特許 5803927 含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5803927

(24)【登録日】2015年9月11日

(45)【発行日】2015年11月4日

(54)【発明の名称】含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20151015BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20151015BHJP

   C12P 13/12 20060101ALI20151015BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12N15/00 A

   C12P13/12 B

   C12P13/12 C

   C12P13/12 Z

【請求項の数】11

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2012-534010(P2012-534010)

(86)(22)【出願日】2011年9月13日

(86)【国際出願番号】JP2011070850

(87)【国際公開番号】WO2012036151

(87)【国際公開日】20120322

【審査請求日】2014年3月25日

(31)【優先権主張番号】特願2010-205019(P2010-205019)

(32)【優先日】2010年9月14日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000066

【氏名又は名称】味の素株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】野中 源

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 J. Bacteriol.，２００８年，Vol.190，p.5439-5454

【文献】 J. Bacteriol.，２００５年，Vol.187，p.6333-6340

【文献】 Microbiology，２００９年，Vol.155，p.813-824

【文献】 J. Bacteriol.，２００７年，Vol.189，p.5429-5440

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], Accession No. AB453015，２００９年，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB453015

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], Accession No. P33015，２０１０年 ８月，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/465569?sat=13&satkey=1607532

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｐ １３／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

含硫アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地中で培養し、該培地から含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物の製造法であって、
前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、方法。
（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質。

【請求項2】

ｙｅｅＥ遺伝子の発現量を増大させること、又は、ｙｅｅＥ遺伝子の翻訳量を増大させることにより、前記タンパク質の活性が増大した、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ｙｅｅＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ｙｅｅＥ遺伝子の発現量が増大した、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ｙｅｅＥ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項5】

前記細菌が、さらに、下記の性質の少なくともいずれかを有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
ｉ）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
ｉｉ）ｙｄｅＤ遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
ｉｉｉ）３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。

【請求項6】

前記細菌がエシェリヒア属細菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記細菌がパントエア属細菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記含硫アミノ酸がＬ−システインである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記含硫アミノ酸がＬ−システインであり、前記関連物質がシスチン又はチアゾリジン誘導体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ−システイン等の含硫アミノ酸又はその関連物質の製造法に関し、詳しくは含硫アミノ酸又はその関連物質の製造に好適な細菌、及びそれを用いた含硫アミノ酸又はその関連物質の製造法に関する。含硫アミノ酸及びその関連物質は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。

【背景技術】

【0002】

従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。

【0003】

Ｌ−システイン生産能を有する微生物としては、例えば、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２〜４）。

【0004】

また、Ｌ−システイン分解系を抑制することによってＬ−システイン生産能が高められた微生物としては、シスタチオニン−β−リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献５）、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼＢ（特許文献６）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。

【0005】

さらに、ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている（非特許文献１）。また、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ遺伝子座、ｅｍｒ遺伝子座、ａｃｒ遺伝子座、ｃｍｒ遺伝子座、ｍｅｘ遺伝子、ｂｍｒ遺伝子、若しくはｑａｃＡ遺伝子（特許文献７）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ若しくはｃｕｓＡ遺伝子（特許文献８）の発現を上昇させることによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている。

【0006】

また、Ｌ−システイン生産菌として、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ（特許文献９）が知られている。

【0007】

さらに、セリンによるフィードバック阻害が低減された３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡが知られており、エシェリヒア・コリのＬ−システイン生産に利用することが示唆されている（特許文献１０、１１）。

【0008】

また、メチオニンは、工業的には主に化学合成によりＤＬ体として製造される。Ｌ体が必要な場合は、ＤＬ体をアセチル化してＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンとし、酵素的にＬ体だけを脱アセチル化することによって製造できる。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−メチオニンの生産も試みられている。Ｌ−メチオニン生産菌としては、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、さらに細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、Ｌ−スレオニン要求性を示し、細胞内のシスタチオニンγ−シンターゼ活性及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたエシェリヒア・コリ（特許文献１２）等が知られている。

【0009】

ｙｅｅＥ遺伝子は、膜透過に関わると推定されるタンパク質（putative transport system permease protein）をコードする遺伝子としてデータベースＥｃｏＣｙｃ（非特許文献２）に登録されている。また、膜タンパク質予測プログラムＳＯＳＵＩ(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)を用いて解析すると、ＹｅｅＥは９回膜貫通型の膜タンパク質であると予想される。よって、何らかのトランスポータであると推定されるが、実際の機能は不明であり、含硫アミノ酸生産との関連は知られていない。

【0010】

また、ｙｅｅＥ遺伝子は、カドミウムにより（非特許文献３）、亜鉛により（非特許文献４）、ＣＯ放出剤であるＣＯＲＭ−２により（非特許文献５）、ＲｐｏＥ依存で定常期の初期に（非特許文献６）、及び、ヒトの体温である３７℃の温度条件により（非特許文献７）アップレギュレートされることが報告されている。また、酢酸により（非特許文献８）、ウルソール酸により（非特許文献９）、及び、ＩＨＦ（−）株において（非特許文献１０）ダウンレギュレートされることが報告されている。しかしながら、いずれもマイクロアレイ実験において発現変動のあった多くの遺伝子の一つとして挙げられているのみであり、含硫アミノ酸生産との関連は示唆されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】特開２００２−２３３３８４号公報

【特許文献2】特開平１１−１５５５７１号公報

【特許文献3】米国特許出願公開第２００５０１１２７３１号

【特許文献4】米国特許第６２１８１６８号

【特許文献5】特開２００３−１６９６６８号公報

【特許文献6】特開２００５−２４５３１１号公報

【特許文献7】米国特許第５９７２６６３号

【特許文献8】特開２００５−２８７３３３号公報

【特許文献9】国際公開パンフレット第０１／２７３０７号

【特許文献10】米国特許第５８５６１４８号

【特許文献11】米国特許出願公開第２００５０００９１６２号

【特許文献12】米国特許第７６１１８７３号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Dassler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)

【非特許文献2】BioCyc Home Page, Escherichia coli K-12 substr. MG1655 Gene: ｙｅｅＥ [平成２２年７月１３日検索]、インターネット< http://biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE?type=GENE&object=EG11895>

【非特許文献3】Kerstin et al., J. Bacteriol., Aug 2008; 190: 5439 - 5454

【非特許文献4】Kaneyoshi et al., J. Bacteriol., Sep 2005; 187: 6333 - 6340

【非特許文献5】Ligia S. Nobre et al., Microbiology, Mar 2009; 155: 813 - 824

【非特許文献6】Md. Shahinur Kabir et al., Microbiology, Aug 2005; 151: 2721 - 2735.

【非特許文献7】Christine A. et al., J. Bacteriol., Aug 2007; 189: 5429 - 5440

【非特許文献8】Carrie N. Arnold et al., J. Bacteriol., Apr 2001; 183: 2178 - 2186.

【非特許文献9】Dacheng Ren et al., Appl. Envir. Microbiol., Jul 2005; 71: 4022 - 4034.

【非特許文献10】Stuart M. Arfin et al., J. Biol. Chem., Sep 2000; 275: 29672

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、細菌の含硫アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、含硫アミノ酸生産菌、及び同細菌を用いた含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように細菌を改変することによって含硫アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）含硫アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
（２）ｙｅｅＥ遺伝子の発現量を増大させること、又は、ｙｅｅＥ遺伝子の翻訳量を増大させることにより、前記タンパク質の活性が増大した、前記細菌。
（３）ｙｅｅＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ｙｅｅＥ遺伝子の発現量が増大した、前記細菌。
（４）前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である前記細菌。
（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質。
（５）前記ｙｅｅＥ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記細菌。
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）さらに、下記の性質の少なくともいずれかを有する前記細菌。
ｉ）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
ｉｉ）ｙｄｅＤ遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
ｉｉｉ）３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
（７）前記細菌がエシェリヒア属細菌である、前記細菌。
（８）前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記細菌。
（９）前記細菌がパントエア属細菌である、前記細菌。
（１０）前記細菌がパントエア・アナナティスである、前記細菌。
（１１）前記細菌を培地中で培養し、該培地から含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
（１２）前記含硫アミノ酸がＬ−システインである、前記方法。
（１３）前記含硫アミノ酸がＬ−システインであり、前記関連物質がシスチン又はチアゾリジン誘導体である、前記方法。

【発明の効果】

【0015】

本発明により、細菌の含硫アミノ酸生産能を向上させることができる。また、本発明によれば、含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】野生型ｎｌｐＤプロモーター（Ｐｎｌｐ：配列番号１５）、及び、変異型ｎｌｐＤプロモーター（Ｐｎｌｐ８：配列番号１６）と、ｙｅａＳ遺伝子との連結部位の配列を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0017】

＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、含硫アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。

【0018】

含硫アミノ酸としては、Ｌ−システイン及びＬ−メチオニンが挙げられ、Ｌ−システインが好ましい。また、本発明の細菌は、Ｌ−システイン及びＬ−メチオニンの両方の生産能を有するものであってもよい。

【0019】

また、本発明において含硫アミノ酸とは、フリー体の含硫アミノ酸もしくはその塩、又はそれらの混合物であってもよい。塩としては、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。

【0020】

ここで、含硫アミノ酸生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内に含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。また、含硫アミノ酸生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量の含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味し、好ましくは、０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上の量の含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味する。

【0021】

含硫アミノ酸がＬ−システインである場合には、細菌が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換することがある。また、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ−スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞中に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第２９９２０１０号参照）。これらのチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。また、Ｌ−システインは、γ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン等の生合成の出発物質として用いられる。したがって、Ｌ−システイン生産能に加えて、これらの化合物を産生する能力を有する細菌を用いることによって、これらの化合物を製造することができる。本発明において、Ｌ−システイン生産能とは、Ｌ−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体（例えばＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、ヘミチオケタール）、もしくは前記のようなＬ−システインを経由して生産される他の化合物（例えばγ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン）、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力を含むものとする。また、本発明において、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体、及び前記のようなＬ−システインを経由して生産される他の化合物をまとめてＬ−システインの関連物質という。

【0022】

Ｌ−メチオニンはＬ−システインを出発物質の一つとして生合成される含硫アミノ酸である。また、Ｌ−メチオニンは、Ｓ−アデノシルメチオニン等の生合成の出発物質として用いられる。したがって、含硫アミノ酸がＬ−メチオニンである場合には、Ｌ−メチオニン生産能に加えて、Ｓ−アデノシルメチオニン等を生産する能力を有する細菌を用いることによって、Ｓ−アデノシルメチオニン等を製造することができる。本発明において、Ｌ−メチオニン生産能とは、Ｌ−メチオニンのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−メチオニン、もしくはＬ−メチオニンを経由して生産される他の化合物（例えばＳ−アデノシルメチオニン）、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力を含むものとする。本発明において、前記のようなＬ−メチオニンを経由して生産される他の化合物をＬ−メチオニンの関連物質という。

【0023】

本発明において、含硫アミノ酸生産能とは、Ｌ−システイン、Ｌ−システインの関連物質、Ｌ−メチオニン、もしくはＬ−メチオニンの関連物質、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力をいう。また、本発明において、Ｌ−システインの関連物質とＬ−メチオニンの関連物質を総称して含硫アミノ酸の関連物質ともいう。

【0024】

含硫アミノ酸生産能を有する細菌としては、本来的に含硫アミノ酸生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えＤＮＡ技術を利用して、含硫アミノ酸生産能を有するように改変したものであってもよい。

【0025】

本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)属など、腸内細菌科に属する細菌であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌、又はクレブシエラ属細菌を用いることが望ましい。

【0026】

エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはＮｅｉｄｈａｒｄｔらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）、エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ ４７０７６）等が挙げられる。

【0027】

これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

【0028】

エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。エンテロバクター属の代表的な株としては、エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ １２２８７株が挙げられる。また、具体的には、欧州特許出願公開９５２２２１号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。

【0029】

パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）が挙げられる。

【0030】

パントエア・アナナティスとしては、具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株、ＳＣ１７株が挙げられる。ＳＣ１７株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離されたＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第６，５９６，５１７号）。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。また、パントエア・アナナティスＳＣ１７株は、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所 郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０９１が付与されている。尚、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５株として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

【0031】

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）が挙げられる。

【0032】

なお、特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067）。よって、エンテロバクター属に属する細菌には、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験等により、パントエア・アグロメランス又はパントエア・ディスパーサ（Ｐａｎｔｏｅａ ｄｉｓｐｅｒｓａ）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスには、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、又はパントエア・スチューアルティに再分類されているものがある。また、エルビニア属に属する細菌には、パントエア・アナナス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｓ）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属、パントエア属、及びエルビニア属等のいずれに属するものであってもよい。

【0033】

以下、腸内細菌科に属する細菌に含硫アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの細菌の含硫アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。

【0034】

細菌に含硫アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、含硫アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、１９８６年５月３０日初版発行、第７７−１００頁参照）。ここで、含硫アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強される含硫アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

【0035】

含硫アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、含硫アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ含硫アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

【0036】

以下、腸内細菌科に属する細菌に含硫アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの細菌の含硫アミノ酸生産能を増強する方法、及び含硫アミノ酸生産能を有する細菌について具体的に例示する。

【0037】

Ｌ−システイン生産能の付与又は増強、及びＬ−システイン生産菌
細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、又はＬ−セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素、例えば、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ、又はセリンアセチルトランスフェラーゼ等の活性を増強することにより、向上させることができる。３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、セリンによるフィードバック阻害を受けるが、このフィードバック阻害が低減又は解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。また、セリンアセチルトランスフェラーゼは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受ける。したがって、このフィードバック阻害が低減又は解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｃｙｓＥ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。

【0038】

また、ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子（Dabler et al., Mol. Microbiol.36. 1101-1112 (2000)）、ＹｆｉＫタンパク質をコードするｙｆｉＫ遺伝子（特開２００４−４９２３７）、又はＹｅａＳタンパク質をコードするｙｅａＳ遺伝子（欧州特許出願公開第１０１６７１０号明細書）の発現を強化することによっても、Ｌ−システイン生産能を高めることができる。

【0039】

Ｌ−システイン生産菌は、下記の性質の少なくともいずれかを有するのが好ましい。
ｉ）セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
ｉｉ）ｙｄｅＤ遺伝子の発現が上昇するように改変されている。
ｉｉｉ）３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。

【0040】

また、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系の活性を増強することによっても、Ｌ−システイン生産能を向上させることができる。硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群は、ｃｙｓＰＴＷＡＭ遺伝子クラスターによってコードされている（特開２００５−１３７３６９号公報、ＥＰ１５２８１０８号明細書）。

【0041】

Ｌ−システイン生産菌としては、具体的には、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコードする複数種のｃｙｓＥアレルで形質転換されたエシェリヒア・コリ ＪＭ１５株（米国特許第６，２１８，１６８号）、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（米国特許第５，９７２，６６３号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ（特開平１１−１５５５７１号公報）、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（ＷＯ０１／２７３０７）などのエシェリヒア属に属する株、ｙｄｅＤ遺伝子、変異型ｃｙｓＥ遺伝子および変異型ｓｅｒＡ５遺伝子を保持するプラスミドｐＡＣＹＣ−ＤＥＳ（特開２００５−１３７３６９（ＵＳ２００５０１２４０４９（Ａ１）、ＥＰ１５２８１０８（Ａ１）））を持つエシェリヒア・コリ等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳは、前記３遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４に挿入することによって得られたプラスミドであり、各遺伝子はＰｏｍｐＡプロモーターにより制御される。

【0042】

エシェリヒア・コリでは、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質として、シスタチオニン−β−リアーゼ（ｍｅｔＣ産物、特開平１１−１５５５７１号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)）、トリプトファナーゼ（ｔｎａＡ産物、特開２００３−１６９６６８、（Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218)）、Ｏ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（ｃｙｓＭ遺伝子産物、特開２００５−２４５３１１）、及び、ｍａｌＹ遺伝子産物（特開２００５−２４５３１１）が知られている。これらのタンパク質の活性を低下させることにより、Ｌ−システイン生産能が向上する。

【0043】

本発明においては、Ｌ−システイン生産菌は、フィードバック阻害耐性の変異型ＳＡＴを保持していることが好ましい。エシェリヒア・コリに由来する、フィードバック阻害耐性の変異型ＳＡＴとして具体的には、２５６位のメチオニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型ＳＡＴ（特開平１１−１５５５７１）、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型ＳＡＴ（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する変異型ＳＡＴ（ＷＯ９７／１５６７３号国際公開パンフレット、米国特許第６２１８１６８号）、野生型ＳＡＴの８９〜９６位に相当するアミノ酸配列が１又は複数の変異を含み、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型ＳＡＴ（米国特許公開第２００５０１１２７３１（Ａ１））、９５位及び９６位のＶａｌ残基及びＡｓｐ残基が、各々Ａｒｇ残基及びＰｒｏ残基に置換された変異型ＳＡＴ（変異型遺伝子名ｃｙｓＥ５、ＷＯ２００５００７８４１）、及び、１６７位のスレオニン残基がアラニン残基に置換される変異（米国特許第６２１８１６８号、米国特許公開第２００５０１１２７３１（Ａ１））等が知られている。

【0044】

ＳＡＴ遺伝子は、エシェリヒア・コリの遺伝子に限られず、ＳＡＴ活性を有するタンパク質をコードするものであれば、使用することができる。例えば、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のＳＡＴアイソザイムが知られており、これをコードする遺伝子を用いることもできる（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）。

【0045】

細菌にＳＡＴをコードする遺伝子、特にフィードバック阻害耐性の変異型ＳＡＴをコードする遺伝子を導入し発現させることで、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強することができる。

【0046】

また、ＳＡＴ等のタンパク質をコードする遺伝子のコピー数を高めることによっても、それらのタンパク質の活性を上昇させることができる。

【0047】

Ｌ−システインを出発物質として生合成されるγ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、及びホモシステイン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。

【0048】

例えば、γ−グルタミルシステイン生産能は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性の増強及び／又はグルタチオン合成酵素活性の低下によって、増強することができる。また、グルタチオン生産能はγ−グルタミルシステイン合成酵素活性及び／又はグルタチオン合成酵素活性の増強によって、付与又は増強することができる。また、グルタチオンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素を用いることでもγ−グルタミルシステインやグルタチオンの生産能を増強させることができる。グルタチオンの生産についてはＬｉらの総説（Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 233-242）に詳しく記載されている。

【0049】

シスタチオニン、ホモシステインはＬ−メチオニン生合成経路の中間体であるため、これら物質の生産能を増強するためには、後述するＬ−メチオニンの生産能を増強させる方法を一部利用することが有効である。シスタチオニン生産能を増強させる具体的方法として、メチオニン要求性変異株を用いる方法（特願２００３−０１０６５４）や、発酵培地にシステイン（またはその生合成原料）及び／又はホモセリン（またはその生合成原料）を添加する方法（特開２００５−１６８４２２）が知られている。ホモシステインはシスタチオニンを前駆体とするため、ホモシステイン生産能を増強するためには、シスタチオニン生産能を増強させる上記方法も有効である。

【0050】

Ｌ−メチオニン生産能の付与又は増強、及びＬ−メチオニン生産菌
Ｌ−メチオニン生産能は、Ｌ−スレオニン要求性あるいはノルロイシン耐性を細菌に付与することによって、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、Ｌ−スレオニンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペロン（thrABC）として存在し、例えば、thrBC部分を欠失させることによってＬ−ホモセリン以降の生合成能を失ったＬ−スレオニン要求株を取得することができる。ノルロイシン耐性株では、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化され、Ｌ−メチオニン生産能が付与又は増強される。E. coliにおいては、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼはmetK遺伝子にコードされている。また、Ｌ−メチオニン生産能は、メチオニンリプレッサーの欠損、ホモセリントランスサクシニラーゼ、及びシスタチオニンγ−シンテース、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII等のＬ−メチオニン生合成に関与する酵素の活性の増強によっても、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、メチオニンリプレッサーはmetJ遺伝子に、ホモセリントランスサクシニラーゼはmetA遺伝子に、シスタチオニンγ−シンテースはmetB遺伝子に、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼIIはmetL遺伝子にそれぞれコードされている。また、メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを用いることでもＬ−メチオニンの生産能を付与又は増強することができる（特開2000-139471号、US20090029424）。なお、Ｌ−メチオニンはＬ−システインを中間体として生合成されるため、Ｌ−システインの生産能の向上によりＬ−メチオニンの生産能も向上する（特開2000-139471号、US20080311632）。よって、Ｌ−メチオニン生産能を付与又は増強するためには、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強させる上記方法も有効である。

【0051】

Ｌ−メチオニン生産菌やそれを構築するために用いられる親株としては、具体的には、AJ11539 (NRRL B-12399)、AJ11540 (NRRL B-12400)、AJ11541 (NRRL B-12401)、AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有する218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) ((ロシア特許第2215782号)等のE. coli株が挙げられる。また、Ｌ−メチオニン生産菌やそれを構築するために用いられる親株としては、E. coli W3110由来のAJ13425 (FERM P-16808)（特開2000-139471号（US7611873））を用いることができる。AJ13425は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたＬ−スレオニン要求株である。AJ13425は、平成１０年５月１４日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号FERM P-16808が付与されている。

【0052】

また、Ｌ−メチオニンを出発物質として生合成されるＳ−アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン生産能は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼを強化することや（ＥＰ０６４７７１２、ＥＰ１４５７５６９）、排出因子ＭｄｆＡを強化すること（ＵＳ７４１０７８９）で付与又は増強することができる。

【0053】

ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性の増大
本発明の細菌は、上述したような含硫アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質（以下、「ＹｅｅＥ」又は「ＹｅｅＥタンパク質」と記載することがある）の活性が増大するように改変することによって得ることができる。ただし、ＹｅｅＥタンパク質の活性が増大するように改変を行った後に、含硫アミノ酸生産能を付与又は増強してもよい。

【0054】

「ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大する」とは、ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるＹｅｅＥタンパク質の活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に増大する。また、「ｙｅｅＥ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増大する」とは、もともとＹｅｅＥタンパク質の活性を有する菌株においてＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともとＹｅｅＥタンパク質の活性が存在しない菌株にＹｅｅＥタンパク質の活性を付与することを含む。すなわち、例えば、パントエア・アナナティスはｙｅｅＥ遺伝子を有さないが、パントエア・アナナティスにＹｅｅＥタンパク質の活性を付与することも含む。

【0055】

ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させるような改変は、例えば、ｙｅｅＥ遺伝子の発現を増強させることによって達成される。

【0056】

ｙｅｅＥ遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、ｙｅｅＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを細菌に導入して形質転換すればよい。前記ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４（ｐＨＳＧ、ｐＡＣＹＣは宝バイオ社より入手可）、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１９（ｐＭＷ２１９はニッポンジーン社より入手可）、ｐＳＴＶ２９（宝バイオ社より入手可）等が挙げられる。

【0057】

組換えＤＮＡを細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２株について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C. H.,Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)）も応用できる。

【0058】

一方、ｙｅｅＥ遺伝子のコピー数を高めることは、上述のようなｙｅｅＥ遺伝子を細菌のゲノムＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌のゲノムＤＮＡ上にｙｅｅＥ遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。ゲノムＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、反復ＤＮＡ配列（repetitive DNA）、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、ゲノム上に存在するｙｅｅＥ遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはインテグレーションベクターを用いて達成することが出来る。

【0059】

あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ｙｅｅＥ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。ゲノム上に遺伝子が転移したことの確認は、ｙｅｅＥ遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。

【0060】

さらに、ｙｅｅＥ遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開００／１８９３５号パンフレットに記載した方法で、ゲノムＤＮＡ上またはプラスミド上のｙｅｅＥ遺伝子の各々のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、各遺伝子の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけること、ｙｅｅＥ遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、ｙｅｅＥ遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。強力なプロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ａｒａＢＡプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、Ｔ７プロモーター、φ１０プロモーター等が知られている。また、エシェリヒア・コリのスレオニンオペロンのプロモーターを使用することもできる。また、ｙｅｅＥ遺伝子のプロモーター領域、ＳＤ領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。例えば、ＳＤ領域の配列をφ１０プロモーター下流のＳＤ領域の配列にそのまま置き換えることもできる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することにより翻訳効率を向上させることも可能である。ｙｅｅＥ遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりｙｅｅＥ遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（ＷＯ２００５／０１０１７５）を使用することが出来る。

【0061】

ｙｅｅＥ遺伝子の発現量を増大させるような改変は、例えば、ｙｅｅＥ遺伝子の発現を正に調節する制御因子や負に制御する制御因子をモジュレートすることによっても達成される。例えばＬｙｓＲファミリーなどに属するものが制御因子として挙げられ、データベースＥｃｏＣｙｃ（http://ecocyc.org/）等を利用して見つけ出すことができる。制御因子のモジュレートによりｙｅｅＥ遺伝子の転写量の増大やＹｅｅＥタンパク質の量の増大が見られればよい。

【0062】

ｙｅｅＥ遺伝子の発現が増大したことは、ｙｅｅＥ遺伝子の転写量が増大したことを確認することや、ＹｅｅＥタンパク質の量が増大したことを確認することにより確認できる。

【0063】

ｙｅｅＥ遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。

【0064】

ＹｅｅＥタンパク質の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。

【0065】

なお、上述したＳＡＴ等をコードする遺伝子についても、同様の方法で細菌に組換えＤＮＡを導入することができ、また、遺伝子のコピー数を高めることができる。

【0066】

エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｙｅｅＥ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、２０８２４９１〜２０８３５４９位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｙｅｅＥ遺伝子は、ＥＣＫ２００７、ＪＷ１９９５と同義である。また、エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のＹｅｅＥタンパク質は、GenBank accession NP_416517(version NP_416517.1 GI:16129954、locus_tag=“b2013”)として登録されている。前記ＭＧ１６５５株のｙｅｅＥ遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３及び１４に示す。

【0067】

細菌が属する属、種、又は菌株によって、ｙｅｅＥ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させるような改変を受けるｙｅｅＥ遺伝子は、配列番号１３に示す塩基配列のバリアントであってもよい。ｙｅｅＥ遺伝子のバリアントは、配列番号１３の塩基配列を参考にして、ＢＬＡＳＴ等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、ｙｅｅＥ遺伝子のバリアントは、同遺伝子のホモログを含む。同遺伝子のホモログとしては、例えば腸内細菌科やコリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、例えば配列番号１３の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増幅可能な遺伝子が挙げられる。

【0068】

エシェリヒア・コリ以外の細菌のｙｅｅＥ遺伝子ホモログの例として、以下の細菌のｙｅｅＥ遺伝子が挙げられる（表１）。表１中、同一性（％）は、エシェリヒア・コリＫ１２株のＹｅｅＥタンパク質（配列番号１４）と、各細菌のホモログとの、ＢＬＡＳＴによる同一性を示す。アクセション番号は、ＮＣＢＩデータベースのアクセション番号を示す。

【0069】

【表1】

【0070】

また、ｙｅｅＥ遺伝子は、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードする限り、上記のようなＹｅｅＥタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。

【0071】

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記のようなＹｅｅＥタンパク質のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、細胞内の活性を増大させたときに含硫アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、「同一性」（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を指すことがある。

【0072】

また、ｙｅｅＥ遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば配列番号１３に示す塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＹｅｅＥタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

【0073】

プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。

【0074】

上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼ、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ等の酵素、又はＹｄｅＤタンパク質や、それらをコードする遺伝子にも準用できる。

【0075】

なお、エシェリヒア・コリ染色体上ではｙｅｅＥ遺伝子の下流にｙｅｅＤ遺伝子が存在し、両遺伝子はオペロンを形成していると考えられている（データベース「ＥｃｏＣｙｓ」; http://ecocyc.org/、データベース「ＲｅｇｕｌｏｎＤＢ」; http://regulondb.ccg.unam.mx/）。通常、オペロンを形成している遺伝子群は共通の機能や関連する機能を担っている場合が多い。したがって、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させるような改変が何らかの効果を発揮する場合には、ＹｅｅＤタンパク質の活性を増大させるような改変も同様の効果を発揮する可能性がある。本発明においては、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させるような改変と共に、ＹｅｅＤタンパク質の活性を増大させるような改変を行ってもよい。

【0076】

＜２＞本発明の含硫アミノ酸、もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地から含硫アミノ酸、もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。含硫アミノ酸がＬ−システインである場合は、Ｌ−システインの関連物質としては、先述したＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に対応するヘミチオケタール等が挙げられる。含硫アミノ酸がＬ−メチオニンである場合は、Ｌ−メチオニンの関連物質としては、先述したＳ−アデノシルメチオニン等が挙げられる。

【0077】

使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。

【0078】

炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。

【0079】

窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。

【0080】

イオウ源としては、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。

【0081】

有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

【0082】

培養は好気的条件下で３０〜９０時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からの含硫アミノ酸の採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。

【0083】

上記のようにして得られるＬ−システインは、Ｌ−システイン誘導体の製造に用いることができる。Ｌ−システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が挙げられる。

【0084】

また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。また、培地にＳ−スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスレイトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。

【実施例】

【0085】

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

【0086】

（１）Ｌ−システイン生産菌の構築
Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｃｙｓＥ（ＵＳ２００５０１１２７３１（Ａ１））、Ｌ−システイン排出因子をコードするｙｄｅＤ遺伝子（ＵＳ５９７２６６３Ａ）、及びＬ−セリンによるフィードバック阻害が低減された３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡ遺伝子（ＵＳ６１８０３７３）が１つのプラスミドに載ったｐＡＣＹＣ−ＤＥＳを、エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株及びパントエア・アナナティス ＳＣ１７株に導入し、Ｌ−システイン生産菌ＭＧ１６５５／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳ、及びＳＣ１７／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳを構築した。前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、１６７位のスレオニン残基がアラニン残基に置換されている。また、前記３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、４１０位のチロシン残基を欠失している。ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳの構築は、特開２００５−１３７３６９（ＵＳ２００５０１２４０４９（Ａ１）、ＥＰ１５２８１０８（Ａ１））に記載されている。

【0087】

（２）ｙｅｅＥ遺伝子発現用プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ｙｅｅＥ（Ｅｃ）の構築
ＹｅｅＥタンパク質の活性を増強するために用いられる、ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現用プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ｙｅｅＥ（Ｅｃ）を以下の手順で構築した。

【0088】

（２−１）プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ＹｅａＳ３の構築
エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ ４７０７６）の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ１（agctgagtcgacccccaggaaaaattggttaataac：配列番号１）、及びプライマーＰ２（agctgagcatgcttccaactgcgctaatgacgc：配列番号２）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター領域（Ｐｎｌｐ０）約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。これらのプライマーの５'末端には制限酵素ＳａｌＩ及びＰａｅＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃ ３分の後、９５℃ ６０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ４０秒を２サイクル、９４℃ ２０秒、５５℃ ２０秒、７２℃ １５秒を２５サイクル、最後に７２℃ ５分。得られた断片をＳａｌＩ及びＰａｅＩで消化し、ｐＭＩＶ−５ＪＳ（特開２００８−９９６６８）のＳａｌＩ−ＰａｅＩサイトに挿入しプラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０を取得した。このｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０プラスミドに挿入されたＰｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片の塩基配列は配列番号３に示したとおりである。

【0089】

次にＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ３（agctgatctagaaaacagaatttgcctggcggc：配列番号４）、及びプライマーＰ４（agctgaggatccaggaagagtttgtagaaacgc：配列番号５）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。これらプライマーの５'末端には制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃ ３分の後、９５℃ ６０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ４０秒を２サイクル、９４℃ ２０秒、５９℃ ２０秒、７２℃ １５秒を２５サイクル、最後に７２℃ ５分。得られた断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しプラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒを取得した。

【0090】

続いてＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ５（agctgagtcgacgtgttcgctgaatacggggt：配列番号６）、及びプライマーＰ６（agctgatctagagaaagcatcaggattgcagc：配列番号７）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｙｅａＳ遺伝子を含む約７００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。これらプライマーの５'末端には制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃ ３分の後、９５℃ ６０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ４０秒を２サイクル、９４℃ ２０秒、５５℃ ２０秒、７２℃ １５秒を２５サイクル、最後に７２℃ ５分。得られた断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒのＳａｌＩ−ＸｂａＩサイトに挿入しプラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ＹｅａＳ３を取得した。こうして、ｐＭＩＶ−５ＪＳベクター上にｎｌｐＤプロモーター、ｙｅａＳ遺伝子、及びｒｒｎＢターミネーターが、この順に繋がったｙｅａＳの発現ユニットが構築された。

【0091】

（２−２）プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ＹｅａＳ３の構築
ｎｌｐＤプロモーターの−１０領域を改変することでより強力なプロモーターとするため、以下の手法で−１０領域のランダム化を行った。ｎｌｐＤプロモーター領域（図１）には、プロモーターとして機能すると推定される領域が２箇所存在し、それぞれの−１０領域及び−３５領域を、Ｐ１（−１０）及びＰ１（−３５）、並びにＰ２（−１０）及びＰ２（−３５）と示す。プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０をテンプレートとして、プライマーＰ１及びプライマーＰ７（atcgtgaagatcttttccagtgttnannagggtgccttgcacggtnatnangtcactgg：配列番号８）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｎｌｐＤプロモーターの３'末端側に含まれる−１０領域（Ｐ１（−１０））をランダム化したＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃ ３分の後、９５℃ ６０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ４０秒を２サイクル、９４℃ ２０秒、６０℃ ２０秒、７２℃ １５秒を２５サイクル、最後に７２℃ ５分。

【0092】

一方、同様にプラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０をテンプレートとして、プライマーＰ２及びプライマーＰ８（tggaaaagatcttcannnnncgctgacctgcg：配列番号９）をプライマーとして用いたＰＣＲによってｎｌｐＤプロモーターの５'末端側に含まれる−１０領域（Ｐ２（−１０））をランダム化したＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃ ３分の後、９５℃ ６０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ４０秒を２サイクル、９４℃ ２０秒、６０℃ ２０秒、７２℃ １５秒を２５サイクル、最後に７２℃ ５分。

【0093】

得られた３'末端側と５'末端側の断片は、プライマーＰ７とＰ８にデザインされたＢｇｌＩＩサイトによってつなぎ合わせることができ、２箇所の−１０領域がランダム化されたｎｌｐＤプロモーター全長を構築することができる。この断片をテンプレートとして、Ｐ１及びＰ２をプライマーとして用いたＰＣＲによって改変型ｎｌｐＤプロモーター全長のＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲサイクルは次のとおりである。９５℃ ３分の後、９５℃ ６０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ４０秒を２サイクル、９４℃ ２０秒、６０℃ ２０秒、７２℃ １５秒を１２サイクル、最後に７２℃ ５分。

【0094】

増幅断片を、プライマーの５'末端にデザインされている制限酵素ＳａｌＩ及びＰａｅＩで消化し、同じくＳａｌＩ及びＰａｅＩで消化したプラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ＹｅａＳ３に挿入することで、プラスミド上の野生型ｎｌｐＤプロモーター部位（Ｐｎｌｐ０）を変異型Ｐｎｌｐと置き換えた。その中から配列番号１０に示すプロモーター配列（Ｐｎｌｐ８）を持つものを選び、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ＹｅａＳ７と命名した。このプラスミドに挿入されたＰｎｌｐ８プロモーターのＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片の塩基配列が配列番号１０に示されている。Ｐｎｌｐ８プロモーターはＰｎｌｐ０プロモーターに比べて、強力なプロモーターである。

【0095】

（２−３）ｙｅｅＥ遺伝子発現用プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ｙｅｅＥ（Ｅｃ）の構築
先述の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ＹｅａＳ７に組み込まれているｙｅａＳ遺伝子をｙｅｅＥ遺伝子に置き換えることで、ｐＭＩＶ−５ＪＳベクター上にＰｎｌｐ８プロモーター、ｙｅｅＥ遺伝子、及びｒｒｎＢターミネーターの順に繋がったｙｅｅＥの発現ユニットが搭載されたプラスミドを構築した。ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現用プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ｙｅｅＥ（Ｅｃ）の構築方法を以下に示す。

【0096】

エシェリヒア・コリのｙｅｅＥ遺伝子の増幅は、ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ｙｅｅＥ（Ｅｃ）ＳａｌＩ−Ｆ（acgcgtcgacatgttttcaatgatattaagcgggc：配列番号１１）、ｙｅｅＥ（Ｅｃ）ＸｂａＩ−Ｒ（ctagtctagattaatttgccgcagcagttgcc：配列番号１２）をプライマーとして用い、ＰＣＲサイクル（９４℃ ５分の後、９８℃ ５秒、５５℃ ５秒、７２℃ ９０秒を３０サイクル、最後に４℃保温）で行った。プライマーの両端にはＳａｌＩとＸｂａＩサイトがそれぞれデザインされている。増幅断片をＳａｌＩとＸｂａＩで切断し、同じくＳａｌＩとＸｂａＩで切断したｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ＹｅａＳ７に挿入しｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ｙｅｅＥ（Ｅｃ）を作製した。また、対応する空のベクター（対照用）としてｐＭＩＶ−５ＪＳ（特開２００８−９９６６８）を使用した。なお、ｙｅｅＥ遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１３、ｙｅｅＥ遺伝子産物の予想アミノ酸配列を配列番号１４に示した。

【0097】

（３）Ｌ−システイン生産培養（エシェリヒア・コリ）
ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現がＬ−システイン及びＬ−システイン関連化合物の発酵生産に及ぼす効果を調べるため、先述のＬ−システイン生産菌 エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳにｙｅｅＥ過剰発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ｙｅｅＥ（Ｅｃ）及びその対照用の空ベクターｐＭＩＶ−５ＪＳを導入した株の発酵生産培養を行い、Ｌ−システイン及びＬ−システイン関連化合物の生産量を比較した。培養には下記組成のＬ−システイン生産培地を使用した。

〔Ｌ−システイン生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １５ｇ／Ｌ
ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｇ／Ｌ
トリプトン １０ｇ／Ｌ
イーストエクストラクト ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物 １３５ｍｇ／Ｌ
Ｌ−メチオニン ３００ｍｇ／Ｌ
成分２：
グルコース ４０ｇ／Ｌ
成分３：
チオ硫酸ナトリウム ７ｇ／Ｌ
成分４：
ピリドキシン塩酸塩 ２ｍｇ／Ｌ
成分５：
炭酸カルシウム ２０ｇ／Ｌ

各成分について、各々１００／４７．５倍（成分１）、１００／４７．５倍（成分２）、５０倍（成分３）、１０００倍（成分４）のストック溶液を作製しておき、使用時に混合し滅菌水で規定の量までメスアップして最終濃度となるように調製した。殺菌は、１１０℃、３０分のオートクレーブ（成分１、２）、１８０℃、５時間以上の乾熱滅菌（成分５）、フィルター滅菌（成分３、４）により行った。

【0098】

Ｌ−システイン生産培養は以下の手順で行った。各Ｌ−システイン生産菌をＬＢ寒天培地に塗り広げ、３７℃で一晩前培養を行った後、１０マイクロリッターサイズの植菌用ループ（ＮＵＮＣ社ブルーループ）でプレート上約７ｃｍ分の菌体を３回掻き取り（３ループ）、大試験管（内径２３ｍｍ、長さ２０ｃｍ）に２ｍｌ張りこんだ上記Ｌ−システイン生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製した。３２℃にて振盪培養を行い、３０時間後に培養を終了した。培地中に生産されたＬ−システイン（シスチン等の一部のＬ−システイン関連物質を含む）の定量はＧａｉｔｏｎｄｅ， Ｍ．Ｋ．（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。各株とも４連で実験を行い、そのときのＬ−システイン生産量（平均値）と標準偏差、消費グルコースに対するＬ−システイン収率を表２に示した。ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現によりＬ−システインの蓄積濃度が増大した。よって、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させることにより、Ｌ−システインの生産を向上させることができると明らかになった。

【0099】

【表2】

【0100】

（４）Ｌ−システイン生産培養（パントエア・アナナティス）
ｙｅｅＥ遺伝子過剰発現がＬ−システイン及びＬ−システイン関連化合物の発酵生産に及ぼす効果を調べるため、先述のＬ−システイン生産菌 パントエア・アナナティス ＳＣ１７／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳにｙｅｅＥ過剰発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ８−ｙｅｅＥ（Ｅｃ）及びその対照用の空ベクターｐＭＩＶ−５ＪＳを導入した株の発酵生産培養を行い、Ｌ−システイン及びＬ−システイン関連化合物の生産量を比較した。Ｌ−システイン生産培養及びＬ−システインの定量方法は先述のエシェリヒア・コリでの実施例と概ね同じである。ただし、植菌量を１ループ、培養時間を２２時間とした。各株とも４連で実験を行い、そのときのＬ−システイン生産量（平均値）と標準偏差、消費グルコースに対するＬ−システイン収率を表３に示した。ｙｅｅＥ遺伝子の過剰発現によりＬ−システインの蓄積濃度が増大した。よって、ＹｅｅＥタンパク質の活性を増大させることにより、Ｌ−システインの生産を向上させることができると明らかになった。

【0101】

【表3】

【産業上の利用可能性】

【0102】

本発明により、細菌の含硫アミノ酸生産能を向上させることができ、含硫アミノ酸もしくはそれらの関連物質、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。

【0103】

配列表の説明
配列番号１：Pnlp0増幅用プライマー
配列番号２：Pnlp0増幅用プライマー
配列番号３：Pnlp0の塩基配列
配列番号４：rrnB遺伝子のターミネーター領域増幅用プライマー
配列番号５：rrnB遺伝子のターミネーター領域増幅用プライマー
配列番号６：yeaS遺伝子増幅用プライマー
配列番号７：yeaS遺伝子増幅用プライマー
配列番号８：Pnlp0の−１０領域（３’側）ランダム化プライマー
配列番号９：Pnlp0の−１０領域（５’側）ランダム化プライマー
配列番号10：Pnlp8の塩基配列
配列番号11：yeeE遺伝子増幅用プライマー
配列番号12：yeeE遺伝子増幅用プライマー
配列番号13：エシェリヒア・コリ野生型yeeE遺伝子の塩基配列
配列番号14：エシェリヒア・コリ野生型YeeEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号15：yeaS遺伝子との連結部位を含むPnlp0の塩基配列
配列番号16：yeaS遺伝子との連結部位を含むPnlp8の塩基配列

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]