特許 5797875 アポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス調節

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5797875

(24)【登録日】2015年8月28日

(45)【発行日】2015年10月21日

(54)【発明の名称】アポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス調節

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20151001BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20151001BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20151001BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20151001BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20151001BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20151001BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20151001BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20151001BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20151001BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   A61K9/10

   A61K31/7088

   A61P3/00

   A61P3/04

   A61P3/06

   A61P3/10

   A61P9/10

   C12N5/00 202A

【請求項の数】20

【全頁数】111

(21)【出願番号】特願2008-298818(P2008-298818)

(22)【出願日】2008年11月21日

(62)【分割の表示】特願2003-517078(P2003-517078)の分割

【原出願日】2002年7月30日

(65)【公開番号】特開2009-55925(P2009-55925A)

(43)【公開日】2009年3月19日

【審査請求日】2008年11月21日

【審判番号】不服2013-8170(P2013-8170/J1)

【審判請求日】2013年5月7日

(31)【優先権主張番号】09/920,033

(32)【優先日】2001年8月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】10/135,985

(32)【優先日】2002年4月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】10/147,196

(32)【優先日】2002年5月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ロザンヌ エム． クルーク

(72)【発明者】

【氏名】マーク ジェイ． グラハム

【合議体】

【審判長】 中島 庸子

【審判官】 今村 玲英子

【審判官】 小堀 麻子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０１／１２７８９パンフレット（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０２／２２６３５パンフレット（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０１／９６５８６パンフレット（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０２／２４７１７パンフレット（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｄｏｎｇｍａｉ Ｙｉｎｇｈｕａ Ｚａｚｈｉ，１９９９年，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．４，ｐ３１５−３１８

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC C12N 15/00-90

A61K 31/7088-7125

A61K 48/00

A61P 3/00-14

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

ＷＰＩ

ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

異常な脂質代謝に関与するアポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物の処置に使用するための組成物であって、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項2】

異常なコレステロール代謝に関与するアポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物の処置に使用するための組成物であって、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項3】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物の処置に使用するための組成物であって、該状態はアテローム性動脈硬化症であり、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項4】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物の処置に使用するための組成物であって、該状態は高脂血症であり、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項5】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物の処置に使用するための組成物であって、該状態は糖尿病であり、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項6】

前記糖尿病が２型糖尿病である、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物の処置に使用するための組成物であって、該状態は肥満であり、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項8】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物の処置に使用するための組成物であって、該疾患は心血管疾患であり、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項9】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物におけるグルコースレベルの低下に使用するための組成物であって、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項10】

前記グルコースレベルが血漿中グルコースレベルである、請求項９に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

前記グルコースレベルが血清中グルコースレベルである、請求項９に記載の使用のための組成物。

【請求項12】

前記動物が糖尿病の動物である、請求項９に記載の使用のための組成物。

【請求項13】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物における血清中コレステロールレベルの低下に使用するための組成物であって、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項14】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物におけるリポタンパク質レベルの低下に使用するための組成物であって、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項15】

前記リポタンパク質がＶＬＤＬである、請求項１４に記載の使用のための組成物。

【請求項16】

前記リポタンパク質がＬＤＬである、請求項１４に記載の使用のための組成物。

【請求項17】

アポリポタンパク質Ｂに関連した疾患または状態を有する動物における血清中トリグリセリドレベルの低下に使用するための組成物であって、該組成物は、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ヒトアポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害し、該核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されるものであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４３、５３または５７に示されるヌクレオチド配列からなる、組成物。

【請求項18】

前記動物がヒトである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項19】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下：
（ｉ）少なくとも１つの改変されたヌクレオシド間結合；
（ｉｉ）少なくとも１つの改変された糖部分；および／または
（ｉｉｉ）少なくとも１つの改変された核酸塩基
を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項20】

請求項１９に記載の使用のための組成物であって、以下：
（ａ）前記改変ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である；
（ｂ）前記改変糖部分が、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である；そして／または
（ｃ）前記改変核酸塩基が５−メチルシトシンである、
組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（発明の分野）
本発明は、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする化合物（特に、オリゴヌクレオチド）に関する。このような化合物は、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節することが示されている。

【背景技術】

【0002】

（発明の背景）
リポタンパク質は、タンパク質、リン脂質およびコレステロールの両親媒性コーティングによって取り囲まれた、アシルグリセロールおよびコレステリルエステルの非極性コアから構成される、球状のミセル様粒子である。リポタンパク質は、それらの機能的特性および物理的特性に基づいて、以下の５つの広範の範疇に分類されている：カイロミクロン（これは、食物脂質を腸から組織へと輸送する）；超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）；中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）；低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（これらは全て、トリアシルグリセロールおよびグリセロールを肝臓から組織へと輸送する）；および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（これは、内在性コレステロールを組織から肝臓へと輸送する）。

【0003】

リポタンパク質粒子は、連続代謝プロセシングを受け、そして非常に多様な特性および組成を有する。リポタンパク質の密度は、粒子直径を低減することなく増大する。なぜなら、これらの外側のコーティングの密度が、内側の密度よりも小さいからである。リポタンパク質のタンパク質成分は、アポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）として公知である。少なくとも９つのアポリポタンパク質が、種々のヒトリポタンパク質において顕著な量で分布している。

【0004】

アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ、アポリポタンパク質Ｂ−１００；ＡｐｏＢ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８；ＡｐｏＢ−４８およびＡｇ（ｘ）抗原としても公知）は、脂質のアセンブリおよび分泌において、ならびに別個のクラスのリポタンパク質の輸送およびレセプター媒介取り込みおよび送達において必須の役割を果たす、大きな糖タンパク質である。アポリポタンパク質Ｂの重要性は、食物脂質の吸収およびプロセシングから循環するリポタンパク質のレベルの調節まで、種々の機能にまたがる（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。この後者の特性は、アテローム性動脈硬化症感受性に関するその関連性の基礎であり、アテローム性動脈硬化症感受性は、アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質の周囲濃度と高度に関連している（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

【0005】

２つの形態のアポリポタンパク質Ｂが、哺乳動物において存在する。ＡｐｏＢ−１００は、ヒト肝臓においてもっぱら合成される、４５３６アミノ酸残基を含む、全長タンパク質を表す（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。ＡｐｏＢ−４８として公知の短縮形態は、アミノ末端の２１５２残基と対応する部分が同一線形順序に並んでおり、そして全ての哺乳動物の小腸において合成される（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

【0006】

ＡｐｏＢ−１００は、ＬＤＬの主なタンパク質成分であり、そしてこのリポタンパク質種とＬＤＬレセプターとの相互作用に必要とされるドメインを含む。さらに、ＡｐｏＢ−１００は、アポリポタンパク質（ａ）との相互作用を媒介して、Ｌｐ（ａ）と呼ばれる別の異なるアテローム発生リポタンパク質を生成する、不対のシステイン残基を含む（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

【0007】

ヒトでは、ＡｐｏＢ−４８は、カイロミクロンと会合して循環し、そしてカイロミクロンのレムナントおよびこれらの粒子は、ＬＤＬレセプター関連タンパク質として公知の別個のレセプターによって浄化される（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。ＡｐｏＢ−４８は、ＡｐｏＢ−１００が、内在性血漿コレステロールの輸送および送達に関与する一方で、食物脂質が小腸から肝臓へと送達される重大な順応とみなされ得る（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

【0008】

アポリポタンパク質Ｂについての共通の構造遺伝子が２つの別個のタンパク質アイソフォームを産生する基礎は、ＲＮＡ編集として公知のプロセスである。部位特異的シトシン−ウラシル編集反応は、ＵＡＡ停止コドン、そしてアポリポタンパク質Ｂの翻訳終結を生じて、ＡｐｏＢ−４８を産生する（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＳｈｅｌｎｅｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．，２０００，２０，１６９−１９３）。

【0009】

アポリポタンパク質Ｂは、１９８５年にクローニングされ（Ｌａｗら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８５，８２，８３４０−８３４４）、そして１９８６年に染色体２ｐ２３−２ｐ２４にマッピングされた（Ｄｅｅｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６，８３，４１９−４２２）。

【0010】

米国特許第５，７８６，２０６号において開示および特許請求されるのは、アポリポタンパク質Ｂ−１００のエピトープ領域をコードする単離されたＤＮＡ配列を含む、血漿中での低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のレベルを決定するための方法および組成物である（Ｓｍｉｔｈら，１９９８）。

【0011】

ヒトアポリポタンパク質Ｂを発現し、高脂肪食餌を給餌されたトランスジェニックマウスは、高血漿コレステロールレベルを発達させることが見出され、そしてアテローム性動脈硬化症の病巣の、非トランスジェニック同腹仔に対して１１倍の増加を提示した（ＫｉｍおよびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，３９，７０３−７２３；Ｎｉｓｈｉｎａら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９０，３１，８５９−８６９）。

【0012】

さらに、短縮形態のヒトアポリポタンパク質Ｂを発現するトランスジェニックマウスを用いて、アポリポタンパク質（ａ）と相互作用してＬｐ（ａ）リポタンパク質粒子を生成するために必要とされる、ＡｐｏＢ−１００のカルボキシル末端の構造的特徴が同定されており、ＡｐｏＢ−１００のＬＤＬレセプター結合領域の構造的特徴が調査されている（ＫｉｍおよびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，３９，７０３−７２３；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，２３６１６−２３６２２）。

【0013】

高脂肪食餌を給餌した場合に高コレステロール血症を発達させることから保護される、アポリポタンパク質Ｂノックアウトマウス（ＡｐｏＢ−１００およびＡｐｏＢ−４８の両方が破壊されている）が作製されている（Ｆａｒｅｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９５，９２，１７７４−１７７８；ＫｉｍおよびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，３９，７０３−７２３）。ＡｐｏＢ１００またはＡｐｏＢ−４８を排他的に発現するマウスにおいてアテローム性動脈硬化症の発生
率が調査されており、そしてアテローム性動脈硬化症に対する感受性は、総コレステロールレベルに依存することが見出された。マウスによって合成されたＡｐｏＢ−１００またはＡｐｏＢ−４８がアテローム性動脈硬化症の程度に影響を与えようが与えまいが、おそらく、ＡｐｏＢ−１００とＡｐｏＢ−４８とでは、固有のアテローム発生性に主な相違はないことを示す（ＫｉｍおよびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１９９８，３９，７０３−７２３；Ｖｅｎｉａｎｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９７，１００，１８０−１８８）。

【0014】

ＡｐｏＢ−１００含有リポタンパク質Ｌｐ（ａ）の血漿レベルの上昇は、アテローム性動脈硬化症およびその発現の危険性の増大と関連し、これらは、高コレステロール血症（Ｓｅｅｄら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９０，３２２，１４９４−１４９９）、心筋梗塞（Ｓａｎｄｋａｍｐら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，３６，２０−２３）、および血栓症（Ｎｏｗａｋ−Ｇｏｔｔｌら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１９９７，９９，Ｅ１１）を包含し得る。

【0015】

Ｌｐ（ａ）の血漿濃度は、遺伝的因子によって強く影響され、そして大部分の薬物および食物操作に対して治療不応性である（ＫａｔａｎおよびＢｅｙｎｅｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，１９８７，１２５，３８７−３９９；Ｖｅｓｓｂｙら，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１９８２，４４，６１−７１）。上昇したＬｐ（ａ）レベルの薬理学的治療は、ほんのわずかにしか好首尾ではなく、そしてアフェレーシスが最も有効な治療様式のままである（ＨａｊｊａｒおよびＮａｃｈｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，１９９６，４７，４２３−４４２）。

【0016】

米国特許第６，１５６，３１５号および対応するＰＣＴ公開ＷＯ ９９／１８９８６において開示および特許請求されるのは、アポリポタンパク質Ｂのアミノ末端領域に結合し得、従って、血管マトリクスに対する低密度リポタンパク質の結合を阻害し得る、有効量の抗体またはそのフラグメントを被験体に投与することを包含する、被験体における血管マトリクスに対するＬＤＬの結合を阻害するための方法である（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＰｉｌｌａｒｉｓｅｔｔｉ，２０００；ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＰｉｌｌａｒｉｓｅｔｔｉ，１９９９）。

【0017】

米国特許第６，０９６，５１６号において開示および特許請求されるのは、心臓血管疾患の診断および処置の目的のための、ヒトＡｐｏＢ−１００に結合するマウス組換え抗体をコードするｃＤＮＡを含むベクターである（Ｋｗａｋら，２０００）。

【0018】

ＰＣＴ公開ＥＰ ９１１３４４において開示および特許請求されるのは、ＡｐｏＢ−４８に特異的に結合し、そしてＡｐｏＢ−１００特異的に結合せず、高脂血症および動脈硬化の診断および治療のために有用である、モノクローナル抗体である（ＵｃｈｉｄａおよびＫｕｒａｎｏ，１９９８）。

【0019】

ＰＣＴ公開ＷＯ ０１／３０３５４において開示および特許請求されるのは、治療有効量の化合物を患者に投与する工程を包含する、心臓血管障害を有する患者を処置する方法であり、ここで、この化合物は、アポリポタンパク質Ｂ分解経路を刺激することによって、アポリポタンパク質Ｂまたはアポリポタンパク質Ｂを含有するリポタンパク質の血漿濃度を低下させるように一定期間にわたって作用する（ＦｉｓｈｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ，２００１）。

【0020】

米国特許第５，２２０，００６号において開示および特許請求されるのは、アテローム発生アポリポタンパク質Ｂの抑制を媒介する、クローニングされたシス作用性ＤＮＡ配列である（Ｒｏｓｓら，１９９３）。

【0021】

ＰＣＴ公開ＷＯ ０１／１２７８９において開示および特許請求されるのは、ＡｐｏＢ−１００ ｍＲＮＡを６６７９位で特異的に切断するリボザイムである（Ｃｈａｎら，２００１）。

【0022】

今日までに、アポリポタンパク質Ｂの機能を阻害することを目的としたストラテジーは、Ｌｐ（ａ）アフェレーシス、抗体、抗体フラグメントおよびリボザイムに制限されている。

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0023】

しかし、Ｌｐ（ａ）アフェレーシスを除いて、これらの調査ストラテジーは、治療プロトコルとしては試験されていない。その結果、アポリポタンパク質Ｂの機能を有効に阻害し得るさらなる薬剤についての必要性が長期にわたって感じられたままである。

【0024】

アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を低減する有効な手段として出現しており、それゆえ、アポリポタンパク質Ｂの発現調節に関連する多数の治療適用、診断適用および研究適用において独特に有用であると証明され得る。

【課題を解決するための手段】

【0025】

本発明は、アポリポタンパク質Ｂの選択的アイソフォームであるＡｐｏＢ−４８の阻害を含め、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節するための、組成物および方法を提供する。

【0026】

（発明の要旨）
本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸を標的化して、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節する化合物（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に関する。本発明の化合物を含む、薬学的組成物および他の組成物もまた提供される。細胞または組織と、１以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物とを接触させる工程を包含する、この細胞中または組織中のアポリポタンパク質Ｂの発現を調節する方法がさらに提供される。治療有効量または予防有効量の１以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することによる、アポリポタンパク質Ｂの発現に関連する疾患もしくは状態を有する疑いがあるか、またはこのような疾患もしくは状態になる傾向がある疑いがある動物（特に、ヒト）を処置する方法がさらに提供される。したがって、本発明は以下を提供する。
（１）アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に対して標的化された、８〜５０核酸塩基長の化合物であって、該化合物は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、そして該アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の発現を阻害する、化合物。
（２）アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１に記載の化合物。
（３）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１または配列番号１２２を含む配列を有する、項目２に記載の化合物。
（４）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変されたヌクレオシド間結合を含む、項目２に記載の化合物。
（５）前記改変されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、項目４に記載の化合物。
（６）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変された糖部分を含む、項目２に記載の化合物。
（７）前記改変された糖部分が、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、項目６に記載の化合物。
（８）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変された核酸塩基を含む、項目２に記載の化合物。
（９）前記改変された核酸塩基が、５−メチルシトシンである、項目８に記載の化合物。
（１０）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、キメラオリゴヌクレオチドである、項目２に記載の化合物。
（１１）アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子上の少なくとも８核酸塩基の活性部位部分と特異的にハイブリダイズする、８〜５０核酸塩基長の化合物。
（１２）項目１に記載の化合物と、薬学的に受容可能なキャリアまたは薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、組成物。
（１３）コロイド分散系をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（１４）前記化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１２に記載の組成物。
（１５）細胞または組織においてアポリポタンパク質Ｂの発現を阻害する方法であって、該方法は、該細胞または組織を、アポリポタンパク質Ｂの発現が阻害されるように項目１に記載の化合物と接触させる工程を包含する、方法。
（１６）アポリポタンパク質Ｂに関連する疾患または状態を有する動物を処置する方法であって、該方法は、治療的有効量または予防的有効量の項目１に記載の化合物を、アポリポタンパク質Ｂの発現が阻害されるように該動物に投与する工程を包含する、方法。
（１７）前記状態が、異常な脂質代謝に関与する、項目１６に記載の方法。
（１８）前記状態が、異常なコレステロール代謝に関与する、項目１６に記載の方法。
（１９）前記状態が、アテローム性動脈硬化症である、項目１６に記載の方法。
（２０）アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子に標的化された項目１に記載の化合物であって、該化合物は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の長い形態であるＡｐｏＢ−１００に特異的にハイブリダイズし、そして該ＡｐｏＢ−１００の発現を阻害する、化合物。
（２１）前記状態が、異常な代謝状態である、項目１６に記載の方法。
（２２）前記異常な代謝状態が、高脂血症である、項目２１に記載の方法。
（２３）前記疾患が、糖尿病である、項目１６に記載の方法。
（２４）前記糖尿病が、２型糖尿病である、項目２３に記載の方法。
（２５）前記状態が、肥満である、項目１６に記載の方法。
（２６）前記状態が、アテローム性動脈硬化症である、項目１６に記載の方法。
（２７）前記疾患が、心血管疾患である、項目１６に記載の方法。
（２８）動物においてグルコースレベルを調節する方法であって、該方法は、項目１に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、方法。
（２９）前記動物が、ヒトである、項目２８に記載の方法。
（３０）前記グルコースレベルが、血漿中グルコースレベルである、項目２８に記載の方法。
（３１）前記グルコースレベルが、血清中グルコースレベルである、項目２
８に記載の方法。
（３２）前記動物が、糖尿病に罹患している動物である、項目２８に記載の方法。
（３３）
動物においてアポリポタンパク質Ｂに関連する疾患または状態の発症を予防または遅延する方法であって、該方法は、治療有効量または予防有効量の項目１に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、方法。
（３４）前記動物が、ヒトである、項目３３に記載の方法。
（３５）前記状態が、異常な代謝状態である、項目３３に記載の方法。
（３６）前記異常な代謝状態が、高脂血症である、項目３５に記載の方法。
（３７）前記疾患が、糖尿病である、項目３３に記載の方法。
（３８）前記糖尿病が、２型糖尿病である、項目３７に記載の方法。
（３９）前記状態が、肥満である、項目３３に記載の方法。
（４０）前記状態が、アテローム性動脈硬化症である、項目３３に記載の方法。
（４１）前記状態が、異常な脂質代謝に関与する、項目３３に記載の方法。
（４２）前記状態が、異常なコレステロール代謝に関与する、項目３３に記載の方法。
（４３）動物におけるグルコースレベルの増加の発生を予防または遅延する方法であって、該方法は、治療有効量または予防有効量の項目１に記載の化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（４４）前記動物が、ヒトである、項目４３に記載の方法。
（４５）前記グルコースレベルが、血清中グルコースレベルである、項目４３に記載の方法。
（４６）前記グルコースレベルが、血漿中グルコースレベルである、項目４３に記載の方法。
（４７）動物において血清中コレステロールレベルを調節する方法であって、該方法は、治療有効量または予防有効量の項目１に記載の化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（４８）前記動物が、ヒトである、項目４７に記載の方法。
（４９）動物においてリポタンパク質レベルを調節する方法であって、該方法は、治療有効量または予防有効量の項目１に記載の化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（５０）前記動物が、ヒトである、項目４９に記載の方法。
（５１）前記リポタンパク質が、ＶＬＤＬである、項目４９に記載の方法。
（５２）前記リポタンパク質が、ＨＤＬである、項目４９に記載の方法。
（５３）前記リポタンパク質が、ＬＤＬである、項目４９に記載の方法。
（５４）動物において血清中トリグリセリドレベルを調節する方法であって、該方法は、治療有効
量または予防有効量の項目１に記載の化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（５５）前記動物が、ヒトである、項目５４に記載の方法。
（５６）項目１に記載の化合物であって、該化合物は、アポリポタンパク質Ｂの選択的スプライシングされた形態をコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、そして該核酸分子の発現を阻害する、化合物。

【0027】

（発明の詳細な説明）
本発明は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子の機能を調節する際に、最終的には、産生されるアポリポタンパク質Ｂの量を調節するために、オリゴマー化合物（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いる。これは、アポリポタンパク質Ｂをコードする１以上の核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによって達成される。本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸」および「アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸」は、アポリポタンパク質ＢをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを包含する）、およびこのようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡもまた包含する。オリゴマー化合物の、その標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、その核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節は、一般に、「アンチセンス」といわれる。妨害されるべきＤＮＡの機能としては、複製および転写が挙げられる。妨害されるべきＲＮＡの機能としては、生命維持に必要な全ての機能（例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡスプライシング、およびＲＮＡに関与し得るかまたはＲＮＡによって促進され得る触媒活性など）が挙げられる。標的核酸機能のこのような妨
害の全体的効果は、アポリポタンパク質Ｂの発現調節である。本発明に関連しては、「調節」とは、遺伝子発現の増大（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明に関連しては、阻害は、遺伝子発現の好ましい調節形態であり、そしてｍＲＮＡが好ましい標的である。

【0028】

アンチセンスに関して特定の核酸を標的とすることが好ましい。アンチセンス化合物を特定の核酸に対して「標的化」することは、本発明に関連しては、複数工程のプロセスである。このプロセスは通常、その機能が調節されるべき核酸配列の同定に始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害状態もしくは疾患状態と関連している細胞性遺伝子（またはこの遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）または感染性因子由来の核酸分子であり得る。本発明では、この標的は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸分子である。この標的化プロセスはまた、所望の効果（例えば、このタンパク質の検出またはこのタンパク質の発現の調節）をもたらすように、この遺伝子内での、アンチセンス相互作用が生じる部位の決定を包含する。本発明に関連しては、好ましい遺伝子内部位は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは翻訳終結コドンを包含する領域である。当該分野で公知であるように、翻訳開始コドンは代表的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」ともいわれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧがインビボで機能することが示されている。従って、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、各例における開始アミノ酸は代表的には、メチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）とはいえ、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物遺伝子および原核生物遺伝子が、２以上の代替的開始コドンを有し得、これらのうちの任意のものが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定のセットの条件下で、翻訳開始に関して優先的に利用され得ることもまた当該分野で公知である。本発明に関しては、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、このようなコドンの配列にかかわらず、アポリポタンパク質Ｂをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにインビボで用いられるコドンをいう。

【0029】

遺伝子の翻訳終結コドン（または「停止コドン」）が、３つの配列（すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）のうちの１つを有し得ることもまた、当該分野で公知である。用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」とは、このようなｍＲＮＡまたは遺伝子のうちの、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）にある約２５〜約５０連続したヌクレオチドを含む部分をいう。同様に、用語「停止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」とは、このようなｍＲＮＡまたは遺伝子のうちの、翻訳終結コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）にある約２５〜約５０連続したヌクレオチドを含む部分をいう。

【0030】

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域をいうことが当該分野で公知であり、効果的に標的化され得る領域でもある。他の標的領域としては、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（これは、ｍＲＮＡのうちの翻訳開始コドンから５’方向にある部分をいうことが当該分野で公知であり、従って、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを包含する）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（これは、ｍＲＮＡのうちの翻訳終結コドンから３’方向にある部分をいうことが当該分野で公知であり、従って、ｍＲＮＡの翻訳終結コドンと３’末端との間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを包含する）が挙げられる。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結されたＮ７−メチル
化グアノシン残基を包含する。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体ならびにキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを包含すると考えられる。５’キャップ領域はまた、好ましい標的領域であり得る。

【0031】

いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写産物は、直接的に翻訳されるが、多くのものは、転写産物から翻訳前に切り出される、「イントロン」として公知の１以上の領域を含む。残りの（それゆえ翻訳された）領域は、「エキソン」として公知であり、そして一緒にスプライシングされて、連続したｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、すなわち、イントロン−エキソン連結部はまた、好ましい標的領域であり得、そして異常なスプライシングが疾患に関与する状況または特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰発現が疾患に関与する状況で特に有用である。再編成または欠失に起因した異常な融合連結部もまた、好ましい標的である。イントロンもまた、例えば、ＤＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡに対して標的化されるアンチセンス化合物についての効果的な（それゆえ、好ましい）標的領域であり得ることが見出されている。

【0032】

一旦、１以上の標的部位が同定されたら、その標的に対して充分に相補的である、すなわち、充分によく、そして充分な特異性を有してハイブリダイズし、所望の効果を与えるオリゴヌクレオチドが選択される。

【0033】

本発明に関しては、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシド塩基間または相補的ヌクレオチド塩基間での水素結合（これは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であり得る）を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対合する、相補的核酸塩基である。「相補的」とは、本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチド間で正確に対合する能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の同じ位置でヌクレオチドと水素結合し得る場合、このオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡとは、その位置で互いに相補的であると考えられる。このオリゴヌクレオチドとこのＤＮＡまたはＲＮＡとは、各分子における充分な数の対応する位置が、互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占められている場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズし得る」および「相補的」は、安定かつ特異的な結合がこのオリゴヌクレオチドとこのＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的との間で生じるような充分な程度の相補性または正確な対合を示すために用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないことが当該分野で理解される。アンチセンス化合物は、この標的ＤＮＡ分子または標的ＲＮＡ分子に対するこの化合物の結合が、この標的ＤＮＡまたはこのＲＮＡの正常な機能を妨害して有用性の喪失を引き起こし、そして特異的結合が所望される条件下で（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合は生理学的条件下で、そしてインビトロアッセイの場合はアッセイが実施される条件下で）非標的配列に対するこのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するに充分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズし得る。

【0034】

標的にハイブリダイズしてその標的の発現を阻害する、本発明のアンチセンスおよび他の化合物は、実験によって同定され、そしてこれらの化合物の配列は、本明細書中以下で、本発明の好ましい実施形態として同定される。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書中以下で、「活性部位」といわれ、それゆえ、標的化のために好ましい部位である。それゆえ、本発明の別の実施形態は、これらの活性部位にハイブリダイズする化合物を包含する。

【0035】

アンチセンス化合物は通常、研究試薬および診断剤として用いられる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（これは、遺伝子発現を鋭敏な特異性で阻害し得る）はしばし
ば、特定の遺伝子の機能を解明するために当業者によって用いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の種々のメンバーの機能を識別するために用いられる。それゆえ、アンチセンス調節は、研究用途のために利用されている。

【0036】

キットおよび診断における使用に関して、本発明のアンチセンス化合物は、単独で、または他のアンチセンス化合物もしくは治療剤との組合せのいずれかで、細胞内および組織内で発現される遺伝子の構成要素の一部または全体の発現パターンを解明するために、示差的分析および／またはコンビナトリアル分析においてツールとして用いられ得る。

【0037】

１以上のアンチセンス化合物で処理された細胞内または組織内での発現パターンは、アンチセンス化合物で処理されていない、コントロールの細胞または組織と比較され、そして生じたパターンは、例えば、調べられる遺伝子の、疾患との関連、シグナル伝達経路、細胞局在、発現レベル、サイズ、構造または機能に関連するので、示差的レベルの遺伝子発現について分析される。これらの分析は、刺激された細胞または刺激されていない細胞において、そして発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在下または非存在下で実施され得る。

【0038】

当該分野で公知の遺伝子発現分析方法の例としては、以下が挙げられる：ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（ＢｒａｚｍａおよびＶｉｌｏ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，１７−２４；Ｃｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（Ｍａｄｄｅｎら，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化したｃＤＮＡの制限酵素増幅）（ＰｒａｓｈａｒおよびＷｅｉｓｓｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３０３，２５８−７２）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１９７６−８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００−１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）の配列決定（Ｃｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，８０，１４３−５７）、差引きＲＮＡフィンガープリント（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８６，９１−９８；Ｌａｒｓｏｎら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００，４１，２０３−２０８）、差引きクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（ＪｕｒｅｃｉｃおよびＢｅｌｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３１６−２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６−９６）、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）技術（ＧｏｉｎｇおよびＧｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５−９０４）および質量分析法（Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，２０００，３，２３５−４１において概説される）。

【0039】

アンチセンスの特異性および感度はまた、治療的用途に関して、当業者によって利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの疾患状態の処置において治療部分として用いられている。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬物（リボザイムを含む）は、ヒトに対して安全かつ有効に投与されており、そして多数の臨床試験が現在行われている。従って、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織および動物（特に、ヒト）の処置に関する処置レジメにおいて有用であるように構成され得る有用な治療様式であり得ることが確立されている。

【0040】

本発明に関しては、用語「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーをいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する、天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。このような改変または置換されたオリゴヌクレオチドはしばしば、ネイティブな形態よりも好ましい。なぜなら、所望の特性（例えば、増強された細胞取り込み、増強された核酸標的親和性およびヌクレアーゼの存在下での増大した安定性など）があるからである。

【0041】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましい形態のアンチセンス化合物であるが、本発明は、以下で記載されるようなオリゴヌクレオチド模倣物を包含するがこれらに限定されない、他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合物は好ましくは、約８〜約５０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約５０個連結されたヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、約１２〜約３０個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物としては、標的核酸にハイブリダイズしてその発現を調節する、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム（ｏｌｉｇｏｚｙｍｅ）、および他の短い触媒性ＲＮＡまたは触媒性オリゴヌクレオチドが挙げられる。

【0042】

当該分野で公知のように、ヌクレオシドは、塩基と糖との組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。２つの最も一般的なクラスのこのような複素環式塩基は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関して、リン酸基は、糖の２’ヒドロキシル部分、３’ヒドロキシル部分または５’ヒドロキシル部分のいずれかへと連結され得る。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基は、隣のヌクレオシドを別のヌクレオシドへと共有結合的に連結して、直鎖状のポリマー化合物を形成する。次いで、この直鎖状ポリマー構造体のそれぞれの末端は、さらに連結されて、環状構造体を形成し得る。しかし、開いた直鎖状構造体が一般的に好ましい。このオリゴヌクレオチド構造においては、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合または骨格は、３’−５’ホスホジエステル結合である。

【0043】

本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例としては、改変された骨格または天然に存在しないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書中で定義する場合、改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、リン原子をその骨格中に保持するオリゴヌクレオチドおよびリン原子をその骨格中に有さないオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書の目的に関して、そしてときどき当該分野で参照されるように、リン原子をそれらのヌクレオシド間骨格に有さない、改変されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。

【0044】

好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、正常な３’−５’結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’−アミノホスホロアミデートおよび３’−アミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートならびにボラノホスフェート；これらの２’−５’連結アナログ；ならびに１以上のヌクレオチド間結合が、３’−３’結合、５’−５’結合または２’−２’結合である、逆の極性を有するオリゴヌクレオチド骨格が挙げられる。逆の極性を有
する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合での単一の３’−３’結合を含む、すなわち、無塩基性（核酸塩基が失われているかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）であり得る単一の逆ヌクレオシド残基を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸の形態もまた含まれる。

【0045】

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号および同第５，６２５，０５０号。これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれらのうちの各々は、本明細書中に参考として援用される。

【0046】

リン原子を含まない、好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルヌクレオシド間結合もしくは短鎖シクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子およびアルキルヌクレオシド間結合もしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以上の短鎖へテロ原子ヌクレオシド間結合もしくは短鎖複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、以下が挙げられる：モルホリノ結合を有する骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合したＮ構成要素部分、Ｏ構成要素部分、Ｓ構成要素部分およびＣＨ_２構成要素部分を有する他の骨格。

【0047】

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的米国特許としては、以下の米国特許が挙げられるがこれらに限定されない：第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号。これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれらの各々は、本明細書中に参考として援用される。

【0048】

他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方（すなわち、骨格）が、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物（優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）といわれる。ＰＮＡ化合物では、オ
リゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。この核酸塩基は、維持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；米国特許第５，７１４，３３１号；および米国特許第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７〜１５００に見出され得る。

【0049】

本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格（特に上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ならびに−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［ここでネイティブホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−と表される］、ならびに上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格）を有するオリゴヌクレオシドである。上記で参照した米国特許第５，０３４，５６０号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。

【0050】

改変されたオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうち１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルもしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換の、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニルおよびＣ_２〜Ｃ_１０アルキニルであり得る）。特に好ましくは、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２であり、ここでｎおよびｍは、１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ_１〜Ｃ_１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、置換された低級アルケニル、置換された低級アルキニル、置換された低級アルカリール、置換された低級アラルキル、置換された低級Ｏ−アルカリールもしくは置換された低級Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基。好ましい改変としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知の２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）（Ｍａｒｔｉｎら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）（すなわち、アルコキシアルコキシ基）が挙げられる。さらに好ましい改変としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、本明細書後述でも記載したような、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知の、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野で、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）（すなわち、本明細書後述の実施例にも記載される、２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２）が挙げられる。

【0051】

さらに好ましい改変としては、ロックされた核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡ）が挙げられ、ここで２’−ヒドロキシル基は、糖環の３’または４’の炭素原子と連結しており、それにより二環式糖部分が形成されている。この結合は、好ましくは、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ_２−）_ｎ基であ
り、ここでｎは、１または２である。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６に記載される。

【0052】

他の好ましい改変としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２’−アリル（２’−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。２’−改変は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位においてであり得る。好ましい２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。同様の改変もまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置（特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位）でなされ得る。オリゴヌクレオチドはまた、糖模倣物（例えば、ペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部分）を有し得る。このような改変された糖構造体の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７９２，７４７号；および同第５，７００，９２０号。これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれらのうちの各々は、その全文が、本明細書中に参考として援用される。

【0053】

オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（しばしば、当該分野において単に「塩基」といわれる）の改変または置換を含み得る。本明細書中で用いられる場合、「非改変」または「天然」の核酸塩基は、プリン塩基である、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基である、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を包含する。改変核酸塩基としては、例えば、以下の他の合成核酸塩基および天然核酸塩基が挙げられる：５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３）ウラシルおよび５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３））シトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−ハログアニン、８−アミノアデニン、８−アミノグアニン、８−チオールアデニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルアデニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−ヒドロキシルグアニン、ならびに他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロ（特に、５−ブロモ）ウラシル、５−ハロ（特に、５−ブロモ）シトシン、５−トリフルオロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン。さらなる改変核酸塩基としては、三環式ピリミジン（例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ（例えば、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン））、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］イン
ドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。改変核酸塩基はまた、プリン塩基またはピリミジン塩基が、他の複素環に置き換えられている核酸塩基（例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドン）を包含し得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示される核酸塩基、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示される核酸塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，国際版，１９９１，３０，６１３により開示される核酸塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，第１５章，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９−３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３により開示される核酸塩基が挙げられる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増強するために特に有用である。これらとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリンおよびＯ−６置換プリンが挙げられ、これには２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，２７６−２７８頁）、そしてこれらは現在好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と合わせた場合、なおさら特に好ましい。

【0054】

上記の改変核酸塩基ならびに他の改変核酸塩基の特定のものの調製を教示する代表的な米国特許としては、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに以下の米国特許が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６４５，９８５号；同第５，８３０，６５３号；同第５，７６３，５８８号；同第６，００５，０９６号；および同第５，６８１，９４１号（これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれらのうちの各々は、本明細書中に参考として援用される）、ならびに米国特許第５，７５０，６９２号（これは、本願と共有に係っており、そしてまた本明細書中に参考として援用される）。

【0055】

本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する１つ以上の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに対して化学的に連結することを含む。本発明の化合物は、官能基（例えば、一級ヒドロキシル基または二級ヒドロキシル基）と共有結合した結合基を包含し得る。本発明の結合基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基が挙げられる。代表的な結合基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が挙げられる。本発明に関連して、薬力学的特性を増強する基としては、オリゴマー取込みを改善する基、分解に対するオリゴマーの耐性を増強する基、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。本発明に関連して、薬物動態学的性質を増強する基
としては、オリゴマーの取込み、分布、代謝または排出を改善する基が挙げられる。代表的な結合基は、１９９２年１０月２３日に出願され、その開示の全体が参考として本明細書中に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６において開示される。結合部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：脂質部分（例えば、コレステロール部分）（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性薬物物質（例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤または抗生物質）に対して結合体化され得る。オリゴヌクレオチド−薬物結合体およびそれらの調製は、その全体が参考として本明細書中に援用される、米国特許出願第０９／３３４，１３０号（１９９９年６月１５日に出願）に記載される。

【0056】

そのようなオリゴヌクレオチド結合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号，同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５
，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号，同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号，同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号。これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれらのうちの各々は、本明細書中に参考として援用される。

【0057】

所定の化合物内の全ての位置に対して、一様に改変する必要はなく、実際、単一の化合物において、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいてすら、１を超える上述の改変が組み込まれ得る。本発明はまた、キメラの化合物であるアンチセンス化合物を包含する。本発明に関連して、「キメラの」アンチセンス化合物または「キメラ」は、２以上の化学的に異なる領域を含み、これらの領域の各々が、少なくとも１つのモノマー単位（すならち、オリゴヌクレオチド化合物の場合、ヌクレオチド）で構成される、アンチセンス化合物（特に、オリゴヌクレオチド）である。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的に、ヌクレアーゼ分解に対する増強した耐性、増大した細胞取込み、そして／または標的核酸に対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに対して与えるようにオリゴヌクレオチドが改変されている、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断し得る酵素に対する基質として役立ち得る。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。それゆえ、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を大いに高める。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドを用いて、匹敵する結果がしばしば得られ得る。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要に応じて、当該分野で公知である関連した核酸ハイブリダイゼーション技術により慣用的に検出され得る。

【0058】

本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記のような２つ以上のオリゴヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造体とし形成され得る。このような化合物はまた、当該分野において、ハイブリッドまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）といわれている。このようなハイブリッド構造体の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７００，９２２号。これらのうちの特定のものは、本願と共有に係っており、そしてこれらのうちの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

【0059】

本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を通して、好都合にかつ慣用的に作製され得る。そのような合成のための装置は、いくつかの販売者（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が挙げられる）によって販売される。当該分野において公知のそのような合成のための任意の他の手段が、追加的にまたは代替的に用いられ得る。オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体）の調製のために同様の技術を使用することは周知である。

【0060】

本発明のアンチセンス化合物は、インビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物もアンチセンス分子のインビボでの合成を指示するように設計した遺伝的ベクター構築物も含まない。

【0061】

本発明の化合物はまた、取込み、分布および／または吸収の補助のために、他の分子、分子構造体、または化合物の混合物と（例えば、リポソーム、レセプター標的化分子、経口処方物、直腸処方物、局所的処方物または他の処方物として）混合され得るか、カプセル化され得るか、結合体化され得るか、さもなければ、会合され得る。そのような取込み、分布および／または吸収を補助する処方物の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第５，１０８，９２１号；同第５，３５４，８４４号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，５２１，２９１号；同第５，５４３，１５８号；同第５，５４７，９３２号；同第５，５８３，０２０号；同第５，５９１，７２１号；同第４，４２６，３３０号；同第４，５３４，８９９号；同第５，０１３，５５６号；同第５，１０８，９２１号；同第５，２１３，８０４号；同第５，２２７，１７０号；同第５，２６４，２２１号；同第５，３５６，６３３号；同第５，３９５，６１９号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４１７，９７８号；同第５，４６２，８５４号；同第５，４６９，８５４号；同第５，５１２，２９５号；同第５，５２７，５２８号；同第５，５３４，２５９号；同第５，５４３，１５２号；同第５，５５６，９４８号；同第５，５８０，５７５号；および同第５，５９５，７５６号。これらは各々、本明細書中に参考として援用される。

【0062】

本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に受容可能な塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物へと投与されたら、生物学的に活性な代謝産物またはその残基を（直接的または間接的に）供給し得る、任意の他の化合物を含む。従って、例えば、この開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩、そのようなプロドラッグの薬学的に受容可能な塩、ならびに他の生体等価物に関する。

【0063】

用語「プロドラッグ」は、内在性酵素もしくは他の化学物質および／または状態の作用によって、体内もしくはその細胞内で活性形態（すなわち、薬物）に転換される、不活性形態で調製される治療薬剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドッグ版は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらに対するＷＯ ９３／２４５１０（１９９３年１２月９日公開）またはＩｍｂａｃｈらに対するＷＯ ９４／２６７６４および米国特許第５，７７０，７１３号に開示される方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。

【0064】

用語「薬学的に受容可能な塩」とは、本発明の化合物の、生理学的および薬学的に受容可能な塩（すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、その上さらに所望しない毒物学的影響を与えない塩）をいう。

【0065】

薬学的に受容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン（例えば、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミン）を用いて形成される。カチオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９を参照のこと）。上記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態と十分量の所望の塩基とを接触させて従来の様式でその塩を生成することにより、調製される。この遊離酸形態は、塩形態と酸とを接触させ、そして従来の様式で遊離酸を単離することによって、再生され得る。この遊離酸
形態は、極性溶媒中での溶解度のような特定の物理的特性がいくらかそれらの各々の塩形態とは異なるが、他の点ではこれらの塩は、本発明の目的のためにはそれらの各々の遊離酸と等価である。本明細書中に使用される場合、「薬学的付加塩」は、本発明の組成物の成分の一つの酸形態の薬学的に受容可能な塩を包含する。これらとしては、アミンの有機酸塩または無機酸塩が挙げられる。好ましい酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に受容可能な塩は、当業者に周知であり、そして以下を包含する：種々の無機酸および有機酸の塩基性塩（例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸）との塩基性塩；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸もしくはホスホ酸、またはＮ−置換スルファミン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エムボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸）との塩基性塩；およびアミノ酸（例えば、天然におけるタンパク質合成に関与する２０種のαアミノ酸（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸））との塩基性塩、ならびにまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−ホスホグリセレートもしくは３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）との塩基性塩、または他の酸性有機化合物（例えば、アスコルビン酸）との塩基性塩）。化合物の薬学的に受容可能な塩はまた、薬学的に受容可能なカチオンを用いて調製され得る。適切な薬学的に受容可能なカチオンは、当業者に周知であり、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類金属カチオン、アンモニウムカチオンおよび四級アンモニウムカチオンを包含する。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。

【0066】

オリゴヌクレオチドに関して、薬学的に受容可能な塩の好ましい例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン（例えば、スペルミンおよびスペルミジン）などのようなカチオンで形成される塩；（ｂ）例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などのような無機酸で形成される酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸で形成される塩；ならびに（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素のような元素のアニオンから形成される塩。

【0067】

本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防のために、ならびに研究試薬およびキットとして利用され得る。治療について、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節することによって処置され得る疾患または障害を有することが疑われる動物（好ましくは、ヒト）が、本発明によるアンチセンス化合物を投与することによって処置される。本発明の化合物は、適切な、薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアに有効量のアンチセンス化合物を添加することによって、薬学的組成物において利用され得る。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用もまた、例えば、感染、炎症または腫瘍形成を予防または遅延させるために、予防的に有用であり得る。

【0068】

本発明のアンチセンス化合物は、研究および診断に有用である。なぜなら、これらの化合物は、アポリポタンパク質Ｂをコードする核酸にハイブリダイズし、サンドウィッチアッセイおよびその他のアッセイが、この事実を活用するように容易に構築されることを可能にするからである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、アポリポタンパク質
Ｂをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の手段によって検出され得る。このような手段としては、オリゴヌクレオチドへの酵素の結合体化、オリゴヌクレオチドの放射性標識化または任意の他の適切な検出手段が挙げられ得る。サンプル中のアポリポタンパク質Ｂのレベルを検出するための、このような検出手段を使用するキットがまた、調製され得る。

【0069】

本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含有する薬学的組成物および薬学的処方物を含む。本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置のいずれが望まれているか、および処置される領域に依存して、多くの経路で投与され得る。投与は、局部（眼への投与、ならびに膣送達および直腸送達を含む粘膜への投与を含む）、肺（例えば、パウダーまたはエアロゾルの吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または吸入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）（噴霧器によるものを含む）；気管支内、鼻腔内、上皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射または注入；あるいは頭蓋内（例えば、くも膜下腔内投与または脳室内投与）が挙げられる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル改変を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられている。

【0070】

局所投与のための薬学的組成物および薬学的処方物としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体およびパウダーが挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水性のベース、パウダーベースまたは油ベース、増粘剤などもまた必要であるか、または望まれ得る。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。好ましい局所処方物としては、本発明のオリゴヌクレオチドが、局所送達剤（例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤）とともに混合物中にある局所処方物が挙げられる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、ネガティブ（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロリルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内にカプセル化され得るか、またはリポソーム（特に、カチオン性リポソーム）に複合体を形成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、脂質（特に、カチオン性脂質）に複合体化され得る。好ましい脂肪酸および脂肪酸エステルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ_１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステート ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドあるいは薬学的に受容可能なそれらの塩。局所処方物は、米国特許出願０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日に出願され、全体が本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。

【0071】

経口投与のための組成物および処方物としては、パウダーまたは顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤またはミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）が挙げられる。増粘剤、香料添加剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤は、望ましくあり得る。好ましい経口処方物は、本発明のオリゴヌクレオチドが、１つ以上の浸透増強剤、界面活性剤およびキレート剤と併用して投与される経口処方物である。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好ましい胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸
、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ
ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好ましい脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、ジグリセリドあるいは薬学的に受容可能なそれらの塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。浸透増強剤の組合せ（例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩）もまた好ましい。特に好ましい組合せは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレーされる乾燥粒子を含む顆粒形態またはミクロ粒子またはナノ粒子を形成するように複合体化された顆粒形態で、経口で送達され得る。オリゴヌクレオチド複合体化剤としては、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅｓ）、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。特に好ましい複合体化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギナート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドのための経口処方物およびそれらの調製は、米国特許出願０８／８８６，８２９（１９９７年７月１日出願）、０９／１０８，６７３（１９９８年７月１日出願）、０９／２５６，５１５（１９９９年２月２３日出願）、０９／０８２，６２４（１９９８年５月２１日出願）および０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日出願）（各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。

【0072】

非経口投与、くも膜下腔内投与または脳室内投与のための組成物および処方物としては、滅菌水溶液（これはまた、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加物（例えば、浸透増強剤、キャリア化合物および他の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤が挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る）が挙げられ得る。

【0073】

本発明の薬学的組成物としては、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有処方物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物は、種々の成分（前もって成形された（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ）液体、自己乳化固体および自己乳化半固体が挙げられるが、これらに限定されない）から作製され得る。

【0074】

本発明の薬学的処方物（単位投薬形態で便利に与えられ得る）は、製薬業界で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術としては、活性成分を薬学的キャリアまたは賦形剤と結合させる工程が挙げられる。一般的に、この処方物は、活性成分を液体キャリアまたは細かく分割された固体キャリアまたは両方と均一かつ密接に結合させることおよび次いで、必要に応じて、この製品を成形することによって調製される。

【0075】

本発明の組成物は、多くの可能な投薬形態（例えば、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟性ゲル、坐薬および浣腸が挙げられるがこれらに限定されない）のいずれかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁液として処方され得る。水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増やす物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む）をさらに含み得る。この懸濁液はまた、安定剤を含み得る。

【0076】

本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物は、泡として処方され、そして使用され得る。薬学的泡としては、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームのような処方物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの処方物は、性質において基本的に類似しているが、最終産物の成分および濃度において異なる。このような組成物および処方物の調製は、薬学および処方の分野における、当業者に一般的に公知であり、そして本発明の組成物の処方に適用され得る。

【0077】

（エマルジョン）
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および処方され得る。エマルジョンは、代表的には、通常直径０．１μｍを越える液滴の形態で別の液体中に分散される、ある液体の不均一系である。（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、２４５頁；Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２巻、３３５頁；Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５，３０１頁）。エマルジョンは、しばしば、互いで完全に混合および分散された２つの不混和性の液体相で構成される二相系である。一般的に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）種のいずれかであり得る。水相が、大量の油相に細かく分割され、そして微細な液滴として分散される場合、生じた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相が、大量の水相に細かく分割され、そして微細な液滴として分散される場合、生じた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散された相および活性薬物（これは、水相、油相中で、またはそれ自体が別の相としてのいずれかで、溶液として存在し得る）に加えて、さらなる成分を含み得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤のような薬学的賦形剤もまた、必要に応じて、エマルジョン中に存在し得る。薬学的エマルジョンはまた、（例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）エマルジョンおよび例えば、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のような）２つより多くの相で構成される複合エマルジョンであり得る。このような複雑な処方物は、しばしば単純な２成分のエマルジョンが成さない特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が、小さい水滴を囲む複合エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油の連続中に安定化された水の小球中に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。

【0078】

エマルジョンは、熱力学的安定性がほとんどまたは全くないことによって特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散された相または不連続相は、外側の相または連続相にうまく分散され、そして乳化剤の手段または処方物の粘性により、この形態で維持される。エマルジョン型の軟膏基剤およびクリームの場合、エマルジョンの相のいずれかは、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいず
れかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、４つのカテゴリーに広く分類され得る：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸着基剤、および細かく分散された固体（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁）。

【0079】

合成の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）としても知られる）は、エマルジョンの処方物における広い適用性を有が見出されており、そして文献中で概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、２８５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，１巻、１９９頁）。界面活性剤は、代表的には両親媒性であり、親水性の部分および疎水性の部分を含む。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の性質の割合は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、処方物の調製において、界面活性剤を分類および選択する際の価値のある道具である。界面活性剤は、親水基の性質：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両親媒性に基づいて異なるクラスに分類され得る（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、２８５頁）。

【0080】

乳化処方物において使用される天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンあよびアカシアが挙げられる。吸着基剤は、吸着基剤が水を吸い上げて、無水ラノリンおよび親水性ワセリンのような、吸着基剤の半固体の粘度をなお維持するｗ／ｏエマルジョンを形成し得るように、親水性の性質を有する。細かく分割された固体はまた、特に界面活性剤との併用において、および粘稠性の調製物における良い乳化剤として使用されている。これらとしては、極性の無機固体（例えば、重金属水酸化物、非膨張性の粘土（例えば、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状のケイ酸アルミニウムおよびコロイド状のケイ酸マグネシウムアルミニウム）、顔料および非極性固体（例えば、カーボンまたはグリセリルトリステアレート）が挙げられる。

【0081】

多種の非乳化物質もまた、エマルジョン処方物中に含まれ、エマルジョンの性質に寄与する。これらとしては、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、３３５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁）。

【0082】

親水性コロイドまたはヒドロコロイドとしては、天然に存在するゴムおよび合成ポリマー（例えば、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアールゴム、カラヤゴム、およびトラガカント））、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、ならびに合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは、水中で分散または膨潤し、コロイド状溶液を形成し、これは分散相の液滴の周りに強
い界面フィルムを形成することおよび外部の相の粘性を増すことによってエマルジョンを安定化する。

【0083】

エマルジョンは、しばしば微生物の増殖を容易に支え得る多くの成分（例えば、炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチド）を含むので、これらの処方物は、しばしば保存剤を取り入れる。エマルジョン処方物中に含まれる一般的に使用される保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤がまた、処方物の変質を抑制するためにエマルジョン処方物に一般的に添加される。使用される抗酸化剤はフリーラジカルスカベンジャー（例えば、トコフェロール、アルキルギャレット、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤（例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム）、および抗酸化共力剤（例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチン））であり得る。

【0084】

皮膚科学的経路、経口経路および非経口経路を介したエマルジョン処方物の適用およびそれらの製造方法は、文献に概説されている（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁）。経口送達のためのエマルジョン処方物は、処方の容易さ、吸収の有効性およびバイオアベイラビリティーの見地の理由で、非常に広く使用されている。（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻，２４５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻，１９９頁）。ｏ／ｗエマルジョンとして一般的に経口で投与されている物質中には、鉱油ベースの下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物がある。

【0085】

本発明の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよび核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして処方される。マイクロエマルジョンは、単一で光学的に等方性であり、熱力学的に安定な液体溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義され得る（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，２４５頁）。代表的には、マイクロエマルジョンは、界面活性剤水溶液中の油をまず分散し、次いで十分量の第４の成分（一般的には中間の鎖長のアルコール）を透明な系を形成するように添加することによって調製される系である。従って、マイクロエマルジョンは、熱力学的に安定で等方的に透明な、２つの混合できない液体の分散物としてもまた記載され、これらの液体は、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される（ＬｅｕｎｇおよびＳｈａｈ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．編，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１８５頁−２１５頁）。マイクロエマルジョンは、３〜５の成分の組み合わせによって一般に調製され、これらの成分としては、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤および電解質が挙げられる。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型であるかまたは水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の特徴ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．，１９８５，２７１頁）。

【0086】

状態図を使用した現象論的アプローチは、広範に研究されており、そして当業者に、どのようにマイクロエマルジョンを処方するかという包括的な知見を与えてきた（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，２４５頁；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，３３５頁）。従来のエマルジョンと比較すると、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される、熱力学的に安定な小滴の処方物中に、水不溶性薬物を溶解するという利点を提供する。

【0087】

マイクロエマルジョンの調製物において使用される界面活性剤としては、単独でまたは補助界面活性剤との組み合わせての、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、脂肪酸ポリグリセロールエステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセスキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられるがこれらに限定されない。補助界面活性剤（通常、短鎖アルコール（例えば、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール））は、界面活性剤分子間に生成された間隙空間に起因して、界面活性剤フィルムに浸透し、それ故に無秩序なフィルムを作製することによって界面の流動性を増加するように作用する。しかし、マイクロエマルジョンは、補助界面活性剤を使用せずに調製され得、無アルコールの自己乳化マイクロエマルジョン系は、当該分野で公知である。水相は、代表的に、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相は、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ポリオキシエチレン化脂肪酸グリセリルエステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーンオイルのような材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0088】

マイクロエマルジョンは、薬物可溶化および薬物の増大された吸収の観点から特に重要である。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む、薬物の経口バイオアベイラビリティーを増大するために提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ、Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９３、１３、２０５）。マイクロエマルジョンは、改善された格物可溶性、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動性および透過性における界面活性剤で誘導された改変に起因する薬物吸収の可能な増大、調製の容易、固形投与量形態よりも経口投与が容易、改善された臨床的効目、および低減された毒性（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５；Ｈｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９６、８５、１３８−１４３）の利点を与える。しばしば、マイクロエマルジョンは、それらの成分が周囲温度で一緒にされるとき、自然に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを処方するとき特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、化粧品および薬学的適用の両方において活性成分の経皮送達に有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および処方物は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の増大し
た全身吸収を容易にし、および胃腸管、膣、頬側口腔および投与のその他の領域内のオリゴヌクレオチドおよび核酸の局所細胞摂取を改善する。

【0089】

本発明のマイクロエマルジョンはまた、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラゾールおよび浸透促進剤のような添加成分および添加剤を含み得、処方物の性質を改善し、そして本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を増大する。本発明のマイクロエマルジョンで用いられる浸透促進剤は、５つの広範なカテゴリー−界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ
Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）の１つに属するとして分類され得る。これら分類の各々は上述されている。

【0090】

（リポソーム）
マイクロエマルジョンの他に、薬物の処方物のために研究され、かつ用いられている、多くの組織化された界面活性剤構造がある。これらは、単層、ミセル、二重層およびビヒクルを含む。リポソームのようなビヒクルは、薬物送達の観点からそれらが提供する、それらの特異性および持続期間のため、大きな興味を引き付ける。本発明で用いられるとき、用語「リポソーム」は、球状二重層または二重層中に配列された両親媒性脂質で構成されるビヒクルを意味する。

【0091】

リポソームは、親油性材料および水性の内側から形成された膜を有する、単層または多層のヒビクルである。水性部分は、送達されるべき組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合し得る利点を所有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージにより摂取される。

【0092】

インタクトな哺乳動物皮膚を横切るために、脂質ビヒクルは、適切な経皮グラディエントの影響下で、各々が５０ｎｍより小さい直径をもつ、一連の微細な穴を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能であり、このような微細な穴を通過し得るリポソームを用いることが所望され得る。

【0093】

リポソームのさらなる利点は以下を含む；天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性かつ生分解性である；リポソームは、広範な範囲の水および脂質可溶性薬物を取り込み得る；リポソームは、それらの内部区画において、代謝および分解からカプセル化された薬物を保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、第１巻、２４５頁）。リポソーム処方物の調製における重要な考慮は、脂質表面電荷、ビヒクルサイズおよびリポソームの水の容積である。

【0094】

リポソームは、作用の部位への活性成分の移入および送達に有用である。リポソーム膜は、生物学的膜に構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用するとき、リポソームは、細胞膜と融合することを開始する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれ、リポソーム内容物は、活性成分が作用し得る細胞中へと、空にされる。

【0095】

リポソーム処方物は、多くの薬物のための送達のモードとして、広範な調査の焦点である。局所投与には、リポソームがその他の処方物に対しいくつかの利点を提示するという証拠が増加している。このような利点は、投与された薬物の高全身吸収に関連する低減された副作用、所望の標的における投与された薬物の増加した蓄積、および、皮膚への疎水性および親水性両方の広範な薬物を投与するための能力を含む。

【0096】

いくつかの報告は、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するためのリポソームの能力の詳細を記載している。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大部分は、上部表皮の標的化を生じた。

【0097】

リポソームは、２つの広範なクラスに入る。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用し、安定な複合体を形成する正に荷電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に内部移行する。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂し、それらの内容物を細胞の細胞質中に放出する（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８７、１４７、９８０−９８５）。

【0098】

ｐＨ感受性であるか、負に荷電したリポソームは、ＤＮＡとの複合体よりもむしろそれを包括する。ＤＮＡおよび脂質の両方は同様に荷電されるので、複合体形成よりもむしろ反発が起こる。それにもかかわらず、特定のＤＮＡは、これらのリポソームの水のある内側の中に包括される。ｐＨ感受性リポソームを用いて、培養中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡが送達されている。外来遺伝子の発現は、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９２、１９、２６９−２７４）。

【0099】

リポソーム組成物の１つの主要なタイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。天然リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。一般に、アニオン性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、その一方、アニオン性の紡錘形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（例えば、大豆ＰＣ、および卵ＰＣなど）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。

【0100】

いくつかの研究は、リポソーム薬物処方物の皮膚への局所送達を評価した。モルモット皮膚へのインターフェロンを含むリポソームの適用は、皮膚ヘルペスただれの減少をもたらした。その一方、その他の手段によるインターフェロンの送達（例えば、溶液として、またはエマルジョンとして）は、有効でなかった（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９２、２、４０５−４１０）。さらに、さらなる研究は、水系を用いるインターフェロンの投与へのリポソーム処方物の一部として投与されたインターフェロンの効目を試験し、そしてこのリポソーム組成物は、水投与より優れていたことを結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅa
ｒｃｈ、１９９２、１８、２５９−２６５）。

【0101】

非イオンリポソーム系もまた、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む特定の系において、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を決定するために試験された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ^ＴＭＩ（グリセロールジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ^ＴＭＩＩ（グリセロールジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む、非イオン性リポソーム処方物を用いて、マウス皮膚の真皮中にシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロスポリンＡの沈着を容易にすることで有効であったことを示した（Ｈｕら、Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、１９９４、４、６、４６６）。

【0102】

リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は、本明細
書で用いられるとき、リポソーム中に取り込まれたとき、このような特別な脂質を欠くリポソームに対して増加した循環寿命を生じる、１つ以上の特別な脂質を含むリポソームをいう。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成性脂質部分の一部分が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１のような１つ以上のグリコリピドを含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような、１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、当該分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ−誘導体化脂質を含む、立体的に安定化されたリポソームについては、これら立体的に安定化されたリポソームの増加した循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への低下した取込みに由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８７、２２３、４２；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、３７６５）。１つ以上のグリコリピドを含む種々のリポソームが当該分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８７、５０７、６４）は、モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を改良する能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎらにより（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８８、８５、６９４９）詳細に説明された。両方ともＡｌｌｅｎらによる、米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ ８８／０４９２４は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧ_Ｍ１またはガラクトセレブロシドサルフェートエステルを含む、リポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）に開示されている。

【0103】

１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製の方法は、当該分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、１９８０、５３、２７７８）は、非イオン性界面活性剤、２Ｃ_１２１５Ｇを含み、ＰＥＧ成分を含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８４、１６７、７９）は、ポリマー性グリコールでのポリスチレン粒子の親水性被覆が、有意に増加した血液半減期を生じることを記載した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の付着によって改変された合成リン脂質はＳｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２６８、２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームの血液循環半減期が有意に増加することを示す実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９９０、１０２９、９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組合せから形成される、ＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡張した。Ｆｉｓｈｅｒによる欧州特許第ＥＰ ０４４５１３１Ｂ１およびＷＯ９０／０４３８４には、それらの外表面上に共有結合したＰＥＧ成分を有するリポソームが記載されている。１〜２０モル％のＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含むリポソーム組成物、およびその使用の方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および同５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ ０４９６８１３Ｂ１）によって記載されている。多くのその他の脂質−ポリマー複合体を含むリポソームが、ＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（両方ともＭａｒｔｉｎらによる）およびＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に記載されている。ＰＥＧ−改変セラミドリピドを含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および同第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、それらの表面上で官能成分でさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記
載している。

【0104】

核酸を含む限られた数のリポソームが当該分野で知られている。ＴｈｉｅｒｒｙらによるＷＯ９６／４００６２は、リポソーム中に高分子量核酸をカプセル化するための方法を記載する。Ｔａｇａｗａらによる、米国特許第５，２６４，２２１は、タンパク質が結合したリポソームを開示し、そしてこのようなリポソームの内容物は、アンチセンスＲＮＡを含み得ることを主張している。Ｒａｈｍａｎらによる米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定の方法を記載している。ＬｏｖｅらによるＷＯ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示している。

【0105】

トランスフェロソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）は、なお別のタイプのリポソームであり、そして薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスフェロソームは脂質小滴であり、それらがこの小滴より小さな穴を容易に通過し得るように高度に変形可能である脂質小滴として記載され得る。トランスフェロソームは、それらが用いられる環境に適合可能であり、例えば、それらは、自己適合性（皮膚中の穴の形状に適合可能）であり、自己修復性であり、フラグメント化なくしてそれらの標的に頻繁に到達し、そしてしばしば自己充填性である。トランスフェロソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に、通常界面活性剤である、表面エッジ活性化剤を添加することが可能である。トランスフェロソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するために用いられている。血清アルブミンのトランスフェロソーム媒介送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注入と同様に有効であることが示されている。

【0106】

界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームのような処方物において、広範な適用を見出している。天然および合成の両方の多くのタイプの界面活性剤の性質を分類かつランク分けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水性基の性質（「頭部」としても知られる）は、処方物で用いられる異なる界面活性剤をカテゴリー分けするための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８８、２８５頁）。

【0107】

界面活性剤分子がイオン化されていないとき、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品および化粧品に広範な適用を見出し、そして広範な範囲のｐＨ値に亘って使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤は、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステルのような非イオン性エステルを含む。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーのような、非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。

【0108】

界面活性剤が水に溶解または分散されるとき、それが負電荷を保持する場合、この界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤は、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミドのようなカルボキシレート、アルキル硫酸およびエトキシル化アルキルサルフェートのような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホサクシネートのようなスルホネート、およびホスフェートを含む。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキルサルフェートおよび石鹸である。

【0109】

界面活性剤が水に溶解または分散されるとき、それが正電荷を保持する場合、この界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤は、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンを含む。この第四級アンモニウム塩は、このクラスで最も使用されるメンバーである。

【0110】

界面活性剤分子が、正または負電荷のいずれかを保持する能力を有する場合、この界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドを含む。

【0111】

薬物製品、処方物における、およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用が総説されている（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８８、２８５頁）。

【0112】

（透過エンハンサー）
１つの実施形態では、本発明は、種々の透過エンハンサーを採用し、動物の皮膚に、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的な送達を行う。大部分の薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で存在する。しかし、通常、脂質可溶性または親油性薬物のみが容易に細胞膜を横切る。横切られるべき膜が透過エンハンサーで処理される場合、非親油性薬物でさえ、細胞膜を横切り得ることが発見された。細胞膜を横切る非親油性薬物の拡散を補助することに加え、透過エンハンサーはまた、親油性薬物の透過性を増大する。

【0113】

透過エンハンサーは、５つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤剤（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）の１つに属するとして分類され得る。透過エンハンサーの上記のクラスの各々は、以下により詳細に記載される。

【0114】

界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性薬剤」）は、水溶液に溶解されるとき、この溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との間の界面間の張力を低減する化学的実体であり、粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収が増大される。胆汁酸塩および脂肪酸に加え、これらの透過エンハンサーは、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエステル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）；およびＦＣ−４３のような、水素をフッ素で置換した化合物（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）のエマルジョン（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８８、４０、２５２）を含む。

【0115】

脂肪酸：透過エンハンサーとして作用する、種々の脂肪酸およびそれらの誘導体は、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ_１−１０アルキル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）エステル、およびそれらのモノおよびジグリセリド（例えば、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノリエートなど）を含む（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９２、４４、６５１−６５４）。

【0116】

胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（Ｂｒｕｎｔｏｎ、第３８章：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９６、９３４−９３５頁）。種々の天然の胆汁酸塩およびその合成の誘導体は、浸透増強剤として作用する。従って、用語「胆汁酸塩」は、胆汁の任意の天然に存在する成分、およびそれらの任意の合成誘導体を含む。本発明の胆汁酸塩としては、例えば、以下が挙げられる：コール酸（またはその薬学的に受容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロー２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｓｗｉｎｙａｒｄ、第３９章： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、１９９０、７８２−７８３頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ
Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９２、２６３、２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９０、７９、５７９−５８３）。

【0117】

キレート剤： 本発明に関して使用される場合、キレート剤は、金属イオンと錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が促進される化合物として定義され得る。本発明における浸透増強剤としてのそれらの使用に関して、キレート剤は、ＤＮａｓｅインヒビターとしても作用するというさらなる利点を有する。なぜなら、最も特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは、触媒のために二価の金属イオンを必要とし、従って、キレート剤によって阻害されるからである（Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５−３３９）。本発明のキレート剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）−９およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．、１９９０、１４、４３−５１）。

【0118】

非キレート性非界面活性剤：本明細書中で使用される場合、非キレート性非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性しか実証しないにもかかわらず、消化粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化合物として規定され
得る（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３）。この種類の浸透増強剤としては、例えば、不飽和環式尿素、１−アルキル−アルカノン誘導体および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）；ならびに非ステロイド抗炎症剤（例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８７、３９、６２１−６２６）が挙げられる。

【0119】

細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進する薬剤はまた、本発明の薬学的組成物および他の組成物に添加され得る。例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号））、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／３０７３１））はまた、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進することが知られている。

【0120】

他の薬剤が、投与された核酸の浸透を促進するために利用され得る。これらの薬剤としては、グリコール（例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール）、ピロール（例えば、２−ピロール）、アゾン（ａｚｏｎｅ）およびテルペン（例えば、リモネンおよびメントン）が挙げられる。

【0121】

（キャリア）
本発明の特定の組成物はまた、処方物中にキャリア化合物を含む。本明細書中で使用される場合、「キャリア化合物」または「キャリア」とは、核酸またはそれらのアナログをいい得、これは、不活性（すなわち、それ自体生物活性を有さない）であるが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、または循環から生物学的に活性な核酸を除去することを促進することによって、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを減少させるインビボプロセスにより、核酸として認識される。核酸とキャリア化合物との同時投与（典型的に、後者の物質過剰である）は、おそらく、共通のレセプターについてのキャリア化合物と核酸との間の競合に起因して、肝臓、腎臓または他の体外循環レザバにおいて回収される核酸の量の実質的な減少を生じ得る。例えば、肝臓組織における部分的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与される場合に減少され得る（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、１９９５、５、１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．、１９９６、６、１７７−１８３）。

【0122】

（賦形剤）
キャリア化合物とは対照的に、「薬物学的キャリア」または「賦形剤」は、薬学的に受容可能な溶媒、懸濁剤または動物に１つ以上の核酸を送達するための他の任意の薬物学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体でも固体でもよく、核酸と所定の薬学的組成物の他の成分とが組み合わされる場合、所望のバルク、粘稠度などが提供されるように考慮して計画された投与様式によって選択され得る。代表的な薬学的キャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポ
リエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）。

【0123】

核酸と有害に反応しない、非腸管外投与に適切な薬学的に受容可能な有機賦形剤または無機賦形剤もまた、本発明の組成物を処方するために使用され得る。適切な薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど。

【0124】

核酸の局所投与のための処方物としては、以下が挙げられ得る：滅菌水溶液および非滅菌水溶液、アルコールのような一般的な溶媒中の非水溶液、または液体油ベースもしくは固体油ベース中の核酸溶液。これらの溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤を含み得る。核酸と有害な反応をしない、非腸管外投与に適切な薬学的に受容可能な有機賦形剤または無機賦形剤が、使用され得る。

【0125】

適切な薬学的に受容可能な賦形剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど。

【0126】

（他の成分）
本発明の組成物は、薬学的組成物中に慣習的に見出される他のアジュバント成分を、当該分野で確立された使用レベルでさらに含み得る。したがって、例えば、組成物は、さらなる適合性の薬学的に活性な物質（例えば、かゆみ止め、収れん薬、局所麻酔剤または抗炎症剤）を含み得るか、あるいは本発明の組成物の、種々の投薬形態を生理学的に処方することにおいて有用なさらなる物質（例えば、色素、矯味剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定剤）を含み得る。しかし、このような材料は、添加される場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に阻害するべきではない。これらの処方物は、安定化され得、そして所望される場合、処方物の核酸と有害に相互作用しない補助剤（例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色料、矯味物質および／または芳香物質など）と混合され得る。

【0127】

水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが挙げられる）を含み得る。懸濁液はまた、安定剤を含み得る。

【0128】

本発明の特定の実施形態は、（ａ）１つ以上のアンチセンス化合物、および（ｂ）１つ以上の他の化学療法剤（これは、非アンチセンス機構によって機能する）を含む薬学的組成物を提供する。このような化学療法剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド（ｍａｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア（ｂｉｓ−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプレゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロへキシルニトロソウレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６
−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ（ＤＥＳ））。一般的に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、１９８７、１２０６−１２２８頁、Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照のこと。本発明の化合物と共に使用される場合、このような化学療法剤は、別個に（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）か、連続して（例えば、一定時間の５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、引き続いてＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）か、あるいは１つ以上の他のこのような化学療法剤と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、または５−ＦＵ、放射線療法およびオリゴヌクレオチド）使用され得る。抗炎症薬物（非ステロイド抗炎症薬物およびコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに抗ウイルス薬物（リビビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルが挙げられるが、これらに限定されない）もまた、本発明の組成物と組み合わされ得る。一般的に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、Ｂｅｒｋｏｗら編、１９８７、Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．、それぞれ、２４９９−２５０６頁および４６−４９頁を参照のこと。他の非アンチセンス化学療法剤もまた、本発明の範囲内である。２つ以上組み合わせた化合物は、一緒にか、または連続して使用され得る。

【0129】

別の関連する実施形態において、本発明の組成物は、第１核酸に標的化された１つ以上のアンチセンス化合物（特にオリゴヌクレオチド）、および第２核酸標的に標的化された１つ以上のさらなるアンチセンス化合物を含み得る。アンチセンス化合物の多数の例は、当該分野で公知である。２つ以上組み合わせた化合物は、一緒にか、または連続して使用され得る。

【0130】

治療組成物の処方およびそれに続く投与は、当業者の技術の範囲内と考えられる。投与は、処置されるべき疾患状態の重篤度および応答性に依存して、数日から数ヶ月間まで続く処置過程で、あるいは治癒がもたらされるか、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く。最適な投与スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定から計算され得る。当業者は、最適な投薬量、投与方法および繰り返し率を容易に決定し得る。最適な投薬は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に非常に依存し得、そして一般的に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ_５０に基づいて評価され得る。一般的に、投薬量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、そして１日に１回以上、一週間に１回以上、一ヶ月に１回以上、もしくは１年に１回以上、または２年〜２０年ごとに１回、与えられ得る。当業者は、測定された、身体の流体または組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための繰り返し率を容易に決定し得る。首尾よい処置の後、患者は、疾患状態の再発を予防するために維持療法を受けることが所望され得、ここで、このオリゴヌクレオチドは、維持用量（体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇ、１日に１回以上〜２０年毎に１回の範囲）で投与される。

【0131】

本発明は、本発明のある好ましい実施形態に従って具体的に記載されているものの、以下の実施例は、本発明を説明するように作用するだけであり、同一なものに限定することを意図しない。

【実施例】

【0132】

（実施例１）
（オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホルアミダイト）
（デオキシアミダイトおよび２’−アルコキシアミダイト）
２’−デオキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトおよび２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトを、業者（例えば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ、またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．）から購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換されたヌクレオシドアミダイトを、米国特許第５，５０６，３５１号（本明細書中に参考として援用される）に記載されたように調製する。２’−アルコキシアミダイトを使用して合成されたオリゴヌクレオチドについて、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程を３６０秒まで長くしたことを除いて、非改変オリゴヌクレオチドについての標準的なサイクルを利用した。

【0133】

５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを、公開された方法（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、２１、３１９７−３２０３）に従って、市販のホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，またはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）を使用して、合成した。

【0134】

（２’−フルオロアミダイト）
（２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト）
２’−フルオロオリゴヌクレオチドを、以前に記載されるように［Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１および米国特許第５，６７０，６３３号（本明細書中に参考として援用される）］合成した。簡潔には、保護ヌクレオシドＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを、文献の手順を改変し、それによりこの２’−α−フルオロ原子を２’−β−トリチル基のＳ_Ｎ２−置換により導入することによって、出発物質として市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを利用して合成した。従って、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを、３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として、中程度の収量において選択的に保護した。ＴＨＰ基およびＮ６−ベンゾイル基の脱保護を、標準的な方法論を使用して達成し、そして標準的な方法を使用して、５’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）中間体および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイト中間体を得た。

【0135】

（２’−フルオロデオキシグアノシン）
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成を、テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として使用して、その中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により達成した。ＴＰＤＳ基の脱保護の次に、そのヒドロキシル基をＴＨＰで保護して、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的Ｏ−脱アシル化およびトリフレート化（ｔｒｉｆｌａｔｉｏｎ）の次に、フッ素で粗製生成物を処理し、次いで、ＴＨＰ基の脱保護を行った。

【0136】

標準的な方法論を使用して、その５’−ＤＭＴ−ホスホルアミダイトおよび５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイトを得た。

【0137】

（２’−フルオロウリジン）
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成を、文献の手順の改変によって達成した。この手順において、２，２’−無水−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを、７０％ フッ化水素−ピリジンで処理した。標準的な手順を使用して、その５’−ＤＭＴ
ホスホルアミダイトおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。

【0138】

（２’−フルオロデオキシシチジン）
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化を介して合成し、続いて、選択的に保護して、Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準的な手順を使用して、その５’−ＤＭＴホスホルアミダイトおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。

【0139】

（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト）
２’−Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトを以下のように調製するか、または代わりに、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４の方法に従って調製する。

【0140】

（２，２’−無水［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］）
５−メチルウリジン（Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎから市販されるリボシルチミン）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）および重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に添加した。この混合物を、攪拌しながら加熱して還流し、発生した二酸化炭素ガスを制御された様式にて放出させた。１時間後、わずかに色が濃くなった溶液を、減圧下で濃縮した。この得られたシロップを、攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。この生成物はガム状物質を形成した。エーテルをデカントし、残渣を、最小量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を、新たなエーテル（２．５Ｌ）に注いで、硬いガム状物質を得た。このエーテルをデカントし、このガム状物質を、真空オーブンで乾燥して（６０℃、１ｍｍＨｇにて２４時間）、固体を得、これを、淡い黄褐色粉末（５７ｇ、８５％粗収率）に粉にした。そのＮＭＲスペクトルは、その構造と一致し、そのナトリウム塩としてフェノールが混入していた（約５％）。さらなる反応のために、この物質を使用した（または酢酸エチル中のメタノール勾配（１０〜２５％）を使用するカラムクロマトグラフィーによりさらに精製されて、白色固体を獲得し得る（ｍｐ ２２２〜４℃））。

【0141】

（２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン）
２，２’−無水−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ、０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を、２Ｌのステンレス鋼圧力容器に添加し、予め加熱した１６０℃の油浴に入れた。１５５〜１６０℃にて４８時間加熱した後、この容器を開け、その溶液を乾燥するまでエバポレートし、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で摩砕した。その残渣を、熱アセトン（１Ｌ）中に再懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、濾液をエバポレートした。その残渣（２８０ｇ）をＣＨ_３ＣＮ（６００ｍＬ）中に溶解し、エバポレートした。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を、０．５％ Ｅｔ_３ＮＨを含有するＣＨ_２Ｃｌ_２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中にパックした。残渣を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５０ｍＬ）中に溶解し、このカラムに装填する前に、シリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を、パックした溶媒を用いて溶出して、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。さらなる物質を、不純物質画分を、再度作業することにより得た。

【0142】

（２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）を、ピリジン（２５０ｍＬ）とともに同時にエバポレートし、その乾燥した残渣を、ピリジン（１．３Ｌ）中に溶解した。ジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）の第１のアリコートを添加し、その混合物を、室温にて１時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの第２のアリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、その反応系を、さ
らに１時間攪拌した。次いで、メタノール（１７０ｍＬ）を添加して、その反応系を停止させた。ＨＰＬＣにより、約７０％の生成物の存在が示された。その溶媒をエバポレートし、ＣＨ_３ＣＮ（２００ｍＬ）で摩砕した。その残渣を、ＣＨＣｌ_３（１．５Ｌ）中に溶解し、２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３および２×５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。その有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、エバポレートした。２７５ｇの残渣を得た。この残渣を、充填され、０．５％ Ｅｔ_３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出される３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製した。この純粋画分をエバポレートして、１６４ｇの生成物を得た。さらに約２０ｇを、不純物質画分から得て、合計収量１８３ｇ（５７％）を得た。

【0143】

（３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦと１８８ｍＬのピリジンから調製した、７５０ｍＬの３：１混合物）および、無水酢酸（２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を合わせ、室温にて２４時間攪拌した。この反応系を、最初にＭｅＯＨの添加によりＴＬＣサンプルをクエンチすることによって、ＴＬＣによりモニターした。ＴＬＣにより判断した場合に、反応が完了した際に、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を添加し、この混合物を、３５℃でエバポレートした。その残渣を、ＣＨＣｌ_３（８００ｍＬ）中に溶解し、２×２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムおよび２×２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。その水層を、２００ｍＬのＣＨＣｌ_３で逆抽出（ｂａｃｋ ｅｘｔｒａｃｔ）した。合わせた有機物質を、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートして、１２２ｇの残渣（約９０％生成物）を得た。その残渣を、３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出した。純粋な生成物画分をエバポレートして、９６ｇ（８４％）を得た。さらに１．５ｇを残りの画分から回収した。

【0144】

（３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン）
第１の溶液を、ＣＨ_３ＣＮ（７００ｍＬ）中に３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）を溶解することによって調製し、とっておいた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．４４Ｍ）を、ＣＨ_３ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）の溶液に添加し、−５℃まで冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて０．５時間攪拌した。０〜１０℃に維持した攪拌溶液に３０分かけてＰＯＣｌ_３を滴下し、得られた混合物を、さらに２時間攪拌した。第１の溶液を、後者の溶液に４５分かけて滴下した。得られた反応混合物を低温室に一晩保存した。塩を反応混合物から濾過し、その溶液をエバポレートした。その残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固体を、濾過により除去した。その濾液を、１×３００ｍＬのＮａＨＣＯ_３および２×３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートした。その残渣を、ＥｔＯＡｃで粉砕して、標題化合物を得た。

【0145】

（２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン）
ジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ_４ＯＨ（３０ｍＬ）中の３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）の溶液を、室温にて２時間攪拌した。このジオキサン溶液をエバポレートし、その残渣を、ＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）で共沸した。その残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中に溶解し、２ｌのステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ_３ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を添加し、この容器を、１００℃まで２時間加熱した（ＴＬＣにより、完全な変換が示された）。この容器の内容物を、乾燥するまでエバポレートし、その残渣を、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２
００ｍＬ）で１回洗浄した。この有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をエバポレートして、８５ｇ（９５％）の標題化合物を得た。

【0146】

（Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）中に溶解し、無水安息香酸（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を攪拌しながら添加した。３時間攪拌した後、ＴＬＣにより、反応が約９５％完了したことが示された。溶媒をエバポレートし、その残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で共沸した。残渣をＣＨＣｌ_３（７００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３（２×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、エバポレートして、残渣（９６ｇ）を得た。その残渣を、溶出溶媒として０．５％ Ｅｔ_３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用して１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物画分をエバポレートして、９０ｇ（９０％）の標題化合物を得た。

【0147】

（Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト）
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１Ｌ）中に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および亜リン酸２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を、窒素雰囲気下で攪拌しながら添加した。得られた混合物を、室温にて２０時間攪拌した（ＴＬＣにより、反応が９５％完了したことが示された）。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ_３（１×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。この水性洗浄液を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３００ｍＬ）で逆抽出し、その抽出物を合わせて、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濃縮した。得られた残渣を、溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用して１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィーにかけた。純粋画分を合わせて、９０．６ｇ（８７％）の標題化合物を得た。

【0148】

（２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト）
（２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト）
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（当該分野で２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても公知）を、以下の段落に記載されるように調製する。アデノシン、シチジンおよびグアノシンのヌクレオシドアミダイトを、アデノシンおよびシチジンの場合には環外アミンをベンゾイル部分で保護し、グアノシンの場合にはイソブチリルで保護することを除いて、チミジン（５−メチルウリジン）と同様に調製する。

【0149】

（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ^２−２’−無水−５−メチルウリジン）
Ｏ^２−２’−無水−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．，Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙ，１００．０ｇ、０．４１６ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ、０．０１３当量、０．００５４ｍｍｏｌ）を、機械的に攪拌しながらアルゴン雰囲気下で周囲温度にて乾燥ピリジン（５００ｍｌ）中に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ、１１９．０ｍＬ、１．１当量、０．４５８ｍｍｏｌ）を一部添加した。その反応系を、周囲温度にて１６時間攪拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ ０．２２、酢酸エチル）により、完全な反応が示された。この溶液を、減圧下で濃オイルになるまで濃縮した。これを、ジクロロメタン（１Ｌ）と、飽和重炭酸ナトリウム（２×１Ｌ）
と、ブライン（１Ｌ）との間で分配した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃オイルになるまで濃縮した。このオイルを、酢酸エチルとエチルエーテルの１：１混合物（６００ｍＬ）中に溶解し、この溶液を−１０℃まで冷却した。得られた結晶生成物を、濾過により回収し、エチルエーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄し、１４９ｇ（７４．８％）の白色固体になるまで乾燥した（４０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）。ＴＬＣおよびＮＭＲは、純粋生成物と一致した。

【0150】

（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン）
２Ｌのステンレス鋼の攪拌されない圧力反応器中に、テトラヒドロフラン（１．０Ｍ、２．０当量、６２２ｍＬ）中のボランを添加した。換気フードにおいて、手動で攪拌しながら、まず、水素ガスの蒸発が静まるまでエチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰）を慎重に添加した。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ^２−２’−無水−５−メチルウリジン（１４９ｇ、０．３１１ｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ、０．００３当量）を、手動で攪拌しながら添加した。反応器を封鎖し、内部温度が１６０℃に達するまで油浴中で加熱し、次いで、１６時間維持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。この反応容器を周囲温度まで冷却し、開けた。ＴＬＣ（所望の生成物についてＲｆ ０．６７およびａｒａ−Ｔ副生成物についてＲｆ ０．８２、酢酸エチル）により、生成物の約７０％の変換が示された。さらなる副生成物形成を避けるために、反応を停止し、より極端な条件を、エチレングリコールを除去するために用いて、温水浴（４０〜１００℃）中、減圧下（１０〜１ｍｍＨｇ）で濃縮した（あるいは、一旦、低温での溶媒沸騰を行い、残りの溶液を、酢酸エチルと水との間で分配し得る。その生成物は、有機相中にある）。その残渣を、カラムクロマトグラフィー（２ｋｇのシリカゲル、１：１〜４：１の酢酸エチル−ヘキサン勾配）により精製した。適切な画分を合わせ、ストリッピングし（ｓｔｒｉｐ）、白色の砕けやすい泡沫（ｃｒｉｓｐ ｆｏａｍ）（８４ｇ、５０％）、混入した出発物質（１７．４ｇ）および純粋な再利用可能な出発物質（２０ｇ）として生成物を乾燥した。出発物資、あまり純粋でない回収された出発物質に基づく収率は、５８%で
あった。ＴＬＣおよびＮＭＲは、９９％の純粋物質と一致した。

【0151】

（２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン）
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ、３６．９８ｍｍｏｌ）を、トリフェニルホスフィン（１１．６３ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）と混合した。次いで、これを、４０℃にて２日間、高減圧下で、Ｐ_２Ｏ_５で乾燥した。この反応混合物を、アルゴンでフラッシュし、乾燥ＴＨＦ（３６９．８ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ、しっかりした封鎖瓶）を添加して、透明な溶液を得た。ジエチル−アゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ、４４．３６ｍｍｏｌ）を、反応混合物に滴下した。添加速度を、得られた濃赤色の着色が、次の滴下の前にちょうど脱色されるように維持した。添加を完了した後、この反応系を４時間攪拌した。そのときまでには、ＴＬＣにより、反応の完了が示される（６０：４０の酢酸エチル：ヘキサン）。溶媒を、真空中でエバポレートした。得られた残渣を、フラッシュカラムに配置し、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出して、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色泡沫（２１．８１９ｇ、８６％）として得た。

【0152】

（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ（ｆｏｒｍａｄｏｘｉｍｉｎｏｏｘｙ））エチル］−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（４．５ｍ
Ｌ）中に溶解し、メチルヒドラジン（３００ｍＬ、４．６４ｍｍｏｌ）を−１０℃〜０℃にて滴下した。１時間後、この混合物を濾過し、その濾液を、氷冷ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し、合わせた有機相を、水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。この溶液を濃縮して、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得た。次いで、これを、ＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）中に溶解した。これに、ホルムアルデヒド（２０％水溶液、ｗ／ｗ、１．１当量）を添加し、得られた混合物を、１時間攪拌した。溶媒を、真空下で除去し；残渣をクロマトグラフィーにかけて、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色泡沫（１．９５ｇ、７８％）として得た。

【0153】

（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン）
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を、乾燥ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を、１０℃にて不活性雰囲気下でこの溶液に添加した。この反応混合物を、１０℃にて１０分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出し、室温にて２時間攪拌し、この反応系を、ＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ ＭｅＯＨ）によりモニターした。ＮａＨＣＯ_３水溶液（５％、１０ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、乾燥するまでエバポレートした。残渣を、ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１Ｍ ＰＰＴＳの溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％ ｗ／ｗ、３０ｍＬ、３．３７ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を、室温にて１０分間攪拌した。この反応混合物を、氷浴中で１０℃まで冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、１０℃にて１０分間攪拌した。１０分後、この反応混合物を、氷浴から取り出し、室温にて２時間攪拌した。この反応混合物に、５％ ＮａＨＣＯ_３（２５ｍＬ）溶液を添加し、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、乾燥するまでエバポレートした。その得られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ ＭｅＯＨで溶出して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを白色泡沫（１４．６ｇ、８０％）として得た。

【0154】

（２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン）
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦおよびトリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ、乾燥、ＫＯＨで維持）中に溶解した。次いで、トリエチルアミン−２ＨＦのこの混合物を、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシラン−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に添加し、室温にて２４時間攪拌した。反応系を、ＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ ＭｅＯＨ）によりモニターした。溶媒を真空下で除去し、その残渣を、フラッシュカラムに配置し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％ ＭｅＯＨで溶出して、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６ｍｇ、９２．５％）を得た。

【0155】

（５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を、Ｐ_２Ｏ_５で、高い減圧下で４０℃にて一晩乾燥した。次いで、これを、無水ピリジン（２０ｍＬ）とともに同時エバポレートした。得られた残渣を、アルゴン雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）中に溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（２６．５
ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を、この混合物に添加し、この反応混合物を、出発物質のすべてがなくなるまで、室温にて攪拌した。ピリジンを真空下で除去し、その残渣を、クロマトグラフィーにかけ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％ ＭｅＯＨ（数滴のピリジンを含有する）で溶出して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジン（１．１３ｇ、８０％）を得た。

【0156】

（５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］）
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を、トルエン（２０ｍＬ）と同時エバポレートした。この残渣に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を添加し、そして高い減圧下、４０℃で一晩、Ｐ_２Ｏ_５上で乾燥させた。次いで、この反応混合物を、無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶解し、そして２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ^１，Ｎ^１−テトライソプロピルホスホルアミダイト（２．１２ｍＬ、６．０８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、周囲温度で、４時間、不活性雰囲気下で撹拌した。この反応の進行を、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル １：１）でモニタリングした。溶媒をエバポレートし、次いで、残渣を、酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶解し、そして５％ＮａＨＣＯ_３水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、そして濃縮した。得られた残渣を、クロマトグラフィー（溶出液として酢酸エチル）にかけて、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を泡状物として得た（１．０４ｇ、７４．９％）。

【0157】

（２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト）
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても当該分野で公知）を、以下のパラグラフにおいて記載するようにして調製する。アデノシンヌクレオシドアミダイト、シチジンヌクレオシドアミダイトおよびチミジンヌクレオシドアミダイトを、同じようにして調製する。

【0158】

（Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］）
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシンアナログは、ジアミノプリンリボシドの選択的２’−Ｏ−アルキル化によって得られ得る。数グラム量のジアミノプリンリボシドを、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入して、少量の３’−Ｏ−異性体と共に、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを提供し得る。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを溶解し得、そしてアデノシンデアミナーゼを用いる処理によって、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換し得る（ＭｃＧｅｅ，Ｄ．Ｐ．Ｃ．，Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｕｉｎｏｓｓｏ，Ｃ．Ｊ．，ＷＯ
９４／０２５０１ Ａ１ ９４０２０３）。標準的な保護手順により、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンおよび２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを得、これらを還元して、２−Ｎ−イソブチリル−６−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供し得る。上記のように、ヒドロキシル基を、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応によってＮ−ヒドロキシフタルイミドで置換し得、そしてこの保護されたヌクレオシドを、従来どおり、亜リン酸化して、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（［２−フタルイミ
ドキシ（ｐｈｔｈａｌｍｉｄｏｘｙ）］エチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を得ることができる。

【0159】

（２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト）
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２）または２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとしても当該分野で公知）を、以下のようにして調製する。他のヌクレオシドアミダイトも、同じようにして調製する。

【0160】

（２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン）
２［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ，６．６６ｇ，５０ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの容器（ｂｏｍｂ）中で撹拌しながら、ボランのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ，１０ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）にゆっくりと添加する。この固体が溶解するにつれて、水素ガスが発生する。Ｏ^２−，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ｇ，５ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．５ｍｇ）を添加し、そしてこの容器を密閉し、油浴に入れ、そして１５５℃で２６時間加熱する。この容器を、室温まで冷却し、そして開ける。粗溶液を濃縮し、そして残渣を水（２００ｍＬ）とヘキサン（２００ｍＬ）との間で分配する。過剰のフェノールをヘキサン層に抽出する。水層を、酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、そして合わせた有機層を、水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮する。残渣を、１：２０のメタノール／塩化メチレン（これは２％のトリエチルアミンを含む）を溶出液として使用するシリカゲルカラムにかける。このカラムの画分を濃縮すると、無色の固体が形成され、これを回収して、表題化合物を白色固体として得る。

【0161】

（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル）］−５−メチルウリジン）
無水ピリジン（８ｍＬ）中の０．５ｇ（１．３ｍｍｏｌ）の２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−エトキシ）エチル）］−５−メチルウリジンに、トリエチルアミン（０．３６ｍＬ）およびジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ，０．８７ｇ、２当量）を添加し、１時間撹拌する。この反応混合物を、水（２００ｍＬ）に注ぎ入れ、そしてＣＨ_２Ｃｌ_２（２×２００ｍＬ）で抽出する。合わせたＣＨ_２Ｃｌ_２層を、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で洗浄し、続いて、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒をエバポレートし、続いて、ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２：Ｅｔ_３Ｎ（２０：１，ｖ／ｖ，１％のトリエチルアミンを含む）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーにかけて、表題化合物を得る。

【0162】

（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト）
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）および２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（１．１ｍＬ、２当量）を、アルゴン雰囲気下で、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）に溶解した５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン（２．１７ｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。この反応混合物を、一晩撹拌し、そして溶媒をエバポレートする。得られた残渣を、酢酸エチルを溶出液として使用するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得る。

【0163】

（実施例２）
（オリゴヌクレオチドの合成）
非置換および置換のホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）で合成する。

【0164】

ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を、ホスファイト結合の段階的チオ化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）のために、標準的な酸化ボトルをアセトニトリル中０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド溶液で置き換えた以外は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成する。このチオ化を待つ工程を、６８秒までのばし、続いてキャッピング工程を行った。ＣＰＧカラムからの切断および濃水酸化アンモニウム中での５５℃における脱ブロック化（１８時間）の後、このオリゴヌクレオチドを、２．５容量のエタノールを用いて２回、０．５ＭのＮａＣｌ溶液から沈殿させることにより精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，５０８，２７０号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0165】

アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第４，４６９，８６３号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0166】

３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，６１０，２８９号または同第５，６２５，０５０号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0167】

ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0168】

アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを、公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれ、ＷＯ ９４／１７０９３およびＷＯ ９４／０２４９９として公開されている）（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0169】

３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，４７６，９２５号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0170】

ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，０２３，２４３号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0171】

ボラノ（ｂｏｒａｎｏ）ホスフェートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号（この両方は本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0172】

（実施例３）
（オリゴヌクレオシドの合成）
メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても特定
される）、ならびに例えば、ＭＭＩ結合とＰ＝Ｏ結合またはＰ＝Ｓ結合とを交互に有する混合骨格化合物を、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、同第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号（これら全ては本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0173】

ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）結合オリゴヌクレオシドおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0174】

エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，２２３，６１８号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。

【0175】

（実施例４）
（ＰＮＡの合成）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）を、以下に言及される様々な手順のいずれかに従って調製する：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３。これらをまた、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７００，９２２号および同第５，７１９，２６２号（本明細書中で参考として援用される）に従って調製し得る。

【0176】

（実施例５）
（キメラオリゴヌクレオチドの合成）
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプのものであり得る。これらとしては、第１のタイプ（結合ヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合ヌクレオシドの５’「ウイング」セグメントと３’「ウイング」セグメントとの間に位置する）、および第２の「開放端」タイプ（ここで「ギャップ」セグメントは、オリゴマー化合物の３’末端または５’末端のいずれかに位置する）が挙げられる。第１のタイプのオリゴヌクレオチドは、「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」またはギャップオリゴヌクレオチドとしても当該分野で公知である。第２のタイプのオリゴヌクレオチドは、「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）」または「ウイングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）」としても当該分野で公知である。

【0177】

（［２’−Ｏ−Ｍｅ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントおよび２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドを、上記のように、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動ＤＮＡ合成機モデル３８０Ｂを使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ部分については２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを、５’ウイングおよび３’ウイングについては５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを使用して、自動合成機を使用して合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾールおよび塩基の送達の後に待つ工程を６００ｓまでのばし、ＲＮＡについては４回、２’−Ｏ−メチルについては２回繰り返すことによって改変する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを、支持体から切断し、そしてホスフェート基を、３：１のアンモニア／エタノール中、室温で一晩脱保護し、次いで乾固するまで凍結乾燥する。室温で２４時間、メタノール性アンモニアで処理して、全ての塩基を脱保護し、サンプルを再び、乾固するまで凍結乾燥する。このペレットを、ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦに、室温で２
４時間再懸濁して、２’位を脱保護する。次いで、この反応を、１Ｍ ＴＥＡＡでクエンチし、次いで、このサンプルを、ｒｏｔｏｖａｃによって２分の１の容量になるまで減らし、その後Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩する。次いで、回収したオリゴを、収率においては分光光度計によって、そして純度についてはキャピラリー電気泳動および質量分析法によって分析する。

【0178】

（［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを使用したこと以外は、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上で記載された手順に従って調製した。

【0179】

（［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド）
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを使用したこと以外は、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上で記載された手順に従って調製する。ヨウ素を用いる酸化により、ホスホジエステルヌクレオチド間結合をキメラ構造のウイング部分内に形成し、そして３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用する硫黄化により、中心ギャップについてホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成する。

【0180】

他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，６２３，０６５号（本明細書中で参考として援用される）に従って合成する。

【0181】

（実施例６）
（オリゴヌクレオチドの単離）
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、制御型多孔質ガラスカラム（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ｃｏｌｕｍｎ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、５５℃で１８時間、濃水酸化アンモニウム中で脱ブロック化した後、このオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、２．５容量のエタノールを用いて２回、０．５ＭのＮａＣｌから沈殿させることにより精製する。合成されたオリゴヌクレオチドを、変性ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、全長の少なくとも８５％の物質であると判断した。合成で得られたホスホロチオエート結合およびホスホジエステル結合の相対量を、^３１Ｐ核磁気共鳴分光法によって定期的にチェックし、そしていくつかの研究のために、オリゴヌクレオチドを、Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，１８１６２−１８１７１に記載されるようにＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣで精製した物質について得られた結果は、ＨＰＬＣで精製していない物質について得られた結果と類似していた。

【0182】

（実施例７）
（オリゴヌクレオチドの合成−９６ウェルプレート様式）
オリゴヌクレオチドを、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホルアミダイト化学によって、標準的な９６ウェル様式で同時に９６の配列を構築し得る自動合成機で合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合を、水性ヨウ素を用いて酸化することによって得た。無水アセトニ
トリル中で、３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン−１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用して硫黄化することによって、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成した。標準的な塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトを、商業的販売業者（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、またはＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。非標準的なヌクレオシドを、公知の文献または特許方法によって合成する。これらを、塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして利用する。

【0183】

オリゴヌクレオチドを、支持体から切断し、そして高温（５５〜６０℃）で１２〜１６時間、濃ＮＨ_４ＯＨを使用して脱保護し、次いで遊離した生成物を減圧下で乾燥した。次いで、この乾燥した生成物を滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得、次いで、このプレートから、全ての分析プレートサンプルおよび試験プレートサンプルを、ロボット式ピペッターを利用して希釈する。

【0184】

（実施例８）
（オリゴヌクレオチドの分析−９６ウェルプレート様式）
各ウェル中のオリゴヌクレオチドの濃度を、サンプルの希釈およびＵＶ吸収分光法によって評価した。個々の生成物の全長完全性を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、９６ウェル様式（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ^ＴＭ ＭＤＱ）、または別々の調製されたサンプルについては、市販のＣＥ装置（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ^ＴＭ ５０００，ＡＢＩ ２７０）のいずれかで評価した。塩基および骨格の組成を、エレクトロスプレー質量分光法を利用する化合物の質量分析により確認した。全てのアッセイ試験プレートを、シングルチャネルロボット式ピペッターおよびマルチチャネルロボット式ピペッターを使用して、マスタープレートから希釈した。このプレート上の化合物の少なくとも８５％が、全長の少なくとも８５％である場合、プレートを許容可能であると判断した。

【0185】

（実施例９）
（細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理）
標的核酸が、測定可能なレベルで存在している限り、標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果を、種々の細胞型の任意のものにおいて試験し得る。これは、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を使用して、慣用的に決定され得る。以下の７個の細胞型を、例示目的のために示すが、選択された細胞型で標的が発現される限り、他の細胞型が慣用的に使用され得る。これは、当該分野で慣用的な方法（例えば、ノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはＲＴ−ＰＣＲ）によって容易に決定され得る。

【0186】

（Ｔ−２４細胞）
ヒト移行細胞の膀胱癌細胞株Ｔ−２４を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｔ−２４細胞を、ＭｃＣｏｙの５Ａ基本完全培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充）中で慣用的に培養した。細胞が９０％のコンフルエンスに達したら、トリプシン処理および希釈によって、慣用的に継代した。ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用するために、細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）に、７０００細胞／ウェルの密度で播種した。

【0187】

ノザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的組織培養プレート上に播種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理し得る。

【0188】

（Ａ５４９細胞）
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ａ５４９細胞を、ＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充）中で、慣用的に培養した。細胞が９０％のコンフルエンスに達したら、トリプシン処理および希釈によって、慣用的に継代した。

【0189】

（ＮＨＤＦ細胞）：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ＮＨＤＦを、供給業者によって推奨されるように、補充された線維芽細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で慣用的に維持した。細胞を、供給業者によって推奨されるように、１０継代まで維持した。

【0190】

（ＨＥＫ細胞）：
ヒト胚性ケラチノサイト（ＨＥＫ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ＨＥＫを、供給業者によって推奨されるように処方した、ケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において慣用的に維持した。細胞を、供給業者によって推奨されるように、１０継代まで慣用的に維持した。

【0191】

（ＨｅｐＧ２細胞）：
ヒト肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で慣用的に培養した。細胞が、９０％コンフルエンスに達したら、トリプシン処理および希釈によって、慣用的に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析における使用のために７０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）に播種した。

【0192】

ノザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的組織培養プレート上に播種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理し得る。

【0193】

（ＡＭＬ１２細胞）
ＡＭＬ１２（αマウス肝臓１２）細胞株を、ＴＧＦαについてトランスジェニックであるマウス（ＣＤ１系統、系列ＭＴ４２）由来の肝細胞から樹立した。細胞を、０．００５ｍｇ／ｍｌインスリン、０．００５ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン、および４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾンならびに９０％；１０％ウシ胎仔血清を含む、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地とＨａｍのＦ１２培地との１：１混合物中で培養する。継代培養するために、使用済培地を除去し、そして０．２５％トリプシン、０．０３％ＥＤＴＡ溶液の新鮮培地を添加する。新鮮トリプシン溶液（１〜２ｍｌ）を添加し、そして
この培養物を、細胞が剥がれるまで室温で静置する。

【0194】

細胞が９０％コンフルエンスに達したら、トリプシン処理および希釈によって、慣用的に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析における使用のために７０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）に播種した。

【0195】

ノザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的組織培養プレート上に播種し、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理し得る。

【0196】

（初代マウス肝細胞）
初代マウス肝細胞を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入したＣＤ−１マウスから調製し、そして１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、２５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、および１０ｎＭウシインスリン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）中で慣用的に培養した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析における使用のために１００００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）に播種した。

【0197】

ノザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、ラット尾コラーゲン（２００μｇ／ｍＬ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でコートした１００ｍｍまたは他の標準的培養プレート上にプレーティングし、そして適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理し得る。

【0198】

（アンチセンス化合物での処理）
細胞が８０％コンフルエンスに達したときに、これらを、オリゴヌクレオチドで処理した。９６ウェルプレートで増殖された細胞に関して、ウェルを一度２００μＬ ＯＰＴＩ−ＭＥＭ^ＴＭ−１低血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で洗浄し、次いで、３．７５μｇ／ｍＬ ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ^ＴＭ−１で処理した。４〜７時間の処理後、培地を、新鮮な培地と置き換えた。細胞をオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に収穫した。

【0199】

使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株間で異なる。特定の細胞株に対して最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を、ある範囲の濃度でポジティブコントロールオリゴヌクレオチドを用いて処理する。ヒト細胞について、ポジティブコントロールオリゴヌクレオチドは、ヒトＨ−ｒａｓを標的化するホスホロチオエート骨格を有する、ＩＳＩＳ １３９２０、

【0200】

【化1】

配列番号１、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）（２’−Ｏ−メトキシエチルが太字で示される））である。マウス細胞またはラット細胞について、ポジティブコントロールオリゴヌクレオチドは、マウスｃ−ｒａｆおよびラットｃ−ｒａｆの両方を標的とするホスホロチオエート骨格を有する、ＩＳＩＳ １５７７０、

【0201】

【化2】

配列番号２、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルが太字で示される）である。次いで、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ ｍＲＮＡ（ＩＳＩＳ １３９２０に対して）またはｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ（ＩＳＩＳ １５７７０に対して）の８０％阻害を生じるポジティブコントロールオリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株についての、後の実験における新規オリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。８０％阻害に達しない場合、Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡまたはｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの６０％阻害を生じるポジティブコントロールオリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株についての、後の実験におけるオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。６０％阻害が達成されない場合、その特定の細胞株を、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に適さないとみなす。

【0202】

（実施例１０）
（アポリポタンパク質Ｂ発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析）
アポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス調節を、当該分野で公知の種々の方法でアッセイし得る。例えば、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルを、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量し得る。リアルタイム定量的ＰＣＲが、ここでは好ましい。ＲＮＡ分析を、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して実施し得る。ＲＮＡ単離の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．１．１〜４．２．９頁および４．５．１〜４．５．３頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示される。ノーザンブロット分析は、当該分野において慣用的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．２．１〜４．２．９頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６に教示される。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能であり、そして製造業者の指示に従って使用される）を使用して簡便に達成し得る。

【0203】

アポリポタンパク質Ｂのタンパク質レベルは、当該分野で周知の種々の方法（例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡまたは蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ））で定量し得る。アポリポタンパク質Ｂに対する抗体を、同定し、種々の供給源（例えば、ＭＳＲＳ抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ））から入手し得るか、または従来の抗体産生方法によって調製し得る。ポリクローナル抗血清の調製のための方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．１２．１〜１１．１２．９頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。モノクローナル抗体の調製は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．４．１〜１１．１１．５頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。

【0204】

免疫沈降方法は、当該分野において標準的であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１０．１６．１〜１０．１６．１１頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８に見出され得る。ウェスタンブロット（イムノブロット）分
析は、当該分野において標準的であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１０．８．１〜１０．８．２１頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に見出され得る。酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）は、当該分野において標準的であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．２．１〜１１．２．２２頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１に見出され得る。

【0205】

（実施例１１）
（ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離）
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、Ｍｉｕｒａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，，１９９６，４２，１７５８−１７６４に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離のための他の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．５．１〜４．５．３頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示される。簡単に述べると、９６ウェルプレートで増殖された細胞について、増殖培地を、その細胞から除去し、そして各ウェルを、２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。６０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、２０ｍＭ バナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、そのプレートを穏やかに攪拌し、次いで、室温で５分間インキュベートした。５５μＬの溶解物を、Ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）コーティング済み９６ウェルプレート（ＡＧＣＴ Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ
ＣＡ）に移した。プレートを６０分間室温でインキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオル上で吸い取らせて過剰な洗浄緩衝液を除去し、次いで、５分間風乾した。６０μＬの溶出緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６）（７０℃まで予備加熱した）を、各ウェルに添加し、そのプレートを、９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートし、次いで、その溶出物を、新しい９６ウェルプレートに移した。

【0206】

１００ｍｍプレート上または他の標準的なプレート上で増殖した細胞を、適切な容量の全ての溶液を使用して、同様に処理し得る。

【0207】

（実施例１２）
（全ＲＮＡ単離）
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入したＲＮＥＡＳＹ ９６^ＴＭキットおよび緩衝液を製造業者の推奨する手順に従って使用して、単離した。簡単に述べると、９６ウェルプレート上で増殖した細胞に対して、増殖培地を、その細胞から除去し、そして各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。１００μＬの緩衝液ＲＬＴを各ウェルに添加し、そしてそのプレートを２０秒間激しく攪拌した。次いで、１００μＬの７０％エタノールを各ウェルに添加し、そして内容物を、３回ピペッティングして出し入れすることによって混合した。次いで、そのサンプルを、廃液収集トレイを備え減圧供給源に取り付けられたＱＩＡＶＡＣ^ＴＭマニホルドに取り付けられた、ＲＮＥＡＳＹ９６^ＴＭウェルプレートに移した。減圧を１５秒間適用した。１ｍＬの緩衝液ＲＷ１を、ＲＮＥＡＳＹ９６^ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして再び減圧を１５秒間適用した。次いで、１ｍＬの緩衝液ＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ９６^ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして減圧を１５秒間適用した。次いで、緩衝液ＲＰＥ洗浄を繰り返し、そして減圧をさらに１０分間適用した。次いで、そのプレートをＱＩＡＶＡＣ^ＴＭマニホルドから取り外し、そしてペーパータオル上にて吸い取らせて乾かした。次いで、そのプレートを、１．２ｍＬコレクションチューブを備えるコレクションチューブラックを備え付けた
ＱＩＡＶＡＣ^ＴＭマニホルドに、再び取り付けた。次いで、各ウェルに６０μＬの水をピペッティングし、１分間インキュベートし、次いで、３０秒間減圧を適用することによって、ＲＮＡを溶出した。この溶出工程を、さらに６０μＬの水を用いて繰り返した。

【0208】

反復するこのピペッティング工程および溶出工程を、ＱＩＡＧＥＮ Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して自動化し得る。基本的に、培養プレート上で細胞を溶解させた後、そのプレートをロボットデッキに移し、このロボットデッキにおいて、ピペッティング工程、ＤＮａｓｅ処理工程および溶出工程を実施する。

【0209】

（実施例１３）
（アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析）
アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの定量を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ７７００
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して、リアルタイム定量的ＰＣＲによって決定した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物をリアルタイムでハイスループット定量することを可能にする、閉鎖管式で非ゲルベースの蛍光検出システムである。ＰＣＲが完了した後に増幅生成物を定量する標準的なＰＣＲに対して、リアルタイム定量的ＰＣＲにおける生成物は、それらが蓄積するにつれて定量される。これは、順方向ＰＣＲプライマーと逆方向ＰＣＲプライマーとの間で特異的にアニールしかつ２つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを、このＰＣＲ反応において含むことによって達成される。レポーター色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡのいずれかから入手される、ＪＯＥ、ＦＡＭ、またはＶＩＣ）を、そのプローブの５’末端に結合させ、そしてクエンチャー色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡのいずれかから入手される、ＴＡＭＲＡ）を、そのプローブの３’末端に結合させる。そのプローブおよび色素がインタクトである場合、レポーター色素発光は、３’クエンチャー色素が近いことにより、クエンチされる。増幅の間、そのプローブが標的配列にアニールすることによって、Ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性によって切断され得る基質が、生成される。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長期の間、Ｔａｑポリメラーゼによりそのプローブが切断されると、そのプローブの残りから（それ故、クエンチャー部分から）レポーター色素が遊離され、そして配列特異的蛍光シグナルが生成される。各サイクルに伴い、さらなるレポーター色素分子が、それらの個々のプローブから切断される。そしてその蛍光強度を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに組み込まれたレーザーオプティクスによって、規則的間隔でモニターする。各アッセイにおいて、未処理のコントロールサンプル由来のｍＲＮＡの系列希釈物を含む一連の並行反応を使用して、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害％を定量するために使用する標準曲線を作成する。

【0210】

定量的ＰＣＲ分析の前に、測定している標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブセットを、そのセットがＧＡＰＤＨ増幅反応によって「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」される能力について評価する。多重化において、その標的遺伝子と内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨとの両方が、単一のサンプル中で同時に増幅される。この分析において、未処理細胞から単離したｍＲＮＡを、系列希釈する。各希釈物を、ＧＡＰＤＨのみに特異的なプライマー−プローブセット、標的遺伝子のみに特異的なプライマー−プローブセット（「一重化（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）」）、または両方に特異的なプライマー−プローブセット（多重化）の存在下で増幅する。ＰＣＲ増幅に続いて、希釈の関数としてのＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡシグナルおよび標的ｍＲＮＡシグナルの標準曲線を、一重化サンプルおよび
多重化サンプルの両方から作成する。多重化サンプルから作成したＧＡＰＤＨシグナルおよび標的シグナルの傾きおよび補正係数の両方が、一重化サンプルから作成したそれらの対応する値の１０％以内に入る場合、その標的に特異的なプライマー−プローブセットは、多重化可能であるとみなされる。他のＰＣＲ方法もまた、当該分野において公知である。

【0211】

ＰＣＲ試薬を、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから得た。２５μＬ ＰＣＲカクテル（１×ＴＡＱＭＡＮ^ＴＭ緩衝液Ａ、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００μＭのｄＡＴＰ、３００μＭのｄＣＴＰおよび３００μＭのｄＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、１００ｎＭの順方向プライマー、１００ｎＭの逆方向プライマー、および１００ｎＭのプローブ、２０単位のＲＮＡｓｅインヒビター、１．２５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ^ＴＭ、および１２．５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素）を、９６ウェルプレート（２５μＬの全ＲＮＡ溶液を含む）に添加することによって、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。このＲＴ反応を、４８℃で３０分間インキュベーションすることによって、実行した。ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ^ＴＭを活性化するために９５℃で１０分間インキュベーションした後、４０サイクルの２工程ＰＣＲプロトコルを実行した。この２工程ＰＣＲプロトコルは、９５℃にて１５秒間（変性）、その後、６０℃にて１．５分間（アニーリング／伸長）であった。

【0212】

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られる遺伝子標的量を、ＧＡＰＤＨの発現レベル（この遺伝子の発現は一定である）を使用すること、またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して全ＲＮＡを定量することのいずれかによって、正規化する。ＧＡＰＤＨ発現を、標的と同時に実施するか、多重化するか、または別々に実施することによって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量する。全ＲＮＡを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓからのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭＲＮＡ定量試薬を使用して定量する。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭによるＲＮＡ定量の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４に教示される。

【0213】

このアッセイにおいて、１７５μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ作業試薬（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中で、１：２８６５に希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ試薬）を、２５μＬの精製細胞ＲＮＡを含む９６ウェルプレートにピペッティングする。このプレートを、４８０ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光を用いてＣｙｔｏＦｌｕｏｒ ４０００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取る。

【0214】

ヒトアポリポタンパク質Ｂに対するプローブおよびプライマーを、公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ０００３８４（本明細書中において、配列番号３として援用される））を使用して、ヒトアポリポタンパク質Ｂ配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトアポリポタンパク質Ｂについて、そのＰＣＲプライマーは、

【0215】

【化3】

であり、そしてそのＰＣＲプローブは、

【0216】

【化4】

（配列番号６）であった。ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色素である。ヒトＧＡＰＤＨについて、そのＰＣＲプライマーは：

【0217】

【化5】

であり、そしてそのＰＣＲプローブは：

【0218】

【化6】

（配列番号９）であった、ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色素である。

【0219】

マウスアポリポタンパク質Ｂに対するプローブおよびプライマーを、公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５１８６（本明細書中において、配列番号１０として援用される））を使用して、マウスアポリポタンパク質Ｂ配列にハイブリダイズするように設計した。マウスアポリポタンパク質Ｂについて、そのＰＣＲプライマーは：

【0220】

【化7】

であり、そしてＰＣＲプローブは：

【0221】

【化8】

（配列番号１３）であった。ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色素である。マウスＧＡＰＤＨについて、そのＰＣＲプライマーは：

【0222】

【化9】

であり、そしてそのＰＣＲプローブは、

【0223】

【化10】

であった。ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色
素である。

【0224】

（実施例１４）
（アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析）
アンチセンス処理の１８時間後、細胞単層を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして１ｍＬ ＲＮＡＺＯＬ^ＴＭ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ ”Ｂ” Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）中に溶解させた。全ＲＮＡを、製造業者の推奨するプロトコルに従って、調製した。２０μｇの全ＲＮＡを、ＭＯＰＳ緩衝液系（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を使用して、１．１％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルを通す電気泳動によって分画した。ＲＮＡを、ノーザン／サザントランスファー緩衝液系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ ”Ｂ” Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用する一晩のキャピラリートランスファーによって、そのゲルからＨＹＢＯＮＤ^ＴＭ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移した。ＲＮＡトランスファーを、ＵＶ可視化によって確認した。膜を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ^ＴＭ ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用するＵＶ架橋によって固定し、次いで、ストリンジェントな条件についての製造業者の推奨を使用して、ＱＵＩＣＫＨＹＢ^ＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してプロービングした。

【0225】

ヒトアポリポタンパク質Ｂを検出するために、ヒトアポリポタンパク質Ｂ特異的プローブを、

【0226】

【化11】

を使用するＰＣＲによって、調製した。ローディング効率およびトランスファー効率における変動を正規化するために、膜をストリッピングし、そしてヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）についてプロービングした。

【0227】

マウスアポリポタンパク質Ｂを検出するために、ヒトアポリポタンパク質Ｂ特異的プローブを、

【0228】

【化12】

を使用するＰＣＲによって、調製した。ローディング効率およびトランスファー効率における変動を正規化するために、膜をストリッピングし、そしてマウスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）についてプロービングした。

【0229】

ハイブリダイズした膜を、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^ＴＭおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ^ＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して可視化し、そして定量した。データを、未処理コントロールにおけるＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。

【0230】

（実施例１５）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害）
本発明に従って、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００３８４（本明細書中で配列番号３として援用される）を使用して、ヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの異なる領域を標的とするように、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。それらのオリゴヌクレオチドを表１に示す。「標的部位」とは、そのオリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上で最初の（最も５’側の）ヌクレオチド番号を示す。表１におけるすべての化合物が、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」）であり、これは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域と、それに両方の側（５’方向および３’方向）で隣接する５ヌクレオチドの「ウィング（ｗｉｎｇ）」から構成されている。このウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、そのオリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。シチジン残基はすべて５’−メチルシチジンである。これらの化合物を、ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載されるような定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは、２回の実験からの平均である。「Ｎ．Ｄ．」が存在する場合、それは「データなし」を示す。

【0231】

（表１）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

【0232】

【表1】

表１に示されるように、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号６６は、このアッセイにおいてヒトアポリポタンパク質Ｂ発現の少なくとも３０％の阻害を示した。従って、これらの配列
が好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書中において「活性部位」と呼ばれており、従って、本発明の化合物により標的化される好ましい部位である。アポリポタンパク質Ｂは、哺乳動物において２つの形態（ＡｐｏＢ−４８およびＡｐｏＢ−１００）で存在し、これらの形態は、アミノ末端が共直線性であるので、ヌクレオチド１〜６５３０を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、両方の形態にハイブリダイズし、一方、ヌクレオチド６５３１〜１４１２１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アポリポタンパク質Ｂの長い方の形態に特異的である。

【0233】

（実施例１６）
（２’−ＭＯＥウィング（ｗｉｎｇ）とデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害−用量応答研究）
本発明に従って、実施例１５におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの部分集合を、用量応答研究においてさらに調査した。処理用量は、５０ｎＭ、１５０ｎＭおよび２５０ｎＭであった。これらの化合物を、ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載されるような定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは、２回の実験からの平均であり、そのデータを表２に示す。

【0234】

（表２）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

【0235】

【表2】

（実施例１７）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害）
本発明に従って、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５１８６（本明細書中で配列番号１０として援用される）を使用して、マウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの異なる領域を標的とする、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。それらのオリゴヌクレオチドを表３に示す。「標的部位」とは、そのオリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上で最初の（最も５’側の）ヌクレオチド番号を示す。表３におけるすべての化合物が、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」）であり、これは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域と、それに両方の側（５’方向および３’方向）で隣接する５ヌクレオチドの「ウィング（ｗｉｎｇ）」から構成されている。このウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、そのオリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。シチジン残基はすべて５’−メチルシチジンである。これらの化合物を、初代肝細胞におけるマウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載されるような定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは、２回の実験からの平均である。「Ｎ．Ｄ．」が存在する場合、それは「データなし」を示す。

【0236】

（表３）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドによるマウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

【0237】

【表3】

表３に示されるように、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９０、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１は、このアッセイにおいてマ
ウスアポリポタンパク質Ｂ発現の少なくとも５０％の阻害を示した。従って、これらの配列が好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書中において「活性部位」と呼ばれており、従って、本発明の化合物により標的化される好ましい部位である。

【0238】

（実施例１８）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスアポリポタンパク質Ｂ発現のアンチセンス阻害−用量応答研究）
本発明に従って、実施例１７におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの部分集合を、用量応答研究においてさらに調査した。処理用量は、５０ｎＭ、１５０ｎＭおよび３００ｎＭであった。これらの化合物を、初代肝細胞におけるヒトアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載されるような定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。データは、２回の実験からの平均であり、そのデータを表４に示す。

【0239】

（表４）
（２’−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベルの阻害）

【0240】

【表4】

（実施例１９）
（アポリポタンパク質Ｂタンパク質レベルのウェスタンブロット分析）
ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）を、標準的方法を使用して行った。細胞をオリゴヌクレオチド処理の１６〜２０時間後に採集し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００μｌ／ウェル）中に懸濁し、５分間沸騰させ、そして１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。ゲルを１５０Ｖにて１．５時間泳動させ、そしてウェスタンブロッティング用の膜にトランスファーした。アポリポタンパク質Ｂに対する適切な一次抗体を、その一次抗体種に対する放射標識二次抗体または蛍光標識二次抗体とともに使用した。バンドを、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を使用して可視化した。

【0241】

（実施例２０）
（Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果：やせた動物対高脂肪食動物）
高脂血症誘導性アテローム性動脈硬化症性プラーク形成に対して感受性であると報告されている系統であるＣ５７ＢＬ／６マウスを、以下の研究において使用して、やせたマウス対高脂肪食マウスにおける潜在的脂質減少化合物としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価した。

【0242】

雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２つの同等の群（（１）野生型コントロールマウス（やせた動物）および（２）高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えられる動物）に分割した。コントロール動物には、生理食塩水処理を与え、そして通常の齧歯類用食餌にて維持した。一晩絶食させた後、各群からのマウスに、生理食塩水または５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）を３日間ごとに６週間、腹腔内投与した。研究の終
了時に、最後の注射の４８時間後に、動物を屠殺し、肝臓中の標的ｍＲＮＡレベル、コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベル、肝臓酵素レベルおよび血清中グルコースレベルについて評価した。

【0243】

この比較研究の結果を、表５に示す。

【0244】

（表５）
（やせたマウスおよび高脂肪マウスにおける、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベル、コレステロールレベル、脂質レベル、トリグリセリドレベル、肝臓酵素レベルおよびグルコースレベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４処理の効果）

【0245】

【表5】

ＩＳＩＳ １４７７６４による処理が、やせたマウスおよび高脂肪マウスの両方において、コレステロールならびにＬＤＬリポタンパク質およびＨＤＬリポタンパク質ならびに血清中グルコールを低下させたこと、ならびに示された効果が、実際には、ｍＲＮＡレベルの減少により支持されるアポリポタンパク質Ｂ発現の阻害に起因することが、これらのデータから明らかである。肝臓酵素レベルの有意な変化は観察されなかった。このことは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドが、いずれの処理群に対しても毒性ではなかったことを示す。

【0246】

（実施例２１）
（高脂肪食マウスに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害効果；６週間時間経過研究）
本発明に従って、６週間の時間経過研究を実施して、高脂肪食マウスにおける脂質代謝およびグルコース代謝に対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果をさらに調査した。

【0247】

高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ １４７７６４）による処理の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。動物の部分集合に、１日経口用量（２０ｍｇ／ｋｇ）のアトロバスタチンカルシウム（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標），Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）を与えた。すべてのマウス（アトロバスタチン処理動物を除く）に、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。血清中コレステロールおよびリポタンパク質を、０週間目、２週間目、および６週間目の暫定時点にて分析した。研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そして肝臓中の標的ｍＲＮＡレベル、コレステロールレベル、リポタンパク質レベル、トリグリセリドレベル、肝臓酵素（ＡＳＴおよびＡＬＴ）レベルおよび血清中グルコースレベル、ならびに体重、肝臓重量、脾臓重量および脂肪パッド重量について評価した。

【0248】

（実施例２２）
（高脂肪食マウスにおけるアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果−肝臓におけるｍＲＮＡ発現）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、ｍＲＮＡ発現に対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そして肝臓中の標的ｍＲＮＡレベルについて評価した。ＩＳＩＳ １４７７６４は、５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量において、ｍＲＮＡレベルをそれぞれ１５％、７５％、および８８％減少させる、用量応答効果を示した。

【0249】

（実施例２３）
（血清中コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、血清中コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。

【0250】

血清中コレステロールレベルを、０週間目、２週間目、および６週間目に測定した。このデータを表６に示す。この表の値は、阻害パーセントとして表されており、生理食塩水コントロールに対して正規化されている。

【0251】

血清中コレステロールに加えて、研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そしてトリグリセリドレベルについて評価した。

【0252】

ＩＳＩＳ １４７７６４により処理したマウスは、研究終了までに、正常レベルに対して、血清中コレステロール（コントロール動物について２４０ｍｇ／ｄＬ、そして５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ２２５ｍｇ／ｄＬ、１２５ｍｇ／ｄＬおよび１１０ｍｇ／ｄＬ）ならびにトリグリセリド（コントロール動物について１１５ｍｇ／ｄＬ、そして５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ１２５ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬおよび８５ｍｇ／ｄＬ）の両方の減少を示した。これらのデータを、２０ｍｇ／ｋｇ経口用量でのアトロバスタチンカルシウムの効果ともまた比較した。このアトロバスタチンカルシウムの効果は、研究終了時に、血清中コレステロールの極小の減少（２０％）しか示さなかった。

【0253】

（表６）
（ＩＳＩＳ １４７７６４によるマウスアポリポタンパク質Ｂコレステロールレベルの阻害パーセント）

【0254】

【表6】

（実施例２４）
（リポタンパク質レベルに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、リポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬ）レベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。

【0255】

リポタンパク質レベルを、０週間目、２週間目、および６週間目に測定した。このデータを表７に示す。この表の値は、阻害パーセントとして表されており、生理食塩水コントロールに対して正規化されている。負の値は、観察されたリポタンパク質レベル増加を示す。

【0256】

これらのデータを、０週間目、２週間目、および６週間目での、一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンカルシウムの効果ともまた比較した。

【0257】

これらのデータは、５０ｍｇ／ｋｇ用量のＩＳＩＳ １４７７６４が、アトロバスタチンよりも大きな程度まで、調査した血清中リポタンパク質部類すべてを減少可能であることを、示す。

【0258】

（表７）
（アトロバスタチンと比較した、ＩＳＩＳ １４７７６４によるマウスアポリポタンパク質Ｂリポタンパク質レベルの阻害パーセント）

【0259】

【表7】

（実施例２５）
（血清中ＡＳＴレベルおよび血清中ＡＬＴレベルに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、肝
臓酵素（ＡＳＴおよびＡＬＴ）レベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。

【0260】

ＡＳＴレベルおよびＡＬＴレベルを、６週間目に測定した。このデータを表８に示す。この表の値は、ＩＵ／Ｌとして表されている。これらの肝臓酵素（ＡＬＴおよびＡＳＴ）のレベルの増加は、毒性および肝臓損傷を示す。

【0261】

ＩＳＩＳ １４７７６４により処理したマウスは、生理食塩水コントロールと比較して、この研究の期間にわたって有意なＡＳＴレベル変化を何ら示さなかった（生理食塩水コントロールについての６５ＩＵ／Ｌと比較して、５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ１０５ＩＵ／Ｌ、７０ＩＵ／Ｌおよび８０ＩＵ／Ｌ）。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウスは、ＡＳＴレベル８５ＩＵ／Ｌを有した。

【0262】

ＡＬＴレベルは、生理食塩水コントロールと比較して、この研究の期間にわたってすべての処理によって増加した（生理食塩水コントロールについての２５ＩＵ／Ｌと比較して、５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ５０ＩＵ／Ｌ、７０ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌ）。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウスは、ＡＳＴレベル４０ＩＵ／Ｌを有した。

【0263】

（実施例２６）
（血清中グルコースレベルに対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、血清中グルコースレベルに対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。

【0264】

研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そして血清中グルコースレベルについて評価した。ＩＳＩＳ １４７７６４は、生理食塩水コントロールについての３００ｍｇ／ｄＬと比較して、５ｍｇ／ｋｇ用量、２５ｍｇ／ｋｇ用量、および５０ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ２２５ｍｇ／ｄＬ、１９０ｍｇ／ｄＬおよび１８０ｍｇ／ｄＬにまで血清中グルコースレベルを減少させる、用量応答効果を示した。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウスは、血清中グルコースレベル２１５ｍｇ／ｄＬを有した。これらのデータは、ＩＳＩＳ １４７７６４が、高脂肪食マウスにおいて血清中グルコースレベルを減少可能であることを示す。

【0265】

（実施例２７）
（体重、脾臓重量、肝臓重量および脂肪パッド重量に対するアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果）
高脂肪食（６０％ ｋｃａｌ脂肪）を与えた雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）を、体重、脾臓重量、肝臓重量および脂肪パッド重量に対するＩＳＩＳ １４７７６４の効果について６週間の時間経過にわたって評価した。コントロール動物には、生理食塩水処理（
５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。マウスに、一晩絶食させた後に、５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）または生理食塩水（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３日間ごと（１週間に２回）に６週間、腹腔内投与した。

【0266】

研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そして体重、脾臓重量、肝臓重量および脂肪パッド重量を測定した。これらのデータを表８に示す。値は、生理食塩水処理したコントロール動物と比較した体重または器官重量の変化パーセントとして表している。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウスからのデータもまた、この表に示している。負の値は、重量の減少を示した。

【0267】

（表８）
（体重または器官重量に対するマウスアポリポタンパク質Ｂのアンチセンス阻害の効果）

【0268】

【表8】

これらのデータは、脾臓重量および肝臓重量の両方の増加により相殺されたＩＳＩＳ １４７７６４の投与範囲にわたる脂肪減少を示し、用量が増加するにつれて全体重の全体的減少が生じている。

【0269】

（実施例２８）
（Ｂ６．１２９Ｐ−Ａｐｏｅ^{ｔｍ１Ｕｎｃ}ノックアウトマウスにおけるアポリポタンパク質Ｂ（ＩＳＩＳ １４７７６４）のアンチセンス阻害の効果：やせた動物対高脂肪食動物）
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得たＢ６．１２９Ｐ−Ａｐｏｅ^{ｔｍ１Ｕｎｃ}ノックアウトマウス（本明細書中でＡｐｏＥノックアウトマススと呼ぶ）は、Ａｐｏｅ^{ｔｍ１Ｕｎｃ}変異についてホモ接合性であり、年齢によっても性別によっても影響を受けない全血漿コレステロールレベルの顕著な増加を示す。これらの動物は、３ヶ月齢にて、近位大動脈中に脂肪線条を示す。これらの病変は、年齢とともに増加し、そして脂質が少ないがより細長い細胞を含む病変（アテローム性動脈硬化症性病変のより進行した病期特有である）へと進行する。

【0270】

これらのマウスにおける変異は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子中に存在する。ＡｐｏＥタンパク質の主要な目的は、コレステロールおよびトリグリセリドを身体全体へと輸送することである。アポリポタンパク質Ｅは、リポタンパク質構造を安定化させ、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）および関連タンパク質に結合し、そしてＨＤＬサブクラス中に存在し、ＨＤＬにＬＤＬＲ結合能を提供する。ＡｐｏＥは、肝臓および脳において最も豊富に発現される。雌Ｂ６．１２９Ｐ−Ａｐｏｅ^{ｔｍ１Ｕｎｃ}ノックアウトマウス（ＡｐｏＥノックアウトマウス）を以下の研究に使用して、潜在的脂質減少化合物としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価した。

【0271】

雌ＡｐｏＥノックアウトマウスは、５週齢〜７週齢の範囲であった。これらの雌Ａｐｏ
Ｅノックアウトマウスに、研究開始前の２週間、通常の食餌を与えた。その後、ＡｐｏＥノックアウトマウスに、６０％脂肪食（０．１５％コレステロール添加）を無制限に与えて、高脂血症および肥満を誘導した。コントロール動物には、コレステロールを添加していない高脂肪食を与えて維持した。一晩絶食させた後、各群からのマウスに、生理食塩水、５０ｍｇ／ｋｇのコントロールアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ２９８３７ ＴＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＧ；配列番号１２４）、あるいは５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、２５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）、５０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＩＳ １４７７６４（配列番号１０９）を、３日間ごとに６週間、腹腔内投与した。

【0272】

このコントロールオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」）であり、これは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域と、それに両方の側（５’方向および３’方向）で隣接する５ヌクレオチドの「ウィング（ｗｉｎｇ）」から構成されている。このウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、そのオリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。シチジン残基はすべて５’−メチルシチジンである。

【0273】

研究終了時に、最後の注射の４８時間後に動物を屠殺し、そして肝臓中の標的ｍＲＮＡレベルについてＲＴ−ＰＣＲ法により評価しノーザンブロット分析により確認した。そしてその動物を、グルコースレベル、コレステロールレベルおよび脂質レベルについてＨＰＬＣ分離法により評価し、トリグリセリドレベルおよび肝臓酵素レベルについて評価した（ＬａｂＣｏｒｐ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡが実施した）。一日経口用量２０ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンにより処理したマウスからのデータもまた、比較のための表に示している。この比較研究の結果を表９に示す。データは、生理食塩水コントロールに対して正規化している。

【0274】

（表９）
（ＡｐｏＥノックアウトマウスにおけるアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡレベル、コレステロールレベル、グルコースレベル、脂質レベル、トリグリセリドレベルおよび肝臓酵素レベルに対する、ＩＳＩＳ １４７７６４処理の効果）

【0275】

【表9】

ＩＳＩＳ １４７７６４による処理が、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおいて、グルコースおよびコレステロールならびに調査したすべてのリポタンパク質（ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）を低下させたことが、これらのデータから明らかである。さらに、これら
の減少は、アポリポタンパク質Ｂタンパク質レベルおよびアポリポタンパク質ＲＮＡレベルの両方の減少と相関した。このことは、アンチセンス作用機構を示す。肝臓効果レベルの有意な変化は観察されなかった。このことは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドが、いずれの処理群に対しても毒性ではなかったことを示す。
（配列表）

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

【表17】

【表18】

【表19】

【表20】

【表21】

【表22】

【表23】

【表24】

【表25】

【表26】

【表27】

【表28】

【表29】

【表30】

【表31】

【表32】

【表33】

【表34】

【表35】

【表36】

【表37】

【表38】

【表39】

【表40】

【表41】

【表42】

【表43】

【表44】

【表45】

【表46】

【表47】

【表48】

【表49】

【表50】

【表51】

【表52】

【表53】