特許 5809142 ベタインを含む肝の再生促進用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5809142

(24)【登録日】2015年9月18日

(45)【発行日】2015年11月10日

(54)【発明の名称】ベタインを含む肝の再生促進用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/205 20060101AFI20151021BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20151021BHJP

   A61K 31/7004 20060101ALI20151021BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20151021BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/205

   A61K31/198

   A61K31/7004

   A61P43/00 105

【請求項の数】3

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2012-526633(P2012-526633)

(86)(22)【出願日】2010年8月24日

(65)【公表番号】特表2013-503156(P2013-503156A)

(43)【公表日】2013年1月31日

(86)【国際出願番号】KR2010005637

(87)【国際公開番号】WO2011025220

(87)【国際公開日】20110303

【審査請求日】2012年2月28日

【審判番号】不服2014-11149(P2014-11149/J1)

【審判請求日】2014年6月12日

(31)【優先権主張番号】10-2009-0080562

(32)【優先日】2009年8月28日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】509084149

【氏名又は名称】エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム， ヨン チョル

【合議体】

【審判長】 村上 騎見高

【審判官】 横山 敏志

【審判官】 前田 佳与子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００３−１５５２４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２９８９１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２３１５８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅ，１９６９，４５（４），ｐ．３８９−９２

【文献】 Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，２００６，５１（７），ｐ．１２２６−９

【文献】 Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，１９９８，４４，ｐ．２４９−２５５

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｐ４３／００

ＣＡＰｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＭＥＤＰｌｕｓ

ＣｉＮｉｉ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（１）：

【化1】

で表されるベタインを有効成分に含む部分切除された正常肝で肝細胞を増殖させることにより、肝の成長を促進するための薬学的組成物。

【請求項2】

前記ベタインはベタイン無水物、ベタイン水和物及び薬学的に許容可能なベタイン塩で構成される群から選択される一形態であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

アミノ酸及び葡萄糖で構成される群から選択される一つ以上の化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、人間を含む哺乳動物の損傷された肝、特に肝切除から正常肝への回復を促進するベタイン、又はこれを含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

肝は沈黙の臓器と呼ばれる。その理由は、肝は１５〜２０％のみ機能を維持しても生存に必須な代謝作用を行うことができるためである。このような肝の特性のため肝疾患の早期発見が難しく、診断後にも患者達が肝の管理を疎かに思う原因となる。最近の統計庁の資料によると、２００７年度死亡原因の順位で肝疾患は、男性では１０万名当たり２３．８人で５位、女性の場合は１０万名当たり７．８人で１０位と調査され、男女を合わせて韓国人の死亡原因８位に該当した。しかし、肝癌を含めば肝疾患は脳血管疾患と心臓疾患に次いで死亡原因３位であり、特に社会的活動が活発な４０、５０代の男性に肝疾患が主な死亡原因との統計は、肝疾患の管理と治療方法、そして治療剤の開発が非常に緊急な課題であることを示唆する。

【0003】

肝疾患は、エタノール及び各種の薬剤や毒性化学物質、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス、胆汁うっ滞、自己免疫などのような多様な原因により発生し、普通脂肪肝を経て肝炎、肝線維化（ｈｅｐａｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び肝硬変へ進む。脂肪肝はそれ自体で病的な状態ではなく、原因物質が除去されれば自ずから回復する可逆的な症状である。しかし、肝組織に脂肪が過多に蓄積された状態が持続的に維持されると脂肪肝炎が発生し、その結果肝細胞壊死と再生が起こり、この過程が繰り返されると線維状のＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）が増加し肝の線維化が進行する。肝損傷が一定の段階に至ることになれば、原因物質の種類と係わりなく持続的な肝細胞の破壊と再生が繰り返され、再生結節が形成されて非可逆的な肝硬変に悪化する。特に、肝硬変症患者の２０〜３０％は窮極的に肝癌に進むことになる。肝硬変症の非可逆性には二つの重要な因子が寄与する。その一つはコラーゲン合成の増加による持続的なＥＣＭの蓄積であり、もう一つは肝再生能力の低下による肝機能喪失である。

【0004】

末期状態に到達した慢性肝疾患患者に最も有効な治療法は肝移植である。しかし、肝移植が求められる患者の数は、肝供与者の数を大きく超過する。この問題を乗り越えるため幾種類の革新的な方法が提示されており、そのうち一つである生体部分肝移植（ＬＤＬＴ；Ｌｉｖｉｎｇ Ｄｏｎｏｒ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、移植待機者名簿の患者数と臓器寄贈者数との差を大きく減少させた。この治療法により、小児患者の肝移植待機期間中の死亡率はほぼ『０』に減少しており（非特許文献１）、成人間の生体部分肝移植もまた急増した（非特許文献２）。現在日本で実施されている肝移植の９９％は生体部分肝移植と報告された（非特許文献３）。

【0005】

一方、部分肝切除は肝癌患者に対しても唯一の根源的な標準治療法として認められている。しかし、過度な肝組織の切除は肝機能の喪失を誘発し得る。肝再生が正常に起きる患者における一時的な肝機能不全は速かに回復するが、慢性的な肝疾患により再生機能が低下した患者の場合、肝機能不全は持続し生命の危急な合併症を起こし得る。肝細胞癌腫（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ， ＨＣＣ）患者を対象に実施された肝切除施術以後発生した肝機能の喪失による死亡率は未だ６０〜９０％と非常に高い状態である（非特許文献４）。

【0006】

部分肝切除後の肝再生は、肝細胞を静止状態（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｔｅ）から増殖状態（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）に切り換えさせる非常に複雑な過程により調節される。幾多の成長因子等が肝増殖を刺激するか又は抑制する信号を提供し、この過程を調節する（非特許文献５）。組織壊死因子α（ｔｉｓｓｕｅ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α；ＴＮＦ−α）とインターロイキン６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６）は肝細胞が分裂を開始する最初の段階に関与し、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）と変形成長因子α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ α；ＴＧＦ−α）とは分裂を促進し、最終的にＴＧＦ−βとアクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）とが細胞の成長を抑制して肝再生を終了させる（非特許文献６）。しかし、線維化が発生した患者の肝は切除後再生能力が著しく減少するものと知られており（非特許文献７；非特許文献８）、したがって、肝移植を介した治療の成功率を低下させる要因となる。最近になって脂肪肝も肝切除患者の手術経過を決める重要な因子として報告されており（非特許文献９；非特許文献１０）、その機構は脂肪肝による肝細胞内の脂質過酸化とクッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ）により媒介される免疫反応を介した正常肝組織の成長阻害によるものと提示された（非特許文献１１）。

【0007】

切除された肝の正常肝への再生は、肝の受領者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）だけでなく供与者（ｄｏｎｏｒ）にも成功的な施術の基本要件となる。生体部分肝移植においては、供与者には肝機能不全を起こさない充分量の肝を残留させなければならず、同時に受領者には健康回復の可能な充分量の移植組織を提供することが必須である。肝組織供与者と受領者全てにおいて合併症の発生は問題になるが、提供者の場合も最悪の場合は死亡が報告されている（非特許文献１２）。供与者に現れる危険性は算定し難いが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｇｉｓｔｙ（ＥＬＴＲ）に参加する西ヨーロッパ国家ではこの割合を０．５％と推定している（非特許文献１３）。これは、腎臓供与に伴われる危険性が０．０１３％であることに比べると３０倍以上に達する。アジア地域センターにおける施術例では、１５０８人の供与者に１６％の合併症が発生しており、１％の再手術、そして少なくとも１件の死亡が報告されており（非特許文献１４）、４４９人の供与者を対象に実施された米国内調査でも、１４．５％の合併証、４．５％の再手術、そして１人の死亡が報告された（非特許文献１５）。総合すれば、単純部分肝切除（肝癌患者及び生体部分肝移植供与者）や部分肝組織受領患者全てに速やかな正常肝の再生は治療の成功を決める最も重要な要素と判断される。

【0008】

一方、式（１）で示されるベタインはトリメチルグリシンの別の名称であって、中性の水溶液で両向性を有する４級アンモニウム構造を有している。

【0009】

【化1】

【0010】

ベタインは、植物と動物の体内に広く分布し、生体内でコリンの非可逆的な酸化過程を介し合成される。

【0011】

ベタインは、尿と血液のホモシステイン濃度が増加する遺伝的疾患であるホモシステイン血症に効果があり、このような目的で米国食品医薬品庁（ＦＤＡ）により使用が認可されたことがある。ベタインが血液内ホモシステイン濃度を低下させることは、ホモシステインのメチル化を促進してホモシステインを枯渇させるためであるものと見られる。特許文献１は、ベタインがホモシステイン血症患者の血液内で上昇したホモシステイン濃度を減少させるとのことについて開示しており、特許文献２は、ベタインを含む製剤であるグリシンベタインが動脈／静脈来由血栓塞栓性及び血液凝固性疾患に対する治療と予防に効果があるとのことについて開示している。さらに、特許文献３によると、１，５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の用量で投与されたベタインがアルコールや四塩化炭素の投与による脂肪浸潤を低下し、脂肪肝の生成を抑制するものと知られている。さらに、本発明者は、特許文献４でベタインが肝線維化及び肝硬変の症状を緩和させることができることを明らかにしたことがある。さらに、ベタインは身体粘膜の乾燥による徴候を緩和させ（特許文献５及び特許文献６）、ベタイン及びアミンオキシドを含む製剤はエンベローピング（ｅｎｖｅｌｏｐｉｎｇ）されたウイルスの活性抑制剤として用いられ（特許文献７、特許文献８）、パンクレアチンと塩酸ベタイン及び第２カルシウムを含む物質は消化効率増進用飼料添加剤として用いられている（特許文献９）。しかし、現在までベタインと肝の再生に係る肝成長との直接的な連関関係を見せるか、ベタインの肝再生過程における有用性を主張する文献は全く報告されたことがない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】国際公開第９８／１９６９０号

【特許文献2】国際公開第２０００／５１５９６号

【特許文献3】米国特許第５，４２８，０６３号明細書

【特許文献4】韓国公開特許第２００８−００７７４００号公報

【特許文献5】国際公開第１９９８／２９０９０号

【特許文献6】韓国公開特許第２０００−００６２４２５号公報

【特許文献7】韓国公開特許第１９９２−００１７６４９号公報

【特許文献8】韓国登録特許第１０−０２２１４８６号公報

【特許文献9】韓国公開特許第２００２−００４１１６２号公報

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】ｄｅ Ｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｒｕｒｇｉｅ，１２２；８３，１９９７

【非特許文献2】Ｔｒｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６；１０７４，２００２

【非特許文献3】Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．９６；４３７，２００９

【非特許文献4】Ｒｅｄａｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ，２６；１１２６，２００２

【非特許文献5】Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６；６０，１９９７

【非特許文献6】Ｍａｒｉｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８０；３６８，２００１

【非特許文献7】Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０２；１３５１，１９９２

【非特許文献8】Ａｎｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ，８９；１８４，２０００

【非特許文献9】Ｖｅｔｅｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２４５；２０，２００７

【非特許文献10】ＭｃＣｏｒｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２４５；９２３，２００７

【非特許文献11】Ｖｅｔｅｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２４５；４４，２００７

【非特許文献12】Ｓｕｒｍａｎ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４６；１０３８，２００２

【非特許文献13】Ａｄａｍｓ，ＥＬＴＲ，２００２

【非特許文献14】Ｌｏ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７５（Ｓｕｐｐｌ）；Ｓ１２，２００３

【非特許文献15】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４８；８１８，２００３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、慢性肝疾患の治療のため実施される肝切除や生体部分肝移植において治療の成否を決める肝再生を促進するため案出されたものであって、ベタインが損傷された、特に切除された肝の正常な肝への回復を直接的に増進させることができることを見付け、これを含む肝切除の合併症の改善及び治療用組成物を提供することにその目的がある。

【課題を解決するための手段】

【0015】

前記目的を達成するため、本発明は、式（１）で示されるベタインを有効成分に含む肝の再生を促進して肝切除の合併症を抑制し、正常肝に回復させる薬学的組成物を提供する。

【0016】

【化2】

【0017】

前記ベタインはベタイン無水物、ベタイン水和物、又は塩酸塩やその他水に溶解させた時ベタインを遊離することができる他の種類の薬学的に許容可能なその塩を含む。前記ベタインは、公知の方法により天然物から抽出されたものや合成されたものを適宜用いることができ、その製造方法や起源は限定されない。

【0018】

さらに、本発明の薬学的組成物は、特に部分切除された肝の再生を促進するのに好ましく用いられる。

【0019】

一方、本発明の実施例によれば、肝組織の２／３を切除し回復期にベタインを飲料水を介し供給すれば、肝切除を実施し浄水された水道水を飲料水として供給したラットに比べ、肝組織の成長を有意的に増加させ、一週間後には完全に正常に回復させた。さらに、ベタインが供給されたラットの肝では細胞周期内Ｇ１期の制限点（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）で発現されるサイクリンＤ１と、ＤＮＡ合成期のＳ期で発現される増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）のタンパク質の量が著しく増加した。この結果は、ベタインが切除された肝の正常肝への再生と回復を促進する効果を有していることを示唆している。総合的に、この実験結果等はベタインが損傷された肝組織の再生に優れた効能を表すことを示し、これからベタインを含む本発明の組成物は、治療のため部分切除を実施するか生体部分肝移植を実施した肝の正常肝への回復を促進することにより、肝切除の合併症を有効に改善又は治療することができることが分かる。

【0020】

本発明の薬学的組成物は、臨床適用時に経口又は非経口に投与可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で用いられ得る。即ち、本発明のベタインを含む肝の再生促進用組成物は、実際の臨床投与時に経口及び非経口の幾多の剤形で投与され得るものの、製剤化する場合は、普段用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、果粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記ベタインに少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混合して調剤される。さらに、単なる賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤等も用いられる。経口投与のための液状製剤には懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般に用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に幾多の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、注射剤、輸液剤、坐剤が含まれ、このような剤形の製剤化のため滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤などが用いられる。非水性溶剤、懸濁溶剤にはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが用いられ得る。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセリン、ゼラチンなどが用いられ得る。

【0021】

さらに、本発明の薬学的組成物は、肝再生に必要な他の成分等を追加して含むことができる。このような有効成分の例には、肝組織を形成するタンパク質の構成成分である各種のアミノ酸や葡萄糖のようなエネルギー源を挙げることができ、特に、正常な食事を供給され得ない手術患者に輸液剤で投与するとき、このように栄養分を添加した製剤は治療効果を上昇させることができる。しかし、アミノ酸や葡萄糖の含有は、ベタインを主成分とする薬学的組成物の一例に該当するだけであり、したがって、本発明の範囲を制限するものではない。

【0022】

本発明の薬学的組成物の有効成分であるベタインの使用量は、投与方法、患者の年齢、体重、疾患の状態などに応じて適宜選択可能であり、投薬単位は、例えば、個別投薬量の１、２、３又は４倍に、又は１／２、１／３又は１／４倍に含むことができる。個別投薬量は有効薬物が１回に投与される量を含み、これは通常１日投与量の全部、１／２、１／３又は１／４倍に該当する。

【0023】

本発明の薬学的組成物の人体投与量は、体内で活性成分であるベタインの吸収度、不活性化率及び排泄速度、患者の年齢、性別、状態、疾病の程度などに従い適宜選択され、成人に１日体重１ｋｇ当り２，０００ｍｇ以下、好ましくは８０ｍｇ以上１，５００ｍｇ以下の範囲が好ましい。

【0024】

ベタインのＬＤ５０に対しては幾多の報告があるが、毒性はないものと思われる。

【0025】

さらに、本発明は、肝切除を受けて集中的な治療が実施された以後（例えば、退院後の患者に）、正常肝への回復を促進し合併症の発生を抑制することができるベタインを有効成分に含む健康機能食品を提供する。

【0026】

本発明の有効成分であるベタインは、幾多の原因により損傷された肝の回復及び肝の再生を促進するための目的で健康食品に添加され得、前記ベタインを食品添加物として用いる場合、ベタインをそのまま添加するか、他の食品又は食品成分と共に用いられ得、通常の方法に従い適宜用いられ得る。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康増進又は治療的処置）に従って適宜に決まり得る。一般に、食品又は飲料の製造時には、本発明の有効成分であるベタインが原料に対し２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的にするか、又は健康調節を目的にする長期間の摂取の場合は、添加量は前記範囲以下であってもよく、安全性の面で問題のない限り有効成分は前記範囲以上の量でも用いられ得る。

【0027】

前記食品の種類には特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例には、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種のスープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール性飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常的な意味での健康食品を全て含む。

【0028】

本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のように幾多の香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。前述の天然炭水化物には、葡萄糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールがある。甘味剤にはタウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを用いることができる。

【0029】

前記以外に本発明の健康食品は、幾多の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の健康食品は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は独立的に又は組み合わせて用いることができる。このような添加剤の割合は大きく重要ではないが、本発明の有効成分であるベタイン１００重量部当り０．１〜３０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。

【発明の効果】

【0030】

ベタインは、肝の再生過程において正常な肝への回復と成長を促進することにより、慢性肝疾患の治療のため実施される肝切除や、生体部分肝移植の供与者と受領者全てに有用に用いられ得、このようなベタインの効果は、肝切除以前に投与する時や肝切除以後から投与する場合に全て発現される。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】肝切除が実施されたラットでＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）発現に対するベタインの効果を見せる図表である。

【図2】肝切除が実施されたラットでＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）発現に対するベタインの効果を見せる図表である。

【図3】肝切除が実施されたラットでサイクリンＤ１の発現に対するベタインの効果を見せる図表である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、本発明を実施例により詳しく説明する。

【0033】

但し、以下の実施例は本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の内容が以下の実施例により限定されるものではない。

【実施例】

【0034】

実験動物

【0035】

雄性スプラーク・ドウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットを株式会社中央実験動物から購入した。実験動物は温度２２±２℃、湿度５５±５％に維持され、人工照明が一日１２時間ずつ提供される飼育室で最小限一週間適応させたあと実験に用いた。肝切除が実施された時点でラットの体重は２３０〜２６０ｇであった。濾過された水道水と固形飼料を自由に摂取するように供給しており、ベタインが供給される動物群には米シグマ社から購入したベタインを１％濃度で浄水された水道水に溶解させたあと飲料水として供給した。ベタインは肝切除が実施された以後から供給した。一部の実験では、ベタインの効能を増加させるためベタインが含まれた飲料水を肝切除実施の２週前から供給した。

【0036】

肝切除

【0037】

肝再生実験のための部分肝切除は、ＨｉｇｇｉｎｓとＡｎｄｅｒｓｏｎ（Ａｒｃｈ Ｐａｔｈ，１２；１８６，１９３１）の方法に従って行った。軽いエーテル麻酔状態でラットの腹部正中線を約３ｃｍ切開した。先ず皮膚を切断して内部の臓器が損傷されないよう慎重に腹筋を切開した。ピンセットで切開された上端部を持ち上げ、肝組織を支持している横隔膜との連結組織をはさみを利用して切り取った。切開線の周りを軽く圧力をかけ、全体肝葉の約７０％体積である中間葉（ｍｅｄｉａｎ ｌｏｂｅ）と左側葉（ｌｅｆｔ ｌａｔｅｒａｌ ｌｏｂｅ）とを露出させた。各肝葉の連結組織等を慎重に除去し、手術用糸で縛って血管を封鎖し、露出した肝葉を除去した。切開部位の筋肉と皮膚を手術用糸で縫い合わせ、手術部位の感染を防止するため７０％のエチルアルコールで消毒した。対照群には腹部切開のみ実施して縫い合わせた動物（Ｓｈａｍ）を用いた。

【0038】

肝毒性関連指標測定

【0039】

アラニンアミノ基転移酵素（Ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＳＴ）活性は、ＲｅｉｔｍａｎとＦｒａｎｋｅｌの方法（Ａｍｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２８；５６，１９５７）を利用して分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定した。試験管にＡＬＴ、ＡＳＴ基質液と血清の一定量を加えて３７℃で反応させた。反応終了後、発色液と０．４Ｎ ＮａＯＨを加えて５２０ｎｍで吸光度を測定した。ピルベート（ｐｙｒｕｖａｔｅ）を同一の方法で発色させた標準検量線から活性を計算した。

【0040】

ウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ａｎ ａｌｙｓｉｓ）

【0041】

標準方法に従って摘出した肝からサイトゾル分画（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を製造した。サイトゾル（ｃｙｔｏｓｏｌ）のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、電気ブロッティング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）してニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転移させた。この膜を、５％の脱脂牛乳（ｎｏｎｆａｔ ｍｉｌｋ）を含むＰＢＳ−Ｔ緩衝液に４℃で一晩中処理した。ニトロセルロース膜を５％のウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）で希釈した１次抗体と反応させた。１次抗体にはマウスモノクローナル抗−サイクリンＤ１血清（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ ｓｅｒｕｍ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）とウサギポリクローナル抗−ヒトＰＣＮＡ（ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＰＣＮＡ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドヤギ抗−ウサギＩｇＧ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で処理した。実験結果はマイクロコンピューター映像機器（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）（Ｍｏｄｅｌ Ｍ１，Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ，Ｃａｎａｄａ）でスキャニング測定（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）した。

【0042】

切除された肝の再生に対するベタインの効果

【0043】

実施例１．ベタインが切除された肝で肝毒性指標と肝重量の増加に及ぼす影響

【0044】

実験に用いられた雄性ラットを無作為に４匹ずつ４群に分けた。第一の群は内部臓器の損傷なく開腹（ｌａｐａｒｏｔｏｍｙ）のみを実施し開腹部位を縫い合わせた対照群であり（Ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ）、第二の群は開腹後ベタインを供給する群（Ｓｈａｍ＋Ｂｅｔａｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）、第三は２／３部分的肝切除（ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ）が実施された群（ＰＨ ｇｒｏｕｐ）、そして第四の群は２／３部分的肝切除が実施された後ベタインを供給する群（ＰＨ＋Ｂｅｔａｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）に設定した。開腹又は部分的肝切除の実施後、ベタイン投与群には１％のベタイン溶液を飲料水に供給し、他の群には浄水された水道水を飲料水に供給した。

【0045】

肝重量の変化を実験した結果を、下記表１に整理した。

【0046】

【表1】

【0047】

前記表１で、０日の値は手術が実施されない正常群における相対肝重量（肝／体重パーセント）。各群は４匹ずつであり、０日の値のみ８匹が用いられた。値は平均±標準誤差。＊ベタインが供給されない動物に比べ統計的に差がある（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ，Ｐ＜０．０５）。７日の値で別のアルファベットで表示された群は統計的に差がある（Ｏｎｅｗａｙ ＡＮＯＶＡ実施後Ｎｅｕｍａｎ Ｋｅｕｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ，Ｐ＜０．０５）。ＳＨ：Ｓｈａｍ，ＰＨ：Ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ。括弧内の値はＳＨ群に対するパーセント値。

【0048】

前記表１で見られるように、実験に用いられた動物と同一年齢帯の動物で、何等の手術が加えられない正常状態で実験が始まる時点に測定された肝／体重相対肝重量（％）は４．０４±０．０８であった。開腹のみ実施されたＳｈａｍ動物群では、一週間経過後の相対肝重量は３．３７±０．０５であって、これはこの期間中のラットの急速な体重増加を反映するものと見られる。ベタイン投与は、それ自体で相対肝重量に何等の変化も与えなかった。肝の２／３を切除した動物の肝は２４時間後約１／３の大きさに減少したが、以後漸次増加して肝切除７日後には正常肝の７８％に回復した。肝切除を実施しベタインを飲料水に供給した動物では、１日後からベタインが供給されない動物に比べ肝重量の増加が速やかであり、２日後からは統計的に有意な差を示した。そして、肝切除後７日目に正常肝の９４％に回復し、統計的にＳｈａｍ群と差を見せなかった。

【0049】

一方、実験終了時にラットの血清で測定された肝毒性指標は、下記表２の通りである。肝切除自体やベタイン投与は、代表的な肝毒性指標の血清ＡＳＴ、ＡＬＴ値に何等の変化も与えなかった。この結果は、用いられた条件でベタインは肝に毒性を誘発しないことを示す。

【0050】

【表2】

【0051】

前記表２で、各群は４匹ずつであり、値は平均±標準誤差。全ての群の間に統計的な差はない（Ｏｎｅｗａｙ ＡＮＯＶＡ実施後Ｎｅｕｍａｎ Ｋｅｕｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ，Ｐ＞０．０５）。

【0052】

実施例２．ベタインが肝切除後に肝再生指標の変化に及ぼす影響

【0053】

肝再生過程で肝細胞は静止状態（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｔｅ）から増殖状態（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）に切り換えられ、このとき細胞周期内のＧ１期の制限点でサイクリンＤ１と、ＤＮＡ合成段階のＳ期でＰＣＮＡが発現される。したがって、この二つの指標は、肝の再生を測定する重要な指標として用いられる。

【0054】

肝切除が実施された後ＰＣＮＡの発現を測定した結果を、図１及び図２に示した。図１は、肝切除施術以後からベタイン１％溶液を飲料水に供給した実験結果である。肝切除を実施し、浄水された水道水を飲料水に供給した動物群で、２４時間後に発現されたＰＣＮＡ量を基準にしたとき、肝切除４８時間後にはＰＣＮＡ発現は約２倍に増加した。ベタイン１％溶液を飲料水に供給した群では、肝切除２４時間と４８時間後全て水道水を飲料水に供給した動物に比べＰＣＮＡ発現は著しく増加した。

【0055】

肝切除が実施された直後の動物は、飲料水や飼料の摂取を直ちに再開することができない。したがって、ベタインの効能を正確に観察するため、動物にベタイン１％溶液を肝切除以前から２週間供給し、施術後ＰＣＮＡ発現を測定しており、その結果は図２の通りである。肝切除施術以前からベタインを供給した群では、水道水供給群に比べ２４時間帯に１９０％、４８時間帯には１５０％の著しいＰＣＮＡ発現の増加を見せた。

【0056】

図１及び図２で、各群は４匹ずつであり、値は平均±標準誤差。図１及び図２で、＊、＊＊、＊＊＊はベタインが供給されない動物に比べ統計的に差がある（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、それぞれＰ＜０．０５，０．０１，０．００１）。

【0057】

図３は、肝切除実施後回復期の動物でサイクリンＤ１発現を測定した結果である。この実験においても、ベタインを肝切除以前の２週間飲料水として投与した。図３で『０』時間帯の値は、ラットにベタイン溶液を飲料水に供給し、肝切除を実施しないまま動物を屠殺してサイクリンＤ１の発現を測定した結果であり、このとき、浄水された水道水を飲料水に供給した正常動物とベタイン投与群との間には何等の差を見せなかった。この結果は、ベタイン投与が肝損傷が発生していない正常状態では、サイクリンＤ１の発現に何等の影響も与えないことを意味する。この時点を基準にしたとき、肝切除以後のサイクリンＤ１の発現は、水道水を供給した動物で速やかに上昇し、１２時間帯には約２倍、２４時間帯には約３．５倍、そして４８時間後には約５倍に増加した。ベタインが供給された動物では、肝切除以後にサイクリンＤ１発現の増加が速やかに起こり、１２時間帯には水道水供給群に比べ約５０％さらに高まり、この結果は統計的にも有意であった。肝切除以後２４時間が経過した時まで、ベタイン投与群では水道水供給群に比べ高いサイクリンＤ１発現を見せており、以後４８時間帯には二つの群の間に差を見せなかった。この結果は、肝損傷後再生が活発に起こる初期時間帯で、ベタイン投与群では水道水のみを供給した動物に比べ遥かに速やかにサイクリンＤ１の発現が増加することを示す。

【0058】

図３で、各群は４匹ずつであり、値は平均±標準誤差。＊、＊＊ベタインが供給されない動物に比べ統計的に差がある（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、それぞれＰ＜０．０５，０．０１）。

【0059】

製造例１． ベタインを含む薬学的組成物の製造

【0060】

＜１−１＞シロップ剤の製造

【0061】

ベタインを有効成分２０％（重量／体積）で含むシロップを次のような方法で製造した。先ず、ベタイン、サッカリン、糖を温水８０ｇに溶解させた。前記溶液を冷却させた後、ここにグリセリン、サッカリン、香味料、エタノール、ソルビン酸及び蒸留水でなる溶液を製造して混合した。この混合物に水を添加し１００ｍｌになるようにした。

【0062】

前記シロップ剤の構成成分は次の通りである。
ベタイン・・・・・・・・・・・２０ｇ
サッカリン・・・・・・・・・・０．８ｇ
糖・・・・・・・・・・・・・・２５．４ｇ
グリセリン・・・・・・・・・・８．０ｇ
香味料・・・・・・・・・・・・０．０４ｇ
エタノール・・・・・・・・・・４．０ｇ
ソルビン酸・・・・・・・・・・０．４ｇ
蒸留水・・・・・・・・・・・・定量

【0063】

＜１−２＞錠剤の製造

【0064】

ベタイン２５０ｇをラクトース１７５．９ｇ、じゃがいも澱粉１８０ｇ及びコロイド性ケイ酸３２ｇと混合した。前記混合物に１０％ゼラチン溶液を添加させた後、粉砕して１４メッシュ篩を通過させた。これを乾燥させ、ここにじゃがいも澱粉１６０ｇ、滑石５０ｇ及びステアリン酸マグネシウム５ｇを添加して得た混合物を錠剤に製造した。

【0065】

前記錠剤の構成成分は次の通りである。
ベタイン・・・・・・・・・・・２５０ｇ
ラクトース・・・・・・・・・・１７５．９ｇ
じゃがいも澱粉・・・・・・・・１８０ｇ
コロイド性ケイ酸・・・・・・・３２ｇ
１０％ゼラチン溶液
じゃがいも澱粉・・・・・・・・１６０ｇ
滑石・・・・・・・・・・・・・５０ｇ
ステアリン酸マグネシウム・・・５ｇ

【0066】

＜１−３＞注射液剤の製造

【0067】

ベタイン１０ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇ及びアスコルビン酸０．１ｇを蒸留水に溶解させて１００ｍｌを製造した。前記溶液を瓶に入れ２０℃で３０分間加熱して滅菌させた。

【0068】

前記注射液剤の構成成分は次の通りである。
ベタイン・・・・・・・・・・・１０ｇ
塩化ナトリウム・・・・・・・・０．６ｇ
アスコルビン酸・・・・・・・・０．１ｇ
蒸留水・・・・・・・・・・・・定量

【0069】

製造例２． ベタインを含む健康食品の製造

【0070】

＜２−１＞食品の製造

【0071】

ベタインを含む食品等を次のように製造した。

【0072】

１．料理用調味料の製造
ベタイン２０〜９５重量％で健康増進用料理用調味料を製造した。

【0073】

２．トマトケチャップ及びソースの製造
ベタイン０．２〜１．０重量％をトマトケチャップ又はソースに添加して健康増進用トマトケチャップ又はソースを製造した。

【0074】

３．小麦粉食品の製造
ベタイン０．５〜５．０重量％を小麦粉に添加し、この混合物を利用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造し、健康増進用食品を製造した。

【0075】

４．スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
ベタイン０．１〜５．０重量％をスープ及び肉汁に添加し、健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。

【0076】

５．グラウンドビーフ（ｇｒｏｕｎｄ ｂｅｅｆ）の製造
ベタイン１〜１０重量％をグラウンドビーフに添加し、健康増進用グラウンドビーフを製造した。

【0077】

６．乳製品（ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
ベタイン１〜５重量％を牛乳に添加し、前記牛乳を利用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。

【0078】

７．禅食の製造
玄米、麦、もち米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎したあと、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。黒豆、黒ごま、荏胡麻も公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎したあと、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。前記で製造した穀物類、種実類の乾燥粉末及びベタインを次の割合で配合して製造した。
穀物類（玄米３０重量％、鳩麦１５重量％、麦２０重量％）、
種実類（荏胡麻７重量％、黒豆８重量％、黒ごま７重量％）、
ベタイン（３重量％）、
霊芝（０．５重量％）、
地黄（０．５重量％）

【0079】

＜２−２＞飲料の製造

【0080】

１．炭酸飲料の製造

【0081】

砂糖５〜１０％、クエン酸０．０５〜０．３％、カラメル０．００５〜０．０２％、ビタミンＣ ０．１〜１％の添加物を混合し、ここに７９〜９４％の精製水を混合してシロップを製造し、前記シロップを８５〜９８℃で２０〜１８０秒間殺菌し冷却水と１：４の割合で混合したあと、炭酸ガス０．５〜０．８２％を注入して本発明のベタインを含む炭酸飲料を製造した。

【0082】

２．健康飲料の製造

【0083】

液状果糖（０．５％）、オリゴ糖（２％）、砂糖（２％）、食塩（０．５％）、水（７５％）のような副材料とベタインを均質に配合して瞬間殺菌したあと、これをガラス瓶、ペット瓶など小包み容器に包装して健康飲料を製造した。

【0084】

３．野菜ジュースの製造

【0085】

ベタイン１〜１０ｇをトマト又はにんじんジュース１，０００ｍｌに加え、健康増進用野菜ジュースを製造した。

【0086】

４．フルーツジュースの製造

【0087】

ベタイン１〜１０ｇを林檎又は葡萄ジュース１，０００ｍｌに加え、健康増進用フルーツジュースを製造した。

【0088】

当業者は、上記説明において開示された概念及び特定の実施形態が、本発明の同一の目的を実行するために他の実施形態を改変又は設計するための基礎として容易に利用できることを理解するだろう。また、当業者は、そのような均等な実施形態が、添付の特許請求の範囲に記載の発明の趣旨及び範囲から逸脱しないものであることも理解するだろう。

【図1】

【図2】

【図3】