特許 5799395 血液中の浮遊癌細胞を捕捉できるマイクロチップ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5799395

(24)【登録日】2015年9月4日

(45)【発行日】2015年10月28日

(54)【発明の名称】血液中の浮遊癌細胞を捕捉できるマイクロチップ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20151008BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20151008BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20151008BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20151008BHJP

   G01N 33/545 20060101ALI20151008BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20151008BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 521

   C12M1/00 A

   C12M1/34 F

   G01N37/00 101

   G01N33/545 Z

   G01N33/574 D

【請求項の数】1

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2011-164897(P2011-164897)

(22)【出願日】2011年7月28日

(65)【公開番号】特開2013-29391(P2013-29391A)

(43)【公開日】2013年2月7日

【審査請求日】2014年7月2日

(73)【特許権者】

【識別番号】000236920

【氏名又は名称】富山県

(73)【特許権者】

【識別番号】305060567

【氏名又は名称】国立大学法人富山大学

(74)【代理人】

【識別番号】100114074

【弁理士】

【氏名又は名称】大谷 嘉一

(72)【発明者】

【氏名】大永 崇

(72)【発明者】

【氏名】小幡 勤

(72)【発明者】

【氏名】高田 耕児

(72)【発明者】

【氏名】村口 篤

(72)【発明者】

【氏名】岸 裕幸

(72)【発明者】

【氏名】嶋田 裕

(72)【発明者】

【氏名】塚田 一博

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−０４６８５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５４４０４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−０３５４２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０６３４１６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｇ０１Ｎ ３３／５４５

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

Ｇ０１Ｎ ３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１個の重合性二重結合を有しカルボキシル基および／またはエポキシ基を有する単量体Ｚと、１個の重合性二重結合を有する単量体Ｚ以外の単量体Ｘと、架橋反応可能な２個以上の重合性二重結合を有する単量体Ｙと、重合体Ｂとからなる混合物を重合固化した重合体組成物からなるマイクロチップであって、
当該重合体組成物の表面又は内部に流体を通すことができるミクロな構造を有する流路を有し、
前記流路は表面の少なくとも一部に癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体が固定され、
前記単量体Ｘは、それを単独で重合した時のガラス転移温度が１０℃以下であり、
前記重合体Ｂは、コア・シェル型の高分子微粒子であり、
前記流路は深さが５０〜１５０μｍであり、流路底面に深さ以下の高さを有する突起を複数個配してあり、隣接する突起間の最小の間隔は血液細胞の流れが阻害されない５０〜１００μｍであり、前記の流路底面に配した突起がマイクロ柱であり、当該マイクロ柱は血液中の浮遊癌細胞を捕捉できる外接円直径が５０〜２００μｍであることを特徴とする血液中の浮遊癌細胞の捕捉用マイクロチップ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は血液中の浮遊癌細胞を単離又は検出するための機能性マイクロチップに関する。

【背景技術】

【0002】

癌の治療や研究において、癌細胞を直接解析する重要性が認識されてはいるものの、その採取は大きな身体的負担が伴うことなどから一般に容易ではない。
一方、近年の研究により、癌の初期段階から末梢血中に癌細胞が存在することが明らかにされており、このような血中の細胞を単離できれば癌細胞を容易に採取できる。
しかし血中の癌細胞濃度は極めて低いため、通常の分離技術では血液が大量に必要となり、現状では実質的に癌細胞の単離は不可能となっている。
非特許文献１は、シリコンウェハを加工したマイクロチップの流路に抗体を固定化し、数ｍｌの血液を流して癌細胞を捕捉する技術を開示する。
しかし、同文献に開示するマイクロチップはシリコンウェハを加工したものであり、加工手順が複雑で高価となること、不透明で透過観察ができないこと、脆いため使用範囲が限定されることなどから、実用性に劣るものであった。
また、特許文献１に金薄膜表面に抗体を固定したマイクロチップを開示するが、やはり構造が複雑で高価であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１０−３８６２８号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology , Sunitha Nagrath et al , Nature Vol.450(2007) , P.1235

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、血液中の浮遊癌細胞の単離又は検出に優れ、生産性が高く安価である樹脂製のマイクロチップの提供を目的とする。
特に血中浮遊癌細胞を単離及び検出するのに有効な樹脂製のマイクロチップの提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明に係るマイクロチップは、１個の重合性二重結合を有しカルボキシル基および／またはエポキシ基を有する単量体Ｚと、１個の重合性二重結合を有する単量体Ｚ以外の単量体Ｘと、架橋反応可能な２個以上の重合性二重結合を有する単量体Ｙと、重合体Ｂとからなる混合物を重合固化した重合体組成物からなるマイクロチップであって、当該重合体組成物の表面又は内部に流体を通すことができるミクロな構造を有する流路を有し、前記流路は表面の少なくとも一部に癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体が固定され、前記単量体Ｘは、それを単独で重合した時のガラス転移温度が１０℃以下であり、前記重合体Ｂは、コア・シェル型の高分子微粒子であり、前記流路は深さが５０〜１５０μｍであり、流路底面に深さ以下の高さを有する突起を複数個配してあり、隣接する突起間の最小の間隔は血液細胞の流れが阻害されない５０〜１００μｍであり、前記の流路底面に配した突起がマイクロ柱であり、当該マイクロ柱は血液中の浮遊癌細胞を捕捉できる外接円直径が５０〜２００μｍであることを特徴とする。
本発明は、マイクロ流路に直接的に癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体を固定したものである。

【0007】

本発明において、抗体と結合する水溶性ポリマーをマイクロチップの流路表面に固定化（共有結合）してもよい。
本発明において、重合体組成物の表面又は内部に流路を有すると表現したのは、重合体組成物の表面にマイクロ流路を形成し、このマイクロ流路の上に透明樹脂プレート又はガラスカバー等の蓋体を重ね合せて血液を送り込む流路を形成してもよく、表面にマイクロ流路を形成した重合体組成物を２つ以上重ね合せて二次元，三次元の立体的な流路を形成してもよい趣旨である。
このようなマイクロチップは光透過性を有し、透過観察ができる。

【0008】

血中に浮遊する癌細胞の表面に存在する抗原に反応する抗体を固定するための、カルボキシル基を有する水溶性のポリマーは、ポリアクリル酸，ポリアクリル酸共重合体，ポリメタクリル酸，ポリメタクリル酸共重合体等が好ましい。
そこで、本発明に係る重合体組成物（樹脂）にカルボキシル基と反応する官能基を有する単量体Ｚを含有するようにした。
単量体Ｚは、フリーラジカル重合により重合する１個の重合性二重結合を有するのが好ましく、重合体組成物中に単量体Ｚは１０〜３５質量％含有するのが好ましい。
１０％未満ではカルボキシル基を有する水溶性ポリマーが十分に付かないからであり、３５％を超えると硬度上昇や吸着力の上昇で成形性に問題が生じる。

【0009】

単量体Ｚは、１個の重合性二重結合を有し、カルボキシル基及び／又はエポキシ基を有するもの、あるいは、カルボキシル基と反応する官能基を有するものであればよい。
このような単量体の例としては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、４−ビニルシクロヘキサンモノエポキサイド、２−アミノエチルビニルエーテル、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルアクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ｔ−ブチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド等が挙げられる。

【0010】

単量体Ｙは、重合時に架橋反応を行わせるためのものである。
単量体Ｙの重合体組成物中の含有量は５〜３５質量％がよい。
５％未満では重合体組成物の粘接着力が高くなり過ぎ、３５％を超えると重合体組成物が硬く脆くなり過ぎる。
単量体Ｙの例としては、ジ（メタ）アクリル酸エチレングリコール、ジ（メタ）アクリル酸ブタンジオール、ジ（メタ）アクリル酸１，６−ヘキサンジオール、ジ（メタ）アクリル酸１，１０−デカンジオール、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、アリル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。

【0011】

単量体ＺとＹとの重合体組成物では、柔軟性に劣る場合がある。
そこで、単量体Ｚと単量体Ｙの他に、当該単量体Ｚ及びＹに均一に混合し、重合体組成物を柔軟化するためのガラス転移温度が１０℃以下であり、１個の重合性二重結合を有する単量体Ｘを含有してもよい。
単量体Ｘとしては、アルキル基、シクロアルキル基がエステル部分に結合した（メタ）アクリレートが挙げられる。
このような単量体の例としては、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、ラウリルアクリレート、ノニルアクリレート、シクロヘキシルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ノニルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどが挙げられる。

【0012】

上記単量体Ｘ，Ｙ及びＺからなる重合体組成物は重合時の収縮が大き過ぎたり、弾性に劣る場合もある。
そこで、単量体Ｘ，Ｙ及びＺに均一に混合又は分散する重合体Ｂを含有し、重合体Ｂは重合体組成物の重合収縮を抑えると共に弾性向上を図るものである。
重合体Ｂは、単量体Ｘ，Ｙ及びＺの混合液体に溶解またはコロイド状に分散する重合体であれば特に制限はなく、ポリ（メタ）アクリレート類、ビニル系ポリマー類、ジエン系ポリマー類、縮合系ポリマー類等が使用できる。
また、本発明において重合体Ｂは、コア・シェル型の高分子微粒子であってもよい。
重合体Ｂをコア・シェル型の高分子微粒子とした場合に、本発明に係る微細構造体を単量体Ｘ，Ｙ及びＺの混合物に重合体Ｂを溶解又は分散させ、光重合により硬化させる際に粘度の上昇が抑えられ取扱いが容易となる。
重合体Ｂのコア・シェル型高分子微粒子は、伸張した歪１００％の状態における発生応力が１００ＭＰａ以下であるのが好ましく、２０ＭＰａ以下であるのがより好ましい。
前記のとおり微細構造体を構成する重合体組成物には、離型性を向上するために弾性を付与することが必要なため、重合体Ｂは柔軟であることが好ましい。
コア・シェル粒子の粒子径には特に制限が無いが、製造方法としては乳化重合を使用しやすいことを考慮すると、粒子径は０．０１〜１０μｍの範囲にあるものが使用しやすい。
コア・シェル粒子のシェルに使用される高分子は特に制限は無いが、製造方法として乳化重合を使用しやすいことや蛍光の発生を考慮すると、ポリメチルメタクリレートのような（メタ）アクリレート重合体およびその共重合体、ポリ酢酸ビニルおよびその共重合体などが挙げられる。
コア・シェル粒子のコアに使用される高分子は特に制限は無いが、製造方法として乳化重合を使用しやすいことや蛍光の発生を考慮すると、ポリブチルアクリレートのような（メタ）アクリレート重合体およびその共重合体、ポリ酢酸ビニルおよびその共重合体などが挙げられる。
コア・シェル型の高分子微粒子は、形状を保持するために、少なくともコア部分が架橋されているのが好ましい。
これにより重合体Ｂは微細構造体を構成する重合体組成物の中で安定に分散相を形成し、柔軟な場合には弾性体として良好に機能することができる。
架橋を形成する単量体については特に制限が無く、ジビニルモノマー類、ジ（メタ）アクリレート類、アリル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。

【0013】

本発明に係るマイクロチップは、単量体Ｘ，Ｙ，Ｚ及び重合体Ｂの混合物を鋳型に流し込み、光重合により固化することができる。
光重合開始剤については特に制限はなく、ベンゾインエーテル系、ケタール系、アセトフェノン系、ベンゾフェノン系、チオキサントン系などの光重合開始剤から自由に選択して用いることができる。
また光硬化性樹脂には、本発明の効果を阻害しない範囲で、モノマー、ポリマー、無機フィラーなどを自由に配合しても良い。
光重合に用いる光照射装置については特に制限が無く、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプ、ＵＶ放電管などを装備した装置を自由に用いることができる。
光硬化性樹脂の硬化は、重合性の観点から窒素雰囲気中で行なうのがより好ましい。

【0014】

本発明に係るマイクロチップは、血液中の浮遊癌細胞を捕捉するのが目的である。
従って、マイクロ流路は血液の流れを確保しつつ、表面積の大きい方が好ましい。
そこで本発明に係るマイクロチップは、流路の深さが５０〜１５０μｍであり、流路底面に深さ以下の高さを有する突起を複数個配してあり、隣接する突起間の最小の間隔が５０〜１００μｍであるのが好ましい。
ここで突起の高さを流路深さ以下にしたのは、マイクロ流路の上部に樹脂プレートやガラスカバー等の透明な蓋体を重ね合せた際に突起上部と干渉しないようにするためである。
突起の数は少なくとも１００個以上有するのが好ましく、突起形状そのもに限定はない。
なお、流路底面に配した突起がマイクロ柱であり、当該マイクロ柱は外接円直径が５０〜２００μｍであると、マイクロ柱の側面に血液中の浮遊癌細胞を捕捉しやすく、マイクロ柱や突起同士の最小間隔を５０〜１００μｍに設定することで、直径数μｍ〜数十μｍの血液細胞の流れが阻害されない。

【発明の効果】

【0015】

本発明に係るマイクロチップは、樹脂製であることから生産性が高く安価であり、流路中に抗体を固定化できることから、癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体を用いて流体中から浮遊癌細胞を単離及び検出できる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明に係るマイクロチップの流路拡大像を示す。

【図2】本発明に係るマイクロチップの全体像を示す。

【図3】マイクロチップをホルダに装着した状態の例を示す。

【図4】本発明に係るマイクロチップを用いた癌細胞捕捉試験結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明に係るマイクロチップの製造例について説明する。
単量体Ｚとして、和光純薬製のメタクリル酸グリシジルを使用した。
単量体Ｘとして、和光純薬工業製のｎ−ブチルアクリレート（重合体のガラス転移温度：−５０℃）を使用した。
単量体Ｙとして、日本油脂製のジエチレングリコールジメタクリレートであるブレンマーＰＤＥ−１００を使用した。
重合体Ｂとして、クラレ製のパラペットＳＡ−ＮＷ２０１（コア・シェル型高分子微粒子で、歪１００％の発生応力１１ＭＰａ）を使用した。
光重合開始剤として、チバ・スペシャルティ・ケミカルズ製の光重合開始剤ＤＡＲＯＣＵＲ １１７３（２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−プロパン−１−オン）を使用した。
単量体Ｚ：メタクリル酸グリシジルを４０重量部，単量体Ｙ：ブレンマーＰＤＥ−１００を４０重量部，単量体Ｘ：ｎ−ブチルアクリレートを４０重量部，重合体Ｂ：パラペットＳＡ−ＮＷ２０１を２０重量部、光重合開始剤：ＤＡＲＯＣＵＲ １１７３を１重量部の配合割合で均一に混合し、その混合物をマイクロチップの鋳型上に流し込み、その上からガラスプレートをのせてＵＶ表面加工装置（サンエナジー株式会社製 ＭＤＣ１５００１Ｙー０３／ＳＫＣ１１０２Ｙ−０１）で紫外線照射した（紫外線照射は搬送速度０．３ｍ／ｍｉｎで動くコンベアー上に置いて行った）。
硬化後に取り出したマイクロチップの流路部の拡大写真を図１に、全体像を図２示す。
このマイクロチップをポリアクリル酸１０％のメタノール溶液に浸漬し、室温でメタノールを蒸発させたのちに１５０℃で１時間加熱した。加熱後にマイクロチップを蒸留水で洗浄し、未反応のポリアクリル酸を除去した。
流路にポリアクリル酸が固定できたことは、赤外吸収スペクトル測定（ＡＴＲ法）により確認した。
このようにしてポリアクリル酸を結合したマイクロチップ表面（流路部）に、抗マウスＩｇＧ抗体のＰＢＳ溶液（抗体濃度２０μｇ／ｍｌ）と１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド メト−ｐ−トルエンスルホナートのＰＢＳ溶液（濃度２０ｍｇ／ｍｌ）とを１：１で混合した溶液をのせて１時間おき、その後にマイクロチップをＰＢＳで洗浄した。
ここでＰＢＳ溶液は一般的に使用されているリン酸緩衝生理食塩水をいう。
このようにして抗マウスＩｇＧ抗体を固定したマイクロチップ表面に、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（免疫動物：マウス）のＰＢＳ水溶液（抗体濃度２０μｇ／ｍｌ）をのせて１時間おき、その後にマイクロチップをＰＢＳで洗浄した。

【0018】

マイクロチップに送液するために、上記のように処理したマイクロチップ本体に樹脂プレートを重ね、ホルダに装着して送液チューブを接続し（図３参照）、送液チューブにはシリンジを接続してシリンジポンプにより細胞懸濁液を送液した。
細胞懸濁液には、食道癌の細胞株であるＫＹＳＥ２２０を用い、濃度４０万個／ｍｌのＰＢＳ懸濁液とした。
細胞懸濁液を流量１ｍｌ／ｈで約１．５ｍｌ送液した後にＰＢＳで浮遊物を流出させて捕捉試験したチップを観察した結果を図４に示す。
抗ＥｐＣＡＭ抗体を固定した場合にはマイクロ柱の周囲に多数の細胞が捕捉される（図４ａ）のに対し、抗ＥｐＣＡＭ抗体がない場合（抗マウスＩｇＧの固定まで）には細胞が認められなかった（図４ｂ）。
また抗ＥｐＣＡＭ抗体を固定したマイクロチップに健常者の血液を用い同様に捕捉試験してチップを観察した場合には、図４ｂと同様に細胞が認められなかった。

【0019】

次に、前記同様の単量体、重合体、光重合開始剤を使用し、前記と同様の割合で混合し、ＵＶ表面加工装置を用いてマイクロチップを作製した。
得られたマイクロチップの表面に、抗マウスＩｇＧ抗体のＰＢＳ溶液（抗体濃度１０μｇ／ｍｌ）をのせて１時間おき、その後にマイクロチップをＰＢＳで洗浄した。
このようにして抗マウスＩｇＧ抗体を固定したマイクロチップ表面に、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（免疫動物：マウス）のＰＢＳ水溶液（抗体濃度２０μｇ／ｍｌ）をのせて１時間おき、その後にマイクロチップをＰＢＳで洗浄した。
得られたマイクロチップを前記同様にホルダに装着し、シリンジポンプで細胞懸濁液を送液して捕捉試験を行った。
捕捉試験後にマイクロチップを観察すると、図４ａと同様にマイクロ柱の周囲に細胞が捕捉された様子が認められた。
このように抗体とマイクロ流路を組み合わせたマイクロチップにより癌細胞が捕捉できることが確認できた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】