乃至ｐＨ７．０、より具体的にはｐＨ２．０乃至ｐＨ６．０、またはｐＨ３．０乃至ｐＨ５．０のような酸性条件下でも乳酸の生産が可能である。

【0041】

一般に微生物の生存条件は、中温（３０−３７℃）と中性ｐＨ（ｎｅｕｔｒａｌ ｐＨ７．０）条件であり、微生物は特にｐＨに非常に敏感であり、狭いｐＨ範囲だけで活発な生存性と生産性を示す特性があるが、弱酸性を有する乳酸を生産する乳酸生産工程では、乳酸の生産自体で酸度を低下させて酸性化する特性があるため、最適のｐＨを維持するために、ＮａＯＨ、（ＮＨ_４）ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２のような塩基（ｂａｓｅ）または炭酸塩（ＣａＣＯ_３）を持続的に添加することによって中性発酵ｐＨを維持することが要求された。しかし、本発明の乳酸生産方法は、このようなｐＨ条件の制限なしにいかなるｐＨ条件でも高い光学純度の乳酸を高収率で生産すること

【0042】

前記乳酸方法によって、好ましくは７０％以上、高い場合は１００％以上の顕著に高い生産収率で光学純度が高い優れた乳酸を大量生産することができる。
したがって、本発明は前記乳酸生産方法によって生産された高光学純度の乳酸を提供する。

【0043】

前記乳酸生産方法によって生産される乳酸は、光学純度が９５％以上であり、高い場合は９９％、より高い場合は９９．９％以上の顕著に優れた光学純度を有することができる。

【発明の効果】

【0044】

本発明によって、ｐＨ条件など生産条件の厳しい制限や微生物内の代謝経路の複雑な調節なしにも簡便に高光学純度の乳酸を高収率で生産することができるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体、その製造方法、およびそれを利用した乳酸生産方法が提供される。
前記形質転換体を利用すれば、別途の付加的な乳酸分離精製工程が不要であるため、乳酸生産段階を顕著に減少させることができて生産費用を大幅に節減することができるだけでなく、沈澱廃棄物による環境的な問題を排除することができて環境保護効果も得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列で表されるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子の発現単位を概略的に示したものである。

【図2】実施例１で製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：２６３ベクターの開裂地図である。

【図3】実施例１で製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクターの開裂地図である。

【発明を実施するための形態】

【0046】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を通じてより詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明を予告するものに過ぎず、本発明の範囲はこれに限定されない。

【0047】

実施例１．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）が導入されたＺＭ形質転換体の製造

【0048】

実施例１−１．プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＤｌｍｅｓＣ２の製造

【0049】

キムチから分離されたロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）菌株からＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするＤｌｍｅｓＣ２遺伝子（１，０６８ｂｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をＰＣＲ方法（９６℃で５分間にかけて前変性（ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）；９６℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分間にかけて総２５ｃｙｃｌｅｓ；７２℃で７分間にかけて後伸張（ｐｏｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ））で０．１ＵｎｉｔのＨｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）と以下に記載されたプライマーを用いて選択的に増幅、分離した。

【0050】

前記ＰＣＲ工程で使用されたプライマーは次のとおりである。
正方向プライマー（ＤＬｍｅｓＣ２Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
５−ＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＣ−３
逆方向プライマー（ＤＬｍｅｓＣ２Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
５−ＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣＴＣ−３
以降、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてＤｌｍｅｓＣ２遺伝子がクローニングされたプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＤｌｍｅｓＣ２を製造し、塩基配列を確認した。ＰＣＲ増幅とクローニングは製造会社の実験方法に従って行った。

【0051】

実施例１−２．ＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクターの製造

【0052】

前記実施例１−１で製造されたプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ−ＤｌｍｅｓＣ２）を制限酵素ＮｃｏＩ（ＮＥＢ）とＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で切断した後、ザイモモナス・モビリスアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）ＩＩ遺伝子（ａｄｈＢ、ＺＭＯ１５９６）のプロモーター部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）とスペクチノマイシン耐性（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）遺伝子（ｓｐｅｃ^Ｒ、１，１４２ｂｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を有するｐＢＳ−ｓｐ−Ｐ１５９６−ｓｐｅｃ^Ｒベクター（マクロゼン）に同一の制限酵素シートでクローニングしてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を含むｐＢＳ−ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを得た。

【0053】

Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）をザイモモナス・モビリス遺伝体に導入するために、相同性組み換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２． “Ｃｈａｐｔｅｒ５：ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｅｐａｉｒ， ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（４ｔｈ ｅｄ．）． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ｐ．８４５）を利用した。

【0054】

相同性組み換えに使用された遺伝子は、ザイモモナス・モビリス（ＡＴＣＣ ３１８２１）の遺伝体情報から選別し、具体的にＯＲＦ ＺＭＯ０２６３からＺＭＯ０２７０までの８個の反復された遺伝子ら（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を選別した。ＯＲＦ ＺＭＯ０２６３からＺＭＯ０２７０までの反復された遺伝子らは、特定の代謝酵素をコーディングしない遺伝子らであり、全体約１０ｋｂに達する部位である。これら遺伝子らの上流相同部位の４，４６８ｂｐ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）と下流相同部位の４，９３５ｂｐ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）のそれぞれを実施例１と同一な実験方法を用いてそれぞれ選択的に増幅、分離した後、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）、ＰｓｔＩ（ＮＥＢ）、ＰｖｕＩ（ＮＥＢ）、ＳｃａＩ（ＮＥＢ）で切断した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングして最終的にｐＢＳ−ｄｅ−２７０：：２６３ベクター（図２）を製造した。使用されたプライマーは次のとおりである。

【0055】

上流遺伝子正方向プライマー（Ｌ−２７０Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
５−ＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＴＡＧ−３
上流遺伝子逆方向プライマー（Ｌ−２７０Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
５−ＧＴＧＡＧＴＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣ−３
下流遺伝子正方向プライマー（Ｒ２６３Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
５−ＧＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＴＧＡＴＡＡＡＧＧＡ−３
下流遺伝子逆方向プライマー（Ｒ２６３Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
５−ＡＴＡＡＧＣＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＡｃｃＣＡＴＣＴＴＧＴＣＣＧＡＣＧ−３
上記で製造されたｐＢＳ−ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）とＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で切断して、ｓｐｅｃ^Ｒ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子切片だけを回収し、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）とＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ酵素（ＮＥＢ）処理を通じて平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）のｓｐｅｃ^Ｒ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子切片を作製した。作製された平滑末端のｓｐｅｃ^Ｒ−ＤｌｍｅｓＣ２を前記製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：２６３ベクターの制限酵素ＨｐａＩシートにＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびクローニングしてｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクター（図３）を製造した。

【0056】

実施例１−３．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）が導入されたＺＭ形質転換体の製造

【0057】

前記実施例１−２で製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株（ＡＴＣＣ ３１８２１）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｍａｌ Ｖｏｌ．１ Ｎｏ．７ ｐｐ．８４１−８４５，１９８２）で形質転換し、ＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ；ａｇａｒ、１５ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）にスペクチノマイシンを添加してｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクターが形質転換された菌株を選別し、最終的にＯＲＦ ＺＭＯ０２６３からＺＭＯ０２７０反復遺伝子らが相同性組み換えられ、ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入された形質転換体をＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ＭＧ６１０６と命名し、２０１０年１１月５日付で韓国生命工学研究院微生物資源センターに寄託して寄託番号ＫＣＴＣ １１８０３ＢＰを付与された。

【0058】

実施例２．多様なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された乳酸生産ＺＭ菌株の製造

【0059】

ロイコノストック・クレモリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＡＴＣＣ１９２５４、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＬＭＧ１８８１１、およびロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＢＲＣ３４２６菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であるｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４、ｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１、およびＤ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６を実施例１と同様な方法と材料を用いてＰＣＲ増幅、分離した。前記多様なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅に使用されたプライマーは次のとおりである。

【0060】

［ｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４遺伝子増幅プライマー］
ＡＴＣＣ１９２５４Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
５−ＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＧＧＣＡＴＴＣＧＴ−３
ＡＴＣＣ１９２５４Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
５−ＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴ−３

【0061】

［ｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１遺伝子増幅プライマー］
ＬＭＧ１８８１１Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
５−ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧ−３
ＬＭＧ１８８１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
５−ＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＡＴＴＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＡ−３

【0062】

［Ｄ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６遺伝子増幅プライマー］
ＮＢＲＣ３４２６Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
５−ＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＧＧＣＡＴＴＣＧ−３
ＮＢＲＣ３４２６Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
５−ＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴ−３

【0063】

個別に増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｃｏＩ（ＮＥＢ）とＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で切断して同一の制限酵素で切断されたｐＢＳ−ｓｐ−Ｐ１５９６−ｓｐｅｃ^Ｒベクター（マクロゼン）に同一の制限酵素シートにＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ酵素（ＮＥＢ）でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびクローニングし、ＮＢＲＣ３４２６菌株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるｐＢＳ−ｓｐ−Ｄ−ＮＢＲＣ３４２６ｌベクター、ＬＭＧ１８８１１菌株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるｐＢＳ−ｓｐ−Ｄ−ＬＭＧ１８８１１、そしてＡＴＣＣ１５２９４菌株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるｐＢＳ−ｓｐ−Ｄ−ＡＴＣＣ１５２９４ベクターをそれぞれ作製した。

【0064】

前記ベクターらを制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）とＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で切断して、ｓｐｅｃ^Ｒ−Ｄ−ＮＢＲＣ３４２６ｌ、ｓｐｅｃ^Ｒ−Ｄ−ＬＭＧ１８８１１、そしてｓｐｅｃ^Ｒ−Ｄ−ＡＴＣＣ１５２９４遺伝子切片を回収し、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）とＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ酵素（ＮＥＢ）処理を通じて平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）の遺伝子切片それぞれを作製した。作製された平滑末端の遺伝子切片を前記実施例１で製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：２６３ベクターの制限酵素ＨｐａＩシートにクローニングしてｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−Ｄ−ＮＢＲＣ３４２６ｌ：：２６３ベクター、ｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−Ｄ−ＬＭＧ１８８１１：：２６３ベクター、そしてｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−Ｄ−ＡＴＣＣ１５２９４：：２６３ベクターをそれぞれ製造した。

【0065】

上記で製造されたベクターらをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株（ＡＴＣＣ ３１８２１）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換し、ＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ；ａｇａｒ、１５ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）にスペクチノマイシンを添加して形質転換された菌株を選別し、最終的にＯＲＦ ＺＭＯ０２６３からＺＭＯ０２７０反復遺伝子らが相同性組み換えられ、ロイコノストック・クレモリスＡＴＣＣ １９２５４菌株からＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が導入された菌株をＭＧ６１１５、ロイコノストック・メセンテロイデスＬＭＧ１８８１１菌株からＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）が導入された菌株をＭＧ６１１６、そしてロイコノストック・メセンテロイデスＮＢＲＣ ３４２６からＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするＤ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）が導入された菌株をＭＧ６１１７とそれぞれ命名した。

【0066】

実施例３．遺伝体内の代謝経路と無関係な遺伝子または部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したＺＭ菌株の製造

【0067】

Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の菌株内導入位置およびこれによる乳酸生産程度に対する影響を調べてみるために、ザイモモナス・モビリス菌株（ＡＴＣＣ ３１８２１）内の代謝経路と無関係な特定の遺伝体位置に該当する遺伝子または部位を除去すると同時に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列を有するＤｌｍｅｓＣ２遺伝子を導入した菌株を製造した。具体的に、ザイモモナス・モビリス遺伝体で特定酵素をコーディングせず、いかなる遺伝子情報を有していない遺伝子部位４種類を選別してそれぞれ除去すると同時に、ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入された菌株を製造した。菌株製造は実施例１と同様な方法を用い、代謝経路と無関係な遺伝子のそれぞれの上流相同部位および下流相同部位約３，０００ｂｐ以上を相同性組み換え部位にクローニングして用いた。

【0068】

実施例３−１．ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９の３種類のＯＲＦ部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造

【0069】

ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９の３種類のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）らを５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，１６８ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，１５９ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）をそれぞれ正方向プライマー（８７Ｆ）と逆方向プライマー（８９Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0070】

正方向プライマー（８７Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）
５−ＴＧＡＡＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＧＡＴＡＴＡＴＣＧＡＡＴＡ−３
逆方向プライマー（８９Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）
５−ＧＴＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＣＴＣＣＧＣＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡ−３

【0071】

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングしてｐＢＳ−ＺＭＯ００８７８９ベクターを作製した。

【0072】

以降、逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ方法を応用してＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９らを除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｄｅｌ ８９Ｆおよびｄｅｌ ８７Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を用い、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0073】

正方向プライマー（ｄｅｌ ８９Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）
５−ＴＡＡＣＣＣＧＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＣＡＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡ−３
逆方向プライマー（ｄｅｌ ８７Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）
５−ＣＡＴＡＡＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡ−３

【0074】

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理して得た遺伝子切片と実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ ８７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：８９ベクターを作製した。

【0075】

実施例３−２．ＺＭＯ０３８１〜ＺＭＯ０３８４の４種類のＯＲＦ部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造

【0076】

ＺＭＯ０３８１〜ＺＭＯ０３８４の４種類のＯＲＦらを５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，１４０ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，２１２ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）をそれぞれ正方向プライマー（３８１Ｆ）と逆方向プライマー（３８４Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0077】

正方向プライマー（３８１Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）
５−ＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＡＡＣＧＡＴＣＴＴＴ−３
逆方向プライマー（３８４Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）
５−ＣＣＡＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＣ−３

【0078】

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ０３８１３８４ベクターを作製した。

【0079】

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ０３８１〜ＺＭＯ０３８４らを除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｄｅｌ ３８４Ｆおよびｄｅｌ ３８１Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0080】

正方向プライマー（ｄｅｌ ３８４Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）
５−ＴＧＴＡＧＴＴＴＡＴＡＣＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＧＧ−３
逆方向プライマー（ｄｅｌ ３８１Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）
５−ＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＧＣＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＧ−３

【0081】

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ ３８１：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：３８４ベクターを作製した。

【0082】

実施例３−３．ＺＭＯ０３９０〜ＺＭＯ０３９４の４種類のＯＲＦ部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造

【0083】

ＺＭＯ０３９０〜ＺＭＯ０３９４の５種類のＯＲＦらを５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，２８０ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，００８ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）をそれぞれ正方向プライマー（３９０Ｆ）と逆方向プライマー（３９４Ｆ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0084】

正方向プライマー（３９０Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）
５−ＡＴＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧ−３
逆方向プライマー（３９４Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）
５−ＴＡＧＣＧＧＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＣＧＡＴＧＴＡ−３
増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ０３９０３９４ベクターを作製した。

【0085】

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ０３９０〜ＺＭＯ０３９４らを除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｄｅｌ ３９４Ｆおよびｄｅｌ ３９０Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0086】

正方向プライマー（ｄｅｌ ３９４Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）
５−ＣＡＴＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣ−３
逆方向プライマー（ｄｅｌ ３９０Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）
５−ＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＧ−３
増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ ３９０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：３９４ベクターを作製した。

【0087】

実施例３−４．ＺＭＯ１７８６〜ＺＭＯ１７８９の４種類のＯＲＦ部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造

【0088】

ＺＭＯ１７８６〜ＺＭＯ１７８９の４種類のＯＲＦらは５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，４５０ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，１００ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）をそれぞれ正方向プライマー（１７８６Ｆ）と逆方向プライマー（１７８９Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0089】

正方向プライマー（１７８６Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）
５−ＡＣＣＡＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴＡＣＣ−３
逆方向プライマー（１７８９Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）
５−ＧＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＧＣＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＧＣ−３

【0090】

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ１７８６１７８９ベクターを作製した。

【0091】

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ１７８６〜ＺＭＯ１７８９らを除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｄｅｌ １７８９Ｆおよびｄｅｌ １７８６Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0092】

正方向プライマー（ｄｅｌ １７８９Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）
５−ＴＡＴＣＴＣＧＣＴＴＧＣＡＡＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧ−３
逆方向プライマー（ｄｅｌ １７８６Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）
５−ＡＧＡＴＴＴＴＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧ−３
増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ １７８６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：１７８９ベクターを作製した。

【0093】

実施例３−５．代謝経路と無関係な遺伝子または部位がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で置換されたＺＭ菌株の製造

【0094】

前記実施例３−１乃至実施例３−４により製造されたベクターらをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株（ＡＴＣＣ ３１８２１）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換して代謝と無関係な遺伝子らが除去され、ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が挿入された菌株らを次のとおり作製した。

【0095】

実施例３−１のｐＢＳ−Ｄｅｌ ８７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：８９ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株に形質転換し、抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ；ａｇａｒ、１５ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ８７８９：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株を製造し、これをＭＧ６１１８菌株と命名した。

【0096】

これと同様に、実施例３−２乃至実施例３−４により製造されたｐＢＳ−Ｄｅｌ ３８１：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：３８４ベクター、ｐＢＳ−Ｄｅｌ ３９０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：３９４ベクターおよびｐＢＳ−Ｄｅｌ １７８６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：１７８９ベクターで形質転換されてそれぞれの遺伝子部位がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ３８１３８４：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１１９菌注）、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ３９０３９４：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１２０菌注）、およびＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ３９０３９４：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１２１菌株）を製造した。

【0097】

実施例４．代謝経路関連遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したＺＭ菌株の製造

【0098】

菌株内Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入と菌株の代謝経路調節間の関係およびその乳酸生産に対する影響を調べてみるために、菌株内の他の代謝経路遺伝子（ら）を除去すると同時にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列を有するＤｌｍｅｓＣ２遺伝子を導入した菌株を製造した。具体的にザイモモナス・モビリス菌株の中心代謝回路に該当するエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）と乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）生産遺伝子が除去された菌株と、ここにＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入された菌株を製造した。菌株製造方法は、実施例１と同様な方法を用い、代謝経路遺伝子のそれぞれの上流相同部位および下流相同部位約３，０００ｂｐ以上を相同性組み換え部位でクローニングして用いた。

【0099】

実施例４−１．乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を導入したベクターの製造

【0100】

ザイモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ ３１８２１）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）から乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子５’末端側に５’末端から上流相同部位の４，８７９ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の４，９８４ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）をそれぞれ正方向プライマー（ｌｄｈＡＦ）と逆方向プライマー（ｌｄｈＡＲ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0101】

正方向プライマー（ｌｄｈＡＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）
５−ＴＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣ−３
逆方向プライマー（ｌｄｈＡＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）
５−ＧＴＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＧ−３

【0102】

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ０２５６ベクターを作製した。

【0103】

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用して乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子を除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２ＦおよびｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0104】

正方向プライマー（ｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）
５−ＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴ−３
逆方向プライマー（ｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）
５−ＣＴＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴＡＣＧ−３

【0105】

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ ＺＭ０２５６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを作製した。

【0106】

実施例４−２．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を導入したベクターの製造

【0107】

ザイモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ ３１８２１）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）から乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）遺伝子５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，６５６ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，８４８ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）をそれぞれ正方向プライマー（Ｄｌｄｈ−Ｆ）と逆方向プライマー（Ｄｌｄｈ−Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0108】

正方向プライマー（Ｄｌｄｈ−Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）
５−ＴＧＴＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＴＴＴＡＡＧＴＣ−３
逆方向プライマー（Ｄｌｄｈ−Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）
５−ＴＣＴＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＣＡＣＡＡ−３

【0109】

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ１２３７ベクターを作製した。

【0110】

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）遺伝子を除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（Ｄｅｌ−ＤｌｄＦおよびＤｅｌ−ＤｌｄＲ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0111】

正方向プライマー（Ｄｅｌ−ＤｌｄＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）
５−ＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡ−３
逆方向プライマー（Ｄｅｌ−ＤｌｄＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）
５−ＴＧＡＴＣＣＴＧＴＡＴＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣ−３

【0112】

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ ＺＭ０１２３７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを作製した。

【0113】

実施例４−３．アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を導入したベクターの製造

【0114】

ザイモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ ３１８２１）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）からアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，８４４ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，８６１ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）をそれぞれ正方向プライマー（Ａｄｈ１−Ｆ）と逆方向プライマー（Ａｄｈ１−Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0115】

正方向プライマー（Ａｄｈ１−Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）
５−ＡＣＴＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＣＴＧＡ−３
逆方向プライマー（Ａｄｈ１−Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）
５−ＡＣＣＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＧＧー−３

【0116】

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ１２３６ベクターを作製した。

【0117】

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子を除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅しており、逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（Ｄｅｌ−Ａｄｈ１ＦおよびＤｅｌ−Ａｄｈ１Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0118】

正方向プライマー（Ｄｅｌ−Ａｄｈ１Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）
５−ＴＴＧＣＧＡＡＴＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＴＴＧＣ−３
逆方向プライマー（Ｄｅｌ−Ａｄｈ１Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）
５−ＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＧＴＣＧＴＣ−３

【0119】

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ ＺＭ０１２３６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを作製した。

【0120】

実施例４−４．アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を導入したベクターの製造
ザイモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ ３１８２１）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）からアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子５’末端側に５’末端から上流相同部位の３、９８６ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，８６８ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）をそれぞれ正方向プライマー（Ａｄｈ２−Ｆ）と逆方向プライマー（Ａｄｈ２−Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

【0121】

正方向プライマー（Ａｄｈ２−Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）
５−ＣＡＴＡＡＣＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＡ−３
逆方向プライマー（Ａｄｈ２−Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）
５−ＴＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧ−３

【0122】

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ１５９６ベクターを作製した。

【0123】

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子を除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（Ｄｅｌ−Ａｄｈ２ＦおよびＤｅｌ−Ａｄｈ２Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を用い、伸長時間を１０分に調節した。

【0124】

正方向プライマー（Ｄｅｌ−Ａｄｈ２Ｆ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）
５−ＣＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣ−３
逆方向プライマー（Ｄｅｌ−Ａｄｈ２Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）
５−ＣＴＧＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣ−３

【0125】

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ ＺＭ０１５９６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを作製した。

【0126】

実施例４−５．代謝経路関連遺伝子がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で置換されたＺＭ菌株の製造

【0127】

前記実施例４−１乃至実施例４−４により製造されたベクターらをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株（ＡＴＣＣ ３１８２１）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換して代謝経路関連遺伝子らが除去され、ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が挿入された菌株らを次のとおり作製した。

【0128】

前記実施例４−１により製造されたｐＢＳ−Ｄｅｌ ＺＭ０２５６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株に形質転換し、抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ；ａｇａｒ、１５ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じて乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ０２５６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株をＭＧ６１１１菌株と命名した。

【0129】

前記実施例４−２により製造されたｐＢＳ−Ｄｅｌ ＺＭ０１２３７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを実施例４−１により乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス菌株（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ０２５６：：ｔｅｔ）に形質転換して、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子およびＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）が全て除去され、ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ０２５６：：ｃｍ、ΔＺＭＯ１２３７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１１２菌株）を、前述のように抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じて製造した。
前記実施例４−３により製造されたｐＢＳ−Ｄｅｌ ＺＭ０１２３６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株に形質転換し、前記抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ１２３６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１１３菌株）を製造した。

【0130】

最後に、前記実施例４−４により製造されたｐＢＳ−Ｄｅｌ ＺＭ０１５９６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株に形質転換し、前記抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ１５９６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１１４菌株）を製造した。

【0131】

実験例１．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性（ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）試験

【0132】

前記実施例１乃至３で製造されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ導入菌株が、ｐｙｒｕｖａｔｅを基質で利用してＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄを生産する酵素反応を促進するＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を示すのか確認するために酵素活性測定実験を行った。
対照群としては野生型ザイモモナス・モビリス菌株ＺＭ４（ＡＴＣＣ ３１８２１）を用い、前記野生型ＺＭ４菌株とＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されたＺＭ菌株（ＭＧ６１０６、ＭＧ６１１５、ＭＧ６１１６、ＭＧ６１１７およびＭＧ６１１８）のそれぞれをＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）で対数増殖期までインキュベータ（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で定置培養して生長させた後、各細胞を回収した（１２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）。回収された各細胞らを高周波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）方法で破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）して上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収して酵素活性測定に用いた。
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性は２種類のキット（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｓｉｇｍａ）を利用して製造会社の方法に従って測定し、その結果を下記表１に示した。

【0133】

【表1】

【0134】

前記表１に示されているように、対照群である前記野生型ＺＭ４菌株の酵素活性は、０．０１２Ｕ／ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎに過ぎない反面、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されたＺＭ菌株（ＭＧ６１０６、ＭＧ６１１５、ＭＧ６１１６、ＭＧ６１１７およびＭＧ６１１８）のそれぞれの酵素活性は、全て１Ｕ／ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎを超え、高い場合は１．５５６Ｕ／ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎまで現れてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された形質転換体の酵素活性が野生型菌株に比べて顕著に優れていることを確認することができた。

【0135】

実験例２．乳酸（Ｄ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ）生産能力試験

【0136】

実験例２−１．乳酸（Ｄ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ）生産能力試験方法

【0137】

前記実施例１乃至４で製造されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ導入菌株らのＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力を試験するために、前記菌株らをそれぞれｐＨを５．０に調節したＲＭ液体培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ）で、それぞれ３０℃で２０時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を以下のような条件でＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて代謝産物を測定した。対照群としては前記実験例１で使用された野生型ザイモモナス・モビリス菌株ＺＭ４（ＡＴＣＣ ３１８２１）を用い、比較例としてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｄｅｑｕｉｎ ａｎｄ Ｂａｒｒｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）． １９９４． Ｆｅｂ；１２（２）：１７３−１７７）および／またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＯＣ２菌株（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． ２００６． Ｆｅｂ；１０１（２）：１７２−１７７）を用いた。

【0138】

＜ＨＰＬＣ測定条件＞
ＨＰＬＣシステム：Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＰＬＣシステム（ｍｏｄｅｌ Ｄ−７０００）
カラム：Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（３００ｍｍＸ７．８ｍｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
移動床（溶媒）：０．００２５Ｎ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ
検出器：
Ｄ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅおよびその他有機酸−ＵＶ検出器（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ−４２００）（２１５ｎｍ）
糖およびエタノール−ＲＩ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）検出器（Ｄ−３３００）

【0139】

実験例２−２．多様なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株らのＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力試験

【0140】

前記実施例１および実施例２で製造された菌株ら（ＭＧ６１０６、ＭＧ６１１５、ＭＧ６１１６、およびＭＧ６１１７）のＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力を前記実験例２−１に記載された方法で比較してみた結果、下記表２に示されているように、ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入された菌株であるＭＧ６１０６だけでなく、これと遺伝子一致度が９５％以上であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＡＴＣＣ １９２５４菌株から分離されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＬＭＧ １８８１１菌株から分離されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＮＢＲＣ ３４２６から分離されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするＤ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ ３４２６遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）がそれぞれ導入された菌株ＭＧ６１１５、ＭＧ６１１６、およびＭＧ６１１７も非常に高い収率および生産性で乳酸を生産できることが分かった。

【0141】

したがって、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、ＤｌｍｅｓＣ２以外にもこれと遺伝子一致度が９５％以上である多様なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を使用可能であることを確認することができた。

【0142】

【表2】

【0143】

実験例２−３．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入位置および代謝経路調節によるＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力に対する影響試験

【0144】

前記実施例３および実施例４で製造された菌株らのＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力を前記実験例２−１に記載された方法で比較してみた結果、下記表３に示されているように、ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入される特定の遺伝体位置に該当する遺伝子または部位と関係なく、乳酸を、低い場合は約９５．０％、高い場合は９９．９％以上の顕著に高い収率と効率で生産することが分かった。また下記表４に示されているように、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＤｌｍｅｓＣ２が導入された各菌株の乳酸生産は他の代謝経路流れに依存したりまたは促進されることもないことが分かった。

【0145】

【表3】

【0146】

【表4】

【0147】

このようにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の乳酸生産は、前記遺伝子が導入される遺伝体の位置（ｇｅｎｅ ｏｒ ｒｅｇｉｏｎ）または代謝経路流れに依存したりまたは促進されず、したがってＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入位置または代謝経路調節と関係なくＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の存在自体に独立依存的に行われることを確認することができた。反面、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、代謝経路と関係がなかったり核心産物代謝（例：エタノール生産経路ら）経路が除去されない状態の独立的なＤ−ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｎａｓｅはＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅ生産に効率的ではないため、代謝経路調節に依存的であることを確認することができた。

【0148】

したがって、代謝経路調節と関係なく独立的にＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅを効率的に生産できるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の乳酸生産能力が顕著に優れていることを確認することができた。

【0149】

実験例２−４．ｐＨ条件による乳酸（Ｄ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ）生産比較

【0150】

前記実施例１で製造されたＭＧ６１０６菌株のｐＨ条件による乳酸生産能力を試験するために、前記実験例２−１に記載された方法と同様な方法でＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力を測定し、ただし、ｐＨ非調節によるＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力は、塩基添加によるｐＨ調節なしに最終発酵ｐＨを３．０にしたＲＭ液体培地で前記菌株を３０℃で２０時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を用いて測定した。その結果を下記表５に示した。

【0151】

【表5】

【0152】

前記表５に示されているように、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の場合、ｐＨ５．０の条件はもちろん、ｐＨ非調節（酸性条件）発酵条件下でも乳酸（Ｄ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ）生産収率がそれぞれ９９．９％以上および９９．７％に非常に高く現れ、ひいてはｐＨ５．０条件およびｐＨ非調節の全ての発酵条件でＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ生産効率が優れていると報告されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ２と比較してみた結果、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ２の場合、同一の条件でＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅ生産収率がそれぞれ６１％および５３％に過ぎないと示され、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株は、ｐＨ条件の制限なしにいかなるｐＨ条件でも顕著に優れたＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅ生産収率を有することを確認することができた。

【0153】

実験例３．ｐＨ条件によるＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅの光学純度（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｕｒｉｔｙ）比較

【0154】

前記実施例１で製造されたＭＧ６１０６菌株のｐＨ条件によるＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅの光学純度を比較分析するために、前記菌株を塩基（ｂａｓｅ）添加を通じてｐＨを５．０に調節したＲＭ液体培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ）と、塩基添加によるｐＨ調節なしに最終発酵ｐＨを３．０にしたＲＭ液体培地で３０℃で２０時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を以下のような条件でＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行ってＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅの光学純度（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｕｒｉｔｙ、％）または光学超過数値（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ、ｅｅ ｖａｌｕｅ、％）を分析してその結果を下記表６に示した。前記実験例２と同様に、対照群としては野生型ザイモモナス・モビリス菌株ＺＭ４（ＡＴＣＣ ３１８２１）を用い、比較例としてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ２菌株（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． ２００６． Ｆｅｂ；１０１（２）：１７２−１７７）を用いた。

【0155】

＜ＨＰＬＣ測定条件＞
ＨＰＬＣシステム：Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＰＬＣシステム（ｍｏｄｅｌ Ｄ−７０００）
カラム：Ｃｈｉｒｅｘ ３１２６カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ）
カラム温度：２５℃
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
移動床（溶媒）：１ｍＭ ｃｏｐｐｅｒ ｓｕｌｆａｔｅ（ＣｕＳＯ４）溶液
検出器：ＵＶ検出器（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｄ−４２００）（２５４ｎｍ）
具体的に標準試薬Ｄ（−）−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｌ０６２５、Ｓｉｇｍａ）、Ｌ（＋）−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｌ１７５０、Ｓｉｇｍａ）、そしてＤＬ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｌ１２５０、Ｓｉｇｍａ）を用いてＤ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄとＬ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄの光学異性体を区分、分離し、光学純度（％）と光学超過数値（％）はそれぞれ以下の数式１および２により計算した。

【0156】

［数式１］
Ｄ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄの光学純度（％）＝Ｄ／Ｄ＋Ｌ＊１００
［数式２］
ｅｅ ｖａｌｕｅ（％）＝Ｄ＋Ｌ／Ｄ−Ｌ＊１００

【0157】

【表6】

【0158】

前記表６に示されているように、対照群である前記野生型ＺＭ４菌株により生産された乳酸の光学純度は約３３．３％と低く示された反面、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株により生産された乳酸の光学純度はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ２と同等な程度である９９．９％の非常に高い光学純度を示すことを確認することができた。ただし、前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ２の場合、前記実験例２−３で考察したように代謝経路調節に依存した乳酸生産効率を示す反面、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼが導入された形質転換菌株の場合、代謝経路調節がなくてもｐＨ条件の制限なしに非常に高い収率と非常に高い光学純度で乳酸を生産することができるため、対照群である前記野生型ＺＭ４菌株はもちろん、前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣ２に比べても顕著に優れていることを確認することができた。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]