特許 5803106 Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＤ−乳酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5803106

(24)【登録日】2015年9月11日

(45)【発行日】2015年11月4日

(54)【発明の名称】Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＤ−乳酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20151015BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20151015BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20151015BHJP

   C12P 7/56 20060101ALI20151015BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/04

   C12N1/19

   C12P7/56

【請求項の数】10

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2010-522119(P2010-522119)

(86)(22)【出願日】2010年6月2日

(86)【国際出願番号】JP2010059306

(87)【国際公開番号】WO2010140602

(87)【国際公開日】20101209

【審査請求日】2013年5月29日

(31)【優先権主張番号】特願2009-134213(P2009-134213)

(32)【優先日】2009年6月3日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000003159

【氏名又は名称】東レ株式会社

(72)【発明者】

【氏名】澤井 健司

(72)【発明者】

【氏名】須田 和美

(72)【発明者】

【氏名】澤井 秀樹

(72)【発明者】

【氏名】山田 勝成

(72)【発明者】

【氏名】山岸 潤也

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 SIEBENALLER J.F., et al.，"Comparison of the D-lactate stereospecific dehydrogenase of Limulus polyphemus with active-site reg，Biochim. Biophys. Acta.，１９８３年，Vol.749, No.2，P.153-162

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチド。
（Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％以上のアミノ酸配列からなり、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド

【請求項2】

下記（ａ）〜（ｃ）、（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３または４に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその相補鎖の全体とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｅ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド

【請求項3】

請求項２に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターとを連結させた、ＤＮＡ構築物。

【請求項4】

前記プロモーターが、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）またはグリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のプロモーターであることを特徴とする、請求項３に記載のＤＮＡ構築物。

【請求項5】

前記プロモーターが、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかから選ばれる、請求項３または４に記載のＤＮＡ構築物。
（Ｉ）配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列からなるプロモーター
（ＩＩ）配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列もしくはその一部を含む塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなるプロモーター
（ＩＩＩ）配列番号５〜７いずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなるプロモーター

【請求項6】

請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３〜５のいずれかに記載のＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換体。

【請求項7】

請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３〜５のいずれかに記載のＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換酵母。

【請求項8】

前記形質転換酵母は、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）およびグリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のうち少なくとも１種類の遺伝子が、請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３〜５いずれかに記載のＤＮＡ構築物に置換されている、請求項７に記載の形質転換酵母。

【請求項9】

前記遺伝子のうち、少なくとも１種類はＰＤＣ１遺伝子である、請求項８に記載の形質転換酵母。

【請求項10】

請求項６に記載の形質転換体または請求項７〜９のいずれかに記載の形質転換酵母を培養する工程を含む、Ｄ−乳酸の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｄ−乳酸を製造するための新規なＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体に関し、さらに該形質転換体を培養することを含むＤ−乳酸の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

再生可能資源であるバイオマスを原料とするポリ乳酸（ＰＬＡ）は、カーボンニュートラルの考え方から強い注目を浴びている。ＰＬＡは、比較的コストが安く、融点もおよそ１７０℃と耐熱性を有し、溶融成形可能な生分解性ポリマーとして期待されている。さらに、ポリ−Ｌ−乳酸とポリ−Ｄ−乳酸を混合することにより、ポリ乳酸ステレオコンプレックスが得られることが知られている（特許文献１〜３）。ポリ乳酸ステレオコンプレックスは、単独のポリマーよりも高融点および高結晶性を示し、繊維やフィルム、樹脂成形品として有用な成形品を与えることが知られており、その原料であるＬ−乳酸、Ｄ−乳酸ともに高純度かつ高効率な製造法が求められている。

【0003】

自然界には乳酸菌などの乳酸を効率良く生産する細菌が存在し、それらを用いた乳酸製造法の中には既に実用化されているものもある。例えば、Ｌ−乳酸を効率良く生産する細菌としてラクトバシラス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）などがある。また、Ｄ−乳酸を効率良く生産する細菌としてスポロラクトバシラス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）の微生物などが知られている（特許文献４）。いずれの場合も嫌気培養で乳酸の蓄積量は高いレベルに達しているが、Ｌ−乳酸発酵の場合はＤ−乳酸が、Ｄ−乳酸発酵の場合はＬ−乳酸が副産物として生成し光学純度の低下をもたらす。そして、これらを分離することは非常に困難である。

【0004】

そこで、高光学純度な乳酸の製造方法として、本来乳酸生産能を有しない酵母にＬ−乳酸またはＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入し、該酵母を用いたＬ−乳酸およびＤ−乳酸発酵が検討されている（特許文献４〜６、非特許文献１）。遺伝子組換え酵母によるＬ−乳酸発酵に関しては、高活性なアフリカツメガエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入することで、高効率かつ高光学純度な乳酸発酵が可能になっている（特許文献４）。一方、遺伝子組換え酵母によるＤ−乳酸発酵に関しては、Ｌ−乳酸発酵と同様に高い光学純度のＤ−乳酸が得られるものの、Ｄ−乳酸収率に課題があった（特許文献５および６、非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開昭６１−３６３２１号公報

【特許文献2】特開昭６３−２４１０２４号公報

【特許文献3】特開平２０００−１７１６３号公報

【特許文献4】ＷＯ２００７／０４３２５３

【特許文献5】特開２００７−０７４９３９号公報

【特許文献6】ＷＯ２００４／１０４２０２

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】イシダら、ジャーナル オブ バイオサイエンス バイオエンジニアリング（２００６）、１０１、１７２−７（Ｉｓｈｉｄａ Ｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｂｉｏｓｃｉ ｂｉｏｅｎｇ（２００６），１０１，１７２−７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、従来よりも高いＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより、生産性の高いＤ−乳酸発酵を実現することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、種々のＤ−乳酸脱水素酵素について鋭意検討した結果、Ｄ−乳酸の産生量を増大させ、同時に副産物の生成が少ないＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成した。

【0009】

すなわち、本発明は、以下の態様からなる。

【0010】

（１）下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチド。
（Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９０％以上のアミノ酸配列からなり、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド

【0011】

（２）下記（ａ）〜（ｃ）、（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３または４に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその相補鎖の全体とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｅ）（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド

【0012】

（３）（２）に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターとを連結させた、ＤＮＡ構築物。

【0013】

（４）前記プロモーターが、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）またはグリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のプロモーターであることを特徴とする、（３）に記載のＤＮＡ構築物。

【0014】

（５）前記プロモーターが、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかから選ばれる、（３）または（４）に記載のＤＮＡ構築物。
（Ｉ）配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列からなるプロモーター
（ＩＩ）配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列もしくはその一部を含む塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなるプロモーター
（ＩＩＩ）配列番号５〜７いずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなるプロモーター。

【0015】

（６）（２）に記載のポリヌクレオチドまたは（３）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換体。

【0016】

（７）（２）に記載のポリヌクレオチドまたは（３）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物が導入されている、形質転換酵母。

【0017】

（８）前記形質転換酵母は、そのピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１遺伝子）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）およびグリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素３遺伝子（ＴＤＨ３遺伝子）のうち少なくとも１種類の遺伝子が、（２）に記載のポリヌクレオチドまたは（３）〜（５）いずれかに記載のＤＮＡ構築物に置換されている、（７）に記載の形質転換酵母。

【0018】

（９）前記遺伝子のうち、少なくとも１種類はＰＤＣ１遺伝子である、（８）に記載の形質転換酵母。

【0019】

（１０）（６）に記載の形質転換体または（７）〜（９）のいずれかに記載の形質転換酵母を培養する工程を含む、Ｄ−乳酸の製造方法。

【発明の効果】

【0024】

本発明によれば、Ｄ−乳酸発酵生産に適したＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドが提供される。また、本発明のポリヌクレオチドによりＤ−乳酸を高生産可能な形質転換体を容易に得ることができ、ひいては、該形質転換体を培養することでＤ−乳酸を効率よく高純度で生産することができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、本発明の酵母ＳＵ０４２株の一つの作製手順を表したものである。

【図2】図２は、本発明の酵母ＳＵ０４２株の膜利用連続培養結果を示したものである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

【0027】

Ｄ−乳酸脱水素酵素（以下、Ｄ−ＬＤＨともいう）活性とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸をＤ−乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変換する活性である。

【0028】

本発明は配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのホモログを包含しており、該ポリペプチドはＤ−ＬＤＨ活性を有していることを特徴としている。

【0029】

配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、カブトガニ科（Ｌｏｍｕｌｉｄａｅ）アメリカカブトガニ属（Ｌｉｍｕｌｕｓ）に属するアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）由来のポリペプチドである。

【0030】

配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログとしては、例えば、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１または２個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドでありかつＤ−ＬＤＨ活性を有しているポリペプチドが挙げられる。

【0031】

また、配列番号３または４に記載のポリペプチドのホモログは、配列番号１または２に記載のアミノ配列との配列同一性が少なくとも８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有し、かつＤ−ＬＤＨ活性を有しているポリペプチドであってもよい。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、この分野で汎用されているソフトウェアであるＢＬＡＳＴを用いて容易に調べることができる。ＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のホームページで誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に同一性を調べることができる。

【0032】

また、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログは、カブトガニ科に属する生物由来、好ましくはアメリカカブトガニ属またはカブトガニ属に属する生物由来、より好ましくはアメリカカブトガニ属のアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）またはカブトガニ属のカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）、ミナミカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｇｉｇａｓ）もしくはマルオカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）由来のポリペプチドであって、Ｄ−ＬＤＨ活性を有するものであってもよい。

【0033】

配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドはアメリカカブトガニから公知の方法により抽出、またはペプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調製することができ、また、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて、遺伝子組換え技術により調製することもできる。配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドはカブトガニ属に属する生物から公知の方法により抽出、またはペプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調整することができ、また、該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて、遺伝子組換え技術により調整することもできる。

【0034】

配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログは、配列番号１または２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドよりＤ−ＬＤＨ活性が向上していても良いし、熱安定性が向上していてもよい。ここで、「Ｄ−ＬＤＨ活性が向上する」とは基質であるピルビン酸やＮＡＤＨに対する基質親和性や分子活性（Ｋｃａｔ）が向上することや、また、該ポリペプチドの酵素活性の最適ｐＨが該ポリペプチドを発現する細胞の生育に適したｐＨにより近くシフトすることを意味する。そのようなポリペプチドは、配列番号１または２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを基に人工的にデザインしても良いし、天然から分離しても良い。また、分子進化工学的手法によりＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子に対してランダムに変異を導入し、そこから好ましいポリペプチドをスクリーニングしても良い。

【0035】

本発明は配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはそのホモログを包含し、該ポリヌクレオチドはＤ−ＬＤＨ活性を有するポリヌクレオチドをコードしていることを特徴とする。ここで、「ポリヌクレオチド」とはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ、レプリコンＲＮＡなど、その由来を問うものではないが、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡであり、より好ましくはＤＮＡである。また、１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよい。また、天然のあるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。

【0036】

配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、アメリカカブトガニ由来のポリヌクレオチドであり、前記Ｄ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴としている。

【0037】

配列番号３または４に記載のポリヌクレオチドのホモログとしては、例えば、配列番号３または４に記載の塩基配列において、１もしくは数個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１から１０個、最適に好ましくは１から５個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、同時にＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードしているものが挙げられる。

【0038】

また、配列番号３または４に記載のポリヌクレオチドのホモログとしては、配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、同時にＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードしているものが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したポリヌクレオチドをプローブとして、公知のハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4）などを用いて、ハイブリダイズするポリヌクレオチドである。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。

【0039】

また、配列番号３または４に記載のポリヌクレオチドのホモログは、配列番号３または４に記載の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、同時にＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。ここで言う、ポリヌクレオチドの塩基配列の配列同一性は、前述の遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。

【0040】

また、配列番号３または４に記載のポリヌクレオチドのホモログは、カブトガニ科に属する生物由来、好ましくはアメリカカブトガニ属またはカブトガニ属に属する生物由来、より好ましくはアメリカカブトガニ、カブトガニ、ミナミカブトガニまたはマルオカブトガニ由来のポリヌクレオチドであって、Ｄ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。

【0041】

前記ポリヌクレオチドは、カブトガニ科、好ましくはカブトガニ科アメリカカブトガニ属に属する生物（以下、これらを総称してカブトガニともいう）からクローニングすることで調整することができるが、化学的に合成または長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用して合成することもできる。カブトガニからのクローニングは、通常公知の方法を用いて単離することができ、このような方法としては、例えば、カブトガニ血球より単離した ｐｏｌｙＡ（＋） ＲＮＡより作製したｃＤＮＡからＤ−乳酸脱水素酵素において高く保存されている配列をもとに合成したプライマーを用いて部分断片の増幅・配列決定を行い、その後５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ法により全ＯＲＦ配列を決定し、その後ＰＣＲによって増幅することで得られる。また、Ｄ−乳酸脱水素酵素の機能相補によっても行うことができる。その原理の詳細は（DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States (1995) 61 266-272）に記載されている。このようにして、一旦決定された塩基配列を有する本発明のポリヌクレオチドは、これを再度カブトガニ血球から得ることも可能であるが、これを直接ＤＮＡ合成装置で化学合成することも可能である。

【0042】

なお、前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、アミノ酸配列または塩基配列に、部位特異的変位導入法（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel etal., (1987) Publish . John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することで適宜改変することができる。また、このようなポリペプチドのアミノ酸配列またはポリヌクレオチドの塩基配列の改変は、人工的に変異を導入しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理に基づいてあるいはこれに限られず自然界におけるアミノ酸の変異によっても生じたものも包含される。

【0043】

前記ポリヌクレオチドは、遺伝子組換えによるＤ−乳酸産生細胞の作製に使用することができる。遺伝子組換えにより本発明のポリヌクレオチドが導入された宿主細胞（以下、形質転換体ともいう）がＤ−乳酸を産生するようになるためには、形質転換体内で該ポリヌクレオチドがコードするＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを発現する必要があるが、その際、Ｄ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを発現させる方法の一つとして、該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターとを連結させた、すなわち、該プロモーターの３’末端側に該ポリヌクレオチドを連結させたＤＮＡ構築物を利用することが有用であり、該ＤＮＡ構築物についても本発明に含まれる。本発明のＤＮＡ構築物は、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と、該ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターをそれぞれ適切な制限酵素で切断し、後述のベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法や、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該プロモーターをＰＣＲによって連結することにより作製することができる。

【0044】

前記ＤＮＡ構築物の好ましい態様としては、該ＤＮＡ構築物をプラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）などのベクターに保持させる。該ＤＮＡ構築物の導入形態（宿主ゲノム内または宿主ゲノム外）や宿主細胞の種類に応じて、当該分野において公知の原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクターまたは植物細胞性ベクターが適宜選択される。

【0045】

なお、プラスミドとしては、例えば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２またはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などを挙げることができる。バクテリオファージとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などを挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２などを挙げることができる。

【0046】

前記ＤＮＡ構築物における「プロモーター」とは、遺伝子からのｍＲＮＡの転写開始に関与する塩基配列を意味し、通常、染色体中に存在する遺伝子の５末端側の上流配列を指す。プロモーターの塩基配列長としては、好ましくは１〜３０００ｂｐ、より好ましくは１〜１０００ｂｐであるが、下流に存在する遺伝子のｍＲＮＡの転写を開始し得る塩基配列であれば特に制限はない。また、プロモーターの転写活性を向上させる変異や操作は公知であり、「プロモーター」には公知の手法により改変されたものも含まれる。前記ＤＮＡ構築物におけるプロモーターは、該ＤＮＡ構築物が導入された形質転換体内でプロモーター活性を有するものであれば特に制限はないが、後述の通り、本発明のＤＮＡ構築物は酵母に導入されることが好ましいため、酵母において機能するプロモーターであることが好ましい。

【0047】

酵母において機能するプロモーターの好ましい例としては、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ１，２，３）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１，２，３，４，５，６，７）遺伝子、ガラクトース代謝系遺伝子（ＧＡＬ１，７，１０）、シトクロムｃ遺伝子（ＣＹＣ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子（ＰＦＫ１）、ピルビンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１，５，６）のプロモーターが挙げられ、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０７２１２９に記載・利用されている、酵母培養開始後５０時間以降における遺伝子発現量が全遺伝子の平均相対発現量の５倍以上であるプロモーターである、エノラーゼ１遺伝子（ＥＮＯ１）、細胞壁関連タンパク質２遺伝子（ＣＷＰ２）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１）のプロモーターが挙げられる。

【0048】

酵母において機能するプロモーターのより好ましい例としては、酵母のエタノール発酵経路において高発現されているＰＤＣ１プロモーターまたはＴＤＨ３プロモーター、あるいは長期間の酵母培養時に高発現されているＳＥＤ１プロモーターが挙げられ、より具体的には、配列番号５に記載されるＰＤＣ１プロモーター、配列番号６に記載されるＳＥＤ１プロモーターまたは配列番号７に記載されるＴＤＨ３プロモーターが挙げられる。

【0049】

また、ＰＤＣ１プロモーター、ＳＥＤ１プロモーターまたはＴＤＨ３プロモーターは、そのプロモーター活性を有する範囲においては配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１から１０個、最適に好ましくは１から５個の塩基配列が欠失、置換および／または付加された塩基配列であってもよい。

【0050】

また、ＰＤＣ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーターまたはＳＥＤ１プロモーターは、そのプロモーター活性を有する範囲においては配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列もしくはその一部を含む塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したポリヌクレオチドをプローブとして、当業者の周知のハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4）などを用いて、ハイブリダイズするポリヌクレオチドである。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate)溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。

【0051】

前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入して得られる形質転換体についても本発明に含まれる。宿主細胞としては、該ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を安定に保持する細胞であれば特に制限はなく、大腸菌、枯草菌、乳酸菌等の細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞または植物細胞が挙げられるが、酵母は耐酸性であり、Ｄ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを発現することでＤ−乳酸を高産生した場合でも生育できるため、好ましく用いられる。

【0052】

酵母としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、イッサチェンキア属（Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ）、フェロミセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母が挙げられるが、好ましくは、サッカロミセス属、キャンディダ属またはクリベロミセス属に属する酵母であり、より好ましくはサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはキャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）またはクリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）である。

【0053】

また、酵母が高次倍数体酵母であれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定してＤ−乳酸の高生産性を維持することが可能となり、Ｄ−乳酸を低コストで安定に生産することができるため、本発明において好ましく用いられる。ここで、「高次倍数体酵母」とは、細胞内に２組以上の染色体をもつ酵母のことである。高次倍数体酵母の染色体の組数に関しては特に制限はないが、２組の染色体を持った２倍体酵母が好ましい。高次倍数体酵母は、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母、清酒酵母、ワイン酵母やビール酵母などの酵母などが挙げられる。使用する高次倍数対酵母は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。

【0054】

また、酵母が栄養非要求性であれば、従来よりも栄養素の少ない培地、すなわち低コストの培地が使用可能となるとともに、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定してＤ−乳酸の高生産性を維持することが可能となり、乳酸を低コストで安定に生産することも可能となるため、本発明において好ましく用いられる。ここで、「栄養要求性」とは、野生型酵母が有する栄養合成遺伝子に何らかの原因で変異が生じ、結果として、該栄養の合成能を欠損していることを意味する。すなわち、「栄養非要求性酵母」とは、栄養要求性を示す遺伝子型を有しないか、もしくは相補されている酵母である。栄養要求性酵母の栄養要求性を復帰させて栄養非要求性酵母を作出する方法としては、遺伝子組換え手法によって栄養合成遺伝子を導入し、栄養要求性を復帰させる方法や、また異なる栄養要求性を有する酵母同士を接合、子嚢形成させ、目的とする栄養要求性を復帰させる過程を繰り返し、最終的に栄養要求性をすべて復帰させ、栄養非要求性酵母とする方法などが挙げられる。なお、栄養非要求性酵母であるか否かの判定方法としては、酵母の最小培地であるＳＤ培地において、生育可能であるかをもってして判断基準とすることができる。

【0055】

また、酵母は旺盛にエタノール発酵を行う微生物であり、その代謝経路は、解糖系産物であるピルビン酸をピルビン酸脱炭酸酵素によりアセトアルデヒドに変換し、そのアセトアルデヒドをアルコール脱水素酵素によってエタノールに変換する。したがって、エタノール代謝経路の起点となるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊された酵母株を宿主とすることは、本来エタノール代謝経路で代謝されるべきピルビン酸が、Ｄ−乳酸代謝経路に用いられるようになるため、好ましい。

【0056】

特にサッカロミセス・セレビセの場合、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子にはピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子、ピルビン酸脱炭酸酵素５（ＰＤＣ５）遺伝子、およびピルビン酸脱炭酸酵素６（ＰＤＣ６）遺伝子の３種類が存在し、そのうちＰＤＣ１とＰＤＣ５のみが酵母細胞内においてピルビン酸脱水素酵素活性を有するとされているため、ＰＤＣ１遺伝子またはＰＤＣ５遺伝子が破壊された株を使用することが好ましく、ＰＤＣ１遺伝子が破壊された株を使用することがより好ましい。また、ＰＤＣ１遺伝子が破壊された株においては、特開２００８−０４８７２６号公報に記載されるように、ＰＤＣ５の活性が低下するような変異を有する変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する株が好ましく、温度感受性の変異型ＰＤＣ５遺伝子を有する株がより好ましい。ここで、「温度感受性の変異型ＰＤＣ５」とは、野生型ＰＤＣ５と比較して、ある培養温度では同程度のピルビン酸脱炭酸酵素活性を示すが、培養温度を変化させて特定の培養温度以上になるとＰＤＣ５活性の消失又は低下を示す性質を有する変異型ＰＤＣ５のことである。サッカロミセス・セレビセの通常の培養温度は２８〜３０℃であり、温度感受性を示す温度が通常の培養温度に近いほど、培養温度を変化させるために必要な熱量が少なくて済み、培養にかかるコストを低減させることができるため、好ましい。具体的には、温度感受性変異型ＰＤＣ５は３４℃以上で温度感受性を示すことが好ましい。

【0057】

前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を酵母に導入して、形質転換酵母内でＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドを発現させる方法としては、前述の通り該ＤＮＡ構築物を含むベクターを酵母染色体外に導入する方法や、該ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を酵母染色体に導入する方法が挙げられるが、いずれも採用することができる。

【0058】

前記ポリヌクレオチドを酵母染色体に導入する方法としては、本発明のポリヌクレオチドに酵母染色体と相同的な配列である相同組換え用ＤＮＡセグメントを備える構築物（以下、相同組換え用ＤＮＡ構築物とも言う）を好適に用いることができる。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、酵母染色体において本発明のポリヌクレオチドを導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えられている。相同組換え用ＤＮＡセグメントが２個備えられている場合、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメントを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメントの間に本発明のポリヌクレオチドを連結することが好ましい。

【0059】

相同組換え用ＤＮＡ構築物により相同組換えする方法に制限はないが、ＰＣＲにより相同組換え用ＤＮＡ構築物を増幅し、該ＰＣＲ断片をプラスミドに挿入して酵母に導入する方法や、該ＰＣＲ断片を酵母に導入する方法が採用できる。また、相同組換え用ＤＮＡ構築物には、本発明のポリヌクレオチドの発現を制御するためのターミネーターが含まれることが好ましい。ここで、「ターミネーター」とは、遺伝子からのｍＲＮＡ転写を終結させる配列を意味し、通常、染色体中に存在する遺伝子の３’末端側の下流配列を指す。

【0060】

また、相同組換え用ＤＮＡ構築物には、本発明のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物の他に、形質転換酵母の選択を容易にするために、選択マーカーが含まれることが好ましい。ここで言う選択マーカーとしては、ＵＲＡ３またはＴＲＰ１等の栄養要求性相補的遺伝子もしくはＧ４１８耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。

【0061】

ＰＣＲにより前記ポリヌクレオチド、ターミネーターおよび選択マーカーを含む相同組換え用ＤＮＡ構築物を調整する方法は、例えば、下記ステップ１〜３の工程により行うことができる。

【0062】

ステップ１：本発明のポリヌクレオチドの下流にターミネーターがつながったプラスミドを鋳型とし、プライマー１，２をセットとして本発明のポリヌクレオチド及びターミネーターを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー１は、導入目的箇所の上流側に相同的な配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインし、プライマー２は、ターミネーターより下流のプラスミド由来の配列をもとにデザインする。

【0063】

ステップ２：選択マーカーを持つプラスミド、例えばｐＲＳ４００、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２６等を鋳型として、プライマー３，４をセットとして選択マーカーを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー３は、ステップ１のＰＣＲ断片のターミネーターより下流の配列と相同性のある配列が３０ｂｐ以上を付加するようにデザインし、プライマー４には、導入目的箇所の下流側に相当する配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインする。

【0064】

ステップ３：ステップ１，２で得られたＰＣＲ断片を混合したものを鋳型とし、プライマー１，４をセットとしてＰＣＲを行うことにより、両末端に導入目的箇所の上流側及び下流側に相当する配列が付加された、本発明のポリヌクレオチド、ターミネーター及び酵母選択マーカーを含む相同組換え用ＤＮＡ構築物が得られる。

【0065】

前記相同組換え用ＤＮＡ構築物を酵母に導入するには、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法やプロトプラスト法等がある。

【0066】

相同組換えにより酵母染色体に前記ポリヌクレオチドを導入する場合、該ポリヌクレオチドが酵母染色体上の内在性遺伝子のプロモーターにより制御可能になるように導入する。この場合、前記ポリヌクレオチドの導入によって、同時に、本来当該プロモーターによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、この内在性遺伝子に替えて外来の本発明のポリヌクレオチドを発現させてもよい。本方法は、特に、当該プロモーターが上記のように酵母において高発現プロモーターである場合や、酵母のＤ−乳酸代謝経路を阻害するように機能する内在性遺伝子を破壊する場合に有用である。

【0067】

前記ポリヌクレオチドを酵母染色体に導入する際のターゲットとなる内在性遺伝子として、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ１，２，３）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１，２，３，４，５，６，７）、ガラクトース代謝系遺伝子（ＧＡＬ１，７，１０）、シトクロムｃ遺伝子（ＣＹＣ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子（ＰＦＫ１）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１，５，６）が好ましい例として挙げられる。また、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０７２１２９に記載・利用されている、酵母培養開始後５０時間以降における遺伝子発現量が全遺伝子の平均相対発現量の５倍以上である、エノラーゼ１遺伝子（ＥＮＯ１）、細胞壁関連タンパク質２遺伝子（ＣＷＰ２）、サプレッション・オブ・エクスポネンシャル・ディフェクト１遺伝子（ＳＥＤ１遺伝子）のプロモーターも好ましい例として挙げられる。特に、酵母のエタノール発酵経路において高発現されているＰＤＣ１遺伝子またはＴＤＨ３遺伝子、あるいは長期間の酵母培養時に高発現されているＳＥＤ１遺伝子がより好ましい例として挙げられ、また前述の通り、少なくともエタノール発酵経路の起点となるＰＤＣ１遺伝子またはＰＤＣ５遺伝子、好ましくはＰＤＣ１遺伝子を破壊するように前記ポリヌクレオチドを導入することで、エタノール発酵経路で代謝されるピルビン酸をＤ−乳酸代謝経路に利用することができるようになるため、さらに好ましい。

【0068】

また、前記ＤＮＡ構築物を酵母染色体に導入する方法としては、前記ポリヌクレオチドを酵母染色体に導入する場合と同様に相同組換え用ＤＮＡ構築物を作成し、相同組換えにより目的とする染色体上の箇所に導入することができる。なお、前記ＤＮＡ構築物には、前記ポリヌクレオチドを発現可能なプロモーターが既に含まれているため、前記ポリヌクレオチドが酵母染色体上の内在性遺伝子のプロモーターにより制御可能になるように導入する必要はない。

【0069】

なお、酵母染色体上の所望の位置に前記ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換酵母からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において公知である。

【0070】

前記形質転換体を培養する工程を含むＤ−乳酸の製造方法についても本発明に含まれる。前記形質転換体を培養すると、該形質転換体内でＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドの発現が新たに付与または増強されてＤ−乳酸代謝経路が新たに付与または増強され、その結果、培養物中からＤ−乳酸を分離する工程を実施することによりＤ−乳酸が得られる。培養物とは、培養上清の他、形質転換体または形質転換体の破砕物を包含している。

【0071】

前記形質転換体の培養方法については特に限定はなく、公知の方法が採用される。例えば、前記形質転換酵母の培養方法としては「M.D. Rose et al., "Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)」等に記載されている方法を用いることができる。なお、前記ＤＮＡ構築物を含むプラスミドや相同組換え用ＤＮＡ構築物に選択マーカーが含まれる場合、選択マーカーに応じた栄養非添加培地または薬剤添加培地で培養することにより所望の形質転換体を選択することができる。

【0072】

前記形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。例えば、形質転換酵母の場合、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、ラフィノース、トレハロース、ソルボース、セロビオース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、イヌリン、キシロース、アラビノース、リボース、ラムノース、グルコサミン、エリスリトール、リビトール、マンニトール、グルシトール、サリシン、スターチ、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。

【0073】

前記形質転換体の培養は、通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下から、通気を実施しないような嫌気条件下までの範囲で、乳酸の生産性が良い条件を設定することができるが、微好気から嫌気の条件下が好適に用いられる。培養温度は２５〜３７℃で行うことができるが、２８〜３５℃が好適である。Ｄ−乳酸が培地中に蓄積するにしたがって培養物のｐＨが低下するため、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アンモニアガスなどのアルカリ性物質によって中和することもできる。また後段における乳酸の精製を容易にするために中和を行わずに培養することもできる。また、培養方法としては、目的とするＤ−乳酸を発酵生産しうる形態であれば特に制限はなく、バッチ培養、フェドバッチ培養、ケモスタット培養、連続培養などを採用できる。好ましくは、バッチ培養またはＷＯ２００７／０９７２６０に記載されている、目詰まりを起こしにくい膜を利用して発酵培養物を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養物に保持または還流させる膜利用連続培養である。

【0074】

前記培養物中に得られたＤ−乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法や、Ｆ−キット（ロシュ社製）を用いる方法などがある。

【0075】

前記発酵培養物中に含まれるＤ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができ、例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法、ＷＯ２００９／００４９２２に開示されるナノ濾過膜と蒸留を組み合わせた分離・精製方法などが挙げられる。

【実施例】

【0076】

以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは本発明の例示であり本発明を制限するものではない。

【0077】

（実施例１）アメリカカブトガニ由来のＤ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子）の塩基配列決定
アメリカカブトガニのｃＤＮＡを作製するために、ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡの精製を行った。ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡはアメリカカブトガニの血球より単離した。アメリカカブトガニ（Marine Biological Laboratory (USA)より購入）の血球より、ＡＧＰＣ法（実験医学Ｖｏｌ．９（１９９１）、１９３７−１９４０頁を参照）を用いて、全ＲＮＡを分離した。分離した全ＲＮＡを用いて、“Oligotex-dT30 Superキット”（タカラバイオ社製)を用いてｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを単離した。次に、“SuperScript II Reverse Transcriptase”（インビトロジェン社製）を用いＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）をプライマーとしてｃＤＮＡを合成した。次に、この反応液を鋳型として用い、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子において高く保存されているＤＮＡ配列に注目してデザインした配列番号８および配列番号９記載のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の部分配列を増幅した。ＰＣＲは以下の条件で行った。９５℃（３分間）：｛９５℃（３０秒間）−４５℃（３０秒間）−７２℃（３０秒間）｝×３５サイクル：７２℃（５分間）。続いて１．０ ％アガロースゲルを用いた電気泳動によって増幅ＤＮＡ断片の確認をおこない、６００ｂｐの増幅断片を“QIA quick Gel extraction kit”（株式会社キアゲン製）を用いて精製した後、プラスミドベクター“pGEMt-easy”（プロメガ株式会社製）にクローニングし、ＤＮＡ配列の決定を行った。塩基配列の決定は、“Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit”（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＳａｎｇｅｒの方法に従って行った。その結果、アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子に相当すると思われる２種類の配列（Ｄ−ＬＤＨ１、Ｄ−ＬＤＨ２）の部分配列が得られた。

【0078】

次に、５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ法を用いて、Ｄ−ＬＤＨ１およびＤ−ＬＤＨ２の全ＯＲＦ配列を明らかにした。５’ＲＡＣＥは以下の方法で行った。まず、１００μＭに調整した配列番号１０記載（Ｄ−ＬＤＨ１用）あるいは配列番号１１記載（Ｄ−ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡを５０μＬ、Ｔ４ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＫｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製） ５０ｕｎｉｔ、１０×Ｋｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１００ｍＭＭｇＣｌ２、５０ ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ） １０μＬ、１００ｍＭＡＴＰ １μＬ、蒸留水３４μＬを混和し、３７℃に１時間静置することで、オリゴＤＮＡの５‘末端のリン酸化を行い、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール処理、エタノール沈殿により精製した。次に、アメリカカブトガニのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを鋳型に、“SuperScript II Reverse Transcriptase”（インビトロジェン株式会社製）を用い上記リン酸化オリゴＤＮＡをプライマーとしてｃＤＮＡの合成を行った。以下、ライゲーション反応による一本鎖ｃＤＮＡのコンカテマー化を“5’-Full RACE Core Set”（タカラバイオ株式会社製）を用いて行い、生成したコンカテマー化ｃＤＮＡを鋳型として配列番号１２および配列番号１３記載（Ｄ−ＬＤＨ１用）、あるいは配列番号１４および配列番号１５記載（Ｄ−ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡをプライマーとして1度目のＰＣＲ、さらに、その反応液を鋳型として配列番号１６および配列番号１７記載（Ｄ−ＬＤＨ１用）、あるいは配列番号１８および配列番号１９記載（Ｄ−ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡをプライマーとして２度目のＰＣＲを行った。増幅断片の確認、精製および塩基配列の決定は前述の通り行った。

【0079】

３’ＲＡＣＥは以下の方法で行った。まず、アメリカカブトガニのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを鋳型に、“SuperScript II Reverse Transcriptase”（インビトロジェン株式会社製）を用いＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）をプライマーとしてｃＤＮＡの合成を行った。次に、この反応液を鋳型としてＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）および配列番号１３記載（Ｄ−ＬＤＨ１用）、あるいは配列番号１５記載（Ｄ−ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡをプライマーとして1度目のＰＣＲを行い、さらに、その反応液を鋳型としてＯｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）および配列番号１７記載（Ｄ−ＬＤＨ１用）、あるいは配列番号１９記載（Ｄ−ＬＤＨ２用）のオリゴＤＮＡをプライマーとして２度目のＰＣＲを行った。増幅断片の確認、精製および塩基配列の決定は前述の通り行った。

【0080】

アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）およびｃＤＮＡのＯＲＦ配列（配列番号３）、あるいはＤ−ＬＤＨ２のアミノ酸配列（配列番号２）およびｃＤＮＡのＯＲＦ配列（配列番号４）は、上記の方法で得られた配列をつなぎ合わせて決定した。なお、ＢＬＡＳＴによる配列番号１および配列番号２に記載のアミノ酸配列間の配列同一性は９３％であり、配列番号３および配列番号４に記載の塩基配列間の配列同一性は８２％であった。

【0081】

（実施例２）アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドの構築
実施例１で決定したアメリカカブトガニ由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子と思われるＤ−ＬＤＨ１遺伝子およびＤ−ＬＤＨ２遺伝子（以下、それぞれＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子、Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ２遺伝子という）のＯＲＦ５’側とＯＲＦ３’側に相当する配列番号２０および配列番号２１記載のオリゴＤＮＡまたは配列番号２２および配列番号２３記載のオリゴＤＮＡをプライマーセットとして、アメリカカブトガニのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行ない、遺伝子のクローニングを行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断した酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（ＴＤＨ３プロモーターおよび選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を搭載、特開２００６−２８０３６８号公報参照。なお、ＴＤＨ３プロモーターおよびターミネーターがＧＡＰＤＨプロモーターおよびターミネーターと表記してある。）の切断部位に導入し、ＴＤＨ３プロモーターと、Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子またはＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ２遺伝子が連結されたＤＮＡ構築物を含むプラスミドベクターを作製した。以後、これらのプラスミドベクターをｐＴＲＳ２０５（Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１を保持する）およびｐＴＲＳ２０６（Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ２を保持する）とする。ここでｐＴＲＳ１１ベクターは、ｐＮＶ１１ベクター（Nature, vol. 357, 25 JUNE 1992, p.700参照）を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、インサートを除いた後にセルフライゲーションすることで作成した。

【0082】

（実施例３）アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドの酵母への導入
実施例２のようにして得られたｐＴＲＳ２０５およびｐＴＲＳ２０６を酵母であるサッカロミセス・セレビセＳＷ０２９−１Ｂ株（遺伝子型：MATa ura TRP(Δpdc1::TRP1) his ade lys leu）（以下、ＳＷ０２９−１Ｂ株という）に導入した。プラスミドの導入は、“YEASTMAKER Yeast Transformation System”（クロンテック社製）を用いた酢酸リチウム法により行った（詳細は、付属のプロトコール参照）。宿主とするＳＷ０２９-１Ｂ株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ２０５および２０６の持つ選択マーカーＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ２０５および２０６の導入された形質転換酵母の選択が可能である。このようにして得られた形質転換体へのＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクター導入の確認は、ウラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キット“Ｇｅｎとるくん”（タカラバイオ株式会社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として用いたＰＣＲにより行った。プライマーには、アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマーをそれぞれ使用した。その結果、全ての形質転換酵母において、各アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子がそれぞれ導入されていることを確認した。

【0083】

（実施例４）Ｄ−乳酸生産性テスト１
実施例３のようにして得られたｐＴＲＳ２０５および２０６が導入されたサッカロミセス・セレビセＳＷ０２９−１Ｂ株（以下、ＳＷ０２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ２０５株、ＳＷ０２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ２０６株という）を用いてＤ−乳酸生産性テストを行った。

【0084】

表１に示した組成のＳＣ３培地からウラシルを除いた培地（ＳＣ３−Ｕｒａ培地）１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量の各株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前培養）。次に、ＳＣ３−Ｕｒａ培地１０ｍＬを試験管にいれ、各前培養液をそれぞれ１００μＬ植菌し、３０℃で振とう培養した（本培養）。本培養開始後４０時間の培養液を遠心分離し、上清に含まれる乳酸を下記に示す条件でＨＰＬＣにより測定した。
カラム：“Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ”（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。

【0085】

また、Ｄ−乳酸の光学純度は、以下の条件でＨＰＬＣ法により測定したＤ−乳酸およびＬ−乳酸濃度の測定結果から、次式に基づいて計算した。
カラム：“ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｅｎａｎｔｉｏ ＬＩ”（登録商標：東ソー株式会社製）
移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
温度：３０℃。
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝１００×（Ｄ−Ｌ）／（Ｄ＋Ｌ）
光学純度（％）＝１００×Ｄ／（Ｄ＋Ｌ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。

【0086】

【表1】

【0087】

その結果、Ｄ−乳酸の蓄積濃度はＳＷ０２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ２０５株で１３ｇ／Ｌ、ＳＷ０２９−１Ｂ／ｐＴＲＳ２０６株で１２ｇ／Ｌであった。また、培養液中にはＤ−乳酸のみ検出され、Ｌ−乳酸は検出限界以下であった。アメリカカブトガニよりクローニングしたＤ−ＬＤＨ遺伝子を酵母に導入することで、該形質転換酵母はＤ−乳酸を産生することが確認できた。

【0088】

（実施例５）アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の酵母染色体への導入
以下のステップ１〜３により、アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む相同組換え用ＤＮＡ構築物を作製した。

【0089】

［ステップ１］
実施例２で得られたＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子を保持するｐＴＲＳ２０５およびＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ２遺伝子を保持するｐＴＲＳ２０６を鋳型として配列番号２４および２５記載のオリゴＤＮＡまたは配列番号２６および２５記載のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲにより、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。ここで配列番号２４，２６記載のオリゴＤＮＡはＰＤＣ１遺伝子の上流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようにデザインした。

【0090】

［ステップ２］
次にプラスミドｐＲＳ４２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ０３４５３）を鋳型として配列番号２７および２８記載のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。ここで配列番号２８に記載のオリゴＤＮＡはＰＤＣ１遺伝子の下流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようにデザインした。

【0091】

［ステップ３］
ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離した後、“QIA quick Gel extraction kit”（キアゲン株式会社製）を用いて精製した。ここで得られたＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む１．１ｋｂ断片、ＴＲＰ１遺伝子を含む１．４ｋｂ断片をそれぞれ混合したものを鋳型として配列番号２４および２８記載のオリゴＤＮＡまたは配列番号２６および２８記載のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲにより各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーターおよびＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂの相同組換え用ＤＮＡ構築物を増幅した。

【0092】

上記のようにして作製した相同組換え用ＤＮＡ構築物をサッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株（以下、ＮＢＲＣ１０５０５株という）のリジン栄養要求性を復帰させた株であるサッカロミセス・セレビセＳＷ０９２−２Ｄ株（以下、ＳＷ０９２−２Ｄ株という）に形質転換した。

【0093】

なお、ＳＷ０９２−２Ｄ株の作製法は次の通りである。フナコシ株式会社製のサッカロミセス・セレビセＢＹ４７４１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号２９，３０）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＹＳ２遺伝子の前半約２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換操作を行い、ＬＹＳ２遺伝子のアンバー変異を解除した。リジン非添加培地で培養することにより、リジン合成能が復帰した形質転換株（ＮＢＲＣ１０５０５（ＬＹＳ２）株）を選択した。形質転換株が、ＬＹＳ２遺伝子のアンバー変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＹＳ２遺伝子を持つサッカロミセス・セレビセＬ０ＧＹ７株とを接合させ２倍体細胞を得て、該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖してそれぞれの一倍体細胞を取得し（テトラッド）、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがリジン合成能を持っていることを確認した。得られたＮＢＲＣ１０５０５（ＬＹＳ２）株とＮＢＲＣ１０５０６株を接合し、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖によりＳＷ０９２−２Ｄ（遺伝子型：MATa ura3 leu2 trp1 his3 ade2 LYS2）株を得た。

【0094】

上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を用いてＳＷ０９２−２Ｄ株を形質転換し、トリプトファン非添加の培地で培養することで形質転換酵母を選抜した。このようにして得られた形質転換酵母をＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１−ＴＲＰ１）株およびＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＤＬＨ２−ＴＲＰ１）株とする。

【0095】

（実施例６）Ｄ−乳酸生産性テスト２
実施例５で作製したＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１−ＴＲＰ１）株、ＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ２−ＴＲＰ１）株を用いてミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ株式会社製、５Ｌ）を用いて発酵評価を行った。

【0096】

表１に示すＳＣ３培地１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量の各株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、４５ｍＬのＳＣ３培地を投入した三角フラスコに前々培養液を５ｍＬ加え、３０℃でさらに8時間培養した（前培養）。１ＬのＳＣ３培地を投入したミニジャーファメンターに前培養液を全量植菌して、３０時間培養を行った。培養条件を以下に示す。
ｐＨ：ｐＨ５
通気：１００ｍＬ／ｍｉｎ
攪拌：１２０ｒｐｍ
中和剤：１Ｎ 水酸化ナトリウム。

【0097】

培養終了時の培養液量および培養液中のＤ−乳酸濃度及びグルコース濃度を“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬株式会社製）で測定し、該乳酸、及びグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された乳酸対糖収率を求めた。その結果、ＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１−ＴＲＰ１）は対糖収率４５％、ＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ２−ＴＲＰ１）は対糖収率４２％でＤ−乳酸を生産していることが確認できた。

【0098】

（比較例１）乳酸菌由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子のクローニング、発酵評価
形質転換酵母においてＤ−乳酸を効率よく発酵生産しうるＤ−ＬＤＨ遺伝子としては、ロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ９１３５株由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子が公知であり（ＷＯ２００４／１０４２０２参照）、該Ｄ−ＬＤＨ遺伝子（以下、Ｌｍ．Ｄ−ＬＤＨ遺伝子という）をクローニングして酵母に導入・発酵することでアメリカカブトガニ由来のＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子またはＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ２遺伝子とのＤ−ＬＤＨ活性の比較検討を行った。

【0099】

Ｌｍ．Ｄ−ＬＤＨ遺伝子のクローニングは、ＷＯ２００４／１０４２０２に記載の塩基配列を参考に設計したプライマーセット（配列番号３１、３２）を用いてＡＴＣＣ９１３５株をテンプレートとしたコロニーＰＣＲ（東洋紡株式会社製“KOD-Plus-polymerase”を使用）により行った。ＰＣＲ増幅断片を精製し末端を“T4 Polynucleotide Kinase”（タカラバイオ株式会社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、“DNA Ligation Kit Ver.2”（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することによりＬｍ．Ｄ−ＬＤＨ遺伝子がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬｍ．Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてＬｍ．Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドｐＴＲＳ２０７を得た。

【0100】

次に、ｐＴＲＳ２０７を鋳型として、配列番号２４または２６に示すプライマーの代わりに配列番号３３に示すプライマーセットを用いた点を除いて実施例５と同様の方法でＬｍ．Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をサッカロミセス・セレビセＳＷ０９２−２Ｄ株の染色体中のＰＤＣ１遺伝子座に導入した。作製した形質転換酵母をＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｍ．Ｄ−ＬＤＨ−ＴＲＰ１）とする。次に、実施例６と同様な方法で、バッチ培養によるＤ−乳酸生産性の評価を行った。その結果、ＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｍ．Ｄ−ＬＤＨ−ＴＲＰ１）の対糖収率は３８％であった。実施例６の結果と合わせて表２に示す。

【0101】

【表2】

【0102】

（参考例１）アフリカツメガエル由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子導入酵母の作製
特開２００８−０２９３２９号公報に記載されている方法により、アフリカツメガエル由来のＬ−ＬＤＨ遺伝子（Ｘ．Ｌ−ＬＤＨ遺伝子）をＰＤＣ１遺伝子座に導入した酵母を作製した。なお、染色体に導入する酵母としてＮＢＲＣ１０５０６株のアデニン栄養要求性を復帰させた株（ＳＵ０１３−１Ｄ株）を用いた。ＳＵ０１３−１Ｄ株の作成方法を以下に示す。プラスミドｐＲＳ４２２を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号３４，３５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＡＤＥ２遺伝子のＰＣＲ断片約２ｋｂを増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、形質転換操作を行い、ＡＤＥ２遺伝子の変異を解除した。アデニン非添加培地で培養することにより、アデニン合成能が復帰した形質転換株を選択した。

【0103】

上記のようにして得られた形質転換株が、ＡＥＤ２遺伝子の変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＡＤＥ２遺伝子を持つサッカロミセス・セレビセＬ０ＧＹ７７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖してそれぞれの一倍体細胞を取得し（テトラッド）、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがアデニン合成能を持っていることを確認した。得られたＮＢＲＣ１０５０６（ＡＤＥ２）株とＮＢＲＣ１０５０５株を接合し、マイクロマニピュレーターでの子嚢解剖によりＳＵ０１３−１Ｄ株（遺伝子型：MATα ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 lys2）を得た。得られた形質転換酵母をＳＵ０１３−１Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｘ．Ｌ−ＬＤＨ−ＴＲＰ１）株とする。

【0104】

（実施例７、比較例２）Ｄ−乳酸生産性テスト３
参考例１のようにして作製したＳＵ０１３−１Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｘ．Ｌ−ＬＤＨ−ＴＲＰ１）株と、実施例５および比較例１で作製したＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１−ＴＲＰ１）株、ＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ２−ＴＲＰ１）株およびＳＷ０９２−２Ｄ（Δｐｄｃ１：：Ｌｍ．Ｄ−ＬＤＨ−ＴＲＰ１）株をそれぞれ接合させ、ＰＤＣ１遺伝子座にＬ−ＬＤＨ遺伝子とＤ−ＬＤＨ遺伝子をヘテロに有する２倍体酵母を作製した。作製した２倍体酵母をそれぞれＬｐ１−Ｘ株、Ｌｐ２−Ｘ株、Ｌｍ−Ｘ株とする。

【0105】

次に、Ｌｐ１−Ｘ株、Ｌｐ２−Ｘ株、Ｌｍ−Ｘ株を実施例５と同様な条件でバッチ培養を行い、生産した乳酸の光学純度を評価した（表３）。

【0106】

【表3】

【0107】

その結果、アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を有する酵母は、光学純度５０％以上でＤ−乳酸を産生したのに対し、ロイコノストック・メセンテロイデス由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を有する酵母が産生したＤ−乳酸の光学純度は４４．４％であった。各酵母が生産するＤ−乳酸の対糖収率およびＤ−乳酸の光学純度は、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子形質転換酵母内でのＤ−ＬＤＨ活性に比例すると考えられることから、表２および表３の結果からロイコノストック・メセンテロイデス由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子よりもアメリカカブトガニ由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子の方が、酵母に導入した場合に高活性のポリペプチドをコードすることが確認できた。

【0108】

（実施例８）酵母染色体中へのＤ−ＬＤＨ遺伝子の多コピー導入および温度感受性変異型ＰＤＣ５酵母の作製
次に、更なるＤ−乳酸収率向上を目的としてＰＤＣ１遺伝子座以外の遺伝子座にもアメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母の作製を検討し、特開２００８−０２９３２９号公報に導入効果が記載されているＴＤＨ３遺伝子および国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０７２１２９に導入効果が記載されているＳＥＤ１遺伝子座に導入した。また、特開２００８−０４８７２６号公報に記載されている温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子も導入した。

【0109】

［ＴＤＨ３遺伝子座へのＤ−ＬＤＨ遺伝子導入］
ＴＤＨ３遺伝子座への導入のために、特開２００８−０２９３２９号公報に記載されているｐＴＲＳ１５０の作製方法と同様に、Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子を保持するｐＴＲＳ２０５のＴＤＨ３ターミネーターをＡＤＨ１ターミネーターに置換したプラスミドｐＴＲＳ２０８を作製した。次に、特開２００８−０２９３２９号公報中の配列番号８の代わりに配列番号３６に示すプライマー用い、ｐＴＲＳ２０８を鋳型としてＴＤＨ３遺伝子座導入用の相同組換え用ＤＮＡ構築物を得た。

【0110】

上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を導入する酵母としては、ＳＵ０１３−１Ｄ株のロイシン非要求性株（ＳＷ０８７−２Ｃ株）を用いた。ＳＷ０８７−２Ｃ株の作成方法を以下に示す。プラスミドｐＲＳ４２５を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号３７，３８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＥＵ２遺伝子のＰＣＲ断片約２ｋｂを増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１３−１Ｄ株の形質転換操作を行い、ＬＥＵ２遺伝子の変異を解除した。ロイシン非添加培地で培養することにより、ロイシン合成能が復帰した形質転換株を選択した。このようにして得られた形質転換株が、ＬＥＵ２遺伝子の変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＥＵ２遺伝子を持つサッカロミセス・セレビセＬ０ＧＹ７７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖してそれぞれの一倍体細胞を取得し（テトラッド）、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがロイシン合成能を持っていることを確認した。得られたＳＵ０１３−１Ｄ（ＬＥＵ２）株とＮＢＲＣ１０５０５株を接合し、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖によりＳＷ０８７−２Ｃ株（遺伝子型：MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2）を得た。

【0111】

上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を用いてＳＷ０８７−２Ｃ株を形質転換し、ウラシル非添加培地でセレクションすることでＴＤＨ３遺伝子座にＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子が導入された形質転換酵母を得た。得られた形質転換酵母をＳＷ０８７−２Ｃ（ΔＴＤＨ３：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ−ＵＲＡ３）株とする。

【0112】

［ＳＥＤ１遺伝子座へのＤ−ＬＤＨ遺伝子導入］
ＳＥＤ１遺伝子座への導入法は、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０７２１２９の実施例２に記載されている方法を改変して行った。すなわち、ＰＣＲの鋳型としてｐＴＲＳ１０２の代わりにｐＴＲＳ２０５を用い、また上記公報中の配列番号１４の代わりに配列番号３９に示すプライマーを用いてＳＥＤ１遺伝子座導入用の相同組換え用ＤＮＡ構築物を増幅した。

【0113】

上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を導入する酵母としては、実施例５で作製したＮＢＲＣ１０５０５（ＬＹＳ２）株と参考例１で作製したＮＢＲＣ１０５０６（ＡＤＥ２）株を接合させ、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖により分離したＳＷ０９２−７Ｄ株（遺伝子型：MATa ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 LYS2）株を用いた。

【0114】

上記相同組換え用ＤＮＡ構築物を用いてＳＷ０９２−７Ｄ株を形質転換し、ヒスチジン非添加培地でセレクションすることでＳＥＤ１遺伝子座にＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子が導入された形質転換酵母を得た。得られた形質転換酵母をＳＷ０９２−７Ｄ（ΔＳＥＤ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ−ＨＩＳ３）株とする。

【0115】

［温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子（ｐｄｃ５ｔｓ−９）の導入］
温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子が導入された酵母として、特開２００８−０４８７２６号公報に記載の、温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子（ｐｄｃ５ｔｓ−９）を有する酵母ＳＷ０１５株を用いた。ＳＷ０１５株とＳＷ０８７−２Ｃ株を接合させ、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖により分離することでＳＷ０９５−４Ｂ株（遺伝子型：MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2 pdc5ts-9 Δpdc1::TRP1）を得た。さらに、ＳＷ０９５−４Ｂ株とＳＷ０９２−２Ｄ株を接合させ、マイクロマニピュレーターによる子嚢解剖により分離することで、ＳＷ０９８−２１Ｂ株（遺伝子型：MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 LYS2 pdc5ts-9）を得た。

【0116】

［ＰＤＣ１、ＴＤＨ３およびＳＥＤ１遺伝子座へのＤ−ＬＤＨ遺伝子導入、ならびに温度感受性変異型ＰＤＣ５遺伝子（ｐｄｃ５ｔｓ−９）の導入］
作製したＳＷ０９２−２Ｄ（ΔＰＤＣ１：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１−ＴＲＰ１）株、ＳＷ０８７−２Ｃ（ΔＴＤＨ３：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１−ＵＲＡ３）株、ＳＷ０９２−７Ｄ（ΔＴＤＨ３：：Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１−ＨＩＳ３）およびＳＷ０９８−２１Ｂを用いて、２倍体接合、テトラッドを繰り返しＰＤＣ１、ＴＤＨ３およびＳＥＤ１遺伝子座にＬｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子を有し、温度感受性変異型ＰＤＣ５（ｐｄｃ５ｔｓ−９）を有し、かつ、２倍体でアデニン・ロイシン・リジンの栄養要求性を有さないＳＵ０４２株を得た。ＳＵ０４２株の作製手順を図１に示す。

【0117】

（実施例９）Ｄ−乳酸生産性のテスト４
実施例８のようにして作製したＳＵ０４２株を用いて、バッチ培養によるＤ−乳酸生産性のテストを行った。培地には表１に示すＳＣ３培地または原料糖培地（１００ｇ／Ｌ “優糖精”（ムソー株式会社製）、１．５ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム）を用いた。まず、ＳＵ０４２株を試験管で５ｍｌのＳＣ３培地または原料糖培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＳＣ３培地または原料糖培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。ミニジャーファメンター（Ａｂｌｅ社製、２Ｌ）に１ＬのＳＣ３培地または原料糖培地を投入し、温度調整（３２℃）、ｐＨ制御（ｐＨ５、５Ｎ 水酸化カルシウム）を行い、通気・攪拌（２００ｍＬ／ｍｉｎ，４００ｒｐｍ）させながら培養を行った。その結果ＳＣ３培地では培養は３０時間で終了し、対糖収率は６３％であった。また、原料糖培地では、培養は５０時間で終了し、対糖収率は７０％であった。この結果から、Ｌｐ．Ｄ−ＬＤＨ１遺伝子のＰＤＣ１、ＴＤＨ３、ＳＥＤ１遺伝子座への導入およびＰＤＣ５遺伝子への温度感受性変異の導入によりＤ−乳酸の発酵性能が向上することが確認できた。

【0118】

（実施例１０）連続培養によるＤ−乳酸生産性テスト
ＳＵ０４２株を用いて、ＷＯ２００７／０９７２６０に記載されている分離膜を用いた連続培養の検討を行った。培地には原料糖培地（７５ｇ／Ｌ “優糖精”（ムソー株式会社製）、１．５ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム）を用いた。培養条件を下記に示す。
発酵槽容量：２（Ｌ）
培養液容量：１．５（Ｌ）
使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜（ＷＯ２００７／０９７２６０の参考例２に記載）
膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ^２
温度調整：３２（℃）
発酵反応槽通気量：空気０．０２（Ｌ／ｍｉｎ）、窒素ガス０．１８（Ｌ／ｍｉｎ）
発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ 水酸化カルシウムによりｐＨ５に調整
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。

【0119】

まず、ＳＵ０４２株を試験管で１０ｍｌの原料糖培地で３０℃、一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な原料糖培地１００ｍｌに全量植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、１．５Ｌの原料糖培地を投入した膜一体型の連続培養装置（ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す装置）に植菌し、培養開始５０時間からペリスタポンプによる培養液抜き出しを開始し（２００ｍＬ／ｈ）、４００時間まで培養を行い、生産物質である乳酸濃度および乳酸生産速度を測定した。結果を図２に示す。なお、連続培養中の乳酸生産速度は以下の式１を用いて算出した。

【0120】

乳酸生産速度（ｇ／Ｌ・ｈ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・（式１）。

【0121】

分離膜を用いた連続培養を行った結果、Ｄ−乳酸の対糖収率は８５％程度までさらに向上し、また、Ｄ−乳酸生産速度は７．５ｇ／Ｌ・ｈまで向上することが確認できた。

【0122】

（実施例１１）キャンディダ・ユーティリスへのアメリカカブトガニＤ−ＬＤＨの導入
次に、クラブツリー陰性酵母であるキャンディダ・ユーティリスを用いたＤ−乳酸の検討を行った。

【0123】

（ａ）アメリカカブトガニＤ−ＬＤＨ遺伝子導入用ベクターの作製
まず、キャンディダ・ユーティリス染色体中のＰＤＣ１遺伝子座にアメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を導入するためのベクター構築を行った。キャンディダ・ユーティリス ＮＢＲＣ０９８８株（以下、ＮＢＲＣ０９８８）をＹＰＤ培地（１％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，２％ Ｂａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ、２％ グルコース）に植菌し、３０℃で一晩培養した。得られた菌体から定法に従い、ゲノムＤＮＡを抽出して続くＰＣＲの鋳型とした。まず、配列番号４０，４１のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしてＰＤＣ１遺伝子のターミネーター領域を含む断片を増幅した。なお、特に断りのない限り、ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡株式会社製）を用いて、付属のプロトコールに従って行った。得られた約１ｋｂの断片を制限酵素ＢｓｓＨＩで切断し、それを精製した後に、同じく制限酵素ＢｓｓＨＩで予め切断しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＫＳ０１とする。

【0124】

次に、同じくＮＢＲＣ０９８８のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号４２，４３のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＧＫプロモーターを含む断片を増幅した。得られた約１ｋｂの断片を精製して続く実験に用いた。次に、抗生物質の一種であるハイグロマイシンＢに対する耐性を付与しうる遺伝子であるｈｐｈ遺伝子を有するプラスミドｐＬＣ１−ｈｐｈを鋳型として、配列番号４４，４５のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ｈｐｈ遺伝子を含む断片を増幅・精製し、約１．１ｋｂの断片を得た。また、ＮＢＲＣ０９８８のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号４６，４７のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＧＡＰターミネーターを含む断片を増幅・精製し、約５００ｂｐの断片を得た。

【0125】

上記のようにして得られたＰＧＫプロモーターを含む断片、ｈｐｈ遺伝子を含む断片およびＧＡＰターミネーターを含む断片を混合して配列番号４８，４９のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによってＰＧＫプロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびＧＡＰターミネーターが連結された断片を増幅した。得られた約２．６ｋｂの断片の末端をリン酸化した後に、ｐＵＣ１１８をＨｉｎｃＩＩで切断して脱リン酸化しておいたものにライゲーションした。得られたプラスミドをｐＫＳ０２とする。

【0126】

次に、同じくＮＢＲＣ０９８８のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号５０，５１のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＧＫターミネーターを含む断片を増幅・精製し、約５００ｂｐの断片を得た。また、上記のようにして得られたｐＫＳ０２を鋳型として、配列番号５２，５３のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＧＫプロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびＧＡＰターミネーターが連結された断片を増幅・精製し、約２．６ｋｂの断片を得た。

【0127】

上記のようにして得られたＰＧＫターミネーターを含む断片およびＰＧＫプロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびＧＡＰターミネーターが連結された断片を混合し、配列番号５０，５３のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＧＫターミネーターＰＧＫプロモーター、ｈｐｈ遺伝子およびＧＡＰターミネーターが連結された断片を増幅した。得られた約３ｋｂの断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切断し、それを精製した後に、同じく制限酵素ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで予め切断しておいたｐＫＳ０２にライゲーションした。得られたプラスミドｐＫＳ０３とする。

【0128】

次に、同じくＮＢＲＣ０９８８のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号５４，５５のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＤＣ１プロモーター領域を含む断片を増幅・精製し、約２．１ｋｂの断片を得た。また、実施例２で作製したｐＴＲＳ２０５を鋳型として、配列番号５６，５７のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、アメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む断片を増幅・精製し、約１ｋｂの断片を得た。

【0129】

上記のようにして得られたＰＤＣ１プロモーター領域を含む断片およびアメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む断片と混合し、配列番号５４，５７のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、ＰＤＣ１プロモーター領域を含む断片とアメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む断片が連結された断片を増幅して得られた約３．１ｋｂの断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、それを精製した後に、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで予め切断しておいたｐＫＳ０３にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＫＳ０４とする。

【0130】

（ｂ）アメリカカブトガニＤ−ＬＤＨ遺伝子のＰＤＣ１遺伝子座への導入
上記のようにして得られたｐＫＳ０４を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断したものをエレクトロポレーション法によってＮＢＲＣ０９８８に導入した。ＹＰＤ培地に少量の菌体を植菌し、３０℃で一晩培養した。遠心して上清を廃棄した後に、菌体を滅菌水および１Ｍ ソルビトールで洗浄し、最終的に１Ｍ ソルビトールに菌体を懸濁した。次に、菌体と制限酵素ＢｇｌＩＩで切断したｐＫＳ０４を混合し、氷上で５分置いた後に、エレクトロポレーション用のキュベットに移し、Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ（２５μＦ）、電圧（０．７５ｋＶ）と抵抗（８００Ω）の条件でエレクトロポレーションを行った。その後、１Ｍ ソルビトール入りのＹＰＤ培地に移し、３０℃で4時間程度培養し、６００μｇ／ＬのハイグロマイシンＢを添加したＹＰＤ培地に塗布した。得られたハイグロマイシンＢ耐性株からゲノムを抽出し、配列番号５４，５７および配列番号５６，５１のオリゴＤＮＡをプライマーセットとしたＰＣＲによって、それぞれ約３ｋｂおよび２ｋｂの断片の増幅を確認することにより、ＰＤＣ１遺伝子座にアメリカカブトガニ由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子が導入された形質転換酵母が得られたことを確認した。得られた形質転換酵母をＣｕＬｐＬＤＨ株とする。

【0131】

（比較例２）キャンディダ・ユーティリスへの乳酸菌由来Ｄ−ＬＤＨの導入
実施例１１と同様の方法で乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデス由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入した。なお、実施例１１では配列番号５５の代わりに配列番号５８のオリゴＤＮＡを用い、また実施例２のｐＴＲＳ２０５の代わりに比較例１のｐＴＲＳ２０７を鋳型とするとともに、配列番号５６，５７の代わりに配列番号５９，６０のオリゴＤＮＡを用いた。得られたプラスミドをｐＫＳ０５とする。

【0132】

上記のようにして得られたプラスミドを実施例１１と同様の方法でＮＢＲＣ０９８８株に導入した。得られたＰＤＣ１遺伝子座に乳酸菌ロイコノストック・メセンテロイデ由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子が導入されている株をＣｕＬｍＬＤＨ株とする。

【0133】

（実施例１２、比較例３）キャンディダ・ユーティリスのＤ−乳酸生産性テスト
実施例１１および比較例２で作製したＣｕＬｐＬＤＨ株、ＣｕＬｍＬＤＨ株を用いて、Ｄ−乳酸生産性を評価した。５００ｍｌの坂口フラスコに５０ｍｌのＹＰＤ培地を加え、そこに少量のＣｕＬｐＬＤＨ株およびＣｕＬｍＬＤＨ株を植菌し、３０℃で一晩振とう培養した（前培養）。培養液を集菌し、新鮮なＹＰＤ培地で洗浄した後、１ＬのＹＰＤ１０培地（１０％ グルコース含有）を添加したミニジャーファメンターに投入し、培養を行った。培養条件を以下に示す。
初期植菌量：ＯＤ_６００＝１０になるように植菌
ｐＨ：ｐＨ６
通気：１００ｍＬ／ｍｉｎ
攪拌：１２０ｒｐｍ
中和剤：１Ｎ 水酸化カルシウム
培養温度：３５℃。

【0134】

培養は４０時間行い、４０時間時点の培養液の乳酸濃度、グルコース濃度を分析した。グルコースは消費されつくされていた。また、消費グルコース当たりの生産性（対糖収率）およびＤ−乳酸光学純度は表４に示す通り、キャンディダ・ユーティリスにＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母はＤ−乳酸を発酵生産可能なことがわかり、また収率はアメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を導入したＣｕＬｐＬＤＨ株の方が高かった。

【0135】

（実施例１３、比較例４）キャンディダ・ユーティリスのＤ−乳酸生産性テスト２
次に、ＣｕＬｐＬＤＨ株、ＣｕＬｍＬＤＨ株を用いて、５単糖であるキシロースを糖源としたＤ−乳酸生産性の評価を行った。５００ｍｌの坂口フラスコに５０ｍｌのＹＰＤ培地を加え、そこに少量のＣｕＬｐＬＤＨ株およびＣｕＬｍＬＤＨ株を植菌し、３０℃で一晩振とう培養した（前培養）。培養液を集菌し、新鮮なＹＰＤ培地で洗浄した後、１ＬのＹＰＸ１０培地（１％ 酵母エキス、２％ バクトペプトン、４％ キシロース）を添加したミニジャーファメンターに投入し、培養を行った。培養条件を以下に示す。
初期植菌量：ＯＤ_６００＝１０になるように植菌
ｐＨ：ｐＨ６
通気：１００ｍＬ／ｍｉｎ
攪拌：１２０ｒｐｍ
中和剤：１Ｎ 水酸化カルシウム
培養温度：３０℃。

【0136】

培養は６０時間行い、６０時間時点の培養液の乳酸濃度、キシロース濃度を分析した。キシロースは消費されつくされていた。また、消費キシロース当たりの生産性（対糖収率）およびＤ−乳酸光学純度は表４に示す通り、キャンディダ・ユーティリスにＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入した酵母は、キシロースを原料としてＤ−乳酸を発酵生産可能なことがわかり、また収率はアメリカカブトガニ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子導入したＣｕＬｐＬＤＨ株の方が高かった。

【0137】

【表4】

【産業上の利用可能性】

【0138】

本発明により、Ｄ−乳酸を低コストで安定に生産することが可能になり、また、得られるＤ−乳酸は光学純度が高く、ポリマー原料として好ましく使用される。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]