特許 5799375 新規酵素、該酵素の製造方法、ならびにその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5799375

(24)【登録日】2015年9月4日

(45)【発行日】2015年10月21日

(54)【発明の名称】新規酵素、該酵素の製造方法、ならびにその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/26 20060101AFI20151001BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20151001BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20151001BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20151001BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20151001BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20151001BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20151001BHJP

   C12P 19/14 20060101ALI20151001BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/26 A

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/20 A

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   C12P19/14 Z

【請求項の数】7

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2011-20681(P2011-20681)

(22)【出願日】2011年2月2日

(65)【公開番号】特開2012-157321(P2012-157321A)

(43)【公開日】2012年8月23日

【審査請求日】2013年11月22日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-1024

(73)【特許権者】

【識別番号】591108178

【氏名又は名称】秋田県

(72)【発明者】

【氏名】金子 隆宏

【審査官】 菅原 洋平

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６２−１０４５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０３−１２３４９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−０３７７８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Database GenBank [online], Accession No.YP_855379, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/117620706?sat=15&satkey=55375> 28-May-2010 uploaded, [retrieved on 2014-11-18] Seshadri,R.et al. Definition:alpha-amylase [Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966]

【文献】 Database GenBank [online], Accession No.P41131, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/728848?sat=14&satkey=5189906> 10-AUG-2010 uploaded, [retrieved on 2014-11-18] Chang,M.C.et al. Definition:RecName: Full=Alpha-amylase; AltName: Full=1,4-alpha-D-glucan glucanohydrolase; Flags: Precursor

【文献】 Sun, H., et al., "Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes." Appl Biochem Biotechnol. 2010; 160(4), pp988-1003. Review.

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ ９／２６

Ｃ１２Ｐ １９／１４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

図１に示すアミノ酸配列を有する新規生澱粉分解酵素。

【請求項2】

請求項１記載の酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ。

【請求項3】

請求項２記載の遺伝子ＤＮＡをその一部に含んでなるベクターＤＮＡ。

【請求項4】

請求項３記載のベクターＤＮＡを含有する形質転換体。

【請求項5】

請求項１に記載の酵素生産能を有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ属５０−２株。

【請求項6】

請求項４記載の形質転換体あるいは請求項５記載のＡｅｒｏｍｏｎａｓ属５０−２株またはそれらの変異株を培養すること、もしくはその培養物から請求項１記載の新規酵素を採取することを特徴とする該酵素の製造方法。

【請求項7】

請求項１から６に記載の酵素、ＤＮＡ、菌株、培養物あるいはその抽出物、もしくはこれらの混合物を用いることを特徴とする変性澱粉の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生澱粉を適度に部分加水分解するための新規酵素、および該酵素の効率的な製造方法ならびにその利用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

酵素を用いて澱粉を加水分解する技術において、エネルギーの節約や蒸煮臭の回避のため、澱粉を液化、糊化、α化などの前処理をすることなく、直接作用させて分解しうる酵素（生澱粉分解酵素）の開発が近年盛んになっている。既に、アスペルギルス属、リゾープス属、カララ・パラドキサ（Ｃｈａｌａｒａ ｐａｒａｄｏｘａ）等のカビ、放線菌およびバチルス属、ストレプトコッカス等の細菌が生澱粉分解酵素を生産することが知られている（非特許文献１）。

【0003】

しかしながら、上記の生澱粉分解酵素は、何れのものも澱粉を完全に糖化し、澱粉から糖を得んがために開発されたものである。そのため、澱粉を生のまま部分加水分解し、その粉体としての物性を改変させるのにはこれらの酵素は不向きである。

【0004】

元来澱粉は糖化物としての使用に比して、粉体として食品に利用されることの方がおおい。その粉体としての物性を改変させるには澱粉粒に物理的にダメージを与える、酢酸や燐酸などで化学修飾をする、などがあるが、酵素反応による粉体の物性改善例は未だ無い。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｕｅｄａ，他、Ｓｔａｒｃｈ，３２（４），１２２−１２５（１９８０）， Ｈａｙａｓｈｉｄａ，他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６（７），１９４７−１９５０（１９８２）， 石神ら、澱粉科学、３２（２），１３６−１４１（１９８５）， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６（８），２１０７−２１１５（１９８２）， 溝上ら、農化、５１（５），２９９−３０７（１９７７）， Ｋａｎｅｋｏ，他、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９（６），１０７３−１０８１（２００５）， Ｇｏｙａｌ，他、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３７（７），７２３−７３４（２００５）， Ｇａｎｇａｄｈａｒａｎ，他、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５８（３），６５３−６６２（２００９）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の課題は、α化など前処理されていない生の澱粉粒に作用して部分加水分解を行い、かつ粉体としての形状は残しつつ、その物性のみを改変し得る生澱粉分解酵素、および該酵素の有効な製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、澱粉がα化されることのない５５℃前後より低い、具体的には４０℃近辺で生澱粉粒にきわめてよく作用して部分加水分解をおこない、同様に５０℃程度の熱処理で完全に失活しうる生澱粉分解酵素を土壌検索菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属５０−２株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２４）が生産することを見出した。

【0008】

さらには該菌株より生澱粉分解酵素遺伝子をクローニングし塩基配列を決定した（非特許文献２）。これよりプラスミドを構築し、形質転換体（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２５）を得ることで該酵素を効率よく製造する技術を完成した。

【非特許文献2】ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ５９３７４２

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、澱粉をα化など前処理することなく、生の澱粉粒のまま部分加水分解せしめ、かつ粉体としての形状は残しつつ、その物性のみを改変し得る生澱粉分解酵素、および該酵素の有効な製造方法が提供される。これにより澱粉を利用した食品の製造分野に大きく貢献できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の酵素のアミノ酸配列

【図2】本酵素の生産菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属５０−２株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列

【図3】本酵素の大腸菌発現用プラスミドｐＫＫ５０−２の模式図

【図4】本酵素の温度の推移に伴う相対活性の変化

【図5】本酵素の温度の推移に伴う残存活性の変化

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明の生澱粉分解酵素および該酵素の製造方法の好ましい態様を以下に述べるが、この記載は本発明を何ら制限するものではない。

【0012】

先ず本発明を実施するために秋田県潟上市の土壌から請求項１に記載の新規生澱粉分解酵素を生産し得る１菌株を見出した。本菌株は後述の実施例６に記載の通りその１６ＳｒＤＮＡの塩基配列(図２)よりＡｅｒｏｍｏｎａｓ属と同定され、また、請求項１に記載の新規酵素を生産するＡｅｒｏｍｏｎａｓ属は他には明らかにされていないことなどから新菌種であるとみとめられた。本菌株は５０−２株と命名され、独立法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターへ寄託されており、その寄託番号はＮＩＴＥ Ｐ−１０２４である。これを請求項５とする。

【0013】

なお、本菌株のほか、請求項１に係わる本発明の酵素を生産する能力を有する限り、例えば本菌株をニトロソグアニジンやＵＶ処理することによって生じた突然変異株であっても、あるいは遺伝子操作等によって得られた変異株であっても本発明に包含される。また、変異操作により、例えばプロモーター部位、ＳＤ配列、転写開始点、あるいはシグナルペプチドなどに異常を来し、外見上該酵素をほとんど生産しない場合であっても、その変異操作の対象となったものが本菌株に由来するものであれば、これも本発明に包含されるものである。

【0014】

請求項２に係わる本発明の塩基配列は、生澱粉分解酵素生産能を有する遺伝子供与体微生物から、遺伝子増幅（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ 非特許文献３、以下単にＰＣＲ）により得られるＤＮＡフラグメントを解析することにより明らかとなる。

【非特許文献3】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，１４．２−１４．４

【0015】

すなわち、ＧｅｎＢａｎｋなどの検索システムより、目的とする生澱粉分解酵素と、その塩基配列がきわめて類似すると思われるものをひとつ、もしくは複数選抜し、それらに共通する領域からＰＣＲ用プライマーを設定し、コロニーダイレクトＰＣＲ（非特許文献４）で得られるＤＮＡフラグメントを解析する。

【非特許文献4】ＰＣＲ Ｔｉｐｓ 秀潤社 １０２−１０８ページ

【0016】

ついでインバースＰＣＲ（非特許文献５）を行い、構造遺伝子のうち、コロニーダイレクトＰＣＲでは解析不充分であった部分の塩基配列を明らかにする。

【非特許文献5】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５（５），１０５４−１０６３、（２００１）

【0017】

コロニーダイレクトＰＣＲ及びインバースＰＣＲ双方の解析結果を合わせ、構造遺伝子の全塩基配列が明らかとなる。

【0018】

遺伝子の増幅はＤＮＡフラグメントが正確に増幅されるものであればいずれの方法でも良い。本発明においては、いわいるＰＣＲと呼ばれる手段が好ましく、なかでも上記非特許文献１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，１４．２−１４．４ページ記載の方法が標準的ではあるが、これに限定されるものではない。また、コロニーダイレクトでなく、遺伝子供与体からテンプレートＤＮＡを精製してＰＣＲを行う従来法でも充分に目的は達しうる。

【0019】

インバースＰＣＲにおいても種々の方法、例えば非特許文献６などがあり、構造遺伝子のうち解析不充分であった塩基配列を補いうるものであればいずれの方法でも良く、さらにコロニーダイレクトＰＣＲのみ、あるいは遺伝子供与体からテンプレートＤＮＡを精製して行う従来法のＰＣＲのみで構造遺伝子の塩基配列を充分に解析しうるものであれば、インバースＰＣＲの行程は必須ではない。

【非特許文献6】Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８６（５）４３４−４３９（１９９８）

【0020】

さらに目的とするＤＮＡフラグメントが解析に足りる量を確保できるのであれば、遺伝子増幅自体不要であり、たとえばショットガンクローニング法、ＤＮＡライブラリーからのプローブによるクローニング法などであっても本発明の請求項２は実現しうる。

【0021】

ＤＮＡフラグメントの解析方法は、オートシーケンサーを用いたダイデオキシ法によるものが既に一般的で、簡便であるが、手分析によるダイデオキシ法でも本発明は遂行可能であり、マクサムギルバート法での解析であっても何ら問題はない。さらには、これら以外の方法であってもＤＮＡの塩基配列を決定しうる方法であればいずれのものでも良い。

【0022】

請求項３に係わる本発明のベクターＤＮＡは、大腸菌を宿主として請求項２の遺伝子ＤＮＡを安定して高発現させるための組換えプラスミドであって、市販（ファルマシア社 非特許文献７）の自立複製型高発現ベクターｐＫＫ２２３−３を基本骨格とし、これの有する発現プロモーター（ｔａｃプロモーター）の下流に上記請求項２の遺伝子ＤＮＡを挿入してなるベクターＤＮＡである。

【非特許文献7】ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｍ７７７４９

【0023】

すなわち該ベクターは、大腸菌用の複製起点としてｐＢＲ３２２に由来するＣｏｌＥ１のｏｒｉを有し、選択マーカーとしてＡｍｐ^ｒを、大腸菌高発現用にｔａｃプロモーターを有する。

【0024】

上記プロモーターは大腸菌で発現するものであれば、ｔｒｐ、ｌａｃなど何れのものでも使用可能であり、それ以外にもバクテリアなど細菌類に由来する数多くのプロモーターが大腸菌で発現することが知られており、これらのものも使用が可能である。また、請求項５のＡｅｒｏｍｏｎａｓ属５０−２株が大腸菌などと同様のグラム陰性の細菌であることから、本菌株自体のプロモーターでも充分な大腸菌発現が期待される。

【0025】

また、大腸菌での選択マーカーはＡｍｐ^ｒ以外にもＫｍ^ｒやＣｍ^ｒなどであっても目的は達せられ、それ以外のもの、例えば栄養要求生によるものであっても、形質転換体を選抜しうるものであれば、本発明に於いて選択マーカーとして使用しても何ら問題はない。

【0026】

さらに複製起点ｏｒｉは上述の通りｐＢＲ３２２に由来するものであるが、ｐＵＣ１８、ｐＡＣＹＣ１７７などのプラスミド、あるいはラムダファージ、Ｍ１３ファージなどのものでも代用可能である。またこれらファージ自体をベクター骨格として使用しても請求項３は実現しうるものである。

【0027】

また、後述の通り大腸菌以外の生細胞を宿主として用いるのであれば、その宿主に応じたベクター骨格、発現プロモーター、選択マーカーなど使用すればよい。

【0028】

請求項４に係わる本発明の形質転換体は、請求項２の遺伝子ＤＮＡ上にコードされた生澱粉分解酵素活性を酵素蛋白として発現させるために、請求項３のベクターをＥ．ｃｏｌｉの細胞内に移入してなる大腸菌組換え体である。

【0029】

すなわち該形質転換体は大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉの実験室株ＤＨ５α（Ｆ⁻，Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５，Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ｄｅｏＲ，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｈｓｄＲ１７（ｒ_Ｋ⁻， ｍ_Ｋ^＋），ｐｈｏＡ，ｓｕｐＥ４４，λ⁻，ｔｈｉ−１，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｌＡ１）を宿主細胞として、請求項３のベクターを塩化カルシウム法（非特許文献８）により移入してのち、アンピシリン耐性を指標として選抜する。

【非特許文献8】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ １ｓｔ ｅｄｔ．２４９ｐｐ

【0030】

この場合、宿主はＤＨ５α以外であっても、たとえばＨＢ１０１、ＪＭ１０９などの実験室株、あるいは野生の大腸菌を使用した場合であっても請求項４に含まれるものである。また本発明の課題は「請求項１に係わる新規酵素を提供すること」であり、請求項３のベクターＤＮＡが保持され、請求項１の酵素製造に係わるのであれば、大腸菌以外の宿主、例えば枯草菌、放線菌、酵母、糸状菌などの微生物類、イネ、トマト、トウモロコシなど植物細胞、カイコ、ラットなど動物細胞、などによる形質転換体であっても請求項４は達せられる。

【0031】

また、請求項３の選択マーカーとしてＡｍｐ^ｒ以外の薬剤耐性遺伝子を用いるのであればそれに応じた薬剤感受性の宿主を、また栄養要求性マーカーを用いて選択するのであればそれに応じた栄養要求株のものを宿主細胞として代用可能である。

【0032】

ベクターの移入方法も、塩化カルシウム法が一般的ではあるが、プロトプラスト法（非特許文献９）、リチウム法（非特許文献１０）、ミニセル細胞融合法（非特許文献１１）、エレクトロポレーション法（非特許文献１２）、その他の方法でも本発明は遂行可能であり、宿主細胞内にベクターを移入可能であればいずれの方法でも良い。

【非特許文献9】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５（１９７８），１９２９−１９３３

【非特許文献10】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３（１），１６３−１６８（１９８３）

【非特許文献11】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６（９），３２９５−３２９７（１９８６）

【非特許文献12】Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉ−２２

【0033】

移入して後の選抜方法も、アンピシリン以外の薬剤に関わる宿主ベクター系を使用したのであればそれぞれに応じた薬剤を、栄養要求性の宿主ベクター系であればそれぞれの要求する栄養素を使用し、選抜の指標にする。

【0034】

請求項１に係わる本発明の生澱粉分解酵素は請求項４の形質転換体、あるいは請求項５のＡｅｒｏｍｏｎａｓ属５０−２株を培養し、その培養上清あるいはその菌体破砕物より得られる。これを請求項６とする。

【0035】

この場合、形質転換体の培養は、それぞれの宿主細胞の培養に用いられる培地並びに培養条件に従って行えばよいが、大腸菌ＤＨ５αの場合は通常ＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％）を用いて３７℃での振とう培養で行われる。また請求項５の培養においては培地中に澱粉質あるいはこれらの誘導体を含むことが好ましく、中性培地（可溶性澱粉１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、燐酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％）を用いて、２８℃での静置培養が最適である。

【0036】

また、形質転換体の培養の際、ｔａｃ、ｌａｃなどラクトースオペロンに係わるプロモーターでの発現では、培養途中で適宜ＩＰＴＧの添加が望まれる。さらに、大腸菌、枯草菌、酵母などの単細胞の宿主による請求項６の実施ではジャーファーメンターなどによる大型培養も有効である。

【0037】

さらに形質転換体の培養においては、形質転換体の選抜に用いた薬剤を培養の際の培地にも添加する、あるいは栄養要求性に対応する栄養素を減ずる、なども好ましくはあるが、これら薬剤や栄養素などを加減せずとも本発明に差し障りはない。例えば、大腸菌−Ａｍｐ^ｒの宿主ベクター系の場合、培地１ｍｌあたりにアンピシリン５０μｇ程度を添加することがこれに相当する（後述〔実施例４〕の「（１）粗酵素液の調製」参照）。

【0038】

本発明の新規酵素は、上記培養液あるいはその菌体破砕物を、例えば濾過や遠心分離などの固―液分離手段により固形物を除いた粗酵素液として得られるが、目的に応じて澱粉吸着法やゲル濾過法などの部分精製など行えば良く、それ以外にも硫安沈殿法、アルコールその他の有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、逆相クロマトグラフ法などの一般的な手法に従って精製すればさらに望ましく、それぞれに応じてカラムを用いての精製やバッチ法での処理などが可能である。

【実施例】

【0039】

以下に実施例を示すことで本発明を詳細に説明するが、使用した菌株、培地、培養方法、プラスミド、プライマー、その他試薬類、実施方法などは一例として挙げたものであり、本発明を実施できるものであればこれらに限定されるものではない。

【0040】

〔実施例１〕該遺伝子の塩基配列の決定
該酵素をコードする遺伝子は下記の通りクローニングし、その塩基配列を決定した。

【0041】

即ち、該生澱粉分解酵素を生産する土壌検索菌が、その１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の相同性からＡｅｒｏｍｏｎａｓ属と推定された（後述の実施例６参照）ことから、同じくＡｅｒｏｍｏｎａｓ属の生産するアミラーゼのうち、その塩基配列が既知のもの４種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ７９６６（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ００８５７０）、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ＭＣＣ−１（Ｌ１９２９９）、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ＪＭＰ６３６（Ｌ７７８６６）、Ａ．Ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ Ａ４４９（ＮＣ００９３４８））のコンセンサス配列より、ＰＣＲプライマー（ＷＹＴＧＧＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＡＹＣＡＲＣＣＢＧＴＣＡＧＣＴ 及び ＲＴＣＡＹＴＧＣＣＮＳＹＣＡＲＧＡＫＧＴＴＧＣＡＧＴＡＣＴＣ）を推定した。

【0042】

本プライマーを用いて５０−２株より定法通りコロニーダイレクトＰＣＲ（アニーリング温度５２℃、２５サイクル）を行ったところ、約１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。本フラグメントの塩基配列をオートシーケンサーで解析した（解析結果１）。

【0043】

他方、５０−２株の染色体ＤＮＡをＳｍａＩあるいはＳｐｈＩで完全に加水分解した後、これをＴ４リガーゼでセルフライゲーションさせ、環状化した。このうちＳｍａＩでの反応液をテンプレート溶液とした場合、ＰＣＲプライマー（ＴＧＣＡＣＧＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＴ 及び ＴＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＧＣＴ）を用いてインバースＰＣＲ（アニーリング温度６０℃、２５サイクル）を、ＳｐｈＩでの反応液をテンプレート溶液とした場合、ＰＣＲプライマー（ＴＣＡＴＡＧＧＴＧＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＣＧＡＡＧＣＧＡＴ 及び ＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＧＡＴＡ）を用いてインバースＰＣＲ（アニーリング温度５３℃、２５サイクル）を行ったところ、それぞれ約１．４ｋｂｐ及び１．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。本フラグメントの塩基配列をオートシーケンサーで解析した（解析結果２）。

【0044】

解析結果１及び２より、開始コドンＡＴＧから終止コドンＴＡＧまでの２３５２塩基がＭｅｔから始まる本酵素７８３アミノ酸残基をコードしていることを見出した。該遺伝子の塩基配列を日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）へ登録した（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ５９３７４２）。

【0045】

〔実施例２〕発現プラスミドの構築
該酵素遺伝子を含んでなる、Ｅ．ｃｏｌｉの高発現プラスミドは以下の通り構築した。

【0046】

即ち、該酵素遺伝子の上流に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを持つプライマー（ＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＴＴＣＧ）及びその下流に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを持つプライマー（ＡＧＧＴＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ）を用いて５０−２株より定法通りコロニーダイレクトＰＣＲ（アニーリング温度４５℃、２５サイクル）を行ったところ、本生澱粉分解酵素の構造遺伝子を含み、上流側に制限酵素ＥｃｏＲＩサイト、下流側に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを持つ約２．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメント（ＯＲＦフラグメント）を得た。

【0047】

また、Ｅ．ｃｏｌｉでの高発現のため市販の発現プラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製、ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ７７７４９）を使用した。これはｔａｃプロモーター、ｒｒｎＢターミネーター、及びマルチクローニングサイトを含む約４．６ｋｂｐのプラスミドである。

【0048】

この発現プラスミドｐＫＫ２２３−３のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ上に、本酵素の構造遺伝子をコードするところの、先に述べたＯＲＦフラグメントを挿入し、本酵素高発現用Ｅ．ｃｏｌｉのベクターｐＫＫ５０−２約７．０ｋｂｐを得た。該ベクターの模式図を図３に示す。

【0049】

〔実施例３〕形質転換体の獲得
生澱粉分解酵素生産性の形質転換体は以下の通り獲得した。即ち、高発現ベクターｐＫＫ５０−２を塩化カルシウム法（前述）にしたがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αへ導入した。該形質転換体を独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターへ寄託した。（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２５）

【0050】

〔実施例４〕酵素の製造
該形質転換体から、以下の手法を用いて粗酵素液を調製し、本酵素の製造を行った。

【0051】

［酵素活性の測定法］
酵素活性の測定は、特に断らない限り次の方法で実施した。
すなわち、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む１％生澱粉（通常では粳種のトウモロコシ澱粉）懸濁液０．５ｍｌに酵素液０．０５ｍｌを加え、ｐＨ６．０、４０℃で一定時間（通常では１５分間）反応させた後、生じた還元力をソモギー・ネルソン法にて定量した。１分間にマルトース１μｍｏｌに相当する還元力を生じる酵素力価を１Ｕ（単位）とした。
温度の推移に伴う酵素の相対活性は、上記の方法で測定の際、その反応温度のみを２５℃から５０℃の各温度に変更したものである。
また、ｐＨの推移に伴う酵素の相対活性は、上記の方法で測定の際、使用する緩衝液を、ｐＨ４．０〜６．０の範囲では酢酸緩衝液に、ｐＨ５．０〜９．０の範囲では燐酸緩衝液に変更したものである。
一方、温度の推移に伴う酵素の残存活性は、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む酵素液を、所定の温度で３０分間加温処理後、残存する活性を上記の方法にて測定したものである。
さらに、ｐＨの推移に伴う酵素の残存活性は、所定のｐＨを示す１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０は酢酸緩衝液、ｐＨ５．０〜９．０はリン酸緩衝液）及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む酵素液を、３５℃で６０分間加温処理後、残存する活性を上記の方法にて測定したものである。

【0052】

（１）粗酵素液の調製
該形質転換体を、抗生物質アンピシリンを培地１ｍｌあたり５０μｇ含むＬＢ培地（前述）を用いて、３７℃で１６時間培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１００μＭとなるよう本培養液に加え、さらに４時間培養した。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分間）し、培養上清と菌体とに分けた。菌体は得られた培養上清と同量の蒸留水に懸濁後、超音波処理をし、溶菌せしめた。この培養上清及び溶菌液はそれぞれ１．４５Ｕ／ｍｌ及び０．１３７Ｕ／ｍｌの酵素活性を示した。この結果から、グラム陰性の桿菌であるＡｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の本菌体外酵素は、同じくグラム陰性の桿菌である宿主大腸菌に於いても効率よく菌体外分泌しており、菌体内の残存量は僅かであることがわかった。以降、この培養上清を粗酵素液として用いた。

【0053】

（２）酵素の精製
上記のようにして得られた粗酵素液はブチルトヨパールカラム（１Ｍ硫安で吸着後、１０ｍＭ燐酸緩衝液で溶出）での濃縮、次いで、トヨパールＨＷ５５（Ｓ）によるゲル濾過を行い精製した。

【0054】

〔実施例５〕酵素の性質
実施例４で得られた精製酵素の性質について検討した。

【0055】

（１）分子量
実施例４の精製酵素について、Ｌａｅｍｍｌｉ法（非特許文献１３）に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。分子量マーカーはファルマシア社製のものを使用した。
泳動終了後、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｇ−２５０で染色したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的に均一な酵素蛋白が得られ、本酵素の分子量は約８０ｋＤａであることが明らかとなった。

【非特許文献13】Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０）

【0056】

（２）至適温度
実施例４の［酵素活性の測定法］に従い、温度の推移に伴う相対活性の変化を測定したところ、温度の上昇と共に緩やかに活性が上昇し、４０℃付近で最も高い活性が観察された後は緩やかに下降した。この結果から、本酵素の至適温度は４０℃付近であることが明らかとなった。（図４）

【0057】

（３）至適ｐＨ
実施例４の［酵素活性の測定法］に従い、ｐＨの推移に伴う相対活性の変化を測定したところ、ｐＨの上昇と共に活性が上昇し、６．０付近で最も高い活性が観察され、その後は緩やかに下降した。このことから、本酵素の至適ｐＨは６．０付近であることが明らかとなった。

【0058】

（４）温度安定性
実施例４の［酵素活性の測定法］に従い、温度の推移に伴う残存活性の変化を測定したところ、４０℃で前処理したものは未処理のものとほぼ同等（１００％）であり、２５℃、３０℃、３５℃のものにおいても１００％に近い残存活性を示した。一方、前処理温度が４０℃を超えるとその残存活性は低下し、４５℃では３０％程度しか示さず、５０℃では残存活性は全くなかった。このことから、本酵素は４０℃以下で安定であり、５０℃以上では完全に失活することが明らかとなった。（図５）

【0059】

（５）ｐＨ安定性
実施例４の［酵素活性の測定法］に従い、ｐＨの推移に伴う残存活性の変化を測定したところ、ｐＨ４．０で前処理したものは低い残存活性であったが、ｐＨの上昇と共に残存活性も上昇し、ｐＨ５．０〜６．０における相対残存活性は未処理のものとほぼ同等（１００％）であった。その後は僅かながら下降したものの、ｐＨ９．０においても８０％程度の残存活性を示した。この結果から、本酵素はｐＨ５．０〜６．０で最も安定であり、酸性側に比べアルカリ性側でより安定であることが明らかとなった。

【0060】

（６）各種澱粉粒への相対活性
実施例４の［酵素活性の測定法］において、反応基質を各種植物由来の生澱粉に変更した場合の、それぞれの活性を測定し、トウモロコシ澱粉（粳種）の酵素力価を１００とした場合の各種澱粉の相対活性を算出した。結果を表１に示す。

【0061】

【表1】

【0062】

表２から明らかなように、本発明の生澱粉分解酵素は小麦澱粉に最もよく作用し、次いで米澱粉、餅米澱粉などによく作用した。また、モチトウモロコシ澱粉に対しては、粳種のトウモロコシ澱粉の約１．５倍、よく作用した。一方、馬鈴薯澱粉や甘藷澱粉などの芋類の澱粉にも作用を示した。このことから、本酵素は種々の生澱粉に作用することが明らかとなった。

【0063】

（７）各種金属化合物の添加効果
実施例４の［酵素活性の測定法］において、実施例４の（２）の精製酵素を５ｍＭのＥＤＴＡで一夜透析したものを用いたこと、塩化カルシウムの代わりに表２に示す各金属化合物（いずれも金属イオンとして１０ｍＭ）を用い、それぞれ３０分間反応させたこと、並びに酢酸緩衝液の代わりに５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いたことの他は、同様の条件で測定した。塩化カルシウム添加の際の酵素力価を１００とした場合の、それぞれの相対活性を算出した。

【0064】

【表2】

【0065】

表２から明らかなように、Ｆｅ^２＋では活性がわずかに上昇したが、それ以外の添加では活性は低下傾向にあり、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｎｉ^２＋の金属イオンではほとんど酵素活性を示さなかった。また金属化合物を全く加えない場合、ごく僅かながら活性が示された。

【0066】

（８）Ｎ末端アミノ酸配列
実施例４の精製酵素を実施例５の（１）と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロットによりＰＶＤＦ膜へ転写し、これをＣＢＢ染色した。染色により生じたバンド部分のＰＶＤＦ膜を切り取り、プロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所）にて解析した。解明したアミノ酸配列はＥＧＶＭＶＨＬＦＱＷＫＦＮＤ−であった。
この結果から、本酵素蛋白質のＮ末端は、図１に記載のアミノ酸配列２５番目の残基からなり、１から２４番目まではシグナルペプチドに相当することが明らかとなった。

【0067】

〔実施例６〕酵素生産菌の同定
実施例１で用いた微生物５０−２株について、その遺伝的情報により微生物の同定を行った。すなわち、秋田県潟上市の土壌からの検索菌である５０−２株を、前述の中性培地で２８℃にて２日間静置培養後、集菌し、得られた菌体より斉藤・三浦の方法（非特許文献１４）により染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、ＰＣＲにより１６ＳｒＤＮＡの１５３７ｂｐ領域を増幅した（非特許文献１５）。この増幅された塩基配列をシーケンシングし、図２に記載の５０−２株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を得た。

【非特許文献14】Ｈ．Ｓａｉｔｏ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０（７２），６１９−６２９（１９６３）

【非特許文献15】Ｋ． Ｍｏｒｉ，他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４７（１），５４−５７（１９９７）

【0068】

得られた１６ＳｒＤＮＡの塩基配列をＢＬＡＳＴ検索した結果、上位１００位のうち９８位の１菌株がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属であり、他の９９株すべてはＡｅｒｏｍｏｎａｓ属であった。そのうち上位６０位までが該５０−２株と９９％以上の相同性であり、６１位のＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（ＡＹ９１０８４４）とは９８％の相同性であった。この上位６０位の内訳は、Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ（ＡＹ９８７７４６）１株、Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ（ＧＵ２０５２００）１株、Ａ．ｍｅｄｉａ（ＡＹ９８７７７３、ＧＵ１７４５０４、ＦＪ９４０８３１、他）８株、種の同定まで至っていないもの（ＧＵ５６６３０５、ＦＭ９５７４６０、ＡＹ９８７７７０、他）１３株、残り３７株がＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（ＧＱ１８４１４８、ＤＱ２０７７２８、ＣＰ０００４６２、ＦＪ５１５７７６、他）であり、さらに上位１０位まではすべてＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａであった。よって該５０−２株はＡｅｒｏｍｏｎａｓ属に分類され、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａに最も近縁と考えられる。

【0069】

本菌株すなわちＡｅｒｏｍｏｎａｓ属５０−２株を中性培地（前述）１ｍｌに１白金耳植菌し、２８℃で１夜静置培養した。これを前培養液として中性培地１００ｍｌへ植菌し、２８℃下に３日間静置し、本培養を行った。

【0070】

この本培養液を遠心分離機にて除菌し、得られた上清を〔実施例４〕の「（２）酵素の精製」と同様に処理して精製酵素を回収した。本精製酵素を〔実施例５〕に準じてその性質を検討したところ、〔実施例５〕と同様の結果を得た。

【産業上の利用可能性】

【0071】

本発明によれば、澱粉をα化など前処理することなく、生の澱粉粒のまま部分加水分解せしめ、かつ粉体としての形状は残しつつ、その物性のみを改変し得る生澱粉分解酵素、およびその有効な製造方法が提供される。これにより種々変性澱粉が得られ、澱粉を利用した食品の製造分野に大きく貢献できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】